BRPI0507647B1 - método para produzir l-treonina - Google Patents
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Abstract
BACTÉRIA PRODUTORA DE L-TREONINA PERTENCENTE AO GÊNERO ESCHERICHIA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L-TREONINA É descrito um método para produzir L-treonina usando bactéria pertencente do gênero Escherichia no qual a bactéria possui produtividade de L-treonina e tem sido modificada para ter expressão intensificada de um ou mais genes, selecionados do grupo consistindo de genes glk, pgi, pfkA, tpiA, gapA, pgk, eno, e pykA, codificadores de enzimas da rota glicolítica
Description
A presente invenção refere-se à biotecnologia, especificamente a um método para produzir L-aminoácidos por fermentação, e mais especificamente aos genes derivados da bactéria ESCHERICHIA COLI. Os genes são úteis para melhorar a produtividade de L-aminoácido, por exemplo, a produtividade de L-treonina.
Convencionalmente, L-aminoácidos têm sido industrialmente produzidos por métodos de fermentação utilizando cepas de microorganismos obtidos de fontes naturais ou mutantes dos mesmos, especialmente modificados para intensificar a produtividade de L-aminoácido.
Intensificação da produtividade de L-aminoácido tem sido realizada, por exemplo, pela amplificação de genes biossintéticos por transformação de um microorganismo com DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente US 4.278.765). Estas técnicas são baseadas no aumento de atividades das enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácido, e/ou na dessensibilização das enzimas alvo para inibição de retro-alimentação pelo L- aminoácido produzido ou seus subprodutos (veja, por exemplo, Patentes US 4.346.170, 5.661.012 e 6.040.160).
Várias cepas usadas para a produção de L-treonina por fermentação são conhecidas. Há cepas com atividades aumentadas das enzimas envolvidas na biossíntese de L-treonina (Patentes US 5.175.107; 5.661.012; 5.705.371; 5.939.307; EP0219072), cepas resistentes a alguns compostos químicos tais como L-treonina e seus análogos (WO0114525A1, EP301572A2, US 5.376.538), cepas com as enzimas alvo dessensibilizadas para inibição de retro-alimentação pelo L-aminoácido produzido de seus subprodutos (Patentes US 5.175.107; 5.661.-12), cepas com enzimas de degradação de treonina inativadas (Patentes US 5.939.307; 6.297.-31).
A cepa produtora de treonina conhecida VKPM B-3996 (Patentes US 5.175.107 e 5.705.371) é correntemente a melhor produtora de treonina conhecida. Para a construção da cepa VKPM B-3996, várias mutações e um plasmídeo, descritos abaixo, foram introduzidos na cepa parental E. coli K-12 (VKPM B-7). O gene mutante thr (mutação thrA442) codifica asparto-cinase-homo-serina-desidrogenase I, que confere resistência à inibição de retro-alimentação por treonina. Gene mutante ilv (mutação 10 z7v√4442) codifica treonina-desaminase que possui uma atividade baixa,acarretando uma velocidade baixa de biossíntese de isoleucina e um fenótipo mutado subnormal de inanição por isoleucina. Em bactérias com mutação z7v442, a transcrição de operon thrABC não é reprimida por isoleucina e portanto é muito eficiente para a produção de treonina. Inativação do gene tdh 15 acarreta a prevenção da degradação de treonina. O determinante genético de assimilação de sacarose genes scrKYABR) foi transferido para a citada cepa. Para aumentar a expressão de genes controladores de biossíntese de treonina, plasmídeo pVIC40 contendo operon treonina mutante thrA442BC foi introduzido na cepa intermediária TDH6. A quantidade de L-treonina 20 acumulada durante a fermentação da cepa alcança até 85 g/L.
Os presentes inventores obtiveram, com respeito à E. coli K- 12, um mutante possuindo uma mutação thrR (aqui referida como rhtA23) que confere resistência às concentrações altas de treonina ou de homo-serina em um meio mínimo (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol.,21, 25 611-616 (1985)). Esta mutação também melhorou a produção de L-treonina (Patente US 974817), de homo-serina e de glutamato (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol.,27, 556-561, 1991, EP 1013765 A) pela respectiva cepa produtora E. coli, tal como a cepa VKPM-3996. Ainda mais, os presentes inventores têm revelado que o gene rhtA existe a 18 min no cromossomo de E. coli próximo ao operon glnHPQ que codifica os componentes do sistema de transporte de glutamina, e que o gene rhtA é idêntico à ORF1 (gene ybiF, números 764 a 1651 no número de acesso do GenBank AAA218541, gi:440181), localizado entre os genes pexB e ompX (Pedidos de Patentes US 2003/148473, 2003/157667). A unidade expressando uma proteína codificada pela ORF1 tem sido chamada de gene rhtA (rht: resistência à homo-serina e à treonina). Também, os presentes inventores têm verificado que a mutação rhtA3 é uma substituição de G-por-A na posição -1 com respeito ao códon de iniciação ATG (ABSTRACTS of 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).
Sob condições pelas quais a rota biossintética de treonina principal é estudada e otimizada em uma grande extensão, a melhoria adicional das cepas produtoras de treonina pode ser feita pela melhoria da eficiência das rotas de metabolismo central, tal como glicólise (rota de Embden-Meyerhof), que gera energia e vários precursores de metabólitos.
A rota glicolítica inclui as seguintes enzimas: glicocinase (EC 2.7.1.2) codificada pelo gene g/k, fosfo-glicose-isomerase (EC 5.3.1.9) codificada pelo gene pgi,fosfoffutocinase-1 (frutose-6-P 1-cinase) (EC 2.7.1.11) codificada pelo gene pfkA,frutose-l,6-bis-fosfato-aldolase (EC 4.1.2.13) codificada pelo gene fbaA, triose-fosfato-isomerase (EC 5.3.1.1) codificada pelo gene tpiA,gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (EC 1.2.1.12) codificada pelo gene gapA, fosfo-glicerato-cinase (EC 2.7.2.3) codificada pelo gene pgk, fosfo-glicerato-mutase (EC 2.7.5.3) codificada pelo gene gpmA, enolase (EC 4.2.1.11) codificada pelo gene eno e isoenzimas de piruvato-cinase (EC 2.7.1.40) codificada pelos genes pykA e pykF (Escherichia coli eSalmonella, Second Edition, Editor-em-Chefe: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
O processo para a produção de L-lisina ou de outros aditivos de alimento contendo L-lisina por fermentação de bactérias corineformes nas quais alelos do gene glkendógeno são super-expressados sob condições adequadas para a formação do produto de gene glk glicocinase tem sido descrito (Pedido PCT W003054198A1). Um método para a produção de ácido chiquímico e seus derivados por E. coli possuindo a capacidade para converter a fonte de carbono em ácido chiquímico e transformada com DNA recombinante compreendendo um gene codificador de uma proteína facilitadora de glicose e uma forma de glicocinase de Zy mo monas mobilis também tem sido descrito (Pedido PCT WO0229078A2). Também, processos para a preparação microbiana de intermediários metabólitos intracelulares, em particular de eritrose 4-fosfato, e processos alternativos para a preparação microbiana de substâncias, em particular aminoácidos aromáticos tal como L- fenil-alanina, no qual a atividade de uma transaldolase está aumentada em um microorganismo produtor destas substâncias tem sido descrito (Patente US 6.316.232). A patente '232 descreve como modalidades preferidas que a atividade de uma transcetolase ou a atividade de uma proteína transportadora para a captação PEP-independente de um açúcar e/ou a atividade de uma glicocinase são/é adicionalmente aumentada(s). Microorganismos empregados incluem aqueles pertencentes ao gênero Escherichia, Serratia, Bacillus, Corynebacterium ou Breibacterium.
Um método para produzir L-aminoácidos, particularmente L- lisina, compreendendo o cultivo de uma célula bacteriana alterada, particularmente Corynebacterium glutamicum,possuindo uma quantidade aumentada de NADPH em comparação com uma célula bacteriana não alterada, no qual a citada célula bacteriana alterada tem aumentado o fluxo de carbono através da rota oxidativa da rota de pentose-fosfato tem sido descrito (Pedido PCT W00107626A2). Esta publicação descreve como a modalidade preferida do método uma célula bacteriana alterada que tem decrescido o fluxo de carbono via a rota glicolítica devido a uma quantidade diminuída da atividade enzimática de 6-fosfo-glicose-isomerase, que resulta de uma mutação no gene pgi. Um método semelhante para produzir L-lisina usando bactérias corineformes possuindo atividade intracelular de uma enzima fosfo- glicose-isomerase (pgi) eliminada também tem sido descrito (Patente US 6.586.214).
Um método para produzir L-lisina compreendendo o cultivo de bactéria corineforme produtora de L-lisina na qual a atividade de 6- fosfofrutocinase codificada pelo gene pfkA está aumentada tem sido descrito (Pedido de Patente Européia EP1195431A1). Ao mesmo tempo, um processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular de L-lisina, compreendendo o cultivo de bactérias corineformes para produzir o L- aminoácido desejado, no qual pelo menos o gene codificador de 6- fosfoffutocinase (gene pfkA) e/ou o gene codificador de 1-fosfofrutocinase (gene fruK) estão/está atenuado(s) tem sido descrito (Pedido PCT WO02074944A1). Esta publicação descreve como a modalidade preferida do processo a preparação de L-lisina usando bactéria corineforme na qual, em adição aos genes pfkA e fruK atenuados, um ou mais dos genes selecionados do grupo compreendendo o gene lysC para uma aspartato-cinase resistente à retro-alimentação, o gene dapA codificador de di-hidro-dipicolinato-sintase, o gene gapcodificador de gliceraldeído-fosfato-desidrogenase, o gene pyc codificador de piruvato-carboxilase, o gene mqo codificador de maltato:quinona-oxido-redutase, o gene zwf codificador de glicose-fosfato- desidrogenase, o gene lysE codificador de exportador de lisina, o gene zwa\ codificador de proteína zwal, o gene tpi codificador de triose-fosfato- isomerase, e o gene pgk codificador de 3-fosfo-glicerato-cinase está/estão simultaneamente intensificado(s), e, em particular super-expressado(s).
Um processo para a preparação de L-aminoácidos, tais comoL-lisina e L-treonina, por fermentação de bactérias corineformes, no qual pelo menos o gene zwfestá amplificado, tem sido descrito (Pedido PCT WOOl70995Al). Esta publicação descreve como a modalidade preferida do processo a preparação de L-aminoácidos usando bactéria corineforme no qual, em adição à atenuação do gene zwf, um ou mais genes selecionados do grupo consistindo de gene dapA que codifica di-hidro-dipicolinato-sintase, o gene lysC que codifica uma aspartato-cinase resistente à retro-alimentação, o gene gapque codifica gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, o gene tkt que codifica transcetolase, o gene gnd que codifica gliconato-6-fosfo- desidrogenase, o gene lysE que codifica exportador de lisina, o gene zwal que codifica proteína zwal, o gene eno que enolase é/são amplificado(s) ou super- expressado(s) ao mesmo tempo.
Bactérias corineformes que produzem L-aminoácidos, incluindo L-treonina, possuindo pelo menos uma cópia no sítio (lócus) natural, e até três cópias adicionais de matrizes de leitura aberta (ORF) escolhidas de um grupo, dentre outros, genes eno, gap, pgk, e tpi, têm sido descritas (Pedidos PCT W003014330A2, W003040373A2).
Um processo para preparar ácido L-glutâmico por fermentação de bactérias corineformes na qual a seqüência de nucleotídeos codificadora de D-alanina-racemase (alr) está atenuada, e em particular, eliminada, tem sido descrito (Pedido PCT WO0208437A2). Esta publicação descreve como a modalidade preferida do processo a preparação de ácido L-glutâmico usando bactéria corineforme na qual, em adição à atenuação da seqüência de nucleotídeos codificadora de D-alanina-racemase (alr), um ou mais dos genes selecionados do grupo incluindo, dentre outros, os genes gape eno são intensificados, e em particular, super-expressados. Um método para produzir compostos químicos finos ou metabolites, tal como L-treonina, usando microorganismos, em particular, bactérias corineformes ou Escherichia coli, nos quais a capacidade de fosforilação de pelo menos uma proteína tem sido permanentemente alterada de tal modo que a biossíntese de pelo menos um composto químico fino sintetizado pelo microorganismo é aumentada comparado com o tipo selvagem devido a uma mutação em pelo menos um aminoácido da proteína,tem sido descrito (Pedido PCT W003023016A2). Um exemplo de tal proteína é enolase mutante (enoS330E).
Dentre os genes codificadores de enzimas da rota glicolítica, quatro genes têm sido usados para melhoria da produção de L-treonina utilizando bactéria da família Enterobacteriaceae, particularmente 10 Escherichia coli. Estes são os genes fbaA, gpmA (pgmfpykF, e pfkB.
Assim, o processo para a preparação de L-aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae e que produzem o L-aminoácido desejado e nos quais o gene fba ou a sequência de nucleotídeos que codifica este gene está intensificado(a,) em particular, super-expressada, tem sido descrito (Pedido PCT WO03004664A2). Ao mesmo tempo, um processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae que produzem o L- aminoácido desejado e nos quais um ou mais dos genes escolhidos do grupo compreendendo, dentre outros, o gene fba ou as seqüências de nucleotídeos que codifica(m) estes, está/estão atenuado(s), em particular eliminado(s), tem sido descrito pelo mesmo requerente no Pedido PCT W003004662A2, mas não contém exemplos.
Também, um processo para a preparação de L-aminoácidos, 25 em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da famíliaEnterobacteriaceae que produzem o L-aminoácido desejado e nos quais o gene pgm ou a seqüência de nucleotídeos que codifica este está intensificado(a), em particular, super-expressado(a), tem sido descrito (Pedido PCT WO3004598A2). Ao mesmo tempo, o processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceaeque produzem o L- aminoácido desejado e no qual um ou mais dos genes escolhidos do grupo compreendendo dentre outros o gene pgm ou seqüências de nucleotídeos que codificam estes está/estão atenuado(s), em particular, eliminado(s), tem sido descrito pelo mesmo requerente no Pedido PCT W003004662A2, mas não contém exemplos.
Também, o processo para a preparação de L-aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae que produzem o L-aminoácido desejado e nos quais o gene pykF ou a sequência de nucleotídeos para este está intensificado(a), em particular, super-expressado(a), tem sido descrito (Pedido PCT WO3008609A2). Ao mesmo tempo, o processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae que produzem o L- aminoácido desejado e no qual um ou mais dos genes escolhidos do grupo compreendendo dentre outros o gene pykF ou seqüências de nucleotídeos que codificam estes está/estão atenuado(s), em particular, eliminado(s), tem sido descrito pelo mesmo requerente no Pedido PCT W003008600A2, mas não contém exemplos.
E finalmente, um processo para a preparação de L- aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae que produzem o L- aminoácido desejado e nos quais o gene pjkB ou a seqüência de nucleotídeos para este está intensificado(a), em particular, super-expressado(a), tem sido descrito (Pedido PCT W03008610A2). Ao mesmo tempo, o processo para a preparação fermentativa de L-aminoácidos, em particular de L-treonina, por fermentação de microorganismos da família Enterobacteriaceae que produzem o L-aminoácido desejado e no qual um ou mais dos genes escolhidos do grupo compreendendo dentre outros o gene pfkB ou seqüências de nucleotídeos que codificam estes está/estão atenuado(s), em particular, eliminado(s), tem sido descrito pelo mesmo requerente no Pedido PCT W003008600A2, mas não contém exemplos.
Não têm havido descrições até o momento sobre do uso de bactéria pertencente ao gênero Escherichiacom expressão intensificada dos genes codificadores de enzimas da rota glicolítica, tais como glk, pgi, pfkA, gapA, pgk^eno epykA, para a produção de L-treonina.
Um objetivo da presente invenção é intensificar a produtividade de cepas produtoras de L-treonina e proporcionar um método para produzir L-treonina usando estas cepas.
Este objetivo foi alcançado pela descoberta de que genes, tais como glk, pgi, pfkA, gapA, pgk^eno e pykA, que codificam enzimas da rota glicolítica, ao serem clonados em um vetor baixo em cópias, intensificam a produção de L-treonina de bactérias produtoras de L-treonina quando a cepa é transformada com o plasmídeo hospedando o gene. Assim a presente invenção tem sido completada.
Um objetivo da invenção é proporcionar uma bactéria produtora de L-treonina pertencente ao gênero Escherichia,no qual a bactéria tem sido modificada para intensificar uma atividade de uma ou mais enzimas glicolíticas.
Um outro objetivo da invenção é proporcionar uma bactéria produtora de L-treonina pertencente ao gênero Escherichia,no qual a bactéria tem sido modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos genes escolhidos do grupo consistindo de glk,pgi,pfkA, gapA,pgk^eno epykA, que codificam enzimas da rota glicolítica, ou as seqüências de nucleotídeos, que codificam estas.
Um outro objetivo da invenção é proporcionar a bactéria como descrita acima, no qual a expressão de um ou mais dos genes é intensificada pelo aumento do número de cópias de gene(s), ou modificação de uma seqüência de controle de expressão do(s) gene(s) de modo que a expressão do(s) gene(s) é intensificada. Um outro objetivo da invenção é proporcionar a bactéria como descrita acima, no qual o número de cópias é aumentado pela transformação da bactéria com um vetor baixo em cópias contendo o gene ou os genes.
Um outro objetivo da invenção é proporcionar a bactéria como descrita acima, no qual os genes são originados de uma bactéria pertencente 10 ao gênero Escherichia. Um outro objetivo da invenção é proporcionar a bactéria como descrita acima, no qual a bactéria tem sido adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo de: - o gene mutante thrA que codifica asparto-cinase-homo-serina- desidrogenase I resistente à inibição de retro-alimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homo-serina-cinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase; - o gene rhtA que codifica a proteína de transmembrana putativa.
Um outro objetivo da invenção é proporcionar a bactéria como descrita acima, no qual a bactéria tem sido modificada para aumentar a quantidade de expressão do gene mutante thrA, do gene thrB, do gene thrC e do gene rhtA.
E um outro objetivo da invenção é proporcionar um método para produzir L-treonina, que compreende cultivar a bactéria como descrita acima em um meio de cultura para produzir e acumular L-treonina no meio de cultura, e coletar a L-treonina do meio de cultura.
Figura 1 mostra a estrutura do promotor mutante sintético pA3m-
A bactéria da presente invenção é uma bactéria produtora de 5 L-treonina pertencente ao gênero Escherichia,na qual a bactéria tem sido modificada para intensificar uma atividade de uma ou mais das enzimas glicolíticas. Particularmente, a bactéria da presente invenção é uma bactéria produtora de L-treonina pertencente ao gênero Escherichia,na qual a bactéria tem sido modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos genes 10 escolhidos do grupo consistindo de glk, pgi, pfkA, gapA, pgk^eno e pykA, que codificam enzimas da rota glicolítica, ou as seqüências de nucleotídeos, que codificam estas.
Na presente invenção, "bactéria produtora de L-treonina" significa uma bactéria, que possui uma capacidade para causar o acúmulo de 15 L-treonina em um meio, quando a bactéria da presente invenção é cultivada no meio. A capacidade de produção de L-treonina pode ser conferida ou intensificada por procriação. A frase "bactéria produtora de L-treonina" como aqui usada também significa uma bactéria, que é capaz de produzir e causar o acúmulo de L-treonina em um meio de cultura em uma quantidade maior do 20 que a de uma cepa parental ou de tipo selvagem de E. coli, tal como cepa E. coli K-12.
A frase "uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia"significa que a bactéria é classificada como o gênero Escherichiade acordo com a classificação conhecida por uma pessoa experiente na arte de 25 microbiologia. Exemplos de um microorganismo pertencente ao gênero Escherichiacomo usado na presente invenção incluem, mas não são limitados a, Escherichia coli (E. coli). A bactéria pertencente ao gênero Escherichiaque pode ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, contudo, por exemplo, as bactérias descritas por Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) são incluídas pela presente invenção.
A frase "modificada para intensificar a expressão de gene(s)"significa que a quantidade de expressão do(s) gene(s) é maior do que aquela de uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepa de tipo selvagem. Exemplos de tais modificações incluem o aumento do número de gene(s) a ser(em) expressado(s) por célula, aumento do nível de expressão do gene, e assim por diante. A quantidade do número de cópias do gene expressado é medida, por exemplo, pela restrição do DNA cromossômico, seguida por Southern blottingusando uma sonda construída baseada na sequência do gene, hibridização in situcom fluorescência (FISH), e semelhantes. O nível de expressão de gene é medido por métodos diferentes, incluindo Northern blotting,RT-PCR quantitativa e semelhantes. Ainda mais, a Escherichia coli K-l, por exemplo, pode ser usada como uma cepa de tipo selvagem para comparação. Como um resultado da intensificação da expressão do(s) genes(s), a quantidade de L-treonina que se acumula em um meio aumenta.
Enzimas da rota glicolítica de acordo com a presente invençãosão apresentadas por glicocinase (EC 2.7.1.2) codificada pelo gene glk, fosfo- glicose-isomerase (EC 5.3.1.9) codificada pelo gene pgi, fosfofrutocinase-1 (frutose-6-P-l-cinase) (EC 2.7.1.11) codificada pelo gene pfkA, triose-fosfato- isomerase (EC 5.3.1.1) codificada pelo gene tpiA, gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase (GAPDH) (EC 1.2.1.12) codificada pelo gene gapA, fosfo- glicerato-cinase (EC 2.7.2.3) codificada pelo gene pgk,enolase (EC 4.2.1.11) codificada pelo gene eno e isoenzimas de piruvato-cinase (EC 2.7.1.40) codificadas pelo gene pykA.
Na presente invenção, o termo "glicocinase" significa umaenzima capaz de catalisar a reação de fosforilação ATP-dependente de glicose com a formação de glicose-6-fosfato. O termo "fosfo-glicose-isomerase" significa uma enzima capaz de catalisar a reação de conversão de glicose-6- fosfato em ffutose-6-fosfato.
O termo "fosfofrutocinase-1 (ffutose-óP-l -cinase)" significa uma enzima capaz de catalisar a reação de fosforilação ATP-dependente de glicose-6-fosfato com a formação de glicose-1,6-difosfato. O termo "triose- fosfato-isomerase" significa uma enzima que interconverte di-hidróxi- acetona-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato. O termo "gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase" significa uma enzima capaz de catalisar a reação NAD+- dependente de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-difosfo-glicerato. O termo 10 "fosfo-glicerato-cinase" significa uma enzima capaz de catalisar a reação de desfosforilação de 1,3-difosfo-glicerato com a liberação de 3-fosfo-glicerato e ATP. O termo "enolase"significa uma enzima capaz de catalisar a reação de desidratação de 2-fosfo-glicerato com a liberação de fosfo-enol-piruvato. O termo "piruvato-cinase"significa uma enzima capaz de catalisar a reação de formação de piruvato a partir de fosfo-enol-piruvato com a liberação de ATP.
Quaisquer genes de bactérias pertencentes ao gênero Escherichiae genes derivados de outras bactérias tais como bactérias corineformes, bactérias pertencentes ao gênero Bacillusou semelhantes podem ser usados como os genes codificadores das enzimas glicolíticas.
Dentre estes, os genes derivados de bactérias pertencentes ao gênero Escherichiasão preferidos.
Como o gene codificador de glicocinase de Escherichia,gene glk tem sido elucidado (números de nucleotídeo 2506481 a 2507446 na seqüência do número de acesso do GenBank NC 000913.1, gi: 16130320; SEQ ID NO: 1). O gene glk está localizado entre as ORFs b2387 e b2389 no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Como o gene codificador de fosfo-glicose- isomerase de Escherichia coli, o gene pgi tem sido elucidado (números de nucleotídeo 4231337 a 4232986 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16131851; SEQ ID NO: 3). O genepgi está cepa localizado entre o gene lysC e o gene yJbE no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Como o gene codificador de fosfofrutocinase-1 de Escherichia coli, o gene pfkA tem sido elucidado (números de nucleotídeo 4105132 a 4106094 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16131754; SEQ ID NO: 5). O gene pfkA está localizado entre a ORF yiiP e o gene sbp no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Como o gene codificador de triose-fosfato- isomerase de Escherichia coli, o gene tpiA tem sido elucidado (números de nucleotídeo 4108320 a 4109087 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi:16131757; SEQ ID NO: 9). O gene tpiA está localizado entre o gene cdh e a ORF yiiQ no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Como o gene codificador de gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de Escherichia coli, o gene gapA tem sido elucidado (números de nucleotídeo 1860795 a 1861790 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi:16129733; SEQ ID NO: 11). O gene gapA está localizado entre as ORFs yeaA e yeaD no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Como o gene codificador de fosfo-glicerato-cinase de Escherichia coli, o gene pgk tem sido elucidado (números de nucleotídeo 3069479 a 3070642 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16130827; SEQ ID NO: 13). O gene pgk está localizado entre os genes fbaA e epd no cromossomo de cepa E. coli Kl 2. Como o gene codificador de enolase de Escherichia coli, o gene eno tem sido elucidado (números de nucleotídeo 2904665 a 2905963 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi:16130686; SEQ ID NO: 17). O gene eno está localizado entre a ORF 778 ORF e o gene pyrG no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Como o gene codificador de piruvato-cinase II de Escherichia coli, o gene pykA tem sido elucidado (números de nucleotídeo 1935673 to 1937115 e 1753722 a 1755134 na seqüência do número de acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16129807 e gi:16129632; SEQ ID NOs: 19 e 21, respectivamente). O gene pykA está localizado entre ORF yebK e o gene msbB no cromossomo de cepa E. coli Kl2. Portanto, os genes acima mencionados podem ser obtidos por PCR (reação em cadeia de polimerase; referir a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados baseados na seqüência de nucleotídeos relatada dos genes.
O gene glk originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; ou (B) uma proteína que compreende uma seqüência de 10 aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, e que possui unia atividade de glicocinase.
O gene pgi originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (C) ou (D): (C) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; ou (D) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, 20 e que possui uma atividade de fosfo-glicose-isomerase.
O gene pfkA originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (E) ou (F): (E) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6; ou (F) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6, e que possui uma atividade de fosfoffutocinase-1 (frutose-6-P-l-cinase).
O gene tpiA originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (G) ou (H): (G) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8; ou (H) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, e que possui uma atividade de triose-fosfato-isomerase.
O gene gapA originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (I) ou (J): (I) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; ou (J) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, e que possui uma atividade de gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase.
O gene pgk originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (K) ou (L): (K) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12; ou (L) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, e que possui uma atividade de fosfo-glicerato-cinase.
O gene eno originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (M) ou (N): (M) uma proteína, que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14; ou (N) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e que possui uma atividade de enolase.
O gene pykA originado de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (O) ou (P): (O) uma proteína, que compreende a seqüência deaminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16; ou (P) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 16, e que possui uma atividade de piruvato-cinase.
O número de "vários" aminoácidos difere dependendo da posição ou do tipo de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína. Pode ser, por exemplo, 2 a 30, preferivelmente 2 a 15, e com maior preferência 2 a 5 para a proteína (A). Isto é porque alguns aminoácidos 15 possuem homologia alta com um outro de modo que a estrutura tridimensional da proteína ou sua atividade não é afetada por tal mudança. Portanto, a proteína (B) pode ser uma que possui homologia menor do que 30% a 50%, preferivelmente 50% a 70%, e com maior preferência entre 70% e 90%, com preferência ainda maior acima de 90%, e mais preferivelmente 20 acima de 95%, com respeito à seqüência de aminoácidos inteira constituindo glicocinase, e que possui atividade de glicocinase. A mesma abordagem é aplicada para as outras proteínas (C), (E), (G), (I), (K), (M) e (O).
Os DNAs, que codificam substancialmente as mesmas proteínas como cada uma das enzimas da rota glicolítica descritas acima, são 25 obtidos, por exemplo, por modificação da seqüência de nucleotídeos do DNA codificador da enzima, por exemplo, por meio do método de mutagênese sítio-direcionada de modo que um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio especificado envolva deleção, substituição, inserção, ou adição. DNA modificado como descrito acima é obtido por tratamentos de mutação convencionalmente conhecidos. Tais tratamentos incluem tratamento com hidroxil-amina do DNA codificador de proteínas da presente invenção ou tratamento da bactéria contendo o DNA com irradiação UV ou um reagente tal como N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina ou ácido nitroso.
Um DNA codificador de substancialmente a mesma proteína como glicocinase é obtido pela expressão de um DNA possuindo a mutação como descrita acima em uma célula apropriada, e investigação da atividade de qualquer produto expressado. Um DNA codificador de substancialmente a mesma proteína como glicocinase também pode ser obtido pelo isolamento de um DNA que é hibridizável com uma sonda possuindo uma seqüência de nucleotídeos que contém, por exemplo, a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1, sob as condições estringentes, e codifica uma proteína possuindo a atividade de glicocinase, do DNA codificador de glicocinase possuindo uma mutação ou de uma célula hospedando-o. As "condições estringentes" aqui referidas são condições sob as quais os denominados híbridos específicos são formados, e híbridos não-específicos não são formados. É difícil expressar claramente esta condição pelo uso de qualquer valor numérico. Contudo, por exemplo, as condições estringentes podem ser exemplificadas pelas condições sob as quais os DNAs possuindo homologia alta, por exemplo, DNAs possuindo homologia não menor do que 50%, preferivelmente de 50% a 70%, e com maior preferência entre 70% e 90%, de preferência ainda maior acima de 90%, e mais preferivelmente acima de 95%, são capazes de hibridizar uns com os outros, mas DNAs possuindo homologia menor do que a acima não são capazes de hibridizarem uns com os outros.
Para avaliar o grau de homologia de proteína ou de DNA vários métodos de cálculo, tais como pesquisa BLAST, pesquisa FASTA e Crus tal W podem ser utilizados. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) é o algoritmo de pesquisa heurística empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx; estes programas atribuem significância às suas descobertas usando os métodos estatísticos de Karlin, Samuel e Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Método de pesquisa FASTA descrito por W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63- 98). Método ClustalW descrito por Thompson J.D., Higgins D.G. e Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).
Altemativamente, as condições estringentes podem ser exemplificadas pelas condições sob as quais os DNAs são hibridizados uns com os outros em uma concentração de sal equivalente às condições de lavagem ordinárias em hibridização de Southern, i.e., 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60°C. Duração do procedimento de lavagem depende do tipo de membrana usada para blottinge, como uma regra, como é recomendado pelo fabricante. Por exemplo, duração recomendada de lavagem da membrana de náilon Hybond™ N+ (Amersham) sob condições estringentes é de 15 minutos. Preferivelmente, lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes.
Uma seqüência parcial da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 também pode ser usada como uma sonda. Sondas podem ser preparadas por PCR usando iniciadores produzidos baseados na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como um modelo. Quando um fragmento de DNA possuindo um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem podem incluir, por exemplo 50°C, 2 x SSC e 0,1% SDS.
A substituição, deleção, inserção, ou adição de nucleotídeos como descrito acima também inclui mutação, que naturalmente ocorre (mutante ou variante), por exemplo, devido à variedade de espécies ou gênero 5 de bactéria, que contém glicocinase.
Um DNA codificador de substancialmente as mesmas proteínas como as outras enzimas da rota glicolítica é obtido semelhantemente à glicocinase como descrito acima.
"Transformação de uma bactéria com DNA codificador de 10 uma proteína" significa a introdução do DNA em uma célula de bactéria, por exemplo por métodos convencionais. Transformação de uma célula de bactéria com este DNA resultará em um aumento na expressão do gene codificador da proteína da presente invenção e intensificará a atividade da proteína na célula bacteriana. Métodos de transformação incluem quaisquer 15 métodos conhecidos que têm sido até agora relatados. Por exemplo, um método de tratar células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade das células ao DNA tem sido relatado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) e pode ser usado.
Métodos de intensificação de expressão de gene incluem 20 aumento do número de cópias de gene. Introdução de um gene em um vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia aumenta o número de cópias do gene. Preferivelmente, vetores de cópias baixas são usados. O vetor baixo em cópias é exemplificado por pSClOl, pMWl 18, pMWl 19 e semelhantes. O termo "vetor baixo em cópias" é usado 25 para vetores, cujo número de cópias é de até 5 cópias por célula.
Intensificação da expressão de gene também pode ser alcançada pela introdução de cópias múltiplas do gene em um cromossomo bacteriano, por exemplo, por um método de recombinação homóloga, integração Mu ou semelhante. Por exemplo, uma rodada de integração Mu permite a introdução em cromossomo bacteriano de até 3 cópias do gene.
Intensificação da expressão de gene também pode ser alcançada pela modificação de uma seqüência de controle de expressão de modo que a expressão do gene seja intensificada, por exemplo, pelo 5 posicionamento do DNA da presente invenção sob o controle de um promotor potente. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor PR ou PL de fago lambda são conhecidos como promotores potentes. Força do promotor é definida pela freqüência de ações de iniciação de síntese de RNA. Método para avaliação da força de promotor é descrito, por 10 exemplo, por Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. ("Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures". EMBOJ-, 5, 2987-2994 (1986)).
Uso de um promotor potente pode ser combinado com multiplicação de cópias de gene.
Altemativamente, um promotor pode ser intensificado, porexemplo, pela introdução de uma mutação no promotor para aumentar o nível de transcrição de um gene localizado a jusante do promotor. Ainda mais, é sabido que a substituição de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (RBS) e o códon de iniciação e especialmente as 20 seqüências imediatamente a montante do códon de iniciação afeta profundamente a capacidade de tradução de mRNA. Por exemplo, uma faixa de 20 vezes nos níveis de expressão foi encontrada, dependendo da natureza dos três nucleotídeos precedendo o códon de iniciação (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol.,35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984).
Inicialmente, os autores da presente invenção mostraram que a mutação rhtA23 é uma substituição de G por A na posição 1 com respeito ao códon de iniciação ATG (ABSTRACTS de 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco,
California August 24-29, 1997, abstract No. 457). Portanto, pode ser sugerido que a mutação rhtA23 intensifica a expressão do gene rhtA e, como uma conseqüência aumenta o nível de resistência à treonina, à homo-serina e a algumas outras substâncias excretadas pelas células.
Ainda mais, também é possível introduzir substituição de nucleotídeo em uma região de promotor de um ou mais genes da glicólise no cromossomo bacteriano de modo que ele deve ser modificado para um mais forte. A alteração da seqüência de controle de expressão pode ser realizada, por exemplo, na mesma maneira que a da substituição de gene usando um 10 plasnüdeo sensível à temperatura, como descrito na Publicação de Patente Internacional WOOO/18935 e na Publicação de Patente Japonesa No. 1215280.
O aumento do número de cópias de um ou mais genes codificadores de enzimas da rota glicolítica também pode ser realizado pela 15 introdução de cópias múltiplas de gene em DNA cromossômico da bactéria. Para introduzir cópias múltiplas de um gene em um cromossomo bacteriano, recombinação homóloga é realizada pelo uso de uma seqüência cujas cópias múltiplas existem no DNA cromossômico como alvos. Como seqüências cujas cópias múltiplas existem no DNA cromossômico, DNA repetitivo, 20 repetições inversas existindo na extremidade de um elemento reversível podem ser usados. Também, como descrito no Pedido de Patente Japonesa Publicado No. 2-109985, é possível incorporar o gene concreto no transposon, e permitir que ele seja transferido para introduzir cópias múltiplas do gene no DNA cromossômico.
Métodos para a preparação de DNA plasmídeo, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e semelhantes podem ser métodos ordinários bem conhecidos por uma pessoa experiente na arte. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E.F., e Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).A bactéria da presente invenção pode ser obtida pela introdução dos DNAs acima mencionados em bactéria que inerentemente possui a capacidade de produzir L-treonina. Altemativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida pelo fornecimento de uma capacidade de produzir L-treonina à bactéria já contendo os DNAs.
Exemplos de cepas parentais incluídas pela presente invenção incluem, por exemplo, mas não são limitados a, bactéria produtora de treonina 10 pertencente ao gênero Escherichiatal como cepa E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente US 5.175.107, Patente US 5.705.371), cepa E. coli NRRL-21593 (Patente US 5.939.307), cepa#, coliFERM BP-3756 (Patente US 5.474.918), cepas E. coliFERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente US 5.376.538) , cepa E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika(em russo), 14, 15 947956 (1978)), cepas E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) esemelhantes podem ser usadas.
A cepa TDH-6 é deficiente em gene thrC também sendo assimiladora de sacarose, e o gene ilvA possui uma mutação subnormal. Esta cepa possui uma mutação no gene rhtA, que confere resistência a 20 concentrações altas de treonina ou de homo-serina. A cepa B-3996 (TDH- 6/pVIC40) contém o plasmídeo pVIC40 que havia sido obtido pela inserção de operon thrA*BC operon incluindo o gene mutante thrA codificador de aspartocinase-homo-serina-desidrogenase I que possui inibição de retroalimentação por treonina substancialmente dessensibilizada no vetor derivado 25 de RSF1010. A cepa B-3996 foi depositada aos 19 de novembro de 1987, no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 113105 Moscou, Federação Russa) aos 7 de abril de 1987 sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) (Dorozhny proezd. 1, Moscou 113545, Federação Russa) aos 17 de abril de 1987 sob o número de acesso B-3996.
Preferivelmente, a bactéria da presente invenção é preferivelmente adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos seguintes genes juntamente com um ou mais dos genes 5 codificadores de enzimas da rota glicolítica. - o gene mutante thrA que codifica aspartocinase-homo-serina- desidrogenase I resistente à inibição de retro-alimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homo-serina-cinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase.
Outra modalidade preferida da presente invenção é a bactéria modificada para intensificar o gene rhtA que codifica uma proteína de membrana putativa em adição à intensificação de gene(s) codificador(es) de enzima(s) glicolítica(s). A modalidade mais preferida da invenção é uma 15 bactéria modificada para aumentar a expressão do(s) gene(s) codifícador(es) de enzima(s) glicolítica(s), o gene mutante thrA, o gene thrB, o gene thrC e o gene rhtA.
O método para produzir L-treonina da presente invenção inclui as etapas de cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura, 20 permitir o acúmulo de L-treonina no meio de cultura, e coletar L-treonina do meio de cultura.
Na presente invenção, o cultivo, a coleta e a purificação de L- treonina do meio e semelhante podem ser realizados em uma maneira semelhante ao método de fermentação convencional no qual L-treonina é 25 produzida usando microorganismo.
Um meio usado para a cultura pode ser um meio quer sintético quer natural, desde que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais em, se necessárias, quantidades apropriadas de nutrientes que o microorganismo requer para crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos tais como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microorganismo escolhido, álcool, incluindo etanol e glicerol, podem ser utilizados. Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amónio tais como amónia e sulfato de amónio, outros compostos de nitrogênio tais como aminas, uma fonte de nitrogênio natural tal como peptona, hidrolisado de feijão-soja, e microorganismo fermentativo digerido são usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e semelhantes são usados.
Como vitaminas, tiamina, extrato de levedo e semelhantes são utilizados. Nutrientes adicionais podem ser adicionados no meio se necessários. Por exemplo, se o microorganismo requerer isoleucina para crescimento (auxotrofia de isoleucina), uma quantidade suficiente de isoleucina pode ser adicionada no meio de cultura.
O cultivo é realizado preferivelmente sob condições aeróbicas tais como uma cultura vascolejada, e cultura agitada com aeração, em uma temperatura de 20°C a 40°C, preferivelmente 30°C a 38°C. O pH da cultura está normalmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amónia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tampões. Normalmente, um cultivo de 1 a 5 dias acarreta o acúmulo de L-treonina no meio líquido.
Após o cultivo, sólidos tais como células podem ser removidos do meio liquido por centrifugação ou filtração em membrana, e então L- treonina pode ser coletada e purificada por métodos de troca iônica, 25 concentração e cristalização.
A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitantes. A cepa E. coli VKPM B-3996 (Patente US 5.175.107) foi usada como uma cepa parental para avaliar o efeito da amplificação dos genes codificadores das enzimas da rota glicolítica sobre a produção de L-treonina.
O plasmideo pMW119 e seus derivados são compatíveis com plasmideo pVI40 (replicon pRSFlOlO), portanto os dois plasmideos pVIC40 e derivado de pMW119 contendo o gene codificador de enzima da rota glicolítica puderam ser mantidos na bactéria simultaneamente. Nas tabelas com resultados de fermentação, os dados de pelo menos três experimentos independentes (por favor confirme) são apresentados.
O gene glk foi obtido por PCR usando DNA cromossômico de cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores Pl (SEQ ID NO: 17) e P2 (SEQ ID NO: 18). A cepa MG 1655 está disponível na American Type Culture Collection (ATCC700926). Iniciador Pl contém sítio de reconhecimento de restritases RamHI introduzido em sua extremidade-5'. Iniciador P2 contém sítio de reconhecimento de restritases &zcl introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (968 pb) contendo o gene glk foi tratado com restritases RtzmHI e Saci e clonado no plasmideo pMW119 previamente modificado para substituir o promotor P[ac pelo promotor PR de fago lambda e então tratado com as mesmas restritases. Assim o plasmideo pMW-PR-glk contendo o gene glk sob o controle do promotor PR foi construído. Nível alto não-regulado de expressão de gene glk pôde ser alcançado usando este plasmideo.
O plasmideo pMW-PR-glk foi introduzido na cepa E. coli B- 3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-glk) foi obtida.
Ambas as cepas E. coli B-3996 e B-3996(pMW-PR-glk) foram crescidas por 18-24 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo estreptomicina (100 pg/mL) e ampicilina (100 pg/mL). Para obter a cultura de semente, a cepa foi crescida sobre um vascolejador rotativo (250 rpm) a 32°C por 18 horas em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm contendo 2 mL de caldo L com 4% de glicose. Então, o meio de fermentação foi inoculado com 0,1 mL (5%) de material de semente. A fermentação foi realizada em 2 mL de 5 meio mínimo para fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm.
Após o cultivo, foi determinado uma quantidade acumulada de L-treonina no meio por TLC. Placas Sorbfíl (Stock Company Sorbopolymer, Krasnodar, Rússia) foram desenvolvidas com uma fase móvel: propan-2-ol : acetona : água : amónia aquosa 25% = 25 : 25 : 7 : 6 (v/v). Os resultados são 10 apresentados na Tabela 1.
A composição do meio de fermentação (g/L) é a seguinte:
Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 seco por calor é esterilizado a 180°C por 2 h. O pH é ajustado para 7,0. Antibióticos são introduzidos no meio após esterilização. Tabela 1
Como é visto da Tabela 1, a intensificação da expressão do gene glk melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
O gene pfkA foi obtido por PCR usando DNA cromossômico da cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores P3 (SEQ ID NO: 19) e P4 (SEQ ID NO: 20). Iniciador P3 contém sítio de reconhecimento de restritases ZtamHI introduzido em sua extremidade-5'. Iniciador P4 contém sítio de reconhecimento de restritases &zcl introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (987 pb) contendo o gene pfkAfoi diretamente clonado no vetor pCR 2.1 (Invitrogen) por ligação notuma a + 4°C. O fragmento de BamlAl-Sacl DNA contendo o gene pfkA foi reclonado no plasmídeo pMW119 previamente modificado para substituir o promotor P|ac pelo promotor PRde fago lambda e então foi tratado com as restritases e Saci. Assim, foi construído o plasmídeo pMW-PR-pfkA contendo o gene pfkA sob o controle do promotor PR. Nível alto não-regulado de expressão do gene pfkA pôde ser alcançado usando este plasmídeo.
O plasmídeo pMW-PR-pfkA foi introduzido na cepa E. coli B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-pfkA) foi obtida.
Acúmulo de L-treonina pelas cepas E. coli B-3996 e B- 3996(pMW-PR-pfkA) foi avaliado como descrito acima (veja Exemplo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 2. Tabela 2
Visto que o efeito da expressão intensificada de gene pfkA sobre a produção de treonina em fermentação em tubo de ensaio não foi impressionante, a fermentação em batelada foi realizada em fermentadores de laboratório possuindo uma capacidade de 1,0 Litro.
Para este propósito, as cepas E. coli VKPM-3996 e VKPM- 3996(pMW-PR-pfkA) foram crescidas durante 18-24 horas a 37°C sobre placas de L-ágar contendo estreptomicina (100 pg/mL). Então uma alça das células foi transferida para 50 mL de caldo L de seguinte composição: triptona - 10 g/L, extrato de levedo - 5 g/L, NaCl - 5 g/L. As células (50 mL, OD540 - 2 o.u.) crescidas a 37°C dentro de 5 horas sobre vascolejador (240 rpm) foram usadas para semear 450 mL de meio para fermentação. A fermentação em batelada foi realizada em fermentadores de laboratório possuindo uma capacidade de 1,0 L sob aeração (1/1 wm) com agitação em uma velocidade de 1200 rpm a 37°C. O valor de pH foi mantido automaticamente a 6,6 usando licor de amónia 8%. Os resultados são apresentados na Tabela 3. A composição do meio de fermentação (g/l
): Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente.pH é ajustado para 6,6. Tabela 3
Como pode ser visto da Tabela 3, a intensificação da expressão do gene pfkA melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
O gene fbaA foi obtido por PCR usando DNA cromossômico da cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores P5 (SEQ ID NO: 21) e P6 (SEQ ID NO: 22). Iniciador P5 contém sítio de reconhecimento de restritases TJamHI introduzido em sua extremidade-5'. Iniciador P6 contém sítio de reconhecimento de restritases Saci introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (1155 pb) contendo o gene fbaA foi tratado com as restritases 5amHI e Saci e clonado no vetor pMW119 previamente modificado para substituir o promotor Plac pelo promotor PRde fago lambda e então foi tratado com as mesmas restritases. Assim, foi construído o plasmídeo pMW-PR-fbaA contendo o gene fbaA sob o controle do promotor PR. Nível alto não-regulado de expressão do gene fbaA 5 pôde ser alcançado usando este plasmídeo.
O plasmídeo pMW-PR-pfaA foi introduzido na cepa E. coli B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-pfkA) foi obtida.
Acúmulo de L-treonina pelas cepas E. coli B-3996 e B- 10 3996(pMW-PR-fbaA) foi avaliado como descrito acima (veja Exemplo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 4. Tabela 4
Como é visto da Tabela 4, a intensificação da expressão dogene fbaA melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
O gene tpiA foi obtido por PCR usando DNA cromossômico da cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores P7 (SEQ ID NO: 23) e P8 (SEQ ID NO: 23). Iniciador P7 contém sítio de 20 reconhecimento de restritases TtamHI introduzido em sua extremidade-5'.
Iniciador P8 contém sítio de reconhecimento de restritases SÍZCI introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (774 pb) contendo o gene tpi foi tratado com as restritases 5<wHI e Saci e clonado no vetor pMW119 previamente modificado para substituir o promotor Plac pelo 25 promotor PR de fago lambda e então foi tratado com as mesmas restritases.
Assim, foi construído o plasmídeo pMW-PR-tpiA contendo o gene tpiA sob o controle do promotor PR. Nível alto não-regulado de expressão do gene tpiA pôde ser alcançado usando este plasmideo.
O plasmideo pMW-PR-tpiA foi introduzido na cepa E. coli B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-tpiA) foi obtida.
Acúmulo de L-treonina pelas cepas E. coli B-3996 e B-3996(pMW-PR-tpiA) foi avaliado como descrito acima (veja Exemplo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 5. Tabela 5
Visto que o efeito da expressão intensificada de gene tpiA sobre a produção de L-treonina em fermentação em tubo de ensaio não foi impressionante, a fermentação em batelada foi realizada em fermentadores de laboratório possuindo uma capacidade de 1,0 Litro como descrito acima (veja Exemplo 2). Os resultados são apresentados na Tabela 6. Tabela 6
Como é visto da Tabela 6, a intensificação da expressão dogene tpiA melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
Para estudar o efeito da expressão intensificada do gene gapA 20 sobre a produção de L-treonina, o gene gapA foi clonado no plasmideo pMW119 sob o controle de promotor mutante sintético (A3m0 derivado de promotor A3 de colifago T3 (Yamada, M. et al., Promoter sequence analysis in Bacillus and Escherichia coir, construction of strong promoter in E. coli. Gene, 99(1), 109-114 (1991)). As mutações introduzidas na seqüência de 25 promotor A3 acarretaram força de promotor diminuída deste promotor dependente de polimerase homoenzima constitutiva Es . Seqüências dos oligonucleotídeos que formaram o promotor sintético mutante A3m são mostradas em SEQ ID NO: 25 e 26. Estrutura do promotor A3m é mostrada na Fig. 1.
O gene gapAfoi obtido por PCR usando DNA cromossômicoda cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores gapA-5' (SEQ ID NO: 27) e gapA-ter (SEQ ID NO: 28). Iniciador gapA-5’ contém sítio de reconhecimento de restritases BamHI introduzido em sua extremidade-5'. Iniciador gapA-ter contém sítio de reconhecimento de restritases A&ÍZI introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (1,2 kb) contendo o gene gpaA com a região 5-não-traduzida até o sítio de início de transcrição PI com promotor A3m sintético possuindo extremidades coesivas de sítios de restrição EcoRI e 5amHI e clonado no vetor pMWl 19 previamente tratado com as restritases ZTmRI e Xbal. Assim, foi obtido o plasmídeo pMWl 19-PA3m-gapA. A estrutura de gene gpaA foi confirmada por seqüenciamento.
Células E. coli HB101 foram transformadas com o plasmídeo pMW119-PA3m-gapA (Sambrook J. e Russell D. W. 2001, "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). A cepa MG 1655 está disponível na American Type Culture Collection (ATCC33694). E as atividades de GAPDH em fase de crescimento semi-log em cepas HB101 e HB101 (pMW-PA3m- gapA) foram determinadas de acordo com o procedimento descrito por Peng., L, e Shimizu, K. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 61, 163-178 (2003)). Os resultados são apresentados na Tabela 7. Tabela 7
Como é visto da Tabela 7, as células HB101 hospedando o plasmídeo possuíram atividade de GAPDH duas vezes mais alta.Então o plasmídeo pMW-PA3m-gapA foi introduzido na cepa E. coli B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PAm-pagA) foi obtida.
Ambas as cepas E. coli B-3996 e B-3996(pMWl 19-pA3- gapA) foram crescidas durante a noite a 37°C sobre placas de LB-ágar, ou placas de LB-ágar contendo ampicilina (100 pg/rnL) no caso da cepa B-3996 (pMWl 19-pA3-gapA). Uma alça (OD595 -2-3 o.u.) da cultura celular noturna de cada uma das cepas foi transferida para 2 mL de meio mínimo de fermentação em tubo de ensaio de seguinte composição: extrato de levedo - 2,0 g/L, (NH4)2SO4 - 16,0 g/L, K2HPO4 - 0,7 g/L, MgSO4.7H2O - 1,0 g/L, MnSO4.5H2O - 0,01 g/L, FeSO4.7H2O - 0,01 g/L, tiamina HC1 (Bj) - 0,2 mg/L, glicose - 4%, CaCO3 (giz) - 30,0 g/L, L-isoleucina - 50 mg/L, ampicilina - 100 pg/mL (apenas no caso da cepa 3996(pMWl 19-pA3-gapA)). As células foram crescidas 48 h a 32°C sob rotação permanente (250 rpm).
Após o cultivo, a quantidade acumulada de L-treonina no meio foi determinada por cromatografia em papel. A fase móvel possui a seguinte composição: n-butanol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1. Os aminoácidos foram coloridos por solução etanólica de ninhidrina (1%) contendo CdCl2 (0,5%). Após incubação de 1 hora a 37°C, as amostras foram medidas em OD508. OS resultados são apresentados na Tabela 8. Tabela 8
Como é visto da Tabela 8, a intensificação da expressão do gene gapA melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
O gene eno foi obtido por PCR usando DNA cromossômico da cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores P9 (SEQ ID NO: 29) e PIO (SEQ ID NO: 30). Iniciador P9 contém sítio de reconhecimento de restritases SamHI introduzido em sua extremidade-5’. Iniciador PIO contém sítio de reconhecimento de restritases Saci introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (1298 pb) contendo o gene eno foi tratado com as restritases ZfrwHI e Saci e clonado no vetor pMW119 previamente modificado para substituir o promotor P[ac pelo promotor PR de fago lambda e então foi tratado com as mesmas restritases. Assim, foi construído o plasmideo pMW-PR-eno contendo o gene eno sob o controle do promotor PR. Nível alto não-regulado de expressão do gene eno pôde ser alcançado usando este plasmideo.
O plasmideo pMW-PR-eno foi introduzido na cepa E. coli B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-eno) foi obtida.
Acúmulo de L-treonina pelas cepas E. coli B-3996 e B- 3996(pMW-PR-eno) foi avaliado como descrito acima (veja Exemplo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 9. Tabela 9
Como é visto da Tabela 9, a intensificação da expressão dogene eno melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
O gene pgi foi obtido por PCR usando DNA cromossômico da cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores Pll (SEQ ID NO: 31) e P12 (SEQ ID NO: 32). Iniciador Pll contém sítio de reconhecimento de restritases -SarnHI introduzido em sua extremidade-5'. Iniciador P12 contém sítio de reconhecimento de restritases Saci introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (1657 pb) contendo o gene pgifoi tratado com as restritases BarnHI e Sad e clonado no vetor pMWl 19 previamente modificado para substituir o promotor Piac pelo promotor PRde fago lambda e então foi tratado com as mesmas restritases. Assim, foi construído o plasmideo pMW-PR-pgi contendo o gene pgi sob o controle do promotor PR. Nível alto não-regulado de expressão do gene pgi pôde ser alcançado usando este plasmideo.
O plasmideo pMW-PR-pgi foi introduzido na cepa E. coli B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-pgi) foi obtida.
Acúmulo de L-treonina pelas cepas E. coli B-3996 e B- 3996(pMW-PR-pgi) foi avaliado como descrito acima (veja Exemplo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 10. Tabela 10
Como é visto da Tabela 10, a intensificação da expressão do gene pgi melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
O gene pgk foi obtido por PCR usando DNA cromossômico da cepa E. coli MG 1655 (VKPM B-6195) como o modelo e iniciadores P13 (SEQ ID NO: 33) e P14 (SEQ ID NO: 34). Iniciador P13 contém sítio de reconhecimento de restritases BamHI introduzido em sua extremidade-5'. Iniciador P14 contém sítio de reconhecimento de restritases Saci introduzido em sua extremidade-5'. O fragmento de DNA obtido (1163 pb) contendo o gene pgk foi tratado com as restritases 5amHI e Saci e clonado no vetor pMW119 previamente modificado para substituir o promotor Piac pelo promotor PR de fago lambda e então foi tratado com as mesmas restritases.
Assim, foi construído o plasmídeo pMW-PR-pgk contendo o gene pgk sob o controle do promotor PR. Nível alto não-regulado de expressão do gene pgk pôde ser alcançado usando este plasmídeo. O plasmídeo pMW-PR-pgk foi introduzido na cepa E. coli 5 B3996 produtora de treonina resistente à estreptomicina (Patente US 5.175.107). Assim, a cepa B-3996(pMW-PR-pgk) foi obtida.
Acúmulo de L-treonina pelas cepas E. coli B-3996 e B- 3996(pMW-PR-pgk) foi avaliado como descrito acima (veja Exemplo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 11. Tabela 11
Como é visto da Tabela 11, a intensificação da expressão do gene pgk melhorou a produtividade de L-treonina da cepa B-3996.
Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às modalidades preferidas da mesma, será evidente para uma 15 pessoa experiente na arte que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregados, sem se desviarem do escopo da invenção. Todas as referências aqui citadas são incorporadas como uma parte deste pedido como referências.
De acordo com a presente invenção, a produção de L-aminoácido tal como L-treonina pode ser melhorada.
Claims (4)
1. Método para produzir L-treonina, caracterizadopelo fato de compreender cultivar uma bactéria recombinante em um meio de cultura para produzir e causar o acúmulo de L-treonina no meio de cultura em uma quantidade maior que a cepa parental ou de tipo selvagem, e coletar a L- treonina do meio de cultura, em que a bactéria recombinante produtora de L-treonina é Escherichia coli, em que a bactéria foi modificada para intensificar a expressão do gene glk, que codifica enzima glicoquinase da rota glicolítica, ou a sequências de nucleotídeo, que codificam esta, em que a expressão do gene é intensificada pelo aumento do número de cópias do gene, ou pelo posicionamento do gene sob o controle de um promotor potente, em que dito gene glk consiste de uma sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 1.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o número de cópias é aumentado pela transformação da bactéria com um vetor baixo em cópias contendo o gene.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato da bactéria ter sido adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo de: - o gene mutante thrA que codifica asparto-cinase-homo-serina- desidrogenase I resistente à inibição de retro-alimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homo-serina-cinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase; - o gene rhtA que codifica a proteína de transmembrana putativa.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato da bactéria ter sido modificada para aumentar a expressão da quantidade de gene mutante thrA, de gene thrB, de gene thrC, de gene rhtA.
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