BRPI0316384B1 - imunoensaio não competitivo para analitos pequenos - Google Patents

Abstract

"imunoensaio não competitivo para analitos pequenos". a invenção refere-se a um imunoensaio não competitivo para analitos pequenos, em que o analito é reagido com dois parceiros ligantes. o primeiro parceiro ligante se liga ao analito para formar um complexo entre o primeiro parceiro ligante e o analito, e o segundo parceiro ligante se liga ao complexo formado pelo primeiro parceiro ligante e o analito. o complexo resultante formado entre o analito e os parceiros ligantes é detectado. os parceiros ligantes são proteínas, tais como anticorpos incluindo fragmentos de anticorpo. a invenção refere-se ainda a pares reativos e kits de teste úteis nos ensaios, bem como ao uso dos pares reativos e a um processo para sua preparação. novos reagentes e meios para sua preparação são também providos.

Description

IMUNOENSAIO NÃO COMPETITIVO PARA ANALITOS PEQUENOS

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a imunoensaios e especialmente a imunoensaios não competitivos para analitos pequenos. A presente invenção refere-se ainda a pares reativos e kits de teste úteis nos ensaios, bem como à utilização dos pares reativos e a um processo para sua preparação. São providos também novos reagentes e meios para sua preparação.

Antecedente Técnico da Invenção Em um imunoensaio competitivo, é necessário se adicionar um reagente externo que compita com o analito, o que não é o caso no formato de ensaio não competitivo. 0 método de escolha para a detecção de analitos por imuno-química é, atualmente, um imunoensaio não competitivo, em que dois anticorpos se ligam a dois epitopos diferentes do analito, criando um assim chamado ensaio sanduíche. Tal ensaio é bem adequado para analitos de alto peso molecular e provê velocidade, sensibilidade e especificidade aumentadas, as quais são necessárias em imunoensaios modernos. No entanto, tem sido uma tarefa difícil desenvolver-se ensaios não competitivos para analitos pequenos, porque moléculas de baixo peso molecular não são grandes o suficiente para ligarem simultaneamente mais do que um anticorpo independentemente. Por esta razão, apesar dos muitos problemas fundamentais em relação à especificidade e sensibilidade, o formato de imunoensaio competitivo tem sido utilizado quase que exclusivamente para a detecção de analitos pequenos.

No entanto, existem algumas poucas publicações onde é reportado o desenvolvimento de um imunoensaio não competitivo para um analito pequeno. Nestes artigos foi desenvolvido um anticorpo complexo anti-imune (anti-IC) secundário, que se liga a um anticorpo anti-analito primário que está combinado com o analito, mas que não se liga ao anticorpo primário ou ao analito sozinhos (Ullman et al., 1993; Self et al., 1994; Towbin et al., 1995). Ullman et al., 1993 descreve um anticorpo que reconhece um complexo imune de uma anticorpo para tetrahidrocanabinol (THC). 0 anticorpo anti-IC foi obtido utilizando-se um anticorpo anti-IC rotulado por afinidade como imunógeno e selecionando-se um anticorpo anti-IC cuja ligação foi aumentada pela presença de A9THC. Self et al., 1994, utilizou o mesmo principio na preparação de anticorpos anti-IC para a determinação de digoxina. Towbin et al., 1995, reportou um imunoensaio sanduíche para angiotensina II haptênica, onde a imunização envolve tolerização com anticorpo primário não complexado antes da imunização com complexo anti-imune para obter os anticorpos anti-IC. Os anticorpos anti-IC utilizados em imunoensaios não competitivos para analítos pequenos têm sido até o momento anticorpos policlonais ou monoclonais obtidos por imunização, e os ensaios descritos aqui incluem a rotulagem do anticorpo primário e a imobilização do secundário ou vice-versa.

Um assim chamado imunoensaio não competitivo "idiométrico" para analitos pequenos foi desenvolvido por Mares et al., 1995. Utilizaram dois tipos de anticorpos anti-idiotípicos, que reconhecem diferentes epitopos dentro da região hipervariável do anticorpo primário especifico para oestradiol. 0 primeiro anticorpo anti-idiotipo (tipo beta) possui a capacidade de competir com o analito por um epitopo no sitio de ligação do anticorpo primário. 0 segundo anticorpo anti-idiotipo (tipo alfa) reconhece um epitopo dentro da região variável do anticorpo primário e a ligação não sensível à presença do analito. 0 tipo alfa é, no entanto, estericamente impedido de ligar-se ao anticorpo primário na presença do tipo beta. Estes três tipos de anticorpos permitem o desenvolvimento de um ensaio não competitivo para analitos pequenos.

Os assim chamados imunoensaios sanduíche foram desenvolvidos para a detecção de haptenos (Suzuki et al., 2000; Suzuki et al., 1999; Yokozeki et al., 2002). São ensaios não competitivos baseados em um fenômeno de acordo com o qual a associação de cadeias VH e VL separadas em alguns anticorpos é fortemente favorecida na presença do antígeno (Ueda et al., 1996).

Apesar dos benefícios significativos do formato de imunoensaio não competitivo, apenas alguns exemplos deste tipo de ensaio foram reportados. A razão para isto é mais provavelmente a dificuldade de se produzir anticorpos secundários (complexo anti-imune, ou anti-idiotípico) pela imunização de animais. Por exemplo, anticorpos monoclonais anti-hapteno, que foram desenvolvidos por tecnologia de hibridoma (Kohler e Milstein, 1995), são auto-antígenos para camundongos e obter-se resposta imune contra eles é difícil (Maruyama et al., 2002; Ullman et al., 1993; Kobayashi et al., 2000). Um problema adicional é o fato do complexo imune utilizado para a imunização tender a se desfazer antes da resposta ao complexo imune ser obtida {Ullman et al., 1993; Kobayashi et ai., 2000). A presente invenção provê agora um protocolo de imunoensaio não competitivo para analitos pequenos, que evita a imunização de animais com o complexo imune, o que tem sido até o momento a tarefa mais desafiadora quando do desenvolvimento de anticorpos anti-IC. A invenção facilita também um imunoensaio homogêneo, o que adicionalmente aumenta a velocidade, sensibilidade e simplicidade do ensaio.

Sumário da Invenção As dificuldades associadas com a criação de anticorpos anti-IC para utilização em imunoensaios para analitos pequenos podem agora ser evitadas provendo-se os anticorpos anti-IC necessários a partir de uma biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante no lugar de a partir de animais imunizados. Uma biblioteca de apresentação em fago pode ser construída contendo um vasto número de clones, dos quais aqueles codificando os parceiros ligantes desejados, tais como fragmentos de anticorpo, podem ser enriquecidos e selecionados através de prospecção seqüencial. Este protocole abre novas possibilidades para o desenvolvimento de imunoensaios rápidos, confiáveis e simples para analitos pequenos de uma forma custo efetiva e factível.

Conseqüentemenre, um objeto da presente invenção é um imunoensaio não competitivo para um analito pequeno compreendendo a reação de uma amostra contendo o dito analito com um par reativo compreendendo um primeiro parceiro ligante que se liga ao dito analito, e um segundo parceiro ligante que se liga ao complexo do dito analito e o dito primeiro parceiro ligante. 0 imunoensaio é caracterizado pelo falo do segundo parceiro ligante ser obtido a partir de uma biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante pela seleção de um parceiro ligante que se liga ao dito complexo do analito e primeiro parceiro ligante, e determinação da ligação do segundo parceiro ligante indicando assim a presença do analito na amostra.

Um outro objeto da invenção é um par reativo para um imunoensaio não competitivo para um analito pequeno, compreendendo um primeiro parceiro ligante que se liga ao dito analito, e um segundo parceiro ligante que sc liga ao complexo do dito analito e dito primeiro parceiro ligante, caracterizado pelo fato do segundo parceiro ligante ser obtido a partir de uma biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante pela seleção de um parceiro ligante que se liga ao dito complexo do analito e primeiro parceiro ligante.

Ainda um outro objeto da presente invenção é um kit dc teste para um imunoensaio não competitivo para um analito pequeno, o dito kit compreendendo um par reativo compreendendo um primeiro parceiro ligante que se liga ao dito analito, e um segundo parceiro ligante que se liga ao complexo do dito analito e o dito primeiro parceiro ligante, caracterizado pelo fato do segundo parceiro ligante ser obtido a partir de uma biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante pela seleção de um parceiro ligante que se liqa ao dito complexo do analito e primeiro parceiro ligante. A invenção se direciona também para o uso de um par reativo compreendendo um primeiro parceiro ligante que se liga a um analito, e um segundo parceiro ligante que se liga ao complexo do dito analito e c dito primeiro parceiro ligante, em um imunoensaio não competitivo,, pelo que o segundo parceiro ligante é obtido a partir de uma biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante pela seleção de um parceiro ligante que se liga ao dito complexo do analito e primeiro parceiro ligante.

Ainda um objeto adicional da invenção é um processo para a preparação de um par reativo para um imunoensaio não competitivo para um analito pequeno compreendendo prover-se um primeiro parceiro ligante que se liga ao dito analito, e um segundo parceiro ligante que se liga ao complexo do dito analito e dito primeiro parceiro ligante, caracterizado pelo fato do segundo parceiro ligante ser obtido a partir de uma biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante pela seleção de um parceiro ligante que se liga ao dito complexo do analito e primeiro parceiro ligante. A invenção provê também novas proteínas de ligação recombinantes, caracterizadas pelo fato de compreenderem uma parte de ligação a ligante do Ml Fab compreendendo as SEQ ID No.: 1 e a SEQ ID No.: 2; M2 Fab compreendendo a SEQ ID No.: 2 e a SEQ ID No.: 4; ou Kll scFv compreendendo a SEQ ID No.: 5. 0 DNA que codifica as novas proteínas de ligação bem como as células hospedeiras que os expressam são também incluídos na invenção.

Realizações vantajosas da invenção são apresentadas nas reivindicações dependentes.

Outros objetos, detalhes e vantagens da presente invenção se tornarão claros a partir dos desenhos, descrição detalhada e exemplos que se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1. Um ELISA competitivo utilizando Ml Fab. Urina+ é urina com 1 pg/ml de morfina.

Figura 2, Imunoensaio fluorescente não competitivo resolvido no tempo (TR-FIA) com o fragmento Kll scFv do complexo imune anti-Ml+morfina Eu rotulado. a) Reatividade cruzada e sensibilidade dc ensaio. b) Sensibilidade do ensaio com diluições de urina Sl de controle como amostras.

Figura 3. Um imunoensaio TR-FIA homogêneo para morfina.

Figura 4. Análise de reatividade cruzada do fragmento Fab Ml anti-morfina com codeina, heroina, noscapina e papaverina por um ELISA competitivo.

Figura 5. Um imunoensaio baseado em TR-FIA comparativo para morfina.

Descrição Detalhada da Invenção 0 par reativo para o imunoensaio não competitivo da invenção compreende um primeiro parceiro ligante e um segundo parceiro ligante. 0 primeiro parceiro ligante se liga ao analito para formar um complexo entre o primeiro parceiro ligante c o analito. 0 segundo parceiro ligante se liga ao complexo formado pelo primeiro parceiro ligante e o analito. Os parceiros ligantes são usualmente proteínas tais como anticorpos incluindo fragmentos de anticorpos que apresentam propriedades ligantes desejadas.

Ura anticorpo é uma molécula de imunoglobulina- e pode pertencer a qualquer uma das classes IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD; IgG e IgM sendo os mais freqüentemente utilizados. Preferivelmente os parceiros ligantes são fragmentos de anticorpos compreendendo o sítio de ligação a ligantes, tal como Fab ou fragmentos de scFv. O fragmento conhecido como fragmento Fab (fragmente de ligação a antígeno) consiste nos domínios variável e constante de uma cadeia leve se imunoglobulina covalentemente ligada por uma ponte de dissulfeto ao domínio variável e primeiro domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Fv (domínio variável) significa as regiões variáveis da molécula de imunoglobulina que são responsáveis pela ligação a ligante. ScFv (Fv de cadeia única) significa uma molécula em que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo estão ligadas por um peptídeo para formar uma cadeia polipeptídica única sintetizada a partir de uma molécula de mRNA única. As regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de imunoglobulina em conjunto são responsáveis pela ligação a ligante. Ligante é a substância à qual o parceiro ligante se liga, em conexão com anticorpos é um antígeno ou hapteno. 0 primeiro parceiro ligante pode ser um anticorpo políclonal ou monoclonal convencional ou um seu fragmento, mas preferivelmente é um recombinante, assim como o é o segundo parceiro ligante. Quando o primeiro parceiro ligante foi selecionado, é complcxado com seu ligante e este complexo é utilizado para selecionar o segundo parceiro ligante a partir de uma biblioteca recombinante. 0 primeiro parceiro ligante sem o ligante é utilizado como contra-seleção. 0 segundo parceiro ligante deveria reconhecer apenas complexos, não parceiro ligante livre nem antígeno livre dentro de um limite significativo. A biblioteca de parceiro ligante recombinante convencionalmente é uma biblioteca de expressão, a qual tipicamente é uma biblioteca de apresentação. 0 principio geral das bibliotecas de apresentação em parceiro ligante recombinante é aquela que apresenta o parceiro ligante como uma proteína de fusão na superfície, que pode ser a superfície de uma célula microbiana como uma célula de levedura ou bacteriana, ou um fago. A biblioteca de apresentação em parceiro ligante recombinante pode também ser uma biblioteca de apresentação, onde complexos estáveis de proteína em crescimento e mRNA são produzidos em um sistema de expressão in vitro. Bibliotecas de apresentação em fago são as mais freqüenteraente utilizadas. Tecnologia de anticorpo de apresentação em fago e suas aplicações são descritas, por exemplo, em Hoogenboom et al., 1998.

Uma biblioteca de anticorpo de apresentação em fago pode ser construída pela clonagem de cDNAs que codificam domínios de imunoglobulina em urn vetor de apresentação era fago apropriado. DNA que codifica para milhões de variantes de fragmentos de anticorpo é clonado em batelada no vetor como parte da proteína da cápsula do fago. Grandes bibliotecas contendo milhões de fragmentos de anticorpos com diferentes especificidades podem ser obtidas pela transformação dos vetores en bactérias. 0 cultivo das bactérias leva à expressão dos fagos apresentando os fragmentos de anticorpo em sua superfície. 0 gene para o anticorpo apresentado é conduzido no genoma do fago, desta forma ligando o genótipo com o fenótipo. A ligação física entre a proteína apresentada e seu DNA permite a varredura de vastos números de variantes da proteína, cada uma ligada a seu DNA correspondente, por um procedimento de seleção in vitro único chamado de prospecção. Em sua forma mais simples, a prospecção é realizada pela incubação do pool de variantes de fago apresentadas com os ligantes de interesse que foi imobilizado em um veículo, descartando-se por lavagem o fago não ligado, e eluindo fago ligado especificamente pela ruptura da ligação ao lígante. 0 fago eluído é então amplificado in vivo. 0 processo é repetido várias vezes, resultando no enriquecimento gradual do pool de fagos em favor das seqüências de ligação mais fortes. Após cerca de 3 a 6 rodadas de seleção e amplificação, as melhores clones são seqüenciados e transformados em uma célula hospedeira para expressão posterior. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica ou procariótica, por exemplo, uma célula de levedura, animal, planta ou de inseto ou uma célula bacteriana. Pode mesmo ser uma célula de hibrídoma, a qual após transformação produz um anticorpo monoclonal recombinante. 0 parceiro ligante recombínante ou pelo menos parte deste pode tambcm ser produzido sinteticamente. 0 conceito para a utilização de bibliotecas de anticorpo recombinante torna o ensaio não competitivo sanduíche para analitos pequenos factível. 0 sanduíche pode ser detectado por todos os imunoensaios padrão. Usualmente um parceiro é imobilizado em um suporte, tal como um poço de micro-título ou uma pérola. Um sanduíche é formado na presença de analito e do outra parceiro ligante. 0 sanduíche pode ser detectado, por exemplo, pela utilização de anticorpos secundários ou pela rotulagem de pelo menos um dos parceiros ligantes. 0 rótulo pode ser qualquer rótulo convencional, tal como um rótulo radioativo, uma enzima, ou um composto fluorescente. 0 ensaio pode ser, por exemplo, ELISA ou FIA.

Uma grande vantagem do par reativo da presente invenção é que possibilita um imunoensaio não competitivo homogêneo, isto é, um imunoensaio que é conduzido em solução. A eliminação das etapas de imobilização e lavagem torna o ensaio extremamente simples. Tal teste é também adequado para teste no local, isto é, em quaisquer locais outros que não o laboratório.

Um imunoensaio homogêneo preferido é aquele baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), para uma revisão ver Szõllõsi et al. , 1998. Na FRET, a energia de um fluoróforo molecular (doador) é excitada para um estado de alta energia e transferida para um outro fluoróforo (receptor) por meio de acoplamento dipolo-dipolo intermolecular. Isto é possível apenas se a distância entre o doador e o receptor é pequena (10-100 Ã) e o espectro de fluorescência do doador e o espectro de absorção do receptor se sobreponham parcialmente. a transferência de energia é então detectada como uma alteração na fluorescência. Freqüentemente é utilizado fluorescência resolvida no tempo (Hemmilã et al,, 1988). FRET é aplicada à presente invenção pela rotulagem dos dois parceiros ligantes, que são fragmentos de anticorpo, com fluoróforos que formam um par doador-receptor de FRET. Quando os parceiros ligantes e o analito são pequenos os fluoróforos ficam muito próximos, e um sinal FRET mensurável é obtido. A invenção provê uma ferramenta analítica conveniente e rápida para analitos de baixo peso molecular, tais como drogas terapêuticas c de abuso, esteróides, hormônios, metabólitos, e poluentes ambientais e toxinas. Uma característica comum destes pequenos analitos é que são muito pequenos para ensaios sanduíche convencionais onde são utilizados dois anticorpos que reconhecem diferentes epítopos do antígeno. 0 peso molecular destes pequenos analitos normaImente é menor que 5000, mas os limites não são absolutos. O imunoensaio pode ser empregado cm todos os tipos de investigação, tais como na detecção de perigos ambientais, compostos tóxicos em alimentos e alimentação, compostos químicos indicativos de processos em andamento, por exemplo, processos microbiológicos em construções, processos metabólicos de organismos vivos, e em testes clínicos, monitoramento de drogas e pesquisa farmacológica. Os ensaios são extremamente adequados para a detecção de drogas de abuso, tais como opiatos (por exemplo, morfina), anfetaminas, canabinóides (por exemplo, tetrahidrocanabinol (THC)), barbituratos, benzodiazepinas, cocaína, LSD, metadona, metaqualona, fenciclidina, propoxifeno, antidepressivos tricíclicos. O ensaio homogêneo provê uma ferramenta excelente e conveniente para testes no local, por exemplo, para ser utilizada pela policia em inspeções a motoristas, etc. A amostra a ser analisada, por exemplo, para drogas e drogas de abuso pode ser qualquer amostra de fluido corporal, tal como sangue, soro, urina ou saliva. 0 par reativo da invenção pode ser incluído em um kit de teste. Este kit de teste pode ainda compreender quaisquer outros reagentes necessários para o ensaio, tais como soluções reativas, tampões, soluções de lavagem e meios de detecção, tais como rótulos e opcionalmente um fluorômetro. Preferivelmente o kit de teste compreende pares reativos múlriplos fisicamente separados entre si, por exemplo, vários na forma um micro-conjunto, pelo que muitas drogas de abuso diferentes podem ser testadas simultaneamente a partir de uma amostra única de saliva.

Em uma realização especial da invenção, é produzido um par reativo para detectar morfina e empregado em um imunoensaio homogêneo para a dita substância. 0 primeiro parceiro ligante é um fragmento Fab obtido a partir de um biblioteca de anticorpo de apresentação em fago produzida a partir de cDNA de um camundongo imunizado com morfina conjugada a um veículo imune BSA. Fagos anticorpos específicos para morfina foram enriquecidos pela seleção daqueles ligantes a morfina conjugada com BSA e separando-se aqueles ligantes apenas a BSA. Após várias rodadas de prospecção foram seqüenciados e expressados dois clones de alta ligação. Os fragmentos Fab expressos foram chamados de Ml Fab e M2 Fab. 0 segundo parceiro ligante é obtido a partir de uma biblioteca de apresentação em fagc de fragmento de anticorpo scFv virgem pela seleção de anticorpos que se ligam a um complexo de morfina e Ml Fab. Inícíalmente os fagos são pré-incubados com Ml Fab ligado para separar aqueles que se ligam a Ml Fab como tal. Os fagos não ligados são separados e incubados com uma mistura de morfina e Ml Fab imobilizado para selecionar cs fagos que se ligam ao complexo imune formado entre o Ml Fab imobilizado e a morfina. Fagos não ligados são descartados por lavagem, e então aqueles ligados ao complexo são eluidos. O fundo é monitorado verificando-se a ligação ao Ml Fab na ausência de morfina. Após várias rodadas de prospecção é tomado, seqücnciado e expresso um número de clones resultando no fragmento Kll de scFv.

Um imunoensaio baseado em fluorescência é realizado utilizando-se Ml Fab rotulado com európio como um primeiro parceiro ligante, e o fragmento Kll de scFv rotulado com Cy5 como um segundo parceiro ligante. Os parceiros ligantes são incubados com amostras de saliva ou urina contendo morfina e então a fluorescência é medida após um tempo determinado. 0 ensaio é completamente homogêneo e o sinal é legível em cerca de 5 minutos. A sensibilidade tar.to para urina quanto para saliva é claramente mais alta que a requerida pelas autoridades no caso de morfina, nosso analito modelo. A realização do teste é tal que os reagentes ficam no poço de uma placa micro-título e séries de diluição ou de saliva ou de urina são adicionadas. Em um modo preferido, por exemplo, para utilização no campo policial, os reagentes estão na forma seca em um recipiente. A saliva é adicionada, o que dissolve os reagentes e o resultado pode ser lido sem processos adicionais.

As novas proteínas de ligação recombinantes providas pela invenção compreendem qualquer parte de ligação a ligante de Ml Fab, M2 Fab ou Kll de scFv. Por "parte de ligação a ligante" quer-se dizer a parte da molécula que é responsável pela ligação. Variações e modificações menores das sequências apresentadas na descrição e reivindicações recaem ainda no escopo da invenção, desde que não afetem a atividade ligante das proteínas. A invenção é ilustrada pelo exemplo não limitante a seguir. Deve-se entender, no entanto, que as realizações dadas na descrição acima e nos exemplos têm propósito apenas ilustrativo, e que várias alterações e modificações são possíveis dentro do escopo da invenção.

Exemplo 1 Desenvolvimento de um anticorpo anti-morfina Imunização de camundonqos Quatro fêmeas de seis semanas de idade de camundongos Balb/c foram imunizadas em intervalos de três semanas com conjugado morfina-BSA (Fitzgerald) em adjuvante de Freund. Amostras de soro foram testadas após uma segunda amplificação e o camundongc mostrando a melhor resposta contra o antígeno era ELISA direto foi selecionado como fonte de uma biblioteca de apresentação em fago de anticorpo.

Construção da biblioteca de apresentação em fago de anticorpo Todos os métodos de DNA recombinante básicos foram realizados essencialmente como descrito (Sambrook et al., 1990;. O camundongo com a resposta de anticorpo mais alta ao conjugado morfina-BSA foi sacrificado e o RNA total foi isolado das células do baço utilizando-se o sistema de isolamento de RNA total RNAgentes® (Promega Co., WI, EUA). O pool de mRNA do RNA total foi isolado cora o kit de raRNA Oiiqotex (QIAGEN Inc., Alemanha). 0 cDNA foi sintetizado a partir do mRNA com iniciador oligo-dT. Genes que codificam fragmentos Fab do anticorpo foram amplificados com PCR utilizando-se iniciadores específicos da cadeia leve e cadeia pesada kapa da reqião variável e da região constanre do anticorpo. Os produtos de PCR da cadeia leve do anticorpo foram reunidos e digeridos com as enzimas de restrição Nhel e Asei, purificados por gel de agarose preparativo em combinação com o kit de extração QIAquick Gel (QIAGEN Inc., Alemanha). 0 DNA de cadeia leve do anticorpo purificado foi ligado no vetor fagomídeo Fab phagemid9 derivado do pCom3 {Barbas et al., 1991) e transformado na cepa XL-Blue de E. coli (Stratagene) por eletroporação. 0 DNA plasmidial foi isolado com o kit QIAGEN Plasmid Midi (QIAGEN Inc., Alemanha) a partir da cultura de uma noite. Os produtos de PCR codificando a região Fd (região variável e primeira constante) da cadeia pesada foram reunidos e digeridos com as enzimas de restrição Sfil e Notl, purificados por isolamento em gel de agarose preparativo e ligados ao vetor fagomídeo contendo o DNA de cadeia leve. 0 vetor fagomídeo foi transformado na bactéria E. coli TOP10F' (Invítrogen Inc., CA, EUA) por eletroporação. As bactérias transformadas foram incubadas por uma noite a +37°C em um agitador e o DNA plasmidial foi isolado com o kit QIAGEN Plasmid Midi. A diversidade da biblioteca de anticorpo foi assegurada pelo seqüenciamento parcial das regiões VL ou VH do gene de clones individuais.

Uma biblioteca de anticorpo de apresentação em fago foi produzida como se segue: 4 pg de DNA plasmidial da biblioteca de anticorpo foram transformados em E. coli TOPIOF' por eletroporação em duas transformações paralelas.

Após as transformações, as células foram suspensas em 2,8 ml de meio SOC e incubadas por lha +35°C em um agitador. Foram adicionados 7 ml de meio SB pré-aquecido (+37°C) , 20 pg/ml de carbenicilina, e 10 pg/ml de tetraciclina. Após incubação por lha +35°C em um agitador, foram adicionados 30 pg/ml de carbenicilina e a incubação foi mantida por 1 h, após o que foi adicionado 1 ml (-1011 pfu) de fago helper VCS-M13 (Strategene) e permitiu-se que os fagos infectassem as bactérias por 20 minutos a +35°C com agitação lenta. As transformações paralelas foram reunidas e foram adicionados 80 ml de meio SB pré-aquecido (+35°C) com 50 pg/ml de carbenicilina e 10 pg/ml de tetraciclina. Após incubação por 2 h a +35°C em um agitador, foram adicionados 70 pg/ml de kanamicina e a incubação foi mantida por uma noite.

As células foram centrifugadas por 15 minutes a 4000 g a +4°C. Foram adicionados 20 ml de P£G 20%, NaCl 2,5 M (PEG/NaCl) ao sobrenadante e este foi incubado por 30 minutos em gelo. Os fagos precipitados em PEG foram centrifugados por 20 minutos a 13000 g a +4°C. O pelete foi suspenso em 2 ml de PBS e 1 ml foi transferido para dois tubos eppendorf. Após centrifugação por 5 minutos a +40C, os fagos foram precipitados pela adição de 200 pl de PEG/NaCl ao sobrenadante. A solução foi misturada e centrifugada por 5 minutos a +4°C. 0 pelete foi suspenso em 1 ml de PBS ou PBS+BSA 1%. Foi adicionado 1 pl de Na-azi.da 20% como preservante. A biblioteca de anticorpo de apresentação em fago foi armazenada a +4°C.

Seleção da biblioteca anti-merfina Anticorpos específicos para morfina foram selecionados a partir da biblioteca de anticorpo de apresentação em fago pelo seguinte procedimento de seleção: Um poço de micro-rítulo foi revestido por uma noite a +4°C com 1 pg de morfina conjugada com BSA (morfina-BSA; Fitzgerald Industries International, Inc., MA, EUA) em 100 μΐ de tampão bicarbonato de sódio 100 mM, pH 9,8. 0 poço foi lavado duas vezes com PBS e bloqueado com BSA 1% em PBS por lha +37°C. 100 μΐ da biblioteca de fago foram incubados no poço por 1 h à temperatura ambiente sob agitação, após o que os fagos não ligados foram removidos e o poço foi lavado 22 vezes com PBS. Os fagos ligados foram eluidos com 100 μΐ de HC1 100 mM (pH 2,2) por 15 minutos. Os fagos eluidos foram removidos do poço e neutralizados com Tris 1M. 3 ml de células de E. coli XLl-Blue (ODgoo^l) crescidas en SB suplementado com 10 pg/ml de tetraciclina foram infectadas com os fagos eluidos a +35°c por 15 minutos. 7 ml de SB pré-aquecido ( + 37°c) com 20 pg/ml de carbenicilina e foram adicionados 10 pg/ml de tetraciclina e a cultura foi incubada por 1 hora a +35°C em um agitador. Foram adicionados 30 pg/ml de carbenicilina e a incubação foi mantida por 1 h. Foi adicionado 1 ml de fago helper VCS-M13 à cultura que foi incubada a +35°c por 15 minutos com agitação lenta. A cultura foi diluída com 90 ml de SB pré-aquecido (+37°C) com 50 pg/ml de carbenicilina e 10 pg/ml de tetraciclina. Após incubação por 2 h a +35°C em um agitador, foran adicionados 70 pg/ml de kanamicina e a incubação foi mantida por uma noite. A purificação dos fagos amplificados foi realizada por precipitação em PEG conforme descrito acima.

Os fagos purificados foram utilizados em rodadas de enriquecimento posteriores. Após quatro rodadas de seleção, os fagos anticorpos específicos para morfina haviam sido enriquecidos em cerca de 1000 vezes em comparação com o fundo. A ligação de fundo dos fagos foi monitorada em paralelo em cada rodada de seleção pela incubação da biblioteca de fago em um poço micro-título revestido com BSA. 0 poço foi lavado e os fagos foram oluídos como no poço revestido com morfina-BSA. O enriquecimento dos fagos específicos para morfir.a foi monitorado por comparação da quantidade dos fagos eluídos a partir do poço revestido com morfina-BSA com a quantidade de fagos eluídos a partir do poço de fundo.

Caracterização dos clones individuais Após a quarta rodada de prospecção, o DNA fagomídeo foi isolado com o kit QIAGEN Plasmid Midi. 0 plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição Nhel e Notl para isolar o fragmento Fab do gene. O DNA isolado em gel de agarose foi ligado ao vetor de expressão PKKtac. A reação de ligação foi transformada em células de E. coli XLl-Blue.

Clones individuais foram tomados e o DNA de miniprep foi extraído com o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Alemanha). De acordo com o seqüenciamento das miniprep, deis clones Fab diferentes foram encontrados. Estes clones foram nomeados como Ml e M2. As seqiiências de aminoácidos do fragmento Ml Fab foram as SEQ ID No. ; 1 (cadeia leve) e SEQ ID No.: 2 (cadeia pesada). Os aminoácidos n° 3 a 108 representam a região variável e os de n° 109 a 215 a região constante da cadeia pesada do Ml (SEQ ID No.: 1). Os aminoácidos n° 4 a 123 representam a região variável e os de n° 124 a 226 a região constante da cadeia pesada do Ml (SEQ ID No.: 2). As sequências de aminoácidos do fragmento Μ2 Fab foram as SEQ ID No.: 3 (cadeia leve) e a SEQ ID No.: 4 (cadeia pesada). Os aminoácidos n° 3 a 108 representam a região variável e os de n° 109 a 215 a região constante da cadeia leve do M2 (SEQ ID No. : 3). Os aminoácidos de n° 4 a 123 representam a região variável e os de n° 124 a 226 a região constante da cadeia pesada do M2 (SEQ ID No.: 4). O restante dos aminoácidos derivam da técnica de clonagem, e alguns dos aminoácidos do terminal C facilitam o isolamento e purificação da proteína. Culturas de expressão Fab em pequena escala (3 ml) foram também produzidas. A fração periplasmática das células foi isolada por congelamento e descongelamento das células por três vezes em PBS.

A ligação dos clones Fab individuais à morfina foi testada por ELISA em poços mícro-título revestidos com morfina-BSA: poços micro-título foram revestidos com 200 ng de morfina-BSA em tampão de bicarbonato de sódio 0, 1 M, pH 9,8 por uma noite a +4°C. Poços de controle foram preenchidos apenas com o tampão. Após o revestimento, os poços foram lavados três vezes com PBS e bloqueados com BSA 5 % em PBS (BSA/PBS) por lha temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com PBS e foi adicionada uma diluição 1:10 das frações periplasmátícas em poços em 100 μΐ de BSA/PBS. Após incubação por lha temperatura ambiente em um agitador, os poços foram lavados três vezes com PBS e foi adicionado anticorpo específico Fab anti-camundongo conjugado com fosfatase alcalina diluido 1:2000 {Sigma, A-1293) em 100 μΐ de BSA/PBS. Os poços foram incubados por lha temperatura ambiente em um agitador e lavados três vezes com PBS. Foram adicionados 100 μΐ de solução substrato de fosfatase alcalina (2 pg/ml de sal dissódico de p-nitrofenilfosfato em tampão dietanolamina-MgCl] aos poços e a absorbância foi medida. De acordo com os resultados preliminares, o Ml Fab mostrou uma performance melhor no ensaio e desta forma foi escolhido para a continuação.

Fermentação e purificação 0 fragmento Fab anti-morfins Ml no vetor de expressão pKKtac foi transformado na cepa de expressão RV308 de E. coli. 0 Fab foi expresso por fermentação com alimentação em batelada em um fermentador Bio-Flow IV (New Brusnwick) e purificado pela sefarose SP de troca iônica e cromatografia de proteína G (Pharmacia].

Performance do anticorpo primário em um imunoensaio competitivo A performance do fragmento Fab antí-morfina Ml foi testada em um ensaio ELISA competitivo utilizando-se controles de toxicologia de urina comerciais SI e S3 (Bio-Rad). 0 controle de toxicologia de urina SI contém drogas e metabólitos de drogas [incluindo morfina) a concentrações 20-25% abaixo dos níveis de corte do imunoensaio conforme recomendado pelo U.S. Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMSHAM) e outras agências. O controle de toxicologia de urina S3 contém drogas e metabólitos de drogas a concentrações aproximadamente três vezes os níveis de corte ao imunoensaio. Poços irticro-título foram revestidos por uma noite a +4°C com 500 ng de norfina-BSA em 100 μΐ de tampão de bicarbonato de sódio, pH 9,8. Os poços foram lavados três vezes com PBS e bloqueados com BSA/PBS por lha temperarura ambiente. Após três lavagens com PBS, foram adicionados aos poços Sl, S3 (Bio-Rad), diluições de urina como controle positivo, ou controle negativo em 100 μΐ de BSA/PBS adicionados de 1 ng de Ml Fab. Os poços foram incubados por 2 h a temperatura ambiente em um agitador e lavados três vezes com PBS. Anticorpo anti-Fab conjugado com fosfatase alcalina diluída 1:2000 (Sigma, a-1293) foi adicionado aos poços em 100 μΐ de BSA/PBS que foram incubados por lha temperatura ambiente em um agitador. Os poços foram lavados três vezes com PBS, foram adicionados 100 μΐ de solução substrato de fosfatase alcalina e foi determinado o A405· Os resultados são mostrados na Figura 1. Um resultado positivo pode ser alcançado com uma diluição 1:64 da amostra.

Desenvolvimento de um anticorpo anti-complexo imune específico para o complexo imune de Ml Fab e morfina Seleção do anticorpo específico para o complexo imune de uma biblioteca de apresentação em faqo de scFv humano virgem 0 fragmento Ml Fab foi biotinilado com o kit ImmunoPure Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce). O anticorpo biotinilado foi purificado e o tampão foi trocado para PBS com colunas Econo-Pac 10DG (Bio-Rad, CA, EUA) . 200 μΐ de uma biblioteca de apresentação em fago de scFv humano virgem (cadeia leve kapa ou lambda) em BSA/PBS foram pré-incubados com 10 μΐ de pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal, M-280) e 0,5 pg de Ml Fab biotinilado por uma noite a +4°C. A biblioteca de apresentação em fago de scFv humano virgem foi construída a partir de linfócitos reunidos de 50 indivíduos saudáveis. O tamanho da biblioteca foi estimado como sendo de 1 x 108 clones. A biblioteca de apresentação em fago de scFv humano virgem contém os genes VH específicos de IgM combinados com os genes VL específicos ou kapa ou lambda. Fagos não ligados foram separados das pérolas e 100 μΐ deles foram incubados com 100 ng de morfina, 500 ng de Ml Fab biotinilado, e 5 μΐ de pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina por lha temperatura ambiente em um agitador. O fundo para o procedimento de seleção foi implementado de forma similar, mas omitindo-se a morfina da reação de ligação. As pérolas magnéticas foram lavadas cinco vezes com 0,5 ml de PBS e os fagos não ligados foram eluídos com 100 μΐ de HC1 (pH 2,2) por 30 minutos. Os fagos eluídos foram neutralizados com Tris 1M e células de E. coli XLl-Blue foram infectadas. As células foram crescidas e os fagos foram purificados como descrito previamente. Após cinco rodadas de prospecção foi observado enriquecimento para a biblioteca de scFv apresentando as cadeia leves kapa, quando a quantidade de fagos eluídos foi comparada com a quantidade de fagos eluída do poço de controle de fundo. O enriquecimento dos ligantes específicos para o complexo imune, formado pelo Ml Fab e morfina, foi também claramente observado em um ELISA de fago quando os pools de fagos eluídos das rodadas de seleção foram testados.

Caracterização dos clones individuais Clones do fago individuais foram tomados e foram seqüenciados. Todos os clones apresentaram a mesma seqüência (SEQ ID No.: 5). A seqüênc.ia de aminoácidos do fragmento scFv do complexo imune anti-Ml + morfina foi nomeado Kll scfv. Os aminoácidos n° 3 a 120 representam a região variável da cadeia pesada, os de n° 140 a 246 representam a região variável da cadeia leve, e os de n° 121 a 139 representam o ligante de Kll scFv (SEQ ID No. : 5). 0 restante dos aminoácidos derivam da técnica de clonagem, e alguns dos aminoácidos do terminal C facilitam o isolamento e purificação da proteína.

Expressão e purificação 0 gene codificador do fragmento Kll de scFv foi inserido no vetor de expressão pKKtac e transformado na cepa RV308 de E. coli. As células foram inoculadas em 20 ml de LB com 100 pg/ml de ampicilina e foram incubadas por uma noite a +37°C em um agitador. A partir da cultura de uma noite, 10 ml do inoculado foram adicionados em dois frascos erlenmeyer contendo 500 ml de LB com 100 pg/ml de ampicilina. As células foram incubadas a +37°C em um agitador até uma OD600 de 1, após o que 0,5 ml de IPTG 1M e 100 pg/ml de ampicilina foram adicionados à cultura e a incubação foi mantida por uma noite a +30°C em um agitador. Tanto o sobrenadante do meio de cultura e a fração periplasmática das células foram utilizados para a purificação do scFv Kll. As células foram centrifugadas a 4000 g por 15 minutos e o sobrenadante foi derramado em um frasco limpo. As células foram re-suspendidas em 2C ml de PBS. A fração periplasmática das células foi isolada por congelamento (-70°C) c descongelamento (+37°C) das células por três vezes. Após centrifugação a 12000 g por 30 minutos, o sobrenadante periplasmático claro foi tomado. O meio de cultura e a fração periplasmática foram tratados com 2 mg/ml de DNAsel para remover o DNA cromossômico residual por duas horas a +37°C. Uma vez que o scFv Kll expressado apresenta um 6xHis-tag em seu terminal C, pode ser purificado por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC). 0 scFv Kll foi purificado por cromatografia em leito expandido utilizando quelante STREAMLINE (Amersham Pharmacia Bíotech) como matriz e cobre como quelato metálico.

Desenvolvimento de vim imunoensaio não competitivo para morfina Rotulagem do anticorpo anti-complexo imune scFv Kll com európio 0 fragmento scFv Kll do complexo imune anti-Ml e morfina foi rotulado com quelato de európio com o kit DELFIA Eu-Labelling [Wallac) como descrito pelo fabricante. 0 tampão do scFv Kll rotulado foi trocado para Tris 50 mM pH 7,8, NaCl 0,9%. O rendimento de rotulagem foi de 0,4 Eu/scFv.

Imunoensaio nãc· competitivo para morfina A sensibilidade e reatividade cruzada do scFv Kll foram estudadas por um imunoensaio não competitivo. Poços micro-título transparentes Streptwell (Roche) revestidos com estreptavidina foram lavados três vezes com PBS. Foram adicionados 500 ng de Ml Fab anti-morfina biotinilado aos poços em 100 μΐ de BSA/PBS e os poços foram incubados por 30 minutos a temperatura ambiente em um agitador. Após três lavagens com PBS, diluições da amostra contendo morfina, anfetamfna, tetrahidrocanabinol (THC) ou urina Sl de controle foram adicionados aos poços em 50 μΐ de BSA/PBS. ScFv Kll rotulado com európio diluído a 1:100 foi adicionado aos poços em 50 μΐ de BSA/PBS e a incubação foi mantida por 1 h. Os poços foram lavados três vezes com PBS e foram adicionados 100 μΐ dc solução de amplificação (Wallac) aos poços. Após 15 minutos sob agitação a temperatura ambiente, a florescência foi detectada por fluorômetro VictorV (Wallac). Os resultados são mostrados na Figura 2. Há uma diferença significativa na afinidade entre o ligante do scFv Kll e o fragmento Ml do anticorpo primário para o complexo imune Ml e morfina. Isto permite a detecção de 1 ng/ml de morfina na amostra. Nenhuma reatividade cruzada com anfetamina ou THC foi detectada.

Transferência de energia de ressonância fluorescente resolvida no tempo homogênea (TR-FRET) 0 fragmento Ml Fab anti-morfina foi rotulado com európio pelo kit de quelato LANCE Eu-Wl024 ITC (Wallac). 0 tampão do Ml rotulado foi trocado para Tris 50mM, pH 7,8, NaCl 0,9%. O rendimento de rotulagem foi de 1,1 Eu/Fab, O fragmento scFv Kll do complexo imune anti-Ml + morfina foi rotulado com Cy5 pelo kit de rotulagem FluoroLink-Ab Cy5 [Amersham Pharmacia Biotech). O rendimento de rotulagem foi de 2 Cy5/scFv.

Saliva foi adicionada de várias diluições de morfina e estas amostras foram filtradas através de tecido de algodão antes da adição a poços mic.ro-título pretos (Nunc) . 1 pg de Ml Fab rotulado com európio e 1 ug de scFv Kll rotulado com Cy5 foram adicionados aos poços em 50 μΐ de BSA/PBS. A TR-FRET foi lida após 5, 15, 30 ou 60 minutos de incubação a temperatura ambiente por fluorômetro VictorV (Wallac). Os resultados são mostrados na Figura 3. Após cinco minutos de incubação, 1 ng/ml de morfina na saliva foi detectado.

Apesar de ter sido descrita uma estratégia para prover reagentes e ensaios da invenção, numerosas variações e modificações serão óbvias ao um especialista na técnica.

Exemplo 2 Reatividade cruzada do fragmento Ml Fab com codeina, heroina, noscapina e papaverina A reatividade cruzada do fragmento Ml Fab anti-morfina com codeina, heroina, noscapina e papaverina foi testada em um ELISA competitivo. Poços de placa micro-título foram revestidos o/n a +4°C com 500 ng de morfina-BSA em 100 μΐ de tampão de bicarbonato de sódio, pH 9,8. Os poços foram lavados três vezes com PBS e bloqueados com BSA/PBS 0,51 por lha temperatura ambiente e lavados novamente três vezes com PBS. Duas amostras de 100 μΐ paralelas contendo morfina, codeina, heroína, noscapina ou papaverina (39, 78, 156, 313, 625, 1250, 2500 ou 5000 ng/ml) em PBS com 5 ng de Ml Fab purificado foram adicionadas aos poços e incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente em um agitador e lavadas três vezes com PBS. Anticorpo anti-Fab conjugado com fosfatase alcalina (Sigma, A-1293) diluída 1:2000 foi adicionado aos poços em 100 μΐ de BSA/PBS 0,5% e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente em um agitador. Os poços foram lavados três vezes com PBS, foram adicionados ICO μΐ de solução substrato de fosfatase alcalina e ο A4Ü5 foi medido. Os resultados são mostrados na Figura 4. De acordo com o resultado de ELISA competitivo, o anticorpo Ml apresenta alta reatividade cruzada para codeina e heroína, que são estruturalmente muito semelhantes à morfina.

Imunoensaio por transferência de energia de ressonância fluorescente resolvida no tempo homogênea (TR-FRET) para morfina 0 fragmento Ml Fab antí-morfina foi rotulado com európío pelo kit de quelato LANCE EU-W1024 ITC (Wallac). 0 tampão do Ml roculado foi trocado para Tris 50mM, pH 7,8, NaCl 0,9%. O rendimento de rotulagem foi de 1,1 Eu/Fab. O fragmento scFv Kll do complexo imune anti-Ml + morfina foi rotulado com Cy5 pelo kit de rotulagem FluoroLink-Ab Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech}. O rendimento de rotulagem foi de 2 Cy5/'scFv.

Saliva foi adicionada de uma alta concentração (10 pg/ml) das seguintes drogas: morfina, heroina, codeina, papaverina e noscapina. As amostras foram filtradas através de um tecido de algodão antes de sua adição de a poços micro-título pretos (Nunc). 1 pg de Ml Fab rotulado com európío e 1 pg de scFv Kll rotulado com Cy5 foram adicionados aos poços em 50 μΐ de BSA/PBS. Como controle foi medida a fluorescência de fundo de um par anticorpo Ml e Kll sem qualquer adição de droga. A TR-FRET foi lida após 5 minutos de incubação a temperatura ambiente pelo fluorômetro VictorV (Wallac). Os resultados são mostrados na Figura 5.

Amostras de saliva conrendo morfina apresentam um valor de fluorescência alto, enquanto que as outras drogas apresentam valores de fluorescência que são semelhantes à fluorescência de fundo detectada dos controles (Ml e fragmentos scFv Kll rotulados sem a adição de qualquer droga). 0 scFv Kll se liga ao complexo imune formado entre Ml e morfina com especificidade extremamente alta. 0 Kll é capaz de discriminar completamente o complexo imune Ml e morfina dos complexos imune entre Ml e heroína ou Ml e codeína, que apresentaram valores de fluorescência correspondendo ao nível de fundo.

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REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1 . Imunoensaio não competitivo para um analito de menos do que 5000 Da compreendendo a reação de uma amostra contendo o dito analito com um par reativo que compreende um primeiro parceiro de ligação que se liga ao dito analito, e um segundo parceiro de ligação que se Liga ao complexo do dito analito e o dito primeiro parceiro de ligação, e determinação da ligação do segundo parceiro de ligação, caracterizado pelo fato de obter-se o dito segundo parceiro de ligação de uma biblioteca de apresentação em parceiro de ligação recombinante pela seleção de um parceiro de ligação que se liga ao dito complexo do analito e primeiro parceiro de ligação.

2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos primeiro e segundo parceiros de ligações serem selecionados de fragmentos Fab e scFv de anticorpo.

3. Ensaio, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato do dito ensaio ser um ensaio homogêneo.

4. Ensaio, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do dito ensaio ser baseado em transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET-J .

5. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do analito· ser uma droga de abuso.

6. Ensaio, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do analito ser morfina, tetrahidrocanabinol (THC) ou amfetamina.

7. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do segundo parceiro de ligação compreender uma parte de ligação a ligante de Kll scFv compreendendo SEQ ID NO 5.

8. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizado pelo fato do primeiro parceiro de ligação compreender uma parte de ligação a ligante de Ml Fab compreendendo SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, ou de M2 Fato compreendendo SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4.

9. Ensaio, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato da dita parte de ligação a ligante do primeiro parceiro de ligação ser formada por amino ácidos nE 3 a 108 de SEQ ID NO 1, e amino ácidos na 4 a 123 de SEQ NO 2; ou de amino ácidos nH 3 a 108 de SEQ ID NO 3, e de amino ácidos na 4 a 123 de SEQ ID NO 4; e do segundo parceiro de ligação por amino ácidos n* 3 a 120 e ne 140 a 246 de SEQ ID NO 5.

10. Processo para a preparação de um par reativo para um imunoensaio não competitivo para um analito de menos do que 5000 Da, que compreende prover um primeiro parceiro de ligação que se liga ao dito analito, e um segundo parceiro de ligação que se liga ao complexo do dito analito e o dito primeiro parceiro de ligação, caracterizado pelo fato do dito segundo parceiro de ligação ser obtido de uma biblioteca de apresentação de parceiros de ligações recombinantes pela seleção de um parceiro de ligação que se liga ao dito complexo do analito e primeiro parceiro de ligação,

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato dos fragmentos dê anticorpo recombinantes serem preparados a partir de uma biblioteca de apresentação em fago.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato do primeiro parceiro de ligação sem o ligante é usado como contra-seleção para selecionar um segundo parceiro de ligação que reconhece complexos imunes, mas nem parceiro de ligação livre, nem analito livre.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato dos ditos fagos de apresentação serem primeiro pré-incubados com primeiro parceiro de ligação ligado compreendendo uma parte de ligação a ligante de Ml Fab compreendendo SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, para classificar aquela ligação ao primeiro parceiro de ligação como tal, após o qual os fagos não-ligados sâo separados e incubados com uma mistura de morfina, e imobilizam o primeiro parceiro de ligação para selecionar fagos que se ligam ao complexo imune formado entre o primeiro parceiro de ligação imobilizado e morfina, mas não ao primeiro parceiro de ligação como tal.