BRPI0520672B1

BRPI0520672B1 - composition formulated for topical administration to the skin and method to improve skin conditions

Info

Publication number: BRPI0520672B1
Application number: BRPI0520672-3A
Authority: BR
Inventors: Dahl Kyun Oh
Original assignee: Regeron, Inc.
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2020-11-10
Also published as: WO2007043721A1; JP5649278B2; CA2625806C; CA2625806A1; KR20090042871A; JP2009511574A; BRPI0520672A2; KR100962566B1

Abstract

Trata-se de uma composição destinada a melhorar as condições da pele para aplicação tópica na pele, compreendendo hormônio de crescimento humano como ingrediente ativo, e um método para melhorar as condições da pele usando tais hormônios. A composição exposta exibe vários efeitos de condicionamento da pele, tais como o tratamento da acne, a melhoria no tratamento de rugas, a remoção de manchas escuras, a melhoria da elasticidade da pele, a estimulação do crescimento de cabelo, a prevenção do envelhecimento da pele, hidratação da pele e a proliferação de células epidérmicas estaminais da pele.It is a composition designed to improve skin conditions for topical application to the skin, comprising human growth hormone as an active ingredient, and a method to improve skin conditions using such hormones. The exposed composition exhibits various skin conditioning effects, such as treating acne, improving wrinkle treatment, removing dark spots, improving skin elasticity, stimulating hair growth, preventing aging of the skin skin, skin hydration and the proliferation of skin epidermal stem cells.

Description

Background of the invention Field of the invention

[001] A presente invenção se refere a composições de melhoramento de condições da pele para aplicação tópica à pele que compreende hormônio de crescimento humano como ingrediente ativo e um método para melhorar as condições de pele de um ser humano.[001] The present invention relates to skin condition improvement compositions for topical application to the skin comprising human growth hormone as an active ingredient and a method for improving the skin conditions of a human.

Description of the state of the art

[002] É de conhecimento geral que as macromoléculas tais como hormônio de crescimento humano (peso molecular de cerca de 22 kD), não penetram o estrato córneo da pele. Um peso molecular que pode ser liberado eficientemente através da epiderme é geralmente reconhecido por ser não mais do que aproximadamente 500 daltons ou, no máximo, 2 kD, mesmo com a ajuda dos colaboradores de penetração na pele. De tal maneira, aplicando macromoléculas tais como a hormônio de crescimento humano de forma tópica à pele intacta e aguardar eficácia médica ou dos cosméticos pela ação das macromoléculas foram considerados mal sucedidos.[002] It is well known that macromolecules such as human growth hormone (molecular weight of about 22 kD), do not penetrate the horny layer of the skin. A molecular weight that can be released efficiently through the epidermis is generally recognized to be no more than approximately 500 daltons or, at most, 2 kD, even with the help of skin-penetrating collaborators. Thus, applying macromolecules such as human growth hormone topically to intact skin and awaiting medical or cosmetic efficacy by the action of macromolecules were considered unsuccessful.

[003] Algumas tentativas foram feitas para a liberação de proteínas à camada cutânea da pele pela aplicação tópica dos lipossomas encapsulando as proteínas. Relatou-se que as proteínas encapsuladas em lipossomas são liberadas através da derme ou dos folículos pilosos. Para a liberação através dos folículos pilosos, um sistema de liberação sob a forma dos lipossomas ou um composto de lipídio compreendendo lipídios tais como ácidos graxos foram relatados como favoráveis. Adicionalmente, embora a eficiência tenha se provado muito menor, uma solução aquosa contendo um solvente orgânico tal como o álcool etílico ou uma solução aquosa contendo um polímero tal como o glicol de polietileno, foram igualmente testadas como um meio facilitador para a liberação através dos folículos pilosos. No que se refere à eficiência da liberação de proteínas através da pele usando as proteínas contendo lipossomas, um princípio geral ainda não foi estabelecido, pois casos de liberação de proteínas contendo lipossomas são escassos e mesmo naqueles casos raros, a eficiência da liberação da proteína variou substancialmente dependendo das escolhas empíricas das proteínas alvo e da natureza dos lipossomas usados. Um ponto a ser levado em consideração é que, embora a idéia de liberar proteínas através dos folículos pilosos esteja ganhando mais aceitação, mesmo quando a proteína é liberada sob a forma de lipossoma encapsulado, lipossomas podem não penetrar através da parcela infundibular dos folículos pilosos intactos, ao invés disso eles podem se submeter a diferentes transformações ou transições morfológicas devido a, primeiro, as características dos fosfolipídios que conferem o pH interno e externo e a carga de valência dos lipossomas, segundo, aquelas de proteínas unidas a ou encapsuladas pelos lipossomas, e terceiro, aqueles dos ingredientes de constituição dos tecidos circunvizinhos que compõem os folículos pilosos. Assim no conjunto, estes três fatores e suas interações complexas parecem determinar as eficiências da liberação folicular dos lipossomas que contêm as proteínas em questão por meio de formulações empíricas ao invés de um princípio de base geral neste momento. O que é particularmente notável no que diz respeito à presente invenção é a existência de uma constatação que indica que os receptores de hormônio de crescimento humano estão posicionados nas camadas de células vivas da epiderme e por todos os órgãos anexos e os tecidos que constituem e cercam os folículos pilosos.[003] Some attempts were made to release proteins to the skin's skin layer by topical application of liposomes encapsulating the proteins. Liposome-encapsulated proteins have been reported to be released through the dermis or hair follicles. For delivery through hair follicles, a delivery system in the form of liposomes or a lipid compound comprising lipids such as fatty acids has been reported to be favorable. In addition, although the efficiency proved to be much lower, an aqueous solution containing an organic solvent such as ethyl alcohol or an aqueous solution containing a polymer such as polyethylene glycol, were also tested as a facilitating means for release through the follicles. hairy. With regard to the efficiency of protein release through the skin using liposome-containing proteins, a general principle has not yet been established, since cases of protein release containing liposomes are scarce and even in those rare cases, the efficiency of protein release has varied substantially depending on the empirical choices of the target proteins and the nature of the liposomes used. One point to be taken into account is that, although the idea of releasing proteins through hair follicles is gaining more acceptance, even when the protein is released in the form of an encapsulated liposome, liposomes may not penetrate through the infundibular portion of the intact hair follicles. , instead they can undergo different transformations or morphological transitions due to, first, the characteristics of the phospholipids that confer the internal and external pH and the valence load of the liposomes, second, those of proteins joined to or encapsulated by the liposomes, and third, those of the constituent ingredients of the surrounding tissues that make up the hair follicles. So, taken together, these three factors and their complex interactions seem to determine the efficiencies of follicular release of the liposomes containing the proteins in question through empirical formulations rather than a general basic principle at this time. What is particularly noteworthy with regard to the present invention is the existence of a finding that indicates that human growth hormone receptors are positioned in the layers of living cells in the epidermis and by all the attached organs and tissues that constitute and surround the hair follicles.

[004] O hormônio de crescimento humano está secretado do lóbulo anterior da glândula pituitária e circula com sangue enquanto influencia cada órgão do corpo humano. No estágio do crescimento de um ser humano, é particularmente envolvida no crescimento do esqueleto, um aumento nos músculos, a decomposição da gordura, o crescimento dos órgãos internos, o crescimento sexual e semelhanteS. Adicionalmente, sugeriu-se que quando o hormônio de crescimento humano fosse administrado por injeção em adultos em uma escala fisiológica de concentração de sangue, mostraria vários efeitos, tais como o fortalecimento do sistema circulatório do coração, a melhoria de habilidades de exercício, o fortalecimento dos músculos, a redução na adiposidade abdominal, o aumento na libido, a melhoria no tratamento da arteriosclerose, e a melhoria da depressão geriátrica. É sabido que os efeitos do hormônio de crescimento humano no corpo humano não são causados pelo hormônio de crescimento humano propriamente dito, mas sim causados pela ação do fator de crescimento insulínico-1 (IGF-1), a expressão do qual é estimulada pelo hormônio de crescimento humano e que é produzido principalmente no fígado e secretado no sangue. Isto se dá porque a meia vida do hormônio de crescimento humano no sangue é de aproximadamente 15 minutos, considerando que a meia vida do IGF-1 é de aproximadamente 20 horas, indica que o IGF-1 pode durar muito mais que o hormônio de crescimento humano. Concretamente falando, o hormônio de crescimento humano secretado pela glândula pituitária se liga à proteína ligada ao hormônio de crescimento humano presente no sangue, migrando com circulação de sangue, e encontra um receptor de hormônio de crescimento humano presente em cada tecido do ser humano. Neste momento, o hormônio de crescimento humano é liberado da proteína ligada ao hormônio do crescimento humano enquanto se liga ao receptor de hormônio de crescimento humano, e a síntese e a secreção do IGF-1 são estimulados em conseqüência da sinalização causada pela ligação. O IGF-1 secretado no sangue liga então a uma proteína IGF-1, e circula com a circulação sanguínea enquanto se liga a um receptor IGF-1 presente em cada tecido do corpo humano, assim exibindo os vários efeitos fisiológicos causados pela secreção do hormônio de crescimento humano. Dessa maneira, se o efeito da injeção de hormônio de crescimento humano na pele for realmente evidente, será um efeito causado pela ação do IGF-1, e assim dependerá necessariamente da presença ou da ausência do receptor IGF-1 na superfície das células cutâneas que podem ser trazidas no contacto direto com o sangue. Mesmo que a pele seja considerada como influenciada diretamente pelo hormônio de crescimento humano, mas não pelo IGF-1, a influência será necessariamente transferida pelo receptor do hormônio de crescimento humano presente nos locais que estão em contacto com o sangue. Conseqüentemente, considera-se que esperar algum efeito na pele ao aplicar o hormônio de crescimento humano (tendo o tamanho molecular que não pode passar através da pele) junto com cosméticos à superfície normal da pele que não é trazida no contacto direto com o sangue não é senso comum. A presente invenção é um primeiro relatório que, através de um método de aplicação de hormônio de crescimento humano sob a forma de uma preparação cosmética à superfície normal da pele que não está no contato direto com o sangue, mas não um método de transferir o efeito do hormônio de crescimento humano através do sangue, o hormônio de crescimento humano pode mostrar efeitos cosméticos e medicinais na pele, tal como a melhoria da acne, rugas, pele atópica, pele danificada pela luz UV, manchas, sardas, pele seca e pele oleosa, a redução dos folículos capilares, e a estimulação do crescimento de pêlo.[004] Human growth hormone is secreted from the anterior lobe of the pituitary gland and circulates with blood while influencing every organ in the human body. In the growth stage of a human being, it is particularly involved in the growth of the skeleton, an increase in muscles, the decomposition of fat, the growth of internal organs, sexual growth and the like. Additionally, it was suggested that when human growth hormone was administered by injection to adults on a physiological blood concentration scale, it would show various effects, such as strengthening the circulatory system of the heart, improving exercise skills, strengthening of muscles, a reduction in abdominal adiposity, an increase in libido, an improvement in the treatment of arteriosclerosis, and an improvement in geriatric depression. It is known that the effects of human growth hormone on the human body are not caused by the human growth hormone itself, but are caused by the action of insulin growth factor-1 (IGF-1), the expression of which is stimulated by the hormone of human growth and which is produced mainly in the liver and secreted into the blood. This is because the half-life of human growth hormone in the blood is approximately 15 minutes, whereas the half-life of IGF-1 is approximately 20 hours, indicates that IGF-1 may last much longer than growth hormone. human. Concretely speaking, the human growth hormone secreted by the pituitary gland binds to the protein bound to the human growth hormone present in the blood, migrating with blood circulation, and finds a human growth hormone receptor present in every human tissue. At this time, human growth hormone is released from the protein bound to human growth hormone while it binds to the human growth hormone receptor, and the synthesis and secretion of IGF-1 is stimulated as a result of the signaling caused by binding. The IGF-1 secreted in the blood then binds to an IGF-1 protein, and circulates with the bloodstream while it binds to an IGF-1 receptor present in every tissue in the human body, thus exhibiting the various physiological effects caused by the secretion of the hormone of human growth. Thus, if the effect of the injection of human growth hormone into the skin is really evident, it will be an effect caused by the action of IGF-1, and thus it will necessarily depend on the presence or absence of the IGF-1 receptor on the surface of the skin cells that can be brought in direct contact with blood. Even if the skin is considered to be directly influenced by human growth hormone, but not by IGF-1, the influence will necessarily be transferred by the human growth hormone receptor present in the places that are in contact with the blood. Consequently, it is considered that expecting some effect on the skin when applying human growth hormone (having the molecular size that cannot pass through the skin) along with cosmetics to the normal skin surface that is not brought into direct contact with blood does not it's common sense. The present invention is a first report that, through a method of applying human growth hormone in the form of a cosmetic preparation to the normal surface of the skin that is not in direct contact with blood, but not a method of transferring the effect of human growth hormone through the blood, human growth hormone can show cosmetic and medicinal effects on the skin, such as improving acne, wrinkles, atopic skin, skin damaged by UV light, blemishes, freckles, dry skin and oily skin , the reduction of hair follicles, and the stimulation of hair growth.

[005] O tecido da pele consiste de epiderme, derme e hipoderme. A epiderme determina as propriedades da pele, e é freqüentemente suscetível a se danificar diretamente pelo ambiente externo, e assim o reparo e a regeneração da epiderme são altamente importantes. A epiderme consiste em uma camada de células epidérmicas. As células epidérmicas da pele também são chamadas de “queratinocitos”, porque as células epidérmicas da pele sintetizam queratina de proteína filamentos intermediários que reforçam a epiderme, durante suas diferenciações. Estas células são acobertadas com diferenciação ao migrarem para a epiderme, e se tomam lisas enquanto os órgãos dentro das células desaparecerem gradualmente e elas tornam-se células mortas. Uma camada de célula situada na parcela mais interior da epiderme é contígua à lâmina basal e chamada de “estrato basal”, e as células que formam a camada são chamadas “células basais”, entre as quais as células estaminais de epidérme estão presentes. As células do estrato basal diferenciam-se na epiderme enquanto formam sequencialmente o estrato espinhoso, o estrato granuloso, o estrato lúcido e o estrato córneo, os estratos sendo divididos em uma camada viva de célula na posição mais baixa em relação ao estrato granuloso, e uma camada de células mortas na posição superior. Tecidos achatados fora do estrato corneom são também chamados “escames” onde as queratinas são preenchidas densamente. As células situadas na parte externa do estrato granuloso ao estrato corneo são reforçadas com uma camada de proteína cuja membrana de plasma é fina e resistente. Quando as células epidérmicas são proliferadas das células estaminais de epiderme e forem diferenciadas no estrato córneo, elas são reforçadas internamente pela ligação das queratinas e igualmente ligadas por queratinas com os desmossomos firmemente ligados com outras células na mesma camada para manter a estrutura de camada inteira. As células epidérmicas são diferenciadas na epiderme exterior enquanto produzem e secretam lipídio para formar tecido de dupla camada em uma membrana de plasma ligada à proteína, assim impedindo o contato da superfície da pele do ambiente externo, como o envoltório de saran. Considerando que a epiderme humana é substituída no intervalo de duas semanas, a habilidade da proliferação das células estaminais da pele que formam a epiderme pode ser considerada muito grande. Foi relatado recentemente que as células estaminais multipotentes da pele estão situadas na região da protuberância, que se encontra logo abaixo da glândula sebácea dos folículos pilosos. Estas células estaminais da protuberância servem de base para fazer células estaminais de epiderme, células estaminais de cabelo matrizes, e células estaminais das glândulas sebáceas.[005] The skin tissue consists of epidermis, dermis and hypodermis. The epidermis determines the properties of the skin, and is often susceptible to damage directly by the external environment, so repair and regeneration of the epidermis is highly important. The epidermis consists of a layer of epidermal cells. Epidermal skin cells are also called "keratinocytes", because skin epidermal cells synthesize protein keratin intermediate filaments that reinforce the epidermis, during their differentiation. These cells are covered with differentiation when they migrate to the epidermis, and become smooth while the organs within the cells gradually disappear and they become dead cells. A cell layer located in the innermost portion of the epidermis is contiguous to the basal lamina and is called the "basal stratum", and the cells that form the layer are called "basal cells", among which epidermal stem cells are present. Basal stratum cells differ in the epidermis while sequentially forming the spinous stratum, the granular stratum, the lucid stratum and the stratum corneum, the strata being divided into a living cell layer in the lowest position in relation to the granular stratum, and a layer of dead cells in the upper position. Flattened tissues outside the stratum corneom are also called "scales" where keratins are densely filled. The cells located on the outside of the granular stratum to the stratum corneum are reinforced with a layer of protein whose plasma membrane is thin and resistant. When epidermal cells proliferate from epidermal stem cells and are differentiated in the stratum corneum, they are reinforced internally by binding the keratins and equally linked by keratins with the desmosomes firmly linked with other cells in the same layer to maintain the entire layer structure. Epidermal cells are differentiated in the outer epidermis while producing and secreting lipid to form double-layered tissue in a plasma membrane bound to the protein, thus preventing contact of the skin's surface from the external environment, such as the saran wrap. Considering that the human epidermis is replaced within two weeks, the ability of the skin stem cells that form the epidermis to proliferate can be considered very great. It has recently been reported that the skin's multipotent stem cells are located in the lump region, which is just below the sebaceous gland of the hair follicles. These lump stem cells serve as the basis for making epidermal stem cells, hair stem cells, and sebaceous gland stem cells.

[006] As células estaminais da protuberância são situadas somente na região da protuberância e revelam uma combinação especial de proteína ao manter sua propriedade como células estaminais. As células estaminais de epiderme mantêm a epiderme quando se proliferam e se diferenciam. Quando um pêlo cai, as células estaminais de cabelo matrizes se proliferarão e se diferenciarão para fazer um cabelo novo. Entretanto, as células estaminais de epiderme, as células estaminais de cabelo matrizes ou as células estaminais das glândulas sebáceas têm limitações em sua habilidade de proliferação ou na habilidade de manter a habilidade de células estaminais, e assim, por exemplo, a maioria das células estaminais de epiderme diferenciar- se-ão depois que se proliferarem 3-6 vezes. Por outro lado, embora as células estaminais da protuberância se proliferem mais lentamente do que outras três células estaminais, aparentemente as células estaminais da protuberância podem se proliferar indefinidamente durante a vida de seres humanos ao fazerem as células estaminais de epiderme, as células estaminais de cabelo matrizes e as células estaminais das glândulas sebáceas e, ao mesmo tempo, a manutenção de seu caráter de célula estaminais. O fato de que a expressão e a ação do hormônio de crescimento humano ocorrem na posição das células estaminais da protuberância tem sido divulgado pela primeira vez com a presente invenção, e esta novidade é bastante significativa, considerando que o hormônio de crescimento humano apresenta os efeitos de melhorar várias condições de pele pela presente invenção.[006] The stem cells of the protuberance are located only in the region of the protuberance and reveal a special combination of protein while maintaining its property as stem cells. Epidermal stem cells maintain the epidermis when they proliferate and differentiate. When a hair falls out, the stem hair stem cells will proliferate and differentiate to make new hair. However, epidermal stem cells, stem hair stem cells or sebaceous gland stem cells have limitations in their ability to proliferate or in their ability to maintain the ability of stem cells, and so, for example, most stem cells epidermis will differentiate after they proliferate 3-6 times. On the other hand, although lump stem cells proliferate more slowly than three other stem cells, it appears that lump stem cells can proliferate indefinitely during the life of humans by making epidermal stem cells, hair stem cells. matrices and stem cells of the sebaceous glands and, at the same time, the maintenance of their stem cell character. The fact that the expression and action of human growth hormone occurs at the position of the stem cells of the lump has been first disclosed with the present invention, and this novelty is quite significant, considering that human growth hormone has the effects to improve various skin conditions by the present invention.

Detailed description of the present invention

[007] Os presentes inventores promoveram intensas pesquisas para desenvolver uma substância capaz de melhorar as condições da pele, e em conseqüência, notaram que o tratamento tópico do hormônio de crescimento humano à pele pode melhorar significativamente as condições de pele, completando a presente invenção.[007] The present inventors have carried out intensive research to develop a substance capable of improving skin conditions, and as a result, have noted that the topical treatment of human growth hormone to the skin can significantly improve skin conditions, completing the present invention.

[008] Dessa maneira, é objetivo da presente invenção fornecer uma composição de melhoria para o tratamento tópico à pele.[008] Thus, it is the objective of the present invention to provide an improvement composition for topical treatment of the skin.

[009] É um outro objetivo da presente invenção fornecer um método para melhorar as condições de pele.[009] It is another objective of the present invention to provide a method for improving skin conditions.

[0010] Outros objetivos e vantagens da presente invenção tornar- se-ão aparentes na descrição detalhada a seguir em conjunto com as reivindicações anexas.[0010] Other objectives and advantages of the present invention will become apparent in the detailed description below in conjunction with the appended claims.

[0011] Em um aspecto desta invenção, é fornecida uma composição formulada para a administração tópica à pele para melhorar as condições da pele, que compreende o hormônio de crescimento humano como um ingrediente ativo.[0011] In one aspect of this invention, a composition is formulated for topical administration to the skin to improve skin conditions, which comprises human growth hormone as an active ingredient.

[0012] Em um outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para melhorar as condições da pele de um ser humano, que compreende a administração tópica à pele do ser humano de uma composição que compreende o hormônio de crescimento humano como um ingrediente ativo.[0012] In another aspect of this invention, a method for improving the skin conditions of a human being is provided, which comprises topically administering to the human skin a composition comprising the human growth hormone as an active ingredient.

[0013] Os presentes inventores conduziram estudos e envidaram esforços para encontrar um uso novo do hormônio de crescimento humano e, em conseqüência, notaram que a aplicação tópica do hormônio de crescimento humano à pele pode melhorar significativamente as condições da pele. A terapia atual com o hormônio de crescimento humano é executada principalmente para tratar o nanismo e a deficiência de hormônio de crescimento humano usando um método de injeção. Na arte anterior, por causa do elevado peso molecular do hormônio de crescimento humano e um prejuízo para o caminho de ação de hormônio de crescimento humano, não se observou que o tratamento tópico de hormônio de crescimento humano à pele normal torna possível esperar efeito. A presente invenção afasta-se significativamente deste senso comum ou conhecimento convencional na arte e é caracterizada em que o efeito do tratamento tópico de hormônio de crescimento humano à pele normal foi detectado pela primeira vez. A presente invenção é a primeira invenção de aplicação de hormônio de crescimento humano à pele através de duas rotas, isto é, folículos pilosos e a epiderme.[0013] The present inventors conducted studies and made efforts to find a new use of human growth hormone and, as a consequence, noticed that the topical application of human growth hormone to the skin can significantly improve skin conditions. Current therapy with human growth hormone is performed primarily to treat stunting and human growth hormone deficiency using an injection method. In the prior art, because of the high molecular weight of human growth hormone and a detriment to the human growth hormone pathway of action, it has not been observed that the topical treatment of human growth hormone to normal skin makes it possible to expect an effect. The present invention deviates significantly from this common sense or conventional knowledge in the art and is characterized in that the effect of topical treatment of human growth hormone on normal skin was first detected. The present invention is the first invention of applying human growth hormone to the skin via two routes, i.e., hair follicles and the epidermis.

[0014] A presente invenção é a primeira exibição que, por um método de aplicar o hormônio de crescimento humano à superfície da pele normal oposta a uma região que esteja em contacto com o sangue, mas não por um método de transferir o efeito do hormônio de crescimento humano pelo sangue, o hormônio de crescimento humano pode mostrar efeitos cosméticos e medicinais na pele, tal como a melhoria da acne, rugas, da pele atópica, pele danificada pela luz UV, manchas escuras, sardas, da pele seca e da pele oleosa, redução dos fólicos pilosos, e estimulação do crescimento de cabelo.[0014] The present invention is the first exhibition that, by a method of applying human growth hormone to the surface of normal skin opposite a region that is in contact with the blood, but not by a method of transferring the effect of the hormone of human growth through blood, the human growth hormone can show cosmetic and medicinal effects on the skin, such as the improvement of acne, wrinkles, atopic skin, skin damaged by UV light, dark spots, freckles, dry skin and skin oily, reduction of hair follicles, and stimulation of hair growth.

[0015] Hormônio de crescimento humano (hGH) que é usado como ingrediente ativo na presente invenção pode ser qualquer polipeptídio que mostre atividade de hormônio de crescimento humano. Por exemplo, qualquer um selecionado do grupo consistindo em hGH maduro, Met-hGH, hGH variantes, hGH modificadas, fragmentos do hGH e os análogos ao hGH podem ser usados. É preferido o hGH maduro ou Met-hGH. O hGH maduro se refere ao hormônio de crescimento humano que tem a seqüência de amino ácido do principal hormônio de crescimento humano presente no sangue humano, o Met-hGH se refere ao hormônio de crescimento humano que tem o metionino adicionado ao N-terminus do hGH maduro, as hGH variantes referem-se aos hormônios de crescimento humano que têm as seqüências de amino ácido de hormônios de crescimento humano diferentes do principal hormônio de crescimento humano presente no corpo humano, o hGH modificado se refere ao hormônio de crescimento humano modificado pela adesão de um aditivo tal como a pegilação ou a glicação a pelo menos um resíduo do amino ácido de hormônio de crescimento humano, os fragmentos do hGH indicam hormônios de crescimento humano obtidos pela supressão de uma parcela das seqüências de amino ácido de hormônios de crescimento humano por um método da engenharia genética ou por método bioquímico, e o hGH análogo se refere a um hormônio de crescimento humano obtido pela modificação da seqüência de amino ácido do hormônio de crescimento humano em outra seqüência de amino ácido possuindo propriedades similares pelo método de engenharia genética. Conforme utilizada neste processo, a frase “possuindo atividade de hormônio de crescimento humano” pode ser especificada de acordo com um dos seguintes métodos. Em um método, pode-se especificar se o hormônio de crescimento humano causa a sinalização ligando a uma proteína de hormônio do crescimento humano ou a um receptor de hormônio de crescimento humano, e em um outro método, pode-se especificar se os efeitos biológicos causados pela ação do hormônio de crescimento humano estão mostrados.[0015] Human growth hormone (hGH) that is used as an active ingredient in the present invention can be any polypeptide that shows human growth hormone activity. For example, any one selected from the group consisting of mature hGH, Met-hGH, hGH variants, modified hGH, hGH fragments and hGH analogs can be used. Mature hGH or Met-hGH is preferred. Mature hGH refers to the human growth hormone that has the amino acid sequence of the main human growth hormone present in human blood, Met-hGH refers to the human growth hormone that has methionine added to the hGH N-terminus. mature, the hGH variants refer to human growth hormones that have human growth hormone amino acid sequences different from the main human growth hormone present in the human body, modified hGH refers to adhesion-modified human growth hormone of an additive such as pegylation or glycation to at least one human growth hormone amino acid residue, hGH fragments indicate human growth hormones obtained by deleting a portion of the human growth hormone amino acid sequences by a genetic engineering method or biochemical method, and the hGH analogue refers to a human growth hormone obtained by the modification of the human growth hormone amino acid sequence into another amino acid sequence having similar properties by the genetic engineering method. As used in this process, the phrase "having human growth hormone activity" can be specified according to one of the following methods. In one method, you can specify whether human growth hormone causes signaling by binding to a human growth hormone protein or a human growth hormone receptor, and in another method, you can specify whether the biological effects caused by the action of human growth hormone are shown.

[0016] Na presente invenção, o hormônio de crescimento humano pode ser aplicado à pele como uma solução aquosa ou com um veículo. Uma das características surpreendentes da presente invenção é que, como ilustrado no exemplo XII e na FIG. 10b, mesmo quando uma solução aquosa de hormônio de crescimento humano é aplicada diretamente à pele, o efeito desejado de melhorar as condições da pele pode ser de alguma forma conseguido. Mesmo quando uma solução aquosa de hormônio de crescimento humano é aplicada de maneira tópica à pele, o hormônio de crescimento humano alcançará a posição das células estaminais da protuberância nos folículos de pêlo e pode fornecer o efeito de melhorar as condições da pele.[0016] In the present invention, human growth hormone can be applied to the skin as an aqueous solution or with a vehicle. One of the surprising features of the present invention is that, as illustrated in example XII and in FIG. 10b, even when an aqueous solution of human growth hormone is applied directly to the skin, the desired effect of improving skin conditions can be somehow achieved. Even when an aqueous solution of human growth hormone is applied topically to the skin, the human growth hormone will reach the position of the stem cells of the bulge in the hair follicles and can provide the effect of improving skin conditions.

[0017] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, uma composição de acordo com a presente invenção tem uma composição de fosfolipídios ou de lipossoma, e preferencialmente uma composição de lipossoma. É preferível que o hormônio de crescimento humano como um ingrediente ativo seja encapsulado no lipossoma e aplicado à pele. De acordo com uma realização mais preferida da presente invenção, a presente composição tem uma composição de nanolipossoma. Como aqui usado, o termo “nanolipossoma” se refere a um lipossoma que tem a forma de lipossoma convencional e um diâmetro médio de partícula de 20-1000 nm. De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o diâmetro médio da partícula do nanolipossoma é de 50-500 nm, mais preferível de 50-350 nm, e ainda mais preferível de 50-250 nanômetro.[0017] According to a preferred embodiment of the present invention, a composition according to the present invention has a phospholipid or liposome composition, and preferably a liposome composition. It is preferable that human growth hormone as an active ingredient is encapsulated in the liposome and applied to the skin. According to a more preferred embodiment of the present invention, the present composition has a nanoliposome composition. As used herein, the term "nanoliposome" refers to a liposome that has the form of a conventional liposome and an average particle diameter of 20-1000 nm. According to a preferred embodiment of the present invention, the average particle diameter of the nanoliposome is 50-500 nm, more preferably 50-350 nm, and even more preferable 50-250 nanometer.

[0018] O lipossoma é definido como uma vesícula esférica de fosfolipídio de partículas coloidais que são associadas entre si, e os lipossomas compostos de moléculas anfifílicas cada uma tendo uma cabeça solúvel em água (grupo hidrófilo) e uma cauda não solúvel em água (grupo hidrofóbico) apresentando uma estrutura alinhada pela ligação espontânea causada pela interação entre si, e são classificadas, de acordo com o tamanho e a lameralidade, em SUV (vesícula unilamelar pequena), LUV (vesícula unilamelar grande) e MLV (vesícula multilamelar). Os lipossomas apresentando varias lameralidades tal como descrito acima possuem uma estrutura de dupla membrana similar à membrana celular.[0018] The liposome is defined as a spherical vesicle of phospholipid of colloidal particles that are associated with each other, and the liposomes composed of amphiphilic molecules each having a head soluble in water (hydrophilic group) and a tail not soluble in water (group hydrophobic) presenting a structure aligned by the spontaneous connection caused by the interaction between them, and are classified, according to size and lamerality, in SUV (small unilamellar vesicle), LUV (large unilamellar vesicle) and MLV (multilamellar vesicle). Liposomes showing various lameralities as described above have a double membrane structure similar to the cell membrane.

[0019] O (nano)lipossoma na presente invenção pode ser preparado usando fosfolipídio, poliol, surfactante, ácido graxo, sal e/ou água.[0019] The (nano) liposome in the present invention can be prepared using phospholipid, polyol, surfactant, fatty acid, salt and / or water.

[0020] O fosfolipídio que é um componente usado na preparação do presente (nano)lipossoma é usado como lípido bifilico, e os exemplos incluem fosfolipídios naturais (por exemplo, lecitina da gema de ovo, lecitina de soja, e esfingomielina) e fosfolipídios sintéticos (por exemplo, dipalmitoilfosfatidilcolina ou lecitina hidrogenada), a lecitina sendo a preferida. Mais preferível, a lecitina é uma lecitina não saturada ou saturada naturalmente extraída da soja ou da gema do de ovo.[0020] The phospholipid which is a component used in the preparation of this (nano) liposome is used as a biphilic lipid, and examples include natural phospholipids (eg, egg yolk lecithin, soy lecithin, and sphingomyelin) and synthetic phospholipids (for example, dipalmitoylphosphatidylcholine or hydrogenated lecithin), lecithin being preferred. Most preferably, lecithin is an unsaturated or saturated lecithin naturally extracted from soy or egg yolk.

[0021] Os Poliois que podem ser usados na preparação do presente (nano)lipossoma não são especificamente limitados e, preferencialmente, incluem o glicol de propileno, glicol de dipropileno, glicol de 1,3-butileno, glicerina, metilpropanediol, glicol de isopreno, glicol de pentileno, erithritol, o xilitol e o sorbitol.[0021] Polyols that can be used in the preparation of the present (nano) liposome are not specifically limited and preferably include propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, methylpropanediol, isoprene glycol , pentylene glycol, erithritol, xylitol and sorbitol.

[0022] O surfactante que pode ser usado na preparação do presente (nano)lipossoma pode ser qualquer surfactante conhecido na arte, e exemplos incluem surfactantes aniónicos (por exemplo, glutamato de acílico de alquila, fosfato de alquila, lactato de alquila, fosfato dialquila e fosfato de tri alquila), surfactantes catiônicos, surfactantes anfotéricos e surfactantes nonionicos (por exemplo, alquil éter alcoxilatado, éster alcoxilatado de éster de alquila, alquilpoliglicosídeo, polyglycerylester e do açúcar).[0022] The surfactant that can be used in the preparation of the present (nano) liposome can be any surfactant known in the art, and examples include anionic surfactants (e.g., alkyl acyl glutamate, alkyl phosphate, alkyl lactate, dialkyl phosphate and tri-alkyl phosphate), cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants (eg, alkoxylated alkyl ether, alkoxylated alkyl ester, alkyl polyglycoside, polyglycerylester and sugar).

[0023] Os ácidos graxos que podem ser usados na preparação do presente (nano)lipossoma são ácidos altamente gordurosos, e preferencialmente saturados ou o ácido graxo não saturado tendo a cadeia alquila C12-22 , e os exemplos incluem o ácido láurico, o ácido miristico, o ácido palmítico, o ácido esteárico, o ácido oleico e o ácido linoleico.[0023] The fatty acids that can be used in the preparation of the present (nano) liposome are highly fatty acids, and preferably saturated or unsaturated fatty acid having the C12-22 alkyl chain, and examples include lauric acid, acid myristic, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid.

[0024] O sal que é usado na preparação do presente (nano)lipossoma pode ser qualquer sal conhecido na arte, e exemplos incluem o sal do fosfato, o sal do sulfato, o sal do nitrato, o sal do cloreto, o sal do hidróxido, o sal do sódio, o sal do potássio, o sal do cálcio, o sal da amónia, o sal do amino ácido, e o amino ácido.[0024] The salt that is used in the preparation of the present (nano) liposome can be any salt known in the art, and examples include the phosphate salt, the sulfate salt, the nitrate salt, the chloride salt, the salt of the hydroxide, sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonia salt, amino acid salt, and amino acid.

[0025] A água que é usada na preparação do presente (nano)lipossoma é geralmente água destilada deionizada.[0025] The water that is used in the preparation of this (nano) liposome is usually deionized distilled water.

[0026] De acordo com uma realização mais preferida da presente invenção, o presente (nano)lipossoma é preparado somente com fosfolipídios, sal e água, como descrito em detalhe nos exemplos abaixo.[0026] In accordance with a more preferred embodiment of the present invention, the present (nano) liposome is prepared only with phospholipids, salt and water, as described in detail in the examples below.

[0027] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o hGH-contendo nanolipossoma é preparado com um processo que compreende as etapas de: (a) dissolução de um fosfolipídio capaz de formar o lipossoma (preferivelmente, lecitina da gema de ovo ou lecitina de soja) em uma solução aquosa tamponada de sal contendo o hormônio de crescimento humano; e (b) passando a solução aquosa contendo hormônio de crescimento humano e o fosfolipídio através de um homogeneizador de alta pressão enquanto aumenta gradativamente o conteúdo de fosfolipídios e a pressão do homogeneizador de alta pressão enquanto aumenta o número de passagens, assim preparando hormônio de crescimento humano contendo o nanolipossoma.[0027] According to a preferred embodiment of the present invention, the hGH-containing nanoliposome is prepared with a process comprising the steps of: (a) dissolving a phospholipid capable of forming the liposome (preferably, egg yolk lecithin or soy lecithin) in a salt-buffered aqueous solution containing human growth hormone; and (b) passing the aqueous solution containing human growth hormone and phospholipid through a high pressure homogenizer while gradually increasing the phospholipid content and pressure of the high pressure homogenizer while increasing the number of passages, thus preparing growth hormone human containing the nanoliposome.

[0028] A solução aquosa contendo o hormônio de crescimento humano é preferivelmente uma solução tamponada que tem um pH de 6-8, e ainda mais preferivelmente de aproximadamente 7, por exemplo, solução de fosfato do sódio. Se a solução tamponada de fosfato do sódio é usada, sua concentração será preferivelmente de 5-100 mM, melhor de 5-60 mM, ainda mais preferivelmente de 10-30 mM, e mais preferivelmente de aproximadamente 20 mM.[0028] The aqueous solution containing the human growth hormone is preferably a buffered solution that has a pH of 6-8, and even more preferably approximately 7, for example, sodium phosphate solution. If the sodium phosphate buffered solution is used, its concentration will preferably be 5-100 mM, better 5-60 mM, even more preferably 10-30 mM, and more preferably approximately 20 mM.

[0029] A característica a mais proeminente do presente processo é que a mistura do fosfolipídio e da solução aquosa contendo hGH é passada pelo homogeneizador de alta pressão diversas vezes, nas quais a quantidade do fosfolipídios e a pressão do homogeneizador são aumentadas gradativamente enquanto o número das passagens aumenta. De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a pressão do homogeneizador é aumentada gradativamente de 0 a 1000 bar, e preferencialmente de 0 a 800 bar. A pressão pode ser aumentada em 50 ou 100 bar, preferencialmente 100 bar. De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a quantidade do fosfolipídio é aumentada gradativamente de 5 a 40 p/v(%), e mais preferencialmente de 5 a 30 p/v(%).[0029] The most prominent feature of the present process is that the mixture of phospholipid and aqueous solution containing hGH is passed through the high pressure homogenizer several times, in which the quantity of phospholipids and the pressure of the homogenizer are gradually increased while the number of the passages increases. According to a preferred embodiment of the present invention, the pressure of the homogenizer is gradually increased from 0 to 1000 bar, and preferably from 0 to 800 bar. The pressure can be increased by 50 or 100 bar, preferably 100 bar. According to a preferred embodiment of the present invention, the amount of phospholipid is increased gradually from 5 to 40 w / v (%), and more preferably from 5 to 30 w / v (%).

[0030] Através do processo de homogeneização de alta pressão que inclui estes aumentos por etapas no índice e na pressão do fosfolipídio, um nanolipossoma contendo hGH é preparado e um nanolipossoma líquido contendo hGH é preferencialmente preparado.[0030] Through the high-pressure homogenization process that includes these stepwise increases in the phospholipid index and pressure, a nanoliposome containing hGH is prepared and a liquid nanoliposome containing hGH is preferably prepared.

[0031] A composição da presente invenção é útil na melhoria em condições de pele variadas. Preferencialmente, a presente composição é eficaz na melhoria nas condições da pele incluindo acne, rugas, manchas escuras, elasticidade, crescimento de pêlo, envelhecimento, umidade da pele e proliferação da célula estaminal cutânea. Mais especificamente, as melhorias em condições da pele se referem ao tratamento da acne, rugas, remoção de manchas escuras, elasticidade, crescimento de pêlo, prevenção ao envelhecimento da pele, aumento da propriedade de retenção de umidade da pele ou para a promoção da proliferação de células estaminais cutâneas. Preferencialmente, a condição de pele melhorada pela presente invenção é acne, rugas ou crescimento de pêlo.[0031] The composition of the present invention is useful in improving various skin conditions. Preferably, the present composition is effective in improving skin conditions including acne, wrinkles, dark spots, elasticity, hair growth, aging, skin moisture and skin stem cell proliferation. More specifically, improvements in skin conditions refer to the treatment of acne, wrinkles, removal of dark spots, elasticity, hair growth, preventing skin aging, increasing the moisture retention property of the skin or promoting the proliferation of the skin of cutaneous stem cells. Preferably, the skin condition improved by the present invention is acne, wrinkles or hair growth.

[0032] A presente composição pode ser fornecida como uma composição cosmética ou farmacêutica.[0032] The present composition can be supplied as a cosmetic or pharmaceutical composition.

[0033] As composições cosméticas desta invenção para melhorar condições da pele podem ser formuladas em uma grande variedade de formas, por exemplo, incluindo uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma pasta, uma pomada, um gel, um creme, uma loção, um pó, um sabão, um limpador surfactante, um óleo, uma base de pó, uma base de emulsão, uma base de cera e um pulverizador.[0033] The cosmetic compositions of this invention to improve skin conditions can be formulated in a wide variety of forms, for example, including a solution, a suspension, an emulsion, a paste, an ointment, a gel, a cream, a lotion , a powder, a soap, a surfactant cleaner, an oil, a powder base, an emulsion base, a wax base and a spray.

[0034] O veículo cosmeticamente aceitável contido na presente composição cosmética, pode ser variado dependendo do tipo da formulação. Por exemplo, a formulação da pomada, pastas, cremes ou gel podem compreender gorduras animais e vegetais, ceras, parafinas, amido, tragacante, derivados de celulose, glicóis de polietileno, silicones, bentonites, silica, talco, óxido de zinco ou misturas destas substâncias. Na formulação do pó ou do pulverizador, pode compreender lactose, talco, silica, hidróxido de alumínio, silicato do cálcio, pó de poliam ida e as misturas destas substâncias. O pulverizador pode adicionalmente compreender os propulsores habituais, por exemplo, clorofluorhidrocarbonetos, propano/butano ou éter dimetil.[0034] The cosmetically acceptable vehicle contained in the present cosmetic composition, can be varied depending on the type of formulation. For example, the formulation of the ointment, pastes, creams or gels may comprise animal and vegetable fats, waxes, paraffins, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silica, talc, zinc oxide or mixtures thereof. substances. In the powder or spray formulation, it can comprise lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder and mixtures of these substances. The sprayer may additionally comprise the usual propellants, for example, chlorofluorhydrocarbons, propane / butane or dimethyl ether.

[0035] A formulação da solução e da emulsão podem compreender solvente, solubilizador e emulsificante, por exemplo água, álcool etílico, isopropanol, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzilico, benzoato benzil, glicol de propileno, 1,3 butilglicol, óleos, em particular óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo do germe do milho, óleo de oliva, óleo de rícino e de girassol, ésteres gordurosos de glicerol, ésteres de glicol de polietileno e do ácido graxo de sorbitan ou misturas destas substâncias. A formulação de suspensão pode compreender diluentes líquidos, água por exemplo, álcool etílico ou glicol propileno, agentes de suspensão, por exemplo álcoois etoxilados isosteary, ésteres de polioxietileno sorbitol e ésteres poli oxietileno sorbitol, celulose micocristalina, metahidroxido de alumínio, bentonite, ágar e tragacante ou misturas destas substâncias.[0035] The solution and emulsion formulation can comprise solvent, solubilizer and emulsifier, for example water, ethyl alcohol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1.3 butyl glycol, oils, in particular cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor and sunflower oil, fatty glycerol esters, polyethylene glycol esters and sorbitan fatty acid or mixtures thereof substances. The suspension formulation may comprise liquid diluents, water for example, ethyl alcohol or propylene glycol, suspending agents, for example isosteary ethoxyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol esters and poly oxyethylene sorbitol esters, mycrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar and tragacanth or mixtures of these substances.

[0036] A formulação do sabão pode compreender sais alcalinos de ácidos graxos, sais de ácido hemiesteres gordurosos, proteínas ácidas gordurosas hidrolizadas, isetionatos, lanolina, álcool gorduroso, óleo vegetal, glicerol, açúcares ou as misturas destas substâncias.[0036] The soap formulation can comprise alkaline fatty acid salts, fatty hemiester acid salts, hydrolyzed fatty acid proteins, isethionates, lanolin, fatty alcohol, vegetable oil, glycerol, sugars or mixtures of these substances.

[0037] Além disso, as composições cosméticas desta invenção podem conter auxiliares assim como o veículo. Os exemplos de auxiliares não limitados incluem preservativos, antioxidantes, estabilizadores, solubilizadores, vitaminas, corantes, agentes odorizantes ou misturas destas substâncias.[0037] In addition, the cosmetic compositions of this invention may contain auxiliaries as well as the vehicle. Examples of non-limited auxiliaries include preservatives, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, dyes, odorants or mixtures of these substances.

[0038] Onde a presente composição é formulada para fornecer uma composição farmacêutica, pode compreender um veículo farmacêutico aceitável que inclui carboidratos (por exemplo, lactose, amilose, glicose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, celulose), acácia de goma, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, soluções de sal, álcoois, goma arábica, xarope, óleos vegetais (por exemplo, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de coco), glicóis de polietileno, celulose metílica, benzoato de metilhidroxi, benzoato de propilhidroxi, talco, estearato do magnésio e de óleo mineral, mas não limitado a estes.[0038] Where the present composition is formulated to provide a pharmaceutical composition, it may comprise an acceptable pharmaceutical carrier which includes carbohydrates (e.g., lactose, amylose, glucose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, cellulose), gum acacia, phosphate calcium, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, salt solutions, alcohols, gum arabic, syrup, vegetable oils (eg corn oil, cottonseed oil, peanut oil, oil olive oil, coconut oil), polyethylene glycols, methyl cellulose, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but not limited to these.

[0039] As composições farmacêuticas desta invenção, podem ainda conter agente umidificante, agente adoçante, emulsificador, tampão, agente de suspensão, preservativos, sabores, perfumes, lubrificante, estabilizador, ou as misturas destas substâncias. Detalhes sobre veículos farmaceuticamente adequados e aceitáveis e de formulações podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995), que são aqui incorporados para referência.[0039] The pharmaceutical compositions of this invention may also contain wetting agent, sweetening agent, emulsifier, buffer, suspending agent, preservatives, flavors, perfumes, lubricant, stabilizer, or mixtures of these substances. Details on pharmaceutically suitable and acceptable vehicles and formulations can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995), which are incorporated herein by reference.

[0040] A composição farmacêutica desta invenção é formulada para o tratamento tópico na pele.[0040] The pharmaceutical composition of this invention is formulated for topical treatment on the skin.

[0041] A dosagem correta das composições farmacêuticas desta invenção será variada de acordo com a formulação particular, a modalidade de aplicação, a idade, o peso de corpo e o sexo do paciente, da dieta, do tempo de administração, da condição do paciente, das combinações da droga, das sensibilidades da reação e da severidade da doença. Compreende-se que o médico qualificado é capaz de prontamente determinar e prescrever uma dosagem correta destas composições farmacêuticas. De acordo com uma realização preferida desta invenção, a unidade apropriada de dosagem é administrar uma vez por dia com 0.001-100 ng/cm2 (área de superfície da unidade da pele), mais preferivelmente, 0.1-2 ng/cm2.[0041] The correct dosage of the pharmaceutical compositions of this invention will be varied according to the particular formulation, the mode of application, the age, body weight and sex of the patient, the diet, the time of administration, the condition of the patient , drug combinations, reaction sensitivities and disease severity. It is understood that the qualified physician is able to readily determine and prescribe a correct dosage of these pharmaceutical compositions. According to a preferred embodiment of this invention, the appropriate dosage unit is to be administered once daily with 0.001-100 ng / cm2 (surface area of the skin unit), more preferably, 0.1-2 ng / cm2.

[0042] De acordo com as técnicas convencionais conhecidas daqueles familiarizados ao assunto, as composições farmacêuticas desta invenção podem ser formuladas com o veículo e/ou carreador farmaceuticamente aceitáveis como descritas acima, fornecendo diversas formas que incluem uma forma de dosagem da unidade. Mais preferencialmente, a composição farmacêutica é uma solução que compreende nanolipossomas.[0042] According to conventional techniques known to those familiar with the subject, the pharmaceutical compositions of this invention can be formulated with the pharmaceutically acceptable carrier and / or carrier as described above, providing various forms that include a unit dosage form. More preferably, the pharmaceutical composition is a solution that comprises nanoliposomes.

[0043] A presente composição atua nas células epidérmicas estaminais para aumentar o número de folículos pilosos para estimular do crescimento do cabelo, prolifera os queratinocitos da camada epidérmica para inibir o envelhecimento da pele, melhora a pele danificada pela luz UV e rugas causadas pela luz UV, remodela o tecido conectivo da camada cutânea para melhorar a firmeza da pele e para melhorar rugas, e mostra os efeitos de tratar a acne e remover as manchas escuras. Tomada em conjunto, a composição desta invenção pode melhorar muito as condições de pele. Além disso, a composição atual é muito segura ao corpo humano, e tem a estabilidade excelente quando é preparada sob a forma de um nanolipossoma.[0043] The present composition acts on epidermal stem cells to increase the number of hair follicles to stimulate hair growth, keratinocytes of the epidermal layer proliferate to inhibit skin aging, improves skin damaged by UV light and wrinkles caused by light UV, remodels the connective tissue of the skin layer to improve the firmness of the skin and to improve wrinkles, and shows the effects of treating acne and removing dark spots. Taken together, the composition of this invention can greatly improve skin conditions. In addition, the current composition is very safe for the human body, and has excellent stability when it is prepared in the form of a nanoliposome.

Brief description of the drawings

[0044] FIG. 1 é uma fotografia do microscópio de elétron de um hormônio de crescimento humano (hGH) - contendo a formulação de creme de lipossoma (formulação A) preparada no exemplo I.[0044] FIG. 1 is an electron microscope photograph of a human growth hormone (hGH) - containing the liposome cream formulation (formulation A) prepared in example I.

[0045] FIG. 2 é um cromatograma da permeação de gel de um lipossoma contendo hGH (Lipo-hGH) da formulação B preparada no exemplo I.[0045] FIG. 2 is a chromatogram of the gel permeation of a liposome containing hGH (Lipo-hGH) of formulation B prepared in example I.

[0046] FIG. 3 mostra os resultados de SDS-PAGE para o hGH encapsulado com Lipo-hGH da formulação B preparada no exemplo I.[0046] FIG. 3 shows the SDS-PAGE results for Lipo-hGH encapsulated hGH of formulation B prepared in example I.

[0047] FIG. 4 é um cromatograma de HPLC de fase-reversa do hGH encapsulado em Lipo-hGH da formulação B preparada no exemplo I.[0047] FIG. 4 is a reverse-phase HPLC chromatogram of the Lipo-hGH encapsulated hGH of formulation B prepared in example I.

[0048] FIG. 5 é um cromatograma de HPLC de fase-reversa do fosfolipídio em Lipo-hGH da formulação B preparada no exemplo I.[0048] FIG. 5 is a reverse-phase HPLC chromatogram of phospholipid in Lipo-hGH of formulation B prepared in example I.

[0049] FIG. 6 é um diagrama gráfico que mostra resultados da análise da segurança para Lipo-hGH da formulação B preparada no exemplo I.[0049] FIG. 6 is a graphical diagram showing results of the safety analysis for Lipo-hGH of formulation B prepared in example I.

[0050] FIG. 7 é um diagrama gráfico que mostra resultados da análise da segurança para um lipossoma contendo hGH de acordo com a presente invenção.[0050] FIG. 7 is a graphical diagram showing results of the safety analysis for a hGH-containing liposome according to the present invention.

[0051] FIG. 8 mostra resultados da análise para o efeito de diminuição rugas do presente lipossoma hGH encapsulado em ratos nus apresentando enrugamentos induzidos por raios UV.[0051] FIG. 8 shows results of the analysis for the wrinkle-reducing effect of the present encapsulated hGH liposome in nude mice showing UV-induced wrinkles.

[0052] FIG. 9 mostra resultados da análise para a atividade de hormônio de crescimento humano encapsulado em um lipossoma hGH encapsulado de acordo com a presente invenção.[0052] FIG. 9 shows analysis results for the activity of human growth hormone encapsulated in an encapsulated hGH liposome according to the present invention.

[0053] FIG. 10a é uma fotografia que mostra a localização do hormônio de crescimento humano, que ocorre quando o presente nanolipossoma hGH encapsulado é liberado à pele através dos folículos pilosos nos ratos Sprague Dawley.[0053] FIG. 10a is a photograph showing the location of human growth hormone, which occurs when the present encapsulated hGH nanoliposome is released to the skin through the hair follicles in Sprague Dawley rats.

[0054] FIG. 10b é uma fotografia que mostra o efeito do presente nanolipossoma hGH encapsulado na camada de derme e nos folículos pilosos da pele dos ratos Sprague Dawley.[0054] FIG. 10b is a photograph showing the effect of the present hGH nanoliposome encapsulated in the dermis layer and hair follicles of the Sprague Dawley rats.

[0055] FIG. 11a é uma fotografia que mostra o efeito do presente nanolipossoma hGH encapsulado na epiderme e na derme da pele dos ratos ICR.[0055] FIG. 11a is a photograph showing the effect of the present hGH nanoliposome encapsulated on the epidermis and skin dermis of ICR mice.

[0056] FIG. 11b é uma fotografia que mostra que o presente nanolipossoma hGH encapsulado induz a remodelação do tecido conectivo na camada cutânea de ratos ICR.[0056] FIG. 11b is a photograph showing that the present encapsulated hGH nanoliposome induces connective tissue remodeling in the cutaneous layer of ICR mice.

[0057] FIG. 12 é uma fotografia que mostra o efeito do presente nanolipossoma hGH encapsulado na pele humana artificial.[0057] FIG. 12 is a photograph showing the effect of the present hGH nanoliposome encapsulated on human artificial skin.

[0058] FIG. 13 mostra resultados da análise para a distribuição de tamanho da partícula de um nanolipossoma hGH encapsulado de acordo com a presente invenção.[0058] FIG. 13 shows results of the analysis for the particle size distribution of an encapsulated hGH nanoliposome according to the present invention.

[0059] FIG. 14 é um diagrama gráfico que mostra o efeito de diminuição de ruga do presente nanolipossoma hGH encapsulado.[0059] FIG. 14 is a graphic diagram showing the wrinkle-reducing effect of the present encapsulated hGH nanoliposome.

[0060] Os exemplos específicos a seguir são ilustrativos da invenção e não devem ser interpretados como a limitação do escopo da invenção como definidos por reivindicações anexas. Exemplos Exemplo I: Preparação de várias formulações de lipossomas contendo hormônio de crescimento humano (Lipo-hGH) Formulação A (formulação de creme): formulação de creme contendo hormônio de crescimento humano[0060] The following specific examples are illustrative of the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention as defined by the appended claims. Examples Example I: Preparation of various liposome formulations containing human growth hormone (Lipo-hGH) Formulation A (cream formulation): cream formulation containing human growth hormone

[0061] O fosfolipídio usado na formulação A foi o lipoid S100 (Lipoid GmbH, Alemanha) ou o lipoid S75 (Lipoid GmbH, Alemanha).[0061] The phospholipid used in formulation A was lipoid S100 (Lipoid GmbH, Germany) or lipoid S75 (Lipoid GmbH, Germany).

[0062] O trocador de calor de um homogeneizador de alta pressão (saída máxima 5 l/h, pressão mais elevada 1200 bar, Modelo HS-1002; manufaturado por Hwasung Machinery Co., Ltd., Coréia do Sul) foi colocado na água de gelo de maneira que a temperatura de saída do homogeneizador não excedeu 30°C, e o interior do homogeneizador foi lavado então com água destilada para estar pronto para operar. Então, a 100 ml de uma solução de hormônio de crescimento humano (LG Life Sciences, Ltd) dissolvida em uma solução tampão (20 mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA) em concentração de 1 mg/ml, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 5 p/v% e suficientemente hidratada e agitada. A solução agitada foi passada através do homogeneizador três vezes ou mais na temperatura ambiente e em uma baixa pressão de 0 bar. À solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 6 p/v% e suficientemente hidratada e agitada. A solução agitada foi passada através do homogeneizador três vezes ou mais a 100 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador na condição de 100 bar, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 7 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 200 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador a 200 bar, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 8 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 300 bar. À solução passada através do homogeneizador a 300 bar, fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 9 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 400 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador na condição de 400 bar, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 10 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 500 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador na condição de 500 bar, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 11 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado pelo homogeneizador três vezes ou mais a 600 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador na condição de 600 bar, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 12 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 800 bar, assim preparando uma formulação de lipossoma em creme contendo hormônio de crescimento humano (Lipo-hGH).[0062] The heat exchanger of a high pressure homogenizer (maximum output 5 l / h, highest pressure 1200 bar, Model HS-1002; manufactured by Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) was placed in the water of ice so that the outlet temperature of the homogenizer did not exceed 30 ° C, and the interior of the homogenizer was then washed with distilled water to be ready to operate. Then, to 100 ml of a human growth hormone solution (LG Life Sciences, Ltd) dissolved in a buffer solution (20 mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA) in a concentration of 1 mg / ml, the phospholipid was added in a ratio of 5 w / v% and is sufficiently hydrated and agitated. The stirred solution was passed through the homogenizer three times or more at room temperature and at a low pressure of 0 bar. To the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 6 w / v% and sufficiently hydrated and stirred. The stirred solution was passed through the homogenizer three times or more at 100 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer in the condition of 100 bar, the phospholipid was added in a ratio of 7 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 200 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer at 200 bar, the phospholipid was added in a ratio of 8 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 300 bar. To the solution passed through the homogenizer at 300 bar, phospholipid was added in a ratio of 9 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 400 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer in the 400 bar condition, the phospholipid was added in a ratio of 10 w / v%, sufficiently hydrated and agitated, and passed through the homogenizer three times or more at 500 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer in the condition of 500 bar, the phospholipid was added in a ratio of 11 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 600 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer in the condition of 600 bar, the phospholipid was added in a ratio of 12 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 800 bar, thus preparing a formulation of liposome in cream containing human growth hormone (Lipo-hGH).

[0063] FIG. 1 mostra uma fotografia obtida através de microscópio de elétron da formulação de creme do hormônio de crescimento humano contendo lipossoma preparada neste exemplo. A formulação do creme de lipossoma preparada neste exemplo foi revestida com ouro e observada com um microscópio de elétron (HITACHI S 2500). No resultado da observação, a forma do fundo curvado e conectado foi presumida como gel, e os grãos esféricos pequenos foram estimados como (0.02-0.3 pm) lopossomas de nano tamanho.[0063] FIG. 1 shows an electron microscope photograph of the liposome-containing human growth hormone cream formulation prepared in this example. The liposome cream formulation prepared in this example was coated with gold and observed with an electron microscope (HITACHI S 2500). As a result of the observation, the shape of the curved and connected bottom was assumed to be gel, and the small spherical grains were estimated as (0.02-0.3 pm) nanosize lopossomas.

[0064] Formulação B (formulação do lipossoma): Hormônio de crescimento humano (hGH) - contendo a formulação do lipossoma[0064] Formulation B (liposome formulation): Human growth hormone (hGH) - containing the liposome formulation

[0065] O fosfolipídio usado na preparação da formulação B foi lecitina de soja (ShinDongBang Corp., Coreia do Sul), Metarin P (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH &Co. KG), Nutripur S (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH &Co. KG) ou Emultop (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH &Co. KG).[0065] The phospholipid used in the preparation of formulation B was soy lecithin (ShinDongBang Corp., South Korea), Metarin P (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG), Nutripur S (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) or Emultop (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG).

[0066] O trocador de calor de um homogeneizador de alta pressão (saída máxima 5 L/hr, a mais elevada pressão de 1200 bar, modelo HS-1002; manufaturado por Hwasung Machinery Co., Ltd., Coreia do Sul) foi colocado na água gelada de maneira que a temperatura da saída do homogeneizador não excedeu 30 0 C, e o interior do homogeneizador foi lavado então com água destilada para estar pronto para operar. Então, a 100 ml de uma solução de hormônio de crescimento humano (LG Life Sciences, Ltd.) dissolvida em uma solução tampão (20 mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA) em uma concentração de 1 mg/ml, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 10 p/v% e suficientemente hidratado e agitado. A solução agitada foi passada através do homogeneizador três vezes ou mais na temperatura ambiente e em uma baixa pressão de 0 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 14 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 100 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 18 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 200 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 20 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 300 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 22 p/v%, e hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 400 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 24 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 500 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 26 p/v%, hidratado suficientemente e agitado, e passado através do homogeneizador três vezes ou mais a 600 bar. Então, à solução passada através do homogeneizador, o fosfolipídio foi adicionado em uma razão de 28 p/v%, suficientemente hidratado e agitado, e passada através do homogeneizador três vezes ou mais a 700 bar. Então, a solução passada através do homogeneizador a 700 bar foi passada através do homogeneizador três vezes ou mais a 800 bar e descarregada do homogeneizador. A solução descarregada foi sujeitada à centrifugação de alta velocidade em 15.000 x g por 30 minutos, e o sobrenadante foi separado. Neste momento, o hormônio de crescimento humano que não foi encapsulado em lipossoma foi removida pela cromatografia da permeação de gel (GE Healthcare, USA), assim obtendo o lipossoma líquido (veja FIG. 2).[0066] The heat exchanger of a high pressure homogenizer (maximum output 5 L / hr, highest pressure of 1200 bar, model HS-1002; manufactured by Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) was placed in ice water so that the temperature of the homogenizer outlet did not exceed 30 0 C, and the interior of the homogenizer was then washed with distilled water to be ready to operate. Then, 100 ml of a human growth hormone solution (LG Life Sciences, Ltd.) dissolved in a buffer solution (20 mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA) in a concentration of 1 mg / ml, the phospholipid was added at a rate of 10 w / v% and sufficiently hydrated and stirred. The stirred solution was passed through the homogenizer three times or more at room temperature and at a low pressure of 0 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 14 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 100 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 18 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 200 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 20 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 300 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 22 w / v%, and sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 400 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 24 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 500 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 26 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 600 bar. Then, to the solution passed through the homogenizer, the phospholipid was added in a ratio of 28 w / v%, sufficiently hydrated and stirred, and passed through the homogenizer three times or more at 700 bar. Then, the solution passed through the homogenizer at 700 bar was passed through the homogenizer three times or more at 800 bar and discharged from the homogenizer. The discharged solution was subjected to high speed centrifugation at 15,000 x g for 30 minutes, and the supernatant was separated. At this time, the human growth hormone that was not encapsulated in the liposome was removed by gel permeation chromatography (GE Healthcare, USA), thus obtaining the liquid liposome (see FIG. 2).

[0067] A formulação B preparada usando uma solução de água destilada e solução tampão (20 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 6.0-7.5) não mostrou uma diferença nas propriedades físicas e na estabilidade do lipossoma. Também, a formulação obtida foi armazenada em mais de 10 p/v% de lecitina de soja a 15-30 °C durante um longo período do tempo e, em conseqüência, da separação de fase em uma camada do lipido (mais baixa) e em uma solução aquosa (superior). Entretanto, em menos de 10 p/v% da lecitina de soja, houve excelente estabilidade sem fase de separação.[0067] Formulation B prepared using a solution of distilled water and buffer solution (20 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 6.0-7.5) did not show a difference in the physical properties and stability of the liposome. Also, the formulation obtained was stored in more than 10 w / v% soy lecithin at 15-30 ° C for a long period of time and, as a result, of phase separation in a lipid layer (lower) and in an aqueous solution (top). However, at less than 10 w / v% of soy lecithin, there was excellent stability without separation phase.

Example II: FPLC separation and SDS-PAGE analysis

[0068] Para a análise do hormônio de crescimento humano contendo lipossoma da formulação B preparada no exemplo I, FPLC (explorador Acta, Amersham Bioscience) foi equipado com uma coluna 200 HR/30 superdex a temperatura ambiente, e a coluna foi equilibrada com duas vezes o volume de coluna de uma solução tampão (20 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA and 150 mM NaCI). Então, o hormônio de crescimento humano contendo lipossoma foi separado em frações que então foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE. Segundo as indicações de FIG. 3, a faixa de hormônio de crescimento humano podia ser observada em aproximadamente 22 kDa.[0068] For the analysis of the human growth hormone containing liposome of formulation B prepared in example I, FPLC (explorer Acta, Amersham Bioscience) was equipped with a 200 HR / 30 superdex column at room temperature, and the column was balanced with two times the column volume of a buffer solution (20 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA and 150 mM NaCI). Then, the human growth hormone containing liposome was separated into fractions which were then collected and analyzed by SDS-PAGE. As shown in FIG. 3, the range of human growth hormone could be observed at approximately 22 kDa.

Example III: Quantification of human growth hormone in the liposome

[0069] O HPLC (Shimazu) foi equipado com a coluna C18 Delta pack (Waters, EUA), e a fase reversa do HPLC foi executada pelo gradiente de concentração (B 60-10%: 0-25 min, B 60%: 25.01-30 min) em uma taxa de fluxo de 1 ml/min usando 0.1% acetonitrilos de TFA como solvente A e 0.1% TFA H2O como solvente B. Uma amostra padrão (hormônio de crescimento humano NIBSC padrão internacional código 98/574) foi quantificada usando um detetor fluorescente (excitação: 295 nm, escala: 270-300 nm; emissão: 350 nm, escala: 300-400 nm) nas condições de uma temperatura do forno 55 °C e de um tempo de execução de 30 min. Então, uma amostra foi pré-tratada interrompendo a solução de hormônio de crescimento humano contendo lipossoma com um aparelho de ultra-som e adicionando uma solução tampão (50 mM Tris-CI pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% Tween 20) a isso no mesmo volume que a amostra e então introduzindo com pipeta a mistura, e foi quantificada por HPLC que usa o detetor fluorescente (veja FIG. 4).[0069] The HPLC (Shimazu) was equipped with the C18 Delta pack column (Waters, USA), and the reverse phase of the HPLC was performed by the concentration gradient (B 60-10%: 0-25 min, B 60%: 25.01-30 min) at a flow rate of 1 ml / min using 0.1% acetonitriles of TFA as solvent A and 0.1% TFA H2O as solvent B. A standard sample (human growth hormone NIBSC international standard code 98/574) was quantified using a fluorescent detector (excitation: 295 nm, scale: 270-300 nm; emission: 350 nm, scale: 300-400 nm) under the conditions of an oven temperature of 55 ° C and an execution time of 30 min. Then, a sample was pre-treated by interrupting the human growth hormone solution containing liposome with an ultrasound device and adding a buffer solution (50 mM Tris-CI pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% Tween 20) to this in the same volume as the sample and then pipetting the mixture, and it was quantified by HPLC using the fluorescent detector (see FIG. 4).

[0070] Dos resultados da quantificação, pode-se ver que o Lipo- hGH da formulação B preparado no Exemplo I contem aproximadamente 3.69 pg/ml de hormônio de crescimento humano.[0070] From the results of the quantification, it can be seen that the Lipo-hGH of formulation B prepared in Example I contains approximately 3.69 pg / ml of human growth hormone.

Example IV: Analysis of the phospholipid index

[0071] O HPLC (Shimazu) foi equipado com uma coluna de Spherisorb S5 NH2 (Waters), e o HPLC foi executado pelo gradiente isocratico em uma taxa de fluxo de 1 ml/min usando um solvente misturado de 60% de acetonitrilo, 30% de metanol e 5% H2O. O fosfolipídio foi dissolvido completamente em um solvente misturado de metanol: clorofórmio (90%: 10%) e quantificada usando um detetor da luz UV (215 nm) nas condições de uma temperatura de forno de 35°C e de um tempo de execução de 20 Min. Na mesma maneira, a solução de hormônio de crescimento humano contendo lipossoma foi dissolvida completamente em um solvente misturado do metanol: clorofórmio (90%: 10%) e quantificado então por HPLC (veja FIG. 5).[0071] The HPLC (Shimazu) was equipped with a Spherisorb S5 NH2 column (Waters), and the HPLC was performed by the isocratic gradient at a flow rate of 1 ml / min using a mixed solvent of 60% acetonitrile, 30 % methanol and 5% H2O. The phospholipid was completely dissolved in a mixed methanol: chloroform solvent (90%: 10%) and quantified using a UV light detector (215 nm) under the conditions of an oven temperature of 35 ° C and a run time of 20 Min. In the same way, the human growth hormone solution containing liposome was completely dissolved in a mixed solvent of methanol: chloroform (90%: 10%) and then quantified by HPLC (see FIG. 5).

[0072] Dos resultados da quantificação, pode-se ver que o Lipo- hGH da formulação B preparada no exemplo I contem aproximadamente 3.26 mg/ml de fosfolipídio.[0072] From the results of the quantification, it can be seen that the Lipo-hGH of formulation B prepared in example I contains approximately 3.26 mg / ml of phospholipid.

Example V: Stability test

[0073] Um teste de estabilidade para hormônio de crescimento humano contendo lipossoma da formulação B preparado no Exemplo I foi executado na seguinte maneira. O presente Lipo-hGH contendo 0.1% metíl parabeno foi analisado para estabilidade sendo colocado em frascos de cor marrom, estando os frascos a 4°C e 15-30 °C, respectivamente, e determinando o índice do hGH por HPLC em intervalos de uma semana. Como pode ser visto na FIG. 6, o presente Lipo-hGH após 10 meses de armazenagem teve índices iniciais do hGH de 87.5% a 4°C e 75% na temperatura ambiente. Isto sugere que o Lipo-hGH atual tenha excelente estabilidade.[0073] A stability test for human growth hormone containing liposome of formulation B prepared in Example I was performed in the following manner. The present Lipo-hGH containing 0.1% methyl paraben was analyzed for stability, being placed in brown flasks, with the flasks at 4 ° C and 15-30 ° C, respectively, and determining the hGH index by HPLC at intervals of one week. As can be seen in FIG. 6, the present Lipo-hGH after 10 months of storage had initial hGH indexes of 87.5% at 4 ° C and 75% at room temperature. This suggests that the current Lipo-hGH has excellent stability.

Example VI: Security test

[0074] Para testar a segurança do presente hormônio de crescimento humano contendo o lipossoma (formulação B preparada no Exemplo I), os citotoxicitos para a linha celular queratinocito humana HaCaT (DKFZ, Alemanha) e o fibroblasto embrionário humano HEF (presente do prof. Lee, Jaeyong, departamento de bioquímica, Faculdade de Medicina, Universidade de Hallym) foram examinados.[0074] To test the safety of the present human growth hormone containing the liposome (formulation B prepared in Example I), the cytotoxicites for the human keratinocyte cell line HaCaT (DKFZ, Germany) and the human embryonic fibroblast HEF (gift from prof. Lee, Jaeyong, department of biochemistry, Faculty of Medicine, Hallym University) were examined.

[0075] HaCaT e HEF foram suspensos em 10% FBS/DMEM (meios do FD em concentrações de 1 x 105 células/ml e de 5 x 104 celulas/ml, respectivamente. 1 ml de cada um das suspensões foi adicionado a uma placa de 24 cavidades e cultivado então em uma incubadora de 5% CO2 a 37°C por um dia. Após um dia de cultura, a camada superior foi removida com cuidado, e uma quantidade apropriada de 10% FD e várias concentrações de amostras foram adicionadas às cavidades da placa e puderam reagir em uma incubadora de 5% CO2 a 37°C por um dia. As amostras usadas eram uma solução tampão (contendo 20 mM Na-Pi, pH 7.0, 1 mM EDTA e 0.1% metíl parabeno), lipossoma, hormônio de crescimento humano e o Lipo-hGH da formulação B preparada no exemplo I. Após a reação, a viabilidade das células foi medida usando 3-(4,5- dimetiltiazol-2-yl) -2,5-brometo de difeniltetrazolium (MTT: Sigma, EUA) (Shearman e outros, Proc. Nacional. Acad. Sei. 91 (4): 1470-4 (1994), Shearman e outros, J. Neurochem. 65 (1): 218-27 (1995) e Kaneko e outros, J. Neurochem. 65 (6): 2585-93 (1995)). Os produtos da reação MTT foram medidos para a absorção em 570 nm usando um leitor ELISA (Molecular Devices, EUA). A viabilidade da célula em cada uma das amostras foi expressa como um valor relativo à absorção de uma cavidade não contendo as amostras, tomada como 100% (FIG. 7).[0075] HaCaT and HEF were suspended in 10% FBS / DMEM (FD media in concentrations of 1 x 105 cells / ml and 5 x 104 cells / ml, respectively. 1 ml of each of the suspensions was added to a plate of 24 wells and then grown in a 5% CO2 incubator at 37 ° C for one day. After a day of culture, the top layer was carefully removed, and an appropriate amount of 10% FD and various sample concentrations were added to the plate wells and were able to react in a 5% CO2 incubator at 37 ° C for one day.The samples used were a buffer solution (containing 20 mM Na-Pi, pH 7.0, 1 mM EDTA and 0.1% methyl paraben), liposome, human growth hormone and Lipo-hGH of formulation B prepared in example I. After the reaction, cell viability was measured using 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-bromide diphenyletrazolium (MTT: Sigma, USA) (Shearman et al., National Proc. Acad. Sci. 91 (4): 1470-4 (1994), Shearman et al., J. Neurochem. 65 (1): 218-27 ( 1995) and K aneko et al., J. Neurochem. 65 (6): 2585-93 (1995)). The MTT reaction products were measured for absorption at 570 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, USA). The cell viability in each of the samples was expressed as a value relative to the absorption of a cavity not containing the samples, taken as 100% (FIG. 7).

[0076] Como pode ser visto na FIG. 7, o presente nanolipossoma contendo hGH não teve nenhum efeito a viabilidade da célula de HaCaT e de HEF, indicando que é uma formulação muito segura a um corpo vivo.[0076] As can be seen in FIG. 7, the present hGH-containing nanoliposome had no effect on the viability of the HaCaT and HEF cells, indicating that it is a very safe formulation for a living body.

Example VII: Analysis for proliferation of the nanoliposome formulation Lipo-hGH in Nb2 cells

[0077] À uma cavidade de uma placa de 96 cavidades contendo 50 pil da linha celular Nb2 nobre do linfoma do rato (NIBSC ECACC #97041101) em uma concentração de 1 x 105 celulas/ml, S-hGH (hormônio de crescimento humano padrão, código NIBSC 98/574), uma amostra que compreende uma diluição de 1000 dobras de uma solução pré-tratada obtida interrompendo uma solução de lipossoma que não contem nenhum hormônio de crescimento humano com um sonicador e que adiciona uma solução (contendo 50 mM Tris- Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% Tween 20) no mesmo volume que a amostra então introduzindo com pipeta a mistura, S-hGH adicionado, ou uma amostra que compreende uma diluição de 1000 dobras do Lipo-hGH (N-hGH; a formulação B preparada no Exemplo I) sujeito a um processo de pré-tratamento da amostra que compreende interrupção de uma solução de lipossoma que não contem nenhum hormônio de crescimento humano com um sonicador e que adiciona uma solução (contendo 50 mM Tris-CI pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% Tween 20) no mesmo volume que a amostra e introduzindo com pipeta então a mistura), foi adicionada. Cada uma das amostras foi cultivada em uma incubadora de 5% CO2 a 37°C por 5 dias, e a quantidade de células proliferadas foi medida usando MTT. A absorção média do grupo que contem o hGH foi calculada como um valor relativo à absorção média do grupo de controle que não contem nenhum hGH, tomada como 100%.[0077] To one well of a 96 well plate containing 50 piles of the noble mouse lymphoma Nb2 cell line (NIBSC ECACC # 97041101) at a concentration of 1 x 105 cells / ml, S-hGH (standard human growth hormone , code NIBSC 98/574), a sample comprising a 1000-fold dilution of a pretreated solution obtained by interrupting a liposome solution that does not contain any human growth hormone with a sonicator and adding a solution (containing 50 mM Tris - Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea, 2% Tween 20) in the same volume as the sample then pipetting the mixture, added S-hGH, or a sample comprising a 1000-fold dilution of Lipo-hGH (N-hGH; formulation B prepared in Example I) subjected to a sample pretreatment process that comprises stopping a liposome solution that does not contain any human growth hormone with a sonicator and adding a solution (containing 50 mM Tris-CI pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M urea , 2% Tween 20) in the same volume as the sample and then pipetting the mixture), was added. Each sample was cultured in a 5% CO2 incubator at 37 ° C for 5 days, and the amount of proliferated cells was measured using MTT. The average absorption of the hGH-containing group was calculated as a value relative to the average absorption of the control group that does not contain any hGH, taken as 100%.

[0078] Conforme demonstrado na FIG. 9, o hormônio de crescimento humano encapsulado no presente Lipo-hGH manteve sua atividade original.[0078] As shown in FIG. 9, the human growth hormone encapsulated in the present Lipo-hGH maintained its original activity.

Example VIII: Analysis of the particle size distribution

[0079] O Lipo-hGH da formulação B separado pela cromatografia da permeação do gel no exemplo acima foi analisado para a distribuição de tamanho da partícula em um indice de refração de 1.52 usando um analisador do tamanho de partícula (Mastersizer 2000/ Malvern Instruments Ltd.) (veja FIG. 13). Como representado na FIG. 13, o presente Lipo-hGH mostrou a maior distribuição em um tamanho de partícula de 0.193 pm, indicando que o Lipo- hGH da formulação B está no tamanho de nanômetro.[0079] The Lipo-hGH of formulation B separated by gel permeation chromatography in the example above was analyzed for the particle size distribution at a refractive index of 1.52 using a particle size analyzer (Mastersizer 2000 / Malvern Instruments Ltd .) (see FIG. 13). As shown in FIG. 13, the present Lipo-hGH showed the greatest distribution in a particle size of 0.193 pm, indicating that the Lipo-hGH of formulation B is in the nanometer size.

Example IX: Analysis of the improvement effect on wrinkles

[0080] Ratos nus de 4 semanas de idade (comprados do Korea Research Institute of Chemical Technology) foram testados usando o Lipo-hGH (N-hGH). Uma câmara de criação de animais foi mantida em uma temperatura 22 ± 2°C e em uma umidade de 55-60% em um ciclo 12-hr luz/12-hr escuridão, e aos animais era permitido livre acesso à alimentação sólida (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Coréia) e a água esterilizada pela irradiação e aclimatados por aproximadamente 2 semanas. A fim induzir enrugamentos na parte lombar desses ratos nus, 20 mJ de UVB foram irradiados aos ratos três vezes por semana por 8 semanas. Então, na parte lombar que sofreu a irradiação UVB, cada uma das soluções das amostras e uma solução de controle foram aplicadas usando uma escova cosmética por 8 semanas. Então, um efeito de melhoramento foi avaliado de acordo com o método de Donald (Hyun-Seok Kim e outros, Meeh. Ageing Dev. (2005. 8.16 na imprensa)).[0080] 4-week-old nude mice (purchased from the Korea Research Institute of Chemical Technology) were tested using Lipo-hGH (N-hGH). An animal breeding chamber was maintained at a temperature of 22 ± 2 ° C and a humidity of 55-60% in a 12-hr light / 12-hr dark cycle, and animals were allowed free access to solid feed (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea) and water sterilized by irradiation and acclimated for approximately 2 weeks. In order to induce wrinkles in the lumbar part of these nude mice, 20 mJ of UVB was irradiated to the mice three times a week for 8 weeks. Then, on the lumbar part that underwent UVB irradiation, each of the sample solutions and a control solution were applied using a cosmetic brush for 8 weeks. Then, an improvement effect was evaluated according to Donald's method (Hyun-Seok Kim et al., Meeh. Aging Dev. (2005. 8.16 in the press)).

[0081] Os resultados da análise são mostrados nas FIGS. 8 e 14. Na FIG. 8, o grupo de controle (n=3) não foi tratado com nenhuma substância, o grupo do controle UVB (n=3) foi tratado com o 20 mJ de UVB para induzir somente enrugamentos, o lipossoma (n=3) foi tratado com o 20 mJ de UVB para induzir o enrugamento e tratado com o lipossoma, e o grupo de Lipo-hGH (n=3) foi tratado com 20 mJ de UVB para induzir enrugamentos e tratado com o presente Lipo-hGH. Conforme demonstrado nas FIGS. 8 e 14, o presente Lipo- hGH teve o efeito de eficazmente de remover os enrugamentos Uv-induzidos, que foi mostrada claramente partir de 2 semanas após o tratamento tópico do presente Lipo-hGH.[0081] The results of the analysis are shown in FIGS. 8 and 14. In FIG. 8, the control group (n = 3) was not treated with any substance, the UVB control group (n = 3) was treated with 20 mJ UVB to induce only wrinkles, the liposome (n = 3) was treated with 20 mJ UVB to induce wrinkling and treated with the liposome, and the Lipo-hGH group (n = 3) was treated with 20 mJ UVB to induce wrinkles and treated with the present Lipo-hGH. As shown in FIGS. 8 and 14, the present Lipo-hGH had the effect of effectively removing UV-induced wrinkles, which was clearly shown from 2 weeks after topical treatment of the present Lipo-hGH.

Example X: Analysis of the effect of acne treatment

[0082] O efeito do tratamento da acne do presente hormônio de crescimento humano contendo lipossoma foi examinado na seguinte maneira.[0082] The effect of the acne treatment of the present human growth hormone containing liposome was examined in the following way.

[0083] Sessenta mulheres com idades entre 15-40 anos foram divididas aleatoriamente em três grupos, e autorizadas a usar a formulação B de lipossoma contendo hGH do Exemplo I (formulação 1), uma solução comparativa que contêm somente o lipossoma (formulação 2) e uma solução tampão comparativa (formulação 3) primeiramente após lavar o rosto duas vezes por dia (manhã e noite) por 3 semanas. Adicionalmente, não houve nenhuma limitação particular em cosméticos geralmente usados. Então, a melhoria da acne foi avaliada com base na opinião do usuário de acordo com os seguintes critérios. Os resultados são mostrados na tabela 1 abaixo. Critérios da avaliação: +++ (teve um efeito muito bom de melhoria); ++ (teve um efeito significativo de melhoria); + (teve um leve efeito de melhoria); ± (não teve nenhum efeito de melhoria, mas não se tornou pior); e - (se tornou pior).

[0083] Sixty women aged 15-40 years were randomly divided into three groups, and allowed to use liposome formulation B containing hGH from Example I (formulation 1), a comparative solution containing only the liposome (formulation 2) and a comparative buffer solution (formulation 3) first after washing your face twice a day (morning and night) for 3 weeks. In addition, there were no particular limitations on commonly used cosmetics. Then, acne improvement was assessed based on the user's opinion according to the following criteria. The results are shown in Table 1 below. Evaluation criteria: +++ (had a very good improvement effect); ++ (had a significant improvement effect); + (had a slight improvement effect); ± (had no improvement effect, but it didn't get any worse); and - (became worse).

[0084] Como pode ser visto na tabela 1, a presente formulação teve um efeito muito bom na melhoria da acne, que começou ser mostrada claramente 2 semanas após a aplicação da formulação. Além disso, a presente composição não causou substancial a irritação à pele, por exemplo, a eritema ou coceira.[0084] As can be seen in Table 1, the present formulation had a very good effect on the improvement of acne, which started to be shown clearly 2 weeks after the application of the formulation. In addition, the present composition did not cause substantial skin irritation, for example, erythema or itching.

Example XI: Analysis of the effect of removing dark spots

[0085] O efeito da remoção de manchas escuras do presente hormônio humano de crescimento contendo lipossoma foi testado na seguinte maneira.[0085] The effect of removing dark spots from the present human growth hormone containing liposome was tested in the following way.

[0086] Sessenta mulheres com idades entre 40-60 anos foram divididas aleatoriamente em três grupos, e autorizadas a usar a formulação B de lipossoma contendo hGH do Exemplo I (formulação 1), uma solução comparativa que contêm somente o lipossoma (formulação 2) e uma solução tampão comparativa (formulação 3) primeiramente após lavar o rosto duas vezes por dia (manhã e noite) por 8 semanas. Adicionalmente, não houve nenhuma limitação particular em cosméticos geralmente usados. Então, a melhoria das manchas escuras foi avaliada com base na opinião do usuário de acordo com os seguintes critérios. Os resultados são mostrados na tabela 2 abaixo. Critérios da avaliação: +++ (teve um efeito muito bom de melhoria); ++ (teve um efeito significativo de melhoria); + (teve um leve efeito de melhoria); ± (não teve nenhum efeito de melhoria, mas não se tornou pior); e - (se tornou Pior).

[0086] Sixty women aged 40-60 years were randomly divided into three groups, and allowed to use liposome formulation B containing hGH from Example I (formulation 1), a comparative solution containing only the liposome (formulation 2) and a comparative buffer solution (formulation 3) first after washing your face twice a day (morning and night) for 8 weeks. In addition, there were no particular limitations on commonly used cosmetics. Then, the improvement of the dark spots was evaluated based on the user's opinion according to the following criteria. The results are shown in table 2 below. Evaluation criteria: +++ (had a very good improvement effect); ++ (had a significant improvement effect); + (had a slight improvement effect); ± (had no improvement effect, but it didn't get any worse); and - (became worse).

[0087] Como pode ser visto na tabela 2, a presente formulação teve um excelente efeito na melhoria das manchas escuras, que começou ser mostrada claramente em aproximadamente 3-5 semanas após a aplicação da formulação. Além disso, a presente composição não causou substancial a irritação à pele, por exemplo, a eritema ou coceira.[0087] As can be seen in Table 2, the present formulation had an excellent effect on the improvement of dark spots, which started to be shown clearly in approximately 3-5 weeks after the application of the formulation. In addition, the present composition did not cause substantial skin irritation, for example, erythema or itching.

Example XII: Analysis of the location of the Lipo-hGH nanoliposome formulation and its effect on the skin

[0088] A região abdominal de um rato Sprague Dawley foi dividida em seis zonas (cada círculo com um raio de 1 cm) e tratada com as seguintes amostras: 0.1% solução tampão de metíl parabeno, 0.1% lipossoma, 0.001 U hGH, 0.0001 U hGH, 0.001 U Lipo-hGH e 0.0001 U Lipo-hGH.[0088] The abdominal region of a Sprague Dawley rat was divided into six zones (each circle with a radius of 1 cm) and treated with the following samples: 0.1% methyl paraben buffer solution, 0.1% liposome, 0.001 U hGH, 0.0001 U hGH, 0.001 U Lipo-hGH and 0.0001 U Lipo-hGH.

[0089] O animal foi tratado com cada uma das amostras em uma quantidade de 50 pl duas vezes em intervalos de 24 horas sete vezes no total. Em 24 horas após o tratamento com a última amostra, o tecido foi extraído do rato. O tecido extraído foi secionado a uma espessura de 40 pm e tratado com um anticorpo primário hormônio de crescimento anti-humano policlonal de coelho (DAKO, EUA) e então com um anticorpo secundário de biotina-conjugado de coelho (VECTOR. VECTASTAIN ABC kit (RABBIT IgG), EUA) em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, o tecido secionado foi tratado com um reagente VECTASTAIN ABC (VECTOR, EUA) em temperatura ambiente por 30 minutos e sujeito a uma reação do desenvolvimento de cor com um substrato DAB (Diaminobenzidine, Sigma, EUA). 0 tecido secionado foi desidratado com álcool etílico 78%, álcool etílico 85% e álcool etílico 95% em ordem e tratado então com o xileno por 5 minutos. O tecido era fixo em uma lâmina de vidro, e a localização do hormônio de crescimento humano contido no Lipo-hGH foi observada.[0089] The animal was treated with each of the samples in an amount of 50 pl twice at 24-hour intervals seven times in total. Within 24 hours after treatment with the last sample, tissue was extracted from the rat. The extracted tissue was sectioned to a thickness of 40 pm and treated with a primary rabbit polyclonal anti-human growth hormone antibody (DAKO, USA) and then with a secondary biotin-rabbit conjugate antibody (VECTOR. VECTASTAIN ABC kit ( RABBIT IgG), USA) at room temperature for 30 minutes. Then, the sectioned tissue was treated with a VECTASTAIN ABC reagent (VECTOR, USA) at room temperature for 30 minutes and subjected to a color development reaction with a DAB substrate (Diaminobenzidine, Sigma, USA). The sectioned tissue was dehydrated with 78% ethyl alcohol, 85% ethyl alcohol and 95% ethyl alcohol in order and then treated with xylene for 5 minutes. The tissue was fixed on a glass slide, and the location of the human growth hormone contained in Lipo-hGH was observed.

[0090] Tal como demonstrado na FIG. 10a, o hormônio de crescimento humano encapsulado no presente Lipo-hGH ou o hormônio de crescimento do rato contido originalmente no rato foram encontrados nas posições consideradas como células estaminais dos folículos pilosos.[0090] As shown in FIG. 10a, the human growth hormone encapsulated in the present Lipo-hGH or the rat growth hormone originally contained in the rat were found in the positions considered to be hair follicle stem cells.

[0091] Também, segundo as indicações da FIG. 10b, a camada cutânea da pele do rato onde aplicou-se o presente Lipo-hGH (contendo 0.0001 U hGH) foi alargada, e o número de folículos pilosos na camada cutânea aumentou. Além disso, pode-se encontrar na FIG. 12 que, mesmo a solução aquosa do hGH foi aplicada à pele, o hGH alcançou a posição das protuberâncias das células estaminais nos folículos pilosos, e esta descoberta foi muito surpreendente considerando o nível técnico e o estado da técnica. Isto resulta na possibilidade de conseguir a melhoria de condições de pele, mesmo quando não somente hGH encapsulado no lipossoma, mas também uma solução aquosa de hGH é aplicado à pele.[0091] Also, according to the indications of FIG. 10b, the cutaneous layer of the rat's skin where the present Lipo-hGH was applied (containing 0.0001 U hGH) was enlarged, and the number of hair follicles in the cutaneous layer increased. In addition, it can be found in FIG. 12 that even the aqueous solution of hGH was applied to the skin, hGH reached the position of stem cell protuberances in hair follicles, and this discovery was very surprising considering the technical level and the state of the art. This results in the possibility of achieving improvement in skin conditions, even when not only hGH encapsulated in the liposome, but also an aqueous solution of hGH is applied to the skin.

Example XIII: Analysis of the effect of the nanoliposome formulation Lipo-hGH on rat skin

[0092] O efeito da presente formulação nanolipossoma Lipo-hGH (preparada no exemplo I) na pele dos ratos ICR foi analisado pelo manchamento de H&E (Hematoxilina & eosina). Para esta finalidade, após ter removido os pelos da parte lombar dos ratos ICR, as regiões lombares divididas no que diz respeito à vértebra foram tratadas com um grupo de controle e o presente Lipo- hGH em intervalos de 4 horas por 2 semanas: grupo 1 (n=3); grupo não tratado 2 (n=3); um grupo (n=3) tratado com o lipossoma/0.1 U do presente Lipo-hGH; o grupo 3 (n=3) tratado com o lipossoma/0.01 U do presente Lipo-hGH; o grupo 4 (n=3) tratado com o lipossoma/0.001 U do presente Lipo-hGH. Após 2 semanas do tratamento, os tecidos foram extraídos dos ratos. Os tecidos extraídos foram dispostos em blocos de parafina e secionados à uma espessura de 4pm, e os tecidos secionados foram dispostos em uma lâmina de vidro. Então, as seções foram desparafinadas e tratadas com uma solução de hematoxileno a temperatura ambiente por 10 minutos e então com uma solução de eosina a temperatura ambiente por 1 minuto. Em seguida, as seções foram desidratadas com álcool etílico 78%, álcool etílico 85%, álcool etílico 95% e álcool etílico 100% em ordem e tratadas então com o xileno por 5 minutos. Os tecidos foram imobilizados, e os tecidos manchados foram observados então sob um microscópio.[0092] The effect of the present Lipo-hGH nanoliposome formulation (prepared in example I) on the skin of the ICR mice was analyzed by H&E staining (Hematoxylin & eosin). For this purpose, after removing the hair from the lumbar part of the ICR rats, the lumbar regions divided with respect to the vertebra were treated with a control group and the present Lipo-hGH at 4-hour intervals for 2 weeks: group 1 (n = 3); untreated group 2 (n = 3); a group (n = 3) treated with the liposome / 0.1 U of the present Lipo-hGH; group 3 (n = 3) treated with the liposome / 0.01 U of the present Lipo-hGH; group 4 (n = 3) treated with the liposome / 0.001 U of the present Lipo-hGH. After 2 weeks of treatment, tissues were extracted from the rats. The extracted tissues were arranged in paraffin blocks and sectioned at a thickness of 4pm, and the sectioned tissues were arranged on a glass slide. Then, the sections were dewaxed and treated with a hematoxylene solution at room temperature for 10 minutes and then with an eosin solution at room temperature for 1 minute. Then, the sections were dehydrated with 78% ethyl alcohol, 85% ethyl alcohol, 95% ethyl alcohol and 100% ethyl alcohol in order and then treated with xylene for 5 minutes. The tissues were immobilized, and the stained tissues were then observed under a microscope.

[0093] Como representado na FIG. 11a, a proliferação das células na camada epidérmica da pele tratada com a presente formulação de nanolipossoma Lipo-hGH foi extremamente aumentada, e a remodelação de tecidos conectivos na camada cutânea ocorreu para formar tecidos conectivos mais compactos. A FIG. 11b é uma fotografia tirada em ampliação 400x e mostra claramente que a remodelação de tecidos conectivos na camada cutânea ocorreu.[0093] As shown in FIG. 11a, the proliferation of cells in the epidermal layer of the skin treated with the present formulation of nano-liposome Lipo-hGH was extremely increased, and the remodeling of connective tissues in the skin layer occurred to form more compact connective tissues. FIG. 11b is a photograph taken at 400x magnification and clearly shows that the remodeling of connective tissues in the skin layer has occurred.

Example XIV: Analysis of the effect of the Lipo-hGH nanoliposome formulation on artificial skin

[0094] Neoderm-EDTM (Tego Science, Coréia do Sul) foi usado para analisar o efeito da presente formulação nanolipossoma Lipo-hGH na pele artificial. Neoderm-EDTM é um modelo de pele humana para testes in vitro e consiste em uma matriz epidérmica e cutânea. Os grupos de teste foram os seguintes: grupo 1 não tratado; o grupo 2 tratado somente com a solução tampão; os grupos 3 e 4 tratados com o lipossoma; e os grupos 5 e 6 tratados com 0.001 unidades e 0.01 unidades, respectivamente, do presente Lipo-hGH. A inclusão de parafina e manchamento H&E foram executados na mesma maneira que no exemplo acima. Finalmente, os tecidos manchados foram observados sob um microscópio.[0094] Neoderm-EDTM (Tego Science, South Korea) was used to analyze the effect of the present lipo-hGH nanoliposome formulation on artificial skin. Neoderm-EDTM is a model of human skin for in vitro testing and consists of an epidermal and skin matrix. The test groups were as follows: group 1 untreated; group 2 treated only with the buffer solution; groups 3 and 4 treated with the liposome; and groups 5 and 6 treated with 0.001 units and 0.01 units, respectively, of the present Lipo-hGH. Paraffin inclusion and H&E staining were performed in the same manner as in the example above. Finally, the stained tissues were observed under a microscope.

[0095] Segundo as indicações da FIG. 12, a proliferação das células na camada de queratinocito da Neoderm-EDTM tratada com a presente formulação nanolipossoma Lipo-hGH foi feita ativamente.[0095] According to the indications of FIG. 12, the proliferation of cells in the keratinocyte layer of Neoderm-EDTM treated with the present formulation nanoliposome Lipo-hGH was actively carried out.

[0096] Tendo descrito exemplos específicos da presente invenção, deve ser compreendido que tais exemplos são somente realizações preferidas e não devem ser interpretados como limitação do escopo da invenção. Conseqüentemente, o escopo real da invenção pode ser determinado pelas reivindicações anexas e por seus equivalentes.[0096] Having described specific examples of the present invention, it should be understood that such examples are only preferred embodiments and should not be construed as limiting the scope of the invention. Consequently, the actual scope of the invention can be determined by the attached claims and their equivalents.

Claims

1. COMPOSITION FOR TOPICAL SKIN ADMINISTRATION to improve skin conditions, characterized by the fact that it comprises human growth hormone as an active ingredient, in which the human growth hormone is encapsulated in a nanoliposome with an average particle size of 50-500 nm.

2. COMPOSITION according to claim 1, characterized by the fact that the nanoliposome has a particle size of 50-250 nm.

3. COMPOSITION according to claim 1, characterized by the fact that the condition of the skin is acne, wrinkles, dark spots, skin elasticity, hair growth, skin aging, skin moisture or proliferation of skin stem cells.

4. COMPOSITION according to claim 1, characterized in that the composition is a cosmetic or pharmaceutical composition.

5. METHOD FOR IMPROVING THE SKIN CONDITIONS of a human being, characterized in that it comprises the topical administration to human skin of the composition as defined in any one of claims 1 to 4 comprising human growth hormone as an active ingredient.