BRPI0520362B1 - Preparation of insulin conjugates - Google Patents

Abstract

preparação de conjugados de insulina. a presente invenção refere-se a um processo para fazer um conjugado de oligômero de insulina como uma reação "one-pot" pela conjugação de éster de insulina com um oligômero ativado em que é realizado desbloqueio e conjugação simultaneamente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE INSULINA".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para fazer um conjugado insulina-oligômero como uma reação "one pot" pela conjugação de éster de insulina com um oligômero ativado em que é realizado desbloqueio e conjugação simultaneamente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As células β das ilhotas pancreáticas secretam um precursor de cadeia única da insulina, conhecido como pró-insulina, que após a proteólise resulta no polipeptídeo de insulina biologicamente ativo. A molécula de insulina é altamente conservada entre as espécies e consiste geralmente em duas cadeias de aminoácidos ligadas por pontes de dissulfeto. A molécula de insulina humana natural (pm 5.807 Dáltons) tem uma cadeia-A de 21 resíduos de aminoácidos com glicina na terminação amino; e uma cadeia-B de 30 resíduos de aminoácidos com fenilalanina na terminação amino. A insulina pode existir como um monômero ou pode se agregar em um dímero ou um hexâmero formado por três dos dímeros. O monômero tem a habilidade de se ligar aos receptores e é a forma biologicamente ativa. O polipeptídeo de insulina é o hormônio primário responsável por controlar o transporte, a utilização e o armazenamento de glicose no corpo. Um defeito no metabolismo de carboidrato como um resultado de produção insuficiente de insulina ou sensibilidade reduzida do receptor à insulina leva ao distúrbio biológico do diabetes. O diabetes prejudica a habilidade normal de usar a glicose e como um resultado os níveis de açúcar no sangue aumentam (hiperglicemia). Como a glicose se acumula no sangue, níveis excessivos de açúcar são excretados na urina (glicosúria). Outros sintomas de diabetes incluem volume e freqüência urinários aumentados, sede, irritação, fome, perda de peso e fraqueza. Diabetes quando não tratado leva a cetose, seguida por acidose com náusea e vômito. Como os produtos tóxicos continuam a se acumular, o paciente vai ao coma diabético, que leva à morte do paciente. Há dois tipos de diabetes. Tipo I é o diabetes melito insu- lina-dependente, ou IDDM. IDDM era anteriormente referido como "diabetes de inicio na juventude". No IDDM, a insulina não é secretada pelo pâncreas e deve ser fornecida a partir de uma fonte externa. Tipo II ou diabetes de início na idade adulta pode geralmente ser controlado pela dieta, embora em alguns casos avançados a insulina seja necessária.

Banting et aí descreveram o uso de insulina para o tratamento de diabetes usando extrato ativo do pâncreas em cães diabéticos. "Pancrea-tic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus" {Can. Med. Assoe. J., 12:141-146 (1922)). Naquele mesmo ano, o tratamento de um paciente com extratos pancreáticos resultou em uma melhora clínica dramática, que salvou sua vida.

Tradicionalmente, insulina bovina e suína eram usadas quase que exclusivamente para tratar diabetes em seres humanos. Com o desenvolvimento da tecnologia recombinante em escala comercial, a produção de insulina humana tornou-se possível pela fermentação. Além disso, análogos de insulina manipulados geneticamente que têm atividade biológica comparável àquela da insulina humana natural foram desenvolvidos para combater a doença.

Entretanto, o tratamento do diabetes requer tipicamente injeções regulares de insulina. Devido à inconveniência de injeções de insulina, várias abordagens têm sido tentadas para formular insulina para administração por vias não injetáveis. Uma lista de tais descrições inclui: US 4.338.306 (Kitao et al.) descreve composições farmacêuticas de insulina e ácidos graxos que têm 8 a 14 átomos de carbono e sais atóxicos desses para administração retal de insulina; US 4.579.730 (Kidron et al.) descreve composições de insulina com revestimento entérico com um ácido biliar ou sal de metal alcalino desse para administração oral de insulina; US 5.283.236 (Chiou et al.) descreve uma composição de insulina com um agente que aumenta a permeabilidade para auxiliar a absorção sistêmica de polipeptídeos de peso molecular maior, assim como inibidores de peptidase para liberação sistêmica de insulina através dos olhos em que o fármaco passa pelo duto nasolacrimal e é absorvido pela circulação; US 5.658.878 (Backstrom et al.) descreve insulina e um sal de sódio de um ácido graxo saturado de extensão de cadeia de carbono de 10 (isto e, caprato de sódio), 12 (laurato de sódio) ou 14 (mirista-to de sódio) que aumentam a absorção de insulina no trato respiratório inferior; US 5.853.748 (New et al.) descreve uma composição de insulina com revestimento entérico, um sal biliar ou ácido biliar, e íons de carbonato ou bicarbonato, usados para ajustar o pH do intestino para um pH entre 7.5 a 9 para administração oral de insulina; US 6.200.602 (Watts et al.) descreve uma composição para liberação de fármaco de insulina para liberação colô-nica de insulina com um promotor de absorção que inclui uma mistura de ácidos graxos que têm 6 a 16 átomos de carbonos e seus sais ou uma mistura de mono/diglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média junto com um agente dispersante, em um revestimento para impedir a liberação da insulina e do promotor de absorção até que o comprimido, cápsula ou pélete alcance o cólon proximal.

Foram feitas tentativas para liberar a insulina por administração oral. Os problemas associados com a administração oral de insulina para se obter a euglicemia em pacientes diabéticos estão bem-documentados na literatura farmacêutica e médica. As enzimas digestivas no trato Gl degradam rapidamente a insulina, resultando em produtos de degradação biologicamente inativos. No estômago, por exemplo, insulina administrada oralmente sofre proteólise enzimática e degradação ácida. A sobrevivência no intestino é impedida pela proteólise excessiva. No lúmen, a insulina é bombardeada por uma variedade de enzimas incluindo enzimas gástricas e pancreáti-cas, exo e endopeptidases e peptidases de borda em escova. Mesmo que a insulina sobreviva a esse ataque enzimático, as barreiras biológicas que devem ser transpostas antes que a insulina possa alcançar os seus receptores in vivo podem limitar a administração oral de insulina. Por exemplo, a insulina pode possuir baixa permeabilidade de membrana, limitando sua habilidade de passar do lúmen para a corrente sanguínea.

Polipeptídeos farmaceuticamente ativos tal como a insulina foram conjugados com misturas polidispersas de polietileno glicol ou misturas polidispersas de polietileno glicol contendo polímeros para fornecer misturas polidispersas de conjugados fármaco-oligômero: US 4 179 337 (Davis ei ai) aescreve conjugação de polipeptídeos tal como a insulina com vários polieti-leno glicóis tais como MPEG-1900 e MPEG- 5000 fornecidos por Union Carbide. US 5.567.422 (Greenwald) descreve a conjugação de nucleófilos biologicamente ativos com polietileno glicóis tais como m-PEG-OH (Union Carbide), que tem um número de peso molecular médio de 5000 Dáltons. A conjugação de polipeptídeos, tal como insulina, com polímeros de glicolipídio modificado por polietileno glicol e polímeros de ácido graxo modificado por polietileno glicol é descrita em US 5.359.030 (Ekwuribe et ai.). US 6.011.008 (Domb et al.) descreve um método para produzir um conjugado de polissacarídeo solúvel em água de uma substância sensível à oxidação que compreende ativar o polissacarídeo para um dialdeído por oxidação com periodato; (b) purificar o dialdeído a partir de íons interfe-rentes e subprodutos; e (c) acoplar a substância ao dialdeído purificado pela formação de base de Schiff para formar o conjugado. Opcionalmente, o conjugado da etapa (c) é reduzido para um conjugado de amina por uma substância redutora. Insulina foi conjugada a AG (arabinogalactano) oxidado a-través de uma ligação de amina ou imina pela reação de uma solução pura de AG (arabinogalactano) oxidado em solução tampão de borato em pH 8.9 com insulina a 4°C durante a noite. A solução clara foi dialisada através de uma diálise em celulose e a solução foi liofilizada para produzir 115 mg de um sólido branco. US 6.022.524 (Maisano et al.) Gd-DTPA foi conjugado com insulina de porco em uma solução de DTPA e dimetilsulfóxido (DMSO), é preparado por aquecimento e agitação, então é resfriado em temperatura ambiente e adicionado com uma solução de 11,73 g de NHS (0,102 mol) em 300 ml de DMSO, então, gota a gota, com uma solução de 19,6 g de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0,097 mol) em 400 ml de DMSO. A mistura é agitada por 16 horas, então filtrada e o filtrado é concentrado por evaporação a 50 graus C. e 5 Pa para um óleo espesso com um volume de cerca de 160 ml. US 6.309.633 (Ekwuribe etal.) descreve o uso de insulina sólida para conjugação de insulina com PEG5 laurato na presença de Trietilamina e DMSO em temperatura ambiente. A reação foi monitorada através de HPLC a cada 30 min. O conjugado foi purificado usando um HPLC preparativo. US 6.828.297 (Ekwuribe et al.) descreve métodos para fazer PEG7-Hexil-Insulina pelo uso de zinco ou insulina humana sem zinco para conjugação com oligômero ativado e purificação de PEG7-Hexil-lnsulina modificada B29. Insulina em dimetilsulfóxido e trietilamina foi reagida com oligômero ativado a 22+/- 4°C. A mistura de reação bruta é dialisada ou diafiltrada para remover solventes orgânicos e impurezas de baixo peso molecular, trocada contra tampão de acetato de amônio e liofilizada; que é ainda submetida à RP-HPLC equilibrado com tampão de trietilamina 0,5%/ácido fosfórico 0,5% (TEAP A). A coluna foi eluída com um fluxo em gradiente usando um sistema de solvente TEAP A e TEAP B (80% de acetonitrila e 20% de TEAP A). Frações contendo o conjugado foram agrupadas, o tampão de eluição e o solvente foram removidos por diálise ou diafiltração contra tampão de acetato de amônio e liofilizados para produzir um pó branco de PEG7-hexil-insulina, monoconjugado B29 (pureza>97%).

Atualmente, a técnica anterior existente ensina o uso de pó ou cristais de insulina pura como material de partida para fazer insulina conjugada em que a insulina usada é uma forma biologicamente ativa. A presente invenção facilita a conjugação de insulina em sua forma de éster inativo com um oligômero, em que o éster de insulina é desbloqueado e conjugado ao oligômero simultaneamente como uma reação "one pot". A presente invenção é mais simplificada e econômica para a produção de um conjugado de insulina em que várias etapas de purificação para obter insulina pura na forma biologicamente ativa são evitadas. O material de partida é o caldo fermentado contendo o precursor de insulina. O caldo contendo o precursor de insulina é submetido a uma etapa de combinação de purificação por troca de cátion, cristalização com fenol e ZnCÍ2, liofili-zação e transpeptidação para se obter o éster de insulina. O éster de insuli- na é submetido à conjugação com um oligômero que tem a fórmula geral OC-(CH2)n-(OCH2CH£)n-OCH3 e mais preferivelmente um oligômero ativado de fórmula molecular C14H23NO8 (CAS.n9 622405-78-1), para se obter o conjugado de insulina. O conjugado insulina-oligômero mais preferido é insulina-OC-CH2 CH2-(OCH2CH2)3-OCH3 daqui por diante referido como IN 105. O custo total de produção de insulina conjugada como um resultado desse processo é minimizado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para fazer um conjugado insulina-oligômero em uma reação "one pot" pela conjugação de um éster de insulina com um oligômero ativado em que o desbloqueio e conjugação simultâneos são feitos em tampão de borato. O oligômero ativado so-lubilizado em acetonitrila é adicionado a uma solução contendo éster de insulina e o pH da mistura é elevado para cerca de 11.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção descreve um processo de reação "one pot" para a preparação de conjugados insulina-oligômero que compreende o desbloqueio e conjugação simultâneos de um éster de insulina. O conjugado insulina-oligômero é ainda purificado e liofilizado para um pó seco. O processo para fazer um conjugado insulina-oligômero em "one pot" compreendendo: (i) transpeptidação de precursor de insulina, (ii) desbloqueio de éster de insulina e conjugação com um oligômero simultaneamente em "one pot", (iti) fornecimento de conjugado insulina-oligômero. O processo ainda compreende: (i) purificação do precursor de insulina por cromatografia e precipitação, (ii) transpeptidação para fornecer um ester de insulina, (iii) purificação do éster de insulina usando RP-HPLC, (iv) tratamento do éster de insulina com um oligômero em tampão de borato, para efetuar 0 desbloqueio e conjugação simultaneamente, (v) purificação opcional do conjugado, iyt) fornecimento de conjugado insulina-oligômero. O processo em que a preparação do conjugado insulina-oligômero compreende o processo "one pot" de desbloqueio do éster de insulina e conjugação com o oligômero. O processo de produzir um conjugado insulina-oligômero compreendendo a adição de um oligômero solubilizado em acetonitrila a uma solução contendo éster de insulina em tampão de borato e aumento do pH da mistura. O processo em que o pH é aumentado para cerca de 11. O processo em que o precursor de insulina é pró-insulina ou mi-ni-pró-insulina. O processo em que o oligômero é um alquil-PEG ou derivado desse. O processo em que o oligômero é ativado antes da conjugação. O processo em que o oligômero ativado usado para a conjugação é C14H23NO8. O processo em que 0 alquil-PEG tem a fórmula geral - OC-(CH2)n-(OCH2CH2)n-OCH3 O processo em que 0 conjugado insulina-oligômero é conjugado insulina B29 Νε-oligômero. O processo em que 0 conjugado insulina-alquil PEG é conjugado insulina B29 Νε -alquil PEG. O processo em que 0 conjugado é insulina -OC-CH2-CH2- (O-CH2CH2)3-OCH3.

Fermentação de levedura recombinante contendo o gene de insulina Inóculo de levedura recombinante contendo o gene de insulina é preparado pela adição de 100 microlitros de cultura estoque de glicerol em 50 ml de meio mínimo de glicerol (MGY) em frascos de agitação de 250 ml. O meio MGY contém base nitrogênio leveduras (YNB), glicerol, tampão fosfato e D-biotina. Frascos de semeadura são incubados a 30 graus C, 240+/-10 até que OD de 15+/-5 (densidade óptica a 600 nm) seja alcançada. O meio de fermentação contém ácido orto-fosfónco, sulfato de cáicto dinidratado, sulfato de potássio, sulfato de magnésio heptahidratado, hidróxido de potássio, glicerol, sais residuais e D-biotina. O fermentador é preparado pela adição de todos os componentes acima exceto sais residuais e D-biotina e autoclavado a 121 - 124° C por uma hora. A solução de sal residual é preparada por esterilizar por filtração uma solução de sulfato cúprico pentahidratado, iodeto de sódio, sulfato de manganês monohidratado, moli-bidato de sódio dihidratado, ácido bórico, cloreto de cobalto hexa-hidratado, cloreto de zinco, sulfato ferroso heptahidratado. A solução de biotina também é esterilizada por filtração. O fermentador é inoculado e corrido em uma temperatura de 30°C, pH 5.5, fluxo de ar 0,5 Ipm e DO de 30. Após a fase de "batelada", a alimentação de glicerol (50% p/p com água) é iniciada para produzir a biomassa. Glicerol 50% p/p é preparado e autoclavado por 30 min a 121-124 graus C e então as soluções de sais residuais & biotina são adicionadas na taxa de 12 ml/l. A taxa de alimentação de glicerol é gradualmente aumentada até 20 +/- 5 g/h. Uma vez que 300-400 g/l de biomassa é produzida, a temperatura é reduzida para 20 - 25°C, o pH é alterado para 3.5 -6.5 e é iniciada a alimentação de metanol. O metanol é esterilizado por filtração e as soluções de sal residual e biotina são adicionadas na taxa de 12 g/l. A alimentação de metanol é aumentada com base no consumo até 25 +/- 5 g/h. Durante a alimentação de metanol, alimentação de extrato de levedura e peptona é adicionada na taxa de 0,2 - 0,5 g/h. A fermentação é continuada até 12 dias.

Purificação de pró-insulina a partir do caldo 900 mg de caldo contendo o Precursor de Insulina foi ajustado para pH 4.0 com ácido acético e passado através de resinas de troca de cá-tion, pré-equilibradas com ácido acético 50 mM. A coluna foi lavada com ácido acético 50 mM e eluída com ácido acético 50 mM com NaCI 1M. Foram obtidos 855 g do produto que foram diluídos 1:3 com água e a concentração foi levada para 6mg/ml. Fenol foi adicionado (1,25 mg/l) e ZnCh 5% (v/v) de estoque 5% (p/v) foi adicionado à solução. O pH foi ajustado para 5.2 com NaOH 1N. A solução foi mantida a 4°C durante a noite. A suspensão de sóli- do foi centrifugada e o precipitado formado foi liofilizado até secar A recupe raça o na etapa foi de 90%.

Transpeptidação e esterificação da pró-insulina 400 mg de pó seco de precursor foram solubilizados em 30 ml de DMF contendo 30-70% de N,N dimetil formamida. 724 mg de éster butíli-co de treonina foram adicionados à solução. O pH da solução foi ajustado para 6.5 com ácido acético 3 N. A reação foi iniciada com a adição de 55 mg de tripsina. A reação foi monitorada a cada hora e foi paralisada com 5 ml de ácido acético 3 N após 4 h quando a conversão de precursor de insulina para éster de insulina era de 74%. O rendimento dessa etapa foi de 68% em termos de conversão de produto. O produto obtido foi precipitado como acima, em pH 6.0 e 228 mg de éster de insuiina foram recuperados. O precipitado cristalino de éster de insulina foi solubilizado em 250 mM de ácido acético. O material filtrado foi passado através de uma matriz C8 Kromasil e o éster de insulina 95% puro foi recuperado a partir do gradiente de acetonitrila. No final do RP-HPLC, 149 mg do produto foram recuperados. O éster de insulina assim obtido é usado para a preparação do conjugado de insulina como descrito aqui nos seguintes exemplos, não considerados como limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1 5 ml do conjunto de eluição de RP obtidos como no exemplo 2 são tomados e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados a mistura de reação; o pH da mistura de reação foi elevado para 11 e a mistura de reação foi agitada por 3 h a 24°C. Desbloqueio foi monitorado e quando se completou, 0,5 mg do oligômero ativado (C14H23NO8) solubilizado em 300 μΙ de acetonitrila foram adicionados à mistura de reação. A reação foi paralisada pela queda do pH da reação para 7.5. O rendimento é de 44%, com uma pureza cromatográfica de 28%. A maioria do produto permanece não convertida.

Exemplo 2 5 ml do conjunto de eluição de RP são tomados como material de partida e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados a mistura de reação; o pH da mistura de reação foi aumentado para 11 e a mistura de reação foi agitada por 3 h a 24°C. Desbloqueio foi monitorado e quando se completou, 2,5 mg do oligômero ativado (Cu^NOe) foi solubilizado em 300 pl de acetonitrila e adicionado à mistura de reação. A reação foi paralisada pela queda do pH da reação para 7.5. O rendimento é de 63% com um produto de pureza cromatográfica de 56%.

Exemplo 3 5 ml de conjunto de eluição de RP são tomados como material de partida e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados à mistura de reação; o pH da mistura de reação foi aumentado para 11 e a mistura de reação foi agitada por 3 h a 24°C. Desbloqueio foi monitorado e quando se completou, 10 mg do oligômero ativado (C14H23NO8) foi solubilizado em 300 μΙ de acetonitrila. A amostra foi analisada a partir de todos os grupos em 10 min e 1h. O rendimento é de 18% com uma pureza cromatográfica do produto de 11%. Na maior parte, o produto diconjugado foi observado.

Exemplo 4 5 ml de conjunto de eluição de RP são tomados como material de partida e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados à mistura de reação; 0 pH foi ajustado para 10.5 e mantido por 5 h. 2,5 mg do oligômero ativado (C14H23NO8) foram dissolvidos em 300 μΙ de acetonitrila e adicionados uma vez que o DESBLOQUEIO estava completo. Uma alíquota foi retirada e analisada. O rendimento foi de 58% com uma pureza cromatográfica de 51%.

Exemplo 5 5 ml de conjunto de eluição de RP são tomados como material de partida e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados à mistura de reação;o pH foi ajustado para 10.75 e mantido por 4 h. 2,5 mg do oligômero ativado {C14H23NO8) foram dissolvidos em 300 μΙ de acetonitrila e adicionados uma vez que o DESBLOQUEIO estava completo. Uma alíquota foi reti- rada e analisada. O rendimento foi de 61% com uma pureza cromatogeáfica de 53%.

Exemplo 6 (Desbloqueio e conjugação simultâneos) 5 ml de conjunto de eluição de RP são tomados como material de partida e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados à mistura de reação; o pH foi ajustado para 11 e 4 mg do oligômero ativado (C14H23NO8) dissolvido em 300 pi de acetonitriia foram adicionados. A amostra foi analisada aos 10 min, 1h, 2h e 3h após 0 desbloqueio simultâneo com a conjugação ter ocorrido. O rendimento foi de 64% com uma pureza cromatográfica de 58%.

Exemplo 7 (Desbloqueio e conjugação simultâneos) 5 ml de conjunto de eluição de RP são tomados como material de partida e 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados à mistura de reação; o pH foi ajustado para 11 e 2,5 mg do oligômero ativado (Ci4H23NOa) dissolvido em 300 μ( de acetonitriia foram adicionados. A amostra foi analisada aos 10 min, 1 h, 2h e 3h após o desbloqueio simultâneo com a conjugação ter ocorrido. O rendimento após 3h foi de 75% com uma pureza do produto de 73,4%. O desbloqueio continuou por 1 h, 2h e 3h e a conjugação foi iniciada em cada ponto de tempo e deixada continuar até que tanto o desbloqueio como a conjugação estivessem completos para cada caso. 5 ml de cada conjunto de eluição de RP foram colocados em cada um de 4 tubos. 1,2 ml de tampão de borato 1M são adicionados à mistura de reação; 0 pH foi ajustado para 11. No ipool tubo, 2,5 mg de oligômero ativado (C14H23NO8) foram adicionados a Oh. O desbloqueio foi deixado continuar por 1 h no 2pool tubo e a mesma quantidade de oligômero ativado (C14H23NO8) foi adicionada à mistura de reação. O desbloqueio foi deixado continuar por 2h no 3pool tubo e 2,5 mg de oligômero ativado (C14H23NO8) foram adicionados após 2h. No 4pool tubo o desbloqueio continuou por 3h antes da mesma quantidade de oligômero ativado (C-uH^NOe) ser adicionada. A conjugação foi deixada continuar para cada tubo até parecer estar completa como confirmado por cromatografia analítica. O rendimento da e- tapa assim como o percentual de pureza do conjugado de insulina foi monitorado por cromatogramas analíticos.

Exemplo 8 150 ml de conjunto de eluição de RPHPLC em 36 ml de tampão de borato são tomados em pH 8.7. O pH foi elevado para 11 pela adição de 10 ml de NaOH 10 N e a mistura de reação foi mantida a 25° C por 3h. 135 mg do oligômero ativado (C14H23NO8) solubilizados em 9 ml de acetonitrila foram adicionados à mistura de reação para iniciar a reação de conjugação. Após 1 h, a reação de conjugação foi paralisada pela diminuição do pH da mistura de reação para 7.5 pela adição de ácido acético glacial. O rendimento encontrado do desbloqueio e conjugação foi de 61% nessa reação e a pureza do produto foi de 62%.

Exemplo 9 975 ml de conjunto de eluição de RP com concentração de 8,4 mg/ml são tomados e 234 ml de tampão de borato 1 M são adicionados em pH 8.2. O pH é ajustado para 11 com NaOH 10 N. 975 mg do oligômero ativado (C14H23NO8) dissolvidos em 58,5 ml de acetonitrila foram adicionados à mistura de reação e os processos de desbloqueio assim como de conjugação foram iniciados juntos.

Alíquotas foram retiradas com 2 e 3 h, analisadas em HPLC para monitorar o perfil da reação. A conjugação foi paralisada após 3h pela redução do pH da mistura de reação para 7.5 pela adição de ácido acético glacial. O rendimento encontrado foi de 68% com uma pureza do produto de 69%.

Exemplo 10 (Recuperação do produto) O produto conjugado final é diluído com ácido acético 250 mM para levar a concentração para 2,5 mg/ml. O material é aplicado em uma coluna Kromasil CS RP HPLC e eluído com gradiente de acetonitrila. O conjunto eluído tem o IN 105 com uma pureza de 96,7% e com a recuperação na etapa de 72%. O IN 105 purificado, eluído da coluna de RPHPLC é cristalizado com fenol e ZnCl2 em pH 5.2 em condição fria. O pélete cristalino final foi coletado por centrifugação. O pélete cristalino coletado foi liofilizado e coletado como cristais secos purificados de IN 105.

REIVINDICAÇÕES

Claims (11)

1. Processo para fazer um conjugado de oligômero de insulina em "one pot", caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transpeptidação e esterificação de um precursor de insulina para fornecer um éster de insulina; (ii) desbloqueio do éster de insulina e conjugação com um oligômero simultaneamente em "one pot" através de adição simultânea de um oligômero solubilizado em acetonitrila a uma solução contendo o éster de insulina em tampão borato e aumento do pH da solução; e (iii) obtenção do conjugado de oligômero de insulina.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende, (i) purificação do precursor de insulina por cromatografia e precipitação, (ii) purificação do éster de insulina usando RP-HPLC, (iii) purificação opcional do conjugado.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é aumentado para cerca de 11.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o precursor o precursor de insulina é proinsulina ou mini-proinsulina.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligômero é um alquil-PEG ou derivado desse.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligômero é ativado antes da conjugação.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o oligômero ativado usado para conjugação é C14H23NO8.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o alquil-PEG tem a fórmula geral -OC-(CH2)n-(OCH2CH2)n-OCH3.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligômero de insulina é conjugado de oligômero de insulina B29 Νε.

10. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjugado de insulina alquil-PEG é conjugado de alquil PEG de insulina B29 Νε.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado de insulina é o conjugado insulina B29 Νε -OC- CH2-CH2-(OCH2CH2)3-OCH3.