BRPI0512392B1 - Composição para impedir ou aliviar um sintoma ou distúrbio associado ao desequilíbrio de cálcio, e uso de aequorina - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES CONTENDO AEQUORINA E USO DA AEQUORINA. A presente invenção refere-se a composições contendo aequorina e métodos para seu uso na prevenção e/ou para aliviar sintomas e distúrbios relacionados ao desequilíbrio de cálcio são fornecidos pela presente invenção.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere em geral às composições úteis para a manutenção de homeostase de cálcio. Em particular, esta invenção é direcionada a composições farmacêuticas e nutracêuticas contendo aequorina úteis em impedir e/ou aliviar doenças ou sintomas associados ao desequilíbrio de cálcio.

Antecedentes da Invenção

[0002] Cálcio é o quinto elemento mais abundante no corpo humano e ocorre principalmente no osso. Mais que 99% do cálcio no corpo são armazenados no esqueleto, que constantemente troca seu abastecimento com o 1% restante dissolvido nos fluidos e tecido macio do corpo, como o sangue. O controle desta permuta é largamente ditado pelo sistema endócrino que sente a concentração de cálcio ionizado no plasma e direciona a permuta de cálcio para manter este equilíbrio crítico. Apenas uma fração pequena do 1% de cálcio nos fluidos intersticiais e nos tecidos macios é ionizada e solúvel, o resto estando ligado às proteínas, particularmente proteínas de ligação de cálcio (CaBPs). Estas CaBPs são conhecidas funcionar na manutenção da homeostase de cálcio. Uma vez o corpo requer concentrações específicas de íon de cálcio para realizar os processos fisiológicos requeridos, a manutenção de homeostase de cálcio é, portanto de importância crítica para a saúde corporal. Concentrações de cálcio iônico apropriadas em plasma e fluidos de corpo são entendidas pela comunidade médica serem críticas em funções corporais, incluindo, mas não limitadas à excitabilidade neuronal, contração muscular, permeabilidade de membrana, divisão de célula, secreção de hormônio e mineralização de osso. Um rompimento em homeostase de cálcio, isto é, um desequilíbrio de cálcio, está associado a muitas doenças, síndromes e condições, incluindo, mas não limitadas a, câncer, doença cardíaca e doença neurodegenerativa.

[0003] No passado, antagonistas de canal de cálcio que bloqueiam o fluxo de cálcio entre os interiores das células e fluido intersticial foram extensamente prescritos como agentes farmacêuticos úteis na prevenção de distúrbios relacionados a cálcio incluindo hipertensão, angina, asma, enxaquecas e deterioração neural. Por exemplo, nimidopina foi observada melhorar a sintomatologia clínica e funções cognitivas em demência aliviando um desequilíbrio de cálcio que causa deterioração neural. Porém, muitos destes antagonistas de canal de cálcio têm efeitos colaterais indesejados incluindo, mas não limitados a, mal-estar, retenção de fluido, azia, taxa cardíaca irregular, vertigem, estômago desarranjado e, em casos raros, desfalecimento, febre e hemorragia excessiva.

[0004] Uma necessidade existe, portanto por novos terapêuticos e alternativos que aliviam ou impedem desequilíbrio de cálcio. Em particular, composições farmacêuticas ou nutracêuticas que reduziram efeitos colaterais quando comparadas aos agentes anteriores são desejadas e, se constatadas, satisfariam uma necessidade a muito tempo sentida nas comunidades de saúde médicas e nutricionais.

Sumário da Invenção

[0005] A presente invenção fornece composições farmacêuticas e nutracêuticas que são vantajosas no alívio e/ou prevenção de sintomas ou distúrbios associados ao desequilíbrio de cálcio. Tais composições incluem aequorina em combinação com veículos aceitáveis para administração em um indivíduo por uma variedade de rotas. Consequentemente, a presente invenção é direcionada às composições farmacêuticas que compreendem quantidades eficazes de aequorina em combinação com um veículo aceitável. Em outras modalidades, a presente invenção é direcionada às composições nutracêuticas incluindo quantidades eficazes de aequorina em combinação com um veículo aceitável. Em certas modalidades, as composições nutracêuticas incluem, além de aequorina, pelo menos um outro componente reconhecido como fornecendo benefício nutracêutico.

[0006] Em outra modalidade, a invenção também fornece métodos para tratar um sintoma ou distúrbio associado ao desequilíbrio de cálcio administrando a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de aequorina.

[0007] Em ainda outra modalidade, a invenção abrange o uso de aequorina para a manufatura de composições úteis no alívio ou prevenção de sintomas ou distúrbios associados ao desequilíbrio de cálcio.

[0008] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornarão evidentes após revisão do relatório descritivo e reivindicações. Breve Descrição dos Desenhos Figura 1 descreve micrógrafo de fluorescência descrevendo a absorção de aequorina através de neurônios hipocampais. Figura 2 mostra micrógrafos de vídeo ilustrando que a aequorina é neuroprotetora quando administrada antes de isquemia. Figura 3 ilustra um gráfico de barras do número médio de neurônios contendo tripano azul (mortos) após isquemia. Descrição Detalhada da Invenção

I. EM GERAL

[0009] Antes de os métodos presentes serem descritos, é entendido que esta invenção não é limitada à metodologia particular e materiais descritos, visto que estes podem variar. É também para ser entendido que a terminologia aqui usada é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

[00010] Deve ser observado que como aqui usado e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Como também, os termos "um" (ou "uma"), "um(a) ou mais" e "pelo menos um(a)" podem ser usados alternadamente aqui. É também para ser observado que os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" podem ser usados alternadamente.

[00011] A menos que do contrário definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados que comumente entendidos por alguém de habilidade usual na técnica ao qual esta invenção diz respeito. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são por este meio incorporadas por referência para o propósito de descrever e revelar as químicas e metodologias que são relatadas nas publicações que poderiam ser usadas com relação à invenção. Nada aqui é para ser interpretado como uma admissão que a invenção não é intitulada para antecipar tal revelação em virtude da invenção anterior.

II. A INVENÇÃO

[00012] Aequorina é uma fotoproteína originalmente isolada de água-viva luminescente e outros organismos marinhos. O complexo de aequorina compreende uma proteína de apoaequorina de 22.000 dáltons, oxigênio molecular e o luminóforo coelenterazina. Quando três íons de Ca2+ se ligarem a este complexo, a coelenterazina é oxidada em coelenteramida, com uma liberação concomitante de dióxido de carbono e luz azul. Aequorina não é exportada ou segregada através de células, nem é compartimentada ou sequestrada dentro das células. Consequentemente, medições de aequorina foram usadas para detectar alterações de Ca2+ que ocorrem em períodos relativamente longos. Em vários sistemas experimentais, a luminescência de aequorina foi detectável muitas horas a dias após carregamento de célula. É também conhecido que aequorina também não rompe as funções celulares ou desenvolvimento de embrião.

[00013] Por causa de sua luminescência dependente de Ca2+, o complexo de aequorina foi extensivamente usado como um indicador de Ca2+ intracelular. Aequorina de Aequorea victoria foi especificamente usada para: (1) analisar a resposta de secreção de células de cromafina adrenais simples aos agonistas colinérgicos nicotínicos; (2) esclarecer o papel de liberação de Ca2+ em dano do músculo do coração; (3) demonstrar a liberação volumosa de Ca2+ durante a fertilização; (4) estudar a regulação da expressão de bomba de Ca2+ do retículo sarcoplásmico em mioblastos de pintinho em desenvolvimento; e (5) calibrar micropipetas com volumes de injeção tão pequenos quanto 3 picolitros.

[00014] Purificação convencional de aequorina da água-viva Aequorea victoria requer procedimentos de extração laboriosos e às vezes rende preparações que são substancialmente heterogêneas ou que são tóxicas aos organismos sob estudo. Duas toneladas de água- viva tipicamente rendem ~125 mg da fotoproteína purificada. Em contraste, aequorina recombinante é preferivelmente produzida purificando apoaequorina de Escherichia coli geneticamente criado, seguido por reconstituição do complexo de aequorina in vitro com coelenterazina pura. Este método de preparação rende um complexo de aequorina puro, não-tóxico, completamente carregado que é adequado para o uso na presente invenção. Uma preparação comercial exemplar de aequorina útil na presente invenção está disponível de Molecular Probes, Inc., sob o nome comercial AQUALITE. Aequorina útil na presente invenção foi descrita, portanto, e está comercialmente obtenível através de esquemas de purificação e/ou sínteses conhecidos àqueles de habilidade na técnica.

[00015] A função da aequorina é distinguida por várias características: aequorina é não-tóxica e não interfere com a estequiometria celular interna. (Miller et al., Methods Cell Biol. 40:305338 (1994)); a proteína é não-tóxica quando introduzida nas células estranhas (Blinks, J. Environ Health Persp 83:75-81 (1990)). Cada molécula de aequorina é conhecida ligar a três íons de cálcio (Inouye et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:3154-3158 (1985)).

[00016] A presente invenção é direcionada à administração de composições contendo aequorina a um indivíduo a fim de corrigir ou manter o equilíbrio de cálcio naquele indivíduo. A manutenção das concentrações de cálcio iônico em plasma e fluidos do corpo é entendida ser crítica em uma ampla variedade de funções corporais, incluindo, mas não limitadas à excitabilidade neuronal, contração muscular, permeabilidade de membrana, divisão de célula, secreção de hormônio e mineralização de osso. Rompimento em homeostase de cálcio, isto é, um desequilíbrio de cálcio, é entendido causar e/ou correlatar com muitas doenças, síndromes e condições. O estudo de CaBPs levou ao seu reconhecimento como fatores protetores que agem na manutenção de níveis de cálcio iônico apropriados.

[00017] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção compreendem administrar aequorina como o ingrediente ativo exclusivo para tratar desequilíbrio de cálcio, para tardar a progressão de desequilíbrio de cálcio, para impedir o princípio de desequilíbrio de cálcio e para impedir e/ou tratar a recorrência de desequilíbrio de cálcio. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos que compreendem administrar aequorina em combinação com um ou mais agentes adicionais tendo valor terapêutico conhecido.

[00018] Como aqui usado, o termo "tratamento" inclui preventivo como também tratamento remitente de distúrbio. Como aqui usado, os termos "reduzir", "aliviar", "suprimir" e "inibir" têm seu significado comumente entendido de reduzir ou diminuir. Como aqui usado, o termo "progressão" significa aumentar em escopo ou severidade, avançar, crescer ou ficar pior. Como aqui usado, o termo "recorrência" significa o retorno de uma doença após uma remissão.

[00019] Como aqui usado, o termo "administrar" se refere a colocar um paciente, tecido, órgão ou célula em contato com aequorina. Como aqui usado, administração pode ser realizada in vitro, isto é em um tubo de teste, ou in vivo, isto é em células ou tecidos de organismos vivos, por exemplo, seres humanos. Em modalidades preferidas, a presente invenção abrange administrar as moléculas úteis na presente invenção a um paciente ou indivíduo. Um "paciente" ou "indivíduo", usado equivalentemente aqui, se refere a um mamífero, preferivelmente um humano, que ou: (1) tem um distúrbio relacionado a desequilíbrio de cálcio remediável ou tratável por administração de aequorina; ou (2) é suscetível a um distúrbio relacionado a desequilíbrio de cálcio que é evitável administrando aequorina.

[00020] Como aqui usado, "composição farmacêutica" significa quantidades terapeuticamente eficazes de aequorina junto com diluentes adequados, conservantes, solubilizantes, emulsificantes e adjuvantes, coletivamente "veículos farmaceuticamente aceitáveis". Como aqui usado, os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" referem-se à quantidade de agente ativo suficiente para render uma resposta terapêutica desejada sem efeitos colaterais adversos impróprios como toxicidade, irritação ou resposta alérgica. A "quantidade eficaz" específica, obviamente, variará com tais fatores como a condição particular sendo tratada, a condição física do paciente, o tipo de animal sendo tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (se houver), e as formulações específicas empregadas e a estrutura dos compostos ou seus derivados. Neste caso, uma quantidade seria julgada terapeuticamente eficaz se resultasse em um ou mais dos seguintes: (a) a prevenção de um distúrbio relacionado ao desequilíbrio de cálcio; e (b) a reversão ou estabilização de um distúrbio relacionado ao desequilíbrio de cálcio. As quantidades eficazes ótimas podem ser facilmente determinadas por alguém de habilidade usual na técnica usando experimentação rotineira.

[00021] Composições farmacêuticas são líquidas ou liofilizadas ou do contrário formulações secas e incluem diluentes de vários teores de tampões (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e resistência iônica, aditivos como albumina ou gelatina para impedir absorção nas superfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácido da bílis), agentes solubilizantes (por exemplo, glicerol, glicerol de polietileno), antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfeto de sódio), conservantes (por exemplo, Thimerosal, álcool benzílico, parabenos), aumentar substâncias ou modificadores de tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), ligação covalente de polímeros como polietileno glicol para a proteína, complexação com íons de metal, ou incorporação do material dentro ou sobre preparações particuladas de compostos poliméricos como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogéis, etc, ou sobre lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas milamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócito ou esferoplastos. Tais composições influenciarão o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de liberação in vivo. Composições de liberação controlada ou contínua incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos graxos, ceras, óleos).

[00022] Também abrangidos pela invenção são os métodos de administrar composições particuladas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxâmeros ou poloxaminas). Outras modalidades das composições incorporam formas particuladas, revestimentos protetores, inibidores de protease ou intensificadores de permeação para várias rotas de administração, incluindo parenteral, pulmonar, nasal e oral. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é administrada parenteral, paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular, intracraniana ou intratumoralmente.

[00023] Também, como aqui usado "veículos farmaceuticamente aceitáveis" são bem conhecidos àqueles versados na técnica e incluem, mas não são limitados a, 0,01-0,1M e preferivelmente 0,05M de tampão de fosfato ou 0,9 % de solução salina. Adicionalmente, tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser soluções aquosas ou não-aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não- aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados.

[00024] Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer e fixos tratados com lactato. Veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólito como aqueles com base na dextrose de Ringer, e outros. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de intercalação, gases inertes e outros.

[00025] Composições de liberação controlada ou contínua administráveis de acordo com a invenção incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo ácidos graxos, ceras, óleos). Também compreendidas pela invenção são as composições particuladas revestidas com polímeros (por exemplo poloxâmeros ou poloxaminas) e o composto acoplado aos anticorpos direcionados contra receptores tecido-específicos, ligandos ou antígenos ou acoplados aos ligandos de receptores tecido-específicos.

[00026] Outras modalidades das composições administradas de acordo com a invenção incorporam formas particuladas, revestimentos protetores, inibidores de protease ou intensificadores de permeação por várias rotas de administração, incluindo parenteral, pulmonar, nasal, oftálmica e oral.

[00027] Compostos modificados pela ligação covalente de polímeros solúveis em água como polietileno glicol, copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol, carboximetil celulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona ou poliprolina são conhecidos exibir meias-vida substancialmente mais longas em sangue seguindo injeção intravenosa que os torna compostos inalterados correspondentes. Tais modificações podem também aumentar a solubilidade do composto em solução aquosa, eliminar a agregação, intensificar a estabilidade física e química do composto e grandemente reduzir a imunogenicidade e reatividade do composto. Como resultado, a atividade biológica in vivo desejada pode ser alcançada pela administração de tal polímero-composto frequentemente sequestra menos ou em doses inferiores que com o composto inalterado.

[00028] Em ainda outro método de acordo com a invenção, uma composição farmacêutica pode ser liberada em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o agente pode ser administrado usando infusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, um emplasto transdérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada. Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade ao alvo terapêutico, isto é, a próstata, desse modo requerendo apenas uma fração da dose sistêmica.

[00029] A preparação farmacêutica pode compreender aequorina sozinha, ou pode também incluir um veículo farmaceuticamente aceitável, e pode ser em forma sólida ou líquida como comprimidos, pós, cápsulas, péletes, soluções, suspensões, elixires, xaropes, bebidas, emulsões, géis, cremes, formulações oftálmicas ou supositórios, incluindo supositórios retais e uretrais. Veículos farmaceuticamente aceitáveis também incluem gomas, amidos, açúcares, materiais celulósicos e misturas destes. A preparação farmacêutica contendo aequorina pode ser administrada a um paciente, por exemplo, mediante implantação subcutânea de um pélete. Em uma outra modalidade, um pélete fornece durante um certo tempo para liberação controlada de aequorina. A preparação pode também ser administrada por injeção intravenosa, intra-arterial ou intramuscular de uma preparação líquida, administração oral de uma preparação líquida ou sólida ou através de aplicação tópica. Administração pode também ser realizada pelo uso de um supositório retal ou um supositório uretral.

[00030] As preparações farmacêuticas administráveis pela invenção podem ser preparadas por processos conhecidos de dissolução, mistura, granulação ou formação de comprimido. Para administração oral, aequorina ou seus derivados fisiologicamente tolerados como sais, ésteres, N-óxidos, e outros, é misturada com aditivos habituais para este propósito, como veículos, estabilizantes ou diluentes inertes, e convertida através de métodos habituais em formas adequadas para administração, como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina duras ou macias, soluções aquosas, alcoólicas ou oleosas. Exemplos de veículos inertes adequados são bases de comprimido convencionais como lactose, sucrose ou amido de milho em combinação com aglutinantes como acácia, amido de milho, gelatina, com agentes desintegrantes como amido de milho, amido de batata, ácido algínico, ou com um lubrificante como ácido esteárico ou estearato de magnésio.

[00031] Exemplos de veículos ou solventes oleosos adequados são óleos vegetais ou animais como óleo de girassol ou óleo de fígado de peixe. Preparações podem ser realizadas ambos como grânulos secos quanto úmidos. Para administração parenteral (subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou injeção intramuscular), os compostos antiandrógenos ou seus derivados fisiologicamente tolerados como sais, ésteres, N-óxidos e outros, são convertidos em uma solução, suspensão ou expulsão, se desejado com as substâncias habituais e adequadas para este propósito, por exemplo, solubilizantes ou outros auxiliares. Exemplos são líquidos estéreis como água e óleos, com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Óleos ilustrativos são aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de feijão-soja ou óleo mineral. Em geral, água, solução salina, dextrose, soluções aquosas e de açúcar relacionadas, e glicóis como propileno glicóis ou polietileno glicol são veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis.

[00032] A preparação de composições farmacêuticas que contêm um componente ativo é bem entendida na técnica. Tais composições podem ser preparadas como aerossóis liberados à nasofaringe ou como injetáveis, ou como soluções líquidas ou suspensões; porém, formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsificada. O ingrediente terapêutico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou outros, ou qualquer combinação destes. Além disso, a composição pode conter quantidades secundárias de substâncias auxiliares como agentes emulsificantes, agentes tamponantes de pH que intensificam a eficácia do ingrediente ativo.

[00033] Um componente ativo pode ser formulado na composição como formas de sal farmaceuticamente aceitável neutralizadas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido como os que são formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, ácidos clorídricos, ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e outros. Sais formados dos grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e outros.

[00034] Para administração tópica nas superfícies do corpo usando, por exemplo, cremes, géis, gotas e outros, aequorina ou seus derivados fisiologicamente tolerados são preparados e aplicados como soluções, suspensões ou emulsões em um diluente fisiologicamente aceitável com ou sem um veículo farmacêutico.

[00035] Em outro método de acordo com a invenção, o composto ativo pode ser liberado em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., em Liposomes in the Therapy of Infection Disease and Cancer, Lopez- Berestein e Fidler (eds.), Liss, N. Y., págs. 353-365 (1989)).

[00036] Para uso em medicina, os sais de aequorina podem ser sais farmaceuticamente aceitáveis. Porém, outros sais podem ser úteis na preparação dos compostos de acordo com a invenção ou de seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamente aceitáveis adequados dos compostos incluem sais de adição de ácido que podem, por exemplo, ser formados misturando uma solução de aequorina com uma solução de um ácido farmaceuticamente aceitável como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido metanossulfônico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzóico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbônico ou ácido fosfórico.

[00037] Além disso, composições contendo aequorina descritas aqui podem ser fornecidas na forma de composições nutracêuticas onde aequorina impede o princípio ou reduz ou estabiliza vários distúrbios deletérios relacionados ao desequilíbrio cálcio. O termo "nutracêutica" ou "composição nutracêutica", para o propósito deste relatório descritivo, se refere a um item alimentício, ou uma parte de um item alimentício que oferece benefícios de saúde médica, incluindo prevenção e/ou tratamento de doença. Uma composição nutracêutica de acordo com a presente invenção pode conter apenas aequorina de acordo com a presente invenção como um ingrediente ativo ou, alternativamente, pode também compreender, em admistão com suplementos dietéticos incluindo vitaminas, co-enzimas, minerais, ervas, aminoácidos e outros que suplementam a dieta aumentando a ingestão total daquela substância.

[00038] Portanto, a presente invenção fornece métodos de fornecer benefícios nutracêuticos a um paciente que compreende a etapa de administrar ao paciente uma composição nutracêutica contendo aequorina. Tais composições em geral incluem um "veículo nutraceuticamente aceitável" que, como referido aqui, é qualquer veículo adequado para liberação oral incluindo os veículos farmaceuticamente aceitáveis acima mencionados adequados para a rota oral. Em certas modalidades, composições nutracêuticas de acordo com a invenção compreendem suplementos dietéticos que, definidos em uma base funcional, incluem agentes de reforço imunes, agentes antiinflamatórios, agentes antioxidantes, agentes antivirais ou misturas destes.

[00039] Reforços imunes e/ou agentes antivirais são úteis para acelerar a cura de ferida e melhorar a função imune; e eles incluem extratos do flor-de-cone, ou ervas do gênero Echinacea, extratos de ervas do gênero Sambuca, e extratos de Goldenseal. Ervas do gênero Astragalus são também reforços imunes eficazes em suas formas naturais ou processadas. Astragalus estimula o desenvolvimento dentro de células-tronco na medula e o tecido das linfas ativa as células imunes. Zinco e seus sais bioativos, como gluconato de zinco e acetato de zinco, também agem como reforços imunes no tratamento do resfriado comum.

[00040] Antioxidantes incluem a alicina de aminoácido natural, contendo enxofre que age para aumentar o nível das enzimas de antioxidante no sangue. Ervas ou extratos herbários, como alicina contendo alho, são também antioxidantes eficazes. As catequinas, e os extratos de ervas como chá verde contendo catequinas, são também antioxidantes eficazes. Extratos do gênero Astragalus também mostram atividade antioxidante. Os bioflavonóides, como quercetina, hesperidina, rutina e misturas destes, são também eficazes como antioxidantes. O papel benéfico primário dos bioflavonóides pode ser proteger a vitamina C de oxidação no corpo. Isto torna mais vitamina C, ou ácido ascórbico, disponível para o uso pelo corpo.

[00041] Bioflavonóides como quercetina são também agentes antiinflamatórios eficazes, e podem ser usados como tal nas composições inventivas. Suplementos herbários antiinflamatórios e compostos antiinflamatórios derivados de plantas ou ervas podem também ser usados como agentes antiinflamatórios na composição inventiva. Estes incluem bromolaína, uma enzima proteolítica encontrada em abacaxi; chás e extratos de urtiga; turmérico, extratos de turmérico ou curcumina, um pigmento amarelo isolado de tumérico.

[00042] Outro suplemento que pode ser usado na presente invenção é gengibre, derivado de ervas do gênero Zingiber. Este foi observado possuir atividade cardiotônica devido aos compostos como gingerol e o composto relacionado shogaol como também fornecendo benefícios no tratamento de vertigem, e distúrbios vestibulares. Gengibre é também eficaz no tratamento de náusea e outros problemas estomacais.

[00043] Suplementos que ajudam a reconstruir as estruturas de tecidos macios, particularmente reconstruir a cartilagem, são úteis em composições para tratar a dor de artrite e outros distúrbios de junta. Glicosamina, sulfato de glicosamina, condroitina e sulfato de condroitina são particularmente úteis para este propósito. Condroitina pode ser derivada de uma variedade de fontes, como Alce Aveludado de Chifre. Complexos de lipídios marinhos, complexos de ácido graxo de omega 3 e óleo de peixe são também conhecidos ser úteis em tratar dor associada à artrite.

[00044] Suplementos úteis em tratar dores de cabeça de enxaqueca incluem matricária e Gingko biloba. O ingrediente ativo principal em matricária é o partenolídeo de lactona de sesquiterpeno, que inibe a secreção das prostaglandinas que por sua vez causa dor através de atividade vasoespástica nos vasos sanguíneos. Matricária também exibe propriedades antiinflamatórias. Óleo de peixe, devido a suas ações de estabilização de plaqueta e antivasoespástica, pode também ser útil em tratar dores de cabeça de enxaqueca. A erva Gingko biloba também ajuda no tratamento de enxaquecas estabilizando as artérias e melhorando a circulação do sangue.

[00045] Embora alguns dos suplementos listados acima tenha sido descrito sobre seus efeitos farmacológicos, outros suplementos podem também ser utilizados na presente invenção e seus efeitos são bem documentados na literatura científica.

III. EXEMPLOS EXEMPLO 1. AEQUORINA É ABSORVIDA PELOS NEURÔNIOS HIPOCAMPAIS.

[00046] Em um conjunto de estudos preliminares, aequorina foi diretamente de forma bilateral injetada no hipocampo de 3 ratos adultos diferentes. Os ratos foram retornados para suas gaiolas por pelo menos 24 h após as quais eles foram anestesiados e seus cérebros removidos, seccionados e tingidos para aequorina usando um anticorpo de antiaequorina monoclonal. O anticorpo primário foi depois visualizado usando um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594. Figura 1 mostra um exemplo de neurônios hipocampais marcado por aequorina usando microscopia de fluorescência convencional. O painel esquerdo é um fotomicrógrafos do hipocampo que mostra a localização da ponta da cânula na região de CA1. O retângulo branco indica a localização dos dois neurônios piramidais de CA3 marcados por aequorina mostrados no painel direito. Os dados ilustram que infusão direta de aequorina no hipocampo (painel esquerdo) resulta em marcação dos neurônios piramidais em CA1 e CA3. Aequorina (6% p/v) foi dissolvida em aCSF livre de cálcio na presença de 3% de DMSO. A solução foi lentamente injetada (taxa ~1 μl/min) diretamente no hipocampo usando uma bomba de seringa (volume ~1 μL por lado). Após conclusão da injeção, as cânulas de liberação permaneceram no lugar durante cerca de 1 min antes da remoção. Um exemplo de dois neurônios piramidais de CA3 contendo aequorina é mostrado no painel direito (objeto 40X). Os dados demonstram claramente de forma direta a liberação de aequorina no cérebro e também que a aequorina esparrama ao longo do hipocampo e é depois absorvida pelos neurônios em CA1, CA3, e o giro dentado.

EXEMPLO 2. EFEITOS DE ISQUEMIA AEQUORINA EM MORTE DE CÉLULA A SEGUIR.

[00047] Um experimento foi realizado para investigar o benefício da proteína ligadora de cálcio aequorina em isquemia. Aequorina (4%) foi dissolvida em fluido cérebro-espinhal livre de cálcio com 6% de DMSO (sulfóxido de dimetila). Duas a três horas depois, um rato foi anestesiado com isoflurano e sacrificado por decapitação. Fatias do cérebro de quatrocentos mícrons de espessura foram preparadas usando um Vibratome de temperatura controlada. As fatias foram colocadas imediatamente em fluido cérebro-espinhal artificial oxigenado (95% de O2/5% de CO2) (aCSF) da composição a seguir (em mM): 124 NaCl, 2,8 KCl, 2 MgSO4, 2 NaH2PO4, 2 CaCl2, 26 NaHCO3, 0,4 ascorbato de sódio, 10 d-glicose, pH 7,4, ~30°C). Após uma recuperação de uma hora, as fatias foram submetidas a um episódio isquêmico de 5 min. Isquemia foi induzida substituindo a glicose com frutose e substituindo o oxigênio com nitrogênio. Seguindo o desafio isquêmico de 5 min, as fatias foram retornadas para aCSF normal oxigenado contendo 0,04% de tripano azul e incubadas no aCSF de tripano azul por 30 minutos. O método de exclusão de tripano azul (células saudáveis excluem tripano azul enquanto que as células mortas ou morrendo absorverão o tripano azul e desse modo aparecerão azul) é comumente usado para avaliar morte de célula em cultura de célula ou fatias de cérebro. Após incubação em tripano azul as seções foram removidas e colocadas em fixador durante a noite seguido por incubação de 3 horas em 30% de sucrose. As fatias de 400 μm de espessura foram depois seccionadas para uma espessura de -40 μm usando um criostato, montado sobre lâminas revestidas com gelatina e lâminas cobertas. Referindo à Figura 2, é evidente que há mais neurônios tingidos com tripano azul (mortos) no controle (painel superior) com relação aos neurônios injetados com aequorina (painel inferior). Figura 3 mostra um gráfico de barras do número médio de neurônios contendo tripano azul (mortos) após isquemia. Este experimento demonstra que injeção de aequorina confere neuroproteção diretamente no hipocampo contra um insulto isquêmico.

[00048] É entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou alterações à luz destas serão sugeridas às pessoas versadas na técnica e são para ser incluídas dentro do espírito e esfera deste pedido de patente e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui são por este meio incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims (2)

1. Composição para impedir ou aliviar um sintoma ou distúrbio associado ao desequilíbrio de cálcio, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) aequorina; e (b) um veículo aceitável selecionado dentre tampão de fosfato, propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis.

2. Uso de aequorina, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para conferir proteção contra lesão isquêmica em um indivíduo.

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