BRPI0318312B1 - método de diagnóstico de doença dos pés e boca por infecção virótica e kit de diagnóstico de doença dos pés e boca por infecção virótica - Google Patents
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Abstract
"método de diagnóstico de doença dos pés e boca por infecção virótica e kit de diagnóstico de doença dos pés e boca por infecção virótica". provê um método para diagnóstico de doença da boca e pés por infecção virótica, compreendendo as etapas de aplicação de uma quantidade predeterminada de uma amostra de teste a uma região de carga de uma fita; acoplamento de um reagente de detecção incluindo um reagente de rotulagem dado para um material de análise de interesse na amostra de teste para formar um complexo entre eles; desenvolvimento do complexo em uma membrana trançada; e observação de mudanças na aparência de uma zona de reatividade tendo pelo menos mais que uma fase imobilizada selecionada de antígeno, anticorpo ou hapteno na região predeterminada da membrana trançada, derivada de fmdv ou obtida de fmdv através de uma reação imunológica para determinar a presença ou ausência de doença dos pés e boca por infecção virótica. ela também provê um kit para diagnosticar doença dos pés e boca por infecção virótica compreendendo uma fita (1) incluindo uma zona de reatividade (13) contendo pelo menos mais que uma fase imobilizada selecionada de antígeno, anticorpo ou hapteno na mesma, derivados de fmdv ou obtidos de fmdv através de uma reação imunológica, e uma zona de controle (14) para confirmar a operação normal do kit, provida em uma região predeterminada de uma membrana trançada (9); e um alojamento (20) protegendo a fita (1) de uma variedade de contaminantes, e incluindo pelo menos uma porta de aplicação de amostra de teste (2) e uma janela indicadora (4) para observação dos resultados de reação na zona de reatividade (13) e na zona de controle (14) na fita.
Description
"MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA E KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS Ξ BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA". A presente patente de privilégio de invenção refere-se a um método e um kit para diagnosticar uma infecção do indivíduo com o vírus da febre aftosa (FMDV) e mais particularmente, um método e conjunto de instrumentos para detectar rapidamente a infecção dos sujeitos com FMDV pela observância de uma mudança na aparência de uma zona de reatividade contendo, ao menos, mais do que uma fase imobilizada selecionada de antígenos, anticorpos ou haptenos derivados do FMDV, ou viáveis do FMDV através de uma reação imunológica que é reativa imunológica com a amostra de teste de animais como alvo. A Febre Aftosa (FMD) é uma doença devastadora de animais criados em fazenda e uma doença Lista-A do Office International dês Epizooties. Todas as espécies de animais de casco (gado, porcos, ovelhas, cabras) são suscetíveis e a doença é extremamente contagiosa. Perdas financeiras como resultado da FMD podem ser significantes. Hã perdas diretas devido a mortes de animais jovens, perda de leite, perda de carne e uma diminuição na performance produtiva. Os custos associados com a erradicação ou controle podem ser altos e, além disso, hã perdas indiretas devido â imposição das restrições de comercialização. O agente causador é o FMDV, um aftovírus da família do Picornaviridae (Bittle et al., 1982 e Fross et al., 1984). O genoma FMDV consiste em um único filamento positivo RNA de aproximadamente 8.000 bases de nucleotídeo. O RNA é inicialmente traduzido como um único polipeptídio que é, subsequentemente, clivado por proteases virais codificadas para produzir quatro proteínas capsídeas de (VP1-VP4) e polipeptídios não-estruturais (2C, 3a, 3ABC e 3D) em células infectadas. A região de codificação para proteínas estruturais e não-estruturais é mostrada de maneira esquemãtica na figura 3. O vírus FMD é antigenicamente heterogêneo. Sete estereótipos distintos foram reconhecidos O, A, C, ASIAl, SAT1, SAT2 e SAT3 (SAT = Territórios Africanos). Cada estereótipo de FMDV é antigenicamente distinto dos outros seis estereótipos. Os vírus do estereótipo A são os mais variáveis, tendo mais de 30 subtipos. Além disso, cada estereótipo pode ser subdividido em subtipos múltiplos antigenicamente distintos. Os estereótipos do vírus FMD foram originalmente identificados por experiências de imunidade remissiva em animais. Um animal, recuperado da infecção, com um estereótipo, sendo resistente para desafiar pelo mesmo estereotipo, mas permanecendo suscetível à infecção por qualquer outro estereótipo. Os diferentes estereótipos de FMDV têm diferentes distribuições geológicas. Na Ásia, estereótipos A, O e Ásia são mais comuns. Na Europa e América do Sul, estereótipos A, O e C são encontrados. Na África, estereótipos A, O e SAT são prevalentes. Alguns países na África, Ásia e América do Sul são áreas endêmicas. 0 diagnóstico primário de FMD envolve o reconhecimento de sinais clínicos típicos em animais afetados. Os sinais clínicos de FMD são essencialmente similares em todas as espécies apesar da severidade poder variar de forma considerável. Os sinais principais são febre seguida de formação de vesícula na boca e pés, resultando em salivação e fraqueza. 0 diagnóstico serológico é determinado pela presença de antígenos ou anticorpos específicos do FMDV nos animais suspeitos e podem ser normalmente realizados por testes ELISA e de neutralização de vírus.
Após os animais terem sido infectados com o FMDV, anticorpos específicos contra proteínas estruturais (SPs) e proteínas não-estruturais (NSPs) começam a aparecer e a títragem aumentar e permanecer longa. Assim, a presença de anticorpos específicos de vírus FMD em um soro indica que o animal do qual a amostra foi coletada teve contato com o vírus ou antígeno da FMD. A detecção de anticorpos para o vírus FMD em soro tem várias utilidades. A detecção de anticorpos evidencia infecção anterior em animais dos quais o material vesicular não está disponível. A diagnose do FMD por sinais clínicos pode ser difícil, especialmente para ovelhas e cabras, nos quais os sinais clínicos são freqüentemente amenos (Barnett, P. V et al., 1999 e Callens, M. L. et al., 1998). Além disso, várias outras infecções de vírus vesiculares, incluindo aquelas causadas pelo vírus da doença vesicular suína (SVD), vírus da estomatite vesicular, e outros, não podem ser distinguidas da infecção FMDV através de achados clínicos. 0 FMDV pode estabelecer um estágio persistente ou de portador em ruminantes e não mostram sinais de FMD. Tais animais portadores podem tornar-se a fonte de novos aparecimentos da doença. Em função destes problemas, um método sorológico rápido é necessário para identificar os animais infectados e/ou portadores e distingui-los dos animais vacinados. Este método de detecção de anticorpos pode ser usado em pesquisas epídemiológícas e para medir a efetividade da vacinação.
Tanto a vacinação quanto a infecção induzem os anticorpos às proteínas capsídeas estruturais. Portanto, se a proteína capsídea é usada sozinha na análise do diagnóstico, ela determinará tanto o animal vacinado quanto o infectado, com base na detecção do anticorpo para a proteína estrutural. Por esta razão, o teste de anticorpos para a proteína estrutural pode ser usado comumente em regiões livres de vacinação como EUA e Reino Unido, mas não em regiões onde a prática da vacinação for estabelecida. Mas, mesmo em áreas onde os animais são vacinados, a FMD ocorre com frequência. Em tais regiões, os teste de diagnósticos que podem diferenciar a infecção da vacinação são exigidos. Vários estudos relataram que usar proteínas não-estruturais de FMDV como 2C e 3ABC, os animais que haviam sido infectados com FMDV poderíam ser diferenciados dos animais vacinados com base na detecção de anticorpos a uma ou mais proteínas não-estruturais do vírus (Rodriguez A et al, Mackey Dk et al., Sorensen KJ et al.).
Um outro método para detectar o FMDV é o PCR (reação em cadeia da polimerase). Para detectar sequência de RNA específica de FMDV, uma análise RT-PCR (transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase) também foi desenvolvida (Munes et al.). Esta técnica pode fornecer alta e específica sensibilidade e assim detectar RNA viral da FMD em amostra pobremente preservadas quando apresentado vírus insuficiente para iniciar infecção em cultura de tecido. Mas este método requer equipamentos para PCR e eletricidade, o que o toma impraticável na análise de campo e, se substâncias inibitórias â reação da PCR estiverem presente em algumas amostras, algumas amostras que contenham vírus ou genoma viral não darão resultado positivo por PCR.
Portanto, a presente invenção foi feita em vista dos problemas acima, e é um objeto da presente invenção fornecer um método para diagnosticar a infecção do animal sujeito com o vírus da febre aftosa, possibilitando facilitar e rapidamente identificar se o animal está infectado com o vírus ou não, sob o uso de amostras biológicas obtidas do animal. É outro objeto da presente invenção fornecer um kit de diagnóstico para realizar o método acima mencionado.
De acordo com a presente invenção, os objetos acima e outros objetos podem ser realizados através da provisão de um método para diagnosticar a infecção do vírus da febre aftosa compreendendo as etapas de: 1} aplicar uma quantia pré-determinada de uma amostra de teste para uma região de carregamento de uma faixa; 2) juntar um reagente de detecção, incluindo um determinado reagente classificatório a um analito de interesse na amostra teste para formar um meio complexo; 3) desenvolver o complexo sobre uma membrana torcida; e 4) observar as mudanças na aparência de uma zona de reatividade tendo ao menos mais do que uma fase imobilizada selecionada a partir do antígeno, anticorpo ou hapteno na região pré-determinada na membrana torcida, derivado do FMDV, ou viáveis do FMDV através de uma reação imunológica para determinar a presença ou ausência de infecção do vírus da febre aftosa. 0 método de diagnóstico de acordo com a presente invenção inclui uma analise sanduíche ou uma análise de competição.
Como um conjunto de instrumentos de diagnóstico, a fim de realizar o método de diagnóstico conforme acima descrito, a presente invenção fornece um conjunto para diagnóstico de infecção de vírus de febre aftosa compreendendo: • uma faixa 1 incluindo uma zona de reatividade 13 contendo ao menos mais do que uma fase imobilizada selecionada de antígenos, anticorpos ou haptenos derivados do FMDV, ou viáveis do FMDV através de uma reação imunológica, e um controle de zona 14 para confirmar operação normal do conjunto de instrumentos, fornecidos em uma região predeterminada de uma membrana torcida 9; e • uma hospedagem 20 protegendo a faixa 1 de uma variedade de contaminantes, e incluindo ao menos uma porta 2 de aplicativo de amostra de teste e uma janela símbolo 4 para observar os resultados da reação na zona de reatividade e a zona de controle 14 na faixa 1. A amostra teste é preferivelmente um fluído corpóreo que é produzido fora do corpo e inclui sangue, soro, plasma, urina, lágrimas, saliva, leite, etc.
Também, o analito de interesse que esta contido na amostra teste a ser analisado pode incluir quaisquer substâncias contendo membros de ligação específica que podem ser naturalmente formados ou artificialmente transmitidos, incluindo substâncias presentes em antígenos, anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais e policlonais), haptenos, e combinações destes, por exemplo.
Além disso, uma fase imobilizada (ou, reagente de captura) é um membro de ligação específico não classificado que, de modo específico, liga-se ao analito e é imobilizado de modo direto ou indireto na membrana torcida 9 da faixa 1. O reagente de detecção, pode ligar-se de maneira difusa ou não difusa a uma plataforma e inclui um reagente classificado, o membro auxiliar de ligação específica e/ou um componente de um sistema gerador de sinal. 0 sistema gerador de sinal inclui ao menos um membro catalítico e soluto. 0 soluto pode ser catalisado pelo membro catalítico para induzir uma reação, e gera um sinal reconhecível a partir da membrana superficial ou interna. 0 membro catalítico pode ser enzima ou não-enzima. 0 soluto pode realizar a reação que está catalisada pelo membro catalítico. Tal reação produz uma grande quantia de composto gerador de sinal que pode ser diretamente ou indiretamente detectãvel. 0 sinal detectável por estes componentes inclui espectrofotométrico, sinal visível, sinal eletroquímico e outros sinais eletricamente detectáveis. A presente patente será pormenorizadamente descrita com base nas figuras abaixo relacionadas, nas quais: a figura la mostra uma visão perspectiva separada de um dispositivo (um conjunto de instrumentos rápidos) para a diagnosticar infecção do animal sujeito com vírus da febre aftosa de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção; a figura lb mostra uma visão perspectiva separada de um dispositivo (um conjunto de instrumentos rápidos) para a diagnosticar infecção do animal sujeito com vírus da febre aftosa de acordo com um segundo aspecto da presente invenção; a figura 2 mostra uma configuração de uma faixa constituindo um dispositivo de diagnóstico de acordo com a presente invenção; a figura 3 mostra uma estrutura de uma poliproteína expressada a partir do vírus da febre aftosa; as figuras 4a e 4b mostram um resultado de teste exemplificado para um conjunto de instrumentos de teste de uma linha; as figuras 5a, 5b e 5c mostram um resultado de teste exemplificado para um conjunto de instrumentos de teste de duas linhas; a figura 6 mostra um mapa de plasmídeo pBM-VPlTw97F; a figura 7 mostra um mapa de plasmídeo pBM-2CTw97F; a figura 8 mostra um mapa de plasmídeo pBM-3ABCTw97F; e a figura 9 mostra um mapa de plasmídeo pBM-3DTw97F.
Cabe ainda salientar que na figura 3, a indicação 3.1 representa o Peptídeo líder, a indicação 3.2 representa o percursor de poliproteína, a indicação 3.3 representa "3D(RNA polimerase)", e a indicação 3.4 representa "3C(protease); e nas figuras 6, 7, 8 e 9, as insicações A representam "promotor tac", as indicações B representam "glutatíona S-transferase", e as indicações C representam "Beta-lactamase".
As figuras la e lb são, respectivamente, visões perspectivas separadas dos conjuntos de instrumentos de diagnóstico exemplificados como uma configuração preferida usada na presente invenção. 0 conjunto de instrumentos de diagnóstico inclui uma faixa 1 e uma hospedagem 20. A hospedagem é requerida para identificar uma amostra de teste de uma porta 2 de aplicativo de amostra de teste e uma porta 3 de aplicativo de reagente em desenvolvimento em uma plataforma de filtro (ou uma plataforma de pigmento: refere-se a uma plataforma contendo um reagente de detecção). 0 conjunto de ferramentas inclui um corpo principal 7 tendo uma cobertura 5 compreendendo uma janela indicia 4 para mostrar os resultados dos testes e um membro de montagem de faixa 6 para colocar e fixar a faixa 1 no seu local. A cobertura 5 e corpo principal 7, estão interconectados através de um membro de fixação 8. Eles são exigidos para fixar a faixa 1 e para prevenir o contato com uma zona de reatividade ou contaminação desta, e são preferivelmente feitos de material não reativo que não rege com quaisquer outros reagentes usados no teste, tal qual plástico ou similares.
Conforme apresentado na configuração da figura la de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, onde a amostra de teste ê identificada através da porta 2 de aplicativo na plataforma de filtro 11 (também servindo como uma plataforma de pigmento), uma porta 3 de aplicativo reagente em desenvolvimento separado é requerida. A porta 3 de aplicativo reagente em desenvolvimento é configurada para ter uma curvatura em forma de xícara a fim de receber uma quantia predeterminante do reagente em desenvolvimento. Também, a parte mais baixa desta é, preferivelmente, em contato próximo com uma plataforma de reservatório 10 a fim de evitar que o reagente derrame em outras regiões do dispositivo de teste.
Diferentemente da configuração na figura la, onde uma porta 2' de aplicativo de amostra de teste é posicionada sobre uma parte imediatamente superior de uma plataforma de reservatório 10' constituindo a faixa a fim de que aplique ímedíatamente a amostra de teste â plataforma de reservatório 10' (neste caso, a plataforma de reservatório também tem a função da plataforma de filtro conforme o seguinte exemplo abaixo, e, assim, nenhuma porta de aplicativo de reagente em desenvolvimento em separado é solicitada), conforme mostrado na configuração da figura 1b, de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, a porta de aplicativo 2' é configurada para ter uma curvatura em forma de xícara a fim de que receba uma quantia predeterminada da amostra de teste. Ainda, a parte mais baixa desta está, preferencialmente, em contato próximo com a plataforma de reservatório a fim de evitar que a amostra do teste derrame em outras regiões do dispositivo de teste. Neste caso, uma plataforma 11' é uma plataforma de pigmento contendo o reagente de detecção, ou uma segunda plataforma de filtro, ou pode ser eliminada.
Uma janela símbolo 4 é criada para observar mudanças externas que ocorrem na zona de reatividade 13 e uma zona de controle 14 na membrana torcida 9 constituindo a faixa 1 e é apresentada uma cobertura de hospedagem 5 a fim de ser posicionada imediatamente sobre a zona de reatividade 13 e zona de controle 14.
Ainda, a cobertura de hospedagem 5 pode se equipada com símbolos de discriminação específicos, por exemplo, 'D' para data de teste, 'ID' para o sujeito, 'C' para a zona de controle, 'T' (teste) para a zona de reatividade, Ά' (amostra) para a porta de aplicativo da amostra do teste, porta de aplicativo de reagente em desenvolvimento, janela indicia para mostrar o resultado do teste, etc. podem ser facilmente distinguidos. Aqueles símbolos podem ser qualquer letra, número, ícone ou similares e quaisquer combinações destes diferentes do precedente.
Agora, como configuração preferida, uma estrutura de uma faixa constituindo o dispositivo de diagnóstico de acordo com a presente invenção será descrito com referência às figuras la e lb e figura 2, A figura la mostra uma configuração de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. A faixa inventiva 1 inclui uma membrana torcida 9, uma plataforma reservatório 10, uma plataforma de filtro 11 (também servindo como plataforma de pigmento), uma plataforma absorvente 12, e uma zona de reatividade 13 e uma zona de controle 14 apresentada na membrana torcida 9. na superfície posterior da faixa 1, está anexado um membro base 15 para montar a faixa 1 em um membro de montagem 6 do corpo de hospedagem principal 7. O membro base 15, é, preferencialmente, feito de plástico ou prato de vidro. A figura lb mostra uma outra configuração de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. A faixa inventiva 1' tem a mesma configuração da faixa mostrada na figura la, exceto para a plataforma de reservatório 10', e uma plataforma de filtro 11' (que pode também servir cortio plataforma de pigmento) . A descrição detalhada da respectiva configuração deste será baseado no primeiro aspecto da presente invenção mostrada na figura la, mas somente a diferença entre estes será mencionada.
Uma plataforma de filtro 11 está em contato com uma superfície posterior da membrana torcida 9 para cromatografia para formar uma passagem de conexão pãrea fluxo de fluido na membrana torcida 9. a superfície posterior da plataforma de filtro 11 está em contato com a plataforma de reservatório 10 para formar uma passagem de conexão para o fluxo de fluido entre elas. A plataforma absorvente 12 está anexada à parte superior da membrana torcida 9. Em uma região pré-determinante da membrana 9, estão separadas uma zona de reatividade 13, contendo ao menos mais do que uma fase imobilizada que liga-se, especificamente, a um analito a ser detectado, um reagente classificado, um membro auxiliar de conexão específica ou similares, e uma zona de controle 14 para determinar se o conjunto de instrumentos está operando normalmente. A plataforma de reservatório 10 absorve a amostra de teste, ou a solução necessária para outros testes, por exemplo, um reagente em desenvolvimento, e similares e inclui uma membrana capilar para transferir analito à plataforma de filtro ou membrana torcida. A plataforma de reservatório 10, é requerida que tenha vácuos e volume suficiente para receber a amostra de teste ou reagente em desenvolvimento. 0 material adequado para a plataforma de reservatório é, preferivelmente, substâncias de ligação de proteína de peso molecular baixo, incluindo celulose, poliéster, poliuretano, fibra de vidro, tendo um tamanho de poro de 0.45 a 60 μ™, etc. A plataforma de filtro 11 filtra componentes desnecessários na amostra de teste e pode conter um reagente de detecção (neste caso, a plataforma de filtro pode também funcionar como uma plataforma de pigmento). Onde o reagente de detecção está inserido na plataforma de filtro, há uma vantagem de eliminar a etapa de pré-misturar o reagente de detecção com a amostra de teste para o teste. Assim como o material adequado para a plataforma de filtro 11, pode ser mencionado poliéster, poliuretano, policetato, celulose, fibra de vidro, nylon, tendo um tamanho de poro de 0.45 a 60 μπι, etc. Onde apropriado, a plataforma de reservatório 10 e a plataforma de filtro 11, podem ser feitas do mesmo material e, neste caso, o reagente de detecção pode estar inserido no fundo de uma plataforma de filtro 11 longa. 0 reagente de detecção é guarnecido com um reagente classificado, membro auxiliar de ligação específica, e/ou um componente constitucional de um sistema gerador de sinal que possibilita identificar a presença do analito de interesse a olho nu ou outra instrumentação externa. Os reagentes de detecção classificados são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Exemplos de tais classificações incluem catalise, enzimas (por exemplo, fosfatase, peroxidase, etc., e mais especificamente, fosfatase alcalina e peroxidase do rãbano silvestre, ou similares, que á usado em combinação com um substrato para uma enzima), substrato para enzima (por exemplo, nítrobluetrazolium, 3,5',5,5 '-tetranitrobenzidina, 4-metoxy-l-naftanol, 4-cloro-l-naftanol, 5-bromo-4-cloro-3-indolylfosfato, substratos chemoluminiscente para enzimas, por exemplo, dioxetano e derivados e análogos destes), compostos fluorescentes (por exemplo, fluoresceina, phycobiliproteína, rodamina, derivados e análogos destes), compostos chemoluminiscentes, elementos radiativos, e similares. Além destes, metal sol, pigmento sol, látex em forma de partículas, indicador de cor, matéria de cor inserida em lipossoma, carbono sol e não-metal sol como selênio, podem ser mencionados conforme apresentado na Patente US N° 5.728.587 também. Ainda, esta patente, nas colunas 8-10, apresenta um grande número de classificações imunoquímicas como classificações usadas no método de diagnóstico da presente invenção.
Os reagentes de classificação acima mencionados podem formar um conjugado com um determinado membro auxiliar de ligação específica tendo uma propriedade de facilmente ligar-se a um analito de interesse. Um membro auxiliar de ligação específica não é especificamente limitado e inclui antígeno, anticorpos, haptenos ou similares, por exemplo, proteína G, proteína A, proteína G/A, conhecidos como matéria de boa ligação com um anticorpo no caso do analito ser anticorpo e vários anticorpos conhecidos como boas ligações a outros anticorpos IgG e IgM. Estes materiais são apresentados comercialmente como recombinantes Sigma, etc. A partir do precedente, o reagente de detecção, não precisa necessariamente estar incluído na plataforma de filtro 11. 0 reagente de detecção pode ser suprido em qualquer ponto entre a zona de reatividade 13 na membrana torcida mostrando um resultado de detecção e a porta de aplicativo de amostra de teste. Este reagente de detecção pode ser aplicado no superior ou interior de qualquer ponto da plataforma de filtro 11 ou membrana torcida 9, no estado seco ou seco congelado. Então, se desejado, a fim de melhorar a sensibilidade do teste, reatividade, etc, uma variedade de agentes auxiliares podem ser adicionados, como buffer, detergente, solução de armazenamento antícoagulante e similares, por exemplo.
Além disso, a faixa 1 pode ainda incluir um determinado reagente de controle para determinar se o conjunto de instrumentos está operando normalmente ou não. Similar ao reagente de detecção, o reagente de controle pode ter suprido a qualquer ponto entre a plataforma de filtro 11 ou a zona de reatividade 13 na membrana torcida 9 e a porta de aplicativo da amostra do teste. 0 reagente de controle pode ser selecionado a partir da proteína, antígeno, anticorpos e similares, classificados, que especificamente ligam-se a uma fase imobilizada (por exemplo, proteína, antígeno, anticorpos ou similares) formando uma zona de controle (ou faixa de controle) na membrana torcida 9. Estas fases imobilizadas e reagentes de controle são bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Como o reagente de classificação que pode ser incluído no reagente de controle, aqueles descritos no reagente de detecção podem ser aplicados. 0 membro auxiliar de ligação específica não está particularmente limitado e inclui uma espécie selecionada de avidina, biotina, FXTC, anticorpos de anti-FITC de camundongos, imunoglobulina de camundongo ou anticorpos de imunoglobulina de anticamundongos, por exemplo. A membrana torcida 9 deveria ter suficiente vácuo, e ser capaz de absorver porções substanciais de amostra de teste que passaram pela plataforma de filtro 11. como um exemplo de material adequado para tal membrana torcida, foi mencionado ao menos mais do que um material selecionado de nylon, poliéster, celulose, polisulfone, fluoreto de polivinilideno, acetato de celulose, poliuretano, fibra de vidro, nitrocelulose ou similares.
Onde um reagente em desenvolvimento for empregado, um exemplo de material adequado para o reagente em desenvolvimento pode incluir buffer fosfato, salina, Tris-HCL, água, etc. 0 reagente em desenvolvimento é requerido onde a porta 2 de aplicativo de amostra de teste está posicionada sobre a parte imediatamente superior da plataforma de filtro 11 a fim de identificar a amostra de teste. Portanto, como na configuração em concordância com o segundo aspecto da figura lb, o reagente em desenvolvimento não é particularmente requerido onde a porta 2' de aplicativo de amostra de teste está posicionada na plataforma de reservatório 10' a fim de carregar uma pré-determinada quantia de amostra de teste nela.
Onde o complexo classificado com o reagente de detecção contém o analito a ser detectado, ele liga-se à fase imobilizada localizada na zona de reatividade 13 da membrana torcida 9 e então resulta em mudança externamente discernível. 0 material que pode ser usado assim como uma fase imobilizada pode incluir ao menos mais do que um selecionado de antígeno, anticorpos ou haptenos que constituem o vírus da febre aftosa ou pode ser derivado destes a através de uma reação imunológica. O material que pode ser usado como antígeno, inclui proteínas estruturais e/ou não-estruturais. As proteínas estruturais incluem materiais rompidos de FMDV inativo ou constituintes deste, polipeptídio VP1-VP4. proteínas não-estruturais podem incluir ao menos mais do que um polipeptídio selecionado a partir do peptídeo líder (Lb), 2B, 2C, 3a, 3D, 3ΆΒ e 3ABC. A figura 3 mostra um mapa de um precursor de poliproteína compreendendo proteínas estruturais e não-estruturais.
As proteínas estruturais com o mesmo nome podem também exibir alguma diferença em aminoãcidos constitucionais entre eles, dependendo da classificação sorológica do FMDV. Preferencialmente, as proteínas estruturais que podem ser usadas na presente invenção não estão, particularmente, limitadas, conquanto que elas possam reagir especificamente com anticorpos formados contra todos os sorotipos. Um exemplo destas proteínas estruturais inclui, mas não limita a, VP1 representado por SEQ ID NO:118.
Entretanto, mesmo quando a proteína estrutural sozinha acima mencionada é usada como uma fase imobilizada para a construção do conjunto de ferramentas de diagnóstico, ha o caso em que é possível diagnosticar, de modo preciso se o gado está infectado ou não com o vírus da febre aftosa, para o gado não vacinado, mas é difícil de distinguir gado infectado de gado vacinado. Um exemplo de antígeno empregado na produção de vacinas inclui, além de proteína estrutural, uma proteína 3D não-estrutural. Assim, mesmo quando uma proteína 3D não-estrutural é usada como uma fase imobilizada, as mesmas limitações, conforme descritas acima, aparecem. Um exemplo de uma proteína 3D não-estrutural é mostrado na SEQ ID NO:121.
As proteínas não-estruturais {exceto para 3D) são proteínas que não foram usadas na produção de vacinas convencionais e um anticorpo àquelas proteínas é viável somente em animal infectado. Assim, quando esta proteína for aplicada como uma fase imobilizada, será possível fazer um diagnóstico exato para o animal infectado. E claro que tal proteína não-estrutural também tenha alguma diferença em aminoácidos constituintes desta, dependendo do respectivo sorotipo de FMDV. Proteínas não- estruturais utilizáveis não são particularmente limitadas, assim como preferenciais, elas podem especificamente reagir com anticorpos produzidos contra todos os sorotipos. Os exemplos destas proteínas estruturais incluem 2C representados por SEQ ID NO:119 e 3ABC representada por SEQ ID NO:12 0.
As figuras 4a e 4b mostram um exemplo foi aplicada como uma fase imobilizada única. T representa a zona de reatividade na qual a proteína não-estrutural (2C ou 3ABC) foi imobilizada, o que nunca foi usado na produção de vacina até agora. C representa uma zona de controle. 0 conjunto de ferramentas tendo tanto T quanto C descolorado (figura 4b} representa um animal negativo anterior à vacinação ou animal vacinado. Se C não for descolorado em qualquer caso, significa que o conjunto de ferramentas de interesse não foi normalmente operado com o resultado, assim obtido, sendo não-confiãvel.
Onde somente a proteína não-estrutural, conforme acima descrito é empregada como em uma fase imobilizada, é difícil distinguir entre o animal negativo anterior à vacinação e o animal vacinado, neste caso. Portanto, a configuração mais preferida da presente invenção traz um método de diagnóstico e o conjunto de ferramentas que possibilita distinguir um animal infectado com FMDV assim como um animal vacinado. Com este propósito, é preferível ter uma primeira zona reatividade na qual como uma fase imobilizada, um antígeno utilizável na produção de vacina conhecida até agora foi imobilizado em um local específico na membrana torcida e uma segunda zona de reatividade na qual como uma fase imobilizada, uma proteína não-estrutural que era tida como nunca antes usada na produção de vacina foi espaçada e imobilizada em um local específico diferente da primeira zona de reatividade na membrana torcida. Portanto, é possível diagnosticar se o animal foi vacinado, infectado pelo vírus ou negativo anterior à vacinação, através de mudança na aparência produzida de uma reação de ligação entre estas primeiras e segundas zonas de reatividade e um complexo classificado. A fase imobilizada unindo a um reagente controle forma uma zona de controle em um local diferente espaçado das zonas de reatividade. Como tal fase imobilizada, vários reagentes e fases imobilizadas que são aplicadas em outros conjuntos de instrumentos comercialmente disponíveis podem ser usados. Detalhes que serão descritos em exemplos a seguir.
Agora, um método para diagnosticar infecção de FMDV usando o conjunto de instrumentos tendo a configuração acima descrita será escrito com referencia às configurações preferidas. Uma amostra de teste como soro animal (ou plasma, todo sangue) é indicado na porta 2 de aplicativo de amostra de teste formada na cobertura da hospedagem. A plataforma de filtro 10, constituindo a faixa, é posicionada na extremidade mais baixa da porta 2 de aplicativo. A plataforma de filtro 10 também contém uma proteína G-gold conjugada como um reagente de detecção. A proteína G-gold conjugada pode formar complexos com todos anticorpos presentes na amostra de teste. Uma quantia pré-determínada de um reagente em desenvolvimento é carregada na porta 3 de aplicativo de reagente em desenvolvimento na qual a plataforma de reservatório 10 constituindo a faixa é posicionada na extremidade mais baixa deste. A aplicação de reagentes em desenvolvimento resulta na formação de um complexo entre o conjugado classificado e um anticorpo na amostra de teste. Então, este complexo é cromatografado pelo eixo longitudinal da membrana torcida 9 (preferivelmente, membrana nitrocelulose}. O antígeno recombinante do FMDV (a construção aqui será descrita em detalhes com referencia aos exemplos seguintes) foi anteriormente aplicado e imobilizado na zona de reatividade 13 da membrana torcida 9, e assim, se o complexo contém um anticorpo especifico ao antígeno recombinante, este sofrerá reação e então mostrará descoloração na forma de uma linha vermelha.
Se o antígeno recombinante incluir tanto proteínas estruturais quanto não-estruturais, hã descrito, por exemplo, um método de diagnose se o animal foi vacinado, infectado pelo vírus ou negativo anterior â vacinação.
As figuras 5a, 5b e 5c mostram este exemplo. TI representa uma linha na qual o antígeno (proteína estrutural ou proteína não-estrutural 3D), que tinha sido introduzida na produção de vacina até agora, foi imobilizada. T2 representa uma linha na qual uma proteína não-estrutural (2C ou 3ABC) que nunca tinha sido usada antes na produção de vacina foi imobilizada. C representa a linha de controle. Primeiro, o conjunto de instrumentos (figura 5a) na qual todos Tl, TI e C que foram descolorados representam um animal infectado pelo vírus. Segundo, um conjunto de instrumentos (figura 5b} na qual somente o Tl e C que forma descolorados representam um animal vacinado. Finalmente, um conjunto de instrumentos (figura 5c) significa um animal negativo anterior à vacinação, já que somente o C estava descolorado. Se C não estivesse descolorado em nenhum caso, significa que o conjunto de instrumentos não foi normalmente operado com o resultado, assim obtido, não sendo confiável.
Conforme descrito acima, o dispositivo de diagnóstico utilizável na presente invenção pode ser feito de varias configurações e modificações conforme revelado em US 5,728,587 e a revelação específica da construção da faixa (ou seja, arranjo das plataformas) incluídas neste disposto em separado não constitui a essência da presente invenção. Assim, o arranjo da plataforma não é limitado àquelas descritas acima e outros arranjos como uma plataforma de reserva/uma primeira plataforma de filtro/uma segunda plataforma de filtro/uma membrana torcida/uma plataforma absorvente podem ser consideradas. Neste caso, a primeira plataforma de filtro ou uma segunda plataforma de filtro serve para filtrar e separar as células sanguíneas, ou filtrar e remover materiais estranhos desnecessários para a amostra de teste.
Apesar da presente invenção ser convenientemente explicada por meio do exemplo de proteínas estruturais e não estruturais constituindo o vírus da febre aftosa como uma fase imobilizada contida na zona de reatividade, o escopo e espírito da presente invenção seria construído para circundar qualquer material que havia sido já fornecido como antígeno para a produção de vacina no momento de classificar a presente invenção ou seria fornecido como antígeno em um futuro próximo e um determinado material capaz de induzir um anticorpo in vivo (incluindo hapteno) ou vários anticorpos obtidos a partir do FMDV através de uma reação imunológica.
Exemplos Agora, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos a seguir. Estes exemplos são fornecidos apenas para ilustração da presente invenção e não devem ser interpretados como límítantes do escopo e espírito da presente invenção, MATERIAIS
Oligonucleotídeos para a construção e sequência de genes foram sintetizados na ResGen (Huntsville, Al) . A menos que de outra forma indicado, a sequência de DNA também foi realizada na ReGen.
Para a reação em cadeira de polimerase (PCR) , a Vent DNA polimerase e buffer foram compradas da New England Biolabs, Inc, (Beverly, MA) e uma mistura de dNTPs foi comprada da Amersham-Pharmacia (Piscataway, NJ) e usada de acordo com as especificações do fabricante a menos que indicado de outra maneira. As amplificações de PCR foram realizadas em um alternador térmico GeneAmp 2400 das Perkin Elmer Corporation (Foster City, Calif). O produto PCR foi purificado pelo uso de coluna Qiagen PCR {Qiagen Inc., Chatsworth, Calif) conforme recomendado pelo fabricante. A menos que indicado de outro modo, as enzimas de restrição foram adquiridas da New England Biolabs, e os fragmentos de DNA foram isolados em géis de agarose (Sigma-Aldrich) , tratados com enzimas de restrição e então usados para clonagem. O fragmento desejado e o DNA foi extraído com um conjunto de extração de gel QIAEX II conforme recomendado pelo fabricante. O DNA foi suspenso novamente em H20 ou TE (lm ácido Etilenodiaminotetraacético EDTA; pH 8,0; Sigma-Aldrich) , lOmM Tris (hidroximetil) aminometano-hidrocloridro (TRis-HCL; pH 8,0; Sigma-Aldrich) ). As ligações foram realizadas através do uso de ligase DNA (Boehringer Mannhein Corporation, Indianãpolis, Ind.) conforme recomendado pelo fabricante. A reação de ligação foi incubada a 16°C durante a noite. As transformações bacteriais foram realizadas através do uso de células competentes XLl-Blue da E-Coli. A menos que indicado de outro modo, as transformações bacteriais remarcadas oram laminadas nas laminas ágar LB (Lennos) suplementadas com ampicilina lOOug/ml. Todas incubações bacteriais (laminas e culturas liquidas) foram conduzidas por toda a noite (16 horas) a 37°C.
Filtrar os transformantes para identificar os clones desejados foi realizado pela digestão da enzima de restrição mini-reparação de DNA e/ou colônia PCR. A mini-reparação de DNA foi preparada de acordo com a Clonagem Molecular: Um Laboratório Manual, a menos que outro seja indicado. As colônias contendo clones desejados foram propagadas a partir de transferência de laminas ou armazenadas em glicerol a -70°C. PRODUÇÃO DE ANTIGENO Exemplo 1 A. Preparação do antígeno recombinante FMDV VP1. {i) Construção de gene VP1 sintético. A proteína VP1 do vírus da febre aftosa de sequência Tipo Taiwan O 97 foi encontrada no banco de dados do NCBI GenBank e oligonucleotídeos para gene sintético foram sintetizados na ResGen {Hunstville, AL), Nos oligonucleotídeos sintéticos, os códons nativos de FMDV foram alterados para conformar-se ao códon E.coli em um esforço de aumentar os níveis de expressão da proteína recombinante E.coli. veja, por exemplo, M.Gouy e C.Gauter, Pesquisa de Ácido Nucléico 10:7055 (1982); H. Grosjean e W. Fiers, Gene 18:199 (1982); J. Watson et.al (eds), Biologia Molecular do Gene, 4o Ed., Benjamim Kumming Publishing Co., p. 440 (1987) . O método recursivo PCR foi usado para reunir os oligonucleotídeos em gene VP1 total. A estratégia de construção do gene envolveu a síntese de uma série de oligonucleotídeos sobrepostos com extremidades complementares. Quando aneladas, as extremidades serviram como base para a extensão do filamento complementar. Os fragmentos foram, então, amplificados pelas bases excessivas externas. 0 oligonucleotídeo foi criado para conter um local de restrição BamHI para clonar no vetor de expressão pGEX-4T-l. 0 oligonucleotídeo reverso contém um códon de tradução de parada (TAA) e local de restrição EcoRI . Quando as bases externas TW97-1 (SEQ ID NO: 1) e TW97-16 (SEQ ID NO: 16) foram usadas, todo gene VPl (213 aminoãcidos) foi sintetizado (SEQ ID N0:118).
Estas etapas para PCR recursivo foram detalhadas abaixo.
Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase (1U) e IX buffer, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 50 pmol cada um dos oligonucleotídeos TW97-1 (SEQ ID NO: 1) e TW97-16 (SEQ ID N0:1), e .25 pmol cada um oligonucleotídeos TW97- 2 (SEQ ID NO:2) através de TW97-15 (SEQ ID NO: 15). A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 30 ciclos de 95°C por 15 segundos, 58°C por 15 segundos e 72°C por 60 segundos, seguidos pela incubação a 72°C por 5 minutos. O produto derivado de PCR foi purificado através do uso da coluna PCR Qiagen.
(ii) Clonagem do Produto PCR 0 produto PCR amplificado conforme acima descrito foi digerido com a restrição de endonucleases Bam HI+Eco RI e ligada ao vetor pGEX-4T-l que havia sido digerido com o Bam HI+Eco RI e gel isolado. A ■ ligação do produto foi usada para transformar células competentes de XL-1 Blue. As células transformadas foram laminadas em laminas LB com 100 ug/ml. A mini-preparação de DNA foi preparada a partir de culturas de colônias que ocorreram durante uma noite e digeridas com Bam HI+Eco RI para classificar os clones desejados. O clone com inserção direito foi criado como pBM-VPlTw97F (figura 6). O clone pBM-VP!Tw97F foi seqüenciado com as bases de oligonucleotídeos pGEX-5 (SEQ ID NO:116) e pGEX-3 {SEQ ID NO:117). B. Cultivo e Indução de pressão da E.Colicom plasmídeo VP1 Culturas de sementes por toda a noite de cada clone de E.Coli foram preparadas em 500ml de LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina e colocado em uma incubadora orbital a 37°C. 50 ml de inóculo de culturas de sementes foram transferidos para frascos contendo 0.5 litros LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina.As culturas foram incubadas a 37°C até que as culturas alcançassem um crescimento médio logarítmico e então induzidas com lmM ITPG (isopropiltiogalactosideo) por 3 horas a 37°C, Após o período indução, as células foram granuladas por centrifugação e colhidas seguindo os procedimentos padrões. As células granuladas foram armazenadas a -70°C até outro processo. C. Preparação do Antígeno VP1 As células congeladas do Exemplo B foram suspensas novamente em PBS com 1 mM PMSF.
As células foram rompidas através de Ultra-som (Branson). Os corpos inclusos foram separadas das proteínas solúveis pela centrifugação. Os corpos granulados inclusos foram lavados seqüencíalmente em 1) PBS; e 2) água. Os corpos inclusos lavados foram suspensos novamente em uma solução de PBS e uréia 5 M com breve sonicação. Mais uma vez, os corpos granulados por centrifugação inclusos foram totalmente solubilizados em 7M guanidina-HCl os antígenos recombinantes solubilizados foram clarificados por centrifugação e passado por um filtro 0,2um, A proteína de fusão solubilizada guanidina-HCl foi desnaturado pela diluição em água e a proteína desnaturada foi precipitada pela centrifugação. Os grânulos foram lavados com água e suspensos em água. Solução 2M NaOH foi adicionada para solubilizar a proteína desnaturada completamente e então foi adicionada para neutralizar o pH da solução protéica.
Exemplo 2 Preparação de recombinante antígeno FMDV 2C. A. Construção de vetor de expressão FMDV 2C. A seqüência do genoma da proteína FMDV 2C oi encontrada no banco de dados do NCBI GenBank (GI:5921457, 0 pressão Chu-Pei) e oligonucleotídeos para a síntese de todo o gene 2C e sequência foram sintetizados na ResGen (Huntesville, AL.). A seqüência de código de DNA é 954 nucleotídeo, que codifica 318 aminoãcidos (SEQ ID NO: 119). (i) Construção de gene sintético de comprimento total 2C.
Para obter o gene 2C de vírus FMD, 24 bases de oligonucleotídeos foram sintetizados, cada um com extremidades complementares, na Resgen.
Usamos o método PCR recursivo para unir os oligonucleotídeos em um gene 2C completo. A estratégia de construção do gene envolveu a síntese de uma série de oligonucleotídeos sobrepostos com extremidades complementares. Quando aneladas, as extremidades serviram como base para a extensão do filamento complementar. Os fragmentos foram, então, amplificados pelas bases excessivas externas, Em função do grande tamanho do gene 2C a ser sintetizado, os oligonucleotídeos foram divididos em três grupos e PCRs recursivos respectivos foram realizados. Os DNAs produzidos foram criados como fragmentos A, B e C. Os fragmentos B e C foram unidos com o PCR e então, os fragmentos B-C foram unidos com o fragmento A para produzir gene 2C completo. Um dos oligonucleotídeos foi criado para conter um local de restrição BamHl para clonagem no vetor de expressão pGEX-4T-l.
A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos, e então simplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 530C por 30 segundos e 73°C por 100 segundos, seguidos por incubação a 73°C por 5 minutos. A parte alíquota da mistura da reação foi analisada por eletroforese em mini-gel agarose.
(ii) Clonagem do Produto PCR 0 produto PCR amplificado conforme descrito acima foi digerido com as endonucleases de restrição Bam HI+HindIII e ligado no vetor pGEX-4T-l que havia sido digerido anteriormente com Bam HI+Hind III. 0 produto de ligação foi usado para transformar células competentes de E.Coli XL-l Blue. As células transformadas foram laminadas em laminas LB suplementado com 100 ug/ml de ampicilina. A mini-reparação de DNA foi preparada a partir de culturas de colônias que ocorreram durante uma noite e digeridas com Bam HI+Hind III para classificar os clones desejados. O clone com inserção direito foi criado como pGEX-2CTw97F (figura 7).
O clone pGEX-2CTw97F foi seqüenciado com bases de oligonucleotídeo pGEXS ( SEQ ID NO: 116) , pGEX3 (SEQ ID NO: 117), 2C-25 (SEQ ID N0:41) e 2C-26 (SEQ ID NO: 42}.
B. Cultivo e Indução de deformação de E.Coli com 2C plasmídeo.
Culturas de sementes por toda a noite de pGEX-2CTw97F foram preparadas em 500ml de LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina e colocado em uma incubadora orbital a 37°C. 50 ml de inóculo de culturas de sementes foram transferidos para frascos contendo 0.5 litros LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina. As culturas foram incubadas a 37°C até que as culturas alcançassem um crescimento médio logarítmico e então induzidas com lmM ITPG (isopropiltiogalactosideo) por 3 horas a 37°C. após o período indução, as células foram granuladas por centrifugação e colhidas seguindo os procedimentos padrões. As células granuladas foram armazenadas a -70°C até outro processo.
C. Preparação do Antígeno FMDV 2C
As células congeladas do Exemplo 2B foram suspensas novamente em PBS com 1 mM PMSFe detergente Triton X-100 e então foram rompidas através de Ultra-som (Branson). Os corpos inclusos foram separadas das proteínas solúveis pela centrifugação. A fração de proteína enriquecida com 2C foi obtida através de 3-4 ciclos de lavagem de contaminantes e solubilização do grânulo da célula lisate na uréia ou Guanidina-HCl. 2C recombinante foi purificada através de cromatografia de exclusão de tamanho (FPLC, Sephacryl S 200 HR) sob condição de desnaturação (5N GuHCX, PBS (pH7,4)) e fração eluída contendo 2C foi identificada por SDS-PAGE e dialisada contra 20mM fosfato buffer (ph 9.0). A solução de proteína foi armazenada refrigerada após adicionar azido de sódio a 0,05%. Para armazenamento maior (mais de um mês), a solução da proteína foi aliquotada e congelada a -7 0 0 C .
Exemplo 3 Preparação de recombinante antígeno FMDV 3ABC. A. Construção de vetor de expressão FMDV 3ABC. A seqüência do genoma da proteína FMDV 3ABC foi encontrada no banco de dados do NCBI GenBank (GI:5921457, 0 pressão Chu-Pei) e oligonucleotídeos para a síntese de todo o gene 3ABC e seqüência foram sintetizados na ResGen (Huntesville, AL.). A seqüência de código de DNA é 1281 nucleotídeo, que codifica 427aminoãcidos (SEQ ID NO: 120) . (i) Construção de gene sintético de comprimento total 3ABC.
Para obter o gene 3ABC de vírus FMD, 33 bases de oligonucleotídeos foram sintetizados, cada um com extremidades complementares, na Resgen.
Usamos o método PCR recursivo para unir os oligonucleotídeos em um gene 3ABC completo. A estratégia de construção do gene envolveu a síntese de uma série de oligonucleotídeos sobrepostos com extremidades complementares. Quando aneladas, as extremidades serviram como base para a extensão do filamento complementar. Os fragmentos foram, então, amplificados pelas bases excessivas externas.
Em função do grande tamanho do gene 3ABC a ser sintetizado, os oligonucleotídeos foram divididos em quatro grupos e PCRs recursivos respectivos foram realizados. Os DNAs produzidos foram designados como fragmentos A, B, C e D. OS fragmentos A e B foram unidos ao fragmento C-D para produzir o gene 3ABC completo.
Um dos oligonucleotídeos foi criado para conter um local de restrição BamHI para clonagem no vetor de expressão pGEX-4T-l. O oligonucleotídeo anti- sentido contém um códon de tradução de terminação (TAA) e local de restrição EcoRI. Quando as bases terminais N- e C-, 3ABC-1 (SEQ ID NO:43) e 3ABC-33 (SEQ ID NO:75) foram usadas um gene completo 3ABC (427 aminoácidos) foi sintetizado.
Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase {1U) e IX buffer, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 4 ul lOOmM MgS04 e 100 pmol de cada um dos oligonucleotídeos. 0 modelo foi a mistura do fragmento A-B e fragmento C-D descrito acima. A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos e 73°C por 120 segundos, seguidos pela incubação a 73°C por 5 minutos. O produto derivado de PCR foi purificado através do uso gel agarose e a faixa de DNA foi removida e eluída do gel pelo uso de um conjunto de extração gel Quigen.
(ii) Clonagem do Produto PCR O produto PCR amplificado conforme descrito acima foi digerido com as endonucleases de restrição Bam HI+HindIII e ligado no vetor pGEX-4T-l que havia sido digerido anteriormente com Bam HI+Hind III. O produto de ligação foi usado para transformar células competentes de E.Coli XL-1 Blue. As células transformadas foram laminadas em laminas LB suplementado com 100 ug/ml de ampicilina. A mini-reparação de DNA foi preparada a partir de culturas de colônias que ocorreram durante uma noite e digeridas com Bam HI+Hind III para classificar os clones desejados. 0 clone com inserção direito foi criado como pBM-3ABCTw97F (figura 8). 0 clone pBM-3ABCTw97F foi seqüenciado com bases de oligonucleotídeo pGEX5 (SEQ ID NO: 116) , pGEX3 {SEQ ID NO: 117), 3ABC-36 (SEQ ID NO:78) e 3ABC-37 (SEQ ID NO: 79). B. Cultivo e Indução de deformação de E.Coli com E3ABC plasmídeo.
Culturas de sementes por toda a noite de pBM-3ABCTw97F foram preparadas em 500ml de LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina e colocado em uma incubadora por agitação orbital a 37°C. 50 ml de inóculo de culturas de sementes foram transferidos para frascos contendo 0.5 litros LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina. As culturas foram incubadas a 37°C até que as culturas alcançassem um crescimento médio logarítmico e então induzidas com lmM ITPG (isopropiltiogalactosideo) por 3 horas a 37°C. Após o período indução, as células foram granuladas por centrifugação e colhidas seguindo os procedimentos padrões. As células granuladas foram armazenadas a -70°C até outro processo. C. Preparação do Antígeno FMDV 3ABC.
As células congeladas do Exemplo 3B foram suspensas novamente em PBS com 1 mM PMSFe detergente Triton X-100 e então foram rompidas através de Ultra-som (Branson) . Os corpos inclusos foram separadas das proteínas solúveis pela centrifugação. A fração de proteína enriquecida com 3ABC foi obtida através de 3-4 ciclos de lavagem de contaminantes e solubilização do grânulo da célula lisate na uréia. 3ABC recombinante foi passado através de cromatografia de mudança de íon (FPLC, Q-Sepharose FF) sob condição de desnaturação (8M uréia, lOmM DTT, 20mM fosfato de potássio pH 7,0) e eluído por gradiente NaCl. A fração eluída foi dialisada contra 20mM fosfato buffer (ph 9.0). Após medir a concentração de proteína pelo método Bradford e adicionar azido de sódio a 0,05%, a solução protéica foi armazenada refrigerada. Para armazenamento maior (mais de um mês), a solução da proteína foi aliquotada e congelada a -70°C.
Exemplo 4 Preparação de recombinante antígeno FMDV 3D. A. Construção de vetor de expressão FMDV 3D. (i) Construção de gene sintético de comprimento total 3D.
Para obter o gene 3D de vírus FMD, 36 oligonucleotídeos foram sintetizados, cada um com extremidades complementares, em Resgen. Usamos o método PCR recursivo para unir os oligonucleotídeos em um gene 3D completo (SEQ ID NO: 121) . A estratégia de construção do gene envolveu a síntese de uma série de oligonucleotídeos sobrepostos com extremidades complementares. Quando aneladas, as extremidades serviram como base para a extensão do filamento complementar. Os fragmentos foram, então, amplificados pelas bases excessivas externas.
Em função do grande tamanho do gene 3D a ser sintetizado, os oligonucleotídeos foram divididos em três grupos e PCRs recursivos foram realizados. Os DNAs produzidos foram designados como fragmentos A, B e C. OS fragmentos B e C foram unidos ao PCR e então o fragmento B-C foi unido ao fragmento A para produzir o gene 3D completo. 0 oligonucleotídeo foi criado para conter um local de restrição BamHI para clonagem no vetor de expressão pGEX-4T-l. 0 oligonucleotídeo anti-sentido contém um códon de tradução de terminação (TAA) e local de restrição EcoRI . Quando as bases terminais N- e C-, 3d-lA (SEQ ID NO:80} e 3d-36A (SEQ ID NO:115) foram usadas um gene completo 3D (470 aminoácidos) foi sintetizado.
Estas etapas estão aqui detalhadas a seguir: 1. 3DA fragmento PCR.
Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase(1U) e tampão de IX, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) , 4 ul lOOmM MgS04 e 100 pmol de cada um dos oligonucleotídeos 3d-lA (SEQ ID NO: 80) e 3d-14 (SEQ ID NO: 93). 0 modelo foi a mistura de 0.83 pmol de cada oligonucleotídeo 3d-lA a 3d-14. A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 53°C por 30 segundos e 73 °C por 100 segundos, seguidos pela incubação a 73°C por 5 minutos. A alíquota da mistura da reação foi analisada por eletroforese am mini-gel agarose. 2. 3DA fragmento PCR.
Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase(1U) e tampão de IX, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) , 4 ul lOOmM MgS04 e 100 pmol de cada um dos oligonucleotídeos 3d-13 (SEQ ID NO: 92) e 3d-24 (SEQ ID NO: 103). 0 modelo foi a mistura de 0.83 pmol de cada oligonucleotídeo 3d-13 a 3d-24. A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 90 segundos, seguidos pela incubação a 72°C por 5 minutos. A alíquota da mistura da reação foi analisada por eletroforese am mini-gel agarose. 3. 3DC fragmento PCR.
Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase(1U) e tampão de IX, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 4 ul lOOmM MgS04 e 100 pmol de cada um dos oligonucleotídeos 3d-25 (SEQ ID NO: 104) e 3d-36A (SEQ ID NO: 115). O modelo foi a mistura 0.83 pmol de cada oligonucleotídeo 3d-25 a 3d-36A. A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 53°C por 30 segundos e 73°C por 100 segundos, seguidos pela incubação a 73°C por 5 minutos. A alíquota da mistura da reação foi analisada por eletroforese am mini-gel agarose.
4. 3DB-C fragmento PCR
Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase(1U) e tampão de IX, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) , 4 ul 100mM MgS04 e 100 pmol de cada um dos oligonucleotídeos 3d-13 (SEQ ID NO: 92) e 3d-36A (SEQ ID NO: 115). O modelo foi a mistura dos fragmentos B e C descritos acima. A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 73°C por 90 segundos, seguidos pela incubação a 73°C por 5 minutos. A alíquota da mistura da reação foi analisada por eletroforese am mini-gel agarose. 5. 3D (ABC) PCR de comprimento total Reação PCR (100 ul volume) foi determinada como segue: Vent DNA polimerase(1U) e tampão de IX, juntamente com 25 uM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) , 4 ul lOOmM MgS04 e 100 pmol de cada um dos oligonucleotídeos 3d-lA (SEQ ID NO:80) e 3d-36A (SEQ ID NO: 115) . O modelo foi a mistura dos fragmentos A, B e C descritos acima. A reação foi incubada a 95°C por 5 minutos e então amplificada com 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos e 73°C por 120 segundos, seguidos pela incubação a 73 °C por 5 minutos. O produto derivado de PCR foi purificado através do uso gel agarose e a faixa de DNA foi removida e eluída do gel pelo uso de um conjunto de extração gel Quigen.
(ii) Clonagem do Produto PCR O produto PCR amplificado conforme descrito acima foi digerido com as endonucleases de restrição Bam HI+Eco RI e ligado no vetor pGEX-4T-l que havia sido digerido anteriormente com Bam HI+Eco RI e gel-isolado. O produto de ligação foi usado para transformar células competentes XL-1 Blue. As células transformadas foram laminadas em laminas LB suplementado com 100 ug/ml de ampicilina. A mini-preparação de DNA foi preparada a partir de culturas de colônias que ocorreram durante uma noite e digeridas com Bam HI+Eco RI para classificar os clones desejados. 0 clone com inserção direito foi criado como pGEX-3Df(figura 9). B. Cultivo e Indução de deformação de E.Coli com pGEX-3Df.
Para proteína recombinante expressa GST-3D, pGEX-3Df plasmídeo foi transformado em E.coli BL21 (DE3) e transformantes foram espalhados em lâminas LB agar suplementada com 100 ug/ml ampicilina Culturas de sementes por toda a noite de pGEX-3Df foram preparadas em 500ml de LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina e colocado em uma incubadora por agitação orbital a 37°C. 50 ml de inóculo de culturas de sementes foram transferidos para frascos contendo 0.5 litros LB estéril suplementado com 100 ug/ml de ampicilina. As culturas foram incubadas a 37°C até que as culturas alcançassem um crescimento médio logarítmico e então induzidas com lmM ITPG (isopropiltiogalactosideo) por 3 horas a 37°C. Após o período indução, as células foram granuladas por centrifugação e colhidas seguindo os procedimentos padrões. As células granuladas foram armazenadas a -70°C até outro processo.
C. Preparação da proteína GST-3D
As células congeladas do Exemplo foram suspensas novamente em PBS com 1 mM PMSF.
As células foram dissolvidas por ultra-som (Branson, modelo S-125) . O lisate não processado, solúvel, foi preparado pela centrifugação da célula lisate (10,000 rpm, 30 min) e filtrada com 0,45 um com filtro siringa (Sartorius). A cromatografia de semelhança glutatione foi realizada para purificar a proteína rGST-3D, a célula lisate solúvel foi carregada em coluna glutathione sefarose 4B(Pharmacia) equilibrada com PBS. Após lavar a coluna com três volumes de PBS, o GST3D foi eluído com glutathione reduzida 10 mM, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 solução de tampão. As frações de extração foram analisadas nos 8% SDS-PAGE. As frações que continham a preteina de fusão foram dialisadas em PBS por toda a noite.
Exemplo 5 Formulação do conjunto de instrumentos de detecção de antídoto de Dv. A. Preparação de membrana antígeno impressa. A partir de uma solução armazenada, os recombinantes 2C e 3ABC foram ajustados e misturtados a 0.5mg/ml e filtrado através de uma unidade de filtro 0,22 Millex-GV (Millipore). A solução avidina em PBS (pH 7.4) foi usada como um controle interno após filtrado. A mistura de antígeno e solução de controle foram aplicados à membrana de nitrocelulose usando equipamento Bio-Dot (BioDot). Após seco em sala de baixa umidade por toda a noite a membrana foi bloqueada com 3% BSA em PBS por 20 minutos e então seco em um ventilador por ao menos 2 horas. Os laminas de membrana processada devem ser armazenadas em um contêiner com dessecante ou sala de baixa umidade. B. Preparação da proteínaG-Gold conjugada. A proteína G recombinante preparada para eliminar ligações não especificas com albumina de soro for adquirida da Sigma e foi feita a uma concentração de lmg/ml. A Proteína G foi adicionada em gotas à solução gold enquanto mexida para criar uma nova concentração de lOug/ml e a solução foi mantida por 15 min. Então, 15% da solução BSA foi adicionada à partícula de suspensão gold usada. Após mexer por outros 15 minutos, a solução gold unida foi centrifugada e nata foi descartada a fim de remover a Proteína G solta. Para a solução gold unida 2% da BSA foi adicionada e, banho sônico (Branson modelo #2200 ou equivalente) a fim de suspender novamente o grânulo. A suspensão foi centrifugada novamente e o grânulo final foi suspenso em 2% BSA e armazenado em refrigerador. C. Preparação de biotin-BSA-gold conjugada: indicador de controle A Biotinilated BSA adquirida da Pierce foi usada para união gold. Os procedimentos de conjugação foram basicamente os mesmos descritos acima como Proteína G. lOug de biotinylated BSA por cada ml de suspensão de partícula goldfoi adicionada à solução gold com movimento vigoroso. No final da reação de união 15% da solução BSA foi adicionada por ml de suspensão de partícula gold. Após mexer por mais 15 minutos, a suspensão conjugada gold unida Biotin-BSA foi centrifugada para descartar a nata para remover a Bioti-BSA solta. Para o grânulo da solução gold unida 2 % de BSA {lOmM de fosfato de sódio, pH 7,5) foi adicionado e a suspensão foi centrifugada novamente para lavar. 0 grânulo foi suspenso novamente em 2% de BSA e armazenado em refrigerador. A Solução de proteína G gold unida foi diluída usando um buffer de diluição de pigmento (1% de caseína, lOOmM de fosfato de sódio, pH 7.0). A solução gold unida Biotin-BSA foi adicionada para geração da linha de controle que se liga à avidina na membrana. A solução gold diluída foi espalhada na plataforma Lydall (o papel de microvidro) e seca no liofilizador. A plataforma Lydall foi armazenada em sala de baixa umidade até o uso. E. Preparação de plataforma de reservatório. 0 papel filtro de celulose foi pré-ensopado em buffer de pré-tratamento (lOOmM fosfato de sódio, pH 7.0) e seco em um ventilador após a retirada do liquido excessivo. A plataforma de reservatório preparada foi armazenada em uma sala de baixa umidade. F. Montagem do dispositivo: A plataforma absorvente foi anexada ao longo do eixo da lamina após a folha de proteção da fita no topo ter sido retirada. O filtro foi anexado debaixo da área de teste da membrana ao longo do eixo da lâmina após a folha de proteção da fita no fundo da lamina ter sido retirada.b A plataforma de pigmento sobreporia o fundo da membrana de teste. Então a plataforma de reservatório foi anexada à lâmina para cobrir o fundo da plataforma de filtro. A lâmina da membrana alinhada foi cortada em uma tira tendo uma largura que encaixe na hospedaria.
RESULTADO
Um total de 1540 soros identificados de gado, suíno, cabra e ovelha foram usados. Um teste de soro compreende o animal negativo anterior à vacinação, o animal infectado e vacinado e animal infectado. 3ABC Elisa (Itália e USDA, EUA} foi usado como um teste de referência, para cada teste de gado. De modo geral, a sensibilidade relativa, a precisão geral e específica foram de 98,6% (69/70), 98,6% (1449/1470) e 98,6% (1518/1540), respectivamente. 0 teste inventivo versus o Teste de Referência.
BioSiqn™FMDV
Aplicabilidade Industrial De acordo com a presente invenção, é possível rapidamente de precisamente diagnosticar se um animal está infectado com o vírus da febre aftosa (FMDV) com base em amostras de testes feitos no animal. Ainda, onde for apropriado, também é possível distinguir entre animais vacinados contra FMV e um animal infectado com somente um pequeno volume de amostra de teste. Assim, é permitida uma determinação fácil e rápida se o animal suscetível ao FMV foi infectado com o FMV apesar da vacinação contra FMV.
Apesar das configurações preferidas da presente invenção terem sido reveladas com propósito ilustrativo, aqueles habilitados na técnica avaliarão que as várias modificações, adições e substituições são possíveis, sem sair do escopo e espírito da invenção conforme revelado nas reivindicações anexas. Portanto, as configurações da presente invenção foram ilustradas pelo modo de FMDV antígeno somente, mas o escopo e espírito da presente invenção, certamente, pode também ser aplicado para detectar anticorpos do FMDV, PRRSV (Vírus de Sintoma Reprodutivo e Respiratório do Porco) antígeno e anticorpos, FeLV (Vírus Felino da Leucemia) antígeno, FIV (Vírus da Imunodeficiência Felina) anticorpos, marcador de diagnostico para hidrofobia, CSF (Febre Suína Clássica) antígeno e anticorpos, anticorpos Johnes, BVDV (Vírus da Diarréia Viral Bovina) antígeno e anticorpos.
Além disso, a presente invenção é aplicável a uma variedade de marcadores de doença em organismos, como marcadores de diagnostico de câncer, hormônios, enzimas, drogas e vários antígenos na amostra de teste.
REIVINDICAÇÕES
Claims (23)
1. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", caracterizado por compreender as etapas de: 1) aplicação de uma quantidade predeterminada de uma amostra de teste a uma região de carga de uma fita; 2) acoplamento de um reagente de detecção incluindo um reagente de rotulagem dado para um material de análise de interesse na amostra de teste para formar um complexo entre eles; 3) desenvolvimento do complexo em uma membrana trançada; e 4) observação de alterações na aparência da zona de reatividade tendo uma fase imobilizada de antigeno, na região predetermina da membrana trançada, derivados de FMDV ou obtidos de FMDV através de uma reação imunológica para determinar a presença ou ausência de doença dos pés e boca por infecção virótica, em que a fase imobilizada contém, mais de um polipeptideo selecionado do grupo consistindo em proteínas não estruturais 2C representadas pela ID SEQ. N° 119, 3D representadas pela ID SEQ. N° 121 e 3ABC representadas pela ID SEQ. N° 120.
2. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método ser um método de sanduíche ou um método de competição.
3. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase imobilizada conter proteínas não estruturais derivadas de FMDV.
4. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a zona de reatividade incluir uma primeira zona de reatividade contendo uma proteína selecionada dentre proteína estrutural e proteína 3D; e uma segunda zona de reatividade contendo uma proteína selecionada dentre proteína não estrutural, exceto 3D.
5. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o reagente de detecção ser provido em qualquer local na fita.
6. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o reagente de detecção incluir, antígenos rotulados.
7. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o reagente de detecção incluir, mais de um material selecionado do grupo de anticorpos capazes de ligarem-se a proteína G, proteína A, proteína G/A, ou IgG e IgM específicas a espécies rotuladas.
8. "MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra de teste ser sangue, soro, plasma, urina, lágrimas, saliva ou leite.
9. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", caracterizado por compreender: uma fita incluindo uma zona de reatividade contendo uma fase imobilizada de antígeno, derivada de FMDV ou obtida de FMDV através de uma reação imunológica, e uma zona de controle para confirmar a operação normal do kit, provida em uma região predeterminada de uma membrana trançada; e um alojamento para recebimento da fita, e incluindo uma porta de aplicação de amostra de teste e uma janela indicadora para observar resultados de reação na zona de reatividade e na zona de controle da fita, e em que a fase imobilizada contém, mais de um polipeptideo selecionado do grupo consistindo em proteínas não estruturais 2C representadas pela ID SEQ. N° 119, 3D representadas pela ID SEQ. N° 121 e 3ABC representadas pela ID SEQ. N° 120.
10. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a fase imobilizada conter proteínas não estruturais derivadas de FMDV.
11. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a zona de reatividade incluir uma primeira zona de reatividade contendo uma proteína selecionada de proteína estrutural e proteína 3D; e uma segunda zona de reatividade contendo uma proteína selecionada de proteínas não estruturais, exceto 3D.
12. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o reagente de detecção ser provido em qualquer local na fita.
13. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o reagente de detecção incluir, mais que um material selecionado de um grupo de anticorpos capazes de ligar-se a proteína G, proteína A, proteína G/A rotuladas, ou IgG e IgM específicos a espécies.
14. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a fita ter uma configuração na qual uma almofada de reservatório, uma almofada de filtro em contato com uma extremidade da almofada de reservatório para filtrar a amostra de teste, uma membrana trançada em contato com uma extremidade da almofada de filtro para mover a amostra filtrada por ação capilar e uma almofada absorvente em contato com uma extremidade da membrana trançada estão conectadas sequencialmente em um membro base.
15. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o reagente de detecção ser provido em qualquer local na fita.
16. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o membro base ser feito de plástico ou material de vidro.
17. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o reagente de detecção conter um rótulo predeterminado de modo que um material de análise de interesse possa ser confirmado por inspeção visual ou por outra instrumentação externamente.
18. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o reagente de detecção conter um rótulo selecionado do grupo consistindo de catalisador, enzima, substrato para enzima, composto fluorescente, composto quimioluminiscente, elemento radioativo, solução metálica, solução não metálica, solução de corante, indicador de cor, material colorido contido em lipossoma, partícula de látex, e rótulo imunoquímico.
19. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o material de análise na amostra de teste ser antígeno.
20. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a fita compreender ainda um outro filtro entre a almofada de reservatório e a almofada de filtro.
21. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o material para a membrana trançada ser mais que um material selecionado do grupo consistindo de náilon, poliéster, celulose, polissulfona, polivinilidenodifluoreto, acetato de celulose, poliuretana, fibra de vidro e nitrocelulose.
22. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a fase imobilizada constituindo uma zona de controle ser uma fase selecionada dentre avidina, biotina, FITC, anticorpo anti-FITC, anticorpo de imunoglobulina de camundongo e de imunoglobulina anti-camundongo.
23. "KIT DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇA DOS PÉS E BOCA POR INFECÇÃO VIRÓTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o reagente de controle ser selecionado de proteína rotulada, antígeno e anticorpo que especificamente se ligam à fase imobilizada constituindo a zona de controle na membrana trançada.
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