BRPI0509497B1 - Seqüência de polipeptídeos envolvida na modulação do efeito imunosupressor de proteínas virais - Google Patents

Abstract

SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS ENVOLVIDA NA MODULAÇÃO DO EFEITO IMUNOSUPRESSOR DE PROTEÍNAS VIRAIS. A presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo uma seqüência de 7 a 20 resíduos de aminoácido, que é capaz de modular as propriedades imunosupressoras de uma proteína viral, ou um fragmento desta, contra o hospedeiro no qual ela é expressa (seqüência de imunosupressão-modulatória) quando substitui a seqüência homóloga de referida proteína viral ou fragmento, referido polipeptídeo compreendendo a seqüência de amino ácido de consenso seguinte mínimo: X1 Y9 Y10 Y11 CY12 X12 no qual X1 e X2 são selecionados para impactarem nas referidas propriedades imunosupressora, e Y9 a Y12 representam resíduos de aminoácido variáveis.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a uma sequência de aminoácidos capaz de modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína, especialmente de proteínas antigênicas. A invenção também se refere a polipeptídeos derivados de uma proteína antigênica e imunossupressora, tendo adquirido propriedades imunossupressoras moduladas com relação à proteína da qual eles são derivados, enquanto retém substancialmente suas propriedades antigênicas.

[0002] A invenção se refere especialmente ao campo de infecções virais e retrovirais, incluindo o campo de retroviroses endógenas, e proporciona meios para a projeção de agentes para a profilaxia e/ou tratamento de hospedeiros suscetíveis a tais viroses e retroviroses, incluindo hospedeiros humanos e animais.

[0003] Os polipeptídeos da invenção podem ser especialmente usados na geração de composições imunogênicas e na produção de viroses atenuadas, para uso nos métodos para profilaxia e/ou tratamento de infecções virais ou suas consequências prejudiciais, ou para profilaxia e/ou tratamento das consequências prejudiciais de indução da expressão de retroviroses endógenas (ERV).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Os agentes infeciosos, tais como vírus, têm desenvolvido mecanismos e estratégias para infectar seus hospedeiros e para escapar de sua resposta imunológica. Várias publicações têm demonstrado as propriedades imunossupressoras das proteínas codificadas por vírus: o herpesvírus humano 4, ou Epstein-Barr (Suzuki et al. 1995. J. Exp. Med. 182, 477-486; Qin et al. 1996 J. Immunol. 156, 2316-2323), o vírus do macaco Mason-Pfizer (Blaise et al. 2001 J. gen. Virol. 82, 1597-1600), o vírus da leucemia murina Moloney (Mangeney e Heidmann. 1988. Proc. Natl. Sci. USA. 95. 14920-14925) e outros (veja a revisão Alcami et al. 2002 relatórios EMBO. 3(10), 927-932). Isto pode ser confirmado pelo fato que a infecção por retrovírus está frequentemente associada com as disfunções do sistema imune do hospedeiro.

[0005] Estes efeitos imunossupressores incluem a inibição da proliferação do linfócito dependente da interleucina 2, da atividade citolítica de células humanas “natural killers”, e de morte das células tumorais mediada por monócito, bem como a modulação da síntese da citoquina.

[0006] Testes in vivo demonstraram que os vírus inativados, assim como os peptídeos sintéticos similares às proteínas envoltórias do retrovírus têm propriedades imunossupressoras (Oostendorp et al. 1993 Crit. Rev. Oncol. Hematol. 14. 189-206; Haraguchi et al. 1997 J. Leukocyte Biol 61, 654-666). Mais recentemente, Mangeney et al. (1998. Proc. Natl. Sci. EUA. 95. 14920-14925) mostrou que as células tumorais murinas a partir da linhagem C57BL/6, expressando uma proteína envoltória retroviral, forma tumores quando injetada em ratos de Balb/c (aloenxerto), visto que as mesmas células, que não expressam a proteína envoltória retroviral, são rejeitadas. Para execução de retiradas diferentes na proteína envoltória, um domínio responsável pela função imunossupressora, que foi chamado domínio ISU (para «imunossupressora»), foi identificado.

[0007] O domínio ISU foi primeiramente identificado na metade transmembrana da glicoproteína envoltória. O gene env (envoltório) dos retrovírus codifica um polipeptídeo precursor que é então dividido em duas proteínas: a glicoproteína de superfície (SU) e a subunidade da transmembrana (TM). A proteína SU é responsável pelo reconhecimento e pela ligação ao receptor celular para o vírus. A metade TM é envolvida na fixação do complexo envoltório (SU e TM) para a membrana da célula do alvo, e é diretamente responsável pela fusão da membrana da célula e a entrada do vírus.

[0008] A estrutura da subunidade TM tem sido elucidada para muitos vírus, especial para o vírus da leucemia murina de Moloney (Mo- MuLV), o vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e o vírus da leucemia da célula-T humana tipo 1 (HTLV-1). Uma organização altamente conservada nas proteínas envoltórias também tem sido encontrada em proteínas não- retrovirais, tais como aquelas do vírus influenza e do vírus Ebola.

[0009] Os efeitos imunossupressores também têm sido descobertos em uma outra classe de proteínas, caracterizada nos ERVs, especialmente HERVs (Retroviroses Endógenas Humanas). HERVs compreendem os elementos que são sequências de origem retroviral que tem espalhado no genoma humano, e representam resíduos provirais de infeções ancestrais. Consequentemente, as similaridades fortes podem ser inferidas entre HERVs e retroviroses. Alguns destes elementos HERV são ainda funcionais e podem codificar proteínas ativas, isto é, proteínas semelhantes às virais, embora a maioria delas tenham mutações acumuladas, deleções e/ou mutilações.

[0010] Um papel para estes HERVs funcionais tem sido proposto, incluindo uma proteção contra infeção do retrovírus (Best et al. 1997 Trends Microbiol. 5, 313-318) ou uma proteção do feto contra o sistema imune materno através dos efeitos imunossupressores (Cianciolo et al. 1985 Science 230, 453- 455; Mangeney and Heidmann Proc 1998. Natl. Sci. USA 95. 1492014925). Um HERV codificando uma proteína envoltória tendo propriedades imunossupressoras foi identificado por Mangeney et al. (2001 J. Gen. Virology 82, 2515-2518). Esta publicação relata que a proteína codificada por HERV-H permite que as células expressando envoltórios escapem da resposta imunológica e proliferem, enquanto as mesmas células transfectadas com vetores vazios são normalmente rejeitadas pelo rato enxertado.

[0011] Outros ERVs, especialmente HERVs, codificando as proteínas envoltórias funcionais foram identificados, os quais têm propriedades fusogênicas, isto é, são capazes de formar sincício in vitro (células multinucleadas): elas incluem HERV-FRD e HERV-W (Blond et al. 2000 J. Viral. 74, 3321-3329; Blaise et al. 2003. Proc Natl. Acad. Sci. 22. 1301313018). Além do mais, as experiências in vivo têm mostrado que quando co- expressada com as partículas virais MoMLV deficientes para a produção de sua própria proteína envoltória, a proteína envoltória HERV-W pode formar partículas virais funcionais, capazes de infectar células humanas (Patiente et al. 1998 J. Viral. 72, 2671-2676). Em conclusão, HERV-W tem conservado suas propriedades fusogênicas e de infecciosidade. As propriedades fusogênicas e infecciosas análogas têm sido observadas para HERV-FRD.

[0012] Os efeitos imunossupressores observados podem ser relacionados, dependendo do contexto, por um lado para uma infecção viral virulenta, e por outro lado para uma proliferação ativa das células do tumor, nos mamíferos e particularmente no ser humano. A proliferação ativa das células do tumor e especialmente uma consequência da expressão de proteínas semelhante à viral ERV. Entretanto, visto que mais discernimentos são necessários para entender completamente os mecanismos da imunossupressão, a identificação destas proteínas imunossupressoras abre novas perspectivas para terapêutica, incluindo vacinas, estratégias contra as infecções virais, contra a indução da expressão de retroviroses endógenas, ou contra as suas consequências prejudiciais em um hospedeiro.

[0013] As vacinas usadas atualmente podem especialmente ser classificadas como segue: - vacinas atenuadas vivas (as bactérias ou a vacina do vírus) consistindo em uma patogênese atenuada ou enfraquecida, modificada. Após a administração ao hospedeiro, os organismos patogênicos modificados duplicam no hospedeiro e estimulam uma resposta imunológica. Este tipo de vacina geralmente produz uma imunidade de longa duração após uma administração de dose única, mas pode causar efeitos colaterais, isto é, um caso brando da doença causado pelo referido patógeno, e assim não deve ser dado as pessoas com um sistema imune enfraquecido. - vacinas inativados ou mortas, consistindo no patógeno morto ou inativado, especialmente em consequência dos tratamentos químicos e/ou de calor (organismo inteiro). Tais patogenias tratadas não podem duplicar, e não podem causar a doença que eles normalmente provocam. Consequentemente, eles são seguros e podem ser administrados mesmo aos hospedeiros cujo sistema imune é enfraquecido. Entretanto, eles não são geralmente tão eficazes quanto as vacinas vivas e consequentemente requerem a administração de doses múltiplas. - vacinas consistindo em frações antigênicas de um organismo patogênico, incluindo proteínas inteiras ou determinantes antigênicos delas, especialmente obtidas por tecnologias recombinantes, em consequência da expressão dos genes que codificam o antígeno. A proteína expressada pode ser administrada a um paciente, ou o gene que codifica a proteína pode ser introduzido em um vetor de expressão que é administrado ao hospedeiro. Tais vacinas, entretanto, não são geralmente tão eficazes quanto as vacinas vivas e requerem consequentemente doses múltiplas.

[0014] Os princípios aplicados para a projeção dos compostos adequados para as preparações vacinais capazes de provocar uma resposta imunológica em um hospedeiro, a fim proteger um hospedeiro da infecção devido às patogenias, incluindo os vírus, as bactérias ou outros, foram transpostos à projeção dos compostos adequados para o tratamento de infecções estabelecidas, pela imunoterapia. A eficiência de tais compostos não tem, entretanto, provado ser suficiente o bastante, especialmente no campo de profilaxia ou imunoterapia antiviral ou semelhante a um antiviral. Além disso, o uso dos compostos ainda provoca discussões a respeito da segurança.

[0015] Um inconveniente observado no uso de algumas proteínas envoltórias retrovirais para imunização, como princípios vacinais ou para imunoterapia, encontra-se em suas propriedades imunossupressoras que podem impedir ou afetar a eficiência da resposta imunológica do hospedeiro. Consequentemente, estas proteínas não podem ser administradas a um paciente em sua forma nativa por causa de sua inibição potencial da resposta imunológica. Um desafio grande deveria, portanto, ser suprimir ou modular as propriedades imunossupressoras destas proteínas, sem alterar suas propriedades antigênicas e/ou suas propriedades relacionadas à infecção da célula de hospedeiro. Entretanto, as tentativas para mudar o complexo da proteína envoltória, tem conduzido a uma alteração forte de suas funções de fusão e infecção e consequentemente de seu interesse como o princípio ativo para provocar uma resposta imunológica (Delamarre et al. 1997 J. Viral. 71(1), 259-266; Rosenberg et al. 1999 J. Cell Biol. 145, 57-68).

[0016] Benit et al. (J. of virology, 2001, vol. 75, n 23, o 11709-11719) mostra produtos do gene env de vários ERV. O domínio imunossupressivo CKS17u tem sido mutado a fim de otimizar o referido motivo para reconhecimento de pelo menos um membro do grupo positivo de CKS17.

[0017] US-A-4 822 606 aborda polipeptídeos imunossupressores derivados de retrovírus que exibem propriedades imunomoduladoras e tendo sequências de consenso A-Gin-B-Arg-C-D-E-F-G- H-I-J-K-L-M-NO.

[0018] Uma proposta da presente invenção é identificar determinantes das propriedades imunossupressoras das proteínas, incluindo para identificar sequências de polipeptídeo e resíduos de aminoácido envolvidos na modulação das propriedades imunossupressoras das proteínas, particularmente proteínas virais ou semelhantes às virais, que substancialmente retêm suas propriedades antigênicas das referidas proteínas imunossupressoras.

[0019] Este é um objeto adicional da invenção, identificar tais determinantes das propriedades imunossupressoras da proteína, e usar a mesma para a concepção dos polipeptídeos modificados, isto é, com propriedades imunossupressoras moduladas.

[0020] Outro objeto da presente invenção é proporcionar tais polipeptídeos, que são derivados de uma proteína antigênica e imunossupressora, em que os polipeptídeos são caracterizados pelas propriedades imunossupressoras moduladas ao reter propriedades antigênicas da proteína de partida.

[0021] É também um objeto da presente invenção proporcionar meios para promover uma resposta imunológica eficiente contra organismos patogênicos, especialmente contra vírus, isto é, uma resposta imunológica humoral e/ou mediada por célula que poderia ser protetora contra uma infecção por tal organismo patogênico, especialmente vírus, ou protetora contra seus efeitos prejudiciais no hospedeiro, ou protetora contra as consequências prejudiciais da expressão de retroviroses endógenas em um hospedeiro, com riscos reduzidos de alteração do sistema imune. A invenção também proporciona os meios adequados para tratamento por imunoterapia dos pacientes infectados com organismos patogênicos, incluindo vírus, ou para o tratamento de seus efeitos prejudiciais, incluindo efeitos malignos ou para o tratamento dos pacientes sofrendo de patologias associados com a indução da expressão das viroses endógenas que são normalmente silenciosas nos hospedeiros.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0022] Em um aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo que seja capaz de modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína viral, ou de um fragmento dela, contra o hospedeiro em que ela é expressa quando substitui a sequência homóloga da referida proteína, ou fragmento, referido polipeptídeo tendo a seguinte sequência de aminoácido de consenso: X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 em que, X1 e X2 são selecionados para impactar nas referidas propriedades imunossupressoras, Y representa resíduos variáveis de aminoácido, e 3 e 1 representam o número de resíduos de aminoácido variáveis respectivamente entre X1 e C e entre C e X2.

[0023] A referida sequência de consenso mínima é designada «sequência modulatória-imunossupressora».

[0024] Em uma concretização, os peptídeos que respondem à definição acima, compreendendo uma sequência de imunossupressão-modulatória, são derivados de uma proteína viral, incluindo de uma proteína semelhante à viral, especialmente uma proteína retroviral, em particular, uma proteína envoltória viral ou retroviral ou uma proteína envoltória a partir do retrovírus endógeno, especialmente a partir de um retrovírus endógeno humano (HERV).

[0025] As sequências de aminoácido de diversas proteínas envoltórias dos vírus (incluindo ERV) têm sido descritas na Figura 3 de Benit et al (J Virol. December 2001, p. 11707-11719).

[0026] Pares particulares de resíduos de aminoácido impactando nas propriedades imunossupressoras no contexto de uma determinada proteína, têm sido caracterizados, e consequentemente as sequências tendo propriedades «imunossupressoras-modulatórias» têm sido identificadas e podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em: a) as sequências envolvidas na ocorrência de propriedades imunossupressoras de uma proteína em que elas estão presentes compreendem: E-(Y)3-C-(Y)1-A Q-(Y)3-C-(Y)1-A e b) sequências alterando, por exemplo, a diminuição ou a supressão das propriedades imunossupressoras de uma proteína imunossupressora quando elas estão presentes na mesma, compreendem R-(Y)3-C-(Y)1-F

[0027] Em um outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo derivado de uma determinada proteína antigênica e imunossupressora, o referido polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos (assim chamada sequência imunossupressora-modulatória) representada por X1-(Y)3-C-(Y)1-X2, em que o referido polipeptídeo Y representa resíduos de aminoácido variáveis, 3 e 1 representam o número dos resíduos de aminoácido variáveis Y respectivamente entre X1 e C e entre C e X2, e X1 e X2 são escolhidos para conferir ao referido polipeptídeo propriedades imunossupressoras alteradas com respeito às propriedades imunossupressoras da referida proteína determinada.

[0028] Em uma concretização particular, a proteína tendo propriedades antigênicas e imunossupressoras e codificada por um gene derivado de um vírus, e especialmente por um gene env de um retrovírus.

[0029] Tal proteína compreende uma sequência imunossupressora determinante tendo a seguinte sequência consenso: E/Q-G- G-L/T/I-C-A/K/L/M/V/I-A. A mesma proteína em que resíduos de X1 (E/Q), e opcionalmente X2 (A), são substituídos pode ser desprovida de propriedades imunossupressoras, mas retém suas propriedades antigênicas. Um exemplo de sequência imunossupressora-modulatória modificada é R-G-G-L/T/I-C- A/K/L/M/V/I-F, que altera propriedades imunossupressoras e especialmente pode dar origem a um polipeptídeo não-imunossupressor que contenha a referida sequência. Uma sequência imunossupressora-modulatória modificada particular é selecionada do grupo de: RGGLCAF (SEQ ID NO: 1) RGGLCKF (SEQ ID NO: 2) RGGLCLF (SEQ ID NO: 3) RGGLCMF (SEQ ID NO: 4) RGGLCVF (SEQ ID NO: 5) RGGLCIF (SEQ ID NO: 6) RGGTCAF (SEQ ID NO: 7) RGGTCKF (SEQ ID NO: 8) RGGTCMF (SEQ ID NO: 9) RGGTCIF (SEQ ID NO: 10) RGGICAF (SEQ ID NO: 11) RGGICKF (SEQ ID NO: 12) RGGICLF (SEQ ID NO: 13) RGGICMF (SEQ ID NO: 14) RGGICVF (SEQ ID NO: 15) RGGICIF (SEQ ID NO: 16)

[0030] Em uma concretização particular, a proteína tem ainda propriedades infecciosas e/ou de fusão. A modificação da sequência imunossupressora-modulatória, por exemplo, pela substituição de resíduos do aminoácido X1, e opcionalmente X2, pode ser vantajosamente realizada em uma maneira que nao afete uma destas ou ambas as propriedades suplementares.

[0031] Em um outro aspecto, a invenção se refere a composições compreendendo tais polipeptídeos ou partículas virais recombinantes expressando estes polipeptídeos. Tais composições ou partículas podem ser usadas na prevenção ou no tratamento de uma infecção viral incluindo a prevenção ou o tratamento de seus efeitos prejudiciais, ou para a prevenção ou o tratamento das consequências da expressão de um vírus endógeno em um hospedeiro, especialmente um HERV, pela evocação de uma resposta imunológica no hospedeiro em que elas são injetadas. Elas também podem ser usadas na preparação de vírus atenuados.

[0032] Em um outro aspecto, a invenção se refere aos métodos para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína pela modificação da composição do aminoácido da sequênciaimunossupressora-modulatória.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1: Representação esquemática dos vetores contendo o ácido nucleico env de MoMLV ou de seus polipeptídeos derivados.

[0033] Os ácidos nucleicos contidos nestes vetores codificam a proteína envoltória do tipo selvagem de MoMLV (envMoMLV) ou seus polipeptídeos derivados da invenção por substituições dos códons codificando X1 e/ou X2. Figura 1A representa o vetor phCMV-envMoMLV. Figura 1B representa o vetor pDFG-envMoMLV-iresHigro.

Figura 2: Representação esquemática dos vetores contendo o ácido nucleico env de MPMV ou de seus polipeptídeos derivados.

[0034] Os ácidos nucleicos contidos nestes vetores codificam a proteína envoltória do tipo selvagem de MPMV (envMPMV) ou seus polipeptídeos derivados da invenção por substituições dos códons codificando X1 e/ou X2. Figura 2A representa o vetor phCMV-envMPMV. Figura 2B representa o vetor pDFG-envMPMV-iresHigro.

Figura 3: Representação esquemática dos vetores contendo o ácido nucleico HERV-M de HERV-W ou seus polipeptídeos derivados.

[0035] Os ácidos nucleicos contidos nestes vetores codificam a proteína W envoltória tipo selvagem (envW) ou seus polipeptídeos derivados da invenção por substituições dos códons codificando X1 e/ou X2. Figura 3A representa o vetor phCMV-envW. Figura 3B representa o vetor pDFG-envW-iresHigro.

Figura 4: Representação esquemática da análise de fusão célula-célula.

[0036] O vetor usado compreende o ácido nucleico codificando uma proteína envoltória de interesse (subunidades SU e TM), um promotor CMV e um elemento nucleotídico poli A (pA).

Figura 5: Representação esquemática do estabelecimento do envoltório expressando células dos tumores e análise in vivo.

[0037] O vetor usado compreende o ácido nucleico codificando uma proteína envoltória de interesse (env), o gene higromicina (higro) e um IRES (local interno de entrada do ribossomo - Internal Ribosome Entry Site). As caixas brancas representam LTRs e a seta indica o início da transcrição.

Figura 6: Resultados da análise da propriedade infecciosa.

[0038] Os números 1 a 12 se referem as linhas usadas no presente pedido. Este diagrama apresenta os resultados da infecção para proteínas envoltórias do tipo-selvagem (wt) ou do mutante de acordo com a invenção.

Figura 7: Resultados da análise da propriedade imunossupressora.

[0039] O diagrama apresenta os resultados da análise da propriedade imunossupressora das células MCA205 que expressam o envoltório quando injetadas em ratos alogênicos balb/c. Em inserção, resultados das células MCA205 que expressam a proteína envoltória injetada nos ratos C57B1/6 singênicos. As barras preenchidas representam a proteína envoltória HERV-W, as barras brancas representam a proteína envoltória MPMV e as barras sombreadas representam a proteína envoltória do duplo- mutante (R44Q+F50A) HERV-W.

Figura 8: Delineação estrutural da subunidade TM da proteína HERV-W ENV.

[0040] Esta delineação estrutural mostra a posição dos resíduos de aminoácido da Arginina (X1) e da Fenilalanina (X2) da sequência imunossupressora-modulatória, bem como os dois resíduos de aminoácido (Alanina e Treonina) não envolvidos em tais propriedades.

Figura 9: Exemplos da sequência imunossupressora- modulatória de viroses diferentes e de HERVs.

[0041] A primeira coluna indica os nomes comuns dos vírus ou dos HERVs, a segunda coluna indica a origem dos vírus ou dos HERVs, a terceira coluna indica que as sequências nucleotídica das sequências imunossupressoras-modulatórias identificadas (uma letra do aminoácido usado) e a última coluna indica o número de acesso (Accession Number) da proteína envoltória. Os resíduos de aminoácido X1 e X2 estão em realce.

Figura 10: Sequências de nucleotídeo e de aminoácido das proteínas envoltórias do tipo selvagem.

[0042] Nas sequências de aminoácido, as posições X1 e X2 foram sublinhadas.

[0043] A e B representam as sequências do nucleotídeo e da proteína da proteína envoltória de MoMLV, C e D representam as sequências do nucleotídeo e da proteína da proteína envoltória de MPMV e E e F representam as sequências do nucleotídeo e da proteína da proteína envoltória de HERV-W (envW).

[0044] As sequências do nucleotídeo (A, C e E) são as sequências de codificação das proteínas envoltórias, com o primeiro códon (ATG) sendo o primeiro códon da transcrição e o último códon (TAG) sendo o códon de terminação.

[0045] Para as sequências de proteína (B, D e F), a primeira letra do código do aminoácido é usada. O primeiro M representa a primeira metionina da proteína, e o símbolo « * » representa o códon de terminação.

Figura 11A, Figura 11B e Figura. 11C: Propriedades in vitro da proteína envoltória FV imunossupressora-refrativa.

[0046] Figura 11A, infectividade da proteína envoltória do tipo selvagem FV (wt), proteína envoltória mutante E14R, proteína envoltória mutante A20F, e proteína envoltória duplo-mutante (DM) E14R+A20F como expressado na superfície de pseudotipos virais MLV, usando células NIH 3T3 como um alvo. O eixo central vertical representa a infectividade (ffu/ml). Figura 11B, atividade imunossupressoras in vivo (eixo horizontal, índice de imunossupressão) do tipo selvagem (wt) e da proteína envoltória FV do duplo- mutante (DM). Figura 11C, comparação das taxas da propagação in vitro do tipo selvagem (círculos pretos) e vírions FV imunossupressores-defeituosos (círculos cinza), usando células NIH 3T3 como um alvo. A carga viral de sobrenadantes da célula (eixo vertical, cópia de RNA número/mL) é analisada por RT-PCR quantitativo. O eixo horizontal representa o número dos dias após a infecção. Os círculos brancos representam um controle.

Figura 12A e Figura 12B: Efeitos in vivo da perda da imunossupressão conduzida pelo envoltório na infecção de FV.

[0047] Cargas virais do soro (eixo vertical, cópia do RNA números/mL) de ratos suíços irradiados (Figura 12A) e nao-irradiados (Figura 12B) após a injeção do mutante do tipo selvagem FV (círculos pretos) ou do mutante não-imunossupressivo FV (círculos cinza). O sinal para ratos PBS-injetados estava abaixo da detecção do ponto inicial (círculos brancos). A eixo horizontal representa os dias após injeção.

Figura 13: Detecção imunológica de FV em ratos infectados.

[0048] lgGs dirigidos contra a subunidade de SU da proteína envoltória de FV foram quantificados (eixo vertical, unidades arbitrárias) nos soros dos ratos injetados com o tipo selvagem FV (círculos e linha pretos), o mutante não-imunossupressor FV (círculos e linha cinza) ou PBS (círculos brancos e linhas pontilhadas). As linhas representam os meios geométricos dos níveis de IgG. O eixo horizontal representa os dias após a injeção.

Figura 14A e Figura 14B: Antigenicidade das proteínas envoltórias FV mutantes não-imunossupressoras e do tipo selvagem.

[0049] Figura 14A, lgMs e lgGs dirigidos contra a subunidade de TM da proteína envoltória de FV foram quantificadas nos soros dos ratos injetados com subunidades TM recombinantes da proteína envoltória FV (esquerda) ou partículas virais FV inativadas por UV (direita). Preto: tipo selvagem FV; cinza: mutante FV não-imunossupressor; branco: adjuvante somente. ± significa desvio padrão de 5 (esquerda) ou 14 (direita) de ratos suíços. O eixo vertical representa o sinal anti-TM ELISA nas unidades arbitrárias (a.u.). Figura 14B, mesmo como na Figura 14A com os ratos injetados com o tipo selvagem (wt) ou subunidades TM recombinantes de duplo mutante (dm) de MoMLV (esquerda) e HERV-W ENV (direita) como descrito no Exemplo 1. O eixo vertical representa o nível de IgG em ng/mL.

Figura 15: Análises de vacinação.

[0050] Figura 15 representa a carga viral (eixo vertical, soro do RNA cópias/mL) dos ratos imunizados com Virus Friend (FV) duplo-mutante não imunossupressivo ou do tipo selvagem inativados por UV, com o Virus Friend (FV) duplo mutante não imunossupressivo intacto, ou com o adjuvante CpG somente, e provocados com o tipo selvagem FV. A imunização foi realizada no dia 1, no dia 7 e no dia 14 antes da mudança no dia 21, e as cargas virais correspondentes são representadas como pontos cinza. 5 as cargas viral 5 dias pós mudança são representadas como pontos pretos. O ponto inicial da detecção é representado como uma linha horizontal a 2.103 cópias/mL de RNA. No alto do gráfico é indicado o número e a porcentagem dos ratos que têm uma carga viral abaixo do nível de detecção em 5 dias pós mudança. As barras horizontais representam os meios geométricos das cargas virais.

Figure 16A, Figura 16B e Figura 16C: Procedimento de abatimento e racionalização da análise.

[0051] A figura 16A representa o procedimento para abater a expressão ERV, um vetor derivado-plncx foi construído empregando o vetor pSUPER para gerar, sob o controle do promotor H1-RNA, transcritos curtos de fita dupla para interferência de RNA. As células B16 foram transformadas com estes vetores da expressão, submetidos a seleção G418, e as células resultantes ERVKD e de controle B16 foram injetadas subcutaneamente no flanco dos ratos, cujo crescimento do tumor foi monitorado. Figura 16B, estrutura preferida do dsRNA gerado pelos vetores ERV e de controle (gfp); os números se referem às posições nt dentro das sequências alvejadas respectivas (ver Métodos). Figura 16C, análise de Western blot da expressão de Gag (anti-Gag) e de Env (anti-Env) no sobrenadante do ERV-abatido (ERVKD) e em células de controle. Os pesos moleculares são representados em ambos os lados da Figura.

Figura 17A e Figura 17B: Células abatidas tendo conservado um fenótipo transformado.

[0052] Figura 17A, análise in vitro do fenótipo transformado usando a análise do ágar macio. Painel esquerdo, células ERVKD (placas direitas) e controle B16 (placas esquerdas) (2x103 ou 2x104) foram blindadas em uma camada semi-sólida por 4 semanas, e então colônias foram numeradas (painel direito). Figura 17B, ensaio para o fenótipo transformado in vivo usando ratos imuno-incompetentes. Células ERVKD e do controle B16 (2x105) foram injetadas subcutaneamente no flanco de ratos X-irradiados (5 Gy) C57BI/6 (painel esquerdo) ou SCID (painel direito) (experimentos independentes 2-5 com 5 ratos por grupo) e o crescimento do tumor foi determinado medindo a área tumoral (eixo vertical, mm2) em função do tempo (eixo horizontal, dias pós injeção).

Figura 18A, Figura 18B e Figura 18C: Inibição do crescimento da célula do tumor e da sobrevivência aumentada do rato após abatimento de ERV.

[0053] Figura 18A, crescimento da célula do tumor do controle (pontos pretos) e das células ERVKD B16 (pontos brancos) enxertadas nos ratos imunocompetentes C57B1/6 (22 ratos por grupo; mesmas condições experimentais que na Figura 17B). A área do tumor (eixo vertical, mm2) é medida como uma função do tempo (eixo horizontal, dias pós injeção). Figura 18B, porcentagem dos sobreviventes (eixo vertical) dentre os ratos enxertados (10 ratos por grupo) com as células de controle (pontos pretos) e ERVKD B16 (pontos brancos), em função do tempo (eixo horizontal, dias pós injeção). Figura 18C, porcentagem dos sobreviventes (eixo vertical) dentre os ratos enxertados (10 ratos por grupo) com as células transduzidas MelARV env - ERVKD B16 (pontos cinzentos) e com ERVKD B16 (pontos brancos), em função do tempo (eixo horizontal, dias pós injeção).

Figura 19: Imunomanchamento para a detecção da proteína envoltória ERV.

[0054] Células de controle, ERVKD, e ERVKD+env B16 foram marcadas com o anticorpo 9B6 (dirigido contra a proteína envoltória MelARV; doação de E. Gorelik, Cancer Res 1988;48:4954-4958) revelado por um anticorpo de cabra FITC anti-rato (Caltag, Burlingame, USA). A análise de citometria de fluxo foi realizada usando um citômetro Facscalibur. O número das contagens (eixo vertical) é representado como uma função da expressão envoltória ERV (eixo horizontal).

Figura 20A e Figura 20B: Administração sistêmica in vivo do siRNA reduz a progressão da célula do tumor.

[0055] O siRNA sintético visado para as sequências 19 nt ERV (pontos brancos) e de controle (gfp) (pontos pretos) referidas na Figura 16B foi comprado de MWG Biotech. Eles foram injetados intraperitoneamente (3 μg de siRNA em 50 μl de PBS), no dia 12 após o enxerto prévio de 2x105 células B16 no flanco direito dos ratos. Figura 20A, a área do tumor (eixo vertical, mm2) é medida em função do tempo (eixo horizontal, dias pós injeção do tumor), a injeção de siRNA é representada como uma seta. Figura 20B, a porcentagem dos sobreviventes (eixo vertical) foi monitorada (5 ratos por grupo em duas experiências independentes) em função do tempo (eixo horizontal, dias pós injeção do tumor).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0056] A presente invenção proporciona um polipeptídeo tendo uma sequência de 7 a 20 resíduos de aminoácido, que seja capaz de modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína viral, ou de um fragmento dela, contra o hospedeiro em que ela é expressa quando ela substitui a sequência homóloga da referida proteína viral, ou fragmento, o referido polipeptídeo compreendendo a seguinte sequência de aminoácido consenso mínima: X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 em que, X1 e X2 são selecionados para impactar nas referidas propriedades imunossupressoras, Y representa resíduos de aminoácido variáveis, e 3 e 1 representam o número dos resíduos Y do aminoácido variáveis, respectivamente entre X1 e C e entre C e X2.

[0057] A presente invenção proporciona um polipeptídeo tendo uma sequência de 7 a 20 resíduos de aminoácido codificada por um ácido nucleico, derivado de um gene viral, que é capaz de modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína viral, ou um fragmento dela, contra o hospedeiro em que ela é expressa (sequência imunossupressora- modulatória) quando ela substitui a sequência homóloga da referida proteína viral, o referido polipeptídeo compreendendo a seguinte sequência consenso mínima: X1Y9Y10Y11CY12X2 em que X1 e X2 são selecionados para impactar nas referidas propriedades imunossupressoras, tais como: - X1 é E, K ou Q, e X2 é tal que garante que a estrutura da proteína viral seja conservada, ou - X1 é E, K ou Q e X2 é A, ou - X1 é W e X2 é I ou V, ou - X1 é R, H ou K, X2 é tal que garante que a estrutura da proteína viral seja conservada, ou - X1 é R, H ou K e X2 é F, W, Y ou H, ou - X1 é F, W, Y ou H e X2 é R, H ou K E Y9 a Y12 representa resíduos de aminoácidos variáveis.

[0058] Em todas as sequências da presente invenção, o código de uma letra do aminoácido é usado. X e Y são usados para designar os resíduos de aminoácido variáveis, X sendo determinado para influenciar as propriedades imunossupressoras de uma proteína determinada.

[0059] Y representa os resíduos de aminoácido que podem variar para polipeptídeos diferentes e dentro de um polipeptídeo determinado. « (Y)3 » indica que 3 resíduos de aminoácido estão presentes entre os resíduos X1 e o resíduo da cisteína (C). Os 3 resíduos de aminoácido podem ser diferentes ou idênticos e podem ser selecionados de forma independente um do outro. A indicação de um resíduo particular de aminoácido em uma sequência, como a cisteína na sequência acima, significa que este resíduo de aminoácido e invariante, isto é, tem uma posição constante na referida sequência.

[0060] Opcionalmente, a sequência consenso pode também ser notada como segue: X1Y9Y10Y11CY12X2 em que X1 representa X1, X2 representa X2, e Y9 a Y12 representa qualquer aminoácido. Como pretendido aqui os aminoácidos Y9 a Y12 são idênticos ou diferentes.

[0061] Na presente invenção, as expressões « vírus » ou « viral » se aplicam a viroses exógenas ou endógenas ou seus compostos, a menos que de outra maneira estabelecido. Consequentemente, « proteína viral» abrange «proteínas semelhantes às virais», as quais podem também ser referidas quando descrevem os produtos de expressão das viroses endógenas, especialmente ERV, em HERV particular.

[0062] A sequência consenso acima do polipeptídeo de acordo com a invenção é chamada «sequência imunossupressora- modulatória» significando que, quando ela está presente no polipeptídeo tendo 7 a 20 resíduos de aminoácido, os polipeptídeos podem ser usados para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína que tenha sido identificada como portadora de tais propriedades imunossupressoras ou, como necessitando de tais propriedades apesar do fato que é compreendido um motivo peptídico tendo uma sequência X1-(Y)3-C-(Y)1-X2.

[0063] Mais especialmente, X representa ambos os resíduos do aminoácido (X1 e X2) diretamente envolvidos, individualmente ou juntos, na modulação das propriedades imunossupressoras de uma proteína compreendendo a sequência de consenso acima. Elas são respectivamente localizadas nas extremidades N-terminal e C-terminal do polipeptídeo mínimo tendo 7 resíduos de aminoácido.

[0064] Uma proteína é referida para ter propriedades imunossupressoras, quando esta proteína, expressada em células do tumor enxertado em um hospedeiro que poderia normalmente ser rejeitado pelo referido hospedeiro, pelo contrário permite que estas células do tumor proliferem e escapem da rejeição imunológica pelo hospedeiro.

[0065] Um procedimento in vivo para analisar a atividade imunossupressoras de uma proteína, que é usada por Mangeney M. e Heidmann T., 1998 PNAS, ou por Blaise et al. 2001, representado na Figura 5. Um ácido nucleico do tipo selvagem ou modificado expressando a proteína a ser testada e transfectado em linhagens de célula do tumor tais como MCA 205 ou em linhagens da célula C18.1 por métodos de transfecção conhecidos. As células do tumor expressando a proteína a ser testada são, então, especialmente injetadas por injeção subcutânea (s.c.) em um hospedeiro, geralmente ratos. Depois da referida injeção, o estabelecimento do tumor ou, pelo contrário, sua rejeição, é determinado e a área do tumor é medida. Análises in vitro poderiam ser realizadas usando doses elevados de peptídeos sintéticos, mas eles são indiretos e menos convincentes, uma vez que a expressão «imunossupressoras» é relevante quando aplicada aos animais que possuem um sistema imune completo e não a linhagen de célula.

[0066] A expressão «ácido nucleico modificado» como usada aqui se refere a qualquer alteração genética, tal como substituição, deleção ou inserção de nucleotídeo que muda a composição do aminoácido do polipeptídeo ou da proteína codificada. Assim, uma sequência do aminoácido pode substituir, isto é, repor uma sequência homóloga presente na proteína original.

[0067] O termo «sequência homóloga» na proteína que é testada para a modulação de suas propriedades imunossupressoras se refere a uma sequência tendo a mesma sequência do aminoácido que aquela que a repõe (isto é, a substitui) para a análise, isto é, X1-(Y)3-C-(Y)1-X2, exceto para os resíduos X1 e X2; pelo menos um dos quais, e possivelmente ambos, são selecionados para ser diferente de seus resíduos de aminoácido correspondentes na sequência original. Assim, os resíduos de aminoácido Y são conservados entre a sequência homóloga da proteína a ser modificada e a sequência do polipeptídeo tendo 7-20 resíduos de aminoácido como definido acima.

[0068] Tais sequências homólogas são reveladas na Figura 9 para vários vírus e são ilustradas no contexto da subunidade TM de vários envoltórios para vários vírus em Benit L. et al. (J. Viral. Vol. 75. No. 23, dezembro 2001, p. 11709- 11719) na Figura 3.

[0069] Os resíduos de aminoácido X1 e X2 são escolhidos para modular as propriedades imunossupressoras da proteína viral original. O termo «modular» como usado aqui se refere a um aumento ou a uma diminuição da atividade imunossupressora da proteína modificada com relação à atividade imunossupressora (isto é, não modificada) da proteína original, quando testada nas mesmas condições.

[0070] A invenção especialmente se refere a uma «sequência imunossupressora-modulatória» que permite uma diminuição nas propriedades imunossupressoras da proteína modificada com relação à proteína originalmente imunossupressora. A modulação é preferivelmente significante, significando que a resposta imunológica do hospedeiro se toma detectável, e vantajosamente torna-se suficiente para eliminar o agente patogênico ou torna-se suficiente para estabilizar ou inverter as consequências prejudiciais da infecção pelo referido patógeno em um hospedeiro ou da expressão de vírus endógeno, especialmente de ERV normalmente silencioso, especialmente HERV, em um hospedeiro.

[0071] Em uma concretização particular, a modulação resulta em diminuir as propriedades imunossupressoras da proteína original.

[0072] Em uma concretização particular ela corresponde pelo menos a uma diminuição de duas vezes das propriedades imunossupressoras da proteína original, na modificada, isto é, proteína derivada.

[0073] O polipeptídeo acima definido da invenção, tendo de 7 a 20 resíduos do aminoácido e compreendendo a sequência X1-(Y)3-C-(Y)1- X2, é tal que X1 e/ou X2 são selecionados para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína e consequentemente: em uma concretização particular da invenção, X1 é um resíduo de aminoácido alcalino e X2 é um resíduo aromático ou um vice versa.

[0074] Como pretendido aqui «alcalino» se refere aos aminoácidos básicos.

[0075] Em uma outra concretização particular da invenção, X1 é um resíduo alcalino ou X2 é um resíduo aromático ou vice versa.

[0076] Os inventores observaram que o efeito da modulação de X1 e de X2 nas proteínas imunossupressoras é inferior quando somente um dos resíduos X1 ou X2 é modificado em uma proteína imunossupressoras original.

[0077] Consequentemente, a modificação de ambos X1 e de X2 em uma sequência imunossupressora-modulatória pode ser considerada como vantajosa.

[0078] Em uma outra concretização particular da invenção, os resíduos X1 ou X2 localizados na sequência de aminoácido representada como X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 são selecionados como segue: onde X1 é escolhido dentre R, H e K, X2 é escolhido dentre F, W, Y e H ou onde X1 é escolhido entre F, W, Y e H, X2 e escolhido dentre R, H e K.

[0079] Em uma concretização adicional da invenção, X1 é R, H ou K e X2 é F, ou vice versa.

[0080] Em uma concretização adicional da invenção, X1 é R e X2 é F, W, Y ou H.

[0081] Em uma outra concretização adicional da invenção X1 e X2 são selecionados a partir do grupo consistindo em: a. X1 é E, K ou Q e X2 é A b. X1 é W e X2 é I ou V c. X1 é R e X2 é F d. X1 é K e X2 é F

[0082] Os inventores identificaram os efeitos dos resíduos X1 e X2 particulares, em uma sequência imunossupressora-modulatória na modulação das propriedades imunossupressoras de uma proteína envoltória viral.

[0083] Suas observações possibilitam considerar que, quando X1 é o ácido glutâmico (E) ou a glutamina (Q) e X2 pode ser a alanina (A), a proteína envoltória viral resultante compreendendo a sequência consenso da invenção abriga propriedades imunossupressoras. Pelo contrário, quando X1 é a arginina (R) e X2 é a fenilalanina (F), a proteína envoltória viral resultante tendo a sequência consenso da invenção tem pouca ou nenhuma propriedade imunossupressora. Interessantemente, considerando que as interações van der Waals são pensadas no par E/A, uma interação eletrostática pode ocorrer no par R/F, entre a cadeia lateral positivamente carregada da Arginina e os pi-elétrons (polo negativo) da Fenilalanina.

[0084] Consequentemente, em uma concretização particular da invenção, o polipeptídeo tendo de 7 a 20 resíduos de aminoácido nao tem uma sequência imunossupressora-modulatória X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 adequada para conferir pouca ou nenhuma propriedade imunossupressora a uma proteína, em que X1 é R e/ou X2 é F.

[0085] Em uma outra concretização, X1 é K e X2 é F para conferir pouca ou nenhuma propriedade imunossupressora a uma proteína. Em particular, tal proteína tem baixas propriedades imunossupressoras.

[0086] Deve ser recordado que as propriedades imunossupressoras são analisadas em um teste como definido acima e ilustradas nos Exemplos.

[0087] A sequência consenso, X1-(Y)3-C-(Y)1-X2, pode ser identificada em proteínas virais e especialmente em proteínas envoltórias virais. As proteínas envoltórias particulares são aquelas dos retrovírus que compreendem duas subunidades: as subunidades SU e TM. Tais sequências consenso foram encontradas em MoMLV, retrovírus Friend, FeLV, HTLV-1, HTLV-2, STLV-1, GLV-X, viroses Pox, MPMV ou SSAV, ou em viroses Ebola ou Marburg ou em retroviroses endógenas tais como FRD, PyERV, PERV ou HERV-T.

[0088] Os resíduos do aminoácido Y assim identificados em várias proteínas permitem determinar sequências particulares da invenção tais como E/Q-G-G-L/T/I-C-A/K/L/M/V/I-A ou R-G-G-L/T/I-C-A/K/L/M/V/I-F. O símbolo «/» indica que esta posição da sequência aceita vários tipos de resíduos do aminoácido de acordo com as indicações que são proporcionadas.

[0089] Consequentemente, o polipeptídeo acima definido da invenção compreende, em uma concretização particular, uma sequência mínima que possa ser selecionada a partir do grupo consistindo em: QGGLCKA (SEQ ID NO: 17) QGGLCAA (SEQ ID NO: 18) QGGLCLA (SEQ ID NO: 19) QGGICLA (SEQ ID NO: 20) EGGLCAA (SEQ ID NO: 21) EGGLCVA (SEQ ID NO: 22), em que estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionam propriedades imunossupressoras a uma proteína que as compreende, ou RGGTCLF (SEQ ID NO: 23) KGGTCMF (SEQ ID NO: 24) KGRTCLF (SEQ ID NO: 25) KGGLCIF (SEQ ID NO: 26) RGGLCKF (SEQ ID NO: 27) RGGLCAF (SEQ ID NO: 28) RGGLCLF (SEQ ID NO: 29) RGGICLF (SEQ ID NO: 30) RGGLCVF (SEQ ID NO: 31) RGGTCVF (SEQ ID NO: 32), estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionando pouca ou nenhuma propriedade imunossupressora a uma proteína que as compreende.

[0090] Mais particularmente, o polipeptídeo acima definido da invenção compreende, em uma outra concretização, uma sequência mínima que possa ser selecionada a partir do grupo consistindo em: QGGLCKA (SEQ ID NO: 17) QGGLCAA (SEQ ID NO: 18) QGGLCLA (SEQ ID NO: 19) QGGICLA (SEQ ID NO: 20) EGGLCAA (SEQ ID NO: 21) EGGLCVA (SEQ ID NO: 22), em que estas sequências propriedades imunossupressoras-modulatórias proporcionam propriedades imunossupressoras a uma proteína que as compreende, ou KGGTCMF (SEQ ID NO: 24) KGRTCLF (SEQ ID NO: 25) KGGLCIF (SEQ ID NO: 26), em que estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionam pouca propriedade imunossupressora a uma proteína que as compreende, ou RGGTCLF (SEQ ID NO: 23) RGGLCKF (SEQ ID NO: 27) RGGLCAF (SEQ ID NO: 28) RGGLCLF (SEQ ID NO: 29) RGGICLF (SEQ ID NO: 30) RGGLCVF (SEQ ID NO: 31) RGGTCVF (SEQ ID NO: 32), estas sequências imunossupressoras-modulatória proporcionando essencialmente nenhuma propriedade imunossupressora a uma proteína que a compreende.

[0091] Como pretendido aqui, «as propriedades imunossupressoras baixas» relacionam-se a um polipeptídeo que proporcione baixas propriedades imunossupressoras a uma proteína que a compreende do que os polipeptídeos representados pelo SEQ ID NO: 17 a 22, mas proporcionam propriedades imunossupressoras mais elevadas a uma proteína que a compreende do que os polipeptídeos representados pelo SEQ ID NO: 23 a 27 a 32. Em particular, uma proteína compreendendo um polipeptídeo que proporcione propriedades imunossupressoras baixas e menos imunossupressor do que um mutante duplo HERV-W ENV R393Q F399A, tal como representado pelo SEQ ID NO: 118. Mais particularmente, o índice imunossupressor de uma proteína compreendendo um polipeptídeo que proporciona propriedades imunossupressoras baixas é positivo, mas menor que o índice imunossupressor do referido mutante duplo HERV-W ENV R393Q F399A, e preferivelmente menor que 50% do índice imunossupressor do referido duplo-mutante HERV-W ENV R393Q F399A.

[0092] Todos os polipeptídeos da invenção são codificados pelos ácidos nucleicos que podem ser obtidos por todos os métodos conhecidos para possibilitar a expressão dos polipeptídeos em células do hospedeiro, especialmente em células procarióticas ou eucarióticas. Como exemplo, os ácidos nucleicos podem ser isolados a partir das amostras expressando vírus, usando sondas adequadas e técnica de amplificação. Eles podem também ser quimicamente sintetizados ou obtidos pela digestão enzimática de plasmídeos existentes ou dos plasmídeos da invenção.

[0093] Além disso, os polipeptídeos da invenção também podem ser quimicamente sintetizados ou semi-sintetizados de acordo com procedimentos bem estabelecidos.

[0094] Um polipeptídeo particular de 20 aminoácidos tem a seguinte sequência consenso: (Y)13-X1-(Y)3-C-(Y)1-X2,

[0095] Como explicado acima, X1 e X2 são selecionados para impactar nas propriedades imunossupressoras de um teste, isto é, de uma proteína imunossupressoras viral original, em que o polipeptídeo é inserido, incluindo por substituição dos resíduos X1 e X2 em uma sequência homóloga como definido acima, em que Y representa resíduos do aminoácido variáveis, 3 e 1 representam o número de resíduos do aminoácido Y variáveis respectivamente entre X1 e C e entre C e X2, e 13 representam o número de resíduos do aminoácido na parte N-terminal do polipeptídeo. Os resíduos Y podem independentemente ser idênticos ou diferentes na sequência.

[0096] A identificação de resíduos do aminoácido invariantes em várias sequências da proteína permite definir uma sequência particular: (Y)2-N-(Y)3-L-(Y)2-L-(Y)3-X1-(Y)3-C-(Y)1-X2, isto é, a partir da extremidade N-terminal para a extremidade C-terminal: dois resíduos do aminoácido variáveis, uma asparagina (N), três resíduos do aminoácido variáveis, uma leucina (L), dois resíduos do aminoácido variáveis, uma leucina (L), três resíduos do aminoácido variáveis, o resíduo X1, três resíduos do aminoácido variáveis, uma cisteína (C), um resíduo do aminoácido variável e o resíduo X2.

[0097] Opcionalmente, a sequência consenso acima pode ser notada como segue:Y13Y14NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2 em que X1 e X2 são respectivamente idênticos a X1 e X2, e Y1 a Y14 representa qualquer aminoácido. Como pretendido aqui, os aminoácidos Y1 a Y14 podem ser idênticos ou diferentes.

[0098] A sequência de aminoácido particular apresentando capacidade para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína imunossupressora viral no teste acima descrito, pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em: AQNRRGLDLLFWEQGGLCKA (SEQ ID NO: 33) LQNCRCLDLLFLSQGGLCAA (SEQ ID NO: 34) LQNRRGLDMLTAAQGGLCLA (SEQ ID NO: 35) LQNRRGLDLLTAEQGGICLA (SEQ ID NO: 36) LQNRRGLDILFLQEGGLCAA (SEQ ID NO: 37) LQNRRGLDLLFLKEGGLCAA (SEQ ID NO: 38) LQNRRGLDLLFLKEGGLCVA (SEQ ID NO: 39), em que estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionam propriedades imunossupressoras a uma proteína que as compreende, ou LQNRRALDLLTAERGGTCLF (SEQ ID NO: 40) LQNWRALDLLTAKRGGTCLF (SEQ ID NO: 41) LQNWRALDLLIAKRGGTCVF (SEQ ID NO: 42) LQNRRGLDLLTAERGGTCLF (SEQ ID NO: 43) LQNRRALDLLTAERGGICLF (SEQ ID NO: 44) LQNRRGLDLLTAEKGGLCIF (SEQ ID NO: 45) MQNRRALDLLTADKGGTCMF (SEQ ID NO: 46) AQNRQALDLLMAEKGRTCLF (SEQ ID NO: 47) AQNRRGLDLLFWERGGLCKF (SEQ ID NO: 48) LQNCRCLDLLFLSRGGLCAF (SEQ ID NO: 49) LQNRRGLDMLTAARGGLCLF (SEQ ID NO: 50) LQNRRGLDLLTAERGGICLF (SEQ ID NO: 51) LQNRRGLDILFLQRGGLCAF (SEQ ID NO: 52) LQNRRGLDLLFLKRGGLCAF (SEQ ID NO: 53) LQNRRGLDLLFLKRGGLCVF (SEQ ID NO: 54), estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionando pouca ou nenhuma propriedade imunossupressora a uma proteína que as compreende.

[0099] De acordo com uma concretização preferida, as sequências do aminoácido particulares apresentando capacidade para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína imunossupressora viral no teste descrito acima, podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em: AQNRRGLDLLFWEQGGLCKA (SEQ ID NO: 33) LQNCRCLDLLFLSQGGLCAA (SEQ ID NO: 34) LQNRRGLDMLTAAQGGLCLA (SEQ ID NO: 35) LQNRRGLDLLTAEQGGICLA (SEQ ID NO: 36) LQNRRGLDILFLQEGGLCAA (SEQ ID NO: 37) LQNRRGLDLLFLKEGGLCAA (SEQ ID NO: 38) LQNRRGLDLLFLKEGGLCVA (SEQ ID NO: 39), em que estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionam propriedades imunossupressoras a uma proteína que as compreende, ou LQNRRGLDLLTAEKGGLCIF (SEQ ID NO: 45) MQNRRALDLLTADKGGTCMF (SEQ ID NO: 46) AQNRQALDLLMAEKGRTCLF (SEQ ID NO: 47), em que estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionam propriedades imunossupressoras baixas a uma proteína que as compreende, ou LQNRRALDLLTAERGGTCLF (SEQ ID NO: 40) LQNWRALDLLTAKRGGTCLF (SEQ ID NO: 41) LQNWRALDLLIAKRGGTCVF (SEQ ID NO: 42) LQNRRGLDLLTAERGGTCLF (SEQ ID NO: 43) LQNRRALDLLTAERGGICLF (SEQ ID NO: 44) AQNRRGLDLLFWERGGLCKF (SEQ ID NO: 48) LQNCRCLDLLFLSRGGLCAF (SEQ ID NO: 49) LQNRRGLDMLTAARGGLCLF (SEQ ID NO: 50) LQNRRGLDLLTAERGGICLF (SEQ ID NO: 51) LQNRRGLDILFLQRGGLCAF (SEQ ID NO: 52) LQNRRGLDLLFLKRGGLCAF (SEQ ID NO: 53) LQNRRGLDLLFLKRGGLCVF (SEQ ID NO: 54), estas sequências imunossupressoras-modulatórias proporcionando essencialmente nenhuma propriedade imunossupressora a uma proteína que as compreende.

[0100] A presente invenção também se refere ao uso de uma primeira mutação de um primeiro aminoácido e opcionalmente de uma segunda mutação de um segundo aminoácido em uma proteína envoltória (ENV) viral tipo selvagem compreendendo essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2 em que o primeiro aminoácido a ser mudado é X1 e o segundo aminoácido a ser mudado é X2, e Y1 a Y12 representa qualquer aminoácido, para manufaturar uma proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora modificada com relação a referida proteína ENV tipo selvagem.

[0101] A expressão «proteína envoltória viral tipo selvagem» se refere a uma proteína envoltória em que o aminoácido X1 não foi mutado. Em particular, não se exclui que outras mutações ou modificações tenham sido trazidas à proteína envoltória.

[0102] A expressão «compreendendo essencialmente» significa que pelo menos dois dos quatro aminoácidos constantes da sequência acima (representada em realce) estão presentes no referido envoltório viral tipo selvagem. Dois aminoácidos são suficientes para determinar claramente a posição de X1 e de X2 na sequência envoltória. Vantajosamente, a sequência acima é usualmente localizada na subunidade da transmembrana (TM), mais particularmente no ectodomínio da subunidade TM.

[0103] Como pretendido aqui, os aminoácidos Y1 a Y12, independentemente uns dos outros são diferentes ou idênticos.

[0104] Como pretendido aqui, a proteína ENV mutada carrega essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X’1Y9Y10Y11CY12X’2 em que X’1 corresponde ao X1 e ao X’2 mudado corresponde ao X2 mudado.

[0105] A expressão «atividade imunossupressora modificada» significa que a proteína ENV mutada tem atividade imunossupressora aumentada ou diminuída com relação à proteína ENV tipo selvagem. Em particular, a proteína ENV mutada pode ser essencialmente privada de qualquer atividade imunossupressora residual. Em um outro exemplo, a proteína ENV mutada pode ter atividade imunossupressora considerando que a proteína ENV tipo selvagem correspondente é essencialmente privada da atividade imunossupressora. A atividade imunossupressora pode ser medida como descrita acima e nos Exemplos, por exemplo usando o método do índice imunossupressor.

[0106] Vantajosamente, as proteínas ENV mutadas tendo a atividade imunossupressora modificada possuem muitas aplicações, em particular aplicações terapêuticas, que serão discutidas daqui por diante.

[0107] Em uma concretização preferida do uso acima definido, estruturas responsáveis pela antigenicidade da proteína ENV mutada são essencialmente preservadas.

[0108] Como pretendido aqui, a expressão «estruturas responsáveis pela antigenicidade» se refere às estruturas da proteína que são responsáveis por interagir com os componentes do sistema imune, tais como anticorpos ou membranas receptoras de células imunológicas, em particular células T.

[0109] De acordo com a invenção, pelo menos uma ou mais destas estruturas apresentam a mesma conformação na proteína ENV mutada com relação à proteína ENV tipo selvagem correspondente. Vantajosamente, isto significa que uma reação imunológica trazida à tona contra uma proteína ENV mutada poderá também ser dirigida contra a proteína ENV tipo selvagem correspondente.

[0110] De acordo com uma concretização preferida, a invenção também se refere ao uso acima definido de uma primeira mutação de um primeiro aminoácido e opcionalmente de uma segunda mutação de um segundo aminoácido em uma proteína envoltória (ENV) viral tipo selvagem essencialmente compreendendo a seguinte sequência:NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2 em que o primeiro aminoácido a ser mutado é X1 e o segundo aminoácido a ser mudado é X2, e Y1 a Y12 representa qualquer aminoácido, para manufaturar uma proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora diminuída com relação à referida proteína ENV tipo selvagem.

[0111] Em uma concretização de maior preferência, a diminuição na atividade imunossupressora é tal que quase nenhuma atividade residual é vista na proteína ENV mutada.

[0112] De acordo com uma concretização preferida, a invenção também se refere ao uso acima definido de uma primeira mutação de um primeiro aminoácido e de uma segunda mutação de um segundo aminoácido em uma proteína envoltória viral (ENV) tipo selvagem essencialmente compreendendo a seguinte sequência:NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2 em que o primeiro aminoácido a ser mudado é X1 e o segundo aminoácido a ser mudado e X2, e Y1 a Y12 representam qualquer aminoácido, para manufaturar uma proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora diminuída com relação à referida proteína ENV tipo selvagem.

[0113] A mutação de X1 sozinho é suficiente modificar a atividade imunossupressora da proteína ENV mutada com relação ao correspondente ENV tipo selvagem. Entretanto, é vantajoso que X2 seja também mutado porque se assegura que a estrutura da proteína ENV mutada seja essencialmente conservada com relação à proteína ENV tipo selvagem correspondente.

[0114] Em uma concretização preferida do uso acima definido, a mutação é uma substituição.

[0115] Em uma outra concretização preferida do uso acima definido, X1 é substituído por R ou por H.

[0116] Em uma outra concretização preferida do uso acima definido, X2 é substituído por F, M, Y ou W.

[0117] Em uma concretização adicionalmente preferida do uso acima definido, X1 é E, K, ou Q e é substituído por R ou por H.

[0118] Em uma concretização preferida do uso acima definido, a proteína ENV e HERV-H ENV e X1 e K.

[0119] Em uma concretização adicionalmente preferida do uso acima definido, X2 é A, V, L, I, ou K e é substituído por F, M, Y, ou W.

[0120] Em uma concretização particularmente preferida do uso acima definido, a proteína ENV é um HERV ENV, em particular selecionada de: HERV-FRD ENV (SEQ ID NO: 82), em que X1 é Q427 e X2 é A433, ou HERV-T ENV (SEQ ID NO: 84), em que X1 é Q516 e X2 é A522, ou HERV-R ENV (SEQ ID NO: 86), em que X1 é E561 e X2 é K567, ou HERV-V ENV (SEQ ID NO: 88), em que X1 é Q381 e X2 é V387, ou HERV-R(b) ENV (SEQ ID NO: 90), em que X1 é E391 e X2 é L397.

[0121] HERV se refere ao Retrovírus Endógeno Humano, que têm sido descritos previamente. As proteínas HERV ENV foram encontradas por serem expressas em células de câncer. O HERV ENV listado acima apresenta uma atividade imunossupressora e pode ajudar as células de câncer que carregam as respostas imunológicas do escape. Estes HERV são bem conhecidos ao técnico no assunto e são em particular descritos em Benit et al. J. Virol. 2001, 75:11709-11719. Como pode ser aparente, as proteínas HERV ENV posteriores tendo atividade imunossupressora diminuída são vantajosas para preparar as vacinas que inibem a atividade das proteínas ENV tipo selvagem expressadas em células de câncer.

[0122] Em uma concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV e HERV-FRD ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 120. SEQ ID NO: 122. SEQ ID NO: 120 carregando a mutação Q427R. SEQ ID NO: 122 carregando a mutação Q427R + A433F.

[0123] O HERV-FRD ENV mutado representado pelao SEQ ID NO: 120 ou 122 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente HERV-FRD ENV tipo selvagem.

[0124] Em uma outra concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV e HERV-V ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 124. SEQ ID NO: 126. SEQ ID NO: 124 carregando a mutação Q381R. SEQ ID NO: 126 carregando a mutação Q381R + V387F.

[0125] O HERV-V ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 124 ou 126 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente HERV-V ENV tipo selvagem.

[0126] Em uma outra concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV é HERV-T ENV e a sequência da proteína ENV mutada e selecionada de: SEQ ID NO: 128. SEQ ID NO: 130. SEQ ID NO: 128 carregando a mutação Q516R. SEQ ID NO: 130 carregando a mutação Q516R + A522F.

[0127] O HERV-T ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 128 ou 130 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente HERV-T ENV tipo selvagem.

[0128] Em uma outra concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV é HERV-R ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 146. SEQ ID NO: 148. SEQ ID NO: 146 carregando a mutação E561R. SEQ ID NO: 148 carregando a mutação E561R + K567F.

[0129] O HERV-R ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 128 ou 130 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente HERV-R ENV tipo selvagem.

[0130] Em uma outra concretização particularmente preferida do uso acima definido, a proteína ENV é selecionada de: HTLV-1 ENV (SEQ ID NO: 92), em que X1 é Q389 e X2 é A395, ou HTLV-2 ENV (SEQ ID NO: 94) em que X1 é Q385 e X2 é A391, ou FeLV ENV (SEQ ID NO: 96), em que X1 é E527 e X2 é A533, ou PERV ENV (SEQ ID NO: 98), em que X1 é E545 e X2 é A551, ou STLV-1 ENV (SEQ ID NO: 100), em que X1 é Q389 e X2 é A395, ou MoMLV ENV (SEQ ID NO: 70), em que X1 é E551 e X2 é A557, ou MPMV ENV (SEQ ID NO: 72), em que X1 é Q471 e X2 é A477, ou FV ENV (SEQ ID NO: 102), em que X1 é E561 e X2 é A567. HTLV-1 e 2 se refere ao tipo 1 e 2 do Vírus da Leucemia da Célula-T Humano. FeLV se refere ao Vírus da Leucemia Felina. PERV se refere ao Retrovírus Endógeno Suíno. STLV-1 se refere ao tipo 1 do Vírus da Leucemia da Célula-T Seminal. MoMLV se refere ao Vírus da Leucemia Murine Moloney. MPMV se refere ao Vírus do Macaco Mason-Pfizer. FV se refere ao Vírus Friend do rato.

[0131] Estes vírus são bem conhecidos do técnico no assunto e são notavelmente descritos em Benit et al. (J. Viral. 2001, 75:1170911719). A propagação destes vírus é notavelmente favorecida pela presença de uma proteína ENV imunossupressora que ajuda o vírus a escapar da resposta imunológica. Como estará aparente posteriormente, as proteínas virais ENV tendo atividade imunossupressora diminuída são vantajosas para inibir a atividade das proteínas ENV tipo selvagem expressadas por vírus.

[0132] Em uma concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV é FeLV ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 104. SEQ ID NO: 106. SEQ ID NO: 104 carregando a mutação E527R. SEQ ID NO: 106 carregando a mutação E527R + A533F.

[0133] O FeLV ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 104 ou 106 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente FeLV ENV tipo selvagem.

[0134] Em uma outra concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV é HTLV-1 ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 108. SEQ ID NO: 110. SEQ ID NO: 108 carregando a mutação Q389R. SEQ ID NO: 110 carregando a mutação Q389R + A395F.

[0135] O HTLV-1 ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 108 ou 110 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente HTLV-1 ENV tipo selvagem.

[0136] Em uma outra concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV e HTLV-2 ENV e a sequência da proteína ENV mutada e selecionada de: SEQ ID NO: 112. SEQ ID NO: 114. SEQ ID NO: 112 carregando a mutação Q385R. SEQ ID NO: 114 carregando a mutação Q385R + A391F.

[0137] O HTLV-2 ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 112 ou 114 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente HTLV-2 ENV tipo selvagem.

[0138] Em uma outra concretização vantajosa do uso acima definido, a proteína ENV e PERV ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 150. SEQ ID NO: 152. SEQ ID NO: 150 carregando a mutação E545R. SEQ ID NO: 152 carregando a mutação E545R + A551F.

[0139] O PERV ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 150 ou 152 apresenta uma atividade imunossupressora diminuída com relação ao correspondente PERV tipo selvagem.

[0140] A presente invenção se refere também ao uso acima de uma primeira mutação de um primeiro aminoácido e opcionalmente de uma segunda mutação de um segundo aminoácido em uma proteína envoltória (ENV) viral tipo selvagem compreendendo essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2 em que o primeiro aminoácido a ser mudado é X1 e o segundo aminoácido a ser mudado é X2, e Y1 a Y12 representam qualquer aminoácido, para manufaturar uma proteína ENV mudada tendo uma atividade imunossupressora aumentada com relação à referida proteína ENV tipo selvagem.

[0141] A mutação de X1 sozinho e suficiente aumentar a atividade imunossupressora da proteína ENV mutada com relação ao correspondente ENV tipo selvagem. Entretanto, é vantajoso que X2 seja também mutado porque se assegura que a estrutura da proteína ENV mutada seja essencialmente conservada com relação à correspondente proteína ENV tipo selvagem.

[0142] Vantajosamente, é possível, de acordo com a invenção, obter uma proteína ENV mutada com atividade imunossupressora considerando que a correspondente proteína ENV tipo selvagem é essencialmente privada de tal atividade. Tais proteínas ENV mutadas com atividade imunossupressora aumentada são úteis para inibir o sistema imune, por exemplo em rejeições do enxerto ou em doenças autoimunes.

[0143] Em uma concretização preferida do uso acima mencionado para manufaturar uma proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora aumentada, a mutação é uma substituição.

[0144] Em uma outra concretização preferida do uso acima mencionado para manufaturar uma proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora aumentada, X1 é substituído por E, K ou Q e X2 e substituído por A.

[0145] Em uma outra concretização preferida do uso acima mencionado para manufaturar uma proteína ENV mutada tendo atividade imunossupressora aumentada, a proteína ENV e HERV-W ENV, tal como representada pela SEQ ID NO: 74, e a sequência do HERV-W ENV mudado e preferivelmente selecionado de: SEQ ID NO: 116. SEQ ID NO: 118. SEQ ID NO: 116 carregando a mutação R393E/Q. SEQ ID NO: 118 carregando a mutação R393E/Q + F399A.

[0146] O HERV-W ENV mutado representado pela SEQ ID NO: 116 ou 118 apresenta uma atividade imunossupressora aumentada com relação ao correspondente HERV-W tipo selvagem que é essencialmente privado de tal atividade.

[0147] A presente invenção também proporciona um polipeptídeo derivado de uma determinada proteína antigênica e imunossupressora, o referido polipeptídeo compreendendo uma sequência do aminoácido (assim chamada «sequência imunossupressora-modulatória») representada por X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 em que no referido polipeptídeo Y representa resíduos de aminoácidos variáveis, 3 e 1 representando o número de resíduos de aminoácidos Y variáveis, respectivamente entre X1 e C e entre C e X2, e X1 e X2 são escolhidos para conferir ao referido polipeptídeo propriedades imunossupressoras alteradas com relação às propriedades imunossupressoras da referida proteína determinada.

[0148] O termo «derivado», como usado aqui, indica que a sequência do aminoácido, e especialmente a sequência imunossupressora- modulatória no polipeptídeo, é modificada com relação à sequência da proteína determinada. Referida proteína «determinada» é aqui a proteína original cuja modificação é requerida para modular suas propriedades imunossupressoras. Um polipeptídeo, de acordo com a invenção, pode ser derivado, biologicamente ou quimicamente, de uma proteína determinada por substituição, deleção, adição, recombinação ou inserção de um ou vários resíduos ou sequências de aminoácido, desde que a sequência consenso da invenção seja tal que X1 e X2 sejam selecionados para modular as propriedades imunossupressoras da determinada proteína de partida, e portanto desde que X1 e/ou X2 sejam mutados pela substituição com relação a seus resíduos correspondentes originais na referida proteína imunossupressora determinada. No caso de inserção da sequência, substituir a sequência imunossupressora-modulatória pode uma sequência homóloga presente na proteína determinada, ou pode substituir uma sequência conhecida ou provavelmente ser envolvida na mesma função de modulação das propriedades imunossupressoras como a sequência inserida, ou pode ser inserida dentro da sequência do aminoácido de partida. Em todos os casos, a estrutura de leitura aberta da sequência de aminoácido seguindo o local de inserção (na parte C-terminal do polipeptídeo) é conservada.

[0149] Obviamente, a invenção pode ser realizada com ou sem realmente começar a partir da referida proteína determinada para derivar o polipeptídeo da invenção. Portanto, a referida proteína determinada é uma referência para a delineação do polipeptídeo derivado, melhor que um material de partida necessário a partir de um ponto de vista biológico ou químico.

[0150] Em uma concretização particular da invenção, o polipeptídeo derivado tendo propriedades imunossupressoras mais baixas do que o referido polipeptídeo de partida determinado e vantajosamente tem substancialmente perdido as referidas propriedades imunossupressoras, por exemplo não tem nenhuma propriedade imunossupressora.

[0151] As expressões «polipeptídeo» e «proteína» através da presente invenção definem moléculas, se seus comprimentos (exceto se de outra forma citado na presente descrição) compreendem uma sequência de aminoácido.

[0152] Em uma concretização particular, o polipeptídeo ou a proteína são multiméricos, especialmente triméricos.

[0153] «Determinado» como usado aqui se refere a uma proteína de partida a partir da qual o polipeptídeo da invenção é designado, isto é, derivado para ter propriedades imunossupressoras moduladas. Esta proteína pode ser uma proteína tipo selvagem (por exemplo isolada de uma cepa viral, especialmente retroviral) ou uma proteína previamente modificada (por exemplo expressado de um vetor em um hospedeiro). Tal proteína é escolhida dentre aquelas tendo propriedades antigênicas e imunossupressoras.

[0154] A proteína determinada tendo propriedades imunossupressoras teve definição acima: quando esta proteína determinada é expressa nas células do tumor normalmente rejeitadas por um hospedeiro enxertado, permite que estas células do tumor proliferem e escapem da rejeição imunológica.

[0155] Em segundo lugar, ela é uma proteína antigênica, isto é, capaz de ser reconhecida pelos anticorpos formados em um hospedeiro a quem é administrada. Vantajosamente ela é capaz de induzir uma resposta imunológica no hospedeiro a quem é administrada em condições conhecidas, e consequentemente a referida proteína antigênica é vantajosamente uma proteína imunogênica. Isto envolve que o referido hospedeiro produza anticorpos contra os epítopos da proteína.

[0156] Em vista desta propriedade desejada da proteína ser antigênica, especialmente imunogênica, e em vista da propriedade requerida para que o polipeptídeo derivado substancialmente retenha estas propriedades antigênicas, especialmente imunogênicas, a proteína determinada usada para derivar o polipeptídeo da invenção abrange proteínas nativas, ou ocorrendo naturalmente, ou antigênicas, especialmente imunogênicas, ou fragmentos delas, desde que os referidos fragmentos adicionalmente tenham propriedades imunossupressoras. Ela também abrange proteínas modificadas com relação à proteína nativa ou que ocorre naturalmente, desde que as proteínas modificadas tenham propriedades antigênicas e imunossupressoras.

[0157] A proteína determinada usada como a referência para derivar o polipeptídeo da invenção pode ser uma proteína viral, isto é, codificada por ácido nucleico de agentes infecciosos semelhantes a vírus, ou por uma proteína codificada por ácido nucleico de origem viral, tal como as retroviroses endógenas, especialmente HERV. Uma proteína particular é uma proteína originária de uma subclasse das viroses: retroviroses. Em uma concretização particular, a proteína determinada é uma proteína envoltória, isto é, o produto da expressão do gene env.

[0158] «Ácido nucléico», como usado aqui, se refere aos ácidos nucléicos virais na forma de DNA ou RNA, incluindo ácidos nucléico celulares tais como DNA genômico, DNA complementar, sequências de codificação. Todo o ácido nucléico citado no presente pedido pode ser em fita única ou em duplex.

[0159] Os resíduos de aminoácido X1 e X2 do motivo X1- (Y)3-C-(Y)1-X2 são escolhidos como descritos acima.

[0160] O polipeptídeo acima definido da invenção derivado de uma proteína antigênica e imunossupressora, e compreendendo a sequência X1-(Y)3-C-(Y)1-X2, pode ser definido como segue: em uma concretização particular da invenção, X1 é um resíduo de aminoácido alcalino e X2 é um resíduo aromático ou vice versa. em uma outra concretização particular da invenção, X1 é um resíduo alcalino ou X2 é um resíduo aromático ou versa vice.

[0161] Os inventores têm observado que o efeito da modulação de X1 e de X2 nas propriedades imunossupressoras das proteínas é usualmente menor quando somente um dos resíduos X1 ou X2 é modificado em uma proteína imunossupressoras original.

[0162] Portanto, a modificação de ambos X1 e X2 é uma sequência imunossupressora-modulatória podendo ser considerada como vantajosa.

[0163] Em uma outra concretização particular da invenção, os resíduos X1 ou X2 localizados na sequência de aminoácido representada como X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 são selecionados como segue: onde X1 é escolhido dentre R, H e K, X2 é escolhido dentre F, W, Y e H ou onde X1 é escolhido dentre F, W, Y e H, X2 é escolhido dentre R, H e K. em uma concretização adicional da invenção, X1 é R, H ou K e X2 é F, ou vice versa. em uma concretização adicional da invenção, X1 é R e X2 é F, W, Y ou H.

[0164] Os inventores têm especialmente identificado que um polipeptídeo, derivado de uma proteína antigênica e imunossupressora, tem alterado as propriedades imunossupressoras comparadas as propriedades imunossupressoras da proteína a partir da qual é derivada quando os resíduos X1 e X2 de interesse particular são respectivamente R e F ou K e F.

[0165] A proteína determinada pode, vantajosamente, ser uma proteína viral e, particularmente, uma proteína retroviral ou uma proteína de origem viral como uma de um HERV, tendo propriedades antigênicas e imunossupressoras.

[0166] As proteínas envoltórias de baixa ou nenhuma propriedade imunossupressora conhecidas de HERV-W, H1, F(c)1 ou F(c)2 não são, como tal, o objeto da presente invenção.

[0167] Em uma concretização particular da presente invenção, o polipeptídeo derivado de uma proteína antigênica tem alterado propriedades imunossupressoras e especialmente propriedades imunossupressoras reduzidas, enquanto retêm suas propriedades antigênicas.

[0168] Em uma outra concretização particular, estas proteínas têm, adicionalmente as propriedades antigênicas e imunossupressoras, propriedades infecciosas e/ou de fusão.

[0169] Quando a proteína de partida determinada adicionalmente tiver propriedades infecciosas e de fusão, tais como aquelas identificadas para proteínas envoltórias virais, uma destas ou ambas as propriedades podem ser retidas, mas não necessariamente, no polipeptídeo derivado.

[0170] A avaliação ou a medida das propriedades infecciosas e/ou de fusão para determinar se estas propriedades da proteína determinada original são mantidas no polipeptídeo derivado da invenção podem proporcionar indicações úteis a respeito de se o polipeptídeo derivado tem substancialmente retido a estrutura, especialmente a estrutura antigênica, por exemplo, determinantes imunogênicos, da proteína determinada original.

[0171] Uma proteína é referida ter propriedades de fusão quando as células transfectadas com os ácidos nucléicos codificando a referida proteína são capazes de formar sincício (células multinucleadas) com outras células provavelmente não expressando a mesma proteína. Certamente, suspeita-se que uma expressão forte de uma proteína com propriedades de fusão obstrui a expressão dos receptores da referida proteína envolvida no evento de fusão. Portanto, a capacidade de fusão pode ser definida pela formação de sincício entre células expressando a referida proteína com propriedades de fusão e as células expressando seu receptor. As células podem ser transfectadas tendo o recurso dos vários métodos conhecidos tais como precipitação do fosfato de cálcio ou com liposomas, tais como LipofectamineTM.

[0172] Uma proteína é referida para ter propriedades infecciosas quando os pseudotipos revestidos com esta proteína são capazes de infectar células. «Pseudotipos», como usado aqui, se refere às partículas virais em que uma proteína ENV a partir de uma cepa diferente é incorporada. As partículas do núcleo de MLV são usadas correntemente. Pseudotipos são produzidos nas linhagens de célula (tais como as células 293T) em que um vetor codificando a proteína infecciosa é cotransfectado com um ou vários vetor/es codificando as proteínas GAG e POL de uma outra cepa viral.

[0173] Os polipeptídeos particulares tendo as propriedades descritas são derivados da proteína envoltória viral (ENV) e especialmente das envoltórias retrovirais. Tal ENV retroviral pode ser selecionado a partir do grupo de retroviroses consistindo em: MoMLV, retrovírus Friend, FeLV, HTLV-1, STLV-1 e MPMV. Outros polipeptídeos interessantes são aqueles codificados por ácidos nucléicos de origem viral tal como HERV. Tanto quanto as viroses são interessantes, as viroses Ebola e Marburg têm proteínas ENV a partir das quais os polipeptídeos da invenção podem ser derivados.

[0174] A referida proteína envoltória pode ser toda ou uma parte da proteína nativa ou ocorrendo naturalmente ou de uma variante antigênica, especialmente imunogênica dela, incluindo um fragmento dela, isto é, um análogo de uma proteína envoltória viral ocorrendo naturalmente tanto quanto propriedades antigênicas, especialmente propriedades imunogênicas, e imunossupressoras são referidas.

[0175] Dentro da sequência de aminoácido das proteínas determinadas descritas acima, os inventores têm identificado resíduos particulares que são envolvidos na regulação da imunossupressão. Tal sequência, chamada sequência imunossupressora-modulatória que confere propriedades imunossupressoras a uma proteína é a seguinte: E/Q-G-G-L/T/I- C- A/K/L/M/V/I-A, em que « / » indica que esta posição da sequência aceita vários tipos de resíduos de aminoácido. Assim, proteínas compreendendo uma sequência imunossupressora-modulatória é selecionada do grupo consistindo em: QGGLCKA (SEQ ID NO: 17) QGGLCAA (SEQ ID NO: 18) QGGLCLA (SEQ ID NO: 19) QGGICLA (SEQ ID NO: 20) EGGLCAA (SEQ ID NO: 21) EGGLCVA (SEQ ID NO: 22) são as proteínas determinadas particulares tendo propriedades imunossupressoras, a partir das quais os polipeptídeos da invenção podem ser derivados por modificação do terminal E/Q e ou dos resíduos de A figurando nas posições X1 e X2 da sequência de consenso da invenção.

[0176] Como descrito acima, o termo «derivado», como usado aqui, indica que a sequência de aminoácido, e especialmente a sequência imunossupressora-modulatória, do polipeptídeo é modificada com relação à sequência da proteína determinada de maneira a impactar nas propriedades imunossupressoras, especialmente para diminuir as referidas propriedades. Estas propriedades imunossupressoras alteradas podem ser a consequência da substituição dos resíduos X1 e X2 de acordo com as características do aminoácido descritas acima.

[0177] Estas propriedades imunossupressoras alteradas podem também ser a consequência da inserção do polipeptídeo compreendendo a sequência X1-(Y)3-C-(Y)1-X2 em que X1 e X2 são selecionados para alterar as propriedades imunossupressoras, em um local permissivo da proteína escolhida.

[0178] «Local permissivo», como usado aqui, refere-se a um local que não altere substancialmente as propriedades antigênicas de uma proteína.

[0179] A inserção pode substituir uma sequência homóloga ou uma sequência envolvida na imunossupressão. O polipeptídeo de 7 a 20 resíduos de aminoácido de acordo com a invenção pode também ser inserido sem retirada de resíduos de aminoácido da proteína determinada.

[0180] Um polipeptídeo derivado de uma proteína determinada como descrito acima, e tendo propriedades imunossupressoras alteradas compreende uma sequência tendo a seguinte sequência R-G-G-L/T/I- C-A/K/L/M/V/I-F, e particularmente uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: RGGLCKF (SEQ ID NO: 27) RGGLCAF (SEQ ID NO: 28) RGGLCLF (SEQ ID NO: 29) RGGICLF (SEQ ID NO: 30) RGGLCVF (SEQ ID NO: 31)

[0181] As sequências dadas acima foram derivadas pela mutação dos referidos resíduos X1 e X2 em proteínas ENV retrovirais ocorrendo naturalmente.

[0182] A mesma estratégia pode ser aplicada com viroses que expressam as proteínas apresentando uma sequência similar a X1-(Y)3-C- (Y)1-X2. Em particular, os resíduos Y podem ser resíduos de aminoácido diferentes a partir daqueles descritos acima (Benit et al. 2001).

[0183] Além disso, a estrutura, por exemplo sua estrutura tridimensional das proteínas ENV determinadas do presente pedido, tem sido mostrada para repartir as características estruturais similares com aquela dos outros vírus e especialmente com outros retrovírus, apesar da diversidade da sequência de aminoácido. Assim, uma organização altamente conservada da estrutura TM foi encontrada nas proteínas dos vírus Ebola ou Marburg, mais provavelmente relevantes a um mecanismo comum para provocar o processo de fusão e a entrada viral. Consequentemente, uma mesma aproximação pode ser aplicada para identificar as sequências particulares, envolvidas na modulação da imunossupressão em tais viroses.

[0184] A presente invenção também se refere a uma proteína ENV mutada resultante da mutação de uma proteína ENV do tipo selvagem essencialmente carregando a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2 em que o aminoácido X1 e opcionalmente o aminoácido X2 são mutados, e Y1 a Y12 representa qualquer aminoácido, a referida proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora modificada com relação à proteína ENV tipo selvagem, ou um fragmento dela, desde que o referido fragmento carregue o aminoácido mudado X1 e opcionalmente X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que opcionalmente sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à estrutura que ele adota no contexto da proteína ENV mutada, ou em uma proteína derivada da proteína ENV mutada, ou fragmentos dela, pela inserção, deleção ou substituição de pelo menos de um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carregue o aminoácido mudado X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar àquela da proteína ENV mutada, ou fragmento dela.

[0185] Como pretendido aqui, a proteína ENV mutada essencialmente carrega a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X’1Y9Y10Y11CY12X’2 em que X’1 corresponde ao X1 mutado e X’2 corresponde ao X2 mutado.

[0186] Como pretendido aqui, fragmentos da proteína ENV mutada de acordo com a invenção, são, em particular, de pelo menos 7 aminoácidos de comprimento e compreendem o aminoácido X1 mutado. Opcionalmente, os fragmentos possuem pelo menos 7 aminoácidos de comprimento e compreendem ambos X1 e X2. Os fragmentos preferidos da proteína ENV mutada de acordo com a invenção são notavelmente constituídos da subunidade TM ou do ectodomínio da subunidade TM.

[0187] Em uma concretização preferida da invenção, a proteína acima mencionada derivada a partir da proteína ENV mutada apresenta pelo menos 80% de identidade de sequência com a referida proteína ENV mutada, em particular pelo menos 90% de identidade de sequência.

[0188] Em uma concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, as estruturas responsáveis pela antigenicidade da referida proteína ENV mutada, ou fragmento dela, são essencialmente preservadas com relação à proteína ENV tipo selvagem.

[0189] De acordo com uma concretização preferida, a presente invenção se refere à proteína ENV mutada acima definida resultante da mutação de uma proteína ENV tipo selvagem essencialmente compreendendo a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12 em que o aminoácido X1 e, opcionalmente, o aminoácido X2 são mutados, e Y1 a Y12 representam qualquer aminoácido, a referida proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora diminuída com relação à proteína ENV tipo selvagem,

[0190] A invenção se refere a uma proteína ENV mutada resultante de uma mutação de uma proteína ENV do tipo selvagem que essencialmente compreende a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, na qual X1 é E, K ou Q e X2 é A, V, L, I ou K e Y1 a Y12 representa qualquer aminoácido, em que o aminoácido X1 é substituído por R ou H, a referida proteína ENV mutada tendo quase nenhuma atividade imunossupressora com relação à proteína ENV do tipo selvagem, ou um fragmento dela que tenha pelo menos 7 aminoácidos de comprimento, desde que o referido fragmento carrege o aminoácido X1 mutado e, opcionalmente, X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à estrutura que ele adota no contexto da proteína ENV mutada, ou uma proteína derivada da proteína ENV mutada, apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência, em particular 90% de identidade de sequência, ou fragmentos dela, por inserção, deleção ou substituição de pelo menos de um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carrege o aminoácido mutado X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar àquela da proteína ENV mutada, ou fragmento dela, ou um fragmento dela, desde que o referido fragmento carregue o aminoácido X1 mutado e, opcionalmente, X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que opcionalmente sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à estrutura que ela adota no contexto da proteína ENV mutada, ou uma proteína derivada da proteína ENV mutada, ou fragmentos dela, por inserção, deleção ou substituição de pelo menos de um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carrege o aminoácido mutado X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar àquela da proteína ENV mutada, ou fragmento dela.

[0191] De acordo com uma concretização preferida, a presente invenção se refere a uma proteína ENV mutada acima definida resultando da mutação de uma proteína ENV tipo selvagem compreendendo essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, em que o aminoácido X1 e o aminoácido X2 são mutados, e Y1 a Y12 representam qualquer aminoácido, a referida proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora diminuída com relação à proteína ENV do tipo selvagem, ou um fragmento dela, desde que o referido fragmento carregue os aminoácidos mutados X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que opcionalmente sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à estrutura que ele adota no contexto da proteína ENV mutada, ou em uma proteína derivada da proteína ENV mutada, ou uma proteína derivada da proteína ENV mutada, ou fragmentos dela, por inserção, deleção ou substituição de pelo menos de um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carregue os aminoácidos mutados X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar àquela da proteína ENV mutada, ou fragmento dela.

[0192] Em uma concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a mutação é uma substituição.

[0193] Em uma outra concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, X1 é substituído por R ou H.

[0194] Em uma outra concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, X2 é substituído por F, M, Y ou W.

[0195] Em uma outra concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, X1 é E, K, ou Q e é substituído por R ou H.

[0196] Em uma concretização preferida, a proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, é HERV-H ENV em que X1 é K.

[0197] Em uma outra concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, X2 é A, V, L, I, ou K e é substituído por F, M, Y, ou W.

[0198] Em uma concretização particularmente preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é um HERV ENV, em particular selecionado de: HERV-FRD ENV (SEQ ID NO: 82), em que X1 é Q427 e X2 é A433, ou HERV-T ENV (SEQ ID NO: 84), em que X1 é Q516 e X2 e A522, ou HERV-R ENV (SEQ ID NO: 86), em que X1 é E561 e X2 é K567, ou HERV-V ENV (SEQ ID NO: 88), em que X1 é Q381 e X2 é V387, ou HERV-R(b) ENV (SEQ ID NO: 90), em que X1 é E391 e X2 é L397.

[0199] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é HERV-FRD ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 122

[0200] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV e HERV-V ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 126

[0201] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é HERV-T ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 130

[0202] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é HERV-R ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 148

[0203] Em uma concretização particularmente preferida da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é selecionada de: HTLV-1 ENV (SEQ ID NO: 92), em que X1 é Q389 e X2 é A395, ou HTLV-2 ENV (SEQ ID NO: 94) em que X1 é Q385 e X2 é A391, ou FeLV ENV (SEQ ID NO: 96), em que X1 é E527 e X2 é A533, ou PERV ENV (SEQ ID NO: 98), em que X1 é E545 e X2 é A551, ou STLV-1 ENV (SEQ ID NO: 100), em que X1 é Q389 e X2 é A395, ou MoMLV ENV (SEQ ID NO: 70), em que X1 é E55 l e X2 é A557, ou MPMV ENV (SEQ ID NO: 72), em que X1 é Q471 e X2 é A477, ou FV ENV (SEQ ID NO: 102), em que X1 é E561 e X2 é A567.

[0204] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é FeLV ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 106

[0205] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é HTLV-1 ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 110

[0206] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é HTLV-2 ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 114

[0207] Em uma concretização vantajosa da proteína ENV mutada acima definida, ou fragmento dela, a proteína ENV é PERV ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada de: SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 152

[0208] De acordo com uma concretização preferida, a presente invenção se refere a uma proteína ENV mutada, como definido acima, resultante da mutação da proteína ENV tipo selvagem, essencialmente compreendendo a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, em que o aminoácido X1 e, opcionalmente, o aminoácido X2 são mutados, e Y1 a Y12 representa qualquer aminoácido, a referida proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora aumentada com relação à proteína ENV tipo selvagem, ou fragmento dela, desde que o referido fragmento carregue os aminoácidos mutados X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mudada, e que opcionalmente sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à estrutura que ele adota no contexto da proteína ENV mutada, ou uma proteína derivada da proteína ENV mutada, ou fragmentos dela, por inserção, deleção ou substituição de pelo menos de um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carregue os aminoácidos mutados X1 e X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar àquela da proteína ENV mutada, ou fragmento dela.

[0209] A invenção também está relacionada com uma proteína ENV mutada resultante de uma mutação de uma proteína ENV do tipo selvagem, compreendendo essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, na qual X1 é R e X2 é F e Y1 a Y12 representa qualquer aminoácido, em que o aminoácido X1 é substituído por E ou R, a referida proteína ENV mutada tendo uma atividade imunossupressora enquanto a proteína ENV do tipo selvagem é desprovida desta atividade, ou um fragmento dela, que possua pelo menos 7 aminoácidos de comprimento, desde que o referido fragmento carregue o aminoácido X1 mutante e, opcionalmente, X2, e que ele tenha possui uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, que é imunossupressora, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à estrutura adotada no contexto da proteína ENV mutada, ou uma proteína derivada da proteína ENV mutada, apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência, em particular 90% de identidade de sequência, com a referida proteína ENV mutante, ou fragmento desta, por inserção, deleção ou substituição de pelo menos um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carregue o aminoácido X1 e X2 mutante, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, e que, opcionalmente, sua estrutura antigênica seja essencialmente similar à da proteína ENV mutada, ou fragmento desta.

[0210] Em uma concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, tendo atividade imunossupressora aumentada, ou fragmento dela, a mutação e uma substituição.

[0211] Em uma concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, tendo atividade imunossupressora aumentada, ou fragmento dela, X1 é substituído por E, K, ou Q e X2 é substituído por A.

[0212] Em uma concretização preferida da proteína ENV mutada acima definida, tendo atividade imunossupressora aumentada, ou fragmento dela, a proteína ENV é HERV-W ENV, tal como representado pela SEQ ID NO: 74, e a sequência do HERV-W ENV mutado é selecionada de: SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 118

[0213] A presente invenção também se refere a uma proteína, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo como definido acima, ou ao menos uma proteína ENV mutada, ou fragmento dela, como definido acima, desde que quando o referido polipeptídeo origina a partir de uma proteína ENV tipo selvagem, então a referida proteína compreendendo o referido polipeptídeo é diferente da referida proteína ENV tipo selvagem.

[0214] A presente invenção também se refere aos ácidos nucléicos, e especialmente aos polinucleotídeos, codificando polipeptídeos da invenção. Em uma concretização particular, estes ácidos nucléicos são inseridos em um vetor. O vetor recombinante pode ser um plasmídeo, um fago para a introdução por bactéria ou um YAC capaz de transformar levedura, ou qualquer vetor de expressão.

[0215] Em adição, o vetor recombinante compreende as regiões de regulação da transcrição (incluindo promotores) que permitem a expressão induzível ou a expressão condicional do ácido nucléico sob controle ou, se apropriado, a expressão constitutiva. Uma região de transcrição específica do tecido pode também ser usada. Além disso, o vetor recombinante compreende uma origem de genes de replicação e/ou marcador.

[0216] Em uma concretização particular da invenção, o vetor também compreende o ácido nucléico que codifica as proteínas virais GAG e/ou POL, ou fragmentos suficientes delas, para expressar proteínas virais funcionais. Opcionalmente, o vetor pode compreender ácidos nucléicos codificando proteínas virais acessórias, como NEF, TAT ou fragmentos delas.

[0217] Altemativamente, as sequências de codificação GAG e POL podem ser inseridas em vetores separados, incluindo em vector(es) diferente(s) do vetor expressando ENV.

[0218] Em uma concretização particular da invenção, um genoma provírus é modificado com um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção tendo propriedades antigênicas, mas propriedades imunossupressoras alteradas com relação a uma proteína determinada ou a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção tendo propriedades infecciosas, de fusão e antigênicas, mas propriedades imunossupressoras alteradas com relação a uma proteína determinada.

[0219] A presente invenção também se refere às células que compreendem os ácidos nucléico que codificam polipeptídeos da invenção.

[0220] Em uma concretização particular, uma célula é transformada com um polinucleotídeo da invenção, de uma maneira que o polinucleotídeo seja integrado no genoma da célula por uma recombinação com a sequência celular homóloga ou por inserção no genoma celular. A célula pode também ser transfectada com um vetor da invenção, pelos métodos bem conhecidos pelo homem técnico no assunto. A transfecção ou infecção pode ocorrer ex vivo, isto é, em um meio artificial externo ao organismo vivo.

[0221] Em uma outra concretização, um vetor contendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de acordo com as células da invenção é complementado com a introdução de outros ácidos nucleicos contidos em vetores adicionais, especialmente codificando a proteína viral GAG e/ou a proteína POL.

[0222] Estas linhagens de célula são úteis para a produção de partículas virais recombinantes. Em uma concretização particular, os polipeptídeos GAG e POL originam da mesma cepa de vírus que a proteína ENV. Em uma outra concretização, os polipeptídeos GAG e POL originam de uma cepa diferente da proteína ENV.

[0223] As partículas virais recombinantes produzidas compreendem um ácido nucléico que codifica uma proteína POL funcional, um ácido nucleico que codifica uma proteína GAG funcional e um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção.

[0224] Além do mais, a proteína ENV pode ser escolhida dentre a proteína ENV anfotrópica viral de acordo com o hospedeiro, isto é, capaz de infectar células de uma espécie da qual o vírus não é originado, ou proteína ENV ecotrópica viral de acordo com o hospedeiro, isto é, capaz de replicar somente nas células da espécie da qual o vírus é originado.

[0225] Para assegurar que as partículas virais recombinantes sejam infecciosas e replicativas, o vetor compreende várias sequências nucleicas escolhidas dentre os sinais da transcrição, expressão e encapsidação, tais como LTRs, cPPT, PPT3', CTS, SA, SD, sequência psi e RRE. Entretanto, tais elementos podem ser retirados para produzir partículas virais não-replicativas. Além do mais, o genoma proviral compreende ácidos nucléicos que codificam proteínas acessórias.

[0226] Opcionalmente as partículas podem ser preparadas para expressar compostos adicionais úteis para a aplicação médica em um hospedeiro.

[0227] A presente invenção também se refere a um ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo, como definido acima, para uma proteína ENV mutada, de acordo com o definido acima, ou para uma proteína, como definido acima.

[0228] Em uma concretização preferida o ácido nucleico acima definido é caracterizado pelo fato de que é representado por uma sequência selecionada a partir da lista compreendendo: SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, e SEQ ID NO: 151.

[0229] As SEQ ID NO: 103 a 129 acima mencionadas e as SEQ ID NO: 147 a 151 (números ímpares) respectivamente codificam as SEQ ID NO: 104 a 130 e SEQ ID NO: 146 a 152 (números pares).

[0230] A presente invenção também se refere a um vetor de expressão eucariótico ou procariótico, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido acima, bem como os elementos necessários para a expressão do referido ácido nucleico.

[0231] Em uma concretização preferida, o vetor de expressão eucariótico ou procariótico acima definido é um vetor viral, em particular um vetor de varíola, tal como uma varíola aviária, uma varíola de canário, ou um vetor MVA (vírus de vacina modificado Ancara), um vetor adenoviral, um vetor do sarampo, ou um vetor CMV (citomegalovírus).

[0232] Em uma concretização adicionalmente preferida, o vetor de expressão eucariótico ou procariótico acima definido é um vetor viral, em particular um vetor de varíola de canário, compreendendo uma codificação da sequência do ácido nucleico para uma proteína ENV mutada, como acima definida, ou um fragmento dela, em particular um FeLV ENV mutado, tal como representado pela de SEQ ID NO: 103 ou SEQ ID NO: 105, bem como opcionalmente um ácido nucleico codificando para a proteína GAG que origina do mesmo vírus que o referido ENV mutado.

[0233] A presente invenção também se refere a uma célula recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido acima, ou a um vetor de expressão eucariótico ou procariótico como definida acima.

[0234] A presente invenção também se refere a uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção tendo propriedades imunossupressoras alteradas com relação a uma proteína determinada, e particularmente um polipeptídeo que retém substancialmente propriedades antigênicas, especialmente propriedades imunogênicas da proteína da qual eles derivam.

[0235] Uma composição particular da invenção tem propriedades imunossupressoras baixas com relação à proteína de partida determinada, ou não tem substancialmente nenhuma propriedade imunossupressora.

[0236] Outras composições compreendem polinucleotídeos ou vetores compreendendo ácido nucleico codificando polipeptídeos da invenção. Neste caso, os promotores específicos do tecido podem ser escolhidos dependendo do órgão no qual a composição é administrada, por exemplo injetada, e dependendo da intensidade da expressão requerida.

[0237] Outras composições da invenção compreendem as partículas virais ou viroses hospedando os polipeptídeos da invenção e opcionalmente expressando compostos adicionais tendo um interesse médico em um hospedeiro.

[0238] Os polipeptídeos e as composições da invenção são úteis para a delineação do princípio ativo para drogas e tem consequentemente propriedades interessantes para a profilaxia e ou tratamento de infecções, especialmente infecções virais ou para o tratamento de consequências prejudiciais, especialmente de estado maligno, incluindo tumores, resultantes da infecção viral ou também para a profilaxia e/ou para o tratamento das consequências prejudiciais, em particular as de estado maligno, incluindo tumores associados com a expressão das viroses endógenas, especialmente HERV, que são normalmente silenciosos em um hospedeiro. A expressão «tratamento» abrange o efeito curativo alcançado com os polipeptídeos e composições da invenção e também o alívio dos sintomas observados em um paciente ou na melhoria da condição do paciente.

[0239] Em uma concretização particular, a composição da invenção adicionalmente compreende os compostos ativos adicionais úteis para a profilaxia ou tratamento das infecções, especialmente infecções virais, em particular infecções retrovirais, incluindo citocinas ou útil para o tratamento das consequências resultantes da expressão de ERV normalmente silencioso.

[0240] Quando usada para a administração sistêmica ou local, especialmente por injeção, a composição adicionalmente compreende um excipiente farmaceuticamente apropriado ou portador e/ou veículo.

[0241] Diversos tipos de composições podem ser usados para suscitar uma resposta imune contra um polipeptídeo antigênico da invenção.

[0242] Primeiramente, uma composição compreendendo um ácido nucleico é administrada a um hospedeiro, por exemplo de forma injetada (conhecido como vacinação de DNA), e o referido ácido nucleico expressa in vivo um polipeptídeo de acordo com a invenção. As vacinas de DNA geralmente consistem em vetores de plasmídeo compreendendo promotor eucariótico, local de clonagem, uma sequência de poliadenilação, um marcador selecionável e uma origem bacteriana de replicação. Todos estes elementos são bem conhecidos do homem técnico no assunto. A entrega do DNA puro tem mostrado ser pobremente eficiente, e alguns portadores são necessários para aperfeiçoar a entrega do DNA em células. Dois tipos de portadores foram desenvolvidos: os portadores virais (adenoviroses, lentiviroses) ou portadores não-virais, tais como polímeros (e especialmente polímeros catiônicos), DNA encapsulados (liposomas) ou DNA ligados às micropartículas de ouro.

[0243] Um outro tipo de composição compreende um polipeptídeo da invenção tendo propriedades imunossupressoras alteradas com relação a uma proteína determinada e tendo propriedades antigênicas. Tal composição pode ser imunogênica, isto é, ela e capaz de suscitar uma resposta imune em um hospedeiro em que é administrada. Entretanto, desde que as proteínas são as vezes não-imunogênicas ou pobremente imunogênicas, um adjuvante pode ser administrado com o polipeptídeo, para suscitar ou aperfeiçoar a resposta imune. Um adjuvante é definido como qualquer substância que aumenta a imunogenicidade de um antígeno misturado com o referido adjuvante. Alguns adjuvantes convertem antígenos solúveis em partículas pequenas, tais como gel do hidróxido de alumínio, óleo em emulsão de água ou complexos estimulatórios imunes (ISCOMs). Uma outra classe de adjuvantes compreende constituintes estéreis das bactérias tais como a parede da célula ou os polissacarídeos, adjuvante de Freund.

[0244] Portanto, uma composição compreendendo um polipeptídeo tendo propriedades antigênicas, mas propriedades imunossupressoras alteradas com relação a uma proteína determinada, é interessante na elicitação de uma resposta imune em um hospedeiro no qual é administrada e na produção de uma resposta imune humoral e/ou mediada por célula.

[0245] Na verdade, a administração, por exemplo, injeção, de um polipeptídeo tendo propriedades não imunossupressoras proporciona uma reação imune mais eficiente que a administração da proteína determinada (tendo propriedades imunossupressoras), porque o sistema imune do hospedeiro é inteiramente funcional.

[0246] Em uma concretização particular, um polipeptídeo de acordo com a invenção tem propriedades antigênicas, de fusão e infecciosas, mas tem propriedades imunossupressoras alteradas com relação à uma proteína imunossupressora determinada.

[0247] As propriedades imunossupressoras alteradas de acordo com a invenção vantajosamente correspondem às propriedades imunossupressoras diminuídas com relação à proteína de partida original.

[0248] As partículas virais revestidas com um polipeptídeo tendo as referidas propriedades descritas acima podem ser construídas em linhas de célula recombinantes transfectadas com vetores gag-pol e vetor compreendendo um ácido nucleico codificando o referido polipeptídeo.

[0249] Opcionalmente, estas partículas virais também expressam outros compostos de interesse terapêutico ou profilático.

[0250] Interessantemente, tais partículas virais são capazes de infectar e fundir com as células de um hospedeiro, e incorporam uma proteína envoltória não imunossupressora. Uma composição compreendendo tais partículas virais suscitam uma reação imune eficiente, melhor que a partícula viral incorporando a proteína determinada tendo propriedades imunossupressoras. De fato, a proteína envoltória não é capaz de imunossuprimir seu hospedeiro, resultando em uma reação imune ideal. Uma outra consequência é que as partículas virais que poderiam ter a capacidade de replicar, devido aos eventos de recombinação que não envolvem o gene ENV, poderiam ter sua propagação limitada no hospedeiro, uma vez que a partícula viral recombinante não pode evadir a resposta imune.

[0251] Uma composição compreendendo partículas virais revestidas com uma proteína envoltória antigênica com propriedades de fusão e infecciosas parece ser uma vacina eficiente e segura.

[0252] Interessantemente, tais partículas virais podem ser replicativas (funcional) ou não-replicativas. Isto pode ter consequências no tempo de residência das partículas uma vez administradas no hospedeiro e na qualidade da resposta imune.

[0253] Todas as composições citadas acima podem ser injetadas em um hospedeiro através de rotas diferentes: injeção subcutânea (s.c.), intradermal (i.d.), intramuscular (i.m.) ou intravenosa (i.v.), administração oral e administração intranasal ou inalação.

[0254] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou vacinal compreendendo como substância ativa: pelo menos um polipeptídeo como definido acima, ou pelo menos uma proteína ENV mudada, ou fragmentos dela, como definidos acima, ou pelo menos um ácido nucleico como definido acima, ou pelo menos um vetor de expressão procariótico ou eucariótico como definidos acima, ou pelo menos uma célula recombinante como definida acima, em associação com um portador farmaceuticamente aceitável.

[0255] Como será descrito daqui por diante estas composições farmacêuticas são particularmente úteis para tratar cânceres, enfermidades imunes ou doenças virais.

[0256] A presente invenção também se refere ao uso de pelo menos de uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína ENV mutada, ou fragmentos dela, tendo atividade imunossupressora diminuída, como definido acima, ou um ácido nucleico codificando para a referida proteína, para a manufatura de um medicamento ou vacina pretendidos para a prevenção e/ou tratamento das doenças virais, tais como infecções HTLV ou FeLV.

[0257] A administração a um indivíduo da proteína ENV mutada tendo atividade imunossupressora diminuída é responsável por proteger o referido individuo da infecção pelo vírus correspondente. De fato, a resposta imune suscitada contra a proteína ENV mutada é também dirigida contra a proteína ENV tipo selvagem correspondente. Como demonstrado aqui, esta resposta imune efetivamente bloqueia a atividade imunossupressora da proteína ENV tipo selvagem e impede o escape imune do vírus.

[0258] Além do mais, a proteína ENV mutada é também responsável por atuar como um atrativo molecular que compete com a ENV tipo selvagem viral para ligação a seu receptor natural, assim inibindo a atividade do referido ENV tipo selvagem.

[0259] A presente invenção também se refere ao uso de pelo menos uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína HERV ENV mutada, ou fragmentos dela, como definido acima, ou de um ácido nucleico codificando para a referida proteína, para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento de câncer.

[0260] Como demonstrado aqui, bloquear a atividade das proteínas HERV ENV expressadas pelas células de câncer impede o escape imune destas células. Como tal, a resposta imune efetivamente suscitada contra as proteínas HERV ENV mutadas tendo atividade imunossupressora diminuída poderia também ser dirigida contra a HERV ENV tipo selvagem expressado pelas células de câncer e assim impedi-las de possibilitar o escape imune destas células de câncer.

[0261] Além disso, a proteína ENV mutada é também responsável por atuar como um atrativo molecular que compete com o ENV tipo selvagem expressado por células de câncer para ligação a seu receptor natural, assim inibindo a atividade do referido ENV tipo selvagem.

[0262] A presente invenção também se refere ao uso de pelo menos de uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína ENV mutada tendo atividade imunossupressora aumentada, ou fragmentos dela, como definido acima, ou de um ácido nucleico codificando para a referida proteína, para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento das patologias que requerem uma inibição do sistema imune, tal como doenças autoimunes, alergias ou rejeições de enxerto.

[0263] Como pretendido aqui, rejeições do enxerto também abrangem doença do hospedeiro vs. enxerto (GVHD - Graft Versus Host Disease).

[0264] A presente invenção também se refere ao uso de pelo menos um polipeptídeo como definido acima, ou de uma proteína compreendendo o referido polipeptídeo como definido acima, ou de um ácido nucleico codificando para o referido polipeptídeo ou referida proteína, para a manufatura de um medicamento pretendido para a prevenção e/ou do tratamento de câncer, de doenças virais, ou de patologias requerendo uma inibição do sistema imune, tal como doenças autoimunes, alergias ou rejeições do enxerto.

[0265] Os polipeptídeos como definidos acima, e as proteínas que os compreendem, podem ter várias aplicações. Quando originários da proteína ENV imunossupressora tipo selvagem eles podem ser usados diretamente para inibir o sistema imune. De outra forma, se originários de uma proteína ENV imunossupressora ou não imunossupressora eles podem ser usados como atrativos pretendidos para ligar aos receptores naturais das proteínas ENV tipo selvagem correspondentes expressadas por células de câncer ou viroses, que impedem a atividade da referida proteína ENV tipo selvagem.

[0266] A presente invenção também se refere ao uso de pelo menos uma proteína ou de um ácido nucleico codificando para a referida proteína, a referida proteína compreendendo ou sendo constituída de: - uma proteína ENV imunossupressora essencialmente compreendendo a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, em que os aminoácidos Y1 a Y12 representam qualquer aminoácido, o aminoácido X1 representa E, K ou Q, e opcionalmente o aminoácido X2 representa A, - ou um fragmento dela, que possui pelo menos 7 aminoácidos de comprimento, desde que o referido fragmento carregue o aminoácido X1 e, opcionalmente, X2, e que ele tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da referida proteína ENV, - ou uma proteína derivada da referida proteína ENV, apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência, em particular 90% de identidade de sequência, ou fragmentos dela, por inserção, deleção ou substituição de pelo menos um aminoácido, desde que a referida proteína derivada carregue o aminoácido X1 e, opcionalmente, X2, e a que ela tenha uma atividade imunossupressora similar àquela da proteína ENV mutada, para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento de cânceres, de doenças virais, ou das patologias requerendo uma inibição do sistema imune, tal como doenças autoimunes, alergias ou rejeições do enxerto.

[0267] Em uma concretização preferida do uso acima definido pelo menos uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína ENV imunossupressora essencialmente compreendendo a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou tratamento de cânceres, de doenças virais, ou das patologias requerendo uma inibição do sistema imune, tal como doenças autoimunes, alergias ou rejeições do enxerto, a proteína ENV é selecionada de: HERV-T ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 84, ou HERV-R ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 86, ou HERV-V ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 88, ou HERV-R(b) ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 90, ou HTLV-1 ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 92, ou HTLV-2 ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 94, ou FeLV ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 96, ou PERV ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 98, ou STLV-1 ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 100, ou FV ENV, tal como representado pelo SEQ ID NO: 102.

[0268] Quanto aos polipeptídeos acima mencionados, estas proteínas, e os fragmentos dela, podem ter várias aplicações. Podem ser usados diretamente para inibir o sistema imune, ou como atrativos pretendidos para ligar aos receptores naturais das proteínas ENV tipo selvagem correspondentes expressadas por células de câncer ou por viroses.

[0269] A invenção também se refere a um método para produção de anticorpos compreendendo: a. modificação da sequência imunossupressora-modulatória do nucleotídeo em uma maneira a modular o efeito imunossupressivo, mas reter as propriedades de fusão, de infecção e imunossupressoras, b. expressão do gene modificado, c. purificação do polipeptídeo modificado, d. injeção do polipeptídeo modificado em um animal para induzir uma resposta imune, e. purificação dos anticorpos produzidos em reação contra o polipeptídeo modificado.

[0270] A invenção também proporciona um método para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína antigênica e imunossupressora enquanto retêm suas propriedades antigênicas compreendendo: a. identificação da sequência de ácido nucleico codificando uma sequência imunossupressora-modulatória codificando uma sequência de aminoácido de consenso como definida acima em uma sequência do ácido nucleico codificando as referidas propriedades antigênicas e imunossupressoras, b. identificação dos códons codificando aminoácidos X1 e X2 impactando nas propriedades imunossupressoras em sequência X1-(Y)3-C(Y)1- X2 como definido acima, c. modificação dos códons codificando referidos ambos os aminoácidos de tal maneira que a proteína resultante retenha suas propriedades antigênicas, mas tenha propriedades imunossupressoras modificadas, d. expressão da sequência do ácido nucleico modificado obtido codificando a referida proteína antigênica tendo propriedades imunossupressoras modificadas.

[0271] Um método particular para modular as propriedades imunossupressoras de uma proteína antigênica e imunossupressora, tendo adicionalmente propriedades infecciosas e de fusão, enquanto retem sua fusão, as propriedades infecciosas e antigênicas compreendendo: a. identificação da sequência imunossupressora-modulatória de um gene env codificando uma sequência de aminoácido similar àquela definida acima, b. modificação dos códons codificando aminoácidos impactando nas propriedades imunossupressoras de tal maneira que a proteína resultante retem suas propriedades de fusão, infecciosas e antigênicas, mas tenha modificado suas propriedades imunossupressoras.

[0272] A invenção também proporciona um método para preparar vírus atenuados compreendendo: a. modificação do gene codificando para uma proteína antigênica e imunossupressora de um vírus de uma maneira a modular suas propriedades imunossupressoras, mas reter suas propriedades antigênicas, b. expressão do gene modificado em linhagens de célula recombinantes, para produzir partículas virais recombinantes atenuadas integrando um genoma proviral modificado.

[0273] A invenção também se refere a um método para preparar vírus atenuados compreendendo: a. modificação do gene codificando para uma proteína ENV antigênica e imunossupressora de um vírus tendo propriedades de fusão e infecciosas adicionais de uma maneira a modular suas propriedades imunossupressoras, mas reter suas propriedades de fusão, infecciosa e antigênica, b. expressão do gene modificado em linhagens de célula recombinantes, para produzir partículas virais recombinantes atenuadas integrando o genoma proviral modificado.

[0274] A invenção, de forma mais geral, também se refere ao uso dos polipeptídeos não imunossupressores ou de baixa imunossupressividade para a preparação de uma composição imunogênica adequada para a profilaxia, ou tratamento de uma doença viral ou de um estado maligno, ou de uma doença tumoral.

[0275] As proteínas ocorrendo naturalmente que tenham nenhuma propriedade imunossupressoras ou baixa imunossupressividade podem ser usadas adequadamente; elas abrangem HERV-W ou HERV-H.

[0276] A presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo como definido acima, ou de uma proteína mutada ou de uma proteína como definido acima, para a preparação dos ligantes das proteínas ENV selecionadas de: - anticorpos policlonal ou monoclonal, ou fragmentos deles, tais como fragmentos Fab ou F(ab)’2, - polipeptídeos scFv, - aptâmeros, - peptídeos de ligação.

[0277] Tais ligantes e métodos para prepará-los são bem conhecidos do técnico no assunto.

[0278] A presente invenção também se refere aos anticorpos ou fragmentos deles, polipeptídeos scFv, aptâmeros, ou peptídeos de ligação, dirigidos contra as proteínas ENV mutadas, como definidos acima, ou proteínas ou polipeptídeos compreendendo-as, como definido acima, desde que os referidos anticorpos ou fragmentos deles, polipeptídeos scFv, aptâmeros, ou peptídeos de ligação não se liguem às proteínas ENV tipo selvagem correspondentes.

[0279] A presente invenção também se refere ao uso dos polipeptídeos, como definido acima, ou das proteínas, como definidas acima, para seleção de compostos responsáveis por modular a atividade imunossupressora das viroses ou das células de tumor.

[0280] A presente invenção também se refere ao uso dos anticorpos, ou fragmentos deles, polipeptídeos scFv, aptâmeros, ou peptídeos de ligação, como definido acima, para seleção de compostos responsáveis por modular a atividade imunossupressora das viroses ou das células de tumor.

[0281] Em uma concretização preferida dos usos definidos acima dos polipeptídeos como definidos acima, das proteínas como definidas acima, ou dos anticorpos, ou fragmentos deles, polipeptídeos scFv, aptâmeros, ou peptídeos de ligação, como definidos acima, os compostos para selecionar são peptídeos, em particular peptídeos compreendendo de 5 a 30 aminoácidos, tais como os peptídeos originários das bibliotecas de peptídeo combinatorial.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 MÉTODOS: Ratos e Linhagens de célula.

[0282] As linhagens da célula usadas nestes testes foram: - 293T, células de rim embrionárias (ATCC CRL11268), - HeLa, células do carcinoma epitelióide humano (ATCC CCL2), - MCA205, células fibrosarcoma murino metilcholantrene- induzidas (Shu e Rosenberg, 1985), - NIH 3T3, fibroblastos do rato,

[0283] Células foram cultivadas em DMEM suplementadas com 10% de soro de vitela fetal, estreptomicina (100 μg/ml) e penicilina (100 unidades/ml).

[0284] De maneira a testar o efeito imunossupressor da proteína modificada, ratos C57BL/6 e de BALB/c, 8 a 12 semanas de idade, obtido de Janvier (Laval, França), foram usados.

Construções.

[0285] Os vetores expressando o envoltório de HERV-W e HERV-T (phCMV-envW e phCMV-envT) têm sido previamente descritos (Blaise et al., 2003). Em resumo, compreendem um promotor (promotor precoce do citomegalovírus humano), o íntron β-globina do coelho e as sequências de poliadenilação. O cDNA do HERV-W env foi inserido entre os locais EcoRI do vetor (Figura 3A).

[0286] O gene envoltório de MPMV foi recuperado do vetor pTMO (Brody et al., 1994) por PCR usando os seguintes iniciadores: Atacatctcgagaccggtccaactagaaccatgaacttcaattatcatttcatctgga (SEQ ID NO: 55) e Atacatacgcgtctatgttaaggtcaaatatgagccacc (SEQ ID NO: 56) digerido com o XhoI e o MluI (sublinhados), e clonados em phCMV-envT digerido com as mesmas enzimas. O vetor da expressão de phCMV-envMPMV contendo e expressando o gene envoltório de MPMV foi obtido (Figura 2A). Estes vetores são usados no ensaio de fusão célula-célula e para a produção dos pseudotipos.

[0287] Posições de aminoácido * na seguinte descrição das construções foram numerados de acordo com a estrutura modelo da subunidade TM de HERV-W gerado com o software do Swiss-Model (Figura 8) (http://swissmodel.expasy.org/) e a estrutura da subunidade TM do vírus da leucemia murina de Moloney como um molde (Protein Data Bank ID: 1MOF(1), http://www.resb.org/pdf/). As posições 44 e 50 de acordo com este esquema de numeração representam, portanto, as seguintes posições quando identificadas nos precursores SU-TM dos envoltórios correspondentes descritos como o número de acesso da sequência NCBI:

[0288] A mutagênese de local dirigido de phCMV- envW foi realizada como descrito previamente (Kunkel et al., 1987), usando DNA de fita simples uracilatado como molde e oligonucleotídeos mutagênicos (mutação na face realçada), que também introduziram silenciosamente um local de restrição (sublinhado) para uma seleção mais fácil: A36G: tagtccttcaaatcgccgcggtttagacttgctaa (SEQ ID NO: 57), R44Q: acaagggggtacctgtttatttttaggggaaga (SEQ ID NO: 58), T47I: ccgctgaaagagggggcatatgtttatttttagggga (SEQ ID NO: 59), F50A: aaccgctgaaagagggggtacctgtttagctttaggggaaga (SEQ ID NO: 60), R44Q/F50A: aaccgctgaacaagggggtacctgtttagctttaggggaaga (SEQ ID NO: 61).

[0289] A mutagênese de local dirigido de phCMV- envMPMV foi realizada pelo mesmo método, exceto pelo fato de os fragmentos de PCR ligam a um iniciador antissenso introduzindo XhoI silenciosamente (cttcggcgtctctcgagagacgccgaag) (SEQ ID NO: 62) aos iniciadores mutagênicos Silent: caaaacagaagaggattagatctacttacagc (SEQ ID NO: 63), Q44R: tacttacagcagagagaggaggtatctgcttag (SEQ ID NO: 64), A50F: gggaggtatctgcttatttttacaggaaaaatgtt (SEQ ID NO: 65), Q44R/A50F: acttacagcagagagaggaggtatctgcttatttttacaggaaaaatg) (SEQ ID NO: 66) foram usados ao invés dos oligonucleotídeos sintéticos.

[0290] Os mutantes derivativos do pDFG-envW foram construídos pela ligação tripla dos fragmentos de BstBI-BsrGI e BsrGI-BstEII do pDFG-envW com o fragmento de BstEII-BstBI de phCMV-envW.

[0291] O pDFG-envMPMV e seus derivados mutantes (Figura 2B) foram construídos pela ligação dos fragmentos AgeI-MluI de phCMV-envMPMV no vetor do pDFG-MoTMTag digerido com a mesma enzima. O plasmídeo do pDFG é um envoltório expressando o vetor contendo LTRs, locais de ligação (SD e SA), uma sequência psi e um elemento de IRES (local de entrada do ribosoma interno), bem como um gene de seleção (gene resistente a antibiótico). Estes vetores (Figuras 1B, 2B e 3B) são usados nas Células de Tumor Expressando o Envoltório e na Análise in Vivo.

Propriedade de Fusão: Análise da Fusão Célula-Célula.

[0292] As células HeLa foram transfectadas usando Lipofectamine (Invitrogen, 2 μg do DNA para 5 x 105 células). A atividade da fusão das glicoproteínas envoltórias foi medida 24 h após a transfecção com os vetores de expressão correspondentes (Figuras 1A, 2A e 3A). Para visualizar o sincício, as células foram fixadas em metanol e coloridas pela adição de soluções May-Grunwald e Giemsa (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. O índice da fusão, que representa a porcentagem de eventos da fusão em uma população de célula é definido como [(N - S)/T ] x 100, onde N é o número dos núcleos na sincício, S é o número de sincício, e T é o número total dos núcleos contados (Figura 4). Um vetor phCMV não expressando a proteína envoltória foi usado como um controle negativo.

Propriedades Infecciosas: A Análise da Infectividade.

[0293] 7.5 x 105 células 293T foram cotransfectadas com 1.75 μg de CMV-gag-pol-MoMLV, 1.75 μg de MFG-nls-lacZ e o 0.55 μg do vetor phCMV (Figuras 1A, 2A e 3A) expressando as glicoproteínas envoltórias (tipo selvagem ou mudadas) que usam o método do fosfato de cálcio. O vetor MFG-nls-lacZ compreende o LTRs de MoMLV, a sequência psi, um NLS (sinal de localização nuclear) e o gene LacZ. Sobrenadantes que contêm os pseudotipos (corpo viral de MoMLV com proteína envoltória de uma outra cepa de vírus) foram recuperados 2 dias mais tarde, filtrados, seriamente diluídos em meio de cultura e usados para uma infecção de 4 x 103 células HeLa em placas da cultura de 96 poços na presença de 4 μg/mL de polibreno.

[0294] As placas foram fixadas 2 dias mais tarde, coloridas com X-gal por 1 hora, e os focos de células infectadas expressando β- galactosidase foram contados para determinar os títulos do pseudotipo (número de partículas infecciosas por ml do sobrenadante). Um vetor phCMV não expressando a proteína envoltória foi usado como controle negativo.

Propriedades lmunossupressoras: O Estabelecimento de Células do Tumor Expressando Envoltório e Análise in Vivo.

[0295] Os vetores de expressão retrovirais pDFG (1.75 μg) foram acondicionados por cotransfecção transiente em 7.5 x 105 células 293T com 1.75 μg de CMV-gag-pol-MoMLV e 0.55 μg CMV-envAmpho, usando o método do fosfato de cálcio. Sobrenadantes foram recuperados 2 dias mais tarde, filtrados e usados para uma infecção de 5 x 105 células do tumor MCA205 na presença de 4 μg/mL do polibreno, como descrito em Mangeney & Heidmann, 1998. As células foram mantidas em meio seletivo (400 unidades/mL de higromicina) por 2 semanas. Para análises in vivo, as células do tumor tripsinizadas, centrifugadas e resuspensas em PBS em uma concentração de 1 x 107 células/mL. 100 μL de cada suspensão foram injetados s.c. no flanco direito raspado de 3 ratos C57/BL6 e 8 a 10 BALB/c. O estabelecimento do tumor foi determinado por palpação e a área do tumor (mm2) foi determinada medindo diâmetros perpendiculares do tumor (Figura 5). O índice de imunossupressão é definido como i = (Senv-Snone)/Snone, em que Senv é a érea máxima alcançada por um tumor expressando uma proteína envoltória e Snone é a área máxima alcançada por um tumor não expressando a proteína envoltória (controle negativo).

RESULTADOS 1. Determinação das propriedades infecciosas das várias proteínas envoltórias tipo selvagem

[0296] A infecciosidade das proteínas envoltórias foi testada em células NIH 3T3 (MoMLV) ou em células HeLa (HERV-W e MPMV). A Figura 6 mostra que as três proteínas envoltórias tipo selvagem (linhagens 1, 5 e 9) foram capazes de sustentar uma infecção.

2. Determinação dos efeitos imunossupressores das várias proteínas envoltórias tipo selvagem

[0297] O efeito imunossupressor do retrovírus MPMV e do HERV-W foi testado nas células MCA205, injetadas em balb/c alogênico ou nos ratos C57Bl/6 singênicos. A Figura 7 mostra que os tumores expressando MPMV (barras pretas) foram maiores quando comparados aos tumores expressando HERV-W (barras brancas). Visto que os inventores confirmaram o efeito imunossupressor do envoltório MPMV, eles mostraram que HERV-W não foi capaz de imunossuprimir um hospedeiro alogênico.

[0298] Em conclusão, as proteínas envoltórias MPMV e HERV-W têm as mesmas propriedades em termos de fusogenicidade e infecciosidade, mas diferem por suas propriedades imunossupressoras.

3. Estratégia para a identificação da proteína envoltória com propriedades imunossupressoras alteradas

[0299] Baseado nas propriedades diferentes de HERV-W e MPMV, os inventores tentaram identificar domínios na sequência do aminoácido, os quais poderiam estar envolvidos na modulação da imunossupressão.

[0300] Um suposto domínio imunossupressor de 17 aminoácidos foi previamente caracterizado em várias publicações entre o aminoácido 30 e o aminoácido 47 do subdomínio cristalizado, o domínio TM, respectivamente duas leucinas (L) no MoMLV (Blaise et al. 2001 J Viral. 82, 1597- 1600).

[0301] Uma estratégia de duas etapas foi aplicada; a primeira etapa foi modificar uma proteína envoltória de tal maneira que a proteína derivada (isto é, a proteína modificada) retenha as propriedades de fusão e infecção da proteína não modificada correspondente. Uma vez que uma proteína envoltória modificada tenha sido identificada, seu efeito imunossupressor foi testado e comparado com aquele da proteína nada modificada.

4. Estudo da HERV-W modificada

[0302] Uma dificuldade esbarra no fato de que tentativas precedentes para modificar a composição de aminoácido da subunidade TM têm conduzido à perda da associação de SU-TM e têm alterado a infectividade. Uma deleção de Leucina 30 para Treonina 40 do domínio imunossupressor MPMV, por exemplo, anula completamente a infectividade das proteínas envoltórias (Brody et al. 1992 J Virol 66, 3466-3475; Brody et al. 1994 Virology 202, 673-683).

[0303] Apesar destas tentativas mal sucedidas, os inventores estudaram a composição do aminoácido do domínio ISU, e seu possível impacto na estrutura do domínio e alcançaram uma nova definição do referido domínio ISU envolvido nas propriedades imunossupressoras observadas in vivo. Eles adicionalmente determinaram que algumas posições na sequência do aminoácido das proteínas junto com a natureza dos resíduos do aminoácido nestas posições foram críticas para o efeito imunossupressivo.

[0304] Os inventores especialmente designaram algumas modificações na sequência do aminoácido de uma proteína envoltória não imunossupressora, isto é, proteína HERV-WEnv, para torná-la imunossupressora, usando, por exemplo, a substituição de resíduos determinados pelos resíduos de MPMV correspondentes.

a. Propriedades infecciosas

[0305] As substituições A36G e T47I do envoltório HERV-W não modificaram a infecciosidade, a fusogenicidade e o efeito imunossupressor da proteína envoltória (Tabela 1). Estes dois aminoácidos parecem não ser determinantes para estas funções. Pelo contrário, as substituições R44Q ou F50A alteraram fortemente as propriedades infecciosas e de fusão da proteína envoltória (Tabela 1, e Figura 6, linhas 2 e 3).

[0306] Um duplo mutante compreendendo as substituições R44Q e F50A foi construído. Surpreendentemente, o duplo mutante reteve as propriedades infecciosas e de fusão similares àquelas do polipeptídeo tipo selvagem (Tabela 1 e Figura 6, linha 4).

[0307] Este resultado, e a delineação desta proteína envoltória modificada usando algumas posições homólogas encontradas no envoltório de MoMLV (Figura 8), sugere que estes dois aminoácidos poderiam interagir juntos por causa de suas respectivas localizações na estrutura da unidade TM da proteína envoltória, e sua natureza. Esta possível interação pode explicar o comportamento compensatório deste par de mutações. Isto foi inesperado, por causa das tentativas precedentes que falharam em identificar tais aminoácidos.

b. Propriedades imunossupressoras

[0308] Um outro resultado, tão surpreendente como o acima mencionado, origina-se a partir do estudo do efeito imunossupressor. De fato, considerando que a proteína envoltória HERV-W tipo selvagem não era imunossupressora em vista do tamanho dos tumores, o mutante duplo HERV- W era mais imunossupressor que as proteínas envoltórias MPMV tipo selvagem (Tabela 1 e Figura 7, barras brancas).

[0309] Além disso, os inventores identificaram duas posições dos aminoácidos na sequência, uma das quais não foi relatada anteriormente como parte do domínio ISU (posição 50), que, tomadas juntas, revelaram estar envolvidas na modulação do efeito imunossupressor das proteínas envoltórias HERV-W.Tabela 1: Resultados obtidos pelas propriedades de fusão, infecção e

5. Estudo das proteínas envoltórias do retrovírus modificadas

[0310] Para confirmar o fato de que estes resíduos de aminoácidos pertencem a um determinante de imunossupressão, outros retrovírus compreendendo aminoácido similar nas posições 44 (E ou Q) e 50 (F) foram selecionados. Vários destes retrovírus têm sido identificados e são descritos na Figura 9: vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), vírus Friend, vírus da leucemia Feline (FeLV), vírus linfotrópico da célula-T humana tipo-1 (HTLV-1) e vírus linfotrópico da célula-T do macaco tipo-1 (STLV-1).

[0311] Em dois deles, os vírus MPMV e MoMLV, os resíduos de aminoácido 44 e 50 foram substituídos pelos aminoácidos correspondentes encontrados em HERV-W. As seguintes construções foram feitas: E44R, A50F e E44R/A50F (MoMLV) e, Q44R, A50F e Q44R/A50F (MPMV).

a. Propriedade infecciosas

[0312] Interessantemente, em MoMLV, o mutante simples perde suas propriedades de infectividade (Tabela 2 e Figura 6, linhas 6 e 7), considerando que o duplo mutante tem as mesmas propriedades que a proteína tipo selvagem (Tabela 2 e Figura 6, linha 8).

[0313] Em MPMV, diferenças ligeiras foram observadas entre mutantes e tipo selvagem, mas somente o duplo mutante apresenta propriedades estritamente idênticas às proteínas tipo selvagem (Tabela 3 e Figura 6, linhas 10 a 12).

b. Propriedades imunossupressoras

[0314] Em MoMLV, uma proteína com a substituição E44R ou um duplo mutante (E44R+A50F) tem suas propriedades imunossupressoras reduzidas in vivo (Tabela 2).

[0315] Em MPMV, uma proteína com a substituição Q44R ou um duplo mutante (Q44R+A50F) têm suas propriedades imunossupressoras reduzidas in vivo (Tabela 3).Tabela 2: Os resultados obtidos para propriedades infeciosas e de imunossupressão de proteínas envoltórias MoMLV modificadas (MoMLV é não fusiogênico). n/d: não determinado

Tabela 3: Resultados obtidos para propriedades de fusão, infecciosas e de

[0316] Tomados juntos, todos estes resultados permitem extrair as seguintes conclusões:

[0317] Primeiramente, uma única mutação parece suficiente para modificar as propriedades imunossupressoras de uma proteína envoltória imunossupressora retroviral. Na verdade, a substituição da glutamina ou do ácido glutâmico na posição 44 com uma arginina reduziu o comportamento imunossupressor dos mutantes. Entretanto, as propriedades de fusão e infecciosas, mesmo se não anuladas, são fortemente reduzidas (MPMV).

[0318] Em segundo lugar, os duplos mutantes (nas posições 44 e 50) têm propriedades imunossupressoras reduzidas quando comparados à proteína envoltória tipo selvagem correspondente. Interessantemente, os duplos mutantes MPMV têm as propriedades de fusão tão eficientes quanto aquelas da proteína tipo selvagem, e propriedades infecciosas elevadas. O interesse de tal proteína na produção de partículas virais e da vacina viva é promissor.

EXEMPLO 2 MÉTODOS

[0319] Ratos e linhagens de célula: Os ratos suíços (FV permissivos), de 10 semanas de idade, foram obtidos de Janvier (Laval, França). As linhagens de células 293T (ATCC CRL11268), HeLa (ATCC CCL2), NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) e MCA205 (REF) foram cultivados em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitela, estreptomicina (100 μg/ml) e penicilina (100 unidades/ml).

[0320] Construções: Plasmídeos p57 (Oliff et al. J Virol 33, 475-86 (1980)) e pET28(+)b (Novagen) foram usados.

[0321] phCMV-envFV foi construído como phCMV-envMPMV (Exemplo 1), usando p57 como o molde de PCR e os iniciadores 16 e 17. Os derivados do mutante foram construídos pela inserção nos produtos de PCR de dois vetores abertos Clal/Avrll, o primeiro digerido com Clal, o segundo com Avril. Estes fragmentos foram gerados com pares 1-2 e 3-4 do iniciador fosforilatado para a mutação E14R (que corresponde à mutação E561R do ENV de comprimento total), pares 1-5 e 3-6 para a mutação A20F (que corresponde à mutação A567F do ENV de comprimento total), e pares 1-2 e 4-6 para a mutação E14R+A20F. pDFG-envFV e seu derivado mutante foram construídos pela inserção de fragmentos Agel/Mlul de phCMV- envFV no pDFG-MoTMTag digerido com as mesmas enzimas. O duplo mutante p57 foi construído pela inserção do fragmento BstZ11I/Bsml do duplo mutante phCMV-envFV em p57 digerido com as mesmas enzimas.

[0322] O vetor de expressão bacteriano para a subunidade de SU da proteína envoltória FV foi construído pela inserção de um fragmento de PCR gerado com phCMV-envFV como um molde e um par 7-8 do iniciador, e digerido com NcoI e XhoI, em pET28(+)b digerido com as mesmas enzimas.

[0323] Os vetores de expressão bacterianos para as subunidades SU e TM da proteína envoltória foram construídos pela inserção de um fragmento de PCR gerado com tipo selvagem ou duplo mutante phCMV- envFV como um molde e um par 7-8 ou 9-10 do iniciador, e digerido com o NcoI e o XhoI, em pET28(+)b digerido com as mesmas enzimas. SEQUÊNCIA SEQ ID 1 CAACCTTACCAACCCTGATAAAACTCAAGA SEQ ID NO: 131 2 CAG ICCICCICIIIIIAGGAACAACAGG 1 C IAGGC SEQ ID NO: 132 3 TGTGCTGCCCTAAAAGAAGAATGTTGTT SEQ ID NO: 133 4 GGACTAAAGCCTGGACTACTGAGATCCTG SEQ ID NO: 134 5 CAGTCCTCCTTCTTTTAGGAACAACAGGT SEQ ID NO: 135 6 TGTGCTTTCCTAAAAGAAGAATGTTGTTTCTAT SEQ ID NO: 136 7 ATACATCCATGGCGTGTTCAACGCTCCCAAAATCCCCTA SEQ ID NO: 137 8 AI ACAI C I CGAG IICICIIIIAIGICIAIAGGAIIIII CAAAC SEQ ID NO: 138 9 ATACATCCATGGCTGCCGTACAAGATGATCTCA SEQ ID NO: 140 10 ATACATCTCGAGATCTCTTACTAGGCCTGTATGGTCAGC SEQ ID NO: 141

[0324] Produção, quantificação e inativação viral: 7.5x105 células 293T foram transfectadas com 4 μg de DNA p57 usando um kit de transfecção de fosfato de cálcio (Invitrogen). 48h mais tarde, sobrenadantes das células foram usados para infectar 5x105 células NIH/3T3 na presença do polibreno de 4 μg/mL e as células infectadas foram cultivadas por 4 dias adicionais. As partículas virais foram coletadas dos sobrenadantes das células, concentradas por ultracentrifugação, resuspensas em PBS, e congeladas. A inativação foi realizada por exposição a uma suspensão viral em PBS à luz UV em 0.5 mW/cm2 durante 30 minutos.

[0325] Análise de Imunossupressão: As células MCA205 foram transduzidas com um vetor de expressão do gene envoltório ou um vetor vazio, e enxertado em ratos alogênicos onde estabeleceram tumores transientes, como descrito no Exemplo 1. O índice de imunossupressão foi calculado como (Aenv- Anone)/Anone, onde Aenv e Anone são as áreas médias do tumor obtidas com as células expressando o gene envoltório e o cassete vazio, respectivamente.

[0326] Análises de fusão e infectividade célula-célula: foram realizadas como descrito no Exemplo 1, com o phCMV-envFV e os seus derivativos mutantes como vetores de expressão do envoltório.

[0327] Análise da carga viral: O RNA de 2 μl da concentração viral ou 20 μl de sobrenadante celular ou de soro foi extraído usando o microkit RNAeasy (QIAgen), o reverso-transcrito foi obtido com o kit de transcrição reversa de MoMuLV (Applied) e hexâmeros randômicos como iniciadores, e o cDNA foi quantificado pelo método de PCR de tempo real usando o kit Platinum SYBR Green qPCR (Invitrogen) e os iniciadores CTCAGGGAGCAGCGGGA (SEQ ID NO: 142) e TAGCTTAAGTCTGTTCCAGGCAGTG (SEQ ID NO: 143).

[0328] Proteínas recombinantes: As proteínas recombinantes foram produzidas nas células de E. coli BL21(DE3) (Stratagene) usando pET28(+)b (Novagen) como um vetor de expressão. A subunidade SU foi produzida como corpos de inclusão, e as subunidades tipo selvagem e mutante TM como material solúvel. Elas foram purificadas em colunas HiTrap Chelating HP (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante. As subunidades TM foram adicionalmente purificadas em uma coluna Superdex 75 HRl 0/30 (Amersham) para isolar a forma trimérica principal, seus teores LPS foram quantificados usando o kit LAL QCL-1000 (Cambrex) e ajustados a 5 μg/mg de proteína pela adição de LPS de E. coli (cepa 0111:B4, Sigma).

[0329] Imunização dos ratos: Os ratos foram injetados três vezes em um intervalo de uma semana com 100 μg de subunidades TM recombinantes ou 1.5 1010 cópias do RNA de uma partícula viral intacta ou FV inativadas por UV. 100 μg de CpG (oligonucleotídeo fosforotioato TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 144)) foram sistematicamente adicionados como um adjuvante. Os soros foram coletados 4 dias após a última imunização. Os ratos com partículas imunizadas virais inativadas foram provocados com 106 cópias do RNA de FV tipo selvagem, e os soros pós mudança foram coletados 5 dias mais tarde.

[0330] Detecção de FV imune: A subunidade SU recombinante foi produzida como corpos de inclusão em células de E. coli BL21(DE3) (Stratagene) usando pET28(+)b (Novagen) como um vetor de expressão, purificado em uma coluna HiTrap Chelating HP (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante, e usado para revestir microplacas MaxiSorp (Nunc) em uma concentração de 2 μg/ml. Os níveis de IgG em soros diluídos de forma seriada foram quantificados usando um anticorpo anti-rato IgG conjugado a HRP (Amersham) e a OPD como um reagente cromogênico (Sigma).

RESULTADOS 1. Perda da imunossupressão da proteína envoltória induzida conduzindo a uma rejeição imune completa de um retrovírus infeccioso

[0331] A disjunção genética, gerada por dupla mutação entre a imunossupressão e a infectividade evidenciada no Exemplo 1, abre a possibilidade de gerar um retrovírus inteiro isento da atividade imunossupressora de sua proteína envoltória, mas ainda replicativo e infeccioso.

[0332] O Vírus da Leucemia Murina Friend (FV) foi escolhido como um modelo porque o genoma do rato não contém um retrovírus endógeno relacionado que poderia prejudicar sua detecção in vivo.

[0333] Os resíduos chaves do envoltório FV foram substituídos por aqueles de Syncytin-1 (HERV-W ENV), e foi checado, como para o envoltório de MPMV, que a dupla mutação E14R + A20F (que corresponde à mutação E561R + de A567F do comprimento total do ENV) reverte a imunossupressão sem alterar a infectividade (Figuras 11A e 11B). O gene envoltório tipo selvagem foi substituído por seu mutante não imunossupressor no clone molecular 57 FV, e cada tipo de partículas retrovirais foi produzido in vitro. Os rendimentos do vírus foram similares quando medidos por uma análise quantitativa do RNA viral nos sobrenadantes das células por RT-PCR.

[0334] Como esperado, ambos os tipos do vírus demonstraram a mesma cinética de propagação em uma análise de infecção in vitro nas células NIH/3T3 (Figura 11C), e similarmente quando injetado in vivo em ratos imunocomprometidos, irradiados com 5-Cinza (Figura 12A).

[0335] Em ratos normais, o FV tipo selvagem estabeleceu primeiramente viremia elevada em todos os ratos durante a fase da primo- infecção (no dia 7 após a injeção do vírus, Figuras 12A-12B). Esta fase foi seguida pelo estabelecimento de infecções persistentes, os ratos sendo capazes de controlar a replicação viral em várias extensões, como esperado com os ratos não congênicos, exogênicos. Após 4 meses, 80% dos ratos infectados apresentaram uma síndrome de eritroleucemia, com um nível de hematócrito abaixo de 35%.

[0336] Em contraste, o FV não-imunossupressor mutado foi indetectável como primeiramente nos 14 dias após a injeção de doses frequentemente muito elevadas de cópias virais (106 cópias do RNA, 102 ID50) com nenhuma evidência para qualquer patologia. Importantemente, IgG dirigido contra a proteína envoltória FV foi detectado persistentemente nos ratos infectados com FV tipo selvagem, mas somente transientemente nos ratos infectados com o FV duplo mutante (Figura 13), indicando a liberação completa do vírus mutado.

[0337] Em conclusão, as presentes experiências demonstram que a imunossupressão dirigida pelo envoltório é essencial para a infecção FV, como sua ausência conduz à rejeição imune completa do vírus entrante.

2. Imunogenicidade aumentada de proteínas envoltórias recombinantes imunossupressoras-negativas e partículas virais inativadas

[0338] Como o elemento chave para a entrada viral na célula alvo, as proteínas envoltórias retrovirais são sistematicamente incluídas em cada formulação vacinal, como proteínas recombinantes, como fragmentos delas, ou como genes carregados por um vetor viral defeituoso. Poder-se-ia suspeitar que a imunossupressão da proteína-mediada do envoltório poderia inibir a resposta montada contra um imunogênio contendo o ISU, assim abaixando sua eficiência vacinal.

[0339] Para testar esta hipótese, dois tipos de imunogenes contendo ISU foram gerados: 1) proteínas recombinantes correspondendo aos ectodomínios da subunidade TM da proteína envoltória FV tipo selvagem ou mutante, produzido em E. coli como forma solúvel - assim corretamente dobrada - e formas triméricas demonstrando comportamento idêntico após purificação; 2) partículas FV tipo selvagem e mutante que estavam intactas ou inativadas pela exposição à luz UV, de maneira a preservar a estrutura nativa de suas proteínas envoltórias. Estes imunogenes foram injetados três vezes em ratos suíços para gerar uma resposta humoral secundariamente forte.

[0340] Como ilustrado na Figura 14A, somente a proteína envoltória não-imunossupressora mutante alcança tal resposta, com níveis elevados de IgG. Em cada caso, os sinais obtidos com as placas revestidas com as subunidades TM mutante ou o tipo selvagem foram quantitativamente os mesmos, indicando que os anticorpos anti-TM nos soros dos ratos não são preferencialmente dirigidos contra o próprio ISU, mas antes contra outros epítopos dentro das subunidades TM.

[0341] Assim, a dupla mutação introduzida na proteína envoltória FV não converte seu ISU em um epítopo altamente eficiente. Em adição, os níveis de IgM alcançados pela proteína envoltória tipo selvagem são muito mais elevados do que aqueles alcançados por suas contrapartes mutantes não-imunossupressoras. Estes resultados sugerem que o domínio imunossupressor da proteína envoltória FV inibe diretamente o sistema imune, e que este efeito não requer a entrada e replicação viral na célula alvo nem mesmo em nenhum outro componente viral a não ser a subunidade TM sozinha.

[0342] A Figura 14B confirma estes resultados com MoMLV ENV e HERV-W ENV. Quase nenhuma resposta de IgG é suscitada contra a subunidade TM recombinante tipo selvagem de MoMLV ENV, visto que o duplo mutante não imunossupressor (ver Exemplo 1) mostra uma resposta de IgG forte. Além do mais, como esperado, uma resposta de lgG é vista contra a subunidade TM HERV-W ENV, que é naturalmente privada da atividade imunossupressora, considerando que o duplo mutante imunossupressor (ver Exemplo 1) suscita somente uma resposta de lgG leve.

3. Perda da imunossupressão da proteína envoltória induzida aperfeiçoa a eficiência vacinal de partículas virais inativadas

[0343] Poder-se-ia suspeitar que este efeito de inibição de antigenicidade do ISU poderia abaixar a eficiência de qualquer formulação de vacina contendo uma proteína do envoltório imunossupressora, e, assim, que a interrupção específica, induzida pela dupla mutação , deste efeito poderia aperfeiçoar a eficiência vacinal.

[0344] Para testar esta hipótese, ratos imunizados com partículas virais inativadas de duplo mutante e do tipo selvagem ou com partículas virais do duplo mutante intacto foram provocados com o FV tipo selvagem intacto. As cargas virais do soro foram, então, analisadas no pico da viremia, cinco dias após a mudança (Figura 15).

[0345] O vírus foi detectável em todos os ratos imunizados com o FV tipo selvagem inativados, contudo com a média geométrica da carga viral 50 vezes menor do que aquela dos ratos de controle imunizados somente com o adjuvante, indicando uma proteção significante, mas incompleta conferida pela imunização com partículas tipo selvagem. Em contraste, as cargas virais de 6 dos 14 ratos imunizados com o FV mutante duplo inativados não-imunossupressor estavam abaixo do ponto inicial da detecção da análise, e a média geométrica da carga viral foi reduzida 7500 vezes quando comparada aos ratos imunizados somente com adjuvante. Além do mais, as cargas virais de 12 dente os 14 ratos imunizados com o FV duplo mutante não- imunossupressor intacto estavam abaixo da detecção do ponto inicial e a média geométrica da carga viral estava também abaixo do ponto inicial da detecção.

[0346] Estes resultados mostram que o rompimento da imunossupressão pelas mutações que preservam a função canônica - assim a estrutura - de uma proteína envoltória aperfeiçoa a eficiência da formulação vacinal baseada em tais proteínas.

EXEMPLO 3 MÉTODOS

[0347] Ratos e linhagens de célula: Os ratos C57BL/6 e SCID, de 8-12 semanas de idade, foram obtidos de Janvier (França). B16 (linhagem de célula do melanoma murine de origem C57BL/6, EACC 94042254) e 293T (células de rim embrionárias humanas, ATCC CRL11268) foram mantidos em DMEM suplementado com 10% de soro de vitela fetal inativado por calor e antibióticos.

[0348] Construções: vetores de expressão plncxH1 derivados dos vetores plncx (Miller and Rosman Biotechniques 1989;7: 989-90) e pSUPER (Brummelkamp et al. Science 2002;296: 550-3) foram construídos para gerar os transcritos curtos dirigidos contra MelARV (alvo para o transcrito genômico dentro da sequência gag; posições nt 1220-1238 do códon de partida), ou contra o transcrito da proteína fluorescente verde (posição nt 215233 a partir do códon de partida) como um controle. Eles foram obtidos primeiramente por inserção de oligonucleotídeos 64-mer anelados (sequências na Figura 1B) no pSUPER aberto nos locais Bglll e HindIII, seguidos pela introdução do fragmento BamHI-HindIII destas construções no plncx aberto nos locais correspondentes. O vetor da expressão para o envoltório MelARV (pDFG MelARVenv) e o controle (nenhum pDFG) foram construídos pela introdução (ou não) de um produto de RT-PCR, gerado do RNA viral MelARV usando um iniciador contendo Agel na extremidade 5’ do envoltório e um iniciador contendo Xhol na extremidade 3’ do envoltório, em um vetor pDFG contendo higromicina (Mangeney and Heidmann Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: 14920-14925) aberto nos mesmos locais.

[0349] Estabelecimento de células do tumor ERVKD B16: 7.5x105 de células 293T foram cotransfectadas com o vetor plncxHl (1.75 μg) e vetores de expressão para as proteínas MLV (0.55 μg para o vetor envoltório MLV anfotrópico e 1.75 μg para o vetor MLV gag e pol, ver Blaise et al. J Viral 2004;78: 1050- 1054). Trinta seis horas pós-transfecção, os sobrenadantes virais foram coletados para a infecção das células do tumor B16 (2.5 ml do sobrenadante para 5x105 células, com 8 μg/ml de polibreno). As células foram mantidas no meio seletivo (1 mg/ml de neomicina) por três semanas. Em algumas experiências, o vetor de expressão MelARVenv pDFG (ou o controle de nenhum pDFG) foi adicionalmente introduzido nas células usando o mesmo protocolo e células infectadas foram selecionados com 300 unidades/ml de higromicina.

[0350] Expressão das proteínas MelARV: A análise da expressão MelARV foi realizada por Western blot. Os sobrenadantes de 107 células foram coletados, centrifugados por 10 minutos a 100xg, filtrados e concentrados por ultracentrifugação em um rotor de SW41 Beckman (150.000xg, 1 hora, 4°C). Os pellets foram resuspensos no tampão de lise, submetidos a SDS-PAGE, submetidos ao bloting e revelados com o anti-Env mAb (Ciancolo et al. J Exp Med 1984; 159:964-969) e soro da cabra anti-Gag (Viromed Biosafety Labs).

[0351] Análise de transformação in vitro: as células de controle e ERVKD-B16 foram colocadas em ágar suave para determinar a eficiência do crescimento independente ancoragem. As células (2x103 ou 2x104) foram colocadas em 5 ml de 0.33% de ágar em DMEM com 10% de soro bovino fetal recoberto em uma camada sólida de 0.5% ágar em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal. A cultura foi mantida por 4 semanas, as colônias foram coloridas com solução INT (Sigma-Aldrich) e então contadas.

[0352] Progressão do tumor in vivo: Para ensaios in vivo, as células do tumor foram lavadas três vezes com PBS, fragmentadas sem tripsinação, e inoculadas subcutaneamente em uma área raspada do flanco direito do rato. O estabelecimento do tumor foi determinado por palpação e a área do tumor foi determinada pela medição dos diâmetros perpendiculares do tumor.

[0353] Purificação da célula T CD4+CD25+ e transferência adotiva nos ratos C57BL/6 singênicos: As células CD4+CD25+ foram isoladas de forma fresca dos baços dos ratos C57BL/6 enxertados com 2x105 células B16 17 dias antes. As células foram purificadas por um procedimento de duas etapas de seleções negativas e positivas, usando grânulos magnéticos MACS (kit de isolamento da célula T regulatória do rato, Miltenyi Biotech), de acordo com as instruções do fabricante. Cinquenta mil linfócitos purificados foram transferidos intravenosamente nos ratos C57BL/6 simples. Os ratos recipientes foram provocados no mesmo dia com 2x105 células de controle- ou ERVKD-B16 no flanco direito.

RESULTADOS 1. Abaixar o ERV não modifica o fenótipo transformado de células melanoma B16.

[0354] Uma tentativa de interferência do RNA foi usada baseada em vetores estáveis produzindo RNA duplex curto (dsRNA) dirigido contra o genoma viral do elemento MelARV e o irrelevante gene gfp como um controle. A análise racional do procedimento e a estrutura dos plasmídeos usados são ilustradas nas Figuras 16A-16B. A Figura 16C mostra claramente que o vetor dsRNA ERV-específico quase completamente anulou a expressão ERV nas células B16 transduzidas (células ERVKD B16), com uma redução > de 10 vezes na quantidade das proteínas virais Env e Gag quando comparada às células transduzidas de controle (célula B16 de controle). Como uma próxima etapa, o fenótipo transformado das células ERVKD e de controle B16 foram analisadas in vitro e in vivo. In vitro, a taxa de crescimento de ancoragem independente foi medida após colocação em meio semissólido (análise em ágar suave). Como ilustrado na Figura 17A, a linha da célula ERVKD B16 deu uma elevação para um número similar das colônias como as células de controle B16. In vivo, a taxa de crescimento das duas populações de célula foi analisada após enxerto em ratos X-irradiados ou SCID. Como ilustrado na Figura 17B, ambas as populações da célula têm um fenótipo transformado, com taxas de crescimento similares. Em conjunto, estes resultados mostram que o abaixamento do retrovírus endogenoso MelARV não tem nenhum efeito no estado transformado das células de melanoma.

2. Abaixar o ERV inibe o crescimento da célula do tumor B16 in vivo e aumenta a sobrevivência de hospedeiros imunocompetentes.

[0355] Para investigar se as células do tumor podem oprimir a resposta antitumoral in vivo através de um mecanismo ERV-dependente, os inventores exploraram o impacto do abaixamento de MelARV na progressão do tumor pela injeção no rato imunocompetente C57BL/6 com o controle e as células ERVKD B16. Como ilustrado na Figura 18A, o crescimento das células de controle B16, como esperado, conduziu a tumores grandes na maioria dos animais, considerando que as células ERVKD B16 renderam tumores de um tamanho limitado e em somente em um número pequeno de ratos enxertados. A diferença no crescimento da célula do tumor é também claramente substanciada pela extensão da sobrevivência do animal (Figura 18B): assim no dia 70, 90% dos ratos enxertados com as células B16 de controle tinham sido mortos por seus tumores, considerando que 80% dos ratos enxertados com célula ERVKD B16 estavam vivos e livres de tumores (e ainda assim no dia 130). Em uma tentativa de identificar os genes de MelARV envolvidos nos efeitos observados, um vetor da expressão (faltando a sequência dsRNA- alvejada) para o gene env MelARV único foi introduzido atrás nas células ERVKD B16. As células B16 ERVKD+env duplas transduzidas resultantes (ou controle) foram então enxertadas nos ratos C57BL/6. Como ilustrado na Figura 18C, isto resultou na reversão parcial do efeito de abaixamento, com os já 50% dos ratos enxertados com as células expressando Env mortas pelo dia 70. Esta reversão indica que o gene env é - pelo menos em parte - responsável pelo escape imune do tumor. O efeito parcial da reversão é mais provavelmente explicado pela expressão mais baixa (Figura 19) da proteína Env quando expressado pelo vetor exógeno.

[0356] Ao longo desta linha, é de interesse aquela primeira série das experiências usando o siRNA sintético alvejado a MelARV, e injetado intraperitoneamente 12 dias após o enxerto das células B16 em ratos imunocompetentes, que realmente resultou em uma inibição de 1/3 do crescimento do tumor em comparação aos ratos injetados com siRNA de controle (Figura 20A) e, como ilustrado na Figura suplementar 20B, em um aumento reproduzível no atraso da sobrevivência.

[0357] Os presentes dados demonstram que os tumores são capazes de oprimir o sistema imune pela expressão do envoltório de um ERV e que bloqueia a expressão ERV resultado da rejeição do tumor aumentado.

[0358] É digno de nota que nos seres humanos a expressão dos genes env ERV, principalmente restringida à placenta e aos testículos nos tecidos normais, pode ser observada em vários tipos de tumor, tais como seminomas e melanomas. Tais proteínas HERV ENV têm sido mostradas para ser imunossupressoras. Consequentemente, a inibição da expressão ou da atividade destas proteínas ENV é uma tentativa aproximada de aumentar uma resposta imune contra tumores expressando ENV. Tal inibição da atividade das proteínas ENV tumorais podia ser realizada, por exemplo, por uma resposta imune suscitada por uma vacinação profilática ou terapêutica com as proteínas ENV mutadas esgotadas de sua atividade imunossupressora de acordo com a invenção ou pelos compostos diretamente ligados às proteínas ENV tumorais.

Claims (20)

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de ter uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de: LQNWRALDLLTAKRGGTCLF (SEQ ID NO: 41) LQNWRALDLLIAKRGGTCVF (SEQ ID NO: 42) LQNRRGLDLLTAERGGTCLF (SEQ ID NO: 43) LQNRRALDLLTAERGGICLF (SEQ ID NO: 44) AQNRRGLDLLFWERGGLCKF (SEQ ID NO: 48) LQNCRCLDLLFLSRGGLCAF (SEQ ID NO: 49) LQNRRGLDMLTAARGGLCLF (SEQ ID NO: 50) LQNRRGLDLLTAERGGICLF (SEQ ID NO: 51) LQNRRGLDILFLQRGGLCAF (SEQ ID NO: 52) LQNRRGLDLLFLKRGGLCAF (SEQ ID NO: 53) LQNRRGLDLLFLKRGGLCVF (SEQ ID NO: 54), estas sequências imunossupressoras-modulatórias não proporcionando essencialmente propriedades imunossupressoras para uma proteína compreendendo-as.

2. Proteína ENV mutada resultante da mutação de uma proteína ENV tipo selvagem, caracterizada por compreender essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, no qual X1 é E ou Q e X2 é A e Y1 a Y12 representam qualquer aminoácido, em que o aminoácido X1 é substituído por R a referida proteína ENV mutada quase não tendo atividade imunossupressora com relação à proteína ENV do tipo selvagem.

3. Proteína ENV mutada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de ser resultante da mutação de uma proteína ENV tipo selvagem e compreender essencialmente a seguinte sequência: NY1Y2Y3LY4Y5LY6Y7Y8X1Y9Y10Y11CY12X2, em que o aminoácido X1 é substituído por Re o aminoácido X2 é substituído por F.

4. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é uma HERV ENV, em particular selecionada de: HERV-FRD ENV (SEQ ID NO: 82), no qual X1 é Q427 e X2 é A433, ou HERV-T ENV (SEQ ID NO: 84), no qual X1 é Q516 e X2 é A522.

5. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é HERV-FRD ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada a partir de: SEQ ID NO: 120, e SEQ ID NO: 122.

6. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é HERV-T ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada a partir de: SEQ ID NO: 128, e SEQ ID NO: 130.

7. Proteína de ENV mutada, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é selecionada a partir de: HTLV-1 ENV (SEQ ID NO: 92), no qual X1 é Q389 e X2 é A395, ou HTLV-2 ENV (SEQ ID NO: 94) no qual X1 é Q385 e X2 é A391, ou FeLV ENV (SEQ ID NO: 96), no qual X1 é E527 e X2 é A533, ou PERV ENV (SEQ ID NO: 98), no qual X1 é E545 e X2 é A551, ou STLV-1 ENV (SEQ ID NO: 100), no qual X1 é Q389 e X2 é A395, ou MoMLV ENV (SEQ ID NO: 70), no qual X1 éE551 e X2 é A557, ou MPMV ENV (SEQ ID NO: 72), no qual X1 é Q471 e X2 é A477, ou FV ENV (SEQ ID NO: 102), no qual X1 é E561 e X2 é A567.

8. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de ENV é FeLV ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada a partir de: SEQ ID NO: 104, e SEQ ID NO: 106.

9. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é HTLV-1 ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada a partir de SEQ ID NO: 108 e SEQ ID NO: 110.

10. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é HTLV-2 ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada a partir de: SEQ ID NO: 112, e SEQ ID NO: 114.

11. Proteína ENV mutada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína ENV é PERV ENV e a sequência da proteína ENV mutada é selecionada a partir de: SEQ ID NO: 150, e SEQ ID NO: 152.

12. Composição farmacêutica ou de vacina, caracterizada pelo fato de compreender como substância ativa: pelo menos um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, ou pelo menos uma proteína ENV mutada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 2 a 11, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Uso de pelo menos uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína ENV mutada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 11, ou um ácido nucléico que codifica para referida proteína, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento de doenças virais.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de as doenças virais serem infecções de HTLV ou FeLV.

15. Uso de pelo menos uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína ENV mutada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de2 a 11, ou um ácido nucléico que codifica para referida proteína, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento de câncer.

16. Uso de pelo menos uma proteína compreendendo ou constituída de uma proteína ENV mutada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 2 a 11, ou um ácido nucléico que codifica para referida proteína, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento de doenças autoimunes, alergias ou rejeições enxerto.

17. Uso de pelo menos um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, ou um ácido nucléico que codifica para referido polipeptídeo, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento pretendido para a prevenção e/ou o tratamento do câncer, de doenças virais, ou de patologias que requerem uma inibição do sistema imune, tais como doenças autoimunes, alergias e rejeições de enxertos.

18. Uso de pelo menos uma proteína compreendendo ou consistindo em uma proteína ENV mutada conforme definida nas reivindicações 2 a 11 ou de um ácido nucléico que codifica para a referida proteína, a referida proteína sendo caracterizada pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento, ou de uma vacina, pretendido para a prevenção e/ou o tratamento de doenças autoimunes, alergias e rejeições de enxertos.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína ENV é selecionada a partir de: HERV-T ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 84, ou HERV-R ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 86, ou HERV-V ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 88, ou HERV-R(b) ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 90, ou HTLV-1 ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 92, ou HTLV-2 ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 94, ou FeLV ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 96, ou PERV ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 98, ou STLV-1 ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 100, ou FV ENV, tal como representada por SEQ ID NO: 102.

20. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, ou de uma proteína conforme definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ligantes proteínas de ENV selecionadas a partir de: anticorpos policlonais ou monoclonais, ou fragmentos destes, tais como fragmentos Fab ou F(ab)'2 , polipeptídeos scFv, aptâmeros, e peptídeos de ligação.

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