BRPI0513596B1 - Método e kit para detectar uma infecção micobacteriana em uma amostra de um indivíduo de interesse por meio da detecção de antígeno micobacteriano - Google Patents

Abstract

anticorpo enriquecido para detecção de infecção micobacteriana, métodos de uso e teste diagnóstico empregando o mesmo. a tecnologia revelada provê uma população de anticorpos enriquecidos, altamente específicos para um antígeno de um polissacarídeo de superfície de mycobacterium. em uma concretização correlata, o anticorpo é enriquecido por ter sumido em um ambiente que mantém o antígeno antigenicamente ativo. esses anticorpos podem ser empregados em um ambiente imunorreativo para detectar a presença de infecção micobacteriana em uma amostra de um indivíduo.

Description

(54) Título: MÉTODO E KIT PARA DETECTAR UMA INFECÇÃO MICOBACTERIANA EM UMA AMOSTRA DE UM INDIVÍDUO DE INTERESSE POR MEIO DA DETECÇÃO DE ANTÍGENO MICOBACTERIANO (51) Int.CI.: C07K 16/12; G01N 33/569 (30) Prioridade Unionista: 20/07/2004 US 60/589,419 (73) Titular(es): CHEMOGEN, INC.

(72) Inventor(es): VLADIMIR A. KOULCHIN; ELENAV. MOLOKOVA; JILL L. KERRICK

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO E KIT PARA DETECTAR UMA INFECÇÃO MICOBACTERIANA EM UMA AMOSTRA DE UM INDIVÍDUO DE INTERESSE POR MEIO DA DETECÇÃO DE ANTÍGENO MICOBACTERIANO.

Campo Técnico

A presente invenção refere-se aos exames de diagnóstico para detecção de doenças e condições microbianas e, mais especificamente, aos exames de diagnóstico e métodos para detecção da tuberculose. Antecedentes

Durante as últimas décadas, a TB vem evoluindo de uma infecção predominantemente pulmonar em uma patologia multifacetada com uma razão de crescimento dos casos extrapulmonares. Até agora, programas eficazes de prevenção da TB vêm sendo dificultados pela ausência de um ensaio rápido e adaptado para o campo. Nos países ricos, a cultura mico15 bacteriana permanece como o diagnóstico padrão, porém sendo consumidor de tempo e relativamente caro. De modo ideal, a microscopia do esputo que se baseia nos três esfregaços de esputo podendo identificar até 67% dos casos de cultura positivos. A co-infecção por HIV foi reportada como fornecendo a demonstração de Mycobacterium turberculosis nos esputos, embora alguns investigadores não reportem qualquer influência do estado sorológico no diagnóstico de AFB. A porcentagem maior de TB extrapulmonar nos pacientes de TB com HIV aumenta a razão de casos de TB negativos para AFB. Isso transforma o diagnóstico da tuberculose em um desafio e reforça uma necessidade urgente de ferramentas laboratoriais para seu diagnóstico.

As abordagens atuais para diagnóstico da TB não são satisfatórias. O teste do esputo para TB pulmonar nem sempre é eficaz, especificamente se não existirem bactérias detectáveis no esputo ou se nenhuma amostra de esputo puder ser obtida. Além disso, esse teste de diagnóstico requer microscopia e/ou cultura das bactérias para confirmar o diagnóstico, nenhuma das quais sendo especialmente apropriada para diagnóstico em campo. O emprego de fluido cerebrospinal para diagnóstico de meningite tuberculosa é também problemático, especificamente no campo, uma vez

Petição 870170072491, de 27/09/2017, pág. 10/16 que, novamente, a microscopia e/ou cultura das bactérias e/ou um teste ELISA são geralmente necessários para confirmar o diagnóstico.

Os exames de sangue para TB são também conhecidos, porém possuem um registro de trilha fraco, sendo complexos e não confiáveis. Os exames de urina são mais simples e mais confiáveis, porém os métodos atuais requerem processamento da urina arites de ser realizado o exame de diagnóstico - tal processamento geralmente envolvendo concentração da urina.

Entre os métodos desenvolvidos recentemente se encontram os testes de anticorpo contra vários antigenos micobacterianos, porém nenhum desses testes alcançou até agora a especificidade necessária para os fins de diagnóstico de rotina. A queda da sensibilidade nos casos HIV positivos é também uma barreira maior. Uma abordagem diferente é medir as respostas imunes aos antigenos específicos para Mycobacteríum turberculosis como ESAT-6, porém até agora a diferenciação entre infecção por TB latente e doença por TB não foi possível.

A tuberculose é uma patologia extremamente complexa existindo em múltiplas formas, porém sempre iniciando como uma infecção transportada pelo ar. A tuberculose pulmonar ocorre imediatamente no ponto de entrada do microorganismo e a tuberculose extrapulmonar é o resultado da penetração adicional no corpo do paciente com os exemplos mais difundidos de meningite tuberculosa e tuberculose óssea. A complexidade da patologia determina as várias abordagens tentadas durante esse século na medicina moderna. Adicionalmente, as manifestações clínicas e radiográficas da tuberculose pulmonar relacionada ao HIV são dramaticamente alteradas pela imunodeficiência. Esses fatores limitam muito essa capacidade de reconhecimento sintomático precoce da tuberculose em pacientes com HIV/TB e também aumenta o perigo da transmissão da tuberculose para parentes e para as pessoas que cuidam de tais pacientes.

As micobactérias podem ser recuperadas potencialmente de uma variedade de espécimes clínicos, incluindo coletas das vias aéreas superiores (esputo, lavagens brônquicas, lavagem broncoalveolar, biópsias brônquicas e outros); urina, fezes, sangue, fluído cerebrospinal (CSF), biópsias de tecidos, e punções virtualmente de qualquer tecido ou órgão. A cultura bacteriana permanece o padrão de ouro no diagnóstico da tuberculose, porém pode levar até 6-8 semanas para fornecer um diagnóstico conclusivo. Existem três tecnologias principais para o diagnóstico rápido (mais rápidas que a cultura bacteriana) das infecções micobacterianas:

- microscopia direta de esfregaço do esputo;

- ensaio com base na PCR;

- métodos de imunodiagnóstico

Microscopia direta de esfregaço do esputo. Mais de um século atrás, Robert Koch identificou o agente etiológico da tuberculose por coloração e cultura do mesmo a partir de espécimes clínicos. Atualmente, o diagnóstico da tuberculose é geralmente estabelecido usando técnicas de coloração e cultura, que não diferem substancialmente aquelas empregadas por Koch. Atualmente a microscopia direta do esputo é a norma para o diagnóstico da tuberculose nos países em desenvolvimento sendo a referência contra a qual deve ser avaliada a eficiência de qualquer novo teste. Ela é aplicada à tuberculose pulmonar, porém não é muito útil para crianças ou pacientes com estágios iniciais da tuberculose pulmonar.

Ensaios com base na PCR. Um estudo comparativo do desempenho dos testes de PCR em sete laboratórios mostrou níveis altos de resultados de PCR falso-positivos, variando de 3% a 20% (com um extremo de 77% em um laboratório). Esse desempenho relativamente fraco resultou da falta de monitoramento de cada etapa do procedimento e reforça a necessidade de controle de qualidade cuidadoso durante todos os estágios do ensaio.

Métodos de Imunodiagnóstico

O Teste da Tuberculose pela Pele. Esse é o teste imunológico provavelmente mais antigo para tuberculose. Uma pequena quantidade de substância denominada Tuberculina PPD é colocada sob a camada superior da pele no antebraço com uma pequena agulha. O teste é lido 48 a 72 horas após ter sido administrado. Geralmente, um intumescimento de 10 mm ou mais é considerado positivo. Muitos países em desenvolvimento empregam a vacinação com BCG para proteção contra a tuberculose. Após vacinação com BCG, o teste da pele com PPD geralmente se torna positivo. Os resultados do teste da pele variam com a qualidade do antígeno PPD, reatividade do sistema imune e provavelmente mesmo a raça do indivíduo. Esse teste também não fornece uma indicação correta a respeito do estágio e local da infecção.

Testes Sorolóqicos para M. tuberculosis. Essa abordagem com base na detecção da resposta imune do anticorpo aos antígenos micobacte10 rianos é uma das mais amplamente empregadas na pesquisa e ambientes clínicos. Todos os testes sorológicos possuem aproximadamente a mesma sensibilidade e especificidade se eles empregam antígenos purificados. A sensibilidade dos melhores testes está em uma faixa de 80% para casos de esfregaço positivo e 60-70% para casos de esfregaço negativo. A especifici15 dade reportada é geralmente alta e está em uma faixa de 95-100%.

As tecnologias correntemente existentes estão limitadas em seu desempenho de várias formas.

O teste microscópico rápido mais amplamente aceito requer várias horas para seu término, técnicos capacitados e ambiente laboratorial clínico. A interpretação do teste é muito difícil se comparada ao padrão atual de teste de POC rápido na área das doenças infecciosas. O custo real de uma análise por paciente se encontra na faixa de $100-150 para um hospital nos Estados Unidos da América. A especificidade clínica do teste é muito boa, porém quaisquer aperfeiçoamentos na sensibilidade serão bem vindos.

O teste da pele possui sensibilidade suficiente, porém demora muito e não fornece informações com relação ao estágio do processo patológico e não diferencia de modo suficiente os indivíduos infectados e os vacinados.

Os testes sorológicos geralmente não possuem sensibilidade su30 ficiente. Os resultados dos testes variam com as variações na resposta imune individual aos antígenos da tuberculose. Esses testes praticamente não fornecem resultado em pacientes com HIV infectados por M. tuberculosis.

%

Esse fator limita muito sua aplicabilidade na África e em muitos países asiáticos. Nos Estados Unidos, esse grupo de pacientes constitui a maior parte dos pacientes infectados por tuberculose.

Os testes com PCR são amplamente usados nos países desen5 volvidos, porém são complexos, caros e não são sensíveis o suficiente para justificar seu uso como teste de classificação nos países em desenvolvimento.

Um método preferido para diagnóstico rápido das doenças infecciosas tem como base a detecção de um antígeno bacteriano em uma amos10 tra de paciente, o que provê prova incontestável do processo infeccioso ativo causado pelo agente patogênico específico. O conceito do emprego de um teste de antígeno direto para detecção das infecções micobacterianas foi descrito em várias aplicações.

Por exemplo, o desenvolvimento de um dos primeiros ensaios de antígeno direto para M. tuberculosis foi reportado em 1982 - um radioimunoensaio para a detecção de antígenos da M. tuberculosis no esputo de pacientes com tuberculose pulmonar ativa, usando um anticorpo de coelho específico para as células integrais de M.bovis (vacina BCG). O esputo autoclavado e sonicado foi empregado como uma amostra. O ensaio detectou o antígeno em 38 das 39 amostras de esputo de pacientes com tuberculose pulmonar ativa.

Os últimos estudos reportaram o desenvolvimento do sistema ELISA para a detecção dos agentes micobacterianos no fluido cerebrospinal dos pacientes com meningite tuberculosa, também empregando anticorpos específicos para as células integral de M.bovis. Ambos os sistemas mostraram especificidade suficientemente alta. A despeito do fato de que LAM foi o antígeno principal responsável pela detecção, foi reportado que M.kansaii mostrou 5% de reatividade cruzada e M. intracelluiare, M. avium, M. fortitum e M. vaccae mostraram reatividade cruzada apenas em 2%. Outros reporta30 ram detecção, por ELISA, do antígeno micobacteriano no CSF de nove pacientes com meningite tuberculosa, correspondendo à sensibilidade de 81,25%. A especificidade do teste foi igual a 95%.

Tr

Praticamente todas as tentativas anteriores para desenvolver um teste para diagnóstico da tuberculose focaram a detecção da forma pulmonar da doença. Formas extrapulmonares, que são notoriamente difíceis de serem diagnosticadas, atraíram relativamente pouca atenção devido à razão de baixa prevalece em comparação a pulmonar. Até as décadas de 50 e 60, os casos de tuberculose extrapulmonar compreendiam apenas em torno de 10% dos casos da tuberculose. O início da pandemia HIV/AIDS alterou completamente a situação. Essas duas doenças eventualmente ser fundiram em um novo problema de saúde pública complexo. Atualmente, 60% dos pacientes com HIV não-tratados desenvolvem tuberculose ativa durante a sua vida e até 70% dos pacientes com tuberculose estão infectados com HIV na África sub-Saara e Ásia. A sobreposição de HIV e tuberculose alterou não apenas a epidemiologia da tuberculose, porém também o curso da doença propriamente. Durante as últimas décadas a tuberculose de desenvolveu de uma infecção predominantemente pulmonar em uma patologia multifacetada com uma prevalece sempre crescente de formas extrapulmonares. Estimase que os casos de tuberculose extrapulmonar compreendam correntemente até 30% de todos os casos de tuberculose; esse número podendo mesmo ser subestimado, em razão da falta de ferramentas para classificação rápida e diagnóstico das formas extrapulmonares da tuberculose. Contudo, mesmo a tuberculose pulmonar nos pacientes com HIV freqüentemente exibe sintomas típicos. Por exemplo, tais pacientes tipicamente não produzem esputo. Esses fatores limitam gravemente nossa capacidade de reconhecimento sintomático precoce da tuberculose em pacientes com HIV/TB e também aumentam o risco da transmissão da tuberculose para os parentes e as pessoas que cuidam de tais pacientes. Um modo fácil de empregar o teste de classificação, capaz de detectar um amplo espectro de patologias derivas à infecção por M.tuberculosis é urgentemente necessário, incluindo um teste para formas extrapulmonares da TB. Tal necessidade há muito vem sendo discutida sem progresso na direção da realização desse objetivo. Atualmente, a necessidade se tornou uma emergência de saúde pública.

Em outros casos das infecções bacterianas pulmonares, o processo de classificação atual de escolha baseia-se na detecção dos antígenos de polissacarídeo secretados na urina do paciente. Os polissacarídeos bacterianos são compostos de monossacarídeos incomuns aos seres humanos e portanto resistentes à divagem por enzimas humanas. Isso permite sua secreção na urina nas formas imunoquimicamente intactas para detecção por um imunoensaio específico para polissacarídeo. Concentrações extremamente baixas de polissacarídeos bacterianos secretadas na urina requerem sensibilidade muito alta do imuoensaio, a fim de empregar as mesmas como um procedimento de classificação.

Grupos de colaboração de pesquisa da Suécia e da Noruega tentavam desenvolver um sistema ELISA específico para LAM que detectasse antígeno de LAM na urina do paciente. O sistema empregou a captura do antígeno para detectar tuberculose da urina com base no lipoarabinomanano, um polissacarídeo presente na superfície da Mycobacteríum tuberculosis, o organismo responsável pela tuberculose nos seres humanos, conforme revelado no pedido PTC número WO 97/34149 de Svenson. O procedimento de diagnóstico descrito detectou a presença de LAM na urina do paciente em 81,3% dos pacientes AFB-positivos e 57,4% dos pacientes AFBnegativos e demonstrou utilidade na detecção do antígeno de LAM micobacteriano para o diagnóstico das infecções micobacterianas. Ao mesmo tempo o sistema não demonstrou utilidade do processo revelado para fins de classificação. A despeito do uso do anticorpo policlonal de coelho purificado de afinidade específico para antígeno - LAM, o procedimento não teve sensibilidade suficiente para ser usado nas amostras de usina não-concentrada e não-processada. O procedimento de diagnóstico precisou de 24-48 horas de manipulações sofisticadas em um laboratório bioquímico focado na concentração da urina do paciente e preparação da mesma para análise pelo teste ELISA. Sobretudo, a sensibilidade do ensaio de Svenson não é suficiente para uso prático do método descrito. A complexidade e extensão do imunoensaio também impedem seu uso prático como um teste de classificação para detecção de infecções micobacterianas porque ele provou ser muito trabalhoso para uso nas manipulações clínicas, onde a velocidade, facilidade de uso e alta seletividade são todos muito importantes para os testes de diagnóstico usados para detectar as condições da doença.

Sumário da Invenção

Em uma primeira concretização da invenção é provida uma iso5 forma antigenicamente ativa do lipoarabinomanano a partir da Mycobacterium tuberculosis, preparada por oxidação de LAM empregando métodos de oxidação branda, tais como, tratamento com baixas concentrações de NalO4. Em outras concretizações, a isoforma antigenicamente ativa de LAM, gerada por métodos de oxidação branda, é empregada para preparar anti10 corpos altamente puros e específicos para Mycobacteríum inativado, mais especificamente para polissacarídeos de superfície, tais como, LAM, par uso na detecção dos polissacarídeos (por exemplo, LAM) na urina, esputo, sangue, tecido ou outras amostras de pacientes de interesse. Outras concretizações empregam anticorpo altamente puro e específico, que surge da for15 ma antigenicamente ativa de LAM para diagnóstico da tuberculose nos pacientes de interesse.

Em outra concretização específica, é provida uma população de anticorpos enriquecida, altamente específica para um antígeno de um polissacarídeo de superfície de um Mycobacteríum. Nessa concretização, a po20 pulação de anticorpos enriquecidos pode ser enriquecida por ter sido criada em um ambiente que mantém o antígeno antigenicamente ativo. Alternativamente ou além disso, o anticorpo é enriquecido por exclusão dos anticorpos que reconhecem antígeno relativamente inativo. Em algumas concretizações, o Mycobacteríum pode ser Mycobacteríum tuberculosis. De modo semelhante, a superfície do polissacarídeo pode ser constituída de lipoarabinomanano (LAM).

Em outra concretização, é provido um processo para produção de um anticorpo enriquecido altamente específico para um antígeno de um Mycobacteríum. Nessa concretização, o processo compreende criação e isolamento do anticorpo para antígeno das micobactérias e separação dos anticorpos isolados daquela população de anticorpos que é específica para antígeno relativamente inativo, de modo a produzir anticorpo enriquecido

2>Ο isolado.

Em outra concretização, é provido um processo para produção de um anticorpo enriquecido altamente específico para antígeno de um Mycobacteríum. Nessa concretização, o processo compreende isolamento do antígeno das micobactérias sob condições que mantêm a atividade antigênica; e criação de anticorpos para o antígeno isolado enquanto mantendo sua atividade antigênica.

Ainda em outra concretização, é provido um processo para produção de um anticorpo enriquecido altamente específico para um antígeno de um Mycobacteríum. Nessa concretização, o processo compreende aplicação de soros de um mamífero inoculado com micobactérias a uma primeira matriz de afinidade preparada com antígeno isolado do Mycobacteríum, tal que, o anticorpo específico para o antígeno isolado é retido pela primeira matriz de afinidade; aplicação do anticorpo isolado a uma segunda matriz de afinidade preparada com antígeno modificado a partir do Mycobacteríum, tal que, o anticorpo específico para o antígeno modificado é retido pela segunda matriz de afinidade, onde o antígeno modificado foi tratado com um agente para desativar sua relação ao antígeno isolado; isolamento do anticorpo enriquecido específico para o antígeno isolado por coleta do efluente da segunda matriz de afinidade, de modo que o anticorpo enriquecido é mais altamente específico e mostra sensibilidade maior ao antígeno de Mycobacteríum que o anticorpo não enriquecido.

Nas concretizações correlatas adicionais, o Mycobacteríum pode ser Mycobacteríum tuberculosis, e o polissacarídeo de superfície pode ser lipoarabinomanano (LAM).

Em outras concretizações o agente para modificação do antígeno de Mycobacteríum é periodato de sódio. Em outras concretizações correlatas, o polissacarídeo de superfície pode se isolado do adjuvante de Freund.

Ainda outra concretização provê um método para detectar uma infecção micobacteriana em uma amostra de um indivíduo. Nessa concretização, o método compreende provisão de um ambiente imunorreativo, tal ambiente desenvolvido do anticorpo enriquecido conforme descrito acima e reação da amostra no ambiente imunorreativo, de modo a detectar a infecção micobacteriana.

Opcionalmente, a infecção micobacteriana pode ser M. tuberculosis ou doença de Johne. De modo semelhante, o polissacarídeo de superfície pode ser lipoarabinomanano (LAM). Nas concretizações correlatas adicionais, o ambiente imunorreativo compreende um ELISA e pode ser implementado com um teste de fita. Nas concretizações correlatas, a infecção micobacteriana pode ser uma infeção pulmonar por Mycobacteríum tuberculosis ou uma infeção extra pulmonar por Mycobacteríum tuberculosis, e a amostra pode ser um esputo, sangue, urina, tecido ou outra amostra apropriada. Em uma concretização específica correlata, a amostra pode ser urina não processada, não concentrada.

Outras concretizações fornecem um kit para detecção de uma infecção micobacteriana em uma amostra, um kit compreendendo um ensaio provendo ambiente imunorreativo, onde o ambiente compreende um anticorpo enriquecido conforme descrito acima. Nas concretizações correlatas, o ambiente imunorreativo compreende um ELISA e pode ser implementado como um teste de filamento. Nas concretizações correlatas adicionais, a infecção micobacteriana pode ser Mycobacteríum tuberculosis e o anticorpo pode ser lipoarabinomanano (LAM).

Breve Descrição dos Desenhos

As características precedentes da invenção serão mais prontamente entendidas com referência à descrição detalhada que se segue, tomada com referência aos desenhos anexos, onde:

A figura 1 mostra um modelo estrutural de ManLAM, PILAM e AraLam micobacteriano.

A figura 2 mostra uma comparação da atividade serológica para experimentos de LAM.

A figura 3 mostra a eficiência das preparações Ab específicas para LAM no ELISA de captura.

A figura 4a ilustra a sensibilidade do ELISA para LAM para con11 centrações diferentes de LAM na urina. A fração representou a Densidade Óptica do Controle Negativo + 0,1, resultando em um limite de detecção mínima de 0,25 ng/mL.

A figura 4b ilustra a ligação dos anticorpos específicos para LAM no ELISA para antígenos não micobacterianos que foi excluída para as espécies bacterianas que se seguem:

Klebsiella pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae 14/12F, Pseudomonas aeruginosa, Staphyiococcus aureus 25923/43300, Proteus vulgarís, E. coli 15 8739, Neissería meningitidis A/13/13102, Haemophilus infiuenzae A/B/D.

A figura 4c ilustra a sensibilidade do ELISA para LAM para várias cepas micobacterianas. LAMs de M. bovis e M. tuberculosis são detectados mais sensivelmente.

A figura 5 ilustra a correlação entre a densidade micobacteriana microscópica dos pacientes AFB positivos e sua concentração de antígenos medida pelo ELISA para LAM na urina não processada. AFB + (microscópio, aumento de 1.000 vezes; 4-90 bacilos álcool-ácido resistentes 100 campos) 38 casos. AFB++ (1-9/campo) 23 casos. AFB+++ (~10/campo) 20 casos. O gráfico mostra o décimo, vigésimo quinto, qüinquagésimo, septuagésimo quinto e nonagésimo percentuais e concentração média do antígeno.

A figura 6 é uma ilustração esquemática de um processo de purificação de antígeno, de acordo com concretizações específicas da invenção reivindicada.

A figura 7 é uma ilustração esquemática para preparação de colunas de afinidade de acordo com concretizações específicas da invenção reivindicada.

A figura 8 é uma ilustração esquemática de um processo de purificação de anticorpo de acordo com concretizações específicas da presente invenção.

A figura 9 é uma ilustração esquemática de uma preparação de conjugado, de acordo com as concretizações específicas da presente invenção.

Descrição Detalhada das Concretizações Específicas

Definições

Os termos que se seguem têm os significados indicados, a menos que de outra forma requerido pelo contexto:

Ambiente imunorreativo conforme usado aqui, significa um ambiente que suporta imunoensaios, imunorreções, imunoquímica, e quaisquer processos, ensaios, metodologia ou sistema que envolvam, se relacionem ou se fiem na reação imunológica para obter um resultado desejado. Exemplos de ambientes imunorreativos são aqueles descritos na Patente US número 5.073.484 de Swanson e outros; e Patentes US números 5.654.162 e 6.020.147 de Guire e outros, descrevendo o método e aparelho para determinação quantitativa de um analisado em um líquido, onde concretizações específicas empregam reações imunoquímicas onde o analisado e o reagente representam partes diferentes de um par de ligação de ligante específico (antigeno) - anticorpo (antiligante). Essas patentes se referem a tecnologias que foram implementadas como aquela que foi citada nessa descrição e nas reivindicações que se seguem como teste de fita.

Adjuvante de Freund é comercializado pela Sigma, USA.

Foi desenvolvido um método de alta sensibilidade para detecção da presença de antígenos de Mycobacteríum, especificamente antígenos de M. tuberculosis, tais como os polissacarídeos de superfície lipoarabinomanano (LAM) e espécies correlatas, nos fluidos corpóreos incluindo, porém não limitados a urina. Até agora, os testes dessa natureza não apresentavam sensibilidade e não eram operáveis para amostras de urina não processadas ou para detecção de infecções de TB extrapulmonar. Especificamente, foram desenvolvidos anticorpos enriquecidos criados para antigeno das micobactérias onde o anticorpo é enriquecido por ter sido criado em um ambiente que mantém o antigeno antigenicamente ativo. Foi denominado o método para produção dessa primeira classe de anticorpos enriquecidos de método direto, que é descrito em maiores detalhes a seguir.

Foi desenvolvido um anticorpo que é enriquecido por exclusão dos anticorpos que reconhecem antigeno relativamente inativo. O método de produção dessa classe de anticorpos começa por seguir o método direto para obter anticorpos enriquecidos, porém então opera por exclusão dos anticorpos que reconhecem o antígeno relativa mente inativo. Foi denominado o método para produção dessa segunda classe de anticorpo enriquecido de método melhorado, que é também descrito em detalhes a seguir.

A figura 8 é uma ilustração esquemática mostrando as etapas envolvidas na prática de uma concretização do método melhorado. Uma vez que o método melhorado constrói o método direto, a figura 8 também ilustra o método direto, caso pare após a primeira coluna de afinidade.

A seguir foi mostrado como os anticorpos enriquecidos de cada uma ou ambas as classe podem ser usados para detectar infeções pulmonares e extrapulmonares de TB em várias amostras, incluindo, porém não limitado às amostras não-reagidas (isto é, não concentradas) de urina. (Outras fontes em potencial da amostra incluem esputo, fluido cerebrospinal, sangue, tecido, lavagens). Nos exemplos que se seguem os anticorpos enriquecidos são criados para um epítopo de lipoarabinomanano (LAM) em um ambiente que mantém sua atividade antigênica.

Os métodos anteriores para detecção dos polissacarídeos de superfície (LAM) usando fluidos diferentes do corpo tais como, soro, urina, esputo, foram investigados, porém mostraram ser problemáticos. No soro, a detecção de LAM parece ser perturbada por formação de complexo imune. A detecção de LAM no esputo é possível apenas nas amostras de pacientes com TB pulmonar, uma vez que as infecções extrapulmonares freqüentemente não fornecem esputo contendo antígenos micobacterianos. Estudos anteriores com urina precisavam de processamento e manipulação extensa da amostra, limitando tais metodologias no campo. Nenhum foi eficaz para o diagnóstico das infecções micobacterianas extrapulmonares, tais como aquelas que surgiram nos indivíduos HlV-posItivos.

As concretizações da presente invenção superam as dificuldades da técnica anterior pela provisão de anticorpos enriquecidos que podem ser empregados para detectar antígenos micobacterianos em uma ampla faixa de tipos de amostra de um indivíduo. Esses tipos de amostra incluem soro,

0)6 sangue, esputo, lavagens, tecido e urina processada e não processada, entre outros.

O lipoarabinomano (LAM) é um lipopolissacarídeo com peso molecular de 17.500, específico para o gênero Mycobacteríum. O lipoarabinomanano é um antígeno de polissacarídeo complexo composto de manose e resíduos de arabinose formando uma estrutura altamente ramificada e complexa. A despeito de mais de quatro décadas de estudos estruturais dos antígenos de polissacarídeo das micobactérias, os versados na técnica falam apenas sobre fragmentos da estrutura ou motivos estruturais e modelos compósitos. O modelo compósito mais recente da estrutura LAM é apresentado na figura 1 a seguir.

Como parte da parede celular eterna das micobactérias, LAM é liberado das células metabolicamente ativas ou bacterianas em degeneração. Presume-se que na infeção de TB ativa, LAM vaze para a circulação, passe através dos rins e possa portanto ser detectado na urina refletindo o nível de carga micobacteriana. Uma vez que LAM é um antígeno de carboidrato com ligações glicosídicas para as quais não existem glicosidases de degradação, o antígeno ocorre na urina na forma intacta.

O antígeno de LAM da micobactéria é composto de três domínios estruturais principais: a âncora manosila-fospatidila-mio-inositol (MIP), contendo número variável de aminoácidos com comprimento de cadeia variável; polissacarídeo de núcleo manano variável em número de resíduos de manose; e cadeias de polissacarídeos arabinano ramificadas conectadas ao núcleo de manano. A despeito de muitos esforços, o(s) sítio(s) de anexação para cadeias arabinano no núcleo de manano permanece(m) desconhecido(s). As cadeias de polissacarídeo de arabinano são capeadas por oligossacarídeos de manose, consistindo em unidades mono(a1-2)-di e (a1-2)-tri manosila de comprimento variável (motivos de capeamento). O grau de capeamento varia de cepa para cepa e possivelmente também depende das condições de crescimento.

A complexidade estrutural extremamente alta e variabilidade do LAM micobacteriano leva a um espectro muito complexo de epítopos antigê15 %

nicos. A complexidade do antígeno de diagnóstico selecionado, nos força a empregar anticorpo policlonal purificado de afinidade como um reagente de imunoensaio principal. Apenas o uso do anticorpo policlonal permite cobrir o espectro completo de especificidades antigênicas potencialmente associadas ao LAM presente nas amostras clínicas. A fim de obter a maior sensibilidade de ensaio possível do imunoensaio intercalado, foram empregadas as concentrações maiores de anticorpo específico para antígeno na zona de captura e também como o anticorpo marcado. A purificação de afinidade específica para antígeno é conhecida para produzir tal anticorpo.

Para preparar a coluna de afinidade com base no antígeno, foi desenvolvido um processo para isolamento do antígeno e acoplamento ao suporte de fase sólida. O processo de isolamento do antígeno de LAM se baseia, com algumas modificações menores, nos métodos de isolamento de outros polissacarídeos bacterianos descritos na literatura, bem conhecidos dos versados na técnica e descritos a seguir.

O imunoensaio de antígeno direto à base de LAM anterior descrito na literatura utilizou anticorpo policlonal purificado por cromatografia de afinidade específica para antígeno empregando coluna de Sepharose-LAM. A abordagem da técnica anterior para a síntese da matriz de afinidade teve como base a oxidação parcial de NalO4 do polissacarídeo de LAM com acoplamento subseqüente à Nbh-Sepharose. Surpreendentemente, esses experimentos mostraram a atividade antigênica de oxidação de NalO₄ do polissacarídeo de LAM, conforme pode ser visto na figura 2.

Uma vez que a eficiência de acoplamento do polissacarídeo oxidado para o suporte Nhk-sólido é proporcional ao grau de oxidação, foi acoplado o suporte de Sepharose através do antígeno de LAM da molécula espaçadora de BSA funcionalizado, oxidado com 50 mM de NalO₄. Nesse nível de oxidação, o polissacarídeo de LAM ainda mantém sua atividade antigênica, conforme descrito abaixo, porém provê alta eficiência de acoplamento. A aplicação do soro imune à matriz de afinidade, resultou no isolamento da fração do anticorpo de coelho com alto rendimento. O teste de tal anticorpo no formato de imunoensaio de ELISA em placa como um anticorpo de captu16

ÒY ra mostrou alguma atividade funcional, porém não em nível suficiente para ser usado no imunoensaio de sensibilidade alta para classificação das aplicações usando amostras de urina não concentradas. Esses dados explicam os resultados obtidos na literatura anteriormente, onde o anticorpo purificado de afinidade específica ao LAM foi empregado, porém ainda foi necessário concentrar as amostras de urina, a fim de detectar o LAM presente nas amostras.

Inesperadamente, alterando-se a química de acoplamento de LAM para um processo não destrutivo mais brando, com base na ativação do polissacarídeo com brometo de cianogênio (CNBB), isso resultou na purificação de um anticorpo específico para LAM de melhor qualidade, conforme pode ser visto na figura 3.

Então, surpreendentemente, quando se passou o anticorpo purificado na coluna com LAM intacto (processo de ativação de CNBr) através de uma coluna com antígeno de LAM após imersão, uma forte redução de NalO4 (vide abaixo) produziu uma fração relativamente pequena do anticorpo, aproximadamente 7-10% da quantidade aplicada, com atividade muito alta no imunoensaio de antígeno direto específico para LAM. Quando tal anticorpo foi marcado com peroxidase da raiz forte (HRP) e usado como um anticorpo de marcação, ele também demonstrou atividade superior a qualquer anticorpo testado ou conhecido. O sistema ELISA com base em tal anticorpo mostrou sensibilidade extremamente alta e provou ser útil no teste de amostras de urina não concentradas. Isso permitiu a produção do imunoensaio de classificação específico para LAM com características de desempenho apropriadas para classificação rápida, no campo, ou ambos os casos TB pulmonar ou extrapulmonar, um aspecto não obtido anteriormente pelos outros. Assim, embora LAM tenha sido descrito com urina congelada de pacientes com TB, o ensaio para tais registros requer uma preparação extensiva da amostra e portanto não se adapta ao campo.

Protocolos

Nessa seção foram descritos os protocolos apropriados para prática do método direto e o método melhorado definido acima. Essa discus17 são não foi classificada estritamente de acordo com o método direto e o método melhorado propriamente, porém descreve especificamente os métodos de preparação de colunas apropriadas para uso em cada um ou ambos os métodos, dependendo do contexto. A figura 8 mostra um esquema dos métodos direto e melhorado.

Isolamento das células secas de M.tubercuiosis do Adjuvante de Freund

Primeiro, deixe que as células com adjuvante de Freund assentem por no mínimo 1 semana a temperatura ambiente antes do uso. Remova as tampas dos frascos do adjuvante e sem perturbar as células assentadas no fundo do frasco, extraia o óleo mineral em volume. Uma pequena quantidade de óleo mineral pode ser deixada no frasco como uma precaução para evitar escoamento do precipitado de células. Descarte o óleo mineral e então misture 6,0 L de etanol e 6,0 L de éter dietílico e adicione 5 mL de mistura de etanol:éter dietílico a cada frasco.

Em seguida, feche o frasco, inverta e transfira rapidamente a suspensão para um frasco Erlenmeyer de 2 litro. Evite deixar as células reassentarem no frasco durante essa etapa. Quando o frasco Erlenmeyer de 1 litro estiver cheio até a linha de 1 litro, deixe as células assentar por 1 hora a 1 hora e meia. Em seguida, decente brandamente o solvente do frasco Erlenmeyer em um béquer limpo de 1 litro. Evite perturbar as células assentadas e mover as mesmas com o solvente. Se o solvente decantado no béquer se tornar límpido, descarte o mesmo. Se uma quantidade significativa de células forem decantadas com o solvente, retorne o solvente decantado para o frasco Erlenmeyer e repita a etapa de assentamento. Usando alíquotas de 20-30 mL de mistura de etanokéter dietílico, transfira as células para um filtro de vidro sinterizado.

Lave as células com 500 mL de uma mistura de etanol-éter dietílico, então lave com 200 mL de éter dietílico. Em seguida, seque as células ao ar em um filtro usando um vácuo de 200 mmHg +/-10 (vácuo baixo). Ocasionalmente, misture e proceda à homogeneização da massa de células, então cubra o filtro com um material poroso (tal como um lenço Kim) e deixe na capela até secar (cerca de 15 horas, isto é, por toda a noite).

Pese e registre o peso total e calcule o peso seco das células. Então vede hermeticamente com tampa revestida com borracha e armazene a 15-30°C.

Extração de Fenol do antígeno LAM bruto

Coloque as células secas de M. tuberculosis em uma garrafa de meios de 240 mL Pyrex e adicione água desionizada aquecida sobre as células. Inverta e sonique por pulsos (~20 pulsos por segundo) a suspensão no banho de água ultra-sônico até a suspensão homogeneizar.

Extraia o fenol das células, então precipite o fenol e coloque as células precipitadas no refrigerador (2-8°C) por toda a noite (~16 horas) para permitir que o precipitado seja assentado. Tome cuidado para não perturbar o precipitado, drene brandamente o sobrenadante até cerca de 100 mL do sobrenadante serem deixados cobrindo o precipitado. Misture a combinação brandamente, então transfira a suspensão restante para os tubos de centrífuga de teflon e centrifugue a 12.000 rpm por 20 minutos. Drene tanto sobrenadante quanto possível de todos os tubos sem perturbar a microesfera, adicione 5 mL de água desionizada a cada tubo e, usando inversão e sonicação por pulso, dissolva a microesfera em água. Combine todas as frações com a microesfera dissolvida e coloque em um frasco de 500 mL (Observação: não exceda 1/10 da capacidade do frasco/volume). Evapore por rotação a um volume mínimo, porém evite caramelizar a amostra. Redissolva a película com aproximadamente 50 mL de água e repita a secagem e redissolução até a amostra ter sido seca 3 vezes. Redissolva em 50 m de água e liofilize.

Purificação do antígeno de LAM por cromatografia em Sephadex G-25

Dissolva 800 mg de LAM Ag bruto em 15 mL de solução de ácido acético a 0,25%. Inverta e sonique em banho ultra-sônico para obter dissolução completa. Centrifugue em uma microcentrífuga a 500 rpm por 5 minutos. Colete o sobrenadante em um frasco de vidro de 20 mL, divida o sobrenadante em 3 partes iguais para separar as operações cromatográficas, e então brandamente aplique um terço do sobrenadante de LAM Ag coletado na parte de cima da coluna cromatográfica. Após um volume de 100 mL ter loo sido escoado através da coluna, comece a coleta das frações. Continue a coletar as frações até 350 mL da fase móvel terem passado, desde o único da cromatografia. Cubra todas as frações e armazene a 2-8°C. Evapore por rotação em um frasco de evaporação de 250 mL (nenhum volume superior a

25 mL). Evapore para o volume mínimo, porém evite caramelização da amostra. Dilua o material evaporado em 20 mL de água, sonique, inverta até dissolução completa e então proceda com a liofilização (cerca de 8 horas). Raspe o material seco com uma espátula em um frasco de vidro tarado e pese.

As etapas precedentes foram ilustradas esquematicamente na figura 6.

Acoplamento do antígeno de LAM ao espacador de BSA por ativação de

CNBr

Primeiro, prepare soluções de 0,5 M de bicarbonato de sódio e 1

M de carbonato de potássio. Então, dissolva 30,0 g de LAM Ag purificado em 1,5 mL de água desionizada. Use a sonicação por pulso (10-20 pulsos por segundo) e inverta para dissolver completamente o LAM Ag.

Dissolva 300 mg de ligante de BSA-hidrazina em 15 mL de água desionizada. Sonique por pulsação (10-20 pulsos por segundo) e inverta pa20 ra dissolver completamente, então coloque em tubos de centrífuga e centrifugue em uma microcentrífuga por 10 minutos a 10.000 rpm. Usando uma pipeta Pasteur colete cuidadosamente e agrupe o sobrenadante límpido de cada tubo e transfira para um frasco de 20 mL. Evite perturbar qualquer microesfera que possa se formar. Adicione 1,0 mL de bicarbonato de sódio a

0,5 M no frasco e misture bem por agitação. Adicione 150 pL de carbonato de potássio 1M resfriado à solução de LAM e misture bem por inversão breve. Coloque a solução obtida em ganho de gelo/água.

Prepare 5 mg/mL de CNBr em acetonitrila para uso imediato e adicione 180 μί de solução de brometo de cianogênio à solução de LAM.

Misture por inversão e coloque no gelo por cerca de 15 minutos. Adicione essa solução à solução de ligante de BSA-Hidrazina (acima) com uma pipeta Pasteur. Misture bem e incube por toda a noite (16-24 horas), a 2-8°C em frasco hermeticamente vedado.

Acoplamento do antígeno de LAM ao espaçador de BSA por ativação de

NalO₄

Dissolva o antígeno de LAM em 1,25 mL de água desionizada em um frasco de 3-4 mL. Pulse por sonicação e inverta para dissolver completamente. Prepare uma solução de periodato 0,1 M: (em tampão de NaOAc, pH 4,0). Adicione 1,25 mL da solução de NalO₄ a 0,1 M à solução de 1,25 mL de LAM. Inverta para misturar. Cubra o frasco com folha de alumínio; coloque o mesmo sobre a plataforma giratória e misture por 1 hora +/- 5 minutos a temperatura ambiente.

Dissolva 250 mg de ligante BSA-hidrazina em 12,5 mL de água desionizada em um frasco de soro de vidro de 25-40 mL. Use sonicação por pulso e inverta para dissolver completamente, então centrifugue por cerca de 10 minutos a 10.000 rpm. Usando uma pipeta Pasteur colete o sobrenadante de cada tubo e agrupe em um frasco de vidro de 25-40 mL. Evite perturbar a microesfera. Adicione 12,5 mL de fosfato de sódio a 0,1 M (pH 6,8) ao frasco e misture bem com inversão breve.

Processo de Acoplamento

À solução de BSA-hidrazina adicione a solução de LAM oxidada e inverta. Adicione 100 mg de cianoborohidreto de sódio e vede. Amostre 10 gL da solução final e dilua com 90 gL de tampão 1X PBS (solução QC) e mantenha para análise adicional (a concentração de LAM será de cerca de 0,75 mg/mL).

Ativação de Sepharose por NalO₄

Meça uma alíquota da suspensão de Sepharose 4B-CI correspondente aos 80 mL de gel assentados e transfira para um filtro de vidro sinterizado. Lave com 500 mL de água e drene usando vácuo baixo (cerca de 300 mmHg) até a estrutura granular da superfície do gel se tornar visível. Evite formação de rachaduras por ar na camada de gel. Prepare uma solu30 ção de tampão de acetato de sódio a 0,1 M, pH 4,0 e use para preparar uma solução de 30 mM de NalO₄ em 0,1 M de NaOAc.

Adicione 250 mL de NalO₄ a 30 mM ao gel e misture completa21 mente. Cubra a garrafa com folha de alumínio e coloque em um ângulo de 45° sobre uma plataforma giratória em velocidade média por uma hora e meia ±10 minutos a temperatura ambiente. Transfira para o filtro de vidro sinterizado e lave com 1 litro de água usando vácuo baixo (cerca de 300 mmHg). O gel ativado deve ser preparado dentro de no máximo 4 horas para uso.

Acoplamento de ligante de BSA-LAM à Sepharose ativada (Para síntese das primeira e segunda colunas de afinidade)

Preparação da matriz

Prepare uma solução de azida de sódio a 0,1% em 1XPBS (salmoura de fosfato tamponada). Meça uma suspensão da Sepharose ativada correspondendo a 60 mL do gel assentado (ou outra matriz apropriada) e transfira para um filtro de vidro sinterizado. Drene o gel usando vácuo baixo (300 mmHg) até o gel acumular-se e a estrutura granular ser visível, porém evite formação de rachaduras na superfície do gel.

Solução de Ligante de BSA-LAM:

Em uma garrafa de meios de 250 mL, dilua cerca de 17 a 20 mL de solução de ligante BSA-LAM para 90 mL com tampão de fosfato de sódio (pH 6,8). Adicione 90 mg de cianoborohidreto de sódio cristalino, à solução. Feche hermeticamente a garrafa usando a tampa de plástico fornecida. Misture bem por inversão breve. A solução pode parecer opaca porém não deve haver precipitação. Bolhas de gás microscópicas formadas pelo cianoborohidreto de sódio podem ser visíveis.

Etapa de Acoplamento:

À solução de LAM preparada acima, adicione o gel Sepharose ativado e drenado. Feche hermeticamente e misture completamente a suspensão usando inversão branda, incube por cerca de 4 horas a 37°C +/-2°C, misture (por inversão) a mistura de reação a cada hora. Adicione 4,5 mL de tampão 1,5 M Tris e feche hermeticamente a tampa novamente. Continue a incubar a 37°C +/- 2°C por cerca de 16 horas (por toda a noite).

Transfira a mistura de reação para um filtro de vidro sinterizado e colete a fase líquida em um frasco Bunzen limpo de 100-200 mL por aplica22 ção de vácuo baixo (300 mmHg). Lave o gel de LAM-Sepharose no filtro com 400 mL de água desionizada e continue lavando com 600 mL de IX PBS. Embalamento e armazenamento da Coluna:

Em um béquer de 250 mL adicione 100 mL de 1X PBS ao gel preparado. Agite manualmente até se transformar em pasta. Embale em uma coluna de acordo com os procedimentos padrão usando 1X PBS. Equilibre a coluna com 1X PBS mais 0,1% de azida de sódio.

Acoplamento Genérico de ligante de LAM à Sepharose ativada (para preparação das colunas de afinidade I e II)

Meça a suspensão da Sepharose ativada correspondendo a 100 mL do gel assentado e transfira a mesma para o filtro de vidro sinterizado. Drene o gel usando vácuo baixo (300 mmHg) até o gel se acumular e a estrutura granular for visível, porém evite formação de rachaduras na superfície do gel. Mantenha o gel drenado para uso posterior.

Solução de ligante BSA-LAM

Em uma garrafa de meios Pyrex de 250 mL dilua cerca de 27,5 mL de solução de ligante BSA-LAM a 100 mL com o tampão fosfato de sódio (pH 6,8). Adicione 100 mg de cianoborohidreto de sódio cristalino à solução. Feche hermeticamente a garrafa usando a tampa plástica fornecida. Misture bem por inversão breve. A solução pode parecer opaca porém não deve haver precipitação. Bolhas de gás microscópicas formadas pelo cianoborohidreto de sódio podem ser visíveis.

Etapa de Acoplamento:

À solução de LAM preparada acima, adicione o gel Sepharose ativado e drenado. Feche hermeticamente com a tampa de plástico fornecida. Misture completamente a suspensão usando inversão branda (velocidade média) e incube por cerca de 4 horas a 37°C +/-2°C, agitando a mistura de reação (por inversão) a cada hora. Adicione 7,5 mL de tampão 1,5 M Tris e feche hermeticamente. Continue a incubar a 37°C +/- 2°C por cerca de 16 horas (por toda a noite).

Transfira a mistura de reação para um filtro de vidro sinterizado e colete a fase líquida em um frasco Bunzen limpo de 100-200 mL por aplica23

1<η ção de vácuo baixo (300 mmHg). Lave o gel de LAM-Sepharose no filtro com 800 mL de água desionizada. Continue a lavar com cerca de 1,2 L de 1X PBS.

Embalamento e armazenamento da Coluna:

Em um béquer de 250 mL adicione 160 mL de 1X PBS ao gel acima. Agite manualmente (com espátula/barra de vidro) até formar uma pasta. Embale em uma coluna de acordo com os procedimentos padrão usando 1X PBS. Equilibre a coluna com 1X PBS mais 0,1% de azida de sódio.

As etapas precedentes envolvendo o uso de LAM purificado e a preparação de colunas de afinidade I e II são ilustradas esquematicamente na figura 7.

Isolamento do anticorpo por cromatografia de afinidade I (o Método Direto)

Prepare as seguintes soluções de estoque:

litro de tampão de 0,1 M glicina, ajuste do pH para 2,5 com 1M

HCI.

litro de solução 3 x PBS (dilua uma solução de estoque de PBS 10 vezes com água desionizada) e verifique o pH reajuste para 7,2 a 7,4, se necessário, com 1M HCI ou 1M NaOH.

200 mL de 1X PBS mais solução de azida de sódio a 0,1%

100 mL de uma solução de 0,5 M fosfato de hidrogênio dissódio (Na₂HPO₄)

Preparação do Soro

Descongele o soro congelado lentamente no refrigerador (cerca de 16 horas/por toda a noite) até estar completamente descongelado. Meça o volume do soro e pese 2,9 g de cloreto de sódio para cada 100 mL de soro e adicione aos soros. Agite brandamente até dissolução completa: a concentração final será de 0,5 M NaCI.

Centrifugue (4-8°C) a -8.000 g por 20 minutos. Drene o sobrenadante de todos os tubos da centrífuga com pipeta Pasteur. Não perturbe o pelete. Filtre o sobrenadante através de um funil cavilhado com algodão e colete o filtrado. O filtrado coletado poderá ser ligeiramente opaco, porém não deverá conter quaisquer materiais em partículas. Coloque o soro filtrado loó no refrigerador até, o início da etapa de cromatografia de afinidade.

Aplicação do Soro:

Prepare uma coluna I (LAM não modificado acoplado ao material de coluna) para aplicação do soro por equilíbrio com 1X PBS. Ajuste a razão para 2,0 mL/minuto e continue aplicando 1X PBS até a linha de base permanecer estável por pelo menos 1 hora. Ajuste o gravador ou detector para zero, conforme necessário. Uma vez que a linha de base esteja estável, ajuste a razão para 0,5 a 0,6 mL/minuto e então aplique o soro preparado acima na Coluna de Afinidade I de LAM na razão de 0,5-0,6 mL/minuto. Colete o elu10 ente de volume vazio (será de cerca de 30% do volume da coluna). Monitore as frações por detecção com UV a 260-280 nm e quanto um aumento no sinal ocorrer, comece a coletar o soro passado através da coluna em um soro de 500-1.000 mL. Após todo o volume do soro ter sido aplicado à coluna, cesse brevemente o fluxo da coluna, aplique tampão 3X PBS e então continue o fluxo do líquido. Prossiga com a lavagem da coluna com 3X PBS até o sinal diminuir para cerca de 50% da linha de base. Nesse ponto, pare a coleta do soro e salve todas as frações coletadas. Altere a razão do fluxo para 2,0 mL/min e continue a lavagem da coluna com 3X PBS até a linha de base ser aproximadamente de 10-15%. Descarte o fluxo direto. Substitua o tampão 3X PBS por tampão 1X PBS e lave com cerca de 2 a 2,5 volumes de coluna em uma razão 2,0 mL/minuto. Descarte o fluxo direto.

Eluicão da Etapa de Anticorpos:

Ajuste a razão para 1,0 mL/min. Substitua o tampão 1X PBS por tampão 0,1 M Gly-HCI esfriado preparado acima, e inicie a eluição do anti25 corpo absorvido. Quando o sinal aumentar rapidamente e estiver 10-15% da escala plena, comece a coletar a coluna do eluente em tubos cônicos de 15 mL colocados no banho de água gelada (0°C). Colete frações de 5 mL.

Continue coletando os anticorpos no tampão Gly-HCI até o sinal começar a diminuir rapidamente. Pare a coleta da fração quando o sinal cair para o nível de sinal do começo da coleta (10-15% da escala plena). Neutralize a solução de anticorpos coletada para cada fração de 5 mL com 0,5 mL de 0,5 M Na2HPO4 em incrementos de 0,1 mL. O volume total adicionado seria igual a 10% do volume da fração antes da neutralização.

Misture a solução brandamente durante adição do tampão de Na₂HPO4 e agrupe as frações neutralizadas. Meça o O.D. dos anticorpos em 280 nm contra uma peça em bruto contendo apenas 0,1 M de tampão Gly-HCl e calcule a concentração do anticorpo. Coloque o anticorpo coletado em 2-8°C por um mínimo de 3 dias para permitir rachadura e derramamento. Cuidado com a Coluna:

Equilibre a coluna com 1X PBS até obter a neutralidade (pH 7). Quando não estiver sendo usada, equilibre a coluna com 1X PBS mais solução de azida de sódio a 0,1 % e armazene a coluna a 4-8°C até uso futuro. Diálise

Centrifugue os anticorpos preparados em 10.000G por um mínimo de 5 minutos. Transfira o sobrenadante para tubulação de diálise de fração de peso molecular de 12-14 e dialize contra 1X PBS por 2-3 dias com um mínimo de 4 mudanças de tampão, com uma razão de solução AB para volume total £ 1:20. Remova os anticorpos da diálise. Meça o volume da solução de anticorpo usando cilindro de vidro graduado. Se houver qualquer rachadura/derramamento adicionais (na forma de um precipitado) centrifugue a solução de anticorpos novamente a 10.000G por um mínimo de 5 minutos. Meça o O.D. dos anticorpos a 280 nm após bloqueio do espectrofotômetro com tampão 1X PBS. Calcule a concentração em mg/mL e coloque para armazenamento a 4-8°C.

Isolamento do anticorpo por cromatografia de afinidade II (o Método Melhorado)

Purificação de Anticorpos Altamente Específicos

Aplique 1X PBS à Coluna de Afinidade 2 de LAM preparada acima, (LAM modificado por forte oxidação, acoplado ao material de coluna usando NalO₄), a uma razão de 2,0 mL/minuto até a linha de base permanecer estável por pelo menos 15 minutos. Ajuste o gravador e detector para zero, conforme necessário. Continue a monitorar a linha de base pelos próximos 30 minutos e uma vez estável, aplique o anticorpo à coluna. Ajuste a razão para 0,5-0,6 mL/minuto e aplique um volume de anticorpo, conforme

ΙόΥ »

preparado acima, correspondendo a *100-150 mg de Ab à Coluna de Afinidade 2 de LAM usando uma Econo bomba ou dispositivo semelhante. Colete o eluato de volume vazio (ele será de cerca de 30% do volume da coluna) a 280 nm. Comece a coletar os anticorpos conforme o sinal aumentar para cerca de 10-15% acima da linha de base em uma garrafa de soro limpa. Quando o volume total do anticorpo tiver sido aplicado, cesse brevemente o fluxo de líquido, aplique tampão 1X PBS e então continue o fluxo do líquido a 0,5-0,6 mL/minuto. Prossiga com a coleta do material escoando através da coluna em 280 nm. Quando o sinal cair para 10-15% acima do início da cole10 ta (30-50% acima da linha de base), pare a coleta da solução.

Meça o O.D. dos anticorpos altamente específicos a 280 nm e após isso calcule a concentração do anticorpo. Coloque a solução de anticorpo imediatamente em 4-8°C para armazenamento temporário.

Lavagem da Coluna

Continue a lavar a coluna com 1X PBS em uma razão de 2,0-2,5 mL/minuto. Passe um mínimo de 3 volumes de coluna de 1X PBS. Elua o material absorvido na coluna com tampão frio 0,1M Glu-HCI preparado acima. Colete o material eluído em frascos de vidro. Quando o monitor/sinal cair para *10-15% da linha de base, cesse a coleta. Neutralize a solução de

Anticorpo coletada por adição de 10% do volume total de 0,5M de fosfato de sódio, preparado acima, por adição em incrementos de 0,5 mL. Meça o O.D. dos anticorpos em 280 e calcule a concentração do anticorpo. Coloque imediatamente a solução de anticorpos coletados a 4-8°C e mantenha até a análise dos anticorpos coletados na etapa acima estar completa. Se a con25 centração de anticorpos acima for inferior a 0,3 mg/mL, concentre.

Lave a coluna com um mínimo de 3 volumes de coluna de 1X

PBS a uma razão de 2,0-2,5 mL/minuto. Lave a coluna novamente com 1 volume de coluna de 1X PBS mais azida de sódio a 0,1% e armazene a 48°C até uso futuro.

As etapas precedentes mostrando o isolamento dos anticorpos enriquecidos das colunas de afinidade I e II empregando os métodos direto e melhorado são ilustradas esquematicamente na figura 8.

Processo para revestimento da placa de ELISA

Programação do Sistema Moduline 300

O revestimento Ab deve ser completado dentro do máximo de 8 horas a partir do final da preparação da solução de revestimento M815. A solução de revestimento de anticorpos deve ser mantida no gelo (0°C) durante o processo de revestimento.

Etapa Um

Pese antecipadamente e inspecione as placa vazias descartando as placas quebradas. Distribua 100 mel de solução de revestimento Ab específica para MTB-LAM em cada cavidade de cada tira da placa usando um sistema Moduline 300. Verifique visualmente todas as 96 cavidades de cada placa quanto a uniformidade de enchimento da cavidade durante o processo de revestimento. Não descarte a solução Ab não utilizada e armazene a (28°C) até o lote completo de placas ter sido processado e passado para uso. Empilhe as placas com Ab dispensado em pilhas de 10 placas cada e cubra a placa superior com uma placa vazia usada como um revestimento. Rotule cada placa de revestimento de pilha de 1 a 18. Refrigere as pilhas de placas a 2-8°C e incube por toda a noite (14-18 horas).

Etapa Dois

Programe o sistema Moduline 300 para realizar ciclos de 3 lavagens seguidos por dispensa imediata do ciclo de 312 pL de Solução de Bloco. A solução de Bloco deve ser usada dentro de no máximo 24 horas do final da preparação. Remova as placas do refrigerador e remova as placas de cobertura das pilhas conforme elas vão sendo colocadas no Moduline e coloque as mesmas de lado. Programe o cronômetro para 6 horas. Programe placas bloqueadas vindo do transportador, em bandejas numeradas seqüencialmente e bloqueie por 5 a 6 horas em temperatura ambiente (2028°C).

Coloque as placas nas bandejas na Câmara de Secagem e incube a 20-23°C e 20-22% de umidade relativa por 24-72 horas. Remova as placas secas da câmara de secagem.

Preparação de MTB-Ab para Conjugação ao HRP (Preparação da solução de MTB-Ab seria realizada por pelo menos 7 dias antes do procedimento de conjugação).

Diálise:

Diálise a quantidade necessária da solução de MTB-LAM-Ab contra 1X PBS por no mínimo 48 horas com 4 mudanças mínimas, a 2-8°C. Utilize a tubulação da diálise com MWCO 12-14.000. Após a diálise, centrifugue a solução de Ab a 12.000 rpm por 10 minutos e aspire cuidadosamente o sobrenadante no tubo de centrífuga graduado de 15 mL.

Meça a densidade óptica da solução de Ab após a diálise a 280 nm e calcule a concentração de Ab após a diálise. Se a solução de Ab após a diálise possuir OD₂80 nm > 2,8, faça uma diluição para 1:7 da solução de Ab emIXPBS.

Concentração:

Realize uma pré-lavagem do dispositivo de filtro da centrífuga Ultrafree-15 da Amicon com 1X PBS. Coloque cerca de 15 mL da solução de 1X PBS no dispositivo e centrifugue a 3.500 rpm por cerca de 5 minutos. Descarte toda a solução das unidades do dispositivo. Concentre a solução de Ab acima após a diálise com o dispositivo de filtro de centrífuga Ultrafree15 para 4,5-5,5 mg/mL por centrifugação na centrífuga de bancada (rotor de embolo) a 3.500 rpm por cerca de 5 minutos x 3. Aspire cuidadosamente a solução de Ab concentrada da Unidade de Filtro do dispositivo Amicon em um tubo de 15 mL. Para maximizar a recuperação, remova a amostra concentrada imediatamente após a centrifugação e ressuspenda o volume concentrado várias vezes com uma pipeta para garantir a mistura apropriada antes da aspiração de Ab.

Centrifugue a solução de Ab concentrada a 10.000 rpm por cerca de 15 minutos e aspire o sobrenadante de Ab em um tubo de 15 mL. Meça a OD₂₈o da solução de Ab em diluição de 1:20 em 1X PBS e calcule a concentração de Ab.

Faça a amostragem de 0,1 mL da solução de Ab para análise com ELISA. Armazene a 2-8°C.

Preparação do Conjugado MTB-LAM-Ab-HRP

Lave todos os frascos de vidro e barras de agitação para etapas de conjugação e frascos de vidro para armazenamento conjugado com solução de H2SO4 e enxágüe os mesmos totalmente com água de torneira e água desionizada.

Preparação da Coluna Sephadex G-25 para cromatografia

Obtenha a coluna (1,5 x 30 cm) com volume de cerca de 50 mL embalada com Sephadex G-25 (Fine). Embale a coluna conforme descrito acima. Ajuste as condições que se seguem para realizar a cromatografia de modo a equilibrar a coluna com 1 mM de sódio

- Tampão de acetato, pH 4,4

- comprimento de onda do monitor de UV para 280 nm

- sensibilidade do monitor: 0,2 OD

- velocidade do registrador de gráfico: 2 mm/minuto

- razão da bomba para lavagem da coluna: 60 mL/hora

Lave a coluna com cerca de 100-150 mL de acetato de sódio 1 mM, pH 4,4 e ajuste a linha de base do monitor de UV para a posição 0. Certifique-se de que a linha de base estabelecida permaneça estável por cerca de 30 minutos. Calcule a quantidade da solução de MTB-LAM-Ab necessária para conjugação e centrifuge Ab a 12.000 rpm por cerca de 10 minutos. As20 pire cuidadosamente o sobrenadante Ab em um frasco de vidro limpo. Meça a OD₂80nm da solução Ab na diluição 1:20 em 1X PBS e calcule a concentração da solução Ab não diluída. Armazene a solução Ab a 2-8°C até utilização.

Oxidação de HRP (peroxidase de raiz forte) com NaICU

Pese 8 mg de HRP em frasco de vidro conformado em V. Adicione 2,0 mL de água desionizada. Agite brandamente a solução por cerca de 2-3 minutos até toda HRP ter sido dissolvida. Certifique-se de que não existam partículas de HRP não dissolvidas nas paredes do frasco de vidro.

Prepare a solução fresca de 0,1 M de NalO4, pH 4,4 para uso no máximo dentro de 5 minutos e proteja da luz. Adicione 0,4 mL de 0,1 M NalO₄ à solução de HRP preparada acima, enquanto agitando. Cubra o frasco com uma folha de alumínio para proteger a mistura da luz. Incube a mistura por 20 minutos com agitação a temperatura ambiente. Adicione 4 gotas de etileno glicol à mistura de reação e agite por cerca de 2 minutos. Cromatografia e Concentração de HRP Oxidado

Imediatamente após o término da etapa 5.4.7 purifique a RHP oxidada por filtração em gel na coluna Sephadex G-25 (Fine). Ajuste a razão da bomba para eluição da amostra para cerca de 50 mL/hora. Aplique cuidadosamente o volume final da HRP oxidada preparada acima ao leito de gel seco porém tomando cuidado para não perturbar o leito de gel. Não seque o gel demasiadamente. Colete toda HRP oxidada (solução colorida) em um tubo de 15 mL. Primeira máxima no gráfico de cromatografia (OD280nm > 0,05). Após a cromatografia estar completa, esvazie a coluna de Sephadex G-25 e descarte o gel, registrando o volume da solução de HRP após a cromatografia.

Concentração da HRP Oxidada

Realize a pré lavagem dos dispositivos de filtro da centrífuga Ultrafree-15 com 1 mM de acetato de sódio, pH 4,4 com cerca de 15 mL de 1 mM acetato de sódio, pH 4,4 e centrifuge a unidade de filtro por cerca de 5 minutos a 3.500 rpm usando uma centrifuga de bancada (rotor de emboto). Então descarte todas as soluções da Unidade de Filtro. Imediatamente após a cromatografia, concentre a solução de HRP oxidada (a partir do acima) para cerca de 2 ± 0,2 mL com uma unidade de filtro de centrífuga Ultrafree15 (membrana Biomax-10K) por centrifugação a 3.500 rpm por cerca de 5 minutos. Aspire cuidadosamente a solução de HRP concentrada da Unidade de Filtro do dispositivo no frasco de vidro limpo, meça, registre o volume e armazene a 2-8°C.

Conjugação de HRP em MTB-LAM-Ab

Calcule a quantidade de solução MTB-LAM-Ab necessária para conjugação em HRP. Coloque a MTB-LAM-Ab (a partir do acima) em um frasco de vidro conformado em V com barra de agitação triangular, sem deixar gotas da solução Ab nas paredes do frasco. Adicione 1/2 volume da solução de HRP oxidada (acima) à solução de MTB-LAM-Ab, cubra o frasco com folha de alumínio para proteger a mistura de reação da luz e agite a

Ϊ4_ύ mistura de reação no frasco de vidro por 30 minutos a temperatura ambiente. Evite espumamento.

Adicione 1M de Carbonato-HCI, em pH 9,5 e agite a temperatura ambiente por duas horas. Proteja da luz e evite espumamento.

Prepare 4 mg/mL de boroidreto de sódio (NaBH₄) imediatamente antes do uso e proteja da luz com a folha de alumínio. Adicione imediatamente a quantidade calculada de NaBH₄ necessária para a solução MTBLAM-Ab preparada acima e incube a mistura de reação por cerca de 2-8°C por 2 horas. Dialise a mistura de reação contra 1X PBS por no mínimo 48 horas a 2-8°C com um mínimo de 4 mudanças de tampão em intervalos de 8-16 horas. Use a tubulação de diálise de frações de 12-14kDa para diálise. Armazenamento e Análise do Conjugado

Após a diálise, centrifugue a solução de conjugado a 4.000 rpm por cerca de 4 minutos. Retire o sobrenadante cuidadosamente e coloque a solução de conjugado em um frasco de vidro limpo de 6 mL. Meça 18 mL de Estabilizador de Conjugado de Peroxidase Guardian/Diluente na garrafa de vidro de 50 mL com barra de agitação magnética. Adicione 2 mL de conjugado MTB-Ab-HRP e agite a mistura por cerca de 10 minutos. Armazene a 2-8°C e proteja da luz.

As etapas precedentes relacionadas à preparação do conjugado de MTB são ilustradas esquematicamente na figura 9.

Resultados

A seguir são apresentados os dados da avaliação de um ELISA de antígeno direto que detecta LAM na urina não processada e não concen25 trada usando o método direto para produção de anticorpos enriquecidos.

(Acredita-se que resultados melhores possam ser obtidos por emprego dos anticorpos enriquecidos produzidos usando o método melhorado descrito acima). Os estudos que produziram esses dados foram realizados na região de Mbeya que está localizada nas terras altas a sudoeste da Tanzânia, em colaboração com o Regional TB e Leprosy Programme e o Mbeya Medicai Research Project (MMRP). Na região de Mbeya, cerca de 3.500 novos casos de TB são diagnosticados anualmente e o tratamento é conduzido de acordo li.3 com a estratégia DOTS nacional. O início de cada terapia é realizado em uma instalação central do Mbeya Referral Hospital. A razão de cura da TB foi de 72,3% em 2002. O objetivo do estudo foi avaliar o desempenho de um ELISA de captura de LAM disponível comercialmente na prática clínica e comparar os resultados com o padrão ouro da diagnóstico da TB: Microscopia do esputo, cultura de TB, radiografia do tórax e investigação clínica. MATERIAIS E MÉTODOS

Descrição do LAM-ELISA

O imunoensaio intercalado de antígeno direto MTB-ELISA (MTB10 ELISA, Chemogen, So. Portland, ME, USA) é um LAM-ELISA semelhante ao ensaio desenvolvido por outros. Os imunosoros foram colhidos de coelhos brancos da Nova Zelândia que foram imunizados com células integrais inativadas de M. tuberculosis H37Rv. Anticorpos específicos LAM policlonais foram isolados por cromatografia de afinidade usando LAM imobilizado como um ligante. O kit de teste consiste em placas de ELISA de 96 cavidades prérevestida com anticorpo específico para LAM, bloqueada e vedada em uma bolsa plástica com dessecante; um frasco com anticorpo policlonal específico para LAM conjugado a HRP específico para LAM; um frasco com substrato cromogênico de componente simples de TMB; um frasco com uma solu20 ção de controle negativo e três frascos com calibradores correspondendo a 0,5 ng/mL e 4,5 ng/mL de LAM em amostras de urina. As amostras de urina foram consideradas positivas no ELISA quando a densidade óptica obtida em 450 nm era de pelo menos 0,1, acima do sinal do controle negativo (> 2SD).

Uma amostra de urina de paciente de 0,1 mL é colocada em duplicatas na placa ELISA, incubada por 1 hora e lavada com solução de 0,05% Tween-20/PBS (PBST). Foi adicionado 0,1 mL de conjugado de HRP específico para LAM. Após uma hora de incubação a placa foi lavada com solução de PBST e 0,1 mL de substrato de TMB foi adicionado. Após 10 mi30 nutos de incubação a reação do substrato é parada por adição de 0,1 m L de 1M H2SO4 e a revelação da cor é lida em 450 nm.

Nas outras concretizações, a isoforma específica do lipoarabi33 nomanano (LAM) determinada para conter a atividade antigênica é empregada para gerar anticorpos policlonais altamente específicos, altamente puros, para uso na detecção do lipoarabinomanano de Mycobacteríum na urina dos pacientes a serem classificados quanto a tuberculose ativa, usando protocolos semelhantes aos descritos acima. A isoforma antigenicamente ativa de LAM foi identificada usando oxidação seletiva de LAM, onde duas isoformas foram prontamente identificáveis e distinguíveis (dados não-mostrados). Uma continha porções sensíveis a altas concentrações de periodato de sódio (NaICU), tal que, em concentrações altas de periodato de sódio, a atividade sorológica de LAM foi destruída. A outra isoforma mantinha atividade sorológica, mesmo quando submetida a altas concentrações de periodato de sódio. Uma comparação dos dois métodos de oxidação de LAM, usando tanto agentes de oxidação branda quanto concentrações baixas de NalO4 preservou a atividade antigênica do LAM. A oxidação por altas concentrações de NaICU, contudo, resultou em perda da atividade antigênica do LAM.

Portanto, apenas LAM ativado com CNBr ou oxidado com agentes de oxidação branda ou baixas concentrações de NalO4 é empregado para gerar LAM altamente antigênico para uso na preparação de anticorpos policlonais altamente específicos e altamente puros, que são usados na detecção de LAM nas amostras de urina de modo a diagnosticar TB em pacientes de interesse.

Esses resultados são completamente inesperados em comparação aos métodos de detecção revelados por Svenson e outros (vide, por exemplo, WO97/34149) que empregaram apenas altas concentrações de NalO₄ para oxidar o LAM micobacteriano e conseqüentemente destruíram a atividade antigênica do LAM usado para gerar os anticorpos. O desconhecimento da existência de mais de uma isoforma de LAM a ser detectada, não permitiu, na revelação anterior, a preparação de anticorpos altamente específicos para a forma antigenicamente ativa de LAM, uma vez que nenhum desses estudos anteriores demonstrou conhecimento da existência de uma isoforma separada que continha a atividade antigênica ou que tal atividade seria perdida durante meios padrão de oxidação, a saber, o tratamento com contrações altas de NalO₄.

Descrição do Sítio Clínico

No período de 8 semanas, 242 pacientes com suspeita de TB foram recrutados nos departamentos ambulatoriais de 5 centros clínicos em Mbeya, Tanzânia. O protocolo padrão de investigação incluiu avaliação clínica, radiografia do tórax, ESR, contagem dos leucócitos e teste para HIV, coloração 3 x AFB (Zíehl Neelson) do esputo no dia 1, 2 e 3, duas culturas de esputo no meio Loewenstein Jenssen e LAM-ELISA na urina e soro.

Todos os pacientes possuíam sinais clínicos de TB (tosse mais de quatro semanas, suores noturnos, perda de peso, perda de apetite). Cento e trinta e sete desses pacientes tinham TB pulmonar confirmada em laboratório (PTB), 9 tinham suspeita radiológica alta de PTB (efusões pleuraís ou nodos linfáticos hilar aumentados) e 8 mostraram sinais clínicos e radiológicos de TB militar. Os pacientes consentiram teste de HIV e 70% foram confirmados como HlV-positivos. Os dados foram manipulados confidencialmente. O estudo foi aprovado pela Comissão de Revisão Institutional e pelo Comitê Ético Nacional da República da Tanzânia.

Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados nas instalações do laboratório do Mbeya Medicai Research Project.

Microscopia e Cultura das Amostras de Esputo

A coloração Ziehl Neelson e microscopia foram realizadas por um técnico de laboratório experimentado e qualificado. Após descontaminação, as amostras de esputo foram cultivadas no meio Loewenstein Jenssen em duplicata. As culturas foram examinadas semanalmente quanto ao crescimento durante 8 semanas.

Espécimes de Urina

Foram coletados, em um recipiente de plástico estéril, 30 mL de urina de cada paciente, que foram rotulados com o número de código do formulário de dados do paciente. 100 pL de urina fresca e não processada foram adicionados ao cavidades da placa de ELISA em duplicata. Controles negativos, controles positivos baixo, médio e alto foram também adicionados a cada placa em duplicata. Os espécimes foram processados dentro de 24

Μ horas e então armazenados a -20°C para teste futuro na Alemanha.

Grupos de Controle da Tanzânia e USA

Amostras de urina de 23 elementos do grupo do Mybeya Referral Hospital, de 20 elementos do grupo do Chemogen, Inc. e de 200 pacientes de 2 clínicas em New York foram testadas no LAM-ELISA. Todos pareceram saudáveis nos exames clínicos e não tinham quaisquer sinais de infecções respiratórias.

RESULTADOS

Avaliação Pré-Clínica do Sistema ELISA

A figura 4a) mostra a curva de resposta de dose usando concentrações diferentes de LAM na urina. O valor das frações ópticas foi definido de acordo com essas curvas como concentração de LAM produzindo uma densidade óptica (OD) excedendo a OD do controle negativo em 0,1 OD, o que corresponde a mais de 2 desvios padrão acima do sinal da amostra de controle negativa. Todas as amostras com uma densidade óptica acima dessa fração foram consideradas como positivas quanto ao ELISA. A fração foi igual a cerca de 0,25 ng/mL de LAM na urina fresca não tratada.

O MTB-ELISA foi avaliado quanto a reatividade cruzada com outras espécies e gêneros das várias bactérias Gram-positivas e Gramnegativas típicas para infecções do trato urinário e pneumonia bacteriana. Nenhuma dessas espécies testadas mostrou qualquer reatividade no sistema LAM-ELISA avaliado, mesmo em concentrações maiores testadas (figura 4b). Uma análise das células integrais das várias espécies de micobactérias no sistema LAM-ELISA mostra reatividade cruzada com todas as espécies testadas de micobactérias (M.) (figura 4c), contudo, M. tuberculosis H37Rv e M. bovis foram detectadas mais sensivelmente. Ambas as espécies estão muito próximas do ponto de vista imunoquímico, porém M. bovis raramente é a causadora de infecção micobacteriana em seres humanos.

Dados dos Participantes do Estudo

De acordo com a tabela 1, os 242 pacientes com suspeita de TB foram divididos em três categorias principais: (1) pacientes com Tb pulmonar foram confirmados por microscopia e/ou diangóstico de cultura, (2) pacientes ΐ£γ com sinais clínicos e radiográficos típicos e (3) pacientes com sintomas clínicos de TB, que não foram considerados como pacientes com TB, uma vez que todas as ferramentas de diagnóstico disponíveis (radiografia, microscopia e cultura do esputo) foram negativas.

O grupo um incluiu 137 pacientes com TB pulmonar confirmada laboratorialmente. 132 foram confirmados por cultura Loewenstein Jenssen e cinco tiveram cultura negativa porém coloração AFB positiva. Dos 132 casos de cultura positiva, 62,12% foram positivos quanto a AFB.

O grupo dois compreendia um adicional de 17 pacientes que foram envolvidos no programa de terapia DOTS com base nas verificações radiográficas e clínicas (Tabela 1). Dos 88 pacientes do grupo, 3 tiveram esputo negativo e não apresentaram sinais radiológicos específicos de B pulmonar e, portanto, não foram envolvidos no programa DOTS.

A idade média dos participantes era de 34 anos. A razão de homens e mulheres foi de 41:59. A prevalência de HIV total entre os 223 pacientes concordaram com o teste de HIV foi de 69,1% (vide Tabela 2). A prevalência de HIV foi de 73,2% entre os pacientes com e 60,8% entre os pacientes sem TB confirmada.

Avaliação Clínica do ELISA

Dos 137 pacientes com TB pulmonar confirmada (cultura ou AFB positivo) 111 se apresentaram como positivos ao LAM-ELISA (sensibilidade de 81,02%) para a fração predefinida (densidade óptica (OD) do controle negativo + 0,1). O incremento médio de OD (= OD média absoluta - OD do controle negativo) para esfregaço e grupo de cultura positiva (82) foi de 0,604. Para casos de esfregaço negativo e cultura positiva (50) para incremento médio de OD foi de 0,293 e para casos de esfregaço positivo, porém cultura negativa (5) de 0,249.

Dos 17 pacientes no grupo dois que apresentaram cultura negativa e AFB negativo, porém possuíam sinais radiológicos e clínicos para TB, 13 (76,47%) apresentaram resultados de teste LAM-ELISA positivo com um incremento médio de OD de 0,183. 13 deles (76,47%) apresentaram HIV positivo.

1Η

Os 88 pacientes restantes que chegaram à clínica de TB especial com sinais clínicos sugestivos de TB pulmonar, apresentaram cultura e AFB negativos e não apresentaram sinais radiográficos específicos para TB. Treze desses pacientes (14,77%) apresentaram teste LAM-ELISA positivo (incremento médio de OD de 0,184).

Com base na concentração conhecida nos controles positivos baixo, médio e alto, que foram incluídos em cada placa, foi possível determinar a concentração aproximada de LAM de cada amostra de urina, com base no valor OD do ELISA. Foi avaliado nos pacientes que apresentam AGB positivo se a concentração de LAM se correlaciona à carga individual das bactérias de tuberculose. Embora os pacientes com uma densidade baixa de bactérias de tuberculose na microscopia (AFB+) tivessem uma concentração de antígeno LAM média de 0,93 ng/mL na urina, os pacientes com uma densidade intermediária de bacilos álcool-ácido resistentes (AFB ++) tinham uma concentração de antígeno de 1,74 ng/mL em sua urina e pacientes AFB +++ 2,02 ng/mL (figura 5). O último valor é menor que a concentração real de LAM na urina dos pacientes AFB+++, porque o leitor de ELISA usado no laboratório da Tanzânia não lia sinais acima de 2 correspondendo a cerca de 4 ng/mL.

O estado sorológico do HIV não influencia na sensibilidade de LAM-ELISA nos pacientes com TB pulmonar confirmada. Dos 124 pacientes com estado sorológico de HIV conhecido e cultura de TB positiva e/ou coloração AFB, 73 dos 89 pacientes infectados com HIV (82,0%) foram positivos no LAM-ELISA quando comparados aos 26 dos 35 indivíduos não infectados (74,3%). De modo semelhante, a sensibilidade do AFB não compreendida o estado sorológico do HIV. A sensibilidade foi de 61,2% e 58,8% nos indivíduos infectados e não infectados com HIV, respectivamente.

A especificidade do ensaio foi avaliada usando a urina de voluntários saudáveis da Tanzânia e dos Estados Unidos da América. A urina de 23 elementos do corpo médico saudáveis de origem tanzaniana foi analisada. Nenhuma das amostras testadas se mostrou positiva no LAM-ELISA (OD relativa média de -0,047, especificidade de 100%). As amostras de urna de 220 voluntários saudáveis dos Estados Unidos foram coletadas e analisa38 iie>

das. Cerca de 4 tinham uma densidade óptica baixo da fração de 0,1 (especificidade de 98,18%).

DISCUSSÃO

As ferramentas clássicas para diagnóstico de TB, cultura de esputo e microscopia de esfregaço, apresentavam limitações óbvias. Ambos os métodos apenas detectam casos de TB pulmonar aberta. Isso prejudica significativamente a possibilidade de detecção de todos os casos de TB ativa, independente do órgão de manifestação. Portanto, vários métodos que surgiram no passado foram avaliados, os quais pudessem suplementar as ferramentas clássicas, especialmente ajustes em pesquisas fracas. Os critérios que foram estabelecidos para tal novo ensaio são: a) uma sensibilidade maior que a microscópica, b)especificidade comparável, c) uma carga de trabalho adicional limitada, d) a possibilidade de diagnóstico de esputo negativo de TB e e) uma sensibilidade que não seja prejudicada por co-infecção por HIV.

Nessa primeira avaliação, a sensibilidade do LAM-ELISA (81% de culturas positivas) foi superior à coloração AFB (69%). A sensibilidade pode ser adicionalmente aperfeiçoada por concentração da urina fresca, o que poderia, contudo, resultar em um esforço adicional para um técnico laboratorial. A razão de detecção do LAM-ELISA para casos de TB militar confirmada radiologicamente (87,5%), bem como para casos de esputo negativo com sinais radiológicos típicos de TB pulmonar (67%) foi encorajadora, embora o número de casos não fosse alto o suficiente para permitir uma conclusão final. Para indivíduos saudáveis, a especificidade do ELISA foi alta (98,18% nos Estados Unidos da América e 100% na Tanzânia). A coinfecção com HIV nos casos de cultura de TB positivo não influenciou a sensibilidade do LAM-ELISA.

Em comparação aos resultados publicados anteriormente do LAM-ELISA, o novo teste detecta LAM em concentrações inferiores (0,2 ng/mL) em relação aos testes realizados anteriormente. A sensibilidade do novo teste foi de 82,9% (de AFB +) para urina não concentrada e fresca em comparação à sensibilidade de 81,3% para teste anterior usando urina processada e congelada. A especificidade do teste foi de 98,36% nesse estudo, ίλύ em comparação aos 86,9% no estudo anterior.

A limitação desse estudo de TB em seção transversal foi o fato de que uma determinada proporção de pacientes com suspeita de TB permaneceu ambígua em termos de seu estado de TB (grupos 2 e 3). Para reconhecimento desse problema foram criadas três categorias principais de análise: Grupo 1: TB confirmada em laboratório, Grupo 2: TB diagnosticada clínica e radiologicamente, Grupo 3: nenhuma prova laboratorial ou radiológica de TB. Embora se esteja confiante de que os participantes da categoria sejam casos verdadeiros de TB, não se pode excluir aqueles da categoria e 3 contendo alguns pacientes que se enquadram fortemente na categoria. Portanto, foram excluídos aqueles pacientes citados por último do cálculo de sensibilidade e especificidade. O diagnóstico de TB freqüentemente requer acompanhamento longo dos pacientes. Especialmente os pacientes com esputo negativo e aspectos radiológicos incomuns precisariam de várias consultas de acompanhamento, a fim de reformular seu estado de TB. Em um estudo clínico longo, bem como reavaliação de diagnóstico e conseqüências do tratamento da TB forneceríam informações adicionais importantes para classificação dos grupos 2 e 3 em pacientes com TB e sem TB.

É de interesse maior a questão se existe uma correlação quantitativa entre a carga bacteriana de M. tuberculosis e a quantidade de LAM detectada na urina. O único modo de solucionar essa questão em um formato de estudo em seção transversal foi correlacionar a classificação de coloração do esputo em AFB com a concentração de LAM na urina. Conforme mostrado na figura 5, houve uma correlação óbvia positiva da concentração de antígeno na urina e densidade de bactérias da tuberculose no esputo. Tal correlação fornece várias aplicações adicionais para o ensaio de LAM. O monitoramento do tratamento com sucesso e o reconhecimento precoce de reincidência após término do tratamento são de relevância prática imediata. A combinação com a capacidade de detectar TB extrapulmonar e AFB negativo toma o ensaio LAM uma ferramenta potente no ambiente com uma prevalência crescente de formas extrapulmonares de TB e formas pulmonares com sintomas clínicos atípicos. O LAM-ELISA poderia não apenas ser usado

Ul para o diagnóstico de pacientes com sintomas clínicos, porém também para classificação dos pacientes HIV positivos e outros grupos de alto risco. A detecção precoce da TB ativa e tratamento eficaz são os dois pilares em uma luta de sucesso contra a TB. Para explorar adicionalmente o papel do ensaio de LAM nessa luta, estão sendo planejados atualmente vários estudos prospectivos e em vários centros.

Em suma, o LAM-ELISA pode ser facilmente integrado aos procedimentos de diagnóstico de rotina dos laboratórios, em ambos, os países desenvolvidos e em desenvolvimento. Ele é simples de usar e um ensaio robusto. O término do ELISA requer apenas duas horas e meia e muitas amostras podem ser analisadas ao mesmo tempo. Uma vez que o antígeno Lipoarabinomanano é estável, é possível manter a urina refrigerada por 3 dias sem queda significativa na densidade óptica. O novo MTB-ELISA desenvolvido para detecção de LAM na urina não processada possui o poten15 ciai de um teste de classificação para ser usado também em condições de campo difíceis nos países em desenvolvimento.

Grupo de estudo	Diagnóstico de TB	Participantes	LAM+	LAM-
1:	LJ + e/ou AFB	137	111 (81,02%)	26
TB confirmada em laboratório
	LJ + e/ou AFB +	82	68 (82,9%)	14(17,1%)
	Apenas LJ+	50	38 (76%)	12 (24%)
	Apenas AFB +	5	5 (100%)	0(0%)
2:	TB militar	8	7	1
TB diagnosticada cínica e radiologicamente			(87,5%)	(12,5%)
	Efusão pleural ou linfo hilar aumentado	9	6	3
			(67%)	(33%)

ί.λ.^

Grupo de estudo	Diagnóstico de TB	Participantes	LAM+	LAM-
3:
Nenhuma TB comprovada laboratorial ou radiologicamente	Apenas sinais clínicos de TB	88	13	75
	Nenhum envolvimento no DOTS		(14,77%)	(85,23%)
4:	Nenhum sinal clínico de TB	243	4	239
Grupo de controle negativo			(1,64%)	(98,36%)

Tabela 1: Análise da excreção urinária de LAM nos 242 pacientes vindos de OPD com suspeita clínica de TB e de 243 controles clinicamente saudáveis. O valor da fração para LAM-ELISA positiva é de 0,1 acima da densidade óptica média do controle negativo na placa. + = positivo.

	HIV +
Todos suspeitos de TB	69,1%
Cultura	71%
AFB + (77)	72,7%
EXPTB (17)	76,4%

Tabela 2. Proporção de pacientes HIV positivos nos diferentes grupos. Duzentos e vinte e três dos duzentos e quarenta e dois pacientes consentiram com o teste de HIV.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para detectar uma infecção micobacteriana em uma amostra de um indivíduo de interesse por meio da detecção de antígeno micobacteriano, caracterizado pelo fato de que compreende:

   5 provisão de um ambiente imunorreativo compreendendo a amostra e o imunoensaio, o referido imunoensaio utilizando um anticorpo policlonal específico para o antígeno micobacteriano, em que o antígeno é um polissacarídeo de superfície de uma micobactéria, em que o polissacarídeo de superfície é lipoarabinomano (LAM) e o anticorpo policlonal é enriquecido

   10 por exclusão de anticorpos que reconhecem antígenos modificados por oxidação com NaIO₄, e;

   reação da amostra com o imunoensaio no ambiente imunorreativo, para detectar antígeno micobacteriano na amostra, de modo a detectar a infecção micobacteriana, em que um resultado de imunoensaio que é eleva15 do em comparação com um controle negativo é considerado positivo para infeção micobacteriana.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 14, onde a infecção micobacteriana é Mycobacterium tuberculosis.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 20 fato de que o imunoensaio compreende um ensaio de ensaio imunossorvente ligado a enzimas.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a infecção micobacteriana é doença de Johne.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 25 fato de que a infecção micobacteriana é uma infecção pulmonar por Mycobacterium tuberculosis.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a infecção micobacteriana é uma infecção extrapulmonar por Mycobacterium tuberculosis.

   30
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é qualquer uma de saliva, sangue, urina, tecido ou outra amostra apropriada.

   Petição 870170072491, de 27/09/2017, pág. 11/16
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é urina não-concentrada, não-processada.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, a mycobacterium é selecionada a partir do grupo consistindo em M. bovis, M. chelonei, M. gor5 donae, M. marinum, M. paratuberculosis, M. fortuitum, M. xenopi, M. kansasii, M. phlei, e M. tuberculosis.
10. 10. Kit para detectar uma infecção micobacteriana em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

    um imunoensaio provendo um ambiente imunorreativo em que o 10 ambiente compreende um anticorpo policlonal enriquecido, em que o anticorpo policlonal é enriquecido por exclusão de anticorpos que reconhecem antígenos modificados por oxidação com NaIO₄,.
11. 11. Kit de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o imunorreativo compreende um ensaio imunossorvente ligado a en15 zimas.
12. 12. Kit de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a infecção micobacteriana é Mycobacterium tuberculosis.
13. 13. Kit de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é realizado como um teste de tira.

    Petição 870170072491, de 27/09/2017, pág. 12/16

    1/11

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