BRPI0520182A2 - teste imunocromatográfico rápido do fluido oral - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um teste imunocromatográfico rápido do fluído oral. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um suabe de coleta do fluído oral separado da tira de imunocromatografia por fluxo lateral para a detecção do analito no fluído oral, a qual, essencialmente, consiste de uma almofada da amostra, uma almofada do conjugado, uma almofada da zona de teste e da zona de controle, e, que é feita de, pelo menos, um material matriz, e, em que a almofada do conjugado fica a jusante da almofada da amostra, e, é listrada com o conjugado; a almofada de teste e da zona de controle fica a jusante da almofada do conjugado em que a zona de teste é imobilizada com um reagente de ligação específico que se liga especificamente ao analito-alvo; e a zona de controle, que fica a jusante da zona de teste, é imobilizada com o segundo reagente de captura. Além disso, a invenção refere- se ao método de fabricação da tira, ao método de imunocromatografia por fluxo lateral para a detecção do analito no fluído oral mediante o uso da tira, e, aos kits que contêm a tira.

Description

TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DO FLUÍDO ORAL

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um teste imunocromatográfico rápidodo fluído oral. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma tirado teste de imunocromatografia por fluxo lateral para a detecção do analito nofluído oral, a um método de coleta do espécime do fluído oral, a um método defabricação da tira, a um método de imunocromatografia por fluxo oral para adetecção do analito no fluído oral mediante o uso da tira, e aos kits que contêma tira.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Numerosos métodos analíticos foram desenvolvidos para detectarqualitativa ou quantitativamente vários analitos em tecidos e fluídos dosorganismos. Atualmente, a maior parte dos testes de diagnóstico é realizadacom sangue, urina, material fecal, biopsia de tecidos ou fluídos orais. Secomparada em relação a outras substâncias, a coleta de fluídos orais inclusivesaliva e/ou transudato de mucosa oral para testes requer relativamente poucainvasão da privacidade, é relativamente segura, e pode ser feita rapidamentecom relativa facilidade.

Até agora, muito esforço tem sido feito para desenvolver tiras de testepara coleta, transporte e manuseio de amostras de fluídos orais, e, paradesenvolver ensaios à base dos fluídos orais, particularmente, o ensaio paravários anticorpos e metabólitos.

Por exemplo, o patente WO 88/07680 divulgou um método dedetecção qualitativa ou quantitativa da presença ou da quantidade de IgM, IgG eIgA específicos nos fluídos corporais dos humanos e animais selecionados desaliva, lágrimas, sêmen, urina e fluído cerebrospinal mediante oradioimunoensaio (RIA) complicado, ensaio imunoenzimático (ELISA) e osensaios semelhantes que são realizados com relativa dificuldade, consomemtempo, e são caros.

O patente US Patent No. 5,103,836 divulgou um método de coleta desubstâncias da cavidade oral para realização do teste, compreendendo ospassos seguintes: a inserção da almofada absorvente impregnada com sais deuma solução hipertônica, em que os sais da solução hipertônica estão naalmofada em uma concentração eficiente para recuperar a concentração altadas ditas substancias dentro da cavidade oral; a remoção da almofada dacavidade oral; e a preservação da almofada para a remoção subseqüente dassubstâncias coletadas da almofada para realização do teste ELISA. A almofadaabsorvente revelada neste patente precisa ser pré-tratada com a soluçãohipertônica, a fim de proporcionar a alta concentração de analitos, e o testeELISA complicado é usado novamente para detectar os analitos.

O patente US Patent No. 6,303,081 divulgou uma tira de teste paracoleta e transporte do fluído aquoso da cavidade oral para uma tira decromatografia lateral para realização dos testes. A tira de cromatografia lateralencerrada em um invólucro é colocada dentro da cavidade oral e se estende aolongo dela. Pelo menos, um local de exame para a tira de cromatografia lateral éproporcionado, a fim de possibilitar o exame de locais selecionados na tira decromatografia lateral para se obter os resultados do teste. A mecha porosa seprotrai do invólucro para o local de coleta que fica do lado de fora do invólucroem uma extremidade e se comunica com a tira cromatográfica lateral na outra.

As mechas porosas possuem uma estrutura especial: as partículas queadsorvem o fluído aquoso oral transportam o fluído da boca até a tira decromatografia lateral sem absorção substancial. A mecha porosa liberaprontamente o fluído para a tira de cromatografia lateral. A prevenção do fluxoreverso até a cavidade oral da tira de cromatografia lateral ocorre naturalmentedevido ao caminho circular do fluxo da mecha porosa. A chapa de mordedura éacoplada ao invólucro e se insere entre os dentes do paciente para posicionar amecha porosa na cavidade oral para coleta do fluído oral. Normalmente, achapa de mordedura é mantida no local pela força oclusiva dos dentes queposiciona a mecha porosa no espaço bucal. Mediante a observação da tira decromatografia lateral enquanto a tira de teste se encontra na boca, obtêm-se osresultados imediatos do teste. A solicitação de registro do patente US PatentApplication No. 2002/0192839 e a solicitação de registro do patente US PatentApplication No. 2002/0155029 também divulgaram as tiras de testeaperfeiçoadas e métodos de coleta de passo único do fluído oral para adetecção e/ou quantificação dos analitos no fluído oral; a divulgação destespatentes ou solicitações de registro está incorporada aqui por referência em suatotalidade.

Apesar de que os ensaios mediante as tiras de teste mencionadasacima tenham as vantagens de serem diretos e rápidos e não requeiram passoscomplicados, fica inconveniente para o indivíduo permanecer mordendo a tira deteste o tempo todo durante o processo de detecção. Além disso, para osensaios que têm indicadores "inválidos" onde um resultado inválido requer arepetição do teste, ou para tais testes diagnósticos como o de HIV que,rotineiramente, requerem que um teste confirmatório do espécime coletado sejarealizado, o indivíduo terá que morder a tira de teste para realizar mais um oumais testes. Porém, deve-se notar que a coleta do transudato de mucosa oraltipicamente reduz os exsudatos disponíveis, ricos em IgG1 na superfície dostecidos orais uma hora após a coleta inicial, tornando inconveniente as coletassubseqüentes para a repetição do teste com "coletas de amostras de passoúnico/combinações de testes" desde que o indivíduo que está sendo testado,deve aguardar ou até que o nível de exsudatos seja mais alto ou correr o riscode se fazer um teste com a amostra com a sensibilidade reduzida (R. Mink,dados não publicados).

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção foi feita considerando as desvantagens acimaque ocorriam nas técnicas anteriores, e o objetivo da presente invenção éproporcionar uma coleta do fluído oral simples, conveniente e barata com umatira de imunocromatografia lateral adequada para a detecção rápida e sensíveldos analitos no fluído oral.

O outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método defabricação da tira de teste de imunocromatografia por fluxo oral.

Mais um objetivo da presente invenção é proporcionar um métodosensível adequado para a detecção rápida e sensível dos analitos no fluído oral.

Além disso, mais um objetivo da presente invenção é proporcionarkits para a detecção rápida e sensível dos analitos no fluído oral.

Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporciona a tirade teste de imunocromatografia por fluxo oral para a detecção do analito nofluído oral que, essencialmente, consiste de uma almofada da amostra, umaalmofada do conjugado, uma almofada da zona de teste e da zona de controle,feita, pelo menos, de um material matriz, em que a almofada do conjugado seencontra a jusante da almofada da amostra, e está listrada com um conjugado;a almofada da zona de teste e da zona de controle fica a jusante da almofada doconjugado e contém a zona de teste e a zona de controle em que a zona deteste é imobilizada com um reagente de ligação específico que se ligaespecificamente ao analito-alvo, e a zona de controle é imobilizada com umsegundo reagente de captura.

Na representação deste aspecto, o analito a ser testado éselecionado dos anticorpos contra os antígenos de doenças infecciosas,hormônios, fatores de crescimento, drogas terapêuticas, drogas de abuso eprodutos do metabolismo das drogas de abuso.

Na outra representação, o material da matriz é selecionado dos pósinorgânicos tais como sílica e alumina; papel de filtragem de fibra de vidro;material polimérico natural, especialmente, materiais à base de celulose, papelcromatográfico; polímeros sintéticos ou modificados que ocorrem naturalmente,tais como nitrocelulose, acetato de celulose, cloreto de (poli)vinil, poliacrilamida,dextrana com ligação cruzada, agarose; e a combinação deles.

Em mais uma representação, o material da matriz para a almofada daamostra é de papel de filtragem de fibra de vidro; o material da matriz para aalmofada do conjugado é de poliéster; o material da matriz para a almofada deteste e a almofada de controle é de membrana de nitrocelulose.Em mais uma representação, o conjugado compreende um marcadorconjugado ao primeiro reagente de captura que captura anticorpos endógenosao fluído oral. O marcador é selecionado das partículas de ouro coloidal;partículas elementares ou de hidrossol de metal inclusive selênio, prata, ferritaou carbono; outras partículas globulares inclusive látex colorido, lipossomas, epartículas de corantes.

Em mais uma representação, o primeiro reagente de captura éselecionado dos anticorpos contra IgG, IgM ou IgA, proteína A, proteína G econcanavalina A. De preferência, o primeiro reagente de captura é a proteína A.

Em outra representação, o reagente de ligação específico éselecionado dos antígenos de doenças infecciosas, hormônios, fatores decrescimento, drogas terapêuticas, drogas de abuso e produtos do metabolismodas drogas de abuso.

Em mais uma representação, o antígeno de doença infecciosa érecombinante ou peptídeo sintético representando a região imunodominante daproteína do HIV, especialmente, a proteína do envelope do HIV selecionada degp120 e gp41 do HIV-1 e gp36 do HIV-2.

Em mais uma representação, o segundo reagente de captura éselecionado dos anticorpos contra IgG, IgM ou IgA, proteína A, proteína G econcanavalina A em que o anticorpo contra IgG é o anticorpo IgG anti-humanode cabra.

No segundo aspecto, a invenção proporciona um método defabricação da tira de teste de imunocromatografia lateral, definido por qualqueruma das reivindicações 1-17, compreendendo: a) aplicação em listras doconjugado na almofada do conjugado; b) imobilização do agente específico deligação na zona de teste da almofada da zona de teste e da zona de controle; c)imobilização do segundo reagente de captura na zona de controle da almofadada zona de teste e da zona de controle; d) bloqueio de cada almofada com oagente bloqueador; e e) alinhamento das almofadas resultantes na comunicaçãode fluídos com relação a um ao outro.

Em uma representação, o conjugado é estabilizado em uma soluçãosimples ou complexa de açúcar antes de aplicação em listras, em que a soluçãode açúcar contém sacarose, trealose, estanato de potássio e peróxido dehidrogênio de uréia.

Em outra representação, o reagente específico de ligação éimobilizado na zona de teste e zona de controle utilizando um Iigante debiotina/estreptavidina.

Em mais uma representação, o reagente específico de ligação éimobilizado na zona de controle utilizando o Iigante de biotina/estreptavidina.

Em mais uma representação, o agente bloqueador contémdetergentes em formas não iônica, catiônica, aniônica e anfotérica; açúcaresincluindo sacarose, frutose; ou proteínas incluindo albumina de soro bovino,soro animal integral, caseína e leite em pó desnatado.

Em outra representação, o soro animal integral é o soro de bezerrofetal. Em outra representação, o soro animal integral é o soro aviárioselecionado de soro de ganso, soro de peru e soro de galinha.

No terceiro aspecto, a invenção proporciona um método deimunocromatografia por fluxo lateral para a detecção do analito no fluído oral,compreendendo: (a) a coleta do fluído oral com um coletor separado da tira deteste de imunocromatografia por fluxo lateral definida por qualquer uma dasreivindicações 1-17; (b) a imersão do coletor em um volume do tampão deamostra para liberar o fluído oral no tampão, a fim de se obter a mistura; (c) acolocação da tira de teste de imunocromatografia por fluxo lateral, definida porqualquer uma das reivindicações abaixo, dentro da mistura; e (d) adeterminação da validade do teste mediante a observação da presença do sinalna zona de controle, e a determinação da presença do analito mediante aobservação da presença do sinal na zona de teste dentro de 15-60 minutos apartir do início do teste.

Em mais uma representação, o coletor no passo (a) é um suabe depoliéster não tratado tal como Texwipe Large Alpha Swab TX714A.

Na outra representação, o tampão de amostra é a soluçãotamponada de fosfato de potássio a pH 7,2 +/- -0.2 que, além disso, contémcloreto de sódio 0,15M, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinha inativado porcalor de 15%, Avidina de 30pg/ml, Tween 80 de 0,2%, Tetronic T-904 de 0,2% eProClin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%.

Em mais uma representação, o volume do tampão de amostra é de1000 μl.

Na outra representação, o método ainda inclui um passo de remoçãoda alíquota da mistura entre o passo (b) e o passo (c) em que o volume daalíquota é de 200 μl.

Em mais uma representação, o sinal é observado dentro de 20-45minutos.No quarto aspecto, a invenção proporciona um kit para a detecção doanalito no fluído oral, compreendendo, pelo menos, uma tira de teste deimunocromatografia por fluxo lateral mencionada acima. A tira de teste estáfechada dentro de um recipiente dessecado. Cada kit pode incluir, de maneiraopcional, o tampão de amostra, o coletor do fluído oral, o encarte do pacoteproporcionando as instruções de uso das tiras incluídas, os frascos que contêmum controle positivo e negativo para testar a qualidade da tira de teste, umcronômetro que pode ser utilizado para determinar quando o ensaio da invençãoficar completo, e/ou um recipiente para descarte de materiais biológicosperigosos.

Na representação apresentada deste aspecto, o tampão de amostra éa solução tamponada de fosfato de potássio de pH 7,2 +/- -0.2 que, além disso,contém cloreto de sódio 0,15M, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinha inativadopor calor de 15%, Avidina de 30pg/ml, Tween 80 de 0,2%, Tetronic T-904 de0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%.

Em mais uma representação, o coletor é um suabe de poliéster nãotratado tal como Texwipe Large Alpha Swab TX714A.

Consequentemente, a vantagem da presente invenção é asimplicidade do desenho e baixo custo dos materiais devido à ausência de uminvólucro tal como no outro teste rápido do fluído oral (veja, por exemplo,patente US Patent 6303081, solicitações de registro dos patentes US PatentApplications 20020155209 e 20020192386) e outros ensaios rápidos de fluxolateral (patentes US Patents 6,303,081, 5,935,864, 6,485,982, 6,534,320,6,352,862, 6,187,598 e 6,027,943). Isso não apenas possibilita a baixar o custode fabricação do produto, mas também proporciona um processo de fabricaçãomenos complicado, o que reduz os custos ainda mais.

Mais uma vantagem da presente invenção é que o ensaio em si éseparado do coletor de amostra (tal como no patente US Patent 6303081,solicitações de registro dos patentes US Patent Application 20020155029 e20020192839, e patente US patent 5935864), o que possibilita ao usuário atestar o espécime múltiplas vezes sem a coleta adicional. Esta é uma vantagemespecial com tais ensaios como os de imunocromatografia por fluxo lateral quetêm indicadores "inválidos" onde o resultado inválido requer a repetição do teste,ou para tais testes de diagnóstico como os de HIV que, rotineiramente,requerem que um teste confirmatório seja realizado com o espécime coletado,considerando que, normalmente, a coleta do transudato de mucosa oral umahora após a coleta inicial reduz os exsudatos ricos em IgG disponíveis nasuperfície dos tecidos orais, tornando inconveniente a coleta adicional pararepetição do teste com "coletores de amostra de passo único/combinações deteste".

Mais uma vantagem da presente invenção é que a tira deimunocromatografia rápida do fluído oral é extremamente compacta (porexemplo, 5mmx1mmx75mm) se comparada com outros testes do fluído oral (porexemplo, patente US Patent 6,303,081), o que possibilita a reduzir o custo dedespacho e armazenagem.

A outra vantagem da presente invenção é que o método de coleta dofluído oral proporciona o volume suficiente para se obter outras opiniões do testetais como o teste confirmatório.Mais uma vantagem da presente invenção é que a fabricação émenos complicada se comparada com outros testes do fluído oral (por exemplo,patente US Patent 6,303,081) porque não é necessário montar um invólucro aoredor da tira de cromatografia por fluxo lateral resultando na redução tanto doscustos do material como do tempo do processo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 demonstra o procedimento do teste imunocromatográfico rápido dolíquido oral de acordo com a representação apresentada dainvenção em que as Figuras 1-1 a 1-15 mostram os passos doteste.

A Figura 2 demonstra os três resultados possíveis do testeimunocromatográfico rápido do líquido oral de acordo com arepresentação apresentada da invenção em que as Figuras 2A, 2Be 2C representam o resultado negativo, positivo e inválido,respectivamente.

DESCRIÇÃO DAS REPRESENTAÇÕES APRESENTADAS

A melhor compreensão da presente invenção pode ser obtida dadescrição detalhada seguinte da representação apresentada descrita emrelação aos desenhos acompanhantes.

No primeiro aspecto, a presente invenção proporciona a tira de testede imunocromatografia por fluxo lateral para a detecção do analito no fluído oralque, essencialmente, consiste de uma almofada da amostra, uma almofada doconjugado, uma almofada da zona de teste e da zona de controle, feita de, pelomenos, um material matriz em que a almofada do conjugado fica a jusante daalmofada da zona de amostra e está listrada com o conjugado; a almofada dazona de teste e da zona de controle fica a jusante da almofada do conjugado e éimobilizada com um reagente de ligação específico que se liga especificamenteao analito-alvo para a zona de teste e é imobilizado com um segundo reagentede captura para a zona de controle.

A almofada da amostra recebe a amostra do fluído oral.Normalmente, a almofada da amostra é feita de um material que demonstra aretenção baixa de anticorpos-alvo. Em algumas representações, a almofada daamostra, também, pode funcionar como um filtro mecânico retendo qualquersubstância particulada indesejada tal como sujeira, fragmentos, precipitados,muco ou sangue.

A almofada do conjugado fica a jusante da almofada da amostra econtém um conjugado que compreende um marcador direta ou indiretamenteacoplado ao primeiro reagente de captura.

A zona de teste fica a jusante da almofada do conjugado e contémum reagente de ligação específico que se liga especificamente ao anticorpo-alvopor meio do qual o conjugado marcado pode ser imobilizado para a matriz.

A zona de controle fica a jusante da zona de teste no caminho dofluxo. A zona de controle contém o segundo reagente de captura que captura osanticorpos capturados pelo primeiro reagente de captura e, de preferência, éimobilizado dentro da zona de controle para formar uma linha de controle queconcentra qualquer conjugado do anticorpo marcado ligado pelo segundoreagente de captura.

Conforme usado aqui, o termo "fluído oral" se refere a um ou maisfluídos orais encontrados na cavidade oral individualmente ou em combinação.Estes incluem, mas não são limitados a, saliva e transudato de mucosa oral.Reconhece-se que o fluído oral pode compreender uma combinação de fluídosde uma quantidade de fontes (por exemplo, parótida, submandibular, sublingual,glândulas suplementares, mucosa gengival e mucosa bucal), e o termo fluídooral inclui fluídos de cada uma destas fontes individualmente ou emcombinação. O termo saliva se refere à combinação de fluídos orais tais comoos que são normalmente encontrados na boca, especialmente, apósmastigação. O termo "transudato de mucosa oral", conforme usado aqui, serefere ao fluído produzido pela difusão passiva dos componentes de soro daintersticial de mucosa oral para dentro da cavidade oral. Freqüentemente, otransudato de mucosa oral forma um componente da saliva.

Conforme usado aqui, o termo "analito" é usado para se referir a umaparte que deve ser detectada em um ensaio particular. Os analitos comumentedetectados no ensaio da invenção incluem, mas não são limitados a, anticorposcontra antígenos de doenças infecciosas, hormônios, fatores de crescimento,drogas terapêuticas, drogas de abuso e produtos do metabolismo das drogas deabuso. Os analitos especialmente preferidos incluem anticorpos contraantígenos de tais doenças infecciosas como HIV, hepatite, e doenças similares.

Os antígenos podem ser, mas não são limitados a, tais antígenos comoanticorpos para HIV, anticorpos para HTLV, anticorpos para Helicobacter pylori,anticorpos para hepatite, anticorpos para sarampo, anticorpos para caxumba eanticorpos para rubéola. As drogas terapêuticas e drogas de abuso ou produtosdo metabolismo das drogas de abuso podem ser, mas não são limitados a,tertrahidrocanabinol, nicotina, etanol, teofilina, fenitoína, acetaminofeno, lítio,diazepam, nortriptilina, secobarbital, fenobarbitol. Os hormônios podem ser, masnão são limitados a, testosterona, estradiol, hidroxiprogesterona-17,progesterona, tiroxina, hormônio estimulante da tiróide, hormônio estimulante defolículos e hormônio luteinizante.

Conforme usado aqui, o "reagente de ligação específico" é umreagente que se liga especificamente ao analito-alvo, selecionado dos antígenosde doenças infecciosas, hormônios, fatores de crescimento, drogasterapêuticas, drogas de abuso e produtos do metabolismo das drogas de abuso,conforme descrito acima.

Conforme usado aqui, o "antígeno" é uma substância que, quandointroduzida em um mamífero ou pássaro, estimula a produção de um anticorpo.Os antígenos preferidos da presente invenção incluem as proteínas do vírus deimunodeficiência humana (HIV), especialmente, a proteína do envelope viralgp120 e gp41 do HIV-1 e gp36 do HIV-2.

Conforme usado aqui, o "anticorpo" se refere a uma proteína queconsiste de um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados pelos genesda imunoglobulina ou fragmentos dos genes da imunoglobulina. Os genes daimunoglobulina reconhecidos incluem os genes das regiões constantes de capa,lambda, alfa, gama, delta, épsilon e miu assim como uma grande quantidade degenes das regiões variáveis da imunoglobulina. As cadeias leves dos anticorpossão classificadas ou como capa ou como lambda. As cadeias pesadas sãoclassificadas como gama, miu, alfa, delta ou épsilon, os quais, por sua vez,definem as classes da imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE,respectivamente.

Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo (tambémconhecido como imunoglobulina) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero écomposto por dois pares idênticos das cadeias de polipeptídeos, sendo quecada par possui uma cadeia leve (cerca de 25 kD) e uma cadeia pesada (cercade 50-7- kD). O ponto final N de cada cadeia define a região variável de cerca100 a 110 ou mais aminoácidos, principalmente, responsáveis peloreconhecimento dos antígenos. Os termos a cadeia leve variável (VL) e a cadeiapesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas,respectivamente.

Os anticorpos podem existir como imunoglobulinas intactas ou comoum número de fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestão comvárias peptidases. Assim, por exemplo, a região de pepsina produz F(ab')2, umdímero de Fab que, por si mesmo, é uma cadeia leve ligada à VH-VH1 por umaligação de bissulfeto. O F(ab')2 pode ser reduzido sob condições amenas a fimde quebrar a ligação de bissulfeto na região de junta convertendo, por meiodisso, o dímero F(ab')2 para um monômero Fab. O monômero Fab é,essencialmente, um Fab com a parte da região de junta (veja, ImunologiaFundamental, W.E. Paul, Ed., Raven Press, N.Y., 1993, para a descrição maisdetalhada dos outros fragmentos dos anticorpos). Enquanto vários fragmentosdo anticorpo são definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, osespecialistas perceberão que tais fragmentos do Fab' podem ser sintetizados denovo ou quimicamente ou mediante o uso da metodologia do DNArecombinante. Assim, o termo anticorpo, conforme usado aqui, também, incluios fragmentos do anticorpo ou produzidos pela modificação dos anticorposinteiros ou sintetizados de novo mediante o uso das metodologias do DNArecombinante.

Conforme usado aqui, o termo "matriz" se refere a um materialinsolúvel capaz de suportar o fluxo do fluído. Os materiais da matriz podem serde fontes naturais e/ou sintéticas, absorventes ou não absorventes, fibrosos ouparticulados. As matrizes da invenção podem ser formadas como tiras contínuasdo mesmo material ou mistura de materiais diferentes que são distribuídos demaneira consistente ao longo da tira comum, ou de maneira inconsistente, a fimde formar as zonas que possuem diferentes características físicas ou químicasem diferentes regiões da tira. De modo alternativo, uma série de almofadasdistintas pode ser formada do mesmo ou dos diferentes materiais da matriz comreagentes para o ensaio ser acrescentado a cada almofada. Então, a almofadapode ser colocada na comunicação dos fluídos, um com o outro, a fim de formarum caminho contínuo do fluxo. Os materiais usados para construir matrizes dainvenção podem ser inertes ou podem reagir com um ou mais reagentes dainvenção contanto que os materiais permaneçam insolúveis durante o exercícioda invenção, conforme descrito aqui. Os materiais da matriz podem serselecionados para pós inorgânicos tais como sílica e alumina; papel de filtragemde fibra de vidro; material polimérico natural, especialmente, materiais à base decelulose tais como papel de filtragem, papel cromatográfico; polímeros sintéticosou modificados que ocorrem naturalmente, tais como nitrocelulose, acetato decelulose, cloreto de (poli)vinil, poliacrilamida, dextrana com ligação cruzada,agarose; e a combinação deles. Na representação apresentada, a matriz é amembrana de nitrocelulose.

Em mais uma representação apresentada da invenção, o papel defiltragem de fibra de vidro é utilizado como a matriz da almofada da amostra, omaterial de poliéster é usado como a matriz da almofada de conjugação, e amembrana de nitrocelulose é usada como a matriz da almofada da zona deteste e da zona de controle.

"Absorvente" se refere à capacidade de certos materiais absorventesde suportar as taxas diferenciais de migração do soluto durante o fluxo do fluídoatravés do material absorvente. Os materiais absorventes com propriedadesabsorventes são, portanto, capazes de separação cromatográfica de solutos àbase das propriedades físicas e/ou químicas.

Conforme usado aqui, o termo "marcador" se refere a uma partemolecular ou atômica detectável que se associa especificamente com o analitoou direta ou indiretamente através do parceiro de ligação específico para oanalito. Os marcadores da presente invenção podem ser detectados física ouquimicamente. Os marcadores preferíveis são visíveis ao olho nu quandoassociados para indicar o resultado positivo do ensaio. Os marcadores dapresente invenção são selecionados de partículas de ouro coloidal; partículaselementares ou de hidrossol de metal inclusive selênio, prata, ferrita ou carbono;outras partículas globulares inclusive látex colorido, Iipossomas e partículas decorantes. Na representação apresentada da invenção, o marcador é partículasde ouro coloidal. Estes marcadores são bem conhecidos na técnica e sãodescritos em, por exemplo, G. Frens, Nature, 241, 20-22 (1973) e patente USPatent No. 4,313,734, cujas descobertas são incorporadas neste por referênciaem sua totalidade.

"Ouro coloidal" usado na presente invenção se refere ao hidrossol departículas finas de ouro que são capazes de permanecer na suspensão aquosaindefinidamente.

Conforme usado aqui, o "reagente de captura" é qualquer moléculaque se liga especificamente ao anticorpo-alvo. Os reagentes de captura dapresente invenção são, de preferência, imobilizados para a matriz em umpadrão definido, tipicamente, uma linha perpendicular ao caminho do fluxo. Osreagentes de captura preferidos são anticorpos contra IgG, IgM ou IgA; proteínaA, proteína G ou concanavalina A.

Conforme usado aqui, o "primeiro reagente de captura" da invenção éum reagente de captura conjugado para o marcador. De preferência, osprimeiros reagentes de captura são anticorpos contra IgG, IgM ou IgA; proteínaA, proteína G ou concanavalina A. Em mais uma representação apresentada, aproteína A ou proteína G é conjugada ao marcador formando um conjugado.

A "proteína A" usada na presente invenção se refere a um receptor desuperfície altamente estável produzido por Staphylococcus aureus, que é capazde ligar a porção Fc de imunoglobulinas, especialmente IgGs, de um grandenúmero das espécies (Boyle, M.D.P. e K.J. Reias. Receptores Bacteriais Fc.Biotecnologia 5:697-703, 1987). Uma proteína A molecular pode ligar, pelomenos, 2 moléculas de IgG simultaneamente (Sjõquist, J., Meloun, B, e Hjelm,Η. A Proteína A é isolada de Staphylococcus aureus após digestão comlisostafina. (Eur J Biochem 29:572-578, 1972).

A "proteína G" utilizada na presente invenção se refere a umaproteína celular associada à superfície do estreptococo que se liga ao IgG comalta afinidade. Ela possui três domínios de ligação de IgG altamente homólogos(veja, Lian.e outros, 1992, Journal of Mol. Biol. 228:1219-1234 e Derrick eWigley. 1994. Journal of Mol. Biol. 243:906-918).

Conforme usado aqui, "o segundo reagente de captura" é umreagente de captura imobilizado na zona de controle para capturar os anticorposcapturados pelo primeiro reagente de captura. Os segundos reagentes decaptura adequados da presente invenção são anticorpos contra IgG1 IgM ou IgA,proteína A, proteína G ou concanavalina A. Em mais uma representaçãoapresentada, os segundos reagentes de captura incluem os anticorpos anti-lgGdas espécies exceto a que contribui o fluído oral. De preferência, o segundoreagente de captura é o anticorpo IgG anti-humano; mais preferivelmente, osegundo reagente de captura é o anticorpo IgG anti-humano de cabra.

Conforme usado aqui, o "caminho do fluxo" se refere à rota tomadapor uma amostra de fluído oral enquanto ela passa através da matriz. Ocominho do fluxo é, de preferência, uma rota única, mas pode incluir várias rotasonde cada rota pode suportar o fluxo do líquido simultaneamente,seqüencialmente ou independentemente em relação a outras rotas.

"A jusante" se refere ao caminho do fluxo direcional de um líquidoatravés da matriz em direção oposta ao ponto de aplicação do líquido.

"Contra a corrente" se refere ao caminho do fluxo direcional de umlíquido através da matriz em direção ao ponto de aplicação do líquido.

No segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método defabricação da tira de teste de imunocromatografia por fluxo lateral,compreendendo: a) a aplicação em listras do conjugado na almofada doconjugado; b) a imobilização do reagente de ligação específico na zona de testee imobilização do segundo reagente de captura na zona de controle daalmofada da zona de teste e da zona de controle; c) o bloqueio de cada umadas almofadas com o agente bloqueador; e e) o alinhamento das almofadasresultantes na comunicação de fluído em relação a uma com a outra.

Aplicação em listras do conjugado na almofada do conjugado

O conjugado é depositado na matriz da almofada de conjugação demodo a permitir que ele esteja prontamente mobilizável no fluxo do fluído apóscontato com a amostra do fluído oral. Para conseguir isso, a matriz da almofadado conjugado é feita de um poliéster não tecido. O conjugado é aplicado emlistras na almofada com uma solução de Iistramento usando, por exemplo, ouuma ponta de contato ou uma ponta de aerossol. Antes da aplicação, oconjugado é, de preferência, estabilizado. Por exemplo, o conjugado pode serestabilizado em sacarose de 20%, trealose de 5% e peróxido de hidrogênio deuréia de 0,1%.

Enquanto a amostra do fluído oral passa através da almofada deconjugação, o conjugado é solubilizado e se junta ao fluxo do fluído através datira de teste.

Imobilização do reagente de ligação específico na zona de teste

Os reagentes de ligação específicos adequados para uso nainvenção podem ser obtidos de qualquer fonte inclusive a produção nativa, desíntese química ou recombinante, utilizando os métodos bem conhecidos paraos especialistas da técnica. Por exemplo, a porção de peptídeos da SEQ IDNo.1 a 5 apresentada pode ser sintetizada quimicamente usando as técnicas desíntese dos peptídeos de fase sólida ou produzida de uma maneirarecombinante ligando operavelmente o ácido nucléico, codificando o peptídeodesejado num vetor de expressão, e, expressando o ácido nucléico numhospedeiro adequado. Uma vez isolado, o peptídeo pode ser biotinilado usandoas técnicas conhecidas.

Os antígenos adequados podem ser imobilizados para a matrizusando qualquer método conhecido para os especialistas da técnica, que nãodestrói a ligação específica do antígeno com o anticorpo-alvo. De preferência,para os antígenos de proteína recombinante, o antígeno é imobilizadodiretamente na matriz sem mais modificações. De preferência, o antígeno depeptídeo sintetizado é imobilizado para a matriz usando o Iigante debiotina/estreptavidina, e, de maneira mais preferível, o antígeno é juntado àbiotina e complexado com a estreptavidiva antes de juntar a estreptavidina àmatriz. Normalmente, para matrizes absorventes, a estreptavidina do complexoé juntada à matriz antes do bloqueio usando as técnicas bem conhecidas paraos especialistas da técnica. De preferência, a junção é alcançada em umasolução que contém, pelo menos, a razão de 4:1 de equivalentes do local deligação de estreptavidina a cada parte de biotina, apesar de outras razões taiscomo 0,5:1, 1:1, 2:1, 3:1 e 5:1, entre outras, e todas as razões intermediárias(fracionais) também serem contempladas como parte da invenção. Paramatrizes absorventes, o complexo final pode ser simplesmente aplicado aomaterial da matriz e secado, seguido de bloqueio com o agente bloqueadoradequado. Os antígenos adequados tais como muitas proteínas recombinantesque têm o peso molecular suficientemente alto para se ligar à matrizdiretamente, não precisam ser ligados mediante o Iigante debiotina/estreptavidina. Os exemplos das seqüências dos aminoácidos depeptídeos antigênicos adequados para o uso na presente invenção sãoproporcionados como as SEQ ID No.1 a 5.

A imobilização do antígeno para a matriz é, de preferência, realizadade uma maneira que sirva para concentrar o conjugado do anticorpo marcadoque se liga especificamente ao antígeno imobilizado. Mediante a concentraçãodo conjugado do anticorpo marcado, o sinal produzido pelo marcador éfortalecido melhorando a sensibilidade e minimizando o potencial de se obter oresultado errôneo.

Imobilização do segundo reaqente de captura na zona de controle

A zona de controle contém o segundo reagente de captura e é, depreferência, imobilizado dentro da zona de controle para formar a linha decontrole que concentra o conjugado do marcador. Os segundos reagentes decaptura adequados para uso na presente invenção são imobilizados para amatriz usando as técnicas conhecidas, inclusive, as descritas acima para oantígeno imobilizado. O segundo reagente de captura pode ser imobilizado paraa matriz usando o Iigante de biotina/estreptavidina em cujo caso, de maneiramais preferível, o segundo reagente de captura é ligado à biotina e complexadocom a estreptavidina antes de ligar a estreptavidina à matriz, conforme descritoacima. De preferência, os reagentes de captura tais como o IgG F(ab')2 anti-humano de cabra podem ser imobilizados na matriz diretamente sem o uso doIigante de biotina/estreptavidina.Bloqueio das almofadas com agentes bloqueadores

Apesar de os materiais inerentemente absorventes poderem serusados para fazer as almofadas na presente invenção, o fluxo do fluído atravésdas tiras de teste da presente invenção é, de preferência, de natureza nãoabsorvente.

Os materiais absorventes podem ser convertidos para materiais quedemonstram as características de fluxo não absorventes mediante a aplicaçãode agentes bloqueadores. Estes agentes podem ser detergentes, açúcares ouproteínas que podem obscurecer as forças interativas, produzindo ascaracterísticas absorventes. Os exemplos dos agentes bloqueadores deproteína incluem albumina de soro bovino ou por si só ou em forma metilada ousuccinilada, soros animais integrais tais como soro de cavalo ou de bezerrofetal, e outras proteínas de sangue. O agente bloqueador preferido é soroaviário tal como o soro de ganso ou de peru, e, mais preferivelmente, o soro degalinha. Outros exemplos dos agentes bloqueadores de proteína incluemcaseína ou leite em pó desnatado. Os agentes bloqueadores à base dodetergente são selecionados de formas não iônicas, catiônicas, aniônicas eanfotéricas sendo que a seleção é baseada na natureza da matriz que estásendo bloqueada. O Tween 20 é um detergente especialmente útil parabloquear membranas. Os exemplos de açúcares que podem ser utilizados comoagentes bloqueadores, incluem sacarose e frutose.

A aplicação do agente bloqueador pode ser realizada tratando asalmofadas com a solução do agente bloqueador em uma concentração eficientepara descartar as reatividades não desejadas na superfície. Em geral, estetratamento é conduzido com a solução bloqueadora tal como a solução deproteína de 1-20 mg/ml a aproximadamente temperatura ambiente durantevários minutos a várias horas. Então, o material recoberto resultante épermanentemente adsorvido para a superfície pela secagem de ar, liofilizaçãoou outros métodos de secagem.

O uso da matriz que é inerentemente absorvente, mas conversívelpara a característica de fluxo não absorvente é, especialmente, útil paraimobilização dos reagentes de ligação específicos e segundos reagentes decaptura. Por exemplo, o segundo reagente de captura pode ser aplicado àmatriz antes da aplicação dos agentes bloqueadores e pode ser imobilizado insitu. Assim que o segundo reagente de captura foi imobilizado na matriz, então,o agente bloqueador pode ser aplicado.

Por exemplo, os agentes bloqueadores da invenção são aplicados naalmofada da amostra em volumes suficientes para prevenir a interação doanticorpo-alvo com o material da matriz durante o exercício da invenção. Oagente bloqueador especialmente vantajoso para uso na almofada da amostra ésoro aviário, mais preferivelmente, o soro de galinha. Na representaçãoapresentada, a almofada da amostra é impregnada com a solução que contémpolivinilpirolidona, albumina de soro bovino, soros aviários, tampões de boratoe/ou carbonato (cerca de 0,5M) e detergentes Triton X-100 ou Tween 20. Para aalmofada da amostra feita do material de fibra de vidro, o tampão bloqueador deamostra mais preferido consiste de soro de galinha de 40% (inativado pelo calore esterilizado pela filtragem), bicarbonato de potássio de 0,25M, bibásico defosfato de potássio de 0,05M, Tween 80 de 0,1%, estanato de potássio de100mM e peróxido de hidrogênio de uréia de 0,2% a pH de 8,2 a 8,5. Aalmofada é espremida para remover o excesso do tampão e secada durante onoite a 30° C. A vantagem desta abordagem é o aumento de molhabilidade e daação capilar da almofada da mostra.

A composição e o pH do tampão bloqueador variam com o tipo dematerial da almofada. Por exemplo, a almofada do conjugado feita de materialde poliéster é bloqueada imergindo-a no tampão que contém polivinilpirolidona,soro de galinha, albumina de soro bovino, peróxido de hidrogênio de uréia de0,1%, tampões de estanato de potássio de 100 mM e carbonato de potássioe/ou borato. Então, a almofada de conjugação é secada a 50°C e o ar forçadopor 120 minutos, seguido de secagem por ar a temperatura ambiente durante anoite. Para a almofada da zona de teste e da zona de controle feita demembrana de nitrocelulose, o tampão bloqueador de amostra mais preferidoconsiste de albumina de soro bovino de 0,15%, Tween 20 de 0,075 em potássiotamponado a pH 7,8 +/- -0,1.

No terceiro aspecto, a presente invenção proporciona o método deimunocromatografia por fluxo lateral para a detecção do analito no fluído oral,compreendendo: (a) a coleta de fluído oral com o coletor separado da tira deteste de imunocromatografia por fluxo lateral; (b) a imersão do coletor numvolume do tampão de amostra para liberar o fluído oral no tampão para se obtera mistura; (c) a colocação da tira de teste de imunocromatografia por fluxolateral, conforme descrito acima, na mistura durante cerca de 15-60 minutos; (d)a determinação da validade do teste mediante a observação da presença dosinal na zona de controle, e a determinação da presença do analito mediante aobservação da presença do sinal na zona de teste.

O princípio do método mencionado acima é conforme segue. O fluídooral é absorvido pela matriz e migra para cima da tira de teste do ensaio. Ele re-hidrata o conjugado, por exemplo, o reagente de ouro coloidal de proteína Aavermelhado, e o IgG na amostra se liga ao conjugado para formar oscomplexos de IgG/conjugado. Os complexos de IgG/conjugado continuammigrando para cima da tira, e, primeiramente, chegam à zona de teste da tira deteste que contém o reagente de ligação específico que pode serespecificamente ligado pelo analito-alvo, e ficam imobilizados na zona de teste,sendo que aparece um sinal, por exemplo, uma linha de cor avermelhada. Issoindica um resultado reativo ou positivo. A ausência do sinal na zona de testeindica que a amostra não contém o analito-alvo e constitui um resultado nãoreativo ou negativo. Os complexos de IgG/conjugado continuam migrando paracima da tira de teste do ensaio até chegarem à zona de controle. A zona decontrole contém o segundo reagente de captura, por exemplo, os fragmentos deF(ab')2 IgG anti-humanos de cabra imobilizados em uma linha da tira de testedo ensaio. Os complexos de IgG/conjugado remanescentes se ligam aosfragmentos de F(ab')2 imobilizados e o sinal, por exemplo, uma linha de coravermelhada aparece. O aparecimento deste sinal evidencia que o testefuncionou adequadamente e conteve o IgG. O sinal aparecerá na zona decontrole durante a realização de todos os testes válidos independentemente dea amostra ser reativa ou não reativa para o analito-alvo. O espécime continuamigrando, passando a zona de controle, até a almofada absorvente final queajuda a retirar os complexos de IgG/conjugado através da tira e limpar qualquercor de segundo plano.

Neste aspecto, o coletor da amostra que pode ser usado para esteensaio, pode coletar o transudato de mucosa oral da boca, e, se sabe que elepossui o IgG diagnóstico mais alto requerido por outros produtos (por exemplo,veja patente US Patent No. 5,103,836). De fato, na representação apresentada,o coletor usado para este ensaio é um suabe de poliéster não tratadoprontamente disponível no comércio, ou seja, Texwipe Large Alpha Swab,TX714A (Texwipe Inc., Upper Saddle River NJ).

Na representação deste aspecto, o tampão da amostra usado paradiluir o fluído oral é o cloreto de sódio de 0,15M tamponado com fosfato depotássio a pH de 7,2 +/-0,2, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinha inativadopelo calor de 15%, Avidina de 30 pg/ml, Tween 80 de 0,2%, Tetronic T-904 de0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%. O volume do tampão deamostra usado para diluir o fluído oral é de 1000μl.

Ema mais uma representação apresentada, o método, além disso,compreende um passo de remoção de uma alíquota da mistura entre o passo(b) e o passo (c). Em uma representação especial, o volume da alíquota é de200 μl.

Quando estiver funcionando corretamente, o segundo reagente decaptura continuará a ligar todos os conjugados dos anticorpos marcados até osconjugados dos anticorpos marcados não ligados forem esgotados ou osegundo reagente de captura ficar saturado. Considerando que até a amostrado fluído oral de mamíferos sadios contêm o IgG endógeno e o valor molar doagente marcador unido ao marcador, de preferência, excede o valor molar doantígeno imobilizado, o conjugado do anticorpo marcado sempre deve estardisponível para se ligar ao segundo reagente de captura, produzindo um sinalna linha de controle. Portanto, o malogro de detectar o sinal na linha de controleindica ou a ausência do IgG humano suficiente para produzir a linha visível ou atira de teste defeituosa ou manuseio incorreto da tira.

Normalmente, os sinais do marcador podem ser observados entre 15e 60 minutos, mais preferivelmente, entre 15 e 45 minutos, e o maispreferivelmente, entre 15 e 30 minutos após a tira de teste ser inserida no fluídooral. A leitura dos resultados do teste antes de 15 minutos ou depois de 60minutos após o início do teste pode produzir resultados errôneos. Os sinaisproduzidos por marcadores coloridos, conforme descrito acima, geralmente,podem ser detectados diretamente da tira de teste sem processamentoadicional. O marcador fluorescente pode requerer um fluorímetro para detecção.Os sinais produzidos por marcadores de hidrossol de metal podem serintensificados usando a solução de sal de prata nos métodos bem conhecidospara os especialistas da técnica. De maneira semelhante, quando enzimas sãousadas, os marcadores devem estar em contato com o substrato do marcadorde enzimas que produz um produto detectável. Assim, estes métodosaperfeiçoados desviam da rotina, o ensaio de um passo só realizado com osmarcadores de particulados coloridos e hidrossóis enquanto a matriz deve estarem contato com a solução em desenvolvimento (a solução de um sal de prataou de substrato) antes de o marcador ser detectado.

Na representação mais preferida, a presente invenção proporcionauma tira de teste que contém ou proteínas recombinantes ou peptídeossintéticos representando as regiões imunodominantes das proteínas doenvelope de gp41 do HIV-1 e gp36 do HlV-2 e o controle do procedimento decaptura do anticorpo do fragmento do IgG F(ab')2 anti-humano de cabraimobilizado na membrana de nitrocelulose na zona de teste e na zona decontrole, respectivamente.

A Figura 1 demonstra o procedimento do teste imunocromatográficorápido do líquido oral de acordo com a representação apresentada da invençãoem que as Figuras 1-1 a 1-15 demonstram os passos do teste. Para realizar oensaio, as gengivas superiores e inferiores dos indivíduos são esfregadas comum suabe de poliéster o qual, então, é colocado em aproximadamente 1000μΙde tampão de amostra do fluído oral (cloreto de sódio de 0,15M tamponado comfosfato de potássio a pH de 7,2 +/-0,2, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinhainativado pelo calor de 15%, Avidina de 30 pg/ml, Tween 80 de 0,2%, TetronicT-904 de 0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285% em uma proveta emisturado na proveta. O líquido no suabe é espremido e descartado, e 200 μΙ damistura deste espécime é transferido para uma proveta limpa, a fim de realizar oensaio. A tira de teste do ensaio é colocada verticalmente na proveta quecontém a mistura de espécime de 200μΙ. Enquanto o espécime diluído migrapara cima da tira de teste do ensaio, ele re-hidrata o reagente de ouro coloidalde proteína A avermelhado na tira, e o IgG no espécime se liga à proteínaA/partículas de ouro coloidal para formar os complexos de IgG/conjugado. Oscomplexos de IgG/conjugado continuam migrando para cima da tira e,primeiramente, chega até a zona de teste da tira de teste do ensaio que contémo antígeno do HIV que se liga aos anticorpos do anti-HIV e se tornamimobilizados na linha de antígenos na zona de teste, sendo que a linha decoloração avermelhada aparece. Isso indica o resultado reativo ou positivo. Aintensidade da linha não é proporcional ao volume do anticorpo presente noespécime. A ausência da linha colorida na zona de teste indica que a amostranão contém os anticorpos do anti-HIV. Os complexos de IgG/conjugadocontinuam migrando para cima da tira de teste do ensaio até chegarem à zonade controle. A zona de controle contém os fragmentos de F(ab')2 IgG anti-humano de cabra imobilizados na linha na tira de teste do ensaio. Os complexosde IgG/conjugado se ligam aos fragmentos F(ab')2 imobilizados e a linha decoloração avermelhada aparece. O aparecimento da linha de controle evidenciaque o teste funcionou adequadamente e conteve o IgG. A linha de controleavermelhada aparecerá na zona de controle durante a realização de todos ostestes válidos independentemente de a mostra ser reativa ou não reativa paraos anticorpos para o HIV-1 ou 2. O espécime continua migrando, passando azona de controle, até a almofada absorvente final que ajuda a retirar oscomplexos de IgG/conjugado através da tira e limpar qualquer coloração desegundo plano. Os resultados do teste são interpretados 20 minutos depois,mas não mais do que 45 minutos após a introdução da tira de teste do ensaio noespécime diluído. A leitura dos resultados do teste antes de 20 minutos oudepois de 45 minutos após o início do teste pode produzir os resultados errados.A amostra diluída remanescente pode ser utilizada para outro teste tal como oteste confirmatório.

A Figura 2 demonstra os três resultados possíveis do testeimunocromatográfico rápido do líquido oral de acordo com a representaçãoapresentada da invenção em que as Figuras 2A, 2B e 2C representam osresultados negativo, positivo e inválido, respectivamente.

A Figura 2A demonstra os resultados não reativos em que apenasuma linha só aparece na zona de controle sugerindo a ausência dos anticorposreativos do anti-HIV-1 ou anti-HIV-2 na amostra do fluído oral. O resultado doteste é interpretado como negativo para os anticorpos do HIV.

A Figura 2B mostra o resultado reativo em que ambas as linhas deteste e de controle aparecem, ou seja, duas linhas aparecem na tira de teste, nazona de teste e na zona de controle, respectivamente. Uma destas linhas podeser mais escura do que a outra. O resultado reativo significa que os anticorposdo anti-HIV-1/2 foram detectados na amostra do fluído oral. Este resultado doteste é interpretado como positivo preliminar para os anticorpos do HIV.

A Figura 2C mostra os resultados inválidos em que não há linha decontrole na zona de controle. O resultado é inválido mesmo se a linha de testeapareça na zona de teste. O teste inválido deve ser repetido com a nova tira deteste.

A representação descrita acima pode ser desenhada de maneirasalternativas que incluem marcadores alternativos exceto o hidrossol de ouro. Porexemplo, outros marcadores incluem, mas não são limitados a, hidrossóiselementares ou de metal tais como selênio, prata, ferrita ou carbono, outraspartículas globulares tais como látex colorido, Iipossomas e partículas decorantes. Outros primeiros reagentes de captura capaz de capturarespecificamente os anticorpos nas amostras do fluído oral incluem, mas não sãolimitados a, anticorpos contra o IgM ou IgA; proteína G ou concanavalina A. Osegundo reagente de captura também pode ser formulado para incluir, mas nãoser limitado a, Iigantes alternativos tais como a proteína A ou a proteína G.

No quarto aspecto, a presente invenção proporciona os kits para adetecção do analito no fluído oral, compreendendo uma tira só de teste deimunocromatografia por fluxo lateral, conforme descrito acima. A tira de teste seencontra encerrada em um recipiente dissecado. Cada kit pode incluiropcionalmente o tampão de amostra, o coletor do fluído oral, o encarte dopacote que proporciona as instruções de uso das tiras incluídas, frascos quecontêm o controle positivo e negativo para testar a qualidade da tira de teste, umcronômetro que pode ser usado para determinar quando o ensaio da invençãofor completado, e/ou um recipiente para descarte de materiais biológicospotencialmente perigosos.

Na representação apresentada deste aspecto, o tampão da amostra éa solução tamponada de fosfato de potássio a pH de 7,2 +/-0,2, que aindacontém o cloreto de sódio de 0,15M, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinhainativado pelo calor de 15%, Avidina de 30 pg/ml, Tween 80 de 0,2%, TetronicT-904 de 0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%.

Apesar de a invenção acima ser descrita em alguns detalhesmediante a ilustração e exemplos para maior clareza e compreensão, seráaparente no contexto desta invenção para qualquer pessoa especialista datécnica que várias alterações e modificações podem ser feitas nela sem sedesviar do espírito e escopo das reivindicações anexadas.

Além do diagnóstico do HIV mediante a detecção dos anticorpos doHIV no fluído oral, a presente invenção pode ser prontamente configurada paraa diagnose de numerosas condições que requerem a detecção imunológica deanalitos no fluído oral. É especialmente fácil usar o conceito da invenção paradetecção de doenças sexualmente transmissíveis tais como o anticorpo de sífilise anticorpo do vírus de hepatite.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes ilustrarão a invenção sem limitá-la a eles.

Exemplo 1: fabricação das tiras de teste de imunocromatografia.

As tiras de teste para o teste rápido do HIV-1/2 do fluído oral sãoproporcionados neste exemplo em que o material de fibra de vidro é utilizadocom a matriz da almofada da amostra, material de poliéster é usado como amatriz da almofada de conjugação, e a membrana de nitrocelulose é usadacomo a matriz da almofada de teste e de controle.

1 polegada de material de fibra de vidro S&S S-33 é embebida com otampão bloqueador que consiste de soro normal de galinha de 40% (inativadopêlo calor) bicarbonato de potássio de 0,25M, bibásico de fosfato de potássio de0,05M, Tween 80 de 0,1%, estanato de potássio de IOOmM e peróxido dehidrogênio de uréia de 0,2% a pH de 8,2 a 8,5 secada a temperatura ambiente(15-30° C) em uma sala com baixa umidade durante 8 horas, e, então, durante anoite em um recipiente dissecado a 50° C, e mantida dissecada.

A almofada do conjugado foi preparada da membrana de poliésterlistrando o conjugado de ouro e proteína A na almofada usando uma ponta deaerossol. Antes de aplicação em listras, o conjugado foi estabilizado emSacarose de 20%, Trealose de 5%, estanato de potássio de 100mM e peróxidode uréia de 0,1%. Então, a almofada foi imersa em um tampão que continhapolivinilpirolidona, soro de galinha, albumina de soro bovino e tampão decarbonato, e secada a 50° C usando o ar forçado durante 50 minutos.

Os antígenos do HIV podem ser juntados às almofadas da zona deteste usando a ligação de estreptavidina/biotina. Para aplicação em listras, opeptídeo sintético do HIV-1 e peptídeo sintético do HIV-2, (por exemplo, SEQ IDN0.1 a 5) são usados a 300ng/tira de teste e 0,15 ng/tire de teste aplicados naalmofada de teste, respectivamente. A solução que consiste de 1,2 mg/ml doHIV-1, 0,06 mg/ml do HIV-2, Avidina de 4,36 mg/ml e álcool de isopropila de0,05%, é usada na aplicação em listras da almofada de teste. 1 mg/ml do IgG FcF(ab)2 anti-humano de cabra é aplicado na almofada de controle.

Para a tira de teste usando o HIV-1 recombinante/HIV-2recombinante, a proteína gp41 a 0,4-0,7 pg/tira e a proteína gp36 a 0,04-0,08pg/tira em Tween 80 de 0,001%, sacarose de 80,5% e metanol de 2% sãoaplicados na zona de teste e IgG F(ab')2 anti-humano de cabra a 0,175 pg/testeem sacarose de 5%, metanol de 2% e carbonato de potássio de 0,01 M a pH 8,4é aplicado na zona de controle.

A almofada da zona de teste e da zona de controle tratada conformedescrito acima é bloqueada pelo agente bloqueador que consiste de albuminade soro bovino de 0,15%, Tween 20 de 0,075% no tampão de fosfato depotássio a pH 7,8 +/-0,1%. Então as almofadas resultantes foram alinhadas emcomunicação de fluído em relação a uma à outra sendo que a almofada doconjugado ficou a jusante da almofada da amostra; a almofada de teste e dazona de controle a jusante da almofada do conjugado de tal maneira que a zonade controle ficou a jusante da zona de teste.Exemplo 2: teste imunocromatoqráfico rápido do fluído oral

O teste imunocromatográfico rápido do líquido oral usando a tira dainvenção é proporcionado conforme mostrado na Figura 1-1 às Figuras 1-15.Primeiro, misture o tampão da amostra (cloreto de sódio 0,15M tamponado comfosfato de potássio a pH 7,2 +/- 0,2, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinhainativado pelo calor de 15%, Avidina de 30 pg/ml, Tween 80 de 0,2%, TetronicT-904 de 0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%) virando demaneira suave a garrafa cerca de 3 vezes. Remova a tampa da garrafa (Fig. 1-1)e encha o tampão até a linha na pipeta (Fig. 1-2). Esvazie todo conteúdo dapipeta na proveta (Fig. 1-3). Então, remova um dos suabes limposproporcionados da sacola. Pegue o suabe pela haste. Evite tocar a extremidadede pano do suabe. Subseqüentemente, aplique a pressão moderada enquantoestiver esfregando de maneira suave a linha da gengiva superior para frente epara trás com a extremidade de pano do suabe. Comece em um canto da boca,esfregando de maneira suave e lenta até alcançar o outro canto da boca (Fig. 1-4) e, então, esfregue de volta ao longo da linha da gengiva superior até ondefica o ponto de início (cerca de 5-6 segundos) (Fig. 1-5). Então, vire o suabepara usar o outro lado do suabe para a gengiva inferior (Fig. 1-6). Usando ooutro lado suabe, esfregue de maneira suave e lenta a linha da gengiva inferiorpara frente e para trás. Comece em um canto da boca (Fig. 1-7) terminando nooutro canto da boca, e, então, esfregue de volta ao longo da linha da gengivainferior até o ponto em que você começou (cerca de 5-6 segundos) (Fig. 8).Coloque imediatamente o suabe na proveta que contém o tampão de amostra(Fig. 1-9). Pegue com firmeza a haste do suabe. Emirja e tire o suabe do tubodo tampão de amostra 6-8 vezes esfregando ambos os lados do suabe contraas paredes da proveta (Fig. 1-10). Remova o suabe da proveta (Fig. 1-11).Agora, a amostra está pronta para realizar o teste. Transfira 200 μΙ destaamostra para uma proveta de teste vazia. Esta alíquota será testada com a tirade teste do ensaio abaixo. Se mais do que uma tira de teste for utilizada naamostra, as alíquotas múltiplas de 200 μΙ podem ser transferidas para asprovetas individuais de teste vazias. Abra o tubo que contém as tiras de teste doensaio. Remova uma tira de teste do ensaio do tubo e feche-o com a tampaimediatamente. Evite tocar a superfície da membrana no meio da tira com seusdedos. Coloque a tira de teste do ensaio na proveta que contém 200 μΙ doespécime diluído, com as setas na tira de teste do ensaio apontando para baixo(Fig. 1-12). Ajuste o cronômetro para 20 minutos, ou anote o tempo em que atira de teste do ensaio foi acrescentada à amostra (Fig. 1-13). Leia o resultadodo teste 20 minutos depois (Fig. 1-14). Então, descarte a tira, a proveta e osuabe para o recipiente de resíduos biológicos perigosos (Fig. 1-15).

Exemplo 3: determinação da sensibilidade, especificidade e precisão dos kits

A sensibilidade, especificidade e precisão do teste do fluído oral sãodeterminadas neste exemplo. As pesquisas de validação externa dos TestesLaterais do HIV do Fluído Oral começaram em abril de 2004 na Clínicatailandesa anônima do HIV da Cruz Vermelha de Bangkok, Tailândia, e foramcompletadas em junho de 2004. 986 indivíduos que se apresentaram na Clínicatailandesa anônima do HIV da Cruz Vermelha tailandesa e não estavam naquelemomento submetidos à terapia anti-retroviral (ARV), foram submetidos aostestes voluntários de anticorpos do HIV e aconselhamento. O estudo foirealizado mediante o teste seqüencial dos indivíduos sem conhecimento préviodos resultados. Além disso, 37 indivíduos que se sabia que estavam positivos esubmetidos à terapia anti-retroviral (ARV)1 também foram voluntariamentesubmetidos ao teste de anticorpos do HIV e aconselhamento. Os indivíduostiveram a oportunidade de concordar voluntariamente em proporcionar asamostras adicionais para serem testadas mediante estes testes.

A metodologia de referência usada na Clínica Anônima do HIV foi oTeste Rápido de Sangue do HIV-1/-2 da Orgânica, Checagem Dupla ™ Il paratriagem inicial. Os espécimes reativos deste teste foram confirmados usandoBio-Rad GenScreen™ HIV-1/-2 Versão 2 ELISA e/ou o Teste de Aglutinação dePartículas (apenas HIV-1) de Fujirebio Serodia®-HIV.

A sensibilidade é representada como a percentagem obtida peladivisão do número de resultados positivos no teste de referência pelo número deresultados positivos no teste rápido do fluído oral. A especificidade érepresentada como a percentagem obtida pela divisão do número de resultadosnegativos no teste de referencia pelo número de resultados negativos no testerápido do fluído oral. E a precisão é representada como a percentagem obtidapela divisão do número total de indivíduos pelo número dos resultadosconsistentes entre o teste rápido do fluído oral e o teste de referencia. Osresultados são mostrados nas tabelas seguintes.

Tabela 1. Teste rápido do fluído oral do HIV-1/-2 - peptídeo do HIV-1recombinante/HIV-2 sintético.<table>table see original document page 39</column></row><table>

Tabela 2. Teste rápido do fluído oral do HIV-1/-2 - peptídeo do HIV-1sintético/HIV-2 sintético.

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Claims (45)

1. Uma tira de teste de imunocromatografia por fluxo lateralcaracterizada por detectar o analito no fluído oral que, essencialmente, consistede uma almofada da amostra, uma almofada do conjugado, uma almofada dazona de teste e da zona de controle, feitas de, pelo menos, um material matriz,em que:- a almofada do conjugado fica a jusante da almofada da amostra, eestá listrada com o conjugado;- a almofada da zona de teste e da zona de controle fica a jusante daalmofada do conjugado e contém a zona de teste e a zona de controle, em que- a zona de teste é imobilizada com um reagente específico deligação que se liga especificamente ao analito-alvo; ea zona de controle é imobilizada com o segundo reagente de captura.

2. A tira de teste de acordo com a reivindicação 1, em que o analito aser testado é selecionado de anticorpos contra antígenos de doençasinfecciosas, hormônios, fatores de crescimento, drogas terapêuticas, drogas deabuso e produtos do metabolismo das drogas de abuso.

3. A tira de teste de acordo com a reivindicação 1 em que o materialda matriz é selecionado de pós inorgânicos tais como sílica e alumina; papel defiltragem de fibra de vidro; material polimérico natural especialmente materiais àbase de celulose, papel cromatográfico; polímeros sintéticos ou modificados queocorrem naturalmente, tais como nitrocelulose, acetato de celulose, cloreto depoli(vinil), poliacrilamida, dextrana com ligação cruzada, agarose; e acombinação deles.

4. A tira de teste de acordo com a reivindicação 3 em que o materialda matriz para a almofada da amostra é de papel de filtragem de fibra de vidro.

5. A tira de teste de acordo com a reivindicação 3, onde o material damatriz para a almofada do conjugado é de material de poliéster.

6. A tira de teste de acordo com a reivindicação 3, em que o materialda matriz para a almofada de teste e a almofada de controle é a membrana denitrocelulose.

7. A tira de teste de acordo com a reivindicação 1, em que oconjugado compreende um marcador conjugado para o primeiro reagente decaptura que captura anticorpos endógenos para o fluído oral.

8. A tira de teste de acordo com a reivindicação 7, em que omarcador é selecionado de partículas de ouro coloidal; partículas elementaresou de hidrossol de metal inclusive selênio, prata, ferrita ou carbono; outraspartículas globulares inclusive látex colorido, lipossomas, e partículas decorantes.

9. A tira de teste de acordo com as reivindicações 7 ou 8, em que omarcador é partículas de ouro coloidal.

10. A tira de teste de acordo com a reivindicação 7, em que o primeiroreagente de captura é selecionado dos anticorpos contra IgG1 IgM ou IgA1proteína A1 proteína G e concanavalina A.

11. A tira de teste de acordo com a reivindicação 8, em que o primeiroreagente de captura é a proteína A.

12. A tira de teste de acordo com a reivindicação 1 em que oreagente de ligação específico é selecionado dos antígenos de doençasinfecciosas, hormônios, fatores de crescimento, drogas terapêuticas, drogas deabuso e produtos do metabolismo das drogas de abuso.

13. A tira de teste de acordo com a reivindicação 12 em que oantígeno da doença infecciosa é peptídeo recombinante ou sintéticorepresentando a região imunodominante da proteína do HIV.

14. A tira de teste de acordo coma reivindicação 13 em que aproteína do HIV é a proteína do envelope do HIV.

15. A tira de teste de acordo com a reivindicação 14 em que aproteína do envelope do HIV é selecionada de gp120 e gp41 do HIV-1 e gp36do HIV-2.

16. A tira de teste de acordo com a reivindicação 1 em que o segundoreagente de captura é selecionado dos anticorpos contra IgG1 IgM ou IgA1proteína A, proteína G e concanavalina A.

17. A tira de teste de acordo com a reivindicação 16 em que oanticorpo contra IgG é o anticorpo IgG anti-humano de cabra.

18. O método de fabricação da tira de teste de imunocromatografiapor fluxo lateral definido por qualquer uma das reivindicações 1-17,compreendendo:a) aplicação em listras do conjugado na almofada do conjugado;b) imobilização do reagente de ligação específico na zona de teste daalmofada da zona de teste e da zona de controle;c) imobilização do segundo reagente de captura na zona de controleda almofada da zona de teste e da zona de controle;d) bloqueio de cada uma das almofadas com o agente bloqueador; ee) alinhamento das almofadas resultantes na comunicação do fluídoem relação a uma à outra.

19. O método de acordo com a reivindicação 18 em que o conjugadoé estabilizado em uma solução simples ou complexa de açúcar antes deaplicação em listras.

20. O método de acordo com a reivindicação 19 em que a solução deaçúcar contém sacarose, trealose, estanato de potássio e peróxido dehidrogênio de uréia.

21. O método de acordo com a reivindicação 18 em que o reagentede ligação específico é imobilizado na zona de teste usando o Iigante debiotina/estreptavidina.

22. O método de acordo com a reivindicação 18 em que o reagentede ligação específico é imobilizado na zona de controle usando o Iigante debiotina/estreptavidina.

23. O método de acordo com a reivindicação 18 em que o agentebloqueador contém detergentes em formas não iônica, catiônica, aniônica eanfotérica; açúcares incluindo sacarose, frutose; ou proteínas inclusive albuminade soro bovino, soro animal integral, caseína e leite em pó desnatado.

24. O método de acordo com a reivindicação 19 em que o soroanimal integral é o soro de bezerro fetal.

25. O método de acordo com a reivindicação 19 em que o soroanimal integral é o soro aviário.

26. O método de acordo com a reivindicação 21 em que o soroaviário é selecionado do soro de ganso, soro de peru e soro de galinha.

27. O método de imunocromatografia por fluxo lateral para a detecçãodo analito no fluído oral, compreendendo:(a) coleta do fluído oral com o coletor separado da tira de teste deimunocromatografia por fluxo lateral definida por qualquer uma dasreivindicações 1-17;(b) imersão do coletor em um volume do tampão de amostra paraliberar o fluído oral no tampão, a fim de se obter a mistura;(c) colocação da tira de teste de imunocromatografia por fluxo lateraldefinida por qualquer uma das reivindicações anteriores para dentro da mistura;e(d) determinação da validade do teste mediante a observação dapresença do sinal na zona de controle, e a determinação da presença do analitomediante a observação da presença do sinal na zona de teste dentro de 15-60minutos a partir do início do teste.

28. O método de acordo coma reivindicação 27 em que o coletor nopasso (a) é um suabe de poliéster não tratado.

29. O método de acordo com a reivindicação 28 em que o suabe éTexwipe Large Alpha Swab TX714A.

30. O método de acordo com a reivindicação 27 em que o tampão deamostra é a solução tamponada de fosfato de potássio a pH 7,2 +/- 0,2.

31. O método de acordo com a reivindicação 30 em que a soluçãotambém contém cloreto de sódio de 0,15M, Triton X-100 de 0,1%, soro degalinha inativado pelo calor de 15%, Avidina de 30 pg/ml, Tween 80 de 0,2%,Tetronic T-904 de 0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%.

32. O método de acordo com a reivindicação 27 em que o volume dotampão de amostra é de 1000 μΙ.

33. O método de acordo com a reivindicação 27 em que o métodotambém compreende o passo de remoção da alíquota da mistura entre o passo(b) e o passo (c).

34. O método de acordo com a reivindicação 33 em que o volume daalíquota é de 200 μΙ.

35. O método de acordo com a reivindicação 27 em que o sinal é umalinha colorida.

36. O método de acordo com a reivindicação 35 em que a linhacolorida é uma linha avermelhada.

37. O método de acordo com a reivindicação 27 em que o sinal éobservado dentro de 20-45 minutos.

38. O kit para a detecção do analito no fluído oral compreendendo,pelo menos, uma tira de teste de imunocromatografia por fluxo lateral definidapor qualquer uma das reivindicações 1-17.

39. O kit de acordo com a reivindicação 38 em que a tira de teste estáencerrada em um recipiente dissecado.

40. O kit de acordo com a reivindicação 38 em que o kit tambémcompreende um tampão de amostra e, pelo menos, um coletor para coleta dofluído oral.

41. O kit de acordo com a reivindicação 40 em que o tampão deamostra é a solução tamponada de fosfato de potássio a pH 7,2 +/- 0,2.

42. O kit de acordo com a reivindicação 41 em que a solução tambémcontém o cloreto de sódio de 0,15M, Triton X-100 de 0,1%, soro de galinhainativado pelo calor de 15%, Avidina de 30 Mg/ml, Tween 80 de 0,2%, TetronicT-904 de 0,2% e ProCIin 950 (ingrediente ativo) de 0,0285%.

43. O kit de acordo com a reivindicação 40 em que o coletor é umsuabe de poliéster não tratado.

44. O kit de acordo com a reivindicação 43 em que o suabe éTexwipe Large Alpha Swab TX714A.

45. O kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 44 emque o kit também compreende frascos que contêm o controle positivo e negativopara testar a qualidade da tira de teste.