BRPI0318197B1

BRPI0318197B1 - Processo para redução de cor de efluente de papel e polpa

Info

Publication number: BRPI0318197B1
Application number: BRPI0318197-9A
Authority: BR
Inventors: Rita Kumar; Anil Kumar; Deepa Kachroo Tiku
Original assignee: Council Scient Ind Res
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2015-07-14
Also published as: ZA200507592B; US20050158840A1; US6896806B2; WO2004083410A1; CN100343384C; DE60319280D1; AU2003285608A1; US20040018608A1; BR0318197A; EP1613739A1; EP1613739B1; CN1771322A; ATE386796T1; DE60319280T2

Description

"PROCESSO PARA REDUÇÃO DE COR DE EFLUENTE DE PAPEL E POLPA" Campo da presente invenção: A presente invenção se refere a uma cepa bacteria-na de no. de acesso MTCC 5099, um processo para a preparação de inóculo da referida cepa e um processo para a redução de cor de efluente de moinho de polpa empregando o referido i-nóculo anterior, que compreende as etapas de inocular as a-líquotas apropriadas do efluente de moinho de papel e polpa com a lama de célula obtida, incubar a mistura em cerca de 37°C em aproximadamente 100 rpm para duração de tempo variando entre 24-48 horas, avaliar a cor e níveis de lignina totais para determinar a eficiência de remoção de cor da referida bactéria anterior.

Fundamento e referências da técnica anterior da presente invenção 0 problema de remoção de cor do resíduo do moinho de papel e polpa foi um assunto de grande consideração e investigação nas últimas décadas. Dois trilhões de galões estimados de águas residuais são descarregados anualmente pela indústria de papel e polpa em países produtores de papel principais e muito deste efluente é altamente colorido. (Joyce e outros, 1983). A cor acastanhada da água residual é principalmente orgânica na natureza e principalmente atribuível a produtos de degradação de lignina formados durante várias operações de branqueamento e polpação (Srivastava e outros, 1984, Dilek e outros, 2000). Os outros agentes de transferência de cor extrativos de madeira, taninos, resinas e tintas sintéticas .

Nunca foi pensado que a cor seria um problema principal, sendo classificada como um poluente não convencional. As razões para regulamentos de cor em alguns lugares são referidas ser, proteção de pescas ou considerações estéticas. Em segundo lugar, descarga de efluentes de polpação coloridos às águas receptoras, inibe a atividade de fotos-sintética de biota aquática reduzindo-se a penetração de luz solar, além de ter efeitos tóxicos diretos sobre biota.

Os compostos de cor da mesma forma quelam os íons de metal e podem transmitir a contaminação por metais pesados. Recentemente, os compostos orgânicos causadores de cor da mesma forma foram implicados no aparecimento de flores algais azuis-verdes (Paerl, 1982; Kuenzler e outros, 1982; Witherspoon & Pierce, 1982). É portanto, impreterível que a cor presente nos efluentes de moinho de papel de polpa seja removida, antes de ser descarregada em águas receptoras. Há duas estratégias gerais para a remoção da cor do efluente de um moinho de papel & polpa: 1) Término convencional do tratamento do tubo 2) Modificação do processo de fabricação de papel e polpa de forma que menos cor seja produzida As seguintes são as tecnologias de remoção de cor convencionalmente empregadas: - Tratamento secundário: os efluentes são tratados com método lama ativada convencional. Entretanto, os sistemas de tratamento biológico convencionais não podem remover a cor (Yosefian e outros, 2000). - Pré-tratamento de enzima - Separação de resina e permuta de íon - Óxido de alumínio - Adsorção em madeira - Processos de membrana - Irradiação - Processo eletrolítico - Carbono ativado - Tratamento terrestre - Ozônio Neste momento, nenhuma tecnologia de remoção de cor única foi identificada como a mais eficaz. Considerando que todas as tecnologias citadas acima são de custo-intensivo, elas teriam impacto econômico adverso sobre o moinho envolvido. Além disso, os processos de tratamento químico adicionam até a concentração sempre crescente de substâncias químicas no ambiente (Kapdam e outros, 2000) .

Em princípio, a descoloração é realizável empregando uma ou uma combinação dos seguintes métodos,· - Adsorção - Filtração - Precipitação - Degradação química - Fotodegradação e - Biodegradação Rohella e outros, 2001 empregaram polieletrólitos {comercialmente disponível) para remover a cor de efluentes de moinho de polpa. Entretanto, a análise de custo-benefício deste tratamento não foi ainda trabalhada e consequentemente este tipo de tecnologia não é viável. Entretanto, desde que os polieletrólitos contam com a carga iônica do efluente, a capacidade de redução de cor será altamente variável, considerando as flutuações enormes ocorrendo na composição da á-gua residual. A maioria de técnicas de remoção de cor funciona por concentração de cor em uma lama ou pelo esgotamento parcial ou esgotamento completo da molécula colorida (Willmott e outros, 1998). Entretanto, a composição química e cor dos efluentes de moinho de polpa são normalmente submetidos a ambos os processos diários bem como variações periódicas. Uma solução de término de tubo universalmente aplicável única, não tem portanto aparecido até a data.

Os métodos de remoção de cor físico-químicos tais como precipitação química, filtração de areia rápida, processos de membrana e adsorção foram desenvolvidos (Springer, 1985). A adsorção e processos de membrana, embora sejam eficientes, porém caros (Manjunath e Mehrotra, 1981) , A aplicação de métodos eletroquímicos é outra maneira de tratar as águas residuais da produção de papel de celulose (Christoskova e Lazarov, 1988). Este método garante alta eficiência de tratamento porém sua eficácia depende dos tipos de eletrodos, da construção de eletrocoaguladores e das condições sob as quais o processo é conduzido. A precipitação química, usando alume, cloreto fér-rico e cal, da mesma forma foi estudada extensivamente La-thia e Joyce, 1978; Dugal e outros, 1976; Joyce e outros, 1979; Srivastava e outros, 1984; Beulker e Jekel, 1993; Ste-phenson & Duff, 1996). A despeito de tempos de retenção curtos e baixos custos de capital, hã algumas desvantagens relatadas, tal como alto custo de substâncias químicas para precipitação bem como para ajuste de pH, produção de lama volumosa devido à dosagens pesadas, problemas associados com desidratação e disposição de lama gerada e níveis de cátion residual altos, de forma que sua cor permaneça no sobrena-dante (Stephenson e Duff, 1996; Srivastava e outros, 1984).

Teoricamente, o tratamento biológico produz a solução ideal para remoção de cor visto que menos lama é produzida quando comparada aos tratamentos químicos. Custos de operação diários inferiores são da mesma forma incorridos. Entre os sistemas biológicos, fungos de putrefação branca foram extensivamente pesquisados em, quanto a sua capacidade de degradar lignina que forma um componente importante e principal dos efluentes de papel e polpa (Feijoo e outros, 1995). Certos trabalhadores têm mostrado que as pelotas de fungos de putrefação branca, sob condições específicas de incubação, adsorvem fortemente a cor e AOX do efluente de planta de branqueamento de kraft (Jaspers e outros, 1996).

Raghu Kumar e outros, 1996, mostraram que fungos marinhos podem da mesma forma ser utilizados para remoção de cor do efluente de planta branqueada. Uma cepa foi relatada para produzir 74% de descoloração em pH alcalino durante um período de 14 dias, Vários outros pesquisadores têm da mesma forma relatado a descoloração parcial por fungos de putrefação branca (Eaton e outros, 1980; Livernoche e outros, 1983; Pronty, 1990; Gokcay e Dilek, 1994). Gokcay e Dilek (1994) têm indicado que devido à necessidade para concentrações de glicose altas pelo fungo, este tratamento é economicamente impraticável. Eles da mesma forma têm relatado que os fungos não foram eficazes quando os efluentes de branqueamento estiveram presentes.

Dilek e outros, 1999 têm relatado a descoloração de efluentes de polpação empregando uma alga de cultura misturada. Uma combinação de tratamento aeróbico-anaeróbico foi empregada por Vidal e outros. Fungos de putrefação branca excretando várias enzimas oxidativas extracelulares incluindo lignina peroxidase, Manganês peroxidase e lacases foram empregadas para descolorir efluentes de moinho de polpa de kraft de branqueamento. Até 64% de cor foram removidos aplicando-se o tratamento aeróbico-anaeróbico seguido por tratamento de enzima.

Até a data, não há quase relatos com respeito a utilização de culturas bacterianas puras para descoloração de efluente de polpação. A novidade da presente invenção é a aplicação de culturas puras de bactérias, isoladas de habitat natural, para remover a cor de águas residuais de papel e polpa em um aspecto industrialmente e economicamente viável .

Objetivos da presente invenção 0 objeto principal da presente invenção é fornecer um processo para o tratamento aeróbico de água residual de moinho de polpa para redução de cor.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma cepa bacteriana para redução de cor de efluente de polpa e papel.

Ainda outro objetivo da presente invenção é desenvolver um inoculo da cepa para redução de cor de efluentes de polpa e papel.

Sumário da presente invenção A presente invenção se refere a uma cepa bacteriana de no. de acesso MTCC 5099, a um processo para a preparação de inoculo da referida cepa, e a um processo para a redução de cor de efluente de moinho de polpa empregando o referido inoculo anterior, que compreende as etapas de inocu-lar alíquotas apropriadas do efluente de moinho de papel e polpa com a lama celular obtida, incubar a mistura em cerca de 37°C em cerca de 100 rpm para duração de tempo variando entre 24-48 horas, avaliar a cor e níveis de lignina totais para determinar a eficiência de remoção de cor da referida bactéria anterior.

Descrição detalhada da invenção presente: A invenção presente se refere a uma cepa de bactéria de no. de acesso MTCC 5099, a um processo para a preparação de inoculo da cepa, e a um processo para a redução de cor de efluente de moinho de polpa empregando o referido i-noculo anterior, que compreende as etapas de inocular as a- líquotas apropriadas do efluente de moinho de papel e polpa com a lama celular obtida, de acordo com a reivindicação 2, para estudos de redução de cor junto com um frasco de controle contendo a amostra de efluente sem qualquer inoculo adicionado, incubar os frascos estabelecidos na etapa (a) a 37°C/100 rpm durante 48 horas, retirar as amostras dos frascos acima em alíquotas de 50 ml e processá-las para avaliar a cor e níveis de lignina Totais analisando a eficiência de remoção de cor da referida bactéria acima.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que uma cepa de bactéria de No. de Acesso MTCC 5099.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cepa A de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa é gram-ve.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cepa A de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa é bastões curtos.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que um processo para a preparação de inóculo da cepa da reivindicação 1, o referido processo compreende em: i) isolar uma bactéria da lama ativada coletada da planta de tratamento de efluente de um moinho de papel e polpa, ii) cultivar a referida bactéria em meios de ágar nutriente contendo 0,1% em p/v cada dentre lignina, tanino e vanilina para obter as culturas puras, iii) inocular a referida bactéria em caldo de nutriente contendo 0,01% de Tween 80 para obter a cultura iniciadora, iv) cultivar a bactéria anterior para obter a biomassa requerida inoculando-se a alíquota apropriada do caldo de nutriente, com a cultura iniciadora e incubar o meio acima a 37°C/100 rpm durante 16-18 horas, v) centrifugar a cultura resultante, depois de alcançar uma densidade óptica de 1,5-2,0, para obter a pelota, lavar a pelota coletada dissolvendo-se em tampão de P04'3, Q,Q5M, pH 6,8, re-centrifugar a pelota, e vi) coletar a pelota obtida da etapa (e), dissolver em 10 mL de tampão de P04'3, 0,05M, pH 6,8, para obter a lama de célula para estudos de tratabilidade.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que o inóculo para empregar em experiências de redução de cor é obtido inoculando-se a referida bactéria anterior em caldo de nutriente contendo 0,01% de Tween 80 para obter a cultura iniciadora.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a referida cultura iniciadora anterior é empregada para obter o inóculo requerido inoculando-se a alíquota apropriada de caldo nutriente, com a cultura iniciadora e incubar o meio anterior a 37°C/100 rpm durante 16-18 horas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cultura resultante é centrifugada em rpm apropriada, preferivelmente 6000 rpm durante um período de 20 minutos a 4°C.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a pelota resultante é lavada dissolvendo-se em tampão de P04'3, 0,05M, pH 6,8 e re-centrifugando-se a pelota.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a pelota resultante é dissolvida em 10 ml de tampão de P04'3, 0,05 M, pH 6,8, para obter inóculo para estudos de redução de cor;

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cor do efluente de moinho de polpa emprega o referido inóculo anteriormente mencionado, como reivindicado na reivindicação 2, que compreende: i) inocular alíquotas apropriadas do efluente de moinho de papel e polpa com a lama celular obtida, como reivindicado na reivindicação 2, para estudos de redução de cor junto com um frasco de controle contendo amostra de efluente sem qualquer inóculo adicionado; ii) incubar os frascos estabelecidos na etapa (a) a 37°C/100 rpm durante 48 horas; íii) retirar amostras dos anteriores frascos em alíquotas de 50 ml e processá-las para avaliar os níveis de lignina Totais e cor, iv) analisar a eficiência de remoção de cor da referida bactéria anteriormente mencionada comparando-se os níveis de cor do efluente tratado com a bactéria, como reivindicado na reivindicação 2, com 0 nível de cor da amostra de controle depois de intervalos de 24 e 48 horas, v) checar a viabilidade da referida cultura anteriormente mencionada no efluente cultivando-se em meio de ágar nutriente e calcular CFU/ml.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a viabilidade da referida cultura anteriormente mencio- nada é checada semeando-se diluições de amostras tiradas da experiência para obter colônias contãveis e calcular CFU/ml da amostra após intervalos de 24 e 48 horas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que A processa como reivindicado nas reivindicações 1 a 9, em que um processo de descoloração biológico, aeróbio é definido empregando-se um isolado bacteriano, obtido de lama ativada de um ETP de moinho de papel e polpa, que produz até 55% de redução em níveis de cor do determinado efluente.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cepa mostra redução de cor de 55% em 24 horas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cepa mostra redução de cor de 60% em 48 horas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a relação de equivalente para biomassa é cerca de 1:1.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cepa está viável a redução de cor.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a invenção fornece um processo biológico para a redução de cor de efluente de moinho de papel e polpa. Também descrita, é uma cepa bacteriana isolada de uma fonte específica, capaz de reduzir a cor do efluente de papel e polpa. O referido isolado bacteriano foi capaz de reduzir a cor do e-fluente.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a presente invenção se refere a um processo biológico para redução de cor de efluente de moinho de papel e polpa empregando-se uma cepa bacteriana aeróbia isolada de fonte específica do moinho de papel e polpa.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a presente invenção fornece um processo para a redução de um efluente de moinho de polpa empregando-se processo de tratamento aeróbio. Uma cepa bacteriana aeróbia foi isolada de uma fonte específica do moinho de papel e polpa e empregada para descoloração do efluente de moinho de polpa.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que o isolado bacteriano de acordo com a presente invenção está atualmente depositado em IGIB como CBTCC/, e sua identificação está a caminho.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que este isolado bacteriano facilita a redução de cor do e-fluente de papel e polpa.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a bactéria descrita na referida invenção é isolada da lama ativada da planta de tratamento de efluente de um moinho de papel e polpa. 5,0 gramas de lama ativada homogeneizada tirados da planta de tratamento de efluente de moinho de papel e polpa são inoculados no meio de enriquecimento. O meio de enriquecimento consiste em 100 ml de infusão de lama, 25 ml de caldo de nutriente estéril e 0,1% (p/v) de cada uma dentre lignina (Alcali lignin-Aldrich, USA), vanilina e tanino (Sigma). O pH ê ajustado a 6,8+0,2.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que o extrato de lama á preparado fervendo-se uma mistura contendo 300 ml de lama em 1200 ml de água destilada três vezes durante cerca de 30 minutos. A infusão foi resfriada, centrifugada e filtrada grossa. 0 filtrado final obtido autoclavado a 121°C, 1,05 kg/cm2 durante 20 minutos e empregado para preparar o meio de enriquecimento. O meio de enriquecimento inoculado com lama ativada é incubado a 37°C durante 24-48 horas para obter uma cultura enriquecida.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a cultura enriquecida é serialmente diluída em 10-12 empregando-se 0,05 M de tampão de NaH2PO4-Na2HP04, pH 7,0. Soluções de matéria-prima de lignina, vanilina e tanino são preparadas. Caldo de nutriente contendo 2% de ágar é preparado e 0,2% de (v/v) cada uma dentre lignina, vanilina e tanino são adicionados a partir das soluções de matéria-prima. 0 inóculo serialmente diluído é em seguida semeado e incubado a 37°C durante 24-48 horas. A colônia isolada simples é escolhida e riscada em uma placa fresca no mesmo meio. A e-tapa anterior é repetida duas vezes, até que colônias puras sejam obtidas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a bactéria supracitada é inoculada com ajuda de alça de nicromo estéril em 15-20 ml de caldo de nutriente estéril (NB) contendo (por litro), 5,0 g de digesto péptico de tecido de animal, 5,0 g de cloreto de sódio, 1,5 g de extrato de carne de boi, 1,5 g de extrato de levedura e 0,2 ml de Twe-en-80. A cultura é incubada a 37°C durante cerca de 16-18 horas em uma agitadora incubadora. Para agitação suave, a agitadora incubadora é mantida em uma rpm apropriada, preferivelmente 100 rpm. Depois que o crescimento suficiente é obtido, o caldo foi armazenado a 4°C até outro uso. 250 ml de NB estéril são inoculados com 250 μΐ da cultura iniciado-ra anteriormente preparada.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que o frasco é mantido para incubação a 37°C/100 rpm durante 16-18 horas até uma densidade óptica (650 nm) de 1,5-2,0 ser obtida. As células são colhidas por centrifugação em um rpm apropriado, preferivelmente 6000 rpm durante 20 minutos. A pelota resultante é lavada dissolvendo-se em quantidade mínima de tampão de fosfato, 0,05 M, pH 6,8 e re-centrifugada empregando-se as mesmas condições de tempo e rpm. Durante a centrifugação, a temperatura é mantida a 4°C. A pelota desta maneira obtida, é re-suspensa em volume mínimo de tampão de fosfato, 0,05M, pH 6,8, preferivelmente 10 ml e vortexada para preparar uma suspensão homogênea a ser empregada para reduzir a cor do efluente de papel e polpa.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que para estabelecer as experiências de redução de cor, 250 ml de amostra são conduzidos em frascos cônicos tampados com tampa com rosca. 0 inóculo e adicionado à amostra de efluente depois de checar que o pH do efluente estã preferivelmente em torno de 7,0. Os frascos de controle que não contém qualquer inóculo adicionado são também mantidos para comparação. Os frascos são incubados a 37°C/100 rpm durante um período de 48 horas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que para analisar a eficiência da redução de cor bem como os níveis de lignina totais das bactérias anteriormente mencionadas, aproximadamente 50 ml de amostras são retirados. As amostras são preparadas para análise centrifugando-as em rpm apropriado, preferivelmente 8000 rpm durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante é em seguida passado através de filtros de 0,45 μ (Millipore). Para medir os níveis de cor, o pH das amostras é ajustado em 7,6 e a densidade óptica medida em 465 nm como descrito no método de estimação de cor NCASI. O ensaio de lignina total é também realizado pelo método de Modified Pearl Benson.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que para avaliar a viabilidade da cultura durante a experiência inteira, a amostra é diluída serialmente e semeada sobre o meio de ãgar nutriente e incubada a 37°C, durante a noite em uma posição invertida. As colônias foram contadas e as Unidades de Formadoras de Colônia/ml (CFU/ml) calculadas.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, em que a invenção fornece um processo para a preparação de inó-culo da referida bactéria e emprega-o para a redução de cor do efluente industrial de papel e polpa, que compreende: a) isolar uma bactéria da lama ativada coletada da planta de tratamento de efluente de um moinho de papel e polpa; b) cultivar a referida bactéria em meios de ãgar nutriente contendo 0,1% p/v de cada qual dentre lignina, tanino e va-nilina para obter culturas puras; c) inocular a referida bactéria em caldo de nutriente contendo 0,01% de Tween 80 para obter cultura iniciadoras; d) cultivar a bactéria anterior para obter biomassa requerida inoculando-se alíquota apropriada de caldo de nutriente, com a cultura iniciadora e incubando-se o meio anterior a 37°C/100 rpm durante 16-18 horas; e) Centrifugar a cultura resultante, depois de atingir uma densidade óptica de 1,5-2,0, para obter pelota, lavando a pelota coletada dissolvendo-se em tampão de PO4'3, 0,05M, pH 6,8, re-centrifugando-se a pelota; f) coletar a pelota obtida da etapa (e) , dissolvendo-se em 10 ml de tampão de P04'3, 0,05M, pH 6,8, para obter lama celular para estudos de tratabilidade; g) inocular alíquotas apropriadas do efluente de moinho de papel e polpa com a lama celular obtida na etapa (f) para estudos de redução de cor junto com um frasco de controle contendo amostra efluente sem qualquer inóculo adicionado; h) incubar os frascos estabelecidos na etapa (g) a 37°C/lOO rpm durante 48 horas; i) Retirar amostras dos frascos anteriores em alíquotas de 50 ml e processá-las para avaliar os níveis de lignina e cor,· j) Analisar a eficiência de remoção de cor da referida bactéria anterior comparando-se com 0 nível de cor da amostra de controle depois de intervalos de 24 e 48 horas; k) checar a viabilidade da bactéria anterior no efluente por método de contagem de colônia e calcular a CFU/ml depois de 24 e 48 horas.

Em uma modalidade da presente invenção, a bactéria é isolada da lama ativada coletada da planta de tratamento de efluente de um moinho de papel de polpa.

Em outra modalidade da presente invenção, a supracitada bactéria é inoculada em caldo de nutriente contendo 0,01% de Tween 80 para obter a cultura iniciadora.

Em outra modalidade da presente invenção, a cultura da bactéria é preparada inoculando-se o caldo de nutriente com cultura iniciadora.

Em outra modalidade da presente invenção, a incubação das cepas bacterianas é realizada por agitação suave a 100 rpm.

Em uma modalidade da presente invenção, o crescimento das cepas bacterianas incubadas é realizado a uma temperatura de 37°C durante um período de 16-18 horas.

Em outra modalidade da presente invenção, a referida bactéria foi centrifugada em uma rpm apropriada, preferivelmente 6000 rpm durante um período de aproximadamente 20 minutos a 4°C, depois de obter uma densidade óptica de aproximadamente 1,5-2,0.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a pelota resultante é lavada dissolvendo-se em quantidade mínima de tampão de fosfato, 0,05M, pH 6,8 e re-centrifugada empregando-se as mesmas condições de tempo e rpm. Durante a centrifugação, a temperatura é mantida a 4°C.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a pelota desta maneira obtida, é re-suspensa em volume mínimo de tampão de fosfato, 0,05M, pH 6,8, preferivelmente 10 ml e vortexada para preparar uma suspensão homogênea.

Em um da modalidade da presente invenção, a lama celular obtida anteriormente é empregada para inocular as amostras de efluente para reduzir a cor. A invenção também fornece um método para a redução de níveis de cor de um efluente de moinho de papel e polpa.

Em outra modalidade da presente invenção, os frascos contendo o inóculo anterior são incubados a 37°C a 120 rpm durante 48 horas.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a redução em níveis de lignina totais e cor é observada durante um período de 48 horas.

Em outra modalidade da presente invenção, a cultura é cultivada sobre placas contendo meio de ágar nutriente para viabilidade da bactéria no referido efluente.

Como descrito na patente provisória, as associações bacterianas foram capazes de reduzir a cor do efluente durante um período de cinco dias. Entretanto, estudos mais recentes foram realizados para reduzir o tempo de retenção (prepara o processo mais rápido) bem como para realçar a extensão de redução de cor do efluente. Aproximadamente, uma redução de 58% nos níveis de cor dentro de um período de 24 horas por um único isolado bacteriano foi observada, que é definitivamente melhor do que a redução de 51% no princípio no período de 3 a 5 no caso de associações. Portanto, no relatório descritivo da patente completa, os resultados obtidos empregando-se o isolado bacteriano individual foram a-presentados; sendo notadamente melhores do que aqueles obtidos pelas associações bacterianas. 2. A cultura já foi enviada para depósito em IMTECH no depo-sitório internacional e o número deveria ser distribuído em 17 de março de 2003. 3. Gostaríamos de reivindicar apenas um isolado bacteriano que tem repetidamente dado melhores resultados como determinado na tabela 5 e 8 do relatório descritivo completo. A cepa do Pedido presente é depositada em MTCC, Chandigarh INDIA e o no. de acesso é MTCC 5099. A cepa é mencionada como cepa bacteriana Bacterium B4 no relatório descritivo em vários lugares. A invenção do Pedido presente é também elaborada na forma de exemplos. Entretanto, estes exemplos simplesmente comprovam a invenção e não constroem para limitar o escopo da invenção Exemplo I

As bactérias foram isoladas de água residual emergindo de ambas entradas bem como saída da Planta de Tratamento de Efluente. O pH do efluente foi checado e constatado ser 7,6 + 0,2. Água residual auto-clavada e filtrada foi empregada como meios para isolar bactérias autóctones de porcentagens diferentes viz., 100%, 80%, 50%, 30% e 10% empregando meio de sais minerais (MSM) . A composição do MSM empregada foi como segue: K2HP04 5 mM

KH2P04 5 mM

MgS04.7H20 1 mM

EDTA 0,3 mM

ZnS04.7H20 0,01 mM

MnS04.7H20 0,02 mM

CuS04.7H20 0,004 mM

FeS04.7H20 0,1 mM

NaMo04.2H20 0,004 mM

(NH4)2SO4.7H2O 5 mM pH 7,0 ± 0,2 Para alíquotas de 100 ml de Caldo de Nutriente (NB) , 1 ml de cada entrada bem como saída de água residual foi adicionado e mantida a 37°C/24-48 horas para enriquecimento.

Placas de MSM de efluente foram preparadas empregando 2% de ãgar como agente de solidificação. As placas foram mantidas para solidificação e invertidas ate outro uso. A semeadura de diluição serial foi realizada diluindo-se serialmente os inóculos enriquecidos até uma diluição de 10-12. A diluição serial foi realizada tirando-se 9 ml de alíquotas de tampão de Na2HP04 - NaH2P04 (pH 6,8, 0,05 M) e i-noculando-se 1 ml de inóculo enriquecido no primeiro frasco, vortexando e tirando 1 ml deste frasco e diluindo 0 próximo frasco com elas, até que uma diluição de 10'12 seja obtida. Estes frascos foram em seguida empregados para semear sobre as placas de MSM de efluente. 100 μΐ das diluições anteriores foram colocados no Efluente diferente - MSM semeado e semeado espalhado com a ajuda de uma bastão de vidro estéril. Todos as placas foram preparadas em duplicatas e incubadas durante 24-48 horas a 37°C. Colônias aparecendo sobre estas placas foram marcadas de acordo com diferenças morfológicas e selecionadas para outra purificação.

Colônias exibindo diferente aparência morfológica foram escolhidas com agulha de inoculação estéril e riscadas sobre placas contendo os meios de crescimento respectivos Depois de duas a três sub-culturações repetitivas, os isolados purificados foram obtidos os quais foram testados quanto a pureza e armazenadas como inclinações e tentativas em seus meios respectivos.

Alça de culturas foi tirada e inoculada em alíquotas estéreis de Caldo de Nutriente, vortexada e mantida para incubação a 37°C/120 rpm durante 16-18 horas. Checaram a densidade óptica destas culturas mães em 650 nm.

Trinta e cinco bactérias morfologicamente diferentes foram selecionadas para avaliar a sua capacidade de reduzir a cor da água residual de moinho de polpa. 100 ml de NB estéril foram inoculados com 100 μΐ de culturas mães respectivas e incubados a 37°C/120 rpm durante 16-18 horas. As densidades ópticas finais e iniciais em 650 nm foram notadas. As culturas foram colhidas em um OD^so de 1,5-2,0 centrifugando-se em 6000 rpm durante 20 minutos a 4°C. A pelota obtida foi lavada duas vezes empregando tampão de fosfato estéril (pH 6,8, 0,05 M) e re-suspensa em volume menor do mesmo. Esta suspensão foi em seguida empregada para ensaio de tratabilidade em uma relação de 1:1, isto é, 100 ml de amostra de efluente foram tratados com a pelota obtida de 100 ml de meio de cultura. A experiência de remoção de cor foi realizada em cultura de batelada em frascos de agitação cônicos a 37°C em 120 rpm durante um período de cinco dias. Intensidades de cor foram medidas em 450 nm empregando método de densidade óptica de NCASI no dia zero, terceiro dia e quinto dia. 13 bactérias produziram uma redução de 50% e mais no quinto dia (Tabela 1).

Exemplo II

As treze bactérias individuais exibindo mais do que 50% de redução de cor foram selecionadas e nove associa-ções bacterianas diferentes foram formuladas empregando combinações aleatórias.

Culturas individuais constituindo as associações formuladas foram independentemente cultivadas em caldo de nutriente inoculando-se 100 μΐ de culturas ativamente cultivadas em cada frasco, As culturas foram incubadas a 37°C/16-18 horas em 120 rpm até que a uma densidade óptica 1,5-2,0 fosse obtida. As culturas foram em seguida agrupadas juntas de acordo com a composição de associação. A densidade óptica em 650 nm da cultura agrupada foi avaliada. As células das associações resultantes foram colhidas centrifugando-se em 6000 rpm durante 20 minutos a 4°C e foram lavadas duas vezes com tampão de Na2HP04-NaH2P04 (pH 6,8, 0,05 M) . As pelotas foram em seguida re-dissolvidas em 10 ml de tampão de fosfato e empregadas para experiências de redução de cor.

Amostras de efluente, neutralizada em pH 7,0 + 0,2, foram tiradas em 500 ml de alíquotas em frascos de agitação e inoculadas com as pelotas preparadas acima em uma relação de 1:1. Todos os frascos foram incubados a 37°C/120 rpm durante 3 dias. Os controles foram da mesma forma mantidos, os quais não continha qualquer inóculo adicionado, a-parte da flora indígena.

As amostras foram analisadas quanto aos níveis de cor empregando o ensaio espectrofotométrico de NCASI e a porcentagem de redução calculada. Somente duas associações exibiram redução de cor em mais do que 50% (Tabela 2).

Exemplo III 0 tamanho de inóculo ideal para reduzir os níveis de cor foi checado inoculando-se as associações em três relações diferentes, viz., 1:1, 1:0,5, e 1:0,75 (efluente: cultura). 100 ml de amostras de efluente foram tiradas em frascos de agitação e inoculadas com as associações preparadas de 100 ml, 50 ml e 75 ml de alíquotas de NB. Todas as condições de temperatura de incubação, tempo e agitação foram mantidas similares ao exemplo 2 e os níveis de cor avaliados depois do tratamento durante três dias.

As associações exibiram a redução de cor mais alta com relação de 1:1 de efluente: biomassa (Tabela 3).

Exemplo IV

Para melhorar a eficiência de remoção de cor, o isolamento bacteriano fresco foi realizado da lama ativada obtida de ETP de um Moinho de Papel e Polpa. 5,0 gramas de lama ativada homogeneizada tirada de ETP de moinho de papel e polpa foram enriquecidos em meio consistindo em 100 ml de infusão de lama, 25 ml de caldo de nutriente estéril e 0,1% (p/v) cada dentre lignina (Alkali lignin-Aldrich, USA), va-nilina e tanino (Sigma). O pH foi ajustado para 6,8 ± 0,2, As bactérias individuais foram avaliadas quanto a sua capacidade de descolorir o efluente de moinho de papel. 0 ensaio de tratabilidade foi conduzido em 100 ml de alíquotas e as pelotas bacterianas individuais avaliadas quanto a suas eficiências de remoção de cor. Número de isolado 4 foi observado estar entre todos os melhores, produzindo 68% de remoção de cor em 48 horas, seguido por números de isolados, 35 (63%) e 19 (60%) (Tabela 4).

Exemplo V

Isolados 4, 19 e 35 foram em seguida individualmente cultivados em dois meios diferentes - Caldo de Nutriente (NB) (meios ricos) e Meio de Sais Minerais (meio mínimo) com constituintes inorgânicos e glicose (1%) como fonte de carbono para comparar o efeito de meios de crescimento no desempenho das culturas removendo a cor para águas residuais de moinhos de polpa.

Os isolados anteriores foram da mesma forma separadamente cultivados para formulá-los juntos na forma de uma associação e testar os mesmos quanto ao efeito de meios de cultura sobre a eficiência da associação para reduzir a cor.

Caldo de Nutriente (NB) foi preparado dissolvendo-se (por litro), 5,0 g de digesto péptico de tecido animal, 5,0 g de cloreto de sódio, 1,5 g de extrato de carne de boi, 1,5 g de extrato de levedura e 0,2 ml de Tween-80. Meio de Sais Minerais (MSM) foi preparado como descrito no exemplo I. Glicose (1% em v/v) tirada de sua solução de matéria prima estéril foi da mesma forma adicionada ao MSM para agir como um suplemento de carbono para as bactérias.

Ensaios de remoção de cor foram conduzidos em culturas em batelada em 100 ml de alíquotas com uma temperatura de incubação de 37°C e agitação de 120 rpm. As amostras para análise de cor foram retiradas em intervalos de zero, 24 e 48 horas e analisadas quanto aos níveis de cor.

Ambos, NB bem como culturas cultivadas em MSM exibiram resultados quase similares (Tabela 5).

Exemplo VI

Isolados 4, 19 e 35, que exibiram mais do que 60% de redução em cor do efluente de moinho de polpa, foram formulados em uma associação e avaliados junto com outras associações que continham culturas aleatoriamente combinadas, para suas capacidades de redução de cor. A associação CC17 foi a melhor entre todas que exibem até 55% de redução de cor dentro de 48 horas.

Exemplo VII A associação CC 17 formulada no Exemplo VI foi empregada para remoção de cor de efluente de entrada do século na presença de concentrações diferentes de glicose e sacaro-se Viz. 0,5, 0,75, 1,0 em p/v. 1% de glicose foi constatado ser o melhor suplemento quando comparado a outros produzindo até 75% de redução em cor dentro de 48 horas. Entretanto, todos os outros não foram significativamente diferentes um do outro (Tabela 7) .

Exemplo VIII

Embora a adição de glicose na água residual parecesse produzir melhor redução de cor, entretanto, sua viabilidade praticável é questionável. Portanto os inventores decidiram aumentar o carregamento de biomassa no efluente para observar o efeito. Bactérias no. 4, 19 e 35 foram individualmente cultivadas, como descrito no princípio até um OD 650 de 1,5-2,0, no lugar de 1,0 para formular a associação e MTCC 5099 foi individualmente cultivado para uma densidade óptica de 1,5-2,0 igualmente para observar qualquer realce na eficiência de remoção de cor. Todas as outras condições experimentais foram as mesmas. Número de bactéria 4 exibiu até 55% de redução de cor dentro de 24 horas (Tabela 8).

Os níveis de lignina totais das bactérias anteriores foram da mesma forma estimados empregando o método Pearl Benson Modificado. Número de bactéria 4 exibiu melhor resposta do que as outras bactérias individuais bem como a associação com o carregamento de biomassa aumentado. Os resultados foram replicados três vezes.

Exemplo IX 0 monitoramento de níveis de biomassa e viabilidade do isolado 4 em toda a experiência em termos de Unidades Formadoras de Colônia (CFU/ml) foi realizado.

Foi constatado que em zero hora, o nível de CFU/ml foi aproximadamente IO9 CFU/ml, que manteve como tal até 24 horas e de fato mostrou um aumento para 1010 CFU/ml mostrando que as células foram completamente viáveis mesmo até o final da experiência. As amostras foram riscadas sobre meio de nutriente sólido para comparar as características morfo-lógicas da cultura original com a cultura no efluente e constatou ser as mesmas.

Tabela - 1 Redução na Cor de Entrada de Moinho de Papel e Polpa do Século para ETP _______________________________________________ * Bactérias mostrando mais do que 50% de redução na cor Nota: Todos os valores são médias de três experiências Tabela - 2 % de Redução na Cor de Efluente de Entrada de ETP do Século por Associações Formuladas Diferentes * Associações mostrando mais do que 50% de redução na cor no zero dia Todos os valores são uma média de análises triplicadas com um S.D. de + 0,2 Tabela - 3 % de Redução de Cor de Efluente de Entrada de ETP no Século joor Associações Formuladas Diferentes Todos os valores são uma média de análises triplicadas com um S.D. de + 0,2 Tabela 4 % de Remoção da Cor por Isolados Bacterianos Diferentes De-pois de 48 Horas______________________________________________ Todos os valores são uma média de análises triplicadas com um S.D. de + 0,2 Tabela 5 % de Redução na Cor de efluente de moinho de polpa por Iso-lados Individuais e sua associação formulada_ Todos os valores são média de análises triplicadas com um S.D. de + 0,2 Tabela 6 % de Redução de Cor de Efluente de Moinho de Polpa por Associações Formuladas Diferentes Todos os valores são média de análises triplicadas com um S.D. de + 0,2 Tabela 7 Efeito de Fontes de carbono Adicionais sobre a Eficiência da Associação CC17 Todos os valores são média de análises duplicadas com um S.D. de + 0,2 Tabela 8 Efeito de Níveis de Biomassa Crescentes de Bactérias Indivi- dualmente bem como na Forma de associações sobre a Cor e Níveis de Liqnina Totais de Efluente de Moinho de PolDa Todos os valores são uma média de três leituras com um S.D. de + 0,5 Tabela 9 Viabilidade de MTCC 5099 no Efluente durante a experiência de redução de cor em termos de Unidades Formadoras de Colônia (CFU/mL) Vantagens 1. A bactéria isolada é capaz de reduzir a cor do efluente de moinho de polpa de uma maneira reproduzível. 2. A bactéria isolada permanece viável mesmo depois da conclusão da experiência sugerindo sua reutilização no próximo grupo de experiência. 3. A bactéria naturalmente isolada não é patogênica e pode ser cultivada em meios de nutriente simples sem qualquer carga econômica. 4. Este tipo de redução bacteriana de cor de efluentes de moinho de polpa é novo.

Claims

1. Processo para a preparação de inóculo da cepa bacteriana de No. de Acesso MTCC 5099 CARACTERIZADO por compreender : a) cultivar a cepa bacteriana de No. de Acesso MTCC 5099 em meios de ágar nutriente contendo 0,1% em p/v cada de lignina, tanino e vanilina para obter culturas puras ; b) inocular a referida bactéria em caldo nutriente contendo 0,01% de Tween 80 para obter a cultura iniciadora; c) cultivar a bactéria anterior para obter a bio-massa requerida, inoculando-se a alíquota apropriada do caldo nutriente com a cultura iniciadora, e incubar o meio anterior a 37°C/100 rpm durante 16-18 horas; d) centrifugar a cultura resultante, depois de alcançar uma densidade óptica de 1,5-2,0, para obter pelota, lavar a pelota coletada dissolvendo-se em tampão de P04-3, 0,05M, pH 6,8, re-centrifugar a pelota; e e) coletar a pelota obtida da etapa (d), dissolver em 10 mL de tampão de P04-3, 0,05M, pH 6,8, para obter a lama de célula para estudos de tratabilidade.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do inóculo para uso em experiências de redução de cor ser obtido pela inoculação da referida bactéria em caldo nutriente contendo 0,01% de Tween 80 para obter a cultura iniciadora.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da cultura iniciadora ser empregada para obter o inóculo requerido através da inoculação da alíquota apropriada de caldo nutriente com a cultura iniciadora e incubação do meio acima a 37°C/100 rpm durante 16-18 horas .

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da cultura resultante ser centrifu-qada em rpm apropriada, preferivelmente 6000 rpm, durante um período de 20 minutos a 4°C.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da pelota resultante ser lavada dis-solvendo-se em tampão de P04-3, 0, 05M, pH 6,8, e re-centrifugando-se a pelota.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da pelota resultante ser dissolvida em 10 mL de tampão de P04-3, 0,05M, pH 6,8, para obter o inóculo para estudos de redução de cor.

7. Processo aeróbico para a redução da cor do efluente de moinho de polpa empregando o inóculo da cepa bacteriana de No. de Acesso MTCC 5099 CARACTERIZADO por compreender : a) inocular as alíquotas apropriadas do efluente de moinho de papel e polpa com a lama de célula obtida através do processo conforme definido na reivindicação 1, para estudos de redução de cor junto com um frasco de controle contendo amostra de efluente sem qualquer inóculo adicionado ; b) incubar os frascos estabelecidos na etapa (a) a 37°C/100 rpm durante 48 horas; c) retirar as amostras dos frascos acima em 50 mL de alíquotas e processá-las para avaliar a cor e os níveis de lignina totais, d) analisar a eficiência de remoção de cor da referida bactéria comparando-se os níveis de cor do efluente tratado com a bactéria com o nível de cor da amostra de controle depois de intervalos de 24 e 48 horas, e) checar a viabilidade da referida cultura anterior no efluente cultivando-se a mesma em meio de ágar nutriente e calcular a CFU/mL.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato da viabilidade da referida cultura ser checada semeando-se diluições de amostra tirada da experiência para obter as colônias contáveis e calculando-se a CFU/mL da mesma depois de intervalos de 24 e 48 horas.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de um processo de descoloração biológico aeróbico ser definido empregando a cepa bacteriana de No. de Acesso MTCC 5099, obtida da lama ativada de um ETP de moinho de papel e polpa, que produz até 55% de redução em níveis de cor do dado efluente.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato da cepa mostrar redução de cor de 55% em 24 horas.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato da cepa mostrar redução de cor de 60% em 48 horas.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa é viável depois da redução de cor.