BRPI0410919B1 - uso de uma película de colágeno eqüino - Google Patents

Abstract

"uso de uma película de colágeno eqüino". um método de usar uma película de colágeno eqüino substancialmente não porosa para reparar e regenerar tecido de dura-máter de mamíferos quando o tecido de dura-máter é danificado como um resultado de dano, tumores, cirurgia e outros. a película de colágeno equino nao porosa compreende fibrilas de colágeno que fornecem uma composição de duramáter de substituição que é elástica, impermeável a líquido e que tem uma resistência à tração alta. a película de colágeno eqüino nao porosa é além disso reabsorvível e fornece uma biomatriz, em que uma neodura é rapidamente formada que se torna indistinguível da dura-máter autóloga em uma questão de semanas. o processo para fabricar a película de colágeno eqüino reduz a probabilidade de transmissão de doença.

Description

“USO DE UMA PELÍCULA DE COLÁGENO EQUINO” Uma parte da divulgação deste documento de patente contém material que é objeto de proteção dos direitos autorais. O detentor dos direitos autorais não tem nenhuma objeção à reprodução de fac-símile por qualquer pessoa do documento de patente ou da divulgação de patente, como aparece nos depósitos ou registos de patente do Escritório de Patente e Marcas, mas de outo modo reserva todos e quaisquer direitos autorais.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao uso de composições de película de colágeno substancialmente não porosas como material de enxerto para reparar e/ou regenerar tecido de dura-máter de mamíferos. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito ao uso de composições de película de colágeno de uma origem não humana como material de dura-máter substituto e como uma biomatiz para a regeneração da dura. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A dura-máter é uma estrutura funcionalmente significante na anatomia do sistema nervoso central, formando um sistema de membrana que envolve o sistema nervoso central inteiro e o protege das influências externas. A dura-máter pode requerer reparo devido a várias causas, incluindo trauma, processos inflamatórios ou neoplásticos, procedimentos cirúrgicos ou anormalidades congênitas. A necessidade para fechar defeitos durais, especialmente a seguir de procedimentos cirúrgicos e na presença de fistulas pós traumáticas, tem motivado uma questão quanto ao substituto de dura-máter ideal. Estes defeitos podem resultar em complicações pós operatórias, em particular, vazamento de fluido cerebrospinal, infecções e convulsões cerebrais resultantes. Alguma forma de procedimento de enxerto durai é requerida em associação com quase 30 % das craniotomias. Como o fechamento primário do defeito durai freqüentemente falha, a disponibilidade de um substituto durai para evitar as complicações acima é de enorme signifícância prática.

Um fechamento impermeável a líquido permanente da dura-máter é requerido para evitar o vazamento do fluido cerebrospinal depois de danos no crânio ou intervenções cirúrgicas para remover tumores malignos no cérebro ou coluna espinal. Os neurocirurgiões correntemente usam substitutos de dura-máter reabsorvíveis ou não reabsorvíveis e usualmente os prendem à dura-máter no crânio ou coluna espinal com suturas e/ou cola de fibrina. Os exemplos de materiais reabsorvíveis incluíram dura-máter cadavérica humana, fascia lata humana, pericárdio bovino, esponjas de colágeno xenogênicas e implantes de materiais tecidos, que consistem de poliéster reabsorvível (poliglactina e/ou poli-p-di-oxanona). Os exemplos de substitutos de dura não reabsorvíveis incluem materiais fabricados de poli-tetra-fluoro-etileno (PTFE) ou poliéster uretano.

Quase todos os enxertos durais estudados até agora estão associados com complicações, algumas importantes. As complicações principais que foram relatadas são reações inflamatórias crônicas e de rejeição e a formação de adesões corticomeningíticas resultando entre outras coisas no desenvolvimento de focos epileptogênicos. Hematomas e fístulas de fluido cerebrospinal também são observadas, que por sua vez fornece um ponto de entrada para vários organismos causadores de doença.

Numerosos materiais e métodos foram avaliados nas décadas passadas em questão do enxerto durai ideal, incluindo vários metálicos, implantes, materiais sintéticos, transplantes de tecido autólogo e dura-máter cadavérica humana preservada. A maioria destes produtos não são adequados por causa das complicações pós operatórias associadas, algumas delas sérias. Os exemplos das complicações incluem reações inflamatórias crônicas e de rejeição, desenvolvimento de adesões corticomeningíticas, hemorragias e encapsulação dos enxertos de dura-máter em uma camada espessa de tecido conectivo. Estudos anteriores sobre o assunto de substituições durais adequadas mostram que a absorção de enxerto inicial ligada com a formação de uma neodura endógena são os fatores principais preditos de fosão durai sem qualquer acontecimento e permanente.

Diversos tecidos autólogos foram usados no passado como substitutos de dura-máter. Em 1911, Kostling usou um saco hemial do paciente para formar um enxerto durai. Kostling, W., Med Wochenschr, 58, 1042 (1911). Outros tecidos autólogos tais como a fáscia temporal, fascia lata femoris e retalhos periosteais foram usados desde então. Barrow et al. reconstruíram com êxito uma lesão durai grande com omento maior endógeno. Barrow et al, J Neurosurg. 60; 305-1 (1987). A vantagem de enxertos autólogos é que não existe nenhum risco de transmissão de patógeno ou rejeição de tecido. Entretanto, a remoção adicional de tecido aumenta o trauma cirúrgico e prolonga o que é provavelmente em qualquer caso um procedimento cirúrgico complicado. A dura cadavérica humana preservada tem sido usada rotineiramente por muitos anos como um substituto de dura-máter para a substituição durai em pacientes humanos. Estas preparações consistem de fibras de tecido conectivo que são entrelaçadas como a dura-máter do próprio corpo. Depois que as dura-máter cadavéricas humanas foram utilizadas em neurocirurgia, elas são ditas formar um fechamento impermeável a líquido, similar à própria dura-máter do corpo e são eventualmente substituídas pelo tecido do próprio corpo durante um processo de degradação em um período prolongado de tempo. O material derivado de cadáver é preservado pela secagem por congelamento (liofilização) e esterilização gama (Lyodura, B. Braun Melsungen Aktiengesellschaft, Melsungen, Alemanha) ou em uma processo químico de estágio múltiplo (processo Tutoplast®, Tutoplast Dura, Tutogen Medicai GmbH, Neunkirchen am Brand, Alemanha). Os enxertos de dura-máter cadavérica humana, entretanto, foram associados com riscos significantes no transporte de vírus e príons, que podem causar a doença temida encefalite espongiforme (doença de Creutzfeldt-Jakob ou a síndrome de Gerstmalnn Streussler), Devido a numerosas mortes ocorridas após a implantação de dura-máter humana, o uso de enxertos de dura-máter cadavérica humana tem sido restringido ou abolido em vários países.

As preparações de fascia lata e pericárdio humanos também foram usadas como material substituto de dura-máter com menos perigo de transmitir agentes infecciosos do que a dura-máter cadavérica humana. Embora estas preparações impliquem em menos risco de transmitir doença, elas são reabsorvidas lentamente em períodos de meses ou anos que pode resultar na formação de cicatriz e encapsulação do material substituto da dura.

Os substitutos de dura também foram derivados de fontes não humanas tais como colágeno bovino ou porcino isolado da pele ou tendões e tecido do pericárdio bovino. Similar às fontes derivadas de ser humano, acredita-se que alguns substitutos bovinos de dura transmitam doença, a saber a encefalopatia espongiforme bovina (BSE), ao paciente que recebe o enxerto de dura-máter. O uso de substitutos durais derivados de porcino, entretanto, resultaram em adesões com o tecido cerebral subjacente.

Narotam et al., U.S. 5.997.895, divulgam substitutos durais derivados de colágeno xenogênico tratado nas formas de esponja, feltro ou película de colágeno poroso. O tratamento de colágeno inativa a contaminação viral e priônica tal que o substituto não contém quantidades infecciosas de víms e prions. A porosidade dos substitutos de dura é divulgada como necessária para permitir que vasos, células e tecido meningítico se infiltrem na dura substituta. Na prática clínica, entretanto, a aplicação dos materiais porosos disponíveis está associada com desvantagens, visto que a estabilidade de forma e primariamente a impermeabilidade a líquidos não são sempre garantidas. Narotam et al. também divulgam um substituto de dura que é um sanduíche de duas ou mais formas de esponja, feltro ou película de colágeno em que pelo menos uma forma é suficientemente porosa para o encravamento do tecido meningítico.

Poliésteres reabsorvíveis também estão disponíveis para o uso clínico mas têm a desvantagem de elasticidade baixa e degradação lenta. Em situações especiais estes implantes causam problemas na cicatrização do dano e podem aumentar a infecção.

Películas ou folhas que consistem de um metal tal como ouro, platina, prata, níquel, tântalo ou aço ou polímeros tais como politetrafluoroetileno (PTFE) ou outros poliésteres, também foram usadas como substitutos de dura-máter, Estes substitutos não são absorvidos pelo paciente, entretanto, mas tomam-se encapsulados em uma camada resistente de tecido conectivo e permanece no corpo durante a vida do paciente como um corpo estranho sem substituição pelas estruturas do próprio corpo. Isto pode resultar em um risco alto de desenvolvimento de germes nos poros internos que não pode ser controlado pelo mecanismo de defesa do próprio corpo, devido à estrutura porosa das membranas de película de PTFE.

Os produtos com base em colágeno estão se tomando crescentemente popular. Os processos químicos podem ser usados para modificar as estruturas com um componente de tecido conectivo superior, tal como o pericárdio ou a derme, de modo que apenas um esqueleto de colágeno acelular, isento de antígeno é preservado. Os produtos são disponíveis que consistem totalmente de fibrilas de colágeno ou materiais sintéticos revestidos de colágeno. Em ambos os casos a rede de fibra de colágeno atua como uma matriz para desenvolver tecido conectivo endógeno.

Chaplin et al testaram um produto obtido da pele do porquinho da índia (XenoDerm, Lifecell Corp., The Woodlands, TX) em um modelo de animal. Neurosurgery, 45: 2, 320 a 327 (Agosto 1999). O comparador foi pericrânio autólogo. A epiderme, todos os componentes celulares e outros elementos potencialmente antigênicos ou infecciosos foram quimicamente removidos no processo de fabricação. As fibras de colágeno e a arquitetura estrutural da pele foram preservadas inalteradas. O produto foi rapidamente relatado incorporar com a dura circundante na presença de uma resposta celular branda. Fibroblastos invasores foram observados preferencialmente no local de implantação. O enxerto e a dura-máter original foram ditos estar escassamente distinguíveis no final do estudo 6 meses de pós operatório. A seguir destes resultados, Warren et al (2000) investigou AlloDerm (LifeCell Corp., The Woodlands, TX) para a substituição durai em pacientes humanos. Neurosurgery 46 (6): 1391 a 1396 (2000). Duzentos pacientes receberam um enxerto durai de AlloDerm durante o estudo, este material é obtido da derme humana. O processo de fabricação é dito ser o mesmo como para o XenoDerm, produzindo uma biomatriz de colágeno acelular que é isento de antígeno do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Sete dos 200 pacientes desenvolveram complicações pós operatórias tais como infecção e fístulas de fluido cerebrospínal (CSF), mas nenhum destes incidentes foi relatado como causado pelo próprio enxerto. A revisão cirúrgica foi dita mostrar que nenhum destes pacientes desenvolveram adesões ou reações de rejeição no local do enxerto durai. O material foi dito ser altamente similar à dura circundante no exame macroscópico. Os dados de estudo de longa duração sobre este produto ainda não estão disponíveis.

Filippi et al (2001) descreveram experimentos no uso de pericárdio bovino esterilizado com gama preservado em solvente (Tutopatce, Tutogen Medicai GmbH, Neunkirchen, Alemanha) para a substituição durai em 32 pacientes. Filippi, et al, Neurosurg. Rev., 24: 103 a 107 (2001). O curso pós operatório foi dito ser sem qualquer acontecimento em todos exceto um paciente, que morreu de causas cardíacas logo depois da operação. O enxerto foi descrito como fácil de manusear, durável e de custo baixo. Os dados de estudo de longa duração descartando possíveis complicações posteriores ainda não estão disponíveis.

Os produtos de colágeno são adequados para o uso como biomaterial em muitos aspectos: a interação quimiotática em que eles empenham facilita a infiltração rápida das células endoteliais e fibroblastos, que por sua vez produz e deposita novas fibras de colágeno; uma resposta inflamatória linfocítica concomitante limitada nas estruturas circundantes promove a absorção da biomatriz de colágeno. O colágeno também possui propriedades hemostáticas que são aplicadas para o uso terapêutico. As plaquetas se depositam elas próprias sobre a estrutura de colágeno, desintegram-se e assim o fazendo liberam fatores de coagulação que facilitam a formação de fibrina em conjunção com fatores plasmáticos.

Os materiais substitutos de dura conhecidos e os métodos relacionados de usar tais materiais falham em fornecer uma dura-máter substituta impermeável a líquido, reabsorvível que evite a encapsulação, formação de cicatriz na dura ou adesão ao tecido cerebral e além disso tenha um risco baixo de transmitir germes, vírus e prions que podem causar encefalite espongiforme ou outras doenças. Uma substituição de dura-máter ideal não deve gerar uma resposta de defesa imune ou inflamação e não deve ser tóxica. Deve ser rapidamente absorvida e ao mesmo tempo permitir que a arquitetura do tecido conectivo se forme de modo que uma neodura endógena se desenvolva. O enxerto não deve aderir ou fundir com tecido cerebral ou ósseo durante este processo. O material deve ser resistente ao rasgo, manter a sua forma e resistir à permeação do fluido cerebrospinal. A dura-máter de substituição também deve ser estável no seu volume e forma em que ela resista à expansão ou contração depois da implantação. Outros critérios importantes são a segurança viral e priônica, afabilidade ao usuário e custo de fabricação econômico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Entre os vários aspectos da presente invenção, portanto, está o fornecimento de um material de dura-máter de substituição que seja reabsorvível, impermeável a líquido, elástica, estável no seu volume e forma e forneça um perfil de segurança excelente com respeito ao risco de transmissão de doença.

Em resumo, portanto, a presente invenção diz respeito a um método para reparar e/ou regenerar tecido de dura-máter em um mamífero. O tecido de dura-máter é contatado com uma película de colágeno eqüino compreendendo uma biomatriz de fibrilas de colágeno. A película de colágeno eqüino é formada por um processo em que uma suspensão de fibrilas de colágeno é precipitada para formar a película de fibrilas de colágeno e em que as fibrilas de colágeno não são reticuladas pelos produtos químicos ou pela radiação.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para reparar tecido de dura-máter em um mamífero compreendendo contatar o tecido de dura-máter com uma película de colágeno eqüino substancialmente não porosa compreendendo uma biomatriz que não ocorre naturalmente de fibrilas de colágeno, em que a película de colágeno eqüino consiste essencíalmente de componentes acelulares e em que as fibrilas de colágeno não são reticuladas por produtos químicos ou radiação.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para reparar e/ou regenerar tecido de dura-máter em um mamífero compreendendo contatar o tecido de dura-máter com uma película de colágeno eqüino substancialmente não porosa que consiste essencialmente de uma biomatriz de colágeno em que a biomatriz de colágeno não é reticulada por produtos químicos ou radiação.

Outros aspectos e características desta invenção estarão em parte evidentes e em parte salientados a seguir.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS A Fig. 1 é uma fotografia de SEM (microscópio eletrônico de varredura) que ilustra a superfície de uma película de colágeno eqüino seca.

As fibrilas de colágeno são claramente ilustradas. A não porosidade substancial da superfície é evidente a partir da imagem.

As Figs. 2A e 2B são fotografias tirada sob condições de ESEM (microscópio eletrônico de varredura ambiental), que significa próximo das condições naturais em uma atmosfera levemente úmida, que ilustram a superfície superior, observada pela lateral de uma película de colágeno equino. A não porosidade substancial da superfície é evidente a partir das fotografias.

As Figs. 3A e 3B são fotografias tiradas sob condições de ESEM que ilustram a superfície inferior de uma película de colágeno equino. As fibrilas de colágeno são ilustradas na Fig 3A. A não porosidade substancial da superfície é evidente a partir das imagens. A Fig. 4 é uma fotografia SEM que ilustra a superfície de uma película de colágeno eqüino hidratada. As fibrilas de colágeno são claramente ilustradas na Fig. 4. A não porosidade substancial da superfície é evidente a partir da imagem.

As Figs. 5A, 5B e 5C são fotografias tirada sob condições ESEM (atmosfera úmida) que ilustra a seção transversal de uma película de colágeno eqüino. O material revela uma estrutura semelhante a uma pilha de folhas adensadas muito firmemente juntas. Interstícios entre as camadas de colágeno são mostrados na imagem.

As Figs. 6A e 6B são fotografias SEM que ilustram a seção transversal de uma película de colágeno eqüino seca. As camadas múltiplas de colágeno e os interstícios entre as camadas de colágeno são ilustradas nas imagens. A Fig. 7 é uma fotografia que ilustra um aspecto intraoperativo do defeito durai do lado esquerdo depois da inserção da película de colágeno eqüino, as bordas durais circundantes são cobertas com coágulos sangüíneos. A Fig. 8 é uma fotografia que ilustra uma visão geral microscópica de tingimento com Trichrom (seção frontal) do local da operação mostrando as estruturas corticais e a dura-máter sobreposta com ambos os enxertos (película de colágeno eqüino no lado direito; Tutoplast Dura no lado esquerdo) (ampliação de 8X). A Fig. 9 é uma fotografia que ilustra enxertos de dura-máter em oito semanas após a operação. No lado esquerdo, o enxerto de dura cadavérico Tutoplast® Dura parece inalterado com bordas claramente visíveis. As partes remanescentes da membrana de tecido conectivo fino que cobre o enxerto podem ser observadas. No lado direito, o enxerto de biomatriz de película de colágeno eqüino parece totalmente incorporado na dura circundante. As manchas escuras são causadas pelos resíduos de coágulo sanguíneo pequenos dentro da neodura. A Fig. 10 é um fotografia que ilustra um aspecto macroscópico do enxerto de biomatriz de película de colágeno eqüino voltado para o córtex, oito semanas após a operação. O enxerto parece liso, móvel e totalmente incorporado na dura circundante. Nenhuma lesão cortical pôde ser observada. A Fig. 11 é uma fotografia que ilustra um aspecto macroscópico do enxerto de dura cadavérica Tutoplast® Dura voltado para o córtex oito semanas após a operação. O enxerto parece liso e homogêneo, mas nenhum sinal de incorporação do enxerto está presente. As adesões corticomeningíticas estão ausentes. A Fig. 12 é uma fotografia que ilustra duas células gigantes polinucleares com fragmentos intracelulares do enxerto de biomatriz de película de colágeno eqüino, duas semanas após a operação (tingimento com hematoxilina-eosina (HE); ampliação de 800X). A Fig. 13 é uma fotografia que ilustra fibroblasto e células fagocíticas que infiltraram no enxerto de biomatriz de película de colágeno eqüino, quatro semanas após a operação. Neocapilares com eritrócitos também estão visíveis (tingimento com HE, ampliação de 600X). A Fig. 14 é uma fotografia que ilustra fragmentos do enxerto de biomatriz de película de colágeno eqüino que estão circundados por células fagocíticas e uma inflamação linfocítica branda, quatro semanas após a operação (tingimento com HE, ampliação de 600X). A Fig. 15 é uma fotografia que ilustra a dura cadavérica Tutoplast Dura, quatro semanas após a operação. A dura cadavérica mostra sinais mínimos de infiltração celular ou remodelagem de enxerto. Uma reação inflamatória linfocítica densa é encontrada acima e abaixo do enxerto (tingimento com HE, ampliação de 250X). A Fig. 16 é uma fotografia de um aspecto microscópico da neodura oito semanas após a operação que ilustra camadas recém formadas de fibras de colágeno, fibroblastos e resíduos do enxerto de biomatriz de película de colágeno eqüino (tingimento com Trichrom, ampliação de 150X). A Fig. 17 é uma fotografia de um aspecto microscópico da neodura dezesseis semanas depois da implantação da película de colágeno eqüino que ilustra fibras de colágeno densas e capilares recém formados, preenchido com eritrócitos (tingimento de van Gieson, ampliação 200X). A Fig. 18 é um desenho que ilustra o aparelho de teste utilizado para medir a impermeabilidade à água, resistência à tração e elasticidade/flexibilidade do material da dura-máter de substituição. O grau de convexidade do material que resultou de uma altura de coluna de água específica foi medido para determinar o nível de elasticidade/ flexibilidade. A quantidade de água, pressionada através dos materiais de teste, foi medida para testar a impermeabilidade à água, A Fig. 19 é um gráfico que representa o grau de convexidade da película de colágeno eqüino (teor de colágeno: 5,6 mg/cm2) em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 20 é um gráfico que representa o grau de convexidade Λ de uma película de colágeno (teor de colágeno: 4 mg/cm) em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 21 é um gráfico que representa o grau de convexidade de DuraGen em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). O DuraGen rompeu na pressão hidrostática de 200 cm H20. A Fig. 22 é um gráfico que representa o grau de convexidade de diversos produtos de substituição de dura-máter em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 23 é um gráfico que representa o grau de convexidade e a perda de água da película de colágeno eqüino (teor de colágeno: 5,6 mg/cm) em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 24 é um gráfico que representa o grau de convexidade e a perda de água de uma película de colágeno (teor de colágeno: 4 mg/cm2) em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 25 é um gráfico que representa o grau de convexidade e a perda de água de DuraGen em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 26 é um gráfico que representa o grau de convexidade e a perda de água de diversos produtos de substituição de dura-máter em pressão hidrostática aumentada (alturas de coluna de água). A Fig. 27 é um gráfico que representa a resistência ao rasgo/força de tração final de vários implantes de colágeno. A amostra E é película de colágeno eqüino.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

De acordo com a presente invenção, foi surpreendentemente descoberto que uma película substancialmente não porosa compreendida de fibrilas de colágeno eqüino em uma biomatriz que não ocorre naturalmente pode ser eficazmente utilizada como um substituto de dura-máter reabsorvível para o reparo, regeneração e restauração da dura em mamíferos, incluindo seres humanos, animais de laboratório e outros. A película de colágeno eqüino da presente invenção é impermeável a líquido e fornece características de alta segurança contra o risco de transmissão de vírus ou prions. Além disso, a película de colágeno eqüino é flexível e elástica por natureza enquanto mantém uma resistência à tração alta. Esta película, daqui em diante aludida como “película de colágeno eqüino”, quando implantada, corresponde em propriedades importantes para a dura-máter humana. A película de colágeno eqüino serve como um esqueleto de biomatriz para o encravamento celular in vivo e é substituída por uma neodura durante a regeneração e restauração.

Em uma forma de realização, a biomatriz de película de colágeno eqüino é compreendida de proteínas de tecido conectivo que consiste essencialmente de fíbrilas de colágeno. Preferivelmente, a biomatriz de película de colágeno eqüino é compreendida de proteínas de tecido conectivo que consiste de fíbrilas de colágeno. Mais preferivelmente, a biomatriz de película de colágeno eqüino é compreendida de proteínas de tecido conectivo que consistem de fíbrilas de colágeno do Tipo I.

Além de ser compreendida de fíbrilas de colágeno, a película de colágeno eqüino pode ainda compreender um excipiente, um conservante, um fator de crescimento ou um aditivo que ajuda na flexibilidade e elasticidade do produto final.

Película de Colágeno Eqüino A película de colágeno eqüino da presente invenção é uma biomatriz de fíbrilas de colágeno tratadas para remover componentes celulares e para formar uma folha de fíbrilas de colágeno. A película de colágeno eqüino utilizada em uma forma de realização da presente invenção é uma membrana de colágeno em camada múltipla que não ocorre naturalmente que consiste de numerosas fíbrilas de colágeno entrelaçadas multi-direcionais. Uma ilustração de uma película de colágeno eqüino seca pode ser vista na Fig. 1. A fotomicrografia (SEM) ilustra a superfície da película de colágeno eqüino em que fibrilas de colágeno são embutidas. Uma fotografia pode ser vista nas Figs. 2A-2B da superfície superior da película de colágeno eqüino sob condições de ESEM (Microscópio eletrônico de varredura ambiental), em que uma atmosfera levemente úmida fornece condições quase naturais. As fibrilas de colágeno são visíveis na superfície. A superfície aparece lisa e substancialmente não porosa. As fotografias (ESEM) da superfície inferior da película de colágeno eqüino são fornecidas nas Figs. 3A e 3B. A fotografia da superfície inferior também ilustra a não porosidade substancial da película de colágeno eqüino.

Antes de usar a película de colágeno eqüino para reparar tecido de dura-máter de um mamífero, o material de película de colágeno eqüino seco pode ser hidratado. A Fig. 4 é uma fotografia SEM que ilustra a superfície de uma película de colágeno eqüino hidratada em que as fibrilas de colágeno são claramente mostradas. A não porosidade substancial da superfície é evidente a partir da imagem. A orientação única das fibras de colágeno em direções bidimensionais nas camadas múltiplas é primariamente responsável pela impermeabilidade a líquido mesmo sob alta pressão hidrostática e fornece resistência maior com alta elasticidade. Devido às numerosas camadas de fibrila de colágeno finas orientadas em paralelo da película de colágeno eqüino, este material é adequado para substituir temporariamente a dura-máter do próprio corpo na cobertura do defeito depois da implantação para se obter um fechamento do vazamento de fluido cerebrospinal impermeável a líquido e fornece um esqueleto de biomatriz para encravamento de célula para formar uma neodura.

Esta propriedade é importante no processo de cicatrização de dano visto que ela reduz o risco do paciente desenvolver a condição de liquorréia.

Características de Estrutura e Reabsorcão de Película de Colágeno Eqüino A película de colágeno eqüino é reabsorvível pelo mamífero no qual ela é implantada. Acredita-se que esta propriedade seja realçada pela estrutura da película de colágeno eqüino. O processo utilizado para produzir a película de colágeno eqüino forma camadas empilhadas de fibrilas de colágeno. Entre cada camada estão os interstícios nos quais as células e a vasculatura do paciente podem migrar e formar o tecido da neodura.

Cada camada de fibrilas de colágeno é substancialmente não porosa. Os poucos poros que podem estar presentes são tipicamente isolados um do outro e não se interconectam através das camadas múltiplas de fibrilas de colágeno. A estrutura de camada múltipla da presente invenção realça as características de impermeabilidade a líquido da película de colágeno eqüino. As imagens de microscópio eletrônico de varredura das Figs. 1 a 4 ilustram a natureza não porosa da película de colágeno eqüino.

Embora a película de colágeno eqüino seja substancialmente não porosa, interstícios existem entre as camadas de fibrilas de colágeno. As características intersticiais e de camada podem ser facilmente observadas nas Figs. 5A, 5B e 5C que são fotografias transversais da película de colágeno eqüino sob condições de ESEM (atmosfera úmida). As Figs. 6A e 6B são fotografias SEM da película de colágeno eqüino seca. Assim, a película de colágeno eqüino é análoga a uma pilha de folhas de papel em que cada folha de papel é substancialmente lisa e não porosa, com um espaço entre cada folha de papel. Quando na sua forma seca (Figs. 6A e 6B), os interstícios são mais pronunciados. Os interstícios se tomam reduzidos quando a película de colágeno eqüino é observada sob condições quase naturais em um atmosfera levemente úmida. As Figs. 5A, 5B e 5C são imagens de seções transversais da película de colágeno eqüino em uma atmosfera úmida, em que a redução dos interstícios da película de colágeno eqüino é ilustrada.

Além de promover uma propriedade impermeável a líquido, as numerosas camadas de fibrila de colágeno finas da película de colágeno eqüino orientadas em paralelo simultaneamente servem como um esqueleto de biomatriz para o encravamento celular para a construção de novo da dura do próprio corpo.

Anteriormente, acreditou-se frequentemente que uma estrutura de esqueleto porosa fosse necessária para promover o encravamento do tecido e vasculatura autonômicos em um tecido de dura-máter de substituição. Foi surpreendentemente descoberto que a estrutura de camada não porosa da película de colágeno eqüino promove o encravamento das células, vasculatura e a formação de novas estruturas de colágeno através da película de colágeno eqüino e nos interstícios que existem entre as suas camadas múltiplas, formando uma neodura com uma estrutura de camada típica de uma dura natural dentro de semanas da implantação. Como descrito mais abaixo e no Exemplo 1, o encravamento das células, vasculatura e da nova estrutura de colágeno é tão extensa que dentro de semanas após a operação, a neodura toma-se difícil de distinguir de um tecido de dura-máter previamente existente . do paciente. Em aproximadamente quatro a oito semanas de pós operação, a organização celular das células meningíticas é de cerca de 40% a 70%.

Depois de cerca de dezesseis semanas, o enxerto está totalmente organizado (100%).

Experimentos com animais demonstram a rápida infiltração celular na área da película de colágeno eqüino de camada múltipla. Histologicamente, a infiltração densa da biomatriz de colágeno com linfócitos, macrófagos e fibroblastos foi observada dentro de 14 dias depois da implantação. Capilares formam-se no enxerto mais tarde. Uma transição contínua entre a película de colágeno eqüino e a dura circundante devido à neogênese das fibras de colágeno é facilmente evidente. Depois de apenas 4 semanas, a película de colágeno eqüino é parcialmente substituída pelo tecido vagamente estruturado do próprio corpo. Depois de 24 semanas, é difícil distinguir a dura previamente existente do paciente da arquitetura do tecido conectivo como a neo-dura recém formada que substitui a película de colágeno equino implantada na área de defeito.

Transmissão de Doença/Resposta Imune Um benefício significante do uso da película de colágeno equino da presente invenção é o risco substancialmente baixo de transmitir uma doença a um paciente no qual ela é implantada. O processo de fabricação em que as fibrilas de colágeno são tratadas com ácidos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético e outros) e bases, tais como hidróxido de sódio, para produzir a película de colágeno eqüino beneficamente atua para inativar ou reduzir os níveis infecciosos de bactérias, vírus e prions que possam estar presentes. O tratamento de biomaterial com ácido clorídrico, hidróxido de sódio, óxido de etileno (ETO) e outros foram reconhecido pelas agências governamentais como métodos aprovados dentro dos regulamentos de medicamento e biomaterial para inativar prions e vírus. Tal tratamento pode, sob alguns regulamentos, reduzir as exigências reguladoras para testar a película de colágeno eqüino em cada lote. Assim, o tratamento das fibrilas de colágeno durante o processo de fabricação realça a segurança do produto e reduz o risco de transmissão de doença a um paciente. O material eqüino que foi submetido ao processo de fabricação descrito acima não é conhecido transmitir nenhum patógeno aos pacientes. Assim, além do processo de fabricação, a utilização de colágeno com base eqüina ainda evita os riscos de transmitir encefalite espongiforme que estavam anteriormente associados com substitutos cadavéricos humanos. O uso de colágeno derivado de uma origem eqüina, tal como colágeno derivado de tendões de Aquiles eqüinos evita os riscos de transmitir encefalopatia espongiforme transmissível (TSE), que também é conhecida como encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou scrapie. A transmissão desta doença foi associada com o uso de material biológico obtido de fontes ruminantes (por exemplo, material biológico de gado, cabras, ovelhas e outros). A película de colágeno eqüino da presente invenção em que o colágeno é derivado de uma origem eqüina e tratado (por exemplo, com enzimas) adicionalmente reduz o risco de evocar uma resposta imune. Nenhuma resposta imune foi relatada por um período de mais de dez anos durante os quais o colágeno com base eqüina foi usado em procedimentos de substituição de tecido (para tecidos outros que não a dura-máter). A película de colágeno derivada de eqüino também resulta em uma resposta inflamatória redüzida. Quando comparada com substitutos de dura-máter que contém colágeno derivado de fontes tais como a fascia lata humana, o número de células inflamatórias que resultam da implantação da película de colágeno eqüino de substituição é significantemente inferior. Os processos inflamatórios evocados pela implantação da película de colágeno eqüino também são muito mais curtos em duração comparados com os dispositivos de dura-máter de substituição derivados de outras fontes. Estas propriedades significantemente reduzem o risco de rejeição de enxerto da película de colágeno eqüino por um sistema imune do paciente, melhorando desse modo o sucesso de procedimentos neurocirúrgícos que requerem a substituição da dura-máter.

Estabilidade de Volume/Tamanho Problemas podem surgir se uma dura-máter de substituição significantemente se expande ou contrai quando hidratada. Os produtos de substituição de dura-máter de colágeno poroso da técnica anterior têm em alguns casos tendido a encolher significantemente depois da hídratação. Em tais casos, a dura-máter de substituição pode puxar as suturas que a ligam à dura-máter do paciente causando dano ao implante e à dura-máter autóloga e ao local cirúrgico. Outras complicações incluem a pressão exercida no local cirúrgico se a dura-máter de substituição continua a expandir depois que ela é implantada, exercendo pressão indesejada sobre o tecido neurológico adjacente. A mudança em volume da película de colágeno eqüino da presente invenção é pequena ou negligenciável quando hidratada. Ao contrário dos produtos de substituição porosos, a película de colágeno eqüino substancialmente retém o seu tamanho e forma ao ser hidratada, tendo excelente estabilidade de forma, permanecendo bioestável mesmo depois da hidratação e não causando nenhum problema de intumescimento ou encolhimento no cérebro a seguir da implantação. Uma vez hidratada e implantada, a película de colágeno eqüino não se expande ou contrai significantemente em área ou espessura até o grau em que ela podería rasgar as suturas cirúrgicas ou romper os selos de cola de fibrina que prendem a película de colágeno eqüino à dura-máter do paciente.

Em uma forma de realização, o encolhimento ou intumescimento da área da película de colágeno eqüino seca pode variar de cerca de -5% a cerca de 20% quando completamente hidratada. Em uma outra forma de realização, a área da película de colágeno eqüino seca pode variar entre cerca de -5% a cerca de 10% quando completamente hidratada. Em uma outra forma de realização, a área da película de colágeno eqüino seca varia entre cerca de -5% a cerca de 5% por cento quando completamente hidratada. Em uma outra forma de realização, a área da película de colágeno eqüino seca aumenta não mais do que cerca de 4 por cento quando completamente hidratada.

Em uma forma de realização, a película de colágeno eqüino aumenta até cerca de 4 vezes a sua espessura seca quando ela está completamente hidratada. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino aumenta até cerca de 3 vezes a sua espessura seca quando ela está completamente hidratada. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino aumenta até cerca de duas vezes a sua espessura seca quando ela está completamente hidratada. A espessura da dura humana adulta varia de aproximadamente 0,5 mm na base do crânio até aproximadamente 2,0 mm. A espessura da dura-máter também pode variar dependendo da idade do paciente em que bebês e crianças jovens tipicamente seriam esperado ter tecido de dura-máter mais fino do que os adultos. A espessura da película de colágeno eqüino da presente invenção pode ser formulada para variar quanto a área desejada de aplicação e quanto ao paciente tratado.

Em uma forma de realização, a película de colágeno eqüino da presente invenção, quando na sua forma seca, tem uma espessura entre cerca de 0,01 mm a cerca de 3,0 mm. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino tem uma espessura entre cerca de 0,02 mm a cerca de 2,0 mm. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino tem uma espessura entre cerca de 0,03 mm a cerca de 1,5 mm. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino tem uma espessura entre cerca de 0,05 mm a cerca de 1 mm. Ainda em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino tem uma espessura de cerca de 1,0 mm ou menos. O peso seco da película de colágeno eqüino é dependente da sua espessura desejada. Em uma forma de realização, o peso seco da película f\ Λ de colágeno eqüino está entre cerca de 1 mg/cm a cerca de 50 mg/cm . Em uma outra forma de realização, o peso seco da película de colágeno eqüino está entre cerca de 1,5 mg/cm a cerca de 30 mg/cm . Em uma outra forma de realização, o peso seco da película de colágeno eqüino está entre cerca de 2 r\ n mg/cm a cerca de 20 mg/cm . Em uma outra forma de realização, o peso seco Λ da película de colágeno eqüino está entre cerca de 2,5 mg/cm a cerca de 15 o mg/cm. Em uma outra forma de realização, o peso seco da película de colágeno eqüino está entre cerca de 3 mg/cm a cerca de 10 mg/cm .

Em uma forma de realização, o peso da película de colágeno equino aumenta até cerca de 15 vezes o seu peso seco na hidratação. Em uma outra forma de realização, o peso da película de colágeno eqüino aumenta até cerca de 10 vezes o seu peso seco na hidratação. Em uma outra forma de realização, o peso da película de colágeno eqüino aumenta até cerca de 7 vezes o seu peso seco na hidratação. Ainda em uma outra forma de realização, o peso da película de colágeno eqüino aumenta até cerca de 5 vezes na hidratação a partir do seu estado seco.

Para servir como substituições de dura-máter adequadas, os substitutos de dura implantados não devem se tomar frouxos mas ao invés possuem uma estabilidade/resistência à tração muito alta mesmo quando hidratados. A película de colágeno eqüino da presente invenção beneficamente tem resistência à tração alta, o que melhora e suporta o manuseio da película de colágeno eqüino durante a sua aplicação cirúrgica e fornece uma estabilidade mecânica aumentada depois da sua implantação. Experimentos comparativos estão resumidos nos exemplos abaixo em que a resistência à tração da película de colágeno eqüino foi superior comparada com preparações de colágeno poroso (por exemplo, espumas de colágeno). Adicionalmente, aumentando a espessura da película de colágeno eqüino pode-se aumentar significantemente a resistência à tração. A propensão do material de película de colágeno eqüino rasgar sob a pressão exercida pode ser medida como a sua “carga de tração final” ou “força de tração final,” daqui em diante aludidas como “força de tração final.” A força de tração final de uma película de colágeno eqüino pode ser determinada submetendo-se pressão a uma tira de película de colágeno eqüino tendo uma largura especificada e determinando-se a quantidade de pressão aplicada que resulta em colapso (por exemplo, rasgo ou ruptura) da película de colágeno eqüino. A força de tração final pode ser quantificada usando a seguinte equação: “Força de tração final” = força aplicada/largura da tira de película de colágeno = Newtons/cm de tira.

Em uma forma de realização, a película de colágeno equino tem um força de tração fmal entre cerca de 1 e cerca de 30 Newtons/cm de tira, preferivelmente entre cerca de 1,5 e cerca de 15 Newtons/cm de tira, preferivelmente entre cerca de 2 e cerca de 10 Newtons/cm de tira, ainda mais preferivelmente, entre cerca de 3 e cerca de 6 Newtons/cm de tira.

Embora a película de colágeno eqüino da presente invenção tenha uma resistência à tração alta, ela permanece elástica e flexível quando hidratado. Esta característica permite que a película de colágeno eqüino se adapte otimamente às condições anatômicas (por exemplo, curvas) presentes no local de implante.

Quando no seu estado hidratado, a película de colágeno eqüino pode ser facilmente movida em tomo do local cirúrgico e otimamente modelada à forma do defeito onde ela está sendo implantada. Uma vez implantada, o enxerto de película de colágeno eqüino permanece lisa e móvel. Com o tempo, as células e a vasculatura migram através da película de colágeno eqüino, eventualmente substituindo-a com uma neodura semelhante à dura, Depois da organização celular com as células meningíticas, a película de colágeno eqüino não adere ao tecido neural, cerebral, do crânio ou da coluna espinal.

Preparação de Película de Colágeno Eqüino A película de colágeno eqüino da presente invenção pode ser produzida a partir de suspensões de fibrilas de colágeno de alto peso molecular através de um processo de secagem controlada. Uma precipitação gradual da suspensão de fibrila de colágeno resulta da evaporação da água e elevação de pH simultânea. O processo de secagem controlada resulta em uma construção de camada múltipla de uma película de colágeno que pode ser implantada pelos neurocirurgiões como um substituto para a dura-máter humana. A construção de película de colágeno de camada múltipla fornece várias das propriedades descritas acima que são benéficas em um substituto de dura-máter e como uma biomatriz para a regeneração do tecido de dura vivo.

Em uma forma de realização, o processo para produzir a película de colágeno equino da presente invenção remove todos os componentes celulares produzindo uma película de colágeno eqüino de fibrilas de colágeno que consiste essencialmente de componentes acelulares.

Usando procedimentos estabelecidos na química do colágeno, o tecido contendo colágeno é usado como um material de partida para a preparação da película de colágeno eqüino da presente invenção. Em uma forma de realização, tendões eqüinos são usados como um material de partida. Em uma outra forma de realização, tendões de Aquiles eqüinos são usados como um material de partida.

Em uma forma de realização, o material de partida, por exemplo tendões de Aquiles eqüinos, é primeiro cultivado e tratado por pelo menos uma hora com hidróxido de sódio 1 N e neutralizado com ácido clorídrico. O material de partida de colágeno é tratado em condições ácidas no pH 2. O ácido utilizado pode ser o ácido clorídrico, ácido acético ou coisa parecida. Subseqüentemente, as proteínas não colaginosas e as ligações de reticulação intermolecular presentes no material de partida são degradadas enzimaticamente com pepsina para formar uma suspensão de colágeno. A suspensão é depois neutralizada. Em uma forma de realização, a suspensão é neutralizada entre cerca do pH 6,5 até cerca do pH 8,0. Em uma outra forma de realização, a suspensão é neutralizada entre cerca do pH 6,9 a cerca do pH 7,5, Em uma outra forma de realização, a suspensão é neutralizada até cerca do pH 7. A suspensão de colágeno é centrifugada, o sobrenadante removido e o precipitado recolocado em suspensão em ácido acético a cerca do pH 2 a 4,5. As proteínas não colaginosas são desse modo removidas com êxito da suspensão de colágeno. A repetição das etapas descritas acima pode ser conduzida como necessário para remover as proteínas não colaginosas residuais presentes no precipitado.

Um resultado surpreendente do processo de produção da película de colágeno eqüino é que uma elevação do pH controlada da suspensão de colágeno em ácido acético é obtida devido à remoção especificada de água pela evaporação em um período longo de tempo, por exemplo, 24 horas. A elevação especificada de pH causa a precipitação das fibrilas de colágeno entrelaçadas multi-direcionais em camadas de direção bidimensional formando uma construção de camada múltipla da película de colágeno eqüino. Em uma forma de realização, o processo é realizado em uma estufa de secagem a uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 55°C, com equipamento para remover vapor e a neutralização simultânea do vapor de ácido acético. Em uma outra forma de realização, o processo é realizado em um estufa de secagem a uma temperatura de cerca de 30°C a cerca de 45°C. A película de colágeno eqüino que resulta do processo de produção é considerado estar na sua forma seca quando a perda de água não é mais detectada ou é negligenciável. O teor de água da “forma seca” da película de colágeno eqüino está tipicamente entre cerca de 2% a cerca de 18% em peso. O teor de água residual relativamente alto presente na “forma seca” da película de colágeno eqüino impede ou restringe a desnaturação das moléculas de colágeno que compreendem a película de colágeno eqüino. O processo descrito acima é responsável pela precipitação das fibrilas de colágeno da suspensão visto que os componentes com solubilidade baixa sedimenta no começo do processo em uma elevação de pH baixa. Esta técnica resulta em uma precipitação de fibrilas de colágeno durante a evaporação da água e elevação de pH simultânea.

Durante o processo de precipitação, as fibrilas de colágeno tomam-se naturalmente reticuladas conforme as fibrilas precipitam da solução para formar uma película de colágeno. Ao contrário da reticulação das fibrilas de colágeno com produtos químicos ou radiação (por exemplo, radiação ionizante ou ultravioleta), que pode resultar em tempos de reabsorção aumentados, permitir a reticulação natural das fibrilas de colágeno promove tempos de reabsorção reduzidos uma vez que a película de colágeno eqüíno seja implantada. A reticulação natural das fibrilas na película de colágeno utilizada na invenção ocorre por meios naturais, semelhantes ao fisiológico. Primariamente esta reticulação natural é devido às interações não covalentes (por exemplo, interações de van der Waals ou de dipolo-dipolo) ou pela formação de ligações de base de Schiff facilmente dissociáveis entre as cadeias laterais de aminoácído da molécula de colágeno. A reticulação intermolecular de colágeno é responsável pela estabilidade física e química. A etapa chave na formação das reticulações de colágeno depende da conversão ■ enzimática de resíduos de lisina ou hidroxilisina e dá origem a aldeídos, alisina e hidroxialisina. Estes grupos de aldeído espontaneamente reagem com grupos amino reativos resultando na formação de componentes da base de Schiff contendo produtos da condensação de aldol instáveis com ligações de aldimina instáveis (-CH=N-). Assim, as fibrilas do produto da presente invenção podem ser dissociadas pelo tratamento com, por exemplo, um ácido fraco. A reticulação que surge do uso de agentes de reticulação química pode ser detectada da presença de porções de reticulação covalentemente reticuladas. Comumente, isto é realizado pelo uso de um Reagente de base de Schiff (por exemplo, glutaraldeído) para formar produtos da reação de base de Schiff e depois estabilizando as ligações através de um rearranjo de Amadori ou condições redutoras. Além disso, o colágeno pode ser reticulado por vários reagentes de carbodiimida bifimcionais. A reticulação que surge do uso de radiação pode ser detectada pela presença de ligações covalentes estáveis entre as fibrilas de colágeno, causadas pela reação das porções de radical livre geradas durante a irradiação. As fibrilas no produto da presente invenção, por outro lado, são substancialmente não reticuladas sem nenhuma ligação covalente estável e não foram tratadas em uma maneira química ou irradíativa. Assim, qualquer associação entre as fibrilas no produto da invenção é substancialmente não covalente ou facilmente reversível e não são estavelmente reticuladas. Os produtos químicos tais como cianamida, glutaraldeído, formaldeído, acrilamida, carbodiimidadionas, diimidatos, bisacrilamidas e outros foram utilizados no passado para reticular quimicamente as fibrilas de colágeno em substitutos de dura-máter. O uso de tais produtos químicos, entretanto, pode resultar em riscos de toxicidade associados com o contato inadvertidamente do tecido cerebral com produtos químicos residuais em um substituto de dura-máter. O processo de precipitação desse modo evita os riscos de toxicidade de produtos químicos de reticulação e tempos de reabsorção mais longos associados com a reticulação das fibrilas de colágeno com produtos químicos ou radiação. A composição de colágeno seca, precipitada, resultante forma uma película de colágeno eqüino compreendida de uma membrana de colágeno de camada múltipla de peso molecular alto que consiste de numerosas fibrilas de colágeno naturalmente entrelaçadas multi-direcionais. A película de colágeno eqüino primariamente contém colágeno do Tipo I intersticial. A película de colágeno eqüino substancialmeníe não tem poros e é primariamente impermeável a líquido. Os testes de difusão imune podem ser conduzidos no produto para garantir a ausência de proteína estranha. O processo descrito acima usado para produzir a película de colágeno eqüino para o uso na presente invenção também é utilizado pela Resorba Wundversorgung GmbH & Co. KG, Nuremberg, Alemanha, na fabricação de películas de colágeno comercialmente disponíveis da Baxter AG, Viena, Áustria. As películas comercialmente disponíveis são indicadas para o uso como agentes hemostáticos, como substitutos de tecido temporários, para a cobertura de danos e como substâncias carregadoras de selante de fibrina. A espessura da película de colágeno eqüino para o uso na presente invenção pode variar como requerido por uma aplicação particular. Por exemplo, no reparo de tecido de dura-máter pediátrico, uma película de colágeno eqüino maís fina pode ser utilizada, ao passo que uma película de colágeno eqüino maís espessa pode ser utilizada no reparo de tecido de dura-máter de adulto. A espessura da película de colágeno eqüino pode ser controlada variando-se a quantidade de material de partida utilizado para produzir um tamanho particular de película de colágeno eqüino. A película de colágeno eqüino é esterilizada a gás com óxido de etileno (ETO) ou gás de esterilização similar ou por irradiação. Procedimentos de Fixação Antes do uso, a película de colágeno eqüino seca pode ser hidratada, por exemplo, em solução salina fisiológica. Em uma forma de realização, a solução salina fisiológica compreende uma solução de cloreto de sódio a 0,9%. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é hidratada em excipientes ou soluções contendo medicamento. A duração de tempo necessária para hidratar a película de colágeno eqüino está relacionada com a espessura da película. A película de colágeno eqüino é hidratada até que ela esteja constante em espessura através da sua área inteira. Em uma forma de realização a película de colágeno eqüino é hidratada entre cerca de 5 segundos e cerca de 1 hora em solução salina fisiológica. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é hidratada entre cerca de 5 segundos e cerca de 30 minutos em solução salina fisiológica. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é hidratada entre cerca de 5 segundos e cerca de 20 minutos em solução salina fisiológica. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é hidratada entre cerca de 5 segundos e cerca de 10 minutos em solução salina fisiológica. Ainda em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é hidratada entre cerca de 1 minuto e cerca de 6 minutos em solução salina fisiológica. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é hidratada em cerca de 5 minutos em solução salina fisiológica. Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino não é hidratada antes do implante. A película de colágeno eqüino pode ser ligada à dura-máter do paciente pelas técnicas cirúrgicas estabelecidas, por exemplo, por selante de fibrina, cola de tecido, suturas cirúrgicas ou pelas técnicas cirúrgicas de assentamento por pressão. Altemativamente, a atração natural entre a película de colágeno eqüino e o tecido de dura-máter pode ser usada para fixar a película de colágeno eqüino ao tecido de dura-máter sem o uso de nenhum selante, cola, suturas ou técnicas de assentamento por pressão. Uma vez hidratada, a película de colágeno eqüino pode ser cortada ligeiramente maior do que a abertura cirúrgica na dura-máter do paciente. A película de colágeno eqüino desse modo ligeiramente se sobrepõem à dura-máter do paciente à qual ela é ligada. Em uma forma de realização, a película de colágeno eqüino hidratada é dimensionada para ter uma sobreposição de aproximadamente 0,5 cm a cerca de 1 cm com a dura. A quantidade de sobreposição pode variar dependendo das preferências e habilidade do neurocirurgião.

Em uma forma de realização, de acordo com a interação bem conhecida de colágeno com fibrina, a película de colágeno eqüino pode ser ligada à dura-máter com selante de fibrina aprovado para uso neurológico. Os exemplos de selante de fibrina aprovado para uso neurológico incluem selantes de fibrina Tissucol e Tisseel (Baxter AG, Viena, Áustria). Altemativamente, uma cola de tecido que é aprovada para uso neurológico também pode ser utilizada. O selante de fibrina ou cola de tecido podem ser aplicados em uma linha contínua em tomo da porção da película de colágeno eqüino que se sobrepõem à dura-máter de modo a formar um selo impermeável a líquido. Como descrito acima, um selo impermeável a líquido é vantajoso visto que ele evita complicações associadas com a perda de fluido cerebrospinal tal como liquorréia.

Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino produz um selo impermeável a líquido quando ligada à dura-máter autóloga com uma linha contínua de selante de fibrina ou cola de tecido.

Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino que se sobrepõem à dura-máter pode ser dotada com selante de fibrina ou cola de tecido para ligá-la à dura-máter.

Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é ligada suturando-a cirurgicamente na dura-máter uma vez que ela foi posicionada no sítio de implantação desejado. Embora esta forma de realização possa ser utilizada para fixar a película de colágeno eqüino na dura-máter autóloga do paciente, as suturas podem causar canais ramificados, que por sua vez pode resultar em fistulas e vazamento de fluido cerebrospinal. Se a película de colágeno eqüino deva ser suturada, técnicas de sutura sem tensão devem ser usadas para impedir a película de rasgar. E recomendado selar as linhas de sutura, por exemplo, com um selante de fibrina.

Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é posicionada e implantada de acordo com técnicas de fixação por pressão conhecidas no ramo. Nesta técnica, a película de colágeno eqüino é posicionada no local de implantação desejado e mantida no lugar pela pressão interna natural presente no crânio ou coluna espinal. Assim, o enxerto permanece no lugar sem o uso de suturas cirúrgicas, selante de fibrina ou cola de tecido.

Em uma outra forma de realização, a película de colágeno eqüino é posicionada e implantada sem o uso de qualquer selante, cola, sutures ou técnicas de fixação por pressão. Nesta técnica, a película de colágeno eqüíno é posicionada no local de implantação desejado e mantida no lugar pela atração ou adesão naturais que ocorre entre a película de colágeno equino e o tecido de dura-máter, A película de colágeno eqüino da presente invenção pode ser utilizada como um enxerto de dura-máter de substituição para reparar tecido de dura-máter humano devido a uma condição congênita, defeito de nascimento, doença, dano, remoção de tumor ou outro procedimento cirúrgico que rompa ou penetre a dura-máter de um paciente ou qualquer outra condição em que a dura-máter requeira reparo. A película de colágeno eqüino também pode ser utilizada para reparar tecido de dura-máter de outros mamíferos, incluindo, mas não limitado a ovelha, macacos, cavalos, animais de laboratório ou outros mamíferos. A película de colágeno eqüino pode ser usada para reparar tecido de dura-máter no crânio ou ao longo da coluna espinal. A presente invenção é ainda direcionada a um kit compreendendo película de colágeno eqüino e instruções para a sua preparação e uso como uma dura-máter de substituição.

Contra-indicações Um paciente conhecido ter reações alérgicas aos cavalos ou produtos eqüinos estaria contra-indicado de receber película de colágeno eqüino.

Outras contra-indicações podem incluir pacientes que estejam passando pela terapia de radiação logo depois da cirurgia. Por exemplo, pacientes que estão para receber terapia de radiação logo depois de uma ressecção de tumor cerebral não são bons candidatos para serem receptores da película de colágeno eqüino da presente invenção. A terapia de radiação pode retardar ou inibir o desenvolvimento da neodura, que é compreendida de células que se dividem rapidamente, nas quais a película de colágeno eqüino é reabsorvida. Em uma tal situação uma dura-máter de substituição não reabsorvível, tal como de Teflon, seria mais adequada. Um cirurgião habilitado, entretanto, reconhecería os tratamentos em que uma substituição não reabsorvível seria necessária.

Definições “Película de colágeno equino” significa uma biomatriz (isto é, uma matriz de material biocompatível) de fibrilas de colágeno eqüino tratadas para remover componentes celulares e para formar uma folha de fibrilas de colágeno. O termo “película de colágeno eqüino” não inclui uma película compósita de uma ou mais folhas substancialmente não porosas de fibrilas de colágeno unidas a uma ou mais folhas porosas de colágeno. “Tecido de dura-máter” significa o tecido de dura-máter autólogo de um mamífero. “Biomatriz que não ocorre naturalmente” significa uma matriz ou estrutura fabricada compreendendo fibrilas de colágeno formadas de (1) um material existente por natureza (isto é, material natural) que foi tratado ou processado em uma maneira em que as fibrilas de colágeno contidas no material natural fossem movidas ou reposicionadas do seu arranjo que ocorre naturalmente dentro da estrutura de colágeno do material natural; ou (2) um material não existente por natureza (isto é, um material não natural) tratado ou processado com fibrilas de colágeno. Por exemplo, uma biomatriz que não ocorre naturalmente pode ser formada de material de partida compreendendo colágeno que foi mecânica ou quimicamente processado (por exemplo, moído, picado, etc.). Ao contrário, uma biomatriz de colágeno que é formada do tratamento ou processamento de material de partida em um maneira que preserve a estrutura da estrutura de colágeno não é uma biomatriz que não ocorre naturalmente (por exemplo, tecido epidérmico tratado para remover componentes celulares enquanto preserva a estrutura de colágeno que ocorre naturalmente). “Substancialmente não poroso” significa que qualquer um dos poros que estão presentes em uma película de colágeno eqüino como um resultado da precipitação de fibrilas de colágeno para formar uma folha de colágeno estão primariamente isolados um do outro. Os poros que podem estar conectados entre si não estão interconectados de uma maneira que atravesse a espessura da película de colágeno eqüino. Perfurações mecânicas que criam furos na película de colágeno eqüino não são poros. Preferivelmente, o material parece ser substancialmente isento de poros que possam ser visíveis usando um microscópio eletrônico de varredura em ampliação de 1500x.

Os seguintes exemplos ilustrarão ainda mais a invenção.

Exemplo 1 Este exemplo apresenta os resultados de experimentos em ovelha para avaliar uma película de colágeno eqüino quanto a sua adequabilidade como um substituto de dura-máter usado para reparar tecido de dura-máter e como uma biomatriz para a regeneração da dura.

Um experimento foi conduzido para avaliar as propriedades de uma película de colágeno eqüino para o uso como substituto craniano de dura-máter como investigado em um modelo de ovelha. A película de colágeno eqüino compreende fibrilas de colágeno eqüino nativas (5,6 mg/cm) purificada de tendão de Aquiles eqüino picado e não contém nenhum componente celular. O produto de referência usado foi dura cadavérica humana preservada (Tutoplast Dura). Ambos os produtos foram ligados em posição usando apenas cola de fibrina (Tissucol Duo S Immuno, Baxter AG, Viena, Áustria).

Os seguintes itens foram estudados: Aspectos macroscópicos de incorporação dos dois enxertos;

Reações de estruturas de tecido adjacente (inflamação, adesão, fibrose, necrose); e Avaliação histológica do processo de incorporação e organização de tecido conectivo O processo de purificação para produzir película de colágeno eqüino começa com pelo menos uma hora de tratamento com solução de hidróxido de sódio do material de partida de tendão, seguido pela neutralização em ácido clorídrico. Pepsina é depois usada para romper os tendões. O colágeno coloidal assim produzido é precipitado como fibrüas. A secagem e a esterilização com gás produz então a película de colágeno eqüino com 5,6 mg de fibrilas de colágeno nativas por centímetro quadrado. Nada mais é adicionado e nenhum métodos artificial para a reticulação (isto é, envolvendo produtos químicos ou radiação) são realizadas. Os testes de imunodifusão garantem que nenhuma proteína estranha esteja presente. MATERIAIS E MÉTODOS Animais Experimentais O estudo foi realizado em 25 ovelhas adultas. As ovelhas foram animais domésticos de cruzamento misto usados na agricultura. Os animais pesaram em média 53,0 kg no momento da cirurgia e a sua idade média foi de 2 anos. Todos os animais foram fêmeas. Os animais foram mantidos no aprisco de animal da Luebeck Medicai University que é equipado com estruturas de telhado e um fechamento de ar aberto. Os animais foram ministrados com ração mista convencional. Os animais foram divididos em grupos de cinco para os testes de histologia e caracterização de diversos estágios de incorporação de enxerto (Grupo 1 ao Grupo 5). Os tempos de sobrevivência por grupo foram 2,4, 8,16 e 24 semanas.

Produto de estudo A película de colágeno eqüino da investigação é fabricada de fibrilas de colágeno eqüino naturais (principalmente colágeno do tipo I intersticial). Um centímetro quadrado do material contém 5,6 miligramas de fibrilas de colágeno sem nenhum componente celular. O comparador (Tutoplast Dura, Tutogen Medicai GmbH, Neunkirchen a. Brand, Alemanha) é uma dura cadavérica de ser humano preservada por um processo escasso de tecido. A cola de fibrina, Tissucol Duo S, foi usada para ligar os enxertos à dura-máter. Esta cola de componente duplo biológico consiste de uma seringa pré enchida contendo proteínas de plasma humano, fibrinogênio, fator de coagulação XIII, fibronectina plasmática e aprotinina e uma outra seringa pré enchida contendo trombina e cloreto de cálcio.

Anestesia Os animais foram pré medicados com uma injeção intramuscular de cloridreto de xilazina, (Rompun 2%, Bayer AG, Leverkusen, Alemanha), dosagem: 0,1 mg por kg de peso corporal, (S)-cetamina (Ketanest S, Parke-Davis GmbH, Karlsruhe, Alemanha) dosagem: 2 mg por kg de peso corporal e 0,5 mg de atropina, 1 ml de solução de injeção, (Atropinsulfat Braun 0,5 mg, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha), em um coquetel de injeção. Uma linha venosa e arterial foi inserida na orelha direita. Propofol (Disoprivan 2%, AstraZeneca GmbH, Wedel, Alemanha) 1 mg/kg de peso corporal foi administrado para a anestesia. Os animais foram entubados endotraquealmente (D. I. 7,0 mm) e 100% de oxigênio foi administrado por normoventilação controlada (ventilador de anestesia Sulla 808V, Drãger, Luebeck, Alemanha). ■ Propofol, (S)-cetamina e sevoflurano foram administrados para manter a anestesia equilibrada. As relações de pressão e volume dentro do ciclo respiratório, a fração de oxigênio inspiratória (Oxydig, Drãger, Luebeck, Alemanha), a concentração de carboidrato expiratório final (Kapnodig, Drãger, Luebeck, Alemanha), eletrocardiograma e pressão sangüínea arterial invasiva foram monitorada durante a cirurgia.

Profilaxia antibiótica pré operativa Imediatamente antes da cirurgia, cada animal recebeu uma dose intravenosa de 2,0 g de cefazolin (Basocef 2,0 g, Curasan AG, Kleinostheim, Alemanha). A profilaxia antibiótica foi mantida por mais 4 dias de pós operatório por duas doses subcutâneas de um produto de depósito, Strepdipen-Suspensão (1,0 ml contém 100 000 IU de benzil penicilina benzatina e 100 000 IU de sulfato de diidroestreptomicina; dosagem de 1,0 ml por kg de peso corporal). As injeções subcutâneas foram administradas imediatamente na conclusão do procedimento e mais uma vez 48 horas mais tarde. Técnica cirúrgica Os animais já entubado foram colocados em uma posição lateral esquerda. A cabeça foi depois virada para a direita e mantida em uma posição horizontal prendendo-a na mesa de operação. O crânio foi depois cuidadosamente raspado, a pele foi desengordurada com benzina e depois desinfetada. Um lençol estéril com uma abertura expondo a área a ser operada foi fixado e o animal inteiro foi coberto com cobertores estéreis. A primeira incisão da pele foi feita 1,5 cm para a esquerda da linha mediana e prolongada por aproximadamente 6 cm. Qualquer sangramento do escalpo foi coagulado usando fórceps bipolar, Um retrator foi aplicado e o osso do crânio foi exposto na região temporoparietal retraindo-se e espalhando-se a gálea aponeurótica. Dois furos (0,8 cm no diâmetro) aproximadamente 5 cm separadamente foram depois perfurados usando uma broca manualmente operada, Uma serra (Mikrotom, Aesculap, Melsungen, Alemanha) foi depois usada para remover um disco oval longitudinal de osso do crânio entre os furos da broca.

Qualquer sangramento do crânio foi interrompido usando cera óssea. Um bisturi foi usado para fazer uma incisão na dura aproximadamente 0,5 cm no comprimento. Tesouras de Dura foram então usadas para cortar uma peça oval de dura-máter medindo aproximadamente 3 x 2 cm ao longo da margem do osso. Cuidado especial foi tomado para não lesar a aracnóide- máter. Um agente haemosiyptic, TachoCombW (Nycomed Áustria GmbH, Linz, Áustria) foi usado para deter qualquer sangramento dos vasos sangüíneos durais.

Um pedaço oval de película de colágeno eqüino (medindo 3,5 x 2,5 cm) foi depois cortada no tamanho e imersa por 5 minutos em solução salina a 0,9% estéril. Para fechar o defeito, a película de colágeno eqüino foi comprimida toda em volta sob as margens da dura-máter e pontilhada com cola de fibrina para mantê-la no lugar. Ver a Fig. 7. O disco do crânio foi depois religado usando duas miniplacas (Bioplates, Codman, Norderstedt, Alemanha). A gálea foi fechada usando sutura absorvível (Vicryl 2.0) e a pele foi suturada com Ethilon 3.0. O produto Tutoplast® Dura foi aplicado de maneira similar no aspecto direito do crânio. Ver a Fig. 8. Ambos os danos foram fínalmente tratados com um curativo pulverizado (Hansaplast Spmhpflaster, Beiersdorf AG, Hamburg, Alemanha). O tempo de operação médio foi de 120 minutos. O período médio de indução de anestesia para o início da cirurgia foi de aproximadamente 60 minutos e o tempo médio do final da sutura até o final da anestesia foi de 5 a 10 minutos.

Observação Pós Operatória dos Animais Os animais foram retomados para a sua gaiola aproximadamente 30 minutos depois da extubação. Eles foram checados em intervalos regulares pelo cirurgião, veterinário e cuidadores de animal quanto a sinais de inflamação ou anormalidades neurológicas. Os animais foram deixados no fechamento de ar aberto oito dias depois da cirurgia.

Eutanásia Animal Os animais foram mortos com propósitos de amostragem nos tempos de sobrevivência redefinidos de 2, 4, 8, 16 e 24 semanas do pós operatório.

Antes da matança os animais foram sedados pela injeção intramuscular de 1 mg por kg de peso corporal de Rompun a 2%. Um monitor de eletrocardiograma (ECG) foi preso e uma linha venosa e arterial foi colocada na orelha direita. Os animais profundamente sedados foram depois mortos pela injeção intravenosa de T-61 (Hoechst Roussel Vet, Somcrville, Nova Jérsei); 1 ml de solução de injeção contém 0,2 g de embutramida, 0,05 g de iodeto de mebezônio e 0,005 g de cloridreto de tetracaína; dosagem de 0,3 ml por kg de peso corporal). O processo foi monitorado pelo ECG e medição da pressão arterial.

Amostragem Os animais tiveram as suas cabeças raspadas e foram posicionados como descrito para o procedimento cirúrgico. Uma incisão circular medindo aproximadamente 9 cm no diâmetro foi feita na pele em tomo das duas cicatrizes cirúrgicas. A gálea aponeurótica foi retraída para expor uma seção grande do tampão do crânio e um furo foi perfurado na região frontal direita. Um disco circular do crânio medindo aproximadamente 8 cm foi removido com uma serra. O local do enxerto inteiro que consiste de osso, dura e parênquima cerebral foi acessado cortando-se ao longo da margem do osso com um bisturi. A dura e o tecido cerebral foram depois cuidadosamente separados do osso sobrejacente e fixados em formalina para o trabalho histológico. A amostra de enxerto mediu aproximadamente 7 cm no diâmetro. Métodos Histológicos As amostras de enxerto foram examinadas macroscopicamente e divididas em fatias frontais. Os dois sítios cirúrgicos foram preparados simultaneamente. Cinco seções de aproximadamente 2 a 3 pm de espessura foram tomados de cada amostra.

Os métodos de tingimento padrão usados para avaliar as mudanças incluíram Hematoxilina-Eosina para os componentes celulares, Elastica van Gieson para as estruturas mesenquimais, Tricromo para as estruturas mesenquimais e para avaliar a neogênese de fibra de colágeno e uma mancha de ferro para determinar o grau de sangramento.

Resultados Curso intraoperativo e pós operatório O acompanhamento da anestesia, cirurgia e período pós operatório foram sem qualquer acontecimento em todos com exceção de dois animais. Um animal morreu durante a indução de anestesia como um resultado de arritmia cardíaca refrataria. Um outro animal morreu repentina e inesperadamente 14 dias depois da cirurgia a seguir do que houve um curso pós operatório sem qualquer acontecimento até então. A examinação microscópica do cérebro mostrou necrose cortical extensiva com evidência de cicatrização. A causa mais provável da morte é portanto isquemia cerebral longa duração de etiologia desconhecida.

Houve muito pouca hemorragia intraoperativa, que foram brandas e na maioria dos casos de vasos sanguíneos pequenos da dura-máter. A hemorragia foi rapidamente controlada usando-se fórceps bipolar ou agentes haemostyptic.

Nenhum dos animais demonstraram anormalidades neurológicas durante o acompanhamento pós operatório. Do mesmo modo, nenhum dos animais demonstraram sinais de inflamação, vazamento de fluido cerebrospinal ou cicatrização de dano prejudicada.

Macroscopia Os seguintes parâmetros foram examinados e quantificados durante a remoção das amostras dos locais cirúrgicos: - Formação de adesões entre o crânio e a dura; - Vazamento de fluido cerebrospinal e mudanças inflamatórias; - Mudanças visíveis nos enxertos durais; e - Adesões Meningocorticais e reação cortical.

Microscopia ' As seções de histologia foram avaliados sistematicamente em termos do seguinte: - Descrição e quantificação das reações inflamatórias no local do enxerto (epidural, subdural, zona transicional entre a dura e o enxerto); - Grau de organização do tecido conectivo do enxerto; - Grau de reação de corpo estranho; - Mudanças no espaço subaracnoidal (processos inflamatórios, fibrose vs. Espaço subaracnoidal aberto); e - Mudanças no córtex (inflamação, necrose).

Resultados de Macroscopia e Histologia Os resultados de histologia descritos abaixo são idênticos em termos de composição celular, enquanto varia em intensidade, em seções frontais diferentes do mesmo animal e em todos os animais do mesmo grupo. Avaliação Macroscópica de Incorporação de Enxerto A remoção do crânio depois de um período de 2 semanas divulga adesões mínimas bilateralmente entre os resíduos de cola de fibrina e o osso sobrejacente. As adesões são facilmente soltas. Não existe nenhum sinal de inflamação ou vazamento de fluido cerebrospinal em cada local de enxerto durai. Ambos enxertos são manchados com coágulos sangüíneos individuais medindo uns poucos milímetros no diâmetro.

No hemisfério esquerdo a película de colágeno equino é ainda circunscrito como tal e parece ser menos transparente do que o seu aspecto de vidro moído original. O produto de colágeno retém a sua ligação às margens durais quando a dura é cuidadosamente levantada do córtex. Existem umas poucas adesões muito leves que são muito facilmente soltas sem danificar o córtex. O Tutoplast Dura no hemisfério direito é inalterado ao olho nu. 0 Tutoplast Dura toma-se descolado em lugares na zona de contato enxerto-dural quando o produto é removido. Existem umas poucas adesões subaracnoidais quando a dura é levantada do córtex, mas elas são facilmente soltas com fórceps.

Quatro semanas de pós operatório, ainda existe umas poucas adesões entre as margens do osso sobrejacente e a dura abaixo; estas são devido aos resíduos de cola de fibrina. O osso é facilmente solto da dura-máter sem esforço, não causando nenhum dano à dura ou enxerto. No local da película de colágeno eqüino no hemisfério esquerdo, a zona de demarcação entre a dura-máter e o enxerto não é mais distinta. O enxerto é menos transparente do que anteriormente e adquiriu uma cor vermelha clara. O aspecto do enxerto voltado para a superfície cerebral é homogênea, lisa e móvel. As adesões subdurais não estão mais presentes. Uns poucos resíduos de coágulo sangüíneo são visíveis. O Tutoplast Dura mais uma vez parece inalterado ao olho nu. A inspeção da área de contato entre o enxerto e a dura divulga uma ligação inadequada, facilmente solta.

Oito semanas do pós operatório, a zona de transição entre a dura e o enxerto de película de colágeno eqüino no hemisfério esquerdo não está mais presente. A continuidade estrutural é evidente em ambos os lados da meninge. A área onde a película de colágeno eqüino foi colocada é evidente apenas em uma membrana levemente mais fina e de aparência levemente avermelhada. Ver as Figs. 9 e 10. O enxerto de Tutoplast Dura no hemisfério direito está neste tempo coberto em ambos os lados com uma membrana de tecido conectivo fino. Ver a Fig. 11. As bordas do enxerto são ainda claramente visíveis abaixo da dura sobrejacente. Um leve puxão no Tutoplast Dura é suficiente para descolá-lo da dura pré formada.

Depois de 16 semanas, a formação da neodura procedeu ainda no local da película de colágeno eqüino e a dura e a neodura são escassamente distinguíveis. A encapsulação com tecido conectivo do enxerto Tutoplast® Dura no hemisfério direito tem se tomado mais acentuado.

Depois de um período de 24 semanas, as seções de ambos sítios de enxerto não diferem macroscopicamente daqueles do grupo previamente.

Avaliação Microscópica da Incorporação do Enxerto Duas semanas do pós operatório, como esperado, o local do enxerto da película de colágeno equino divulga áreas extensas de mudança inflamatória. O espaço subaracnoidal inteiro é fechado pelas adesões resultantes da exsudação copiosa de linfócitos, granulócitos segmentados e macrófagos. Algumas áreas de exsudação inflamatória muito extensa são também evidentes acima do enxerto. Além dos componentes linfocíticos e monocíticos, existe também cavacos pequenos de osso aqui com uma reação de corpo estranho correspondente pelas células gigantes polinucleares. O enxerto de película de colágeno equino por si só demonstra soltura de estruturas homogêneas e invasão de células inflamatórias, na forma de coração ou extensivas. Ver a Fig. 12. Em uns poucos casos existe necrose isquêmica (relacionada com a cirurgia) de áreas superficiais do córtex cerebral. A amostra de Tutoplast Dura também demonstra uma resposta inflamatória extensa, especialmente no espaço subaracnoidal. O próprio enxerto não é infiltrado pelas células inflamatórias, mas linfócitos e monócitos inflamatórios e reação de corpo estranho são identificáveis em ambas as extremidades.

Depois de um período de quatro semanas, as mudanças inflamatórias no local do enxerto da película de colágeno equino regrediram significantemente, mas exsudados linfocíticos e monocíticos como gramado estão ainda presentes. Ver as Figs. 13 e 14, As células gigantes de corpo estranho polinucleares são mais comuns, especialmente próximo dos cavacos de osso. Numerosos fibroblastos podem ser vistos dentro do enxerto de película de colágeno eqüino original. As estruturas homogêneas típicas do enxerto não são detectáveis nas seções de HE (tingímento com hematoxilina-eosina). As amostras tingidas com EVG (Elastica von Gieson) e tricromo mostram neogênese extensiva de fibras de colágeno no primeiro local do enxerto. A dura-máter verdadeira suavemente dá lugar ao tecido vagamente estruturado que consiste de fibras de colágeno recém formadas que demonstram infiltração inflamatória. A adesão inflamatória previamente observada das leptomeninges não está mais presente. O espaço subaracnoidal está mais uma vez em evidência, deixando uma fenda. A pia-máter continua a exibir nódulos pequenos de infiltração linfocítica-monocítica no espaço ocupado. Não há nenhum sinal de organização de tecido conectivo no local do Tutoplast Dura. A exsudação inflamatória está presente acima e abaixo do tecido implantado e infiltrados inflamatórias estão presentes na zona de transição da dura pré formada. O espaço subaracnoidal é detectável e evidente. Ver a Fig. 15.

Oito semanas de pós operatório, no grupo da película de colágeno eqüino, os processos inflamatórios na neodura regrediram ainda mais. Apenas cachos pequenos de infiltração linfocítica e monocítica estão ainda presentes. O espaço subaracnoidal é claro e, mais uma vez, apenas focos pequenos de atividade inflamatória estão presentes. As seções tingidas com EVG e tricromo mostram continuidade acentuada entre a dura endógena altamente colaginosa e as fibras de colágeno recém formadas da neodura. Esta nova membrana parece variar em espessura e demonstra soltura estrutural em partes. Ver a Fig. 16. A atividade inflamatória também foi bem depurada no local do Tutoplast Dura. A incorporação com a dura vizinha está ausente em certos lugares e em outros existe sinais de infiltração inflamatória e adesão com a dura adjacente.

Depois de 16 semanas, no grupo da película de colágeno eqüino, cachos de infiltrados inflamatórios nodulares linfocíticos e monocíticos são ainda visíveis. A continuidade entre a dura verdadeira altamente colaginosa e a neodura é inalterada, com estruturas mão demonstrando maiores mudanças versus as descobertas na semana 8. As fibras de colágeno de espessura variável estão presentes, com alguma soltura estrutural em certos lugares. O local do Tutoplast Dura mais uma vez mostra mudanças inflamatórias e adesões com a dura circundante; estas descobertas variam em intensidade.

Depois de 24 semanas, no grupo da película de colágeno eqüino, à parte de mais regressão da resposta inflamatória celular, não existe nenhuma diferença histológica relevante ao estágio de incorporação de enxerto na semana 16. Ver a Fig. 17.

Resultados Histológicos A quantificação da resposta inflamatória, tecido conectivo organização e grau de reação de corpo estranho nos locais de enxerto e espaço subdural e epidural são fornecidos abaixo na Tabela 1.

Tabela 1 - Exame de Enxertos, Espaço Subdural e Epidural Inflamação (Reação inflamatória): --Nenhum sinal visível de resposta inflamatória u Apenas infiltrados inflamatórios circunscritos + Resposta inflamatória branda ++ Resposta inflamatória significante +++ Infiltrados inflamatórios graves Organização de enxerto: -Organização de tecido conectivo ausente ou leve + Fibroblastos isolados dentro do enxerto u Organização de tecido circunscrita (40% a 70%) u/K Organização de tecido > 70% K Continuidade visível de neodura e dura, organização completa (100%) do enxerto Reação de corpo estranho com células gigantes polinucleares: - Nenhuma reação de corpo estranho u Reação de corpo estranho apenas circunscrita + Reação de corpo estranho branda ++ Reação de corpo estranho significante +++ Reação de corpo estranho extensiva Os resultados do exame histológico do espaço subaracnoidal em ambos os locais de enxerto são fornecidos na Tabela 2, abaixo.

Tabela 2 - Exame do Espaço Subaracnoidal (SAS) Inflamação: - Sem resposta inflamatória + Reação inflamatória branda ++ Resposta inflamatória significante Reação inflamatória grave SAS (espaço subaracnoidal) fechado: --Células inflamatórias dispersas + SAS fechado pelo infiltrado celular u Infiltrados inflamatórios isolados no SAS pF/F Fibrose parcial/Fibrose de SAS SAS aberto: - SAS principalmente claro com grupos de célula isoladas + Espaço subaracnoidal claro Debate Avaliação de Métodos Cirúrgicos e Manuseio de Ambos os Enxertos A película de colágeno eqüino foi caracterizado pelo manuseio intraoperativo isento de problemas. A reidratação em solução salina fisiológica por 5 minutos produziu uma película espessa, extremamente elástica de aproximadamente 2 mm que não perdeu a sua forma, não conglutinou e foi facilmente cortado na sua forma. O material foi facilmente posicionado no defeito durai usando fórceps e um gancho abrupto. Devido à sua mobilidade, também foi fácil corrigir a posição da película de colágeno eqüino na superfície cerebral antes de fixá-la no lugar. Não houve necessidade para suturar a película porque o enxerto foi rápida e facilmente ligado à borda durai usando cola de fibrina. Estudos anteriores também mostraram que a cola de fibrina é um selante seguro para o fechamento durai.

As suturas de contenção experimentalmente administradas rasgaram a película de colágeno eqüino no mais leve puxão, indicando que a cola de fibrina é o melhor método para este enxerto.

Quando os produtos foram mais tarde removidos, houve evidência em alguns casos de que a aplicação muito liberal de cola de fibrina deixou adesão com o osso sobrejacente em certos lugares. Estas adesões tiveram que ser soltas cuidadosamente com um dissector para evitar puxar as meninges e o córtex. Este problema foi evitado pela aplicação ou ponteação de quantidades escassas da cola de fibrina. Quando os produtos foram removidos estava evidente que a aplicação de cola de fibrina por si só produz fechamento durai seguro e impede o vazamento de fluido cerebrospinal. Isto foi evidente tão cedo quanto 2 semanas de pós operatório quando nenhum dos animais desenvolveram vazamento de CSF subcutâneo ou fistulas de fluido cerebrospinal. O produto Tutoplast Dura também é fácil de manusear depois de um breve período de reidratação de diversos minutos, mas é muito mais rígido e demonstra maior flutuação em termos de calibre. A cola de fibrina produziu adesão adequada para manter o Tutoplast Dura inicialmente no lugar, mas a conexão entre a dura original e o enxerto foi perdida quando o local cirúrgico foi reaberto. Este foi ainda o caso na semana 24 do pós operatório devido ao fato de que o próprio Tutoplast Dura não se fundiu com a dura-máter autóloga. A prática de unir este enxerto com suturas individuais portanto parece ser superior ao uso da cola de fibrina como as observações indicam que a incorporação adequada de outro modo não ocorrerá. Houve adesões muito raras na zona transicional entre Tutoplast Dura e córtex que foram fáceis de soltar usando um dissector. A técnica usada para inserir a película de colágeno eqüino entre a dura e o córtex é provavelmente inadequada em certas situações cirúrgicas. Em particular, a fixação adequada é improvável de ser obtida com este método em procedimentos que envolvem defeitos grandes da parênquima cerebral, por exemplo, cavidades tumorais.

Macroscopicamente, todos os animais demonstraram fechamento confiável do defeito durai sem nenhuma reação de rejeição de enxerto. Pequenas adesões entre o implante e as estruturas corticais desenvolveram-se em uns poucos casos, provavelmente devido a danos muito pequenos na aracnóide-máter durante a cimrgia. O uso excessivamente liberal de cola de fibrina resultou em alguns dos animais em pequenas áreas de adesão com o osso sobrejacente que foram facilmente soltas.

Histologicamente, a infiltração densa da película de colágeno eqüino com linfócitos, macrófagos e fibroblastos foi observada dentro de 14 dias depois da implantação. Capilares se formam no enxerto mais tarde no tempo. As mudanças inflamatórias concomitantes nos espaços subaracnoidal e subdural/epidural e na zona transicional da dura-enxerto regrediram exatamente em 4 semanas de pós operatório. Uma transição contínua entre o enxerto da película de colágeno eqüino e a dura circundante devido à neogênese de fibras de colágeno também é evidente neste ponto no tempo.

Esta neodura que foi induzida pela película de colágeno eqüino não é tão espessa quanto a dura original na semana 24 do pós operatório, provavelmente porque a película de dura-máter forneceu apenas uma certa espessura desde o princípio. É possível entretanto que esta diferença seja mais tarde compensada conforme mais fibras de colágeno são produzidas.

Nas duas semanas de pós operatório, o Tutoplast® Dura demonstra encapsulação macroscopicamente visível do produto em uma camada fma de tecido conectivo que se toma mais espessa conforme o tempo continua. Mais uma vez, todos os animais demonstram fechamento durai adequado sem nenhuma fistula de CSF e umas poucas adesões entre o enxerto e córtex ou osso estão presentes. A despeito de reações inflamatórias similares nas estruturas que circundam o enxerto, não existe sinal de processos de organização pós operatória e pouca evidência de infiltração e revitalização celulares do enxerto.

Nenhum dos animais desenvolveram anormalidades neurológicas ou infecções de dano fora de uma resposta inflamatória linfocítica e monocítica localmente contida planejado.

Exemplo 2 - Capacidade de Intumescimento de Película de Colágeno Equino As investigações concernentes à capacidade de intumescimento da película de colágeno eqüino foram realizadas como segue: 1) A película de colágeno eqüino foi primeiro cortada em pedaços quadrados de 1 cm2. 2) Amostras destes pedaços cortados foram examinadas sob um microscópio de varredura convencional para determinar a consistência morfológica bruta e a espessura do material como uma referência para os procedimentos de intumescimento. 3) Estes pedaços foram depois levados em placas de cultura de plástico. 4) A capacidade de captação de fluido e a capacidade de intumescimento foram então examinadas pela titulação sucessiva com solução salina fisiológica, administrada com micropipetas de Eppendorf usando quantidades ascendente de fluido, partindo com 10 μΐ/cm2 até 150 μΐ/cm2 (ver a Tabela 3).

Tabela 3 Resultados: A quantidade de fluido que foi embebido na película de colágeno equino foi determinada depois de 1,2 e 3 horas como listado acima.

Um pedaço de material de película de colágeno equino medindo 1 cm2 absorveu uma quantidade de 10 μΐ de fluido de solução salina completamente sem um intumescimento visível da espessura.

Uma quantidade de 20 μΐ de fluido de solução salina foi completamente absorvido pelo pedaço de película de colágeno eqüino de 1 o cm e levou a um leve aumento na espessura do material.

Apenas um aumento mínimo da espessura da película de colágeno eqüino foi observado na série inteira. É estimado que o aumento máximo na espessura é apenas de cerca do dobro do volume inicial, mesmo depois de 3 horas.

Nenhum aumento significante em espessura ou absorção de fluido foi observado depois da primeira hora.

Exemplo 3 - Aumento de Extensão da Película de Colágeno Eqüino Hidratada Sete pedaços secos de película de colágeno eqüino medindo 1,0 cm2 foram hidratados por 1 hora em cloreto de sódio isotônico. A extensão da dimensão média resultante da hidratação dos pedaços secos de película de colágeno eqüino foi de aproximadamente 3,4 por cento.

Tabela 4 Exemplo 4 - Aumento no Peso da Película de Colágeno Eqüino Hidratada.

Sete pedaços secos de película de colágeno eqüino medindo Λ 1,0 cm foram hidratados em cloreto de sódio isotônico por 1 hora. Os pedaços hidratados de película de colágeno eqüino pesaram cerca de cinco vezes mais do que quando em um estado seco.

TabelaS

Exemplo 5 - Resistência à Tração e Elasticidade/Flexibilidade da Película de Colágeno Eqüino A resistência à tração de diversos produtos de dura-máter e da película de colágeno eqüino da presente invenção foi medida. As amostras foram montadas na extremidade inferior de um tubo e a resistência à tração foi aumentada por uma coluna continuamente crescente de água até um máximo de 300 cm. A Fig. 18 fornece uma ilustração da câmara de teste. A câmara de teste foi capaz de determinar a resistência dos produtos substitutos de dura-máter pela identificação do ponto no qual um produto podería falhar devido à pressão que excedesse a resistência à tração do produto. A película de colágeno eqüino (teor de colágeno: 5,6 mg/cm2) da presente invenção e uma película de colágeno (teor de colágeno: 4,0 mg/cm2) foram comparadas ao Duragen (Integra NeuroSciences, Plainsboro, NJ).

Os resultados de teste indicaram que a película de colágeno eqüino (teor de colágeno: 5,6 mg/cm) e a película de colágeno (teor de colágeno: 4,0 mg/cm2) suportaram uma coluna de água de até 300 cm sem falhar. Ver as Figs. 19 e 20.

Em comparação, a pressão exercida no crânio saudável não excede mais do que aproximadamente 15 cm de coluna de água alta; em situações patológicas, a pressão pode surgir até aproximadamente 50 cm.

DuraGen mediu resistência à tração significantemente mais baixa, rompendo sob a pressão de uma coluna de água de 200 cm, Ver a Fig. 21. A câmara de teste também foi capaz de comparar a elasticidade dos produtos pela identificação do grau no qual o produto esticaria sob a pressão. A elasticidade/flexibilidade de um produto foi portanto determinada medindo-se a convexidade do produto sob o peso da coluna de água. A elasticidade/flexibilidade da película de colágeno eqüino η (teor de colágeno: 5,6 mg/cm) e a película de colágeno (teor de colágeno: 4,0 mg/cm2) foram comparadas com DuraGen, uma película de teste de colágeno, Fascia lata Tutoplast (Tutogen Medicai GmbH, Neunkirchen am Brand, Alemanha) e Ethisorb Dura Patch (Ethicon GmbH & Co. KG, Nordrstedt. Alemanha). Ver as Figs. 22 a 25.

Em comparação com os outros produtos, a película de λ colágeno eqüino (teor de colágeno: 5,6 mg/cm) demonstrou uma mistura de resistência à tração significante ligada com elasticidade/flexibilidade. Isto permite que ela suporte a pressão exercida contra ela como um substituto de dura-máter enquanto permanece flexível e elástica, permitindo que ela forme os contornos do cérebro e crânio. Ao contrário, Ethisorb e Tutoplast, demonstraram resistência à tração alta no experimento da coluna de água mas possuíram elasticidade/flexibilidade muito mais baixa.

Exemplo 6 - Propriedades de Impermeabilidade a Líquido As medições das propriedades de impermeabilidade a líquido de dura-máter de produtos de substituição foram determinadas usando o mesmo arranjo experimental como foi debatido no Exemplo 5.

Neste experimento, o desenvolvimento de gotas de água e o volume de água perdida foram medidos em relação à altura da coluna de água.

Os resultados deste experimento são ilustrados nas Figs. 23 a 26.

Neste experimento, a película de colágeno eqüino (teor de colágeno: 5,6 mg/cm) permaneceu impermeável a líquido embora sob mais do que uma coluna de água alta de 300 cm. A película de colágeno (teor de Λ ' colágeno: 4,0 mg/cm ) demonstrou uma perda de gotas de água finas sob uma coluna de água alta de 300 cm, Tendo uma estrutura porosa, DuraGen não foi impermeável à água, mas demonstrou perda de água claramente visível mesmo sob pressões de água baixas. Similarmente, Fascia Lata Tutoplast também não foi impermeável à água, demonstrando uma perda de água sob pressões baixas.

Exemplo 7 - Estabilidade e Resistência ao Rasgo Apenas materiais que são suficientemente estáveis, elásticos e resistentes ao rasgo em ambientes úmidos e secos são adequados como implantes em situações cirúrgicas especiais, Tais como para duras-máter substitutas. A determinação de resistência ao rasgo/força de tração final do material umedecido fornece portanto informação valiosa com respeito à estrutura, estabilidade e probabilidade de permanecer no lugar no local cirúrgico. A resistência ao rasgo de implantes cirúrgicos colaginosos foi testada em espécime hidratado de modo a imitar as condições prevalecentes no corpo. Os materiais foram colocados em solução salina isotônica por cinco minutos.

Para medir a resistência ao rasgo/força de tração final, tiras de implantes de colágeno foram presos em uma Máquina de Teste Polivalente Zwick Modelo 1120 (Zwick GmbH & Co. KG, Ulm, Alemanha). Os implantes de colágeno testados são fornecidos na Tabela 6.

Tabela 6 - Implantes Colaginosos O controle da máquina, a aquisição dos dados e teste, incluindo a avaliação estatística, foram realizados usando o software TestExpert (Zwick GmbH & Co. KG, Ulm, Alemanha). Os espécimes de esponja de teste A, B e C pareceram ser bastante frágeis. Os espécimes A, B e C foram cortados em tiras de 4 cm tendo uma largura de 1,4 cm. Os resultados de teste de todos os espécimes foram calculados proporcionalmente para uma tira de 1,0 cm de largura. Os valores de força de tração final das tiras de teste foram medidas em Newtons/cm de tira. Os resultados de teste são fornecidos na Tabela 7 e Fig. 27.

Tabela 7 - Resistência ao Rasgo/Força de Tração Final Conclusões O método de fabricação único da película de colágeno equino aumenta a sua resistência ao rasgo/força de tração final.

As películas de colágeno demonstraram resistência ao rasgo/força de tração final significantemente maiores comparadas às esponjas colaginosas. A resistência ao rasgo das películas colaginosas aumentaram com o teor de colágeno por centímetro quadrado (por exemplo, Teor de Λ Λ colágeno de 4,0 mg/cra : 3,21 N/cm de tira; Teor de colágeno de 5,6 mg/cm : 4,09 N/cm de tira).

Em vista do acima, será observado que os diversos objetivos da invenção são obtidos.

Como várias mudanças podem ser feitas nas composições e processos acima sem divergir do escopo da invenção, é intencionado que todas as questões contidas na descrição acima sejam interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitante.

Com referência ao uso da(s) palavra(s) “compreendem” ou “compreende” ou “compreendendo” neste relatório descritivo inteiro (incluindo as reivindicações abaixo), os Requerentes mencionam que a menos que o contexto de outro modo requeira, estas palavras são usadas no entendimento base e claro de que elas devem ser interpretadas inclusivamente, ao invés de exclusivamente e que os Requerentes pretendem que cada uma destas palavras sejam assim interpretadas na construção deste relatório descritivo inteiro.

REIVINDICAÇÕES

Claims (19)

1. Uso de uma película de colágeno equino compreendendo uma biomatriz de ocorrência não-natural formada por múltiplas camadas de Πbritas de colágeno equino precipitadas, nas quais o colágeno equino não é reticulado por produtos químicos ou radiação, no qual a película apresenta poucos poros isolados que não se interconectam através das camadas múltiplas de íibrilas de colágeno de forma que a película é impermeável a líquidos, c no qual a película apresenta interstícios entre as múltiplas camadas de Íibrilas de colágeno que permitem a infiltração de células e vasculatura para a reconstrução da dura-mãter, caracterizado pelo fato de ser empregada na fabricação de um. medicamento para reparar e regenerar tecido de dura-mãter em um mamífero.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo falo de que as Íibrilas de colágeno equino são derivadas de tendões.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os tendões são tendões de Aquiles.

4. Uso de acordo com qualquer lima das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüíno é reabsorvível.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o tecido de dura-mãter necessita de reparo e regeneração como um resultado de uma condição congênita, defeito de nascença, doença, lesão ou um procedimento cirúrgico.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o procedimento cirúrgico é um tumor removível.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o tecido de dura-mãter está localizado no crânio.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 6, caracterizado pelo fato de que o tecido de dura-máter está localizado na coluna espinal.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüino, na sua forma seca, tem uma espessura de entre 0,01 mm e 3,0 mm, por exemplo entre 0,02 mm e 2,0 mm, 0,03 mm e 1,5 mm ou 0,05 mm e 1,0 mm.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüino, na sua forma seca, tem uma espessura de 1,0 mm ou menos.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüino, quando completamente hidratada, pesa até 15 vezes, preferivelmente apenas até 10 ou até 5 vezes, o seu peso seco.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüino, quando seca, pesa entre 1 mg/cm2 e 50 mg/cm2, por exemplo entre 2,5 mg/cm2 e 10 mg/cm2.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a área de superfície da película de colágeno eqüino, quando completamente hidratada, está entre -5% e 20% maior, preferivelmente de -5% a 10% ou de -5% a 5% maior, do que quando na sua forma seca, por exemplo até cerca de 4 por cento maior, do que quando na sua forma seca.

14. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espessura da película de colágeno eqüino, quando completamente hidratado, é de cerca de duas vezes ou 3 vezes a espessura da sua forma seca.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o mamífero é selecionado do grupo que consiste de seres humanos, cavalos, ovelha, macacos e animais de laboratório.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüino ainda compreende um excipiente selecionado do grupo que consiste de um conservante, um fator de crescimento, um aditivo que ajuda na flexibilidade e elasticidade da película de colágeno eqüino e combinações desta.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as fibrilas de colágeno eqüino são tratadas com ácidos fortes e bases fortes que inativam ou reduzem os níveis infecciosos de bactérias, vírus e príons.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as fibrilas de colágeno consistem principalmente de colágeno do Tipo I.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a película de colágeno eqüino tem uma força de tração final dentre 0,5 Newton/cm de tira e 30 Newtons/cm de tira, por exemplo entre 1 Newton/cm de tira e 6 Newtons/cm de tira.