BRPI0414845B1 - mólecula de ácido nucleico, vetor, célula de levedura, partícula semelhante a vírus, bem como método para produzir a dita partícula semelhante a vírus - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS, MÉTODO PARA PRODUZIR AS PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS. VACINA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, E, MÉTODOS PARA PREVENIR INFECÇÃO POR HPV E PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM ANIMAL. Moléculas de DNA sintéticas codificadoras de proteína HPV45 LI são providas. Especificamente, a presente invenção proporciona polinucleotídeos codificadores de proteína HPV45 Ll, na qual os citados polinucleotídeos têm sido códon-otimizados para expressão de alto nível em uma célula de levedura. As moléculas sintéticas podem ser usadas para produzir partículas semelhantes ao vírus HPV45 (VLPs), e para produzir vacinas e composições farmacêuticas compreendendo HPV45 VLPs. As vacinas da presente invenção proporcionam imunoprofilaxia efetiva contra infecção pelo papilomavírus por meio de imunidade mediada por célula e anticorpo neutralizador.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral à terapia de papilomavírus de humano (HPV). Mais especificamente, a presente invenção refere-se aos polinucleotídeos sintéticos codificadores de proteína HPV45 Ll, e aos vetores recombinantes e aos hospedeiros compreendendo os citados polinucleotídeos. Esta invenção também se refere às partículas semelhantes ao vírus HPV45 (VLPs), na qual as VLPs são produzidas pela expressão de Ll ou de Ll + L2 recombinantes de HPV45 em células de levedura e ao seu uso em vacinas e composições farmacêuticas para prevenir e tratar HPV.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Há mais do que 80 tipos de papilomavírus de humano (HPV), muitos dos quais têm estado associados com uma ampla variedade de fenótipos biológicos, desde verrugas proliferativas benignas a até carcinomas malignos (para revisão, veja McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol.82(1): 15- 33 (2001)). HPV6 e HPV11 são os tipos mais comumente associados com verrugas benignas e/ou condiloma acuminado não maligno de mucosa genital ou respiratória. HPV16 e HPV18 são os tipos de alto risco mais freqüentemente associados com carcinomas in situe invasivos da cerviz, da vagina, da vulva e do canal anal. Mais do que 90% dos carcinomas cervicais estão associados com infecções de HPV 16, HPVI8 ou com os tipos oncogênicos menos prevalecentes HPV31, -33, -45, -52 e -58 (Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst.85(12): 958-64 (1993)). A observação de que o DNA de HPV é detectado em mais do que 90% dos cânceres cervicais proporciona evidência epidemiológica forte de que os HPVs causam carcinoma cervical “MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICÓ* VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS, MÉTODO PARA PRODUZIR AS PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS, VACINA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, E, MÉTODOS PARA PREVENIR INFECÇÃO POR - 5 HPV E PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM ANIMAL” < CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral à terapia de papilomavírus de humano (HPV). Mais especificamente, a presente invenção refere-se aos polinucleotídeos sintéticos codificadores de proteína HPV45 Ll, ^0 e aos vetores recombinantes e aos hospedeiros compreendendo os citados polinucleotídeos. Esta invenção também se refere às partículas semelhantes ao vírus HPV45 (VLPs), na qual as VLPs são produzidas pela expressão de Ll ou de Ll + L2 recombinantes de HPV45 em células de levedura e ao seu uso em vacinas e composições farmacêuticas para prevenir e tratar HPV.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Há mais do que 80 tipos de papilomavírus de humano (HPV), muitos dos quais têm estado associados com uma ampla variedade de fenótipos biológicos, desde verrugas proliferativas benignas a até carcinomas malignos (para revisão, veja McMurray ei al., Int. J. Exp. Pathol.82(1): 15- 33 (2001)). HPV6 e HPV11 são os tipos mais comumente associados com verrugas benignas e/ou condiloma acumimdo não maligno de mucosa genital ou respiratória. HPV16 e HPV18 saj os tipos de alto risco mais frequentemente associados com carcinomas in situe invasivos da cerviz, da ■ vagina, da vulva e do canal anal. Mais do que 90% dos carcinomas cervicais estão associados com infecções de H?V16, HPV 18 ou com os tipos oncogênicos menos prevalecentes HPV31, -33, -45, -52 e -58 (Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst.85(12): 958-64 (1993)). A observação de que o DNA de HPV é detectado em mais do que 90% dos cânceres cervicais proporciona evidência epidemiológica forte de que os HPVs causam carcinoma cervical (veja Bosch et al., J. Natl. Cancer Inst. 87(11): 796-802 (1*995)).

Os papilomavírus são virus de DNA icosaédricos, não envelopados, pequenos (50-60 nm) que codificam até oito genes precoces e dois genes tardios. As matrizes de leitura aberta (ORFs) dos genomas virais * 5 são chamadas de El a E7, e Ll e L2, nas quais "E" denota precoce e ”L" * tardio. Ll e L2 codificam proteínas de capsídeo do vírus, enquanto que os genes E estão associados com funções tais como replicação virai e transformação celular.

A proteína Ll é a maior proteína de capsídeo e possui um peso ^0 molecular de 55-60 kDa. A proteína L2 é a menos proteína de capsídeo. Dados imunológicos sugerem que a maior parte da proteína L2 é interna à proteína Ll no capsídeo virai. Ambas as proteínas Ll e L2 estão elevadamente conservadas dentre os papilomavírus diferentes.

A expressão da proteína Ll ou de uma combinação de 15 proteínas Ll e L2 em células de levedura, de inseto, células de mamífero ou em bactérias acarreta a auto-montagem das partículas semelhantes a vírus (VLPs) (para revisão, veja, Schiller e Roden, em Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lac ey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp. 101-12 (1996)). VLPs são morfologicamente "O semelhantes aos virions autênticos e são capazes de induzir títulos altos de anticorpos neutralizadores sob administração em um animal. Devido ao fato de as VLPs não conterem o genoma vira^ potencialmente oncogênico, elas apresentam uma alternativa segura para o uso de vírus vivo em desenvolvimento de vacina de HPV (para revisão, veja Schiller e Hidersheim, 25 J. Clin. Virol.19:67-74 (2000)). Por este motivo, os genes Ll e L2 têm sido identificados como alvos imunológicos para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas para a doença e a infecção por HPV.

O desenvolvimento e a comercialização de vacina de HPV têm sido impedidos por dificuldades associadas com a obtenção de níveis de produção de proteína purificada. lize as sequências de nucleotídeos expressão altos de genes exógenos em organismos hospedeiros bem sucedidamente transformados, limitando a Portanto, a despeito da identificação das séqüências de nucleotídeos de tipo selvagem codificadoras de proteínas HPV Ll tal como a proteína HPV45 Ll, seria elevadamente desejável o desenvolvimento de uma fonte prontamente renovável de proteína HPV Ll bruta que ut: codificadoras de HPV45 Ll que estão otimizadas para a expressão na célula hospedeira intencionada. Adicionalmente seria útil produzir quantidades grandes de HPV45 Ll VLPs possuindo as propriedades proporcionadoras de imunidade das proteínas nativas para uilização em desenvolvimento de vacina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção referd-se às composições e aos métodos para gerar ou intensificar imunidade aos produtos de proteína expressados pelos genes HPV45 Ll, que têm estado associados com câncer cervical. Especificamente, a presente invenção proporciona polinucleotídeos codificadores de proteína HPV45 Ll, na qual os polinucleotídeos têm sido códon-otimizados para expressão de alto nível em uma célula de levedura. A presente invenção adicionalmente proporciona partículas semelhantes ao vírus HPV45 (VLPs), na qual as citadas VLPs são produzidas pela expressão de Ll ou de Ll + L2 de HPV45 recombinantes uso de HPV45 VLPs em composiçõe prevenção e/ou o tratamento de câncer associado com HPV.

A presente invenção refere-se às moléculas de DNA sintéticas codificadoras de proteína HPV45 Ll. Os códons das moléculas sintéticas estão planejados de modo que uma célula de levedura use os códons preferidos. As moléculas sintéticas podem ser utilizadas como uma fonte de proteína HPV45 Ll, que pode ser auto-montável em VLPs. As citadas VLPs podem ser empregadas em uma vacina baseada em VLP. em células de levedura e descreve o s farmacêuticas e vacinas para a

Uma modalidade exemplar da presente invenção compreende uma molécula de ácido nucleico sintética que codifica a proteína Ll de HVP45 como apresentada na SEQ ID NO: 2, a citada molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos como apresentada na 5 SEQ ID NO: 1.

Também são proporcionados vetores recombinantes e células hospedeiras recombinantes, tanto procarióticas quanto eucarióticas, que contêm as moléculas de ácido nucleico descritas em todo este relatório descritivo.

A presente invenção também se refere a um processo para expressar uma proteína HPV45 Ll em uma célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introduzir um vetor compreendendo um ácido nucleico codificador de uma proteína HPV45 L l em uma célula hospedeira de levedura; e (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que 15 também permitem a expressão da citada proteína HPV45 Ll.

A presente invenção refere-se em adição a um processo para expressar uma proteína HPV45 Ll em uma célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introduzir um vetor compreendendo um ácido nucleico codificador de uma proteína HPV45 Ll em uma célula hospedeira; sendo que lo a molécula de ácido nucleico está códon-otimizada para ótima expressão em célula hospedeira de levedura e; (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitem a expressão ce citada proteína HPV45 LL

Em modalidades preferidas, o ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1 (sequência 45 25 Ll R).

Esta invenção também se refere às partículas semelhantes a vírus HPV45 (VLPs) que são produzidas em células de levedura, aos métodos de produção de HPV45 VLPs, e aos métodos de uso de HPV45 VLPs.

Em uma modalidade preferida da invenção, a levedura é selecionada do grupo consistindo dê: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, e Schizosaccharomyces pombe.

Outro aspecto desta invenção é uma HPV45 VLP, no qual a VLP é produzida pela expressão recombinante de HPV45 Ll ou Ll + L2 em uma célula de levedura.

Ainda outro aspecto desta invenção é uma HPV45 VLP que compreende uma proteína HPV45 Ll codificada por um gene HPV45 Ll códon-otimizado. Em uma modalidade exemplar deste aspecto da invenção, o ^0 gene HPV45 Ll códon-otimizado compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1.

Esta invenção também proporciona um método para induzir uma resposta imune em um animal compreendendo administrar partículas semelhantes ao vírus HPV45 ao animal. Em uma modalidade preferida, as 15 HPV45 VLPs são produzidas por um gene códon-otimizado.

Ainda outro aspecto desta invenção é um método de prevenir ou de tratar câncer cervical associado com HPV compreendendo administrar a um mamífero uma vacina compreendendo HPV45 VLPs. Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, as HPV45 VLPs são ío produzidas em levedura. ' Esta invenção também se refere a uma vacina compreendendo partículas semelhantes a vírus HPV45 (VLPs).

Em uma modalidade alternativa deste aspecto da invenção, a vacina compreende adicionalmente VLPs c.e pelo menos um tipo de HPV 25 opcional. O pelo menos um tipo de HPV opcional pode ser de qualquer tipo de HPV de interesse, incluindo qualquer tipo de HPV descrito na técnica ou aqueles subsequentemente identificados. Em uma modalidade preferida, o tipo de HPV é um tipo que está associado com um fenótipo clínico tal como verrugas ou câncer cervical. Em uma outra modalidade preferida, o pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo consistindo de: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, e HPV68.

Esta invenção também se refere às composições farmacêuticas compreendendo as partículas semelhantes a vírus HPV45. Em adição, esta invenção refere-se às composições farmacêuticas compreendendo HPV45 VLPs e VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Em uma modalidade preferida, o pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo consistindo de: HPV6, HPV11, HPV16, EÍPV18, HPV31, HPV33, HPV35, 40 HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, e HPV68.

Como usadas em todo o relatório descritivo e nas reivindicações apendidas, as formas no singular de "um", "uma", e "o", "a" incluem as correspondentes no plural a não ser que o contexto dite claramente o contrário.

Como usadas em todo o relatório descritivo e nas reivindicações apendidas, as seguinte definições e aplicações se aplicam: O termo "promotor"refere-se a um sítio de reconhecimento em uma fita de DNA no qual a RNA polimerase se liga. O promotor forma um complexo de iniciação com RNA polimerase para iniciar e conduzir a lo atividade de transcrição. O complexo pode ser modificado por seqüências ativadoras chamadas de "intensificadoras" ou "seqüências ativadoras a montante" ou seqüências inibidoras chamadas de "silenciadoras". O termo "vetor"refere-se a alguns meios pelos quais os fragmentos de DNA podem ser introduzidos em um organismo hospedeiro ou 25 tecido hospedeiro. Há vários tipos de vetores incluindo plasmídeos, vírus (incluindo adenovirus), bacteriófagos e cosmídeos.

A designação "sequência de tipo selvagem 45 Ll"refere-se à seqüência de HPV45 Ll DNA aqui descrita como SEQ ID NO: 3 (45 Ll wt). Embora a seqüência de HPV 45 Ll DNA de tipo selvagem tenha sido descrita previamente, não é incomum encontrar variações de seqüência menores entre os DNAs obtidos de isolados clínicos. Portanto, uma seqüência de 45 Ll DNA de tipo selvagem representativa foi isolada de amostras clínicas, as quais, como previamente mostrado, contêm HPV45 DNA (veja EXEMPLO 1). A seqüência 45 Ll de tipo selvagem íbi usada como uma seqüência de referência em comparação com as seqüências 45 Ll códon-otimizadas aqui descritas (veja FIGURA 1).

A designação "HPV 45 Ll R" ou "45 Ll R" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos HPV45 Ll sintética (SEQ ID NO: 1), aqui descrita, na qual a seqüência foi reconstruída de modo que compreendesse códons que são preferidos para a expressão de alto nível por uma célula de levedura. O termo "quantidade efetiva" significa que composição de vacina suficiente é introduzida para produzir os níveis adequados de polipeptideo, de modo que resulte uma resposta imune. Uma pessoa experiente na técnica reconhecerá que este nível pode variar. Uma "substituição de aminoácido conservativa" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por outro, resíduo de aminoácido quimicamente semelhante. Exemplos de tais substituições conservativas são: substituição de um resíduo hidrofóbico (isoleucina, leucina, valina, ou metionina) por outro/ substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar de mesma carga (por exemplo, lisina por arginina; ácido aspártico por ácido glutâmico). O termo "mamífero" refere-se a qualquer mamífero, incluindo um ser humano. "VLP" ou "VLPs" significa(rr) partícula semelhante a vírus ou partículas semelhantes a vírus. "Sintético" significa que o gene HPV45 Ll foi preparado de modo a conter uma seqüência de nucleotídeos que não é igual à seqüência de nucleotídeos presente no gene HPV45 Ll de tipo selvagem naturalmente ocorrente (45 Ll wt, SEQ ID NO: 3). Gomo enunciado acima, moléculas sintéticas são aqui proporcionadas compreendendo uma sequência de nucleotídeos compreendendo códons que são preferidos para a expressão por células de levedura. As moléculas sintéticas aqui proporcionadas codificam a 5 mesma seqüência de aminoácidos que a do gene HPV45 Ll de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2).

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

FIGURA 1 é um alinhamento de sequências de DNA mostrando nucleotídeos que foram alterados no gene HPV45 Ll sintético da |0 presente invenção (SEQ ID NO: 1, indicada como "45 Ll R") (veja EXEMPLO 2). A seqüência de referência é a seqüência 45 Ll de tipo selvagem (SEQ ID NO: 3, indicada como "45 Ll wt"; veja EXEMPLO 1). Nucleotídeos alterados são indicados em sua localização correspondente. Número de nucleotídeos está contido entre parênteses. Nucleotídeos idênticos 15 na seqüência reconstruída 45 Ll estão indicados com pontos.

FIGURA 2 mostra as seqü meias de aminoácidos de código único e de nucleotídeos HPV 45 Ll sintéticas reconstruídas. O número de nucleotídeos está indicado à esquerda.

FIGURA 3 mostra um Northerns blot sondado especificamente ^0 para HPV 45 Ll RNA sob condições de estringência alta (veja EXEMPLO 4). Faixa (1) contém 5 pg de HPV 45 Ll RNA e faixa (2) contém 10 pg de HPV 45 Ll R RNA. Um transcrito de RNA de comprimento total é evidente sobre o blot. Seta à esquerda indica a posição predita de um transcrito de HPV 45 Ll de comprimento total.

FIGURA 4 mostra um Western Blot de HPV45 Ll wt e de três isolados de HPV 45 Ll. Conteúdos das faixas são: 45 Ll wt (faixa 1), 45 Ll R #4 (faixa 2), 45 Ll R #7 (faixa 3), 45 Ll R #1 (faixa 4), HPV 16 Ll controle (faixa 5). Quinze microgramas de extrato de proteína de levedura total foram carregados para dentro de cada faixa de um gel de 10% SDS- PAGE. Um anti-soro policlonal de cabra contra uma proteína de fusão TrpE- HPV 45 Ll foi usado para especificamente identificar a proteina HPV 45 Ll. A seta à esquerda indica a posição de 55 kDa.

FIGURA 5 mostra uma porção dos dados de dois 5 experimentos de ELISA em ng de VLP/ pg de proteina total (veja EXEMPLO 7). Uma comparação entre 45 Ll wt e dois clones separados de 45 11 R, é mostrada. Expressão de HPV 45 Ll VLP reconstruída foi de aproximadamente 2 vezes maior do que a de 45 Ll wt.

FIGURA 6 mostra uma amostra representativa de HPV 45 JO VLPs compostas de moléculas de proteina HPV 45 Ll R, aqui descritas, como visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (veja EXEMPLO.8). A barra representa aproximadamente 100 nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os carcinomas cervicais estão em sua maioria associados com 15 infecções de tipos de oncogenes específicos de papilomavírus de humano (HPV). A presente invenção refere-se às composições e aos métodos para gerar ou intensificar a imunidade aos produtos de proteína expressados por genes de tipos de HPV oncogênicos. Especificamente, a presente invenção proporciona polinucleotídeos codificadores de proteína HPV45 Ll, que se ^0 auto-montam em partículas semelhantes a vírus HPV45 (VLPs) e descreve o uso de citados polinucleotídeos e VLPs em composições farmacêuticas e vacinas para a prevenção e/ou o tratamento de câncer associado com HPV.

A seqüência de nucleotídeos HPV45 Ll de tipo selvagem tem sido relatada (Número de Acesso no GenBank: NC_001590; veja também 25 Delius e Hofman, Curr. Top. Microbiol. Tmmunol. 186: 13-31 (1994)). A presente invenção proporciona moléculas de DNA sintéticas codificadoras de proteína HPV45 Ll. As moléculas sintéticas da presente invenção compreendem uma seqüência de códons, na qual pelo menos uma porção dos códons tem sido alterada para que uma célula de levedura use os códons preferidos para expressão de nível àlto.”Âs moléculas sintéticas podem ser utilizadas como uma seqüência codificadora para expressão de proteína HPV45 Ll, que pode se auto-montar em VLPs. As citadas VLPs podem ser utilizadas em uma vacina baseada em VLP para proporcionar imunoprofilaxia 5 efetiva contra infecção por papilomavírus por intermédio de imunidade mediada por célula e anticorpo neutralizadcr.

A expressão de HPV VLPs em células de levedura oferece as vantagens de ser custo-efetiva e facilmente adaptada ao crescimento de grande escala em fermentadores. Contudc, as proteínas HPV Ll, incluindo 10 HPV45 Ll são expressadas em níveis nas células de levedura que são menores do que aquele que é desejável para aumento de escala comercial.

Conseqüentemente, a presente invenção refere-se às sequências de gene HPV45 Ll que estão "otimizados" para expressão em nível alto em um ambiente celular de levedura.

Um códon "tripleto" de quatro bases de nucleotídeo pode existir em mais de 60 formas variantes. Devido ao fato de estes códons proporcionarem a mensagem para apenas 20 aminoácidos diferentes (bem como iniciação e terminação de transcrição), alguns aminoácidos podem ser codificados por mais do que um códon, um fenômeno conhecido como ^0 redundância de códon. Por razões não completamente entendidas, códons alternativos não estão uniformemente presentes no DNA endógeno de tipos diferentes de células. De fato, parece que há uma "preferência" ou hierarquia natural variável para certos códons em certos tipos de células. Como um exemplo, o aminoácido leucina é especificado por qualquer um de seis códons 25 de DNA incluindo CTA, CTC, CTG, CTT., TTA, e TTG. Análise exaustiva de frequências de uso de códon de genoma para microorganismos tem revelado que DNA endógeno de E. coli contém mais comumente o códon CTG especificador de leucina, enquanto que o DNA de leveduras e de bolores de lodo inclui mais comumente um códon TTA especificador de leucina. Em vista desta hierarquia, acredita-se em geraf que a possibilidade de se obterem níveis altos de expressão de um polipeptídeo rico em leucina por um hospedeiro E. coli dependerá em alguma extensão da frequência de uso de códon. Por exemplo, é provável que um gene rico em códons TTA seja 5 insatisfatoriamente expressado em E. coli, enquanto que um gene rico em CTG seja provavelmente elevadamente expressado neste hospedeiro. De maneira semelhante, um códon preferido fura expressão de um polipeptídeo rico em leucina em.células hospedeiras de levedura seria TTA.

As implicações dos fenômenos de preferência de códon sobre as técnicas de DNA recombinante são manifestas, e o fenômeno pode servir para explicar muitas falhas anteriores para se alcançarem níveis altos de expressão de genes exógenos em organismos hospedeiros bem sucedidamente transformados — um códon menos "preferido" pode estar repetidamente presente no gene inserido e o maquinário da célula hospedeira para expressão pode não operar tão eficientemente. Este fenômeno sugere que os genes sintéticos que têm sido planejados para incluírem códons preferidos de células hospedeiras planejado proporcionam uma forma ótima de material genético estranho para a prática da expressão de proteína recombinante. Assim, um aspecto desta invenção é um gene HPV45 Ll que está códon-otimizado para a ^0 expressão de nível alto em uma célula de levedura. Em uma modalidade preferida desta invenção, tem sido verificado que o uso de códons alternativos codificadores de mesma seqüência de proteína pode remover as restrições sobre a expressão de proteínas HPV45 Ll por células de levedura.

De acordo com esta invenção, segmentos de gene HPV45 Ll 25 convertidos em seqüências possuindo seqüências traduzidas idênticas mas com uso de códon alternativo como descrito por Sharp e Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991)), que é por meio desta aqui incorporada como referência. A metodologia em geral consiste da identificação de códons na seqüência de tipo selvagem que não estão comumente associados com genes de levedura elevadamente expressados e da substituição deles por códons ótimos para expressão alta em células de levedura. A seqüência de gene nova é então inspecionada para as seqüências indesejadas geradas por estas substituições de códon (por 5 exemplo, seqüências "ATTTA", formação inadvertida de sítios de reconhecimento de editoração de íntron, sítios de enzima de restrição indesejados, conteúdo de GC elevado, presença de sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos por levedura, etc.). Seqüências indesejáveis são eliminadas por substituição dos códons existentes por códons diferentes ^0 codificadores de mesma aminoácido. Os segmentos de gene sintéticos são então testados para expressão melhorada.

Os métodos descritos acima foram usados para preparar segmentos de gene sintéticos para HPW-5 Ll, resultando em um gene compreendendo códons otimizados para expressão de nível alto em um 15 ambiente de célula de levedura. Embora o procedimento acima proporcione um sumário de nossa metodologia para planejamento de genes códon- otimizados para uso em vacinas de HPV, é entendido por uma pessoa experiente na técnica que eficácia de vacina semelhante ou expressão aumentada de genes pode ser realizada por variações mínimas no Id procedimento ou por variações mínimas na seqüência.

Consequentemente, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo sintético compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma proteína HPV45 Ll, ou de um fragmento biologicamente ativo ou de uma forma mutante biologicamente ativa de uma proteína HPV45 25 Ll, a seqüência de polinucleotídeo compreendendo códons otimizados para expressão em uma célula hospedeira de levedura. As citadas formas mutantes de proteína HPV45 Ll incluem, mas não estão limitadas a: substituições de aminoácido conservativas, truncações de terminação-amino, truncações de terminação-carboxila, deleções ou adições. Qualquer um de tal fragment e/ou mutante biologicamente ativo ‘codificará quer uma proteína quer um fragmento que pelo menos substancialmente imita as propriedades imunológicas da proteína HPV45 Ll como apresentada na SEQ ID NO: 2. Os polinucleotídeos sintéticos da presente invenção codificam moléculas de mRNA que expressam uma proteína HPV45 Ll funcional de modo a serem úteis no desenvolvimento de uma vacina de HPV terapêutica ou profilática.

Um aspecto desta invenção é uma molécula de ácido nucleico códon-otimizada que codifica a proteína HPV45 Ll com apresentada na SEQ ID NO: 2, a citada molécula de ácido nucle:.co compreendendo uma seqüência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ] D NO: 1.

A presente invenção também se refere aos vetores recombinantes e às células hospedeiras recombinantes, tanto procarióticas quanto eucarióticas, que contêm as moléculas de ácido nucleico descritas em todo este relatório descritivo.

O HPV45 DNA sintético cu seus fragmentos construído por meio dos métodos aqui descritos podem ser recombinantemente expressados por clonagem molecular em um vetor de expressão contendo um promotor adequado e outros elementos regulatórios de transcrição apropriados, e transferido para dentro de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas para produzir HPV45 Ll recombinante. Técnicas para tais manipulações são totalmente descritas por Sambrook et al. {Molecular Cloning: A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates e Wiley-Interscience, New York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al.. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990)), que são por meio desta aqui incorporadas em suas totalidades como referências.

Assim, a presente invenção refere-se a um processo para expressar uma proteína HPV45 Ll em urna célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introduzir um vetor* compreendendo um ácido nucleico codificador de uma proteína HPV45 Ll em uma célula hospedeira de levedura; e (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitem a expressão de citada proteína HFV45 Ll.

Esta invenção refere-se em adição a um processo para expressar uma proteína HPV45 Ll em uma célula hospedeira recombinante, compreendendo: (a) introduzir um vetor compreendendo um ácido nucleico como apresentado na SEQ ID NO: 1 em unia célula hospedeira de levedura; e (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitem a 0 expressão de citada proteína HPV45 L1.

Os genes sintéticos da presente invenção podem ser montados em um cassete de expressão que compreende seqüências planejadas para proporcionarem expressão eficiente da proteína HPV45 Ll na célula hospedeira. O cassete preferivelmente contém o gene sintético, com 15 seqüências de controle de transcrição e de traduções relacionadas operativamente ligadas nele, tais como um promotor, e seqüências de terminação. Em uma modalidade preferida, o promotor é o promotor 5. cerevisiae GAL1, embora aquelas pessoas experientes na técnica reconheçam que qualquer um de numerosos outros promotores de levedura conhecidos ^0 possam ser utilizados. Um terminador de transcrição preferido é o terminador S. cerevisiae ADH1, embora outros terminadores de transcrição conhecidos também possam ser empregados. A combinação de promotor GAL1 - terminador ADH1 é particularmente preferida.

Outro aspecto desta invenção é uma partícula semelhante a 25 vírus HPV45 (VLP) produzida por expressão recombinante de genes HPV45 Ll ou Ll + L2 em uma célula de levedura, métodos de produção de HPV45 VLPs, e métodos de uso de HPV45 VLPs. VLPs podem se auto-montar quando Ll, a proteína de capsídeo maior de papilomavírus de humano e de animal, for expressada em célula de levedura, células de inseto, células de mamífero ou bactérias (para revisão, veja Schiller e Roden, em Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses} Lac ey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp. 101-12 (1996)). HPV VLPs morfologicamente distintas também podem ser produzidas pela expressão de uma combinação de proteínas de capsídeo Ll e L2. VLPs são compostas de 72 pentâmeros de Ll em uma estrutura icosaédrica T=7 (Baker et al., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).

VLPs são morfologicamente semelhantes aos virions autênticos e são capazes de induzir títulos altos de anticorpos neutralizadores sob administração em um animal. Foi mostrado que imunização de coelhos (Breitburd et al.7 J. ViroL 69(6): 3959-63 (1995)) e de cães (Suzich et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92(25): 11553-57 (1995)) com VLPs em ambos induz anticorpos neutralizadores e protege contra infecção por papilomavírus experimental. Contudo, devido ao fato de as VLPs não conterem o genoma virai potencialmente oncogênico e poderem se auto-montar quando expressadas de um gene único, elas apresentam uma alternativa segura ao uso de vírus vivo no desenvolvimento de vacina de HPV (para revisão, veja Schiller e Hidesheim, J. Clin. Virol.19: 67-74 (2000)).

Marais e colegas (J. Med. Virol. 60: 331-336 (2000)) descrevem HPV45 VLPs, que foram produ2;idas em células de inseto a partir de um gene HPV45 Ll expressado de baculovírus. A expressão de VLPs em células de inseto não é vantajosa para o desenvolvimento de vacina por causa dos custos altos associados. Adicionalmente, muitas vezes é difícil aumentar a escala da expressão de genes HPV Ll em cultura de células de inseto para volumes grandes necessários para o desenvolvimento de produto comercial. HPV45 VLPs produzidas em células de levedura não têm sido descritas. A expressão de HPV VLPs em células de levedura oferece as vantagens de ser custo-efetiva e facilmente adaptada ao crescimento de escala grande em fermentadores. Em adição, o genoma de levedura pode ser prontamente alterado para garantir a seleção de levedura transformada, recombinante, com potencial de crescimento e de expressão aumentado.

Assim, a presente invenção refere-se às partículas semelhantes a vírus compreendidas de proteína Ll recombinante ou de proteínas Ll + L2 5 recombinantes de HPV45, na qual a protena recombinante é expressada em uma célula de levedura.

Em uma modalidade preferida da invenção, as HPV45 VLPs são produzidas pela expressão de HPV45 Ll ou de HPV45 Ll + L2 em uma levedura selecionada do grupo consistindo de: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, e Schizosaccharomyces pombe.

Outro aspecto desta invenção é uma HPV45 VLP que compreende uma proteína HPV45 Ll produzida pela expressão de um gene HPV45 Ll códon-otimizado. Em uma modalidade preferida deste aspecto da 15 invenção, o gene HPV45 Ll códon-otimizado compreende uma seqüência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1.

Ainda outro aspecto desta invenção é um método de produzir HPV45VLPs, compreendendo: (a) transformar levedura com uma molécula de DNA recombinante codificadora de proteína HPV45 Ll ou de proteínas ^0 HPV45 Ll + L2; (b) cultivar a levedura transformada sob condições que permitem a expressão da molécula de DNA recombinante para produzir a proteína HPV45 recombinante; e (c) isolar a proteína HPV45 recombinante para produzir HPV45 VLPs.

Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, a 25 levedura é transformada com um gene HPV45 Ll códon-otimizado para produzir HPV45 VLPs. Em uma modalidade particularmente preferida, o gene HPV45 Ll códon-otimizado compreende uma seqüência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1.

Esta invenção também proporciona um método de induzir uma resposta imune em um animal compreendendo administrar partículas semelhantes a vírus HPV45 ao animal. 3m uma modalidade preferida, as códon-otimizado. HPV45 VLPs são produzidas por um gene

Ainda outro aspecto desta invenção é um método de prevenir ou tratar câncer cervical associado com HPV compreendendo administrar a um mamífero uma vacina compreendí modalidade preferida deste aspecto da produzidas em levedura.

Esta invenção também se refere a uma vacina compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLPs).

Em uma modalidade altem: endo HPV45 VLPs. Em uma invenção, as HPV45 VLPs são itiva deste aspecto da invenção, a de pelo menos um tipo de HPV o pelo menos um tipo de HPV vacina compreende adicionalmente VLPs adicional. Em uma modalidade preferida, adicional é selecionado do grupo consistindo de: HPV6, HPV11, HPV 16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, e HPV68.

Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, a vacina compreende adicionalmente HPV 16 VLPs.

Em outra modalidade preferida da invenção, a vacina compreende adicionalmente HPVI6 VLPs e HP18 VLPs

Em ainda outra modalidade compreende adicionalmente HPVI6 VLPs. HP 18 VLPs. HP 18 VLPs. preferida da invenção, a vacina HPV11 VLPs, HPV16 VLPs e

Esta invenção também se refere às composições farmacêuticas vírus HPV45. Em adição, esta compreendendo partículas semelhantes a invenção refere-se às composições farmacêuticas compreendendo HPV45 VLPs e VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Em uma modalidade preferida, o pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo consistindo de: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, e HPV68.

Composições de vacina da presente invenção podem ser usadas sozinhas em dosagens apropriadas definidas por teste rotineiro com o propósito de se obter inibição ótima de infecção por HPV45 ao mesmo tempo 5 minimizando qualquer toxicidade potencial. Em adição, a co-administração ou administração sequencial de outros agentes pode ser desejável.

A quantidade de partícuías semelhantes a vírus a ser introduzida em um recipiente de vacina dependerá da imunogenicidade do produto de gene expressado. Em geral, uma dose imuno lógica ou dO profilaticamente efetiva de cerca de 10 pg a 100 pg, e preferivelmente de cerca de 20 pg a 60 pg de VLPs é administrada diretamente em tecido muscular. Injeção subcutânea, introdução intradermal, impressão através da pele, e outros modos de administração tais como liberação intraperitoneal, intravenosa, ou por inalação também são contemplados. Também é 15 contemplado que vacinas de reforço possam ser proporcionadas. Também é vantajosa a administração parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, subcutânea ou de outro meio de administração com adjuvantes tal como alume ou adjuvante de alumínio Merck, concorrentemente com ou subseqüente à introdução parenteral da vacina desta invenção.

Todas as publicações aqui mencionadas são incorporadas como referências para o propósito de descrição e de redação das metodologias e dos materiais que podem ser usados em conexão com a presente invenção. Nada aqui é para ser entendido como uma admissão de que a invenção não é designada para preceder tal descrição em virtude da invenção anterior.

Tendo descrito as modalidades preferidas da invenção com referência aos desenhos acompanhantes, é para ser entendido que a invenção não é limitada àquelas modalidades precisas, e que várias mudanças e modificações podem ser aqui efetuadas por uma pessoa experiente na técnica sem se desviarem do escopo ou do espírito da invenção como definido nas reivindicações apendidas.

Os seguintes exemplos ilustram, mas não limitam a invenção.

EXEMPLO 1 Determinação de uma Seqüência de HPV45 Ll Representativa

A seqüência HPV45 Ll tem sido descrita previamente ((Número de Acesso no GenBank: NC 001590; veja também Delius e Hofman, Curr. Top. Microbiol. Immunol.186: 13-31 (1994)). Contudo não é incomum encontrar variações de seqüência menores entre os DNAs obtidos de isolados clínicos. Para determinar uma seqüência de tipo selvagem de |0 HPV45 Ll representativa, DNA foi isolada de quatro amostras clínicas, que como previamente mostrado, contêm HPV 45 DNA. As seqüências de HPV 45 Ll foram amplificadas em uma reação em cadeia de polimerase (PCR) usando Tag DNA polimerase e os seguintes iniciadores: HPV 45 Ll F 5’- CCACCACCACCTATATAGGTATTC-3’ (SEQ ID NO:4)e HPV 45 Ll B 5’- CAAACATACAT AT ATGTGCTAACA- 3’ (SEQ ID NO:5). Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese sobre genes de agarose e visualizados por coloração por brometo de etídio. As bandas de Ll de -1500 pb foram excisadas e o DNA foi purificado usando o kit de purificação QIA quick PCR (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA foi então ligado em um ^0 vetor de clonagem TA (Invitrogen Coip., Carlsbad, CA), E. Coli foi transformada com a mistura de ligação e plaqueada sobre ágar LB com ampicilina mais IPTG e X-gal para seleção de colônias azuis/brancas. As placas foram invertidas e incubadas por 16 noras a 37°C. PCR de colônias foi realizada sobre oito colônias bancas originárias de cada um dos quatro isolados clínicos que haviam sido amplificados por PCR. HPV 45 Ll DNA foi amplificado por PCR usando iniciadores HPV 45 Ll F e HPV 45 Ll B. O protocolo de PCR específico consistiu de 25 ciclos de 15 segundos a 98°C (desnaturação), 30 segundos a 50°C (andamento) e 2 minutos a 68°C (extensão). Produtos de PCR foram visualizados por coloração por brometo de etídio após eletroforese em gel de agarose. Várias colônias de cada isolado continha bandas de Ll. A segunda colônia de cada isolado foi cultivada em meio LB com ampicilina, agitando a 37°C por 16 horas. Minipreparados foram realizados para extrair DNA 5 plasmídeo das colônias.

Seqüenciamento de DNA foi conduzido sobre os plasmídeos contendo o HPV 45 Ll DNA amplificado e clonado dos quatro isolados clínicos. As seqüências de DNA e ce aminoácidos traduzida foram comparadas entre si e com as seqüências Genbank HPV 45 LL Análise de |0 seqüência dos quatro isolados clínicos revelou que nenhuma seqüência foi idêntica à seqüência de Genbank. O plasmídeo HPV 45 Ll do isolado #33 foi escolhido para ser a seqüência de tipo selvagem (wt) 45 Ll representativa e é aqui referida como a "seqüência de tipo selvagem 45 Ll" (SEQ ID NO:3, veja a FIGURA 1). Esta seqüência continha uma deleção de nove nucleotídeos, 15 três aminoácidos, que manteve a matriz de leitura da seqüência subseqüente, mutações de cinco pontos resultando em mudanças de cinco aminoácidos e oito mutações de ponto silenciosas adicionais. Aminoácidos 495-497 na seqüência de Genbank estão deletados na 45 Ll wt. Aminoácidos de números 23 (S—>N), 55 (N-»S), 303 (I-»T), 357 (S-->N), e 356 (Q->H) representam as ^0 cinco mudanças de aminoácido (Genbank ia 45 Ll wt aa). As 8 mutações silenciosas estavam distribuídas em toda a seqüência 8. Veja a FIGURA 1.

A seqüência de tipo selvagem 45 Ll foi amplificada usando os iniciadores LS-112 5’-CTCAGATCTACAAAACA^VKATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGAC-3’ (SEQ ID NO:6) e HPV45 Ll EAS 5’- 25 GACAGATCTTATTTTTTACTACGTATACGTACACG-3’ (SEQ ID NO:7) para adicionar extensões Bgfil. PCR foi realizada usando Vent polimerase. O produto da PCR foi visualizado por coloração por brometo de etídio de um gen de agarose. A banda de -1500 pb fcr excisada e o DNA foi purificado usando o kit de extração em gel QIAEX fl (Qiagen). O produto da PCR foi então digerido com Bglíl a 37°C por 2 horas e purificado usando o kit de purificação QIA quick PCR. O produto de PCR HPV45 Ll digerido por Bglíl foi ligado em pGALHO digerido por (descrito em Hofinann et al., Virology209: 506-18 (1995)) e E. coli DPÍ5 foi transformado com a mistura 5 de ligação.

Colônias foram triadas por PCR para o inserto HPV45 Ll na orientação correta. Seqüência e orientação foram confirmadas por seqüenciamento de DNA. O clone selecionado foi chamado de PGAL110- HPV 45 Ll #6. Este clone foi digerido 3om Pstí, EcoRI, e HindlIIpara J0 determinar o perfil de fragmentos de restrição do gene HPV45 Ll dentro do vetor pGALHO. Os fragmentos de DNA foram submetidos à eletroforese sobre geles de agarose. O perfil de fragmentos de restrição resultantes foi visualizado por cloração por brometo de etídio e visto por luz UV.

DNA maxiprep foi preparado. Células de Saccharomyces 15 cerevisiae foram tomadas competentes por sua transformação em esferoplasto com Glusalase e transformadas com pGAL110-HPV 45 Ll #6. A mistura de transformação de levedura foi plaqueada em ágar de topo de sorbitol Leu(-) sobre placas de sorbitol (Leu-) e incubada invertida por 5-7 dias a 30°C. As colônias foram coletadas e espalhadas para isolamento clonal sobre placas de ^0 sorbitol Leu(-). As colônias foram subseqüentemente crescidas em 5 mL de 5 X Sorbitol Leu(-) Ade(-) com 1,6% de glicose e 4% de galactose em culturas de tubo rotativo a 30°C para induzir a transcrição de Ll e a expressão de proteína.

EXEMPLO 2 Otimização de códon de levedura

Códons preferidos de levedura têm sido descritos (Sharp, Paul M. e Cowe, Elizabeth 191 Synonymous Códon Usage in Saccharomyces cerevisiaeYEAST 7: 657-678). Expressão da proteína HPV45 Ll wt foi detectável; entretanto, para obter a expressão aumentada necessária para desenvolvimento de produto comercial, o gene HPV45 Ll foi reconstruído utilizando códons preferidos de levedura. A citada seqüência reconstruída proporcionará expressão de HPV45 aumentada, que será um avanço significativo sobre o tipo selvagem para uso em desenvolvimento de vacina. 5 Quando a seqüência foi construída usando seqüências de códon otimizadas de levedura, a seqüência de nucleotídeos de 45 Ll wt foi alterada em 392 posições para produzir 45 Ll R (R - reconstruída). A seqüência de aminoácidos, contudo, não foi alterada. As sequências de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de HPV45 Ll R são mostradas ^0 na FIGURA 2.

A estratégia empregada para a reconstrução de gene foi planejar oligômeros de anti-senso e de senso de recobrimento longo que abarcam o gene, substituir nucleotídeos por seqüências de códon preferidas de levedura ao mesmo tempo mantendo a seqüência de aminoácidos original. Estes oligômeros foram utilizados no lugar de DNA modelo em uma reação PCR. Iniciadores de amplificação adicionais foram planejados e usados para amplificar as seqüências reconstruídas dos oligômeros modelo. Pfu DNA polimerase foi utilizada na PCR de 25 ciclos.

As condições ótimas para amplificação foram seção- 20 específicas, contudo a maioria empregou um programa parecendo-se com 94°C por 5 minutos (desnaturação) seguida por 25 ciclos de 95°C por 30 segundos (desnaturação), 55-50°C por 30 segundos (anelamento), e 72°C por 1,5 minutos (extensão), seguido por uma extensão final de 7 minutos a 72°C e manutenção a 4°C. Os produtos de PCR foram examinados por eletroforese 25 em gel de agarose. Bandas de tamanho apropriado foram excisadas e o DNA foi purificado em gel. Os fragmentos excüados foram então usados como modelo para montar o gene 1533 nt rebuilt HPV 45 LL

Após a reconstrução, a banda 1533 nt foi purificada por gel, ligada em pCR4 Blunt (Invitrogen) e eélulas E. coliTOP 10 foram transformadas com a mistura de ligação. Colônias foram crescidas em 4 mL de LB com ampicilina e DNA plasmídeo foi extraído por técnicas de minipreparação padrão. O DNA plasmídeo foi seqüenciado para confirmar a presença de mudanças desejadas para o reconstruído 45 Ll. O 45 Ll R 5 (reconstruído) foi reamplificado de pCR4Blunt-45 Ll R para adicionar extensões /LwzHI em ambas as extremidades mais uma seqüência líder 5'- não-traduzida de levedura a montante do códon de iniciação ATG. O fragmento amplificado foi clonado como acima e o DNA plasmídeo foi seqüenciado. O plasmídeo, pCR4 Blunt-45L1 R (Bam), foi digerido com fO RízmHI e os fragmentos de DNA foram submetidos à eletroforese sobre um gel de agarose. O fragmento de 45 Ll R (Bam) de -1550 pb foi purificado por gel, ligado em pGALUO digerido com BamHI e transformado em TOP 10F'E. coli (Invitrogen).

Colônias foram tríadas por PCR para o inserto HPV45 Ll R na 15 orientação correta em pGALUO. Seqüência e orientação foram confirmadas por seqüenciamento de DNA. DNA plasmídeo maxiprep foi preparado e usado para a transformação de células de S', cerevisiae que haviam sido tomadas competentes por sua transformação em esferoplasto. As leveduras transformadas foram plaqueadas em ágar de topo de sorbitol Leu(-) sobre ^0 placas de sorbitol (Leu-), que foram incubadas invertidas por 7 dias. As colônias foram espalhadas para isolamento clonal sobre placas de sorbitol Leu(-). As colônias foram subseqüentemente crescidas em 5 mL de 5 X Sorbitol Leu(-) Ade(-) com 1,6% de glicose e 4% de galactose em culturas de tubo rotativo a 30°C para induzir a transcrição de Ll e a expressão de 25 proteína. Após 48 horas de cultura, um volume de cultura equivalente a uma ODóoo = 10 foi pelotizado, o sobrenadante foi removido e as pelotas foram congeladas e armazenadas a -70°C.

EXEMPLO 3 Preparação de RNA

Pelotas de células de leveduras transformadas induzidas para expressarem HPV45 Ll por indução por galactose foram descongeladas sobre gelo, suspensas em 0,8 mL de reagente Trizol (Life Technologies, Gibco, BRL) e incubadas na temperatura ambiente por 5 minutos. Um quinto volume - 5 de clorofórmio foi adicionado no frasco. Ele foi então agitado vigorosamente por 15 segundos para misturar e incubado na temperatura ambiente por 3 minutos. Após uma centrifugação de 5 minutos a 13000 rpm, a fase superior foi coletada e transferida para um frasco novo. 0,4 mL de isopropanol foi adicionado e a incubado na temperatura ambiente por 10 minutos. ^|0 Centrifugação para pelotizar o RNA foi realizada a 13000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi decantado, a pelota de RNA foi lavada com EtOH 75% e a centrifugação foi repetida. O sobrenadante foi decantado e a pelota de RNA foi permitida secar ao ar por 15 minutos seguido por suspensão em água livre de RNase. Espectro fotometria foi realizada para determinar a concentração de RNA na amostra assumindo que uma leitura de A26O de 1 = 40 pg/mL de RNA quando A260/280 é 1,7-2,0.

EXEMPLO 4 Análise de Northern blot

Um gel de agarose e formaldeído a 1,1% foi vazado. Cinco e *0 dez microgramas de RNA foram combir.ados com tampão desnaturante (concentrações finais: 6% de formaldeído, 50% de formamida e 0,1 x MOPS) e aquecido a 65°C por 10 minutos. Um décimo volume de tampão de carregamento de gel foi adicionado e a amestra carregada para cima do gel. Eletroforese foi realizada a 75 volts em tampão 1 x MOPS por ~3 horas. O gel 25 foi lavado por 60 minutos em 10 x SSC. O RNA foi transferido para uma membrana de náilon Hybond- N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por ação capilar durante 16 horas em 10 x SSC. O RNA foi então fixs.do na membrana de náilon por reticulação usando função de auto-reticulação de Stratagene UV-Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). Após fixação, a membrana de náilon foi permitida secar em ar. O Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Suíça) foi usado para marcar seqüências 5 de 45 Ll R DNA com DIG a serem usadas como uma sonda para detectar 45 L RI RNA sobre Northern blot. A pré-hibridizaçao, a hibridização, e o desenvolvimento imunológico usando um anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina foram realizados segundo as recomendações do fabricante. Em resumo, o blot foi pré-hibridizado a 37°C por 30 minutos com agitação suave. A sonda foi desnaturada por aquecimento a 95°C por 5 minutos e a reação foi interrompida sobre gelo. A sonda foi adicionada na solução de hibridização e aplicada na membrana por 4 horas a 44,6°C com agitação suave. A solução de hibridização foi então removida e o blot foi lavado duas vezes por 5 minutos em 2 x SSC com 0,1 % SDS na temperatura ambiente, 15 seguido por uma lavagem adicional a 65°C com 0,5 x SSC e 0,1% SDS. O blot foi então bloqueado por 30 minutos e anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina foi aplicado em uma diluição de 1:5000 por 30 minutos. O blot foi lavado e a presença de RNA ligado em sonda foi determinada por detecção de substrato NBT/BCIP do anticorpo anti-DIG ligado conjugado 50 com fosfatase alcalina.

Análise inicial de levedura expressando 45 Ll wt sugeriu que houve transcrição e tradução de HPV45 Ll funcional; conduto, a seqüência foi reconstruída com seqüências de códon preferidas de levedura para obter um nível de expressão aumentado, útil para | o desenvolvimento de vacina. A 25 seqüência 45 Ll reconstruída foi engenhadj para omitir quaisquer sítios de terminação de transcrição prematuros possíjveis para garantir a transcrição robusta. Análise de Northern blot do transclito 45 Ll R revelou que foram gerados transcritos de comprimento total (FIGURA 3).

EXEMPLO 5 Expressão de proteína HPV45 Ll

Pelotas de células de leveduras congeladas de culturas induzidas por galactose equivalentes à OD.,oo= 10, foram descongeladas sobre gelo e suspensas em 300 pL de tampão PC (Na2HPO4 100 mM e NaCl 0,5 M, 5 pH 7,0) com PMSF 2 mM. Glóbulos de vidro de 0,5 mm lavados com ácido, foram adicionados, ~0,5 g/tubo. Os tubos foram agitados por 3 ciclos de 5 minutos a 4°C com um repouso de 1 minuto. 7,5 pL de Triton XI00 20% foram adicionados e a agitação foi repetida por 5 minutos a 4°C. Os tubos foram deixados sobre gelo por 15 minutos, e então centrifugados por 10 0 minutos a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga estéril, rotulado como exTato de proteína de levedura total, datado e armazenado a -70°C.

EXEMPLO 6 Análise de Western blot

Extratos de proteína de levedura total de vinte colônias de levedura isoladas para cerca de construt D de 45 Ll foram analisados por Western blot para confirmar a expressão de proteína 45 Ll após indução por galactose.

Dez microgramas de extrato de proteína de levedura total ^0 foram combinados com tampão de carregamento de SDS-PAGE e aquecidos a 95°C por 10 minutos. As proteínas foram carregadas para cima de um gel de 10% SDS-PAGE e submetidas à eletroforese em tampão Tris-Glicina. Após a separação das proteínas, as proteínas foram transferidas para Western do gel para nitrocelulose e o blot foi bloqueado em 1 x tampão diluente (Kirkegaard and Perry Laboratories) por 1 hora na temperatura ambiente com movimentação oscilante. O blot foi lavado três vezes e então incubado com uma diluição de 1:2500 de soro de cabra anti-trpE-HPV 45 Ll na temperatura ambiente por 16 horas. O blot foi lavado três vezes e incubado com uma diluição de 1:25000 de anticorpo anti-cabra conjugado com HRP por 1 h. O blot foi novamente lavado três vezes e o substrato de detecção NBT/BCIP foi aplicado (Kirkegaard and Perry Laboratories). Proteínas imunorreativas foram detectadas como bandas púrpuras sobre o blot.

Os resultados demonstram que em todos os casos, a protein 45 Ll foi detectada como uma banda imunorreativa distinta sobre nitrocelulose correspondendo a aproximadamente 57 kDa (FIGURA 4). A proteína 16 Ll, que é aproximadamente de 55 kDa, foi incluída como um controle positivo, juntamente com extrato de proteína de levedura total livre de HPV Ll como um controle negativo (dados não mostrados).

EXEMPLO 7 Ensaio ELISA

As células de levedura expressando HPV 45 Ll foram crescidas por uma variedade de métodos incluindo culturas em tubo rotativo, frascos agitados e fermentadores. As leveduras foram lisadas e os extratos de 15 proteína foram preparados para determinar a quantidade de partículas semelhantes a vírus HPV 45 Ll (VLPs) produzidas por micrograma de proteína total. Um ELISA de sanduíche foi planejado para demonstrar a expressão de HPV 45 Ll VLP.

O anticorpo monoclonal H1SR.5 (mAb), que reconhece ambos lo os tipos de HPV 18 e 45 Ll VLPs, foi usado para ligar as 45 Ll VLPs encontradas em extratos de proteína de levedura. As proteínas não ligadas foram removidas por lavagem e H45.1 OB 11.5A5, um tipo de HPV 45 L1 VLP e mAB específico conformacional, foi aplicado como um anticorpo de detecção. 45 Ll VLPs verdadeiros, conformacionalmente corretos foram 25 ligados e a detecção foi facilitada pelo uso de um anticorpo IgGl anti- camundongo conjugado com HRP e substrato TMB.

Especificamente, H18R.5 foi usado para revestir o fundo de placas de 96 cavidades Immulon 4 HBX durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com PBS e 0,05% Tween 20, seguido por bloqueio com solução de bloqueio (PBS + 0,05% Tween 20 + 1% BSA). As placas foram lavadas três vezes e antígenos (lisados de célula total diluídos em solução de bloqueio para 100 pg/mL), foram aplicados na fila A em duplicata. Padrões de referência de HPV 45 Ll VLPs purificadas foram aplicados nas colunas 1 e 2 da fila A a 3300 ng/mL em 100 pg/mL de proteína de levedura total. As amostras de referência e de teste foram então serialmente diluídas duas vezes descendentemente em cada colina. Após 3 horas na temperatura ambiente o antígeno em excesso foi removido por aspiração e as placas foram lavadas 3 vezes. Sobrenadante cellular contendo HPV 45 Ll VLP conformacional específico mAb H45.10B1 de bloqueio e aplicado em cada cavidad ambiente. As placas foram lavadas três vezes e um anticorpo IgGl anti- camundongo conjugado com HRP diluído 1 aplicado por 1 hora na temperatura ambiente. (Pierce) foi aplicado por 5 minutos para conjugado com HRP. A reação de detecção foi interrompida pela adição de H2SO4 2 M. As placas foram lidas em comprimento de onda de 450 nm e a concentração de HPV 45 Ll VLP foi deteiminada por comparação com os padrões de referência em ng de VLP/ pg de protein total

Uma comparação entre 45 Ll 1.A5 foi diluído 1:80 em solução e por uma hora na temperature :8000 em solução de bloqueio foi As placas foram lavadas e TMB detectar complexos de anticorpo roteína total. wt e dois clones separados de 45 Ll R, todos ensaiados em duplicatas, é mostrada na FIGURA 5. Expressão de HPV45 Ll VLP reconstruída foi aproximadamente 2 vezes maior do que a dos resultados observados para 45 Ll wt (FIGURA 6)

EXEMPLO 8 Microscopia eletrônica de transmissão

Para demonstrar que a proteína 45 Ll foi de fato auto- montagem para formar capsômeros L1-pentaméricos, que por sua vez se auto- montam em partículas semelhantes a vírus, um extrato de proteína 45 Ll R parcialmente purificado foi analisado por EM de transmissão.

Células de levedura foram crescidas sob condições de fermentação em escala pequena, pelotizadas e as pelotas foram submetidas aos tratamentos de purificação. A pelota e os extratos de levedura clarificados foram analisados por imunoblot para demonstrar a expressão de proteína Ll e a retenção por meio do procedimento de purificação. Extratos de levedura clarificados foram então submetidos à centrifugação sobre uma camada de sacarose a 45% e a pelota resultante foi suspensa em tampão para análise por microscopia eletrônica de varredura (EM).

Uma amostra representativa das 45 Ll VLPs produzidas é 0 mostrada na FIGURA 6. O diâmetro das partículas periféricas nesta amostra bruta variou de entre 40 nm e 60 nm com algumas partículas exibindo um arranjo de capsômeros regular.

Claims (11)

1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 1.

2. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 1.

3. Célula de levedura caracterizada pelo fato de que compreende o vetor definido na reivindicação 2.

4. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

5. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser Saccharomyces cerevisiae.

6. Partícula semelhante a vírus (VLP) caracterizada pelo fato de que compreende a proteína Ll recombinante de HPV45, em que a proteína Ll recombinante é produzida em levedura e consiste em uma sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 2.

7. Partícula semelhante a vírus, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína Ll recombinante é codificada por uma molécula de ácido nucleico códon otimizada para Ll de HPV45.

8. Partícula semelhante a vírus, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico códon otimizada consiste essencialmente em uma sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 1.

9. Método para produzir uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV45 caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar levedura com uma molécula de DNA códon otimizada codificadora de proteína Ll de HPV45, definida na reivindicação 1; (b) cultivar a levedura transformada sob condições que permitem a expressão da molécula de DNA códon otimizada para produzir uma proteína de papilomavírus recombinante; e (c) isolar a proteína de papilomavírus recombinante para produzir a VLP de HPV45.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

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