BRPI0417098B1 - Formulação dental compreendendo osteopontina, bem como o uso da mesma - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA- ÇÃO DENTAL COMPREENDENDO OSTEOPONT1NA, BEM COMO O USO DA MESMA".

Campo Técnico da Invenção A presente invenção diz respeito a formulações dentais. Partícu- la rmente, a invenção diz respeito ao uso da osteopontina (OPN) para reduzir significativamente o crescimento de placa bacteriana no esmalte do dente.

Antecedentes da Invenção Muitos problemas ocorrem juntamente com os cuidados dentá- rios, tanto de um ponto de vista cosmético quanto terapêutico, tal como for- mação da placa dental, crescimento bacteríano na placa dental, cáries den- tais, cálculos dentais (tártaro), doença periodontal e desmineralização dos dentes.

Placa dental é um biopelícula complexo que se acumula nos teci- dos duro (dentes) na cavidade oral. Embora mais de 500 espécies bacteria- nas compreendam a placa, a colonização segue um padrão arregimentado com a adesão dos colonizadores iniciais á película salivar do esmalte, seguido por colonização secundária através da adesão bacteriana. É bem conhecido que uma variedade de espécies de estreptocooos pertence aos primeiros co- lonizadores, É, conseqüentemente, importante controlar a adesão dessas bactérias. Uma variedade de adesinas e interações moleculares formam a base das interações adesivas e contribuem para o desenvolvimento da placa e, derradeira mente, a doenças tais como cáries e doença periodontal, O esmalte do dente é compreendido de hídroxiapatita, Na boca, um equilíbrio natural existe entre, por um lado, a dissolução da hídroxiapatita do esmalte dos dentes e, por outro lado, a formação de hídroxiapatita no ou dentro do dente a partir de substâncias que ocorrem naturalmente na saliva.

Quando o equilíbrio é tal que a hídroxiapatita é dissolvida, uma condição ca- riogêníca aparece, a qual é referida como desmineralização.

Sabe-se há muito tempo que a incorporação de íons fluoreto no esmalte do dente o protege da desmineralização. Portanto, o fluoreto é ge- ral mente incorporado na pasta dental. Entretanto, fluoreto pode acarretar a fíuorose, especialmente se o paciente estiver ingerindo a pasta de dente ou outro dentifrício ou produto de higiene oral, o que geralmente é o caso, por exemplo, em crianças pequenas. Isso pode também ser um problema em áreas com grandes quantidades de fluoreto na água para beber. O propósito desse pedido de patente é propor o uso de uma pro- teína inerente do leite, a osteopontina, adicionada a uma formulação dental, para controlar ou inibir o crescimento de bactérias na superfície do dente e, conseqüentemente, prevenir ou reduzir a formação de placa e cáries.

Existe um grupo de pacientes que descreve o uso de frações de proteínas do leite, isto é, hidrolisatos de caseína, fosfopeptídeos de Ca / CPP e glicomacropeptídeo / GMP do coalho do leite para reparo do dano ao esmalte com a hipótese de que eles agem como um fornecedor de fosfato de cálcio amorfo ao esmalte. WO 03/059304 propõe uma composição de cuidado oral conten- do uma fonte de íon fluoreto e fração CPP. Essa formulação estabiliza o fos- fato de cálcio adicionado à formulação oral em uma forma amorfa e, ao mesmo tempo, estabiliza o nível de fluoreto na formulação. WO 00/07454 descreve o GMP o qual, adicionado a uma formu- lação de comida especial baseada em leite, tem um efeito anticariogênico em ratos.

Em contraste com os peptídeos CPP e GMP, a OPN introduz uma nova dimensão na cavidade oral, através de seu potencial de influenciar bioativamente a ligação dos organismos orais ao esmalte e, dessa forma, afetar o desenvolvimento de cáries. Como a CPP e a GMP, a OPN também tem um efeito nos níveis de fosfato de cálcio amorfo na saliva disponível pa- ra o reparo dental. OPN, conseqüentemente, tem várias funções no contexto da cárie dental. A grande vantagem do uso da OPN em, por exemplo, pasta den- tal e colutório, é que ele é um componente de proteína natural no leite bovi- no e, dessa forma, existe uma necessidade limitada para a testagem clínica.

Sumário da Invenção Agora, mostrou-se surpreendentemente que a osteopontina u- sada em formulações orais reduz a aderência bacteriana e o crescimento em superfícies de esmalte. A invenção é sobre composições orais contendo os- teopontina, incluindo pasta de dente, colutório e goma de mascar, assim como composições relacionadas.

Descrição Detalhada da Invenção Um estudo in vitro usando um análogo de dente de um disco de hidroxiapatita (HA) finamente polido mergulhado em uma solução diluída de OPN fornece um filme de OPN na superfície de HA, o qual não pode ser re- movido por lavagem com água. Quando tais discos tratados foram colocados em contato com a saliva humana, descobriu-se surpreendentemente que a peiícula de OPN reduziu significativamente a aderência e crescimento de bactérias nas superfícies do análogo do dente, resultando em uma formação de placa significativamente menor, Os testes foram feitos usando amostras de saliva de um grupo de pacientes de diferentes idades e flora oral. Esses resultados significam que o uso de potencial OPN em formulações orais, tais como pasta de dente e colutório, MSA também como um ingrediente de go- ma de mascar.

Dessa forma, a invenção refere-se ao uso de osteopontina para reduzir o crescimento da placa bacteriana no esmalte do dente e em formu- lações dentais contendo osteopontina.

Conforme aqui usado, o termo "osteopontina" ou "OPN" significa osteopontina obtida do leite, incluindo fragmentos ou peptídeos de ocorrên- cia natural derivados da OPN por divagem proteolítica no leite, ou variantes da junção de genes- ou fosforilação- ou glicosilação como podendo ser obti- dos a partir do método proposto na WO 01/49741. O leite pode ser leite de quaisquer animais produtores de leite, tal como vacas, camelos, cabras, ove- lhas, dromedários e lhamas. Entretanto, OPN do leite bovino é preferido de- vido à sua disponibilidade. Todas as quantidades são baseadas na OPN de leite bovino natural, MSA podem ser facilmente corrigidas às quantidades correspondentes de uma fração ativa do mesmo ou OPN de outra fonte. OPN ou derivados dos mesmos podem também ser geneticamente prepara- dos.

As formulações dentais podem ser qualquer dentifrício ou produ- to relacionado de relevância na higiene oral tal como, por exemplo, pó de dente, gel de dente, colutório dental, spray bucal ou goma de mascar. Oste- opontina (OPN) é uma proteína de ligação de cálcio ácida, rica em ácido siá- lico altamente fosforilada. OPN se liga a 28 moles de fosfato e a cerca de 50 moles de Ca por mol. O ponto isoelétrico é de cerca de 3,0. A proteína existe em muitos tecidos no corpo e desempenha um papel como uma proteína sinalizadora e regulatória. Ela é uma proteína ativa no processo de biomine- ralização. OPN é expressa por uma variedade de tipos celulares incluindo células ósseas, células do músculo liso e células epiteliais. OPN está presente no leite bovino, Uma concentração típica é de 20 mg/L. OPN pode, relativamente, ser isolada de um modo simples por cromatografia aniônica a partir de, por exemplo, soro de leite ácido em um pH 4,5, conforme descrito pela patente WO 01/497741 A2 ou WO 02/28413.

Uma pureza de até 90 - 95% pode ser facilmente obtida. A quantidade de osteopontina está normalmente entre cerca de 50 mg de OPN e cerca de 1500 mg de osteopontina por Kg de formulação dental. Entretanto, uma quantidade menor também terá um efeito. Quantida- des maiores podem ser usadas, MSA o efeito não será essencialmente au- mentado. Uma quantidade útil é de 100 - 1000 mg de OPN/Kg, preferivel- mente 200 - 500 mg, e mais preferivelmente cerca de 350 mg. Quantidades maiores não irão, presumivelmente, fornecer resultados melhores e não são, portanto, recomendadas, porque a OPN é um ingrediente muito dispendioso.

Composições preferidas do assunto da invenção estão, confor- me já mencionado, na forma de pastas dentais, géis dentais e pós dentais.

Componentes de uma tal pasta dental e de géis dentais incluem um ou mais dos seguintes: um abrasivo dental (de cerca de 10% até cerca de 50%), um tensoativo (de cerca de 0,5% até cerca de 10%), um agente espessante (de cerca de 0,04% até cerca de 0,5%), um umectante (de cerca de 0,1% até cerca de 3%), um agente aromatizante (de cerca de 0,04% até cerca de 2%), um agente adoçante (de cerca de 0,1% até cerca de 3%), um agente corante (de cerca de 0,01 % até cerca de 0,5%) e água (de 2% até 45%).

Agentes anticáries contêm de 0,001% até cerca de 1% de OPN. Agentes anticálculos contêm de cerca de 0,1 % até cerca de 13% de OPN. Pós de pasta, claramente, são substancialmente livres de todos os componentes líquidos.

Outras composições preferidas do objeto da invenção são colu- tórios dentais, incluindo sprays bucais. Componentes de tais colutórios e sprays bucais tipicamente incluem um ou mais dos seguintes: água (de cer- ca de 45% até cerca de 95%), etanol (de cerca de 0% até cerca de 25%), um umectante (de cerca de 0% até cerca de 50%), um tensoativo (de cerca de 0,01 % até cerca de 7%), um agente aromatizante (de cerca de 0,04% até cerca de 2%), um agente adoçante (de cerca de 0,1% até cerca de 3%) e um agente corante (de cerca de 0,001% até cerca de 0,5% de agentes anti- cárie, incluindo OPN, de cerca de 0,001% até 1% e um agente anticálculo (de cerca de 0,1% até cerca de 13%).

Uma terceira área de aplicação está em formulações de gomas de mascar de várias composições em termos gerais. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos e expe- rimentos.

EXEMPLOS

Antecedente Foi propósito desse estudo provar duas coisas: OPN se liga às superfícies de hidroxiapatita de uma forma está- vel. A película não pode ser removida pela rinsagem com água ou tampão. OPN influencia a aderência de bactérias na superfície análoga do dente. A capacidade da OPN de prevenir o aumento de placa in vitro foi investigada nesse estudo em discos de hidroxiapatita (HA) agindo como um modelo para o esmalte do dente. Os discos foram mergulhados em solução de OPN e, subseqüentemente, incubados com saliva. O crescimento de substâncias foi estudado com contagem bacteriana de diferentes cepas bac- terianas formadoras de placa na Faculdade de Odontologia na Universidade de Malmô, Suécia. Como uma referência para superfícies de HA revestidas com OPN, discos de HÁ tratados com BSA (albumina de soro bovino} e não- tratados foram usados. O estudo foi feito em amostras de saliva bem carac- terizadas a partir de 6 doadores, conforme descrito abaixo.

Materiais e métodos Produtos químicos Osteopontina (OPN) foi preparada pela Arla Foods amba com uma pureza cromatográfica de cerca de 95%. Albumina de soro bovino (BSA) foi comprada da Sigma-Aldrich. Dodecilsulfato de sódio (SDS) foi ob- tido da Sigma (St. Louis, MO, USA, L-6026). Todos os outros produtos quí- micos foram de grau analítico e a água usada foi de qualidade Milli-Q. Pré- tratamentos de substratos e experimentos de adsorção foram feitos em tam- pão de fosfato contendo fosfato 0,01 M e cloreto de sódio 0,05 M em pH 7.

Toda a vidraria e pontas de pipetas, etc, assim como os tampões, foram es- terilizados por autoclavação. Soluções de proteína usadas nos experimentos foram esterilizadas por filtração (porosidade de 0,22 pm).

Amostras de saliva Saliva estimulada para os experimentos foi coletada após mascar um peda- ço de parafina. Um sumário dos doadores das amostras de saliva estimula- das é mostrado no Apêndice 1. Não foi ingerida comida ou bebida duas ho- ras antes da coleta.

Substratos Discos de hidroxiapatita (HA), 10 mm em diâmetro, foram com- prados do Swedish Ceramic Institute, Gõteborg. Os discos usados para es- tudos SEM foram polidos de ambos os lados, de forma que pudessem ser limpos usando ultra-som. Antes de iniciar os experimentos, substratos (dis- cos) foram tratados em solução detergente branda e completamente rinsa- dos em água. Finalmente, eles foram rinsados em etanol e água. Substratos foram estocados em etanol 70% até o uso, quando eles foram rinsados com água e secos em um fluxo de nitrogênio. Após a secagem, os substratos usados nas medidas de elipsometria foram plasma lavado com ar residual de baixa pressão (10-30 Pa) usando uma unidade de descarga de incan- descência de radiofrequência (Harrick PDC3XG, Harrick Scientific Corp, Os- sining, Nova Iorque).

Formação de película bacteriana Superfícies de substrato foram pré-incubadas por 1 hora na so- lução de proteína a 37 °C. Os substratos foram então rinsados com tampão e incubados a 37 °C por 40 horas. A agitação foi aplicada durante o pré- tratamento e incubação nos experimentos. Após incubação, os discos de HA foram rinsados com tampão.

Elipsometria A interação da OPN com proteínas salivares em substratos de HA foi seguida pela elipsometria, a qual é um método ótico para medir as alterações no plano da luz polarizada na reflexão na superfície (3). O instru- mento usado foi um elipsômetro de película fina da Rudolph, tipo 436 (Ru- dolph Research, Fairfíeld, N. J), equipado com uma lâmpada de xenônio fil- trada para 4015 A, e operada em um funcionamento conforme descrito por Landgren e Jõnsson (1993). Para determinar os ângulos elipsométricos, Δ e Ψ, para o substrato exposto, a posição de intensidade mínima foi estabeleci- da. Das alterações no Δ e Ψ na adsorção, a espessura e o índice de refra- ção para o filme protéico adsorvido foi calculado de acordo com McCrackin et al. (4), assumindo uma película homogêneo na superfície. A massa ad- sorvida, Γ (mg/m2), foi calculada de acordo com Cuypers et al (5). Conforme mostrado por esses autores, a massa adsorvida pode, em uma cobertura de superfície baixa, ser determinada mais precisamente do que a espessura da película e o índice de refração, e foi apresentada aqui, por essa razão. Os valores da proporção entre peso molar e refratividade molar e do volume específico parcial usados foram 4,1 g/ml e 0,75 ml/g, respectivamente. Es- ses valores são comumente usados para proteínas e foram previamente a- plicados em uma variedade de estudos considerando a adsorção de compo- nentes salivares (cf. (6,7)).

Superfícies preparadas conforme descritas na seção substrato acima foram colocadas na cubeta do elipsômetro contendo o tampão. A cu- beta foi termostatizada a 37 °C, a não ser que tenha sido dito o contrário, e a solução foi agitada com um agitador magnético. Quando os ângulos elipso- métricos foram estabilizados, a saliva foi adicionada até uma concentração final de 10% (v/v). A adsorção foi medida durante 1 h, seguida pela rinsagem da cubeta com um fluxo de tampão contínuo de 12 ml/min durante 5 minu- tos. A dessorção foi, então, seguida por mais 25 minutos. Esse foi o proce- dimento padrão para a formação de película. Para obter uma medida das propriedades coesivas da película, os experimentos demonstraram uma adi- ção final de SDS. No experimento padrão, uma concentração de 17 mM (du- as vezes o cmc em água e aproximadamente nove vezes o cmc no tampão) foi adicionada e, depois disto, uma rinsada final com tampão foi feita 5 minu- tos depois da adição de SDS. Métodos para análises microbiolóaicas Meio de cultura O meio de ágar básico empregado para o isolamento de micro- roganismos foi ágar sangue (8), Ágar Mitis Salivarius (MSA, Difco Lab.), Á- gar Mitis sa//Varás-bacitracina (MSB) (9), ágar cândida-seletivo, de acordo com Nickerson (Merck), ágar Mac Conkey (Difco Lab) e meio de Staphyio- coccus 110 (Difco Lab).

Procedimentos de Cultivo para Amostras de Saliva Amostras de saliva foram transportadas em meio VMG II con- vencional (conservadores de viabilidade), misturados com vórtex no intervalo de 24 horas da coleta, diluídas e inoculadas no ágar sangue, MSA e MSB. Ágar sangue foi incubado em uma câmara anaeróbica (10% de hidrogênio, 10% de dióxido de carbono em nitrogênio) durante 4 dias e, ágar MSA em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono por 2 dias. A quantidade total de unidades formadoras de colônia (UFC) nas placas de ágar foi contada com a ajuda de um estereomicroscópio.

Remoção dos micromanismos dos discos Os microrganismos ligados aos discos foram removidos por ul- tra-som em um Sonics Vibracell com uma microponta usando 10 pulsos de 1 segundo. A remoção das células por ultra-som foi confirmada como sendo eficiente pela falta de crescimento microbiológico observada.

Procedimentos de Cultivo para amostras de dessorbato As amostras de dessorbato foram misturadas com vórtex, diluí- das e inocuiadas no seguinte meio: ágar sangue, MSA, ágar cândída- seletivo, ágar Mac Conkey e meio de Staphylococcus 110. Ágar sangue foi incubado em uma câmara anaeróbica (10% de hidrogênio, 10% de dióxido de carbono em nitrogênio) durante 5 dias, o MSN em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono durante 2 dias e ágar cândida-seletivo, ágar Mac Conkey e meio de Staphyíococcus 110 aerobicamente durante 2 dias. O número total de UFCs nos ágares foi contado com a ajuda de um estereomi- croscópio. A UFC no MSA foi analisada prestando atenção especial à morfo- logia, tamanho e número de tipos de colônias diferentes. Células de colônias representativas de cada tipo morfológico foram coradas com Gram e inocu- ladas em ágar sangue para identificação posterior. Para caracterização adi- cional, isolados crescendo em MSA foram retidos a -79 °C em leite desnata- do (10% de pó de leite desnatado em água destilada, p/v); Oxoid Lab. L31, Hampshire, UK).

Identificação dos Isolados de Estreptococos Cocos catalase negativos, Gram-positivos em cadeias foram considerados como sendo estreptococos, e esses isolados serão identifica- dos em níveis de espécie e subespécie baseando-se em características descritas anteriormente (10).

Resultados e discussão Estudo de interação protéica Para investigar a interação entre OPN e HA e OPN e saliva, um estudo elipsométrico foi feito. Na Fig. 1, o efeito da temperatura de adsorção é apresentado. A partir dessa figura, é possível ver que a adsorção de OPN nas superfícies HA acontece quase que instantaneamente. Uma quantidade maior de OPN foi absorvida em uma temperatura maior (37 °C), embora a rinsagem resulte em alguma dessorção a 37 °C para uma carga de superfí- cie estável de 1 mg/m2. Para estimular o efeito químico na escovação dental, foi adicionado SDS à cubeta durante cinco minutos, seguido pela rinsagem com tampão. Após essa etapa de limpeza, não houve diferença significativa na quantidade adsorvida nas duas temperaturas.

Os resultados obtidos indicam que a OPN fornece uma cobertu- ra superficial dos discos HA que é estável, embora uma redução na espes- sura da película seja obtida após rinsagem com água e tratamento com SDS.

Formação de película bacteriano As contagens de bactérias apresentadas nas tabelas 1 e 2 des- sorvidas por ultra-som branda mostrou para discos de HA tratados com so- luções OPN com concentração de 0,1 mg/ml e 1 mg/ml, respectivamente, um efeito significativo na aderência de bactérias, tanto nas contagens totais nas placas de ágar sangue e ágar MSA para todos os doadores de saliva.

Discos de HA tratados com BSA ou saliva exibiram mais bactérias nas su- perfícies. As contagens totais de microrganismos foram de 10 até 1000 ve- zes mais baixas nos discos revestidos com OPN do que nos discos de con- trole (saliva ou revestidos com BSA). As amostras de saliva estimulada exibi- ram uma composição microbiana diversa, a qual é considerada como sendo uma característica comum da microflora salivar. A descoberta de que signifi- cativamente menos estreptococos colonizaram os discos revestidos com OPN do que os discos de controle foi de interesse.

Tabela 1 Análise bacteriana de discos inteiros, polidos em ambos os la- dos, incubados em saliva estimulada após diferentes pré-tratamentos. Con- tagem total (UFC) em placas de ágar sangue incubadas anaerobicamente.

Tabela 2 Análise bacteriana de discos inteiros, polidos em ambos os la- dos, incubados em saliva estimulada após diferentes pré-tratamentos. Con- tagem total em ágar Mitis Salivarious (MSA) incubados facultativa e anaero- bicamente.

Sumário Os resultados mostram um efeito claro do pré-tratamento com OPN de discos de HA na quantidade de bactérias após a incubação em sali- va estimulada. O efeito antiadesivo parece ser quase que independente de concentração na faixa investigada de 0,1 -1 mg/mL de solução OPN para mergulho dos análogos de dente. Para uma cobertura de monocamada, uma pequena quantidade de OPN é necessária. É interessante notar que houve uma significativa aderência menor de estreptococos nos discos revestidos com OPN, quando comparados com os discos de controle.

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS 1 Hanh Berg, C, et ai. 2 Dawes, C, "Rhythms in Salivary fíow Rate and Composition", International Journal of Chronobiology, 2 (1974) 253-279. 3 Azzam, R. Μ. A, e Bashara, N. M., Ellipsometry and Polarized Light, North-Holland Amsterdam, 1977. 4 McCrackin, F. L, Passaglia, E., Stromberg, R. R, e Steinberg, H. L, "Measurement of the Thickness and Refractive Index of very Thin Films and Optical Properties of Surfaces by Ellipsometry", J. Res. Nat. Bur. Stand., A67 (1963) 363-377. 5 Cuypers, P. A., Corsel, J. W., Janssen, Μ. P., Kop, J. Μ. M., Hermens, W. T. e Hemker, H. C, "The adsorption of Prothrombin to Phos- phatidylserine Multilayers Quantitated by Ellipsometry", J. Biol. Chem., 258 (1983)2426-2434. 6 Vassiiakos, N. Arnebrant, T. e Glantz, P.-O., "Adsorption of Who- le Saliva onto Hydrophilic and Hydrophobic Solid Surfaces. The Influence of Concentration, lonic Strength and pH.", Scand. J. Dent. Res., 100 (1992) 346-353. 7 Vassiiakos, N., Arnebrant, T., Rundegren, J. e Glantz, P.-O., "In vitro Interactions of Anionic and Cationic Surfactants with Salivary Fractions on Well Defined Solid Surfaces.", Acta Odontol. Scand, 50 (1992) 179-188. 8 Beighton D, Russell RRB, Whiley RA; A simple biochemical s- cheme for the differentiation of Strepíococcus mutans and Streptococcus sobrinus: Caries Res 1991; 25:174-178. 9 Gold OG, Jordan HV, van Houte J: A selective médium for Strep- tococcus mutans. Arch Oral Biol 1973; 18:1357-1364. 10 Holdeman LV, Cato EP, Moore WEC: Anaerobe Laboratory Ma- nual, ed 4. Blackbury, Anaerobic Laboratory, Virgínia Polytechnic Institute and State University, 1977.

Claims (6)

1. Formulação dental, caracterizada pelo fato de que contém de 5 mg de osteopontina até 1500 mg de osteopontina por quilo de formulação.

2. Formulação dental de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é na forma de uma pasta dental, pó dental, gel dental, colutório dental, spray bucal ou goma de mascar.

3. Formulação dental de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende de 100 mg de osteopontina até de 1000 mg de osteopontina por quilo de formulação.

4. Formulação dental de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende de 200 mg de osteopontina até 500 mg de osteopontina por quilo de formulação.

5. Formulação dental de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende 350 mg de osteopontina por quilo de formulação.

6. Uso de osteopontina, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de cáries dentais, cálculos dentários ou doença periodontal.