BRPI0418805B1

BRPI0418805B1 - construção de recombinante de adenovírus oncolítico expressando especificamente um fator imunomodulatório gmcsf em células tumorais e seus usos

Info

Publication number: BRPI0418805B1
Application number: BRPI0418805-5A
Authority: BR
Inventors: Zunhong Ke
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2021-01-26
Also published as: BRPI0418805B8; RU2361611C2; BRPI0418805A; US7951585B2; CA2568995A1; CN1706955A; CN100361710C; PT1767642E; WO2005121343A1; EP1767642A4; JP2008501349A; ES2466415T3; EP1767642A1; CA2568995E; RU2006146665A; PL1767642T3; EP1767642B1; US20100047208A1; CA2568995C; DK1767642T3

Abstract

CONSTRUÇÃO DE RECOMBINANTE DE ADENOVÍRUS ONCOLÍTICO EXPRESSANDO ESPECIFICAMENTE UM FATOR IMUNOMODULATÓRIO GM-CSF EM CÉLULAS TUMORAIS E SEUS USOS. A presente invenção relaciona-se à terapia do gene para tumores, especificamente, a terapia relaciona-se à construção do adenovírus oncolítico recombinado, que expressa especificamente um fator imunomodulatório GM-CSF em células tumorais e seus usos.

Description

Campo da invenção

(001) A presente invenção está relacionada a uma terapia gênica para tumores. Mais especificamente, está relacionada a recombinantes de adenovírus oncolíticos que replica preferencialmente em células tumorais e expressa um fator imuno- estimulante para a indução de resposta imune específica para o tumor no corpo humano.

Histórico da invenção

(002) Já se passou mais de um século desde que um vírus foi primeiramente usado para tratar doenças neoplásticas. Os médicos percebiam que, eventualmente, um paciente era curado após uma infecção viral. Essa charada só foi resolvida no início da década de 1920 e, desde então, tem atraído a atenção de cientistas e médicos. Era o início da viroterapia (uso de vírus para o tratamento do câncer). Na década de 1950, mais de 50 vírus foram testados para atividade antitumoral em animais ou pacientes (Mullen and Tanabe (2002) The Oncologist 7:106-119; McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1:130-141). Em 1956, Dr. Smith e sua equipe trataram mais de 30 pacientes com câncer cervical com lisado de células HeLa ou células KB que foram infectadas com 10 sorotipos de adenovírus selvagem através de injeção intratumoral, arterial intra-hepática ou intravenosa. Exceto por sintomas de gripe, não foram observados efeitos colaterais graves na maioria dos pacientes. Por outro lado, os tumores de vários pacientes sofreram redução e necrose. Infelizmente, devido à limitação na produção e purificação do vírus, este trabalho não foi continuado. O trabalho do Dr. Smith encorajou muitos cientistas a explorar a possibilidade de usar vírus para o tratamento de cânceres (Chiocca EA (2002) Nature Review Cancer 2: 938-950).

(003) Juntamente com o progresso nos campos da biologia molecular, e da engenharia genética em particular, com um melhor entendimento dos vírus com relação ao ser humano, os cientistas têm sido capazes de manipular geneticamente o genoma viral desde o final do século passado, o que inclui a criação bem-sucedida de vírus mutantes que podem replicar especificamente em células tumorais (McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1:130-141). Por exemplo, o mutante do vírus do herpes G207, específico para glioma, (Martuza et al., (1991) Science 252:854-856), adenovírus Addl1520 (Onyx-015), um mutante de adenovírus que replica preferencialmente em células tumorais defeituosas p53 (Bischoff et al., (1996) Science 274:373-376) e CV706, um mutante de adenovírus específico para câncer de próstata (Rodriguez et al. (1997) Cancer Research 57:2559-2563). Este trabalho constituiu o alicerce para a formação de um novo campo: viroterapia para o tratamento de câncer. No momento, há mais de 20 variantes de vírus em testes clínicos (Mullen and Tanabe (2002) The Oncologist 7:106-119).

(004) Há várias abordagens para a obtenção de vírus oncolíticos específicos para células tumorais. Uma abordagem para se obter uma variante de vírus que replique seletivamente em células tumorais é usar elementos reguladores específicos para célula tumoral, como promotores e intensificadores, para controlar a expressão de genes virais essenciais, como por exemplo os genes E1A, E1B, E2 e E4 do adenovírus (DeWeese et al. (2001) Cancer Research 61:7464-7472). De acordo com essa abordagem, os genes virais essenciais e, em última análise, a replicação do vírus, estariam sob o controle dos elementos reguladores específicos para célula tumoral, que incluem o promotor e os intensificadores do antígeno específico da próstata (PSA), o promotor e os intensificadores da alfa-fetoproteína (AFP), o promotor humano E2F-1, entre outros (McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1:130-14).

(005) A telomerase é uma enzima importante para o controle da extensão da extremidade do cromossomo da célula, capaz de regular a extensão da extremidade do cromossomo durante o processo de fissão celular. A telomerase consiste basicamente de três partes, onde o RNA e o gene da transcriptase reversa da telomerase (hTERT), de atividade catalítica, controlam a atividade da telomerase, enquanto que o promotor do hTERT determina a expressão e a atividade da telomerase.

(006) Pesquisas adicionais indicaram que a telomerase tem muito pouca ou nenhuma atividade em células normais de adultos (Kim N W et al. Science. 1994 Dec. 23; 266(5193):2011-5; Shay J W et al. European Journal of Cancer 1997, 33;271-282), enquanto que apresenta um alto nível de entrega em mais de 90% das células tumorais (Hahn and Weinberg (2002) Nature Review Cancer 2:331-341; Shay and Wright (1996) Current Opinion Oncology 8:66-71). Com base nessas características de hTERT, os cientistas geraram com sucesso vários vetores nos quais o promotor de hTERT foi incorporado no genoma viral para entrega de genes, incluindo os trabalhos publicados recentemente e que descrevem o uso do promotor de hTERT para replicação condicional de adenovírus oncolíticos (Lanson et al. (2003) Cancer Research 63:7936-7941; Kawashima et al., (2004) Clinical Cancer Research 10:285-292; Kim et al. (2003) Oncogene 22:370-380; Irving et al. (2004) Cancer Gene Therapy 11:174-185).

(007) Há poucos elementos reguladores endógenos no genoma adenoviral que regulam a expressão dos genes virais como, por exemplo, o promotor e o intensificador do gene E1A, entre esses elementos reguladores endógenos, a seqüência do intensificador do E1A se sobrepõe ao sinal da carga viral. Para minimizar o impacto dos elementos reguladores endógenos sobre a regulação de um promotor heterólogo, os cientistas mudaram o sinal da carga do local original, na extremidade esquerda, para o lado direito (Bristol et al. (2003) Molecular Therapy 7(6):755-764; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63:1490-1499). Infelizmente, esse tipo de mudança do sinal da carga do local original para a extremidade direita desestabilizou o genoma viral, resultando na geração de muitos mutantes virais (WO 02/067861; ASGT 2003 Annual Meeting, Molecular Therapy). Assim, a mudança do sinal da carga viral mencionada acima não é uma abordagem viável para minimizar o impacto dos elementos reguladores endógenos. Como minimizar o impacto dos reguladores virais endógenos sobre os elementos heterólogos e evitar a geração indesejada de muitos mutantes virais, mantendo o genoma viral estável?

(008) Com relação ao nível de expressão da telomerase em humanos, durante o desenvolvimento e diferenciação embrionários, os cientistas conseguiram ainda reconhecer que há um certo nível de atividade da telomerase em algumas células, incluindo células cervicais, progenitores e células-tronco (Wright et al. (1996) Development Genetics 18:173-179; Sharma et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12343-12346; Kolquist et al. (1996) British Journal of Cancer 80:1156-1161; Tahara et al. (1999) Oncogene 18:1561-1567; Tanaka et al. (1998) American Journal of Pathology 153:1985-1991). O nível baixo de atividade da expressão da telomerase advertiu os cientistas quando usaram o promotor de hTERT para entregar um gene terapêutico no vetor da terapia gênica ou para gerar adenovírus oncolíticos específicos para célula tumoral pelo controle de genes virais essenciais (Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research10:1203-1205). Devido ao baixo nível de expressão da telomerase em células não-alvo, como as progenitoras, o promotor de hTERT no controle de adenovírus oncolíticos pode replicar maciçamente em células progenitoras, resultando em efeitos colaterais graves (Huang et al. (2004) Clinical Cancer Research 10:1439-1445; Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10:1203-1205; Masutomi et al. (2003) Cell 114:241-253). Assim, aumentar a especificidade do promotor de hTERT para células tumorais é um dos projetos-chave para a geração de adenovírus oncolítico usando-se o promotor de hTERT.

Resumo da invenção

(009) Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um recombinante para controlar a expressão ling de genes virais essenciais do adenovírus humano, o recombinante é obtido pela incorporação ao adenovírus de elementos reguladores específicos para célula tumoral.

(010) Para realizar esta invenção, em outro aspecto, a presente invenção está relacionada a adenovírus oncolíticos específicos para célula tumoral, assim como a recombinantes obtidos pela combinação de adenovírus oncolítico com elemento imuno-regulador através do método de engenharia genética. O recombinante é obtido pela incorporação ao genoma do adenovírus do promotor específico para célula tumoral e do gene imuno-regulador através da tecnologia de clonagem de DNA, obtendo-se assim uma seqüência fundida capaz de replicar em células tumorais e expressar o gene imuno-regulador nas células tumorais.

(011) Em outro aspecto, esta invenção está relacionada a um recombinante de vírus oncolítico específico para célula tumoral capaz de expressar o fator imuno- estimulante. Este recombinante consiste principalmente de vetor viral essencial, elemento regulador seletivo para célula tumoral e fator imuno-estimulante.

(012) Em outro aspecto, esta invenção está relacionada a um método de geração de recombinante de vírus oncolítico de replicação condicional.

(013) Em outro aspecto, esta invenção está relacionada ao uso do recombinante de vírus oncolítico de replicação condicional na fabricação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento terapêutico de cânceres.

(014) Em outro aspecto, esta invenção está relacionada a um medicamento para prevenção e/ou tratamento terapêutico de cânceres que contém o recombinante de vírus oncolítico de replicação condicional.

(015) Em outro aspecto, esta invenção está relacionada a um promotor da seqüência de nucleotídeos indicada na SEQ ID No. 2.

(016) O recombinante, de acordo com a presente invenção, pode ser usado para controlar o adenovírus de tal forma que esses adenovírus repliquem apenas em células tumorais. Pela modificação genética do promotor de hTERT, o recombinante da invenção tem uma especificidade substancialmente aprimorada do promotor de hTERT para células tumorais.

(017) O recombinante de vírus oncolítico específico para célula tumoral, de acordo com a invenção, pode ser preparado através de engenharia genética, de um fator imuno-estimulante capaz de induzir uma resposta imuno-estimulante específica do corpo humano às células tumorais, com o genoma viral de replicação específica para células tumorais. O recombinante de vírus resultante pode replicar seletivamente em uma população celular específica, e pode replicar e se propagar em células tumorais, matando assim as células tumorais; conseqüentemente, o recombinante pode ser usado para o tratamento de câncer e prevenção de tumores.

(018) No estado da técnica, a obtenção e propagação de recombinantes de adenovírus oncolíticos de replicação condicional ou vetores virais modificados geneticamente se dá nas linhagens celulares modificadas geneticamente, como a linhagem celular 293. Como uma linhagem celular expressa as proteínas adenovirais E1 para complementar a função do vetor adenoviral replicação- defectivo sem E1 ou um recombinante de adenovírus oncolítico de replicação condicional no qual o gene viral E1 está sob o controle de um elemento regulador seletivo para célula tumoral. Infelizmente, o recombinante produzido em tal linhagem celular geralmente contém uma certa quantidade de adenovírus selvagens ou recombinados (citados como adenovírus competente para replicação, RCA - replication-competent adenovirus). O motivo para a geração de RCA no produto recombinante é que as células de geração semelhante à da linhagem celular 293 contêm a seqüência de genes do adenovírus; esta parte da seqüência do adenovírus “selvagem” recombinará na célula com o adenovírus sem E1 ou com E1 aprimorado, resultando em um adenovírus “selvagem” ou em um adenovírus recombinante. Tal produto pode não atender às especificações de produto e pode causar efeitos colaterais inesperados relacionados à segurança. A célula usada para a obtenção do recombinante, de acordo com a invenção, não contém seqüência de gene adenoviral e, portanto, pode evitar o RCA e solucionar o problema de segurança mencionado anteriormente.

(019) Esta invenção fornece um recombinante de adenovírus oncolítico de replicação condicional no qual o capsídeo foi aprimorado para aumentar a afinidade de ligação do recombinante com células tumorais, resultando em um aumento na infectividade do recombinante para célula tumoral. Muitos estudos recentes têm demonstrado uma expressão nula ou pequena do receptor 5 do adenovírus (o vírus coxsackie B e o receptor do adenovírus, CAR) em células tumorais, entretanto todas as células tumorais expressam um alto nível de CD46 (Shayakhmetov et al., 2002. Cancer Research 62:1063-1068). Estudos complementares têm demonstrado que o receptor para Adenovírus sorotipo 35 é a molécula de proteína CD46 (Sirena et al. (2004) Journal of Virology 78(9):4454-4462). Assim, propomos substituir a região globular da fibra da seqüência de proteína no adenovírus sorotipo 5 do recombinante por aquela do adenovírus sorotipo 35, esta última capaz de se ligar ao receptor da proteína CD46, de modo a obter um recombinante com um adenovírus fundido capaz de se ligar ao receptor. Acredita-se que tal recombinante terá melhor infectividade em um espectro mais amplo de células tumorais.

(020) O vírus oncolítico de replicação condicional, de acordo com a invenção, pode ser um vírus DNA ou um vírus RNA; pode ser qualquer um dos sorotipos de adenovírus, incluindo os sorotipos 5, 2, 35, 41, etc, preferivelmente o sorotipo 5, ou um adenovírus aprimorado. Por exemplo, um recombinante de adenovírus em que os genes E1A e E1B são unidos por um sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES - internal ribosome entry site), um recombinante de adenovírus no qual a região globular da fibra do adenovírus tipo 5 é substituída por outra do adenovírus sorotipo 35, um recombinante de adenovírus no qual a seqüência terminal de transcrição é inserida após o ITR viral e o local de empacotamento e antes de um promotor heterólogo, como o promotor de hTERT ou o adenovírus com sua seqüência de codificação para 10.4K, 14.5K e 14.7K removida, na região E3. Tal seqüência terminal de transcrição pode encerrar a transcrição do gene mediada por qualquer RNA polimerase, como a seqüência inicial poli-A do SV40 ou como o recombinante de adenovírus com as seqüências para codificação de 10.4K, 14.5K e 14.7K no fragmento E3 removidas.

(021) O elemento regulador de gene específico para célula tumoral mencionado é qualquer promotor, intensificador, silenciador ou combinação destes, preferivelmente o promotor de hTERT aprimorado como indicado na SEQ. ID No. 2, com sítio de ligação para o fator de transcrição E2F-1.

(022) O elemento imuno-regulador mencionado pode ser qualquer gene ou suas variantes que possam estimular e induzir uma resposta imune, como IL-2, IL-10, IL- 12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF e INF-alfa, INF-beta, etc, preferivelmente GM-CSF, incluindo suas formas secretadas e ligadas a membrana, assim como suas variantes.

(023) Um recombinante de adenovírus preferível, de acordo com a invenção, é um recombinante no qual o vetor essencial do vírus é um adenovírus aprimorado no qual a seqüência terminal de transcrição é inserida após o ITR viral e o local de empacotamento mas antes do promotor heterólogo, e o elemento regulador específico para célula tumoral é o promotor de hTERT com seqüência apresentada na SEQ ID No. 2, o gene imuno-estimulante é GM-CSF, com seqüência apresentada na SEQ ID No. 3 (KH-901) ou GM-CSF ligado a membrana (KH-902).

(024) Outro recombinante de adenovírus preferível, de acordo com a invenção, é um recombinante no qual o vetor essencial do vírus é um adenovírus aprimorado em cuja seqüência a região globular da fibra é de um adenovírus sorotipo 35, em substituição à do adenovírus sorotipo 5, e o elemento regulador específico para célula tumoral é o promotor de hTERT com seqüência apresentada na SEQ ID No. 2, e o gene imuno-estimulante é GM-CSF (KH-904), preferivelmente GM-CSF ligado a membrana (KH-905).

(025) Os genes E1A e E1B são ligados pelo IRES, a região globular da fibra é do sorotipo 35, o elemento terminal de transcrição é inserido antes do ITR e do local de empacotamento e após um elemento regulador heterólogo; o elemento regulador seletivo para tumores é o promotor de hTERT com seqüência como a SEQ ID No. 2, no qual o gene imuno-estimulante é GM-CSF, preferivelmente em sua forma ligada a membrana.

(026) Outro recombinante de adenovírus preferível, de acordo com a invenção, é um recombinante no qual o vetor essencial do vírus é um adenovírus aprimorado no qual a seqüência terminal de transcrição é inserida após o ITR viral e o local de empacotamento mas antes do promotor heterólogo; o adenovírus com a seqüência de codificação para 10.4K, 14.5K e 14.7K removida, na região E3; o elemento regulador específico para célula tumoral é o promotor de hTERT com seqüência apresentada na SEQ ID No. 2, o gene estimulante de tumor é GM-CSF, preferivelmente GM-CSF ligado a membrana (KH-903).

(027) Outro recombinante de adenovírus preferível, de acordo com a invenção, é aquele no qual a seqüência terminal de transcrição é inserida após o ITR viral e o local de empacotamento e antes do promotor heterólogo, e os genes adenovirais E1A e E1B são ligados pelo IRES, o elemento regulador específico para célula tumoral é o promotor de hTERT com seqüência apresentada na SEQ ID No. 2 e o gene imuno-estimulante é GM-CSF (KH-906).

(028) Os recombinantes de adenovírus, de acordo com a invenção, incluem, entre outros, KH-901, KH-902, KH-903, KH-904, KH-905 e KH-906, no qual a seqüência para KH-901 é apresentada na SEQ ID No. 3, onde,

(029) 1-103: ITR adenoviral esquerdo {adenovírus sorotipo 5 de seqüência apresentada no Genbank No. BK000408};

(030) 194-358: seqüência de carga do adenovírus e seqüência aprimorada para E1;

(031) 362-534: seqüência poli-A do SV40 e o ligante (a seqüência de adenovírus sorotipo 5 dos quais nos. 362 a 551 foram removidos);

(032) 525-811: a seqüência do promotor de hTERT aprimorado geneticamente e o ligante;

(033) 812 para a direita: seqüência de adenovírus, incluindo E1A, E1B, E2, etc.;

(034) 28995-29436: gene imuno-estimulante GM-CSF;

(035) 29437 para a direita: seqüência de adenovirus do gene E4 e a extremidade direita;

(036) A seqüência do KH-900 é similar à seqüência apresentada na SEQ ID No. 3, enquanto que sua seqüência do promotor de hTERT está na forma selvagem, sem transversão de base (vide SEQ ID No. 1 e 2). Não há seqüência poli-A do SV40 entre o local de empacotamento e o promotor de hTERT.

(037) A seqüência de KH-902 é similar à do KH-901, mas o gene imuno- estimulante GM-CSF é substituído por sua forma ligada a membrana, com seqüência apresentada na SEQ ID No. 4.

(038) A seqüência de KH-903 é similar à de KH-901, exceto que a seqüência de codificação para 10.4K, 14.5K e 14.7K foi removida, e a seqüência removida é parte do genoma adenoviral de np 29804 a 30857. As proteínas dessas seqüências de codificação inibem a resposta imune, particularmente a resposta imune mediada por TNF do fator de necrose de tumor. Assim, a remoção dessas regiões de codificação melhorará as respostas imunes para tumor induzidas pelos adenovírus oncolíticos de replicação condicional.

(039) A seqüência de KH-904 é similar à de KH-901, exceto que a região globular da fibra é alterada do adenovírus sorotipo 5 para sorotipo 35; a seqüência é apresentada na SEQ ID No. 5. Pesquisas recentes têm revelado que muitas células tumorais não expressam a proteína CAR do receptor do adenovírus sorotipo 5, mas expressam em nível alto de molécula CD46. A molécula CD46 é o receptor para o adenovírus sorotipo 35. Assim, a presença de região globular de fibra do adenovírus sorotipo 35 aprimorará a infectividade dos recombinantes de adenovírus oncolíticos de replicação condicional.

(040) KH-905 é similar a KH-904, exceto pelo fato de o gene imuno-estimulante GM-CSF ter sido alterado da forma secretada para a forma ligada a membrana.

(041) KH-906 é obtido a partir de KH-901, pela substituição do promotor endógeno E1B por um sítio interno de entrada dos ribossomos (Li et al., (2001) Cancer Research 62; Zhang et al. (2002) Cancer Research 62:3743-3750).

(042) Esta invenção fornece também a seqüência do promotor de hTERT aprimorado, como apresentado na SEQ ID No. 2; este promotor possui um sítio de ligação para o fator de transcrição E2F-1.

(043) Esta invenção apresenta ainda um método de geração do promotor de hTERT aprimorado acima mencionado. Dois primers são sintetizados com base na seqüência do promotor de hTERT, como apresentado na Figura 1:

(044) 5’-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3’

(045) 5’-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3’

(046) O promotor de hTERT foi amplificado por PCR com DNA genômico humano ativado como modelo, e os primers foram apresentados acima. As condições para reação do PCR são: para o primeiro ciclo, 94°C por 5 minutos para desnaturação, 81°C por 1 minuto para anelamento, 72°C por 2 minutos para extensão. Para cada um dos 35 ciclos a seguir: 93°C por 1 minuto para desnaturação, 68°C por 1 minuto para anelamento, 72°C por 2 minutos para extensão. O produto PCR foi analisado em gel de ágar e o fragmento do promotor de hTERT foi recuperado para confirmação por seqüenciamento. A seqüência foi confirmada conforme publicado (Figura 1). O DNA do fragmento de PCR purificado foi clonado no vetor pUC19. Com o método de mutagênese descrito pela Strategene (mutagênese sítio- dirigida), a seqüência do promotor de hTERT foi alterada para aquela apresentada na Figura 2.

(047) Esta invenção oferece ainda o promotor de hTERT aprimorado com a seqüência apresentada na SEQ ID No. 2, que pode ser obtido pelo método mencionado acima.

(048) No promotor de hTERT, de acordo com a invenção, não há pares TATA conservados, mas há duas seqüências como a caixa E de CACGTG e as 4 regiões de ligação Sp-I ricas em GC. Essas seqüências conservadoras são cruciais para a expressão da telomerase, já que a transcrição da telomerase é regulada pelo promotor de hTERT através de C-Myc/Max e Sp-I (Cong et al (1999) Human Molecular Genetics 8(1):137-142; Kyo et al (2000) Nucleic Acids Research 28(3):669-677). Muitos estudos revelaram que Myc exerce um papel importante na proliferação e cyling celular, assim sendo a modificação do promotor hTERT acima mencionada terá impacto adicional na transcrição e expressão da telomerase.

(049) Para minimizar a atividade do promotor de hTERT em células normais, como as progenitoras, e para aumentar sua seletividade para células tumorais, analisamos em detalhes os sítios de ligação do fator de transcrição do promotor de hTERT, através de modelagem por computador. Com base na modelagem por computador, realizamos análises em várias mutagêneses e identificamos entre elas uma mutante na qual o quarto Sp-I foi alterado para o sítio de ligação E2F-1; a seqüência foi alterada de ‘...TTTCCGCGGCCCCGGCC...’ (Figura 1) para ‘...TTTCCGCGGCAACGCCC...’ (Fig. 2).

(050) O estudo in vitro demonstrou que o promotor hTERT aprimorado mantém a atividade em células tumorais e reduz significativamente a atividade de “promoção” em células normais. Assim, o promotor aprimorado apresenta uma atividade de transcrição significativamente reduzida em células normais, incluindo células progenitoras. Foi demonstrado em um experimento de transfecção temporária, usando o gene reportado, que, em células tumorais, o promotor de hTERT aprimorado tem uma atividade de aproximadamente 5 a 10 vezes maior que o promotor de hTERT selvagem enquanto que, em células normais, o promotor de hTERT aprimorado tem uma atividade muito reduzida (Figura 6). Obtivemos então um adenovírus oncolítico de replicação condicional através do controle do gene viral essencial com o promotor de hTERT aprimorado; o vírus oncolítico resultante não é tóxico para as células-tronco (Figura 7), portanto o adenovírus oncolítico resultante tem uma segurança significativamente maior para aplicação clínica.

(051) Como o promotor E2F-1 é ativo nas células tumorais defectivas na via pRb/E2F/p16, tem sido amplamente usado em terapia gênica, particularmente na obtenção de adenovírus oncolítico de replicação condicional (Parr et al. (1997) Nature Medicine 3(10):1145-1149; Jakubczak et al. (2003) Cancer Research 63:1490-1499; Bristol et al. (2003) Molecule Therapy 7(6):755-763). O promotor de hTERT aprimorado não possui sítios de ligação apenas para os fatores de transcrição E2F-1, como também sítios de ligação Sp-I e NF-1 adquiridos do promotor E2F-1, portanto o promotor de hTERT aprimorado é ativo em células tumorais reguladas para cima pela telomerase e defectivas na via Rb. Assim, o promotor de hTERT aprimorado é ativo nesses dois tipos de células tumorais, mas não é ativo em células normais como as células-tronco; isto representa uma alta especificidade para tumor.

(052) Enquanto isso, está invenção fornece um recombinante de adenovírus oncolítico de replicação condicional no qual os genes E1A e E1B são ligados por sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES) e, com isso, passa a transcrição de dois genes importantes do recombinante do adenovírus, E1A e E1B, para o controle do promotor de hTERT aprimorado, como KH-906.

(053) Esta invenção oferece um recombinante de adenovírus oncolítico no qual o sinal de término da transcrição é localizado após o ITR e o local de empacotamento viral e antes do promotor específico para célula tumoral como o promotor de hTERT. O sinal de término da transcrição, como o poli-A inicial do SV40, pode bloquear qualquer transcrição mediada pela RNA polimerase. Estudos in vitro demonstraram que, devido à presença de um sinal de término da transcrição como o poli-A inicial do SV40, o ITR e a seqüência que se sobrepõe no local de empacotamento e tem efeito intensificador, têm apenas impacto secundário sobre o promotor de hTERT.

(054) Os recombinantes do adenovírus oncolítico de acordo com a invenção apresentam genes imuno-estimulantes. Em vários recombinantes de adenovírus oncolítico conhecidos, o gene GM-CSF foi usado como gene imuno-estimulante; os recombinantes de adenovírus oncolítico descritos nesta invenção também contêm o gene GM-CSF como imuno-estimulante, embora não limitados ao gene GM-CSF, e outros genes imuno-estimulantes como a citocina também podem ser usados. Contudo, GM-CSF é bem conhecido como indutor para respostas imunes de longa duração (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-3543). É uma glicoproteína secretada que pode estimular a diferenciação de granulócitos, monócitos, macrófagos e células dendríticas, e aumentar a expressão de MHC e da molécula co-estimuladora B7 em células com antígenos. GM-CSF pode também aumentar a infiltração de células imunes em tecidos e a diferenciação de células B. Devido às propriedades de GM-CSF descritas acima, os cientistas têm usado, no passado, GM-CSF em associação com a quimioterapia, para o tratamento de cânceres. Muitas vacinas para tumores que consistem de células tumorais capazes de expressar GM-CSF estão em testes clínicos, atualmente (Armitage (1998) Blood 92:4491-4508; Mach et al. (2000) Cancer Research 60:3239-3246; Gilboa (2004) Nature Reviews Cancer 4:401-411). Um adenovírus oncolítico de replicação condicional que expresse GM-CSF pode não apenas matar as células cancerosas como também expressar GM-CSF em células tumorais para induzir respostas imunes específicas para célula tumoral, resultando em efeitos de imunoterapia contra o câncer. Portanto, este processo de estabelecer uma vacina antóloga contra tumores não apenas eliminou o processo complicado de preparação de uma vacina contra tumores, mas também mantém a alta integridade de células tumorais sem manipulação in vitro, incluindo expressão do antígeno, o que tornou a vacina contra o câncer in situ mais eficiente. Assim, o vírus oncolítico descrito acima pode matar células tumorais no local onde foram entregues e, ao mesmo tempo, matar células tumorais distantes através das respostas imunes mediadas por GM-CSF. O método da invenção aqui descrita apresenta uma abordagem única de obtenção de melhores vírus oncolíticos.

(055) Dois recombinantes de adenovírus oncolítico, dentre aqueles de acordo com a invenção, contêm e expressam GM-CSF ligado a membrana (mbGM-CSF). Estudos anteriores revelaram que GM-CSF ligado a membrana pode melhorar a interação com as células dendríticas e induzir melhores respostas imunes que GM- CSF secretado (Soo Hoo et al. (1999) Journal of Immunology 169:7343-7349; Yei et al. (2002) Gene Therapy 6:1302-1311). Não foi relatado que GM-CSF ligado a membrana seja expresso em um recombinante de adenovírus oncolítico de replicação condicional de modo a obter um ingrediente ativo recombinado geneticamente.

(056) Esta invenção apresenta ainda um método de fabricação de recombinantes de vírus oncolítico, composto pelas seguintes etapas:

(057) construção da porção esquerda do genoma adenoviral que contém o promotor de hTERT;

(058) construção da porção direita do genoma adenoviral que contém o gene imuno-estimulante;

(059) co-transfecção de plasmídeos contendo as porções esquerda e direita do genoma adenoviral em células 293, células HeLa, células HeLa-S3 ou células A549, e o recombinante é gerado por recombinação homóloga.

(060) O recombinante da invenção pode ser obtido pelos seguintes processos: o recombinante viral é obtido de células de mamíferos, através de recombinação homóloga. Antes de tudo, o promotor endógeno do gene E1A é removido de pXC.1 (um plasmídeo que contém a extremidade esquerda do adenovírus sorotipo 5, comprado de Microbix, Canadá) e substituído pelo sinal de término poli-A do SV40 e pelo promotor de hTERT aprimorado através de técnicas comuns de clonagem, resultando em pKH-901a. Enquanto isso, a seqüência codificadora gp19K em pBHGE3 (um plasmídeo que contém a porção direita do adenovírus, comprado de Microbix, Canadá) é substituída pelo gene GM-CSF, resultando em um plasmídeo chamado pKH-901b.

(061) O DNA do plasmídeo de pKH-901a e pKH-901b é co-transfectado em células HeLa, um único clone é tomado do plaqueamento e nomeado como KH- 901. Seguindo o mesmo procedimento foram obtidos os recombinantes KH-900, KH-902, KH-903, KH-904, KH-905 e KH-906.

(062) Na verdade, os recombinantes podem ser obtidos a partir de quaisquer células de mamíferos ou não-mamíferos.

(063) Seguindo o plano delineado acima, o fragmento de DNA do nucleotídeo foi amplificado por PCR a 362 para 551 de pXC.1 respectivamente com endonucleases de restrição SspI e PinAI (AgeI). O fragmento de DNA do promotor de hTERT foi amplificado de DNA genômico humano por PCR, ligado a poli-A. Duas endonucleases de restrição, SspI e PinAI, foram adicionadas às duas extremidades do fragmento de DNA. O fragmento de DNA foi digerido com SspI e PinAI e ligado a pXC.1, que foi digerido com a mesma enzima. A ligação foi transformada em células de DH5-alfa de E.coli (Invitro gene, EUA). Dez colônias foram tomadas e cultivadas em uma incubadora por 24 horas. O DNA foi extraído e analisado com enzimas de restrição; o plasmídeo foi confirmado por seqüenciamento e nomeado pKH-901a.

(064) Usando-se os primers de 5’-ATAACCATGTGGCTGC-3’ e 5’- AAATTACTCCTGGACTGG-3’, um GM-CSF de codificação de fragmento de DNA foi amplificado por PCR de um modelo de cDNA extraído do macrófago ativado. O gene completo GM-CSF foi clonado em pUC19 e confirmado por seqüenciamento. Em seguida, o fragmento de cDNA do gene GM-CSF foi clonado em pBHGE3 na região de codificação para gp19k e o plasmídeo resultante, nomeado KH901b, foi seqüenciado e confirmado por análise com enzima de restrição.

(065) O DNA do plasmídeo de pKH-901a e pKH-901b foi co-transfectado em células HeLa para recombinação homóloga. Antes da transfecção, o DNA do plasmídeo foi linearizado por ClaI e transfectado em células HeLa mediado por Lipofectin (Invitrogen, EUA); 10 dias após a transfecção, as células foram colhidas, sofreram 3 ciclos de congelamento/degelo e foram tomados 100ml para plaqueamento em células HeLa. Oito dias após o plaqueamento, placas isoladas eram visíveis sob o ágar. Seis placas foram tomadas e inoculadas em células HeLa. O lisado da célula foi colhido 4 a 6 dias após a inoculação. O DNA adenoviral foi extraído do lisado da célula (kit de Qiagen) e a estrutura viral foi confirmada através de digestão por enzima de restrição, PCR e análise de Southern blot. O vírus resultante foi nomeado KH-901.

(066) O recombinante do vírus, de acordo com a invenção, pode ser usado para preparar composições farmacêuticas para o tratamento de cânceres e/ou para a prevenção de cânceres. O recombinante de vírus pode ser usado em associação com radiação e quimioterapia para atingir uma melhor eficácia terapêutica.

(067) O recombinante do vírus, de acordo com a invenção, pode ser formulado em composições injetáveis para administração intravenosa, injeções intratumoral, intramuscular, subcutânea, intra-organismo, intraperitoneal, etc.

(068) Para preparação em larga escala, o recombinante do vírus da invenção pode ser fabricado em células HeLa, HeLa-S3 ou A549 através de cultura de células, infecção por vírus, propagação, concentração, purificação. O recombinante de vírus fabricado através deste processo pode ser usado como matéria-prima para formulações de composições injetáveis clinicamente, juntamente com veículos farmaceuticamente aceitáveis, pela tecnologia convencional de formulação.

(069) Experimentos descrevendo a aplicação potencial e os efeitos favoráveis da presente invenção são descritos a seguir:

(070) Experimento 1: Atividade do promotor de hTERT e comparação de especificidade para célula tumoral entre os promotores de hTERT selvagem e aprimorado

(071) Para testar a especificidade da versão aprimorada do promotor de hTERT, o promotor de hTERT selvagem (telo) e o promotor de hTERT aprimorado (Mtelo) foram ligados a um gene repórter luciferase (luc); os plasmídeos resultantes foram transfectados em um painel de células humanas cancerosas e normais. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção e os lisados de célula foram usados para determinar o nível de expressão da luciferase. Durante a transfecção, um gene repórter secundário, o plasmídeo repórter LacZ foi usado para normalizar a eficiência da transfecção entre vários tipos de células. O resultado apresentado na Fig. 6 demonstrou que (1) nas células tumorais o promotor aprimorado Mtelo apresentou uma atividade de luciferase muito maior que o promotor de hTERT selvagem (telo). Por exemplo, em células Hep3b (reguladas para cima por telomerase e defectivas para via Rb) Mtelo produziu uma atividade de luciferase 6 vezes maior que telo, e em células LNCaP (reguladas para cima por telomerase e defectivas para via Rb), Mtelo produziu uma atividade de luciferase 18 vezes maior que o promotor de hTERT selvagem; (2) em células humanas normais, o promotor de hTERT selvagem, telo, levou a um nível menor de atividade de transcrição, enquanto que o promotor de hTERT aprimorado, Mtelo, apresentou basicamente um valor de fundo de atividade de transcrição. Por exemplo, em células MRC-5 (telomerase negativas e via Rb normal), o promotor Mtelo apresentou uma atividade 6 vezes menor que a do promotor de hTERT selvagem, telo. Este resultado indicou que a adição dos sítios de ligação E2F aumentou significativamente a seletividade para célula tumoral e a capacidade de transcrição do promotor de hTERT.

(072) Esta conclusão foi depois confirmada pelos testes, nos quais a seletividade melhorada do promotor de hTERT aprimorado, a atividade transcricional do promotor foi determinada nas células infectadas com recombinantes pela medição do número de cópias da mensagem de E1A. Quatro vírus foram incluídos no estudo: adenovírus selvagem como controle positivo, adenovírus replicação- defectivo dl312 (sem E1A) como controle negativo, KH-900 (com promotor de hTERT selvagem) e KH-901 (com promotor de hTERT aprimorado). Queratinócitos de prepúcio humano (hFKs) e hFKs-E6, as células hFK transformadas com o gene E6 do vírus papiloma humano tipo 16 (HPV-16), foram usados para os testes. Demonstrou-se anteriormente que hFKs-E6 apresenta atividade regulada para cima pela telomerase (Horikawa et al. (2001) Journal of Virology 75(9):4467-4472). As células foram infectadas com os vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de uma unidade de formação de placa (pfu) por célula, e o número de RNA mensageiro de E1A foi determinado por PCR de transcrição reversa (RT-PCR). O resultado apresentado na Fig. 7 demonstrou que não foi detectado 7mRNA mensageiro de E1A em células hFKs e hFKs-E6 infectadas com dl312; aproximadamente 4000 cópias de RNA mensageiro de E1A foram detectados em células infectadas com Ad5 e não houve diferença significativa nas cópias de mRNA entre as células hFKs e hFKs-E6. Entretando, em células infectadas com KH-900, poucas cópias de mRNA de E1A foram detectadas em células hGKs, enquanto que 20 vezes mais cópias de mRNA de E1A foram detectadas em células hFKs-E6. Mais curiosamente, foram detectados mais de 100 vezes mais mRNA de E1A em células hFKs-E6 infectadas com KH-901 que células hFKs. Enquanto isso, o número de cópias de mRNA de E1A foi ainda menor em células hFKs infectadas com KH-901 que em células hFKs infectadas com KH-900. Em conjunto, isso demonstrou que o promotor Mtelo, quando ligado ao gene repórter, apresenta um nível de atividade e uma seletividade para célula tumoral maiores que o promotor telo; ao mesmo tempo, a seletividade melhorada para tumores é verdadeira, quando o promotor é inserido no genoma adenoviral. O promotor Mtelo apresenta melhor especificidade para tumor que o promotor selvagem, quando usado para controlar os genes virais essenciais.

(073) Este resultado foi ainda confirmado em células de medula óssea humana cultivadas. Em um estudo de viabilidade de célula, KH-900 e KH-901 foram usados para infectar células 293 e células-tronco mesenquimais de medula óssea humana (hBMsc) com MOI de 1. O resultado apresentado na Fig. 8 demonstrou que KH-901 matou as células 293 de forma tão eficiente quanto KH-900, contudo KH-900 apresentou um certo nível de morte celular em células hBMsc, enquanto que com KH901 não houve morte.

(074) Experimento 2: Comparação da capacidade de matar células tumorais de quatro recombinantes de adenovírus oncolíticos de replicação condicional

(075) A linhagem celular de câncer pulmonar A549 foi usada para comparar a capacidade de matar de quatro adenovírus oncolíticos de replicação condicional. As células foram semeadas em placas de 6cm e os vírus foram aplicados com MOI de 1 quando as células cresceram até 85% de confluência. A viabilidade celular foi determinada em vários momentos após a infecção (Hallenbeck et al. (1997) Human Gene Therapy 11:1172-1179). O resultado apresentado na Fig. 9 demonstrou que KH-904 matou as células de forma mais eficiente que KH-901 e KH-902, enquanto que KH-900 foi o mais fraco.

(076) Este resultado indicou que o promotor de hTERT aprimorado apresentou atividade mais forte que o promotor de hTERT selvagem. Indicou também que a substituição da região globular na fibra do gene do sorotipo 35 pode apresentar infectividade maior que o sorotipo 5. Esta conclusão foi confirmada em um painel de células cancerosas e células humanas normais (Tabela 1). Um painel de células humanas tumorais e normais foi infectado com diferentes variantes de adenovírus por 72 horas, e a viabilidade celular foi medida conforme descrito acima. EC50 foi calculado para a quantidade de vírus necessária para matar 50% das células. Quanto menor o EC50, maior a eficiência do vírus para matar as células. O resultado apresentado na Tabela 1 indica que (1) KH-901 matou as células tumorais de forma mais eficiente que KH-900, confirmando assim que o promotor de hTERT aprimorado apresenta uma melhor especificidade para tumor; (2) KH- 902 e KH-903 mataram células de forma similar a KH-901, enquanto que KH-904 foi o mais forte. Em contraste, o promotor Mtelo aprimorado contendo vírus (KH- 901, KH-902, KH-903 e KH-904) matou menos células normais quando comparado com KH-900, o vírus apresentou o promotor de hTERT selvagem. Para KH-906, no qual o gene viral E1B foi ligado a E1A pelo IRES, houve uma boa especificidade para célula tumoral, embora a capacidade de matar tenha sido relativamente menor.

(077) Tabela 1. Expressão de GM-CSF em células infectadas com KH-901

(078) Tabela 2. EC50 . de KH-900 KH-901, KH-902, KH-903, KH-904 e KH906

(079) O mais interessante é que, para célula humana normal, os recombinantes virais que foram modificados para incluir o promotor Mtelo aprimorado geneticamente, incluindo HK-901, HK-902, HK-903 e HK-904, todos apresentaram uma capacidade de matar muito mais fraca (indicada por um EC50 maior) que HK- 900, que foi modificado para incluir o promotor de hTERT selvagem.

(080) Além disso, os recombinantes de adenovírus KH-906, nos quais um sítio interno de entrada dos ribossomos foi inserido entre os genes E1A e E1B e que, portanto, têm a transcrição dos genes E1A e E1B sob o controle do promotor Mtelo aprimorado, demonstraram uma seletividade para célula tumoral mais alta que os outros recombinantes virais, embora sua capacidade de matar células tumorais tenha sido um pouco mais fraca que as outras.

(081) Experimento 3: KH-901 produz um alto nível de GM-CSF biologicamente ativo em células tumorais

(082) Cinco linhagens de célula tumoral e uma linhagem celular humana normal foram infectadas com KH-901, com MOI de 1 ou 10. 48 horas após a infecção, as células foram colhidas para determinação da concentração de GM-CSF por ELISA e para p ensaio de TF-1 conforme descrito anteriormente (Li et al. (2001) Cancer Research 61:6428-6436). O resultado apresentado na tabela 1 demonstrou que 5 células tumorais infectadas com KH-901 produziram um alto nível de GM-CSF. Por exemplo, em células LNCaP infectadas com KH-901, a quantidade de GM-CSF detectado nas células foi de 231ng/10A6 células/24h. Em contraste, havia um nível muito baixo de GM-CSF detectável em células humanas normais infectadas com KH-901. O bioensaio revelou posteriormente que GM-CSF expresso em células tumorais era biologicamente ativo (vide Tabela 2)

(083) Experimento 4: Eficácia anti-tumor de recombinantes de adenovírus oncolíticos em modelos tumorais

(084) A eficácia anti-tumor de adenovírus oncolíticos foi avaliada em modelos tumorais de câncer de próstata LNCaP de camundongo atímico. Seis milhões de células LNCaP foram inoculadas por via subcutânea em camundongo atímico, e os vírus foram injetados via intratumoral por três vezes nos dias 1, 5 e 9, a uma dose de 3x10A10 partículas de vários vírus (KH-901, KH-904 e addl1520, um adenovirus oncolítico sem E1B-p55), quando o volume do tumor atingiu 200 mmA3 em 4 semanas. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana, e o resultado foi apresentado na Fig. 10.

(085) Neste teste, três recombinantes, ou seja, KH-901, KH-904 e KH-907 (não apresentado, semelhante a KH-901 mas sem o gene GM-CSF) foram usados para a injeção tumoral; Add1520 foi também testado, como controle.

(086) Como pode ser visto na Fig. 10, o tumor cresceu muito rápido para o tratamento de placebo; no dia 48 o volume do tumor atingiu 1200% do valor de referência. No grupo tratado com KH-901, o tumor se manteve igual à referência, enquanto que os tumores tratados com KH-904 reduziram o volume para 15% da referência. Durante o mesmo período, os tumores tratados com addl1520 cresceram até 850% da referência.

(087) Este resultado indicou que KH-901 e KH-904 apresentam uma atividade anti- tumoral melhor que Addl1520 (Onyx-015). Curiosamente, como demonstrado no estudo in vitro, KH-904 apresentou uma eficácia anti-tumor melhor que KH-901.

(088) No mesmo estudo, a expressão de GM-CSF também foi documentada. Não foi detectado GM-CSF em animais tratados com KH-907 e Addl1520, enquanto que um alto nível de GM-CSF foi detectável em animais tratados com KH-901 ou KH- 904. Por exemplo, no dia 14 a quantidade de GM-CSF detectada nos animais tratados com KH-901 ou KH-904 era de 2.322g/ml ou 2.776g/ml, respectivamente. Este resultado sugeriu que o vírus oncolítico KH-901 e semelhantes produziu GM- CSF não apenas nas células tumorais mas também uma alta expressão in vivo em animais com tumor.

(089) Os resultados desses estudos demonstraram a replicação de KH-901 e semelhantes em várias células tumorais e que altos níveis de expressão de GM- CSF são detectados após a infecção.

(090) Os outros adenovírus oncolíticos descritos acima foram também caracterizados por seguir procedimento similar e serão descritos em maiores detalhes nos respectivos exemplos.

(091) Os adenovírus oncolíticos de replicação recombinante descritos nesta invenção apresentam as seguintes características:

(092) Características estruturais

(093) Esses recombinantes são vírus vivos, e podem replicar e se propagar em células tumorais. São diferentes de medicamentos sintetizados e modificados geneticamente. Eles podem replicar em células tumorais, expressar genes estranhos e apresentar alta atividade biológica, assim como atividade anti-tumoral. Esses recombinantes apresentam genes imuno-estimulantes, portanto o gene imuno-estimulante pode ser expresso nas células infectadas pelo vírus, induzindo respostas imunes específicas para célula tumoral. São seguros devido à presença de elemento regulador específico para tumores.

(094) Aplicações potenciais

(095) Os elementos reguladores específicos para tumor nos vírus recombinantes são ativos em mais de 90% das células tumorais, ou seja, na maioria das células tumorais o gene crítico desses vírus recombinantes está sob o controle de um promotor específico para tumores; assim, esses vírus recombinantes podem replicar na maioria das células tumorais e matá-las. Sendo assim, esses vírus recombinantes têm várias aplicações potenciais, incluindo o tratamento de cânceres na cabeça, pescoço, pulmão, cólon, próstata, bexiga, estômago, fígado, etc.

(096) Como esses vírus recombinantes apresentam gene imuno-estimulante, como descrito acima, os vírus não apenas apresentarão efeitos oncolíticos, matando as células tumorais, mas também estimularão respostas imunes específicas para tumor após a expressão da citocina nas células tumorais. Assim, esses vírus não serão eficientes apenas no tumor local mas também em células tumorais distantes.

(097) Os vírus recombinantes, de acordo com a invenção, apresentam as seguintes características: 1) são mais específicos para células tumorais, não sendo infecciosos para células somáticas e células-tronco normais; assim, esses vírus podem apresentar menos efeitos colaterais em aplicação clínica; 2) expressam gene imuno-estimulante, incluindo as formas secretada e ligada a membrana. Esta citocina estimulará respostas imunes específicas para tumor, portanto eles podem sem também eficientes para tumores distantes; 3) através da modificação para o capsídeo viral, esses adenovírus apresentam melhor infectividade de célula e, portanto, melhor atividade anti-tumoral.

(098) Esta invenção apresenta a seguinte contribuição:

(099) Através da modificação por mutagênese dirigida, o elemento regulador específico para tumor, promotor de hTERT, apresenta uma maior atividade de transcrição e especificidade para tumor; o promotor resultante apresenta uma melhor capacidade de direcionamento, reduziu significativamente a atividade de transcrição do gene ligado em células somáticas normais, especialmente células sexuais, progenitoras e células-tronco. Os adenovírus oncolíticos, cujo gene crítico está sob o controle do promotor de hTERT aprimorado, não pode replicar em células da medula óssea, mas á altamente potente em muitas células tumorais.

(0100) O GM-CSF imuno-estimulante foi modificado nos adenovírus recombinantes, então o GM-CSF será expresso apenas nas células infectadas pelo vírus. Tal vírus pode matar as células tumorais através dos efeitos oncolíticos após a injeção intra- tumoral; enquanto isso, após a lise oncolítica as células infectadas pelo vírus expressam GM-CSF, que estimula respostas imunes fortes contra as células tumorais. Particularmente, um adenovírus oncolítico que expresse GM-CSF terá ainda um efeito preventivo, já que o vírus educará o sistema imunológico do paciente através da combinação de efeitos oncolíticos (morte celular e apresentação de antígeno) e resposta imune pela educação das células imunes do paciente. Assim, tal vírus pode ser capaz de evitar a recorrência de tumores no paciente.

(0101) Através da modificação do capsídeo, o adenovírus oncolítico recombinante resultante apresenta maior infectividade em tumores. Devido à pequena ou nenhuma expressão do receptor CAR do adenovírus sorotipo 5, é bem comum que o Ad5 não infecte bem a célula tumoral. Contudo, quando o genoma de Ad5 é incorporado ao sítio de ligação e à seqüência para o receptor do adenovírus sorotipo 35, a infectividade para a maioria das células tumorais pode ser bastante aumentada. Estudos in vitro e in vivo confirmaram esta observação.

(0102) Descrição das seqüências na Listagem de Seqüências

(0103) SEQ ID No. 1 é um fragmento bp contendo seqüências do promotor de TERT humano, que apresenta vários sítios de ligação para fator de transcrição, incluindo SP-1 (caixas GC), caixas E (sítio de ligação para Myc), NF-1 (sítio para ligação do fator NF).

(0104) SEQ ID No. 2 é um promotor de TERT humano aprimorado por mutagênese que apresenta uma maior seletividade para célula tumoral e atividade de transcrição; E2F-1: sítio de ligação do fator de transcrição E2F.

(0105) SEQ ID No. 3 é uma seqüência da extensão completa de KH-901, onde 1) 1-103: ITR adenoviral esquerdo {seqüência de adenovírus sorotipo 5, apresentada no Genbank No. BK000408}; 2) 194-358: seqüência de empacotamento do adenovírus e seqüência aprimorada para E1; 3) 362-534: seqüência poli-A do SV40 e o ligante (a seqüência de adenovírus sorotipo 5 dos quais np 362 a 551 foram removidos); 4) 525-811: as seqüências do promotor de hTERT aprimorado e o ligante; 5) 812 para a direita: seqüência de adenovírus, incluindo E1A, E1B, E2, etc.; 6) 28995-29436: gene imuno-estimulante GM-CSF humano; 7) 29437 para a direita: seqüência de adenovírus incluindo o gene E4 e a extremidade direita;

(0106) SEQ ID No. 4 é um elemento imuno regulador GM-CSF na forma ligada a membrana (mbGM-CSF) contido no genoma do recombinante.

(0107) SEQ ID No. 5 é de uma seqüência de proteína fibrosa quimérica no genoma do recombinante KH-904, na qual a região globular da fibra do gene pertence ao adenovírus humano sorotipo 35.

(0108) Breve descrição dos desenhos

(0109) Fig. 1 descreve a seqüência do promotor da transcriptase reversa da telomerase humana e os sítios de ligação para os fatores de transcrição. SP-1 (caixas GC): sítios de ligação para SP1; Caixas E: sítios de ligação para Myc; NF-1: sítio de ligação para NF.

(0110) Fig. 2 descreve o promotor de TERT humano aprimorado por mutagênese que apresenta uma maior seletividade para célula tumoral e atividade de transcrição; E2F-1: sítio de ligação do fator de transcrição E2F.

(0111) Fig. 3-1 e Fig. 3-2: descrevem as estruturas dos recombinantes de acordo com a invenção.

(0112) Fig. 4-1, Fig. 4-2 e Fig. 4-3: descrevem o processo de geração da variante KH-901 do adenovírus recombinante.

(0113) Fig. 5 apresenta os detalhes da obtenção do recombinante KH-901

(0114) Fig. 6 apresenta a atividade do promotor para os promotores de hTERT selvagem (telo) e mhTERT aprimorado (Mtelo).

(0115) Fig. 7 apresenta a expressão do RNA mensageiro de E1A do adenovírus recombinante em células hFK e hFKs-E6, que é capaz de transformar o gene E6 do HPV.

(0116) Fig. 8 apresenta a atividade citolítica de adenovírus recombinantes para células-tronco mesenquimais de medula óssea humana.

(0117) Fig. 9 apresenta a atividade citolítica de adenovírus recombinantes em células A549 (% viabilidade celular).

(0118) Fig. 10 apresenta a eficácia anti-tumoral em modelo de xeno-enxerto de câncer de próstata LNCaP após a injeção intra-tumoral de adenovírus recombinantes.

(0119) Aplicações específicas

(0120) São dados os seguintes exemplos para descrever os detalhes da invenção; tais exemplos não representarão qualquer limitação a esta invenção. Exemplo 1:

(0121) Construção de recombinante de adenovírus oncolítico replicante KH-901 e sua análise (Figura 4 e Figura 5).

(0122) De acordo com a seqüência do promotor de hTERT apresentado na Figura 1, foram sintetizados dois primers, conforme segue:

(0123) 5’-GTC TGG ATC CGC TAG CCC CAC G-3’

(0124) 5’-CGA CCG GTG ATA TCG TTT AAT TCG C-3’

(0125) Para a amplificação do promotor de hTERT pelo método de PCR, no qual o RNA humano ativado foi usado como modelo. As condições para reação do PCR são: para o primeiro ciclo, desnaturação a 94°C por 5 minutos, anelamento a 81°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 2 minutos. Para cada um dos ciclos subseqüentes, desnaturação a 93°C por 1 minuto, depois análise em gel de ágar e recuperação do fragmento do promotor de hTERT. Ficou indicado pelo sequenciamento que o fragmento do promotor obtido é o mesmo que o apresentado (Fig. 1). Esse fragmento de DNA foi então clonado no vetor pUC19 e reformado até a seqüência apresentada na Fig. 2 por mutagênese, através de um kit da Strategene (Strategene, CA).

(0126) A seqüência do sinal poli-A foi amplificada por PCR com os seguintes primers:

(0127) 5’-TAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGGATCTCTGC-3’

(0128) 5’-GGATCCAGACATGATAAGATACATTGAGAG-3’

(0129) Onde Pcmv/ZERO (Invitrogen, EUA) foi usado como modelo, as condições para o anelamento durante a reação do PCR foram as mesmas descritas acima. O fragmento de PCR foi purificado e confirmado por sequenciamento.

(0130) O fragmento do promotor de hTERT purificado e o fragmento de DNA poli-A foram desnaturados juntos a 95°C por 5 minutos e resfriados até a temperatura ambiente, como o modelo. Um fragmento de DNA com aproximadamente 500 pares foi amplificado com primers A e D; o fragmento de PCR purificado e seqüenciado foi digerido com SspI e AgeI e o fragmento purificado contendo a sequência poli-A e o promotor de hTERT foram usados para os processos subsequentes de clonagem.

(0131) pXC.1 (comprado de Microbix, Canadá) foi usado como modelo e dois sítios de enzimas foram adicionados ao nucleotídeo 339 (SspI) e 551 (PinAI) via mutagênese. O pXC.1 mutado foi digerido com SspI e PinAI e purificado, com o fragmento grande como vetor. O fragmento poli-A/hTERT foi ligado ao vetor pXC.1 e transformado em DH5 de E.Coli por técnicas comuns de clonagem após 20 horas. Após uma incubação a 4°C por 30 minutos, choque térmico a 42°C por 30 segundos e posterior incubação a 4°C por 2 minutos, é feita sua cultura a 37°C por 45 com 1ml de solução de cultura LB. Foi então movido para uma placa de cultura de ágar contendo ampicilina para cultura por 24 horas; uma bactéria individual foi tomada usando um palito de dentes esterilizado e movida para um frasco de cultura limpo contendo 1ml de LB por 24 horas. O DNA do plasmídeo foi purificado do E.coli cultivado, teve a estrutura confirmada por digestão por enzima e foi nomeado pKH-901a. Este plasmídeo contém o ITR esquerdo, o sinal para empacotamento, a seqüência poli-A, o promotor de hTERT (Mtelo), E1A e E1B parcial.

(0132) Construção da extremidade direita do adenovírus

(0133) Vetor pGEM-7 (disponível para compra na Promega). Foram usados, então, dois pares de primers para amplificar dois fragmentos de DNA: 5’-AACCAAGGCGAACCTT-3’ 5’-CCACATGGTTATCTTGG-3’ 5’-CCAGTCCAGGAGTAATTTAC-3’ 5’-TGCGCTTTAGGCAGCAGATG-3’

(0134) Para clonar o gene GM-CSF, foram usados os seguintes genes:

(0135) M. 5’-CCACCCAAGATAACCATGTGGCTGC-3’

(0136) N. 5’-AACTTAGTAAATTACTCCTGGACTGG-3’.

(0137) Uma grande quantidade do fragmento de cDNA do GM-CSF foi amplificada a partir do modelo de cDNA preparado a partir de macrófagos ativados por PCR com condições de amplificação similares às descritas acima. A sequência do cDNA foi conformada pelo sequenciamento após purificação; o fragmento de cDNA foi misturado a dois fragmentos de DNA amplificados com pBHGE3 como modelo para amplificação adicional por PCR com os primers E e H, para produzir um grande fragmento de DNA. A seqüência deste fragmento de DNA resultante foi confirmada por sequenciamento e o fragmento de DNA foi clonado no vetor pGEM-7 após digestão com BsiWI e NotI e subseqüentemente ligado a pBHGE3, resultando em um plasmídeo pKH-901b. Este plasmídeo da extremidade esquerda contém a maior parte do gene E1B, os genes E2 e E3 completos, o gene GM-CSF e o gene E4.

(0138) 7. Construção do adenovírus recombinante KH-901

(0139) Os DNAs dos plasmídeos pKH-901a e pKH-901b foram linearizados com endonuclease de restrição NdeI e ClaI e co-transfectados em células HeLa (com transfectin, da Invitrogen) após a purificação do DNA do plasmídeo. As células foram colhidas após incubação a 30°C por 10 dias. 100 ul do sobrenadante foram tomados para estudo em placa após 3 ciclos de congelamento/degelo. Placas isoladas foram avistadas abaixo do ágar de baixo ponto de fusão, 8 a 12 dias após a adição do sobrenadante. 10 ul de líquido sob o ágar foram tomados por pipetagem automática e adicionados às células HeLa pré-semeadas. O lisado de célula foi visto e coletado 4 a 8 dias após a inoculação. 200 ul de lisado de célula foram usados para extração de DNA. A estrutura viral foi confirmada por PCR e Southern blot. Placas individuais foram depois purificadas em células HeLa e cultivadas em células HeLa para estoque de vírus. O estoque de vírus foi armazenado a -80°C. Uma alíquota do estoque de vírus foi tomada para confirmação por sequenciamento e o vírus foi nomeado KH-901.

(0140) O método para produção em grande escala de KH-901 será descrito em separado; contudo, resumindo, as células HeLA-S3 (células HeLa adaptadas para crescer em meio sem soro) foram cultivadas em bioreator de 3 litros; quando o número de células atingiu 3 milhões por litro, as células foram infectadas com KH- 901 e continuaram na cultura por 2-3 dias. As células foram então colhidas e o vírus foi purificado através de purificação por gradiente de CsCl2 ou coluna de troca iônica. O purificado foi armazenado em tamponamento adequado, como PBS e glicerol. Exemplo 2

(0141) KH-900 foi construído seguindo uma rotina similar àquela para KH-901, exceto que não havia poli-A no plasmídeo pKH-901a nem mutante no fragmento do promotor de hTERT; a seqüência é a mesma da SEQ. ID No. 1. O plasmídeo resultante é nomeado pKH-900a; pKH-900a foi co-transfectado com pKH-901b em células HeLa para gerar KH-900. Exemplo 3

(0142) Para a construção de KH-902, o cDNA de GM-CSF em pKH-901b foi substituído pela versão ligada a membrana, conforme apresentado na SEQ ID No. 4, resultando em pKH-902b. pKH-901a e pKH-902b foram co-transfectados em células HeLa para gerar KH-902. Exemplo 4

(0143) Para produzir KH-903, as regiões de codificação para 10.4k, 14.5k e 14.7k em pKH-901b foram removidas por método de modificação genética convencional, resultando em um plasmídeo chamado KH-903b. pKH-901a e pKH-903b foram co- transfectados em células HeLa para gerar KH-903. Exemplo 5

(0144) Para produzir KH904, a região globular do gene da fibra, isto é, o adenovírus sorotipo 5 foi substituído pela região globular do adenovírus sorotipo 35, como apresentado na SEQ ID No. 5, resultando em um plasmídeo chamado pKH-904b. Exemplo 6

(0145) Para a construção de KH-905, o cDNA do gene GM-CSF em pKH-904b foi substituído pela versão ligada a membrana, conforme apresentado na SEQ ID No. 4, resultando em pKH-905b. pKH-901a e pKH-905b foram co-transfectados em células HeLa para gerar KH905. A estrutura viral foi confirmada por PCR e sequenciado. Exemplo 7

(0146) Para gerar KH-906, o promotor endógeno para E1B foi substituído pelo sinal interno de entrada dos ribossomos, resultando em um plasmídeo clamado pKH- 906a. pKH-906a e pKH-901b foram co-transfectados em células HeLa para gerar KH-906 (Li et al. (2001) Cancer Research 62:2667-2674). A estrutura viral foi confirmada por PCR e seqüenciamento.

Claims

1. “RECOMBINANTE DE ADENOVIRUS ONCOLITICO”, caracterizado pelo dito recombinante compreender o vírus essencial, elementos reguladores específicos para célula tumoral em que o elemento regulador especifico para células tumorais o promotor hTERT seletivo para células tumorais de SEQ ID NO: 2 e um gene imuno-regulador, onde o gene imuno-regulador é um gene fator estimulador de colônia de macrófagos granulócitos GM-CSF e o referido vírus essencial sendo um adenovírus selecionado do grupo que compreende os sorotipos de adenovírus, Ad5 e Ad35: i) um adenovírus no qual os seus genes EIA e ElB estão ligados por um sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES); ii) um adenovírus no qual a região globular da fibra do sorotipo 5 de adenovírus foi substituído pela região globular da fibra do sorotipo 35 de adenovírus; iii) um adenovírus no qual um elemento terminal de transcrição é inserido a jusante do ITR (repetição terminal invertida) e o local de empacotamento e a montante do promotor hTERT; iv) um adenovírus no qual a sequência de codificação para 10.4K, 14.5K e 14.7K na região E3 do adenovírus foi eliminada; e v) um adenovírus no qual os seus genes EIA e ElB estão ligados por um sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES) e a sua a região globular da fibra do sorotipo de adenovírus foi substituído pela região globular da fibra do adenovírus sorotipo 35 e um elemento terminal de transcrição é inserido a jusante do ITR e o local de embalagem e a montante do promotor hTERT.

2. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela variante de adenovírus aprimorada ser um adenovírus no qual os genes E1A e E1B são ligados por um sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES).

3. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo o vírus essencial ser um adenovírus no qual a região globular da fibra do adenovírus tipo 5 foi substituído pela a região globular da fibra do adenovírus sorotipo 35.

4. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus no qual um elemento terminal de transcrição é inserido a jusante do ITR e do local de embalagem e a montante do promotor hTERT.

5. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus no qual a seqüência de codificação para 10.4K, 14.5K e 14.7K na região E3 do adenovírus foi removida.

6. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus no qual os genes E1A e E1B são ligados por um sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES) e a região globular da fibra do adenovírus sorotipo 5 foi substituída pela região globular da fibra do adenovírus sorotipo 35 e um elemento terminal de transcrição é inserido antes do ITR e do local de empacotamento e após um promotor hTERT.

7. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo elemento terminal de transcrição ser a seqüência do sinal inicial poli-A de SV40.

8. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus melhorado, em que um elemento terminal de transcrição inserido a jusante da ITR e do local de empacotamento e a montante do promotor hTERT, a sequência de codificação para 10,4K, 14,5K e 14,7K na região E3 do adenovírus foi excluído.

9. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo gene GM-CSF ser o gene GM-CSF humano.

10. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo dito GM-CSF está na forma ligada a membrana.

11. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus aprimorado, no qual, seus genes E1A e E1B são ligados por um sítio interno de entrada dos ribossomos (IRES), sua região globular da fibra do adenovírus sorotipo 5 foi substituída pela região globular da fibra do adenovírus sorotipo 35 e um elemento terminal de transcrição é inserido antes do ITR e do local de empacotamento e após um promotor heterólogo, e onde o elemento regulador específico para célula tumoral é o promotor de hTERT.

12. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus aprimorado, no qual, a região globular da fibra do sorotipo 5 foi substituída pela região globular da fibra do sorotipo 35, o elemento regulador específico para célula tumoral é o promotor hTERT.

13. “RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus essencial ser um adenovírus melhorado, no qual, a região globular da fibra do sorotipo 5 foi substituída pela região globular da fibra do sorotipo 35, o elemento regulador específico da célula de tumor é o promotor hTERT.

14. “RECOMBINANTE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo gene dito GM-CSF ser na sua forma ligada à membrana.

15. “PROMOTOR”, caracterizada por ter uma sequência SEQ ID No. 2, de acordo com a reivindicação 1.

16. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, caracterizado por incluir qualquer dos recombinantes das reivindicações 1 a 15.

17. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por ser formulada para aplicação por injeção.

18. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela composição ser aplicada juntamente com quimioterapia e/ou radioterapia.

19. “USO DO RECOMBINANTE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada pela fabricação de medicamento para prevenção e/ou tratamento de tumores.

20. “MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO RECOMBINANTE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por conter as seguintes etapas: a) geração da porção esquerda do adenovírus, que contém a seqüência do promotor de hTERT da SEQ ID No. 2.; b) geração da porção direita do adenovírus, que contém um gene imuno-regulador; e c) co-transfecção das porções direita e esquerda do DNA do plasmídeo nas células 293, HeLa, HeLa-S3 ou A549 e geração do recombinante através de recombinação homóloga.