BRPI0407176B1 - composições compreendendo uma ou mais cepas de bifidobacterium e seus usos - Google Patents

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Abstract

"cepas de bifidobacterium possuindo a capacidade de produzir glutamina". a invenção refere-se às cepas de bifidobacterium, especialmente das espécies de bifidobacterium infantis, possuindo a capacidade de sobreviver no trato intestinal e produzir glutamina e opcionalmente arginina in vivo, bem como às composições compreendendo tais cepas.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO UMA OU MAIS CEPAS DE BIFIDOBACTERIUM E SEUS USOS (51) Int.CI.: A61K 35/745; A23L 33/135; C12N 1/20; C12R 1/01 (52) CPC: A61K 35/745,A23L 33/135,C12N 1/20,C12R 1/01,A23Y 2300/45 (30) Prioridade Unionista: 14/02/2003 US 60/447,274, 31/01/2003 SE 03 00245-8 (73) Titular(es): PROBI AB (72) Inventor(es): GÓRAN MOLIN; SIV AHRNÉ; BENGT JEPPSSON
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO UMA OU MAIS CEPAS DE BIFIDOBACTERIUM E SEUS USOS.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se às novas cepas de Bifidobacterium possuindo a capacidade de produzir glutamina e opcionalmente arginina in vivo.
Antecedentes da Invenção
Glutamina é o aminoácido mais abundante no corpo. Ela é um 10 transportadora bidirecional de nitrogênio entre os tecidos e um combustível para os enterócitos, colonócitos, linfócitos e células proliferativas. A função do intestino é prejudicada nos pacientes com deficiência de glutamina, especificamente devido à perda da proteção contra translocação das bactérias e/ou endotoxina do lúmen do intestino para a circulação portal. O esgota15 mento de glutamina ocorre em pacientes gravemente doentes e prejudicados, e pode contribuir para a alta taxa de infecção e esgotamento muscular.
A administração enteral de glutamina conferiu efeitos benéficos a saúde em pacientes com diferentes indicações. Nos pacientes de unidade de tratamento intensivo com disfunção múltipla dos órgãos, a administração de glutamina diminuiu as complicações infecciosas nos pacientes (Houdijk e outros, Lancet, 352: 772-776, 1998). Efeitos semelhantes foram observados em pacientes que sofrem transplante da medula óssea recebendo nutrição parenteral suplementada com glutamina (Ziegler e outros, Annals Internai Medicine, 116: 821-828, 1992). Outro exemplo é o de pacientes com sín25 drome de intestino curto, que tinham um aperfeiçoamento substancial de sua capacidade de absorção após suplementação com glutamina (Byrne e outros, Annals of Surgery, 222: 243-255, 1995). A suplementação oral com glutamina durante e após a quimioterapia também mostrou reduzir significativamente a duração e a gravidade da estomatite associada à quimioterapia.
Foi concluído que a glutamina oral pareceu ser uma medida simples e útil para aumentar o conforto de muitos pacientes com alto risco de desenvolverem úlceras na boca como consequência da quimioterapia intensiva contra o
Petição 870170095615, de 08/12/2017, pág. 9/25 ·» câncer (Anderson e outros, Câncer 1998; 83: 1433-9). A suplementação nutrícia de glutamina após exercício intenso também diminuiu a incidência de infecções, especifica mente de infecções do trato respiratório superior (Castell, Amino acids 2001; 20(1): 49-61). Contudo, o efeito preciso de glutamina na imunodepressão ainda não foi estabelecido.
Uma dificuldade técnica maior com a glutamina é que, durante o ι
processamento e armazenamento da glutamina, ela é facilmente convertida em ácido glutâmico (glutamato), isto é, a glutamina é um composto relativamente instável que é difícil de ser incorporado às fórmulas destinadas à ad10 ministração oral. Adicionalmente, a glutamina administrada oralmente será, a um alto grau, no ambiente ácido do estômago, convertida em ácido glutâmico e nunca alcançará o intestino e será absorvida como glutamina.
A arginina melhora a função imune e promove a cura de feridas. A administração de arginina tem sido usada em pacientes no pós-operatório e em pacientes com cuidado intensivo. Na maior parte dos estudos clínicos, a arginina foi administrada em conjunto com outras substâncias, tais como, RNA e óleo de peixe. Existem indicações de que a administração de arginina modula a resposta imune pós-operatória. Daly, John E. e outros, Surgery 112: 55-67, 1992 mostra que a nutrição enteral com arginina suplementar,
RNA e ácidos graxos ômega-3 em pacientes após operação aperfeiçoa a defesa imune através de mecanismos diferentes. A arginina reduz complicações em pacientes sofrendo quimiorradiação e cirurgia (Tepaske e outros, 2001; Lancet 358: 696- 701), e reduz o tempo de estadia dos pacientes na unidade de tratamento intensivo (Bauere outros, 1995, Criticai Case Medici25 ne 23:436-449).
Uma sobrevivência aumentada podería ser observada em animais alimentados com uma dieta suplementada com arginina. Contagens de colônia quantitativas e a porcentagem calculada de bactérias viáveis remanescentes mostrou que a capacidade de exterminar os organismos translo30 cados foi significativamente melhorada em animais que receberam arginina (Adawi, D. e outros, 1997, Hepatology 25: 642-647).
Cepas de Bifidobacterium spp., isto é, as bifido-bactérías, estão
Figure BRPI0407176B1_D0001
··· · · · frequentemente presentes em números altos no cólon dos seres humanos, especialmente nos bebês que são alimentados no peito. As bactérias da Bifidobacterium spp. estão relacionadas aos probióticos, isto é, bactérias vivas que, quando da ingestão, promovem efeitos benéficos à saúde do hospedei5 ro. Números altos de Bifidobacterium spp. no cólon foram reivindicados como possuindo efeitos benéficos à saúde. Contudo, o curso de ação dos efeitos benéficos é amplamente desconhecido.
Técnica Anterior
Matteuzzi e outros [Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 1978; 129
B,175-181] investigaram um grande número de bifido-bactérias de diferentes habitats quanto a sua capacidade de liberar aminoácidos livres nos caldos de cultura. Os dados obtidos indicaram que várias espécies de bifidobactérias eram capazes de sintetizar todo o aminoácido necessário para o desenvolvimento e também para liberação dos compostos nos caldos de cultura. Foi verificado que B. thermophilum, B. bifidum e B. adolescentis são os melhores produtores e os aminoácidos mais geralmente encontrados nos caldos de cultura eram principalmente alanina, valina e ácido aspártico. Foi também especulado que Bifidobacterium spp. desempenha um papel no metabolismo do aminoácido do trato gastrointestinal.
O WO 01/83700 (Universidade de Maryland) descreve uma composição e processo para tratamento e prevenção de lesão gastrointestinal, enterocolite necrosante neonatal (NEC) e septicemia bacteriana. A composição inclui uma combinação de bactérias Gram (+), especificamente, Lactobacilius e Bifidobacterium e glutamina e seria administrada oralmente ou na25 so-oralmente. Diz-se que a composição bloqueia a translocação dos agentes bacterianos, tais como, bactérias Gram (-).
A glutamina administrada intra venosa mente é muito eficiente, porém cara e complicada. Um modo melhor de administrar a glutamina seria naturalmente, o uso de uma cepa bacteriana possuindo a capacidade de produzir quantidades substanciais de glutamina nos intestinos. Até agora, contudo, nenhuma de tais cepas foi descrita.
Sumário da Invenção
Figure BRPI0407176B1_D0002
······ • · · * · · · • · · · · • · · ·· • 4 • 1
Foi verificado, surpreendente mente, que cepas específicas de Bifídobacterium são capazes de produzir glutamina em um meio de cresci*» mento mimetizando o ambiente no cólon humano. As ditas cepas podem assim ser usadas para produzir glutamina in vivo, após administração oral ou enteral a um mamífero, especialmente um ser humano. Algumas cepas são também capazes de produzir arginina.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 é uma representação esquemática do padrão eletroforético obtido com polimorfismo do comprimento do fragmento dè restrição (RFLP) para as cepas CURE 19, CURE 21, CURE 26, CURE 28, e CURE 29 obtidas por divagem de DNA cromossômico com EcoRI e Hind lli, respectivamente, seguido por hibridização com uma sonda de fragmento de 420 pb marcada com DIG (posição 506 a 926, numeração de E.colí) do gene de 16S rRNA de L.casei subesp. pseudoplantarum DSM 20008 usando hibridização
Southern Blot. Marcador de DNA de Peso Molecular Marcado Dig VI (Roche) e marcador de DNA de peso molecular VI (Roche) foram usados como padrão.
A figura 2 mostra uma fotografia de fragmentos de DNA separados obtidos por divagem de DNA cromossômico das cepas CURE 19 (raia
1), CURE 29 (raia 2) e CURE 28 (raia 3) com a enzima de restrição EcoRI (Análise de endonuclease de restrição, REA). Marcador de DNA de peso molecular alto (BRL) marcador de DNA de peso molecular VI (Roche) foram usados como padrão (raia 4).
A figura 3 mostra uma fotografia de fragmentos de DNA separa25 dos obtidos por divagem de DNA cromossômico das cepas CURE 19 (raia 2), CURE 28 (raia 3) e CURE 29 (raia 4) com a enzima de restrição Hind Iil. Marcador de DNA de peso molecular alto (BRL) marcador de DNA de peso molecular VI (Roche) foram usados como padrão (raias 1 e 5).
A figura 4 mostra uma fotografia de fragmentos de DNA separa30 dos obtidos por divagem de DNA cromossômico das cepas CURE 21 (raia
1) e CURE 26 (raia 2) com enzima de restrição EcoRI. Marcador de DNA de peso molecular alto (MD, USA) marcador de DNA de peso molecular VI (Ro5 • · · ··· · ·♦* ·« • · · · · ··· * · ······ · · · ·· ········ · * ·♦ «» ·«·· ·· · · • · · * ···· · che) foram usados como padrão (raia 3).
A figura 5 mostra uma fotografia de fragmentos de DNA separados obtidos por divagem de DNA cromossômico das cepas CURE 21 (raia
2) e CURE 26 (raia 3) com a enzima de restrição Hind III. Marcador de DNA dè peso molecular alto (MD, USA) marcador de DNA de peso molecular VI (Roche) foram usados como padrão (raias 1 e 4).
Figura 6. índice de atividade de doença nos dias 4,.5, 6 e 7. * indica p < 0,05 em comparação ao controle de colite, π indica p< 0,05 em comparação a L. gasseri, # indica p<0,05 em comparação a L. paracasie.
Descrição da Invenção
A invenção refere-se a uma cepa de Bifidobacteríum possuindo a capacidade de sobreviver no trato intestinal e produzir glutamina in vivo. De modo especial, a glutamina é produzida no cólon humano. A sobrevivência neste contexto significa que as cepas bacterianas foram isoladas em di15 ferentes ocasiões de amostragem nas fezes de um indivíduo. Assim, as bactérias obviamente cresceram e sobreviveram em seu hospedeiro por um tempo. As cepas bifido-bacterianas da invenção não podem desenvolver-se em meio nutriente possuindo um pH abaixo de 7, especialmente 5,5-6,5. Ágar Rogosa é um exemplo de tal meio, o outro é MRS.
De acordo com um aspecto preferido, as novas cepas também possuem a capacidade de assimilar amônia.
A invenção refere-se especialmente as cepas pertencentes às espécie Bifidobacteríum infantis.
De acordo com um aspecto específico, a invenção também refe25 re-se a uma cepa de Bifidobacteríum que possui os genes 16S rRNA localizados nos fragmentos simples de DNA com tamanhos moleculares de cerca de 2.840 kb, obtidos por divagem de DNA cromossômico com Hind III, seguido por separação dos fragmentos por eletroforese de gel agarose, e por hibridização com uma sonda de fragmento de 420 pb marcada DIG (posi30 ções 506 a 926, numeração E.coli) do gene 16S rRNA de L.casei subesp. pseudoplantarum DSM 20008 usando hibridização Southern blot. Tais cepas são, por exemplo, as cepas depositadas no Deutsche Sammlung von Mikro-
Figure BRPI0407176B1_D0003
organismen und Zellkulturen GmbH em 23 de agosto de 2002, Bifidobacterium infantis CURE 19 (DSM 15153); Bifidobacterium infantis CURE 21 (DSM 15159); Bifidobacterium infantis CURE 26 (DSM 15160); Bifidobacterium infantis CURE 28 (DSM 15161); Bifidobacterium infantis CURE 29 (DSM
15162).
De acordo com outro aspecto, a invenção também refere-se a uma cepa de Bifidobacterium que possui os genes 16S rRNA localizados nos fragmentos de DNA simples com pesos moleculares de cerca de 895 kb, obtidos por divagem de DNA cromossômico com EcoRI, seguido por sepa10 ração dos fragmentos por eletroforese de gel agarose e por hibridização com uma sonda de fragmento de 420 pb marcada DIG (posições 506 a 926, numeração E.coii) do gene 16S rRNA de Lcasei subesp. pseudoplantarum DSM 20008 usando hibridização Southern blot. De acordo com um aspecto preferido, a cepa é capaz de produzir glutamina sem reduzir o ácido glutâmi15 co.
A invenção refere-se, especialmente, as cepas de Bifidobacterium infantis CURE 21 e Bifidobacterium infantis CURE 26, que foram depositadas no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH em 23 de agosto de 2002 e receberão números de cessão DSM 15159 e
DSM 15160, respectivamente ou variações dos mesmos. As ditas cepas são capazes de produzir glutamina sem reduzir o ácido glutâmico.
De acordo com outro aspecto a invenção também refere-se a uma cepa de Bifidobacterium que possui os genes 16S rRNA localizados em fragmentos de DNA simples com tamanhos moleculares de cerca de 3.420 kb, obtidos por divagem de DNA cromossômico com EcoRI, seguido por separação dos fragmentos por eletroforese de gel agarose e por hibridização com uma sonda de fragmento de 420 pb marcada DIG (posição 506 a 926, numeração E.coii) do gene 16S rRNA de L.casei subesp. pseudoplantarum DSM 20008 usando hibridização Southern Blot. De acordo com um aspecto preferido, a dita cepa possui a capacidade de produzir arginina.
A invenção também refere-se, especialmente, as cepas que se seguem, que também foram depositadas no Deutsche Sammlung von Mi-
Figure BRPI0407176B1_D0004
• · * ♦·♦ · *·* ·♦ «*
4··«·· · · * ·· ··«··* ♦ * · * ♦ • · « · » Ί · * »4 • · «I * ·*** * · kroorganismen und Zellkulturen GmbH em 23 de agosto de 2002 e receberam um número de depósito, isto é Bifidobacteríum infantis CURE 19, DSM * 15158, Bifidobacteríum infantis CURE 28, DSM 15161 e Bifidobacteríum infantis CURE 29, DSM 15162, e as variantes dos mesmos. As ditas cepas são capazes de produzir além de glutamina, também arginina.
As novas cepas também foram isoladas das fezes de uma criança e selecionadas por cultura em ágar a um pH abaixo de 7. As cepas foram subseqüentemente caracterizadas por ribotipagem e REA.
Outro objetivo da invenção é uma composição compreendendo uma ou mais cepas de Bifidobacteríum da invenção, em combinação com um veículo. Exemplos de veículos são mingau de farinha de aveia, alimentos fermentados com ácido láctico, inulina, lactulose, frutooligossacarídeos, amido resistente, β-glucanos e goma guar. A fim de aperfeiçoar a proliferação das bifidobactérias e aumentar a produção de glutamina e arginina, respecti15 vamente, além de melhorar a assimilação de amônia no cólon, as firas de dieta seriam adicionadas à composição. As fibras de dieta são por exemplo, inulina, frutooligossacarídeos, maltodextrinas, β-glucanos e goma guar. A invenção também refere-se a uma composição, conforme descrita, compreendendo além disso fibras de dieta.
As composições da invenção, tais como, suspensões, comprimidos, cápsulas, pós, podem ser administradas oralmente. Elas também podem ser administradas como um enema.
A composição da invenção pode ser uma composição alimentícia onde o veículo é um produto alimentício. As cepas de Bifidobacteríum que produzem glutamina podem ser administradas a uma criança jovem, pessoas idosas, atletas e consumidores comuns que desejam manter a forma para aperfeiçoar a função muscular e evitar imunodepressão seguido aos exercícios. As cepas de Bifidobacteríum que produzem arginina podem ser administradas aos consumidores comuns que desejam manter a forma e evitar influência negativa na função imune.
A composição da invenção pode ser uma composição farmacêutica, onde o veículo é um veículo terapeuticamente aceitável. As cepas que
Figure BRPI0407176B1_D0005
«·««·· · · · «ι • · ··· · · · · · · · • * ««·« 9« «« «·· ·»· * · produzem glutamina, bem como as cepas que produzem arginina podem, além disso, ser usadas nas fórmulas para alimentação enteral.
* As cepas de Bifidobàcterium assimilando amônia da invenção podem ser administradas aos pacientes com falência renal temporária, tal com visto errí pacientes com cuidado intensivo após cirurgia e complicações ou após outras doenças, tais como, infecções graves, intoxicações. Em tais çasos, a função renal pode retornar e um tratamento direcionado para reduzir a carga de nitrogênio do intestino pode evitar a necessidade de diálise. As cepas de assimilação de amônia podem ser administradas aos pacientes com falência hepática e encefalopatia, por exemplo, na hepatite ou intoxicação ou após abuso de álcool. Uma absorção reduzida de substâncias nitrogenosas do intestino nessas situações, melhorará a encefalopatia e função hepática. As cepas de Bifidobàcterium assimilando amônia podem ser administradas a uma criança jovem, pessoas idosas ou consumidores com doen15 ças subjacentes que dificultam sua capacidade hepática para a conversão de amônia em uréia ou possuindo absorção aumentada de nitrogênio do intestino, por exemplo, pacientes com falência renal crônica ou hepática de grau pequeno a moderado, que ainda não precisam de transplante ou diálise.
De acordo com um aspecto especial, a composição da invenção também compreende uma ou mais cepas Lactobacillus.
Além dos efeitos benéficos à saúde opcionais dos lactobacilos propriamente, as ditas bactérias podem proteger as bifidobactérias da influência prejudicial do oxigênio.
De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a uma ou mais cepas pertencendo à espécie Bifidobàcterium infantis para uso em terapia.
A invenção refere-se ao uso de uma ou mais das cepas de Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158; Bifidobàcterium infantis CURE
21, DSM 15159; Bifidobàcterium infantis CURE 26, DSM 15160; Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161; Bifidobàcterium infantis CURE 29, DSM 15162; ou uma variante das mesmas, para preparação de um medicamento para tratamento em pacientes em cuidado intensivo com disfunção múltipla dos órgãos e falência intestinal, para profilaxia em pacientes de quimioterapia e pacientes com doenças inflamatórias e administração pós-operatória após uma cirurgia maior.
Experimentação
Todas as cepas foram isoladas das fezes de crianças jovens, envelhecidas por uma semana a um ano. As amostras de fezes foram diluídas em série em uma solução de diluição (0,9% [peso/volume] NaCl, 0,1% [peso/volume] peptona, 0,1% [peso/volume] Tween 80, 0,02% [peso/volume] cisteína-HCl) e dispersas em placas com ágar Rogosa. Os isolados foram selecionados com relação a sua capacidade de crescimento em ágar Rogosa, pH 5,4, e isolamento repetido de um indivíduo. Os isolados foram coletados de placas ágar Rogosa após incubação a 37°C por 72 horas. Eles foram identificados ao nível do gênero por PCR específica para gênero (Roy e outros, 2000; FEMS Microbiological Letters 191: 17-24) e ao nível de espécies por sequenciamento de 16S rDNA (Pettersson e outros, 2002; Systematic and Applied Microbiology 23: 332-336). As cepas seriam isoladas pelo menos duas vezes do mesmo indivíduo com uma a quatro semanas entre as amostragens, o que indica fortemente que as cepas tinham uma determinada capacidade de colonizar o trato gastrointestinal. As cepas foram identificadas por ribotipagem, isto é, polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição, (RFLP) do gene 16S rRNA e por REA, que é a Análise de Endonuclease de Restrição.
As cepas que se seguem foram isoladas:
1) Bifidobacterium infantis CURE 19; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia ao mesmo grau, cheiro ácido após fermentação.
2) Bifidobacterium CURE 20; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia ao mesmo grau, cheiro ácido após fermentação.
3) Bifidobacterium infantis CURE 21; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia ao mesmo grau, • · ·
Figure BRPI0407176B1_D0006
cheiro ácido após fermentação.
4) Bifidobacterium CURE 22; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia ao mesmo grau, cheiro agradável após fermentação.
5) Bifidobacterium CURE 23; capaz de desenvoíver-se em ágar
Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia ao mesmo grau, cheiro 4 agradável” após fermentação.
6) Bifidobacterium infantis CURE 24; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia ao mesmo grau, cheiro agradável após fermentação.
7) Bifidobacterium CURE 25; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia.
8) Bifidobacterium infantis CURE 26; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia.
9) Bifidobacterium dentium CURE 27; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia.
10) Bifidobacterium infantis CURE 28; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia.
11) Bifidobacterium infantis CURE 29; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia.
12) Bifidobacterium infantis CURE 30; capaz de desenvolver-se em ágar Rogosa e de fermentar mingau de farinha de aveia.
Produção de Glutamina
As cepas isoladas 1-12 foram testadas quanto à produção de glutamina em caldo pelo procedimento que se segue.
As cepas de teste foram cultivadas a 37°C por 4 dias em meio de desenvolvimento (caldo) modificado do meio descrito por Matteuzzi e outros (Ann. Microbik (Inst. Pasteur, 1978,129B : 175-181). O caldo era composto de: acetato de sódio, 10 g/L; ácido ascórbico, 10 g/L; sulfato de amônio ((NH4)2SO4), 5 g/L; hidrogeno fosfato de dipotássio hidrogênio (K2HPO4), 3 g/L; dihidrogeno fosfato de potássio (KH2PO4), 3 g/L; MgSO4 x 7H2O, 0,32 g/L; FeSO4 x 7H2O, 0,01 g/L; MnSO4H2O, 0,007 g/L; NaCI, 0,01 g/L ; extrato • * ·
Figure BRPI0407176B1_D0007
de levedura, 0,5 g/L; glicose, 20 g/L; Tween 80, 1 mL/L. O pH foi ajustado com 1 M NaOH para 6,18-6,24 antes da etapa na autoclave.
A concentração de glutamina no caldo foi medida antes da inoculação com bactérias e após o desenvolvimento da cepa de teste. Após o desenvolvimento, a cultura foi centrifugada e filtrada em esterilização e o sobrenadante isento de célula subseqüentemente congelou a -80°C. Os aminoácidos foram analisados em um analisador automático (Biochrom 20, Pharmacia Biotech) após adição do ácido sulfossalicílico e ajuste de pH com hidróxido de lítio.
O aumento na concentração de glutamina e ácido glutâmico no caldo, após o desenvolvimento de cepas de teste diferentes é mostrado na Tabela 1 a seguir.
Tabela 1. Concentração aumentada de glutamina e redução/produção de ácido glutâmico no caldo de cultura, após desenvolvimento das cepas de
Bifidobacterium testadas.___'
Cepa de teste Glutamina (μΠΊθΙ/L) Ácido glutâmico [redução (R), produção (P) em μιτιοΙ/L]
B. infantis CURE 19 53 (29-67)* R
Bifidobacterium CURE 20 4.2 (3,5-4,8)5 R
B, infantis CURE 21 37 (36 - 38)* P37 (31-41)
Bifidobacterium CURE 22 16(14-18)5 R
Bifidobacterium CURE 23 8,9(8,1-9,6)5 R
β. infantis CURE 24 3,0 (0-5,9)5 R
B. infantis CURE 25 35 R
B. infantis CURE 26 36 P60
β. dentium CURE 27 7,4 R
β. infantis CURE 28 35 R
B. infantis CURE 29 28 R
β. infantis CURE 30 37 R
# O valor médio de três amostras derivadas de três culturas separadas.
Figure BRPI0407176B1_D0008
§ Ο valor médio de duas amostras derivadas de duas culturas separadas.
Todas as cepas de teste produziram alguma glutamina, porém apenas sete das 12 cepas testadas tinham uma produção relativamente alta de glutamina (>20 pmol/L). Para todas, exceto duas cepas (CURE 21 e CURE 26) o aumento na glutamina ocorreu juntamente com uma redução forte do ácido glutâmico no meio. O meio ao qual nenhuma bactéria foi adicionada tinha uma concentração de partida média de ácido glutâmico de 223 pmol/L, enquanto o teor de glutamina era zero. As três cepas CURE 20, CURE 23 e
CURE 24 consumiram todo o ácido glutâmico disponível no meio, enquanto CURE 28 diminuiu a concentração de ácido glutâmico com 247 μηηοΙ/L, CURE 29 com 220 μΐτιοΙ/L, CURE 22 com 187 μηηοΙ/L, CURE 19 com 128 μητιοΙ/L, CURE 30 com 160 μιτιοΙ/L, CURE 27 com 151 μητιοΙ/L e CURE 25 com 47 μΓηοΙ/L Pode ser especulado que essas bactérias convertem ácido glutâmico em glutamina. Duas cepas, CURE 21 e CURE 26, produziram glutamina sem qualquer redução da concentração de ácido glutâmico no meio. Em contraste com ouras cepas, elas aumentaram o nível de ácido glutâmico no caldo.
Produção de Arginina
A produção de aminoácido de cada cepa foi medida após desenvolvimento da cepa de teste a 37°C por 4 dias em meio de desenvolvimento (caldo) modificado do meio descrito por Matteuzzi e outros (1978). O caldo era composto de: acetato de sódio, 10 g/L; ácido ascórbico, 10 g/L; sulfato de amônio ((NH4)2SO4), 5 g/L; hidrogeno fosfato de dipotássio (K2HPO4), 3 g/L; dihidrogênio fosfato de potássio (KH2PO4), 3 g/L; MgSO4 x
7H2O, 0,32 g/L; FeSO4 x 7H2O, 0,01 g/L; MnSO4H2O, 0,007 g/L; NaCI, 0,01 g/L ; extrato de levedura, 0,5 g/L; glicose, 20 g/L; Tween 80, 1 mL/L. O pH foi ajustado com 1 M NaOH para 6,18-6,24 antes da etapa na autoclave.
A concentração de aminoácido no caldo foi medida antes da ino30 culação com bactérias e após o desenvolvimento da cepa de teste. Após o desenvolvimento, a cultura foi centrifugada e filtrada em esterilização e o sobrenadante isento de célula subseqüentemente congelou a -80°C. Os a-
Figure BRPI0407176B1_D0009
mínoácidos foram analisados em um analisador automático (Biochrom 20, Pharmacia Biotech) após adição do ácido sulfóssalicílico e ajuste de pH com hidróxido de lítio.
O aumento na concentração de arginina e citrulina no caldo, a5 pós o desenvolvimento de cepas de teste diferentes é mostrado na Tabela 2. Tabela 2. Concentração aumentada de arginina e citrulina no caldo após desenvolvimento das cepas de teste.
Cepa de teste Arginina (pmol/L) Citrulina (pimol/L)
B. infantis CURE 19 11 (8,8-14)* 52 (9,2-136)*
Bifidobacterium CURE 20 0§ 4,1 (4,4-3,7)5
B. infantis CURE 21 0* 0*
Bifidobacterium CURE 22 0§ 6,3 (5,8-6,7)5
Bifidobacterium CURE 23 2,0 (0-3,9)5 6,1 (5,4-6,8)
B. infantis CURE 24 0§ 0§
B. infantis CURE 25 0 4,2
B. infantis CURE 26 2,6 0
B. dentium CURE 27 4,9 0,0
B. infantis CURE 28 37 202
B. infantis CURE 29 26 13
B. infantis CURE 30 2,0 5,7
# O valor médio de três amostras derivadas de três culturas se10 paradas.
§ O valor médio de duas amostras derivadas de duas culturas separadas.
Três das doze cepas de teste aumentaram a concentração de arginina em mais de 10 μηΊοΙ/L, isto é, CURE 19, CURE 28 e CURE 29. Du15 as das cepas também tinham uma produção admiravelmente forte de citrulina (> 100 pmol/L) isto é, CURE 19 e CURE 28. A citrulina é produzida tanto por dessaminação de arginina ou através de NO sintase e geração de NO. A produção de citrulina também reflete a produção de arginina em uma etapa anterior.
Figure BRPI0407176B1_D0010
Também outros aminoácidos penetraram no caldo durante o desenvolvimento das cepas de teste, vide Tabela 3. CURE 21 não produziu qualquer citrulina ou arginina, porém quantidades significativas de asparagina ácida e tirosina. CURE 26 não produziu nenhuma citrulina porém quantidades muito pequenas de arginina e um amplo espectro de aminoácidos diferentes. Adicionalmente, CURE 26 foi a única cepa de teste que aumentpu a concentração de prolina no caldo. Todas as cepas de teste produziram treonina.
Tabela 3. Aumento nas concentrações de aminoácido (umol/L), além da glutamina, ácido glutâmico, arginina e citrulina no caldo após desenvolvimento das cepas de teste.
Cepa Thr Tyr Cys Asp Ala Gly He
CURE 19 39 15 0 23 15 0 0
CURE 21 51 21 0 96 0 0 0
CURE 26 46 46 12 151 61 0 6
CURE 28 44 12 14 0 0 0 0
CURE 29 35 28 0 0 2 0 0
Thr-treonina; Tyr-tirosina; Cys-cisteina; Asp-ácido asparagina; Ala-alanina; Gly-glicina; lle-isoleucina.
Os valores representam valores médios de três ou duas amostras derivadas de três ou duas culturas separadas.
Identificação do Genótipo
REA
As cepas foram examinadas em relação ao padrão de divagem do DNA cromossômico, através do processo de análise de endonuclease de restrição - REA de acordo com Stâhl M, Molin G, Persson A, Ahrné S & Stáhl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40: 189-193, 1990 e adicionalmente desenvolvido por Johansson, M-L e outros, International Journal of Systematic Bacteriology 45: 670-675, 1995. REA esquematicamente pode ser descrito como se segue: DNA cromossômico das cepas envolvidas no estudo foi preparado e clivado por endonucleases de restrição. 0,75 μ9 de cada DNA foi separadamente digerido a 37°C por 4 horas com 10 unidades
Figure BRPI0407176B1_D0011
• ·' de EcoRI e Hind III; cada endonuclease foi usada separadamente. Os fragmentos de DNA clivados são separados de acordo com o tamanho por eletroforese do gel usando géis de lâmina de agarose horizontal submergidos. Os géis consistiram em 150 mL de agarose a 0,9% (classificação de DNA ultrapura; osmose eletro-endo baixa; BioRad Laboratories, Richmond, USA) e foram fundidos como géis de lâmina (150 por 235 mm). 0,2 pg do marcador de DNA de Peso Molecular Alto (Bethesda Research Laboratories, MD, USA) em conjunto com 0,5 pg do marcador de peso molecular de DNA VI (Roche, Alemanha) foram usados como padrão. Distorção de faixa mínima e intensidade máxima foram obtidas por aplicação do DNA da amostra no tampão de carga Ficoll (2 g de Ficoll, 8 mL de água, 0,25% de bromofenol).
Os géis foram operados a uma tensão constante de 40V por 18 horas a cerca de 6-8°C. O tampão (89 mM Tris, 23 mM H3PO4, 2 mM EDTA sódio, pH 8,3) foi recirculado durante o período de operação. Após isso, os géis foram manchados por 20 minutos em brometo de etídio (2 pg/mL) e retirada a mancha em água destilada, visualizados a 302 nm com transiluminador de UV (UVP Inc., San Gabriel, USA) e fotografados. Esse modo de operação da eletroforese de gel forneceu faixa bem-distribuída e relativamente bem separada para um peso molecular de 1,2 x 106.
RFLP do gene 16S rRNA (ribotipagem)
Preparação de Análise de Endonuclease de Restrição e cromossômica do DNA cromossômico foi realizada conforme descrito anteriormente (Stáhl e outros, 1990, Stáhl e outros, 1994).
A sonda era um fragmento de 420 pb (posição 506 a 926, numeração E.coii) do gene 16S rRNA de L.casei ssp. pseudoplantarum DSM 20008, obtido por PCR e marcado por técnica de marcação de DNA DIG de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Boehringer Mannheim, Bromma, Suécia). A quantidade de sonda usada nas reações era de 50 ng.
Hibridização Southern blot. Um pg do DNA cromossômico foi digerido com 10U de EcoRI e HindlW (Boehringer Mannheim) por 4 horas a 37°C. Separação dos fragmentos de restrição por eletroforese de gel agarose foi realizada de acordo com Stáhl e outros, 1994. Marcador de DNA de • * · • · · · · ····· • · · ♦ · · · • * · ♦ · • · ·
Figure BRPI0407176B1_D0012
peso molecular marcado com DIG lll e marcador de DNA de peso molecular VI foram usados como padrão (Roche, Alemanha). O DNA foi imobilizado sobre uma membrana de náilon positivamente carregada (Roche) por cozedura por 30 minutos a 120°C. Pré-hibridização, hibridização e detecção de quimioluminescência com o substrato CSPD® (Roche) foram realizados de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. A temperatura de hibridização era de 68°C. O teste resultou em uma faixa simples com um peso molecular de cerca de 2.840 kb em todas as cepas (CURE 19, 21, 26, 28 e 29) quando DNA cromossômico foi clivado por Hind lll. Quando DNA cromossômico foi clivado por HcoRI, os genes para 16S rRNA terminaram em um fragmento simples com o peso molecular de cerca de 895 kb nas cepas CURE 21 e 26, enquanto outra faixa simples com um peso molecular de cerca de 3.420 kb foi obtida para cepas CURE 19, 28 e 29.
Teste in vivo
Teste 1. Efeitos das cepas Lactobacillus e Bifídobacterium na colite induzida por PDS em ratos
O objetivo desse estudo foi o de comparar os efeitos das cepas de Lactobacillus e Bifídobacterium em colite induzida por DDS (Sulfato sódico de dextrana) nos ratos.
Ratos Sprague Dawley foram divididos em seis grupos, um grupo de controle (colite sem administração de bactérias) e cinco grupos aos quais cepas bacterianas diferentes (Lactobacillus piantarum 299v, Lactobacillus paracasei 8700:2, Lactobacillus gasseri LG1, Bifídobacterium 3B1 e Bifídobacterium infantis CURE 19, respectivamente) foram administradas. As cepas bacterianas foram administradas oralmente por 7 dias antes da indução da colite (dia 0) e foram contínuamente administradas por 7 dias em combinação com DDS (5% peso/volume dissolvido em água). O grau de colite foi determinado diariamente com DAI (Disease Activity Index). A amostragem foi realizada no dia 14 e translocação bacteriana e quantidade no intestino foram determinadas.
Nos grupos que receberam Lactobacil/us piantarum 299v, Bifidobacterium 3B1 e Bifídobacterium CURE 19, DAI diminuiu significativamen• *· te nos dias 4, 5, 6 e 7 em comparação ao grupo de controle. Além disso, DAI abaixou significativamente no grupo que recebeu B. infantis CURE 19 em comparação aos grupos que receberam Lactobacilius paracasei 3700:2 e Lactobacillus gasseri LG1 após 6 e 7 dias. Em comparação a colite de controle, a translocação bacteriana para nodos linfáticos mesentériços diminuiu significativamente em todos os grupos, bem como a translocação das Enterobactérias para o fígado.
Concluindo, as cepas bacterianas administradas ao Lactobacillus plantarum 229v, Lactobacillus paracasei 8700: 2, Lactobacillus gasseri LG1, Bifidobacteríum 3B1 e Bifidobacteríum infantis CURE 19 são capazes de exercer efeitos positivos diminuindo a translocação em colite experimental em ratos. Lactobacillus piantarum 229v, Bifidobacteríum 3B1 e Bifidobacteríum infantis CURE 19 mostraram os efeitos mais evidentes no DAI aperfeiçoado na colite de ratos induzida por DDS. Bifidobacteríum infantis CURE 19 foi algo mais eficaz em neutralizar a colite que os outros após 6 dias e 7 dias de tratamento. Vide figura 6.
Teste 2 - Sobrevivência do Lactobacillus e/ou Bifidobacteríum no trato gastrointestinal após administração oral
A administração do Lactobacillus e/ou Bifidobacteríum provê efeitos positivos diferentes, por exemplo, prevenindo a diarréia associada ao antibiótico (D’Souza e outros, 2002, BMJ 324: 1361)
Os efeitos positivos podem ser obtidos, contanto que as bactérias sobrevivam à administração oral e tenham a capacidade de sobreviver e desenvolver nos intestinos. Para obter cepas apropriadas que possam ser usadas como probióticos, várias cepas candidatas possíveis são administradas oralmente aos indivíduos saudáveis. A determinação da freqüência das cepas administradas nas fezes identifica cepas com capacidade de sobrevivência maior. O objetivo desse estudo é encontrar cepas bacterianas que possam ser administradas oralmente com uma capacidade superior de sobrevivência e desenvolver no trato gastrointestinal humano.
Projeto do Estudo
Durante quatro semanas, quatorze voluntários recebem uma
Figure BRPI0407176B1_D0013
mistura para beber de aproximadamente 20 cepas diferentes de Lactobacil· ius e Bifidobacteríum. Todas as cepas são representativas das cepas que ocorrem nos seres humanos ou no alimento que produz ácido láctico. As amostras fecais foram obtidas antes da administração, após 3 semanas de administração e uma semana após a administração. A flora bacteriana é determinada por contagem viável e RAPD (DNA Polimórfico Ampliado Aleatoriamente; Johanson e outros, 1995).
Conclusão
Os resultados mostraram que as cepas selecionadas, isto é, Bi10 fidobacteríum infantis CURE 19, DSM 15158; Bifidobacteríum CURE 21, DSM 15159; Bifidobacteríum infantis CURE 26, DSM 15160; Bifidobacteríum infantis CURE 28, DSM 15161; e Bifidobacteríum infantis CURE 29, DSM 15162, podem sobreviver à passagem através do trato gastrointestinal após administração oral. Estudos em ratos também mostram um potencial de e15 xercício dos efeitos positivos na colite experimental.

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma ou mais cepas de Bifidobacterium selecionadas a partir de Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158, Bifidobacterium infantis CURE 21, DSM
    5 15159, Bifidobacterium infantis CURE 26, DSM 15160, Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161, e Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162, apresentando a capacidade de sobreviver no trato intestinal e produzir glutamina in vivo, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável ou um alimento.
    10 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais cepas de Bifidobacterium apresentam a capacidade de produzir arginina e são selecionadas a partir de Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158; Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161; e Bifidobacterium infantis CURE 29.
    15 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais cepas de Bifidobacterium apresentam a capacidade de assimilar amônia.
    4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o veículo é mingau de farinha de aveia.
    20 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 4, caracterizada pelo fato de que também compreende fibras dietéticas.
    6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é uma composição alimentícia.
    7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    25 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é uma composição farmacêutica, em que o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
    8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que também compreende uma ou mais cepas de Lactobacillus.
    30 9. Uso de uma ou mais das cepas de Bifidobacterium infantis
    CURE 19, DSM 15158, Bifidobacterium infantis CURE 21, DSM 15159, Bifidobacterium infantis CURE 26, DSM 15160, Bifidobacterium infantis CURE
    Petição 870170095615, de 08/12/2017, pág. 10/25
    28, DSM 15161, Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162, apresentando a capacidade de sobreviver no trato intestinal e produzir glutamina in vivo, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento ou alimento.
    5 10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento é selecionado a partir de um ou mais de: um medicamento para tratamento de pacientes em cuidado intensivo com disfunção múltipla dos órgãos; um medicamento para tratamento de pacientes em cuidado intensivo com falência intestinal; um medicamento para profila10 xia em pacientes em quimioterapia; um medicamento para profilaxia de doenças inflamatórias; um medicamento para administração pós-operatória após uma grande cirurgia.
    Petição 870170095615, de 08/12/2017, pág. 11/25
    1/6
    23130 —
    9416
    6557
    4361
    I
    2176
    1766
    1230
    1033 τοοοοοοοοοο ídcccccccccc
    Ο.—1~1—S—τ —ι —ι —1—1—1 —1 -7<0Φα>α)(ΐ>α>α)Φα>(ΐ>
    -^-^(0(003(0(0030)iTTTTmmmmm ;·ο o o o o
    3 3 3 Ξ3
    CL CL O. CL CL
    FIG 1
  2. 2/6
    FIG 2
  3. 3/6 ] 2 3 4 5
    s.
    FIG 3
  4. 4/6
    FIG 4
  5. 5/6
    FIG 5
  6. 6/6
    Dia 4
    Dia 5 índice de atividade da doença índice de atividade da doênça
    Dia 6 i Dia 7
    FIG 6
BRPI0407176A 2003-01-31 2004-01-27 composições compreendendo uma ou mais cepas de bifidobacterium e seus usos BRPI0407176B8 (pt)

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