BRPI0507209B1 - processo para detecção da formação e desenvolvimento de um biofilme de microrganismos em uma superfície de um meio de cultura líquido e dispositivo que permite detectar a formação e o desenvolvimento de um biofilme em um meio de cultura líquido - Google Patents

Abstract

processo e dispositivo que permitem medir a viscosidade de uma cultura de microorganismo a presente invenção trata de um processo que permite medir a viscosidade de um meio de cultura de microorganismo (5), caracterizado pelo fato de comportar etapas que consistem sucessivamente em : a) mergulhar pelo menos uma partícula carregada eletricamente, magnética ou magnetizável ou revestida por pelo menos uma camada magnética ou magnetizável (3) na referida cultura (4), b)submeter a referida cultura (4) a um campo elétrico, magnético ou eletromagnético, de modo a colocar a referida partícula (3) em movimento, c) detectar o grau de liberdade de movimento da partícula na cultura (3). a presente invenção aplica-se mais particularmente a um processo e dispositivo para detectar a formação e o desenvolvimento de biofilmes em uma cultura de microorganismos.

Description

“PROCESSO PARA DETECÇÃO DA FORMAÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE UM BIOFILME DE MICRORGANISMOS EM UMA SUPERFÍCIE DE UM MEIO DE CULTURA LÍQUIDO E DISPOSITIVO QUE PERMITE DETECTAR A FORMAÇÃO E O DESENVOLVIMENTO DE UM BIOFILME EM UM MEIO DE CULTURA LÍQUIDO” Campo da Invenção [001] A presente invenção trata do campo da detecção da viscosidade de um meio de cultura.

[002] A presente invenção trata mais particularmente do campo do estudo do desenvolvimento de um biofilme em um meio de cultura homogêneo ou não homogêneo.

Antecedentes da Invenção [003] O referido biofilme ao se desenvolver dificulta o movimento de partículas aptas a se deslocar em um campo magnético, elétrico ou eletromagnético, como partículas carregadas eletricamente (pela presença de íons positivos e/ou negativos) ou magnéticas ou magnetizáveis ou ainda recobertas por uma camada magnética ou magnetizável, [004] A esse respeito, no presente texto, o termo “viscosidade” deve ser entendido como fazendo referência ao grau de liberdade da partícula magnetizável no biofilme. Há de se entender com a leitura do presente texto que esta invenção não tem por objeto uma medida da viscosidade de um meio como pode dar a entender a palavra “viscosidade” em seu sentido comum, mas coloca em evidência o desenvolvimento de um microrganismo pela medida do grau de liberdade de uma (ou mais) partículas magnetizáveis, cujo movimento é ou não contido por um filme, que é ele próprio significativo da presença ou não do referido microrganismo em desenvolvimento.

[005] Da mesma forma, a expressão “meio de cultura” deve ser entendida como qualquer meio no qual pelo menos um microrganismo é suscetível de estar presente e de se desenvolver. Trata-se portanto de um meio que pode ser natural ou sintético. Assim, por exemplo, a água entra nessa definição. Na continuação do presente texto a expressão “meio de cultura” ou os termos “meio” ou “cultura” poderão ser empregados indiferentemente em relação a essa definição.

[006] Assim, por “meio de cultura”, “meio” ou “cultura”, deve-se entender de acordo com a presente invenção o microrganismo e o meio no qual ele se encontra, ou eventualmente apenas o meio.

[007] Um microrganismo é um ser vivo microscópico tal como as bactérias, os levedos, os fungos, as algas, os protistas. Um microrganismo pode ser unicelular ou pluricelular. Estados larvares de organismos pluricelulares (metazoários) podem também dar origem a biofilmes.

[008] A maior parte dos microrganismos (patogênicos ou não) foram estudados até agora em sua forma “planctônica”, livres e isolados em um meio (cultivados em suspensão ou em meio seletivo). Ora, no meio natural, fora do laboratório, as populações bacterianas estão fixadas em um suporte (estado “séssil”) e se desenvolvem em comunidade organizada denominada “biofilme”. Essa comunidade bacteriana está geralmente englobada em uma matriz de exopolissacarídeos (EPS) que limitam as trocas com o meio circundante (A. Filloux, I. Vallet. Biofilm: “Mise en place et organisation d’une communauté bactérienne”. Médecine/Sciences 2003; 19: 77-83).

[009] Quando um biofilme se desenvolve, ocorre em primeiro lugar a adesão das bactérias sobre um suporte que é seguida pela colonização desse suporte. As bactérias, ao se multiplicarem, formam rapidamente um filme constituído por estratos de corpos celulares que secretam uma gangue de exopolissacarídeos que os protege das agressões do meio circundante (Costerton et ai., Bacterial Biofilms. Sciences 1999: 284-6). A cinética de formação de um biofilme pode ser subdividida em 5 etapas: - Condicionamento da superfície: As moléculas orgânicas ou minerais presentes na fase líquido vão ser adsorvidas na superfície, para formar nela um iilme condtcionante” - A aderência ou adesão reversível: Os microrganísmos presentes se aproximam das superfícies por gravimetria, movimentos brownianos ou por quimiotactismo se possuírem flagelos. Durante essa primeira etapa de fixação, em que ocorrem apenas fenômenos puramente físicos e interações físico-químicas fracas, os microrganísmos podem ainda se desprender facilmente. - A adesão: Nesta etapa mais lenta intervém interações de energia mais elevada bem como o metabolismo microbiano e os apêndices celulares do mícrorganísmo {flagelos, pilís, A adesão é um fenômeno ativo e específico. Os primeiros colonizadores vão se ligar de modo irreversível à superfície graças, em particular, à síntese de exopolissacarídeos. Esse processo é relativamente lento e depende dos fatores ambientais e dos microrganísmos em presença. - A maturação do biofilme (desenvolvimento e colonização da superfície): Depois de ter aderido a uma superfície, as bactérias se multiplicam e se reagrupam para formar colônias rodeadas de polímeros. Essa matriz de polímeros (ou glícocãlix) vai agir como um “cimento” e reforçar a associação das bactérias entre si e com a superfície para finalmente formar um biofilme e atingir um estado de equilíbrio. O biofilme se desenvolve geralmente em uma estrutura tridimensional que constitui um local de confinamento. Esse micro-ambiente vai ser a sede de diversas modificações fisiológicas e moleculares em relação ao modo de crescimento planctônico. O biofilme assim formado vai ocupar toda a superfície que lhe é oferecida se as condições o permitirem. Geral mente a maturação do biofilme está correlacionada com a produção de EPS mesmo que certas espécies de microrganísmos não sintetizem ou sintetizem nenhum ou poucos polímeros que podem também aderir e formar biofilmes sobre superfícies. - Desprendimento: Os biofilmes são estruturas em perpétuo equilíbrio dinâmico e evoluem em função do suporte, dos microrganismos, e de meio ambiente. Essa evolução pode se traduzir por desprendimentos de células ou de agregados.

[010] Essa precipitação de células no meio líquido pode permitir posteriormente a contaminação de outras superfície e é em geral a causa de diversas doenças recorrentes no meio médico (fonte de resistências).

[011] A natureza dos biofilmes é muito variada. Alguns são muito ricos em ExoPolissacarídeos (EPS), outros são constituídos principalmente por corpos bacterianos.

[012] Em relação à saúde humana, os biofilmes são responsáveis por infecções cada vez mais difíceis de debelar: em toda a esfera ORL (conduto auditivo, mucosa nasal, conjuntiva do olho ...), nos dentes (aparecimento de tártaro, de cáries ...), nos brônquios, nos pulmões (nos pacientes acometidos de mucoviscidose ...), no trato urogenital (...).

[013] Eles constituem a origem da maior parte das patologias nosocomiais (mais de 10 000 mortes por ano) formando-se em cateteres, ou implantes (válvulas cardíacas, quadris artificiais, sondas urinárias ...) (J.W. Costerton, P. Stewart e E.P. Greenberg, Bacterial Biofilms: “A common cause of persistent infections”, Science, vol. 284, pp. 1318-1322).

[014] Os biofilmes também estão presentes nas torres de refrigeração responsáveis pelas infecções causadas pelas legionelas.

[015] Eles afetam também a indústria agroalimentar devido ao papel que desempenham nos casos de intoxicações alimentares (formação nas rupturas da cadeia de frio, desenvolvimento nos instrumentos de corte, de moagem, nas superfícies de trabalho).

[016] Da mesma forma, os biofilmes se desenvolvem nas canalizações, provocando em particular fenômenos de corrosão.

[017] Os biofilmes se desenvolvem também na superfície de objetos submersos, como por exemplo cascos de barcos, e dão origem a problemas de “fouling” (encardimento da superfície dos cascos devido à colonização dos casos por diversos microrganismos).

[018] Deve-se notar que as bactérias não são as únicas a criar biofilmes: os fungos, as algas, os protozoários também se organizam em biofilmes.

[019] Os biofilmes estão portanto onipresentes em diversas áreas, apresentam riscos sanitários e provocam prejuízos relativamente elevados.

[020] Entretanto, o desenvolvimento e o comportamento desses biofilmes são ainda pouco conhecidos devido a complexidade que isso envolve, apesar da existência de diversos métodos de estudo do seu desenvolvimento.

[021] Os métodos de estudos dos biofilmes se baseiam principalmente na colonização de peças de vidro e de plástico imersas em um meio de cultura contido em frascos sob agitação em estufas, que são coloridos a seguir com cristal violeta ou observados ao microscópio.

[022] Existem outros métodos de detecção mais complexos, como por exemplo detecções por Micro-balança a cristal de quartzo (Q-CMD, Quartz Microbalance with Dissipation Monitoring), detecções por MTA (Mass Transport Analysis), por UFDR (Ultrasonic Frequency Domain Reflectometry), por PCR in situ (em gene funcional Amo A), por FISH (hibridação in situ em fluorescência), por CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy), por PAS (Photo Acoustic Spectroscopy).

[023] Outros métodos utilizam por sua vez partículas/esferas magnéticas revestidas de lectina, ou de anticorpos para isolar as bactérias responsáveis pelo desenvolvimento do biofilme, a fim de permitir a seguir a caracterização desses microrganismos por métodos clássicos de imunoanálise ou por biologia molecular (hidridação ou PCR).

[024] Tais métodos, porém, se mostraram difíceis de pôr em prática e são relativamente caros. Além disso, eles não permitem a obtenção de um ensinamento suficientemente probante sobre o comportamento das bactérias e portanto sobre a formação e o desenvolvimento dos biofilmes. De fato, esses métodos não permitem o acompanhamento do desenvolvimento de um biofilme, seja ele principalmente constituído por corpos celulares (tipo Listeria), de EPS (exopolissacarídeo) ou por uma matriz análoga secretada pelos microrganismos colonizadores (tipo pseudomonas).

[025] A presente invenção trata de um processo e de um dispositivo que permitem detectar a evolução da viscosidade de um meio de cultura, homogêneo ou não homogêneo, turvo e/ou opaco e do uso do referido processo e/ou do referido dispositivo em aplicações particulares.

[026] O termo “meio de cultura não homogêneo” deve ser entendido, no presente pedido, em seu sentido mais amplo. Em particular, um meio de cultura não homogêneo poderá consistir em um meio de cultura límpido, no qual evoluem microrganismos em suspensão.

[027] Conhece-se da arte anterior o pedido de patente francesa FR2555316. Esse pedido de patente refere-se a um processo e a um dispositivo para determinar a viscosidade de um meio fluido, processo esse que consiste em mergulhar uma esfera condutora no meio fluido, em aplicar na esfera um campo magnético giratório sensivelmente centrado sobre ela, e esse campo giratório é tal que o escoamento do fluido em contato com a esfera posta em rotação permanece laminar, e em determinar uma grandeza ligada ao torque exercido sobre a esfera devido à viscosidade do meio fluido. Assim, a esfera, mergulhada em um meio viscoso, é submetida a um momento de freagem proporcional à viscosidade, e adquire em regime permanente uma rotação cujo período é também proporcional à viscosidade do meio líquido a ser analisado. A rotação da esfera pode ser visualizada por meio das manchas de difração obtidas por iluminação da esfera com um feixe laser ao longo de seu eixo de rotação.

[028] Entretanto, esse processo só é apropriado para a realização em um meio viscoso homogêneo. Ora, um meio de cultura de bactérias é opalescente, turvo e opaco. Esse método não permite portanto determinar a formação ou não de biofilmes no meio de cultura.

[029] Foi também proposto no pedido de patente japonesa JP61161436 um método de medida da viscosidade de um fluido não-newtoníano que repousa sobre o princípio da atração magnética, O método consiste em medir a viscosidade por meio da medida do deslocamento e da velocidade de deslocamento de uma barra imantada sob o efeito de um campo magnético.

[030] O método proposto no resumo japonês permite determinar as características relativas ao fluido viscoso como a viscosidade. Entretanto, o método em questão não permite de forma alguma reproduzir o comportamento de um mícrorganísmo, tal como uma bactéria, que evoluí no fluido viscoso.

Descrição da Invenção [031] A presente invenção tem portanto por objeto propor um processo e um dispositivo que permitem modelizar o desenvolvimento dos biofilmes em um meio não homogêneo, turvo e opaco que corresponde ao meio de cultura no qual os microrganismos se desenvolvem para formar esses biofilmes.

[032] A presente invenção tem também por finalidade permitir a modelização do processo de colonização de uma superfície de microrganismos.

[033] A presente invenção tem também por finalidade permitir colocar em evidência diferenças de viscosidade em um meio não homogêneo e conseqüentemente permitir a modelização do meio de cultura em diferentes áreas segundo o desenvolvimentos de biofilmes em cada área.

[034] A presente invenção tem igualmente por objeto propor um processo e um dispositivo de detecção do desenvolvimento dos biofilmes de realização simples, pouco onerosa e automatizável.

[035] Para isso, a presente invenção é do tipo descrito acima e ela é notável, em sua acepção mais ampla.

[036] Assim a presente invenção tem por objeto um processo que permite medir a viscosidade de um meio de cultura de microrganismos (5), que comporta etapas que consistem sucessivamente em: a) mergulhar pelo menos uma partícula carregada eletricamente, magnética ou magnetizável ou recoberta de pelo menos uma camada magnética ou magnetizável na referida cultura, b) submeter a referida cultura a um campo elétrico, magnético ou eletromagnético, e de preferência magnético, de modo a colocar a referida partícula em movimento, c) detectar opticamente o grau de liberdade de movimento da referida partícula na referida cultura, de preferência por medida óptica, sendo que o referido processo não utiliza um microscópio de varredura.

[037] A etapa b) consiste em submeter a referida cultura a um campo elétrico, ou a um campo magnético, ou a um campo eletromagnético, eventualmente aplicado por impulsão, ou a um aumento progressivo de um campo eletromagnético, ou a variações mais complexas de campo eletromagnético, ou a uma combinação de campos.

[038] O aumento progressivo do campo eletromagnético é obtido, segundo uma configuração particular da presente invenção, por aproximação de um ímã segundo uma trajetória retilínea ou sinusoidal, ou então segundo um movimento oscilante que apresenta ou não uma amplitude de oscilação e uma freqüência variáveis. As variações mais complexas do campo eletromagnético são obtidas por rotação, ou por combinações de movimentos de uma barra imantada nas proximidades da referida cultura.

[039] Vantajosamente, o referido campo elétrico, magnético ou eletromagnético é gerado por meios geradores de campo em movimento.

[040] Vantajosamente, a cultura escoa em fluxo constante ou em fluxo descontínuo em um intervalo de tempo determinado através de um reator aberto. Essa última configuração é preferida pelo fato de permitir uma adequação com as condições naturais de desenvolvimento de um biofilme.

[041] De acordo com a presente invenção, no que diz respeito à partícula, ela pode ser uma partícula carregada eletricamente, ou uma partícula magnética, ou uma partícula revestida de pelo menos uma camada magnética, ou uma partícula magnetizável, ou uma partículas revestida por uma camada magnetizável.

[042] Vantajosamente, a referida partículas magnética pode apresentar um tamanho sensivelmente idêntico ao tamanho dos microscópios que geral os biofilmes.

[043] Vantajosamente ainda, pode-se utilizar partículas de diferentes tamanhos e/ou, também vantajosamente, de cores diferentes. As partículas de tamanho menor são imobilizadas antes das partículas maiores durante o desenvolvimento de um biofilme. Pode-se assim definir com maior precisão o desenvolvimento do referido biofilme ou sua degradação.

[044] Da mesma forma, segundo uma configuração vantajosa da presente invenção, a referida partículas é geradora de um sinal detectável pelo referido dispositivo de detecção óptica do movimento. O referido sinal pode ser detectado quer de modo autônomo (vantajosamente por radioatividade), quer per reemissão de energia transmitida em fluxos contínuos ou descontínuos (vantajosamente transmissão de energia luminosa por feixe laser e reemissão de fluorescência).

[045] Vantajosamente, a referida partículas é de tipo fluorescente, fosforescente, radioativa ou quimioluminescente.

[046] De acordo com um modo preferencial da presente invenção, a etapa c) consiste em iluminar por meio de uma fonte luminosa a referida partícula e em detectar o movimento da referida partícula na referida cultura.

[047] Para fazer isso, a referida partícula poderá vantajosamente sr fluorescente.

[048] De acordo com uma configuração, preferida, a referida partícula (3) está configurada de tal maneira que ela está em posição estável em repouso (na ausência de campo) no referido reator 1). Vantajosamente, a referida partícula pode ser uma partícula em forma de palete, de geometria assimétrica com uma face plana, (...).

[049] De acordo com um modo de realização particular da presente invenção, o referido processo consiste ainda em realizar uma medida da viscosidade da referida cultura, de acordo com o processo tal como descrito anteriormente, em um tempo t = 0 que corresponde à inoculação da referida cultura, e pelo menos uma medida em um tempo t da viscosidade da referida cultura de acordo com o processo tal como descrito anteriormente, bem como em comparar as referidas medidas com to e t.

[050] O processo de acordo com a presente invenção permite medir a viscosidade de uma cultura de microrganismos homogênea e não homogênea, de preferência não homogênea.

[051] De acordo com outro aspecto, a presente invenção tem por objeto um dispositivo que permite a realização do processo de acordo com a presente invenção, tal como descrito anteriormente.

[052] Assim, a presente invenção tem por objeto um dispositivo que permite medir a viscosidade de uma cultura de microrganismos, homogênea ou não homogênea, que compreende: - pelo menos um reator de cultura destinado a receber a referida cultura para realizar a detecção da formação e do desenvolvimento de biofilmes, - pelo menos uma partícula carregada eletricamente ou magnética ou magnetizável ou coberta por pelo menos uma camada magnética ou magnetizável, imersa na cultura, - meios para gerar um campo elétrico, magnético ou eletromagnético, de preferência um campo magnético, campo esse que é aplicado à referido partícula de modo a colocá-la em movimento, - um dispositivo de detecção óptica do movimento da referida partículas, diferente de um microscópio de varredura.

[053] Por varredor de cultura, entende-se um recinto que apresenta pelo menos uma extremidade fechada, do tipo tubo, poço, (...) (reator fechado), ou um recinto que apresenta duas aberturas para permitir o escoamento da referida cultura através do referido recinto (reator aberto).

[054] De acordo com uma primeira configuração da presente invenção, o referido reator apresenta uma extremidade fechada de modo a formar um fundo plano.

[055] A fim de apresentar uma posição estável no fundo do tubo quando a partícula está em repouso, ou seja, quando não é gerado nenhum campo, o fundo do referido reator pode apresentar uma ou mais cavidades ou sulcos destinados a receber a ou as referida(s) partícula(s).

[056] De acordo com uma segunda configuração da presente invenção, o referido reator apresenta uma extremidade fechada de modo a formar um fundo hemisférico.

[057] De acordo com outro configuração da presente invenção, o reator pode apresentar duas extremidades abertas. Nessa configuração, o referido reator pode ser configurado para permitir um escoamento da referida cultura em fluxo constante ou em fluxo descontínuo com intervalo de tempo determinado.

[058] No que diz respeito à referida partícula, ela é, vantajosamente, uma partícula carregada eletricamente (pela presença de íons positivos e/ou negativos), ou uma partícula magnética, ou uma partícula revestida de pelo menos uma partícula magnética, ou uma partícula magnetizável, ou uma partícula revestida de pelo menos uma camada magnetizável.

[059] Vantajosamente, a referida partícula magnética apresenta um tamanho sensivelmente idêntico ao tamanho dos microrganismos que geram os biofilmes.

[060] Vantajosamente, pode-se utilizar partículas de tamanhos diferentes e, vantajosamente também, de cores diferentes. As partículas de menor tamanho são imobilizadas antes das partículas de maior tamanho durante o desenvolvimento de um biofilme. Pode-se assim definir com mais precisão o desenvolvimento do referido filme ou sua degradação.

[061] Da mesma forma, de acordo com uma configuração vantajosa da presente invenção, a referida partícula gera um sinal detectável pelo referido dispositivo de detecção óptica do movimento. Vantajosamente, a referida partícula é de tipo fluorescente ou fosforescente ou radioativa ou quimioluminescente.

[062] Em relação ao dispositivo de detecção óptica do movimento, ele comporta uma fonte luminosa que emite em direção da referida partícula, e meios de detecção ópticos que permite detectar o movimento da referida partícula na cultura. Por meio de detecção ópticos, entende-se qualquer meio de detecção utilizável. De acordo com um modo de realização preferido, trata-se de meios ópticos macroscópicos. De acordo com um modo particular da presente invenção, o movimento da partícula poderá ser visualizado diretamente, a olho nu.

[063] Em relação à detecção, a partículas iluminada poderá consistir em uma partícula fluorescente ou uma partícula preta, ou pelo menos opaca.

[064] Vantajosamente, pode-se utilizar partículas de cores diferentes, de tamanhos diferentes, de densidades diferentes, de formas/geometrias diferentes, de constituições físico-químicas diferentes, de estados de superfície diferentes para multiplicar os critérios de caracterização de desenvolvimento de um biofilme.

[065] Vantajosamente, pode-se acoplar a superfície das partículas dos grupos químicos a ser testados e testar as propriedades anti-adesão dos referidos grupos químicos (partículas móveis).

[066] Vantajosamente, pode-se acoplar à superfície das partículas moléculas que permitem caracterizar certas categorias de microrganismos e testar a adesão das referidas categorias de microrganismos (partículas imobilizadas).

[067] A referida partícula poderá ser diretamente configurada para permanecer em uma posição estável em repouso no fundo plano do referido reator. Vantajosamente, a referida partícula pode ser uma partícula por exemplo em forma de palete, de geometria simétrica com uma face plana, (...).

[068] Vantajosamente, o referido dispositivo pode compreender ainda meios de medida para medir a viscosidade da referida cultura em intervalos de tempo determinados e meios de comparação que permitem comparar as medidas obtidas.

[069] Dessa maneira, pode-se testar o obstáculo ao desenvolvimento da referida partículas devido à presença dos mícrorganismos colonizadores, ou de exopolissacarídeos ou de matriz secretada pelos mícrorganismos na qual a referida partícula está inserida em diferentes tempos.

Breve Descricão pos Desenhos [070] A presente invenção será mais bem compreendida com a leitura da descrição feita a seguir a título meramente explicativo de diferentes modos de realização da presente invenção, em relação às figuras anexas: - a figura 1 ilustra o princípio de detecção da formação e do desenvolvimento do biofilme sobre o fundo de um tubo de fundo hemisférico; - a figura 2 representa o princípio da detecção da formação de um biofilme sobre o fundo de um tubo com fundo hemisférico (ou de tubos diferentes de tubos com fundo plano} {vista de cima}; - a figura 3 ilustra o princípio de detecção da formação e do desenvolvimento do biofilme em um tubo de fundo plano; - a figura 4 ilustra o princípio de detecção da formação e do desenvolvimento do biofilme em um tubo com extremidades abertas; - a figura 5 representa outra ilustração do princípio de detecção da formação e do desenvolvimento do biofilme em um reator (1) do tipo tubo (1) com fundo (2) plano; - a figura 6 representa uma variante da invenção apresentada na figura 5; - a figura 7 representa uma aplicação particular da presente invenção tal como descrita na figura 5; - a figura 8 representa uma aplicação particular da presente invenção no campo do controle da contaminação das canalizações, particularmente no controle da contaminação das válvulas.

[071] O princípio geral para detectar a formação e o desenvolvimento de um biofilme em uma cultura que contém mícrorganismos desenrola-se da maneira indicada a seguir.

Descrição de Realizações da Invenção [072] Uma ou mais partículas ou esferas carregadas eletricamente, magnétíca(s), magnetizável(eis) ou revestida(s) de uma camada magnética ou magnetízável é(são) colocada(s) na cultura. A composição das partículas poderá variar desde que seja compatível com uma reatividade em um campo elétrico, magnético ou eletromagnético. A fim de simplificar a descrição que será feita a seguir, as referidas partículas só serão descritas em termos de esferas.

[073] As referidas esferas vão então ser incorporadas pouco a pouco à matriz secretada pelos microrganismos, até ímobilização completa.

[074] No processo biológico da formação do biofilme, os microrganismos são imobilizados e englobados nessa matriz, Eles são então dissimulados, protegidos das agressões do meio externo, daí a origem das resistências observadas aos antibióticos (patologias nosocomiais). As esferas permitem simular essa imobilização.

[075] A fim de simular essa imobilização, um gerador de campo é aproximado das referidas esferas. Assím, nos meios em que nenhum biofilme se desenvolveu, as esferas reagem à aproximação do referido gerador e se deslocam, em geral em direção ao gerador de campo e eventual mente conforme o movimento do referido gerador. Em compensação, se as partículas são englobadas na matriz do biofilme, seu movimento será contido, e mesmo impedido de acordo com o grau de formação do biofilme.

[076] O método de acordo com a presente invenção reside portanto na exploração do comportamento das esferas que podem ser postas em movimento sob o efeito de campos, elétricos, magnéticos ou eletromagnéticos. Se o comportamento das referidas esferas sofrer um entrave pela presença da matriz que compõe o biofilme, é então possível detectar e visualizar seu grau de mobilidade (móveis, semimóveis, imóveis), e conseqüentemente visualizar o desenvolvimento do biofilme.

[077] O referido método permite ainda diferenciar as esferas que podem ser postas em movimento sob o efeito de um campo e aquelas cujos movimentos sofrem um entrave pela presença da matriz secretada pelos microrganismos.

[078] A detecção do movimento das esferas no biofilme é efetuada por medida óptica, seja por iluminação direta, seja por iluminação indireta. Nesse último caso, as esferas utilizadas serão vantajosamente fluorescentes.

[079] Em função do formato escolhido das esferas (geometria, tamanho, densidade), o corpo bacteriano será simulado com maior ou menor precisão e a evolução do biofilme caracterizada com novos critérios.

[080] Em função da freqüência de apresentação do gerador de campo, em função da força do campo, a evolução dinâmica da matriz constitutiva do biofilme poderá ser acompanhada. Da mesma forma, depois que um biofilme tiver sido constituído, sua degradação poderá ser acompanhada sob o efeito de um tratamento particular.

[081] É então possível, com testes bioquímicos, analisar a constituição da referida matriz.

[082] Da mesma forma, o acompanhamento da imobilização da esfera pela matriz que constitui o biofilme permite acompanhar por analogia o processo de ocultação das bactérias nessa matriz que elas secretam.

[083] A fim de testar o desenvolvimento de biofilme no fundo de um tubo, a detecção será realizada com partículas suficientemente densas para sedimentar no fundo do referido tubo. Inversamente, a detecção será realizada com partículas pouco densas para flutuar na superfície do meio de cultura, a fim de estudar o desenvolvimento de biofilme na superfície (interface ar/líquido).

[084] Além disso, atuando-se sobre a densidade das partículas, séries de detecção podem se realizadas em interfaces sólido/líquido, líquido/líquido, líquido/gás.

[085] As detecções podem também utilizar partículas de tamanhos diferente, que podem ser também diferenciadas por cores diferentes.

[086] Exemplos de realização desse método vão ser descritos a seguir. Nesses exemplo, os microrganismos descritos são bactérias. Deve ficar claro que a descrição a seguir é aplicável a qualquer outro microrganismos cujo desenvolvimento do biofilme se deseja estudar. Entretanto, o tamanho das esferas será vantajosamente adaptado ao tamanho dos microrganismos estudados para poder modelizar o comportamento dos microrganismos no biofilme formado.

[087] As figuras 1 a 8 ilustram o princípio de detecção da formação de um biofilme em diferentes geometrias de tubos que recebem uma cultura que compreendem as bactérias a ser estudadas.

[088] A figura 1 e a figura 2 ilustram em particular o princípio de detecção da formação e do desenvolvimento do biofilme em um reator (1) do tipo (1) com fundo (2) hemisférico. A figura 1 é uma ilustração em corte, a figura 2 é uma vista de cima.

[089] Por exemplo, a experiência pode ser realizada em uma placa que apresenta 96 tubos (ou poços), com uma capacidade de 200 μΙ. No presente exemplo, uma esfera (3) é depositada no fundo de cada tubo (1). Evidentemente, o processo não se limita necessariamente a uma única esfera. Um meio de cultura (4) é então adicionado a cada um dos tubos (1), e esse meio é inoculado a seguir com uma cepa bacteriana (5) que pode evoluir em biofilme (6), em condições de cultura estandardizadas (temperatura, oxigenação, pH ...).

[090] A um intervalo de tempo regular, um ímã (7) posicionado sob o tubo (1), e mais particularmente sob a esfera (3), desloca-se para subir regularmente ao longo da parede do referido tubo (1).

[091] Quando a esfera (3) não encontra obstáculos em seu movimento ou não sofre um entrave suficiente na matriz secretada pelas bactérias (5) e que constituem o biofilme (6), a esfera (3) acompanha o movimento do referido ímã (7) (Figuras 1b e 1c ou 2c). Quando o ímã é(está) afastado, a esfera não é mais submetida a seu campo e pode voltar à sua posição inicial. Em compensação, quando a formação do biofilme (6) é tal que o movimento da esfera (3) é contido e mesmo impedido, a referida esfera (3) fica imóvel no fundo do tubo (1) (Figura 1d ou 2d). Esse estado traduz então um desenvolvimento da matriz extracelular constitutiva do biofilme (6) no tubo (1) de tal modo que a referida matriz engloba a esfera (1) do mesmo modo que ela engloba as bactérias.

[092] Nesse exemplo, o ímã é manipulado de modo a deslocar a esfera (3) ao longo da parede do referido tubo (1). Entretanto, pode ser vantajoso manipular o ímã na direção da esfera (3) ou inversamente, manipular o tubo em direção ao ímã, de modo a deslocar a esfera (3) segundo uma trajetória diferente da parede do referido tubo (1).

[093] Vantajosamente, um dispositivo óptico permite visualizar automaticamente o grau de liberdade da referida esfera (não representado). O referido dispositivo compreende uma fonte luminosa que emite em direção da referida esfera (3) e meios de detecção que permitem detectar o movimento da esfera (3) na cultura (4).

[094] Quando o tubo (3) for transparente, a fonte luminosa está disposta sob o tubo (1) de modo a emitir o feixe luminoso diretamente em direção à esfera magnética (3). Os meios de detecção estão então dispostos acima do referido tubo (3). Assim, a detecção do movimento da esfera (3) é efetuado acompanhando-se o movimento da mancha escura que corresponde à esfera (3).

[095] Quando o tubo (1) for de material opaco, como por exemplo de metal, a fonte luminosa está disposta acima do referido tubo de modo a emir o feixe luminoso através da cultura (4) em direção à esfera magnética (3). Do mesmo modo que anteriormente, os meios de detecção estão dispostos acima do referido tubo. Nessa configuração, as referidas esferas (3) são constituídas vantajosamente de material fluorescente. Assim, quando as referidas esferas (3) forem iluminadas pela fonte luminosa, seu movimento é detectado pelos referidos meios de detecção acompanhando-se o movimento da mancha fluorescente que corresponde à esfera (3).

[096] A figura 3 ilustra uma variante de realização da presente invenção: a detecção da formação do biofilme (6) em um reator (1) do tipo tubo (1) com fundo (2) plano.

[097] Vantajosamente, o fundo (2) do tubo (1) é dotado de suas cavidades (8, 9) adjacentes. Uma esfera (3) é depositada no tempo inicial em uma das referidas cavidades (8). O ímã (7) é então disposto em contato com a outra cavidade (9). Quando o movimento da esfera (3) não sofre o entrave provocado pelo biofilme (6), ela desliza da cavidade (8) para a cavidade adjacente (9) (Figura 3b). O ímã (7) é deslocado a seguir sob a primeira cavidade (8) (Figura 3c). Pela ação de atração do ímã (7), não estando seu movimento suficientemente impedido, ou pelo menos o entrave desse movimento não sendo suficiente, a esfera (3) desliza em direção à referida primeira cavidade (8). E o teste vai ser repetido em intervalos regulares até se observar a imobilização total ou parcial das esferas (3) como ilustra a figura 3d: quando o ímã (7) é deslocado sob a segunda cavidade (9), a esfera (3) envolvida no biofilme (6), não consegue mais, em resposta ao efeito de atração do ímã (7), passar para segunda cavidade (9) pelo fato de seu movimento estar entravado no referido biofilme (6).

[098] Em uma variante, o fundo do tubo não apresenta cavidades destinadas a receber a ou as referidas esferas magnéticas. Para esse fim, a referida esfera magnética (3) está configurada para poder se manter em uma posição estável no fundo do referido tubo (1).

[099] A figura 4 ilustra outro modo de realização da presente invenção que utiliza um reator (1) do tipo tubo (1) que apresenta extremidades abertas (10, 11). O tubo (1) é então configurado para permitir um fluxo contínuo do meio de cultura (5).

[0100] Como no exemplo do tubo com fundo plano, a superfície interna (12) da parede (13) do referido tubo (1) apresenta vantajosamente cavidades (8, 9) para receber a ou as referidas esfera(s) (3). De acordo com o mesmo princípio que o descrito anteriormente, um ímã (7) é apresentado de modo a colocar as esferas (3) em movimento de modo que elas passem de uma cavidade para a outra.

[0101] No caso de não haver nenhuma cavidade na superfície (12) da parede (13) do referido tubo (1), o princípio será semelhante ao descrito para o tubo com fundo hemisférico: o ímã (7) é apresentado e deslocado de modo a fazer com que as referidas esferas subam sobre a face interna (12) da parede (13) do referido tubo (1).

[0102] De acordo com uma configuração particular da presente invenção, as esferas inseridas no biofilme (6) pode ser recuperadas a seguir por um ímã mergulhado na cultura. Dessa maneira, um fragmento do biofilme é retirado e destinado a testes de caracterização física (viscosidade da matriz ...), química, bioquímica (elementos constitutivos da matriz, ...), biológica (microrganismos constitutivos da matriz em estado de latência, em atividade, corpos mortos,...).

[0103] A figura 5 é outra ilustração do princípio de detecção da formação e do desenvolvimento do biofilme em um reator (1) do tipo tubo (1) de fundo (2) chato. Esta ilustração é uma vista em plano a partir do ápice do tubo.

[0104] Esferas (3) são depositadas no fundo de cada tubo (1). Um meio de cultura (4) é então adicionado em cada um dos tubos (Figuras 5a), e esse tubo é inoculado a seguir com uma cepa bacteriana (5) que pode evoluir em biofilme (Figuras 5b a 5e), em condições de cultura estandardizadas (temperatura, oxigenação, pH ...).

[0105] A um intervalo de tempo regular, um ímã (7) fica posicionado sob o tubo (1) (Figura 5b e 5e). Quando as esferas (3) não encontram obstáculo em seu movimento ou não ficam suficientemente retidas na matriz secretada pelas bactérias (5) e que constituem o biofilme, elas são atraídas na direção do ímã (7) (Figura 5b). As esferas (3) atraídas em torno do ímã (7) liberam uma área “sem esferas” ou “área clara” simples de detectar, particularmente de modo visual. Quando a formação do biofilme (6) for tal que o movimento das esfera (3) é dificultado e mesmo impedido, as referidas esferas (3) ficam imóveis no fundo do tubo (1) (Figuras 5d e 5e). Esse estado traduz então um desenvolvimento da matriz extracelular constitutiva do biofilme (6) no tubo (1) tal que a referida matriz engloba a esfera magnética (1) do mesmo modo que ela engloba as bactérias (5).

[0106] A figura 6 ilustra uma variante da presente invenção apresentada na figura 5.

[0107] Caixas de Petri (1) que contêm um meio de cultura líquido (4) são inoculadas com bactérias (5) e esferas magnéticas (3 e 3’) de tamanhos diferentes são depositadas em cada caixa (1) (Figura 7). As condições de cultura são estandardizadas (temperatura, oxigenação, pH, ...) a fim de permitir o desenvolvimento das bactérias e portanto o desenvolvimento do biofilme (6).

[0108] Em um intervalo regular, um ímã (7) é posicionado sob a caixa de Petri (1). Quando a esfera (3) não encontra um obstáculo a seu movimento ou não fica suficientemente retida na matriz secretada pelas bactérias (5) e que constitui o biofilme (6), as esferas magnéticas (3) são atraídas na direção do ímã (7). Uma área clara (14) desenha-se então entre o limite externo da área de influência das linhas de campo magnético (9) que atraem as esferas e o agregado de esferas (15). Quando a formação do biofilme (6) for tal que o movimento das esferas (3) fica entravado e mesmo impedido, as referidas esferas (3) ficam imóveis na caixa (1). Entretanto, devido ao tamanho diferente das esferas, seu deslocamento é função de seu tamanho e da densidade do biofilme. À medida que o biofilme se desenvolve, as esferas terão em primeiro lugar seu deslocamento impedido pelo biofilme, e a seguir com um desenvolvimento adicional do biofilme, as esferas grandes ficarão por sua imobilizadas.

[0109] A figura 7 ilustra uma aplicação particular da presente invenção tal como descrita na figura 5 ou na figura 6, as esferas são depositadas sobre uma superfície recoberta por um produto que contém um agente antimicrobiano, como por exemplo um agente antifouling. A referida superfície pode ser de qualquer material, em particular de metal. Quando um ímã é aproximado da superfície, as esferas são atraídas pelas linhas de forças do ímã, que constituem então uma área de densidade de esfera mais elevada que o resto da superfície. Essa aplicação é vantajosa quando se deseja medir a eficácia de um produto antifouling aplicado sobre uma superfície metálica.

[0110] Nessa forma de realização particular, pode ser mais interessante fazer variar a intensidade do campo magnético, por exemplo fazendo uma barra imantada girar sobre a superfície a ser testada.

[0111] A figura 8 ilustra uma aplicação particular da presente invenção no campo do controle da contaminação das canalizações, particularmente no controle da contaminação das válvulas.

[0112] Para modelizar o desenvolvimento de biofilme em um suporte submetido a um fluxo de líquido (canalizações (1)), é possível utilizar um dispositivo com um anel (16) retido em uma protuberância de uma mangueira (17). Uma partícula magnetizável (4) é incluída em um ponto do anel (2). Sob a ação do campo magnético (Figura 8b ou 8c), pode-se fazer esse anel girar.

[0113] Se um biofilme se desenvolver no dispositivo, o movimento do anel fica entravado.

[0114] Esse dispositivo modeliza uma válvula, o local das canalizações em que os biofilmes se desenvolvem mais facilmente.

[0115] A presente invenção foi descrita acima a título de exemplo. Deve ficar claro que o técnico no assunto tem condições de realizar diferentes variantes desta invenção, sem sair com isso do âmbito da patente.

Reivindicações

Claims (23)

1. PROCESSO PARA DETECÇÃO DA FORMAÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE UM BIOFILME (6) DE MICRORGANISMOS (5) EM UMA SUPERFÍCIE DE UM MEIO DE CULTURA (4) LÍQUIDO, caracterizado por compreender as etapas que consistem sucessivamente em: a) imergir no dito meio de cultura (4) líquido pelo menos uma partícula carregada eletricamente, magnética ou magnetizável ou recoberta de pelo menos uma camada magnética ou magnetizável (3), b) manter a dita cultura (4) em condições que permitam o desenvolvimento do biofilme (6) pelo dito mícrorganismo na dita superfície, dita pelo menos uma partícula (3) repousando sobre dita superfície, c) detectar a formação do biofilme na dita superfície pela aplicação de um campo eletromagnético destinado a colocar em movimento a dita pelo menos uma partícula (3), a formação do biofilme sendo detectada quando os movimentos da dita pelo menos uma partícula (3) sobre dita superfície são retardados ou mesmo evitados devido à formação do biofilme.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa b) consistir em manter dita cultura (4) em um campo eletromagnético, eventualmente aplicado por impulsão.

3. PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da etapa b) consistir em manter dita cultura (4) a um aumento progressivo de um campo eletromagnético.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do referido campo elétrico, magnético ou eletromagnético ser gerado por meios geradores de campo em movimento.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de dita cultura de microrganismos se escoar em fluxo constante através de um reator (1) aberto.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da cultura (4) se escoar através do reator (1) aberto em fluxo descontínuo a um intervalo de tempo determinado.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato da etapa c) consistir em iluminar por meio de uma fonte luminosa dita partícula e detectar o movimento de dita partícula em dita cultura (4).

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato da partícula (3) ser geradora de um sinal.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato da partícula (3) ser do tipo fluorescente ou fosforescente ou radioativa ou quimioluminescente.

10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que: - na etapa a) são imergidas várias partículas no dito meio de cultura (4), - na etapa c) a formação do biofilme na dita superfície é detectada pela aplicação do campo eletromagnético destinado a colocar as referidas partículas em movimento, a formação do biofilme sendo detectada quando os movimentos das ditas partículas não possam ser agrupadas na referida superfície pelo campo eletromagnético.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de dita cultura (4) ser homogênea ou não homogênea, preferencialmente não homogênea.

12. DISPOSITIVO QUE PERMITE DETECTAR A FORMAÇÃO E O DESENVOLVIMENTO DE UM BIOFILME (6) EM UM MEIO DE CULTURA (4) LÍQUIDO, caracterizado pelo fato de compreender: - pelo menos um reator de cultura (1) destinado a receber uma cultura (4) para realizar a detecção da formação e do desenvolvimento de um biofilme (6) compreendendo pelo menos uma superfície que é imersa no dito meio de cultura líquido quando este é presente, - pelo menos uma partícula carregada eletricamente, magnética ou magnetizável ou coberta por pelo menos uma camada magnética ou magnetizável, dita partícula podendo ser imersa na cultura (4) quando esta é presente no reator e repousa na dita superfície, - meios para gerar um campo elétrico, magnético ou eletromagnético, capaz de colocar em movimento a dita pelo menos uma partícula (3) na dita superfície, - um dispositivo de detecção óptica que possibilita detectar movimentos da dita partícula sobre a referida superfície no meio de cultura líquido (4) para a implementação de um processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de dito reator (1) apresentar uma extremidade fechada de modo a formar um fundo (2) plano.

14. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do fundo (1) do referido reator (1) apresentar uma ou mais cavidades (8, 9) ou sulcos, destinados a receber a ou as referidas partícula(s).

15. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de dito reator (1) apresentar uma extremidade fechada de modo a formar um fundo (2) hemisférico.

16. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de dito reator (1) apresentar duas extremidades abertas.

17. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato do referido reator (1) ser configurado para permitir um escoamento da referida cultura (4) em fluxo constante ou em fluxo descontínuo em um intervalo de tempo determinado.

18. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de dita partícula (3) gerar um sinal detectável pelo referido dispositivo de detecção do movimento.

19. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de dita partícula (3) ser do tipo fluorescente, fosforescente ou radioativa ou quimioluminescente.

20. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizado pelo fato de dita partícula (3) estar configurada de modo a ficar em posição estável em repouso no referido reator (1).

21. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, caracterizado pelo fato de dita partícula (3) apresentar um tamanho sensivelmente idênticos ao tamanho dos microrganismos (5).

22. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, caracterizado pelo fato de dito dispositivo de detecção óptica compreender uma fonte luminosa que emite em direção de dita partícula (3), e dos meios de detecção permitirem detectar o movimento de dita partícula (3) no meio de cultura líquido (4).

23. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizado pelo fato de compreender: - meios de medida para medir que na etapa a) são imergidas várias partículas no dito meio de cultura (4) líquido, - meios de medida para medir que na etapa c) é formado biofilme na dita superfície sendo detectada pela aplicação do campo eletromagnético destinado a colocar em movimento as referidas partículas, a formação do biofilme sendo detectada quando os movimentos das ditas partículas não podem ser agrupadas na referida superfície pelo campo eletromagnético,- meios de comparação que permitem comparar as medidas obtidas, e quando as partículas podem ser agrupadas, a detecção deste reagrupamento é visual.