BRPI0413499B1 - Methods for generating or increasing the resistance of a plant to a plant ogly pathogen, for the production of a plant or a part of this plant resistant to a plant ogly pathogen, and use of a polynucleotyde - Google Patents

Description

“MÉTODOS PARA GERAR OU AUMENTAR A RESISTÊNCIA DE UMA PLANTA A UM PATÓGENO VEGETAL DO FILO OOMYCETA, PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA OU UMA PARTE DESTA RESISTENTE A UM PATÓGENO VEGETAL DO FILO OOMYCETA, E USO DE UM POLINUCLEOTÍDEO” A presente invenção diz respeito a um novo método para aumentar a resistência de uma planta, em particular de uma Solanaceae, preferivelmente de batata e tomate, aos patógenos de planta do filo Oomyceta que compreende aumentar a atividade do polipeptídeo da presente invenção. A invenção ainda diz respeito a polinucleotídeos e vetores que compreendem estes polinucleotídeos. A invenção além disso diz respeito a vetores, células, plantas transgênicas correspondentes e ao material de propagação transgênico derivado destes, métodos para produzi-los e ao seu uso para a produção de gêneros alimentícios, alimentações de animais, semente, produtos farmacêuticos ou produtos químicos finos. O objetivo do trabalho da biotecnologia vegetal é a geração de plantas com novas propriedades vantajosas, por exemplo para aumentar a produtividade agrícola, aumentar a qualidade no caso de gêneros alimentícios ou para produzir produtos químicos ou produtos farmacêuticos específicos (Dumyell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487 a 496). Os mecanismos de defesa natural da planta contra patógenos são freqüentemente insuficientes. As doenças fúngicas sozinhas resultam em perdas de produção anuais de muitos bilhões de US$. A introdução de genes estranhos de fontes vegetais, animais ou microbianas pode aumentar as defesas. Os exemplos são a proteção de tabaco contra o dano de alimentação pelos insetos pela expressão de endotoxinas de Bacillus thuringiensis sob o controle do promotor 35SCaMV (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33 a 37) ou a proteção de tabaco contra a infecção fungica pela expressão de uma quitinase de feijão sob o controle do promotor CaMV (Broglie et al. (1991) Science 254:1194 a 1197). Entretanto, a maior parte dos métodos descritos apenas oferecem resistência a um único patógeno ou um espectro restrito de patógenos. A despeito da escassez absoluta da batata irlandesa notória do meado do século 19, a ferrugem tardia ainda continua a ser uma das mais devastadoras de todas as doenças nas plantas de saíra. A ferrugem tardia é causada pelo fungo Oomycete Phytophthora infestans, um patógeno especializado, que causa primariamente a doença na folhagem e frutos de uma faixa de espécies Solanaceae, especialmente batata e tomate. O fungo foi primeiro observado no México e por diversas razões acredita-se que o México seja o centro de origem do fungo. Ambos os tipos companheiros Al e A2 estão permanentemente presentes por exemplo na área de Toluca. Também, o P. infestans é relatado na espécie Solanum nativa em áreas remotas do México. Além disso, muitas espécies de tubérculos que carregam Solanum com um alto nível de resistência à ferrugem tardia são encontrados no México. Medidas eficazes para impedir os insucessos de safra ou rendimentos reduzidos implicam na aplicação de fungicidas que impedem ou curam uma infecção pelo P. infestans. Ao invés do uso maciço de pesticidas químicos um método alternativo para controlar a ferrugem tardia pode ser vantajoso: o uso de cultivares, que abrigam resistência parcial ou completa à ferrugem tardia. Para se obter a resistência à ferrugem tardia, criadores focalizaram no passado na introgressão de genes R dominantes de Solanum demissum, uma espécie de batata selvagem nativa do México. Onze de tais genes R foram identificados, diversos dos quais foram mapeados nos locais específicos no mapa genético da batata (revisto em Gebhardt e Valkonen, 2001) e recentemente o gene RI foi clonado. RI e R2 estão localizados nos cromossomas 5 e 4, respectivamente. R3, R6 e R7 estão localizados no cromossoma 11. Genes R desconhecidos que conferem resistência específica de espécie à ferrugem tardia também foram descritos em S. luberosum ssp. andigena e S. berthcmltü e S. pinnatisectum. A resistência induzida por estes genes R foi (quase) completa mas pareceu não ser durável em nenhum caso. Por causa do alto nível de resistência e facilidade de transferência, muitos cultivares contém resistência derivada de S. demissum. Infelizmente, a resistência específica de espécie derivada de S. demissum, embora quase completa, não é durável.

Uma vez que cultivares de batata recém produzidas foram cultivados em escala maior em campos comerciais, novas virulências emergiram no P. infestans, que tomaram o patógeno capaz de superar a resistência introgredida. A resistência de campo mais durável à ferrugem tardia, ffeqüentemente quantitativa por natureza e presumida não ser específica de espécie, pode ser encontrada em diversas espécies de Solanum mexicanas e das américas central e do sul. Entretanto este tipo de resistência é difícil de transferir em cultivares da batata através do cruzamento e seleção fenotípica. S. bulbocastanum diplóide do México e Guatemala é uma das espécies que carregam tubérculo que é a muito conhecida por seus altos níveis de resistência à ferrugem tardia. Infelizmente, a transferência clássica de resistência a partir das espécies de Solanum selvagens para a batata cultivada é freqüentemente impedida devido às diferenças na ploidia e Número de Equilíbrio Endospermático (EBN). A despeito destes problemas, a introgressão do traço de resistência de S, bulbocastanum foi bem sucedida. Recentemente, híbridos somáticos de S, bulbocastanum e S. tuberosum e germoplasma retrocruzado foram descobertos serem altamente resistentes à ferrugem tardia, mesmo sob pressão de doença extrema (Helgeson et al, 1998). A despeito dos relatos de supressão de recombinação, a resistência no material retrocruzado pareceu estar no cromossoma 8 dentro de um intervalo de aproximadamente 6 cM entre os marcadores RFLP CP53 e CT64. Um marcador CAPS derivado da sonda RFLP do tomate CT88 co-segregou com resistência.

Consequentemente, nos anos recentes o desenvolvimento de plantas resistentes aos patógenos do filo Oomyceta avançaram. Entretanto, 40 anos de pesquisa intensa e contínua e esforços de cruzamento com o germoplasma disponível ainda não resultou na introdução acentuada de cultivares resistentes. O número prevalecente de genes identificados nos anos recentes confere meramente a resistência específica de espécie. Além disso, a resistência alcançada não foi durável. Além disso, a aplicação de protetores de safra é amplamente considerada ser uma carga para o meio ambiente. Assim, em vários países ocidentais, a legislação toma-se mais restritiva e parcialmente proibitiva à aplicação de fungicidas específicos, tomando o controle químico da doença mais difícil. Além disso, o controle químico é caro. Finalmente, uma outra restrição é o desenvolvimento de resistência pelo fungo aos fungicidas específicos tais como metalaxil, que foi relatado de muitos países no mundo.

Consequentemente, o problema fundamental da presente invenção é fornecer novos meios e métodos para uma proteção eficiente de plantas contra a ferrugem tardia e doenças relacionadas. A solução do problema técnico é obtida pelo fornecimento das formas de realização caracterizadas nas reivindicações.

Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um método para gerar ou aumentar a resistência de uma planta ao patógeno vegetal do filo Oomyceta que compreende aumentar a atividade da proteína Rpi-blb2 na planta ou em um tecido, órgão ou célula da planta ou um parte desta.

Rpi-blb2 é um tipo LZ-NBS-LRR de gene R e mostra homologia de seqüência ao gene Mi-1 do tomate, que confere resistência a três espécies de nematóides do nó da raiz (Meloidogyne spp.) assim como ao afídio da batata Macrosiphum euphorbiae (Yos et al, 1998; Rossi et ai., 1998; Milligan et al, 1998) e tanto aos biotipos B e Q da mosca branca Bemisia tabaci (Nombela et al., 2003). Como foi descoberto para Rpi-blb, Rpi-blb2 também confere resistência completa a uma faixa de isolados de P. in/estans que carregam fatores de virulência múltiplos e a especificidade de espécie não foi ainda demonstrada. O termo “Rpi-blb2” refere-se a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a atividade da proteína Rpi-blb2 aqui mencionada ou um polipeptídeo tendo a dita atividade da proteína Rpi-blb2. Se no que segue o termo “Rpi-blb2” diz respeito a um polipeptídeo ou a um polinucleotídeo está claro a partir do contexto do seu uso.

Pelo termo “gerar” ou “aumentar” ou “estimular” “a resistência de uma planta” é intencionado que a resistência de uma planta ou uma parte desta seja aumentada ou gerada ou estimulada em comparação a uma referência. “Conferir”, “existir”, “gerar”, "estimular” ou “aumentar” uma resistência a patógeno significa que os mecanismos de defesa de uma espécie ou variedade vegetal específica é crescentemente resistente a um ou mais patógenos devido ao uso do método de acordo com a invenção em comparação com o tipo selvagem da planta, à qual o método de acordo com a invenção não foi aplicado, sob condições de outro modo idênticas (tais como, por exemplo, condições climáticas, condições de cultivo, espécie de patógeno e outros). A resistência aumentada manifesta-se por si mesma preferivelmente em uma manifestação reduzida dos sintomas de doença, sintomas de doença que compreende - além dos efeitos adversos mencionados acima - por exemplo também a eficiência de penetração de um patógeno na planta ou células da planta ou a eficiência de proliferação em ou na mesma. Neste contexto, os sintomas de doença são preferivelmente reduzidos em pelo menos 10 % ou pelo menos 20 %, especial e preferivelmente em pelo menos 40 % ou 60 %, muito especial e preferivelmente em pelo menos 70 % ou 80 % e o mais preferivelmente em pelo menos 90 % ou 95 %.

Pelo termo “aumentado” é por meio deste intencionado que uma atividade de um produto de gene é mais alta do que em uma referência. Assim, o termo “aumentado” inclui que uma atividade, por exemplo, a atividade de produto de gene Rpi-blb2 ou de um outro produto de gene, é gerado de novo, se essa atividade, por exemplo, a atividade de Rpi-blb2 aqui descrita, não foi encontrada na referência. O termo “aumentado” também diz respeito à estimulação da atividade de um produto de gene. Uma expressão aumentada de um gene, isto é, a sua ativação pode ser estimulada de diversos modos, por exemplo, pela aplicação de produtos químicos ou pelo estresse biótico a um organismo. Por exemplo, uma resistência ao gene que medeia parasitas infecciosos pode ser ativada pela infecção com um parasita, por exemplo, com P. infestans e confere uma resistência aumentada ao mesmo e/ou a outros patógenos.

Assim, no que segue, o termo “aumentar” também compreende os termos “estimular” e “gerar”. “Resistência a patógeno” denota a redução ou enfraquecimento de sintomas de doença de uma planta a seguir da infecção por um patógeno.

Os sintomas podem ser múltiplos, mas preferivelmente abrangem aqueles que direta ou indiretamente têm um efeito adverso na qualidade da planta, na quantidade da produção, na adequabilidade para o uso como alimentação de animais ou gêneros alimentícios ou ainda que tomam a semeadura, plantio, colheita ou processamento da safra difícil. “Patógeno” dentro do escopo da invenção significa por via de exemplo mas não por limitação vírus ou virióides, bactérias, fungos, pragas de animais tais como, por exemplo, insetos ou nematóides. O termo “proteína Rpi-blb2” diz respeito a uma proteína ou polipeptídeo cuja expressão em uma planta ou uma parte confere resistência da planta ou uma parte da planta a um dos patógenos aqui descritos em comparação com uma cepa não resistente. A planta ou um tecido, órgão ou célula da planta ou uma parte destes que compreendem atividade aumentada da proteína Rpi-blb2 é menos suscetível a uma infecção por um patógeno, em particular ao patógeno do filo Oomyceta, preferivelmente ao ?, infestans, do que uma planta ou uma parte desta que tem o fundo genético idêntico mas não os elementos genéticos necessários para permitir uma expressão de Rpi-blb2 (aqui denominada como “tipo selvagem” ou “referência”). Os ensaios para o teste da resistência de uma planta ou de uma parte desta são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. A resistência ao P. infestans pode ser definida como índice de esporulação de acordo com Flier, 2001. Flier descreve o índice de esporulação como um nível de esporulação por 1 cm2. Assim, uma redução de esporulação por 1 cm2 de 20 % comparada com um tipo selvagem é aqui definida como resistência. Nos exemplos que ilustram a presente invenção, o índice de esporulação foi definido como o nível de esporulação por lesão, assim, pelo termo “resistência” pode ser altemativamente intencionada uma redução de esporulação por lesão de 20 % comparada comum tipo selvagem. A última definição é preferida.

Era formas de realização preferidas a esporulação em um ensaio é reduzida em 30 %, mais preferida é uma redução de 50 %, ainda mais preferido é 70 %, ainda mais preferido é mais do que 80 %, mais preferidos são 85 % e 90 %. O mais preferido é uma redução de 95 % ou mais.

Consequentemente, na presente invenção por “atividade” de uma proteína Rpi-blb2 é intencionado, que a expressão da proteína confira a dita redução no índice de esporulação. Além disso, foi observado, que uma resposta típica para plantas contendo Rpi-blb2 a uma infecção por P. infestans é a presença de pequenas lesões, sem qualquer esporulação evidente, no final da estação de cultivo. Assim, em uma forma de realização, a atividade de Rpi-blb2 é definida como a presença de pequenas lesões sem qualquer esporulação evidente nos experimentos como descrito. A resistência a Rpi-blb2 mostra regiões necróticas que contém um baixo nível de esporulação. Um experimento realizado com folhas destacadas exemplifica a atividade de Rpi-bib2. O experimento é descrito no exemplo 17 e figura 18. A diferença entre Rpi-blb2 e outros genes de resistência de P. infestans é que Rpi-blb2 permite um baixo nível de esporulação (Figura 18). Um ensaio de folha destacada em que as lesões presentes no genótipo Rpi-blb2 (ARD 92-1197-16) mostra um baixo nível de esporângios em relação à ausência completa, de esporângios em um genótipo contendo o gene R2 de S. demissum, O índice de espomlação é de apenas 1,1 % de um fenótipo suscetível (cv. Bintje) (Tabela 7 e Figura 18).

Experimentos de campo também mostraram que Rpi-blb2 permite um baixo nível de infecção. Os sintomas da ferrugem tardia desenvolveram em um nível baixo durante a estação de cultivo (Figura 3, ARF87- 801) ou no final da estação de cultivo (Figura 2, ARF87-601; Figura 3, ARF87-507 e ARF87-601).

Assim, em uma forma de realização, a atividade de Rpi-blb2 é ainda definida como resultando depois da expressão em uma planta em regiões necróticas que contém um baixo nível de esporulação em experimentos como descrito.

Assim, em uma forma de realização, o método da presente invenção produz plantas que mostram regiões necróticas que contém um baixo nível de esporulação ou menos. O termo “referência” diz respeito a um organismo ou uma parte deste, por exemplo, uma célula, que é essencialmente tão idêntico quanto possível no genoma, proteoma e/ou metaboloma ao organismo relevante ou parte deste, por exemplo, uma célula, por exemplo à planta da presente invenção.

Assim, o termo “referência” diz respeito por exemplo a um organismo ou uma parte deste, por exemplo, uma célula, que é de modo essencial genética, proteômica e/ou metabolicamente idêntico ao organismo da presente invenção ou uma parte deste mas uma atividade de um produto de gene específico, por exemplo, Rpi-blb2, não pode ser observado visto que existe uma diferença relevante no genoma, proteoma ou metaboloma da referência. Assim, a referência pode ser uma planta ou uma parte desta que não expressa ou expressa muito pouco de um produto de gene ativo relevante, por exemplo, não codifica um Rpi-blb2 ou não transcreve um gene que codifica Rpi-blb2 ou não traduz um mRNA de Rpi-blb2 ativo. Assim, a referência não fornece a modificação que cria um produto de gene ativo em uma quantidade suficiente para resultar em um fenótipo como descrito. Se duas plantas são de modo essencial geneticamente idênticas podem ser testadas com ensaios conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, por intermédio da análise de impressão digital, por exemplo, como descrito em Roldan-Ruiz, Theor. Appl. Genet, 2001,1138 a 1150. O padrão de expressão de proteínas pode ser testado como descrito na técnica por exemplo, por intermédio da eletroforese em gel (1D, 2D, 3D), análise espectrométrica de massa e outros métodos como descrito por exemplo em www.waters.com,www.proteine.org.au,www.proteomesci.com, www.sdu.dk/Nat/CPA. 0 metaboloma pode ser analisado pela pessoa habilitada como descrito na técnica, por exemplo, por intermédio da HPLC, GC, OPLC, LC-MS, GC-MS, LC-MS-MS, e outros métodos como descritos por exemplo, m www.metabolic-explorer.com, www.ki.se/icsb2002/pdf/ICSB209.pdf,www.genomics.mg.nl/technologies. htm, Fiehn et al., Nature Biotech, 18 (2000), 1157, Raamsdonk et al., Nature Biotech, 19 (2991), 45 a 50, Buchholz, Anal. Biochem, 295 (2001) 129 a 137, Soga et al, Anal Chem. 74 (2002) 2233 a 2239.

De modo a aumentar a resistência a um patógeno o organismo de referência ou a parte deste é suscetível à infecção com o patógeno, por exemplo, um patógeno vegetal, por exemplo, P. infestans.

Preferivelmente, a referência é um clone daquele organismo em que por exemplo um polinucleotídeo relevante, por exemplo, o polinucleotídeo da invenção ou um ativador, por exemplo, um ativador de um produto de gene relevante que medeia a atividade, por exemplo, um ativador que aumenta a expressão de um polinucleotídeo relevante ou um derivado do dito polinucleotídeo ou um ativador de um polipeptídeo relevante, por exemplo, do polipeptídeo da presente invenção e/ou um que corresponda ao vetor que codifique o produto de gene relevante que foi introduzido. Por exemplo, uma referência preferida no método da presente invenção é um organismo ou uma parte deste, que é um clone do organismo ou parte deste, por exemplo, uma célula que tenha sido transfectada ou transformada com o polinucleotídeo ou vetor da invenção.

Se o clone como descrito não pode ser identificado é o estado da técnica clivar, silenciar ou desligar aqueles elementos que essencialmente medeia a atividade relevante, por exemplo, que medeiam uma atividade Rpi-blb2 aumentada, por exemplo, que medeiam uma expressão aumentada, no organismo, por exemplo, na planta. É bem conhecido pela pessoa habilitada, como reduzir ou inibir a atividade de um produto de gene relevante, por exemplo, pela redução ou inibição da expressão por exemplo, de Rpi-blb2. Um tal clone pode ser então comparado com um organismo produzido de acordo com o método da presente invenção, por exemplo, um genótipo resistente a P. infestans, que expressa Rpi-blb2. O termo “planta” como aqui usado refere-se a todos os gêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do Reino Vegetal. O termo inclui as plantas maduras, sementes, brotos e mudas e suas partes derivadas, material de propagação, órgãos vegetais, tecido, protoplastos, calo e outras culturas, por exemplo culturas de célula, e qualquer outro tipo de agrupamento de célula vegetal para dar unidades funcionais ou estruturais. “Planta Madura” refere-se a uma planta em qualquer estágio de desenvolvimento desejado além daquele que da muda. Muda refere-se a uma planta imatura jovem em um estágio de desenvolvimento inicial. “Planta” abrange todas as plantas monocotilédones e dicotilédones anuais e perenes. Preferido dentro do escopo da invenção são aquelas plantas que são utilizadas como gêneros alimentícios ou alimentações de animais, por exemplo gêneros monocotilédones ou dicotilédones, em particular espécies, como aquelas descritas acima, por exemplo, espécies de cereal ou membros da família Solanaceae, respectivamente, o mais preferivelmente batata e tomate.

Como conhecido por uma pessoa habilitada na técnica, o método da presente invenção compreende ainda selecionar aquelas plantas em que, como oposto ou como comparado com a planta de referência, a resistência a pelo menos um dito patógeno existe ou é aumentada. “Seleção” com respeito às plantas em que - como oposto ou como comparado com a planta de referência - a resistência a pelo menos um patógeno existe ou é aumentada significa todos aqueles métodos que são adequados para reconhecer uma resistência existente ou aumentada a patógenos. Estes podem ser sintomas de infecção por patógeno mas também podem compreender os sintomas aqui descritos que dizem respeito à qualidade da planta, à quantidade da produção, à adequabilidade para o uso como alimentações de animais ou gêneros alimentícios e outros.

Consequentemente, em uma forma de realização do método da presente invenção a proteína Rpi-blb2 é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma molécula de ácido nucléico selecionado do grupo que consiste de: a) moléculas de ácido nucléico que codificam pelo menos a forma madura do polipeptídeo representado na SEQID NO: 2 ou 4; b) moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência codificadora como representado na SEQ ID NO: 1 ou 3 ou 5 ou 6 que codificam pelo menos a forma madura do polipeptídeo; c) moléculas de ácido nucléico, a seqüência de nucleotídeo das quais é degenerada como um resultado do código genético a uma seqüência de nucleotídeo de (a) ou (b); d) moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo derivado do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de (a) a (c) por intermédio de substituição, deleção e/ou adição de um ou de vários aminoácidos da seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por ura polinucleotídeo de (a) a (c); e) moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo, a seqüência das quais tem uma identidade de 70 % ou mais com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de (a) ou (b); f) moléculas de ácido nucléico que compreendem um fragmento ou uma porção que carrega epítopo de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (e); g) moléculas de ácido nucléico que compreendem um polinucleotídeo tendo uma seqüência de uma molécula de ácido nucléico amplificado de uma biblioteca de ácido nucléico usando os iniciadores como listado na Tab 3b, em particular ARF1F e ARF1R; h) moléculas de ácido nucléico que codificam um fragmento que começa com aminoácido: 1, 30, 50, 100, 200, 300, 500 ou 1000 e acabando com o aminoácido 1276, 1000, 500, 300, 200, 50, 30 ou 1 de um polipeptídeo codificado por qualquer um de (a) a (g); i) moléculas de ácido nucléico que compreendem pelo menos 20 nucleotídeos de um polinucleotídeo de qualquer um de (a) ou (d); j) moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo que são reconhecidas por um anticorpo monoclonal que tem sido incitado contra um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (h); k) moléculas de ácido nucléico obtenível pela triagem de uma biblioteca apropriada sob condições severas com uma sonda tendo as seqüência da molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (j) ou de um fragmento deste de pelo menos 15, preferível 30, 60, 100 ou mais nucleotídeos; e l) moléculas de ácido nucléico o filamento complementar das quais hibridiza sob condições severas com uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) ou (k); ou o filamento complementar de qualquer um de (a) a (1); ou que expressa um polipeptídeo codificado por um segmento ou grupo de ligação 6 de Solanum bulbocastanum que co-segrega com um marcador selecionado da tabela 3A e que medeia a resistência a patógenos, em particular aos patógenos selecionados do grupo que consiste do filo Oomyceta;

Em uma forma de realização, o polinucleotídeo do método da invenção não consiste da seqüência representada na Seq. ID NO.: 7 e/ou 9 e/ou não consiste da seqüência de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína representada na Seq. ID NO.: 8 e/ou 10.

Em uma forma de realização, o polinucleotídeo do método da invenção não consiste da seqüência de uma molécula de ácido nucléico de Mil.l ou Mil.2 e/ou de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína Mi 1.1 ou Mi 1.2.

Assim, em uma forma de realização, o polinucleotídeo do método da presente invenção pode não consistir das seqüências mostradas na Rossi et al 1998, PNAS USA 95: 9750 a 9754, Milligan et al, 1998. Plant Cell 10:1307 a 1319; e/ou WO 9806750. Uma comparação das seqüências de Rpi-blb2, Mil.l e Mil.2 é mostrada nas Figuras 15 a 17. O termo “grupo de ligação” como aqui usado diz respeito a dois ou mais traços e/ou locais e/ou genes e/ou marcadores que tendem a ser herdados juntos como uma conseqüência de uma associação entre os ditos traços e/ou locais e/ou genes e/ou marcadores. Quanto mais juntos os traços e/ou locais e/ou genes e/ou marcadores estiverem, mais baixa a probabilidade de que eles serão separados durante os processos de reparo ou replicação de DNA tal como mitose ou meiose em eucariotas e por este motivo maior a probabilidade de que eles serão herdados juntos. Existem tantos gmpos de ligação quanto existem pares homólogos de cromossomas. O termo “grupo de ligação 6” diz respeito a um grupo de ligação de batata ou tomate que é fundido ao cromossoma 6, tal fusão estabelecida pela identificação de marcadores de posição cromossômica conhecida com base no trabalho publicado por Bematzky e Tanksley (1986) e Tanksley et al., (1992). Gmpos de ligação carregam os mesmos números como seus respectivos cromossomas. No tomate, os cromossomas são numerados de acordo com seus comprimento medidos no paquiteno. Tais números foram aplicados por Barton (1950); o cromossoma 1 é o mais longo, o cromossoma 12, o mais curto. Além do comprimento, tais características como posições de centrômero e quantidade e distribuição de heterocromatina servem para identificar cada cromossoma. Os braços curtos são simbolizados por “S”, os longos por “L”; assim “IS” designa o braço curto do cromossoma 1; como por exemplo, em Barton, D. W. (1950) American Journal of Botany. 37, 639 a 643, Bematzky, R. e Tanksley, S. D. (1986) Genetics 112, 887 a 898, Tanksley, S. D., et ai, (1992) Genetics 132,1141 a 1160. O termo “co-segregação” como aqui usado diz respeito à tendência para dois ou mais traços e/ou locais e/ou genes e/ou marcadores intimamente ligados para serem herdados juntos.

Por exemplo, a região mais concreta do cromossoma 6 que co-segrega com Rpi-bib2 é o braço curto que, no tomate, carrega o marcador morfológico Mi.

Consequentemente, em uma forma de realização a presente invenção diz respeito ao método da presente invenção, em que a proteína Rpi-blb2 é codificada pelo polinucleotídeo da presente invenção, por exemplo, codificado por um polinucleotídeo mostrado nas Seq. ID. 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou um fragmento destes.

Com base em uma procura BLASTX os genes com a homologia mais alta identificada para as sequências Rpi-blb2 identificadas foram os genes e proteínas Mi 1.1 e Mi 1.2; ver as figuras 15 a 17. Ambos os genes têm uma alta identidade com a seqüência representada na Seq. ID NO.: 1 ou 3 ou 5 ou 6 mas não conferem resistência ao patógeno vegetal do filo Oomyceta. Portanto a atividade de Mil.l e Mil.2 é uma outra atividade como a atividade do polipeptídeo da presente invenção. A seqüência da ORF de Mil.l e Mil.2 e proteínas codificadas é aqui mostrada nas Seq. ID NO.: 7 a 10. Além disso, o pedido EP 401764.4 diz respeito aos genes Mi. A seqüência dos genes Mil.l e Mi 1.2 da técnica anterior é excluída do polinucleotídeo da presente invenção, em particular as Seq. ID NOs.: 7 e 9 são excluídas. Também podem ser incluídas as seqüências de polinucleotídeo que codificam o polipeptídeo das Seq. ID NOs.: 8 ou 10, Assim, em uma forma de realização também as seqüências que codificam as proteínas Mi 1.1 e Mi 1.2 são excluídas. As proteínas com uma homologia mais baixa ao polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção são as proteínas de resistência Hero 1 e 2 (Acessos ao GenbankN-; gi26190252 e gi26190254), proteínas de resistência a Tospovírus A, B, C, D e E [Acessos ao GenBank N-: gil5418709, gil5418710, gil5418712, gil5418713, gil5418714]; RI [Acesso ao GenBank N°: gil7432423] e Prf [Acesso ao GenBank N°: gi8547237] cujas seqüências ou seqüências codificadas também são excluídas das seqüências da presente invenção.

Os termos “gene(s)”, “polinucleotídeo”, “seqüência de ácido nucléico”, “seqüência de nucleotídeo” ou “molécula(s) de ácido nucléico” como aqui usados referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula.

Assim, este termo inclui DNA de filamento duplo e único e RNA. Este também inclui tipos conhecidos de modificações, por exemplo, metilação, substituição de “capuzes” de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo. Preferivelmente, a seqüência de DNA da invenção compreende uma seqüência codificadora que codifica o polipeptídeo aqui definido.

Uma “seqüência codificadora” é uma seqüência de nucleotídeo que é transcrita em mRNA e/ou traduzida em um polipeptídeo quando colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Os limites da seqüência codificadora são determinados por um códon de início de tradução no término 5’ e um códon de parada de tradução no término 3!. Uma seqüência codificadora pode incluir, mas não é limitada a mRNA, cDNA, seqüências de nucleotídeo recombinantes ou DNA genômico, embora introns também possam estar presentes sob certas circunstâncias.

Por “hibridização” é intencionado que tais moléculas de ácido nucléico hibridizem sob condições de hibridização convencionais, preferivelmente sob condições severas tais como descritas, por exemplo, por Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Um exemplo de uma tal condição de hibridização severa é a hibridização a 4 X SSC a 65° C, seguido por uma lavagem m 0,1 X SSC a 65° C por uma hora. Altemativamente, uma condição de hibridização severa exemplar está em 50 % de formamida, 4 X SSC a 42° C. Além disso, as condições durante a etapa de lavagem podem ser selecionadas da faixa de condições delimitadas pelas condições de baixa severidade (aproximadamente 2X SSC a 50° C) e condições de alta severidade (aproximadamente 0,2X SSC a 50° C, preferivelmente a 65° C) (20X SSC: 0,3 M de citrato de sódio, 3 M de NaCl, pH 7,0). Além disso, a temperatura durante a etapa de lavagem pode ser elevada a partir das condições de baixa severidade na temperatura ambiente, aproximadamente 22° C, até condições de severidade mais altas em aproximadamente 65° C. Tanto os parâmetros de concentração de sal quanto de temperatura podem ser variados simultaneamente ou ainda um dos dois parâmetros podem ser mantidos constante enquanto apenas o outro é variado. Desnaturantes, por exemplo formamida ou SDS, também podem ser utilizados durante a hibridização. Na presença de 50 % de formamida, a hibridização é preferivelmente efetuada a 42° C. Alguns outros exemplos de condições para a hibridização e etapas de lavagem são mostradas aqui abaixo: (1) as condições de hibridização podem ser selecionadas, por exemplo, das seguintes condições: a) 4X SSC a 65° C, b) 6X SSC a 45° C, c) 6X SSC, 100 mg/ml de DNA de esperma de peixe fragmentado desnaturado a 68° C, d) 6X SSC, 0,5 % de SDS, 100 mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado a 68° C, e) 6X SSC, 0,5 % de SDS, 100 mg/ml DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 50 % de formamida a 42° C, f) 50 % de formamida, 4X SSC a 42° C, g) 50 % (vol/vol) de formamida, 0,1 % de albumina sérica bovina, 0,1 % de Ficoll, 0,1 % de polivinilpirrolidona, 50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,5,750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sódio a 42° C, h) 2X ou 4X SSC a 50° C (condição de severidade baixa), ou i) 30 a 40 % de formamida, 2X ou 4X SSC a 42° C (condição de severidade baixa).(2) As etapas de lavagem podem ser selecionadas, por exemplo, das seguintes condições: a) 0,015 M de NaCl/0,0015 M de citrato de sódio/0,1 % de SDS a 50° C. b) 0,1X SSC a 65° C. c) 0,lXSSC, 0,5 % de SDS a 68° C. d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % de formamida a 42° C. e) 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 42° C. f) 2X SSC a 65° C (condição de severidade baixa).

Em uma forma de realização da presente invenção, o polinucleotídeo da invenção compreende um polinucleotídeo que hibridiza a uma molécula de ácido nucléico que compreende ou consiste de uma molécula de ácido nucléico tendo a seqüência mostrada nas Seq ID Nos. 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou um fragmento deste. O fragmento compreende ou consiste preferivelmente de 15, 20, 30, 40, 70, 100, 300, 500, 700, 1000 ou mais resíduos das Seq ID Nos. 1 ou 3 ou 5 ou 6.

Em uma forma de realização preferida, o polinucleotídeo da invenção compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização “severas” com uma molécula de ácido nucléico que compreende ou que consiste de uma molécula de ácido nucléico tendo a seqüência mostrada nas Seq ID Nos. 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou um fragmento destas. O termo “sob condições de hibridização severas” como aqui usado refere-se a qualquer uma das condições de hibridização severas aqui mencionadas. Em uma outra forma de realização, o termo “sob condições de hibridização severas” refere-se às condições de hibridização mencionadas nos exemplos ou usadas em Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Em uma forma de realização preferida, o termo “sob condições de hibridização severas” como aqui usado refere-se a todas as condições de hibridização severas aqui mencionadas, significando que um polinucleotídeo hibridiza sob todas as condições severas mencionadas.

Rpi-blb2 derivado de outros organismos, pode ser codificada pelas outras seqüências de DNA que hibridizam com as seqüências mostradas nas Seq ID Nos. 1 ou 3 ou 5 ou 6 sob condições de hibridização relaxadas e que codificam na expressão peptídeos tendo a atividade de Rpi-blb2. Além disso, algumas aplicações devem ser realizadas em condições de hibridização de baixa severidade, sem nenhuma conseqüência para a especificidade da hibridização. Por exemplo, uma análise de Southern blot de DNA total pode ser sondada com um polinucleotídeo da presente invenção e lavada com baixa severidade (55° C em 2x SSPE, 0,1 % de SDS). A análise de hibridização pode revelar um padrão simples de genes únicos que codificam Rpi-blb2. Um outro exemplo de tais condições de hibridização severa baixas são 4X SSC a 50° C ou hibridização com 30 a 40 % de formamida a 42° C. Tais moléculas compreendem aquelas que são fragmentos, análogos ou derivados de Rpi-blb2 da invenção e diferem, por exemplo, por intermédio da deleção(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões) e/ou recombinação(ões) de aminoácido e/ou nucleotídeo ou qualquer outra(s) modificação(ões) conhecida(s) na técnica sozinho ou em combinação a partir das seqüências de aminoácido descritos acima ou sua(s) seqüência(s) de nucleotídeo subjacente(s). Entretanto, é preferido usar condições de severidade de hibridização altas. O termo “homologia” significa que as respectivas moléculas de ácido nucléico ou proteínas codificadas são funcional e/ou estruturalmente equivalentes. As moléculas de ácido nucléico que são homólogas às moléculas de ácido nucléico descritas acima e que são derivadas das ditas moléculas de ácido nucléico são, por exemplo, variações das ditas moléculas de ácido nucléico que representam modificações tendo a mesma função biológica, em particular que codifica proteínas com a mesma ou substancialmente a mesma função biológica. Elas pode ser variações que ocorrem naturalmente, tais como seqüências de outras variedades ou espécies ou mutações de plantas. Estas mutações podem ocorrer naturalmente ou podem ser obtidas pelas técnicas de mutagênese. As variações alélicas podem ser variantes alélicas que ocorrem naturalmente assim como variantes sinteticamente produzidas ou geneticamente engenheiradas. As estruturalmente equivalentes, por exemplo, podem ser identificadas testando-se a ligação do dito polipeptídeo aos anticorpos. As estruturalmente equivalentes têm as características imunológicas similares, por exemplo, compreendem epítopos similares.

Os termos “fragmento”, “fragmento de uma sequência” ou “parte de uma seqüência” significa uma seqüência truncada da seqüência original aludida. A seqüência truncada (seqüência de ácido nucléico ou proteína) pode variar amplamente no comprimento; o tamanho mínimo sendo uma seqüência de tamanho suficiente para fornecer uma seqüência com pelo menos uma função e/ou atividade comparável da seqüência original aludida, enquanto que o tamanho máximo não é crítico. Em algumas aplicações, o tamanho máximo usualmente não é substancialmente maior do que a requerida para fornecer a(s) atividade(s) e/ou função(ões) desejada(s) da seqüência original.

Tipicamente, a seqüência de aminoácido truncada variará de cerca de 5 a cerca de 1260 aminoácidos no comprimento. Mais tipicamente, entretanto, a seqüência será de um máximo de cerca de 1000 aminoácidos no comprimento, preferivelmente um máximo de cerca de 500 ou 100 aminoácidos. É usualmente desejável selecionar seqüências de pelo menos de cerca de 10, 12 ou 15 aminoácidos, até um máximo de cerca de 20 ou 25 aminoácidos. O termo “epítopo” diz respeito a sítios imunorreativos específicos dentro de um antígeno, também conhecido como determinantes antigênicos. Estes epítopos podem ser uma série linear de monômeros em uma composição polimérica - tais como os aminoácidos em uma proteína - ou consiste ou compreende de uma estrutura secundária ou terciária mais complexa. Aqueles de habilidade reconhecerá que todos os imunógenos (isto é, as substâncias capazes de evocar uma resposta imune) são antígenos; entretanto, alguns antígeno, tais como haptenos, não são imunógenos mas podem ser feitos imunogênicos pela ligação a uma molécula carregadora. O termo “antígeno” inclui referências a uma substância da qual um anticorpo pode ser gerado e/ou da qual o anticorpo é especificamente imunorreativa. Em uma forma de realização a presente invenção diz respeito a um epítopo de Rpi-blb2. O termo “um ou vários aminoácidos” diz respeito a pelo menos um aminoácido mas não mais do que aquele número de aminoácidos que resultaria em uma homologia abaixo de 70 % de identidade. Preferivelmente, a identidade é maior do que 75 % ou 80 %, mais preferido é de 85 %, 90 % ou 95 %, ainda mais preferido é 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade.

Os termos “polinucleotídeo” e “molécula de ácido nucléico” também diz respeito a polinucleotídeos ou moléculas de ácidos nucléicos “isolados”, Uma molécula de ácido nucléico “isolada” é uma que é separada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presente na fonte natural do ácido nucléico. Preferivelmente, um ácido nucléico “isolado” é livre de seqüências que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (isto é, seqüências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucléico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucléico é derivado, Por exemplo, em várias formas de realização, o polinucleotídeo da presente invenção pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb ou menos de seqüências de nucleotídeo que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucléico é derivada, Além disso, os polinucleotídeos da presente invenção, em particular uma molécula de ácido nucléico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida pelas técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando qmmicamente sintetizado.

Além disso, o polinucleotídeo da invenção compreende uma molécula de ácido nucléico que é um complemento de uma das seqüências de nucleotídeo dos polinucleotídeos acima mencionados ou uma porção destes. Uma molécula de ácido nucléico que é complementar a uma das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 é uma que é suficientemente complementar a uma das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 tal que podem hibridizar a um das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID No: 1 ou 3 ou 5 ou 6, formando deste modo um dúplex estável. O polinucleotídeo da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos de cerca de 70 %, preferivelmente pelo menos de cerca de 75 %, mais preferivelmente pelo menos de cerca de S0 %, 90 % ou 95 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos de cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais homólogas a uma seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou uma porção destas. O polinucleotídeo da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente hibridiza sob condições severas como aqui definido, a uma das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou uma porção destas.

Além disso, o polinucleotídeo da invenção pode compreender apenas uma porção da região codificadora de uma das seqüências nas SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6, por exemplo um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção biologicamente ativa do gene que codifica a proteína Rpi-blb2. As seqüências de nucleotídeo determinadas a partir da clonagem do gene que codifica a proteína Rpi-blb2 presente permite a geração de sondas e iniciadores planejados para o uso na identificação e/ou clonagem de seus homólogos em outros tipos de célula e organismos. A sonda/iniciador tipicamente compreende oligonucleotídeos substancialmente purificados. O oligonucleotídeo tipicamente compreende uma região de seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições severas a pelo menos de cerca de 12, 15 preferivelmente cerca de 20 ou 25, mais preferivelmente cerca de 40, 50 ou 75 nucleotídeos consecutivos de um filamento de sentido de uma das seqüências apresentadas, por exemplo, nas SEQ ID Nos.: 1 ou 3 ou 5 ou 6, uma seqüência de anti-sentido de uma das seqüências, por exemplo, apresentadas nas SEQ ID Nos.: 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou mutantes destas que ocorrem naturalmente. Iniciadores com base em um nucleotídeo da invenção pode ser usado em reações da PCR para clonar homólogos de Rpi-blb2, por exemplo, como os iniciadores descritos nos exemplos da presente invenção, por exemplo, como mostrado nas tab 3a ou 3b, preferivelmente os iniciadores ARP1F e ARF1R são usados. Uma PCR com os iniciadores univ24R e univl4L resultará em um fragmento de Rpi-blb2 que pode ser usado como aqui descrito. Os ditos conjuntos de iniciador são intercambiáveis. A pessoa habilitada na técnica sabe combinar os ditos iniciadores para resultar no produto desejado, por exemplo, em um clone de comprimento completo ou uma seqüência parcial. As sondas com base nas seqüências de nucleotídeo de Rpi-blb2 podem ser usadas para detectar transcritos ou seqüências genômicas que codificam a mesma ou proteínas homólogas. A sonda pode compreender ainda um grupo de rótulo ligado a ela, por exemplo, o grupo de rótulo pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator de enzima. Tais sondas podem ser usadas como uma parte de um kit de teste de marcador genômico para identificar células que expressam um Rpi-blb2, tal como pela medição de um nível de uma molécula de ácido nucléico que codifica Rpi-blb2 em uma amostra de células, por exemplo, detectando os níveis do mRNA de Rpi-blb2 ou determinando se um gene Rpi-blb2 genômico foi mutado ou deletado. O polinucleotídeo da invenção codifica um polipeptídeo ou porção deste que inclui uma seqüência de aminoácido que é suficientemente homóloga à seqüência de aminoácido das SEQ ID Nos: 2 ou 4 tal que a proteína ou porção desta mantenha a capacidade para participar na resistência aos patógenos, em particular uma atividade de proteína Rpi-blb2 como descrita nos exemplos em plantas. Como aqui usado, a linguagem “suficientemente homólogas” refere-se às proteínas ou porções destas que têm seqüências de aminoácido que incluem um número mínimo de resíduos de aminoácido idênticos ou equivalentes (por exemplo, um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar como um resíduo de aminoácido em uma das seqüências do polipeptídeo da presente invenção), a uma seqüência de aminoácido das Seq. ID Nos.: 2 ou 4 tal que a proteína ou porção desta sejam capazes de participar na resistência de plantas aos ditos patógenos. Os exemplos de uma atividade de proteína Rpi-blb2 são aqui descritos. Assim, a função de uma proteína Rpi-blb2 contribui direta ou indiretamente para a resistência aos patógenos de planta, preferivelmente aos patógenos aqui mencionados, mais preferido ao P. infestans. A proteína é pelo menos de cerca de 70 %, preferivelmente pelo menos de cerca de 75 %, e mais preferivelmente pelo menos de cerca de 80 %, 90 %, 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos de cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais homólogas a uma seqüência de aminoácido inteira das SEQID Nos: 2 ou 4, As porções de proteínas codificadas pelo polinucleotídeo da invenção são de modo preferível biologicamente ativas.

Como aqui mencionado, o termo “porção biologicamente ativa” é intencionada a incluir uma porção, por exemplo, um domínio/motivo, que confira resistência a um patógeno vegetal de Oomiceto d ou Bemisia tabaci e/ou afídios ou tenha uma atividade imunológica tal que ela se ligue a uma ligação de anticorpo especificamente à proteína Rpi-blb2 ou tenha uma atividade como apresentada nos Exemplos ou como aqui descrita.

Os fragmentos de ácido nucléico adicionais que codificam porções biologicamente ativas do polipeptídeo da presente invenção podem ser preparadas pela isolação de uma porção de uma das seqüências na SEQ ID No: 1 ou 3 ou 5 ou 6, que expressa a porção codificada da proteína ou peptídeos Rpi-blb2 (por exemplo, pela expressão recombinante in viíro) e avaliar a atividade da porção codificada da proteína. A invenção ainda abrange polinucleotídeos que diferem de uma das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 (e porções destas) devido à degenerescência do código genético e assim codificam um polipeptídeo de Rpi-blb2 como aquele codificado pelas seqüências mostradas nas SEQ ID Nos: 2 ou 4. Além disso, o polinucleotídeo da invenção tem uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID Nos: 2 ou 4. Ainda em uma outra forma de realização, o polinucleotídeo da invenção codifica uma proteína de tamanho natural que é substancialmente homóloga a uma seqüência de aminoácido das SEQID Nos: 2 ou 4.

Além disso, será avaliado por aqueles habilitados na técnica que os polimorfismos da seqüência de DNA que levam às mudanças nas seqüências de aminoácido podem existir, dentro de uma população (por exemplo, a população de S, bulbocastanum). Tal polimorfismo genético no gene Rpi-blb2 pode existir entre indivíduos dentro de uma população devido à variação natural.

Como aqui usado, os termos “gene” e “gene recombinante” referem-se às moléculas de ácido nucléico que compreendem uma matriz de leitura aberta que codifica um Rpi-blb2, preferivelmente um Rpi-blb2 de S. bulbocastanum. Tais variações naturais podem tipicamente resultar em 1 a 5 % de variação na seqüência de nucleotídeo do gene Rpi-blb2. Qualquer e todas de tais variações de nucleotídeo e polimorfismos de aminoácido resultantes em Rpi-blb2 que sejam o resultado de variação natural e que não alterem a atividade funcional de Rpi-blb2 são intencionados a estarem dentro do escopo da invenção.

Os polinucleotídeos que correspondem às variantes naturais e homólogos que não de S. bulbocastanum do cDNA de Rpi-blb2 da invenção podem ser isolados com base na sua homologia aos polinucleotídeos da Rpi-blb2 de S. bulbocastanum aqui divulgados usando o polinucleotídeo da invenção ou uma porção deste, como uma sonda de híbridízação de acordo com as técnicas de hibridização padrão sob condições de hibridização severas. Consequentemente, em uma outra forma de realização, um polinucleotídeo da invenção tem pelo menos 20 nucieotídeos no comprimento. Preferivelmente ele hibridiza sob condições severas à molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo da presente invenção, por exemplo, as SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6. Em outras formas de realização, o ácido nucléico tem pelo menos 20,30, 50,100,250 ou mais nucleotídeos no comprimento. O termo “hibridiza sob condições severas” é definido acima e é intencionado a descrever condições para a hibridização e lavagem sob as quais as seqüências de nucleotídeo pelo menos 65 % idênticas entre si tipicamente permanecem hibridizadas umas às outras. Preferivelmente, as condições são tais que as seqüências pelo menos de cerca de 70 %, mais preferivelmente pelo menos de cerca de 75 % ou 80 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos de cerca de 85 %, 90 % ou 95 % ou mais idênticas entre si tipicamente permanecem hibridizadas umas às outras. Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção que hibridiza sob condições severas a uma seqüência das SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 corresponde a uma molécula de ácido nucléico que ocorre naturalmente.

Como aqui usado, uma molécula de ácido nucléico “que ocorre naturalmente” refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo que ocorre na natureza (por exemplo, codifica uma proteína natural). Preferivelmente, o polinucleotídeo codifica uma Rpi-blb2 de S. bulbocastanum natural.

Além das variantes que ocorre naturalmente da seqüência de Rpi-blb2 que pode existir na população, o técnico habilitado avaliará ainda que as mudanças podem ser introduzidas pela mutação em uma seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo que codifica Rpi-blb2, levando deste modo às mudanças na seqüência de aminoácido da Rpi-blb2 codificada, sem alterar a capacidade funcional da Rpi-blb2. Por exemplo, as substituições de nucleotídeo que levam às substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido “não essenciais” podem ser feitas em uma seqüência do polinucleotídeo que codifica Rpi-blb2, por exemplo, as SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado da seqüência do tipo selvagem da proteína Rpi-blb2 sem alterar a atividade da dita proteína Rpi-blb2, ao passo que um resíduo de aminoácido “essencial” é requerido para a atividade da proteína Rpi-blb2. Outros resíduos de aminoácido, entretanto, (por exemplo, aqueles que não são conservados ou apenas semiconservados no domínio tendo atividade de Rpi-blb2) podem não ser essenciais para a atividade e assim são prováveis de serem passíveis de alteração sem alterar a atividade de Rpi-blb2.

Consequentemente, uma pessoa habilitada na técnica sabe que o uso de códon entre organismos pode diferir. Portanto ele adaptará o uso de códon no polinucleotídeo da presente invenção ao uso do organismo em que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é expressado.

Consequentemente, a invenção diz respeito a polinucleotídeos que codificam Rpi-blb2 que contém mudanças em resíduos de aminoácido que não são essenciais para a atividade de Rpi-blb2. Tais Rpiblb2s diferem na seqüência de aminoácido de uma seqüência contida nas SEQ ID No: 2 ou 4 não obstante retêm a atividade de Rpi-blb2 aqui descrita. O polinucleotídeo pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos de cerca de 70 % idêntica a uma seqüência de aminoácido das SEQ ID Nos: 2 ou 4 e é capaz de participação na resistência a um patógeno vegetal. Preferivelmente, a proteína codificada pela molécula de ácido nucléico é pelo menos de cerca de 70 % idêntica à seqüência nas SEQ ID Nos: 2 ou 4, mais preferivelmente pelo menos de cerca de 75 % idêntica a uma das seqüências nas SEQ ID Nos: 2 ou 4, ainda mais preferivelmente pelo menos de cerca de 80 %, 90 %, 95 % homólogas à seqüência nas SEQ ID Nos: 2 ou 4, e o mais preferivelmente pelo menos de cerca de 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas à seqüência nas SEQ ID Nos: 2 ou 4.

Para determinar a homologia percentual de duas seqüências de aminoácido (por exemplo, uma das seqüências das Seq. ID Nos.: 2 ou 4 e uma forma mutante destas) ou de dois ácido nucléicos, as seqüências são alinhadas com propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na seqüência de uma proteína ou ácido nucléico para alinhamento ótimo com a outra proteína ou ácido nucléico). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições e aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são depois comparadas. Quando uma posição em uma seqüência (por exemplo, uma das seqüências das SEQID Nos: 2 ou 4) é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na outra seqüência (por exemplo, uma forma mutante da seqüência selecionada), então as moléculas são homólogas naquela posição (isto é, como aqui usado a “homologia” de aminoácido ou ácido nucléico é equivalente a “identidade” de aminoácido ou ácido nucléico). A homologia percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, % de homologia = números de posições idênticas/números totais de posições x 100). A homologia pode ser calculada pela comparação com a ajuda do algoritmo do programa GAP (Wisconsin Package Versão 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 et seq), ajustando os seguintes parâmetros: Peso de intervalo: 50 Peso do comprimento: 3 Emparelhamento médio: 10 Desemparelhamento médio: 0 Por exemplo uma seqüência que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência SEQ ID NO: 1 ao nível de ácido nucléico é entendido como significando uma seqüência que, na comparação com a seqüência SEQ ID NO: I pelo algoritmo do programa acima com o ajuste de parâmetro acima, tem pelo menos 80 % de homologia.

Homologia entre dois polipeptídeos é entendido como significando a identidade da seqüência de aminoácido em cada caso em relação ao comprimento da seqüência inteira que é calculado pela comparação com a ajuda do algoritmo do programa GAP (Wisconsin Package Versão 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), ajustando os seguintes parâmetros: Peso do intervalo: 8 Peso do comprimento: 2 Emparelhamento médio: 2,912 Desemparelhamento médio: -2,003 Por exemplo uma seqüência que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência SEQID NO: 2 ao nível da proteína é entendido como significando uma seqüência que, na comparação com a seqüência SEQ ID NO: 2 pelo algoritmo do programa acima com o ajuste de parâmetro acima, tem pelo menos 80 % de homologia.

No presente pedido, a homologia foi determinada com o programa clustalW que pode ser encontrado na www.ebi.ac.uk/tools, as análises de seqüência escolhidas e opção clustalW escolhida (alinhamentos de seqüência múltiplos). Todas as opções foram realizadas sob condições padrão, como segue: alinhamento: completo; formato de saída: aln w/números; ordem de saída: alinhado; alinhamento de cor: nenhum; ktup (tamanho da palavra): def; comprimento da janela: def; tipo de pontuação: porcentagem; topdiag: def; intervalo emparelhado: def; matriz: def; abertura de intervalo: def; intervalos finais: def; extensão de intervalo: def; distâncias de intervalo: def; modo cpu: único; treegraph/tipo: cladograma; gráfico de árvore/distâncias: oculto; árvore filogenética/tipo de árvore: nenhum; árvore filogenética/dist. corrigida: desligado; árvore filogenética/ignorar intervalos: desligado. Portanto um cálculo de Homologia de acordo com clustalW é preferido.

Os equivalentes funcionais derivados de um dos polipeptídeos como mostrado nas SEQ ID NOs: 2 ou 4 de acordo com a invenção pela substituição, inserção ou deleção têm pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, por preferência pelo menos 90 %, especial e preferivelmente pelo menos 95 %, muito especial e preferivelmente pelo menos 98 %, de homologia com um dos polipeptídeos como mostrado nas SEQID NOs: 2 ou 4 de acordo com a invenção e são distinguidas essencialmente pelas mesmas propriedades como o polipeptídeo como mostrado nas SEQ ID NOs: 2 ou 4.

Os equivalentes funcionais derivados da sequência de ácido nucléico como mostrada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6 de acordo com a invenção pela substituição, inserção ou deleção têm pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 80 %, por preferência pelo menos 90 %, especial e preferivelmente pelo menos 95 %, muito especial e preferivelmente pelo menos 98 %, de homologia com um dos polipeptídeos como mostrados nas SEQ ID NO: 2 ou 4 de acordo com a invenção e codificam polipeptídeos tendo essencialmente as mesmas propriedades como o polipeptídeo como mostrado nas SEQ ID NO: 2 ou 4, “Essencialmente as mesmas propriedades” de um equivalente funcional é acima de tudo entendido como significando que conferem um fenótipo resistente a patógeno ou que conferem ou aumentam a resistência a pelo menos um patógeno enquanto aumentam a quantidade de proteína, atividade ou função do dito equivalente de Rpi-blb2 funcional em uma planta ou em um tecido, parte ou células da mesma. O fenótipo de esporulação e lesão depois da infecção em combinação com o dito aumento da quantidade de proteína, atividade ou função do equivalente funcional é além disso entendido como uma propriedade essencial.

Uma molécula de ácido nucléico que codifica uma Rpi-blb2 homóloga a uma seqüência de proteína das SEQ ID Nos: 2 ou 4 pode ser criada pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo em uma seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo da presente invenção, em particular das SEQ ID No: 1 ou 3 ou 5 ou 6 tal que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido são introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas nas seqüências, por exemplo, das SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 pelas técnicas padrão, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada pela PCR. Preferivelmente, substituições de aminoácido conservativas são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais prognosticados. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial prognosticado na Rpi-blb2 é preferivelmente substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família. Altemativamente, em uma outra forma de realização, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência que codifica Rpi-blb2, tal como pela mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto a uma atividade de Rpi-blb2 aqui descrita para identificar mutantes que retenham a atividade de Rpi-blb2. A seguir da mutagênese de uma das seqüências das SEQID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6, a proteína codificada pode ser expressada recombinantemente e a atividade da proteína pode ser determinada usando, por exemplo, os ensaios aqui descritos (ver os Exemplos).

Em uma forma de realização, no método da presente invenção a atividade da proteína Rpi-blb2 e de uma outra proteína de resistência é aumentada. É esperado, que sob condições de campo a presença de mais do que um gene de resistência é benéfico, em particular genes que conferem resistência ao mesmo patógeno. No caso de um isolado de patógeno, por exemplo, uma espécie de P. infestam, estar presente que é capaz de superar a resistência de um dos genes R, o(s) outro(s) um ou mais gene(s) R está/estão ainda funcional(is) tomado-o(s) impossível(is) infectar a planta. A presença de dois genes R não anulados fortemente reduz a chance de que um patógeno, em particular uma espécie de P. infestam, é capaz de mutar em uma espécie que possa superar dois ou mais genes R.

No que segue “polipeptídeo de resistência” ou “proteína de resistência” dizem respeito a um polipeptídeo cuja atividade (aumentada) conferirá resistência a um genótipo suscetível (“tipo selvagem” ou “referência”). Consequentemente, Rpi-blb2 é uma proteína se resistência assim como por exemplo, Rpi-blb (ou RB ou Sbul). Uma “outra proteína de resistência” diz respeito a uma outra proteína de resistência além da proteína da presente invenção, ao passo que o termo “proteína de resistência” compreendo o polipeptídeo da presente invenção assim como uma ou mais outras proteínas de resistência). É ainda entendido, que o termo “e uma outra proteína de resistência” diz respeito a uma ou mais outras proteínas de resistência. Assim, a atividade de uma ou mais proteínas de resistência pode ser aumentada. As outras proteínas de resistência são descritas abaixo. Entretanto, no geral qualquer outra proteína de resistência conhecida pode ser co-expressada com o polipeptídeo da presente invenção ou a sua atividade pode ser aumentada por qualquer um dos métodos aqui descritos para Rpi-blb2.

Em uma forma de realização preferida, a outra proteína de resistência compreende um domínio LRR e uma alça P. A clonagem e caracterização molecular de mais de 30 genes (R) de resistência à doença de planta que conferem resistência às bactérias, fungos, Oomicetos, vírus, nematóides ou insetos tem permitido a sua classificação em classes estruturais independente da especificidade do patógeno (revisado em Dangl e Jones, 2001). A classe mais abundante de genes R caracterizados, que compreendem cerca de 0,5 por cento dos genes prognosticados no genoma de Arabidopsis, é prognosticado codificar proteínas intracelulares que carregam repetições ricas em leucina (LRR) e domínios de sítio de ligação de nucleotídeo (NBS), motivos também encontrados em outras proteínas receptoras e transdução de sinal. As proteínas R NBS-LRR diferem primariamente no término N que exibe similaridade de seqüência à proteína Toll da Drosófila e o domínio de receptor de interleucina-1 de mamífero (TIR-NBS-LRR) ou codifica uma estrutura de espirais espiraladas (CCNBS-LRR), algumas vezes na forma de um zíper de leucina (LZ-NBS-LRR). Embora possam ser associadas à membrana, as proteínas NBS-LRR são prognosticados ser citoplásmicas. Ao contrário, duas outras classes de proteínas R que carregam LRRs são prognosticados transpor a membrana celular, com um domínio LRR extracelular: as proteínas de transmembrana LRR (LRR-TM) Cf e a proteína LRR-TM-cinaseXa21. As proteínas R caracterizadas que carecem das LRRs são o gene Pto do tomate, o gene HslPr-1 da beterraba, o gene mio da cevada, os genes Rpw8 da Arabidopsis e o gene Rpgl da cevada.

De acordo com a hipótese de gene para gene, a resistência à doença segue a percepção pelas proteínas R da planta da função das moléculas efetoras de patógeno com vimlência (Avr), iniciando deste modo através de algum tipo de complexo de reconhecimento elicitor, os caminhos de transdução de sinal que levam a uma resposta hipersensitiva (HR). Em comum com outros receptores é no geral considerado que as proteínas R NBS-LRR têm uma estrutura modular com domínios de reconhecimento e sinalização separados, por meio dos quais a LRR é o domínio de reconhecimento candidato e a região de terminal N incluindo a NBS, o domínio de sinalização principal. A análise funcional das proteínas R recombinantes indica que a especificidade de reconhecimento na verdade reside na LRR. Além disso, a LRR é a região mais viável nas proteínas NBS-LRR intimamente relacionadas e está sob seleção para divergir. Entretanto, evidência é acumulada de que as LRRs também contribuem para a sinalização através da regulagem negativa que envolvem as interações intramoleculares putativas. Correntemente, cinco genes R foram clonados da batata, incluindo dois genes R que conferem resistência à ferrugem tardia, e todas pertencem à classe CC/LZNBS-LRR de genes R de planta. Embora o gene RI derivado do S. demissum confira resistência específica de espécie à ferrugem tardia, o gene derivado de S. bulbocastanum recentemente clonado Rpi-blb (ou RB ou Sbul) confere resistência completa a uma faixa de isolados de P. infestans que carregam fatores múltiplos de virulência e a especificidade de espécie não foi ainda demonstrada.

Além disso, como anteriormente descrito, as plantas progênie de híbridos somáticos contendo Rpi-blb não foram afetadas pela ferrugem tardia nos experimentos de campo no México, onde quase todas as espécies do fungo são encontradas. Devido à complementação do fenótipo suscetível em batata e tomate cultivados o potencial de transferência interespecífica de resistência de amplo espectro à ferrugem tardia às Solanaceae cultivadas a partir de espécies hospedeiras sexualmente incompatíveis pela transformação com genes R clonados únicos foi demonstrado. A US 6.127.607 descreve proteínas de resistência com domínios LRR e alças P. O conteúdo da US 6.127.607 é aqui incorporado por referência. Em particular as colunas 6 a 8 e col. 11 descrevem domínios LRR e alças P. Além disso Song, 2003, PNAS 100 (16), 9128 a 9133 mostra uma comparação de motivos LRR de Rpi-blb na Fig. 4 e dá na página 9132 um resumo a respeito de domínios LRR. Os domínios do polipeptídeo da presente invenção são mostrados na Fig. 14 assim como na Fig. 15.

Preferivelmente a atividade de uma ou mais proteínas de resistência selecionadas do grupo que consiste de Rpi-blb (sinônimo RBor Sbul), Rpi-ABPTl, Rpi-blb3, Rpi-mcd, Rl, R-ber (sinônimo R12), Rpil, R2, R3a, R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, RIO, Rl 1, Ph-1, Ph-2 e Ph-3 é aumentado. Preferido é que além da atividade da Rpi-blb2 pelo menos também a da Rpi-blb seja aumentada.

Em uma forma de realização da presente invenção, a expressão de uma proteína, por exemplo, transgênica, Rpi-blb2 é aumentada e ainda uma expressão do gene de resistência transgênico é aumentada. A proteína de resistência co-expressada com a Rpi-blb2 (ou RB ou Sbul) é preferivelmente uma das proteínas de resistência aqui mencionadas, em particular Rpi-blb, Rpi-ABPTl, Rpi-blb3, Rl, Rpil, R-ber, Rpi-mcd, R2, R3a, R3b, R6, R7, Ph-1, Ph-2 ou Ph3 mas também pode ser uma das outras proteínas que conferem resistência aos patógenos de planta conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica.

Como mencionado, o termo “expressão aumentada” de acordo com esta invenção também inclui uma Expressão de novo de um polinucleotídeo ou polipeptídeo.

Mais preferido é um aumento da resistência por intermédio da coexpressão do polipeptídeo da presente invenção junto com Rpi-blb. Rpi-blb e Rpi-blb2 fornecem ambas a resistência completa em ensaios de folha destacada aos isolados de P. infestans como descrito nos exemplos, e em Song2003, PNAS 100 (16),9128.

Os ditos genes que conferem resistência são por exemplo descritos em RB ou Sbul (sinônimo de Rpi-Blb): AY336128 [gi: 32693280], (Song et aL, 2003). Clones BAC 177 013 e CB3A14 que compreendem o gene Rpi-blb foram depositados no GenBank com os números de acesso N- AY303171 e AY303170.

Rl: AF447489 [gi: 9117432422], (Balivoraet n/„ 2002) Rpil: Kuhl, J. C., Hanneman, R. E., e Havey, M. J., (2201) Characterization and mapping of Rpil, a late blight resistance locus from diploid (1 EBN) Mexican Solanum pinnatisectura. Molecular genet. Genomics 265: 977 a 985. R-ber: Ewing, E. E., Simko, I., Smart, C. D., Bonierbale, M. W., Mizubuti, E. S. G., May, G. D., e Fry, W. E., (2000) Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Molecular breeding 6: 25 a 36, R2: Li, X., van Eck, H. J., van der Voort, J. N. A. M., Huigen, D. J., Stam, P., e Jacobsen, E. (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4, Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121 a 1112. R3, R6, R7: Elkharbotly, A., Palominosanchez, C., Salamini, F., Jacobsen, E., e Gebhardt, C. (1996) R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome XI. Theoretical and Applied. Genetics 92 (7): 880 a 884.

Ph-1: Bonde e Murphy (1952) Main Agric. Exp. Stn. Bull. No 497 Ph-2: Moreau, P., Thoquet, P., Olivier, J., Laterrot, H., e Grimsley, N. H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4): 259 a 269.

Ph-3: Chunwongse, J., Chunwongse, C., Black, L., e Hanson, P. (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 77 (3): 281 a 286.

Rpi-blb3, Rpi-ABPTl e Rpi-mcd: Park, T. H., Van der Vossen, E., Vleeshouwers, V. G. A. A., Tan, A., Visser, R. G. F. e Van Eck, H. J. 2004. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD project. Crop Functional Genomics 2004, Julho de 2004, Jeju, Coréia, página 93. R3a e R3b: Huang, S., Vleeshouwers, V. G. A. A., Werij, J. S., Hutten, R. C. B., Van Eck, H, J., Visser, R. G. F, e Jacobsen, E. (2004). The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI 17 (4), 428 a 435.

Em uma forma de realização, a atividade da Rpi-blb2 é aumentada de acordo com a presente invenção, por exemplo, o polinucleotídeo da expressão da invenção é aumentada e a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucléico é aumentada codificando Rpi-blb, Rpi-ABPTl, Rpi-blb3, Rpi-mcd Rl, R-ber, Rpil, R2, R3a, R3b, R6, R7, Ph- I, Ph-2 e/ou Ph-3 por meio do qual a molécula de ácido nucléico é selecionada do grupo que consiste de: a) molécula de ácido nucléico que codifica pelo menos uma forma madura de pelo menos um polipeptídeo Rpi-Blb (ou RB- ou Sbul-), preferivelmente como codificado pela seqüência mostrada no Acesso do GenBank N°: AY336128 [gi: 32693280]; um polipeptídeo Rl, preferivelmente como codificado pela seqüência mostrada no Acesso do GenBank Nâ: AF447489 [gi 9117432422]; um polipeptídeo Rpi-bib3, Rpi-ABPTl e/ou o polipeptídeo Rpi-mcd, preferivelmente codificado pela seqüência mostrada em Park, T. H., Van der Vossen, E., Vleeshouwers, V. G. A. A., Tan, A., Visser, R. G. F. e Van Eck, H. J. 2004 ou derivável pela informação dada nesta. Major resistance genes for tuber and leaf resistance to Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD project. Crop Functional Genomics 2004, Julho de 2004, Jeju, Coréia, página 93; um polipeptídeo R3a e/ou R3b, preferivelmente codificado pela seqüência mostrada em Huang, S., Vleeshouwers, V. G. A. A., Werij, J. S., Hutten, R. C. B., Van Eck, H. J., Visser, R. G. F, and Jacobsen, E. (2004) ou derivável pela informação dada nesta. The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities. MPMI 17 (4), 428 a 435 e/ou uma proteína que confere resistência a patógeno, preferivelmente P. infestans, mapeado e caracterizado como descrito, por exemplo, como para Rpil em Kuhl, J. C., Hanneman, R. E., e Havey, M, J., (2001) Characterization and mapping of Rpil, a late blight resistance locus from diploid (1 EBN) Mexican Solanum pinnatisectum. Molecular genet. . Genomics 265:977 a 985; for R-ber em Ewing, E. E., Simko, I., Smart, C. D., Bonierbale, M. W., Mizubuti, E. S. G., May, G. D., e Fry, W. E., (2000) Genetic mapping from field tests of qualitative and quantitative resistance to Phytophthora infestans in a population derived from Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. Molecular breeding 6:25 a 36; para R2 em Li, X., van Eck, H. J., van der Voort, J. N. A. M., Huigen, D. J., Stam, P., e Jacobsen, E. (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121 a 1128; para R3, R6, R7 em Elkharbotly, A., Palominosanchez, C., Salamini, F., Jacobsen, E., e Gebhardt, C. (1996) R6 and R7 alleles of potato conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans (Mont) de Bary identified genetic loci clustering with the R3 locus on chromosome Xi. Theoretical and Applied. Genetics 92 (7): 880 a 884; para Ph-1 em Bonde and Murphy (1952) Main Agric. Exp.

Stn. Bull. No 497; ou para Ph-2 em Moreau, P., Thoquet, P., Olivier. J., Laterrot, H., e Grimsley, N. H. (1998) Genetic mapping of Ph-2, a single locus controlling partial resistance to Phytophthora infestans in tomato. Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4): 259 a 269; e/ou para Ph-3 em Chunwongse, J., Chunwongse, C,, Black, L., e Hanson, P. (2002) Molecular mapping of the Ph-3 gene for late blight resistance in tomato. Journal of Horticultura! Science & Biotechnology 77 (3): 281 a 286; ou um polipeptídeo que confere resistência a patógeno, preferivelmente polipeptídeo que confere resistência a P. infestans derivável das ditas publicações; b) molécula de ácido nucléico a seqüência de nucleotídeo da qual é degenerada como um resultado do código genético a uma seqüência de nucleotídeo de (a); c) molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo derivado do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de (a) ou (b) por intermédio de substituição, deleção e/ou adição de um ou vários aminoácidos da seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de (a) ou (b); d) molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo a seqüência do qual tem uma identidade de 70 % ou mais à seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de (a); e) moléculas de ácido nucléico que compreendem um fragmento ou uma porção que carrega epítopo de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (d); f) molécula de ácido nucléico que codifica um fragmento que começa com o aminoácido; 1,30, 50,100,200, 500 ou 1000, e acabando com o aminoácido 1267, 1000,500, 300, 200, 50, 30 ou 1 de um polipeptídeo codificado por qualquer um de (a) a (e) e com uma das ditas atividades; g) molécula de ácido nucléico que compreende pelo menos 20 nucleotídeos de um polinucleotídeo de qualquer um de (a) ou (b); h) molécula de ácido nucléico que codifica um polípeptídeo que é reconhecido por um anticorpo monoclonal que foi incitado contra um polípeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (f); i) molécula de ácido nucléico obtenível pela triagem de uma biblioteca apropriada sob condições severas com uma sonda tendo a seqüência da molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (h) ou de um fragmento destas de pelo menos 20, preferível 30 ou mais nucleotídeos; e j) molécula de ácido nucléico o filamento complementar da qual hibridiza sob condições severas com uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) ou (i); ou o filamento complementar de qualquer um de (a) a (j).

Consequentemente, o método da presente invenção confere resistência de uma das ditas plantas, tecido vegetal ou célula vegetal da presente invenção a um patógeno vegetal de um filo Oomyceta, preferivelmente a um patógeno da ordem Pythiales ou Peronosperales, mais preferido à família Pythiaceae ou Peronosporaceae, mais preferido do gênero Phytophthora ou Bremia ou Peronospera ou Plasmopara, o mais preferido em que o patógeno é da espécie Phytophthora parasitica var. nicotianae (que causa, entre outros, black shank no tabaco), Phytophthora sojae (que causa a podridão da raiz pelo Phytophthora na soja), Phytophthora capsici (que podridões em pimenta e cucurbitáceas e tomate), Phytophthora erythroseptica (que causa a podridão rosa na batata), Plasmopara viticola (que causa o míldio penugento nas uvas), Bremialactuca (que causa o míldio penugento na alface) ou Peronospora tabaci (que causa o mofo azul no tabaco). A atividade de Rpi-blb2 em uma planta, uma célula vegetal, um tecido vegetal, um órgão vegetal ou parte destes de acordo com a presente invenção pode ser aumentada, gerada ou estimulada por intermédio de métodos que são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica e por exemplo, são descritos em Sambrook et ai., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989.

Assim, em uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito ao método da invenção, em que a expressão é uma expressão de novo. O termo “Expressão de novo” em uma célula, um tecido ou em um organismo ou em uma parte desta como aqui entendido diz respeito à expressão de um produto de gene depois de uma não detectabilidade anterior do dito produto de gene ou de uma atividade do dito produto de gene, em particular de um polipeptídeo ou polinucleotídeo correspondente em uma célula, um tecido ou em um organismo ou em uma parte destes. Preferido é que o gene que codifica um polipeptídeo ou um polinucleotídeo em uma célula, um tecido ou em um organismo ou em partes destes e que deva ser expressado de novo não esteja presente no genoma em uma célula, um tecido ou em um organismo ou em partes destes. Se a expressão de um produto de gene não pode ser detectado em uma célula, um tecido ou em um organismo ou em partes destes, é no geral assumido que nenhuma expressão ocorre em uma célula, um tecido ou em um organismo ou em partes destes. Consequentemente, se a atividade não pode ser detectada, é no geral assumido que nenhuma atividade correspondente exista. Uma pessoa habilitada na técnica, entretanto, sabe que os métodos e meios de detecção evoluem para uma sensibilidade mais alta. Assim, em uma forma de realização preferida, o termo “Expressão de novo” diz respeito a uma expressão nova ou adicional em sistemas, onde o nível de atividade, por exemplo, devido a um nível de expressão baixo ou a expressão de um produto de gene (quase) inativo é muito baixo para conferir qualquer resistência a um patógeno vegetal, em particular a P. infestans. Uma comparação de uma cepa silenciada e um fenótipo de cepa de expressão baixa e/ou alta pode mostrar, se alguma diferença na resistência a qualquer um dos patógenos aqui mencionados é observável.

Consequentemente, em uma outra forma de realização da presente invenção, a atividade endógena de uma Rpi-blb2 e/ou uma outra proteína de resistência é aumentada. O nível de expressão em uma célula pode ser aumentada pelos métodos conhecido por uma pessoa habilitada na técnica. Várias técnicas são aqui descritas, por exemplo, a expressão transgênica do polinucleotídeo ou polipeptídeo da presente invenção. O polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser de origem estranha. Preferido é que um polinucleotídeo da mesma origem genética como a célula hospedeira, célula vegetal, tecido vegetal ou planta seja introduzido. A atividade, em particular uma atividade endógena mas também a atividade de uma Rpi-blb2 expressada transgênica pode ser aumentada por vários métodos. Consequentemente, em uma forma de realização preferida, a atividade das proteínas de resistência aqui descritas é aumentada por uma ou mais das seguintes etapas a) estabilizar a proteína de resistência; b) estabilizar a proteína de resistência que codifica o mRNA; c) aumentar a atividade específica da proteína de resistência; d) expressar ou aumentar a expressão de um fator de transcrição homólogo ou artificial para a expressão da resistência; e) estimular a atividade da proteína de resistência através de fatores indutores exógeno; f) expressar um gene de resistência transgênico; e/ou g) aumentar o número de cópia do gene que codifica a resistência.

No geral uma atividade em um organismo, em particular em uma célula vegetal, uma planta ou um tecido vegetal pode ser aumentada pelo aumento da quantidade da proteína específica, isto é, da proteína de resistência, no dito organismo. “Quantidade de proteína” é entendido como significando a quantidade de um polipeptídeo, preferivelmente Rpi-blb2, em um organismo, um tecido, uma célula ou um compartimento celular. “Aumento” da quantidade de proteína significa o aumento quantitativo da quantidade de uma proteína em um organismo, um tecido, uma célula ou uma compartimento celular - por exemplo por um dos métodos aqui descritos abaixo - em comparação com o tipo selvagem do mesmo gênero e espécie, aos quais este método não foi aplicado, sob condições de outro modo idênticas (tais como, por exemplo, condições de cultura, idade da planta e outras). As quantidades aumentram até pelo menos 10 %, preferivelmente pelo menos 20 % ou pelo menos 50 %, especial e preferivelmente pelo menos 70 % ou 90 %, muito especial e preferivelmente pelo menos 100 %, o mais preferivelmente pelo menos 200 % ou mais. O “Aumento” da atividade é entendido como significando o aumento da atividade total de uma proteína em um organismo, um tecido, uma célula ou um compartimento celular em comparação com o tipo selvagem do mesmo gênero e espécie, ao qual este método não foi aplicado, sob condições de outro modo idênticas (tais como, por exemplo, condições de cultura, idade da planta e outras). As quantidades aumentaram até pelo menos 10 %, preferivelmente pelo menos 20 % ou pelo menos 50 %, especial e preferivelmente pelo menos 70 % ou 90 %, muito especial e preferivelmente pelo menos 100 %, o mais preferivelmente pelo menos 200 % ou mais.

Neste contexto, a eficácia da resistência ao patógeno pode desviar tanto a jusante quanto a montante em comparação com um valor obtido quando do aumento de uma das proteínas Rpi-blb2 como mostrado nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Os equivalentes funcionais preferidos são aqueles em que a eficácia da resistência do patógeno - medida, por exemplo, pela eficácia de penetração de um patógeno ou como aqui descrito - difere em não mais do que 50 %, preferivelmente 25 %, especial e preferivelmente 10 % de um valor comparativo obtido pela redução de uma proteína Rpi-blb2 como mostrado nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Especialmente preferido são aquelas seqüências onde o aumento aumenta a eficácia da resistência a patógeno quantitativamente em mais do que 50 %, preferivelmente 100 %, especial e preferivelmente 500 %, muito especial e preferivelmente 1000 % com base em um valor comparativo obtido pela redução de uma das proteínas Rpi-blb2 como mostrado nas SEQ ID NOs: 2 ou 4.

Qualquer comparação é preferivelmente realizada sob condições análogas. “Condições análogas” significa que todas as condições tais como, por exemplo, condições de cultura ou cultivo, condições de ensáo (tais como tampão, temperatura, substratos, concentração de patógeno e outras) são mantidas idênticas entre os experimentos a serem comparados e que os ajustes diferem apenas pela seqüência dos polipeptídeos de Rpi-blb2 a serem comparados, seus organismos de origem e, se apropriado, o patógeno. Quando da escolha do patógeno, cada comparação requer que o patógeno seja escolhido de modo que seja o mais similar ao outro equivalente, levando em consideração a especificidade de espécie.

Devido à atividade aumentada de Rpi-blb2, a resistência de uma planta ou de uma parte desta é aumentada. Em uma forma de realização preferida, o método da presente invenção resulta em redução no índice de esporulação de pelo menos 30 % depois da infecção com P. infestans comparado a um tipo selvagem, mais preferida é uma redução de 50 %, ainda mais preferido são 70 %, ainda mais preferido são mais do que 80 %, mais preferido são 85 % e 90 %. O mais preferido é 95 % ou mais.

Consequentemente, a presente invenção também diz respeito ao dito polinucleotídeo da invenção, como definido acima que codifica uma proteína Rpi-blb2 que compreende uma molécula de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste de: a) moléculas de ácido nucléico que codifica pelo menos a forma madura do polipeptídeo representado nas SEQ Π) NOs: 2 ou 4; b) moléculas de ácido nucléico que compreende a seqüência codificadora como representado nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou que codifica pelo menos a forma madura do polipeptídeo; c) moléculas de ácido nucléico a seqüência de nucleotídeo das quais é degenerada como um resultado do código genético a uma seqüência de nucleotídeo de (a) ou (b); d) moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo derivado do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de (a) a (c) por intermédio de substituição, deleção e/ou adição de um ou de vários aminoácidos da seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de (a) a (c); e) moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo a seqüência do qual tem uma identidade de 70 % ou mais à seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de (a) ou (b); f) moléculas de ácido nucléico que compreendem um fragmento ou uma porção que carrega epítopo de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (e); g) moléculas de ácido nucléico que compreendem um polinucleotídeo tendo uma seqüência de uma molécula de ácido nucléico amplificada a partir de uma biblioteca de ácido nucléico usando os iniciadores como listado na Tab. 3b, preferivelmente ARF1F ou ARF1R; h) moléculas de ácido nucléico que codifica um fragmento de polipeptídeo que começa com o aminoácido: 1,30, 50,100,200,300,500 ou 1000 e acaba com, o aminoácido 1267,1000, 500, 300, 200, 50, 30 ou 1 de um polipeptídeo codificado por qualquer um de (a) a (g); i) moléculas de ácido nucléico que compreendem pelo menos 20 nucleotídeos de um polinucleotídeo de qualquer um de (a) ou (d); j) moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo monoclonal que foi incitado contra um polipeptídeo codificado por uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a (h); k) moléculas de ácido nucléico obteníveis pela triagem de uma biblioteca apropriada sob condições severas com uma sonda tendo a seqüência da molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) a ® ou de um fragmento destas de pelo menos 15, preferível 30, 60, 90 ou mais nucleotídeos; e l) moléculas de ácido nucléico o filamento complementar da qual hibridiza sob condições severas com uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) ou (k); ou o filamento complementar de qualquer um de (a) a (1); ou que codifica um polipeptídeo codificado por um segmento do cromossoma 6 ou de gmpo de ligação 6 de Solanum bulbocastanum que co-segrega com um marcador selecionado da tabela 3 a ou 3b e que medeia a resistência aos patógenos de planta, preferivelmente do filo Oomycetcr, Em uma forma de realização, o polinucleotídeo da invenção não consiste da seqüência representada na Seq. ID NO.: 7 e/ou 9 e/ou não consiste da seqüência de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína representada na Seq. ID NO.: 8 e/ou 10.

Em uma forma de realização, o polinucleotídeo da presente invenção não consiste da seqüência de uma molécula de ácido nucléico de Mil.l ou Mi 1.2 e/ou de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína Mil. 1 ou Mi 1.2.

Assim, em uma forma de realização, o polinucleotídeo da presente invenção pode não consistir das seqüências mostradas nas Rossi et al. 1998, PNAS USA 95: 9750 a 9754, Milligan et al, 1998. Vegetal Cell 10: 1307 a 1319; e/ouWO 9806750.

Em uma outra forma de realização, o polinucleotídeo da presente invenção é derivado ou isolado do genoma de um organismo selecionado do grupo que consiste de Menyanthaceae, Solanaceae, Sclerophylacaceae, Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Polemoniaceae e Hydrophyllaceae de acordo com o Systema Naturae 2000, Brands, S. J., Amsterdam ou tem a sua origem daí, mais preferivelmente este é selecionado do grupo que consiste de Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Fabiana, Frariciscea, Hyoscyamus, Lycium, Mandragora, Nicandra, Nicotiana, Petunia, Physalis, Schizanthus e Solanum de acordo com o Systema Naturae 2000, Brands, S. J., Amsterdam ou tem a sua origem daí, ainda mais preferido é uma seleção do grupo que consiste da família das Solanaceae, preferivelmente S. bulbocastanum, batata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum), petúnia, tree tomato (5. betaceum), melão pêra (S. muricatum) e beringela (S. melongena). Ainda mais preferido são tomate ou batata ou S. bulbocastanum como fonte para o polinucleotídeo da presente invenção. O mais preferido é o S. bulbocastanum como fonte.

Rpi-blb2 foi isolado de material de S. tuberosum derivado de ABPT. Assim, da perspectiva taxonômica a Rpi-blb2 descrita também é derivada de S. tuberosum. Entretanto, o gene estava presente em um fragmento de introgressão presumivelmente derivado de S. bulbocastanum. Um lote das variedades de S. tuberosum contém fragmentos de introgressão da espécie Solanum relacionada, mas ainda são S. tuberosum. Portanto, S. tuberosum pode de acordo com o sistema taxonômico ser também uma fonte para o polinucleotídeo da presente invenção, em particular S, tuberosum derivado de ABPT, assim como outras variedades de outras espécies de Solanum derivadas em umamaneira similar.

Consequentemente, em uma outra fonna de realização o polinucleotídeo da presente invenção é derivado de S. tuberosum.

Um polinucleotídeo da presente invenção, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de nucleotídeo da Seq ID NO: 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou uma porção deste, pode ser isolada usando técnicas de biologia molecular padrão e a informação de seqüência aqui fornecida. Por exemplo, cDNA de Rpi-blb2 pode ser isolado de uma biblioteca usando toda ou porção de uma das sequências do polinucleotídeo da presente invenção como uma sonda de hibridização e técnicas de hibridização padrão (por exemplo, como descrito em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Além disso, um polinucleotídeo que abrange toda ou uma porção de uma das seqüências do polinucleotídeo da presente invenção pode ser isolado pela reação de cadeia da polimerase usando iniciadores de oligonucleotídeo planejados com base nesta seqüência (por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que abrange toda ou uma porção de uma das seqüências de polinucleotídeo da presente invenção). Por exemplo, o niRNA pode ser isolado de células, por exemplo, S. bulbocastanum ou uma outra planta (por exemplo, pelo procedimento de extração com guanidínio-tiocianato de Chirgwin et ai. (1979) Biochemistry 18:5294 a 5299) e o cDNA pode ser preparado usando a transcriptase reversa (por exemplo, a transcriptase reversa de Moloney MLV, disponível da Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase reversa AMV, disponível da Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Os iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para a amplificação pela reação de cadeia da polimerase podem ser planejados com base em uma das seqüências de nucleotídeo mostradas nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6. Um polinucleotídeo da invenção pode ser amplificado usando cDNA ou, altemativameníe, DNA genômico, como um padrão e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com as técnicas de amplificação pela PCR padrão. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser clonado em um vetor apropriado e caracterizado pela análise de seqüência de DNA. Além disso, os oligonucleotídeos que correspondem a uma seqüência de nucleotídeo Rpi-blb2 podem ser preparados pelas técnicas sintéticas padrão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.

Em uma forma de realização da presente invenção a proteína Rpi-blb2 é codificada por um segmento de cromossoma 6 ou grupo de ligação 6 de Solanum bulbocastanum ou S. tuberosum.

Além disso, a presente invenção compreende um segmento de cromossoma 6 ou grupo de ligação 6 de S. bulbocastanum ou S. tuberosum. Em uma forma de realização preferida no método da presente invenção a proteína Rpi-blb2 expressada é codificada por um polinucleotídeo que compreende um segmento de cromossoma 6 ou grupo de ligação 6 de S. bulbocastanum. Preferivelmente o dito segmento um grupo compreende outro elemento que atua em cis, por exemplo, promotores, realçadores, sítios de ligação etc. ou elementos que atuam em trans, como co-fatores, ativadores ou outras proteínas de resistência, que conferem uma resistência aumentada.

Os fragmentos genômicos que compreendem o gene Rpi-blb2 e outros elementos reguladores são representados nas Seq ID NOs.: 5 e 6.

Uma pessoa habilitada na técnica sabe como obter · um segmento de cromossoma, por exemplo, pela clonagem de fragmentos de cromossoma em BACs, como por exemplo Song, 2003, PNAS 100 (16), 9128 ou como aqui descrito e nas referências aqui citadas.

Consequentemente, em uma outra forma de realização, o polinucleotídeo da presente invenção ou um polinucleotídeo que codifica a proteína Rpi-blb2 co-segrega com um marcador selecionado da tabela 3a ou compreende um sítio de replicação ou sítio de hibridização para o dito marcado. Como descrito em detalhes nos exemplos, a resistência a P. infestans pode ser mapeada com os marcadores representados na tabela 3a ou 3b. Quanto mais próximo um marcador está localizado para um gene, mais alta é a porcentagem de linhas, isto é, clones progênie, em que o gene co-segrega com o dito marcador. Portanto em uma forma de realização preferida, o polinucleotídeo da presente invenção co-segrega com o Marcador E40M58, CT119e/ouCT216.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para fabricar um vetor recombinante que compreende inserir o polinucleotídeo da presente invenção em um vetor ou inserir o dito polinucleotídeo e uma outra proteína de resistência em um vetor.

Consequentemente, em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um vetor contendo o polinucleotídeo da presente invenção ou o dito polinucleotídeo e um outro gene de resistência produzido pelo método da presente invenção.

Como aqui usado, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um polinucleotídeo ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que refere-se a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA ou RNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são aludidos aqui como “vetores de expressão”. No geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante são frequntemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma mais habitualmente usada de vetor. Entretanto, a invenção é intencionada a incluir outras tais formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus associados a adeno defeituosos em replicação), que servem a funções equivalentes. A presente invenção também diz respeito a cosmídeos, víms, bacteriofagos e outros vetores convencionalmente usados no engendramento genético que contém uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir vários plasmídeos e vetores; ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N. Y. (1989). Altemativamente, as moléculas de ácido nucléico e vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para a liberação às células alvo.

Em uma outra forma de realização, o vetor da presente invenção ou o método da presente invenção são dessa maneira caracterizados, em que o polinucleotídeo que codifica a proteína Rpi-blb2 ou uma outra proteína de resistência está operativamente ligado às sequências de controle de expressão e/ou um ligado a uma sequência de ácido nucléico que codifica um sinal regulador da expressão transgênica que permite a expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas.

Em uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito a um vetor da presente invenção ou ao método da presente invenção em que o polinucleotídeo que codifica a proteína Rpi-blb2 e/ou a outra proteína de resistência está operativamente ligado às seqüências de controle de expressão da mesma origem de espécie como o polinucleotídeo que codifica a proteína Rpi-blb2 e/ou a outra proteína de resistência.

No caso em que uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção é expressada em uma célula é em princípio possível modificar a seqüência codificadora em um tal modo que a proteína esteja localizada em qualquer compartimento desejado da célula vegetal. Estes incluem o núcleo, o retículo endoplasmático, o vacúolo, a mitocôndria, os amiloplastos como plastídeos, cloroplastos, cromoplastos, o apoplasto, o citoplasma, o espaço extracelular, corpos oleosos, peroxissomas e outros compartimentos de células vegetais (para revisão ver Kermode, Crit. Rev. Plant Sei, 15,4 (1996), 285 a 423 e referências aí citadas). O polinucleotídeo pode ser depois operativamente fundido a um polinucleotídeo apropriado, por exemplo, um vetor, que codifica um sinal para o transporte no compartimento desejável.

Em uma outra forma de realização preferida da presente invenção diz respeito a um vetor em que o polinucleotídeo da presente invenção está operativamente ligado às seqüências de controle de expressão que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro, Nos procariotas, as seqüências de controle no geral incluem promotor, sítio de ligação de ribossoma e terminadores. Nos eucariotas, no geral as seqüências de controle incluem promotores, terminadores e, em alguns casos, realçadores, transativadores; ou fatores de transcrição. O termo “seqüência de controle” é intencionado a incluir, a um mínimo, componentes a presença dos quais é necessária para a expressão, e também pode incluir componentes vantajosos adicionais. O termo “operativamente ligado” refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão em uma relação que os permite funcionar na sua maneira pretendida. Uma seqüência de controle “operativamente ligada” a uma seqüência codificadora é ligada em um tal modo que a expressão da seqüência codificadora é obtida sob condições compatíveis com as seqüências de controle. No caso a seqüência de controle é um promotor, é óbvio para uma pessoa habilitada que ácido nucléico de filamento duplo é usado. A ligação operável deve ser entendida como significando, por exemplo, o arranjo seqüencial de um promotor com a seqüência de ácido nucléico a ser expressada e, se apropriado, outros elementos reguladores tais como, por exemplo, um terminador em um tal modo que cada um dos elementos reguladores possam desempenhar a sua função quando a seqüência de ácido nucléico é expressada recombinantemente, dependendo do arranjo das seqüências de ácido nucléico em relação ao RNA de sentido ou anti-sentido. Para esta finalidade, a ligação direta no sentido químico não é necessariamente requerida. As seqüências de controle genéticas tais como, por exemplo, as seqüências realçadoras, também podem exercer a sua função na seqüência alvo a partir de posições que são ainda longe ou de fato de outras moléculas de DNA. Os arranjos preferidos são aqueles em que a seqüência de ácido nucléico a ser recombinantemente expressada é posicionada atrás da seqüência que atua como promotora, de modo que as duas seqüências sejam covalentemente ligadas entre si. A distância entre a seqüência promotora e a seqüência de ácido nucléico a ser recombinantemente expressada é preferivelmente menor do que 200 pares de base, especial e preferivelmente menor do que 100 pares de base, muito especial e preferivelmente menor do que 50 pares de base. A ligação operável, e um cassete de expressão, podem ser gerados por meios de técnicas de recombinação e clonagem habituais como são descritas, por exemplo, em Maniatis T, Fritsch E F e Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), em Silhavy T J, Bennan M L e Enquist L W (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), em Ausubel F M et al (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, e Wiley Interscience e em Gelvin et al (1990) Em: Plant Molecular Biology Manual. Entretanto, outras sequências que, por exemplo, atuam como um ligador com sítios de divagem específicos para as enzimas de restrição ou como um peptídeo de sinal, também podem ser posicionados entre as duas seqüências. A inserção de seqüências também pode levar à expressão de proteínas de fusão. Preferivelmente, o cassete de expressão, que consiste de uma ligação de promotor e seqüência de ácido nucléico a ser expressada, pode existir em uma forma integrada a vetor e ser inserida em um genoma vegetal, por exemplo pela transformação.

Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ou ver: Gmber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Flórida, eds.: Glick e Thomson, Capítulo 7, 89 a 108 incluindo as referências neste. As seqüências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célula hospedeira e aquelas que direcionam a expressão da seqüência de nucleotídeo apenas em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que o planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzirem por meio destas proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados pelos polinucleotídeos como aqui descritos. Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser planejados para a expressão das ditas proteínas de resistência, preferivelmente Rpi-blb2, em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os genes que codificam o polinucleotídeo da invenção podem ser expressados em células bacterianas tais como E. coli, C. glutamicum, Agrobacterium tumefaciens, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), leveduras e outras células fúngicas (ver Romanos, (1992), Yeast 8: 423 a 488; van den Hondel, (1991) J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p, 396 a 428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, (1991) em; Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, eds,, p. 1 a 28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3: 239 a 251), e vegetais de célula multicelular (ver Schmidt, R. (1988), Plant Cell Rep.: 583 a 586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Flórida, capítulo 6/7, S. 71119 (1993); F. F. White, B, Jenes et alTechniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128 a 143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205 a 225 (e referências citadas nestes) ou células mamíferas. As células hospedeiras adequadas são debatidas ainda em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Altemativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras do promotor T7 e T7 polimerase. A expressão de proteínas em procariotas é mais frequentemente realizada com vetores que contenham promotores constitutivos ou indutíveis que direcionam a expressão das proteínas de fusão ou que não de fusão. Os vetores de fusão adicionam vários aminoácidos a uma proteína codificada dessa maneira, usualmente ao término amino da proteína recombinante mas também ao término C ou fundido dentro de regiões adequadas nas proteínas. Tais vetores de fusão tipicamente servem para três propósitos: 1) para aumentar a expressão de proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante pela atuação como um ligando na purificação por afinidade. Além disso, o vetor de fusão também pode codificar proteínas adicionais, cuja expressão suporta um aumento da atividade de Rpi-blb2 ou da resistência de uma planta contra patógenos vegetais, por exemplo, outras proteínas de resistência. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de divagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e da proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da porção de fusão subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enterocinase.

Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31 a 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Os exemplos de vetores de expressão da E. coli que não de fusão indutíveis adequados incluem pTrc (Amann (1988) Gene 69: 301 a 315) e pETlld (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60 a 89.

Uma estratégia para maximizar a expressão da proteína recombinante é expressar a proteína em uma bactéria hospedeira com uma capacidade prejudicada para clivar proteoliticamente a proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119 a 128). Uma outra estratégia é alterar a seqüência de ácido nucléico do ácido nucléico a ser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácido são aqueles preferencialmente utilizados na bactéria escolhida para a expressão, tal como E. coli ou C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111 a 2118). Tal alteração de seqüências de ácido nucléico da invenção pode ser realizada pelas técnicas de síntese de DNA padrão.

Além disso, o vetor pode ser um vetor de expressão de levedura. Os exemplos de vetores para a expressão na levedura S. cerivisae incluem pYepSecl (Saldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229 a 234), pMFa (Kurjan e Herskowitz, (1982) Cell 30: 933 a 943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113 a 123), e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Preferivelmente, o polinucleotídeo da presente invenção ou aqui descrito é operativamente ligado a uma seqüência de controle de expressão vegetal, por exemplo, um cassete de expressão. Um cassete de expressão vegetal preferivelmente contém seqüências reguladoras capazes de direcionar a expressão de gene em células vegetais e que são operativamente ligadas de modo que cada seqüência possa executar a sua função tal como a terminação de transcrição tal como sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidos são aqueles que originam de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tais como o gene 3 conhecido como octopina sintase do plasmídeo Ti, pTiACH5 (Gielen et al, EMBO J. 3 (1984), 835 ff) ou os equivalentes funcionais destes mas também todos os outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados.

Visto que a expressão de gene vegetal é muito frequentemente não limitada aos níveis transcricionais visto que o cassete de expressão vegetal preferivelmente contém outras seqüências operativamente ligadas como realçadores traducionais tais como a seqüência de sobre marcha contendo a seqüência líder não traduzida 5' do víms mosáico do tabaco que realça a proteína por relação de KNA (Gallie et al 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693 a 8711).

Consequentemente, o polinucleotídeo aqui descrito pode ser operativamente ligado a um promotor apropriado que confere a expressão de gene em uma maneira conveniente, específica de célula ou tecido.

Preferidos são promotores que direcionam a expressão constitutitiva (Benfey et al., EMBO J. 8(1989) 2195 a 2202) como aqueles derivados de vírus vegetais como o 35S CAMV (Franck et ai, Cell 21 (1980) 285 a 294), o 19S CaMV (ver também a US 5352605 e a WO 8402913) ou promotores vegetais como aqueles da subunidade pequena de Rubisco descritos na US 4962028. O termo promotores específicos de planta é entendido como significando, em princípio, qualquer promotor que seja capaz de controlar a expressão de genes, em particular genes estranhos, em plantas ou partes de planta, células vegetais, tecidos vegetais ou culturas vegetais. Neste contexto, a expressão pode ser, por exemplo, constitutiva, indutível ou dependente de desenvolvimento.

Os seguintes são preferidos: a) Promotores constitutivos Os vetores preferidos são aqueles que tomam possível a expressão constitutiva em plantas (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195 a 2202). Promotor “constitutivo” é entendido como significando aqueles promotores que garantem a expressão em um grande número, preferivelmente todos, de tecidos em um período substancial do desenvolvimento da planta, preferivelmente em todos os estágios do desenvolvimento da planta. Em particular um promotor vegetal ou um promotor derivado de um vírus vegetal são preferivelmente usados. Particularmente preferido é o promotor do transcrito 35S do vírus mosáico da couve flor CaMV (Franck et al. (1980) Cell 21: 285 a 294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810 a 812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281 a 288; Gardnereí al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221 a 228) ou o promotor 19S CaMV (US 5.352.605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195 a 2202). Um outro promotor constitutivo adequado é o promotor da “subunidade pequena de Rubisco (SSU)” (US 4.962.028), o promotor da legumina B (Acesso ao GenBank. N- X03677), o promotor da Agrobacterium opalina sintase, o promotor duplo TR, o promotor da Agrobacterium OCS (octopina sintase), o promotor da ubiquitina (Holtorf S et ai, (1995) Plant Mol Biol 29: 637 a 649), o promotor da ubiquitina 1 (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675 a 689; Bruce et al, (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86: 9692 a 9696), o promotor Smas, o promotor da cinamil álcool desidrogenase (US 5.683.439), os promotores das subunidades de ATPase vacuolar ou o promotor de uma proteína rica em prolina do trigo (WO 91/13991), e outros promotores de genes cuja expressão constitutiva em plantas é conhecido pelo trabalhador habilitado. b) Promotores específicos de tecido Preferidos são além disso os promotores com especificidade para as anteras, ovários, flores, folhas, hastes, raízes e sementes. Os promotores específicos de semente tais como, por exemplo, o promotor da faseolina (US 5.504.200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839 a 853), o promotor do gene da albumina 2S (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196 a 12201), o promotor da legumina (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326 a 331), o promotor da USP (proteína de semente não conhecida) (Bãumlein H et al (1991) Mol Gen Genet 225 (3): 459 a 467), o promotor do gene napin (US 5,608.152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515 a 519), o promotor da proteína de ligação da sacarose (WO 00/26388) ou o promotor da legumina B4 (LeB4; Bãumlein H et al, (1991) Mol Gen Genet 225: 121 a 128; Bãumlein et al. (1992) Plant Journal 2 (2): 233 a 239; Fiedler U et al, (1995) Biotechnology (NY) 13 (10): 1090, o promotor da oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980). Outros promotores específicos de semente adequados são aqueles dos genes que codificam a glutenina de peso molecular alto (HMWG), gliadína, enzima de ramificação, ADP glicose pirofosfatase (AGPase) ou amido sintase. Além disso preferidos são os promotores que permitem a expressão específica de semente em monocotilédones tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e outros. Os seguintes podem ser utilizados vantajosamente: o promotor dos genes Ipt2 ou Iptl (W095/15389, WO 95/23230) ou os promotores descritos na WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína, o gene da glutelina, o gene da orizina, o gene da prolamina, o gene da gliadina, o gene da glutelina, o gene da zeína, o gene da casirina ou o gene da secalina).

Os promotores específicos de tubérculo, raiz de armazenagem ou raiz tais como, por exemplo, o promotor da patatina classe I (B33), o promotor inibidor da catepsina D da batata.

Promotores específicos de folha Tais como o promotor FBPase citossólico da batata (WO 97/05900), o promotor de Rubisco (ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase) SSU (subunidade pequena) ou o promotor ST-LSI da batata (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445 a 2451). Muito especialmente preferido são os promotores específicos da epiderme tais como, por exemplo, o promotor do gene OXLP (proteína tipo oxalato oxidase) (Wei et al, (1998) Plant Mol. Biol. 36:101 a 112). Promotores específicos de flor tais como, por exemplo, o promotor da fitoeno sintase (WO 92/16635) ou o promotor do gene P-rr (WO 98/22593).

Promotores específicos de antera tais como o promotor 5126 (US 5,689.049, US 5.689.051), o promotor glob-1 e o promotor γ-zeína. c) Promotores Quimicamente indutíveis Os cassetes de expressão também podem compreender um promotor quimicamente indutível (artigo revisado: Gatz et al (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89 a 108), pelo qual a expressão do gene exógeno na planta em um ponto de tempo particular pode ser controlada. Tais promotores tais como, por exemplo, o promotor PRP1 (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361 a 366), um promotor indutível pelo ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor indutível pela benzenossulfonamida (EP 0 388 186), um promotor indutível pela tetraciclina (Gatz et al, (1992) Plant J 2: 397 a 404), um promotor indutível pelo ácido abscísico (EP 0 335 528) ou um promotor indutível por etanol ou cicloexanona (WO 93/21334) podem ser igualmente usados. d) Promotores indutíveis pelo estresse ou patógeno Outros promotores preferidos são aqueles que são induzidos pelo estresse biótico ou abiótico tal como, por exemplo, o promotor indutível por patógeno do gene PRP1 (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361 a 366), o promotor de hsp70 ou hsp80 indutível por alta temperatura do tomate (US 5.187.267), o promotor da alfa-amilase indutível por alta temperatura da batata (WO 96/12814), o promotor PPDK indutível por luz ou o promotor pinll induzido por ferimento (EP 375091).

Os promotores indutíveis por patógeno abrangem aqueles dos genes que são induzidos como uma conseqüência da infecção por patógenos, tais como, por exemplo, os genes das proteínas PR, proteínas SAR, β-1,3-glicanase, quitinase e outros (por exemplo Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245 a 254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645 a 656; Van Loon (1985) Plant Mol. Virol 4: 111 a 116; Marineau et al., (1987) Plant Mol Biol 9: 335 a 342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325 a 342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83: 2427 a 2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2: 93 a 98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955 a 966; Zhang e Sing (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91: 2507 a 2511; Warner, et al., (1993) Plant J 3:191 a 201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961 a 968 (1989).

Também são abrangidos os promotores indutíveis por ferimento tais como aqueles do gene pinll (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425 a 449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494 a 498), dos genes wunl e wun2 (US 5.428.148), dos genes winl e win2 (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200 a 208), da sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570 a 1573), do gene WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783 a 792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73 a 76), do gene MPI (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 (2): 141 a 150) e outros. e) Promotores dependentes do desenvolvimento Outros promotores adequado são, por exemplo, os promotores específicos de maturação da fruta tais como, por exemplo, o promotor específico da maturação da fruta do tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Os promotores dependentes de desenvolvimento que compreendem parcialmente os promotores específicos de tecido, visto que os tecidos individuais desenvolvem pela natureza em uma maneira dependente do desenvolvimento.

Pode ser vantajosamente que o polipeptídeo da presente invenção seja ativo apenas ou tenha uma atividade aumentada apenas no tecido que é transfectado ou penetrado pelo patógeno aqui mencionado. Especialmente preferido são os promotores constitutivos e específicos de folha e/ou tronco, promotores indutíveis por patógeno e específicos de epiderme com os promotores indutíveis por patógeno e específicos de epiderme sendo os mais preferidos. Também preferido é o promotor natural, que é por exemplo, compreendido no fragmento genômico representado na Seq. ID NO.: 5 e 6.

Além disso, outros promotores podem ser operativamente ligados à seqüência de ácido nucléico a ser expressada, promotores estes que tomam possível a expressão em outros tecidos vegetais ou em outros organismos, tais como, por exemplo, bactérias E. coli. Os promotores vegetais adequados são, em princípio, todos os promotores descritos acima. O termo “sequências de controle genético” deve ser entendido no sentido amplo e refere-se também a todas aquelas seqüências que têm um efeito na materialização ou na função do cassete de expressão de acordo com a invenção. Por exemplo, as seqüências de controle genético modificam a transcrição e tradução em organismos procarióticos ou eucarióticos. Preferivelmente, os cassetes de expressão de acordo com a invenção abrange o promotor com especificidade para a epiderme embriônica e/ou a montante 5’ de flor da seqüência de ácido nucléico em questão a ser recombinantemente expressado, e a jusante 3’ uma seqüência terminadora como seqüência de controle genético adicional e, se apropriado, outros elementos reguladores habituais, em cada caso ligado operativamente à seqüência de ácido nucléico a ser recombinantemente expressada.

As seqüências de controle genético também abrangem ainda promotores, elementos promotores ou promotores mínimos, todos os quais podem modificar as propriedades que controlam a expressão. Assim, por exemplo, a expressão específica de tecido pode adicionalmente depender de certos estímulos que causam estresse, devido às seqüências de controle genético. Tais elementos foram descritos, por exemplo, para o estresse de água, ácido abscísico (Lam E e ChuaNH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131 a 17135) e estresse pelo calor (Schoffl F et al, Molecular & General Genetics 217 (2-3): 246 a 253,1989).

Outras seqüências de controle vantajosas são, por exemplo, os promotores Gram positivos amy e SP02, e os promotores de levedura ou fungicos ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Em princípio, todos os promotores naturais com as suas seqüências reguladoras como aquelas mencionadas acima podem ser usadas para o método de acordo com a invenção. Além disso, os promotores sintéticos também podem ser usados vantajosamente.

As seqüências de controle genético além disso também abrangem as regiões não traduzidas 5’, introns ou a região 3’ não traduzida de genes, tais como, por exemplo, o intron da actina-1, ou os introns de Adhl-S 1, 2, e 6 (referência geral: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, Nova Iorque (1994)). Foi demonstrado que eles podem desempenhar um papel signifícante na regulagem da expressão de gene. Assim, foi demonstrado que as seqüências 5’ não traduzidas podem realçar a expressão transitória de genes heterólogos. Os exemplos de realçadores de tradução que podem ser mencionados são as seqüências líder 5’ do vírus mosáico do tabaco (Gallie et al. (19S7) Nucl Acids Res 15:8693 a 8711) e outros. Além disso, eles podem promover a especificidade de tecido (Rouster J et al, (1998) Plant J 15:435 a 440). O cassete de expressão pode compreender vantajosamente uma ou mais das que são conhecidas como seqüências realçadoras, operativamente ligadas ao promotor, o que toma possível uma expressão recombinante aumentada da seqüência de ácido nucléico. Seqüências vantajosas adicionais, tais como outros elementos ou terminadores regulatórios, também podem ser inseridos na extremidade 3’ da seqüência de ácidos nucléicos a serem expressados recombinantemente. Uma ou mais cópias das seqüências de ácido nucléico a serem recombinantemente expressadas podem estar presentes na construção de gene.

Em uma forma de realização a seqüência terminadora natural compreendida no fragmento genômico representado nas Seq ID Nos.: 5 e/ou 6 é usada.

Sinais de poliadenilação que são adequados como seqüências de controle são sinais de poliadenilação vegetais, preferivelmente aqueles que essencialmente correspondem aos sinais de poliadenilação de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, em particular o gene 3’ do T-DNA (octopina sintase) do plasmídeo Ti, pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J3: 835 et seq.) ou os equivalentes funcionais destes. Os exemplos de seqüências terminadoras que são especialmente adequadas são o terminador da OCS (octopina sintase) e o terminador de NOS (opalina sintase).

As seqüências de controle além disso devem ser entendidas como aquelas que toma possível a recombinação ou inserção homólogas no genoma de um organismo hospedeiro ou que permite a remoção do genoma. No caso de recombinação homóloga, por exemplo o promotor natural de um gene particular pode ser trocado por um promotor com especificidade para a epiderme embrionária e/ou a flor. Os métodos tais como a tecnologia cre/lox permitem uma remoção específica de tecido, se apropriado indutível, do cassete de expressão do genoma do organismo hospedeiro (Sauer B (1998) Methods, 14 (4): 381 a 392). Neste método, as seqüências flanqueadoras específicas (seqüências lox), que mais tarde permitem a remoção por meio da cre recombinase, são ligadas ao gene alvo.

Um cassete de expressão e os vetores derivados dele podem compreender ainda elementos funcionais. O termo elemento funcional deve ser entendido no sentido amplo e refere-se a todos aqueles elementos que têm um efeito sobre a geração, amplificação ou função dos cassetes de expressão, vetores ou organismos transgênicos de acordo com a invenção. Os seguintes podem ser mencionados por via de exemplo, mas não por limitação: a) Os marcadores de seleção que conferem uma resistência a um inibidor do metabolismo tal como 2-desoxiglicose-6-fosfato (WO 98/45456), antibióticos ou biocidas, preferivelmente herbicidas, tais como, por exemplo, canamicina, G 418, bleomicina ou higromicina ou ainda fosfinotricina e outros. Os marcadores de seleção especialmente preferidos são aqueles que conferem resistência a herbicidas. Os exemplos que podem ser mencionados são: seqüências de DNA que codificam as fosfinotricina acetil transferases (PAT) e que inativam os inibidores da glutamina sintase (genes bar e pat), os genes da 5-enolpimvilshiquimato-3-fosfato sintase (genes da EPSP sintase), que conferem resistência ao Glyphosater (N-(fosfonometil) glicina), o gene gox, que codifica as enzimas que degradam o Glyphosater (Glifosato oxidorreductase), o gene deh (que codifica uma desalogenase que inativa dalapon), acetolactato sintases que inativam sulfoniluréia e imidazolinona, e genes bxn, que codificam as enzimas de nitrilase que degradam bromoxinil, o gene aasa, que confere resistência ao antibiótico apectinomicina, o gene da estreptomicina fosfotransferase (SPT), que permite a resistência à estreptomicina, o gene da neomicina fosfotransferase (NPTII), que confere resistência à canamicina ou geneticidina, o gene da higromicina fosfotransferase (HPT), que medeia a resistência à higromicina, o gene da acetolactato sintase (ALS), que confere resistência aos herbicidas de sulfoniluréia (por exemplo variantes de ALS mutadas com, por exemplo, a mutação S4 e/ou Hra). b) Genes repórter que codificam facilmente proteínas quantifícáveis e, por intermédio da sua cor ou atividade enzimática, toma possível uma avaliação da eficácia da transformação, o sítio de expressão ou o tempo de expressão. Muito especialmente preferidos neste contexto são os genes que codificam proteínas repórter (Schenbom E, Groskreutz D. Mol Biotecbnol. 1999; 13(1): 29 a 44) tais como a proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777 a 784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94 (6): 2122 a 2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12): 5888 a 5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267 a 271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325 a 330; Leffel SM etal. (1997) Biothecniques. 23 (5): 912 a 918), cloranfenicol transferase, uma luciferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856 a 859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324 a 414), o gene da aequorina (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259 a 1268), galactosidase, gene do local R (que codifica uma proteína que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecido vegetal e assim toma possível a análise direta da atividade do promotor sem a adição de outras substâncias auxiliares ou substratos cromogênicos; Dellaporta et al Em: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263 a 282,1988), com a β-glucuronidase sendo muito especialmente preferido (Jefferson et al, EMBO J. 1987,6,3901 a 3907). c) Origens de replicação, que garantem a amplificação dos cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, por exemplo, na E. coli. Os exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicação do DNA), o ori pBR322 ou o ori PI5A (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). d) Elementos que são necessários para a transformação vegetal mediada por Agrobacterium, tal como, por exemplo, a borda direita ou esquerda do T-DNA ou a região vir.

Para selecionar células que têm passdo com sucesso pia recombinação homóloga ou ainda para selecionar células transformadas, é, como uma regra, necessário introduzir adicionalmente um marcador selecionável, que confira resistência a um biocida (por exemplo herbicida), um inibidor do metabolismo tal como 2-desoxiglicose-6-fosfato (WO 98/45456) ou um antibiótico às células que passaram com sucesso pia recombinação. O marcador de seleção permite que a seleção das células transformadas a partir daquelas não transformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81a 84). A introdução de um cassete de expressão de acordo com a invenção em um organismo ou células, tecidos, órgãos, partes ou sementes deste (preferivelmente em plantas ou células, tecido, órgãos, partes vegetais ou sementes) pode ser efetuada vantajosamente usando vetores que compreendam os cassetes de expressão. O cassete de expressão pode ser introduzido no vetor (por exemplo um plasmídeo) por intermédio de um sítio de divagem de restrição adequado. O plasmídeo formado é primeiro introduzido na E. coli. As E. coli corretamente transformadas são selecionadas, cultivadas, e o plasmídeo recombinante é obtido pelos métodos familiares ao técnico habilitado. A análise de restrição e o seqüênciamento podem servir para verificar a etapa de clonagem.

Outros promotores para a expressão em partes de planta específicas são por exemplo, o promotor do gene napin da semente de colza (US 5608152), o promotor USP da Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991,225 (3): 459 a 467), o promotor da oleosina de Arabidopsis (WO 9845461), o promotor da faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5504200), o promotor Bce4 de Brassica (WO 9113980) ou o promotor da legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233 a 239) assim como promotores que conferem a expressão específica de semente em plantas monocot como milho, cevada, trigo, centeio, arroz etc. Os promotores adequados para menção são o promotor do gene Ipt2 ou Iptl da cevada (WO 9515389 e WO 9523230) ou aqueles descritos na WO 9916890 (promotores do gene da hordeína da cevada, o gene da glutelina do arroz, o gene da orizina do arroz, o gene da prolamina do arroz, o gene da gliadina do trigo, o gene da glutelina do trigo, o gene da zeína do milho, o gene da glutelina da aveia, o gene da casirina do sorgo, o gene da secalina do centeio).

Além disso, o polinucleotídeo da invenção pode ser clonado no vetor de expressão em uma orientação anti-sentido. Isto é, a molécula de DNA é operativamente ligada a uma seqüência reguladora em uma maneira que permite a expressão (pela transcrição da molécula de DNA) de uma molécula de RNA que é anti-sentido ao mRNA codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção. As seqüências reguladoras operativamente ligadas a um ácido nucléico clonado na orientação de anti-sentido podem ser escolhidas de modo que direcione a expressão contínua da molécula de RNA de anti-sentido em uma variedade de tipos de célula, por exemplo, promotores e/ou realçadores virais ou seqüências reguladoras pode ser escolhidas de modo que direcionem a expressão constitutiva, específica de tecido ou específica do tipo de célula de RNA de anti-sentido. O vetor de expressão de anti-sentido pode estar na forma de um plasmídeo recombinante, fagomídeo ou vírus atenuado em que as moléculas de ácido nucléico de anti-sentido são produzidas sob o controle de uma região reguladora de alta eficiência, a atividade da qual pode ser determinada pelo tipo de célula na qual o vetor é introduzido. Para um debate da regulagem da expressão de gene usando genes de anti-sentido ver Weintraub, H. et ai, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol, 1(1) 1986 e Mol et al., 1990, FEBS Letters 268:427 a 430.

Em uma forma de realização a presente invenção diz respeito a um método de fabricar uma célula hospedeira recombinante que compreende introduzir o vetor ou o polinucleotídeo da presente invenção ou o dito vetor ou o dito polinucleotídeo e um vetor para expressar uma outra proteína de resistência em uma célula hospedeira. O DNA vetorial pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por intermédio das técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Como aqui usado, os termos “transformação” e “transfecção”, conjugação e transdução são intencionados a se referir a uma variedade de técnicas reconhecidas no ramo para a introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo a co-precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada com DEAE-dextrano, lipofecção, competência natural, transferência mediada por produto químico ou eletroporação. Os métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras que incluem célula vegetais podem ser encontrados em Sarabrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros manuais de laboratório tais como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Garland e Davey, Humana Press, Totowa, Nova Jérsei.

Para a transfecção estável de células eucarióticas, é conhecido que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usados, apenas uma pequena fração de células podem integrar o DNA estranho no seu genoma. De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é no geral introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a medicamentos, tais como G418, higroimcina, e metotrexato ou em plantas que conferem resistência voltada a um herbicida tal como glifosato ou glifosinato. O ácido nucléico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no mesmo vetor como aquele que codifica o polipeptídeo da presente invenção ou pode ser introduzido em um vetor separado. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido pode ser identificado, por exemplo, pela seleção de medicamento (por exemplo, células que têm incorporadas o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrerão).

Outras células hospedeiras podem ser produzidas de modo que contenham sistemas de seleção que permitam a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, a inclusão do polinucleotídeo da invenção em um vetor colocando-o sob o controle o operon lac permite a expressão do polinucleotídeo apenas na presença de PTG. Tais sistemas reguladores são bem conhecidos na técnica.

Preferivelmente, a molécula de ácido nucléico introduzida é estranha à célula hospedeira.

Por “estranho” é intencionado que a molécula de ácido nucléico seja heteróloga com respeito à célula hospedeira, isto significa derivado de uma célula ou organismo com um fundo genômico diferente ou seja homóloga com respeito à célula hospedeira mas localizada em um ambiente genômico diferente do que a contraparte que ocorre naturalmente da dita molécula de ácido nucléico. Isto significa que, se a molécula de ácido nucléico é homóloga com respeito à célula hospedeira, está não está localizada no seu local natural no genoma da dita célula hospedeira, em particular ela é circundada por genes diferentes. Neste caso a molécula de ácido nucléico pode estar sob o controle do seu próprio promotor ou sob o controle de um promotor heterólogo. O vetor ou molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção que está presente na célula hospedeira pode estar integrado no genome da célula hospedeira ou pode ser mantido em alguma forma extracromossomicamente. A este respeito, também deve ser entendido que a molécula de ácido nucléico da invenção pode ser usada para restaurar ou criar um gene mutante por intermédio da recombinação homóloga (Paszkowski (ed.), Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)).

Consequentemente, em uma outra forma de realização a presente invenção diz respeito a um célula hospedeira geneticamente engenheirada com o polinucleotídeo da invenção ou o vetor da invenção ou o dito vetor ou o dito polinucleotídeo e um vetor ou um polinucleotídeo para expressar uma outra proteína de resistência.

Os termos “célula hospedeira” e “célula hospedeira recombinante” são usados aqui intercambiavelmente. É entendido que tais termosnão se referem apenas à célula objeto particular mas também à progênie ou progênie potencial de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer nas generações que se sucedem devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célula precursora, mas ainda estão incluídas dentro do escopo do termo como aqui usado.

Por exemplo, um polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzido nas células bacterianas, células de inseto, células fungicas ou células mamíferas (tais como as células do ovário do hamster chinês (CHO) ou células COS), algas, ciliados, células vegetais ou fungos. As células hospedeiras adequadas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Preferidas são as células de E. coli, baculovírus, Agrobacterium ou vegetais.

Além disso, a célula hospedeira também pode ser transformada tal que outras enzimas e proteínas sejam (super) expressadas, expressão esta que sustente um aumento de resistência de uma planta aos patógenos. Preferivelmente, um outro gene de resistência também é expressado, preferivelmente um ou mais genes de resistência, preferivelmente os genes como aqui mencionados, é/são também expressados. O mais preferido é uma co-expressão de Rpi-blb2 e Rpi-blb.

Ainda preferidas são as células de uma das plantas aqui mencionadas, em particular, de uma das Solanaceae mencionadas acima, as mais preferidas são batata, tomate, petúnia, tree tomato, melão pêra ou beringela.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um processo para a produção do polipeptídeo da presente invenção, em particular de uma proteína tendo atividade de Rpi-blb2 que compreende cultivar a célula hospedeira da invenção e recuperar o polipeptídeo codificado pelo dito polinucleotídeo e expressado pela célula hospedeira a partir da cultura ou das células. O termo “expressão” significa a produção de uma proteína ou sequência de nucleotídeo na célula. Entretanto, o dito termo também inclui a expressão da proteína em uma sistema isento de célula. Este inclui a transcrição em um produto de RNA, modificação e/ou tradução pós-transcricional a um produto de proteína ou polipeptídeo de um DNA que codifica este produto, assim como as modificações pós translacionais.

Dependendo das construções e condições específicas usadas, a proteína pode ser recuperada a partir das células, do meio de cultura ou de ambos. Para a pessoa habilitada na técnica é bem conhecido que não é apenas possível expressar uma proteína nativa mas também expressar a proteína como polipeptídeos de fusão ou adicionar seqüências de sinal que direcionam a proteína aos compartimentos específicos da célula hospedeira, por exemplo, garantir a secreção da proteína no meio de cultura, etc. Além disso, uma tal proteína e fragmentos desta podem ser quimicamente sintetizada e/ou modificada de acordo com métodos padrão descritos, por exemplo aqui abaixo.

Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucaríótica em cultura, pode ser usada para produzir (isto é, expressar) o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo da invenção, preferivelmente um polipeptídeo tendo atividade de Rpi-blb2. Um método alternativo pode ser aplicado em adição nas plantas pela transferência direta de DNA nas flores em desenvolvimento por intermédio da eletroporação ou transferência de gene mediada por Agrobacíerium. Consequentemente, a invenção ainda fornece métodos para produzir Rpi-blb2 usando as células hospedeiras da invenção. Em uma forma de realização, o método compreende cultivar a célula hospedeira da invenção em um meio adequado tal que o polipeptídeo da presente invenção seja produzido. Além disso, o método compreende isolar e/ou recuperar o dito polipeptídeo do meio ou da célula hospedeira. O polipeptídeo da presente invenção é preferivelmente produzida pelas técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteína é clonada em um vetor de expressão (como descrito acima), o vetor de expressão é introduzido em uma célula hospedeira (como descrito acima) e o dito polipeptídeo é expressado na célula hospedeira. O dito polipeptídeo pode ser depois isolado das células por um esquema de purificação apropriado usando as técnicas de purificação de proteína padrão. Alternativo à expressão recombinante, o polipeptídeo ou peptídeo da presente invenção podem ser sintetizados quimicamente usando as técnicas de síntese de peptídeo padrão.

Além disso, a Rpi-blb2 nativa pode ser isolada das células (por exemplo, células endoteliais), por exemplo usando o anticorpo da presente invenção como descrito abaixo, em particular, um anticorpo anti-Rpi-blb2, que pode ser produzido pelas técnicas padrão, utilizando o polipeptídeo da presente > invenção ou fragmento deste, isto é, o polipeptídeo desta invenção.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma proteína Rpi-blb2 ou uma proteína tendo atividade de Rpi-blb2.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido codificada por um > polinucleotídeo da invenção ou obtenível por um processo da invenção.

Em uma forma de realização o polipeptídeo da não consiste da sequência representada nas Seq. ID NOs.: 8 e/ou 10 e/ou não consiste da seqüência codificada por uma molécula de ácido nucléico representada nas Seq. ID NOs.: 7 e/ou 9.

Em uma forma de realização, o polipeptídeo da presente invenção não consiste da seqüência da proteína Mi 1.1 ou Mi 1.2 e/ou de uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína Mil.1 ouMil.2.

Assim, em uma forma de realização, o polipeptídeo da presente invenção pode não consistir das seqüências mostradas em Rossi et al. 1998, PNAS USA 95: 9750 a 9754, Milligan et al, 1998. Plant Ceil 10: 1307 a 1319; e/ou WO 9806750.

Os termos “proteína” e “polipeptídeo” usados neste pedido são intercambiáveis, “Polipeptídeo” refere-se a um polímero de aminoácidos (seqüência de aminoácido) e não se refere a um comprimento específico da molécula. Assim peptídeos e oligopeptídeos são incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Este termo também se refere a ou inclui modificações pós translacionais do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e outros. Incluídos dentro da definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), polipeptídeos com ligações substituídas, assim como outras modificações conhecidas na técnica, tanto as que ocorrem naturalmente quanto as que não ocorrem naturalmente.

Preferivelmente, o polipeptídeo é isolado. Uma proteína “isolada” ou “purificada” ou porção biologicamente ativa desta é substancialmente livre de material celular quando produzida pelas técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizada. A linguagem “substancialmente livre de material celular” inclui preparações do polipeptídeo da invenção em que a proteína é separada de componentes celulares das células nas quais ela é natural ou recombinantemente produzido. Em uma forma de realização, a linguagem “substancialmente livre de material celular” inclui preparações tendo menos do que cerca de 30 % (em peso seco) da “proteína contaminante”, mais preferivelmente menos do que cerca de 20 % da “proteína contaminante”, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10 % da “proteína contaminante”, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5 % “da proteína contaminante”. O termo “proteína contaminante” diz respeito a polipeptídeos que não são polipeptídeos da presente invenção. Quando o polipeptídeo da presente invenção ou porção biologicamente ativa deste são recombinantemente produzidos, também é preferível e substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20 %, mais preferivelmente menos do que cerca de 10 %, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5 % do volume da preparação de proteína. A linguagem “substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos” inclui preparações em que o objeto da presente invenção, por exemplo, o polipeptídeo da presente invenção, é separado de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. A linguagem “substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos” inclui preparações tendo menos do que cerca de 30 % (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos que não Rpi-blb2, mais preferivelmente menos do que cerca de 20 % de precursores químicos ou produtos químicos que não Rpi-blb2, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10 % de precursores químicos ou produtos químicos que não Rpi-blb2, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5 % de precursores químicos ou produtos químicos que não Rpi-blb2. Em formas de realização preferidas, as proteínas isoladas ou porções biologicamente ativas destas carecem de contaminantes de proteína do mesmo organismo a partir do qual o polipeptídeo da presente invenção é derivado. Tipicamente, tais proteínas são produzidas pelas técnicas de DNA recombinante.

Um polipeptídeo da invenção que pode participar no polipeptídeo ou porção deste compreende preferivelmente uma seqüência de aminoácido que é suficientemente homóloga a uma seqüência de aminoácido das SEQ ID Nos: 2 ou 4 tal que a proteína ou porção desta mantenham a capacidade para conferir a resistência da presente invenção. A porção da proteína é preferivelmente uma porção biologicamente ativa como aqui descrito. Preferivelmente, o polipeptídeo da invenção tem uma seqüência de aminoácido idêntica como a mostrada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4. Além disso, o polipeptídeo pode ter uma seqüência de aminoácido que é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente hibridiza sob condições severas como descrito acima, a uma seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo da presente invenção. Consequentemente, o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido que é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que é pelo menos de cerca de 70 % preferivelmente pelo menos de cerca de 75 %, mais preferivelmente pelo menos de cerca de 80 %, 90 %, 95 %, e ainda mais preferivelmente pelo menos de cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais homólogas a uma das seqüências de aminoácido das SEQ ID Nos: 2 ou 4. O polipeptídeo preferido da presente invenção preferivelmente possui pelo menos uma das atividades da proteína Rpi-blb2 aqui descrita, por exemplo, a sua resistência ou atividades imunológicas. Um polipeptídeo preferido da presente invenção inclui uma sequência de aminoácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza, preferivelmente hibridiza sob condições severas, a uma seqüência de nucleotídeo das SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6 ou que seja homóloga a estas, como definido acima.

Consequentemente o polipeptídeo da presente invenção pode variar das SEQ ID Nos: 2 ou 4 na seqüência de aminoácido devido à variação natural ou mutagênese, como aqui descrito em detalhes. Consequentemente, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos de cerca de 70 %, preferivelmente pelo menos de cerca de 75 %, e mais preferivelmente pelo menos de cerca de 80, 90, 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos de cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais homólogas a uma seqüência de aminoácido inteira das SEQ ID Nos: 1 ou 3 ou 5 ou 6.

As porções biologicamente ativas de um polipeptídeo da presente invenção incluem peptídeos que compreendem as seqüências de aminoácido derivadas da seqüência de aminoácido de uma proteína Rpi-blb2, por exemplo, a seqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2 ou 4 ou a seqüência de aminoácido de uma proteína homóloga a esta, que incluem menos aminoácidos do que uma proteína de tamanho natural Rpi-blb2 ou a proteína de tamanho natural que é homóloga a uma proteína Rpi-blb2 aqui representada e exibe pelo menos uma atividade de proteína Rpi-blb2. Tipicamente, as porções biologicamente (ou imunologicamente) ativas isto é, peptídeos, por exemplo, peptídeos que têm, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos no comprimento para compreender um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade ou epítopo de uma proteína Rpi-blb2. Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões do polipeptídeo são deletadas, podem ser preparadas pelas técnicas recombinantes e avaliadas quanto a uma ou mais das atividades aqui descritas. A manipulação do polinucleotídeo Rpi-blb2 da invenção pode resultar na produção de Rpi-blb2 tendo diferenças funcionais da proteína Rpi-blb2 do tipo selvagem. Estas proteínas podem ser melhoradas em eficiência ou atividade, podem estar presentes em números maiores na célula do que é usual ou podem ser diminuídas em eficiência ou atividade.

Quaisquer estratégias de mutagênese para Rpi-blb2 para resultar no aumento da dita resistência ou uma resistência a uma outra espécie de patógeno vegetal ou uma outra cepa de uma espécie de patógeno vegetal acima mencionado, do dito composto não são intencionados a serem limitantes; variações nestas estratégias estarão facilmente evidentes a uma pessoa habilitada na técnica. Usando tais estratégias, e incorporando os mecanismos aqui divulgados, o polinucleotídeo e polipeptídeo da invenção podem ser utilizados para gerar plantas ou partes destas, que expressam as moléculas de polinucleotídeo e proteína de Rpi-blb2 do tipo selvagem ou Rpi-blb2 mutada tal que o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de um composto desejado sejam melhorados. Este composto desejado pode ser qualquer produto natural de plantas, que inclui os produtos finais dos caminhos de biossíntese e intermediários dos caminhos metabólicos que ocorrem naturalmente, assim como moléculas que não ocorrem naturalmente no metabolismo das ditas células, mas que são produzidas por uma dita célula da invenção. A invenção também fornece proteínas quiméricas ou de fusão.

Como aqui usado, uma “proteína quimérica” ou “proteína de fusão” compreende um polipeptídeo operativamente ligado a um polipeptídeo que não Rpi-blb2.

Um “polipeptídeo Rpi-blb2” refere-se a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que corresponde ao polipeptídeo tendo uma atividade de Rpi-blb2, ao passo que um “polipeptídeo que não Rpi-blb2” refere-se a um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que corresponde a uma proteína que não é substancialmente homóloga à Rpi-blb2, por exemplo, uma proteína que não confere a resistência aqui descrita, em particular não confere resistência ao P. infestans e que é derivado do mesmo ou de um organismo diferente. Dentro da proteína de fusão, o termo “operativamente ligado” é intencionado a indicar que o polipeptídeo Rpi-blb2 e o polipeptídeo que não Rpi-blb2 são fundidos entre si de modo que ambas as seqüências desempenham a função proposta acrescida à seqüência usada. O polipeptídeo que não Rpi-blb2 pode estar fundido ao término N ou término C do polipeptídeo Rpi-blb2. Por exemplo, em uma forma de realização a proteína de fusão é uma proteína de fusão GST-LMRP na qual as seqüências de Rpi-blb2 estão fundidas ao término C das seqüências de GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de Rpi-blb2 recombinante. Em uma outra forma de realização, a proteína de fusão é uma Rpi-blb2 contendo uma seqüência de sinal heterólogo no seu terminal N. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras mamíferas), a expressão e/ou secreção de uma Rpi-bib2 pode ser aumentada através do uso de uma seqüência de sinal heteróloga.

Preferivelmente, uma proteína quimérica ou de fusão de Rpi-bib2 da invenção é produzida pelas técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo, os fragmentos de DNA que codificam as seqüências de polipeptídeo diferentes são ligadas juntas na matriz de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, pela utilização de términos de extremidade abrupta ou extremidade escalonada para a ligação, digestão com enzima de restrição para fornecer os términos apropriados, cheios de extremidades coesivas como apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar a união indesejável e ligação enzimática. O gene de fusão pode ser sintetizado pelas técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Altemativamente, a amplificação pela PCR de fragmentos de gene podem ser realizados usando iniciadores âncora que dão origem às projeções complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subseqüentemente recozidos e reamplifieados para gerar a seqüência de gene quimérico (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et αί, John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão são comercialmente disponíveis de modo que já codifiquem a porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). O polinucleotídeo da invenção pode ser clonado em um tal vetor de expressão tal que a porção de fusão seja ligada na matriz à proteína codificada.

Além disso, simulações de dobra e reprojeto de computador de motivos estruturais da proteína da invenção podem ser realizadas usando programas de computador apropriados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286 a 299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675 a 679). A modelagem por computador de dobra de proteína pode ser usada para a análise conformacional e energética de modelos de peptídeo e proteína detalhados (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995 a 1012; Renouf, Adv. Exp. Med, Biol. 376 (1995), 37 a 45). Em particular, programas apropriados podem ser usados para a identificação de sítios interativos de ciplina mitogênica and seu receptor, seu ligando ou outras proteínas influenciadoras pelas pesquisas auxiliadas pelo computador quanto a sequências de peptídeo complementares (Fassina, Immunomethods (1994), 114 a 120. Outros sistemas de computador apropriados para o planejamento de proteína and peptídeos são descritos na técnica anterior, por exemplo, em Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033 a 1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sei. 501 (1987), 1 a 13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987 a 5991, Os resultados obtidos a partir da análise de computador descrita acima podem ser usados, por exemplo, para a preparação de peptidomiméticos da proteína da invenção ou de fragmentos desta. Tais análogos de pseudopeptídeos da seqüência de aminoácido natural ! da proteína podem imitar muito eficíentemente a proteína pecursora (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218 a 33224). Por exemplo, a incorporação de resíduos de aminoácido Q aquirais facilmente disponíveis em uma proteína da invenção ou um fragmento desta resulta na substituição de ligações de amida pelas unidades de polimetileno de uma cadeia alifática, i fornecendo deste modo uma estratégia conveniente para construir um peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769 a 777).

Os análogos peptidomiméticos superativos de hormônios peptídicos pequenos em outros sistemas são descritos na técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327 a 331). Os peptidomiméticos apropriados da proteína da presente invenção também podem ser identificados pela síntese de bibliotecas combinatórias peptidomimética através da alquilação da amida sucessiva e testando os compostos resultantes, por exemplo, quanto a sua ligação e propriedades imunológicas. Os métodos para a geração e uso de bibliotecas combinatórias peptidomiméticas estão descritos na técnica anterior, por exemplo, em Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220 a 234 e Domer, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709 a 715.

Além disso, uma estrutura tri-dimensional e/ou cristalográfica da proteína da invenção pode ser usada para o planejamento de inibidores peptidomiméticos da atividade biológica da proteína da invenção (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933 a 12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545 a 1558).

Em uma outra fonma de realização, a presente invenção diz respeito a um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo da presente invenção ou partes, isto é, fragmentos ou epítopos específicos de uma tal proteína.

Os anticorpos da invenção podem ser usados para identificar e isolar Rpi-blb2 e genes em qualquer organismo, preferivelmente plantas, preparados em plantas aqui descritas. Estes anticorpos podem ser anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais ou anticorpos sintéticos assim como fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab, Fv ou scFv, etc. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados, por exemplo, pelas técnicas como originalmente descritas em Kõhler e Milstein, Nature 256 (1975), 495, e Galfró, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, que compreendem a fusão de células de mieloma de camundongo às células de baço derivadas de mamíferos imunizados, Além disso, os anticorpos ou fragmentos destes para os peptídeos anteriormeníe mencionados podem ser obtidos pelo uso de métodos que são descritos, por exemplo, em Harlow e Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estes anticorpos podem ser usados, por exemplo, para a imunoprecipitação e imunolocalização de proteínas de acordo com a invenção assim como para o monitoramento da síntese de tais proteínas, por exemplo, em organismos recombinantes, e para a identificação de compostos que interagem com a proteína de acordo com a invenção. Por exemplo, ressonância de plasma de superfície como utilizado no sistema BIAcore pode ser usado para aumentar a eficiência das seleções de anticorpos de fago, produzindo um alto incremento de afinidade a partir de uma única biblioteca de anticorpos de fago que se ligam a um epítopo da proteína da invenção (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97 a 105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7 a 13). Em muitos casos, o fenômeno de ligação de anticorpos aos antígenos é equivalente a outra ligação de ligando/anti-ligando.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucléico de anti-sentido que compreende a seqüência complementar do polipeptídeo da presente invenção.

Os métodos para modificar os níveis de expressão e/ou a atividade são conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica e incluem por exemplo, a super expressão, co-supressão, o uso de ribozimas, estratégias de sentido e anti-sentido, métodos de silenciamento de gene. “Filamento de sentido” refere-se ao filamento de uma molécula de DNA de filamento duplo que é homóloga a um transcrito de mRNA desta. O “filamento de anti-sentido” contém uma seqüência invertida que é complementar àquela do “filamento de sentido”.

Uma molécula de ácido nucléico de “anti-sentido” compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucléico de “sentido” que codifica uma proteína, por exemplo, complementar ao filamento codificador de uma molécula de cDNA de filamento duplo ou complementar a uma seqüência de mRNA. Consequentemente, uma molécula de ácido nucléico de anti-sentido pode ligar hidrogênio a uma molécula de ácido nucléico de sentido. A molécula de ácido nucléico de anti-sentido pode ser complementar a um filamento codificador de Rpi-blb2 inteiro ou apenas a uma porção deste. Consequentemente, uma molécula de ácido nucléico de anti-sentido pode ser de anti-sentido a uma “região codificadora” do filamento codificador de uma seqüência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “região codificadora” refere-se à região da seqüência de nucleotídeo que compreende códons que são traduzidos em resíduos de aminoácido. Além disso, a molécula de ácido nucléico de anti-sentido é de anti-sentido a uma “região não codificadora” do filamento codificador de uma seqüência de nucleotídeo que codifica Rpi-blb2. O termo “região não codificadora” refere-se às seqüências 5’ e 3’ que flanqueiam a região codificadora que não são traduzidas em um polipeptídeo, isto é, também aludida como regiões não traduzidas 5’ e 3’ (5'-UTR ou 3’-UTR).

Dadas as seqüências de filamento codificador que codificam Rpi-blb2 aqui divulgada, as moléculas de ácido nucléico de anti-sentido da invenção podem ser planejadas de acordo com as regras de emparelhamento de base de Watson e Crick. A molécula de ácido nucléico de anti-sentido pode ser complementar à região codificadora inteira do mRNA de Rpi-blb2, mas também pode ser um oligonucleotídeo que seja de anti-sentido a apenas uma porção da região codificadora ou não codificadora do mRNA de Rpi-blb2. Por exemplo, o oligonucleotídeo de anti-sentido pode ser complementar à região que circunda o sítio de início de tradução do mRNA de Rpi-blb2. Um oligonucleotídeo de anti-sentido pode ter, por exemplo, cerca de 5,10,15,20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleotídeos no comprimento. Uma molécula de ácido nucléico de anti-sentido da invenção pode ser construída usando a síntese química e reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico de anti-sentido (por exemplo, um oligonucleotídeo de anti-sentido) pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos que ocorrem naturalmente ou nucleotídeos variadamente modificados planejados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado entre os ácidos nucléicos de anti-sentido e de sentido, por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos por acridina podem ser usados. Os exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar o ácido nucléico de anti-sentido incluem 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxiidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-D- manosilqueosina, 5,-metoxicarboxi-metiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), vibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tíouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, éster metílico do ácido uracü-5-oxiacético, ácido urac.il-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracila, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina. Altemativamente, o ácido nucléico de anti-sentido pode ser produzido biologicamente usando um vetor de expressão em que um polinucieotídeo foi subclonado em uma orientação de anti-sentido (isto é, RNA transcrito a partir do polinucieotídeo inserido será de uma orientação de anti-sentido a um polinucieotídeo alvo de interesse, descrito ainda na seguinte sub-seção).

As moléculas de ácido nucléico de anti-sentido da invenção são tipicamente administradas a uma célula ou geradas in siíu tal que elas hibridizam ou se ligam ao mRNA celular e/ou DNA genômico que codifica um Rpi-blb2 para inibir a expressão da proteína, por exemplo, pela inibição da transcrição e/ou tradução. A hibridização pode ser pela complementaridade de nucleotídeo convencional para formar um duplex estável, ou, por exemplo, no caso de uma molécula de ácido nucléico de anti-sentido que se liga aos duplexes de DNA, através de interações específicas na ranhura principal da hélice dupla. A molécula de anti-sentido pode ser modificada tal que ela especificamente se ligue a um receptor ou um antígeno expressado em uma superfície de célula selecionada, por exemplo, pela ligação da molécula de ácido nucléico de anti-sentido a um peptídeo ou um anticorpo que se liga a um receptor ou antígeno de superfície celular. A molécula de ácido nucléico de anti-sentido também pode ser liberado às células usando os vetores aqui descritos. Para obter concentrações intracelulares suficientes das moléculas de anti-sentido, as construções de vetor em que a molécula de ácido nucléico de anti-sentido é colocada sob o controle de um promotor vegetal procariótico, viral ou eucariótico forte incluindo promotores vegetais são preferidas.

Em uma outra forma de realização, a molécula de ácido nucléico de anti-sentido da invenção pode ser uma molécula de ácido nucléico anomérica. Um molécula de ácido nucléico α-anomérica forma híbridos de filamento duplo específicos com RNA complementar em que, contrário às unidades usuais, os filamentos correm em paralelo entre si (Gaultier et al (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625 a 6641). A molécula de ácido nucléico de anti-sentido também pode compreender um 2 ’-o-metilribonucleotídeo (Inoue et al (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131 a 6148) ou um análogo de RNA-DNA quimérico (Inoue et al (1987) FEBS Lett. 215:327 a 330).

Além disso, a molécula de ácido nucléico de anti-sentido da invenção pode ser uma ribozima. As ribozimas são moléculas de RNA catalíticas com atividade de ribonuclease que são capazes de clivar um ácido nucléico de filamento único, tal como um mRNA, ao qual eles têm uma região complementar. Assim, as ribozimas (por exemplo, as ribozimas cabeça de martelo (descritas em Haselhoff e Gerlach (1988) Nature 334: 585 a 591)) podem ser usadas para clivar catalíticamente transcritos de mRNA de Rpi-blb2 para inibir deste modo a tradução de mRNA. Uma ribozima tendo especificidade para uma molécula de ácido nucléico que codifica Rpi-blb2 pode ser planejada com base na seqüência de nucleotídeo de um cDNA de Rpi-blb2 aqui divulgado ou com base de uma seqüência heteróloga a ser isolada de acordo com os métodos divulgados nesta invenção.

Por exemplo, um derivado de um RNA de L-19 IVS de Tetraimena pode ser construído em que a seqüência de nucleotídeo do sítio ativo é complementar à seqüência de nucleotídeo a ser clivado em um mRNA codificador. Ver, por exemplo, Cech et al Patente U. S. Na 4.987.071 e Cech et al Patente U. S. Na 5.116.742. Alternativamente, mRNA de Rpi-blb2 pode ser usado para selecionar um RNA catalítico tendo uma atividade de ribonuclease específica de um agrupamento de moléculas de RNA. Ver, por exemplo, Bartel, D. e Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411 a 1418. A molécula de anti-sentido da presente invenção compreende também um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo complementar à região reguladora de uma seqüência de nucleotídeo de Rpi-blb2, por exemplo, o seu promotor e/ou realçadores, por exemplo, para formar : estruturas helicoidais triplas que impedem a transcrição do gene em células alvo. Ver no geral, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6): 569 a 584; Helene, C. et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660: 27 a 36; e Maher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12): 807 a 815.

Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de plantas transgênicas, células vegetais ou tecido vegetal que compreende a introdução do polinucleotídeo ou do vetor da presente invenção no genoma da dita planta, tecido vegetal ou célula vegetal. Em uma forma de realização preferida, o dito vetor ou o dito polinucleotídeo e um vetor ou um polinucleotídeo para a expressão de um outro gene de resistência, em particular para Rpi-blb, também é introduzido no genoma da dita planta, tecido vegetal ou célula vegetal, antes, depois ou junto.

Para a expressão das moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção na orientação de sentido ou anti-sentido em células vegetais, as moléculas são colocadas sob o controle de elementos reguladores que garantem a expressão em células vegetais. Estes elementos reguladores podem ser heterólogos ou homólogos com respeito à molécula de ácido nucléico a ser expressada também com respeito à espécie vegetal a ser transformada e são descritos acima em detalhes.

No geral, tais elementos reguladores compreendem um promotor ativo em células vegetais. Para obter a expressão em todos os tecidos de uma planta transgênica, por exemplo, promotores constitutivos são usados, tais como o promotor 35S da CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810 a 812) ou promotores dos genes da poliubiquitina do milho (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675 a 689). De modo a obter a expressão em tecidos específicos de uma planta transgênica é possível usar promotores específicos de tecido (ver, por exemplo, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245 a 2251). Conhecidos também são os promotores que são especificamente ativos em tubérculos de batatas ou em sementes de diferentes espécies de plantas, tais como milho, Vicia, trigo, cevada etc. Promotores indutíveis podem ser usados de modo a serem capazes de controlar exatamente a expressão. Os promotores indutíveis compreendem também promotores, que são induzidos pelas infecções de plantas. Outras formas de realização são descritas acima.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de uma planta ou uma parte desta resistente a um patógeno do filo Oomyceta que compreende as etapas: expressar na planta ou em uma parte desta o polipeptídeo da presente invenção e uma outra proteína de resistência.

Consequentemente em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito à planta transgênica ou tecido vegetal da invenção ou produzido de acordo com o método da invenção, que na presença do polinucleotídeo ou do vetor é resistente ao dito patógeno. A geração de um organismo transformado (ou de uma célula ou tecido transformados) requer introduzir o DNA, RNA ou proteína em questão na célula hospedeira relevante. Uma multiplicidade de métodos estão disponíveis para este procedimento, que é chamado de transformação (ou transdução ou transfecção) (Keown et al., (1990) Methods in Enzymology 185: 527 a 537). Por exemplo, o DNA ou RNA podem ser introduzidos diretamente pela microinjeção ou pelo bombardeio com micropartículas revestidas com DNA. Também, a célula pode ser permeabilizada quimicamente, por exemplo usando polietileno glicol, de modo que o DNA possa entrar na célula por difusão. O DNA também pode ser introduzido pela fusão de protoplasto com outras unidades contendo DNA tais como minicélulas, células, lisossomas ou lipossomas. Um outro método adequado de introduzir o DNA é a eletroporação, onde as células são permeabilizadas reversivelmente por um pulso elétrico. Os métodos adequados foram descritos (por exemplo por Bilang et al (1991) Gene 100: 247 a 250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104 a 112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111 a 116; Neuhause et al (1987) Theor Appl Genet 75: 30 a 36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70 a 73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al (1985) Science 227: 1229 a 1231; DeBlock et al (1989) Plant Physiology 91: 694 a 701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielmski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

Em plantas, os métodos descritos acima de transformar e regenerar plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais são exploradas quanto a transformação transitória ou estável. Os métodos adequados são especialmente a transformação de protoplasto pela captação de DNA induzido por polietileno glicol, o método balístico com a pistola de gene, que é conhecido como o método do bombardeamento de partícula, eletroporação, incubação de embriões secos na solução contendo DNA e microinjeção.

Além destas técnicas de transformação “direta”, a transformação também pode ser efetuada pela infecção bacteriana por meios de Agrobacterium tamefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. A transformação mediada por Agrobacterium é melhor adaptado às células vegetais dicotiledôneas. Os métodos são descritos, por exemplo, por Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f.

Quando agrobactérias são usadas, o cassete de expressão deve ser integrado em plasmídeos específicos, em um vetor de transporte ou intermediário ou em um vetor binário. Se um plasmídeo Ti ou Ri deva ser usado para a transformação, pelo menos a borda direita, mas na maioria dos casos a borda direita e esquerda, do T-DNA de plasmídeo Ti ou Ri é ligada ao cassete de expressão a ser introduzido na forma de uma região flanqueadora.

Os vetores binários são preferivelmente usados. Os vetores binários são capazes de replicação tanto na E. coli quanto na Ágrobacterium. Como uma regra, eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligador ou poliligador flanqueado pela seqüência da borda direita e esquerda de T-DNA. Eles podem ser diretamente transferidos em Ágrobacterium (Holsters et al (1978) Mol Gen Genet 163: 181 a 187). O gene marcador de seleção permite a seleção de agrobactérias transformadas e é, por exemplo, o gene nptll, que confere resistência à canamicína. A Ágrobacterium que atua como organismo hospedeiro neste caso deve já conter um plasmídeo com a região vir. O último é requerido para transferir o T-DNA para a célula vegetal. Uma Ágrobacterium transformada deste modo pode ser usada para transformar células vegetais. O uso de T-DNA para transformar células vegetais foi estudado e descrito intensivamente (EP 120 516; Hoekema, Em: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Capítulo V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277 a 287). Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais são comercialmente disponíveis tais como, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).

Outros promotores que são adequados para a expressão em plantas foram descritos (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153: 253 a 277; Schardl et al. (1987) Gene 61:111; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86: 8402 a 8406).

As técnicas de transformação direta são adequadas para qualquer organismo e tipo de célula. O plasmídeo usado não precisa atingir qualquer exigência particular no caso da injeção ou eletroporação de DNA ou RNA dentro de células vegetais. Plasmídeos simples tais como aqueles da série pUC podem ser usados. Se plantas completas devam ser regeneradas a partir das células transformadas, é necessário que um gene marcador selecionável adicional esteja localizado no plasmídeo.

As células estavelmente transformadas, isto é, aquelas que contém o DNA introduzido integrado no DNA da célula hospedeira, pode ser selecionado de células não transformadas quando um marcador selecionável é parte do DNA introduzido. Os exemplos de genes que podem atuar como marcadores são todos aqueles que são capazes de conferir resistência aos antibióticos ou herbicidas (tais como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfmotricina) (ver acima). As células transformadas que expressam tais genes marcadores são capazes de sobreviver na presença de concentrações de um antibiótico ou herbicida correspondente que mata um tipo selvagem não transformado. Os exemplos são mencionados acima e preferivelmente compreendem o gene bar, que confere resistência ao herbicida fosfmotricina (Rathore KS et al (1993) Plant Mol Biol 21 (5): 871 a 884), o gene nptll, que confere resistência à canamicina, o gene hpt, que confere resistência à higromicina ou o gene EPSP, que confere resistência ao herbicida Glifosato. O marcador de seleção permite a seleção de células transformadas a partir de células não transformadas (McCormick et al, (1986) Plant Cell Reports 5: 81 a 84). As plantas resultantes podem ser cruzadas e hibridizadas na maneira habitual. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas de modo a garantir que a integração genômica seja estável e hereditária.

Os métodos mencionados acima são descritos, por exemplo, em Jenes B et al, (1993) Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por SD Kung e R Wu, Academic Press, pp. 128 a 143 e em Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205 a 225). A construção a ser expressada é preferivelmente clonada em um vetor que é adequado para a transformação de Agrobacterium tumefadens, por exemplo pBinl9 (Bevan et al (1984) Nucl Acids Res 12: 871 lí). Tão logo uma célula vegetal transformada tenha sido gerada, uma planta completa pode ser obtida usando métodos conhecidos pelo técnico habilitado. Por exemplo, culturas de calo são usadas como material de partida. O desenvolvimento de brotos e raízes pode ser induzido neste como também biomassa de célula não diferenciada em uma maneira conhecida. Os brotos obtidos podem ser plantados e produzidos. O técnico habilitado é familiar com tais métodos de regenerar plantas inteiras a partir de células vegetais e partes de planta. Os métodos para assim fazê-lo são descritos, por exemplo, por Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567 a 570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273 a 278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525 a 533. O método de acordo com a invenção pode ser vantajosamente combinado com outros métodos que realizam a resistência a patógeno (por exemplo aos insetos, fungos, bactérias, nematóides e outros), a resistência ao estresse ou uma outra melhoria das propriedades da planta. Os exemplos são mencionadas, inter alia, por Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; páginas 487 a 496.

As cepas adequadas de Agrobacterium tumefaciens e vetores assim como a transformação de Agrobactérias e o cultivo apropriado e os meios de selecção são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são descritos na técnica anterior (GV31 01 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383 a 396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989), 8467 a 8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963 a 976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Em: Plant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin e Schilperoort (Eds.), Dordrecht, Países Baixos: Kluwer Academic Publ, (1994), 1 a 22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sei., 4,1 a 46; An, EMBO J. 4 (1985), 277 a 287).

Embora o uso de Agrobacterium tumefaciens seja preferido no método da invenção, outras cepas de Agrobacterium, tais como Agrobacterium rhizogenes, podem ser usadas, por exemplo se um fenótipo conferido pela dita cepa for desejado. A transformação da maior parte das plantas dicotiledôneas é possível com os métodos descritos acima. Mas também para a transformação de plantas monocotiledôneas várias técnicas de transformação bem sucedidas foram desenvolvidas. Estas incluem a transformação usando métodos biolísticos como, por exemplo, descrito acima assim como a transformação de protoplasto, eletroporação de células parcialmente permeabilizadas, introdução de DNA usando fibras de vidro, etc. O termo “transformação” como aqui usado, refere-se à transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independente do método usado para a transferência. O polinucleotídeo pode ser transitoriamente ou estavelmente introduzido na célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo ou como ligações quiméricas ou altemativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro, A célula vegetal transformada resultante pode ser depois usada para regenerar uma planta transformada em uma maneira conhecida por uma pessoa habilitada.

Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma célula vegetal que compreende o polinucleotídeo o vetor da presente invenção ou obtenível pelo método da presente invenção. Preferivelmente, a célula compreende um outro polipeptídeo ou vetor que conferem resistência, mais preferido é um vetor ou polinucleotídeo que codifica Rpi-blb.

Assim, a presente invenção diz respeito também às células vegetais transgênicas que contém (preferivelmente estavelmente integrado no genoma) um polinucleotídeo de acordo com a invenção ligado a elementos reguladores que permitem a expressão do polinucleotídeo em células vegetais e em que o polinucleotídeo é estranho à célula vegetal transgênica. Quanto ao significado de estranho; ver supra.

Assim, a presente invenção também diz respeito às plantas e tecido vegetal transgênicos que compreendem células vegetais transgênicas de acordo com a invenção. Devido à (super) expressão de um polipeptídeo da invenção, a dita planta ou tecidos vegetais são de resistência aos patógenos vegetais, em particular aos Oomicetos. Preferivelmente as plantas também são de resistência a outro patógeno, por exemplo, aos patógenos vegetais sugadores. Outros patógenos são aqui descritos. Preferido é que as ditas plantas ou tecido vegetal sejam resistentes à espécie Phytophthora, mais preferido ao P. infestans.

Por exemplo, para obter plantas transgênicas que expressam o gene Rpi-blb2, a sua região codificadora pode ser clonada, por exemplo, no vetor pBinAR (Hofgen und Willmitzer, Plant-Science, 66,1990, 221 a 230). Por exemplo, a seguir de uma tecnologia de reação de cadeia da polimerase (PCR) a região codificadora de Rpi-blb2 pode ser amplificada usando iniciadores como mostrado nos exemplos e figuras, por exemplo, na Tabela 3b em particular ARF1F e ARF1R. O fragmento de PCR obtido pode ser purificado e subseqüentemente o fragmento pode ser clonado em um vetor. O vetor resultante pode ser transferido em Agrobacterium tumefaciens. Esta cepa pode ser usada para transformação e plantas transgênicas podem ser depois selecionadas. Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a uma planta transgênica ou tecido vegetal que compreende a célula vegetal da presente invenção. “Transgênico”, por exemplo com respeito a uma seqüência de ácido nucléico, um cassete de expressão ou um vetor que compreende a dita seqüência de ácido nucléico ou um organismo transformado com a dita seqüência de ácido nucléico, cassete de expressão ou vetor, refere-se a todas estas construções que se originam pelos métodos recombinantes em que a) a seqüência de ácido nucléico Rpi-blb2 ou b) uma seqüência de controle genético ligada operavelmente à seqüência de ácido nucléico de Rpi-blb2, por exemplo um promotor ou c) (a) e (b) não estão localizados em seu ambiente genético natural ou foram modificados pelos métodos recombinantes, um exemplo de uma modificação sendo uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural refere-se ao local cromossômico natural no organismo de origem ou à presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência de ácido nucléico é preferivelmente retido, pelo menos em parte. O meio ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucléico pelo menos a um lado e tem uma seqüência de pelo menos 50 pb, preferivelmente pelo menos 500 pb, especial e preferivelmente pelo menos 1000 pb, muito especial e preferivelmente pelo menos 5000 pb, no comprimento. Um cassete de expressão que ocorre naturalmente - por exemplo a combinação que ocorre naturalmente do promotor de Rpi-blb2 com o gene Rpi-blb2 correspondente - toma-se um cassete de expressão transgênico quando ele é modificado por métodos “artificiais” não naturais, sintéticos tais como, por exemplo, mutagenização. Tais métodos foram descritos (US 5.565.350; WO 00/15815; também observado acima).

Além disso, a célula vegetal, tecido vegetal ou planta também podem ser transformados tal que outras enzimas e proteínas sejam (super) expressadas, expressão esta que sustenta um aumento da resistência da planta ou do tecido vegetal, por exemplo proteínas Rpi-blb (sinônimos Rpi-blbl, RBor Sbul), Rl, Rpí-mcd, R-ber (sinônimo R12), Rpil, Rpi-blb3, Rpi- ΑΒΡΤ1, R2, R3a ou R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, RIO, Rll, Ph-1, Ph-2 e/ou Ph-3. Preferido é a co-expressão de Rpi-blb e Rpi-blb2. A presente invenção também diz respeito a tecidos vegetais cultivados que compreendem células vegetais transgênicas como descrito acima que mostram a expressão de uma proteína de acordo com a invenção.

Os organismos hospedeiros ou de partida que são preferidos como organismos transgênicos são principalmente plantas de acordo com a definição acima, Incluídos dentro do escopo da invenção estão todos os gêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do Reino Vegetal.

Além disso são incluídas as plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e partes, material de propagação e culturas derivadas destas, por exemplo culturas de célula que tenham uma atividade aumentada de Rpi-blb2. Plantas maduras referem-se às plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além daquele da muda. O termo muda refere-se a uma planta imatura jovem em um estágio de desenvolvimento inicial.

Qualquer planta transformada obtida de acordo com a invenção pode ser usada em um esquema de cruzamento convencional ou na propagação de planta in vitro para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características e/ou pode ser usada para introduzir as mesmas características em outras variedades da mesma espécie ou de espécies relacionadas, Tais plantas também são parte da invenção. As sementes obtidas a partir das plantas transformadas geneticamente também contém as mesmas características e são parte da invenção. Como mencionado antes, a presente invenção é em princípio aplicável a qualquer planta e safra que possam ser transformadas com qualquer um dos métodos de transformação conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

No geral, as plantas que podem ser modificadas de acordo com a invenção e que mostram a super expressão de uma proteína de acordo com a invenção ou uma redução da síntese de uma tal proteína podem ser derivadas de qualquer espécies vegetal desejada. Elas podem ser plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas, preferivelmente elas pertencem à espécie vegetal de interesse na agricultura, cultura de madeira ou horticultura de interesse, tais como plantas de safra (por exemplo, milho, arroz, cevada, trigo, centeio, aveias, etc.), batatas, plantas que produzem óleo (por exemplo, semente oleoaginosa de colza, girassol, amendoim, soja, etc.), algodão, beterraba açucareira, cana de açúcar, plantas leguminosas (por exemplo, feijões, ervilhas etc.), plantas que produzem madeira, preferivelmente árvores, etc. Entretanto, as plantas que podem ser infectadas pela espécie Phytophthora são preferidas.

Consequentemente, em uma forma de realização a planta, célula vegetal ou tecido vegetal da invenção ou produzidos de acordo com o método da invenção são selecionados do grupo consiste de Menyanthaceae, Solanaceae, Sclerophilacaceae, Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Polemoniaceae, e Hydrophillaceae de acordo com o Systema Naturae 2000, Brands, S. J., Amsterdam ou tem a sua origem nestes.

Preferivelmente a dita planta, célula vegetal ou tecido vegetal da invenção ou produzido de acordo com o método da invenção é uma Solanaceae, preferivelmente selecionada do grupo de Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Fabiana, Franciscea, Hyoscyamus, Lycium, Mandragora, Nicandra, Nicoíiana, Petunia, Physalis, Schizanthus e Solanum de acordo com o Systema Naturae 2000, Brands, S. J., Amsterdam ou tem a sua origem nestas.

Mais preferido, a planta, célula vegetal ou tecido vegetal da invenção ou produzido de acordo com o método da presente invenção é uma S. bulbocastanum, S. tuberosum (batata), S. lycopersicum (tomate), petúnia, S, betaceum (tree tomato), S. muricatum (melão pêra) ou S. melongena (beringela). Ainda mais preferido, a planta, tecido vegetal ou célula vegetal é uma S. tuberosüm ou S. lycopersicum. O mais preferido é S. tuberosum. Em ouíros sistemas, a classificação será similar. A pessoa habilitada na técnica conhece as diferenças, por exemplo, mais comum, o tomate é chamado sistematicamente de Lycopersicon lycopesicum (L.) Karsten ex Farwell. Já em um outro aspecto, a invenção também diz respeito às partes colhíveis e ao material de propagação das plantas transgênicas de acordo com a invenção que contém células vegetais transgênicas que expressam uma molécula de ácido nucléico e/ou o polipeptídeo de acordo com a invenção ou que contém células que mostram um nível aumentado do polipeptídeo da invenção.

As partes colhíveis podem ser em princípio qualquer parte útil de uma planta, por exemplo, flores, pólen, mudas, tubérculos, folhas, hastes, frutas, sementes, raízes etc, O material de propagação inclui, por exemplo, sementes, frutas, cortes, mudas, tubérculos, rizomas etc. Preferidos são batatas, tomates, eggfmts ou melões pêra como material colhível ou de propagação, No caso, a planta da invenção é petúnia, a presente invenção diz respeito em uma forma de realização às flores de petúnia como parte colhível. A invenção além disso diz respeito ao uso dos organismos transgênicos de acordo com a invenção e das células, culturas de célula, partes - tais como, por exemplo, raízes, folhas e outros no caso de organismos vegetais transgênicos - derivadas destes, e ao material de propagação transgênico tais como sementes ou frutas, para a produção de gêneros alimentícios ou alimentações de animais, produtos farmacêuticos ou produtos químicos finos. Em particular, batatas podem servir para a produção de produtos químicos finos.

Consequentemente em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito ao uso do polinucleotídeo, da planta, célula vegetal ou tecido vegetal, o vetor ou o polipeptídeo da presente invenção para fabricar ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, lipídeos, ésteres cerosos, (poli) sacarídeos e/ou poliidroxialcanoatos e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, células, tecidos e/ou plantas que produzem hormônios esteróides, colesterol, prostaglandina, triacilgliceróis, ácidos de bile e/ou corpos de cetona. Existem vários mecanismos pelos quais o rendimento, produção e/ou eficiência de produção de ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, ésteres de cera, lipídeos, (poli) sacarídeos e/ou poliidroxialcanoatos, e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, hormônios de esteróide, colesterol, triacilgliceróis, prostaglandina, ácidos de bile e/ou corpos de cetona ou outros dos produtos químicos finos acima definidos que incorporam uma tal proteína alterada podem ser afetados. No caso de plantas, por exemplo, pelo aumento da expressão de acetil-CoA que é a base para muitos produtos, por exemplo, ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, lipídeos, (poli) sacarídeos, ésteres cerosos, e/ou poliidroxialcanoatos, e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, prostaglandina, hormônios esteróides, colesterol, triacilgliceróis, ácidos de bile e/ou corpos de cetona em uma célula, pode ser possível aumentar a quantidade dos ditos compostos produzidos permitindo assim maior facilidade de colher e purificar ou no caso de plantas mais divisão eficiente. Além disso, um ou mais dos ditos produtos de metabolismo, quantidades aumentadas dos co-fatores, moléculas precursoras, e compostos intermediários para os caminhos biossintéticos apropriados podem ser requeridos. Portanto, aumentando-se o número e/ou a atividade de proteínas transportadoras envolvidas na importação de nutrientes, tais como fontes de carbono (isto é, açúcares), fontes de nitrogênio (isto é, aminoácidos, sais de amônio), fosfato, e enxofre, pode ser possível melhorar a produção de acetil CoA e seus produtos de metabolismo como mencionados acima, devido à remoção de quaisquer limitações no fornecimento de nutriente no processo biossintético. Em particular, pode ser possível aumentar o rendimento, produção, e/ou eficiência de produção dos ditos compostos, por exemplo, moléculas de ácidos graxos, carotenóides, isoprenóides, vitaminas, ésteres graxos, lipídeos, (poli) sacarídeos, e/ou poliidroxialcanoatos, e/ou seus produtos de metabolismo, em particular, hormônios esteróides, colesterol, prostaglandina, triacilgliceróis, ácidos de bile e/ou corpos de cetona etc. nas plantas.

Além disso preferido é um método para a produção recombinante de produtos farmacêuticos ou produtos químicos finos em organismos hospedeiros, em que um organismo hospedeiro é transformado com um dos cassetes de expressão descritos acima e este cassete de expressão compreende um ou mais genes estruturais que codificam o produto químico fino desejado ou catalisa a biossíntese do desejada produto químico fino, o organismo hospedeiro transformado é cultivado, e o produto químico fino desejado é isolado do meio de cultura. Este método pode ser aplicado amplamente aos produtos químicos finos tais como enzimas, vitaminas, aminoácidos, açúcares, ácidos graxos, e flavorizantes naturais e sintéticos, substâncias aromáticas e corantes. Especialmente preferido é a produção de tocoferóis e tocotrienóis e carotenóides. Os organismos hospedeiros transformados são cultivados e os produtos são isolados dos organismos hospedeiros ou do meio de cultura pelos métodos conhecidos pelo técnico habilitado. A produção de produtos farmacêuticos tais como, por exemplo, anticorpos ou vacinas, é descrita por Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10 (4): 382 a 386; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236:275 a 292.

Em uma forma de realização, a presente invenção também diz respeito ao uso do polinucleotídeo, do vetor ou do polipeptídeo da presente invenção para produzir uma planta ou um tecido vegetal, órgão vegetal ou uma célula vegetal ou uma parte desta resistentes ao dito.

Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a identificação de um composto para estimular a resistência a um dito patógeno vegetal que compreende: a) contatar células que expressara o polipeptídeo da presente invenção ou seu mRNA com um composto candidato sob condições de cultivo de célula; b) ensaiar um aumento na expressão do dito polipeptídeo ou do dito mRNA; c) comparar o nível de expressão com uma resposta padrão feita na ausência do dito composto candidato; por meio do qual, uma expressão aumentada em relação ao padrão indica que o composto está estimulando a resistência. O dito composto pode ser quimicamente sintetizado ou microbiologicamente produzido e/ou compreendido, por exemplo, em amostras, por exemplo, extratos de célula, por exemplo, de plantas, animais ou microorganismos, por exemplo, patógenos. Além disso, o(s) dito(s) composto(s) pode(m) ser conhecido(s) na técnica mas até agora não conhecido ser capaz de suprimir ou ativar Rpi-blb2. A mistura de reação pode ser um extrato isento de célula ou pode compreender uma cultura de célula ou tecido. Ajustes adequados para o método da invenção são conhecidos pia pessoa habilitada na técnica e são, por exemplo, no geral descrito em Alberts et ai, Molecular Biology of Cell, terceira edição (1994), em particular Capítulo 17. Os compostos podem ser, por exemplo, adicionados à mistura de reação, meio de cultura, injetados na célula ou pulverizados sobre a planta.

Se uma amostra contendo um composto é identificada no método da invenção, então é possível isolar o composto da amostra original identificada como contendo o composto capaz de ativar ou aumentar a resistência aos ditos patógenos ou pode-se ainda subdividir a amostra original, por exemplo, se ela consiste de uma pluralidade de compostos diferentes, de modo a reduzir o número de substâncias diferentes por amostra e repetir o método com as subdivisões da amostra original. Dependendo da complexidade das amostras, as etapas descritas acima podem ser realizadas várias vezes, preferivelmente até que a amostra identificada de acordo com o método da invenção apenas compreenda um número limitado de substâncias ou apenas uma substância. Preferivelmente a dita amostra compreende substâncias de propriedades químicas e/ou físicas similares, e o mais preferivelmente as ditas substâncias são idênticas. Preferivelmente, o composto identificado de acordo com o método descrito acima ou seu derivado é ainda formulado em uma forma adequada para a aplicação no cruzamento de planta ou cultura de célula e tecido vegetais.

Os compostos que podem ser testados e identificados de acordo com um método da invenção podem ser bibliotecas de expressão, por exemplo, bibliotecas de expressão de cDNA, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, anticorpos, compostos orgânicos pequenos, hormônios, peptidomiméticos, PNAs ou coisa parecida (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879 a 880; Hupp, Cell 83 (1995), 237 a 245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193 a 198 e referências citadas supra). Os ditos compostos também podem ser derivados ou análogos funcionais dos inibidores ou ativadores conhecidos. Os métodos para a preparação de derivados e análogos químicos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são descritos, por exemplo, m Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, edição Springer Nova Iorque Inc., Quinta Avenida 175, Nova Iorque, N. Y. 10010 U. S. A. e Organic Synthesis, Wiley, Nova Iorque, USA. Além disso, os ditos derivados e análogos podem ser testados quanto aos seus efeitos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Além disso, peptidomiméticos e/ou planejamento auxiliado pelo computador de derivados e análogos apropriados podem ser usados, por exemplo, de acordo com os métodos descritos acima. A célula ou tecido que podem ser utilizados no método da invenção preferivelmente são uma célula hospedeira, célula vegetal ou tecido vegetal da invenção descritos nas formas de realização mais acima.

Determinar se um composto é capaz de suprimir ou ativar a dita resistência pode ser feita, como descrito nos exemplos, em particular por intermédio da determinação do índice de espomlação. O ativador identificado pelo método descrito acima pode se mostrar útil como um fungicida ou protetor de safra. Assim, em uma outra forma de realização a invenção diz respeito a um composto obtido ou identificado de acordo com o método da invenção o dito composto sendo um agonista de Rpi-blb2.

Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção ainda diz respeito a um composto identificado pelo método da presente invenção. O dito composto é, por exemplo, um homólogo de Rpi-blb2. Os homólogos do polipetídeo da presente invenção pode ser gerado pela mutagênese, por exemplo, mutação de ponto ou truncagem discretas de Rpi-blb2. Como aqui usado, o termo “homólogo” refere-se a uma forma variante da proteína que atua como um agonista da atividade da Rpi-blb2. Um agonista da dita proteína pode reter substancialmente a mesma ou um subconjunto, das atividades biológicas de Rpi-blb2.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo que reconhece especificamente o composto da presente invenção. A invenção também diz respeito a uma composição de diagnóstico que compreende pelo menos um dos polinucleotídeos, moléculas de ácido nucléico, vetores, proteínas, anticorpos ou compostos da invenção anteriormente mencionados e opcionalmente meios adequados para detecção. A composição de diagnóstico da presente invenção é adequada para isolar o mRNA a partir de uma célula e contatar o mRNA assim obtido com uma sonda que compreenda uma sonda de ácido nucléico como descrita acima sob condições de hibridização, detectando a presença de mRNA hibridizado com a sonda, e detectando deste modo a expressão da proteína na célula. Outros métodos de detectar a presença de uma proteína de acordo com a presente invenção compreende imunotécnicas bem conhecidas no ramo, por exemplo ensaio imunossorvente ligado a enzima. Além disso, é possível usar as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção em particular os marcadores descritos nos exemplos, por exemplo, na tabela 3a ou 3b como marcadores moleculares ou iniciador na geração de planta.

Meios adequados para a detecção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, tampões e soluções para os ensaios de hibridização, por exemplo, as soluções e tampões anteriormente mencionados, outros e meios para as Southern-, Western-, Northern- etc. blots, como por exemplo, descrito em Sambrook et ai são conhecidos.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um kit que compreende o polinucleotídeo, o vetor, a célula hospedeira, o polipeptídeo, o ácido nucléico de anti-sentido, o anticorpo, a célula vegetal, a planta ou o tecido vegetal, a parte colhível, o material de propagação ou o composto da invenção.

Os compostos do kit da presente invenção podem ser embalados em recipientes tais como frascos, opcionalmente com/em tampões e/ou solução. Se apropriado, um ou mais dos ditos componentes podem ser embalados em um e no mesmo recipiente. Adicionalmente ou altemativamente, um ou mais dos ditos componentes podem ser absorvidos em um suporte sólido como, por exemplo, um filtro de nitrocelulose, uma placa de vidro, um chip ou uma membrana de náilon ou ao reservatórios de uma placa de microtítulo. O kit pode ser usado para qualquer um dos métodos e formas de realização aqui descritos, por exemplo, para a produção das células hospedeiras, plantas transgênicas, composições farmacêuticas, detecção de seqüências homólogas, identificação de antagonistas ou agonistas, etc.

Além disso, o kit pode compreender instruções para o uso do kit para qualquer uma das ditas formas de realização, em particular para o seu uso para aumentar a resistência a um ou mais dos ditos patógenos de uma célula vegetal, tecido vegetal ou planta.

Em uma forma de realização preferida o dito kit compreende ainda um polinucleotídeo que codifica uma ou mais das proteínas de resistência anteriormente mencionadas, preferivelmente Rpi-blb, e/ou um anticorpo, um vetor, uma célula hospedeira, um ácido nucléico de anti-sentido, uma célula vegetal ou tecido vegetal e/ou uma planta relacionada com a(s) dita(s) proteína(s) de resistência, preferivelmente com a Rpi-blb.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de um protetor de safra que forneça o polinucleotídeo, o vetor ou o polipeptídeo da invenção ou que compreenda as etapas do método da invenção; e formular o polinucleotídeo, o vetor ou o polipeptídeo da invenção ou o composto identificado na etapa (c) do dito método em uma forma aplicável como composição agrícola vegetal.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de uma composição protetora de safra que compreende as etapas do método da presente invenção; e (a) formular o composto identificado na etapa (c) em uma forma aceitável como composição agrícola.

Sob “aceitável como composição agrícola” é entendido, que uma tal composição está de acordo com as leis que regulam o teor de fungicidas, nutrientes de planta, herbicidas, etc. Preferivelmente uma tal composição não causa qualquer dano para as plantas protegidas e para os animais (incluído os seres humanos) alimentados com elas. A presente invenção também diz respeito a várias formas de realização que dizem respeito ainda aos usos e métodos. O polinucleotídeo, polipeptídeo, homólogos de proteína, proteínas de fusão, iniciadores, vetores, células hospedeiras, aqui descritas podem ser usadas em um ou mais dos seguintes métodos: identificação de plantas resistentes aos patógenos de planta como mencionados e organismos relacionados; mapeamento de genomas; identificação e localização de seqüências de interesse; estudos evolucionários; determinação de regiões requeridas para a função; modulação de uma atividade.

Consequentemente, os polinucleotídeos da presente invenção têm uma variedade de usos. Primeiro, eles podem ser usados para identificar um organismo como sendo S. bulbocastanum ou um parente próximo deste. Também, eles podem ser usados para identificar a presença de S. bulbocastanum ou um parente deste em uma população mista de plantas. Pela sondagem do DNA genômico extraído de uma cultura de uma única ou de uma população mista de plantas sob condições severas com uma sonda que transpõem uma região do gene da presente invenção que é única para este S. bulbocastanum, pode-se averiguar se a presente invenção foi usada ou se o S. bulbocastanum ou um parente, por exemplo, um parente próximo, está presente.

Além disso, o polinucleotídeo da invenção pode ser suficientemente homólogo às seqüências de espécies relacionadas tal que estas moléculas de ácido nucléico possam servir como marcadores para a construção de um mapa genômico no organismo relacionado. Os polinucleotídeos da invenção também são úteis para estudos evolucionários e estruturais de proteína. Pela comparação das seqüências da Rpi-blb2 da presente invenção com aquelas que codificam enzimas similares de outros organismos, a relacionabilidade evolucionária dos organismos pode ser avaliada. Similarmente, uma tal comparação permite uma avaliação de quais regiões da seqüência são conservadas e quais não são, que podem ajudar na determinação daquelas regiões da proteína que são essenciais para o funcionamento da enzima. Este tipo de determinação é de valor para estudos de engendramento de proteína e pode dar uma indicação do que a proteína pode tolerar em termos de mutagênese sem perder a função.

Estas e outras formas de realização são divulgadas e abrangidas pela descrição e exemplos da presente invenção. Literatura adicional concernente a qualquer um dos métodos, usos e compostos a serem utilizados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada de bibliotecas públicas, usando por exemplo dispositivos eletrônicos. Por exemplo a base de dados pública “Medline” pode ser utilizada que está disponível na Internet, por exemplo sob hfitp://www.ncbi.nlm,nih.gov/ PubMed/medline.html. Outras bases de dados e endereços, tais como hftp://www.ncbi.nim.níh.gov/, hftp;//www.infobiogen.fir/, hftp://www.fini. ch/biology/research-tools.html, hftp://www,tigr.org/, são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e também podem ser obtidos usando, por exemplo, hftp://www,lycos.com. Um resumo da informação de patente na biotecnologia e uma vista geral de fontes relevantes de informação de patente útil para a pesquisa retrospectiva e para a ciência corrente é dada em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352 a 364.

Tabelas: Tabela 1: Seqüências: Tabela 3A. Resumo de marcadores usados para o mapeamento de Kpi-blttí Tabela 3B. Resumo de iniciadores usados para o mapeamento de Rpi-blb2 Tabela 4. Comr>lementacão da sufteetihilidade à ferrugem tardia em batata 1 Tabela 5. Condições de ciclagem usadas para TAIL-PCR

Os genótipos Ro são transformantes primários obtidos a partir da transformação do cultivar do tomate suscetível MoneyMaker com construção de T-DNA contendo o gene Rpi-blb2 RGC5. A cepa de Agrobacterium tumefaciens UlA143a foi usadas para a transformação do cultivar do tomate suscetível ao P. infestans.

As figuras mostram: Figura 1. Representação esquemática do desenvolvimento dos clones híbridos interespecíficos complexos designados como ‘ABPT’ (la) e as populações de mapeamento de S. tuberosum que foram derivadas de dois destes clones: ABPT clone 55 e ABPT clone 60 (lb a d). A; Solanum acaule, B; S. bulbocastanum, P; S.pureja, T; S. tubemsum, 2x; diplóide (2n=2x=24), 3x; triplóide, 4x; tetraplóide, 6x; hexaplóide, cv; cultivar. Os códigos em itálicos indicam populações de mapeamento.

Figura 2. Curvas de progresso da doença para o clone ARF 87-601 e cultivares de controle suscetíveis (cv) Bildtstar, Eersteling e o partial resistentes control cultivar Pimpemel em um teste de campo para a resistência foliar à ferrugem tardia em Toluca Valley, México em 1991. Em oito pontos de tempo depois do plantio, a porcentagem de folhagem com ferrugem devido a uma infecção por ferrugem tardia natural foi marcada na escala CIP de 1 a 9 (Estrada-Ramos, 1983).

Figura 3. Curvas de progresso da doença para o clone ARF 87-507, ARF 87-601, ARF 87-801, o cultivar de controle suscetível (cv) Granola e o clone de geração resistente parcial AR 85-96-13 em um teste de campo para a resistência foliar à ferrugem tardia em Província de Benguet, Filipinas em 1992. Em seis pontos de tempo entre 25 de agosto a 24 de novembro, a porcentagem de folhagem com ferrugem devido a uma infecção por ferrugem tardia natural foi marcada na escala CIP de 1 a 9 (Estrada-Ramos, 1983). Figura 4. Fenótipos típicos em tetraplóides resistentes e clones precursores suscetíveis e clones de progênie que segregam a resistência mediada por Rpi-blb2 à ferrugem tardia no teste de campo anual em Marknesse, Países Baixos, aproximadamente 6 semanas depois da inoculação com isolado IP082001 de P. infestans. Seis canteiros por planta com um clone mostrando o fenótipo resistente (dentro da linha sólida preta) que não mostra nenhuma ou dificilmente qualquer lesão por esporulação e com um clone mostrando o fenótipo suscetível (dentro da linha pontilhada branca) que mostra folhagem completamente atacada pela ferrugem.

Figura 5. Mapa genético com base em 109 clones progênie de S. tuberosum população de mapeamento ARG 95-15 mostrando 7 marcadores AFLP que foram descobertos co-segregar cora o local Rpi-blb2. Os números à esquerda da linha vertical indicam a distância genética entre os marcadores de flanqueamento ou o local Rpi-blb2 em centimorgan (cM).

Figura 6. Mapa genético com base em 137 clones progênie de S. tuberosum população de mapeamento ARG 95-3 mostrando 15 marcadores AFLP e marcador RGA SI E00 que foram descobertos co-segregar com o local Rpi-blb2. Os fenótipos dos clones progênie foram obtidos com ensaios de folha destacadas. Os números à esquerda da linha vertical indicam a distância genética entre os marcadores de flanqueamento ou o local Rpi-blb2 em centimorgan (cM).

Figura 7. Mapa genético com base em 178 clones progênie de S. tuberosum população de mapeamento ARG 95-3 mostrando 5 marcadores que foram descobertos co-segregar com o local Rpi-blb2 no grupo de ligação 6 de S. tuberosum. Os fenótipos dos clones progênie foram determinados no teste de campo em Marknesse, Países Baixos em 1998. Os marcadores E40M58 e E46M52 foram marcados como AFLP, CAPS, SCAR ou estendidos (sufixo: e) marcador (tabela 3A). Parcialmente, o marcador CT119 foi marcado como marcador CT119N (tabela 3a). O marcador CT216 foi marcado como marcador SCAR. Os números à esquerda da linha vertical indicam a distância genética entre os marcadores de flanqueamento ou o local Rpi-blb2 em centimorgan (cM). Para cada marcador, o número de recombinantes entre marcador e fenótipo e o número total de clones progênie marcado é dado em parêntese.

Figura 8. Mapas genéticos com base em 886 clones progênie de S, tuberosum população de mapeamento ARG 95-3 e em 170 clones progênie de S. tuberosum população de mapeamento ARP 96-11, mostrando marcadores que foram descobertos co-segregar com o local de Rpi-blb2 no grupo de ligação 6 de S. tuberosum. Fenótipos dos clones progênie foram determinados no teste de campo em Marknesse, Países Baixos em 2000. O número à esquerda da linha vertical indica a distância genética entre marcadores flanqueadores em centimorgan (cM), O intervalo de marcador que delimita a posição do gene Rpi-blb2, com base nos eventos de recombinação detectados em clones progênie, é indicado pelas linhas duplas com cabeça de seta.

Figura 9. Mapa físico da região genômica contendo Rpi-blb2 em S. tuberosum (linha horizontal superior) e S. bulbocasianum (linha horizontal inferior). As linhas verticais indicam a posição relativa de marcadores ligados à resistência. Os números acima das linhas horizontais são os números de recombinantes identificados entre os marcadores flanqueadores em plantas das progênies 1056 e 1899 de S. tuberosum, derivados de híbridos de espécie complexa “ABPT” (Figura 1), e plantas da progênie de S. bulbocasianum respectivamente. A progênie derivada de ABPT compreende clones tanto da população de mapeamento ARG 95-3 quanto de ARP 9611. Os retângulos representam clones de cromossoma artificial bacteriano (BAC) da biblioteca BAC ARD 1197-16 exceto quanto aos clones BAC com prefixo “Blb” que foram da biblioteca BAC de S. bulbocasianum Blb 2002. O intervalo de marcador que delimita a posição do gene Rpi-blb2, com base nos eventos de recombinação detectados em clones progênie, é indicado pelas linhas duplas com cabeça de seta. As setas pequenas indicam as posições de Candidatos a Gene de Resistência (RGC’s).

Figura 10. Representação esquemática do desenvolvimento do população diplóide, intraespecífica de mapeamento B6 de S. bulbocasianum. Os códigos em itálicos indicam populações de mapeamento.

Figura 11. Mapa genético com base em 1899 clones progênie de S. bulbocasianum população de mapeamento B6, mostrando marcadores que foram descobertos co-segregar com o local Rpi-blb2 no cromossoma 6 de S, bulbocastanum. Os fenótipos dos clones progênie foram determinados pelo ensaio de folhas destacadas. O número à esquerda da linha vertical indica a distância genética entre marcadores flanqueadores em centimorgan (cM). O intervalo de marcador que delimita a posição do gene Rpi-blb2, com base em eventos de recombinação detectados nos clones progênie, é indicado por uma linha dupla com cabeça de seta.

Figura 12. Complementação genética para a susceptibilidade à ferrugem tardia. Fenótipos de doença típicos de folhas de batata (S. tuberosum), 6 dias depois da inoculação com uma suspensão de esporangiosporo de isolado de P. infestans 655-2A. As folhas derivadas de plantas cv Kondor resistentes à canamicina transformadas com pBINPLUS (controle; A), folhas derivadas de plantas cv Kondor que abrigam derivado de BAC SPB39 (B) ou RGC5 derivado de BAC 211 (C), folha derivada de plantas cv Impala resistentes à canamicina transformada com pBINPLUS (controle; D), folhas derivadas de plantas cv Impala que abrigam derivado de BAC SPB39 (E) ou RGC5 derivado de BAC 211 (F). Panéis A e D representam respostas suscetíveis típicas com lesões de esporulação extensiva de P. infestans. Panéis B, C, E e F representam as reações de resistência típicas observadas nos sítios de inoculação em plantas de batata transgênica que abriga Rpi-blb2.

Figura 13. Seqüência de ácidos nucléicos que codificam o gene Rpi-blb2. A. Seqüência codificadora de ácido nucléico do gene Rpi-blb2, B. Seqüência codifícadora de ácido nucléico do gene Rpi-blb2 incluindo a seqüência de intron (posição 43-128). C. Seqüência do fragmento de DNA genômico de 7967 pb Sau3AI de ARD 1197-16 BAC 211 presente em p211F-C12, uma das duas construções genéticas usadas para a complementação genética para a resistência à ferrugem tardia. O fragmento genômico abriga o gene Rpi-blb2 incluindo elementos reguladores naturais necessários para a expressão correta do gene. O códon de início (posição ATG 1546 a 1548) e o códon de terminação (posição TAG 5433 a 5435) são sublinhados. D. Sequência do fragmento de DNA genômico Sau3AI de 9949 pb de S. bulbocastanum 2002 BAC BIbSP39 presente em pSP39-20, uma das duas construções genéticas usadas para a complementação genética para a resistência à ferrugem tardia. O fragmento genômico abriga o gene Rpi-blb2 incluindo elementos reguladores naturais necessários para a expressão correta do gene. O códon de iniciação (posição ATG 1413 a 1415) e o códon de terminação (posição TAG 5300 a 5303) são sublinhados.

Figura 14, Estrutura do gene Rpi-blb2 putativo e seqüência da proteína Rpi-blb2 deduzida, A. Representação esquemática da estrutura do gene Rpi-blb2. As linhas horizontais indicam exons. As caixas abertas representam a seqüência codificadora. As linhas em ângulo a jusante indicam as posições de seqüências de intron. B. Seqüência da proteína Rpi-blb2 deduzida. A seqüência de aminoácido deduzida da seqüência de DNA de Rpi-blb2 é dividida em três domínios (LZ, NBS e LRR). Os resíduos hidrofóbicos no domínio A que forma o primeiro resíduo de repetições heptad do domínio dos zíperes de leucina potenciais (LZ) são sublinhados. Os motivos conservados nas proteínas R são escritos em letras minúsculas e em itálicos no domínio NBS. Os resíduos que igualam o consenso da LRR citoplásmica são indicados em negrito no domínio LRR. Os pontos na seqüência foram introduzidos para alinhar a seqüência com a seqüência LRR de consenso de LRRs citoplásmicos.

Figura 15. Alinhamento dos produtos de proteína deduzidos codificados por Rpi-blb2, Mi-1.1 e Mi-1.2. A seqüência de aminoácido completa de Rpi-blb2 é mostrada e os resíduos de aminoácido de Mi-1.1 e Mi-1.2 que diferem do resíduo correspondente em Rpi-blb2. Traços indicam intervalos inseridos para manter o alinhamento ótimo. Os resíduos de aminoácido que são específicos para Rpi-blb2, quando comparados com aqueles nas posições correspondentes em Mi-1.1 e Mi-1.2 são salientados em negrito e vermelho. As regiões das LRRs que correspondem ao filamento p/volta p motivo xxLxLxxxx são sublinhados. Os motivos conservados no domínio NBS são indicados em letras minúsculas. Uma linha vertical indica a divisão entre CC-NBS e a região LRR. A posição do motivo VLDL que é conservado na terceira LRR de muitas proteínas R vegetais mas não em Rpi-blb2 é indicada por um retângulo sombreado.

Figura 16. CLUSTAL W (1.82) Alinhamentos de Seqüência Múltiplos de ácido nucléicos de Mi 1.1, Mi 1.2 e Rpi-blb2.

Figura 17. CLUSTAL W (1.82) Alinhamentos de Seqüência Múltiplos de proteínas Mi 1.1, Mi 1.2 e Rpi-blb2.

Figura 18. Fenótipos típicos dos genes de resistência R2 (A) e Rpi-blb2 (B) comparado a um fenótipo suscetível de cv. Bintje (C). O painel A representa uma reação hipersensitiva de resposta típica com pontos necróticos muito pequenos, enquanto o painel B mostra regiões necróticas grandes que contém um baixo nível de esporulação. O painel C representa uma reação suscetível típica com esporulação evidente.

Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes.

Exemplos Exemplo 1: Avaliação de resistência em clones e populações retrocruzados derivados de ABPT

Os clones BC2 ARF 87-507 e ARF 87-801 foram selecionados da progênie BC2 obtida depois de duas rodadas de retrocruzamento em clone ABPT híbrido de espécie complexa número 55 (Figura la) com S. tuberosum cultivar Oberambacher Frühe suscetível à ferrugem tardia (LB) como primeiro precursor e S. tuberosum cultivares Arkula (Figura lb) e Blanka (Figura lc) respectivamente como segundo precursores. Similarmente, o clone BC2 ARF 87-601 foi obtido pelo cruzamento sucessivo em clone ABPT 60 com S. tuberosum cultivares Alcmaria e Blanka suscetíveis a LB (Figura ld). O clone ARF 87-601 foi testado como parte de um teste de campo para a triagem de resistência a LB na área de Toluca no México em 1991. Um canteiro do clone ARF 87-601 com sete plantas foi avaliada em comparação com os canteiros com nove plantas cada dos cultivares de controle Bildtstar, Eersteling e Pimpemel. De acordo com as classificações quanto a resistência à ferrugem tardia na lista do Dutch National de cultivares de batata recomendados de 1988, estes cultivares de controle marcaram 3,3 e 8 respectivamente em uma escala de 3 a 8 de resistência crescente. O cultivar Pimpemel é considerado como uma fonte de resistência parcial (Colon et al,, 1985). Cerca de quarenta dias depois do plantio, a infecção natural pelo P. infestans estabeleceu. O desenvolvimento de LB na folhagem depois foi monitorado oito vezes durante o período de 16 de julho a 2 de setembro (Figura 2). Houve uma clara diferença entre as curvas de progresso da doença para ARF 87-601 em comparação com os cultivares de controle. A 74 dias depois do plantio, a folhagem dos cultivares de controle foi completamente ou quase completamente atacada pela ferrugem ao passo que o clone ARF 87-601 não mostrou nenhum sintoma visível (Figura 2). Os clones ARF 87-507, ARF 87-801 e mais uma vez o clone ARF 87-601 mostraram resultados comparáveis em um teste de campo para a triagem de resistência à LB na Província de Benguet das Filipinas em 1992 (Figura 3). Dez plantas de cada um dos três clones BC2, cultivar de controle Granola e os clones de geração moderadamente resistentes a LB AR 85-96-13, que foram usados como precursor fêmea para obter AR 92-1197 (Figura ld), foram plantados em 25 de agosto. A porcentagem de folhagem atacada pela ferrugem foi marcada seis vezes depois da ocorrência de infecção natural pelo P. infestans. As curvas de progresso da doença de clones BC2 derivados de ABPT foram acentuadamente diferentes quando comparadas com o cultivar Granola e o clone AR 85-96-13 (Figura 3). Os clones BC2 não mostraram nenhum ou pouco dos sintomas de LB e nenhum progresso de doença evidente durante o período de classificação ao passo que o cultivar Granola teve a folhagem quase completamente atacada pela ferrugem na terceira data de classificação.

Os clones ARF 87-601, ARF 87-507 e ARF 87-801 foram usados para outro retrocruzamento com cultivares suscetível a LB e clones de geração de S. tuberosum (Figura lb a ld). Este trabalho de geração resultou em quatro populações de mapeamento diferentes, população BC3 tetraplóide ARG 95-15, populações BC4 tetraplóide ARG 95-3 e ARP 96-11 e população BC4 diplóide DPI. Durante as etapas sucessivas deste trabalho de geração os clones resistentes ARF 87-507, ARF 87-601, ARF 87-801, AR 91-1263, AR 91-1292 e AR 921197 foram selecionados com base no desempenho agronômico em avaliações de geração prática comum assim como pela triagem de seus precursores e progênies relevantes em um teste de campo em Marknesse, Países Baixos, que foram inoculados com o isolado complexo IP082001 de P. infestans. O clone diplóide (2n=2x=24) ARD 1197-16 foi selecionado entre a progênie do cruzamento AR 92-1197 x Phu 81-101 (Figura ld), o último clone precursor sendo conhecido por sua capacidade para induzir conjunto de semente partenogênica no precursor fêmea (Hermsen e Verdenius, 1973). inicialmente, a resistência à LB em ARD 1197-16 foi descoberta depois de ensaios de folha destacada repetidos usando isolados de P, infestans IP082001, IP0655-2A e IP0428-2 e verificado em um teste de campo em 1998 em Marknesse. A situação diplóide do clone ARD 1197-16 foi confirmada pela citometria de fluxo (Plant cytometry Services, Schijndel, Países Baixos). A segregação evidente quanto ao traço de resistência a LB na progênie derivada de ABPT e populações de mapeamento foi observada durante anos sucessivos de teste de campo no local de teste de Marknesse, aproximadamente 6 semanas depois da inoculação com IP082001 isolado de P. infestans. Tipicamente, os clones resistentes não mostraram nenhum ou dificilmente qualquer lesão de esporulação ao passo que os clones suscetíveis mostraram folhagem completamente atacada pela ferrugem (Figura 4) Em 2000, um total de 2851 clones das populações de mapeamento ARG 95-3 e ARP 96-11 foram triados como canteiros de planta única. Na média, 24 por cento dos clones mostraram fenótipos que não puderam ser classificados de modo não ambíguo como resistentes ou suscetível. Os clones que puderam ser classificados como tais mostraram relações de segregação de resistentes para fenótipo suscetíveis de 1 para 1 e 1 para 1,5 para as populações ARG 95-3 e ARP 96-11, respectivamente (Tabela 2).

Os ensaios de folha destacada com a progênie derivada de ABPT e populações de mapeamento foram descobertos ser menos precisos para a fenotipagem do que a triagem sob condições de campo. Não obstante, resultados de ensaios de folha destacada foram considerados adequado para a determinação inicial do fenótipo de clones individuais e assim, para a construção de populações de mapeamento.

Exemplo 2: mapeamento genético do local de resistência de Rpi-blb2 em populações retrocruzadas derivadas de ABPT.

Em todas as quatro populações de mapeamento (Figura 1), a resistência segregou como esperado para um traço monogênico, sugerindo a presença de um alelo de resistência dominante em um único local (Tabela 2). Este local foi designado o local Rpi-blb2.

De modo a identificar marcadores ligados a Rpi-blb2, uma análise AFLP inicial com 14 combinações de iniciador (pc) foi realizada no DNA de 10 plantas resistentes e 10 plantas suscetíveis da progênie ARG 9515, com base no ensaio de folha destacada, incluindo os clones precursores. O teste de 21 marcadores potencialmente ligados em um adicional de 89 plantas identificou vários marcadores ligados à resistência (Figura 5). A análise segregante volumosa subsequente (BSA) com 160 pc’s em 2 agrupamentos de DNA resistentes e 2 suscetíveis, cada um contendo DNA genômico de 8 plantas da progênie ARG 95-15 resistentes ou suscetível, respectivamente, identificou um total de 58 marcadores de AFLP potencialmente ligados à resistência (Figura 5). Quando vários destes marcadores foram testados em 137 plantas progênie de ARG 95-3, eles também estavam ligados à resistência nesta população, sugerindo que a resistência nas duas populações foi determinada pelo mesmo local (Figura 6). Estes marcadores co-segregantes mapearam 3 a 28 centimorgan (cM) e 1 a 7,2 cM para um lado do local em ARG 95-15 e ARG 95-3 respectivamente, sugerindo que Rpi-blb2 pode estar situado em uma posição distai em um cromossoma.

Para determinar a posição da Rpi-blb2 no mapa genético da batata, os dois marcadores AFLP co-segregantes E40M58 e E46M52 (Figura 6) foram clonados no vetor pGEM-T (Promega, Países Baixos) e seqüenciados. Iniciadores planejados nas extremidades das seqüências dos fragmentos de AFLP clonados (Tabela 3) foram usados para desenvolver o marcador de seqüência polimórfica amplificada clivada (CAPS) E40M58 que foi descoberto ser co-segregante com o traço de resistência em 25 clones resistentes e 25 suscetível de ARG 95-3. O marcador CAPS E40M58 foi subsequentemente testado em 46 plantas progênie da população de mapeamento CxE (van Eck et al, 1995). Estes dados foram adicionados à classificações de marcador existentes da população CxE. Joinmap (Stam, 1993) as análises de ligação mapearam E40M58 8 cM distai a GP79 (Gebhardt ei al, 1991), posicionando Rpi-blb2 no braço curto do cromossoma 6. Em 178 plantas progênie de população ARG 95-3 nenhuma recombinação entre Rpi-blb2 e marcadores AFLP E40M58, E40M60 e marcador CAPS CT119 foi observada. O marcador AFLP E46M52 e o marcador da região amplificada caracterizada pela seqüência (SCAR) CT216 mapeou 2,2 cM próximo ao gene (Figura 7).

Exemplo 3: Identificação de um marcador RGA ligado a Rpi-blb2 Em uma tentativa para identificar marcadores fimcionalmente relevantes ligados à resistência, iniciadores planejados nos motivos conservados do domínio NBS de genes T vegetais (Leister et al., 1996), foram usados em um protocolo AFLP adaptado (RGA-AFLP) para identificar marcadores específicos análogos ao gene de resistência (RGA).

Usando o iniciador com base na alça P SI de Leister et al (1996) em combinação com o iniciador de AFLP EcoOO, um marcador específico de RGA, S1E00 foi desenvolvido que co-segregou com resistência e marcadores E40M58 e CT119 na população de mapeamento ARG 95-3 (Figura 6 e 7).

Exemplo 4: Desenvolvimento de marcadores SCAR E40M58e e E46M52e para atriagem recombinante.

Usando DNA genômico de AR 91-1263 como padrão, o fragmento clonado de marcador AFLP E46M52 foi estendido pela TAIL-PCR. A TAIL-PCR primária foi realizada usando iniciadores ARO 77 (spl) e ARO 94 (AD) Subsequentemente, a PCR secundária foi realizada usando ARO 128 (sp2) e a PCR terciária usando ARO 129 (sp3) ambos em combinação com o iniciador AD. Isto resultou em um fragmento E46M52e que foi estendido na extremidade 5’ com aproximadamente 500 pb. O fragmento E46M52e foi clonado em pGEM-T e seqüenciado. Um novo iniciador avançado foi planejado nesta seqüência e a PCR em combinação com iniciador ARO 77 resultou em marcador SCAR E46M52e que co-segregou com o fenótipo resistente na quarta população de mapeamento de S. tuberosum e como marcador CAPS também na população B6.

Usando DNA genômico de ARD 1197-16 como padrão, o fragmento clonado de marcador AFLP E40M58 também foi estendido pela TAIL-PCR. A TAIL-PCR primária foi realizada tanto na direção 5! quanto 3’ usando iniciadores spl ARO 73 (3’) e 74(5’) em combinação com iniciador AD. Subsequentemente, a PCR secundária foi realizada usando como sp2 ARO 82 ou 79, respectivamente. Os fragmentos obtidos da PCR secundária, 750 pb da extremidade 3’ e 400 pb da extremidade 5’ foram clonados em pGEM-T e seqüenciados.

Com base em ambas as sequências, dois novos iniciadores foram planejados resultando em um marcador SCAR que co-segregou com resistência na população de mapeamento ARG 95-3 e DPI (Tabela 3). O fragmento de marcador SCAR E40M58e pôde ser amplificado nos precursores resistentes de populações de mapeamento ARG 95-3 e DPI, que foram ambos derivados do clone ABPT 55 (Figura 1), mas a amplificação pela PCR nos precursores ou progênie de clones de populações de mapeamento ARP 96-11 e ARG 95-15, que foram ambos derivados do clone ABPT 60, não deu qualquer produto de PCR detectável. Foi assumido que isto podería ter sido causado por diferenças menores na sequência genômica e portanto, o fragmento AFLP foi estendido pela TAIL-PCR usando DNA genômico de clone AR 91-1292 como padrão. Um fragmento E40M58e2 de aproximadamente 300 pb foi obtido, clonado e seqüenciado. A comparação da seqüência com o fragmento original de marcador AFLP E40M58 mostraram que apenas as primeiras 37 pb do fragmento estendido foram idênticas. A PCR com iniciadores planejados na seqüência de E40M58e2 não resultaram em um marcador polimórfico. Ambos dos marcadores estendidos E40M48e e E40M58e2 foram testados em cinco clones resistentes ou suscetíveis de S. bulbocastanum (BGRC 8005 e 8006). Apenas o fragmento de marcador SCAR E40M58e pôde ser amplificado nos quatro clones S. bulbocastanum, indicando que parte da seqüência de E40M58e2 não foi derivado de S. bulbocastanum. Esta observação sugeriram que E40M58e foi localizado na borda do fragmento de introgressão de S. bulbocastanum no clone AR 91-1292 e que a posição do local Rpi-blb2 foi próxima ao marcador E40M58e.

Exemplo 5: Mapeamento de Rpi-blb2 em uma população de mapeamento diplóide derivada de material ABPT

Um total de 149 clones progênie de população de mapeamento diplóide DPI foram triados com os marcadores E40M58e e E46M52e, Nenhuma recombínação foi descoberta entre estes marcadores sugerindo a recombinação suprimida na região genômica estudada quando comparada com a população de mapeamento tetraplóide ARG 95-3 (Figura 7). Um subconjunto de 112 clones foi triado quanto a resistência ao isolados de P. infestans IP082001, IP0655-2A e IP0428-2 em um ensaio de folha destacada parcialmente repetido. Onze dos clones (11 %) mostraram reações intermediárias e foram classificados como tendo fenótipos desconhecidos. Outros clones 51 e 50 foram classificados como resistentes e suscetíveis respectivamente. Três clones progênie DP1-28, DP1-79 e DP1-81 foram identificados de modo que fossem recombinados de modo putativo entre o local de Rpi-blb2 e os marcadores E40M58e e E46M52e. Em 2000, um subconjunto de 50 dos 112 clones fenotipados foram testados quanto a resistência a LB no campo no local de teste de Marknesse. Os resultados conclusivos no fenótipo para resistência a LB foram obtidos para 33 dos 50 clones. O fenótipo dos clones 28 e 81 como determinado com o ensaio de folha destacada pareceu ser errôneo. Assim, foi concluído que estes clones não representam eventos de recombinação entre Rpi-blb2 e os marcadores usados. O fenótipo de clone DP 1-79 não pôde ser verificado conclusivamente sob condições de campo e este clone pode representar o único evento de recombinação entre o local de Rpi-blb2 e os marcadores E40M58e e E46M52e em 101 clones progênie de DPI (1 cM). Desde que foi mostrado que os dois marcadores, ligados ao traço de resistência em ARG 9515, ARG 95-3 e ARP 96-11, co-segregou com o mesmo local para a resistência a LB em DPI, foi concluído que o clone DPI precursor ARD 1197-16 foi adequado como uma fonte para a isolação de gene Rpi-blb2 em um método de clonagem com base em mapa.

Exemplo 6: Mapeamento físico do local de Rpi-blb2 derivado deABPT O clone resistente ARD 1197-16, heterozigoto para o local Rpi-blb2, foi usado como fonte de DNA para a construção de uma biblioteca BAC (a seguir aludido como a biblioteca BAC ARD 1197-16). A preparação de DNA de alto peso molecular e a construção da biblioteca BAC foram realizados como descrito em Rouppe van der Voort et al (1999). Inicialmente, um total de 67968 clones com um tamanho de inserto médio de 100 kb, que corresponde a aproximadamente 7 equivalentes genômicos, foram individualmente armazenados em 177 placas de microtitulação de 384 reservatórios a -80° C. A triagem de marcador da biblioteca BAC ARD 1197-16 foi realizada como descrito em Rouppe van der Voort et al. (1999). Essencialmente, agmpamntos de DNA gerados para cada placa de 384 reservatórios foram triados pela PCR com marcadores SCAR ou CAPS ligados ao local de Rpi-blb2 de modo a construir uma contig BAC através do local de Rpi-blb2. A triagem da biblioteca BAC ARD 1197-16 com marcadores E40M58e, SI E00 e CT119 identificou vários clones BAC positivos, que serviram como BAC sementes das quais um cromossoma que caminham o local Rpi-blb2 foi iniciado. O marcador E40M58e foi usado para isolar os clones BAC 69 e 141 ao passo que os clones BAC 14, 24,123 e 133 foram positivo para o marcador SI E00. O marcador CT119 foi usado para isolar BAC 67. Depois de seqüenciar as bordas esquerda (L) e direita (R) destes clones BAC, um novo conjunto de marcadores foi desenvolvido; 14L, 24L, 24R, 69L, 69R, 141R, 123L, 123R, 133R e 67L. A triagem dos clones BAC isolados com estes marcadores mostraram que os seguintes pares de clones BAC compartilharam a sobreposição: o lado direito de 123 com o lado esquerdo de 133, 14 completamente com 24, e o lado esquerdo de 69 com o lado direito de 141. BAC 67 não compartilhou sobreposição com os outros clones BAC. A descoberta de que os clones BAC positivos em S1E00 14,24, 123, e 133 não formaram um único contig indicou que SI E00 foi uma seqüência repetitiva. Isto, junto com a descoberta de que as seqüências da extremidade BAC direita de clones BAC 24 e 123 mostraram alta homologia às regiões diferentes do gene de resistência Mil do tomate (Milligan et ai, 1998, Simons et al., 1998), sugeriu que o local Rpi-blb2 abrigou mais do que um RGA. A triagem da biblioteca BAC ARD 1197-16 inicial com marcadores 141R, 24L, 24R e 123L não levou à extensão de contig. Entretanto, a triagem da biblioteca com marcadores 123R e 133R resultou na isolação de clones BAC 99 e 113, estendendo deste modo o contig BAC 123/133 em uma direção. O sequenciamento da extremidade BAC destes dois clones BAC levaram ao desenvolvimento de dois novos marcadores, 99L e 113R. a triagem da biblioteca BAC ARD 1197-16 com 69R levou à extensão do contig 141/69. As triagens consecutivas da biblioteca BAC com marcadores derivados de clones BAC que estenderam ainda mais este contig levaram à isolação de clones BAC 36, 41 e 112, e o desenvolvimento de marcadores 36L, 41L e 112L.

Em uma tentativa para completar o contig BAC através do local Rpi-blb2, a biblioteca BAC ARD 1197-16 foi ampliada com 38864 clones BAC adicionais of -100 kb (números da placa de 384 reservatórios 178 a 273). Esta segunda biblioteca foi triada com marcadores 24L, 24R, 123L, e 141R, levando à identificação de clones BAC positivos tanto para 24R quanto 123L (por exemplo, 191) e clones BAC positivos para 24L (211, 242). Deste modo, o intervalo entre BAC 24 e 123 foi fechado e o contig 24/14 foi estendido na direção do clone BAC 141. Não houve nenhum clone novo na biblioteca ARD 1197-16 estendida que fosse positivo quanto ao marcador 14 IR.

Exemplo 7: Construção de marcadores adicionais na região BAC 123/133.

Em uma tentativa para desenvolver marcadores polimórfícos adicionais a partir de BAC 123 e 133, uma biblioteca de sub-clone de 10 kb foi construída tanto de BAC 123 quanto de 133. O DNA de BAC foi parcialmente clivado com Sau3AI e fragmentos de aproximadamente 10 kbp foram clonados no sítio BamHI do vetor pBINPLUS. De modo a selecionar clones contendo a sequência da extremidade BAC original, 288 subclones de BAC 123 e 192 de BAC 133 foram triados com os marcadores de extremidade BAC 123L ou 133R. No total 14 subclones foram positivos quanto ao marcador 123L e 11 quanto ao marcador 133R. Subsequentemente, a orientação dos clones positivos de extremidade BAC foi determinada pelas várias PCRs usando o iniciador avançado ou reverso do marcador de extremidade BAC relevante em combinação com os iniciadores M13F ou M13R (Tabela 3). Para o marcador 123L três sub-clones e dois sub-clones para o marcador 133R foram selecionados e as extremidades não contendo os marcadores 123L ou 133R foram seqüenciadas (aproximadamente 500 pb). Com base na nova seqüência dois novos iniciadores foram planejados para sublunar 123 resultando no marcador 123L2 e dois novos iniciadores foram planejados para sublunar 133 resultando no marcador 123R2. O marcador SCAR 123L2, que foi localizado a 10 kbp próximo ao marcador 123L, pareceu ser polimórfico em populações de mapeamento ARG 95-3, ARP 96-11 e como CAPS em B6. O marcador SCAR 133R2, que foi localizado a 10 kbp distai ao marcador 133R, foi apenas polimórfico em populações de mapeamento ARG 95-3 e ARP 96-11.

Exemplo 8: Mapeamento fino do local Rpi-blb2 em populações de mapeamento derivadas de ABPT.

De modo a mapear finamente o local Rpi-blb2 em populações de mapeamento derivadas de ABPT um total de 2283 novos clones progênie de população de mapeamento ARG 95-3 e 598 clones de população de mapeamento ARP96-11 foram testados quanto a resistência à LB no campo no local de teste de Marknesse em 2000 (Tabela 2). Na população ARG 95-3 846 clones (37 %) foram marcados suscetíveis e 886 clones resistentes (39 %). Os fenótipos dos 551 clones remanescentes foram incertos. Na população ARP 96-11 256 clones (45 %) foram marcados suscetíveis e 170 clones (30 %) resistentes. Os fenótipos dos 142 (25 %) remanescentes foram incertos (Tabela 2). Os 846 e 170 clones resistentes das populações de mapeamento ARG 95-3 e ARP 96-11, foram selecionados para a triagem recombinante com marcador SCAR CT216 e marcador CAPS 41L ou 36L, respectivamente. No total 85 (9,6 cM) e 22 (12,9 cM) recombinantes foram obtidos nas populações de mapeamento ARG 95-3 e ARP 9611 respectivamente, que foram subsequentemente triados com marcador CAPS 67L, reduzindo o número de recombinantes para 5 (0,56 cM) no intervalo marcador 67L-36L no caso de população de mapeamento ARG 95-3 e a 4 recombinantes (2,35 cM) no intervalo marcador 67L-41L no caso da população de mapeamento ARP 96-11 (Figura 8). Estes 9 recombinantes remanescentes foram ainda analisados com marcadores SCAR e CAPS 113R, 99L, 133R, 133R2, 123R, 123L, 24R, 14L, 24L, 141R, 69L, E40M58e e 69R. Os últimos dois marcadores foram marcados apenas na população de mapeamento ARG 95-3.

Na população ARG 95-3 dois clones mostraram recombinação entre marcadores E40M58e e 69L, posicionando o gene Rpi-blb2 0,23 cM próximo ao marcador E40M58e. Dois outros clones foram recombinados entre os marcadores 113R e 67L e um foi recombinado entre os marcadores 133R2 e 133R, posicionando o gene Rpi-blb2 0,11 cM distai ao marcador 133R.

Na população ARP 96-11, nenhuma recombinação foi detectada entre os marcadores 41L e 69L, posicionando o gene Rpi-blb2 0,58 cM próximo ao marcador 36L. Dois clones progênie foram recombinados entre os marcadores 113R e 67L, e um clone foi recombinado entre os marcadores 99L e 133R, posicionando o gene Rpi-blb2 0,58 cM distai ao marcador 99L (Figura 8; Figura 9).

Exemplo 9: Avaliação e mapeamento genético da resistência à ferrugem tardia em uma população de mapeamento intraespecífica de S. bulbocastanum.

De modo a desenvolver uma população de mapeamento intraespecífica de S. bulbocastanum, um clone resistente Blb 2002 foi obtido de um cruzamento de inter acesso (Figura 10): Este clone foi reciprocamente cruzado com um clone suscetível Blb 48-5 que foi selecionado também na progênie de um cruzamento inter acesso (Figura 10). A população resultante foi designada B6 com sinônimos B6a, Blb 99-229, Blb 00-7 e Blb 00-8.

Inicialmente um pequeno grupo de 47 plantas progênie da população B6 foi triado quanto a resistência ao P. infestans em um ensaio de folha destacada parcialmente repetido usando uma solução de esporangiosporo de isolar IP0655-2A de P. infestans como inóculo. As plantas com folhas que claramente mostraram lesões de esporulação 6 a 9 dias depois da inoculação foram consideradas ter um fenótipo suscetível ao passo que plantas com folhas não mostrando nenhum sintoma visível ou necrose no lado da inoculação na ausência de esporulação evidente foram considerados ser resistentes. Das 47 mudas, 23 marcaram resistentes e 24 suscetíveis. Estes dados indicaram que a progênie da população de mapeamento B6 deu segregação evidente do traço de resistência no ensaio de folha destacada e que a resistência pode ser devido a um único gene dominante ou um cacho de gene firmemente ligado. De modo a determinar a posição do cromossoma deste local, 46 mudas foram analisadas com marcadores 112L e E46M52e. O marcador 112L foi descoberto estar ligado em repulsão com o fenótipo resistente, como apenas dois recombinantes foram obtidos entre este marcador e o fenótipo das 46 mudas (4 cM). Também, o marcador E46M52e foi descoberto estar ligado em repulsão com o fenótipo resistente. Aqui, cinco recombinantes foram obtidos entre o marcador E46M52e e o fenótipo (11 cM). Além disso, os marcadores 69R, 69L e 141R foram usados para a análise dos sete recombinantes entre os marcadores 112L e E40M58e com um grupo adicional de 6,15 e 14 mudas não recombinadas respectivamente, e descobriu estar completamente ligadas na fase de ligação (marcador 69R) ou repulsão (marcadores 69L e 141 R) à resistência, indicando que o gene de resistência foi localizado no mesmo local, isto é, Rpi-blb2, como nas populações de mapeamento derivadas de ABPT.

De modo a determinar a posição de Rpi-blb2 mais precisamente em relação aos marcadores disponíveis, outras 849 mudas da população de mapeamento B6 e 1054 mudas do cruzamento recíproco (Figura 10) foram cultivados e analisados para a recombinação entre os marcadores E46M52e e 112L. Assim, além das 47 mudas iniciais, um total de 1903 clones progênie individuais da população B6 foram triados. A recombinação entre os marcadores E46M52e e 112L foi detectada em um total de 138 destas mudas (7,25 cM), O mapeamento fino do local Rpi-blb2 foi realizado em duas etapas. Primeiramente, o grupo de 138 recombinantes foi reduzido para 19 pela triagem adicional com marcadores 14Lb, 113R, 123L2, 24L, 141 R e 69L (Tabela 3), derivado das sequências de borda esquerda (L) e direita (R) de clones BAC isolados da biblioteca BAC ARD 1197-16 e seleção subsequente de todas as mudas que foram recombinadas entre os marcadores 113R e 69L. Possivelmente devido à recombinação dupla, 4 recombinantes deram padrões para os marcadores marcados que desviam das pontuações esperadas no caso de eventos de recombinação única no intervalo genético estudado e quando assumindo co-linearidade de marcadores. Estes foram retirados de outras análises. Em segundo lugar, os 15 recombinantes remanescentes foram analisados com marcadores das seqüências de borda de clones BAC isolados da biblioteca Blb 2002, SPB39L e SPB30L ou com marcadores MiGA 24L9spec, 24Lspec e 14L24L (Tabela 3). Os resultados das análises de marcador destes 15 recombinantes remanescentes, que deram classificações e fenótipos de marcador claramente interpretáveis, posicionados no local de Rpi-blb2 entre os marcadores 69L e 24L, em um intervalo genético de 0,11 cM (n=1899) (Figura 11).

Exemplo 10: marcadores MiGA A análise de Southern de clones BAC 14, 24, 123 e 133 usando marcadores 123R, 14L ou 24L como sondas mostraram que estes clones BAC contiveram vários análogos de gene de resistência (RGAs). Em vista da homologia entre as seqüências de marcadores 14L, 24L e 123R com o gene Mil de tomate, RGAs dentro da região Rpi-blb2 são em seguida aludidos como análogos do gene Mi (MiGAs). Em uma tentativa para desenvolver marcadores polimórfícos adicionais dentro do intervalo de Rpi-blb2, fragmentos de PCR gerados dos clones BAC 24 e 123 com a combinação de iniciador 14LR e 24LF foram clonados no vetor pGEM-T (Promega, Países Baixos) e parcialmente seqüenciados. Com base no alinhamento destas seqüências parciais, um conjunto de iniciadores universais foram planejados, univ!4L e univ24L (Tabela 3), com o objetivo de amplificar a região correspondente de tantos MiGAs quanto possível dentro do intervalo de Rpi-blb2. Este conjunto iniciador universal foi subsequentemente usado para desenvolver marcadores SCAR/CAPS específicos de MiGA ligados a Rpi-blb2 (por exemplo, marcadores 14L24L, 24Lspec, 24L9spec; Figura 9).

Exemplo 11: Mapeamento físico do local de Rpi-blb2 derivado de S. bulbocastanum. O clone resistente Blb 2002 heterozigoto para o local Rpi-blb2, foi usado como DNA fonte para a construção da biblioteca BAC de S. bulbocastanum, a seguir aludida como a biblioteca BAC Blb 2002. A preparação de DNA de peso molecular alto e a construção da biblioteca BAC foram realizada como anteriormente descrito. Um total de aproximadamente 100.000 clones foram gerados e armazenados como 50 agrupamentos bacterianos contendo aproximadamente 2000 colônias brancas. Estes agrupamentos bacterianos foram gerados raspando-se as colônias das placas de ágar em meio de Caldo de Luria contendo 18 % de glicerol e 12,5 pg/ml de cloranfenicol usando um espalhador de vidro estéril. Para a triagem da biblioteca BAC Blb 2002, o DNA plasmídico foi isolado de cada agrupamento de clones usando o protocolo de lise alcalina padrão e a PCR foi realizada para identificar agrupamentos positivos. As bactérias que correspondem aos agrupamentos positivos foram diluídos e plaqueados em placas de ágar Caldo de Luria contendo cloranfenicol (12,5 pg/ml). As colônias brancas individuais foram subsequentemente coletadas em placas de microtítulo de 384 reservatórios e clones BAC positivos únicos subsequentemente identificados como anteriormente descrito. Os nomes dos clones BAC isolados da biblioteca BAC Blb 2002 carrega os prefixos BlbSP.

De modo a construir um contig BAC derivado de Blb 2002 através do intervalo do marcador genético Rpi-blb2t (69L-24L) a Biblioteca BAC Blb 2002 foi triada com marcadores 141 R e 24L.

Isto levou à isolação de clones BACBlbSP39 e BlbSP30, que se sobrepõem entre si e transpõem o intervalo marcador 141R-24L. As seqüências da extremidade de BAC de ambos os clones BAC foram usados para desenvolver os marcadores SPB30L e SPB39L (Figura 9).

Exemplo 12: Análise de Complementação.

Com propósitos de complementação, todos os candidatos a gene Rpí-blb2, isto é, todos MiGAs presentes nos clones BACBlbSP30, BlbSP39, 24, 242 e 211, foram alvej ados para a subclonagem no vetor binário pBINPLUS (van Engelen et ai, 1996). Isto foi feito como segue. Alíquotas de aproximadamente 1 pg de DNA BAC foram digeridos com 1 U, 0,1 U ou 0,01 U de enzima de restrição Sau3AI por 30 min. O DNA de BAC parcialmente digerido foi submetido à eletroforese de campo elétrico homogêneo contourclamped (CHEF) a 4o C em 0,5 X TBE usando um tempo de pulso de aumento linear de 1 a 10 s. e uma intensidade de campo de 6 V/cm por 16 horas. Depois da eletroforese, o gel de agarose foi tingido com brometo de etídío para localizar a região do gel contendo fragmentos de DNA de aproximadamente 10 kbp no tamanho. Esta região foi excisada do gel e tratada com GEL ASE (Epicentre Technologies, USA) de acordo com o fabricante. O DNA selecionado por tamanho foi ligado ao vetor binário digerido com BamHI e desfosforílado pBINPLUS (van Engelen et al., 1995) seguido pela transformação em células competentes ElectroMAX E. coli DH10B (Life Technologies, UK). Por clone BAC um total de 384 clones foram triados pela PCR quanto a presença de seqüências MiGA usando os iniciadores univ24L e univl4L (Tabela 3). Os clones positivos foram selecionados para outra caracterização. Com base no padrão de restrição dos fragmentos 14L24L digeridos com as enzimas Rsal, Taql, Alui, Dpnil ou Msel, os grupos diferentes de MiGAs foram identificados. O MiGA que abriga o marcador 24L, que foi completamente presente nos clones BAC BIbSP39, 211 e 242 não foi detectado com os iniciadores universais univl4L e univ24L. A posição relativa das seqüências MiGA nos subclones de 10 kbp foi determinada pela PCR usando iniciadores internos 123Mi e 14L2 para a extremidade 5’ e univl4L e 24L2 para a extremidade 3’ em combinação com iniciadores derivados de seqüências de vetor pBINPLUS (ARO 295 e 296; Tabela 3). Dois subclones por RGA de cada biblioteca BAC foram selecionados para transformação.

Para a análise de complementação, os subclones selecionados foram transferidos aos cultivares de batata suscetíveis Impala e Kondor através da transformação mediada por Agrobacterium usando o UA143 isolado (Farrand et al., 1989) ou AGLO (Lazo et al., 1991). Os transformantes primários que abrigam os transgenes de interesse foram testados quanto a resistência ao P. infestans nos ensaios de folha destacada usando 1P0655-2A e IP082001 isolados (Tabela 4). Apenas as construções genéticas que abrigam RGC5, tanto o derivado de S. tuberosum quanto o de S. bulbocastanum, foram capazes de complementar o fenótipo suscetível tanto no cultivar Impala quanto no Kondor; no total 18 dos 19 transformantes primários contendo RGC5 foram resistentes (Tabela 4, Figura 12) ao passo que todos os genes RGC1, RGC2, RGC3, RGC4, RGC6, RGC7 ou RGC8 contendo os transformantes primários foram suscetíveis ao P. infestans, Como os transformantes RGC5 mostraram fenótipos de resistência similares como o precursor de S. bulbocastanum resistente da população de mapeamento B6, RGC5 foi designado o gene Rpi-blb2. O RGC24L homólogo também pode ser transferido para os cultivares de batata suscetíveis descritos e testados quanto a resistência ao P. infestans em um ensaio de folha destacada.

Uma seleção de transformantes primários contendo RGC5 foi analisada quanto ao número de cópia pela análise de Southern. O DNA genômico digerido com EcoRI foi hibridizado com uma sonda ptll (Tabela 3). Com base na presença do número de fragmentos de hibridização nptll, os transformantes primários contiveram pelo menos 1 a 11 insertos de transgene. No total, 4 integrações de cópia única no cultivar Impala e 6 no cultivar Kondor foram observadas dos quais um transformante do cultivar Kondor pareceu ter um fenótipo suscetível de P, infestans.

Para investigar se Rpi-blb2 também pode complementar o fenótipo suscetível no tomate, transformantes primário de cultivar Moneymaker que abriga a construção do gene Rpi-blb2 foram produzidos e testados com os isolados derivados da batata IP082001 e IP0655-2A. O ensaio de resistência à doença revelou que RGC5 também é capaz de complementar um fenótipo do tomate suscetível (Tabela 6).

Exemplo 13: Estrutura do gene Rpi-blb2 e seqüência de aminoácido putativa Os insertos dos subclones binários contendo RGC5 211 F/C12 e SP39-20 foram seqüenciados por uma estratégia de iniciador que encaminha por meio da qual rodadas consecutivas de sequenciamento foram realizadas usando um conjunto de iniciadores abrigados que foram planejados conforme a seqüência contígua foi estendida. O primeiro conjunto de seqüências foi gerado usando os iniciadores M13F e M13R. As seqüências completas dos insertos de clones 211 F/C12 e SP3920 consistiram de 7967 e 9949 nucleotídeos (nt), respectivamente (Figura 13). A seqüência do clone 211F/C12 foi idêntica à seqüência correspondente dentro do clone SP39-20. A posição e a estrutura putativa de Rpi-blb2 foram prognosticadas usando GENSCAN (Burge e Karlin, 1997), GeneMark (Lukashin e Borodovsky 1998) e através do alinhamento para a seqüências de gene de Mil.l e Mil.2. O comprimento e estrutura exatos da seqüência codificadora foram determinados através da amplificação rápida 5’ e 3’ de extremidades de cDNA (RACE) usando o kit GeneRacer (Invitrogen 5 Groningen, Países Baixos). RACE identificou fragmentos de cDNA específicos de Rpi-blb2 5’ e 3’ que compreendem as regiões não traduzidas 5’ e 3’ (UTRs) de 767 e 201 nucleotídeos (nt), respectivamente. O gene Rpi-blb2 contém dois introns. O intron 1 tem 626 nt de comprimento e posicionado dentro dos 32 nucleotídeos que terminam em 5’UTR a montante do códon de início ATG. O intron 2 tem 86 nt de comprimento começando 43 nucleotídeos a jusante do códon de início ATG do gene. A seqüência codificadora do transcrito Rpi-blb2 tem 3804 nucleotídeos. A matriz de leitura aberta deduzida do gene Rpi-blb2 codifica um polipeptídeo prognosticado de 1267 aminoácidos com um peso molecular estimado de 146 kD (Figura 14). Vários motivos funcionais presentes nos genes R da classe NBS-LRR de genes R vegetais são evidentes na proteína codificada. Como ilustrado na Figura 14, a proteína Rpi-blb2 pertence ao subconjunto de zíper de leucina (LZ) de proteínas de resistência NBS-LRR. A metade do terminal N da proteína Rpi-blb2 contém uma região LZ potencial entre os aminoácidos 413 e 434 e seis motivos conservados indicativo de um sítio de ligação de nucleotídeo (van der Biezen e Jones, 1998). A metade do terminal C de Rpi-blb compreende uma série de 15 LRRs irregulares que podem ser alinhadas de acordo com a seqüência de consenso hxxhxxLxxLxLxxC/N/Sx (x) LxxLPxx observada em outras proteínas R citoplásmicas, por meio do qual h pode ser L, I, Μ, V ou F, e x qualquer resíduo de aminoácido (Jones e Jones, 1997).

Exemplo 14: Homologia ao estado conhecido da técnica de seqüências do gene R

Para identificar homólogos in silico do gene Rpi-blb2, pesquisas BLAST (Altschul et al., 1990) foram realizadas com a seqüência codificadora do gene Rpi-blb2. As pesquisas de BLASTN identificaram várias seqüências com homologia significante ao gene Rpi-blb2. Usando o programa de alinhamento ClustalW (ajustes padrão) no pacote de software DNAStar, nós determinamos que a seqüência codificadora Rpi-blb2 compartilha a homologia mais alta ao Mi-1.1 (89,8 %) e Mi-1.2 (89,7 %) (Acesso ao GenBank números AF039681 e AF039682, respectivamente). A última seqüência corresponde ao gene Mi do tomate que confere resistência a três das espécies mais nocivas dos nematóides do nó da raiz (Meloidogyne spp.) (Milligan et al, 1998). Além disso, os nucleotídeos 2410 a 3461 da seqüência codificadora de Rpi-blb2 compartilha 87,8 % de homologia de seqüência com uma seqüência NBS-LRR parcial de Solanum nignim (Acesso ao GenBank número AY055116,1). Ao nível de aminoácido a seqüência de proteína de Rpi-blb2 putativa compartilha a homologia mais alta com Mi-1.1 (82 % de identidade) e Mi-1.2 (81 % de identidade) (Acesso ao Genbank números AF039681 e AF039682).

Através do alinhamento ClustalW das seqüências de aminoácido deduzidas de Rpi-blb2, Mi-1.1 e Mi-1.2 nós identificamos 200 resíduos de aminoácido (aa) que são únicos ao Rpi-blb2 (Figura 15). Destes, 31 são encontrados nas regiões hipervariáveis, isto é, o resíduo nesta posição é diferente em todas as três seqüências e 11 são codificados pelas inserções pequenas (uma inserção de resíduo de 3 aa e uma inserção de resíduo de 8 aa). O resto são específicos de Rpi-blb2 em que os resíduos de aa encontrados nas posições correspondentes em Mi-1.1 e Mi-1,2 são diferentes do resíduo Rpi-blb2 mas conservados nas duas seqüências de proteína Mi (Figura 15). DE modo interessante, o motivo VLDL que é conservado no terceiro LRR de muitas proteínas NBS-LRR incluindo Mi (Axtell et al, 2001; Banerjee et al, 2001), não é conservado emRpi-blb2 (Figura 15).

Exemplo 15: O alelo Rpi-blb2 mining na espécie Solanum selvagem Usando iniciadores ARF1F e ARF1R (Tabela 3B), planejados em tomo dos códons de início e parada do gene Rpi-blb2, é possível amplificar pela PCR, alelos de Rpi-blb2 de qualquer espécie de Solanum. Os produtos de amplificação podem ser clonados entre as seqüências reguladoras transcricionais em um plasmídeo binário e transferidos para o S. tuberosum através da transformação mediada pela Agrobacterium ou qualquer método conhecido por aqueles habilitados na técnica. Os transformantes primários resultantes podem ser subsequentemente analisados quanto a resistência ao P. infestans ou a qualquer patógeno para o qual a batata é uma planta hospedeira.

Exemplo 16: Material e métodos O material e o desenvolvimento de planta de populações de mapeamento m (1) Solanum tuberosum. Clones híbridos interespecíficos complexos, designados ABPT, foram fabricados por Hermsen e colaboradores (Hermsen, 1966; Hermsen e Ramanna, 1969; Ramanna e Hermsen, 1971; Hermsen e Ramanna, 1973; Hermsen, 1983; Hermsen, 1994) (Figura la). A etapa de duplicação do cromossoma com colchicinas foi descrita por Hermsen (1966) e Hermsen e De Boer (1971). Acredita-se que a resistência em alguns dos clones ABPT ao P. infestans seja derivada de um ou ambos dos acessos de S. bulbocastanum BGRC 8007 (CGN 21306; Pi 275196) e BGRC 8008 (CGN 17693; Pi 275198) que foram usados no cruzamento inicial para produzir híbridos entre S. acaule e S. bulbocastanum, visto que todos os outros precursores que foram usados no esquema de geração para clones ABPT foram suscetíveis ou apenas parcialmente resistentes ao P. infestans nos ensaios de folha destacada (Hermsen e Ramanna, 1973). Os tubérculos de 19 clones da população [(clone ABPT número 55 x cultivar (cv) Oberambacher Frühe) x cv Arkula], de 7 clones da população [(clone ABPT número 55 x cv Oberambacher Frühe) x cv Blanka] e de 5 clones da população [(clone ABPT número 60 x cv Alcmaria) x cv Blanka] foram recebidos em 1988 do antigo Department of Plant Breeding of the Wageningen Agricultural University (Wageningen, Países Baixos). O clones ARF 87-507, ARF 87-801 e ARF 87-601 foram selecionados destas populações respectivamente.

Eles representaram progênie de um segundo retrocruzamento (BC2) com os clones ABPT interespecíficos complexos e foram usados para outros retro cruzamentos que resultaram em uma população BC3 tetraplóide, duas populações BC4 tetraplóide e uma população BC4 diplóide que foram usadas para o mapeamento genético do gene Rpi-blb2 (Figura 1). A população de mapeamento de Solanum tuberosum tetraplóide ARG 95-15 foi produzida pelo cuzamento de clone resistente ao P. infestans ARF 87-507 com o cultivar suscetível Alkon. A população tetraplóide ARG 95-3 foi produzida pelo cmzamento de clone resistente ao P. infestans AR 911263 com o cultivar suscetível Cosmos. A população tetraplóide ARP 96-11 foi produzida pelo cuzamento de clone resistente AR 92-1292 com o cultivar suscetível Celeste. A população diplóide DPI foi obtida pelo cruzamento de clone resistente ARD 1197-16 com o clone suscetível ARD 93-2090 (Figura 1).

Material e desenvolvimento de planta de populações de mapeamento em (2) Solanum bulbocasíanum. A população de mapeamento de S. bulbocasíanum diplóide, designada B6 (sinônimo Bóa, Blb 99-229, Blb 00-7 e Blb 00-8), foi desenvolvida pelo cruzamento de um clone resistente de P. infestans Blb 2002 (sinônimo M94-81-C) com um clone suscetível Blb 48-5. Os resultados de cruzamentos recíprocos da população B6 foram combinados. O clone precursor resistente da população B6 foi obtida de um cruzamento entre o clone de S. bulbocasíanum Blb 93D26-3 (acesso BGRC 8002; CGN 17690; Pi 275187) como fêmea precursora e clone de S. bulbocasíanum Blb 93-60-10 (acesso BGRC 8006; Pi 275194) como precursor masculino. O clone precursor suscetível da população B6 foi obtido de um cruzamento entre clones de S, bulbocasíanum dos acessos BGRC 8005 (CGN 17692, PI 275193) e BGRC 8006 (Figura 2).

Ensaios de Doença; (1) Isolados de Phyiophihora infesíans Três isolados de P. infesíans diferentes foram obtidos da Plant Research International B. V. (Wageningen, Países Baixos). Os isolados tiveram estruturas de espécie diferentes e tipos de acasalamento como segue: IP082001: estrutura de espécie 1.2.3.4.5.6.7.10.11, tipo de acasalamento A2; IP0655-2A: estrutura de espécie 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, tipo de acasalamento Al; IP0428-2: estrutura de espécie 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11, tipo de acasalamento A2 (Flier ei ai, 2003).

Ensaios de Doença; (2) testes de campo Túberculos de planta cultivada em estufa ou batatas sementes cultivadas no campo foram plantadas nos locais de teste em Marknesse, Países Baixos de 1985 a 2002, na área de Toluca no México em 1991 ou em um local na Província de Benguet nas Filipinas em 1992. Para clones individuais, canteiros foram plantados consistindo de 1 a 10 tubérculos. Aproximadamente 8 semanas depois do plantio, o campo em Marknesse foi inoculado com uma solução de esporangiosporo de isolado de P. infestans IP082001 e as classificações de doença foram coletadas 3 a 6 semanas depois da inoculação. Os clones que foram livres ou quase livres da ferrugem tardia foram classificados como tendo um fenótipo de resistência ao passo que os clones com uma folhagem completa ou quase completamente atacada pela ferrugem foram classificados como suscetíveis. Os clones com reações intermediárias à ferrugem tardia foram classificados como tendo um fenótipo desconhecido. Nos testes de campo no México e nas Filipinas, a infecção natural ocorreu. Uma vez esta infecção natural pelo P. infestans se estabeleceu, a porcentagem da folhagem atacada pela ferrugem das plantas em cada canteiro foi marcada nos dias 8 e 6 respectivamente em uma escala de 1 a 9 foram estimadas porcentagens de folhagem atacada pela ferrugem de 1 a 9 foram: 0,3,10,25,50,75,90,97 e 100 (Estrada-Ramos et aL, 1983).

Ensaios de Doença (3) folhas destacadas Para o ensaio de folha destacada, as folhas de plantas cultivadas por 6 a 12 semanas na estufa foram colocadas em pedaços de espuma de florista saturada com água, aproximadamente 35x4x4 cm, e colocada em uma bandeja (40 cm de largura, 60 cm de comprimento e 6 cm de altura) com um fundo perfurado. Cada folha foi inoculada com duas gotículas (25 μΐ cada) de solução de esporangiosporo no lado abaxial. Subsequentemente, a bandeja foi colocada em um saco plástico no topo de uma bandeja, em que um papel de filtro saturado com água foi colocado, e incubado em um ambiente aclimatizado a 17° C e um fotoperíodo de 16h/8h dia/noite com luz fluorescente (Philips TLD50W/84HF e OSRAM L58W/21-840). Depois de 6 a 9 dias, as folhas foram avaliadas quanto ao desenvolvimento de sintomas de doença pelo P, infestans.

Avaliação: Plantas com folhas que claramente mostraram lesões por esporulação de 6 a 9 dias depois da inoculação foram consideradas ter um fenótipo suscetível, ao passo que as plantas com folhas não mostrando nenhum sintoma visível ou necrose no lado da inoculação na ausência de esporulação evidente foram consideradas ser resistentes.

Triagem de marcador de DNA vegetal O DNA genômico foi extraído de folhas jovens de acordo com Bendahmane et ai. (1997). Para a análise de PCR, 15 μΐ de misturas de reação foram preparados contendo 0,5 pg de DNA, 15 ng de cada iniciador, 0,2 mM de cada dNTP, 0,6 unidades de Taq-polimerase (15 U/μΙ, SphaeroQ, Leiden, Países Baixos), 10 mM de Tris-HCl pH 9,1. 5 mM de MgCl2,50 mM de KC1, 0,1 % de Triton X-100 e 0,01 % (p/v) de gelatina. As PCRs foram realizadas usando os seguintes perfis de ciclo: 25 segundos de desnaturação de DNA a 94° C, 30 segundos de recozimento e 40 segundos de alongamento a 72° C. Como uma primeira etapa na amplificação por PCR o DNA foi desnaturado por 5 min a 94° C e finalizado por uma etapa de alongamento de 5 min extra a 72° C. As reações de amplificação foram realizadas em um termociclador Biometra® T-Gradient ou Biometra® Uno-II (Westburg, Leusden, Países Baixos). Dependendo do marcador, o produto de PCR foi digerido com uma enzima de restrição apropriada. Um resumo dos marcadores incluindo as seqüências de iniciador, temperatura de recozimento e enzimas de restrição se apropriado, é dado na Tabela 3, Subsequentemente, os produtos de PCR (clivados) foram analisados pela eletroforese em géis de agarose ou acrilamida. Para a análise em gel de acrilamida, o Kit de Análise de DNA CleanGel e o Kit DNA Silver Staining (Amersham Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, Países Baixos) foram usados.

Alongamento de fragmentos de AFLP pelo Interlaçado Assimétrico Térmico (TAIL)-PCR O alongamento da seqüência de um fragmento AFLP foi realizado pela TAIL-PCR de acordo com Liu e Whittier (1995).

Resumidamente, o alongamento de fragmentos AFLP foi realizado usando 2 ou 3 iniciadores específicos abrigados (sp) em combinação com um iniciador degenerado arbitrário (AD). A primeira PCR foi realizada com iniciadores spl e AD, a segunda com sp2 e AD e a terceira com sp3 e AD de acordo com o esquema descrito na Tabela 5. A PCR foi realizada em reações de 25 μΐ contendo a mistura de PCR padrão como descrito anteriormente, exceto que 30 ng de iniciador AD foi usado. Os fragmentos alongados foram clonados em pGEM-T (Promega, Países Baixos) e seqüenciados. Construção e triagem de biblioteca BAC O clone resistente ARD 1197-16, heterozigoto para o local Rpi-blb2, foi usado como DNA fonte para a constracção da biblioteca BAC de S tuberosum, O clone resistente Blb 2002 heterozigoto para o local Rpi-blb2, foi usado como DNA fonte para a construção da biblioteca BAC de S. bulbocastanum. A preparação de DNA de peso molecular alto e a construção da biblioteca BAC foram realizadas como descrito em Rouppe van der Voort et αί, (1999). Para a biblioteca BAC de S. tuberosum, aproximadamente 120.000 clones com um tamanho de inserto médio de 100 kb, que corresponde de 8 a 10 equivalentes genômicos foram fmalmente obtidos. Um total de aproximadamente 70.000 clones foram individualmente armazenados em 177 placas de microtítulo de 384 reservatórios a -80° C. Outros 50.000 clones foram armazenados como 14 agrupamentos bacterianos contendo aproximadamente 4000 colônias brancas. Estes foram gerados raspando-se as colônias das placas de ágar em meio de Caldo de Luria contendo 18 % de glicerol e 12,5 pg/ml de cloranfenicol usando um espalhador de vidro estéril. Estes chamados super agrupamentos também foram armazenados a -80° C. Finalmente, outros 37.000 clones foram adicionados à biblioteca BAC de S. tuberosum. A biblioteca BAC de S. bulbocastanum consistiu de 48 super agrupamentos de aproximadamente 2.000 colônias. A triagem de marcador da biblioteca BAC que abriga os clones BAC individualmente armazenados foi realizada como descrito em Rouppe van der Voort et al (1999). Para a triagem da biblioteca BAC armazenada como super agrupamentos, o DNA plasmídico foi isolado de cada agrupamento de clones usando o protocolo de lise alcalina padrão e a PCR foi realizada para identificar agrupamentos positivos. As bactérias que correspondem aos agmpamentos positivos foram diluídos e plaqueados em placas de ágar Caldo Luria contendo cloranfenicol (12,5 pg/ml). Colônias brancas individuais foram subsequentemente coletadas em placas de microtítulo de 384 reservatórios e clones BAC positivos únicos subsequentemente identificados como descrito acima. Os nomes dos clones BAC isolados dos super agrupamentos carregam o prefixo SP (por exemplo, SP39).

Subclonagem de genes candidatos RGAs candidatos foram subclonados de clones BAC 24, 211, 242, BLBSP39 e BLBSP30 como segue. Alíquotas de aproximadamente 1 pg de DNA BAC foram digeridas com 1 U, 0,1 U ou 0,01 U de enzima de restrição Sau3AI por 30 min. O DNA BAC parcialmente clivado foi submetido Pa eletroforese CHEF a 4o C em 0,5 X TBE usando um tempo de pulso crescente linear de 1 a 10 s e uma intensidade de campo de 6 V/cm por 16 horas. Depois da eletroforese, o gel de agarose foi tingido com brometo de etídio para localizar a região do gel contendo fragmentos de DNA de aproximadamente 10 kbp no tamanho. Esta região foi excisada do gel e tratada com GELASE (Epicentre Technologies, USA) de acordo com o fabricante. O DNA de tamanho selecionado foi ligado ao vetor binário clivado com BamHI e defosforilado pBINPLUS (van Engelen et al, 1995) seguido pela transformação com células competentes ElectroMAX E. coli DH10B (Life Technologies, UK). Um total de 192 clones foram triados pela PCR quanto a presença de seqüências RGC usando os iniciadores de marcador 24L14L (Tabela 3). Os clones positivos foram selecionados para outra caracterização. A identificação dos clones que abrigam RGC1, RGC2, RGC3, RG4, RGC5, RGC6, RGC7, RGC8 e RGC24L foi realizada pelo seqüenciamento de fragmentos de PCR14L24L derivado de clones positivos. A posição relativa dos RGAs dentro de um subclone foi determinada pela análise de PCR usando iniciadores internos (24L2, 123Mi) em combinação com iniciadores específicos pBINPLUS (Tabela 3).

Transformação mediada por Agrobacíerium tumefaciens de batata Os plasmídeos binários que abrigam os genes candidatos foram transformados em uma cepa de A. tumefaciens AGLO (Lazo et al., 1991) ou UIA143 (Farrand et al, 1989), a última contendo o plasmídeo auxiliar pCH32 (Hamilton et al,, 1996). As culturas durante a noite das cepas de A. tumefaciens transformadas foram usadas para transformar discos de tubérculo da batata (cvs Impala e Kondor) de acordo com protocolos padrão (Hoekema et al, 1989; Fillati et al, 1987). Resumidamente, batatas sementes certificadas de cultivares Impala e Kondor foram descascadas e a superfície esterilizada por 30 min em uma solução a 1 % de hipoclorato de sódio contendo 0,1 % de Tween-20. Os tubérculos foram depois lavados cuidadosamente em grandes volumes de água destilada estéril (4 vezes, 10 min). Os discos de aproximadamente 2 mm de espessura e 7 mm no diâmetro foram fatiados de cilindros de tecido de tubérculo preparados com um furador de cortiça. Os discos de tubérculo foram transferidos em meio MS30 líquido contendo A. tumefaciens e incubado por 15 min. Depois de remover a solução de A. tumefaciens, os discos de tubérculo foram transferidos para meio de regeneração contendo MS30, 0,9 mg/1 IAA, 3,6 mg/1 de zeatina ribosídeo e 8 g/1 de ágar (Hoekema et al, 1989). As placas foram incubadas a 24° C, 16 horas de duração do dia (Philips TLD50W/84HF). Depois de 48 horas de co-cultivo, os discos de tubérculo foram enxaguados por 5 min em meio MS líquido incluindo antibióticos, 200 mg/1 de vancomicina, 250 mg/1 de cefotaxim e 75 mg/1 de canamicina, e transferidos para o meio de regeneração suplementado com os mesmos antibióticos. As placas foram incubadas a 24° C, 16 horas de duração do dia (Philips TLD50W/84HF). A cada três semanas, os discos de tubérculo foram transferidos para meio fresco. Os brotos de regeneração foram transferidos para meio MS30 contendo 75 mg/1 de canamicina. Os brotos de enraizamento foram propagados in vitro e testados quanto a ausência de células de A. tumefaciens pela incubação de um pedaço de haste em 3 ml de meio de Caldo Luria (3 semanas, 37° C, 400 rpm). Uma planta de cada regenerado transformado foi transferido para a estufa.

Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens de tomate Sementes da linhagem de tomate suscetível Moneymaker foram enxaguadas em 70 % de etanol para dissolver o revestimento da semente e lavadas com água estéril. Subsequentemente, as sementes foram esterilizadas na superfície em 1,5 % de hipoclorito de sódio por 15 minutos, enxaguados três vezes em água estéril e colocadas em recipientes contendo 140 ml de meio MS pH 6,0 (Murashige e Skoog, 1962) suplementado com 10 g/1 de sacarose (MS 10) e 160 ml de vermiculita. As sementes foram deixadas germinar por 8 dias a 25° C e 0,5 W/M2 de luz.

Explantes de cotilédone de oito dias de idade foram pré cultivados por 24 horas em placas de Petri contendo uma camada alimentadora de duas semanas de idade de células de suspensão de tabaco plaqueadas no meio de co-cultivo (MS30 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Baixos), 0,5 g/1 tampão MES e 8 g/1 de ágar Daichin).

As culturas durante a noite de A. tumefaciens foram centrifugadas e as pelotas foram recolocadas em suspensão em meio de suspensão de célula (MS30 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch, 0,5 g/1 de tampão MES, pH 5,8) contendo 200 μΜ de acetoseringona a uma O.D.goo final de 0,25. Os explantes foram depois infectados com a cultura durante a noite diluída de A. tumefaciens UIA143 contendo pBINRGC5 por 25 minutos, manchadas secas em papel de filtro estéril e co-cultivadas por 48 horas nas placas de camada alimentadora original. As condições de cultura foram como descrito acima. A seguir do co-cultivo, os explantes de cotilédones foram transferidos para placas de Petri com meio indutor de broto seletivo (MS pH 5,8 suplementado com 10 g/1 de glicose, incluindo vitaminas Nitsch, 0,5 g/1 de tampão MES, 5 g/1 de gel de ágar, 2 mg/1 de zeatina ribosídeo, 400 mg/1 de carbenicilina, 100 mg/1 de canamicina, 0,1 mg/1 de IAA) e cultivadas a 25° C com 35 W/m2 de luz. Os explantes foram sub-cultivados a cada 3 semanas sobre meio fresco. Os brotos que emergem foram dissecados do calo subjacente e transferido aos recipientes com meio indutor de raiz seletivo (MS10 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch, 0,5 g/1 de tampão MES, 5 g/1 de gel de ágar, 0,25 mg/1 de IBA, 200 mg/1 de carbenicilina e 100 mg/1 canamicina), Extração de RNA O RNA total foi isolado usando Trizol de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante (Invitrogen, Groningen, Países Baixos) com modificações menores. Em resumo, 0,5 g de tecido de folha jovem foi triturado em nitrogênio líquido e o pó colocado em suspensão em 5 ml de Trizol. Depois de uma incubação de 5 min na temperatura ambiente (RT), 0,5 ml de clorofórmio foi adicionado, a suspensão foi turbilhonado e incubado por 2 min. Depois da centrifugação (15 min, 11404 x g, 4o C) o sobrenadante foi transferido a um tubo novo e 2,5 ml de isopropanol foi adiconado. Depois de 10 min na temperatura ambiente, os ácidos nucléicos foram precipitados (10 min, 11404 xg, 4o C). A pelota foi lavada com 5 ml de etanol a 70 % (5 min, temperatura ambiente) e depois centrifugação (5 min, 6415 x g, 4o C), a pelota foi secada e recolocada em suspensão em 100 μΐ de água destilada estéril. PoliA+ RNA foi extraído do RNA total usando 0 kit OligotexT mRNA midi (Qiagen, GmbH, Alemanha).

Amplificação rápida de extremidade de cDNA.

As extremidades 5’ e 3’ do cDNA de Rpi-blb2 e a confirmação das posições de intron putativas foram determinadas pela amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) usando 0 kit GeneRacer (Invitrogen, Groningen, Países Baixos). 5’-RACE foi realizada em cDNA sintetizado com iniciador GSP4 (ARO 772). Subsequentemente, 0 iniciador GSP6 (ARO 774) foi usado em combinação com 0 iniciador GeneRacer 5’ e a amplificação final foi realizada com GSP6 em combinação com 0 iniciador abrigado GeneRacer 5’. 3’-RACE foi realizada com os iniciadores abrigados GSP1 (ARO 769) e GSP2 (ARO 770) em combinação com 0 iniciador GeneRacer 3’. A amplificação final foi realizada com GSP3 (ARO 771) em combinação com iniciador 3’ abrigado GeneRacer.

As etapas de amplificação por RACE tanto 3’ quanto 5’ foram realizadas usando Accuprime (Ivitrogen®, Groningen, Países Baixos) ao invés da Taq polimerase fornecida pelo kit GeneRacer.

Impressão digital de AFLP e clonagem de fragmentos de AFLP A preparação do padrão e a impressão digital de AFLP foram essencialmente realizadas como descrito em Vos et al. (1995). De modo a 33 clonar fragmentos específicos os fragmentos de AFLP rotulados com P foram excisados do gel de acrilamida pela sobreposição dos géis de poliacrilamida, secadas em papel Whatmann 3MM, com imagens de autorradiograma. Os pedaços de gel/papel por baixo da faixa de interesse foram cortados e transferidos a 200 μΐ de TE e incubados por 1 h na temperatura ambiente. Cinco microlitros de sobrenadante foram usados para re-amplificar 0 fragmento, usando uma PCR em que 0 EcoRI+0 em combinação com MseI+0 foram usados como iniciadores. O fragmento AFLP re-amplificado foi subsequentemente clonado no vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Países Baixos) e os insertos de vários clones seqüenciados. A seqüência de DNA da faixa AFLP excisada foi usada para planejar iniciadores específicos de local. O produto de amplificação obtido com tais iniciadores foi triado quanto a polimorfismos internos com enzimas de restrição. Depois da restrição, os fragmentos foram separados em um gel de agarose de 2 a 3 % incluindo brometo de etídio.

Análise de RGA-AFLP A preparação padrão foi essencialmente realizada como descrito em Vos et al (1995). Entretanto, a segunda etapa de amplificação foi realizada com o iniciador SI com base na alça P de Leister et al (1996) em combinação com o iniciador AFLP EcoRI+0. Uma mistura de reação de 10 μΐ [0,5 μΐ de iniciador SI rotulado com 33P (10 ng/μΐ); 0,5 μΐ de iniciador EcoRl+0 (10 ng/μΐ); 0.8 μΐ de dNTPs (5 mM); 2 μΐ de tampão de PCR lOx Goldstar® (Eurogenetc, Bélgica); 1,2 μΐ de MgCl2 (25 mM); 0,06 μΐ de Goldstar® DNA polimerase (5 U/μΙ) (Eurogentec, Bélgica); 14,94 μΐ de água MQ] foi adicionado a 10 μΐ de padrão diluído (20x diluído em água MQ) e uma reação de PCR realizada usando o seguinte perfil de ciclo: 45 segundos de desnaturação de DNA a 94° C, 45 segundos iniciador recozendo a 49° C e 2 min de etapa alongamento a 72° C (35 ciclos). Antes da ciclagem o DNA padrão foi desnaturado por 2 min a 94° C e a PCR foi finalizada por uma aplicação de uma etapa de alongamento de 5 min extra a 72° C. As reações de amplificação foram realizadas em um termociclador Perkin Elmer 9600. Os fragmentos de produtos da PCR rotulados foram separados em um gel de poliacrilamida a 6 % e as faixa individuais visualizadas pela autorradíografía de acordo com procedimentos padrão.

Exemplo 17: Fenótipo de expressão de Rpi-blb2 Material & Métodos Quatro lesões (6 dias depois da inoculação nas condições padrão) de folhinhas infectadas (IP082001) foram enxaguadas em 3 ml de H2O. A concentração foi determinada usando um hemocitômetro Fuchs-Rosenthal (W. Schreck Hofheim/Ts.) Definição: índice de esporulação é a quantidade de esporângios por ml detectado nas lesões de folhinhas infectadas.

Tabela 7. índice de esporulação de genótipos diferentes depois da infecção com P. infestans em um ensaio de folha destacada A diferença entre Rpi-blb2 e outros genes de resistência de P. infestans é que Rpiblb2 permite um baixo nível de esporulação (Figura 18). Isto é demonstrado por um ensaio de folha destacada em que as lesões presentes no genótipo Rpi-blb2 (ARD 92-1197-16) mostram um baixo nível de esporângios em relação à ausência completa de esporângios em um genótipo contendo 0 gene R2 de S. demissum. Entretanto, 0 índice de espomlação é apenas de 1,1 % de um fenótipo suscetível (cv, Bintje) (Tabela 7 e Figura 18).

Experimentos de campo também mostraram que Rpi-blb2 permite um baixo nível de infecção. Os sintomas de ferrugem tardia desenvolvidos em um nível baixo durante a estação de cultivo (Figura 3, ARF87801) ou no final da estação de cultivo (Figura 2, ARF87-601; Figura 3, ARF87-507 e ARF87-601).

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REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. Método para gerar ou aumentar a resistência de uma planta a um patógeno vegetal do filo Oomyceta, caracterizado pelo fato de que compreende aumentar a atividade da proteína Rpi-blb2 na planta ou um tecido, órgão ou célula de uma planta ou uma parte desta pela expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Rpi-blb2 transgênica d ou pelo aumento do número de cópias de uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Rpi-blb2, em que a referida proteína Rpi“blb2 é codificada por um polinucleotídeos compreendendo uma molécula de ácido nucleico que consiste na molécula de ácido nucléico que compreende a sequência codificadora como representada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6 que codifica pelo menos a forma madura do polipeptídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a atividade de uma outra proteína de resistência é aumentada,

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a atividade é aumentada devido a uma expressão de novo.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a atividade endógena de uma Rpi-blb2 é aumentada.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais das seguintes etapas a) estabilizar a proteína de resistência; b) estabilizar a proteína de resistência que codifica mRNA; c) aumentar a atividade específica da proteína de resistência; d) expressar ou aumentar a expressão de um fator de transcrição homólogo ou artificial para a expressão da proteína de resistência; e) estimular a atividade da proteína de resistência através de fatores de indução exógenos; f) expressar um gene que codifica a proteína de resistência transgênica; e/ou g) aumentar o número de cópia do gene que codifica a proteína de resistência.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que resulta em redução no índice de esporulação em pelo menos 30 % depois da infecção com P. infestam comparado a um tipo selvagem.

7. Método para a produção de uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal transgênicos ou uma parte destes tendo uma resistência aumentada a um patógeno de planta do filo Oomyceta, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) introduzir um polinucleotídeo compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreende a seqüência codificadora como representada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6 que codifica pelo menos a forma madura do polipeptídeo; e (ii) selecionar as plantas nas quais, em oposição ou quando comparadas à planta de referência, a resistência ao dito patógeno existe ou é aumentada.

8. Método para a produção de uma planta ou uma parte desta resistente a um patógeno vegetal do filo Oomyceta, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa: expressar na planta ou uma parte desta um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos codificada por um polinucleotídeo compreendendo a molécula de ácido nucleico que compreende a seqüência codificadora como representada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6 que codifica pelo menos a forma madura do polipeptídeo.

9. Uso de um polinucleotídeo compreendendo uma molécula de ácido nucleico que consiste em moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüência codificadora como representada nas SEQ ID NOs: 1 ou 3 ou 5 ou 6 que codifica pelo menos a forma madura do polipeptídeo caracterizado pelo fato de ser para produzir uma planta ou um tecido vegetal, órgão vegetal ou uma célula vegetal ou uma parte destes resistentes a um patógeno vegetal do filo Oomyceta.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o patógeno vegetal é da ordem Pythiales ou Peronosperales.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 ou 10, caracterizado pelo fato de que o patógeno vegetal é das espécies P. infestam, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora capsici, Phytophthora sojae, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Bremia lactuca, Peronospera tabaci ou Plasmopara viticola.

12. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a outra proteína de resistência é a proteína Rpi-blb.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, ou 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo, o polipeptídeo, a célula vegetal, a célula hospedeira, o tecido vegetal ou a planta são derivados da família Solanceae, preferivelmente S. bulbocastanum, batata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum ou Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten da Farwell), petúnia, tree tomate (S. betaceum), melão pêra (S. muricatum) ou beringela (S. melongena).

14. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o patógeno vegetal é da ordem Pythiales ou Peronosperales.

15. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o patógeno vegetal é das espécies P. infestans, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora capsici, Phytophthora sojae, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Bremia lactuca, Peronospera tabaci ou Plasmopara viticola.

16. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo, o polipeptídeo, a célula vegetal, a célula hospedeira, o tecido vegetal ou a planta são derivados da família Solanceae, preferivelmente S. bulbocastanum, batata (S. tuberosum), tomate (S. lycopersicum ou Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten da Farwell), petúnia, tree tomate (S. betaceum), melão pêra (S. muricatum) ou beringela (S. melongena).