BRPI0316395B1 - vacina atenuada viva contra pleuropneumonia porcina - Google Patents

Abstract

"vacina atenuada viva contra pleuropneumonia porcina". a presente invenção fornece um método para obter uma cepa de actinobacillus pleuropneumoniae, imunogênica e não hemolítica, que está modificada pelo menos em um segmento do gene apxia e, opcionalmente, em um segmento do gene apxiia, que codifica um domínio de transmembrana das exotoxinas apx hemolíticas e citolíticas. ela compreende também as cepas e a vacina viva atenuada contra pleuropneumonia porcina obtida com elas.

Description

VACINA ATENUADA VIVA CONTRA PLEUROPNEUMONIA PORCINA

Campo da Invenção A presente invenção se refere a um método para se obter uma cepa imunogênica, não hemolítica de Actinobacillus pleuropneumoniae, adequado para preparar uma vacina atenuada viva contra a pleuropneumonia porcina. Antecedentes da Invenção 0 Actínobacillus pleuropneumoniae (doravante "App") é uma bactéria gram-negativa, que causa a pleuropneumonia porcina, uma doença infecciosa distribuída mundialmente, responsável por importantes perdas econômicas na indústria de suínos.

Os fatores de virulência mais importantes do App são as proteínas extracelulares, a saber: as exotoxinas de Apx. Essas exotoxinas pertencem à família de toxinas de RTX formadoras de poros, amplamente disseminadas entre as bactérias gram-negativas patogênicas. As principais exotoxinas em App são: Apxl, ApxII, ApxIII e ApxIV.

As exotoxinas Apxl e ApxII são hemolíticas e citolíticas. A Apxl mostra uma forte atividade hemolítica e citolítica e a ApxII mostra uma fraca atividade hemolítica e uma moderada atividade citolítica.

Embora todos os sorotipos, tanto quanto selecionados, sejam capazes de produzir ApxIV, existe uma distribuição de sorotipos característica para a expressão do restante das exotoxinas de Apx. Os sorotipos 1, 5, 9 e 11 produzem exotoxinas Apxl e ApxII; o sorotipo 10 produz somente Apxl; os sorotipos 7 e 12 produzem somente ApxII e os sorotipos 2, 3, 4, 6 e 8 produzem ApxII e ApxIII.

Os genes correspondendo às exotoxinas Apxl e ApxII são organizados como óperons. O óperon da exotoxina Apxl contém 4 genes: apxIC, apxIA, apxIB e apxID. O gene apx IA codifica a própria exotoxina Apxl. O gene apxIC codifica uma proteína de ativador (acilase), que introduz uma modificação pós-traducional (acilação) na Apx, que permite a Apxl adquirir uma conformação ativa, tornando-a capaz de interação com os receptores de célula de específicos quanto ao hospedeiro. Os genes apxIB e apxID codificam duas proteínas de membrana, que secretam a exotoxina Apxl madura para o meio externo. 0 óperon de ApxII contém somente o gene A (apxl IA) e o gene C (apxllC), que codificam, respectivamente, ApxII e a acilase responsável pela aquisição, por ApxII, de uma conformação ativa. Existe também um pequeno fragmento, o qual mostra uma certa similaridade com o gene apxIB, mas, ele não origina uma proteína funcional. A exportação da ApxII madura para o meio externo deve-se à ação das proteínas codificadas pelos genes apxIB e apxlD. 0 presente método de vacinação não fornece uma proteção completa contra todos os sorotípos de App. 0 documento W097/16532A1 descreve a construção de uma cepa de vacina capaz de induzir uma resposta imunológica em um animal. Essa compreende um microorganismo modificado que produz uma toxina de Apx parcial ou totalmente inativada, devido à eliminação parcial. Essa eliminação, feita por mutagênese induzida do gene estrutural apxIA e/ou á eliminação parcial de um gene ativador apxllC. Ela não modifica a zona de transmembrana. 0 documento EP810283A2 descreve a construção de uma cepa de vacina de App por modificação do gene apxIC, de uma maneira tal que ele não produza a proteína de ativador em uma forma funcional e esta não possa ativar a toxina por acilação. Ela não modifica a zona de transmembrana.

Jansen et al. (Infection and Immunity 63:7-37 (1995)) descreveram a produção de recombinantes homólogos de App, por mutagênese sítio-dirigida. Esses mutantes apresentam o gene apxIA, que está inativado por inserção do gene CMr e/ou do gene apxlIA inativado por inserção do gene TETr.

Tascón et al. (Molecular Microbiology 14: 207-216 (1994) ) descrevem dois mutantes de App. Um deles tem uma interrupção no gene apxIBD e o outro uma interrupção no gene estrutural apxIA.

Reimer et al. (Microbial Pathogenesis 18: 197-209 (1995) ) descrevem um mutante avirulento de App, que, por mutagênese química, tem eliminações que afetam partes Importantes do óperon apxIABCD. Esse mutante nãc sintetiza a toxina Apxl, mas, é capaz de sintetizar a ApxII, embora ela não seja secretada a partir da célula.

Cepas que não expressam as exotoxinas Apxl e ApxII não podem ser usadas como vacinas atenuadas porque elas não induzem respostas imunes protetoras, uma vez que as exotoxinas Apxl e ApxII são alguns dos mais importantes determinantes de virulência de App.

Prideaux, no 16° Congresso Internacional da Sociedade Veterinária Porcina, Melbourne (Austrália) 17 a 20 de setembro de 2000, págs. 439 a 442, descreve uma vacina preparada a partir de uma cepa com um gene apxllc inativado, que secreta e expressa uma toxina ApxII não ativada, incapaz, portanto, de se ligar às células alvo.

Assim, as vacinas atenuadas vivas descritas nos antecedentes da invenção acima, com base nas cepas de App sem capacidade hemolítíca, são menos ímunoprotetoras, porque elas sofreram modificações em suas estruturas, que não lhes permite se ligarem ao receptor de membrana das células alvo. Além disso, elas não podem gerar anticorpos contra toxinas Apxl e/ou ApxII, uma vez que essas não são secretadas pela célula. Frey et al. (Gene 142:97-102 (1994)) descrevem a seqüência de aminoácidos da exotoxina Apxl a partir de uma cepa de sorotipo 1, e Smiths et al. (Infection and Immunity 59:4497-4504 (1991)) descrevem a seqüência de aminoácidos da exotoxina ApxII de uma cepa de sorotipo 9.

Sumário da Invenção As requerentes desenvolveram um método para obter uma cepa de App, imunogênica e não hemolítica, a partir de uma cepa de App virulenta, que tinha sido modificada em pelo menos um segmento do gene apxIA (SEQ ID NO 1) e, opcionalmente, em um segmento do gene apxIIA (SEQ ID NO 2), que codificam um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx citolíticas e hemoliticas.

Essa cepa não tem atividade hemolítica, porém, mantém inalterada sua capacidade imunoprotetora e é adequada para preparar uma vacina atenuada viva contra pleuropneumonia porcina.

Os domínios de transmembrana de exotoxinas Apxl e ApxII desempenham um importante papel na formação do poro na membrana da célula alvo. Uma vez que o poro tenha sido formado, desenvolvem-se desequilíbrios osmóticos, os quais eventualmente causam a líse da célula alvo.

Surpreendentemente, constatou-se que a vacina atenuada viva, preparada com essas cepas modificadas de App, pode ser administrada em baixa dosagem, que contém toxinas de Apxl e ApxII sem atividade hemolítica e que contém todos os antígenos imunologicamente necessários para se obter uma forte resposta imunogênica. 0 objeto da presente invenção é desenvolver um método para se obter uma cepa de App imunogênica e não hemolítica, a partir de uma cepa de App virulenta, modificada em pelo menos um segmento de gene apxIA e, opcionalmente em um segmento do gene apxlIA, que codifica um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolíticas.

Além disso, outro aspecto da presente invenção são as cepas a serem obtidas usando-se os métodos objeto da presente invenção e as vacinas preparadas a partir deles.

Em um terceiro aspecto, a invenção visa às cepas de App depositadas na Colección Espanola de Cultivos Tipo, com os números de registro: CECT 5985 e CECT 5994.

Descrição das Figuras Figura 1 A Figura 1 mostra um alinhamento realizado com o programa ClustalX (Thompson et al;Nucleic Research 24:4376-4882 (1997)) entre as seqüêncías de amínoácidos de Apxl provenientes de uma cepa de sorotipo 1 (Frey et al; Gene 142: 97-102 (1994)) e de ApxII a partir de sorotipo 9 (Smits et al.; Infection & Immun. 59: 4497-4504 (1991)). Nessa figura, somente a seqüência contida entre os amínoácidos 1 a 594 de Apxl ela 590 de ApxII foi revelada. Quando do alinhamento, as regiões seguintes estão enquadradas: Hl (amínoácidos 233 a 253), H2 (amínoácidos 296 a 315) e H3 (amínoácidos 369 a 405). Essas regiões correspondem, respectivamente, aos domínios de transmembrana presentes em ambas as Apx.

Figura 2 A Figura 2 mostra um esquema com as etapas seguidas para se obter os plasmídeos híbridos ρΑρχΙΔΗ2 e ρΑρχΙΙΔΗ2. Primeiramente, o plasmídeo pGPl fci obtido por digestão do plasmídeo pGP704 (Miller e Mekalanos; J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988)) com enzimas de restrição EcoRI e .BgilI e subsequente ligação dos oligonucleotídeos pGP5' e pGP3'. Esse plasmídeo contém a origem de replicação vegetativa do plasmídeo R6K (OriRSK) e a origem de transferência por conjugação do plasmídeo RP4 (OriTP4) e do gene de resistência à ampicilina (Bla). 0 plasmídeo pGPl foi digerido com a enzima de restrição PstI e ligado com um fragmento de veiculo de PstI de um gene de resistência à kanamicina (Kmr ou Kan), que provém do plasmídeo pUC4K, para originar o plasmídeo pGP2. Nesse plasmídeo, previamente desfosforilado e digerido com enzima de restrição EcóRI, foram inseridos três fragmentos de ADN amplificados por RCP, a saber: o promotor ptac, a região codificante da fusão em atpE/GFPUV (região ligando ribossoma, na qual a atpE de E. coli com a variante de U.V. da proteína de fluorescência verde) e o terminador rrnB de transcrição. 0 plasmídeo resultante foi denominado pGP3. No plasmídeo, as regiões flanqueantes 5'e 3' (amplificadas por RCP) , que codificam a segunda hélice de transmembrana dos genes apxI e apxll, foram inseridas para formar os plasmideos ρΑρκΙΔΗ2 e ρΑρχΙΙΔΗ2, respectivamente.

Figura 3 A Figura 3 é dividida em três painéis: Painel A mostra os mapas de restrição em quilobases (kb) e a distribuição dos genes no cperon apxl a partir do genoma de App. Em cinza claro, retrata-se o gene apxIA, sendo o objetivo dos diferentes eventos de recombinação, e, em cinza escuro, os genes adjacentes apxIC, apxIB e apxID. Os diferentes genes ou regiões do plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 são desenhados usando-se barras com traços oblíquos. Os fragmentos codificantes das hélices de transmembranas (Hl, H2 e H3) de apxIA são destacados em preto. Os nomes e algumas estruturas detalhadas nos plasmideos da Figura 2 foram simplificados. Portanto, gfpUV compreende o promotor ptac e a fusão atpE/GFPUV; OriV indica a origem vegetativa de replicação de R6K, e OriT, a origem de transferência por conjugação de RP4. Tanto em (1) quanto em (3) mostra-se o mapa de restrição obtido com enzima Xhol e as distribuições dos genes de óperon Apxl do genoma de App. Em (2), mostra-se o mapa de restrição do mesmo óperon depois da inserção do plasmideo ρΑρχΙΔΗ2 no genoma de App. Essa inserção ocorre por um único evento de recombinação homóloga entre as regiões flanqueantes 5' de H2 colocadas no plasmideo ρΑρχΙΔΗ2, e o genoma de Appr respectivamente. 0 Painel B da Figura 3 mostra os resultados da hibridização de uma sonda de gene Apxl com uma transferência de Southern do ADN genômico digerido com XhoI e obtido a partir dos cultivos de: 1) HP816 Nlr; 2) o recombinante obtido por inserção do plasmideo ρΑρχΙΔΗ2 no genoma de App através de um único evento de recombinação homólcga entre as regiões flanqueantes 5' de H2 (HP816R1); 3} o recombinante obtido a partir de HP816R1, que recupera o mesmo fenótipo da cepa parental HP816 Nlr e 4) o recombinante obtido a partir de HP816R1, que recupera o mesmo fenótipo da cepa parental HP816 Nlr com a exceção de que ele mostra a mesma atividade hemolítica que o HP816R1 (AppApxIH2). 0 Painel C mostra o aspecto das colônias selecionadas a partir das mesmas culturas descritas no Painel B (1, 2, 3 e 4), em conjunto com outra colônia proveniente de uma cultura de App de scrotipo 7 (5) . As colônias foram semeadas em placas de agar de sangue Columbia, suplementadas com NAD à 0,004% (CA) ou em placas TSYN, suplementadas com 25 pg/mL de kanamicina (TS). A presença de grandes halos hemcliticos circundando as colônias das culturas 1 e 3, e de pequenos halos hemolíticos circundando as colônias nas culturas 2, 4 e 5, pode ser vista em CA. Também na ausência de crescimento em TS das culturas 1, 3,4 e 5.

Figura 4 A Figura 4 é dividida em 3 painéis: 0 Painel A mostra os mapas de restrição (em kb) e a distribuição dos genes no óperon apxll localizado no genoma de App. Em cinza claro, retrata-se o gene apxIIA. Esse é o objetivo dos diferentes eventos de recombinação. Os genes adjacentes apxIIC, apxIIB são retratados em cinza escuro. Os diferentes genes e regiões do plasmideo ρΑρχΐΙΔΗ2 são desenhados usando-se barras com traços oblíquos. Os fragmentos codificantes das hélices de transmembrana (Hl, H2 e H3) de apxIIA estão destacados em preto. 0 mapa de restrição obtido com a enzima EcoRI e a distribuição dos genes de óperon de ApxII do genoma de App são mostrados em (1) e (3) . É retratado o mapa de restrição do mesmo óperon depois da inserção de plasmideo pApxIIAH2 em (2) . Essa inserção é feita através de um único evento de recombinação homóloga entre as regiões flanqueantes 3' de H2, localizadas no plasmideo ρΑρχΙΙΔΗ2 e o genoma de App. In (4), o mapa de restrição do óperon é retratado depois da resolução do plasmideo inserido em (2), depois de uma segunda recombinação através das regiões flanqueantes 5' de H2, localizadas no genoma de App. 0 Painel B mostra os resultados de hibridização de uma sonda de gene apxIIA em uma transferência Southern dos ADNs genômicos digeridos com EcoRI e obtidos a partir das seguintes culturas: 1) HP8816 Nlr, 2) o recombinante obtido por inserção do plasmideo ρΑρχΐΙΔΗ2 no genoma de App através de um único evento de recombinação homóloga entre as regiões flanqueantes 5' de H2 (HP816R2); o recombinante obtido a partir de HP816R2, que recupera o mesmo fenótipo da cepa parental HP816 Nlr; 4) o recombinante obtido a partir de HP816R2, que recupera o mesmo fenótipo da cepa parental HP816 Nlr, com a exceção de que ele mostra a mesma atividade hemolítica que o HP816R2 (AppApxI/IIH2“) . 0 Painel C mostra o aspecto das colônias semeadas a partir das mesmas culturas descritas no Painel B (1, 2, 3 e 4). As colônias foram semeadas em placas de agar de sangue Columbia suplementadas com NAD (CA), ou em placas TSYN suplementadas com 25 μg/mL de kanamicina (TS). A presença de pequenos halos hemolíticos circundando as colônias das culturas 1 e 3, e a ausência de halos hemolíticos circundando as colônias 2 e 4 pode ser vista. Vê-se, também, em TS, a ausência de crescimento das culturas 1, 3 e 4.

Figura 5 A Figura 5 mostra três gráficos com as curvas de crescimento, representadas (símbolos escuros) a partir de valores de absorbância, à 600 nm, das diferentes culturas, em intervalos de uma hora (eixo y da esquerda) . Simultaneamente, várias amostras foram tomadas a partir dos sobrenadantes das culturas nos mesmos intervalos de tempo. Essas amostras foram mantidas à 0°C até que essas fossem diluídas era 1/50 em tampão de carbonato (pH 9,6). Elas foram, então, colocadas em microcavidades para quantificar a presença de Apxl e ApxII por ELISA, usando-se um anticorpo monoclonal específico para cada Apx. A partir dos valores de absorbância, em 405 nm, de cada amostra testada (eixo y da direita), as curvas foram traçadas representando a acumulação de cada um dos Apxs ao longo do tempo (símbolos claros). Em (A), uma cultura de HP816 Nlr -triângulos - e uma cultura de AppApxIH2" - círculos; os símbolos claros mostram a acumulação de Apxl. Em (B) , uma cultura de HP816 Nlr - triângulos - e uma cultura de AppApxI/IIH2" - círculos; os símbolos claros mostram a acumulação de ApxII. Em (C), uma cultura de HP816RI -triângulos - e uma cultura de HP816R2 - círculos - mostram a acumulação de Apxl e os círculos claros mostram a acumulação de ApxII.

Figura 6 0 Painel (A) mostra uma mancha de Azul de Coomassie de uma eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, com amostras dos sobrenadantes de culturas tomadas em 5 horas a partir de 1) HP816 Nlr; 2) AppApxIH2‘; 3) um controle obtido a partir de um sorotipo 4 de App (o sorotipo 4 de App produz e secreta a ApxII de 105 kD e a ApxlII de 115 kD, mas, não a Apxl); e M) marcador de uma massa molecular ( as bandas relevantes de 110 e de 120 Kd estão indicadas). Em (B), pode-se observar um Western blot de um gel com amostras idênticas àquelas analisadas no gel (A), detectado por meio de um anticorpo monoclonal específico para a Apxl. Em (C), pode-se observar um Western blot de um gel com amostras idênticas àquelas do gel (A), com a exceção de trilha 2, que contém uma amostra do sobrenadante da cultura de AppApxI/IIH2~. Nenhuma figura do gel está incluída, uma vez que a distribuição de bandas é idêntica àquela que aparece no gel (A). Essa transferência foi revelada usando-se um anticorpo monoclonal específico para ApxII. Observe-se que a banda de 105 kD, da trilha 3, aparece detectada somente em (C).

Descrição Detalhada da Invenção A invenção se refere a um método para se obter uma cepa imunogênica e não hemolítica de Actinobacillus pleuropneumoniae a partir de um App virulento, caracterizados pelas seguintes etapas: São determinados os domínios de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citoliticas. - Pelo menos um fragmento do gene apxIA é modificado e, opcionalmente, um segmento do gene apxIIA, que codifica um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolítícas. O termo imunogênico significa que a cepa de App, obtida com o método da presente invenção, mantém inalterada a sua capacidade imunoprotetora, isso significa que ela contém todos os antígenos imunologicamente necessários a se obter uma elevada resposta imunogênica no hospedeiro. 0 termo não hemolítico significa que a cepa de App, obtida com o método da presente invenção, não tem atividade hemolítica, sendo uma cepa avirulenta. A escolha de uma cepa virulenta de App, obtida a partir de animais infectados, que padecem da doença, é feita de acordo com os métodos usuais conhecidos pelos técnicos especializados no assunto. A primeira etapa consiste na identificação dos domínios de transmembrana das exotoxinas Apx de App hemolíticas e citolítícas usando-se os programas TransMem (Aloy et al.; Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) ou Helixmem (Eisenberg et al.? J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)), que analisam as sequências de aminoácidos das exotoxinas Apx hemolíticas e citolítícas, conforme descrito para E. coli em Ludwig et al.; Mol. Genet. 226: 198-208 (1991). A segunda etapa consiste em modificar pelo menos um segmento do gene apxIA e, opcionalmente, um segmento de gene apxIIA, que codifiquem um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolítícas. O termo "modificar" se refere à modificação de um gene, ou por uso de técnicas convencionais de ADN recombínante, que incluem: a substituição de um ou mais nucleotídeos, a inserção de um ou mais nucleotídeos, a eliminação total ou parcial de um gene, ou pelo rompimento por mutagênese induzida por radiação ou quimicamente.

Em uma concretização preferida, a modificação é realizada por eliminação em, pelo menos, um segmento do gene apxIA e, opcionalmente, em um segmento de gene apxlIA, que codificam um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolíticas.

Os domínios de transmembranas, presentes nos genes apxIA e apxlia das exotoxinas hemolíticas e citolíticas, foram detectados usando-se os programas TransMem e Helixmem, mencionados acima. A predição realizada sobre as seqüências de aminoácidos das exotoxinas hemolíticas e citolíticas Apxl e ApxII indicam que os domínios de transmembrana, também denominados de transmembranas, são encontrados posicionados nas seguintes zonas da seqüência das exotoxinas: - Primeiro domínio de transmembrana Η1: entre os aminoácidos 233 e 253 correspondendo aos nucleotídeos 697 a 759 a partir de apxl.

Segundo domínio de transmembrana H2: entre os aminoácidos 296 e 315, correspondendo aos nucleotídeos 886 a 945 a partir de apxl. - Terceiro domínio de transmembrana H3: entre os aminoácidos 369 a 405, correspondendo aos nucleotídeos 1105 a 1215 a partir de apxl.

Em uma concretização preferida, a modificação é realizada por meio de uma eliminação no segmento do gene apxIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxl de App. A modificação é realizada, de preferência, per eliminação dos nucleotídeos 886 a 945 do gene apxIA, que codificam o segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxl de App.

Outra concretização preferida do método objeto da presente invenção, além disso, introduz uma eliminação adicional no segmento do gene apxIIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina ApxII de App. De preferência, uma eliminação dos nucleotídeos 886 a 945 do gene apxlIA, que codificam o segundo domínio de transmembrana da exotoxina ApxII de App.

Na forma de concretização preferida da presente invenção, que será descrita em detalhes na seção "Exemplos", a obtenção de uma cepa de App imunogênica não hemolítica foi realizada usando-se um processo compreendendo as seguintes etapas: A - Seleção de uma cepa virulenta de App. B - Previsão das alfa-hélices do domínio de transmembrana das proteínas Apxl e ApxII, a fim de projetar uma construção de nucleotídeos, que permita a eliminação, no segundo domínio de transmembrana, de ambas as proteínas, sem afetar o processo de dobramento e a capacidade da hemolisina resultante em interagir com os receptores específicos de membrana. C - Construção de um vetor de clonagem capaz de interagir no genoma de App e que contenha genes marcadores que permitam o monitoramento, de uma maneira eficiente, da integração de um tal vetor. C.l - Construção do plasmídeo híbrido pGP3, que tenha uma origem de replicação RK6, a origem RP4 de transferência e um gene de resistência à kanamicina. Além disso, o gene da proteína fluorescente GPVUV (doravante, GFP) foi incluído, sob o controle do promotor ptac e o terminador rrnB. O sítio de clonagem múltipla foi também modificado para facilitar a inserção posterior das seqüências de ADN. C.2 - Construção de um vetor de clonagem híbrido, que contenha as seqüências flanqueantes 5' e 3' da segunda hélice de transmembrana, especificada pelo gene apxIA. Portanto, o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΔΗ2 foi construído a fim de selecionar e clonar tais fragmentos adjacentes às extremidades 5' e 3' do segmento que codifica a segunda hélice de transmembrana no gene apxIA. Esse plasmídeo foi usado como o vetor final para a transformação de App. C. 3 - Construção de um vetor de clonagem híbrido, que contenha as seqüências flanqueantes 5' e 3' da segunda hélice de transmembrana, especificada pelo gene apxIIA. Portanto, o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2 foi construído a fim de escolher e clonar tais fragmentos adjacentes às extremidades 5' e 3' do segmento que codifica a segunda hélice de transmembrana no gene apxIIA. Esse plasmídeo foi usado como o vetor final para a transformação de App. D. Construção das bactérias recombinantes que resolveram o plasmídeo híbrido inserido no genoma. D.l - Construção da cepa recombinante de App denominada HP816R1, que incorpora o plasmídeo híbrido ρΑρχϊΔΗ2 no genoma de App, como um resultado de um único evento de recombinação homóloga entre tal plasmídeo e o genoma de HP816Nlr de App, que é uma cepa resistente ao ácido nalidixico obtido a partir de um mutante espontâneo da cepa HP816 de App. D.2 - Construção da cepa AppApxIH2' usando um procedimento que permita, uma vez que as bactérias recombinantes obtidas na etapa 1 tenham sido identificadas, resolver o vetor recombinante integrado ao genoma através de um segundo evento de recombinação homóloga, assim como detectar e isolar as bactérias que, devido a essa segunda recombinaçao, tenham logrado a eliminação parcial no gene apxIA. D.3 - Construção da cepa recombinante HP816R2 de App, que incorpora o plasmídeo hibrido ρΑρχΙΙΔΗ2 no genoma de AppApxIH2“, como um resultado de um único evento de recombinaçao homóloga entre tal plasmídeo e o genoma de AppApxIH2'. D.4 - Construção da cepa AppApxI/IIH2" usando um procedimento que permita, uma vez que as bactérias recombinantes identificadas tenham sido obtidas na etapa D.3, resolver o vetor recombinante integrado ao genoma por meio de um segundo evento de recombinação homóloga, assim como detectar e isolar as bactérias que, devido a essa segunda recombinação, tenham adquirido a eliminação parcial no gene apxIIA.

Na presente invenção, o mutante AppApxIH.2' obtido é idêntico à cepa de App de tipo selvagem original, exceto pela eliminação dos nucleotideos 886 a 945 (ambos inclusive) da seqüência de codificação do gene apxIA, que corresponde com aquela ausência dos aminoácidos 296 a 315 (ambos inclusive) na Apxl produzida.

Na presente invenção, o mutante AppApxI/IIH2“ obtido é idêntico à cepa AppApxIH2", exceto pela eliminação dos nucleotideos 886 a 945 (ambos inclusive) da seqüência codificante do gene apxIIA, que corresponde com a ausência dos aminoácidos 296 a 315 (ambos inclusive) na ApxII produzida.

Na concretização preferida da presente invenção, as únicas modificações que são produzidas no genoma de App são a eliminação de 60 pares de bases dentro das seqüências codificantes dos genes apxIA e apxIIA, e a substituição delas por alvos de restrição, nesse caso os correspondentes às enzimas XhoII e EcoRI, respectivamente. Nenhuma inserção adicional de seqüências provenientes de ADN plasmidico e produzida (como, por exemplo, o gene de resistência à kanamicina) no genoma de App. Isso permite à cepa obtida ser modificada no mesmo gene ou em outro gene alvo, seguindo-se exatamente a mesma estratégia que foi usada para realizar a primeira modificação. Por outro lado, isso evita que a cepa resultante seja resistente a múltiplos antibióticos, que é uma característica desejável em uma cepa a ser usada como vacina viva. 0 alvo de restrição usado na presente invenção não é crítico. Embora uma construção pudesse ser usada, a qual não introduzisse qualquer alvo de restrição, seu uso é preferível a fim de se ter um mecanismo adicional para detectar os clones recombinantes desejados e de se ser capaz de realizar um acompanhamento da estabilidade da cepa ou cepas obtidas. Portanto, qualquer alvo pode ser usado, contanto que ele não introduza um códon stop da síntese de proteínas e que dê origem a fragmentos de restrição analisáveis por eletroforese (isto é, mais do que 100 pares de bases) com fragmentos de restrição flanqueantes, que poderíam existir previamente no genoma de App. A invenção se refere também a uma cepa de App obtida de acordo com o método descrito acima.

Outro objeto da invenção é uma cepa de App caracterizada pelo fato de ter uma eliminação de nucleotídeos 886 a 945 do gene apxIA, que codifica a segunda transmembrana da exotoxína Apxl, depositada na Coleccíón Espanola de Cultivos Tipo, com o número de registro: CECT 5985, de acordo com o Tratado de Budapeste de 28 de abril de 1977, ou um mutante do mesmo.

Outro objeto da invenção é uma cepa de App caracterizada pelo fato de ter uma eliminação dos nucleotídeos 88 6 a 945 do gene apxIA, que codifica a segunda transmembrana da exotoxina Apxl, e, além disso, uma eliminação dos nucleotídeos 885 a 944 do gene apxIIA, que codifica a segunda transmembrana da exotoxina ApxII, depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo, com o número de registro: CECT 5994, de acordo com o Tratado de Budapeste, ou mutantes do mesmo. A invenção também se refere às vacinas para a proteção dos animais contra a pleuropneumonia porcina. Essas vacinas podem ser preparadas de acordo com os métodos usuais conhecidos pelos técnicos especializados no assunto.

Essas vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de bactérias de uma cepa atenuada de App viva, obtida de acordo com o método descrito na presente invenção. Imunologicamente eficaz significa que a quantidade de bactérias administrada para a vacinação é suficiente para induzir, no hospedeiro, uma resposta imunológica efetiva contra uma infecção causada pelas formas virulentas de App. A dosagem a ser usada dependerá da idade e do peso do animal a ser vacinado e da forma de administração. A vacina pode conter qualquer que seja a dose bacteriana suficiente para induzir uma resposta imune. A dosagem adequada compreende a faixa de 103 a IO10.

Além disso, a vacina pode conter um excipiente farmaceuticamente aceitável. Esse excipiente pode ser tão simples quanto água, mas, ele também pode compreender o fluido de cultura, no qual as bactérias foram cultivadas, ou uma solução com uma concentração fisiológica de sal.

Outro exemplo de excipientes farmaceuticamente aceitáveis, úteis na presente invenção, inclui estabilizadores, carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, manitol, sorbitol) e tampões (por exemplo, tampões de fosfato).

Opcionalmente, outros componentes adjuvantes podem ser adicionados à vacina. Esses adjuvantes são estimulantes não específicos do sistema imune, os quais aumentam a resposta imune do hospedeiro contra o invasor patogênico. Exemplos de adjuvantes são: vitamina E e óleo vegetal. A vacina pode ser administrada a animais por rotas intranasal, intradérmica, subcutânea, por aerossol ou intramuscular. A aplicação industrial da invenção é facilmente deduzida a partir da descrição. É de valor a menção ao fato de que a pleuropneumonia porcina é uma doença respiratória infecciosa mundialmente disseminada, responsável por severas perdas econômicas à indústria porcina, e que o método da presente invenção para se obter cepas de App não hemolítícas, imunogênicas, permite a preparação de vacinas eficazes, para combater a pleuropneumonia porcina.

Os exemplos que se seguem são descritos a fim de fornecer, para o técnico especializado no assunto, uma explicação suficientemente completa e abrangente da presente invenção, mas, isso não tem que ser considerado como limitação aos seus aspectos essenciais, conforme descrito na seção prévia desse relatório descritivo.

Exemplo As técnicas e métodos de ADN recombinante aplicados como se segue, são descritos em detalhes em Sambrook e Russell (In Molecular Cloníng, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001) e Ausubel et al.; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998). Todos os produtos de RCP foram previamente clonados em um plasmídeo pBE antes de ser digerido com enzimas de restrição. Esse plasmídeo é um derivado do vetor pBluescript SK2 (estratagene) e apresenta o sitio de clonagem múltiplo substituído por uma pequena seqüência de nucleotídeos, que especifica semente o alvo da enzima de restrição EcoRV. A cepa XLl-blue de E. coli (Stratagene) tem sido usada como um hospedeiro para vetores híbridos baseadòs em plasmídeos pUC118 ou pBluescript SK. A cepa S17-1 λ pir de E. coli (Simon et al.; Biotechnoloçy 1: 784-791 (1983)) tem sido usada como um hospedeiro dos vetores híbridos baseados no plasmídeo pGP704.

Todas as sequências de nucleotídeos descritas abaixo são escritas no sentido de 5f para 3', a menos se indicado explicitamente de maneira contrária. Em todas as reações de RCP, usou-se a termopolimerase Deep Vent (New England Bíolabs), que tem atividade de correção. A. Seleção de uma cepa de App virulenta A cepa HP816, que corresponde a um sorotipo 1 natural de App, pertencendo a Laboratórios Hipra S.A. (Amer - Girona - Espanha), foi escolhida como uma cepa de App de tipo selvagem. A cepa HP816Nlr é uma cepa resistente a ácido nalidíxico obtida a partir de um mutante espontâneo do tipo selvagem HP816.

B. Identificação do domínio de transmembrana de exetoxinas Apxl e ApxII

Os três domínios de transmembrana, que adotam uma estrutura de α-hélice, foram determinadas por meio do uso de programas TransMem (Aloy et al.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) e HelixMem (Eisenberg et al.; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)) conforme descrito para E. coli (Ludwig et al.; Mol. gene Genet. 226: 198-208 (1991)) aplicados à seqüência de aminoácidos da Apxl proveniente de uma cepa de sorotipo 1 (Frey et al.; Gene 142: 97-102 (1994)) e a ApxII de um sorotipo de tipo 9 (Smiths et al.; Infection and Immunity 59: 4497-4504 (1991)). Esses programas detectaram três regiões que poderíam atuar como hélices de transmembranas em ambas as proteínas (Fig. 1): a primeira transmembrana está localizada entre os aminoácidos 233 e 253 (Hl); a segunda transmembrana está localizada entre os aminoácidos 296 e 315 (H2) e a terceira transmembrana está localizada entre os aminoácidos 369 e 405 (H3) , todas as quais a partir de Apxl. C. Construção de vetores de clonagem híbridos, que são capazes de se integrarem ao genoma de App Na Figura 2, pode-se ver um esquema geral com os mapas dos plasmídeos, que são descritos nessa seção. C.l - Construção do plasmídeo recombinante pGP3 O plasmídeo pGP704 (Miller e Mekalanos; J. Bact. 170: 2575-2583 (1988)) foi cortado simultaneamente com as enzimas de restrição BglII e EcoRI. Usando-se eletroforese em gel de agarose, isolou-se um fragmento de ADN de 3,7 Kb. Esse fragmento foi encubado em uma reação de ligação em conjunto com oligonucleotídeos pGP5' (GAT CGA ATT CAG GAT ATC ACA GAT CT) (SEQ ID NO 3) e pGP3' (ATT TAG ATC TGT GAT ATC GTG AAT TC) (SEQ ID NO 4) . O plasmídeo recombinante obtido foi denominado pGPl. 0 plasmídeo foi digerido com a enzima de restrição PstI. Usando-se a eletroforese em um gel de agarose, foi isolado um fragmento de ADN de 3,12 Kb. Esse fragmento foi ligado a outro fragmento de 1,2 Kb obtido por digestão do plasmídeo pUC4K (Pharmacia) com a enzima de restrição PstI. 0 plasmídeo recombinante assim obtido foi denominado pGP2.

Usando-se o plasmídeo pMAL-p2 (New England Biolabs), as seqüências correspondendo ao promotor ptac forma amplificadas por RCP usando-se os iniciadores de oligonucleotídeo ptac5' (GAA TTC AAT GCT TCT GGC GTC AG) (SEQ ID NO 5) e ptac3' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID NO 6), que englobam, respectivamente, os alvos de restrição de EcoRI e de Kpnl nas extremidades 5'. Também a partir do plasmideo pMAL-p2, por RCP, as seqüências correspondendo ao terminador independente rho do óperon rrnB foram amplificadas usando-se os oligonucleotídeos de iniciador rrnBS' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID NO 7) e rrnB3' (GAA TTC AAG AGT TTG TAG AAA CGC) (SEQ ID NO 8), que englobam, respectivamente, os alvos de restrição de Kpnl e EcoRI, em suas extremidades 5'. 0 tamanho do fragmento amplificado de ADN compreende 278 pares de bases (Pb) .

Com o plasmideo pAG408 (Suarez et al.; Gene 196: 69-74 (1997)), uma fusão do gene da proteína GFPUV com a região que se liga ao ribossoma do gene atpE foi amplificada usando-se os nucleotídeos de iniciador GFP5' (GGT ACC TAA TTT ACC AAC ACT AC) (SEQ ID NO 9) e GFP3' (GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTC ATC) (SEQ ID NO 10), que englobam o alvo de restrição Kpnl em suas extremidades 5'. O fragmento amplificado tem um tamanho de 830 pb.

Os dois primeiros fragmentos (promotor ptac e terminador rrnB) foram digeridos com as enzimas de restrição Kpnl e EcoRI, enquanto que o terceiro (fusão atpE-GFPUV) foi digerido com a enzima de restrição Kpnl. Os três fragmentos obtidos dessa maneira foram, então, ligados com o plsmídeo pGP2, que foi previamente desfosforilado e cortado com a enzima de restrição EcoRI. Dentre os diferentes plasmídeos recombinantes obtidos, escolheu-se um, que foi o veículo dos três fragmentos posicionados de acordo com a Figura 2. As colônias que portavam esse plasmideo exibiram uma intensa fluorescência quando expostas à luz ultravioleta. 0 plasmídeo híbrido assim obtido ioi denominado pGP3. C.2 - Construção do plasmídeo híbrido ρΑρχΙΔΗ2 Nesse estágio, o primeiro objetivo foi obter um fragmento de ADN contíguo à extremidade 5' do fragmento codificante da segunda hélice de transmembrana do gene apxIA. Portanto, um fragmento de 897 pb foi amplificado por RCP a partir do ADN genômico purificado da cepa HP816 de App, usando-se, como íniciadores, oligonucleotídeos de Apxla5' (GAT ATC ATG GCT AAC TCT CTC AGC TCG ATA G) (SEQ ID NO 11) e Apxla3' (CTC GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG) (SEQ ID NO 12), que englobam os alvos de restrição de EcoRV e Xhol em suas respectivas extremidades 5' . A sétima base do oligonucleotídeo Apxlaõ' (SEQ ID NO 9) se corresponde com a primeira base do códon de start da tradução do gene Apxla. A sétima base do oligonucleotídeo Apxla3' (SEQ ID NO 10) é complementar à base 885 da seqüência codificante do gene apxIa, sendo a esta a última base antes da iniciação da seqüência para a segunda hélice de transmembrana. 0 segundo objetivo dessa fase foi obter um fragmento de ADN contígüo à extremidade 3' do segmento codificante da segunda hélice de transmembrana do gene apxIA. Portanto, usando-se RCP, um fragmento de 1042 bp foi amplificado a partir de ADN genômico purificado da cepa HP816 de App, usando-se, como oligonucleotídeos de iniciador ApxIbS' (CTC GAG CCG CTT TCG TTC TTA AAT GTT GCG) (SEQ ID NO 13) e Apxlb3' (AGA TCT TCA CCG GCT TTC TGT GCA CTT TG) (SEQ ID NO 14), que incluem os alvos de restrição Xhol e BglII em suas respectivas extremidades 5'. A sétima base do nucleotídeo Apxlb5' (SEQ ID NO 13) se corresponde com a base 94 6 da seqüência codificante do gene apxIA, sendo essa a primeira base depois do final da seqüência para a segunda hélice de transmembrana. A sétima base do oligonucleotídeo Apxlb3' (SEQ ID NO 14) é complementar à base 1975 da seqüência codificante do gene apxIA.

Uma vez que dois fragmentos previamente descritos foram obtidos, o primeiro foi digerido com as enzimas de restrição BcoRV e Xhol, enquanto que o segundo foi digerido com as enzimas Xhol e BglII. Ambos os fragmentos foram, então, ligados com o vetor pGP3, que foi previamente cortado com as enzimas de restrição EcoRV e BglII. 0 plasmídeo híbrido resultante foi denominado ρΑρχΙΔΗ2. C.3 - Construção do plasmídeo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2 0 primeiro objetivo, nesse estágio, era obter um fragmento de ADN contígüo à extremidade 5' do segmento codificante da segunda hélice de transmembrana do gene apxIIA. Portanto, por RCP, amplificou-se um fragmento de 871 pb a partir do ADN genômico purificado da cepa EP816 de App, usando-se, como iniciadores, os oligonucleotídeos ApxIIa5' (GAT ATC AAA TCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG) (SEQ ID NO 15) e ApxIIa3' (GAA TTC ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID NO 16), que englobam os alvos de restrição EcoRV e EcoRI em suas respectivas extremidades 5'. A base de número 7 do oligonucleotídeo ApxIIaS' (SEQ ID NO 15) corresponde à base 27 da seqüência codificante do gene apxIIA. A sétima base do oligonucleotídeo ApxIIa3f (SEQ ID NO 16) é complementar à base 885 da seqüência codificantes do gene apxIIA, sendo esta a última base antes do início da seqüência para a segunda hélice de transmembrana. O segundo objetivo dessa etapa era obter um fragmento de ADN contígüo à extremidade 3' da seqüência codificante da segunda hélice de transmembrana do gene apxIIA. Portanto, um fragmento de 952 pb foi amplificado por RCP a partir do ADN genômico purificado a partir da cepa HP816 de App, usando, como iniciadores, os oligonucleotídeos ApxIIb5' (GAA TTC CCT CTT TCA TTC TTA AAT GTA GC) (SEQ ID NO 17) e (AGA TCT GCC ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG} (SEQ ID NO 18), que englobam os alvos de restrição de EcoI e Blgll em suas respectivas extremidades 5f . A sétima base do oligonucleotideo ApxIIbS' (SEQ ID NO 17) casa-se com a base 946 da seqüência codificante do gene apxIIA, sendo esta a primeira base depois da extremidade da seqüência para a segunda hélice de transmembrana. A sétima base do oligonucleotideo ApxIIb3' (SEQ ID NO 18) é complementar à base 1845 da seqüência codificante do gene apxIIA.

Uma vez que os dois fragmentos previamente descritos foram obtidos, o primeiro foi digerido com as enzimas de restrição EcoRV e EcoRI, enquanto que o segundo foi digerido com as enzimas EcoRl e Blgll. Ambos os fragmentos foram, então, ligados com o vetor pGP3, previamente digerido com as enzimas de restrição EcoRV e BglII. 0 plasmídeo hibrido resultante foi denominado ρΑρχΙΙΔΗ2. D. - Construção das bactérias recombinantes, que resolveram o plasmídeo híbrido inserido no genoma D.l - Construção da cepa recombinante HP816R1 de App A transformação de App com o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΔΗ2 foi feita por conjugação a partir de células S17-1 λ pír de E. coli, que são veículos desses plasmídeo. A cepa HP816NIr foi usada para a transformação com o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΔΗ2.

Antes de se realizar a conjugação, uma cultura na fase estacionária foi obtida para tais bactérias. 0 meio de cultura TSYN (caldo tríptico de soja à 30 g/L, extrato de lêvedo à 6 g/L e uma vez autoclavado suplementado com 0,004% de NAD) e ácido nalidíxico (50 pg/mL) foi usado para o crescimento de App816NIr. 0 meio de cultura LB (triptona à 10 g/L, extrato de lêvedo à 5 g/L, NaCl à 10 g/L} que, uma vez autoclavado, foi suplementado com 25 μς/mL de kanamicina, foi usado para cultivo de E. coli S17-1 λ pir. Uma vez que a fase estacionária fora alcançada, 0,2 a 0,3 unidades A6oo da cultura de App e 0,6 a 0,8 unidades Aèoo da cultura de E. coli foram adicionados a 1 mL de uma solução 10 mM de MgS04. A seguir, centrifugou-se durante 2 minutos à 15.000 g e o pélete assim obtido foi ressuspenso em 200 pL de uma solução 10 mM de MgSQ4. Uma vez que a mistura de ambas as culturas tivesse sido feita, ela foi estendida em um filtro de nitrocelulose de 2,5 cm e 0,45 μτη, previamente colocado em uma placa de Petri contendo meio TSYN suplementado com agar Noble à 15 g/L. Depois de incubação durante 6 horas, à 37°C, o filtro com a conjugação foi colocado em um tubo contendo 2 mL de PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM, KC1 2 mM, pH 7,4). Depois de agitação vigorosa, o filtro foi removido e a suspensão de células foi centrifugada durante 2 minutos, à 15.000 g, e o pélete foi ressuspenso em 500 pL de PBS. A suspensão assim obtida foi distribuída em placas de Petri com meio TSYN suplementado com 15 g/L de agar Noble, 50 μg/mL de kanamicina e 50 pg/mL de ácido nalidíxico, em uma taxa de 100 pL de suspensão de células para cada placa de Petri. As culturas resultantes foram incubadas à 37°C, durante 24 - 36 horas. Com esse procedimento, foram obtidas 65 colônias resistentes à kanamicina e ao ácido nalidíxico, para a conjugação com o plasmídeo pApxIAH2, que se iguala a uma freqüência de transformação de 1,3 x 10"7 para cada célula de receptor. Várias colônias foram semeadas novamente por exaustão da alça em placas de Petri contendo LP suplementado com 15 g/L de agar Noble, NAD à 0,004%, 50 μρ/ιηΐ, de kanainicina e 50 μg/mL de ácido nalidíxico. Todas as colônias resultantes exibiram graus distintos de fluorescência, quando expostas à luz ultravioleta, o que indicou a integração do plasmídeo no genoma de App em um único evento de recombinação. Conforme mostrado na Figura 3, se ocorresse uma dupla recombinação, os exconjugados seriam incapazes de crescerem em um meio contendo kanamicína. Δ presença desse antibiótico nas placas permite somente o crescimento daqueles recombinantes que integraram o plasmídeo inteiro ao seu genoma. O gene indicador GFP permite discriminar se qualquer das colônias, que são resistentes à kanamicina, é um produto de uma mutação espontânea.

Finalmente, os recombinantes obtidos foram originados a partir de uma recombinação homóloga entre um plasmídeo e o gene apxIA. Isso foi verificado por observação da atividade hemolítica dos recombinantes em placas de agar com sangue Columbia suplementadas com NAD à 0,004% (Figura 3, painel C). Os recombinantes obtidos com o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 exibem uma nítida diminuição do diâmetro do halo hemolítico comparados à cepa parental HP816NIr.

Um dos recombinantes obtidos com o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 foi selecionado para as passagens posteriores e a ele se referiu como HP816R1. D.2 - Construção da cepa AppApxIH2‘ Uma vez que os recombinantes com o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 integrado no genoma tenham sido obtidos, é essencial fixar a eliminação no genoma de App por meio de uma segunda recombinação. Portanto, um dos recombinantes da etapa anterior foi submetido a passagens em série em um meio de cultura suplementado somente com ácido nalidíxico. Um meio sem kanamicina permite que, no caso em que ocorra uma segunda recombinação entre o genoma de App e o plasmídeo integrado, as bactérias resultantes sejam viáveis. Esse segundo evento de recombinação origina o aparecimento de dois diferentes genótipos. No caso em que isso ocorra no mesmo segmento, no qual a primeira recombinação ocorreu, o genótipo resultante será idêntico à cepa parental usada na seção D.l. Se esse segunda recombinação ocorrer no segmento em que não ocorreu a primeira recombinação, o genótipo resultante mostrará uma eliminação no fragmento que codifica a segunda hélice de transmembrana da hemolisina (Figura 3, painel A) . 0 aparecimento de recombinantes pode ser monitorado de várias maneiras diferentes: a) desaparecimento da fluorescência quando as colônias forem expostas à luz ultravioleta; b) sensibilidade à kanamicina e c) recuperação do halo hemolítico exibido pela cepa parental usada na seção D.l. Os métodos a) e b) detectam ambos os tipos de recombinantes. O método c) torna possível distinguir aqueles recombinantes que recuperam o genótipo parental. Isso é devido ao fato de que os recombinantes que exibem a eliminação no segmento codificante da segunda hélice de transmembrana do gene apxIA, a atividade hemolítica do fenótipo parental correspondente não é restabelecida.

As passagens em série foram realizadas a partir de passagens prévias usando-se diluições de 1/10.000 da passagem prévia, com a exceção da primeira passagem, que simplesmente consistiu em uma cultura obtida a partir de uma colônia isolada a partir de HP816R1. 0 meio de cultura foi LB suplementado com NAD à 0, 004% e 50 μς/ιτιΐ, de ácido nalidíxico. Para cada passagem, usou-se um volume de 10 mL de meio. As porcentagens de recombinantes detectados são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1 a) porcentagem determinada por contagem de colônias que recuperou o halo hemolítico que foi exibido pela cepa parental. b) porcentagem determinada por contagem de colônias que nao mostraram fluorescência quando expostas à luz ultravioleta.

Conforme observado na tabela acima, em cada passagem, aumenta o número de bactérias que mostram um plasmideo resolvido devido a uma segunda recombinaçâo. A porcentagem de colônias não fluorescentes é somente levemente mais elevada do que aquela das colônias que recuperam a atividade hemolítíca. Esse fato sugere que a segunda recombinaçâo ocorre, de preferência, no mesmo segmento de ADN, em que a primeira recombinaçâo ocorreu. Se a freqüência para cada tipo recombinante fosse de 50%, dobraria o número de colônias não fluorescentes com respeito aquelas que recuperam a atividade hemolítica.

Uma vez que a cultura tenha sido suficientemente enriquecida em segundos recombinantes, a etapa de purificação pode ser iniciada. Com esse objetivo em mente, várias colônias não fluorescentes foram propagadas em agar Columbia suplementado com NAD e agar LB suplementado com NAD, 50 pg/mL de ácido nalidíxico e 20 μς/ιηΐ, de kanamicina (LBNKrn). Para estudos posteriores, várias colônias foram escolhidas que não tivessem exibido crescimento em LBNKm e que exibiram a mesma atividade hemolítica que o recombinante por inserção HP816R1. D.3 - Construção da cepa recombinante de App HP816R2 A transformação do App com ο ρΑρχΙΙΔΗ2 foi realizada por conjugação a partir da E. coli S17-1 λρϊη, que é o veiculo desses plasmideos. A cepa AppApxIH2“ foi usada para a transformação com o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2. Os procedimentos e os meios de cultura são idênticos àqueles descritos na seção D.l. A freqüência de transformação com o plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 foi similar àquela obtida na seção D.l para o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2. Várias colônias foram semeadas novamente por exaustão da alça em placas de Petri contendo LP suplementado com 15 g/L de agar Noble, NAD à 0,004%, 50 pg/mL de kanamicina e 50 μς/πιί de ácido nalidíxico. Todas as colônias resultantes exibiram graus distintos de fluorescência, quando expostas à luz ultravioleta, o que indicou a integração do plasmídeo no genoma de App em um único evento de recombinação. Conforme mostrado na Figura 4, se ocorresse uma dupla recombinação, os exconjugados seriam incapazes de crescerem em um meio contendo kanamicina. A presença desse antibiótico nas placas permite somente o crescimento daqueles recombinantes que integraram o plasmídeo inteiro ao seu genoma. O gene indicador GFP permite discriminar se qualquer das colônias, que são resistentes à kanamicina, é um produto de uma mutação espontânea.

Finalmente, os recombinantes obtidos foram originados a partir de uma recombinação homóloga entre o plasmídeo e o respectivo gene apxIIA. Isso foi comprovado por observação da atividade hemolítica dos recombinantes em placas de agar Columbia suplementadas com NAD à 0,004% (Figura 4, painel C). Os recombinantes obtidos com o plasmídeo pApxIIH2 mostram um completo desaparecimento do halo hemolítico.

Um dos recombinantes obtidos com o plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 foi escolhido para passagens posteriores e denominado HP816R2. D. 4 - Construção da cepa AppApxI/IIH2" Uma vez que os recombinantes tinham sido obtidos, com o plasmídeo pApx integrado ao genoma, era essencial fixar a eliminação no genoma de App por meio de uma segunda recombinação. Portanto, os recombinantes obtidos na etapa anterior foram submetidos a passagens em série em meio de cultura suplementado somente com ácido nalidíxico, conforme descrito em D. 2. Os valores das porcentagens de recombinantes detectados a partir da segunda passagem são similares àqueles obtidos em D.2.

Uma vez que a cultura esteja suficientemente enriquecida de recombinantes secundários, pode-se proceder à etapa de purificação. Com esse objetivo em mente, várias colônias não fluorescentes foram multiplicadas era agar Columbia suplementado com NAD e agar LB suplementado com NAD, 50 pg/mL de ácido nalidíxico e 20 μς/ιηΐι de kanamicina (LBNKm). Para estudos posteriores, várias colônias foram escolhidas, as quais não exibiram crescimento em LBNKm e mostraram a mesma atividade hemolítica que o recombinante por inserção HP816R2.

E. Análise do ADN purificado a partir das colônias, isoladas na passagem anterior, para testar a homogeneidade das culturas e a presença da eliminação em genes apxIA e apxIIA

Os recombinantes das passagens anteriores D.2 e D.4 foram cultivados em 10 mL de meio TSYN suplementado com 50 pg/mL de ácido nalidíxico, até que fosse alcançada a fase estacionária. Mais tarde, foi realizada a extração de ADN de cada um deles. E.l - Análise dos recombinantes apxIH2“ As amostras da ADN genômico correspondendo a cada uma das culturas dos segundos recombinantes, obtidos a partir do plasmídeo ρΑρχΐΔΗ2, foram digeridas com a enzima de restrição Xhol. Essas digestões, em conjunto com outras realizadas a partir do ADN extraído das culturas da cepa HP816Nlr e HP816R1, respectivamente, foram analisados por Southern-blot, usando-se o fragmento de ADN de 1927 pb, proveniente da digestão do plasmídeo ρΔΑρχ1Η2“, com as enzimas de restrição EcoRV e SglII, como sonda. Os resultados dessas hibridizações estão mostrados na Figura 3B. Os resultados da hibridização da cepa de controle HP816Nlr mostram a presença de um alvo de restrição de Xhol localizado em aproximadamente 20 Kb daquele encontrado dentro do óperon apxl. A análise do recombinante, com a inserção do plasmídeo ρΑρχΐΔΗ2, mostra o aparecimento de duas novas bandas de 20 Kb. Os tamanhos das novas bandas e o aumento daquela pré-existente eram de se esperar a partir da inserção do plasmídeo híbrido ρΑρχΔΗ2 na região flanqueante de 5' , do fragmento codificante da segunda hélice de transmembrana, do gene apxIA, do genoma de App (Figura 3A, destaque 2) . A análise do recombinante, com o plasmídeo resolvido a partir da segunda recombinação, na mesma região 5' onde a primeira ocorreu, mostra o desaparecimento das duas bandas de menores massas moleculares e uma ligeira diminuição da mobilidade da bando de 21 Kb prévia, a qual, agora, aparece no mesmo nível que da cepa parental. Isso, em conjunto com o fato de que a atividade hemolítica é idêntica àquela exibida pela cepa parental HPB16Nlr, sugere que nenhuma modificação adicional foi introduzida no genoma de App durante todo esse processo (Figura 3, A e C).

Finalmente, a análise do recombinante com o plasmídeo resolvido a partir de uma segunda recombinação na região flanqueante de 3', do segmento que codifica a segunda hélice de transmembrana, mostra o desaparecimento da banda de 4,3 Kb, a manutenção da banda de 1,1 Kb, a qual já era observada no recombinante por inserção, e uma leve diminuição da banda de 20 Kb. Essa distribuição de bandas é a esperada, devido ao fato de que o desaparecimento do segmento codificante da segunda hélice de transmembrana e a sua substituição por um alvo de Khol. Esse novo alvo, inserido no genoma de App, dá origem ao fragmento de 1,1 Kb e à conseqüente diminuição de 1,1 Kb na banda de 20 Kb, que é observada na cepa 816Nlr (Figura 3A e B) . Observe-se, em CA, a presença de grandes halos hemolíticos circundando as colônias das culturas 1 e 3, e de pequenos halos hemolíticos circundando as colônias de culturas 2, 4 e 5. Ver também a ausência de crescimento em TS das culturas 1, 3, 4 e 5. Esse recombinante mostra uma atividade hemolítica muito reduzida, quando comparada à cepa parental HP816Nlr, e a mesma atividade hemolítica que a de um App de sorotipo 1, que possui somente a hemolisina ApxII (Figura 3C). Esse resultado indica que a eliminação, na segunda hélice de transmembrana, elimina ou reduz consideravelmente a atividade hemolítica da ApxIA de App. O App modificado pela eliminação descrita será denominado, de agora em diante, ApxIAH2\ 0 recombinante assim obtido, caracterizado por ter uma eliminação nos nucleotídeos 886 a 945 no gene apxIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxl, fora denominado AppApxIH2“. Em 10 de janeiro de 2002, este foi depositado na Colección Espanola de Cultivos Tipo, com o número de registro CECT 5985, de acordo com as condições estabelecidas no Tratado de Budapeste. E.2 - Análise dos recombinantes de apx/IIH2” As amostras de ADN genômico, correspondendo ao recombinante por inserção HP816R2 e aos segundos recombinantes obtidos a partir do plasmídeo ρΑρχ!ΐΔΗ2“, foram digeridas com a enzima de restrição FcoRI. Essas digestões, em conjunto com uma outra realizada a partir do ADN extraído de uma cultura da cepa HP816Nlr, foram analisadas usando-se Southern-blot. Como uma sonda, foram usados os dois fragmentos de ADN amplificados por RCP. Esses corresponderam às regiões flanqueantes de 5' e de 3', do segmento de ADN que codifica a segunda hélice de transmembrana da ApxII (Seção B) . Os resultados dessas hibridizações são mostrados na Figura 4B. Os resultados da hibridização da cepa de controle HP816Nlr mostram a presença de dois alvos de restrição de .EcoRI, distantes um do outro 15,7 Kb, os quais delimitam um fragmento, em que o óperon apxll está incluído. A análise do recombinante por inserção do plasmídeo aApxIlAH2 mostra o desaparecimento da banda de 15,7 Kb e o aparecimento de 3 novas bandas de 8,2, 7,5 e 0,9 Kb. O tamanho das novas bandas é o esperado a partir da inserção do plasmídeo híbrido ρΑρχΙ!ΔΗ2, na região flanqueante de 3', do segmento codifícante da segunda hélice de transmembrana do gene apxIIA do genoma de App (Figura 4A) . A análise do recombinante com o plasmídeo resolvido a partir da segunda recombinação na mesma região de 3' onde ocorreu a primeira, mostra o reaparecimento de uma única banda de 15,7 Kb, a qual coincide com aquela mostrada pela cepa de controle (Figura 4B) . A atividade hemolítica é idêntica àquela mostrada pela cepa parental AppApxIH2“ (Figura 4 C). Finalmente, a análise do recombinante com o plasmideo resolvido a partir de uma segunda recombinação pela região flanqueante de 3' , do segmento que codifica a segunda hélice de transmembrana, mostra o desaparecimento das bandas de 13,5 e de 0,9 Kb e o aparecimento de um novo fragmento (Figura 4B} . Essa distribuição de bandas é a esperada, a partir do desaparecimento do segmento codificante da segunda hélice de transmembrana e a sua substituição por um alvo de EcoRI (Figura 4A). Esse novo alvo, inserido no genoma de App, faz com que o fragmento de 15,7 Kb de FcoRI, o qual incluiu o óperon apxll na cepa parental, se clive em dois fragmentos de 8,2 e de 7,5 Kb (Figura 4A e B) . Esse recombinante é virtualmente não hemolítico (Figura 4C). Esse resultado indica que a eliminação na segunda transmembrana destrói ou reduz na sua totalidade prática, a atividade hemolítica da ApxIIA de App. A Apxll modificada pela realização da eliminação descrita será renomeada, doravante, como ApxIIAH2". Observe-se, em CA, a presença de pequenos halos hemoliticos circundando as colônias das culturas 1 e 3, e a ausência de halos hemoliticos circundando as colônias das culturas 2 e 4. Observe-se, também, a ausência de crescimento das culturas 1, 3 e 4 em TS. A cepa recombinante assim obtida foi renomeada AppApxI/IIH2“. Essa é caracterizada por ter uma eliminação dos nucleotídeos 886 a 945, no gene apxIA, que codifica um segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxl e, além disso, uma eliminação dos nucleotídeos 886 a 945 do gene apxlIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxll. Essa cepa foi depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo, com o número de registre: CECT 5994, conforme especificado nas condições do Tratado de Budapeste sobre patentes. F. - Análise da produção das cepas recombinantes ApxIAH2~ e ApxIIAH2~ obtidas Para determinar se as cepas recombinantes obtidas ainda estão produzindo a ApxH2~, determinou-se a concentração dessa no meio LB. As Apx produzidas foram detectadas usando-se anticorpos monoclonais específicos para Apxl e Apxll, usando-se imunotestes e Western-blot. Conforme mostrado na Figura 5 (A e B) , a produção e excreção para o meio da ApxIAH2" e da ApxIIAH2“, pelas cepas recombinantes, segue o mesmo padrão temporal que as Apx não modificadas, a partir da cepa de tipo selvagem parental HP816NIr. Todas as hemolisinas (modificadas ou não) aparecem no meio de cultura aproximadamente na segunda metade da fase de crescimento exponencial e alcançam a concentração máxima no início da fase estacionária. A partir desse momento em diante, a concentração de todas as hemolisinas permanecem estáveis ou diminuem ligeiramente. Conforme observado na mesma figura, ApxIAH2‘ e ApxIIAH2" se acumulam até atingirem níveis similares àqueles mostrados nas Apx não modificadas respectivas, produzidas pela cepa parental de tipo selvagem HP816NIr. Por outro lado, a eliminação introduzida é muito pequena (18 aminoácidos) e uma diminuição de somente 2 kDa na massa molecular da ApxH2‘ é esperada. Tendo-se em mente que as duas hemolisinas de tipo selvagem têm uma massa molecular aparente de cerca de 105 kDa, uma diminuição de 2 kDa em sua massa molecular é não observável nos géis de poliacrilamida e em seus Western-blots correspondentes (Figura 6) . Finalmente, tem que ser destacado que, nessa mesma figura, não aparecem produtos de polipeptídeo truncados ou processados de maneira imprópria. Observe-se que os 105 kDa na trilha 3 aparece detectado somente em (C) . Todos esses dados indicam que a pequena eliminação introduzida em ambas as Apx não impede que essas sejam sintetizadas de uma maneira completa e exportadas para o meio de cultura. Uma vez que essas tenham sido liberadas no meio de cultura, as ApxH2~ exibem uma estabilidade similar àquela mostrada pelas respectivas Apx não modificadas. G. - Eficácia da atenuação das cepas obtidas Para testar o grau de atenuação das duas cepas recombinantes construídas, foram usados suínos híbridos LW x LD, machos e fêmeas, de três meses de idade. Quatro replicantes de suínos foram usados nos diferentes testes. Cada uma das cepas foi administrada em uma dose de 108 cfu em 5 mL de PBS, para cada um dos animais dos primeiros três grupos, por injeção intratraqueal. Essa dose foi determinada previamente como a DL50 para a cepa de tipo selvagem HP816Nlr em suínos dessa idade. Os animais do quarto grupo foram inoculados somente com uma dose de 5 mL de PBS. Os sinais clínicos foram observados cuidadosamente diariamente, durante o período de 7 dias que durou o teste. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2 (a) Animais com comportamento de alerta e capacidade para responder na presença do tratador prejudicados (Afetados/total) (b) Animais com ritmo respiratório perturbado e/ou dispnéia (Afetados/total) Sete dias depois da inoculação, os animais foram sacrificados e foram registradas as lesões macroscópicas observadas nos órgãos respiratórios. Exames bacteriológicos também foram realizados na necropsia.

Os resultados obtidos nesse teste estão resumidos na tabela 3.

Tabela 3 Dois dos cinco animais desse grupo morreram durante esse periodo de tempo. Na necropsia, quatro dos cinco animais mostraram severas lesões nos pulmões. Os animais que haviam sido inoculados com a cepa AppApxIH2~ exibiram também uma modificação em seus comportamentos, embora esses sinais tenham diminuído a partir da quarto dia da inoculação. Os sinais clínicos foram mais suaves e somente foram observados em 50% dos porcos. Embora nenhum dos animais desse grupo tenha morrido durante o teste, 70% deles exibiram lesões na necropsia, conquanto se constatasse que todas elas eram mais suaves do que o grupo prévio. O terceiro grupo foi inoculado com a cepa AppApxI/IIH2“. Posto que quatro dos animais exibissem comportamento modificado leve, esses diminuiram a partir da quadragésima-oitava hora após a inoculação. Os dois animais que exibiram sinais clínicos limitados também se recuperaram 48 horas depois da inoculação. Não foram observadas lesões pulmonares em qualquer dos animais, na necropsia. A avaliação das lesões pulmonares foi feita de acordo com Hannan et al. (Research in Veterinary Science 33: 76-88 (1982)). Os valores mostrados são as médias aritméticas de cada grupo, em conjunto com o desvio padrão. De acordo cora esses resultados, a cepa AppApxI/IIH2' é não virulenta e pode ser usada de maneira segura como uma vacina viva. É importante destacar que a cepa de App inoculada foi recuperada em 80% dos porcos desse grupo, sete dias depois de sua administração. Esse resultado indica que a viabilidade da cepa AppApxI/IIH2-, em uma infecção experimental, não é modificada apesar do fato de que ela é desprovida de atividade hemolítica. Esse fato é importante se tivermos em mente que é essencial que o microorganismo permanece viável, de modo que as exotoxinas Apx podem sejam geradas e liberadas. Sem a produção das exotoxinas Apx, a cepa atenuada não podería ser usada como vacina viva, uma vez que essa seria incapaz de induzir uma resposta imune, que protegeria o animal contra futuras infecções (Reimer et al.; Microbial Pathogenesís 18: 197-209 (1995)). Em todos os testes, foi conseguida uma forte resposta imunopatogênica.

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. Método para obter uma cepa de Actinobacillus pleuropneumonlae não hemolitica, imunogênica, a partir de uma cepa virulenta de App, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: - identificação dos domínios de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolíticas, em que o domínio H1 corresponde aos nucleotídeos 697 a 759 e codifica para os aminoácidos nas posições 233 e 253, o domínio H2 corresponde aos nucleotídeos 886 a 945 e codifica para os aminoácidos nas posições 296 a 315, e o domínio H3 corresponde aos nucleotídeos 1105 a 1215 e codifica para os aminoácidos nas posições 369 a 405; - modificação de pelo menos um segmento do gene apxIA e, opcionalmente, um segmento do gene apxIIA, que codificam um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolíticas por substituição ou por inserção de um ou vários nucleotídeos, ou por deleção parcial ou total do segmento de gene, ou por meio da interrupção por mutagênese induzida quimicamente ou por radiação; - obtenção das bactérias mutantes contendo as modificações.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de introduzir uma deleção em pelo menos um segmento do gene apxIA e, opcionalmente, em um segmento do gene apxIIA, que codificam um domínio de transmembrana das exotoxinas Apx hemolíticas e citolíticas, em que o domínio H1 corresponde aos nucleotídeos 697 a 759 e codifica para os aminoácidos nas posições 233 e 253, o domínio H2 corresponde aos nucleotídeos 886 a 945 e codifica para os aminoácidos nas posições 296 a 315, e o domínio H3 corresponde aos nucleotídeos 1105 a 1215 e codifica para os aminoácidos nas posições 369 a 405.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de introduzir uma deleção no segmento do gene apxIA, que codifica um segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxl de Actinobacillus pleuropneumoniae, em que o domínio H2 corresponde aos nucleotídeos 886 a 945 e codifica para os aminoácidos nas posições 296 a 315.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de introduzir uma deleção dos nucleotídeos 886 a 945 do gene apxIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina Apxl de Actinobacillus pleuropneumoniae, em que o domínio H2 corresponde aos nucleotídeos 886 a 945 e codifica para os aminoácidos nas posições 296 a 315.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de introduzir uma deleção adicional no segmento do gene apxIIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina ApxII de Actinobacillus pleuropneumoniae, em que o domínio H2 corresponde aos nucleotídeos 886 a 945 e codifica para os aminoácidos nas posições 296 a 315.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de introduzir uma deleção dos nucleotídeos 886 a 945 do gene apxIIA, que codifica o segundo domínio de transmembrana da exotoxina ApxII de Actinobacillus pleuropneumoniae.

7. Cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae caracterizada por ser obtida pelo método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8 . Vacina contra pleuropneumonia porcina caracterizada por compreender uma cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae obtida utilizando-se o método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

9. Cepa de Actlnobaclllus pleuropneumonlae imunogênica e não hemolitica depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo, com o número de registro CECT 5985 .

10. Vacina contra a pleuropneumonia porcina, caracterizada por compreender a cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae conforme descrita na reivindicação 9 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. Cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae imunogênica e não hemolitica depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo, com o número de registro CECT 5994 .

12. Vacina contra a pleuropneumonia porcina, caracterizada por compreender uma cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae conforme descrita na reivindicação 11 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.