BRPI0315980B1 - dna codificando o antígeno p156 de ehrlichia chaffeensis, vetor, célula hospedeira, vacina compreendendo o mesmo, processos para determinar se um cão está infectado com ehrlichia chaffeensis e kits para a realização dos referidos processos - Google Patents

Abstract

"antígenos p153 e p156 para o diagnóstico imunológico da ehrlichiose canina e humana e usos dos mesmos". a presente invenção refere-se a seqüências que codificam duas glicoproteínas imunorreativas foram cionadas de ehrlichia canis (gene p153) e de ehrlichia chaffeensis (gene p156). estas duas glicoproteínas são ortólogos imunorreativos específicos à espécie que são úteis como vacinas em subunidades e para diagnósticos sorológicos e moleculares para e. canis e e. chaffeensis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DNA CODIFICANDO O ANTÍGENO P156 DE EHRUCHIA CHAFFEENSIS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, VACINA COMPREENDENDO O MESMO, PROCESSOS PARA DETERMINAR SE UM CÃO ESTÁ INFECTADO COM EHRUCHIA CHAFFEENSIS E KITS PARA A REALIZAÇÃO DOS REFERIDOS PROCESSOS".

Referência Cruzada ao Pedido de Patente Relacionada Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente provisória U.S. Ne de Série 60/423.573, depositado em 4 de novembro de 2002, agora abandonado.

Legenda do Fundo Federal Esta invenção foi produzida, em parte, utilizando fundos do governo Federal sob o N° de Concessão AI31431 do National Institute of Al-lergy and Infectious Diseases. Consequentemente, o governo Federal possui certos direitos nesta invenção. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se de forma geral aos campos de diagnósticos moleculares e imunológicos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a ortólogos de proteínas imunorreativas específicas à espécie (-200 kDa) de Ehrlichia canis e Ehrlichia chaffeensis que são úteis para o diagnóstico específico à espécie da ehrlichiose canina e da ehrlichi-ose monocitotrópica humana.

Descrição da Técnica Relacionada A ehrlichiose monocítica canina é uma doença potencialmente fatal de origem no carrapato de cães com distribuição por todo o mundo causada primariamente pelo agente de rickettsia, Ehrlichia canis (Huxsoll e outros, 1970). £. canis é uma bactéria intracelular obrigatória que exibe tro-pismo por monócitos e macrófagos (Nyindo e outros, 1971) e estabelece infecções persistentes no hospedeiro vertebrado (Harrus e outros, 1998). A doença é caracterizada por três estágios: o estágio agudo que dura 2 até 4 semanas; o estágio subclínico, no qual os cães podem permanecer persis- Segue-se folha 1a tentemente infectados durante anos, mas não exibir os sinais clínicos, seguido pela fase crônica, em que em muitos cães a doença fica progressiva- mente pior por causa da hipoplasia da medula óssea e o prognóstico menos favorável (Troy e outros, 1990).

Ehrlichia canis infecta e causa ehrlichiose em animais pertencentes à família Canidae. A ehrlichiose canina consiste em uma fase aguda e uma crônica. A fase aguda é caracterizada por febre, descargas nasais e oculares graves, anorexia, depressão e perda de peso. A fase crônica é caracterizada pela pancitopenia grava, epistaxia, hematúria, sangue nas fezes em adição a sinais clínicos mais graves da doença aguda. Se tratada logo durante o curso da doença, os cães respondem bem à doxiciclina. Entretanto, os cães infectados de forma crônica não respondem bem ao antibiótico. Portanto, o diagnóstico precoce é muito importante para o tratamento da ehrlichiose canina. O tratamento da doença na fase aguda é importante para o melhor prognóstico. Anormalidades hematológicas tais como a leucopenia e a trombocitopenia freqüentemente fornecem evidências úteis da ehrlichiose canina e são fatores importantes no diagnóstico iniciai {Troy e outros, 1990). Entretanto, o diagnóstico se toma difícil pelo fato da apresentação clínica da ehrlichiose canina ser inespecífica. O diagnóstico da ehrlichiose canina através de métodos soroló-gicos tal como o teste indireto de anticorpos fluorescentes (1FA) se tornou o método padronizado por causa de sua simplicidade, confiabilidade e eficiência em relação ao custo {Troy e outros, 1990). Entretanto, deficiências do teste indireto de anticorpo fluorescente incluem a incapacidade de produzir um diagnóstico específico à espécie por causa da reatividade cruzada anti-gênica com outras espécies de Ehrlichia intimamente relacionadas que infectam cães (E. chaffeensis, E. ewingii, Anaplasma phagocytophilum e A. platys). As interpretações subjetivas também podem resultar em resultados falso negativos ou falso positivos causados pelos antígenos de reação cruzada. Outros métodos de diagnóstico, tal como a reação em cadeia da poli-merase (PCR), foram desenvolvidos para a detecção específica de E, canis e foram relatados como sendo mais sensíveis que o isolamento de culturas de células, mas este método requer treinamento especializado e equipamentos caros (McBride e outros, 1996). O isolamento do organismo é demorado e somente alguns laboratórios têm sido coerentemente bem sucedidos com este método. Além disso, testes adicionais que caracterizam o isolado são necessários para definir uma etiologia específica utilizando este método.

Foram relatados os antígenos com reação sorológica cruzada compartilhados entre E canis e £ chaffeensis. Algumas das proteínas de reação sorológica cruzada principais exibem massas moleculares de 28-30-kDa (Chen e outros, 1997; Rikihisa e outros, 1994) e é agora sabido que estas proteínas são codificadas por famílias multigênicas homólogas (Ohashi e outros, 1998a, b). Há 22 e 25 genes p28 homólogos, mas não idênticos que foram identificados e seqüenciados em £ chaffeensis e £ canis, respectivamente. A homologia de cepas intraespécies e interespécies foi observada entre as proteínas P28 de £ canis e £ chaffeensis, explicando a reatividade sorológica cruzada destas proteínas (McBride e outros, 1999).

Um relato recente demonstrou que a proteína rP28 de £ chaffeensis era uma ferramenta insensível nos casos de diagnóstico da ehrlichiose monocitotrófica humana (HME) (Yu e outros, 1999a). A razão básica parece ser a variabilidade da proteína P28 entre as cepas diferentes de £ chaffeensis (Yu e outros, 1999b). De forma inversa, os genes P28 identificados em £ canis são conservados entre as cepas dispersas geograficamente e a rP28 de £ canis provou ser útil para o diagnóstico da ehrlichiose canina (McBride e outros, 1999; Ohashi 1998a). Outras proteínas imunorreativas homólogas incluindo as glicoproteínas em in £ canis (gp140) e em £ chaffeensis (gp120) foram clonadas (Yu e outros, 1997, 2000). A reatividade da rgp120 de £ chaffeensis se correlacionava bem com o anticorpo fluorescente indireto para o diagnóstico sorológico da ehrlichiose monocitotrópica humana e estudos preliminares com a rgp 140 de £ canis sugerem que esta pode ser um antígeno para diagnóstico imunológico sensível e confiável (Yu e outros, 1999a, 2000). A técnica anterior é deficiente em antígenos específicos para diagnósticos sorológicos e moleculares para £ canis e E. chaffeensis assim como em métodos para uso. A presente invenção satisfaz esta necessidade duradoura e desejada na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi identificada uma proteína fortemente imunorreativa de 43 kD (p43) de Ehrlichia canis (Patente U.S. N° 6.355.777). Como um antígeno para diagnóstico imunológico, a p43 possuía uma acurácia de 96% quando comparada com o teste de anticorpo fluorescente indireto e fornecia um diagnóstico específico à espécie de infecções por £. canis. Uma investigação adicional revelou que a p43 de £. canis representa a porção N-terminal de uma proteína com uma massa molecular prevista de 2C) 153 kD, a maior proteína imunorreativa descrita em Ehrlichia spp. A análise de fragmentos recombinantes expressos da p153 pela eletroforese em gel de proteínas demonstrou uma massa molecular maior que a prevista (-10 até 30%) e a presença de carboidrato glicanas nos fragmentos N- e C-terminais, indicando que a p153 é uma glicoproteina.

Uma busca com BLASTn foi realizada na sequência genômica disponível de £. chaffeensis (95%) e o gene que codifica o ortólogo da p153 foi identificado na E. chaffeensis. O gene p153 de E. canis (4263 pb) e o gene p156 de £ chaffeensis (4389 pb) possuíam localizações cromossômicas similares, a jusante dos genes homólogos (-87%) da desoxiguanosina-trifosfaío trifosfohídrolase e sequências intergênicas homólogas (-90%) que precedem os quadros abertos de leitura. A homologia de seqüências de ácidos nucléicos (50%) foi observada entre os genes das glicoproteínas, sustentando as descobertas anteriores em relação à divergência genética do fragmento do gene p43 e as proteínas p153 e p156 possuíam similaridade de aminoácidos de 32%. Uma proteína nativa de E canis com uma massa molecular de 200 kD reagia com os anti-soros produzidos contra a região N-terminal (p43) da p153, sugerindo que a proteína nativa era modificada após a tradução. Similarmente, uma proteína recombinante que compreen- de a região N-terminal da p156 de £ chaffeensis migrou mais que o previsto (-200 kD) e foi detectado um carboidrato na proteína recombinante. Um epitopo imunorreativo principal foi identificado neste fragmento N-terminal. A localização cromossômica, a homologia de aminoácidos e as propriedades biofísicas sustentam a conclusão de que as glicoproteínas p153 e p156 (denominadas de gp200s) são ortólogos imunorreativos específicos à espécie.

Os epitopos imunorreativos principais foram identificados nas regiões N- (P43) e C-terminais da p153 de £ canis na região N-terminal do ortólogo p156 de £ chaffeensis que serão úteis para diagnósticos sorológi-cos e vacinas. Além disso, os genes que codificam estas proteínas são específicos à espécie e serão úteis para o desenvolvimento de diagnósticos de base molecular.

Outros aspectos, características e vantagens adicionais da presente invenção serão evidentes partindo da descrição a seguir das modalidades atualmente preferidas da invenção. Estas modalidades são fornecidas com a finalidade de divulgação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

De forma que o objetivo no qual as características, as vantagens e os objetivos citados anteriormente da invenção, assim como outros que se tornarão evidentes, sejam atingidos e possam ser entendidos em detalhes, descrições mais particulares da invenção sucintamente resumidas acima podem ter como referência certas modalidades da mesma que são ilustradas nos desenhos em anexo. Estes desenhos constituem uma parte do relatório descritivo. Deve ser observado, entretanto, que os desenhos em anexo ilustram modalidades preferidas da invenção e, portanto, não devem ser consideradas limitante de seu âmbito.

As Figuras 1A e 1B mostram o alinhamento de aminoácidos de Lipman-Pearson dos ortólogos das proteínas p156 de £ chaffeensis (linha superior) e p153 de £ canis (linha inferior). As identidades dos aminoácidos, substituições conservadas (:) e semiconservadas (.) são mos- tradas no centro.

As Figuras 2A e 2B mostram a expressão de fragmentos recom-binantes de proteínas da p153 de £ canis (A) e E. chaffeensis (B) e a detecção com o anticorpo anti-V5. p153 de £ canis, faixa 1, fragmento N-terminal (1107 pb, nt 1-1107), faixa 2, fragmento interno (910 pb, nt 1080-1990), faixa 3, fragmento interno (1000 pb, nt 1950-2950) e faixa 4, fragmento C-terminal (1280 pb, nt 2940-4220). p156 de E. chaffeensis, faixa 1, fragmento N-terminal (1545 pb, nt 125-1675), faixa 2, fragmento interno (1365 pb, nt 1685-3050) e faixa 3, C-terminal (1365 pb, nt 2950-4315). A Figura 3A mostra um Western immunoblot de fragmentos re-combinantes de p153 de E. canis. Faixa 1, fragmento N-terminal (1107 pb, nt 1-1107), faixa 2, fragmento interno (910 pb, nt 1080-1990), faixa 3, fragmento interno (1000 pb, nt 1950-2950) e faixa 4, fragmento C-terminal (1280 pb, nt 2940-4220). A Figura 3B mostra a detecção de carboidratos nos fragmentos recombinantes purificados correspondentes da p153 de E. canis expressos em £ coli utilizando o vetor de expressão pRSET, As glicanas ligadas às proteínas recombinantes foram oxidadas, marcadas com biotina e detectadas com estreptavidína-fosfatase alcalina. A Figura 4A mostra um Western blot dos fragmentos recombi-nantes da p156 de E. chaffeensis (faixas 1-3) com soro humano (painel esquerdo) e canino (painel direito). Faixa 1, fragmento N-terminal da p156 de E. chaffeensis (1545 pb, nt 125-1675), faixa 2, fragmento interno (1365 pb, nt 1685-3050) e faixa 3, C-terminal (1365 pb, nt 2950-4315). As proteínas recombinantes expressas representam ~95% da p156 de E. chaffeensis. A Figura 4B mostra a detecção de carboidratos das três proteínas p156 recombinantes correspondentes de E. chaffeensis (Faixas 1-3). A Figura 5 mostra um Western blot que demonstra as proteínas no lisado de células totais de £ canis com anti-soros policlonais de um cão infectado por £ canis (faixa 1) e anti-p43 recombinante (gp200) (faixa 2) e anti-gp140 re-combinante (faixa 3) soro policlonal de coelho.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A sequência do gene p43 de £ canis foi previamente relatada como 1173 pb (Patente U.S. Ne 6.355.777), mas uma análise adicional revelou um erro no seqüenciamento do DNA resultando em um códon de término artificial e uma sequência gênica truncada. Utilizando o método de "caminhada" sobre o gene com íniciador-adaptador, foi determinada uma sequência adicional de 4,5 kpb a jusante dos 2,4 kpb no clone p43 original. A sequência incompleta do gene p43 foi completada revelando um quadro aberto de leitura de 4263 pb, que codificava uma proteína com uma massa molecular prevista de 153 kD (denominado de p153). A montante do gene p153 há um quadro aberto de leitura que codifica uma desoxiguanosína-trífosfaío tri-fosfohidrolase e uma região não codificadora íntergênica precedendo o gene p153 que possui alta homología de ácidos nucléicos (87% e 90%, respectivamente) entre £ canis e E. chaffeensis.

Uma busca com BLASTn da sequência genômica de £ chaffeensis com o clone p43 de 2,4 kpb identificou sequências de ácidos nucléicos altamente homólogas. Um quadro aberto de leitura grande (4339 pb) aproximadamente equivalente em tamanho à p153 de £ canis foi encontrado na mesma localização cromossômica em relação às sequências codificadoras homólogas e de ácidos nucléicos intergênicos a montante e codificavam uma proteína com uma massa molecular prevista de 156 kD (p156). A ho-mologia das seqüências de ácido nucléico (-50%) foi observada entre os genes p153 de £ canis p156 de £ chaffeensis; entretanto, as proteínas exibiam uma similaridade de sequência de aminoácidos global de 32% (Figura 1).

Os constructos gênicos expressos em £ coli representando a proteína p156 de £ chaffeensis (nt 125-1670; nt 1685-3050; nt 2950-4315) e quatro fragmentos recombinantes da p153 de £ canis (nt 1-1107 (p43); nt 1080-1990; nt 1950-2950; nt 2940-4220) foram expressos em £ coli (Figura 2). As proteínas expressas recombinantes N-terminal (nt 1-1107) e C-terminal (nt 2940-4220) de £ canis exibiam uma forte imunorreatividade (Fi- gura 3A). Entretanto, somente o fragmento N-terminal (nt 125-1670) da p156 de £ chaffeensis era ímunorreativa (Figura 4A).

Os fragmentos das proteínas recombinantes p156 de £ canis (nt 1-1107 e nt 2940-4420) e de £ chaffeensis (nt 125-1607) migravam mais que as previstas pela SDS-PAGE indicando que a modificação pós-tradução destes fragmentos ocorreu. Subseqüentemente, o carboidrato foi detectado nos fragmentos peptídicos da p153 de £ canis e da p156 de E. chaffeensis (Figuras 3B and 4B). O anticorpo anti-p43 reagiu com uma proteína naiva de aproximadamente 200 kD em lisados de células inteiras de E, canis. Além disso, esta proteína de 200 kD também foi reconhecida pelo soro de um cão infectado com £ canis (Figura 5). Uma seqüêncía gênica parcial previamente identificada como p43 (porção N-terminal da p153) recebeu o número de acesso do GenBank AF252298. A seqüêncía em anexo que codifica a p153 recebeu o número de acesso do GenBank AY156950. A localização cromossômica, a homologia dos aminoácidos e as propriedades biofísicas sustentam a conclusão de que as glicoproteínas p153 e p156 (denominadas de gp200s) são ortólogas imunorreativas específicas à espécie. Estas proteínas possuem usos potenciais no desenvolvimento de vacinas e podem ser utilizadas como antígenos para diagnóstico de soros sensível e confiável para o diagnóstico de infecções por Ehrlichia. Isto é sustentado pelas descobertas anteriores que exibiam a imunorreativi-dade e o uso potencial da p43 de £ canis como antígeno para diagnóstico de soro (Patente U.S. N- 6.355.777). A reação com anticorpos contra a p43 possuía uma correlação de 100% com as amostras possuindo um título indireto de anticorpo fluorescente (IFA) > 40 e não reagiam com várias amostras com títulos indiretos de anticorpo fluorescente < 40. A reatividade fraca de várias amostras indiretas negativas de anticorpo fluorescente com os anticorpos para a p43 sugere que a proteína p43 pode ser um antígeno mais sensível para o diagnóstico de soro. Os resultados apresentados na presente invenção indicam que a p43 faz parte de uma proteína p153 maior em £ canis, A presente invenção se direciona a polinucleotídeos isolados que codificam a proteína de superfície imunorreativa p153 de Ehrlichia canis e a proteína p156 de Ehrlichia chaffeensis. Preferencialmente, os polinucleotídeos isolados codificam as proteínas com as sequências de ami-noácidos mostradas nas SEQ ID N-: 1 e 2. Altemativamente, o DNA pode diferir na seqüência de nucleotídeos por causa da degeneração do código genético. A presente invenção também abrange vetores que compreendem estes polinucleotídeos isolados e elementos reguladores necessários para a expressão do DNA em uma célula; proteínas p153 e p156 isoladas e purificadas; e anticorpos direcionados contra estas proteínas. A presente invenção se dirige ainda ao uso das proteínas p153 e p156 na preparação de vacinas contra a ehrlichiose canina e humana. Em adição, são fornecidos métodos de determinação do fato de um cão ou um ser humano estar infectado com uma espécie de Ehrlichia através da determinação do fato do soro do cão reagir com a proteína p153 ou p156. As proteínas utilizadas podem ser de origens recombinantes e a análise de Western blot pode ser utilizada para detectar a reação do soro às proteínas. Uma vez que a reação com a proteína p28 previamente isolada de £ canis é também um marcador confiável da infecção por £ canis, o diagnóstico pode consistir na detecção da imunorreatividade com a proteína p153, gp 140 e os antígenos p28 de Ehrlichia canis. A presente invenção também se dirige a um kit para diagnóstico do soro para a determinação do fato de um cão ou um ser humano estar infectado por uma espécie de Ehrlichia. O kit compreende proteínas imobilizadas (p153 ou p156) divulgadas aqui, tampões de diluição apropriados para o soro canino, um segundo anticorpo anti-soro de cão ligado a uma molécula repórter e reagentes apropriados para a detecção da molécula repórter. Os métodos possíveis de imobilização dos antígenos incluem a ligação a membranas ou a placas de microtitulação. A molécula repórter pode ser a lucife- rase, a peroxidase da raiz forte, a 1 - galactosidase ou uma marcação fluorescente. A presente invenção também se dirige a um método de amplificação pela PCR de determinação do fato de um cão ter sido infectado por uma espécie de Ehrlichia. O DNA é extraído do sangue de um cão ou um ser humano potencialmente infectado e submetido à amplificação pela PCR com iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene p153 de E. canis ou para o gene p156 de E. chaffeensis. Os produtos resultantes da amplificação pela PCR são separados por tamanho através de um método tal como a ele-troforese em gel de agarose e a detecção de um produto de tamanho aproximado indica infecção por Ehrlichia. A presente invenção também se dirige a um kit para a detecção da PCR do gene p153 ou p156.0 kit compreende reagentes para a extração de DNA do sangue, oligonucleotídeos específicos para a p153 ou para a p156 e reagentes para a amplificação pela PCR.

De acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, de microbiologia e do DNA recombinante dentro do versado na técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambro-ok, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Prac-tical Approach," Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Syn-thesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgíns eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.l. Freshney, ed. (1986)]; "lm-mobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Como utilizado aqui, entende-se que o termo "hospedeiro" inclui não somente procariotos, mas também eucariotos tais como células de levedura, vegetais e animais. Uma molécula de DNA ou um gene recombinante que codifica uma proteína da presente invenção pode ser utilizado para transformar um hospedeiro utilizando qualquer uma das técnicas comumente conhecidas pelo versado na técnica. Os hospedeiros procarióticos podem incluir £ coli, S, tymphimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. Os hospedeiros eucarióticos incluem leveduras tal como Pichia pastoris, células de mamíferos e células de insetos.

Em geral, os vetores de expressão que contêm seqüências promotoras que facilitam a transcrição eficiente do fragmento de DNA inserido são utilizados em associação com o hospedeiro. O vetor de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, promoter(es), terminador(es), assim como genes específicos que são capazes de fornecer a seleção feno-típica em células transformadas. Os hospedeiros transformados podem ser fermentados e cultivados de acordo com meios conhecidos na técnica para atingir o crescimento celular ótimo. Os métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser utilizados para construir vetores de expressão que contêm sinais apropriados de controle da transcrição e da tradução. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2â Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. O termo "inicíador" como utilizado aqui refere-se a um oligonu-cleotídeo, que ocorre naturalmente em uma como em uma digestão de restrição purificada ou é produzido sinteticamente, que é capaz de atual como um ponto de início da síntese quando colocado sob condições em que é induzida a síntese de um produto da extensão do inicíador complementar a um filamento de ácido nucléico. As condições incluem a presença de nucleotí-deos e um agente indutor tal como uma DNA polimerase e uma temperatura e um pH adequados. O inicíador pode ter filamento simples ou filamento duplo e tem que ser suficientemente longo para iniciar a síntese do produto de extensão desejado na presença do agente indutor. O comprimento exato do inicíador dependerá de muitos fatores, incluindo a temperatura, a origem do inicíador e o método utilizado. Por exemplo, para aplicações em diagnósticos, o inicíador de oligonucleotídeo contém tipicamente 15-25 ou mais nu-cleotídeos dependendo da complexidade da sequência alvo. Os iniciadores com menos nucleotídeos também podem ser utilizados.

Os iniciadores contidos aqui são selecionados como sendo "substancialmente" complementares a filamentos diferentes de uma seqüên-cia de DNA alvo particular. Isto significa que os iniciadores têm que ser suficientemente complementares para se hibridizarem com seus respectivos filamentos. Portanto, a sequência do iniciado não precisa refletir a seqüência exata do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeos não complementares pode ser ligado à extremidade a 5' do iniciador, com o restante da seqüência do iniciador sendo complementar ao filamento. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências mais longas podem ser intercaladas no iniciador, contanto que a seqüência do iniciador possua complementaridade suficiente com a seqüência ou se hibridize com a mesma e forme assim o molde para a síntese do produto da extensão.

Os exemplos a seguir são fornecidos com a finalidade de ilustração de várias modalidades da invenção e não são entendidos como limitan-tes da presente invenção de forma alguma. EXEMPLO 1.

Caracterização das Proteínas p153 de F. canis e p156 de F. chaffeensis O gene da proteína p43 de E. canis foi identificado partindo da biblioteca de expressão Lambda Zap II como descrito anteriormente (McBri-de e outros, 2001; Patente U.S. N9 6.355.777). O clone original de 2,4 kb consistia em um quadro aberto de leitura (ORF) codificando um gene da de-soxiguanosina-trifosfato trifosfohidrolase em um espaço intergênico de 229 pb a jusante precedendo o fragmento do gene p43 truncado. Um método da PCR com iniciador-adaptador foi utilizado para determinar a seqüência completa do quadro aberto de leitura do p43 utilizando o DNA genômico de £ canis (Jake, cepa North Carolina) como um molde. Os amplicons foram se-qüenciados diretamente com os iniciadores utilizados para a amplificação ou clonados em TOPO/TA para a análise de seqüência. O ortólogo de £. chaffeensis (gene p156) foi identificado através da realização de uma buca com BLASTn da seqüência genômica de E. chaffeensis com o clone inteiro de p43 de Ε. canis (2,4 kb).

Os genes p153 de E. canis e p156 de E. chaffeensis foram divididos em fragmentos grandes (1 até 1,5 kpb), clonados no vetor doador pU-ni/V5-His-TOPO Echo e recombinados com os vetores de expressão acepto-res pBAD Thio-E or pRSET Echo. As proteínas recombínantes foram expressas durante 4 h após a indução com arabinose ou IPTG. A detecção da glicana nas proteínas recombínantes expressas foi realizada utilizando um kit para immunoblot para a detecção de glicoproteínas (Bio-Rad) seguindo o protocolo de marcação em membrana. A proteína Dsb recombinante de E. chaffeensis descrita anteriormente (McBride e outros, 2002) foi expressa em E. coli e utilizada como uma proteína de controle negativo ehrlíchial para os estudos de detecção de glicoproteínas. Os lisados de células inteiras de E, canis foram separados através da eletroforese em gel utilizando gradientes de géis (4-12% de Bis-Tris, Novagen) e transferidos para nitrocelulose pura utilizando uma unidade de transferência semi-seca (Bio-Rad). O imunoblot-ting foi realizado como descrito anteriormente (McBride e outros, 2001). Discussão A forte imunorreatividade do clone contendo a porção N-terminal (p43) da p153 de E. canis levou a sua identificação e caracterização inicial (McBride e outros, 2001). Quando comparada aos resultados do teste indireto com anticorpo fluorescente para a detecção de anticorpos para E. canis em cães, a p43 exibia excelente sensibilidade e especificidade. Em adição, a p43 parecia fornecer detecção específica à espécie, uma vez que o anticorpo policlonal anti-43 recombinante não reagia com as células DHS2 infectadas com E. chaffeensis. A identificação do ortólogo da p153 ortólogo em E. chaffeensis (p156), que é geneticamente divergente e possui um baixo grau de homologia de aminoácidos, sustenta as descobertas anteriores de que a proteína p43 é um antígeno específico à espécie e assim podería ser um excelente antígeno para diagnóstico imunológico específico à espécie. Os epitopos de células B lineares principais estão presentes nas regiões N-(p43) e C-terminais da proteína p153. A proteína recombínante p43 exibia uma massa molecular maior que a prevista (-30% ou -10 kD) que não era inicialmente reconhecida. As glicoproteínas ehrlichiais previamente relatadas gp 120 e gp 140 eram 60 até 100% maiores que o esperado. Embora o grau de modificação da massa molecular fosse muito menor, a proteína p43 é uma glocoproteína que foi confirmada através da detecção de carboidratos de glicanas ligadas. De forma coerente com as descobertas para a p43, os fragmentos gênicos re-combinantes da p156 expressos de E. chaffeensis exibiam uma massa molecular maior que a esperada e foi detectado carboidrato nestes fragmentos. Adicionalmente, o fragmento C-terminal da p153 de £ canis também exibia uma massa molecular maior que a prevista (-10% ou 6kD).

Quando o gene p43 foi identificado, uma proteína nativa correspondente de E. canis dos lisados de células totais não reagiu com os anti-soros antí-p43. Com base nas descobertas apresentadas aqui, esta discrepância pode ser atribuída ao fato de que o gene p43 representa um quadro aberto de leitura incompleto e não codifica uma proteína de 43 kD. Em adição, a grande massa molecular desta proteína (>150 kD) requer atenção especial às condições de eletroforese em gel com a finalidade de se obter uma identificação coerente desta proteína por imunoblot. A proteína de 200 kD em lisados de células totais de E. canis era fortemente imunorreativa com o anticorpo políclonal anti-p43. A massa molecular desta proteína é coerente com a massa prevista da p153 acoplada com algumas glicanas que contribuem com a massa molecular aumentada. Esta descoberta é também coerente com a massa molecular dos fragmentos recombinantes de p156 de E. chaffeensis que representam quase o quadro aberto de leitura inteiro.

As glicoproteínas de Ehrlichia spp. são algumas das primeiras tais proteínas que foram caracterizadas em bactérias patogênicas. As glicoproteínas ehrlichiais descobertas até hoje são coerentemente e fortemente reconhecidas por anticorpos em pacientes e animais infectados. Estas proteínas imunorreativas exclusivas expostas na superfície possuem potencial no desenvolvimento de vacinas e estas proteínas podem ser componentes im- portantes de subunidades de vacinas.

As referências a seguir foram citadas aqui: Chen e outros, 1997. Western immunoblotting analysis ofthe an-tibody responses of patients with human monocytotropic ehrlichiose to diffe-rent strains of Ehrlichia chaffeensis and Ehrlichia canis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:731-735.

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Quaisquer patentes ou publicações mencionadas neste relatório descritivo são indicativos dos níveis dos versados na técnica a qual a invenção refere-se. Estas patentes e publicações são incorporadas aqui como referência até a mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada como estando incorporada como referência.

Um versado na técnica considerará facilmente que a presente invenção está bem adaptada para a realização dos objetivos e para a obtenção das finalidades e vantagens mencionadas, assim como as inerentes a-qui. Os presentes exemplos junto com os métodos, os procedimentos, os tratamentos, as moléculas e os compostos específicos descritos aqui são atualmente representativos das modalidades preferidas, são exemplos e não são pretendidos como limitações do âmbito da invenção. Ocorrerão aos versados na técnica alterações dos mesmos e outros usos que são abrangidos dentro do espírito da invenção como definido pelo âmbito das reivindicações.

Claims (12)

1. DNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína p156 de superfície imu-norreativa a Ehrlichia chaffeensis possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 operavelmente ligado a um promotor heterólogo.

2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA como definido na reivindicação 1.

3. Célula hospedeira que não é de animal ou planta, caracterizada pelo fato de que é transfectada com o vetor como definido na reivindicação 2.

4. Vacina contra a ehrlichiose canina, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína p156 de superfície imunorreativa a Ehrlichia chaffeensis possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Processo para determinar se um cão está infectado com Ehrlichia chaffeensis, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: determinar se o soro do dito cão reage com a proteína p156 de E. chaffeensis possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, em que a reação com a proteína p156 indica que o dito cão está infectado com Ehrlichia chaffeensis.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a análise de western blot é utilizada para determinar se o soro do dito cão reage com a dita proteína.

7. Kit para diagnóstico do soro para determinar se um cão estar infectado com Ehrlichia chaffeensis, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma proteína p156 de Ehrlichia chaffeensis de SEQ ID NO:1 imobilizada; b) tampões de diluição apropriados para o soro canino; c) um segundo anticorpo anti-soro canino ligado a uma molécula repórter; e, d) reagentes apropriados para a detecção da dita molécula repórter.

8. Kit de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida proteína p156 de Ehrlichia chaffeensis é imobilizada em uma membrana ou em uma placa para microtitulação.

9. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita molécula repórter é selecionada do grupo que consiste em luci-ferase, peroxidase da raiz forte, 3-galactosidase e de marcações fluorescentes.

10. Processo de determinar se um cão está infectado com Ehrlichia chaffeensis, caracterizado pelo fato de que compreende a extração do DNA do sangue do dito cão; e a realização da amplificação por PCR do dito DNA com iniciado-res de oligonucleotídeos específicos para o gene p156 de E. chaifeensis; a separação do produto resultante da PCR por tamanho, em que a detecção positiva de um produto da amplificação com o tamanho apropriado indica infecção com £. chaffeensis.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito produto de PCR é detectado através da eletroforese em gel.

12. Kit para a determinar se um cão está infectado com Ehrlichia chaffeensis, caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagentes para a extração do DNA do sangue; b) oligonucleotídeos específicos para p156; e c) reagentes para a amplificação por PCR.