BRPI0519775B1

BRPI0519775B1 - Proteína isolada de ligação a antígeno, polinucleotídeo isolado, plasmídio e célula isolada e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0519775B1
Application number: BRPI0519775-9A
Authority: BR
Inventors: Frank J. Calzone; Rajendra V. Deshpande; Mei-Mei Tsai
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2022-02-22
Also published as: EA200701292A1; JP2008525034A; US20120237516A1; CA2591304A1; MY146381A; EP2322550A1; KR20150038524A; WO2006069202A3; EP1828248A2; CN102977212B; KR20070100317A; KR101794052B1; AR053318A1; US20150274829A1; CA2928494A1; KR20170125117A; IL184167A; JP4372825B2; EA015146B1; CA2591304C

Abstract

PROTEÍNA ISOLADA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, PLASMÍDIO E CÉLULA ISOLADA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece as composições e métodos relacionados ou derivados de anticorpos anti-IGF-1R. Em incorporações particulares, a invenção fornece anticorpos anti-IGF-1R inteiramente humanos, humanizados ou quiméricos que liga IGF-1R humano, fragmentos de ligação a IGF-1R e derivados de tais anticorpos, e polipeptídios de ligação a IGF-IR compreendendo tais fragmentos. Outras incorporações fornecem ácidos nucléicos codificando tais anticorpos, fragmentos de anticorpos .e derivativos e polipeptídios, células que compreendem tais polinucleotídeos, métodos de produção de tais anticorpos, fragmentos de anticorpos e derivativos e polipeptídios, e métodos de utilização de tais anticorpos, fragmentos de anticorpos e derivativos e polipeptídios, incluindo os métodos de tratamento ou de diagnosticar os pacientes que têm desordens ou condições relacionadas a IGF-IR.

Description

Referência a Aplicação Relacionada

Este pedido reivindica o benefício do pedido provisional americano número de série 60/638.961, depositado em 22 de dezembro de 2004, e é incorporado por esta referência.

Campo de Invenção

Este pedido fornece as composições e os métodos que relacionam- ’0 se aos anticorpos do receptor anti-IGF-1.

Descrição da Técnica Anterior

Os fatores de crescimento de insulina 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2, respectivamente) promovem a diferenciação e a proliferação de uma ampla variedade de tipos de células de mamíferos. IGF-1 e IGF-2 ambos circulam 15 extensamente por todo o corpo no plasma. Exercem seus efeitos nas células ligando e ativando o receptor IGF-1 (IGF-IR). IGF-IR é um membro da família dos receptores do fator de crescimento das tirosinas quinase. Sua seqüência de aminoácido é aproximadamente 70% idêntica àquela do receptor de insulina. As atividades anormais de IGF-1, de IGF-2, e/ou de IGF-IR são associadas a um ‘ número de condições médicas, incluindo vários tipos de câncer, defeitos do crescimento (por exemplo, acromegalia, gigantismo e estatura pequena), psoríase, ateroscleroses, reestenose pós-angioplastia do músculo liso dos vasos sanguíneos, diabetes, proliferação microvascular, neuropatia, perda da massa do muscular e osteoporose.

Descrição das Figuras

A Figura 1 fornece as seqüências de nucleotídeo que codificam domínios variáveis de cadeias leves L1 até L52 e cadeias pesadas de domínios variáveis H1 até H52. A Figura 2 fornece seqüências de aminoácido de domínios variáveis de 30 cadeia leve L1 até L52. As regiões CDR e FR são indicadas.

A Figura 3 fornece seqüências de aminoácido de domínios variáveis de cadeia pesada H1 até H52. As regiões CDR e FR são indicadas. A Figura 4 fornece seqüências de aminoácido de cadeia leve de regiões CDR1 de domínios variáveis de cadeia leve L1 até L52. As seqüências consenso 5 para grupos de seqüências CDR relacionadas também são fornecidas.

A Figura 5 fornece seqüências de aminoácido de cadeia leve de regiões CDR2 de domínios variáveis de cadeia leve L1 até L52. As seqüências consenso para grupos de seqüências CDR relacionadas também são fornecidas. A Figura 6 fornece seqüências de aminoácido de cadeia leve de regiões '0 CDR3 de domínios variáveis de cadeia leve L1 até L52. As seqüências consenso para grupos de seqüências CDR relacionadas também são fornecidas.

A Figura 7 fornece seqüências de aminoácido de cadeia pesadas de regiões CDR1 de domínio variável de cadeia pesada H1 até H52. As seqüências consenso para grupos de seqüências CDR relacionadas também são fornecidas. 15 Figura 8 fornece seqüências de aminoácido de cadeia pesadas de regiões CDR2 de domínio variável de cadeia pesada H1 até H52. As seqüências consensn para grupos de seqüências CDR relacionadas também são fornecidas.

Figura 9 fornece seqüências de aminoácido de cadeia pesadas de regiões CDR3 de domínio variável de cadeia pesada H1 até H52. As seqüências consenso para grupos de seqüências CDR relacionadas também são fornecidas.

Figura 10 fornece a seqüência de aminoácido de um domínio extracelular humano IGF-IR unido à uma região IgGI Fc humana (sublinhada) com uma intervenção do sítio de clivagem caspase-3 (em negrito).

Figura 11 fornece a seqüência de aminoácido de um domínio extracelular 25 do receptor de insulina humana ligado à uma região lgG1 Fc humana (sublinhada).

Figura 12 fornece a seqüência de proteína de um domínio extracelular de IGF-1R humano (incluindo peptídeo sinal) ligado ao C-terminal com a proteína avidina da galinha. O met de iniciação no IGF-1R ECD é designado na posição 1 30 desta figura.

Figura 13 fornece a seqüência polipeptídica de uma região constante do [ | anticorpo humano de cadeia leve kappa e de uma região constante de cadeia pesada do anticorpo IgG 1 humano.

Figura 14 fornece um gráfico que ilustra quatro anticorpos contendo fagos que ligam-se significativamente melhor a uma molécula IGF-IR-Fc do que a um receptor de insulina Fc ou a um murino Fc .

Figura 15 fornece os gráficos que ilustram a habilidade de determinados anticorpos de competir para ligar-se a IGF-IR com IGF-1 e IGF-2. Figura 16 fornece os gráficos que ilustram a habilidade de determinados ’0 anticorpos de inibir o crescimento de células 32D hu IGF-IR+IRS-1.

Figura 17 fornece os gráficos que ilustram a habilidade de determinados anticorpos de inibir o crescimento de células hu IGF-IR de Balb/C 3T3.

Resumo da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção fornece um antígeno isolado ligado a proteina compreendendo: a. uma cadeia leve CDR3 que compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: i. uma seqüência de cadeia leve CDR3 que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos e/ou deletados de uma seqüência CDR3 selecionada do grupo que consiste de seqüências de cadeia leve CDR3 de L1-L52 como mostrado 1 na figura 6; ii. M X1X2X3X4X5P X6X7; iii. Q Q X8 X9X10 Xn P X12 T; e iv. Q S Y X13 X14Xi5 N Xi6X17X18; b. uma cadeia pesada CDR3 que compreende uma seqüênc.a selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências CDR3 de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na Figura 9; ii. Xig X2oX2i X22 X23 X24 X28 X28X27F D I; iii. X28 X2g X3o X3i X32 X33 X34 X38 X36 X37 X38 M D V; iv. D S S X39; ou c. uma seqüência de CDR3 de cadeia leve (a) e a seqüência de CDR3 de cadeia pesada (b); onde XT é um resíduo de glutami:.<a ou um resíduo de glutamato, X2 é um resíduo de alanina, um resíduo de glicina, um resíduo de treonina ou um resíduo de serina, X3 é um resíduo de leucina, um resíduo de fenilalanina ou um resíduo de treonina, X4 é resíduo de glutamina, um resíduo do glutamato ou um resíduo de histidina, X5 é um resíduo de treonina, um resíduo de metionina, um resíduo de triptofano ou um resíduo de valina, X6 é um resíduo de glicina, um resíduo da alanina, um resíduo de valina, um resíduo de 5 leucina, um resíduo de isoleucina, um resíduo de prolina, um resíduo de fenilalanina, um resíduo de metionina, um resíduo de triptofano ou um resíduo de cisteína, X7 é um resíduo de treonina, um resíduo de alanina ou um resíduo de serina, Xs é um resíduo de arginina, um resíduo de serina, um resíduo de leucina ou um resíduo de alanina, X9 é um resíduo de asparagina, um resíduo de serina ’0 ou um resíduo de histidina, X10 é um resíduo da asparagina ou um resíduo de serina, Xn é um resíduo de triptofano, um resíduo de valina, um resíduo de tirosina, um resíduo de prolina ou um resíduo de fenilalanina, X12 é um resíduo de leucina, um resíduo de tirosina ou um resíduo de isoleucina, X13 é um resíduo de aspartato ou um resíduo de glutamina, X14 é um resíduo de serina ou um resíduo 15 de prolina, X15 é um resíduo de serina, um resíduo de tirosina, um resíduo de aspartato ou um resíduo de alanina, Xi6 é um resíduo de glutamina, um resíduo de arginina, um resíduo de valina ou um resíduo de triptofano, X17 é um resíduo de arginina, um resíduo de valina, um resíduo de isoleucina ou nenhum resíduo, Xis é um resíduo de valina ou nenhum resíduo, X19 é um resíduo de glutamato ou nenhum resíduo, X2o é um resíduo de tirosina, um resíduo de glicina, um resíduo de serina ou nenhum resíduo, X2i é um resíduo de serina, um resíduo de asparagina, um resíduo de triptofano, um resíduo de glutamato, um resíduo de aspartato ou nenhum resíduo, X22 é um resíduo de serina, um resíduo de aspartato, um resíduo de triptofano, um resíduo de alanina, um resíduo de 25 arginina, um resíduo de treonina, um resíduo de glutamina, um resíduo de leucina, um resíduo de glutamato ou nenhum resíduo, X23 é um resíduo de serina, um resíduo de glicina, um resíduo da asparagina, um resíduo de treonina, um resíduo do triptofano, um resíduo de valina, um resíduo de alanina ou um resíduo de isoleucina, X24 é um resíduo de arginina, um resíduo de glutamina, um resíduo de 30 tirosina, um resíduo de valina, um resíduo de alanina, um resíduo de glicina, um resíduo de serina, um resíduo de fenilalanina ou um resíduo de triptofano, X25 é um resíduo de asparagina, um resíduo-de leucina, um resíduo de aspartato, u:,. resíduo de treonina, um resíduo do triptofano, um resíduo de tirosina, um resíduo de valina, um resíduo de alanina ou um resíduo de histidina, X26 é um resíduo de 5 aspartato, um resíduo de serina, um resíduo de asparagina ou um resíduo de glutamina, X27 é um resíduo de alanina ou um resíduo de prolina, X28 é um resíduo de alanina ou nenhum resíduo, X29 é um resíduo de glutamato, um resíduo de tirosina, um resíduo de glicina ou nenhum resíduo, X30 é um resíduo de arginina, um resíduo de serina ou nenhum resíduo, X31 é um resíduo de glicina, um residi■ j w de aspartato, um resíduo de valina, um resíduo de serina ou nenhum resíduo, X32 é um resíduo de serina, um resíduo de aspartato, um resíduo de glicina ou nenhum resíduo, X33 é um resíduo de fenilalanina, um resíduo de aspartato, um resíduo de tirosina, um resíduo de glicina, um resíduo de serina, um resíduo de histidina, um resíduo de triptofano ou nenhum resíduo, X34 é um resíduo de 15 triptofano, um resíduo de aspartato, um resíduo de tirosina, um resíduo de serina, ou nenhum resíduo, X38 é um resíduo de aspartato, um resíduo de glutamato, ur? resíduo de arginina, um resíduo de serina, um resíduo de glicina, um resíduo de tirosina ou um resíduo de triptofano, X36 é um resíduo de tirosina, um resíduo de lisina, um resíduo de isoleucina, um resíduo de leucina ou um resíduo de i fenilalanina, X37 é um resíduo de tirosina, um resíduo de serina, um resíduo de fenilalanina, um resíduo de aspartato oü um resíduo de glicina, X38 é um resíduo de glicina, um resíduo de asparagina ou um resíduo de tirosina, X39 é um resíduo de valina, um resíduo de glicina ou um resíduo de serina, e o dito antígeno d 3 ligação proteína liga-se especificamente a IGF-IR humano.

Em uma incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de seis aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou detetados de uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na Figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dor?. aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de L1- L52 como mostrado na Figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado 5 na figura 6; d. uma seqüência de CDR1 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de H1-H52 como mostrado na Figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma •o seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolado 15 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de um ’ aminoácido adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência CDR2 de L1- L52 como mostrado na figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado na figura 6; d. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada que difere-se por não mais 25 do que um total de um aminoácido adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência de CDR1 de H1-H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência de CDR3 de cadeia 30 pesada que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDRI de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve de L1-L52 como mostrado em figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de um '0 aminoácido adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência CDR3 de L1- L52 como mostrado na figura 6; d. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada de H1- H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado 15 na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de: 3 a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDRI de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR3 de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 6; c. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de dois 25 aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e d. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de um aminoácidos adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9. compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de um aminoácidos adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e c. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de: a. uma seqüência de CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de um aminoácido adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4, e b. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 8.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. RSSQSLLHSNGYNYLD; ii. RASQ(G/S)(I/V)(G/S)X(Y/F)L(A/N); e iii. RSSQS(L/I)XXXXX; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. LGSNRAS; ii. AASTLQS; e iii. EDNXRPS; c. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. SSNWWS; ii. XYYWS; e iii. SYAM(S/H); e d. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. (E/I)(IA/)(Y/N)(H/Y)SGST(N/Y)YNPSLKS; e ii. XIS(G/S)SG(G/S)STYYADSVKG; onde os símbolos do resíduo de aminoácido incluídos nos parênteses identificam resíduos alternativos para a mesma posição em uma seqüência, cada X é independentemente nenhum resíduo de aminoácido, e cada Z é independentemente um resíduo de glicina, um resíduo de alanina, um resíduo de valina, um resíduo de leucina, um resíduo de isoleucina, um resíduo de prolina, um resíduo de fenilalanina, um resíduo de metionina, um resíduo do triptofano ou um resíduo de cisteina.

Em uma outra incorporação, a proteína obrigatória isolada do antigeno compreende uma seqüência pesada da corrente CDR3 que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isoladn compreende uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de um aminoácidos adicionado, substituído, e/ou deletado de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende uma seqüência CDR3 de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 9. •

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende duas seqüências de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de seis aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de L1-L52 como mostrado na figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado na figura 6; d. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDRI de H1-H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais que um total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolado compreende três seqüências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste 5 de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais que um total de seis aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de L1-L52 •o como mostrado na figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado na figura 6; d. un.d seqüência CDR1 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de 15 CDRI de H1-H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionadco, ) substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende quatro seqüências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo de: a. uma seqüência CDRI de cadeia leve que difere-se por não mais do que um 25 total de seis aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de L1-L52 como mostrado na figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que 30 difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado na figura 6; d. uma seqüência CDRI de cadeia pesada que difere-se por não mais que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de H1-H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência 5 CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 o como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende cinco seqüências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de seis aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma 15 seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de L1-L52 como mostrado na figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, I substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado nam figura 6; d. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDRI de H1-H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um 25 total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9. compreende: a. uma seqüência CDR1 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de seis aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de L1-L52 como mostrado na figura 4; b. uma seqüência CDR2 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de dois 5 aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de L1-L52 como mostrado na figura 5; c. uma seqüência CDR3 de cadeia leve que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionado0 substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de L1-L52 como mostrado na figura 6; d. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada que difere-se por não mais o do que um total de dois aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência de CDR1 de H1-H52 como mostrado na figura 7; e. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada que difere-se por não mais do que um total de cinco aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR2 de H1-H52 como mostrado na figura 8; e f. uma seqüência CDR3 de cadeh 15 pesada que difere-se por não mais do que um total de quatro aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de uma seqüência CDR3 de H1- H52 como mostrado na figura 9.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende qualquer um: a. domínio variável de cadeia leve compreendendo: i. ) uma seqüência CDR1 de cadeia leve mostrada na figura 4; ii. uma seqüência CDR2 cadeia leve mostrada na figura 5;-e iii. uma seqüência CDR3 de cadeia leva mostrada na figura 6; b. domínio variável de cadeia pesada compreendendo de: i. uma seqüência CDR1 de cadeia pesada mostrada na figura 7; ii. uma seqüência CDR2 de cadeia pesada mostrada na figura 8; e iii. uma seqüência CDR3 de 25 cadeia pesada mostrada na figura 9; ou c. o domínio variável de cadeia leve (a) e o domínio variável de cadeia pesada (b).

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: a. seqüências de cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 onde cada uma é idêntica às seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da mesma 30 seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de L1-L52; b. seqüências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 onde cada uma é idêntica às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3, respectivamente, da mesma seqüência do domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de H1-H52; ou c. seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve (a) e 5 as seqüências CDR1 CDR2, e CDR3 de.cadeia pesada (b).

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno isolada que compreende: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma seqüência de domínio variável de '0 cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreendem pelo menos 15 resíduos contínuos de aminoácidos de uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que seja pelo menos 80% idêntica a uma seqüência 15 de polinucleotídeo que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 1; e iv. uma seqüência de aminoácidos que seja codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que hibridiza-se sob estritas circunstâncias moderada ao complemento de um polinucleotídeo que consiste em uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na ) figura 1; b. uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 80% idêntica a uma seqüência domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreendem pelo menos 15 resíduos de aminoácido contíguos de uma seqüência de domínio 25 variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que seja pelo menos 80% idênticos a uma seqüência do polinucleotídeo que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 1; e iv. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de 30 polinucleotídeo que hibridiza-se sob estritas condições ao complemento de um polinucleotideo que consiste de uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 1; ou c. domínio variável de cadeia leve (a) e domínio variável de cadeia pesada de (b); onde a dita proteína d^ ligação ao antígeno liga-se ao IGF-IR humano.

Em uma incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos 25 0 resíduos contíguos de aminoácido de uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotideo que seja pelo menos 85% idêntica a uma seqüência de polinucleotideo que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 15 1; e iv. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotideo que hibridiza-se sob condições altamente estritas ao complemento de um polinucleotideo que consiste em uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 1; b. uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência } de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 25 resíduos sólidos de aminoácido de uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de 25 polinucleotideo que seja pelo menos 85% idêntica a uma seqüência de polinucleotideo que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura .1; e iv. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotideo que hibridiza-se sob condições altamente estritas ao complemento de um polinucleotideo que consiste em uma 30 seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 1; ou c. domínio variável de cadeia leve (a) e domínio variável de cadeia pesada de (b). •

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende entre outras: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1- L52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 35 resíduos sólidos do aminoácido de uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que seja pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 1; e b. uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 35 resíduos contíguos do aminoácido de uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que seja pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de polinucleotideo que codifica uma seqüência de domínio variável de Cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 1; ou c. o domínio variável de cadeia leve de (a) e o domínio variável de cadeia pesada de (b).

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 50 resíduos contíguos do aminoácido de uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que seja pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma -. seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 1; e b. uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo 5 que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreendem pelo menos 50 resíduos contíguos de aminoácidos de uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; e iii. uma seqüência de o aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que seja pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma sequência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 1; ou c. o domínio variável de cadeia leve de (a) e o domínio variável ú- cadeia pesada (b). •

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 97% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência dos aminoácidos que compreendem pelo menos 75 » resíduos contíguos de aminoácidos de uma seqüência de domínio variável ci~ cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que seja pelo menos 97% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 25 1; e b. uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência dos aminoácidos pelo menos 97% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostradj na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 75 resíduos sólidos do aminoácido de uma seqüência de domínio variável de cadeia 30 pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2, e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que seja pelo menos 97% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma . seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 1; ou c. o domínio variável de cadeia leve de (a) e o domínio variável oe 5 cadeia pesada de (b).

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 99% idêntica a uma seqüência domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na ‘0 figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 90 resíduos contíguos do aminoácido de uma seqüência de domínio variável ue cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 2; e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeo que seja pelo menos 99% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma 15 seqüência de domínio variável de cadeia leve de L1-L52 como mostrado na figura 1; e b. uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de aminoácidos pelo menos 99% idêntica a uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2; ii. uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 90 resíduos sólidos de aminoácidos de uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na figura 2, e iii. uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que seja pelo menos 99% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado na 25 figura 1; ou c. domínio variável de cadeia leve de (a) e domínio variável de cadeia pesada de (b).

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende: a. uma seqüência de domínio variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste de L1-L52 como mostrado na figura 2; b. uma seqüência de domínio 30 variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste de H1-H52 como mostrado na figura 3; ou c. o domínio variável de cadeia leve de (a) e o domínio variável de cadeia pesado de (b).

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável de cadeia leve e de um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo que consiste de: LIHI, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LIOHIO, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20, H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 e L52H52.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende também: a. a seqüência constante de cadeia leve kappa da figura 13, b. a seqüência constante de cadeia pesada de IgGI da figura 13, ou c. a seqüência constante da cadeia leve kappa da figura 13 e a seqüência constante da cadeia pesada de IgGI da figura 13.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada, quando ligada a IGF-1R: a. inibe IGF-1R; b. ativa IGF-1R; c. compete cruzadamente com um anticorpo de referência para ligar-se a IGF-1R; d. liga-se ao mesmo epitope de IGF-1R que o do dito anticorpo dá referência; e. liga-se a IGF-1R com substancialmente o mesmo Kd do dito anticorpo da referência; ou f. liga-se a IGF- 1R com substancialmente a mesma taxa do dito anticorpo de referência; onde o dito anticorpo de referência compreende uma combinação de seqüência de domínios variváveis de cadeia leve e de domínios variáveis de cadeia pesada selecionadas do grupo que consiste das combinações: LIHI, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LIOHIO, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20, H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51 e L52H52.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolado, quando ligada a um IGF-1 R humano, inibe a ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 ao dito IGF-IR humano.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada inibe o crescimento de uma célula cancerígena em aproximadamente 80% na presença de um estimulante de crescimento selecionado do grupo consistindo de soro, IGF- 1, e IGF-2.

Em uma outra incorporação, a dita célula cancerígena é uma célula '0 cancerígena do seio humano MCF-7. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada liga a IGF-1 R humano com uma seletividade que seja pelo menos cinqüenta vezes maior do que sua seletividade para o receptor humano de insulina.

Em uma outra incorporação, proteína de ligação ao antígeno isolada inibe o 15 crescimento in vivo do tumor. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada inibe IGF-1 R mediado por fosforilação da tirosina.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada ligase especificamente ao IGF-1 R de um primata não-humano, de um macaco j cinomolgo, de um chimpanzé, de um mamífero não-primata, de um roedor, de um rato, de um camundongo, de um hamster, de uma cobaia, de um gato, ou de um cão.

Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno isolada compreende: a. um anticorpo humano; b. um anticorpo humanizado; c. um 25 anticorpo quimérico; d. um anticorpo monoclonal; e. um anticorpo policlonal; f. um anticorpo recombinante; g. um fragmento de antígeno ligado ao anticorpo; h. um anticorpo de cadeia unica; i. um dicorpo; j. um tricorpo; k. um tetracorpo; I. um fragmento de Fab; m. um fragmento F (ab'k; n. um anticorpo de domínio; o. um anticorpo de IgD; p. um anticorpo de IgE; q. um anticorpo de IgM; r. um anticorpo 30 de lgG1; s. um anticorpo lgG2; t. um anticorpo lgG3; u. um anticorpo lgG4; ou V. um anticorpo lgG4 contendo pelo menos uma mutação em uma região da dobra que ameniza a tendência de formação de cadeia intra- H bissulfeto.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado que compreende uma seqüência que codifica a cadeia leve, a cadeh 5 pesada, ou ambas da dita proteina de ligação ao antígeno.

Em uma incorporação, o dito polinucleotídeo compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve do ácido nucléico da figura 1 e/ou uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada do ácido nucléico do domínio da figura 1.

Em uma outra incorporação, um plasmídio compreende o dito polinucleotídeo isolado. Em uma outra incorporação, o dito plasmídio é um vetor de expressão. Em uma outra incorporação, uma célula isolada compreende o dito polinucleotídeo.

Em uma outra incorporação, um cromossomo da dita célula compreende o dito polinucleotídeo. . Em uma outra incorporação, a dita célula é um hibridoma. Em uma outra incorporação, um vetor de expressão compreende o dito polinucleotídeo.

Em uma outra incorporação, a dita célula é uma célula de CHO. Em uma outra incorporação, a presente invenção fornece um método de produção de uma proteína de ligação ao antígeno que liga-se ao IGF-1R humano, compreendendo a incubação da dita célula isolada sob condições que permitem a expressão da dita proteina de ligação ao antígeno.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende a proteína de ligação ao antígeno. Em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma condição de um sujeito que consiste em administrar a dita composição farmacêutica ao dito sujeito, onde a dita condição é tratada reduzindo 30 a atividade de IGF-1R no dito sujeito.

Em uma outra incorporação o dito sujeito é um ser humano. . Em uma outra incorporação, a dita condição é um mieloma múltiplo, um tumor líquido, um câncer do fígado, uma desordem do timo, uma doença autoimmune mediada por célula-T, uma desordem endócrina, isquemia ou uma desordem neurodegenerativa.

Em uma outra incorporção, o dito tumor líquido é selecionado do grupo que consiste de uma leucemia linfocítica aguda (ALL) e de uma leucemia mielogênica crônica (CML); onde o dito câncer de fígado é selecionado do grupo consistindo de, hepatoma, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, angiosarcomas, hemangiosarcomas, hepatoblastoma; a dita desordem do timo é selecionada do grupo consistindo de: timoma e de tiroidites, a dita doença autoimmune mediada por células-T é selecionada do grupo que consiste na esclerose múltipla, artrite reumatóide, Lupus sistemático eritomatoso (SLE), doença de Grave’s, tireodite de Hashimoto, Miastenia Gravi’s, tireodites auto-immune, doença de Bechet, a dita desordem endocrinológica é selecionada do grupo consistindo de Diabetes tipo II, hipertireoidismo, hipotireoidismo, tireoidites, hiperadrenocorticismo e hipoadrenocorticismo; a dita isquemia é uma isquemia de infarto pós-cardíaco, ou a dita desordem neurodegenerativa é uma doença de Alzheimer.

Em uma outra incorporação, a dita condição é selecionada do grupo que consiste de: acromegalia, câncer da bexiga, tumor de Wilm’s, câncer ovariano, câncer pancreático, hiperplasia prostática benigna, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de osso, câncer de pulmão, câncer coloretal, câncer cervical, sarcoma sinovial, diarréia associada ao peptídeo intestinal carcinóide, metástase vasoativa secretando tumores, gigantismo, psoríase, aterosclerose, reestenose do músculo liso de vasos sanguíneos, proliferação microvascular inapropriada, glioblastoma, meduloblastoma, câncer escamoso da cabeça e da garganta, câncer oral, leucoplasia oral, neoplasia intraepitelial da próstata, câncer anal, câncer esofageal, câncer gástrico, câncer do osso, câncer metastático, policitemia rubra vera, uma condição benigna relacionada ao stress oxidativo, retinopatia de prematuridade, síndrome de dificuldade respiratória aguda, uma overdose de acetominofena, displasia broncopulmonariana, fibrose cística, fibrose pulmonar e retinopatia diabética.

Em uma outra incorporação, o método ainda compreende administrar ao dito sujeito um segundo tratamento. Em uma outra incorporação, o dito segundo tratamento é administrado ao dito sujeito antes e/ou simultaneamente com e/ou depois que a dita composição farmacêutica é administrada ao dito sujeito.

Em uma outra incorporação, o dito segundo tratamento compreende o tratamento de radiação, cirurgia, ou uma segunda composição farmacêutica.

Em uma outra incorporação, a dita segunda composição farmacêutica compreende um agente selecionado do grupo que consiste em um corticosteróide, um antiemético, hidrocloreto ondansetron, hidrocloreto granisetron, metroclopramida, domperidona, haloperidol, ciclizina, lorazepam, proclorperazina, dexametasona, levomepromazina, tropisetron, uma vacina de câncer, um ageme 15 inibidor GM-CSF, uma vacina de DNA de GM-CSF, uma vacina de base celular, uma vacina de células dendríticas, uma vacina virai recombinante, uma vacina de proteína de choque quente (HSP), uma vacina de tumor alogênica, uma vacina de tumor autólogo, um analgésico, ibuprofeno, naproxeno, trisalicilato de cloro magnésio, um hidrocloreto do oxicodone, um agente anti-angiogênico, um agente ) anti-vascular, bevacizumab, um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo do receptor de anti-VEGF, um fragmento solúvel do receptor de VEGF, anticorpo anti-TWEAK, anticorpo do receptor anti-TWEAK, um fragmento solúvel do receptor TWEAK, AMG 706, AMG 386, um agente antiproliferativo, um inibidor da transferase da proteína farnesil, um inibidor αvβ3, um inibidor avβδ, um inibidor p53, um kit do 25 inibidor do receptor, um inibidor do receptor ret, um inibidor de PDGFR, um inibidor de secreção do hormônio de crescimento, um inibidor de angiopoietina, um agente inibidor da infiltração do tumor por macrófagos, agente inibidor do fms, um anticorpo anti-c-frns, um agente inibidor de CSF-I, anticorpo anti-CSF-1, c-fms um fragmento solúvel, pegvisomante, gemcitabina, panitumumab, irinothecan, e SN- 30 38.

Em uma outra incorporação, o dito método compreende a administração ao dito sujeito de um terceiro tratamento.

Em uma outra incorporação, a dita condição é um câncer, o dito segundo tratamento compreende a administração do panitumumab e o dito terceirn 5 tratamento compreende a administração do gemcitabina.

Em uma outra incorporação, a dita circunstância é selecionada do grupo consistindo de acromegalia, câncer da bexiga, tumor de Wilm’s, câncer ovariano, câncer pancreático, hiperplasia prostática benigna, câncer de mama, câncer de próstata, câncer do osso, câncer de pulmão, câncer coloretal, câncer cervical, '0 sarcoma sinovial, diarréia associada ao peptídeo intestinal carcinóide, metástase vasoativa secretando tumores, gigantismo, psoríase, aterosclerose, reestenose do músculo liso de vasos sanguíneos, câncer escamoso microvascular impróprio da célula de proliferação, do glioblastoma, do medullablastoma, da cabeça e da garganta, câncer oral, leucoplasia oral, neoplasia intraepitelial da próstata, câncer 15 anal, câncer esofageal, câncer gástrico, câncer do osso, câncer metastático, policitemia, uma condição benigna relacionada ao stress oxidativo, retinopatia de prematuridade, síndrome de dificuldade respiratória aguda, um overdose de acetaminofena, displasia broncopulmonariana, fibrose cística, fibrose pulmonar e retinopatia diabética.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de aumentar a longevidade do sujeito que compreende a administração da dita composição farmacêutica ao dito sujeito.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de diminuir a atividade de IGF-1R em um paciente na necessidade que compreende a 25 administração da dita composição farmacêutica ao dito paciente.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de diminuir IGF-IR que sinaliza em um sujeito conforme a necessidade que compreende a administração da dita composição farmacêutica ao dito sujeito.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de inibir a 30 ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1R em um sujeito conforme a necessidade deste que compreende a administração da dita composição farmacêutica ao dito sujeito.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece composições, kits e métodos que relacionam- se às moléculas que ligam-se ao receptor do fator de crescimento semelhante a insulina (“IGF-IR"), incluindo as moléculas que agonize ou antagonizem IGF- 1R, como anticorpos anti-IGF-1R, fragmentos de anticorpos e dos derivados de anticorpos, por exemplo, anti- anticorpos de IGF-1R, fragmentos de anticorpos, ou derivados antagonístico de anticorpos. São fornecidos também os ácidus •o nucléicos, os derivados e os fragmentos destes, compreendendo uma seqüência de nucleotideos que codificam tudo ou uma parte de um polipeptidio que se liga a IGF-1R, por exemplo, o todo ou uma parte codificada do ácido nucléico de um anticorpo anti-IGF-1R, um fragmento de anticorpos ou um derivado de anticorpos, plasmídios e vetores compreendendo tais ácidos nucléicos, e células ou linhagens 15 de células que compreendem tais ácidos nucléicos e/ou vetores e plasmídios.

Os métodos fornecidos incluem, por exemplo, métodos de produção, ue identificação ou de isolamento de moléculas que ligam-se a IGF-1R, tal como, anticorpos anti-IGF-1R, métodos que determinam se uma molécula se liga a IGF- IR, métodos que determinam se uma molécula agoniza ou antagoniza IGF-1R, 3 métodos de produção de composições, tais como composições farmacêuticas, compreendendo uma molécula que se liga a IGF-1R e métodos para administrar uma molécula que se liga IGF-1R a um sujeito, por exemplo, métodos para tratar uma condição mediada por IGF-1R, e para agonizar ou antagonizar uma atividade biológica de IGF-1R, de IGF-1 e/ou de IGF-2 in vivo ou in vitro.

Os polinucleotídeos e as seqüências de polipeptídios são indicados usando o padrão de abreviaturas de uma ou três letras. A menos que indicadas de outra maneira, as seqüências de polipeptidio têm seu amino-terminal na esquerda e seu carboxi-terminal na direita e nas seqüências de cadeia única de ácido nucléico, e a parte superior de seqüências de cadeia dupla do ácido nucléico, tem seu 5'30 terminal na esquerda e seu 3'- terminal na direita.

Uma seqüência particular de polipeptidio ou de polinucleotídeo também pode ser descrita explicando como difere-se de uma seqüência da referência. Os polinucleotídeos e as seqüências particulares de polipeptídios de domínios variáveis de cadeia leve e pesada são mostrados nas figuras 1, 2 e 3, onde são 5 marcados, por exemplo, L1 (“domínio variável de cadeia leve 1"), H1 (“domínio variável de cadeia pesada 1”), os anticorpos etc. que compreendem uma cadeia leve e a cadeia pesada das figuras 2 e 3 são indicados combinando o nome duo domínios variáveis de cadeia leve e o nome dos domínios variáveis de cadeia pesada. Por exemplo, “L4H7,” indica um anticorpo que compreende o domínio o variável de cadeia leve L4 e o domínio variável de cadeia pesada H7.

A menos que de outra maneira aqui definidos, os termos científicos e técnicos usados em relação à presente invenção terão os significados que são compreendidos geralmente por um técnico especializado do assunto. Além disso, a menos que requerido de outra maneira pelo contexto, os termos singulars 15 incluirão pluralidade e os termos plurais incluirão o singular. Geralmente, as nomenclaturas usadas em relação às técnicas, à cultura celular e de tecido, à biologia molecular, à imunologia, à microbiologia, à genética e à química de proteína e à hibridização do ácido nucléico descritos aqui são aquelas bem conhecidas e usadas geralmente no estado da técnica.

Os métodos e as técnicas da presente invenção são executados geralmente de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos do estado da técnica s como descritos nas várias referências gerais e mais específicas são citadas e discutidas durante todo o presente relatório a menos que indicadas de outra maneira. Ver, por exemplo, Sambrook e outros. "Molecular Cloning: A Laboratory 25 Manual" (Clonagem Molecular: manual de laboratório), 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) e Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology”, (Protocolos atuais em Biologia Molecular) Greene Publishing Associates (1992) e Harlow and Lane “Antibodies: A Laboratc.y Manual” (Anticorpos: Um manual de Laboratório) Cold Spring Harbor Laboratory 30 Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990),), que são incorporadas aqui pela referência.

As reações e as técnicas de purificação enzimáticas são executadas de acordo com especificações do fabricante, como realizado geralmente no estado da técnica ou como descrito aqui. A terminologia usada em relação aos 5 procedimentos de laboratório e às técnicas, de química analítica, de química orgânica sintética e de química medicinal e farmacêutica descrita aqui são aquelas bem conhecidas e usadas geralmente no estado da técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento dos sujeitos.

Os seguintes termos, a menos que indicados de outra maneira, são compreendido para ter os seguintes significados:

O termo “molécula isolada” (onde a molécula é, por exemplo, um polipeptídio, um polinucleotídeo ou um anticorpo) no qual, é uma molécula que pela virtude de sua origem ou pela fonte de derivação (1) não é associado com os 15 componentes naturalmente associados que a acompanham em seu estado nativo, (2) estão substancialmente livres de outras moléculas da mesma espécie (3) são expressos por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorrem na natureza. Assim, uma molécula que sintetizada quimicamente ou sintetizada em um sistema celular diferente da célula de que origina naturalmente, “será isolada” ) de seus componentes naturalmente associados. Uma molécula também pode ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados pela isolação, usando técnicas de purificação bem conhecidas do estado da técnica. A pureza ou a homogeneidade da molécula pode ser analisada por vários meios bem conhecidos do estado da técnica. Por exemplo, a pureza de uma amostra de 25 polipeptídio pode ser analisada usando a eletroforese em gel de poliacrilamida e correr o gel para visualizar o polipeptídio usando técnicas bem conhecidos do estado da técnica. Para determinadas finalidades, uma definição mais elevada pode ser fornecida usando o HPLC ou outros meios bem conhecidos do estado da técnica para a purificação.

Os termos “inibidor IGF-1R” e “antagonista IGF-1R” são usados perrnutavelmente. Cada uma destas é uma molécula que detectavelmente inibe pelo menos uma função de IGF-1R. Inversamente, “um agonista IGF-1R" é uma molécula que detectavelmente aumenta pelo menos uma função de IGF-1R. A inibição causada por um inibidor de IGF-1R não necessita estar completa porque é 5 detectada usando um ensaio. Em todo o ensaio de uma função de IGF-1R pode ser usado, os exemplos de que são fornecidos aqui. Os exemplos das funções de IGF- 1R que podem ser inibidos por um inibidor de IGF-1R ou aumentado por um agonista de IGF-1R, incluem a ligação a IGF-1, a IGF- 12 e/ou a uma outra molécula de ativação de IGF-1R, atividade quinase, sinalização "downstream” e o assim por diante. Os exemplos dos tipos de inibidores de IGF-IR e de agonistas de IGF-1R incluem, mas não são limitados a, polipeptídios de ligação a IGF-1R tais como proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, proteínas de ligação ao antígeno inibir de IGF-1R), anticorpos, fragmentos de anticorpos e derivados de anticorpos.

Os termos “peptideo”, "polipeptidio” e “proteína" referem-se a uma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácido ligados um ao outro por uma ligação peptídica. Estes termos abrangem, por exemplo, proteínas, fragmentos de proteína e análogos nativos e artificiais de polipeptidio (tais como, mutantes, variantes, e proteínas de fusão) de uma seqüência da proteína tanto ) pós-traduzidas ou de outra maneira, proteínas modificadas covalentemente ou não-covalentemente. Um peptideo, um polipeptidio ou uma proteína podem ser monoméricos ou poliméricos.

O termo “fragmento de polipeptidio” como usado aqui, refere-se a um polipeptidio que tenha uma deleção amimo-terminal e/ou carboxi-terminal quando 25 comparado a uma proteína inteira correspondente. Os fragmentos podem ser, por exemplo, de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos no comprimento. Os fragmentos podem também ser, por exemplo, na maioria de 1.000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, ou 10 aminoácidos no comprimento. Um 30 fragmento pode além disso compreender, em qualquer uma ou em ambas as suas extremidades, um ou mais aminoácido adicionais, por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de uma proteína natural diferente (por exemplo, um domínio de Fc ou de leucina zipper) ou uma seqüência de aminoácido artificial (por exemplo, uma seqüência artificial do linker).

Os polipeptídios da invenção incluem os polipeptídios que foram modificados por qualquer maneira e por qualquer razão, por exemplo para: (1) reduzir a susceptibilidade a proteólise, (2) reduzira susceptibilidade à oxidação, (3) alterar afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alterar afinidade de ligação e (4) conferir ou modificar outras propriedades físico-químicas o ou funcionais.

Os análogos incluem mutações de um polipeptidio. Por exemplo, substituições únicas ou múltiplas do aminoácido (por exemplo, substituições conservadoras do aminoácido) podem ser feitas na seqüência natural (por exemplo, na porção do polipeptidio fora dos domínios que formam os contatos 15 intermoleculares. “Uma substituição conservadora do aminoácido” é uma que não muda substancialmente as características estruturais da seqüência parenteral (por exemplo, um aminoácido de recolocação não deve tender a quebrar uma hélice que ocorra na seqüência parenteral, ou interromper outros tipos de estrutura secundária que caracterizem a seqüência parenteral ou que seja necessário para ) sua funcionalidade). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias reconhecidas do estado da técnica do polipeptidio são “Proteins, Structures and Molecular Principles" (Princípios Moleculare e Estruturais das Proteínas) (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Introdução a estrutura das Proteínas) (C. Branden and J. Tooze, 25 eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); e Thornton et at. Nature 354: 105 (1991), que são cada um incorporados aqui por sua referência.

A presente invenção fornece também análogos de não- peptídeos de polipeptídios ligados a IGF- 1R. Os análogos do peptídeo são usados geralmente nas indústrias farmacêuticas, como drogas com as propriedades análogas àquelas 30 do peptídeo de molde. Estes tipos de composto não-peptidico são denominados de “peptideo miméticos” ou “peptideomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que são incorporadas aqui por sua referência. Os peptídeo miméticos que são estruturalmente similares aos peptídeos terapeuticamente 5 úteis, podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, os peptideomiméticos são estruturalmemte similares a um polipeptídio de paradigma (isto é, um polipeptídio que tenha uma propriedade bioquímica desejada ou uma atividade farmacológica), como um anticorpo humano, mas tem uma ou mais ligações pepitídicas substituídas opcionalmente 0 por uma ligação selecionada do grupo consistindo de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2- , ~CH=CH-(cis e trans), - COCH2-, -CH(OH)CH2-, and -CH2SO, por métodos de ligação conhecidos do estado da técnica.

A substituição sistemática de um ou mais aminoácido de uma seqüência consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar do 15 L-lisina) pode também ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, os peptídeos confinados que compreendem uma seqüência consenso ou uma variação substancialmente idêntica da seqüência consenso podem ser gerados pelos métodos conhecidos do estado da técnica (Rizo e Gierasch. Rev Ann. Biochem. 61:387 (1992), incorporado aqui por sua referência), por exemplo, j adicionando os resíduos internos de cisteína capazes de formar pontes bissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptideo.

Uma “variante” de um polipeptídio (por exemplo, um anticorpo) compreende uma seqüência de aminoácidos onde um ou os mais resíduos de aminoácidos são introduzidos, deletados e/ou substituídos na seqüência de aminoácidos relativa a 25 uma outra seqüência do polipeptídio. As variantes da invenção incluem proteínas de fusão.

Um “derivado" de polipeptídio é um polipeptídio (por exemplo, um anticorpo) que tenha sido modificado quimicamente, por exemplo, através da conjugação a uma outra fração química, tal como, por exemplo, polietileno glicol, albumina (por 30 exemplo, albumina do soro humana), fosforilação e glicolização.

A menos que indicado de outra maneira, o termo "anticorpo” inclui, além dos anticorpos que compreendem duas cadeias pesadas totalmente completas e duas cadeias leves completas, derivados, variantes, fragmentos e mutações deste, os exemplos destes são descritos abaixo.

O termo “uma proteína de ligação a antígeno” é uma proteína que compreende uma porção que liga-se a um antígeno e, opcionalmente, a uma porção fragmentada ou detetada da porção de ligação ao antígeno adotando uma conformação que promove a ligação entre a proteína de ligação ao antígeno e o antígeno. Exemplos de proteínas de ligação a antígeno incluem anticorpos, ■) fragmentos de anticorpos (por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo), derivados de anticorpos e análogos de anticorpos. A proteína de ligação ao antígeno pode compreender, por exemplo, uma estrutura alternativa ua proteína ou uma estrutura artificial com os derivados enxertados de CDRs ou de CDR. Tais estruturas incluem, mas não são limitados a, estruturas derivadas de 15 anticorpos que compreendem as mutações introduzidas para, por exemplo, estabilizar a estrutura tridimensional da proteína de ligação ao antígeno bem como as estruturas completamente sintéticas que compreendem, por exemplo, um polímero biocompatível. Ver, por exemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics (Proteínas: Estrutura, Função e j Bioinformática), Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639- 654. Além disso, o anticorpo mimético do peptideo (“PAMs”) pode ser usado, assim como estruturas baseadas no anticorpo mimético que utiliza componentes de fibronecção como um estrutura.

Uma proteína de ligação ao antígeno pode ter, por exemplo, a estrutura de 25 uma imunoglobulina natural. Uma “imunoglobulina” é uma molécula tetramérica.

Em uma imunoglobulina natural, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeia polipeptídica, cada alça: contendo uma cadeia "leve” (aproximadamente 25 KDa) e uma cadeia “pesada" (aproximadamente 50-70 KDa). A parte amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de 30 aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos, primeiramente responsáveis para o reconhecimento do antígeno. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante, primeiramente responsável para a função efetora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeia leves kappa e lambda. cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são ligadas por uma região “J” de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região “D” de aproximadamente 10 ou mais aminoácidos. Ver geralmente, Fundamental Immunology (Imunologia fundamental) Ch. 7 (Paul, W., ed., 2o ed. Raven Press, N.Y. (1989) (incorporado pela referênrj em sua totalidade para todas as finalidades). As regiões variáveis de cada par de cadeias leves/pesadas formam o sitio de ligação do anticorpo, de forma que uma imunoglobulina intacta tenha dois sítios de ligação. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo de forma que uma imunoglobulina intacta tenha dois sítios de ligação.

Naturalmente as cadeias de imunoglobulina exibem a mesma estrutura geral das regiões relativamente conservadas da estrutura (FR) ligadas por tm: regiões hipervariáveis, chamadas também regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. Do N-terminal ao C-terminal, ambas as cadeias leve e pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição dos aminoácidos a cada domínio é de acordo com as definições de Kabat e outros em " Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed., US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991.

Um “anticorpo” refere-se a uma imunoglobulina intacta ou a uma porção de ligação ao antígeno deste que compete com o anticorpo intacto para a ligação específica, a menos que especificado de outra maneira. As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por divagem enzimática ou química de anticorpos intactos. As porções de ligação ao antígeno incluem, entre outros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos do domínio (dAbs), e fragmentos de região de determinação de complementaridade (CDP'_ anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, e os polipeptídios quiméricos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina suficiente para conferir a ligação do antígeno específico ao 5 polipeptídio.

Um fragmento de Fab é um fragmento monovalente que tem os domínios VL, VH, CL e CHi; um fragmento F (ab‘)2 é um fragmento bivalente que tem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte bissulfeto na região de dobras; um fragmento Fd tem os domínios VH e CH1; um fragmento Fv tem domínios VL e de ) VH de um único braço de um anticorpo; e um fragmento dAb tem um domínio de

VH, um domínio de VL ou um fragmento de ligação a antígeno de um domínio de VH ou de VL (patente americana US6,846,634; US6,696,245; pedidos de patente americana US 05/0202512, US 04/0202995, US 04/0038291, US 04/0009507, US 03/0039958, Wrad e outros, Nature 341:544 - 546, 1989).

Um anticorpo de cadeia simples-(scFv) é um anticorpo em que um VL e uma região de VH são ligadas através de um linker (por exemplo, uma seqüência sintética de resíduos de aminoácido) para formar uma cadeia contínua de proteina onde o linker é suficientemente longo para permitir que a cadeia de proteína se dobre para trás para formar um local de ligação ao antígeno monovalente (ver, por D exemplo, Bird e outros, 1988, ciência 242:423 - 26 e Huston e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879 - 83). Diacorpos são anticorpos bivalentes que compreendem duas cadeias polipeptídicas, onde cada cadeia polipeptídica compreende os domínios VH e VL ligados por um linker que seja demasiadamente curto para permitir a ligação entre dois domínios na mesma cadeia, assim 25 permitindo que cada domínio ligue-se a um domínio complementar em uma outra cadeia polipeptídica (ver, por exemplo, Holliger e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:6444 - 48, e Poljak e outros, 1994, Struture 2:1121 - 23). Se as duas cadeias polipeptídicas de um diacorpo forem idênticas, então o diacorpo resultante desta ligação terá dois locais de ligação ao antígeno idênticos. As cadeias 30 polipeptídicas que têm seqüências diferentes podem ser usadas para fazer um diacorpo com os dois locais de ligação ao antígeno diferentes. Similarmente, os tricorpos e os tetracorpos são anticorpos que compreendem três e quatro cadeias polipeptídicas, respectivamente, dando forma a três e quatro locais de ligação ao antígeno, respectivamente, que podem ser os mesmos ou diferentes.

As regiões determinação de complementaridade (CDRs) e regiões da estrutura (FR) de um dado anticorpo que pode ser identificado usando o sistema descrito por Kabat et al. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NTH Publication no. 913242, 1991. Um ou o mais CDRs pode ser incorporado em uma molécula covalentemente ou não-covalentemente para fazer uma proteína de ligação ao antígeno. Uma proteína de ligação ao antígeno pode incorporar os CDR como parte de uma cadeia maior de polipeptidio, pode covalentemente ligar os CDR a uma outra cadeia de polipeptidio ou pode incorporar os CDR não-covalentemente. Os CDRs permitem que a proteína de ligação ao antígeno possa ligar-se especificamente a um antígeno particular de interesse.

Uma proteína de ligação ao antígeno pode ter um ou mais locais de ligação. Se houver mais de um local de ligação, os locais de ligação podem ser idênticos um ao outro, ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina humana natural tem tipicamente dois locais de ligação idênticos, quando um anticorpo “biespecífico” ou “bifuncional” tiver dois locais de ligação diferentes.

O termo "anticorpo humano" inclui todos os anticorpos que têm uma ou mais regiões variáveis e constante derivadas das seqüências humanas de imunoglobulina. Em uma incorporação, todos os domínios variáveis e constantes são derivados das seqüências humanas da imunoglobulina (um anticorpo inteiramente humano). Estes anticorpos podem ser preparados de diversas maneiras, os exemplos são descritos abaixo, incluindo a imunização de um antígeno de interesse de um rato que seja modificado geneticamente para expressar os anticorpos derivados dos’ genes que codifica as cadeias pesadas e/ou leves humanas.

Um anticorpo humanizado tem uma seqüência que se difere da seqüência de um anticorpo derivado de uma espécie não-humana por um ou mais aminoácidos substituídos, deletados, e/pu adicionados, de forma que o anticorpo humanizado é menos provável que induza uma resposta imune e/ou induza uma resposta imune menos severa, em relação ao anticorpo não-humano da espécL, 5 quando é administrado a um paciente humano. Em uma incorporação, determinados aminoácidos na estrutura e os domínios constantes das cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo não-humano da espécie são mutáveis para produzir o anticorpo humanizado. Em uma outra incorporação, os domínios constantes de um anticorpo humano são fundidos aos domínios variáveis de uma 0 espécie não-humana. Em uma outra incorporação, um ou mais resíduos do aminoácido em uma ou os mais seqüências de CDR de um anticorpo não-humar J é modificado para reduzir a provável imunogenicidade do anticorpo não-humano quando é administrado a um paciente humano, onde os resíduos modificados do aminoácido ou não são críticos para a ligação imunoespecífica do anticorpo a seu 15 antígeno, ou as modificações na seqüência do aminoácido que são feitas são mudanças conservadoras, de forma que a ligação do anticorpo humanizado ao antígeno não é significativamente pior do que a ligação do anticorpo não-humano ao antígeno. Os exemplos de como produzir anticorpos humanizados podem sof encontrados nas patentes americanas. US6,054,297; US5.886.152 e a US5,877,293.

O termo "anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de uma ou de outros anticorpos. Em uma incorporação, uma ou mais seqüências de CDRs são derivadas de um anticorpo humano anti-IGF-1R. Em uma outra incorporação, todo 25 os CDRs são derivados de um anticorpo humano anti-IGF-1R. Em uma out-» incorporação, os CDRs dos anticorpo humanos de mais de um anti-IGF-1R é misturado e combinado a um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender um CDR1 de cadeia leve de um primeiro anticorpo humano anti-IGF-1R, um CDR2 e um CDR3 de cadeia leve de um segundo 30 anticorpo humano anti-IGF-1R e o CDRs de cadeia pesada de um terceiro anticorpo anti-IGF-1 R. Além disso, as regiões da estrutura podem ser derivadas de um mesmo anticorpo anti-IGF-1R, de um ou mais anticorpos diferentes, tais como um anticorpo humano, ou de um anticorpo humanizado. Em um exemplo de um anticorpo quimérico, uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com, 5 homólogos a, ou derivado de um anticorpo de uma espécie particular ou de pertencer a uma classe ou a uma subclasse particular de anticorpo, quando o restante das cadeias são idênticas com, homólogos a, ou derivado de um anticorpo (s) de uma outra espécie ou de pertencer a uma outra classe de anticorpo ou subclasse. São incluídos também os fragmentos de tais anticorpos o que exibem a atividade biológica desejada (isto é, a habilidade de ligar especificamente a IGF-IR). Ver, por exemplo, a patente americana US No. 4.816.567 e o Morrison, 1985, Science 229:1202 - 07.

“Um anticorpo neutralizante" ou “um anticorpo inibitório” é um anticorpo que iniba a ligação de IGF-IR a IGF-I e/ou a IGF-2 quando um excesso do anticorpo 15 anti-IGF-1R reduz a quantidade do limite IGF-I e/ou IGF-2 a IGF-IR pelo menos por aproximadamente 20% usando o ensaio descrito no exemplo 9. Em várias incorporações, o anticorpo reduz a quantidade de IGF-1 e/ou de IGF-2 limitado a IGF-IR pelo menos por 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, e 99,9%.

“Um anticorpo de ativação” é um anticorpo que ative o IGF-1R pelo menos por aproximadamente 20% quando adicionado a uma célula, a um tecido ou a um organismo expressando IGF-1R, onde “a ativação 100%” é o nível da ativação conseguido sob condições fisiológicas pela mesma quantidade molar de IGF-1 e/ou de IGF-2. Em várias incorporações, o anticorpo ativa a atividade de IGF-1R 25 pelo menos por 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 750% ou por 1000 %.

Os fragmentos ou os análogos dos anticorpos podem prontamente ser preparados por um técnico especializado do assunto que segue os ensinamentos deste relatório e que usa técnicas bem conhecidas do estado da técnica. Os 30 fragmentos de amino e carboxi-términal preferidos ou dos análogos ocorrem pe;ko dos limites de domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados pela comparação dos dados da seqüência do nucleotídeo e/ou do aminoácido às bases de dados públicas ou de seqüência próprias. Os métodos de comparação computadorizados podem ser usados para identificar a parte principal 5 da seqüência ou os domínios preditos de conformação da proteína que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou da função conhecidas. Os métodos para identificar as seqüências da proteína que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Ver, por exemplo, Bowie et ah, 1991, Science 253:164.

“Um anticorpo enxertado CDR” é um anticorpo que compreende um ou mais CDRs derivados de um anticorpo de uma espécie ou um isotipo particular e a estrutura de um outro anticorpo do mesmo ou a espécie ou o isotipo diferente.

“Um anticorpo multi-específico” é um anticorpo que reconhece mais de um epitopo em um ou mais antígenos. Uma subclasse deste tipo de anticorpo é “um 15 anticorpo bi-específíco” que reconhece dois epitopos distintos no mesmo antígeno ou nos antígenos diferentes.

Uma proteína de ligação ao antígeno “liga-se especificamente” a um antígeno (por exemplo, IGF-1R humano) com uma constante de dissociação de 1 nanomolarou menos.

Um “domínio de ligação ao antígeno", "região de ligação ao antígeno,” ou “sítio de ligação ao antígeno” é uma porção de uma proteína de ligação do antígeno que contêm os resíduos do aminoácido (ou outros porções) que interagem com um antígeno e contribui para a especificidade e para a afinidade da proteína de ligação ao antígeno para o antígeno. Para um anticorpo que liga-se 25 especificamente a seu antígeno, isto incluirá pelo menos a parte de pelo menos um de seus domínios CDR.

Um "epitopo” é a porção de uma molécula na qual é limitada por uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, por um anticorpo). Um epitopo pode compreender partes não-contínuas da molécula (por exemplo, em um polipeptidio, 30 os resíduos do aminoácido que não são contínuos na seqüência preliminar do polipeptidio, mas que, no contexto do polipeptidio terciário e da estrutura quaternária, estão perto o bastante de cada um para ser limitada por uma proteína de ligação ao antígeno).

A "identidade percentual" de dois polipeptídios ou duas seqüências de 5 polinucleotídeos é determinada comparando as seqüências usando o programa de computador GAP (uma parte do pacote de GCG Wisconsin, versão 10.3 (Accelrys, San Diego, o CA)), usando seus parâmetros.

Os termos "polinucleotídeo”, “oligonucleotideo” e “ácido nucléico” são usados permutavelmente por toda a parte e incluem as moléculas do DNA (por '0 exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos do DNA ou do RNA gerados usando análogos do nucleotídeo (por exemplo, ácidos nucléicos do peptídeo e análogos não- naturais do nucleotídeo), e híbrido destes. A molécula do ácido nucléico pode ser fita única ou dupla-fita. Em uma incorporação, as moléculas do ácido nucléico da invenção compreendem 15 uma estrutura aberta continua de leitura que codificam um anticorpo, ou um fragmento, um derivado, uma mutação ou uma variante deste, da invenção.

Dois polinucleotídeos de fita simples são “o complemento” de cada uma se suas seqüências puderem ser alinhadas em um orientação anti-paralelo, de forma que cada nucleotídeo em um polinucleotídeo é oposto a seu nucleotídeo o complementar no outro polinucleotídeo, sem a introdução das aberturas, e sem nucleotideos não pareados na extremidade 5 ' ou 3 ' de uma ou outra seqüência. Um polinucleotídeo é “complementar" a um outro polinucleotídeo se os dois polinucleotídeos puderem hibridizar um ao outro sob estritas condições moderadas. Assim, um polinucleotídeo pode ser complementar a outro 25 polinucleotídeo sem ser seu complemento.

Um “vetor” é um ácido nucléico no qual pode ser usado para introduzir um outro ácido nucléico ligado-se a ele em uma célula. Um tipo de vetor é um “plasmidio”, no qual refre-se a uma molécula de DNA de dupla fita circular ou linear em que os segmentos adicionais do ácido nucléico podem ser ligados. Um 30 outro tipo de vetor é um vetor virai (por exemplo, retrovirus de falha de replicação, adenovirus e vírus adeno-associados), através do qual os segmentos adicionais do DNA podem ser introduzidos no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, os vetores bacterianos que compreendem uma origem bacteriana de 5 replicação e vetores episomal de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não-episomal de mamíferos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira sob introdução na célula hospedeira, e desse modo replicando-se junto com o genoma da célula hospedeira. “Um vetor de expressão" é um tipo de vetor que pode dirigir a expressão de um polinucleotídeo escolhido.

Uma seqüência de nucleotídeo está "ligada operativamente” a uma seqüência regulatória se a seqüência regulatória afetar a expressão (por exemplo, o nível, sincronismo ou posição da expressão) da seqüência do nucleotídeo. "Uma seqüência regulatória" é um ácido nucléico que afeta a expressão (por exemplo, o nível, sincronismo, ou posição da expressão) de um ácido nucléico que é ligada operativamente. A seqüência regulatória pode, por exemplo, exercer seus efeitos diretamente no ácido nucléico regulado ou com a ação de uma ou de outras moléculas (por exemplo, os polipeptídios que ligam-se à seqüência regulatória e/ou ao ácido nucléico). Os exemplos de seqüências regulatória incluem promotores, enhancers e outros elementos do controle da expressão (por ’0 exemplo, sinais de poliadenilação). Exemplos adicionais de seqüências regulatória são descritos, por exemplo, em Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Tecnologia da Expressão Gênica: Métodos em Enzimologia)185, Academic Press, San .Diego, CA and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

“Uma célula hospedeira" é uma célula que pode ser usada para expressar um ácido nucléico, por exemplo, um ácido nucléico da invenção. Uma célula hospedeira pode ser um procarioto, por exemplo, E. coli, ou pode ser um eucarioto, por exemplo, um eucarioto de apenas uma célula (por exemplo, um fermento ou outro fungo), uma célula vegetal (uma célula de planta, por exemplo, 30 tabaco ou de tomate), célula animal (por exemplo, uma célula humana, uma célula de macaco, uma célula de hamster, uma célula de rato, uma célula de camundongo, ou uma célula de inseto) ou um hibridoma. Os exemplos de células hospedeiras incluem a linha COS-7 das células do rim do macaco (ATCC CRL 1651) (ver Gluzman e outros, 1981, Cell 23:175), as células L, C127, as células 5 3T3 (ATCC CCL 163), as células do ovário do hamster chinês (CHO) ou seus derivados, tais como Veggie CHO e as linhas relacionadas que crescem em meios livre de soro (ver Rasmussen e outros, 1998, Cytotechnology 28:31) ou em tensão DX-BI 1 de CHO, que são deficientes de DHFR (ver Urlaub e outros, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77:4216 - 20), células HeLa, linhas de células de BHK (ATCC 10 CRL 10), linha de células de CV1/EBNA derivadas da linha CVI de células do rim do macaco verde africano (ATCC CCL 70) (ver McMahan e outros, 1991, EMBO J. 10:2821), células embriogênicas do rim humano, tais como, 293, 293 EBNA ou MSR 293, as células A431 epidermal humanas, as células Colo205 humanas, outras linhas transformadas de células do primata, células diplóides normais, 15 células derivadas da cultura in vitro do tecido preliminar, explantes preliminares, células de HL-60, de U937, de HaK ou de Jurkat. Tipicamente, uma célula hospedeira é uma célula cultivada na qual pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucléico codificando um polipeptídeo, que pode então ser expresso na célula hospedeira. A frase “célula hospedeira recombinante” pode ser usada ’.o para denotar uma célula hospedeira que é transformada ou transfectada por um ácido nucléico a ser expresso. Uma célula hospedeira também pode ser uma célula a qual compreende o ácido nucléico, mas não o expressa em um nível desejado a menos que uma seqüência regulatória for introduzida na célula hospedeira, de forma que se torna funcionalmente ligada ao ácido nucléico.

Compreende-se que o termo célula hospedeira, refere-se não somente às células determinadas particularmente, mas à prole ou á potencial prole de tal célula. Porque determinadas modificações podem ocorrer nas sucessivas gerações devido a, por exemplo, mutação ou influência ambiental, tal prole não pode, na verdade, ser idêntica à célula parenteral, mas é incluída ainda dentro do contexto 30 do termo como usado aqui. IGF-1 R IGF-1 R é urn receptor tirosina quinase transmembrana (Blume- Jensen e outros, 2001, Nature 411: 355 - 65). O IGF-1 R humano é sintetizado como um polipeptidio 1367 do precursor do aminoácido que indue um peptídeo sinal do 5 aminoácido 30 removido durante a translocação no retículo endoplasmático (Suíço-Prot: P08069). O pro-receptor de IGF-1 R é glicolisado e clivado por uma protease nas posições 708-711 (que contam o primeiro aminoácido que segue a seqüência do peptídeo sinal) durante a maturação nos eR-golgi tendo por resultado a formação de uma a-cadeia (1-707) e de uma β-cadeia (712-1337) que io permanecem ligados por ligações bissulfeto (Bhaumick e outros, 1981, Proc Acad Natl Sei EUA 78:4279 - 83, Chernausek e outros, 1981, Biochemistry 20:7345 - 50, Jacobs e outros, 1983, Proc Acad Natl Sei EUA 80:1228 - 31, LeBon e outros, 1986, Biol Chem 261 de J: 7685-89, Elleman, e outros, 2000, Biochem J 347:771 - 79). O formato predominante do IGF-1 R (e de INSR) que existe na superfície da 15 célula é (αβ) um dímero 2 proteoliticamente processado e glicolizado, ligado covalentemente por uma ou mais ligação bissulfeto.

A parte extracelular do IGF-1 R consiste na a-cadeia e em 191 aminoácidos da β-cadeia (712-905). O receptor contém uma única transmembrana que mede a seqüência (906-929) e um domínio citoplasmático do resíduo 408 que indue uma !0 tirosina quinase funcional (Rubin e outros, 1983, nature 305:438 - 440). A análise comparativa da seqüência revelou que o IGF-1 R é composto por 11 unidades principais estruturais distintas (reviewed by Adams et al, 2000, Cell Mol Life Sci 57: 1050-93, Marino-Buslje et al, 1998, FEBS Ltrs 441:331-36, Ward et al, 2001, BMC Bioinformatics 2:4). A metade N-terminal do domínio extracelular contém dois 25 domínios homólogos referidos como L1 (1-151) ea L2 (299-461) (Wrad e outros, 2001, supra) separado por uma região rica em cisteina (CR) (152-298) que consiste em diversos módulos estruturais com bissulfetos ligados que alinham-se para repetir as unidades presentes no receptor de TNF e no laminina (Ward e outros, 1995, proteínas 22:141 - 53). A estrutura cristal do domínio L1- CR-L2 foi 30 esclarecida (Garrett e outros, 1998, natureza 394:395 - 99). O domínio L2 é seguido por três domínios de fibronectina tipo III (Marino-Buslje et al, 1998, supra, Mulhern et al, 1998, Trends Biochem Sei 23:465-66, Ward et al, 1999, Growth Factors 16:315-22). O primeiro domínio de Fnlll (Fnlll-I, 461-579) é constituído por 118 aminoácidos no comprimento. O segundo domínio de Fnlll (Fnlll-2, 580-79o) interrompido por uma seqüência principal de inserção (ID) de aproximadamente 120 aminoácidos no comprimento. O domínio do ID inclui um local de clivagem da protease de furina que separa as cadeias α e β do receptor maduro. O terceiro domínio de Fnlll (Fnlll-3) é situado inteiramente na β-cadeia (799-901) que termina diversos resíduos antes da seqüência da transmembrana. O domínio catalítico da tirosina quinase de IGF-1 R é situado entre as posições dos aminoácidos 9731229, e sua estrutura foi esclarecida (Favelyukis et al, 2001, Nature Structural B.ul 8: 1058-63, Pautsch et al, 2001, Structure 9:955-65). A quinase é flanqueada por duas regiões regulatórias, a região de justamembrana (930-972) e por uma cauda C-terminal do aminoácido 108 (1220-1337) (Surmacz et al, 1995, Experimental Cell Res 218:370-80, Hongo et al, 1996, Oncogene 12:1231-38). As duas regiões regulatórias contêm os resíduos de tirosina que servem como locais de ancoragem para proteínas de sinal transducional quando fosforiladas pela tirosina quinase ativada do IGF-1R (Reviewed by Baserga (ed.), 1998 The IGF-1 Receptor iri Normal and Abnormal Growth, Hormones and Growth Factors in Development and Neoplasia, Wiley-Liss, Inc., Adams et al, 2000, Cell Mol Life Sci 57:1050-93).

A seqüência do aminoácido de IGF-1 R é aproximadamente 70% idêntica ao receptor de insulina (INSR; Suíço-Prot: P06213). A homologia mais elevada entre os receptores é situada no domínio da tirosina quinase (84%); a identidade mais baixa está na região do CR e no C-terminal. O IGF-1R é altamente relacionada também (~ 55% idêntico) ao receptor relacionado da insulina (IRR; Suíço-Prot: P 14616).

IGF-1R humano pode ser ativado pela insulina, como fatores de crescimento, IGF-1 e IGF-2 e insulina (INS) (Montes e outros, 1985, pesquisa Pediatric 19:879 - 86). IGF-1 e IGF-2 são genes não-alélicos codificados (Hill et al, 1985, Pediatric Research 19:879-86). IGF-1 and IGF-2 são genes não-alélicos codificados (Brissenden et al, 1984, Nature 310: 781-8, Bell et al, 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82: 6450-5), e ambos os genes expressam as proteínas alternativas relacionadas por splicing de RNA diferencial e processamento de proteína. Os formatos 5 maduros mais comuns e bem mais estudados de IGF-1 e de IGF-2 são de respectivamente 70 e 67 aminoácidos de comprimento (Jansen et al, 1983, Nature 306:609-11, Dull et al, 1984, Nature 310: 777-81). Estas proteínas (e suas isoformas) são idênticas, nas posições 11/21, à insulina A-peptídeo e idêntico, nas posições 12/30, à insulina B-peptideo.

IGF-1R é expresso em todas os tipos de células em um animal normal adulto, à exceção dos hepatócitos do fígado e das células β maduras. O plasma sanguíneo humano contêm concentrações elevadas de IGF-1 e de IGF-2, e IGF-1 pode ser detectado na maioria dos tecidos. O receptor é um componente integral do mecanismo de controle fisiológico do tamanho do órgão e homeostasia. Sem ser limitado a uma teoria particular, "a hipótese Somatomedina" indica que o Hormônio de crescimento (GH) mediado ao crescimento somático que ocor.e durante a infância e a adolescência é dependente do formato endócrino de IGF- 1que é principalmente produzido e secretado pelo fígado (Daughaday, 2000, Nephrology Pediatric 14:537 - 40). A síntese de IGF-1 hepático é estimulada pela '.o liberação de GH na hipófise em resposta a GHRH hipotalâmico (hormônio de liberação de GH). A concentração do soro de IGF-1 aumenta sobre a dobra 100 entre idades 5-15 anos em seres humanos. A bioavaliabilidade de IGF-1 é regulado pela proteína de ligação 3 de IGF (IGFBP3) com aproximadamente 99% do fator do crescimento compartimentalizado na região de fronteira. A deficiência primária de IGF-1 dá origem a deleções parciais, e deficiência secundária de IGF-1 resultante de defeitos na produção do GH ou na sinalização, não são letais (Woods, 1999, IGF Deficiency in Contemporary Endocrinology: The IGF System, R. a. R. Rosenfeld, C. Jr. Totowa, ed.s, Humana Press, NJ: 651-74). Os indivíduos afetados exibem um retardamento do crescimento, nascimento, crescimento lento e podem resultar em anomalias do CNS.

A Sinalização de IGF-IR promove o crescimento e a sobrevivência da célula com a ativação da proteína-dependente do adaptador IRS da rota PI3Kinase/Akt. O IGF-1 R transmite um sinal a suas estruturas principais, IRS-1 com IRS-4 e proteínas SHE (Blakesley et ah, 1999, IGF-1 receptor function: transducing the IGF- I signal into intracellular events in The IGF System, R. G. a. R. Rosenfeld, Jr. CT. Totowa, ed.s, Humana Press, NJ: 143-63). Isto resulta na ativação da quinase Ras/Raf/MAP e da quinase PI3/Akt que sinaliza a cascata. Entretanto, a indução da sobrevivência da célula Akt-mediada através do IRS é a rota de resposta dominante da cascata sob estimulação de IGF da maioria das células. Ver figura 10.

Proteínas de Ligação a Antiqenos

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, derivados de anticorpos, mutações de anticorpos, e variantes de anticorpos), que liga-se a IGr • 1R, por exemplo, IGF-1 R humano.

As proteínas de ligação ao antígeno, de acordo com a presente invenção, incluem as proteínas de ligação ao antígeno que inibem uma atividade biológica de IGF-1 R. Os exemplos de tais atividades biológicas incluem ligar uma molécula de sinalização (por exemplo, IGF-1 e/ou IGF-2), e transdução de um sinal em resposta a ligação da uma molécula de sinalização.

Diferentes proteínas de ligação ao antígeno podem ligar-se aos domínios eu aos diferentes epitopos de IGF-1 R ou agir por diferentes mecanismos de ação. Os exemplos incluem, mas não são limitados, as proteínas de ligação ao antígeno que interferem na ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R ou que inibem a transdução de sinal. O local da ação pode ser, por exemplo, intracelular (por exemplo, interferindo com uma cascata de sinalização intracelular) ou extracelular. Uma proteína de ligação ao antígeno não necessita completamente inibir um IGF- 1e/ou uma atividade induzida IGF-2 para encontrar o uso na presente invençã'*: preferencialmente, as proteínas de ligação ao antígeno que reduzem uma atividade particular de IGF-1 e/ou de IGF-2 são contempladas para o uso também.

As discussões aqui de mecanismos particulares da ação para proteínas de ligação ao antígeno IGF-1 R no tratamento de doenças particulares são somente ilustrativas e os métodos apresentados aqui não são limitados desse modo).

Tem sido observado que ambas IGF-1 e IGF-2 exibem ligação bifásica a 5 IGF-1 R. A elevada afinidade da ligação' foi relatada para ter um KD na escala d? 0,2 nanômetros; a elevada ligação de afinidade, aproximadamente dez dobras maiores. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um inibidor de IGF-1 R que inibe as afinidades deligação alta e baixa de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-R. Tem sido sugerido que a elevada afinidade de ligação, ao invés da baixa io afinidade de ligação, de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R são requeridas para a mudança da conformação que ativa a atividade da tirosina quinase de IGF-1 R. Assim, em uma outra incorporação, o inibidor de IGF-1 R inibe preferencialmente a elevada afinidade de ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R em relação à baixa afinidade de ligação.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece as proteínas de ligação ao antígeno que compreendem uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em L1 a L52 e/ou uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de H1 a H52, e os fragmentos, derivados, mutações, e variantes deste (ver figuras 2 e 3). Uma proteínas de ligação ao ’.o antígeno pode ser denominada usando a nomenclatura “LxHy", onde “x” corresponde ao número da região variável de cadeia leve e “y” corresponde ao número da região variável de cadeia pesada quando são marcados nas figuras 2 e 3. Por exemplo, L2H1 refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno com uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência do aminoácido L2 e 25 uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência do aminoácido H1, como mostrado nas figuras 2 e 3. As Figuras 2 e 3 indicam também a posição dos CDR e das regiões da estrutura de cada uma destas seqüências de domínios variáveis. As regiões dos CDR de cada cadeia leve e cadeia pesada são agrupadas também pelo tipo e pela similaridade da seqüência nas figuras 4 a 9. As proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção incluem, por exemplo, as proteínas de ligação ao antígeno que têm uma combinação da cadeia leve e dos domínios variáveis de cadeia pesadas selecionadas do grupo consistindo nas combinações L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LIOHIO, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51, and L52H52.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácidos que se difere da seqüência de um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo que consiste de L1 até L52 somente nos resíduos 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1, onde cada diferença da seqüência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um resíduo do aminoácido. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica à seqüência de um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo que consiste de L1 até L52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por uma seqüência de nucleotídeo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica a uma seqüência do nucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo que consiste de l_1 até L52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotideo que hibridiza-se sob condições moderadamente estringentess ao complemento de um polinucleotideo que codifica um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo que consiste de L1 até L52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotideo que hibridiza-se sob condições moderadamente estringentess ao complemento de urn polinucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo que consiste de L1 até L52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por 5 um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições moderadamente estringentes a um complemento de um polinucleotídeo de cadeia leve selecionado da figura 1.

Em uma outra incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácidos que difere-se da seqüência de um io domínio variável de cadeia pesada selecionada dos grupos consistindo de H1 a H52 somente nos resíduos 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1, onde cada diferença da seqüência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um resíduo do aminoácido. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que seja 15 pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica à seqüência de um domínio variável de cadeia pesada selecionada dos grupos consistindo de H1 a H52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por uma seqüência de nucleotídeo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% 10 idêntica a uma seqüência do nucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia pesada selecionado dos grupos’consistindo de H1 a H52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições moderadamente estringentess ao complemento de um polinucleotídeo 25 que codifica um domínio variável de cadeia pesada selecionado dos grupos consistindo de H1 a H52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições moderadamente estringentess ao complemento de um polinucleotídeo que codifca um domínio variável de cadeia 30 pesada selecionado dos grupos consistindo de H1 a H52. Em uma outra incorporação, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob condições moderadamente estringentess a um complemento de um polinucleotídeo de cadeia pesada selecionado da figura 1.

As incorporações particulares de proteína de ligação ao antígeno da presente invenção compreendem uma ou mais seqüência de aminoácido que são idênticas às seqüências do aminoácido de um ou mais CDRs e/ou FRs ilustrados nas figuras 2 a 9. Em uma incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve de CDR1 ilustrada na figura 4. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve CDR2 ilustrada na figura 5. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve CDR3 ilustrada na figura 6. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada de CDR1 ilustrada na figura 7. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada CDR2 ilustrada na figura 8. Em uma outra incorporação, a proteina de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada CDR3 ilustrada na figura 9. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve de FR1 ilustrada na figura 2. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve FR2 ilustrada na figura 2. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve FR3 ilustrada na figura 2. Em uma outra incorporação, a proteina de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia leve FR4 ilustrada na figura 2. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada de FR1 ilustrada na figura 3. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada FR2 ilustrada na figura 3. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada FR3 ilustrada na figura 3. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma seqüência de cadeia pesada FR4 ilustrada na figura 3.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende uma ou mais seqüência de CDR que se diferem de 5 um CDR ligado em seqüência mostrado nas figuras 2 a 9 por resíduos de nao mais que 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácidos.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um CDR de L1-L52 e/ou de H1-H52, como mostrado nas figuras 2 a 9, e pelo menos uma seqüência de CDR de um ’0 anticorpo anti-IGF-1R descrito nos pedidos de patente americano US 03/0235582, 04/0228859, 04/0265307, 04/0886503, 05/0008642, 05/0084906, 05/0186203, 05/0244408, publicação do PCT WO 03/059951, WO 03/100008, WO 04/071529A2, WO 04/083248, WO 04/087756, WO 05/016967, WO 05/016970, ou WO 05/058967 (cada qual é incorporado aqui pela referência em sua totalidade 15 para todas as finalidades) pelo qual a proteína de ligação ao antígeno liga-se ao receptor de IGF-1. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende 2, 3, 4, ou 5 seqüências do CDR L1-L52 e/ou H1-H52, como mostrado nas figuras 2 a 9. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno compreende 2, 3, 4, ou 5 seqüências do CDR de um anticorpo anti-IGi- .0 1R descrito nos pedidos de patentes americanas publicados US 03/0235582, 04/0228859, 04/0265307, 04/0886503, 05/0008642, 05/0084906, 05/0186203, 05/0244408, PCT WO 03/059951, WO 03/100008, WO 04/071529 A2, WO 04/083248, WO 04/087756, WO 05/016967, WO 05/016970, ou WO 05/058967. Em uma outra incorporação, pelo menos uma das seqüências de CDR3 da 25 proteína de ligação ao antígeno é uma seqüência CDR3 de L1-L52 e/ou de H1- H52, como mostrado nas figuras 2, 3, 6, e 9. Em uma outra incorporação, a seqüência de cadeia leve CDR3 da proteína de ligação ao antígeno é uma seqüência de cadeia leve CDR3 de L1-L52 como mostrada nas figuras 2 e 6 e a seqüência de cadeia pesada CDR3 da proteína de ligação ao antígeno é uma 30 seqüência de cadeia pesada de H1-H52 como mostrado nas figuras 3 e 9. Em uma outra incorporação, a proteina de ligação ao antígeno compreende 1, 2, 3, 4, ou 5 seqüências dos CDR que cada uma difere-se independentemente de 6, 5, 4, 3, 2, 1, ou 0 aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados de umn seqüência do CDR de L1-L52 e/ou de H1-H52, e a proteína de ligação ao antígeno 5 ainda compreende 1, 2, 3, 4, ou 5 seqüências do CDR onde cada uma difere-se independentemente por 6, 5, 4, 3, 2, 1, ou 0 aminoácidos adicionados, substituídos, e/ou deletados da seqüência do CDR do publicado nos pedidos de patente americano US 03/0235582, 04/0228859, 04/0265307, 04/0886503, 05/0008642, 05/0084906, 05/0186203, 05/0244408, publicação de PCT, WO o 03/059951, WO 03/100008, WO 04/071529A2, WO 04/083248, WO 04/087756 WO 05/016967, WO 05/016970 ou WO 05/058967.

Em uma outra incorporação, as seqüências do CDR publicados nos pedidos de patente americanos. No. 03/0235582, 04/0228859, 04/0265307, 04/0886503, 05/0008642, 05/0084906, 05/0186203, 05/0244408, publicação de PCT. No. WO 03/059951, WO 15 03/100008, WO 04/071529A2, WO 04/083248, WO 04/087756, WO 05/016967, WO 05/016970 ou WO 05/058967.

Em uma outra incorporação, as seqüências do CDR é (são) de anticorpo (s) que liga-se (ligam-se) a porção L2 do domínio extracelular do receptor de IGF-1. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno não compreende ÍO uma seqüência de cadeia leve CDR3 e/ou uma seqüência de cadeia pesada CDR3 de um anticorpo anti-IGF-1R publicado nos pedidos de patentes americanas US 03/0235582, 04/0228859, 04/0265307, 04/0886503, 05/0008642, 05/0084906, 05/0186203, 05/0244408, publicação de PCT, WO 03/059951, WO 03/100008, WO 04/071529A2, WO 04/083248, WO 04/087756, WO 05/016967, WO 25 05/0169 70 ou WO 05/058967. Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve CDR1 que compreende a seqüência RSSQSLLHXIX2GYNX3LX4 (NO. SEQ ID: 236), onde X, é uma serina ou um resíduo de treonina, X2 é uma asparagina, uma serina ou um resíduo de histidina, X3 é uma tirosina ou um resíduo de fenilalanina e X4 é um 30 aspartato ou um resíduo de asparagina. Em uma outra incorporação, a cadeia leve CDR1 compreende a seqüência TRSSGX|IX2X3NYVQ (NO. SEQ ID: 237), onde X-, é uma serina ou um resíduo do aspartato, X2 é uma alanina ou um resíduo do aspartato, e X3 é uma serina ou um resíduo da asparagina. Em uma outra incorporação, a cadeia leve de CDR1 compreende a seqüência RASQXIX2X3X4X5LX6 (NO SEQ ID: 238), onde XT é uma glicina ou um resíduo de serina, X2 é uma isoleucina, uma valina, ou um resíduo de prolina e X3 é uma serina, uma glicina ou um resíduo de tirosina X4 é qualquer resíduo de aminoácido, X5 é uma fenilalanina, uma tirosina, uma asparagina ou um resíduo de triptofano e X6 é uma alanina ou um resíduo de asparagina. Em uma outra incorporação, X2 é um resíduo de isoleucina ou de valina, X3 é um resíduo de glicina ou de serina, X4 é uma arginina, uma serina, uma asparagina, uma serina, uma tirosina ou um resíduo de isoleucina e X5 é uma fenilalanina ou um resíduo de tirosina.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve CDR2 que compreende a seqüência LX-|X2X3RX4S (NO. SEQ do. ID: 239), onde Xi é uma glicina ou um resíduo de valina, X2 são uma serina ou um resíduo de fenilalanina, X3 é uma asparagina, uma tirosina, ou um resíduo de treonina, e X4 é uma alanina ou um resíduo do aspartato. Em uma outra incorporação, o CDR2 compreende a seqüência AXISX2LX3S (NO. SEQ do ID: 240), onde Xi é uma alanina ou um resíduo de treonina, X2 é uma treonina ou um resíduo de glicina, e X3 é uma glutamina ou um resíduo de glutamato. Em uma outra incorporação, o CDR2 compreende a seqüência XIX2NX3RPS S (NO. SEQ do ID: 241), pelo qual Xi é um glutamato, uma glutamina, ou um resíduo de glicina, X2 é um resíduo de aspartato ou de lisina, e X3 é qualquer resíduo de aminoácido.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve CDR3 que compreende a seqüência MX1X2X3X4X5PX6X7 (NO. SEQ ID: 242), pelo qual; Xi é um resíduo de glutamina ou de glutamato, X2 é uma alanina, uma glicina, uma serina, ou um resíduo de treonina, X3 é um resíduo de leucina ou de treonina, X4 é um glutamina, um glutamata, ou um resíduo de histidina, X5 é uma treonina, um triptofano, uma metionina ou um resíduo de valina, X6 é um resíduo não polar da cadeia lateral, e X7 é uma treonina, uma serina, ou um resíduo de alanina. Em uma outra incorporação, o CDR3 compreende a seqüência QQX1X2X3X4PX5T (NO. SEQ ID: 243), onde Xi é uma arginina, uma serina, uma leucina, ou um resíduo da alanina, X2 são uma asparagina, uma serina, ou um resíduo de histidina, X3 é uma serina ou um resíduo da asparagina, X4 é um resíduo não polar de cadeia lateral, e X5 é uma leucina, uma isoleucina, uma tirosina, ou um resíduo do triptofano. Em uma outra incorporação, o CDR3 compreende a seqüência QSYX1SX2NX3X4V (NO. SEQ ID: 244), pelo qual Xi é um aspartato ou um resíduo de glutamina, X2 são uma serina ou um resíduo do aspartato, X3 é uma glutamina, uma valina, ou um resíduo de triptofano, e X4 é um resíduo de arginina ou nenhum resíduo.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia pesada CDR1 que compreende a seqüência XTX2X3WWS (NO. SEQ ID: 245), pelo qual XT é um resíduo de serina ou nenhum resíduo, X2 é um resíduo de serina ou de asparagina, e X3 é um resíduo da asparagina e um resíduo de isoleucina. Em uma outra incorporação, o CDR1 de cadeia pesada compreende a seqüência XT X2YWS (NO. SEQ ID: 246), onde X1 é uma glicina, uma asparagina, ou um resíduo de aspartato, e X2 é um resíduo de tirosina ou de fenilalanina. Em uma outra incorporação, o CDR1 de cadeia pesada compreende a seqüência SYXÍX2X3 (NO. SEQ do ID: 247), onde XT é um resíduo da alanina ou de glicina, X2 é um resíduo de metionina ou do isoleucina, e X3 é um resíduo de serina óu de histidina.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreenda uma cadeia pesada de CDR2 que compreende a seqüência X^^XnXsGXeTXyYNPSLXeS (NO. SEQ ID: 248), onde, X, é um resíduo de glutamato, uma tirosina, ou de serina, X2 é um resíduo de isoleucina ou de valina, X3 é uma tirosina, uma asparagina, ou um resíduo de serina, X4 é uma histidina, uma tirosina, um aspartato, ou um resíduo de prolina, X5 é um resíduo de serina ou da arginina, Xe é um resíduo de serina ou de asparagina, X7 é um resíduo da asparagina ou de tirosina, eX8é um resíduo de lisina ou do glutamaíu.

Em uma outra incorporação, a cadeia pesada CDR2 compreende a seqüência Xi ISX2X3X4X5X6X7YYADSVKG (NO. SEQ ID: 249), onde XÍ é uma treonina, uma alanina, uma valina, ou um resíduo de tirosina, X2 é uma glicina, uma serina, cu um resíduo de tirosina, X3 é uma serina, uma asparagina, ou um resíduo de aspartato, X4 é um resíduo de glicina ou de serina, X5 é uma glicina, uma serina, ou um resíduo de aspartato, Xθ é uma serina, treonina, ou resíduo de asparagina, eX7é uma treonina, uma lisina, ou um resíduo de isoleucina.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compreenda uma cadeia pesada CDR3 que compreende a seqüência XIX2X3X4X5X6X7X8X9FDI (NO. SEQ do ID: 250), onde XÍ é um resíduo de glutamato ou nenhum resíduo, X2 é tirosina, glicina, ou resíduo de serina ou nenhum resíduo, X3 é um serina, asparagina, triptofano, ou resíduo de glutamato, ou nenhum resíduo, X4 é um serina, aspartato, triptofano, alanina, arginina, treonina, glutamina, leucina, ou resíduo de glutamato, ou nenhum resíduo, X5 é uma serina, uma glicina, uma asparagina, uma treonina, um triptofano, uma alanina, uma valina, ou um resíduo de isoleucina, X6 é uma arginina, glutamina, tirosina, valina, alanina, glicina, serina, fenilalanina, ou o resíduo de triptofano, X7 ? uma leucina, asparagina, aspartato, treonina, triptofano, tirosina, valina, alanina, ou um resíduo de histidina, X8 é um aspartato, uma serina, uma asparagina, ou um resíduo de glutamina, e X9é uma alanina ou um resíduo de prolina. Em uma outra incorporação, a cadeia pesada CDR3 compreende a seqüência X1X2X3X4X5X6X7X8X9X1oXiiMDV (NO. SEQ ID: 251), onde Xi é um resíduo da alanina, ou nenhum resíduo, X2 é um glutamato, tirosina, ou resíduo de glicina, ou nenhum resíduo, X3 é um resíduo de serina ou de arginina, ou nenhum resíduo, X< é um aspartato, glicina, serina, ou resíduo de valina, ou nenhum resíduo, X5é uma serina, glicina, ou resíduo de aspartato, ou nenhum resíduo, X8 é uma glicina, fenilalanina, aspartato, serina, triptofano ou resíduo de tirosina, ou nenhum resíduo, X7 é uma tirosina, um triptofano, uma serina, ou um resíduo de aspartato, ou nenhum resíduo, X8 é um aspartato, arginina, serina, glicina, tirosina, ou o resíduo de triptofano, X9 é uma tirosina, uma isoleucina, uma leucina, uma fenilalanina, ou um resíduo de lisina, X10 é uma tirosina, um fenilalanina, um aspartato, ou um resíduo de glicina, e Xn é uma glicina, uma tirosina, ou um resíduo de asparagina. Em uma outra incorporação, a cadeia pesada CDR3 compreende a seqüência Xi X2X3X4X5X6X7X8X9XIOY (NO. SEQ ID: 252), onde Xi é 5 um resíduo de aspartato ou de valina, ou nenhum resíduo, X2 é uma glicina, tirosina, arginina, ou resíduo de aspartato, ou nenhum resíduo, X3 é uma asparagina, leucina, glicina, isoleucina, serina, valina, fenilalanina ou resíduo de tirosina ou nenhum resíduo, X4 é uma leucina, serina, triptofano, alanina, tirosina, isoleucina, glicina, ou resíduo de aspartato, ou nenhum resíduo, X5 é um glicina, io alanina, tirosina, serina, aspartato ou resíduo de leucina, Xe é uma valina, uma alanina, uma glicina, uma treonina, uma prolina, uma histidina ou um resíduo de glutamina, X7 é um glutamato, uma glicina, uma serina, um aspartato, uma glicina, uma valina, um triptofano uma histidina, ou um resíduo de arginina, X8 é uma glutamina, uma alanina, uma glicina, uma tirosina, uma prolina, uma leucina, um 15 aspartato, ou um resíduo de serina, X9 é um resíduo não polar de cadeia lateral, e X10 é um resíduo de aspartato ou de alanina. Em uma outra incorporação, a cadeia pesada de CDR3 compreende a seqüência X^XsX^sXeX^eXgXioYFDXn (NO. SEQ ID: 253), onde XT é um resíduo de glicina, ou nenhum resíduo, X2 é um resíduo de prolina ou nenhum resíduo, X3 é um resíduo de arginina ou de io aspartato, ou nenhum resíduo, X4 é um resíduo de histidina ou de prolina, X5 é um resíduo de arginina ou de glicina, X6 é uma arginina, uma serina, ou um resíduo de fenilalanina, X7 é um resíduo de aspartato ou de serina, X8 é uma glicina, um triptofano, ou um resíduo de tirosina, X9 é um resíduo de tirosina ou de alanina, X10 é um resíduo de asparagina ou de triptofano, eoXn é um resíduo de asparagina 25 ou de leucina. Em uma outra incorporação, a cadeia pesada CDR3 compreende a seqüência X1X2X3X4DSSX5X6X7X8XgX1oX11X12 (NO. SEQ ID: 254), onde XT é um resíduo de fenilalanina ou nenhum resíduo, X2 é um resíduo de asparagina ou de glicina, ou nenhum resíduo, X3 é uma tirosina ou um resíduo de leucina, ou nenhum resíduo, X4 é um resíduo de tirosina ou de glicina, ou nenhum resíduo, X5 30 é uma glicina, uma serina, ou um resíduo de valina, X6 é uma tirosina, fenilalanina, triptofano, ou resíduo de glutamina, ou nenhum resíduo, X7 é uma tirosina, glicina, ou resíduo de isoleucina ou nenhum resíduo, Xe é uma tirosina, uma leucina, ou um resíduo de glicina, ou nenhum resídüo, X9 é uma metionina, uma glicina ou um resíduo de fenilalanina, ou nenhum resíduo, Xio é um resíduo de aspartato ou de metiionina, ou nenhum resíduo, Xn é uma valina, aspartato ou resíduo de tirosina, ou nenhum resíduo, e X12 é um resíduo de valina ou nenhum resíduo.

Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína isolada de ligação ao antígeno, compreendendo qualquer um de: a. uma cadeia leve CDR3 que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de cadeia leve CDR3 selecionada do grupo que consiste nas seqüências de cadeia leve CDR3 de L1-L52 como mostrado na figura 6; ii. MQALQTPZT; iii. QQ (R/S) (N/S) (S/N) ZPLT; e iv. QSYDSSNXJV; b. uma cadeia pesada CDR3 que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste de: i. uma seqüência de cadeia pesada CDR3 que difere-se por não mais do que um total de três aminoácidos adicionados, substituídos ou deletados de uma seqüência CDR3 selecionado do grupo que consiste nas seqüências de cadeia pesada CDR3 de H1-H52 como mostrado na figura 9; ii. SRLDAFDI; iii. SXYD YYGMDV; iv. HRXDXAWYFDL; e V. DSSG; ou C. a seqüência de cadeia leve CDR3 de (a) e a seqüência de cadeia pesada CDR3 de (b); onde os símbolos do resíduo do aminoácido incluído nos parênteses identificam resíduos alternativos para a mesma posição em uma seqüência, cada X é independentemente qualquer resíduo do aminoácido, cada Z é independentemente um resíduo de glicina, um resíduo de alanina, um resíduo de valina, um resíduo de leucina, um resíduo de isoleucina, um resíduo de prolina, um resíduo de fenilalanina, um resíduo de metionina, um resíduo de triptofano, ou um resíduo de cisteína, cada J é independentemente um resíduo de glutamina, um resíduo de arginina, um resíduo de valina, ou um resíduo de triptofano, e a proteína de ligação ao antígeno liga-se a IGF-1 R humano.

As seqüências do nucleotídeo da figura 1, ou as seqüências do aminoácido das figuras 2 a 9, podem ser alteradas, por exemplo, pela metagênese aleatória ou pela metagênese de local direcionado (por exemplo, metagênese de local- específico direcionado a oligonucleotídeo) para criar um polinucleotídeo alterado que compreende uma ou mais substituições, deleções ou inserções particulares do nucleotídeo em comparação ao polinucleotídeo não-mutante. Os exemplos das 5 técnicas para produzir tais alterações são descritos em Walder et ah, 1986,Gene 42: 133; Bauer et a 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et ah, 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, PlenumPress; e nas patentes americanas US4,518,584 e 4,737,462. Estes e outros métodos podem ser usados para produzir, por exemplo, os derivados dos anticorpos anti- io IGF-1 R que têm uma propriedade desejada, por exemplo, afinidade aumentada, avidez ou especificidade para IGF-1 R, aumento da atividade ou da estabilidade in vivo ou in vitro, ou redução in vivo dos efeitos laterais em comparação ao anticorpo não derivado.

Outros derivados de anticorpos anti- IGF-1R dentro do escopo desta 15 invenção incluem conjugados covalentes ou agregados de anticorpos anti-IGF-1R, ou fragmentos destes, com outras proteínas ou polipeptidios, como através da expressão das proteínas recombinantes de fusão que compreendem os polipeptidios heterólogos fundidos ao N- terminal ou ao C-terminal de um polipeptídio do anticorpo anti IGF-1R. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser >o um polipeptídio heterólogo sinal (ou o líder), por exemplo, fator líder alfa de leveduras, ou um peptídeo, tal como, um epitopo Tag. As proteínas de ligação ao antígeno contendo proteínas de fusão podem compreender os peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou a identificação da proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, poli-His). Uma proteína de ligação ao antígeno também 25 pode ser ligada ao peptidideo Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys da BANDEIRA (DYKDDDDK) (NO. SEQ ID: 255) como descritos por Hopp e outros, Bio/Technology 6:1204, 1988, e na patente americana US5,011,912. O peptídeo FLAG é altamente antigênico e fornece um epitopo reversivelmente limitado por um anticorpo monoclonal específico (niAb), permitindo o ensaio rápido e a fácil 30 purificação da proteína recombinante expressa. Os reagentes utilizados para preparar as proteínas de fusão no qual o peptideo FLAG é fundido a um determinado polipeptidio, estão comercialmente disponíveis (Sigma, St. Louis, MO).

Os oligômeros que contêm uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno podem ser empregados como antagonistas de IGF-1 R. Os oligômeros podem estar no formato de dimeros ligados covalentemente ou ligados não covalentemente, trímeros, ou de oligômeros mais elevados. Os oligômeros que compreendem duas ou mais proteínas de ligação ao antígeno são contemplados para o uso, com por exemplo, é um homodimero. Outros oligômeros incluem o heterodimeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrâmeros, heterotetrâmeros, etc.

Uma incorporação é dirigida aos oligômeros que compreendem múltiplas proteínas de ligação ao antígeno ligado através das interações covalente ou não- covalentes entre aos fragmentos do peptideo fundido às proteínas de ligação ao 15 antígeno. Tais peptídeos podem ser ligantes do peptideo (espaçadores), ou peptídeos que têm a propriedade de promover o oligomerização. O ziper de leucina e determinados polipeptidios derivados dos anticorpos estão entre os peptídeos que podem promover a oligomerização das proteínas de ligação ao antígeno unido a este, como descrito mais detalhadamente abaixo. *J20 Em incorporações particulares, os oligômeros compreendem duas a quatro proteínas de ligação ao antígeno. As proteínas de ligação ao antígeno do oligômero podem estar em qualquer formato, tal como algum dos formatos descritos acima, por exemplo, variantes ou fragmentos. Preferivelmente, os oligômeros compreendem as proteínas de ligação ao antígeno que têm atividade 25 de ligação a IGF-1 R.

Em uma incorporação, um oligômero é preparado usando os polipeptidios derivados das imunoglobulinas. A preparação das proteínas de fusão que compreendem determinados polipeptidios heterólogos fundidos às várias partes de polipeptidios derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por 30 exemplo, por Ashkenazi e outros, 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn e outros, 1990, Nature 344:677; e Hollenbaugh e outros, 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins" (Construção de Proteína de fusão - imunoglobulinas), no Current Protocols’in Immunology, Suppl. 4, pags. 10.19.1 - 10.19.11.

Uma incorporação da presente invenção é dirigida a um dímero que compreende duas proteínas de fusão criadas fundindo um fragmento de ligação IGF- 1 R de um anticorpo anti- IGF- 1 R à região de Fc de um anticorpo. O dímero pode ser feito pela, por exemplo, inserção de uma fusão do gene que codifica a proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, expressando a fusão do o gene nas células hospedeiras transformadas com o vetor recombinante de expressão e permitindo que a proteína expressada da fusão possa ser montada como moléculas de anticorpo, pelo quais as ligações de bissulfeto da cadeia interna formam entre as frações Fc para produzir o dímero.

O termo "polipeptidio Fc” como usado aqui, inclui formas nativa e de 15 mutação dos polipeptídios derivados da região Fc de um anticorpo. Os formatos truncados de tais polipeptídios que contêm a região de dobra que promove a dimerização também são incluídos. As proteínas da fusão que compreendem frações Fc (e os oligômeros formados desta forma) oferecem a vantagem de fácil purificação pela cromatografia de afinidade sobre a proteína A ou as colunas G da . 'lo proteína.

Um polipeptidio Fc apropriado, descrito no pedido PCT WO 93/10151 (incorporado por este meio pela referência), é um polipeptidio de cadeia única que estende da região da dobra N-terminal para a C- terminal nativo da região Fc de um anticorpo humano de IgGI. Um outro polipeptidio Fc utilizado é a mutação de 25 Fc descrito na patente americana US 5,457,035 e por Baum e outros, 1994, EMBO J. 13:3992 - 4001. A seqüência do aminoácido desta mutação é idêntica àquela da seqüência Fc nativa apresentada em WO 93/10151, a não ser que esse aminoácido 19 seja mudado do Leu para Ala, o aminoácido 20 tenha sido mudado de Leu a Glu, e o aminoácido 22 tenha sido mudado de Gly para Ala. A mutação 30 exibe a afinidade reduzida para os receptores Fc.

Em outras incorporações, a parte variável das cadeias pesadas e/ou cadeias leves do anticorpo anti- IGF-1R pode ser substituída pela parte variável de z cadeia pesada e/ou leve do anticorpo.

Alternativamente, o oligômero é uma proteína de fusão que compreende 5 múltiplas proteínas de ligação ao antígeno, com ou sem ligantes de peptídeo (espaçador de peptídico). Entre o peptídeo apropriado para os ligantes são aqueles descritos nas patentes americanas US 4,751,180 e 4,935,233.

Um outro método para preparar proteínas oligoméricas de ligação ao antígeno envolve o uso de um zíper de leucina. Os domínios ziper da leucina são o peptídeos que promovem a oligomerização das proteínas em que são encontrados. Os zíperes de leucina foram identificados originalmente em diversas proteínas de ligação ao DNA (Landschulz e outros, 1988, Science 240:1759), e têm sido encontrados desde então em uma variedade de proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos estão os peptídeos e os derivados naturais 15 deste que dimerizam ou trimerizam. Os exemplos dos domínios zíper de leucina apropriados para produzir proteínas oligoméricas solúveis são descritos na aplicação de PCT WO 94/10308 e o ziper de leucina derivado da proteína D surfactante do pulmão (SPD) descrita em Hoppe e outros, 1994, FEBS Letters 344:191, incorporado por esta referência. O uso de um zíper de leucina modificado o qual permita a trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida a este é descrito em Fanslow e outros. , 1994, Semin. Immunol. 6:267 - 78. Em uma aproximação, as proteínas de fusão recombinante que compreendem um fragmento do anticorpo anti-IGF-1R ou o derivado fundido a um peptídeo do zíper de leucina são expressos em células hospedeiras apropriadas e os fragmentos 25 derivados de anticorpos anti-IGF-1R oligoméricos solúveis que se formam são recuperados do sobrenadante da cultura.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece as proteínas de ligação ao antígeno que interferem na ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a um IGF-1 R. Tais proteínas de ligação ao antígeno podem ser feitas de encontro a IGF-1 R, ou um 30 fragmento, uma variante ou um derivado deste, e ser selecionadas em ensaios convencionais para que a habilidade interfira na ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R. Os exemplos de ensaios apropriados são os protocolos que testam as : proteínas de ligação ao antígeno para a habilidade de inibir a ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 às células que expressam IGF-1 R, ou que testam proteínas de 5 ligação do antígeno para a habilidade de reduzir uma resposta biológica ou celular que resulta da ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 aos receptores de superfície IGF-1n da célula.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que obstrua a ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R, mas não 1 obstrui significativamente a ligação da insulina ao receptor de insulina (INS-R). Em uma incorporação, a proteína de ligação ao antígeno não liga-se a INS-R. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se ao INS-R com uma afinidade tão baixa que não obstrui eficazmente a ligação da insulina a INS-R. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se a INS-R, mas a 15 proteína de ligação ao antígeno ligada ao INS-R pode ainda ligar-se a insulina. Em uma outra incorporação, a seletividade da proteína de ligação ao antígeno para IGF-1 R é pelo menos 50 vezes maior do que sua seletividade para o receptor de insulina. Em uma outra incorporação, a seletividade da proteína de ligação ao antígeno é 100 vezes maior do que sua seletividade para o receptor de insulina.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece proteína de ligação ?o antígeno que demonstre a seletividade da espécie. Em uma incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se a um ou mais IGF-1R de mamíferos, por exemplo, a IGF-1 R humano e um ou mais IGF-1R do rato, camundongo, cobaia, hamster, gerbil, gato, coelho, cão, cabra, carneiros, vaca, cavalo, camelo e IGF-1 R 25 de primata não humano. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se a um ou mais IGF-1R de primata, por exemplo, a IGF-1 R humano e um ou mais IGF-1R de cynomologous, marmoset (tipo de macaco), macaco rhesus, e IGF-1 R do chimpanzé. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se especificamente ao IGF-1R humano, de 30 cynomologous, de marmoset, de rhesus, ou de chipanzé. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno não liga-se a uma ou a mais IGF- 1R do rato, camundongos, cobaia, hamster, gerbil, gato, coelho, cão, cabra, ; carneiros, vaca, cavalo, camelo, e do primata não-humano. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno não liga-se a uma espécie Gu 5 macaco de mundo novo tal como um marmoset. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno não exibe a ligação específica a nenhuma proteína natural à exceção de IGF-1 R. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno não exibe a ligação específica a nenhuma proteína natural à exceção de IGF-1 R de mamíferos. Em outra incorporação, a proteína de ligação o ao antígeno não exibe a ligação especifica a nenhuma proteína natural à exceção do IGF-1 R de primata. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação so antígeno não exibe a ligação específica a nenhuma proteína natural à exceção de IGF-1 R humano. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se especificamente ao IGF-1 R de rato, camundongo, macaco cynomolgus, e 15 de humano. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga - se especificamente ao IGF-1 R de rato, camundongo, macaco cynomolgus, e de humano com uma afinidade de ligação similar. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno obstrui a ligação de IGF-1 e de IGF-2 humanes com IGF-1 R de rato, camundongos, macaco cynomolgus, e de humano. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno obstrui a ligação de IGF-1 e de IGF-2 humanos com IGF-1 R de rato; camundongos, macaco cynomolgus e de humano com K similar. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno obstrui a ligação de IGF-1 e de IGF-2 humanos com rato, camundongos, macaco cynomolgus, e de humano com um K; entre aproximadamente 0,57 e 25 aproximadamente 0,61 nM.

Uma maneira para determinar a seletividade de uma proteína de ligação ao antígeno para um IGF-1 R usa-se métodos bem conhecidos do estado da técnica e seguindo os ensinos deste relatório. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade usando o Westen Blot, FACS, ELISA ou o RIA.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno de IGF-1 R (por exemplo, um anticorpo anti-IGF-1 R), que tenha uma ou mais das seguintes características: as ligações a IGF-1 R humano e de rate , inibem a ligação de IGF-1 e de IGF-2 a IGF-1 R humano, inibem a ligação de IGF- 1 e de IGF-2 com IGF-IR de ratos, inibem preferencialmente a elevada ligação da 5 afinidade de IGF-1 e/ou IGF-2 a IGF-1 R, ligam-se ao domínio L2 de IGF-1 R, causam relativamente pouco a baixo regulamento de IGF-1 R expresso na superfície da célula após 17 horas de exposição como em comparação a MAB391 (R&D systems, Minneapolis, MN); por exemplo, uma quantidade de IGF-1 R é reduzida por menos de 20%), causa um baixo nível de regulação de IGF-17 io expresso na superfície celular em células do tumor de xenoenxertos Colo-205 ou MiaPaCa-2 nos ratos como MAB391 após quatro semanas de dosagem uma vez por semana de 200 microgramas.

Os fragmentos de ligação ao antígeno de proteínas de ligação ao antígeno da invenção podem ser produzidos por técnicas convencionais. Os exemplos de 15 tais fragmentos incluem, mas não são limitados a fragmentos Fab e F (ab')2. Os fragmentos e os derivados do anticorpo produzidos por técnicas da engenhar j genética são contemplados também.

As incorporações adicionais incluem os anticorpos quiméricos, por exemplo, versões humanizadas (por exemplo, murinos) de anticorpos monoclonal não- ?o humano. Tais anticorpos humanizados podem ser preparados por técnicas conhecidas, e oferecem a vantagem de imunogenicidade reduzida quando os anticorpos são administrados aos seres humanos. Em uma incorporação, um I anticorpo monoclonal humanizado compreende o domínio variável de um anticorr > de murino (todo ou parte do local de ligação do antígeno deste) e um domínio 25 constante derivado de um anticorpo humano. Alternativamente, um fragmento humanizado do anticorpo pode compreender o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo monoclonal de murino e de um fragmento de domínio variável (que faltam o sitio de ligação ao antígeno) derivado de um anticorpo humano. Os procedimentos para a produção de anticorpos monoclonais quiméricos e também 30 projetados incluem aqueles descritos em Riechmann et al, 1988, Nature 332:32", 627145 Liu et al, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick et al, 1989, Bio/Technology 7:934, e Winter et al, 1993, TIPS 14:139. Em uma incorporação, o anticorpo quimérico é um anticorpo CDR enxertado. Técnicas para imunização de anticorpos são discutidos, por exemplo, no pedido de patente americano US 10/194,975 (publicado me 27 de fevereiro, 2003), US 5,869,619, 5,225,539, 5,821,337, 5,859,205, Padlan et al, 1995, FASEB J. 9:133-39, e Tamura et al, 2000, J. Immunol. 164:1432-41.

Os procedimentos tem sido desenvolvidos para geração de anticorpos humanos ou anticorpos parcialmente humanos em animais não-humanos. Por 10 exemplo, ratos em que um ou os mais genes endógenos de imunoglobulina que tenha sido inativados por vários meios, foram preparados. Os genes da imunoglobulina humana foram introduzidos nos camundongos para substituir os genes inativados do rato. Os anticorpos produzidos no animal incorporam as cadeias de polipeptidio de imunoglobulinas humanas codificadas pelo materi''! 15 genético humano introduzido no animal. Em uma incorporação, um animal não- humano, tal como um rato transgênico, imunizado com um polipeptidio de IGF- IR,de forma que os anticorpos dirigidos de encontro ao polipeptidio de IGF-1 R são gerados no animal. Um exemplo de um imunogene apropriado é um IGF-1 R de ser humano solúvel, tal como um polipeptidio que compreende o domínio extracelular '0 da proteína da figura 10 ou outro fragmento imunogênico da proteína da figura 10.

Os exemplos das técnicas para a produção e uso de animais transgênicos para n produção de anticorpos humanos ou de anticorpos parcialmente humanos são descritos nas patentes americanas US5,814,318, 5,569,825, e 5,545,806, Davis et al, 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody 25 Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200, Kellermann et al, 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al, 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al, 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al, 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-2°. Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al, 1998, J 30 Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al, 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez et al, 1997, Nat Genet. 15:14656, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al, 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al, 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al, 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al, 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. "Immunoglobulin gene rearrangement in B cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus." International Immunology 5 (1993): 647-656, Choi et al, 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al, 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding et al, 1995, Annals of the New York Academy of io Sciences, Lonberg et al, 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al, 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al, 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor et al, 1994, International Immunology 15 6: 579-91, Tomizuka et al, 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al, 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 722-27, Tuaillon et al, 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3720-24, and Tuaillon et al, 1994, Journal of Immunology 152: 2912-20.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece os anticorpos '0 monoclonais que ligam-se a IGF-1 R. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando qualquer técnica conhecida do estado da técnica, por exemplo, imortalizando as células do baço colhidas do animal transgênico após a conclusão da programação de imunização. As células do baço podem ser imortalizadas usando qualquer técnica conhecida do estado da técnica, por exemplo, fundindo 25 com células do mieloma para produzir hibridomas. As células de Mieloma para o uso em procedimentos de produção de hibridoma pela fusão preferivelmente pc<d produção de não-anticorpos, têm a eficiência de fusão elevada e as deficiências da enzima que rendem a eles a incapacidade de crescimento em determinados meios seletivos que suportam o crescimento somente das células fundidas 30 desejadas (hibridomas). Os exemplos de linhagem de células apropriadas para o uso em fusões do rato incluem Sp-20, P3-X63/Ag8, P3- X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; os exemplos das linhas da pilha usadas em fusões do rato incluem R210.RCY3, Yó- Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens de célula úteis para fusões celulares são U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6.

Em uma incorporação, uma linha de célula de hibridoma é produzida imunizando um animal (por exemplo, um animal transgênico que tem seqüências da imunoglobulina humana) com um imunogene de IGF-1 R; colhendo células do baço do animal imunizado; fundindo as células colhidas do baço a uma linhagem celular do mieloma, desse modo gerando células de hibridoma; estabelecendo uma linhagem celular do hibridoma de células do hibridoma, e identificando uma linhagem celular do hibridoma que produza um anticorpo que se ligue ao polipeptídio de IGF-1 R. Tais linhas de células do hibridoma e anticorpos monoclonais anti-IGF-1R produziram por elas, são abrangidas pela presente invenção.

Os anticorpos monoclonais secretados por uma linhagem de celular do hibridoma podem ser purificados usando qualquer técnica conhecida do estado ua técnica. Os hibridomas ou os mAbs podem também ser selecionados para identificar mAbs com propriedades particulares, tais como a habilidade de obstruir um IGF-1 e/ou uma atividade induzida IGF-2. Os exemplos de tais purificações são fornecidos nos exemplos abaixo.

A evolução molecular das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) no centro do sítio de ligação ao anticorpo também foi usada para isolar anticorpos com afinidade aumentada, por exemplo, anticorpos que aumentam a afinidade para c-erbB-2, como descrita por Schier et ah, 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Dessa forma, tais técnicas são úteis na preparação dos anticorpos para IGF-1R.

As proteínas de ligação ao antígeno dirigidas contra um IGF-1 R podem ser usadas, por exemplo, nos ensaios para detectar a presença de polipeptidios de IGF-1 R, in vitro ou in vivo. As proteínas de ligação ao antígeno também podem ser empregadas na purificação de proteínas de IGF-1 R pela cromatografia de imunoafinidade. Aquelas proteínas de ligação ao antígeno que adicionalmente podem obstruir a ligação de IGF- 1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R podem ser usadas para inibir uma atividade biológica se resultante de tal ligação. As proteínas 5 bloqueadoras de ligação ao antígeno podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Tais proteínas de ligação ao antígeno que funcionam como antagonistas IGF-1 e/ou IGF-2 podem ser empregadas no tratamento de qualquer condição induzida por IGF-1 e/ou por IGF-2, incluindo, mas não limitadas ao câncer. Em uma incorporação, um anticorpo monoclonal de ser humano anti-IGF-1R gerado 10 pelos procedimentos que envolvem a imunização de ratos transgênicos é empregado no tratamento de tais condições.

As proteínas de ligação ao antígeno podem ser empregadas em um procedimento in vitro ou in vivo administrado de forma a inibir uma atividade biológica de indução de IGF-1 e/ou de IGF-2. As doenças causadas ou 15 exacerbadas (diretamente ou indiretamente) pela interação de IGF-1 e/ou de IGF-2 com a superfície da célula IGF-1 R, os exemplos que são fornecidos acima, podem assim ser tratados. Em uma incorporação, a presente invenção fornece um método terapêutico que compreende a administração in vivo de um antígeno de obstrução de IGF-1 e/ou de um IGF-2 ligando a proteína a um mamífero caso '0 necessário em uma quantidade eficaz para reduzir a atividade biológica induzida de IGF-1 e/ou de IGF-2.

As proteínas de ligação ao antígeno da invenção incluem um anticorpo monoclonal inteiramente humano ou parcialmente humano que inibem uma atividade biológica de IGF-1 e inibem também uma atividade biológica de IGF-2.

Uma incorporação é dirigida a um anticorpo monoclonal humano que obstrua pelo menos parcialmente a ligação de IGF-1 e de IGF-2 a uma célula que expresse IGF-1 R humano. Em uma incorporação, os anticorpos são gerados imunizando um rato transgênico com um imunogene de IGF-1 R. Em uma outra incorporação, o imunogene é um polipeptidio humano de IGF-1 R (por exemplo, um fragmento solúvel que compreende todo ou parte do domínio extracelular IGF-1 R). As linhagens celulares derivadas de Hibridoma de tais ratos imunizados, onde o hibridoma secreta um anticorpo monoclonal que liga-se a IGF-1 R, são também fornecidas aqui.

Embora os anticorpos humanos, parcialmente humanos ou humanizados sejam apropriados para muitas aplicações, particularmente aqueles que envolvem a administração do anticorpo a um paciente humano, outros tipos de proteínas ue ligação ao antígeno poderão apropriados para determinadas aplicações. Os anticorpos não-humanos da invenção podem, por exemplo, ser derivados de qualquer animal que produza anticorpos, tal como o rato, camundongo, o coelho, a cabra, o asno, ou o primata não-humano (tal como o macaco (por exemplo, cynomologous ou rhesus) ou outro tipo macaco (por exemplo, chimpanzé)). Os anticorpos não-humanos da invenção podem ser usados, por exemplo, in vitro e as aplicações baseadas na cultura celular, ou qualquer outra aplicação onde uri.a resposta imune ao anticorpo da invenção não ocorre, são insignificantes, podem ser impedidas, não são de nenhum interesse, nem são desejadas. Em uma incorporação, um anticorpo não-humano da invenção é administrado a um paciente não-humano. Em uma outra incorporação, o anticorpo não-humano não produz uma resposta imune no paciente não-humano. Em uma outra incorporação, o anticorpo não-humano é da mesma espécie que o paciente não- humano, por exemplo, um anticorpo do rato da invenção é administrado a um ratv. Um anticorpo de uma espécie particular pode ser feito, por exemplo, imunizando um animal daquela espécie com o imunogene desejado (por exemplo, um polipeptidio solúvel IGF-1 R) ou usando um sistema artificial para gerar anticorpos daquela espécie (por exemplo, um sistema bacteriano ou um sistema baseado em fago para gerar anticorpos de uma espécie particular), ou convertendo um anticorpo de uma espécie em um anticorpo de uma outra espécie substituindo, por exemplo, a região constante do anticorpo em uma região constante da out. a espécie, ou substituindo um ou mais resíduos do aminoácido do anticorpo de modo que se assemelhe mais à seqüência de um anticorpo da outra espécie. Em uma incorporação, o anticorpo é um anticorpo quimérico que compreende as seqüências do aminoácido derivadas dos anticorpos de duas ou mais espécies diferentes.

As proteínas de ligação ao antígeno podem ser preparadas por um grande número de técnicas convencionais. Por exemplo, podem ser purificadas das 5 células que naturalmente expressam etas (por exemplo, um anticorpo pode ser purificado de um hibridoma que o produz), ou produzido sistemas de expressão recombinantes, usando alguma técnica conhecida do estado da técnica. Ver, por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); e Antibodies: A io Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Qualquer sistema de expressão conhecido do estado da técnica pode ser usado para a produção de polipeptidios recombinantes da invenção. Em geral, as células hospedeiras são transformadas em um vetor de expressão recombinantes 15 que compreende o DNA que codifica um polipeptidio desejado. Entre as células hospedeiras que podem ser empregadas estão as células procarióticas, fungos ou determinadas células eucarióticas mais elevadas. Os procariotos incluem os organismos gran-negativos ou gran-positivos, por exemplo E. coli ou Bacilos, AS células eucarióticas mais elevadas incluem células do inseto e linhagens 9 estabelecidas da célula de origem mamífera. Os exemplos de linhagens mamíferas apropriadas de célula hospedeira incluem a linhagem celular COS-7 células renais do macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al, 1981, Cell 23:175), L células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células do ovário do hamister chinês (CHO), células HeLa, linhagem celular BHK (ATCC CRL 25 10) nes, e linhagem celular derivada da linhagem de célula de macaco veroe africano CVI/EBNA CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et ah, 1991, EMBO J. 10: 2821. Os vetores de clonagem e de expressão apropriados para o uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de leveduras, e de mamíferos são descritos por Pouwels e outros. (Cloning Vectors: A Laboratory 30 Manual, Elsevier, New York, 1985).

As células transformadas podem ser cultivadas sob as condições que promovem a expressão do polipeptídio, e do polipeptídio recuperado por procedimentos convencionais de purificação da proteína. Tal procedimento de purificação inclui o uso de cromatografia de afinidade, por exemplo, sobre uma 5 matriz que tem toda ou uma parte (por exemplo, domínio extracelular) de IGF-IR ligado a ela. Os polipeptidios contemplados para o uso aqui incluem substancialmente polipeptidios de anticorpos anti-IGF-1R de mamíferos recombinantes homogêneos, substancialmente livres de contaminação de materiais endógenos.

As proteínas de ligação ao antígeno podem ser preparadas, e selecionadas para propriedades desejadas, por grande número de técnicas conhecidas. Determinadas técnicas envolvem isolar um ácido nucléico que codifica uma cadeia de polipeptídio (ou porção desta) de uma proteína de ligação ao antígeno de interesse (por exemplo, um anticorpo anti-IGF-1R), e manipular o ácido nucléico 15 com a tecnologia de DNA recombinante. O ácido nucléico pode ser fundido a um outro ácido nucléico de interesse, ou pode ser alterado (por exemplo, pela metagênese ou por outras técnicas convencionais) para adicionar, suprimir, ou substituir um ou mais resíduos de aminoácido, por exemplo.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece fragmentos de ligação a o antígenos de um anticorpo anti-IGF-1R da invenção. Tais fragmentos podem consistir inteiramente de seqüências derivadas de anticorpos ou podem compreender seqüências adicionais. Os exemplos de fragmentos de ligação a antígenos incluem Fab, F(ab')2 . os anticorpos de cadeia simples, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, e domínios de anticorpos. Outros exemplos são fornecidos 25 por Lunde e outros, 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500 - 06.

Os anticorpos de cadeia única podem ser formados ligando fragmentos de domínios variáveis de cadeia pesada e claros (região Fv) através de uma ponte do aminoácido (linker curto de peptidio), tendo por resultado uma única cadeia do polipeptídio. Tal cadeia única Fvs (scFvs) foi preparada fundindo o DNA que 30 codifica um linker do peptídeo entre DNAs que codifica os dois polipeptidios de dominio variáveis (VL e VH). Os polipeptídios resultantes podem dobrar-se para trás para formar monômeros de ligaçãó a antígenos ou podem formar polímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, ou tetrâmeros), dependendo do comprimento de um linker flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt e outros, 1997, Prot. Inglês. 10:423; Kortt e outros, 2001, Biomol. Inglês. 18:95 - 108). Pela diferente combinação de VL e VH que compreendem polipeptídios, um pode formar os scFvs multiméricos que ligam-se aos diferentes epitopos (Kriangkum e outros, 2001, Biomol. Inglês. 18:31 - 40). As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas na patente americana US4,946,778; Bird, io 1988, Science 242:423; Huston et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879; Ward et al, 1989, Nature 334:544, de Graaf et al, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Os anticorpos de cadeia única derivaram-se dos anticorpos fornecidos neste e incluem, mas não são limitados a, scFvs que compreendem as combinações de domínios variáveis L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H/', 15 L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H5O, L51H51, e o L52H52) são abrangidos pela presente invenção.

As proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, e derivados de anticorpos) da invenção podem compreender qualquer região constante conhecida do estado da técnica. A região constante de cadeia leve pode ser, por exemplo, uma região constante de cadeia leve do tipo 25 kappa ou lambda , por exemplo, região constante de cadeia leve do tipo kappa ou um lambda humano. A região constante de cadeia pesada pode ser, por exemplo, uma região de cadeia pesada do tipo alfa, delta, epsilon, gama, por exemplo, região de cadeia pesada do tipo alfa, delta, epsilon ou gama humano.

Em uma incorporação, a região constante de cadeia leve ou pesada é um 30 fragmento, um derivado, uma variante, ou uma mutação de uma região constante natural. As técnicas são conhecidas para derivar um anticorpo de uma subclasse ou de um isotipo diferente de um anticorpo de interesse, isto é, subclasse. Assim, os anticorpos de IgG podem ser derivados de um anticorpo de IgM, por exemplo, e vice-versa. Tais técnicas permitem a preparação dos novos anticorpos que 5 possuem as propriedades de ligação- ao antígeno de um dado anticorpo <o anticorpo parenteral), mas exibem também as propriedades biológicas associadas a um isotipo ou uma subclasse do anticorpo diferente daquele do anticorpo parenteral. As técnicas de DNA Recombinante podem ser empregadas. O DNA clonado que codifica polipeptidios particulares do anticorpo pode ser empregado 10 em tais procedimentos, por exemplo, DNA que codifica o domínio constante de um anticorpo do isotipo desejado. Ver também Lantto et ah, 2002, métodos Mol. Biol.178: 303-16.

Em uma incorporação, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção compreende o domínio de cadeia pesada de IgGI da figura 13 ou um fragmento do 15 domínio de cadeia pesado de IgGI da figura 13. Em uma outra incorporação, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção compreende a região de cadeia constante da cadeia leve kappa da figura 13 ou um fragmento da região constante da cadeia leve do kappa da figura 13. Em uma outra incorporação, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção compreende o domínio de cadeia pesada oe o IgGI, ou um fragmento deste, da figura 13 e o domínio de cadeia leve do kappa, ou um fragmento deste, da figura 13.

Dessa forma, as proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção incluem aquelas que compreendem, por exemplo, as combinações de domínios variáveis L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, 25 L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H23, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51, e L52H52, tendo um isotipo desejado 30 (por exemplo, IgA, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgE, e IgD) bem como fragmentos

Fab ou F (ab')2 deste. Além disso, se um lgG4 for desejado, pode-se também desejar introduzir um ponto de mutação (CPSCP - > CPPCP) na região da dobra como descrito em Flores e outros, 1997, ciência 6:407 da proteína, (incorporado por esta referência) para aliviar a tendência de formar ligações de cadeia bissulfeto de intra-H que podem conduzir para a heterogeneicidade nos anticorpos lgG4.

Além disso, as técnicas para derivar as proteínas de ligação ao antígeno que têm propriedades diferentes (isto é, variando as afinidades para o antígeno a que se ligam) são conhecidas também. Tal técnica, referida como um embaralhamento de cadeia, envolve indicar repertórios variáveis do gene do domínio da imunoglobulina na superfície do bacteriófago filamentoso, referida freqüentemente como fago de exposição. O embaralhamento de cadeia foi usado para preparar anticorpo de elevada afinidade ao hapteno-2 feniloxazol-5-ona, como descritos por Mark et ah, 1992, biotecnologia, 10:779.

Em incorporações particulares, as proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção têm uma afinidade de ligação (Ka) para IGF-1 R de pelo menos 106, medido como descrito nos exemplos. Em outras incorporações, as proteínas de ligação ao antígeno exibem um Ka de pelo menos 107, 108, 109, ou de pelo menos 1O10. • .

Em uma outra incorporação, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que possui uma taxa baixa de dissociação de IGF-1 R. Em uma incorporação, a proteína de ligação ao antígeno tem um Kotf de 1x10’4 s’1 ou abaixo. Em uma outra incorporação, o Koff é 5x10‘5 s'1 ou mais baixo. Em uma outra incorporação, o Kotf é substancialmente o mesmo que um anticorpo que possui uma combinação de cadeia leve e de seqüências de domínio variável de cadeia pesada selecionadas do grupo de combinações que consistem em L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51, e L52H52. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se a IGF-1 R com substancialmente o mesmo KOft que urn anticorpo que compreende um ou mais CDRs de um anticorpo que possui uma combinação de seqüências de domínios variáveis de cadeias leves e pesadas 5 selecionadas do grupo de combinações que consistem em L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, '0 L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51, e L52H52. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se a IGF-1 R com substancialmente o mesmo KOft que um anticorpo que compreende uma das seqüências dos aminoácidos ilustradas nas figuras 2 a 9. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno liga-se a IGF-1 R 15 com substancialmente o mesmo KOft que um anticorpo que compreende um ou mais CDRs de um anticorpo que compreende uma das seqüências do aminoácido ilustradas nas figuras 2 a 9.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que liga-se ao domínio L2 de IGF-1 R humano. As proteínas de ligação 1 ao antígeno que ligam-se ao domínio L2 podem ser feitas usando qualquer técnica conhecida do estado da técnica. Por exemplo, tais proteínas de ligação ao antígeno podem ser isoladas usando o polipeptidio completo de IGF-1 R (por exemplo, na preparação de uma membrana de ligação), um fragmento extracelular solúvel do domínio de IGF-1 R (um exemplo é fornecido no exemplo 1), ou um 25 fragmento menor de domínio extracelular de IGF-1 R que compreende ou que consiste no domínio L2 (os exemplos são fornecidos no exemplo 10). As proteínas de ligação ao antígeno assim que isoladas podem ser selecionadas para determinar sua especificidade de ligação usando qualquer método conhecido do estado da técnica (um exemplo é fornecido no exemplo 10).

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que liga-se a IGF-1 R humano expresso na superfície de uma célula e, quando assim limitado, inibe IGF-1 R que sinaliza a atividade na célula sem causar nenhuma redução significativa na quantidade de IGF-1 R na superfície da célula. Qualquer método para determinar ou estimar a quantidade de IGF-1 R na 5 superfície e/ou no interior da célula pode ser usado. Em uma incorporação, a presente invenção fornece uma proteína ligação ao antígeno que liga-se ao domínio L2 de um IGF-1 R humano expresso na superfície de uma célula e, quando limitado assim, inibe IGF-1 R que sinaliza a atividade na célula sem significativamente aumentar a taxa de incorporação do IGF-1 R da superfície da io célula. Em outras incorporações, a proteína de ligação ao antígeno causa a expressão de IGF-1 R menor que aproximadamente 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, ou 0,1% da célula da superfície celular internalizada do IGF- IR. Em um outro aspecto, a proteína ligação ao antígeno à célula expressando IGF-1 R causa uma redução gradual na quantidade de IGF-1 R na superfície da 15 célula de forma que dentro de algumas horas de contato a célula com a proteína ligação ao antígeno, quase nenhuma diminuição na superfície IGF-IR da célula é detectada, mas, após diversos dias ou semanas de exposição da célula à proteina de ligação ao antígeno, uma diminuição marcada na superfície IGF-1 R da célula é detectada.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno que tem uma meia-vida, pelo menos in vitro ou in vivo (por exemplo, quando administrado a um paciente humano). Em uma incorporação, a proteina de ligação ao antígeno tem uma meia-vida de pelo menos três dias. Em uma outra incorporação, a proteína de ligação ao antígeno tem uma meia-vida de quatro dias 25 ou mais por muito tempo. Em uma outra incorporação, a proteína ligação ao antígeno tem uma meia-vida de oito dias ou mais por muito tempo. Em uma outra incorporação, a proteína ligação ao antígeno é derivada ou modificada de forma que tenha uma meia-vida mais longa em comparação a proteina não derivada ou a proteína ligação ao antígeno não modificada. Em uma outra incorporação, a 30 proteína de ligação ao antígeno contêm um ou mais pontos de mutações para aumentar a meia vida no soro, tal como descrito no WO 00/09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000, incorporado por esta referência.

A presente invenção também fornece as proteínas de ligação ao antigen? multi-específico, por exemplo, proteína ligação ao antígeno bi-específica, por 5 exemplo, proteína ligação ao antígeno que liga-se a dois epitopos diferentes de IGF- 1R, ou a um epitopo de IGF-1 R e a um epitopo de uma outra molécula, através de dois sítios de ligação ou de regiões do antígeno diferentes. Além disso, a proteína ligação ao antígeno bi-específica como divulgada aqui, pode compreender um sítio de ligação de IGF-1 R de um dos anticorpos descrito aqui e '0 uma segunda região de ligação de IGF-1 R de outros anticorpos descritos aqH, incluindo aqueles descritos aqui pela referência a outras publicações. Alternativamente, uma proteína de ligação ao antígeno bi-específica pode compreender um sítio de ligação ao antígeno de um dos anticorpos aqui descritos e um local de ligação ao segundo antígeno de um outro anticorpo de IGF-1 R que 15 seja conhecido do estado da técnica, ou de um anticorpo que seja preparado por métodos conhecidos ou por métodos descritos aqui.

Os numerosos métodos de preparação de anticorpos bi-específicos sãn conhecidos do estado da técnica, e discutidos no pedido de patente americano 09/839.632 depositado em 20 de abril de 2001 (incorporado por esta referência). ? Tais métodos incluem o uso do hibridoma híbrido como descrito por Milstein et ah, 1983, Nature 305:537, e outra (patentes americanas US4,474,893; US6,106,833), e acoplamento químico de fragmentos de anticorpos (Brennan et a/., 1985, Science 229:81; Glennie et a/, 1987, J. Immunol. 139:2367; patente americana US6,010,902). Além disso, os anticorpos bi-específicos podem ser produzidm 25 através de meios recombinantes, por exemplo usando frações do zíper de leucina (i.e., á partir de “Fos and Jun proteins, which preferentially form heterodimers”; Kostelny et ah, 1992, J. Immnol. 148:1547) ou outras estruturas de domínio interativas “trave e chave" como descritas na patente americana US5,582,996. As técnicas úteis adicionais incluem aquelas descritas em Kortt et ah, 1997, supra; Patente US5,959,083; e na patente US5,807,706.

Em um outro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno da present invenção compreende um derivado de um anticorpo. O anticorpo derivado pode compreender qualquer molécula ou substância que transmitem uma propriedade desejada ao anticorpo, assim como aumentam a meia vida em uso particular. O 5 anticorpo derivado pode compreender, um meio detectável (ou marcado), (por exemplo, uma molécula antigênica, enzimática, radioativa ou colorimétrica, uma partícula detectável (tal como uma partícula magnética ou eletrodensa (por exemplo, ouro)), ou uma molécula que se ligue a uma outra molécula (prr exemplo, biotina ou o estreptavidina)), um meio diagnóstico ou terapêutico (por ’0 exemplo, um meio radioativo, citotóxico, ou farmaceuticamente ativo), ou uma molécula que aumente a adequação do anticorpo para uso particular (por exemplo, administração a um paciente, tal como um paciente humano, ou outro uso in vivo ou in vitro). Os exemplos das moléculas que podem ser usadas de um anticorpo derivado incluem a albumina (por exemplo, albumina do soro humana) e o 15 polietileno glicol (PEG). Os derivativos de anticorpos ligados a albumina n derivativos de PEG podem ser preparados usando técnicas bem conhecida do estado da técnica. Em uma incorporação, o anticorpo conjugado pode ser tanto ligado de outra maneira ao transtirretina (TTR) ou a um variante de TTR. O variante de TTR ou de TTR pode ser quimicamente modificado com, por exemplo, o um produto químico selecionado do dextran consistindo do grupo poli (piurrolidona n-vinil), polietileno glicóis, homopolímeros propropileno glicoís, co-polímeros do óxido de polipropilene/óxido de etileno, polioxietilatado polióis e álcoois polivini0. Pedido de patente americano US 2003/0,195,154.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para selecionar 25 uma molécula que se liga a IGF-1 R usando as proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção. Qualquer técnica apropriada de seleção pode ser usada. Em uma incorporação, uma molécula de IGF-1 R, ou um fragmento deste a qual uma proteína de ligação ao antígeno da presente invenção se liga, é contatada com a proteina de ligação ao antígeno da invenção e com uma outra molécula, onde n 30 outra molécula liga-se a IGF-1 R se esta reduzir a proteína de ligação ao antígeno a IGF-IR. A proteína de ligação ao antígeno pode ser detectada usando qualquer método apropriado, por exemplo, ELISA. A detecção da proteína de ligação ao antígeno a IGF-1 R pode detectavelmente ser simplificada marcando a proteína de ligação ao antígeno, como discutido acima. Em uma outra incorporação, a 5 molécula de ligação ao IGF-1 R é analisada também para determinar se esta inibe os mediadores de sinalização IGF-1 R, IGF-1, e/ou IGF-2.

Ácidos Nucléicos

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas isoladas de ácido nucléico. Os ácidos nucléicos compreendem, por exemplo, os '0 polinucleotídeos que codificam toda ou parte de uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, uma ou ambas cadeias de um anticorpo da invenção, ou um fragmento, um derivado, uma mutação, ou um variante deste, os polinucleotídeos suficientes para o uso como sondas de hibridização, primers de PCR ou primers de seqüência para identificar, analisar, mutar ou amplificar um 15 polinucleotídeo que codifica um polipeptidio, ácidos nucléicos anti-senso para a inibição da expressão de um polinucleotídeo e seqüências complementares do antecedente. Os ácidos nucléicos podem ser de qualquer comprimento. Podem ser, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ou mais 0 nucleotídeos no comprimento, e/ou podem compreender uma ou mais seqüências adicionais, por exemplo, seqüências regulatórias, e/ou fazer parte de um ácido nucléico maior, por exemplo, um vetor. Os ácidos nucléicos podem de fita simples ou fita dupla e podem compreender RNA e/ou DNA, e variantes artificiais deste nucleotídeos (por exemplo, ácidos nucléicos do peptídeo).

Os ácidos nucléicos que codificam polipeptídios do anticorpo (por exemplo, cadeia pesada ou leve, somente domínio variável ou comprimento total) podem ser isolados das células B dos ratos que foram imunizados com IGF-1 R. O ácido nucléico pode ser isolado por procedimentos convencionais tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR).

A Figura 1 fornece as seqüências do ácido nucléico que codificam as regiões variáveis das cadeias pesadas e regiões variáveis de cadeia leve mostradas nas figuras 2 e 3. O profissional especializado no assunto compreenderá que, devido a degeneração do código genético, cada uma das seqüências do polipeptidio nas figuras 2 a 9 são codificadas também por um 5 grande número de outras seqüências do ácido nucléico. A presente invenção fornece cada seqüência degenerativa do nucleotídeo que codifica cada proteína de ligação ao antígeno da invenção.

A presente invenção também fornece os ácidos nucléicos que hibridizam-se a outros ácidos nucléicos (por exemplo, ácidos nucléicos que compreendem uma ■o seqüência do nucleotídeo da figura 1) sob condiçõess particulares de hibridização. Os métodos para hibridização dos ácidos nucléicos são bem conhecidos do estado da técnica. Ver, por exemplo, protocolos atuais na biologia Molecular, no John Wiley & Soons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como aqui definida, uma condição estrita mente moderada de hibridização usa uma solução pré-lavagem que contêm 15 cloreto de sódio 5Xcitrato de sódio (SSC), 0.5% SDS, 1.0 ml de EDTA (pH 8.0), tampão de hibridização formamida de aproximadamente 50%, 6X SSC, e uma temperatura de hibridização à 55° C (ou. outras soluções similares de hibridização, tais como uma a que contêm a formamida de aproximadamente 50%, com uma temperatura de hibridização à 42° C), e condições de lavagem à 60° C, em 0.5X ) SSC, 0.1% SDS. Uma condição estrita de hibridização hibridiza em 6X SSC à 45° C, seguido por uma ou mais lavagens de 0,1X SSC, 0,2% SDS à 68° C. Além disso, uma pessoa habilitada no assunto pode manipular as condições de hibridização e/ou de lavagem para aumentar ou diminuir a estringência da hibridização de forma que os ácidos nucléicos que compreendem as seqüências 25 do nucleotídeo que são pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou o 99% idênticos entre si, permanecem tipicamente hibridizados entre si. Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições e de orientação da hibridização para planejar condições apropriadas são determinados, por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring 30 Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., capítulos 9 e11; e Current

Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4), e podem prontamente ser determinados por um técnico especializado no assunto baseada sobre, por exemplo, no comprimento e/ou na composição da base do DNA.

As mudanças podem ser introduzidas através da mutação de um ácido nucléico, conduzindo desse modo à mudanças na seqüência do aminoácido de um polipeptídio (por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno) que este codifica. As mutações podem ser introduzidas usando qualquer técnica conhecida do estado da técnica. Em uma incorporação, um ou mais resíduos particulares do •o aminoácido é trocado usando, por exemplo, um protocolo sítio-dirigido a metagênese. Em uma outra incorporação, um ou mais resíduos aleatoriamente selecionados é trocado usando, por exemplo, um protocolo aleatório de metagênese. Porém é feito, um polipeptídio mutante que pode ser expresso e selecionado para uma propriedade desejada (por exemplo, ligar-se a IGF-1 R ou 15 obstruir a ligação de IGF-1 e/ou de IGF-2 a IGF-1 R).

As mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipeptídio que este codifique. Por exemplo, um pode produzir as substituições do nucleotídeo que conduzem às substituições do aminoácido em resíduos de aminoácido não essencial. Em uma ) incorporação, uma seqüência do nucleotídeo fornecida na figura 1, ou um fragmento, uma variante, ou um derivado desejado deste, são mutáveis de forma que codifique uma seqüência do aminoácido que compreende uma ou mais deleções ou substituições dos resíduos de aminoácidos que são mostrados nas figuras 2 a 9 que são resíduos onde duas ou mais seqüências diferem. Em uma 25 outra incorporação, a metagênese introduz um aminoácido junto a um ou mais resíduos de aminoácidos mostrado nas figuras 2 a 9 que são resíduos onde duas ou os mais seqüências diferem. Alternativamente, uma ou mais mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico que mudam seletivamente a atividade biológica (por exemplo, ligação e/ou inibição de IGF-1 R, IGF-1, IGF-2 etc.) de um 30 polipeptídio que este codifique. Por exèmplo, a mutação pode quantitativamente ou qualitativamente mudar a atividade biológica. Os exemplos de mudanças quantitativas incluem o aumento, redução ou eliminação da atividade. Os exemplos de mudanças qualitativas incluem a mudança da especificidade do antígeno de uma proteína de ligação ao antígeno.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas do ácido nucléico que são apropriadas para o uso como primers ou sonda de hibridização para a detecção de seqüências do ácido nucléico da invenção. Uma molécula do ácido nucléico da invenção pode compreender somente uma parte de uma seqüência do ácido nucléico que codifica um polipeptidio inteiro da invenção, por ’o exemplo, um fragmento que possa ser usado como uma sonda, um primer ou um fragmento que codifica uma parte ativa (por exemplo, uma parte de ligação de IGF-1 R) de um polipeptidio da invenção.

As sondas baseadas na seqüência de um ácido nucléico da invenção podem ser usadas para detectar o ácido nucléico ou os ácidos nucléicos similares, 15 por exemplo, transcrições que codificam um polipeptidio da invenção. A sonda pode compreender um grupo de marcadores, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um fator de co-enzima. Tais sondas podem ser usadas para identificar uma célula que expresse o polipeptidio.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece vetores que ) compreendem um ácido nucléico que codifica um polipeptidio da invenção ou parte deste. Os exemplos dos vetores incluem, mas não são limitados a, plasmidios, vetores virai, vetores de mamíferos não-episomais e vetores de expressão, por exemplo, vetores de expressão recombinantes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem compreender 25 um ácido nucléico da invenção em um formato apropriado para a expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras para ser usadas para a expressão, que são ligadas operativamente à seqüência do ácido nucléico a ser expressa. As seqüências regulatórias incluem 30 aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma seqüência do nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras (por exemplo, promoter gene enhancer SV40, do promoter do sarcoma vírus Rous e promoter do cytomegalovirus), aqueles de expressão direta da seqüência do nucleotídeo somente em determinadas células hospedeiras (por exemplo, tissue-specific regulatory sequences, in Voss et al, 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis etal., 1987, Science 236:1237, incorporado por esta referência em suas totalidade), e naquelas que dirigem a expressão induzidas de uma seqüência do nucleotídeo em resposta ao tratamento ou à condição particular- (por exemplo, promoter de metalotionina em células mamíferas e na tet-resposta e/ou promoter de resposta da estreptomicina em sistemas procarióticos e eucarióticos (ver id). Será compreendido por um técnico especializado no assunto que o projeto do vetor da expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível da expressão da proteína desejada, etc. Os vetores ae expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para produzir desse modo proteínas ou peptídeos, incluindo as proteínas de fusão ou os peptídeos, codificadas por ácidos nucléicos como descritos aqui.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece células hospedeiras em que um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (por exemplo, E. coli) ou célula eucariótica (por exemplo, fungo, inseto, ou células de mamíferos (por exempio, células CHO)). O DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas convencionais da transformação ou do transfecção. Para a transfecção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estrangeiro em seu genoma. A fim de identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, como resistência à antibióticos) é introduzido geralmente nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência às drogas, tais como G418, higromicina e metotrexato. As células transfectadas estavelmente com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas pela seleção da droga (por exemplo, as células que incorporaram o gene do marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrerão), entre outros métodos.

Indicações

Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um paciente. O método pode, por exemplo, ter um efeito geralmente saudável no paciente, por exemplo, pode aumentar a longevidade prevista ao paciente. Alternativamente, o método pode, por exemplo, tratar, impedir, curar, aliviar, ou melhorar (“tratar”) uma doença, uma desordem, uma condição, ou uma doença (“uma condição”). Entre as condições a .serem tratadas de acordo com a presente invenção estão as condições caracterizadas pela expressão ou pela atividade imprópria de IGF-1, de IGF-2, e/ou de IGF-1 R. Em algumas tais condições, o nível de expressão ou de atividade é demasiadamente elevado, e o tratamento compreende a administração de um antagonista de IGF-1 R como aqui descrita. Em outras tais condições o nível de expressão ou de atividade é demasiadamente baixo, e o tratamento compreende a administração de um agonista de IGF-1 R como descrito aqui.

Um exemplo de um tipo de condição que possa ser tratado usando os métodos e as composições da presente invenção é uma condição que envolva o crescimento celular, por exemplo, uma condição cancerosa. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece composições e métodos de tratamento de uma condição cancerosa. A condição cancerosa pode ser qualquer condição cancerosa que possa ser tratada usando as composições compreendidas aqui, por exemplo, proteínas de ligação ao antígeno de IGF-1 R antagonizantes, tais como anticorpos anti-IGF-1R, fragmentos de anticorpos, ou derivados de anticorpos. Exemplos de condições cancerosas incluem, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, carcinoma adrenocortical, câncer relacionado a AIDS, linfoma relacionado a AIDS, câncer anal, astrocitoma cerebelar de infância, astrocitoma cerebral da infância, carcinoma basal celular, câncer do dueto biliar extrahepático, câncer da bexiga, osteosarcoma/câncer fibroso maligno do osso de histiocitoma, tumores do cérebro (por exemplo, glioma da haste do cérebro, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores primários supratentorial neuroectodermal, cascata visual e glioma hipotalâmico), câncer de mama, adenomas bronquial/carcinóides, linfoma de Burkitt, tumor carcinóide, tumor carcinóide gastrointestinal, carcinoma primário desconhecido, carcinoma do sistema nervoso central primário, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, câncer cervical, câncer da infância, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica, desordens mieloproliferativas crônicas, câncer de cólon, câncer coloretal, linfoma citâneo da célula-T, câncer endometrial, ependimoma, câncer esofageal, tumores da família “Ewing”, tumor da célula germinativa extracranial, tumor da célula germinativa extragonadal, câncer do dueto da bile extrahepático, câncer de melanoma intraocular, Retinoblastoma, câncer de Gallbladder, câncer gástrico (do estômago), tumor carcinóide gastrointestinal, tumores da células germinativas (por exemplo, extracranial, extragonadal, e ovariano), tumor gestacional trofoblástico, glioma (por exemplo, adulto, haste do cérebro infantil, astrocitoma cerebral infantil, rota visual e hipotalâmico da infância), leucemia das células capilares, da cabeça e da garganta, câncer hepatocelular (do fígado), linfoma de Hodgkin, câncer hipofaringeal, glioma hipotalâmico e da rota visual, melanoma intraocular, carcinoma de ilhotas celulares (pâncreas endócrino), sarcoma de Kaposi, câncer do fígado (renal), câncer laringeal, câncer mielogênico linfocítico, leucemia miolóide crônica, leucemia crônica (por exemplo, linfoblástica aguda, aguda, e de células capilares), da extremidade e da cavidade oral, câncer do fígado, câncer de células não pequenas do pulmão, câncer de células pequenas do pulmão, linfoma (por exemplo, relacionado a AIDS, de Burkitt, cutâneo, de Hodgkin, Não-Hodgkin, e sistema nervoso central primário), macroglobulinemia de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno do osso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intra-ocular (do olho), carcinoma celular de Merkel, mesotelioma, câncer da garganta metastático escamoso com síndrome preliminar, neoplasia endócrina múltipla ocular, mieloma múltiplo/neoplasma celular plasmático, micoses fungóides, síndromes de mielodisplasia, doenças de Mielodisplástica/Mieloproliferativa, leucemia mielogenosa, leucemia mielóide crônica, mieloma múltiplo, desordens crônicas mieloproliferativas, cavidade nasal e 5 câncer do sinus paranasal, câncer nasofaringeal, neuroblastoma, câncer oral, câncer orofaringeal, osteosarcoma/histiocitoma fibrose máligna do osso, câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor ovariano das células da germinativas, tumor ovariano de baixo potencial maligno, câncer pancreático, câncer da ilhota celular pancreático, câncer do sinus paranasal e da cavidade nasal, câncer da o paratiróide, câncer “Penile", feocromocitoma, pineoblastoma, tumor da hipófise, neoplasma celular plasmático/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonariano, linfoma preliminar do sistema nervoso central, câncer da próstata, câncer retal, câncer de célula renal (rim), câncer da pélvis renal e câncer de células transitórias do ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, câncer da glândula salivar, sarcoma 15 do tecido mole, sarcoma uterino, síndrome “Sezary”, câncer de pele não- melanoma, carcinoma da pele celular de Merkel, câncer do Intestino pequeno, sarcoma do tecido mole, carcinoma celular escamoso, linfoma cutâneo de células T, câncer testicular, timoma, carcinoma tímico, câncer da tireóide, tumor gestacional trofoblástico, carcinoma de local primário desconhecido, câncer uretral, ) câncer uterino endometrial, sarcoma uterino, câncer vaginal, glioma visual, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor hipotalâmico de Wilms.

Quatro grupos diferentes estudaram um total de 425 cânceres de mama, na maior parte de origem ductal e 48 tecidos normais ou espécimes benignas por radioimunoensaio ("RIA”) ou (“IHC”) (Papa et al, 1993, Cancer Research 53: 373625 40, Happerfield et al, 1997, Journal of Pathology 183: 412- 17; Ellis et al, 1998,

Breast Cancer Research & Treatment 52: 175-84, Lee et al, 1998, Breast Cancer Research & Treatment 47: 295-302, Schnarr et al, 2000, International Journal of Cancer 89: 506-13). Estes estudos sugerem que a expressão elevada de IGF-1 R, na ordem da dobra 5-10, está associada com o prognóstico favorável e os 30 biomarcadores (ER+ PR+), sugerindo que o estrógeno e IGF cooperam na SOÍ manutenção ou na progressão do tumor bem diferenciado. Similarmente, o estrogênio foi mostrado para ser essencial para o crescimento e a sobrevivência da linhagem celular de câncer de mama de ER+ MCF-7, e neste contexto IGF-1 R é regulado acima pelo tratamento do estrogênio (reviewed in Ellis et al, 1998, 5 Breast Cancer Research & Treatment 52: 175-84). Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar o câncer de mama em um paciente na necessidade de tal tratamento, compreendendo a administração ao paciente uma quantidade eficaz de um antagonista IGF- 1R como descrita aqui. Em uma outra incorporação, o método também compreende a administração de io um inibidor do hormônio, por exemplo, um inibidor de estrogênio.

Uma análise retrospectiva de IGF-1 R por IHC foi relatada para uma coleção de 12 adenomas do cólon, 36 adenocarcinomas coloretais preliminares e 27 metástases correspondentes e 34 tecidos normais adjacentes (Hakam e outros, 1999, Pathology humano. 30:1128 - 33). A freqüência de moderada a forte de 15 mancha IHC pareceu aumentar dramaticamente com estágio e grau mais elevado do tumor (normal de 0% contra metástases de 93%). Os resultados são consistentes com a análise do RNA pelo ensaio da proteção de RNAse (“RPA”) (Freier e outros, 1999, pelo Gut 44:704 - 08). Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar o câncer de cólon em um paciente o na necessidade de tal tratamento, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um antagonista IGF-1 R como descrita aqui.

O plasma elevado de IGF-1 e IGFbp3 reduzido nos homens de 40-80 anos é associado com o risco aumentado do câncer de próstata (Chan e outros, 1998, ciência 279:563 - 6). IGF-1 elevado é associado com um risco de outros cânceres 25 incluindo, o de mama (Hankinson e outros, 1998, Lancet 351: 1393-96), de cólon (Ma et al, 1999, Journal of the National Cancer Institute 91: 620-25) e de pulmão (Yu et al, 1999, Journal of the National Cancer Institute 91: 151-56). Em modelos de ratos transgênico, a incidência do tumor é aumentada pela superexpressão de IGF-1 em posições diversas (Boi et al, 1997, Oncogene 14: 1725-34; DiGiovanni et 30 al, 2000, Cancer Research 60: 1561-70; DiGiovanni et al, 2000, Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 97: 3455-60, Hadsell et al, 2000, Oncogene 19: 889-98). Estes estudos do rato apontam a urn papel para ambos IGF-1 produzido pelo estroma e pelo soro. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar um paciente na necessidade de tal tratamento, compreendendo administração ao paciente uma quantidade eficaz de um antagonista de IGF-1 R como descrita aqui, onde o antagonista inibe a ativação de IGF-1 R por IGF-1. Em uma outra incorporação, o paciente tem o câncer. Em uma outra incorporação, o paciente tem um tumor. Em uma outra incorporação, o câncer é câncer da próstata, de mama, de cólon ou de pulmão.

Observou-se que o osso é a fonte principal de IGF-1 no corpo. Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece composições e métodos inibindo IGF-1 R em um osso de um paciente. Em uma incorporação, um inibidor de IGF-1 R da presente invenção é administrado a um paciente que tenha, ou está em risco tornando-se, um tumor de osso. O tumor pode ser, por exemplo, um tumor preliminar ou um tumor metastático. O tratamento promove opcionalmente a administração a um paciente ou mais tratamento terapêutico e/ou paliativos adicionais, por exemplo, um tratamento anti-tumor (por exemplo, quimioterapia, terapia de radiação, ou terapia do anti-hormônio) ou um tratamento que iniba o turnover do osso (por exemplo, denosumab (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)).

IGF-2 é superexpresso em uma variedade de tumores e de tecidos estrômicos. Os níveis IGF-2 parecem especialmente elevados (tanto quanto a dobra 40) em cânceres preliminares do fígado (Cariani e outros, 1988, pesquisa de Cancer 48:6844 - 49) e em adenocarcinoma do cólon (Freier e outros, 1999, Gut 44:704 - 08). Muitas das desordens do supercrescimento são associadas com uma incidência aumentada de tumores da infância. Cinco a dez por cento dos indivíduos com a Síndrome prenatal de Beckwith-Weidmann de desordem do crescimento (BWS) ou o hemihiperplasia desenvolvem tumores tais como o nefroblastoma, o carcinoma adrenal, e o neuroblastoma (Morison et ah, 1998, Review medicina Molecular hoje 4:110 - 05). O fator de predisposição ao tumor sθ^ nestas crianças parece ser a perda do mosaico do gene imprinting IGF-2 maternal, duplicação do braço cromossômico paternal (1 IP) que carrega IGF-2. Ambas as alterações aumentariam o nível da expressão de IGF-2. A super-expressão de IGF-2 como resultado da disomia do mosaico uniparental ou da perda do IGF-2 imprinting foi detectado também em tumores de Wilms. As desordens do crescimento não são observadas nestas crianças mesmo que as alterações do gene IGF-2 ocorram também em alguns tecidos normais, talvez refletindo a distribuição do tecido das células afetadas. O gene IGF-2 maternal ocorre também nos ratos, e os efeitos da super-expressão de IGF-2 são pertinentes à situação humana (Cariani et al., 1991, Journal of Hepatology 13: 220-26, Schirmacher et al., 1992, Cancer Research 52: 2549-56; Harris et al, 1998, Oncogene 16: 203-09). A incidência de tumores e aumento organomegálicos nos ratos que expressa transgenicalmente o excesso de IGF-2 (Christofori et al., 1994, Nature 369: 41418, Ward et al., 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91: 10365-9, Wolf et al, 1994, Endocrinology 135: 187786, Bates et al, 1995, British Journal of Cancer 72: 1189-93, Hassan et al, 2000, Cancer Research 60: 1070-76). A super-expressão de IGF-2 aumentam a aparência espontânea da próstata, intestinal, do figado e de tumores epidérmicos. A expressão específica do plasma que usa promotores do fígado eleva carcinomas o hepatocelulares e linfoma. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar um paciente na necessidade de tal tratamento, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um antagonista de IGF-1 R como descrita aqui, onde o antagonista inibe a ativação de IGF-1 R por IGF-2. Em uma outra incorporação, o paciente tem o câncer. Em uma outra incorporação, o paciente tem um tumor. Em uma outra incorporação, o paciente tem câncer de fígado, adenocarcinoma de cólon, Síndrome de Beckwith- Weidmann, hemihiperplasia, nefroblastoma, carcinoma adrenal, neuroblastoma, perda do mosaico do gene de imprinting IGF-2 maternal, duplicação do braço cromossomal paternal (11P), expressão aumentada de IGF-2, um tumor (um tumor por exemplo, de próstata, mamário, intestinal, do fígado, epidérmico ou de Wilms), organomegalia, carcinoma hepatocelular ou linfoma.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos de impedir que um câncer se espalhe a uma outra parte do corpo, ou de tratar um câncer que se espalhe a uma outra parte do corpo. Em uma incorporação, o câncer se espalhou 5 para a região do linfonodo. Em uma outra incorporação, o câncer é metastático. O tumor preliminar pode ser qualquer tipo de tumor, por exemplo, um tumor de adenocarcinoma (por exemplo, um tumor de adenocarcinoma da próstata, um tumor de carcinoma da mama, ou um tumor de carcinoma celular renal), um tumor de célula não-pequena ou um tumor pequeno do câncer de pulmão, um tumor do ’0 câncer de tireóide, etc. O local do tumor metastático pode estar em qualquer lugar no corpo. Pode estar, por exemplo, no osso, no sistema linfático, no pulmão, no cérebro, no olho, na pele, no pâncreas ou no fígado. Em uma incorporação particular, um paciente que tem uma doença de tumor é tratado com uma quantidade eficaz de uma composição inibindo IGF-1 R da presente invenção de 15 forma que o tumor preliminar é impedido de metastizar. Em uma outra incorporação particular, um paciente que tem um tumor preliminar é tratado com uma quantidade eficaz de uma composição inibitória de IGF-1 R da presente invenção de forma que o tumor preliminar será inibido de metastizar. Em uma outra incorporação particular, um paciente que tem um tumor metástico é tratado ) com uma quantidade eficaz de uma composição inibitória de IGF-1 R da presente invenção de forma que o crescimento ou o espalhamento do tumor secundário é inibido. Em uma outra incorporação particular, um paciente que tem um tumor metástico é tratado com uma quantidade eficaz de uma composição inibitória de IGF-1 R da presente invenção de forma que o tumor secundário é reduzido em 25 tamanho. Em uma incorporação mais particular, o tumor preliminar é um tumor de adenocarcinoma, um tumor celular não pequeno do pulmão, um tumor celular pequeno do pulmão ou um câncer de tireóide. Em uma outra incorporação mais particular, o tumor metástico está em um osso. Em uma outra incorporação mais particular, um tumor metástico é impedido ou inibido de se formar em um osso. Em 30 uma outra incorporação mais particularmente definida, o método compreende o tratamento do paciente com uma composição inibitória de IGF-1 R da presente invenção e de um ou outros tratamentos mais (por exemplo, um tratamento que elimine ou iniba o crescimento celular do câncer, tais como a radiação, terapia hormonal ou quimioterapia, ou um tratamento que iniba o turnover do osso, vai 5 como o denosumab), não se limitando aos exemplos que são fornecidos aqui.

Esse ou outros tratamentos podem incluir, por exemplo, o padrão de tratamento para a condição particular e/ou tratamento paliativo ao paciente.

Sem ser limitada a qualquer teoria particular, a célula do tumor parecem depender do Kinase/Akt do PB que sinaliza a cascata para resistir à atividade de i.o indução de quimioterapia, da radiação, e terapia do anti-hormônio. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece métodos de tratar um paciente r.d necessidade de tal tratamento que compreende a administração ao paciente de um antagonista de IGF-1 R da presente invenção e uma quimioterapia, radiação, e/ou uma terapia de anti-hormônio. Este conceito foi validado experimentalmente 15 em modelos de cultura celular e em modelos do tumor do roedor pelo antisenso pelas mutações negativas dominantes (revistos por Baserga et al, 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1332: F105-26, Baserga, 2000, Oncogene 19: 557481). Em uma incorporação, os agentes quimioterápicos são selecionados do gru^u que consiste em inibidores mitóticos, em agentes alcalantes, em anti-metabólitos, ) em intercalação de antibióticos, em inibidores do fator do crescimento, em inibidores do ciclo celular, em enzimas, em inibidores da topoisomerase, em agentes de anti-sobrevivência, modificadores de respostas biológicas, anti- hormônios, por exemplo anti-andrógenos, e agentes anti-angiogênicos. Um exemplo de um agente quimioterápico que possa ser administrado em combinação 25 com um inibidor do receptor de IGF-1 da invenção é CPT-11. O CPT-11 (trihidrato do hidrocloreto de irinotecano) é semi-sintético, derivado de camptotecina e solúvel em água, um alcalóide da planta. O CPT-11 é um metabólito associado chamado SN38 inibidor da topoisomerase 1 (TOPO 1). Esta enzima introduz as rupturas reversíveis de cadeia única do DNA que se permitem o desenrolamento e 30 a subsequente replicação do DNA. A inibição de TOPO1 impede a religação de rupturas da fita após a replicação do DNA tendo por resultado a fragmentação cromossomal extremamente aumentada. Estes danos do DNA promovem a morle da célula por apoptose com a ação de p53 e outros sistemas que monitoram a integridade do genoma. O efeito citotóxico de CPT-11 é limitado geralmente às 5 células que replicam o DNA (S-Fase). As células inativas são na maior parte não afetadas. Em uma outra incorporação, a presente invenção fornece o tratamento de um paciente na necessidade deste com uma quantidade eficaz de um antagonista de IGF-1 R da presente invenção e com uma quantidade eficaz de um agente de indução. Em uma outra incorporação, um agente de anti-angiogênes„, '0 tal como (matriz-metaloproteinase 2) um inibidor MMP-2, (matriz-metaloproteinase 9) um inibidor MMP-9, e/ou um inibidor de COX-II (ciclooxigenase II), é usado conjuntamente com um composto da invenção. Os exemplos de inibidores úteis de COX-II incluem CELEBREX™ (alecoxib), BEXTRA™ (valdecoxib), e VIOXX™ (rofecoxib). Os exemplos de inibidores úteis de metaloproteinase da matriz são 15 descritos nos documentos WO 96/33172 (publicado em 24 de outubros de 1996), WO 96/27583 (publicado em 7 de março de 1996), pedido de patente europeu F"1 97304971.1 (depositado me 18 de julho de 1997), pedido de patente europeu EP 99308617.2 (depositado em 29 de outubro de 1999), WO 98/07697 (publicado em 26 de fevereiro de 1998), WO 98/03516 (publicado em 29 de janeiro de 1998), WO i 98/34918 (publicado em 13 de agosto de 1998), WO 98/34915 (publicado em 13 de agosto de 1998), WO 98/33768 (publicado em 06 de agosto de 1998), WO 98/30566 (publicado em 16 de julho 1998), pedido de patente europeu EP 606,046 (publicado em 13 de julho de 1994), pedido de patente europeu EP 931,783 (publicado em 28 de julho de 1999), WO 90/05719 (publicado em 31 de maio de 25 1 990), WO 99/52910 (publicado em 21 de outubro de 1999), WO 99/52889 (publicado em 21 de outubro de 1999), WO 99/29667 (publicdo em 17 de julho de 1999), PCT No. PCT/IB98/01113 (depositado em 21 de julho de 1998), pedido de patente europeu EP 99302232.1 (depositado em 25 de março de 1999), pedido de patente inglês US 99129611 (depositado em 3 de junho de 1999), pedido 30 provisional americano 60/148,464 (depositado em 12 de agosto de 1999), pater'.J US5,863,949 (emitida em 26 de janeiro de 1999), patente US5,861,510 (emitida em 19 de janeiro de 1999), e pedido de patente europeu EP 780,386 (publicado em 25 de janeiro de 1997), as quais são incorporados aqui em suas totalidade pela referência. Em uma incorporação, o inibidor de MMP é um que não demonstra 5 artralgia. Em uma outra incorporação, o inibidor de MMP inibe seletivamente MMP- 2 e/ou MMP-9 relativo a outras matriz-metaloproteinases (isto é, MMP-I, MMP- 3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-IO, MMP-11, MMP-12, e MMP-13). Alguns exemplos específicos dos inibidores de MMP úteis na presente invenção são AG-3340, RO 32-3555, RS 13 - 0830, e os compostos citados na seguinte o lista: 3-[[4-(4-fluor-fenoxi)-benzeno-sulfonil]-(l-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]- ácido propiônico; 3-exo-3-[4-(4-fluor-fenoxi)- benzenesulfonilamina]-8-oxa- biciclo[3,2,1]octane-3-acido carboxílico hidroxiamida; (2R, 3R) l-[4-(2- cloro-4-fluor- benziloxi)-benzenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2- acido carboxílico hidroxiamida; 4-[4-(4-fluor-fenoxi)-benzenosulfonilamina]-tetrahidro-piran-4- acidj 15 carboxílico hidroxiamida; 3-[[4~(4-fluor~fenoxy)-benzenosulfon-il]-(1- hidroxicarbamoil-ciclobutil) amino]-ácido propiônico; 4-[4-(4-cloro-fenoxi)- benzenosulfonilamina]-tetrahidro-piran-4 ácido carboxílico hidroxiamida; (R) 3-[4- (4-cloro-fenoxi)-benzenosulfonilamina]-te- trahidro-piran-3- acido carboxílico hidroxiamida; (2R, 3R) 1-[4-(4-fluor-2-metil-benziloxi)-benzenosulfonil]-3-hidroxi-3- ) metil-pi-peridina-2- acido carboxílico hidroxiamida; 3-[[4-(4-fluor-fenoxi)-benzeneo- ulfonil]-(l- hydroxicarbamoil- 1 -metil-ethi)-amino]-ácido propiônico; 3-[[4-(4-fluc-- fenoxi)-benzenesulfonil]-(4- hidroxicarbamoil-tetrahidro- piran-4-il)-amino]-acido propionico; 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)- benzenesu- lfonilamino]-8-oxa- iciclo[3.2.1]octano-3- acido carboxílico hidroxiamida; 3-endo-3-[4-(4- fluor-fenoxi)- 25 benzenesulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1 ]octano-3 acido carboxílico hidroxiamida; e (R) 3-[4-(4-fluor-fenoxi)-b- enzenesiilfonilamino]-tetrahidro-furan-3- acido carboxílico hidroxiamida e sais aceitáveis farmacêuticamente, derivados solvatados e outras preparações do composto.

As mutações esporádicas que inativam o produto do gene de PETN 30 ocorrem relativamente freqüentemente na maioria de cânceres humanos (Yamada e outros, 2001, Cell Sci 114:2375 de J - 82, Montes e outros, 2002, Pharmacol. Therapeut 93:243 - 51). A perda de PTEN faz com que o Akt do estado fosforilado persista com a perda da habilidade para baixa regulação dos sinais estimulatórios que originam-se de IGF-1 R e de outras fontes. O status do supressor do tumor p53 influencia também a atividade do sistema de sinalização de IGF-1 R. No estado d ? desenvolvimento, a transcrição basal ou constitutiva de IGF-1 R é represada por p53 através de um mecanismo indireto. A ativação de Akt promove a fosforilação de mdm2, que então liga o supressor do tumor p53 e promove sua degradação (Mayo e outros, 2002, TIBS 27:462 - 67), tendo por resultado a expressão o aumentada de IGF-1 R. Um resultado similar é observado quando p53 é inativado pela mutação. Quando transientemente expressas em Saos-2 (uma linhagem celular de osteosarcoma humana) e em RD (uma linhagem celular d« rabdomiosarcoma), o tipo selvagem p53 é abilitado a suprimir a atividade a construção do promoter de IGF-1 R cotransfectado, enquanto que as versões do 15 mutante derivadas do tumor, de p53 não têm nenhum efeito. Foi proposto que o nível aumentado de IGF-1 R promove a resistência à apoptose associado com a perda de células malignas de p53 (Werner et al, 2000, Cell Mol Life Sci 57:93242). Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar uma condição cancerosa em um paciente na necessidade de tal tratamen+i ) que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um antagonista de IGF-1 R como descrita aqui, onde a condição cancerosa é caracterizada pelas células que têm uma expressão ou uma atividade reduzida de p53.

O WTI (proteína do supressor 1 do tumor do fígado de Wilms) também foi mostrado que liga e reprime o promoter de IGF-1 R. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar uma condição cancerosa em um paciente na necessidade de tal tratamento que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um antagonista de IGF-1 R como descrita aqui onde a condição cancerosa é caracterizada por uma expressão ou por uma atividade reduzida de WTI.

A proliferação de fibroblastos normais foi mostrada para requerer, sob condições de cultura definida, a ação combinada de IGF e um fator de crescimento do estroma (por exemplo PDGF, EGF) para aumentar o Ras/Raf/ Map Kinase e promover a entrada do ciclo celular (transição de GO a G1). Os fibroblastos 5 derivaram-se de oncogenes de IGF- 1R dos ratos que não respondem ao fator do crescimento sozinhos, ou a maioria (por exemplo Ras oncogênico) que ativam a cascata Ras/Raf/Map Kinase. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar um paciente na necessidade de tal tratamento que compreende a administração ao paciente de um antagonista de IGF-1 R como o descrito aqui e um agente que alveje um fator do crescimento e/ou um receptor do fator de crescimento, tal como uma tirosina quinase do receptor do fator de crescimento, por exemplo, o EGFR, o HER-2, o bcr-abl, o VEGFR, o kit, o raf, o mTOR, o CDKI/2, o VEGFR2, o PKCβ, o Mek, e/ou o KDR. Os exemplos das moléculas que alvejam tais fatores e/ou receptores do crescimento incluem 15 panitumumab (Abgenix, Fremont, CA/Amgen, Thousand Oaks, CA), HERCEPTIN™ (Genentech, South San Francisco, CA), GLEEVEC™ (Novartis, East Hanover, NJ), IRESSA™ (AstraZeneca, Wilmington, DE), ERBITUX™. (ImClone, New York, NY), AVASTIN™, (Genentech), PTK787 (Novartis), SUI 1248 (Pfizer, New York, NY), TARCEVA™ (OSI Pharmaceuticals, Melville, NY), 43-9006 ) (Bayer, West Haven, CT), CCI-779 (Wyeth, Madison, NJ), RADOOI (Novartis), BMS- 387032 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), IMC-ICI 1 (ImClone), LY333531 (Eli Lilly, Indianapolis, IN), PD 184352 (Pfizer), 2C4 (Genentech), and GW2016 (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC).

O papel de IGF-1 R na hematologia maligna foi revisto por (Novak et a<, 25 2 0 03, Insulin-Like Growth Factors and Hematological Malignancies in Insulin-Like

Growth Factors, LeRoith et al, ed.s, Landes Bioscience). Um papel funcional para o IGF-1 R na hematologia maligna é demonstrado, por exemplo, para a habilidade de anticorpos monoclonais de IGF-1 R de obstruir o crescimento de células transformadas em cultura. O IGF-1 foi encontrado para aumentar o crescimento da 30 leucemia mielogênica aguda humana e blasts de leucemia linfoblásticas recém isoladas. Com respeito às células T malignas, o IGF-1 foi mostrado pan influenciar o crescimento de células de ratos do linfoma que carregam um fenótipo da célula pre-T das células linfoblásticas agudas da leucemia e, da linhagem preliminar imatura e madura do ser humano que foram encontradas para 5 expressar números elevados de IGF-1 R. Assim, em uma incorporação, a presente invenção fornece métodos de tratar uma hematologia maligna em um paciente na necessidade que compreende este, administrando ao paciente um antagonista de IGF- 1 R como descrito aqui. Em uma outra incorporação, a hematologia maligna é uma leucemia mielogênica aguda, uma leucemia linfoblástica aguda, ou uma o célula T maligna.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de identificar os pacientes que são mais prováveis se beneficiar do tratamento usando as composições e/ou os métodos de tratamento da presente invenção. Tais métodos podem permitir o melhoramento de um regime terapêutico às necessidades de um 15 paciente particular e de reduzir a probabilidade de um curso de tratamento ineficaz ou não produtivo. Em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de determinar se um paciente é um candidato para o tratamento usando uma composição ou um método como aqui descrito determinando se uma célula alvo ligada dentro do paciente expressa IGF-1 R, onde se o tipo de célula alvo pode » expressar IGF-1 R, então o paciente é um candidato para o tratamento. Em uma outra incorporação, o método compreende determinar o número médio aproximado de moléculas de IGF-1 R por célula alvo, onde, 102, 103, 104, 105, ou 106 de IGF-1 R por célula indicam que o paciente é um candidato para o tratamento. O número médio aproximado de moléculas de IGF-1 R por célula alvo 25 pode ser determinado usando qualquer técnica conhecida do estado da técnica, por exemplo, marcando uma amostra que compreende células do tipo da célula alvo com uma molécula de ligação a IGF-1 R, e detectando a quantidade de molécula de ligação de IGF-1 R limitada à amostra, onde a quantidade de molécula de ligação de IGF-1 R detectada é proporcional ao número médio de moléculas dn 30 IGF-1 R na amostra. Em uma outra incorporação, o método compreende comparar o número médio aproximado de moléculas de IGF-1 R por célula alvo a um padrão de referência, onde se o número médio aproximado de moléculas de IGF-1 R por célula alvo for maior do que o padrão de referência, então o indivíduo tem maior probabilidade de se beneficiar do tratamento usando as composições e/ou métodos de tratamento da presente invenção. Em uma outra incorporação, o tipo de célula alvo é um tipo de célula cancerosa. Em uma outra incorporação, o tipo de célula alvo é um tipo de célula de câncer de cólon, um tipo de célula de câncer de mama, um tipo de célula de NSCLC, ou um tipo de célula de leucemia. Em uma outra incorporação, um indivíduo que seja um candidato para o tratamento é o identificado detectando IGF-1 e/ou IGF-2 no tipo de célula alvo, ou no status do tipo de célula alvo. Em uma outra incorporação, o tipo de célula alvo é um tipo de célula cancerosa. Em uma outra incorporação, o tipo de célula alvo é um tipo de célula de câncer de colon, um tipo de célula de câncer de mama, um tipo de célula de NSCLC, ou um tipo de célula de leucemia.

Em uma outra incorporação, um indivíduo que seja um candidato para o tratamento é identificado detectando a atividade de sinalização mediada por IGF- 1R no tipo da célula alvo, onde a sinalização mediada por IGF-1 R no tipo da célula alvo indica que o indivíduo é um candidato para o tratamento. Os exemplos das moléculas que podem ser monitoradas para mudanças IGF-1 R-dependentes são ) mostradas nas figura 10, tais como as moléculas na cascata de PI3/Akt, adaptadores, por exemplo, de IGF-1 R, de IRS, Akt, etc. Tais moléculas podem ser monitoradas para, por exemplo, uma mudança no estados da fosforilação, por exemplo, um aumento na fosforilação. Os anticorpos fosfo-específicos que reconhecem as formas ativas destes marcadores de proteína são altamente desenvolvidos, e estes reagentes provaram ser de confiança para a detecção do imunoblot em sistemas experimentais.

As composições e/ou os métodos da presente invenção também podem ser usados, por exemplo, em tratamentos cosméticos, em tratamentos veterinários, para aumentar a longevidade, para tratar defeitos reprodutivos e para tratar uma 30 variedade de desordens relacionadas ao crescimento.

Métodos Terapêuticos e administração de proteínas de ligação ao antígeno

Determinados métodos fornecidos aqui compreendem a administração de uma proteína de ligação ao antígeno de IGF-1 R a um paciente, 5 reduzindo desse modo a resposta biológica de IGF-1 induzida que apresenta um papel em uma condição particular. Em incorporações particulares, os métodos da invenção envolvem contatar IGF-1 R endógenos com uma proteína de ligação ao antígeno de IGF-1 R, por exemplo, através da administração a um paciente ou em um procedimento ex vivo.

O termo “tratamento” abrange o alívio ou a prevenção pelo menos de um sintoma ou outro aspecto de uma disordem, ou a redução da severidade da doença, e similar. Uma proteina de ligação ao antígeno não necessita efetuar uma cura completa, nem erradicar cada sintoma ou minifestação de uma doença, para constituir um agente terapêutico viável. Como é reconhecido no campo pertinente, 15 as drogas empregadas como agentes terapêuticos podem reduzir a severidade de um estado de uma dada doença, mas não necessitam abolir cada manifestação da doença a ser considerada como agentes terapêuticos úteis. Similarmente, um tratamento profilaticamente administrado não necessita ser completamente eficaz em impedir o início de uma condição a fim de constituir um agente profilático > viável. Simplesmente reduzir o impacto de uma doença (por exemplo, reduzindo o número ou a severidade de seus sintomas, ou aumentando a eficácia de um outro tratamento, ou produzindo um outro efeito benéfico), ou reduzir a probabilidade em que a doença ocorrerá ou piorar em um paciente, são suficientes. Uma incorporação da invenção é dirigida a um método que compreende administração 25 a um paciente de um antagonista de IGF-1 R em uma quantidade e por um momento suficiente para induzir uma melhoria sustentada sobre a linha de base de um indicador que reflita a severidade da desordem particular.

Como é compreendido no campo pertinente, as composições farmacêuticas que compreendem as moléculas da invenção são administradas a um paciente de 30 uma maneira apropriada à indicação. As composições farmacêuticas não podem ser administradas por qualquer técnica apropriada, incluindo mas não limitadas a parenteralmente, topicamente ou por inalação. Se injetada, a composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, através das rotas intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal ou subcutânea, pela 5 injeção por bolus ou por infusão contínua. A administração localizada, por exemplo, em um local da doença ou do ferimento é contemplada, como é a distribuição transdermal e a liberação sustentada dos implantes. A distribuição pela inalação inclui, por exemplo, a inalação nasal ou oral, o uso de um nebulizador, a inalação do antagonista no formato do aerossol, e similares, o Alternativas incluem colírios; preparações orais incluindo pílulas, cápsulas, comprimidos ou goma de mascar; e preparações tópicas tais como loções, géis, spray, e pomadas.

O uso de proteínas de ligação ao antígeno em procedimentos ex vivo é contemplado também. Por exemplo, o sangue de um paciente ou o outro líquido 15 corporal podem ser contatados com uma proteína de ligação ao antígeno que liga IGF-1 R ex vivo. A proteína de ligação ao antígeno pode ser limitada a uma matriz insolúvel apropriada ou a um material de sustentação sólida.

Vantajosamente, as proteínas de ligação a antígeno são administradas no formato de uma composição que compreende um ou mais componentes ) adicionalis tais como um portador, um excipiente ou um diluente fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, a composição compreende adicionalmente um ou mais agentes fisiologicamente ativos, por exemplo, uma segunda substância de inibição de IGF-1, uma substância anti-angiogênica, uma substância quimioterápica, uma substância analgésica, etc., os exemplos não-exclusivos de que são fornecidos 25 aqui. Em várias incorporações particulares, a composição compreende um, dois, três, quatro, cinco, ou seis agentes fisiologicamente ativos além de uma proteína de ligação ao antígeno ligando-se a IGF-1 R.

Em uma incorporação, a composição farmacêutica compreende uma proteína de ligação ao antígeno da invenção junto com uma ou mais substâncias 30 selecionadas do grupo que consiste em um tampão, um antioxidante, tal como o ácido ascórbico, um polipeptidio de baixo peso molecular (tal como aqueles que têm menos de 10 aminoácidos), uma proteína, um aminoácido, um hidrato de carbono, tal como a glicose, sucrose ou dextrina, um agente quelante, tal como o EDTA, glutationa, um estabilizador, e um excipiente. Misturados ou protegidos com albumina conspecífica do soro são exemplos de diluentes apropriados. De acordo com padrões apropriados da indústria, os preservativos tais como o álcool benzil podem também ser adicionados. A composição pode ser formulada como liofilizada usando soluções apropriadas do excipiente (por exemplo, sucrose) como diluente. Os componentes apropriados são não-tóxicos aos receptores nas dosagens e nas concentrações empregadas. Exemplos mais adicionais dos componentes que podem ser empregados em formulações farmacêuticas são apresentadas em Pharmaceutical Science of Remington, 16o Ed. (1980) e 20o Ed. (2000), Mack Publishing Companhia, Easton, PA.

Os kits a serem utilizados por médicos incluem uma substância de inibição do receptor de IGF-1 da invenção e um marcador ou outras instruções para o uso em como tratar algumas das condições discutidas aqui. Em uma incorporação, o kit inclui uma preparação estéril de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno ligando-se a IGF-1 R, que podem estar no formulário de uma composição como divulgado acima, e pode estar em uma ou mais vias.

As dosagens e a freqüência da administração podem variar de acordo com fatores como a rota de administração, as proteínas de ligação ao antígeno particularmente empregadas, a natureza e a severidade da doença a ser tratada, se a condição é aguda ou crônica, e de acordo com o tamanho e a condição geral do paciente. As dosagens apropriadas podem ser determinadas pelos procedimentos conhecidos pertinentes ao estado da técnica, por exemplo nas experimentações clínicas que podem envolver estudos de escalonamento de dose.

Uma substância inibidora do receptor de IGF-1 da invenção pode ser administrada, por exemplo, uma vez ou mais de uma vez, por exemplo, em intervalos regulares sobre um período de tempo. Em incorporações particulares, uma proteína de ligação ao antígeno é administrada sobre um período pelo menos de um mês ou mais, por exemplo, por um, dois, ou três meses ou uniforme indefinidamente. Para tratar condições crônicas, o tratamento a longo prazo é geralmente o mais eficaz. Entretanto, para tratar condições agudas, a administração por períodos mais curtos, por exemplo, uma a seis semanas, pode 5 ser suficiente. Em geral, a proteína de ligação ao antígeno é administrada até que o paciente manifeste um grau medicamentoso relevante da linha de base excedente da melhoria para o indicador ou indicadores escolhidos.

As incorporações particulares da presente invenção envolvem administrar uma proteina de ligação ao antígeno em uma dosagem de aproximadamente 1 mg o de proteína de ligação ao antígeno por quilograma do peso do paciente por dia (“mg/kg/dia") a aproximadamente 10 mg/kg/dia, mais preferivelmente de aproximadamente 500 mg/kg/dia a aproximadamente 5 mg/kg/dia, e mais preferivelmente de aproximadamente 5 μg/kg/dia a aproximadamente 2 mg/kg/dia, a um paciente. Em incorporações adicionais, uma proteína de ligação ao antígeno 15 é administrada aos adultos uma vez por a semana, duas vezes por semana ou três ou mais vezes por a semana, para tratar uma doença, uma condição, um desordem mediada por IGF-1 e/ou IGF-2, por exemplo, uma desordem médica divulgada aqui. Se injetada, a quantidade eficaz de proteína de ligação ao antígeno por dose de adulto pode variar de 1-20 mg/m2, e é preferivelmente 3 aproximadamente 5-12 mg/m2. Alternativamente, uma dose baixa pode ser administrada; a quantidade pode variar de 5-100 mg/dose. Uma escala para uma dose baixa é de aproximadamente 20-30 mg por dose. Em uma incorporação da invenção, uma dose baixa de 25 mg/dose é administrada repetidamente pela injeção. Se uma rota de administração à exceção da injeção for usada, a dose é 25 ajustada apropriadamente de acordo com práticas médicas padrão. Um exemplo de um regime terapêutico envolve injetar uma dose de aproximadamente 20-30 mg de proteína de ligação ao antígeno uma a três vezes por semana sobre um período de pelo menos três semanas, embora o tratamento por períodos mais longos pode ser necessário para induzir o grau desejado de melhoria. Para 30 assuntos pediátricos (idade 4-17), um regime apropriado exemplificadamentn envolve a injeção subcutânea de 0,4 mg/kg, até uma dose máxima de 25 mg de proteína de ligação ao antígeno administrado duas ou três vezes por semana.

As incorporações particulares dos métodos fornecidos aqui envolvem a injeção subcutânea de 0,5 mg a 10 mg, preferivelmente 3 a 5 mg, de uma proteína 5 de ligação ao antígeno, uma vez ou duas vezes por semana. Uma outra incorporação é dirigida à administração pulmonária (por exemplo, pelo nebulização) de 3 mg ou mais de proteína de ligação ao antígeno uma vez pur semana.

Os exemplos dos regimes terapêuticos fornecidos aqui compreendem a o injeção subcutânea de uma proteína de ligação ao antígeno uma vez por semana, em um dose de 1,5 a 3 mg, para tratar uma condição em que IGF-1 R sinaliza o início de um papel. Os exemplos de tais condições são fornecidos aqui e incluem, por exemplo, o câncer, a acromegalia e os outras desordens do crescimento, como diabete, obesidade, degeneração macular, e envelhecimento, M 15 administração semanal da proteína de ligação ao antígeno é continua até que um resultado desejado seja conseguido, por exemplo, os sintomas do paciente cessem. O tratamento pode recomeçar com as doses necessárias, ou, alternativamente, doses de manutenção podem ser administradas.

Outros exemplos de regimes terapêuticos fornecidos aqui compreendem a ) administração subcutânea ou intravenosa de uma dose de 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, ou 20 mg de um inibidor de IGF-1 R da presente invenção por massa do corpo por quilograma do paciente (mg/kg). A dose pode ser administrada uma vez ao paciente, ou mais de uma vez em um determinado intervalo, por exemplo, uma vez por dia, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana, 25 três vezes por mês, duas vezes por mês, uma vez por mês, uma vez em cada dois meses, uma vez em cada três meses, uma vez em cada seis meses ou uma vez em um ano. A duração do tratamento e todas as mudanças na dose e/ou na freqüência do tratamento, podem ser alteradas ou variada durante o tratamente d fim de encontrar-se as necessidades particulares do paciente.

Em uma outra incorporação, uma proteína de ligação ao antígeno é administrada ao indivíduo em uma quantidade e por um tempo suficiente para induzir uma melhoria, preferivelmente uma melhoria sustentada, pelo menos em um indicador que reflita a severidade da desordem que está sendo tratada. Vários indicadores que refletem a extensão da doença, da enfermidade ou da condição 5 do paciente podem ser estimados para determinar se a quantidade e tempo do tratamento são suficientes. Tais indicadores incluem, por exemplo, indicadores clinicamente reconhecidos da severidade da doença, sintomas ou manifestações da enfermidade em questão. Em uma incorporação, uma melhoria é considerada para ser sustentada se o paciente exibir a melhoria pelo menos em duas ocasiões o separadas por duas a quatro semanas. O grau de melhoria é determinado geralmente por um médico, que possa fazer esta determinação baseada em sinais, em sintomas, em biopsias, ou em outros resultados de teste, e que possa também empregar os questionários que são administrados ao paciente, tal como os questionários de qualidade de vida desenvolvidos para uma dada doença.

Os níveis elevados de IGF-1 e/ou IGF-2 são associados com um número de enfermidades, incluindo, por exemplo, câncer (cânceres, por exemplo, do pulmão, de próstata, de mama e de cólon), e acromegalia e outras desordens do crescimento (por exemplo, crianças constitucionalmente altas). Os pacientes com uma dada desordem podem ser selecionados, para identificar aqueles indivíduos ) com elevados níveis de IGF-1 e/ou IGF-2, identificando desse modo os pacientes que podem beneficiar a maioria do tratamento com uma proteína de ligação ao antígeno ligando-se a IGF-IR. Assim, õs métodos de tratamento fornecidos aqui compreendem opcionalmente uma primeira etapa de medir os níveis de IGF-1 e/ou IGF-2 de um indivíduo. Uma proteína de ligação ao antígeno pode ser 25 administrada a um indivíduo em quem os níveis IGF-I e/ou IGF-2 estão elevados acima do normal. Em uma incorporação, a presente invenção fornece um método de tratar uma desordem sobre o crescimento (por exemplo, acromegalia) compreendendo administrando a um paciente na necessidade deste de uma proteína de ligação ao antígeno da presente invenção e pegvisomante.

Os níveis de IGF-1 e/ou de IGF-2 de um indivíduo podem ser monitorados antes, durante e/ou depois do tratamento com uma proteína de ligação ao antígeno, para detectar mudanças, se existir, em seus níveis. Para algumas desordens, a incidência de niveis IGF-1 e/ou níveis de IGF-2 elevados podem variar de acordo com fatores como o estágio da doença ou a forma particular da doença. As técnicas conhecidas podem ser empregadas para medir os níveis IGF- 1 e/ou IGF-2, por exemplo, no soro de um paciente. Os níveis de IGF-1 e/ou IGF-2 em amostras do sangue podem ser medidos usando qualquer técnica apropriada, por exemplo, ELISA.

As incorporações particulares dos métodos e as composições da invenção envolvem o uso de uma proteína de ligação ao antígeno e um ou mais antagonistas adicionais de IGF-1 R, por exemplo, duas ou mais proteínas de ligação ao antígeno da invenção, ou uma proteina de ligação ao antígeno da invenção e um ou outros antagonistas de IGF-1 R. Em incorporações mais adicionais, a proteína de ligação ao antígeno é administrada sozinha ou em combinação com outros agentes úteis para tratar a condição com que o paciente e afligido. Os exemplos de tais agentes incluem drogas proteináceas e não- proteináceas. Quando a terapêutica múltipla é co-administrada, as dosage, is podem ser ajustadas adequadamente, como é reconhecido no estado da técnica pertinente. “Co-administração” é a terapia de combinação e não são limitadas à administração simultânea, mas incluem também os regimes de tratamento em que uma proteína de ligação ao antígeno é administrada pelo menos uma vez durante um curso de tratamento que envolve administrar pelo menos um outro agente terapêutico ao paciente.

Os exemplos de outros agentes que podem ser co-administrados com ur>a proteína de ligação ao antígeno são outras proteínas de ligação ao antígeno ou polipeptidios terapêuticos que são escolhidos de acordo com a condição particular a ser tratada. Alternativamente, as drogas não-proteináceas que são úteis em tratar uma das condições particulares discutidas acima podem ser co- administradas com um antagonista de IGF-1 R.

Terapia de Combinação

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar um paciente com uma proteína de ligação ao antígeno inibindo IGF-1 R e um ou outros tratamentos. Em uma incorporação, tal terapia de combinação consegue a sinergia ou um efeito aditivo, por exemplo, atacando locais múltiplos ou alvos moleculares em um tumor. Os tipos de terapias de combinação que podem ser usadas em relação à presente invenção incluem (como apropriado) nódulos múltiplos de inibição ou ativação em uma única cascata relacionado a doença, múltiplas rotas em uma célula alvo, e tipos múltiplos de célula dentro de um tecida alvo (por exemplo, dentro de um tumor). Por exemplo, um inibidor de IGF-1 R da o presente invenção pode ser combinado com um tratamento que inibe IGF-1, promove a apoptose, inibe a angiogênese ou inibe o macrófago. Em uma outra incorporação, um agente alvejado, que, quando usado por si, falha ao elicitar um efeito terapeuticamente desejado, poderia ser usado, por exemplo, para sensibilizar células de câncer ou aumentar o efeito do tratamento de outros 15 agentes. Em uma outra incorporação, um inibidor de IGF-1 R de acordo com u invenção é usado em combinação com uma droga citotóxica ou outro agente alvejado que induz a apoptose. Em uma outra incorporação, um inibidor de IGF-1 R é usado em combinação com um ou mais agentes que inibem os alvos diferentes que são envolvidos na sobrevivência da célula (por exemplo, PKB, mTOR), em j receptores de tirosinas quinases diferentes (por exemplo, ErbBI, ErbB2, c-met, c- kit), ou em tipos diferentes de células (por exemplo, inibidores de KDR, c fms). Em uma outra incorporação, um inibidor de IGF-1 R da invenção é adicionado ao padrão existente do cuidado para uma condição particular. Os exemplos de agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, gemcitabina, taxol, 25 taxotere e CPT-11.

Em uma outra incorporação, um método da terapia da combinação compreende a administração ao paciente de dois, três, quatro, cinco, seis ou mais agonistas ou antagonistas de IGF-1 R descritos aqui. Em uma outra incorporação, o método compreende a administração ao paciente de dois ou mais tratamentcj 30 que junto inibem ou ativam (diretamente ou indiretamente) a transdução mediada por sinalização de IGF-1 R. Os exemplos de tais métodos incluem o uso de combinações de duas ou mais proteínas de ligação ao antígeno inibindo IGF-1 R, de uma proteína de ligação ao antígeno inibindo IGF-1 R e um ou outros agonistas de IGF-1, IGF-2, e/ou antagonistas de IGF-1 R (por exemplo, os polipeptidios 5 ligados a IGF-1 e/ou IGF-2, os derivados de polipeptidios ligados IGF-1 R, IGF-1 e/ou IGF-2, anticorpos anti-IGF-1 e/ou IGF-2, ácidos nucléicos anti-senso contn. IGF-1, IGF-2, e/ou IGF-1 R, ou outras moléculas que ligam-se aos polipeptidios de IGF-1, de IGF-2, e/ou de IGF-IR ou aos ácidos nucléicos), ou de uma proteína de ligação ao antígeno inibindo IGF-1 R e um ou outros tratamentos (por exemplo, o cirurgia, ultra-som, radioterapia, quimioterapia, ou tratamento com outros agentes anti-cancer), como descrito, por exemplo, nas patentes US5,473,054 (emitida em 5 de dezembro de 1995), 6,051,593 (emitida em 18 de abril de 2000), 6,084,085 (emitida em 4 de julho de 2000), 6,506,763 (emitida em 14 de janeiro de 2003), US 03/0092631 (publicado em 15 de maio de 2003), 03/0165502 (publicado em 4 15 de setembro de 2003), 03/0235582 (publicado em 25 de dezembro de 2003), 04/0886503 (publicado em 6 de maio de2004), 05/0272637 (publicado em 8 de dezembro de 2005), WO 99/60023 (publicado em 25 de novembro de 1999), WO 02/053596 (publicado em 1 de julho de 2002), WO 02/072780 (publicado em 19 de setembro de 2002), WO 03/027246 (publicado em 3 de março de 2003), WO ) 03/020698 (publicado em 13 de março de 2003), WO 03/059951 (publicado eci 24 de julho de 2003), WO 03/100008 (publicado em 4 de dezembro de 2003), WO 03/106621 (publicado em 24 de dezembro de 2003), WO 04/071529 (publicado em 26 de agosto de 2004), WO 04/083248 (publicado em 30 de setembro de 2004), WO 04/087756 (publicado em 14 de outubro de 2004), WO 05/112969 25 (publicado em 1 dedezembro de 2005), Kull et al, 1983, J Biol Chem 258:6561-66, Flier et al, 1986, Proc Natl Acad Sei USA 83:664-668, Conover et al, 1987, J Cell Physiol 133:560-66, Rohlik et al, 1987, Biochem Biophys Res Comm 149:276-81, Arteaga et al, 1989, J Clinical Investigation 84:1418-23, Arteaga et al, 1989, Cancer Res 49:6237-41, Gansler et al, 1989, American J Pathol 135:961-66, 30 Gustafson et al, 1990, J Biol Chem 265:18663-67, Steele-Perkins et al, 1990,

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Em uma outra incorporação, o método compreende a administração de um ou mais antagonistas de IGF-1 R descritos aqui e um ou outros tratamentos (um 5 tratamento, por exemplo, terapêutico ou paliativo), por exemplo, tratamentos anti- câncer (tais como, a cirurgia, o ultra-som, o radioterapia, a quimioterapia, ou o tratamento com um outro agente anti-câncer). Onde um método compreende a administração de mais de um tratamento a um paciente, deve ser compreendida que a ordem, o sincronismo, o número, a concentração, e o volume das o administrações estão limitadas somente pelas exigências médicas e as limitações do tratamento, isto é, dois tratamentos podem ser administrados ao paciente, por exemplo, simultaneamente, consecutivamente, alternadamente, ou de acordo com qualquer outro regime. Os exemplos dos agentes que podem ser administrados em combinação com antagonistas de IGF-1 R descritos aqui incluem, mas não são 15 limitados a, agentes de aumento de neutrófilos, irinotecan, SN-38, gemcitabina, herstatina ou um derivativo de ligação a IGF-1 R de herstatina (como descrito, por exemplo, no pedido de patente US 05/0272637), AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA), HERCEPTIN® (Genentech), RITUXAN® (Genentech), ARIMIDEX® (AstraZeneca, Wilmington,.DE), IRESSA® (AstraZeneca), BEXXAR® j (Corixa, Seattle, WA), ZEVALIN® (Biogen Idee, Cambridge, MA), ERBITUX® (Imclone Systems Inc., New York, NY), GEMZAR® (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), CAMPTOSAR® (Pfizer, New York, NY), GLEEVEC® (Novartis), SU-11248 (Pfizer), BMS-354825 (Bristol-Myers Squibb), panitumumab (Abgenix, Fremont, CA/Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), and denosumab (Amgen Inc., Thousand 25 Oaks, CA).

Os seguintes exemplos, reais e profilácticos, são fornecidos com a finalidade de ilustrar incorporações especificas ou características da invenção atual e não limitam seu escopo.

Exemplo 1: 30 Preparação de Antibióticos

Este exemplo demonstra um método de preparar os anticorpos que reconhecem o receptor de IGF-1. Os polipeptidios do receptor de IGF-1 podem ser empregados como imunogenes para gerar anticorpos monoclonais por técnicas convencionais. Reconhece-se que os polipeptidios em vários formatos podem ser 5 empregados como imunogenes, por exemplo, proteínas inteiras, fragmentos destas, proteínas de fusão desta como fusões Fc, células que expressam a proteína recombinante na superfície celular, etc.

Para sumarizar um exemplo de tal procedimento, um imunogene de IGF-1 R é emulsificado por completo. Adjuvante de Freund é injetado subcutaneamente em o ratos de Lewis, em quantidades que variam de 10 μl -100 μl. Três semanas mais tarde, os animais imunizados são impulsionados com imunogene adicional emulsificados com adjuvante de Freund incompleto e impulsionados a cada três semanas depois deste. As amostras do soro são periodicamente feitas pelo sangramento orbital ou excisão da ponta da cauda para testagem por ensaio dot- 15 blot, ELISA (imunoensaio de ligação a enzima), ou inibição por ligação 125I-IGF-1 ou 125l-IGF-2 aos extratos celulares expressando IGF-1 R. Depois da detecção de um anticorpo apropriado, é aplicada aos animais positivos uma injeção intravenosa final de antígeno em solução salina. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados, os baços colhidos, e fundidos à linhagem celular murina AG8653 do > mieloma. As linhagens resultantes do hibridoma são chapeadas em placas múltiplas de microtitulação em um meio seletivo HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células, de mieloma híbrido e de híbrido de células não fundidas do baço.

Clones de hibridomas são gerados assim e selecionados para a reatividade 25 com IGF-1 R. A seleção inicial de sobrenadantes do hibridoma utiliza uma captação do anticorpo e uma ligação do receptor 125I-IGF-1 parcialmente purificado. Os hibridomas que são positivos neste método de seleção são testados por uma captação modificada do anticorpo para detectar as linhagens de células do hibridoma produzidas que estão obstruindo o anticorpo. Hibridomas que secretam 30 um anticorpo monoclonal são capazes de inibir 125I-IGF-1 que se liga às células que expressam IGF-1R são então detectados. Tais hibridomas são então injetados nas cavidades peritoneais de ratos nus para produzir ascites que contêm concentrações elevadas (>1 mg/ml) do anticorpo monoclonal anti-IGF-1R. Os anticorpos monoclonais resultantes podem ser purificados pela precipitação do 5 sulfato de amónia seguida pela cromatografia de exclusão em gel, e/ou a cromatografia de afinidade baseada na ligação do anticorpo aos métodos similares da proteína G. Pode ser usado para gerar anticorpos humanos em ratos transgênicos. Ver, por exemplo, Chen et al., 1993, Internal. Immunol. 5: 647-56; Chen et al, 1993, EMBO J. 12: 821-30; Choi et al, 1993, Nature Genetics 4: 117- o 23; Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51; Harding et al., 1995, Annals New York Acad. Sci.; Lonberg et al, 1994, Nature 368: 856-59; Lonberg, 1994, Handbook Exper.l Pharmacol. 113: 49-101; Lonberg et al, 1995, Internal Rev. Immunol. 13: 65-93; Morrison, 1994, Nature 368: 812-13; Neuberger, 1996, Nature Biotech. 14: 826; Taylor et al., 1992, Nuc. Acids Res. 20: 6287-95; Taylor et al., 15 1994, Internal Immunol. 6: 579-91; Tomizuka etal., 1997, Nature Genetics 16: 133 43; Tomizuka et al., 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97: 722-27; Tuaillon et al., 1993, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 3720-24; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912-20; Russel et al., 2000, Infection and Immunity April 2000: 1820-26; Gallo et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30: 534-40; Davis et al., 1999, Cancer j Metastasis Rev. 18:421-25; Green, 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23; Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Rev. 31:33-42; Green et al, 1998, J. Exp. Med. 188: 483-95; Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7: 607- 14; Tsuda et al, 1997, Genomics 42: 413-21; Mendez et al, 1997, Nature Genetics 15: 146-56; Jakobovits, 1996, Weir's Handbook of Experimental Immunology, The 25 Integrated Immune System Vol. IV, 194.1- 194.7; Mendez e/ α/.,1995, Genomics 26: 294-307; Jakobovits, 1994, Current Biol. 4: 761-63; Arbones, 1994, Immunity 1: 247-60; Green et al, 1994, Nature Genetics 7: 13-21; Jakobovits et al, 1993, Nature 362: 255-58; Jakobovits et al, 1993,. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 2551-55.

EXEMPLO 2: Isolamento de um IGF-1R (ECD)-C3-mulgG1 humano.

Este exemplo fornece um método de produção de um fragmento solúvel de IGF-1 R utilizado para aumentar anticorpos. Clonagem de pDSRa:hulGF-1R(ECD)-C3-mulgG1Fc. Primers 2830-36: 5' AGCAAGCTTCCACCATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAGG 3’ SEQ ID NO:256) e 2830-38: 5’ ATTTGTCGACTTCGTCCAGATGGATGAAGTTTTCAT 3', SEQ ID NO:257) foram usados para amplificar a seqüência extracelular humana do cDNA do domínio de IGF-1 R (1-906). Os primers incluíam uma seqüência de iniciação da tradução Kozak (sublinhada acima) que precede o códon de inicialização, sítios de restrição para subseqüente subclonagem, e um sítio caspase-3, no qual é inserir1 j próximo do domínio extracelular c-terminal. O PCR foi executado em um Perkin Elmer 2400 (Perkin Elmer, Torrance, CA) sob as seguintes condições: 1 ciclo em 95° C por 2 minutos, 23 ciclos em 95° C por 30 segundo, 58.5° C por 30 segundos, e 72° C por 3 minutos e 1 ciclo em 72° C por 10 minutos. As condições finais da reação fram com tampão YKpfu TURBO® (Stratagene, La Jolla, CA), 200 μM dNTPs, 2 μM cada primer, 5 Upfu TURBO® (Stratagene) e DNA do molde de 1 ng. O produto de PCR foi purificado usando uma coluna de Clontech Nucleosp’ ? (Clontech, Paio Alto, CA) de acordo com as instruções dos fabricantes, digerida com Hind III e Sal I (Roche, Indianapolis, IN) e purificado em gel. O IGF-1 R humano inserido foi ligado a pDSRa-mulgGI e digerido por Hind III/ Sal I. A integridade da inserção foi confirmada pela seqüência do DNA. A seqüência da proteína codificada resultante pela estrutura de leitura aberta (IGF-1 R-C3-muFc) é mostrada na figura 10. O vetor de expressão expressão final, pDSRa: hulGFIR (ECD) -C3-mulgGIFc é descrito na tabela 1. Tabela 1

Expressão do hu IGF-1 R(ECD)-C3-mulgG1Fc.

Quinze microgramas do vetor de expressão: pDSRα:hulGFIR (ECD) -C3- mulgGIFc foi transfectada nas células AM-I/D CHOd- usando o reagente de lipofecção de LTI (PanVera Corp., Mádison, Wl), e em células cultivadas sob 5 condições para permitir a expressão e a secreção da proteína nos meios celulares.

Vinte e quatro colônias foram selecionadas após 10-14 dias no meio de seleção de DHFR (Dulbecco's Modified Eagles Medium (Invitrogen) suplementado com o soro fetal bovino 10% dializado, 1X penicilina-streptomicina (Invitrogen)) e niveis da expressão avaliados por West Blot. Para executar este ensaio, 0,5 ml do meio livre io do soro foram adicionados às únicas células confluentes boas cultivadas em uma placa de 24 poços (Falcon). O meio condicionado foi recuperado após 48hs. As amostras por West blot foram corridas em gel de Tris-glicina 10% (Novex), e marcado em uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm (Invitrogen), usando mini células trans-blot (Biorad). As membranas marcadas foram incubadas com o 15 anticorpo de coelho anti-rato IgG Fc, conjugadas com peroxidase de horseradish (Pierce). O clone que expressa nível mais elevado de IGF-1 R (ECD) - C3-mulgG IFc foi expandido no meio da seleção de DFfFR e 2 x 107 células foram inoculadas em 50 frascos cilíndricos cada (Corning) em 250 ml DMEM (de alta-glicose (Invitrogen), 10% FBS dializado (Invitrogen), 1 x glutamina (Invitrogen), 1 x 20 aminoácidos não essenciais (Invitrogen), 1 x piruvato de sódio (Invitrogen). O meio era gaseificado com 10% CO2/ar balanceado por 5 segundos antes de tampar o frasco. Os frascos foram mantidos à 37°C centrifugado à 0,75 rpm.

Quando as células alcançaram aproximadamente 85-90% de confluência (após aproximadamente 5-6 dias na cultura), meio de crescimento foi descartado, 25 as células lavadas com 100 ml PBS e 200 ml de meio de produção foi adicionado (50% DMEM) (de lnvitrogen/50% F12 (Invitrogen), 1 x glutamina (Invitrogen), 1 x aminoácidos não-essenciais (Invitrogen), 1 x piruvato de sódio (Invitrogen), 1,5% DMSO (Sigma)). O meio condicionado foi coletado e substituído em intervalos de uma semana. Os 30 litros resultantes do meio condicionado foram filtrados através de 0,45 μm de acetato de celulose (Corning, Acton, MA).

Purificação do hu IGF-1RCECDVC3-mulgG1Fc

O filtrado resultante do meio condicionado foi concentrdao em 20 dobras usando um cartucho de corte-espiral (peso molecular de corte = kDa 10), então diluído 1:1 com KCI3M, glicina 1M, pH 9,0 levando a uma concentração final de sal KCI 1,5 M, glicina 0.5 M, pH 9.0. Esta amostra foi aplicada a uma coluna de ’0 rProtein Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Upsália, Sweden) que foi equilibrada em KCI 1.5 M, glicina 0,5.M, pH 9.0. A coluna foi lavada com 40 volumes da coluna do mesmo tampão, a seguir foi eluída com 20 volumes da coluna de glicina-HCI 0,1 M, pH 2,8. As frações de 5mL foram coletadas e neutralizadas imediatamente com 1 mL de 1 M Tris-HCI, pH 7.5. As frações que 15 contêm o hulGFIR (ECD) - mulgGFc de C3- foram identificadas por SDS-PAGE, , e dializadas junto ao tampão fosfato salino. O rendimento foi de 2,4 mg/L do meio condicionado. As espécies principais da proteína detectadas foram as cadeias α e β de Fc murino, cada qual pareceram ser corretamente glicolizados baseados em seus pesos moleculares elevados e heterogêneos. IGF-1R não processado (ECD), o assim como IGF-1 R glicolizado, mas não proteoliticamente clivado (CED), também presente na preparação. O deslocamento nas faixas de pesos moleculares mais elevados sob condições de não redução indica que as pontes bissulfeto juntaram as cadeias α e β. O alinhamento em seqüência do amino-terminal do produto final indicou que 60% da proteína foi processado corretamente entre cadeias α e β de 25 IGF-1 R (ECD), enquanto 40% permaneceram não processados.

EXEMPLO 3: Isolamento de INSR (ECD) - mulgGI humano

Este exemplo apresenta um método de clonagem e de expressar um fragmento solúvel do receptor de insulina humana. Primers 2830-40: 5 ' AGCAAGCTTCCACCATGGGCACCGGGGGCCGG 3 ' SEQ ID NO : 259 (sítio Hind III sublinhado) e 2830-41: 5 ’ ATTTGTCGACTTTTGCAATATTTGACGGGACGTCTAA 3 ' SEQ ID NO : 260 (sitio Sal I sublinhado) foram usados para amplificar o domínio extracelular humano de INSR (1-929) e de plamidio parental INSR que codifica o formato B da variante splice INSR (Ullrich et al., 1985, Nature 313:756-61; Ebina et al., 1985, Cell 40:747-58). Os primers incluíram uma seqüência de iniciação de tradução de Kozak que precede os sítios do códon de inicialização para a subseqüente sub- clonagem. PCR foi executado em um Perkin Elmer 2400 sob as seguintes condições: 1 ciclo à 95° C por 2 minutos, 32 ciclos à 95° C por 30 segundos, 58,5’ C por 30 segundos, e 72° C por 3 minutos, e 1 ciclo à 72° C por 10 minutos. As condições finais da reação eram 1X tampão pfu TURBO®, 200 μM de dNTPs, 2 μM de cada primer, 5 U pfu TURBO® (Stratagene) e 10 ng de molde de DNA. O produto de PCR foi purificado usando uma coluna de NUCLEOSPIN® (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) de acordo com as instruções do fabricante, digeridas com Hind III e Sal I (Roche), e o gel purificado antes da ligação com Hind lll/Sa/1 digerido por pDSRa-mulgG1. A integridade da inserção foi confirmada peio alinhamento da seqüência do DNA. A seqüência da proteína do INSR-muFc é mostrada na figura 11.0 vetor final de expressão é descrito na tabela 2. Tabela 2 plasmídio base Número par:

Expressão do hu INSR (ECD) -C3-mulgG1Fc

As células AM-1/D CHOd- foram transfectadas com 15 μm de pDSRa linearizado do vetor da expressão: hulNSR (ECD) - mulgGIFc usando o reagente de lipofecção de FUGENE™ 6 (Roche Diagnóstico Corp., Indianapolis, IN), 5 cultivado então sob condições para permitir a expressão e a secreção da proteína no meio celular. As colônias foram selecionadas e analisadas como descrito acima.

Purificação do hu INSR (ECD) - C3-mulgG1Fc

O meio condicionado filtrado contendo o hulNSR (ECD) - mulgGFc foi concentrado usando um cartucho espiral ( peso molecular de corte = 10KDa), diluído então 1:1 com KCI 3M, glicina 1 M, pH 9.0 para chegar a uma concentração final de sal KCI 1,5 M, glicina 0,5 M, pH 9.0. Esta amostra foi aplicada a uma coluna Sepharose de rProteina (Pharmacia) que foi equilibrada no 5 KCI 1,5 M, glicina 0,5 M, pH 9.0. A coluna foi lavada com 40 volumes da coluna do mesmo tampão, a seguir foi eluida com’20 volumes de glicina-HCI 0,1 M, pH 2,8 da coluna. As frações de 5mL foram coletadas e neutralizadas imediatamente com 1mL de Tris-HCI 1 M, pH 7,5. As frações que continham o hulNSR (ECD) - mulgGFc foram identificadas por SDS-PAGE e dializadas junto ao tampão fosfato m salino. O rendimento foi de 0,9 mg/L do meio condicionado. As espécies principais da proteína eram as cadeias α e β e Fc murino. Cada uma destas espécies pareceu estar corretamente glicolizadas baseadas no seu elevado peso molecular e heterogêneo. O INSR(ECD) não processado foi assim como INSR glicolizado, mas não proteoliticamente clivado, também presente na preparação. O 15 deslocamento nas faixas dos pesos moleculares mais elevados sob condições de não redução indicou que pontes bissulfeto ligaram as cadeias α e β. O alinhamento em seqüência do Amimo-terminal do produto final indicou que 87% da proteína foi processada corretamente entre as cadeias α- e as β de INSR (ECD), enquanto 13% permaneceu não procesada.

EXEMPLO 3: Seleção inicial para fago Fab Anti-IGF-1R

Este exemplo fornece um método de identificar anticorpos anti-IGF-1R.

Uma biblioteca Quest Q Fab do alvo (“the TQ library"; Target Quest, Maastricht, the Netherlands), foi construída usando linfócitos periféricos do sangue 25 de quatro doadores saudáveis e linfócitos do baço de um paciente com carcinoma gástrica, foram obtidos. A diversidade da biblioteca era de 3.7 x 1010 clones, contendo 3x109 de cadeias pesadas. A fonte, os métodos de seleção e a caracterização da biblioteca foram publicados (e Raaid e outros, 1999, J. Biol Chem 274:18218). Dinabeads (200 μl) M-450 sem revestimento (catálogo # 30 1 40.02, Dynal, Lake Sucess, NY) foram lavados 3 vezes com PBS, resuspendido em 200 μl de IGF-1 R (ECD) - C3-mFc a uma concentração de 0,5 μM em PBS, e incubados à 4° C em um roteador overnight. Os grânulos revestidos com IGF-1 R (ECD) - C3-mFc foram lavadas 3x com 1 ml do leite em pó sem gordura 2% (M) em PBS (2% MPBS), e então inibidas com 1 ml de 2% MPBS na temperatura 5 ambiente por 1 hora. Em paralelo, 750 μl da biblioteca de TQ (pfu 4x1012) foi misturado com 250 μl 8% MPBS na temperatura ambiente de 30 minutos a 1 hora. 500 μl de grânulos bloqueadas foram transferidas para um outro tubo de microcentrifugação e separado da solução de inibição em um separador magnético. A mistura dos fagos pré-bloqueados foi adicionada às partículas '0 bloqueadas e incubada por 90 minutos em um roteador a temperatura ambiente.

Fagos ligados às partículas foram separados dos fagos não ligados, e então lavados 6x com 1ml 2% MPBS/0.1%Tween 20, 6x com 1ml de PBS/ 0.1%Tween 20, 2x com PBS, com uma mudança dos tubos entre soluções diferentes de lavagem. O fago ligado foi então eluído com 1 ml de TEA 0.1M (pH 11) por 10 15 minutos, então separados imediatamente dos grânulos e neutralizados com 0,5 ml de Tris.HCI 1 M. O pool de fago eluído foi misturado com 4 ml de caldo 2x YT (10 g de extrato de fermento, 16 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl por litro de água) e 5 ml de cultura bacteriana TGI (O.D. 590 aproximadamente 0.5) em um tubo cônico de 50 ml. A mistura de infecção foi incubada à 37° C em uma incubadora por 30 lo minutos, e então centrifugada à 3500 RPM por 20 minutos. O precipitado celular foi resuspendido em 1500 μl de caldo 2xYT-CG e 300 μl foram espalhados em cada uma de cinco placas 2xYT-CG (caldo 2x YT contendo 100 μg/ml de carbenicilina e 2% de glicose ). Após 20 horas de incubação à 30° C, 4 ml de 2x YT-AG foram adicionados a cada placa e as células foram recuperadas com uma 25 lâmina da placa. Esta etapa foi repetida três vezes. Uma pequena parte das células recuperadas foi usada para o resgate do fago (ver abaixo). A suspensão restante da célula foi centrifugada à 3500 rpm por 20 minutos. O precipitado celular foi suspenso em uma quantidade de 50% de glicerol, aproximadamente metade do volume do precipitado celular e armazenado à -80° C.

A fim de resgatar o fago, a suspensão celular amplificada da placa foi usada para inocular 40 ml de 2x YT-CG a um OD590 de aproximadamente 0,05. A cultura foi incubada à 37° C em um shaker para OD590 0,5. A cultura em fase log foi infectada com o fago ajudante M13KO7 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, catálogo # 18311 - 019, 1.1 x 1011 pfu/ml) em M.O.I. 20 seguida pela incubação à 37° C 5 por 30 minutos. As células infectadas foram centrifugadas à 4000 RPM por 20 minutos. O precipitado celular foi re-suspendido em 200 ml de 2xYT-CK (100 μg/ml carbenicilina e 40 μg/ml de kanamicina) e transferido a dois frascos de 250 ml e incubados à 30° C com agitação à 270 rpm por 20 horas. A cultura overnight foi centrifugada à 4000 rpm por 20 minutos para remover os restos celulares. A ' 0 centrifugação foi repetida para assegurar a remoção do resto celular.

Aproximadamente 1/5 de volume da solução de PEG (20% de PEG 8000, NaCI 2.5 M) foi adicionado ao sobrenadante para precipitar as partículas de fago. A mistura foi incubada no gelo no mínimo por 1 hora, seguida por centrifugação à 4000 rpm por 20 minutos para coletar as partículas de fago precipitadas. O precipitado de 15 fago foi re-suspendido em 1 ml de PBS e foi transferida a um tubo do microcentrifugação. A suspensão de fago foi deixada no gelo por 1 hora paia permitir a suspensão completa de partículas fago, e clarificado por centrifugação à 14.000 rpm por 2 minutos para remover os restos celulares residuais. A etapa de precipitação do fago foi repetida. O precipitado de fago final foi suspenso em PBS ^0 após a clarificação. A suspensão de salvo salvada foi usada na rodada seguinte da seleção.

Quatro rodadas da seleção foram executadas que incluíram alterações de vários parâmetros de ligação padrão. A segunda rodada da seleção foi idêntica a primeira rodada da seleção. As variações no reagente fago do número e da 25 eluição da entrada foram introduzidas nas rodadas três e quatro. Para a rodada três da seleção, o pfu 5xl011 de fagos foi selecionado e os fagos ligados foram eluidos com 1 μM IGF-1 (catálogo # 13769, Sigma, St Louis, MO) ou com uma concentração 1 μM de um anticorpo quimérico αlR3-huFc para render duas rodadas - três pools, de TQ4-3IS e TQ4-3CA. A quarta rodada da seleção foi realizada em pools de fagos resgatados de ambas rodadas e três pools. Duas rodadas de seleção negativa com rato IgG revestido com DYNABEADS® Fc (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) foram incluídas para remover os ligantes do rato Fc antes da seleção atual de IGF-1 R. O tempo de incubação para a seleção negativa foi de 30 minutos cada uma. O pfu 3.78x1011 do pool de TQ4-3IS e o pfu 5 3.75x1012 do pool de TQ4-3CA foram selecionados separadamente. O fago ligado foi eluído com 1 μM IGF-2 (catálogo #.12526, Sigma, St Louis, MO) para render duas rodadas-4 pools, TQ4-4ISI2 e TQ4-4CAI2. A seqüência de aproximadamente 96-192 inserções do DNA fagos foi determinada em cada etapa de eluição.

Em alguns casos, uma seleção secundária foi feita. As misturas do DNA de .o Phagemid da biblioteca total de TQ, e o fago selecionado amplificaram após diversas rodadas da seleção junto a IGF-1 R, foram preparados usando um kit do DNA Maxiprep de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Valença, CA). Todas as quatro preparações do DNA foram digeridas com Asc I e com EcoR I (New England Biolab, Beverly, MA). Os dois fragmentos resultantes Asc l/EcoR i 15 foram separados em um preparado de géis de 0,5% de agarose. Os fragmentos de 2.1 kb que continham cadeias pesadas foram purificados em gel à partir de fagos selecionados de IGF-1 R. Os fragmentos de 3.9 kb que continham as cadeias leves e a parte do vetor de pCES1 foram purificados em gel à partir da biblioteca total TQ de DNA. Os fragmentos de 2.1 kb foram ligados aos fragmentos de 3.9 kb ko da amostra da biblioteca de TQ de DNA na relação de 3:1. O DNA ligado foi precipitado e foi usado para transformar células TGI por eletroporação. O tamanho da biblioteca resultante da biblioteca secundária misturada com a cadeia leve foi de 8.8xl08. Após sequenciar 96 clones escolhidos aleatoriamente, 76 seqüências de cadeias leves originais foram obtidas, indicando que a tentativa de misturas das 25 cadeias leves foram bem sucedidas. •

A condição de ligação, lavagem e eluição para selecionar a biblioteca misturada de cadeia leve foi essencialmente a mesma que decrita para a separação inicial. Entretanto, diversas variações foram incluídas para aumentar a pressão da seleção para a amplificação de ligantes de IGF-1 R com afinidades 30 mais elevadas, especialmente aquelas com taxas significativamente mais lentas.

Estes parâmetros foram: número mais elevado da entrada de fago (pfu 2-2,7 x IO13), menor volume de partícula (100 μl para rodada um, 50 μl para a rodada dois, e 25 μl para a rodada três), e o tempo específico de eluição estendido até 20 horas. Os tampões de eluição foi TEA 0,1 M para rodada um (RDI), 1 μM IGF-1 em 5 0.4% MPBS para RD2 e 1 μM IGF-1 ou IGF-2 em 0.4% MPBS para RD3. Em RD2 e em RD3, os ligantes que foram eluidos em 15 minutos ou 2 horas foram rejeitados. A eluição foi continuada e os fagos eluidos foram coletados após 8-10 horas e novamente após 20 horas.

A Seperação do fago fab por ELISA

Em uma placa de 96 poços de 2 ml, 480 pl/poço de caldo 2xYT-CG foi inoculado com 20 μl de culturas overnight de clones do indivíduo, em seguida incubadas à 37° C, 300 rpm por 3 horas. Em cada poço, 50 μl de fago ajudante M13KO7 diluído 1: 3 foi adicionado para infectar as células. O bloco foi incubado à 37° C sem agitação por 30 minutos, e foi agitado então delicadamente por outros 15 30 minutos à 150 rpm. O bloco foi centrifigado à 3600 rpm por 20 minutos para precipitar as células infectadas. O precipitado celular de cada poço foi suspenso em 480 μl de 2xYT-CK (caldo 2xYT que contêm 100 μg/ml de carbenicilina e 40 μg/ml de kanamicina), e incubadas à 30° C durante a noite por aproximadamente 20 horas. Os restos da célula foram separados por centrifugação à 3600 rpm por 20 20 minutos. O sobrenadante de fago resgatado foi usado no fago em ELISA para verificar se ocorreu a ligação à clones individuais de IGF-1 R-específico, da reação cruzada-INSR ou de ratos Fc .

Três kits de Nunc MaxiSorb Immunoplates foram revestidos com placa de 100 μl de IGF-1 R-C3-mFc em 5 μg/ml, 5 μg/ml de INSR-mFc, ou rato IgGI 25 (catálogo # 010-0103, Rockland, Gilbertsville, PA) em 2 μg/ml de PBS, respectivamente, à 4o C overnight. As placas revestidas foram lavadas 3x com PBS em 300 pl/poço. As placas lavadas foram obstruídas com 300 pl/poço com 2% MPBS na temperatura ambiente por uma hora. Enquanto isso, os fagos resgatados dos clones individuais foram pré-obstruídos misturando 170 μl do fago 30 resgatado com 170 μl de MPBS 4%. As placas obstruídas foram lavados 5x com 300 pl/poço TBST (TBS: 10 milímetros Tris-HCI, pH 7.5, EDTA de 1 milímetro, 150 milímetros de NaCI; Tween-20. 0.1%). 100 pl/poço das diluições do fago pre- obstruído foram distribuídos a cada kit de placa revestida, e foram incubadas à temperatura ambiente em um balancèador por 90 minutos. As placas foram 5 lavados 5x com 300 pl/poço TBST. 100 pl/poço de anti-M13-HRP em 2% MPBS (diluição 1: 3000, catálogo número 27-9421-01, Amersham Pharmacia Biotech) foram distribuídos, e as placas foram incubadas à temperatura ambiente no balancèador por uma hora. As placas foram 5x lavadas com 300 pl/poço TBST. 100 pl/poço do substrato 1-Step™ ABTS (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, o catalog number 37615) foram adicionados. As placas foram incubadas por uma hora. OD405 foi medido para a detecção do sinal.

Os fagos que apresentam anticorpos não exibiram essencialmente nenhuma reação cruzada com o receptor de insulina e o domínio Fc de ratos. O sinal observado em IGF-1 R ELISA é conseqüentemente especifico para o domínio 15 extracelular de IGF-1 R. Os resultados dos ensaios similares para quatro anticorpos que apresentam fagos são mostrados na figura 14.

As inserções do DNA de IGF-1 R positivo, INSR e lgG1 negativo, e clones foram seqüenciados. Cinquenta e duas seqüências originais de Fab fora' identificadas, tendo as seguintes combinações das seqüências de domínios ^í) variáveis de cadeia leve e de seqüências de domínios variáveis de cadeia pesada: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, LI11HI11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20, H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, 25 L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H4 L48H48, L49H49, L50H50, L51H51, e L52H52, onde “Lx” e “Hx” indica o número de domínio variável de cadeia leve e "Hx” indica 0 número de domínio variável de cadeia pesada da figura 1. “X” apresenta seqüências do polinucleotídeo de cada uma destes domínios variáveis de cadeia leve e pesada. Figuras 2 e 3 apresentam 30 as seqüências correspondentes do aminoácido.

EXEMPLO 4:

Subclonagem de VH e de VL em vetores de expressão de lgG1. Este exemplo apresenta um método de sub-clonagem do domínio variável previamente identificado seqüenciado em um vetor de expressão de lgG1.

Construção do pDSR α 20 e pDSRα20:hlgG1CH pDSRa20: o vetor de expressão do hlgGICH (WO 90/14363) é um derivado de pDSR19: hlgGICH (ver pedido de patente provisional US 60/370,407, depositado em 5 de abril de 2002, "Human Anti-OPGL Neutralizing Antibodies As Selective OPGL Pathway Inhibitors" incorporado aqui pela referência em sua totalidade). O io plasmidio pDSRcd9:hlgG1Cn codificou uma região variável do rato/região constante lgG1 do ser humano (rVh/hCh1). O plasmidio foi construído pela ligação de três partes da região variável do anticorpo do rato Xba I e de BsmB I, produto de PCR, a região constante humana de IgGI (CH-i, dobra, e domínios CH2 e CH3) derivada da clivagem de Sal I e pelo isolamento em gel do fragmento BsmB I e Sal 15 I do plasmidio linear pDSRal9: hlgG1 CH ( extremidades Hind III e BsmB I) e um pDSRa19 linearizadas com extremidades de Xba I e Sal I. pDSRa20 foi produzido modificando o nucleotídeo 2563 em pDSRa19 de uma guanosina para uma adenosina por mutagênese sítio dirigida. O vetor de expressão da cadeia pesada, pDSRa20: hlgGICH região variável do rato / lgG1 região constante do ser humano o (rVh/hCh1), é de 6163 pares de base e contêm 7 regiões funcionais descritas na tabela 3. Tabela 3

Plasmídio linear pDSRα20:hlgG1CH foi preparado por digestão de zí \ plasmídio pDSR20: região variável do rato/região constante lgG1 do ser humano com as enzimas Xba I e o BsmB I para remover a região variável do rato e purificado usando um kit de extração em Gel QIAquick. O plasmídio linear pDSRa20: hlgG1CH contendo o domínio de região constante humana lgG1 de 1.0 kbp foi usado para receber seqüências codificadoras de cadeias pesadas variáveis anti- IGF-1R. Construção de clones de expressão de anti-IGF-1R lgG1 de cadeia pesada A seqüência codificadora para a região variável de anti-IGF-1R das cadeias io pesadas foi amplificada do DNA do phagemid com primers complementares do oligonucleotidio. Os primers para a reação em cadeia da polimerase (PCR) foram projetados para incorporar um sítio Hind III, sítios de Xba I, seqüência de Kozak (CCACC) e seqüência do sinal (o peptidio traduzido é MDMRVP AQLLGLLLLWLRGARC; NO. SEQ DO ID: 263) na extremidade 5 ' da região 15 variável, enquanto um sítio de BsmB I foi adicionado na extremidade 3 ' do produto de PCR. Os produtos de PCR foram digeridos com Xba I e BsmB I, e clonados então em BsmB I Xba I do vetor de expressão pDSRa20:hlgG1CH contendo a região constante humana lgG1 (figura 13). Os vetores finais da expressão continham as sete regiões funcionais descritas na tabela 4. Tabela 4 plasmídio base números par:

Construção de clones de expressão de cadeia variável de anti-IGF-1R lgG1. As cadeias leves codificadas no fago do anti-IGF-1R eram tanto da classe kappa ou lambda. Foram clonadas usando uma de duas possibilidades. Os primers complementares foram projetados para adicionar um sítio Hind III, um sítio 5 Xba I, uma seqüência de Kozak (CCACC) e uma seqüência do sinal (o peptidio traduzido é MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC, NO. SEQ DO ID: 264) foram adicionados na extremidade 5’ da região de codificação. Aquelas cadeias que tiveram regiões sem erros de codificação foram clonadas como produtos de comprimento total. As cadeias leves de comprimento total foram clonadas como io fragmentos de Xba I e de Sal I no vetor de expressão pDSRa20. Os vetores finais da expressão continham sete regiões funcionais descritas na tabela 5. Tabela 5 Plasmídio base Número par:

Alguns clones kappa tinham erros em suas regiões contantes quando comparado com a seqüência da região constante natural humana. Para eliminar essas discrepâncias, a região variável kappa foi amplificada com um primer que introduziria um sítio Xba I na extremidade 5 ' e um sítio BsmB I na extremidade 3 Estes fragmentos foram então ligados junto com uma região constante humana 5 kappa (figura 13) com um BsmB compatível I na extremidade 5 ' e na extremidades 3 ' de Sal I em pDSRα20 com as extremidades Xba I e Sal I.

EXEMPLO 5: Expressão transiente dos anticorpos

Este exemplo fornece um método de expressar transientemente anticorpos 10 de anti-IGF-1R. Os anticorpos foram expressos transientemente nas células 293T adaptadas a suspensão livre de soro. Todas as transfecções foram executadas como culturas de 250 mL.. Resumidamente, 1.25 x 108 células (5.0 x 105 células/mL x 250 mL) foram centrifugadas à 2.500 rpm por 10 minutos à 4o C para remover o meio condicionado. As células foram re-suspendidas em DMEM livre de 15 soro e centrifugadas outra vez à 2.500 rpm por 10 minutos à 4o C. Após aspirar a solução de lavagem, as células foram re-suspendidas no meio de crescimento [DMEM/F12 (3: 1) + 1x suplemento de insulina-transferrina-selênio + 1x Pen Strep Glut + 2mM de L-Glutamina + 20 mM de HEPES + 0,01% Pluronic F68] em uma 500 mL cultura do frasco em agitação. A cultura do frasco foi mantida em placa de !0 agitação magnética à 125 rpm que foi colocada em um incubador humidificado mantido à 37° C e 5% de CO2 . O DNA do plasmidio foi incubado com o reagente de transfecção em um tubo cónico de 50 mL. O complexo do reagente transfecção do DNA foi preparado em 5% do volume final da cultura em DMEM livre de soro. Um micrograma de DNA do plasmidio por mililitro da cultura foi adicionado 25 primeiramente a DMEM livre de soro, seguido por 1 μl cultura de X-TremeGene RO-1539/mL. Os complexos foram incubados em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos e foram adicionados então às células no frasco. A transfecção/expressão foi executada por 7 dias, depois do qual o meio condicionado foi coletado por centrifugação à 4.000 rpm por 60 minutos à 4o C.

Se a transfecção inicial não render 100 μg antibiótico purificado requerido, aqueles clones seram re- expressado em frascos cilíndricos. Estas transfecções usaram as células 293T aderentes crescidas e mantidas em DMEM suplementado com 5% FBS + 1x aminoácidos não-essenciais + 1x PenStrepGlut + 1x Piruvato de Sódio. Aproximadamente, 4-5 x 107 de células 293T foram semeadas em frascos 5 cilíndricos de 850cm overnight. As células previamente semeadas foram então transfectadas no seguinte dia usando o reagente de transfecção FUGENE™ 6. A mistura do reagente de transfecção do-DNA foi preparada em aproximadamente 6,75 mL DMEM livre de soro. 675 μl do reagente de transfecção FUGENE™ 6 foi adicionado primeiramente, seguido de 112 μl DNA do plasmidio. O complexo foi io incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. Toda a mistura foi então adicionada a um frasco cilíndrico. O frasco cilíndrico foi infundido com uma mistura de 5% do gás CO2 , tampado firmemente e colocado em uma incubadora à 37° C em uma mesa agitadora à 0,35 rpm. A transfecção foi executada por 24 horas após a qual, 0 meio foi substituído com 100 mL DMEM + 1x suplemento Insulina- 15 transferrina-selênio + 1x PenStrepGlu + 1x aminoácidos não-essenciais + 1x Piruvato de Sódio. Tipicamente, 2-3 coletas (100ml) foram obtidas de cada frasco em um intervalo de 48 horas. O meio foi condicionado livre de soro coletado junto e centrifugado à 4.000 rpm por 30 minutos à 4o C.

EXEMPLO 6: Purificação em pequena escala do anticorpo Anti-IGF-1R

Este exemplo fornece um método de purificação de anticorpos anti-IGF-1R em uma escala pequena. O meio condicionado foi filtrado através de filtros de 0,45 μm de acetato de celulose e concentrou aproximadamente 8 dobras usando um membrana de fluxo tangential 50 K Vivaflow 200 (Vivascience, Goettingen, 25 Germany). A resina de fluxo rápida SEPHAROSE™ da rProteinA (Biosciences de Amersham, Piscataway, NJ) foi lavado com tampão fosfato salino (2,7 mM de cloreto de potássio, 138 mM de cloreto de sódio, 1,5 mM de fosfato de potássio, e 8.1 mM de fosfato de sódio, pH 7.4) (PBS) quatro vezes e então aplicadas diretamente aos meios concentrados. A quantidade de resina usada foi baseada 30 na concentração do anticorpo determinada por ELISA onde 1 μl da resina foi usado por 5 μg de anticorpo. O meio foi incubado overnight à 4o C com leve agitação. A resina foi centrifugada em 500 g por 10 minutos em 4° C. O sobrenadante foi decantado como uma fração não ligante. A resina foi lavada com PBS quatro vezes por um minuto a temperatura ambiente com agitação leve, 5 coletando cada vez a resina por centrifugação em 500 g por 10 minutos à 4o C. O anticorpo foi eluído incubando a resina com 1,5 volumes de glicina 0.1 M pH 3,0 por 10 minutos a temperatura ambiente. A resina foi centrifugada em 500 g por 10 minutos a 4o C e o sobrenadante decantado como o anticorpo eluído. A etapa de eluição descrita acima foi repetida para um total de três eluições; cada vez que o material eluído foi neutralizado com 0,04 volumes de tris-HCI 1.0 M, pH 9.2. A amostra foi filtrada através de filtros de 0.2 μm de acetato de celulose. A concentração da proteína foi determinada pelo método de Bradford usando o ensaio da proteína Bio-Rad (Bio-Rad laboratórios, Hercules, CA) como as instruções fornecidas usando IgG humano (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) como padrão. A amostra foi comparada a um lgG1 humano, padrão de K (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) usando um gel de poliacrilamida de SDS de tris-glicina ■ 20% (SDS-PAGE) marcado com tinta azul de Coomassie brilhante. Nenhuma proteína de contaminação foi visível nestas preparações.

EXEMPLO 7: o Isolamento de clones de CHO estável expressando anticorpos

Este exemplo fornece um método para isolamento de linhagens celulares estáveis de CHO que expressam anticorpos anti-IGF-1R. A expressão estável de TQ11C, TQ25, TQ 58 e TQ59 IgGI foi conseguida pela co-transfecção de células CHO AMI-D (Pat. US6.210.924, incorporado aqui pela referência em sua 25 totalidade) com construções de expressão pDSRa20 de cadeias pesadas e leves de lgG1. As transfecções do plasmídio foram executadas usando LF2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células CHO de 4x 106AM1-D foram semeadas 24 horas antes da transfecção, em placas de petri FALCON™ plásticas de 100 mm de diâmetro 30 (Falcon BD, Franklin Lake, NJ) em 10 ml do meio de Eagle modificado por Dulber-» (Invitrogen) suplementadas com soro fetal bovino 5%, 1x penicilina-estreptomicina e glutamina (Invitrogen), aminoácidos não-essenciais (Invitrogen), piruvato de sódio, e HT (0.1mm de sodiohipoxantina, 16 nM de timidina; Invitrogen). Aproximadamente 15 mg de cada DNA plasmidial pDSRα21 - cadeia pesada e 5 cadeia leve foram linearizados usando Pvu I (New England Biolabs) e foram diluídos em 2 ml de OPTI-MEM® (Invitrogen). Os plasmídios diluídos foram misturados com 75 μl de LIPOFECTAMINE™ 2000 (LF2000; GBCO/BRL) diluído em 2 ml de OPTI-MEM® e a mistura foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente. No dia seguinte foi adicionado meio de crescimento fresco. As células 10 foram cultivadas no meio completo de crescimento por 48 horas, semeados então no meio de seleção HT em diluições 1:20 e 1:50. Aproximadamente 2 semanas após a transfecção, 12-24 colônias visíveis foram picadas em placas de 24 poços, usando discos estéreis de clonagem (RPI). Clones expressando níveis mais elevados de TQI 1C, TQ25, TQ58 e TQ59 IgGI foram identificados pela análise de 15 imunoblot. Para executar este ensaio, 0,5 ml do meio livre de soro foram adicionados as únicas células confluentes cultivadas em placas de 24 poços (Falcon BD). O meio condicionado foi recuperado após 24 horas, e 10 μl de CM foi misturado com um volume igual de tampão de corrida para correr um gel de poliacrilamida com a proteína Tris-Glicina 10% (Invitrogen). O gel foi transferido io para membranas de nitrocelulose de 0.45 μm poros de tamanho (Invitrogen), e a análise de Western Blot foi feita usando diluição 1: 1000 do anticorpo de cabra anti-humano IgG Fc ImmunoPuro (perfurar Biotecnologia, Inc., Rockford, IL) e ECL como agente de detecção.

EXEMPLO 8: Escala média de expressão dos anticorpos

Este exemplo fornece um método de expressar anticorpos anti IGF-1R expressos por linhagens celulares estáveis de CHO.

As linhagens celulares CHO feitas de acordo com o exemplo 7 foram expandidas nos frascos de cultura de tecido T 175 (Falcon) para escalonar a 30 expressão. Frascos T175 confluentes (aproximadamente 2 -3 x 107 células) foram usados para semear 30 frascos cilíndricos de 850 cm2 (Corning Life Science, Acton, MA), e três frascos cilíndricos confluentes (aproximadamente 1-2 x 108 células por frasco) foram usados para semear 30 frascos cilíndricos em 250 ml de DMEM de alta glicose (Invitrogen), FBS 10% dializado (Invitrogen), 1x glutamina (Invitrogen), 1x aminoácidos não essenciais (Invitrogen), 1x piruvato de sóaio (Invitrogen), O meio foi infundido com CO2 10% /ar balanceado por 5 segundos antes de tampar o frasco cilíndrico. Os frascos cilíndricos foram incubados à 37° C mesas agitadoras à 0.75 rpm.

Quando a célula alcançou aproximadamente 85-90% confluência (aproximadamente 5-6 dias de cultura), o meio de crescimento foi descartado, a célula foi lavada com 100 ml PBS, e 200 ml de meio de produção foi adicionado (50% DMEM (lnvitrogen)/50% F12 (Invitrogen)), 1x glutamina (Invitrogen), ix aminoácido não-essencial (Invitrogen), 1x piruvato de sódio (Invitrogen), 1.5% DMSO (Sigma). O meio condicionado foi coletado a cada sete dias para um total de quatro coletas.

O meio condicionado foi filtrado através de filtros de 0,45 μm de acetato de celulose e concentrou aproximadamente 10 dobras usando uma membrana de fluxo tangencial Sartocon Slice Disposable 30 K (Sartorius AG, Goettingen, Germany). O material concentrado foi aplicado a 10 ml de rProteina A de urna coluna de Sepharose à 4o C e o fluxo foi coletado como fração não ligante. A coluna foi lavada com quatro volumes da coluna de PBS. A amostra ligada foi eluída com aproximadamente quatro volumes da coluna de glicina pH 3.0 0.1 M. O pico de eluição foi coletado e neutralizado com 0,04 volumes de tris-HCI 1,0 M, pH 9,2. O eluído foi dializado junto a 150 volumes de PBS overnight á 4o C. A amostra foi filtrada através de filtros de 0.2 μm de acetato celulose e a concentração da proteína foi medida determinando a absorbãncia em 280nm usando um coeficiente de extinção de 14.000 M-l. A amostra foi comparada a um IgGI humano, padrão d K ( Sigma- Aldrich, St Louis, Missouri, EUA) usando um gel SDS-PAGE de tris-glicina 4-20% marcado com a tinta azul de Coomassie brilhante. Os níveis de endotoxina em cada preparação do anticorpo foram determinados usando o ensaio de Pyrotell Limulus Amebocyte Lysate (Cape Cod Associates, Inc., Falmouth, Ma) como pelas instruções fornecidas.

EXEMPLO 9: Ensaios da competição da resposta de Dose ORIGEN®

Este exemplo fornece métodos de teste de habilidade de um anticorpo ligar um bloco ligante a IGF-1 R.

Um ensaio de ligação de ORIGEN® foi usado para determinar se os anticorpos TQI 1C, TQ25, TQ 58 e TQ59 IgGI poderiam obstruir o ligação que liga a IGF-IR usando os procedimentos fornecidos pelo fabricante (Igen, Inc., 10 Gaithersburg, MD). Para marcar IGF-1 e IGF-2 com rutenium, as proteínas liofilizadas foram dissolvidas em PBS para obter 1.0 mg/ml solução. O marcador (ORI-TAG-NHS ester from Igen cat # 110034) foi adicionada à proteína em uma relação molar de 5:1 (marcador: proteína) de um estoque de marcadores de 5 mg/ml em DMSO. A mistura foi incubada a temperatura ambiente (20-22° C) por 1 15 hora no escuro, a seguir foi tratada com 20 μl de glicina 2M por 10 minutos a temperatura ambiente. A proteína marcada foi separada da não marcada pela aplicação a uma coluna Biosciences NAP-5 da Amersham (Biosciences de Amersham, Piscataway, NJ) equilibrada em PBS e as frações de 0m33 ml foram coletadas. A concentração da proteína das frações foi determinada pelo micro 20 ensaio da proteína de BCA (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). As frações dois e três continham a proteína significativa e foram combinadas. A quantidade de marcadores incorporada do rutenium foi avaliada usando a seguinte fórmula: marcador do composto de tris-bipiridil do rutenium (Ru 32+ (bpy)) de IGF-1 e de IGF-2.

As partículas paramagnéticas de Dynal M450 revestidas com o IgG anti-rato de carneiros foram usados como a fase contínua da sustentação para IGF-1 R (ECD) - C3-muFc. As partículas M450 foram preparadas para o carregamento do receptor lavando três vezes com o tampão de ensaio que contêm 1x PBS, 0,05% TWEEN™ 20 (ICI Americas, Inc., Wilmington DE) 0.1% BSA, 0.01% azida de 30 sódio. O IGF-1 R (ECD) - C3-muFc foi ligado por 1 hora numa taxa de 50 ng de receptor por 1 x 106 partículas de M450 em um volume de tampão de ensaio de 25 μl. Para gerar dados da resposta de dose, os anticorpos ou os fatores IGF-1 e IGF-2 não marcados foram adicionados’ nas concentrações crescentes (10‘11 M a 10 ’6M) simultaneamente com 1 nM de Ru-IGF-1 ou 2 nM de Ru-IGF-2. O volume final da reação foi de 100 μl. Após a incubação a temperatura ambiente no escuro por 2 horas, um analisador M8 (Igen) foi usado para remover o rutenium livre marcado ligado e determinar a quantidade de ligante ligado ao receptor. Os dados foram expressos como por cento de ligantes total ligados menos fundo restante após a competição com excesso de crescimento não marcado IGF1 ou IGF-2. As curvas da competição foram geradas com o software GraphPad prisma (software de GraphPad, San Diego, CA) usando um único modelo componente de equilíbrio. Essencialmente todos (> ligação de 98%) os ligantes foram competidos com os fatores em excesso não marcados do crescimento. Os anticorpos positivos do controle na análise de ligação foram os anticorpos murino alR3 (Calbiochem, San Diego, CA) ou MAB391 (R&D Systems, Minneapolis, MN), 24-57 (Biocarta, San Diego, CA) e 1H7 do anti-IGF-1R (Santa Cruz Biotecnology, Inc., Santa Cruz, CA). O anticorpo de controle negativo era um anticorpo anti-CD20. Os dados da competição do ligante são mostrados na figura 15. Os valores do Ki e valores da máxima inibição observados para as reações de ligação de IGF-1 e IGF-2 são listados na tabela 6. Tabela 6

1ki de inibição 2 nível máximo de inibição a 1μM de concentração de anticorpo.

EXEMPLO 10: Ensaio de competição da resposta de Dose do SPA

Este exemplo apresenta um ensaio da proximidade de cintilação (SPA) para avaliar o efeito dos anticorpos na interação da insulina (INS) com o receptor dc insulina (INSR) e de IGF-1 e de IGF-2 a 1GF-1R.

As reações de ligação de IGF-1 R para anticorpos TQ11C, TQ25, TQ58 e TQ59 lgG1 continham 1x PBS, 0,05% TWEEN® 20 (Mallinkrodt), 0,1% BSA (EM Science,Gibbstown,NJ), 50 ng IGF-1 R(ECD)-C3-muFc, 500ug de fluoromicroesferas de anti-rato IgG SPA PVT (Amersham) e IGF-I ou IGF-2 125l- marcado obtido de Amersham em uma concentração final de 0,64 nM. O volume total da reação foi de 100 μl. As reações de ligação de INSR eram idênticas a nõo ser as que continham 50 ng INSR (ECD) - muFc e 0.64 nM de 125I-INS (Amersham). O Receptor foi carregado em microesferas de SPA PVT por 1h a temperatura ambiente antes da montagem das reações de ligações. Para gerar dados da resposta de dose, os anticorpos ou os fatores de crescimento não marcados foram adicionados nas concentrações crescentes (10’11 M a 10 6 M) simultaneamente com fatores de crescimento 125l-marcados. Essencialmente todos os ligantes foram competidos com os fatores excessivos não-marcados do crescimento. O receptor-independente, causado pela estimulação aleatória de microsferas de SPT PVT, foi menor que 0,5% da entrada de 125l cpm. Os dados foram expressos em porcentagem de ligantes totais ligados menos o fundo restante após a competição com fatores excessivos de crescimento não-marcados de IGF1 ou IGF-2. As curvas de competição foram geradas com software GraphPad prisma usando um único modelo componente de equilíbrio. EXEMPLO 11:

Anticorpo que liga-se a IGF-1 R

Este exemplo fornece um método de detectar a ligação de um anticorpo anti-IGF-1R a IGF-1 R. BIACORE® 2000, um sensor de microplaqueta CM5, o surfactante P20, HBS-EP (10mM HEPES, 0.15M deNaCI, 3,4mM de EDTA , 0,005% P20, pH 7.4), o kit de ligação de amino, 10mM de acetato pH 4.5 e 1OmM de glicina pH 1,5. Todos foram comprados de BIACore, Inc. (Piscataway, NJ). Tampão fosfato salir.o (PBS, 1X, sem cloreto de cálcio, sem cloreto de magnésio) foi da Gibco. O soro de albumina bovina (BSA, fração V, IgG livre) foi da Sigma. A proteína Recombinante G (“rProtein G") foi da Pierce Biotecnology.

A Imobilização da rProtein G e IGF-1 R-C3-muFc à superfície do sensor de microplaqueta foi executado de acordo com instruções do fabricante, usando um fluxo continuo de 10mM HEPES, 0.15M de NaCI, 3.4mM de EDTA , 0.005% P20, pH 7.4 (tampão HBS-EP). resumidamente, os grupos carboxil nas superfícies do sensor de microplaquetas foram ativados injetando 60 μl de uma mistura que contendo 0,2 M de n-etil-N’ (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e 0.05 M N- hidroxisuccinimida (NHS). As superfícies específicas foram obtidas injetando a rProtein A (Pierce) ou IGF-1 R-C3-mFc diluídas em 10mM de acetato, pH 4.5 em concentrações entre 20 e 50 μg/ml. Os grupos reativos adicionais nas superfícies foram desativados injetando 60 μl de 1M de etanolamina. Os níveis imobilizados finais foram de 5.000-6.000 unidades de ressonância (RU) para as superfícies O da proteína, e -7.800 RU para as superfícies IGF-1 R-mFc. Uma superfície de referência em branco, simularmente-acoplada foi preparado também no sensor de microplaqueta IGF-1 R-mFc.

A análise cinética da interação entre IGF-1 R-mFc e os anticorpos foi executada como segue. Os anticorpos bem como um anticorpo de controle positivo (quimera anti-IR3-CDR-humano-rato) foram diluídos em PBS + 0.005% P20 + 0.1 mg/ml BSA e injetados sobre as superfícies da proteína G para capturar os anticorpos. O IGF-1 R-mFc foi diluído em PBS + 0.005% P20 + 0.1 mg/ml BSA de 500nM a 3.9nM, e cada concentração foi injetado sobre as superfícies capturadas do anticorpo, assim como sobre uma superfície em branco da proteína G para a subtração de fundo. Após' uma dissociação de 10 minutos, cada superfície foi regenerada injetando 10mM de glicina, pH 1.5. A análise cinética dos sensorgramas resultantes foi executada usando BIAEvaluation, V. 3.2 (BIACore,

Uma análise da afinidade da solução foi feita incubando duas concentrações diferentes (0.2nM e 1nM) dos anticorpos com variação de concentrações (0,01 nM a 50nM) do IGF-1 R-mFc em PBS + 0.005% P-20 + 0,1 mg/ml BSA. As incubações foram feitas a temperatura ambiente no mínimo por cinco horas para permitir que as amostras alcançassem o equilíbrio. As amostras foram então injetadas sob a superfície IGF-1 R-mFc imobilizadas. Após a injeção da amostra, as superfícies foram regeneradas injetando 25 μl de glicina 8mM, pH 1,5. O sinal de ligação obtido é proporcional ao anticorpo livre na solução no equilíbrio. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) foi obtida da análise não- linear da regressão das curvas de competição usando um modelo de ligação um- sitio homogêneo de dupla-curva (KinExA software v.2.3 , Sapidyne Instruments Inc., Boise ID). Os dados são mostrados na tabela 7. Tabela 7

EXEMPLO 12: Mapeamento do Epitopo de proteínas de fusão Avidina. Este exemplo fornece um método de determinar o epitopo de IGF-1 R ligtado por um anticorpo anti-IGF-1R. Os subdominios de IGF-IR ligados por anticorpos TQ11C, TQ25, TQ58, e TQ59 foram determinados usando proteínas de fusão avidina-IGF-LR. Para expressar cada proteína as seqüências codificantes do DNA do IGF-1 R completo (ECD) clonados no vetor de expressão pCep4-avidina-C de forma que a seqüência da avidina da galinha foi ligada ao C-terminal da proteína expressa com IGF-1 R. A seqüência de codificação de ECD (1-932) foi amplificada por PCR à partir de um plasmidio parental de IGF-1R usando primers de PCR 2804-25: 5 5 1 GCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG 3 ’ SEQ ID NO : 265 e 2826-68: 5 ' ATTGCGGCCGCTTCATATCCTGTTTTGGCCTG 3 ' SEQ ID NO : 266 Os primers incluem um sítio 5 ' Hind\\\ e um sítio 3 ' Not I para clonagem em pCep4avidina-C. A seqüência do aminoácido da proteína de fusão avidina humana de IGF-1 R (ECD) é mostrada na figura 12. As construções dos subdomínios de IGF-1R usadas para traçar o epitopo incluem: L1 (1-151), CR (152-298), L2 (299461), Fnlll- 1 (461-579), Fnlll-2/ID (580-798), Fnlll-3 (799-901), L1+CR+L2 (1-461), e LI+CR (1-298). As coordenadas do aminoácido do subdomínio de IGF-1 R representado em cada plasmidio de expressão são dadas em parênteses. A seqüência de codificação de cada domínio foi amplificado por PCR de um clone parental do cDNA de IGF1R usando os éeguintes pares do primer: L1: 2804-25: (SEQ ID NO:265) 2804-19: 5' ATTGCGGCCGCCCCACATTCCTTTGGGGGC 3'SEQ ID NO:267 CR: 2804-38: 5’ AGCAAGCTTGGACCTGTGTCCAGGGACC 3’ SEQ ID NO:268 2804-20: 5’ ATTGCGGCCGCGCAAGGACCTTCACAAGGG 3' SEQ ID NO:269 L2: 2804-39: . 5' AGCAAGCTTGCCGAAGGTCTGTGAGGAAG 3’ SEQ ID NQ:270 2804-23: 5' ATTGCGGCCGCACTTTCACAGGAGGCTCTC 3' SEQ ID NO:271 Fnlll-1: 2808-08: 5' AGCAAGCTTGGACGTCCTGCATTTCACCTC 3' SEQ ID NO:272 2804-52: 5' ATTGCGGCCGCGGTGCGAATGTACAAGATCTC 3’ SEQ ID NO:273 Fnlll-2+ID: 2804-41: 5' AGCAAGCTTGAATGCTTCAGTTCCTTCCATTC 3' SEQ ID NO:274 2804-51: 5' ATTGCGGCCGCAGTCCTTGCAAAGACGAAGTTG 3' SEQ ID NO:275 5 Fnlll-3: 2804-42: 5' AGCAAGCTTGATGCCCGCAGAAGGAGCAG 3' SEQ ID NO:276 2804-50: 5’ ATTGCGGCCGCTTTAATGGCCACTCTGGTTTC 3' SEQ ID NO:277 L1+CR+L2: io 2804-25: 5 ' AGCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG 3 ’ SEQ ID NO : 278 2804-23 (SEQ ID NO:272) L1+CR: 2804-25: AGC AAG CTT GGG AGA AAT CTG CGG GCC AG (SEQ ID NO:279) 15 2804-20 (SEQ ID NQ:270)

Os primers incluíram os sítios Hind III e Not I para a clonagem como descrito para IGF-1 R (ECD). Os subdominios de IGF-1 R foram clonados no vetor de expressão pCep4avidina-N de forma que a seqüência da avidina da galinha (com seqüência de sinal endógeno) é ligada ao N-terminal das proteínas 20 expressas de IGF-1 R. A expressão de cada proteína da fusão da avidina foi conseguida pela transfecção transiente das células 293-EBNA humanas (Invitrogen) em culturas dos frascos cilíndricos. As células foram crescidas e mantidas em DMEM suplementadas com 5% FBS + 1x aminoácidos não essenciais + 1x Pen Strep Glut + 1x Piruvato de Sódio. Aproximadamente 4-5 x 25 107 de células 293-EBNA foram semeadas em frascos cilíndricos de 850 cm2 overnight. As células previamente semeadas foram transfectadas então com DNA plasmidial de pCep4-avidin no dia seguinte usando o reagente de transfecção FUGENE™ 6. A mistura DNA - reagente de transfecção foi preparada dentro de aproximadamente 6,75 mL DMEM livre de soro. 675 μl do reagente de transfecção 30 FUGENE™ 6 foi adicionado primeiramente, seguido por 112.5 μg do DNA plasmidial. O complexo foi incubado a temperatura ambiente por 30 minutos, M mistura completa foi adicionada então a um frasco cilíndrico. O frasco foi gaseificado com uma mistura de gás de CO2 a 5%, tampado firmemente e colocado em uma incubadora a 37° C em uma estufa giratória a 0,35 rpm. A 5 transfecção foi executado por 24 horas após do qual o meio foi substituído com 100 mL de DMEM + 1X suplemento de Insulina-Transferrina-Selênio + 1X Pen Strep Glu + 1X aminoácidos não essenciais + 1X Piruvato de Sódio. A coleta do meio e a recolocação com meio fresco ocorreram em intervalos de 48 horas (2 3 ciclos). O meio condicionado livre de soro coletado e foi unido e clarificado por io centrifugação à 10.000 rpm x por 30 minutos à 4o C.

A concentração da fusão da avidina em cada meio condicionado foi determinada usando um método baseado em FACS quantitativo. 200 μl da proteína de fusão avidina do meio condicionado foi capturada pela incubação por 2 horas a temperatura ambiente com 5μl (- 3.5 x 105) de grânulos revestidos de 15 poliestirenobiotina (Spherotech, Inc., Libertyville, IL). O meio condicionado foi removido por três ciclos de centrifugação e por resuspensão dos grânulos avidina- revestidos em PBS que contêm 0,5% BSA (BPBS). Os grânulos de avidina foram marcados com 1 μg/ml do anticorpo de cabra anti-avidina FITC-marcado (Vector Lab Burlingame, CA) 1ml em BPBS. Após 0,5 horas de incubação dos complexos 20 anticorpo-grânulos foram coletados por centrifugação à 1800 rpm por 5 minutos e o precipitado foi lavado três vezes. A fluorescência de FITC foi detectada com um FACSCAN (Beckton Dickson Bioscience, Franklin Lakes, NJ). O sinal fCi convertido à massa da proteína usando uma curva padrão derivada com avidina recombinante. Para o mapeamento do epitopo, os grânulos de biotina foram 25 carregados com 50-100ng da proteína de fusão da avidina por -3.5 x 105 grânulos dos grânulos através da incubação com a quantidade apropriada (1-20 ml) do meio condicionado. Os grânulos carregados foram lavados extensivamente e re- suspendidos em 1ml de BPBS. Para todo o experimento, os grânulos de biotina foram bloqueados com 10% BSA em PBS antes do carregamento da proteína da 30 fusão. .

Método 1, um ensaio de coloração: os grânulos de poliestirenos revestidos com Biotina carregados com proteínas da fusão do subdomínio de IGF-1 R (ECD) e de IGF-1 R foram misturados com 1 μg do anticorpo de anti-IGF-1R em 1 ml de BPBS. Após a incubação por 1 hora a temperatura ambiente, 4 ml do tampão de lavagem foi adicionado e os complexos dos anticorpo-grânulos foram coletados através da centrifugação por 5 minutos em 750g. O precipitado foi lavado 3 vezes pela re-suspensão em 4 ml de BPBS. Os complexos de grânulos de avidina do anticorpo foram detectados pelo tratamento com 0,5 μg/ml de Ficoeritrina de cabra (PE) F(ab')2 anti-humano (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) em 1 ml de BPBS. Os anticorpos testados foram fornecidos para ligar-se à proteína de fusão avidina contendo o completo IGF-1 R ECD e o domínio L2. A ligação à L1, CR ou à Fnlll-1 não foi detectada neste experimento. Uma reação relativamente fraca foi também observada com o domínio L1.

Método 2, ensaio de duas cores: Monitorar simultaneamente a quantidade de anticorpo monoclonal do anti-IGF-1R e a avidina-fusão ligada aos grânulos de biotina, anticorpos anti-avidina FITC-marcados foram incluídos (1 μg/ml) na reação de ligação em combinação com 0,5 μg/ml lgG1 de cabra anti-humano PE- marcado. Os grânulos foram preparados para a análise de FACSCAN como descritos para o ensaio de cor.

Método 3, competição do anticorpo: Para preparar-se para marcação co.ii fluorescência, os anticorpos foram dializados ou re-suspendidos em uma concentração de 1 mg/ml em PBS (pH 8.5). Ácido hexanóico marcado ([6- fluoresceina-5- (and-6) - carboxamido], ester de succinimidil 5 (6) - SFX] isomeros misturados de sondas moleculares ’(Eugene, OR, cat No. F2181) foram adicionados à proteína em uma relação 9.5:1 molar (marcação: proteina) de um estoque de marcadores de 5mg/ml de DMSO. A mistura foi incubada à 4o C overnight no escuro. O anticorpo marcado foi separado dos não marcados atravóe de diálise em PBS. As relações de anticorpo/ FITO oscilaram de 3 a 8. Para cada experimento de competição, uma reação de ligação foi montada que contendo um excesso de 50 dobras (10-50 μg/ml) do anticorpo competidor não marcado, 3.5 x 105 grânulos de biotina revestidos com a proteína de fusão à avidina em BPBS. O anticorpo FITC-marcado (1 μg/ml) foi adicionado após uma pré-incubação de 30 minutos. O processo seguiu ao método um de coloração deste ponto em diante. Cada um dos quatro anticorpos testados liga-se ao domínio de IGF-1 R L2, como mostrado na tabela 8. Entretanto, os contatos precisos do aminoácido de cada anticorpo no domínio de IGF-1 R L2 podem diferir-se. Tabela 8

1 mapeamento do Epitopo foi realizado com proteínas de fusão avidina-IGF-1R contendo regiões de indicação humana de IGF-1 R. 2 O ECD de fusão continha L1+CR+L2+Fnlll-1+Fnlll-2+ID+Fnlll-3.

EXEMPLO 13: Anticorpo de ligação a superfície celular do IGF-1 R

Este exemplo fornece um método para detecção da ligação de um anticorpo do anti-IGF-1R à superfície da célula que expressa IGF-1 R.

A habilidade dos anticorpos TQ11C, TQ25, TQ58, e TQ59 de ligar-se à IGF- IR humano demonstrado na superfície da célula foi avaliada usando fibroblastos de Balb/C 3T3 e células do câncer de mama humano MCF-7 engenheirados a super expressar o receptor humano IGF-1 R em um nível de ~3-4 x 105 moléculas por célula. Uma linhagem celular de Balb/C 3T3 que super expressam estavelmente o IGF-1 R humano (~ 3 x 105 receptores por célula) foram derivadas com um vetor retroviral essencialmente como descritos por Pietrzkowski et al, 1992 Cell Growth Differentiation 3:199 - 205. Às células do câncer de mama MCF-7 que super produziram o hulGF-1R foram transfectadas com um vetor de expressão pcDNA3.1 (Invitrogen Corp ). As células resistentes de Zeocina que expressam um nível elevado de hu IGF-1 R (~4 x 105 receptores por célula) foram expandidos após a seleção por FACS usando o anticorpo monoclonal αlR3 anti-IGF-1R e um anticorpo IgG anti-murino de cabra PE-marcado (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). O processo da seleção e da expansão foi repetido quatro vezes.

A marcação do anticorpo do receptor de IGF-1 R e a expressão do receptor foram monitoradas por FACS como segue: as células foram liberadas dos frascos T175 (Corning) lavando 2 vezes com o excesso PBS (Ca/Mg livre) seguido pelo tratamento com 5 ml de tampão de dissociação celular (Sigma) por 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram coletadas por centrifugação e lavadss duas vezes ressuspendendo-as em PBS e centrifugação Para o anticorpo preliminar marcado, 1 μg do anticorpo foi adicionado para 106 células ressuspendidas em 100 μl no PBS e mais 0,5% BSA (BPBS) e as células foram incubadas à 4o C por 1,5 horas. As células foram coletadas por centrifugação e lavadas duas vezes com BPBS para remover o anticorpo preliminar não ligado. As células foram ressuspendidas em 100 μl de BPBS e incubadas com 1 μg FITC- marcado de cabra e F(ab')2 (Southern Biotecnology Association, Inc., Birminghar.., AL) à 4°C por 30 minutos. Após a lavagem para remover o anticorpo secundário não ligado de FITC, as células foram ressuspendidas em 1 ml de PBS+ 0.5% BSA e a fluorescência da célula de FITC foi detectada com FACSCAN (Beckton Dickson Bioscience, Franklin Lakes, NJ). Os níveis de fluorescência foram convertidos aos níveis absolutos do receptor usando Quantum microbead (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) com capacidade de ligação predeterminada de lgG1 para gerar uma curva padrão. A redução de dados foi executada com □ software QuickCal v2.1 (Verity Software House, Topsham, ME) fornecido pelo fabricante.

A intensidade do pico de fluorescência do anticorpo anti-IGF-1R marcando super expressores de IGF-1 R foi aumentada 10-20 dobras relativas ao Balb/C 3T3 parental e células MCF-7 para cada um dos anticorpos testados. Este é o resultado presumido para um anticorpo que liga-se especificamenteà IGF-1 R. A fluorescência das células tratadas com nenhum anticorpo ou FITC- secundárics marcados foi insignificante.

EXEMPLO 14: Inibição de IGF-1R

Os presente método deste exemplo é para detectar a inibição de IGF-1 R por anticorpos anti-IGF-1R. Células de inibição 32D hu IGF-1 R+IRS-1

Células murina 32D que co-expressam o receptor humano de IGF-1 R (2O'X por célula) e IRS-1 humano provaram ser um sistema eficaz para examinar os componentes moleculares de IGF-1 R de sinalização Valentinis et al, 1999, Biol Chem 274:12423 de J - 30. As células 32D normais expressam níveis relativamente baixos de ortólogos murinos destes produtos de dois genes. A célula 32D requer normalmente IL3 para seu crescimento e sobrevivência. IGF-1 ou IGF- 2 podem substituir IL3 por células de 32D hulGF-IR+IRS-1 como mostrado na figura 16, painel A. O EC5o da curva de resposta de dose de IGF-1 foi di aproximadamente 0,5 nM, visto que o IGF-2 EC5o (2,8 nM) é de aproximadamente seis dobras mais alta refletindo uma afinidade mais fraca de IGF-2 para IGF-1 R. Para avaliar a habilidade dos anticorpos TQ11C, TQ25, TQ58, e TQ59 de bloquear IGF-1 ou estimular IGF-2, placas de 96 poços de microtitulação foram semeadas com 30.000 32D hu IGF- 1R+IRS-1 células por poço em um volume de 200 μl de RPMI (Gibco/BRL) contedo soro fetal bovino 5% (Gibco/BRL) e 1x penicilina, estreptomicina, glutamina (Gibco/BRL) aumentando concentrações do anticorpo (10‘12 M a 10 6 M) ou nenhum anticorpo. IGF-1 (2 nM, IGF-2 (8 nM) ou nada foram adicionados após uma pré-incubação de 1 hora com anticorpo. 3H-timidina (1 μCi por poço) foi adicionado em 27 adições do anticorpo por hora. As células foram coletadas 21 horas mais tarde, e a incorporação de 3H-timidina no DNA foi determinada para cada amostra. Os ensaios foram executados em triplicata. Um anticorpo anti-CD20 foi usado como um controle negativo. Cada um dos anticorpos TQ11C, TQ25, TQ58, e TQ59 foram capazes de bloquear completamente i estimulação mediada por IGF-1 e IGF-2 das células 32D. A redução da proliferação de fundo na ausência de IGF-I e de IGF-2 adicionados é devido à inibição do soro de IGF-1 e IGF-2. Os dados de ligação foram analisados usando o software de GraphPad PRIZM™. Os dados são mostrados na figura 16.

Inibição celular de hu IGF-1 R de Balb/C 3T3 IGF-1 IGR-1 estimula extremamente a incorporação de 3H-timidina por culturas de soro dos fibroblastos embriogênicos do rato (Balb/C 3T3 ou NTH 3T3) os quah super expressam IGF-1 R (~1 x 106 IGF-1 R por célula). Kato et al, 1993, J Biol Chem 268:2655-61; Pietrzkowski et al, 1992, Cell Growth Differentiation 3:199-205. Este fenômeno é recapitulado com ambos IGF-1 e IGF-2 em uma linhagem de super-expressão da célula de hu IGF-1 R Balb/C 3T3. Ambos os fatores do crescimento estimularam a incorporação da 3H-timidina em aproximadamente 20 dobras. O EC50 da curva de resposta da dose de IGF-1 foi de aproximadamente 0,7 nM, visto que o EC50 de IGF-2 (4.4 nM) é maior em sete dobras, indicando uma afinidade mais fraca de IGF-2 para IGF-1 R. Para avaliar a habilidade de um dado anticorpo para bloquear IGF-1 ou estimular IGF-2, placas de 96 poços de microtitulação foram semeadas com 10.000 células por poço em um volume de 200 μl de DMEM (Gibco/BRL) que contendo soro bovino 10% (Gibco/BRL) e 1x penicilina, estreptomicina, glutamina (Gibco/BRL). Após a incubação overnight, quando as células estavam aproximadamente 80% confluentes, 0 meio de crescimento foi substituído com 100 μl DMEM contendo 0.1% BSA após lavar um vez com 200 μl PBS. Os anticorpos em concentrações crescentes (W12 M a 10 6 M), ou nenhum anticorpo, foram adicionados em 24 horas pós-soro de não alimentação. IGF-1 (2 nM, IGF-2 (8 nM) e 3H-timindina (1 μCi por poço) foram adicionados após pré-incubação de 1 hora com anticorpo. As células foram coletadas 24 horas mais tarde, e a incorporação de 3H- timidina no DNA foi determinada para cada amostra. Os ensaios foram executados em triplicata. Cada anticorpo testado podia bloquear completamente o IGF-1 e mediar a estimulação de IGF-2 de células de Balb/C 3T3, como mostrado na figura 17.

Um anticorpo anti-CD20 foi usado como um controle negativo (“CD20” na figura 17). Cada referência citada aqui é incorporada pela referência em sua totalidade para qualquer ensinamento e para todas as finalidades.

Claims

1. Proteína isolada de ligação ao antígeno CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a. uma combinação L16/H16 de um domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada, em que o dito domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e o dito domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 136; ou b. um domínio variável da cadeia leve que compreende i. a sequência CDR1 dos resíduos 24 a 39 da SEQ ID NO: 32; e ii. a sequência CDR2 dos resíduos 55 a 61 da SEQ ID NO:32; e iii. a sequência CDR3 dos resíduos 94 a 102 da SEQ ID NO:32; e um domínio variável da cadeia pesada compreende iv. a sequência CDR1 dos resíduos 31 a 36 da SEQ ID NO:136; e v. . a sequência CDR2 dos resíduos 51 a 66 da SEQ ID NO:136; e vi. . a sequência CDR3 dos resíduos 99 a 108 da SEQ ID NO:136; em que a dita proteína de ligação ao antígeno se liga ao IGF-1 R humano.

2. Proteína isolada de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que também compreende: a. a seqüência constante da cadeia leve kappa, SEQ ID NO: 234 b. a sequência constante da cadeia pesada de IgG1, SEQ ID NO: 235 ou c. a sequência constante da cadeia leve kappa, SEQ ID NO: 234 e a sequência constante da cadeia pesada de IgG1, SEQ ID NO: 235.

3. Proteína isolada de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação ao antígeno compreende: a. um anticorpo humano; b. um anticorpo humanizado; c. um anticorpo quimérico; d. um anticorpo monoclonal; e. um anticorpo recombinante; um fragmento de anticorpo ligado ao antígeno; um anticorpo de cadeia única; um diacorpo; um triacorpo; um tetracorpo; um fragmento Fab; um fragmento F(ab')2; f. um anticorpo IgD; um anticorpo IgE; um anticorpo IgM; um anticorpo IgG1; um anticorpo IgG2; um anticorpo IgG3; um anticorpo IgG4; ou um anticorpo IgG4 que tem pelo menos uma mutação em uma região da dobradiça que alivie a tendência de formar uma ligação de bissulfeto na cadeia.

4. Polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica a dita proteína de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende opcionalmente uma sequência de ácido nucleico de domínio variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 31 e uma sequência de ácido nucleico de domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 135.

5. Plasmídeo que compreende o dito polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito plasmídeo é opcionalmente um vetor de expressão.

6. Método de produção de uma proteína de ligação a um antígeno que se liga ao IGF-1R humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a incubação de uma célula compreendendo o dito polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 4 sob condições que permitam que expresse a dita proteína de ligação ao antígeno.

7. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a proteína de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.