BRPI0606609A2 - bactéria produtora de l-aminoácido da famìlia enterobacteriaceae, e, método para produzir l-aminoácido - Google Patents

Abstract

BACTéRIA PRODUTORA DE L-AMINOáCIDO DA FAMìLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, MéTODO PARA PRODUZIR L-AMINOáCIDO. é fornecido um método para produzir um L-aminoácido usando uma bactéria da familia Enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia ou Pan toea, tendo a via de biossíntese do glicogênio interrompida.

Description

"BACTÉRIA PRODUTORA DE L-AMINOÁCIDO DA FAMÍLIAENTER OBA CTERIA CEAE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L- AMINOÁCIDO"

Campo Técnico

A presente invenção se refere à indústria microbiológica, eespecificamente a um método para produzir um L-aminoácido usando umabactéria da família Enterobacteriaceae, em que a via de biossíntese doglicogênio foi interrompida.

Arte de Fundo Glicogênio representa a principal forma de carbonoarmazenado para Escherichia coli e muitos outros procariotos, e fornece umsubstrato prontamente metabolizado para energia de manutenção.Acumulação de glicogênio em Escherichia coli é inversamente relacionada àtaxa de crescimento e ocorre mais ativamente quando células entram na faseestacionaria. Os níveis das três enzimas biossintéticas passam por mudançascorrespondentes sob estas condições, sugerindo que controle genético debiossíntese de enzimas pode responder por pelo menos parte da regulação(Preiss, J., Annu. Rev. Microbiol. 38, 419-458 (1984)). Em Escherichia coli,os genes estruturais para biossíntese de glicogênio são agrupados em operonsadjacentes - glgBX e glgCAP. Interessantemente, os genes biossintético(glgCA) e degradativo (glgP) de glicogênio são localizados juntos em umagrupamento, possivelmente para facilitar a regulação destes sistemas in vivo(Romeo, T., Gene. 70(2), 363-76 (1988)). O gene glgC é o gene estruturalpara glicose-1-fosfato adenililtransferase. Sinônimos para glicose-1-fosfatoadenililtransferase são ADP-glicose sintase, ADP-glicose pirofosforilase,ADP: a-D-glicose-1-fosfato adenililtransferase, proteína GlgC.

Glicose-1-fosfato adenililtransferase (EC 2.7.7.27) é umaenzima alostérica na via biossintética do glicogênio de eubactérias. Entre asbactérias entéricas, glicose-1-fosfato adenililtransferase é regulada porintermediários glicolíticos com frutose 1,6- bifosfato como o ativador e AMP,ADP, e Pj como inibidores. A enzima catalisa a síntese de ADP glicose e PPj apartir de glicose 1-fosfato e ATP. Esta reação é a primeira etapa única embiossíntese bacteriana de glicogênio.

É conhecido que o sistema regulador de armazenamento decarbono de Escherichia coli controla a expressão de genes envolvidos emmetabolismo de carboidrato e mobilidade celular. Ligação de CsrA atranscritos de glgCAP inibe metabolismo de glicogênio promovendodecaimento de mRNA de glgCAP. RNA de CsrB funciona como um antagonista de CsrA seqüestrando sua proteína e prevenindo sua ação (Baker,CS. et al, Mol. Microbiol., 44(6), 1599-610 (2002)).

O operon glgCAP está sob o controle positivo de AMP cíclico(cAMP) e da proteína de receptor cAMP (CRP). Tanto o gene cyacodificando adenilato ciclase (EC 4.6.1.1) como o gene crp codificando CRPsão requeridos para síntese ótima de glicogênio (Fletterick, RJ. and Madsen,N.B., Annu. Rev. Biochem., 49, 31-61 (1980)). CRP se liga a um sítiolocalizado anteriormente ao gene glgC. Síntese de glicogênio em E. colitambém é positivamente regulada por ppGpp, que estimula a transcrição dooperon glgCAP (Preiss. J., and Romeo, T., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 47,299-329(1994)).

Usando uma biblioteca cromossômica aleatória mini-Mu eselecionando por super-produção de glicogênio, um novo gene (glgS)envolvido em síntese de glicogênio foi identificado (Hengge-Aronis, R. andFischer, D., Mol Microbiol. 6, 14, 1877-86 (1992)). Também foi mostradoque a proteína GlgS de Escherichia coli é aumentada em resposta a estressepor inanição e foi mostrado que sua superexpressão estimula síntese deglicogênio (Kozlov, G. et al, BMC Biol., 2, 1, 10 (2004)).

O substrato inicial para biossíntese de glicólise é glicose- 1-P,obtido a partir de glicose-6-P, de forma que dita via compete com glicólisepor glicose-6-P. Mas atualmente, não houveram relatos de inativar os operonsglgBX e/ou glgCAP ou inativar o gene glgS para produzir L-aminoácidos.Descrição da Invenção

Objetos da presente invenção incluem realçar a produtividade de cepas produzindo L-aminoácido e fornecer um método para produzir umL-aminoácido usando estas cepas.

Os objetos acima foram atingidos descobrindo que inativaçãodos operons glgBX e/ou glgCAP pode realçar produção de L-aminoácidos, talcomo L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-leucina, L-histidina, L-ácido glutâmico, L-fenilalanina, L-triptofano, L-prolina, e L-arginina.

A presente invenção fornece uma bactéria da famíliaEnterobacteriaceae tendo uma capacidade aumentada para produziraminoácidos, tal como L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-leucina, L-histidina,L-ácido glutâmico, L-fenilalanina, L-triptofano, L-prolina, e L-arginina.

É um objeto da presente invenção fornecer uma bactériaprodutora de L-aminoácido- da família Enterobacteriaceae, caracterizadapelo fato de que a bactéria foi modificada de forma que a via de biossíntesedo glicogênio é interrompida.

E um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactéria como descrito acima, caracterizada pelo fato de que a via de biossíntese doglicogênio é interrompida por atenuação de expressão dos operons glgBX douglgCAP.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, caracterizada pelo fato de que a via de biossíntese do glicogênio é interrompida por inativação dos operons glgBX e/ou glgCAP.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, caracterizada pelo fato de que a inativação dos operonsglgBX e/ou glgCAP é realizada por deleção de pelo menos um geneselecionado a partir de um grupo consistindo de glgB, glgX, glgC e glgA,glgP, e combinações destes.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que a via de biossíntese do glicogênio éinterrompida por atenuação de expressão do gene glgS.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que a via de biossíntese do glicogênio éinterrompida por inativação do gene glgS.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que dito L-aminoácido é selecionado a partir dogrupo consistindo de um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não aromático.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que dito L-aminoácido aromático é selecionado apartir do grupo consistindo de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a bactériacomo descrito acima, em que dito L-aminoácido não aromático é selecionadoa partir do grupo consistindo de L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina,L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-glicina, L-serina, L-alanina,L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, eL-arginina.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer a métodopara produzir um L-aminoácido compreendendo:

- cultivar a bactéria como descrito acima em um meio paraproduzir e excretar L-aminoácido no meio, e

- coletar dito L-aminoácido do meio.É um objeto adicional da presente invenção fornecer o métodocomo descrito acima, em que dito L-aminoácido é selecionado a partir dogrupo consistindo de um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido nãoaromático.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer o métodocomo descrito acima, em que dito L-aminoácido aromático é selecionado apartir do grupo consistindo de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

É um objeto adicional da presente invenção fornecer o métodocomo descrito acima, em que dito L-aminoácido não aromático é selecionado a partir do grupo consistindo de L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina,L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-glicina, L-serina, L-alanina,L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, eL-arginina.

Breve Descrição de Ilustrações

Figura 1 mostra as posições relativas de iniciadores glgCL eglgCR em plasmideo pACYC184, que foram usadas para amplificação dogene cat.

Figura 2 mostra a construção do fragmento de DNAcromossômico contendo o gene glgC inativado.

Figura 3 mostra a construção do fragmento de DNAcromossômico contendo os operons glgBXe glgCAP inativados.Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

A presente invenção é descrita em detalhe abaixo.

1. Bactéria da presente invenção

A bactéria da presente invenção é uma bactéria produtora deL-aminoácido da família Enterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de que abactéria foi modificada de forma que a via de biossíntese do glicogênio éinterrompida.

Na presente invenção, "bactéria produtora de L-aminoácido"significa uma bactéria que tem uma capacidade para produzir e excretar L-aminoácido em um meio, quando a bactéria é cultivada no meio.

O termo "bactéria produtora de L-aminoácido" como usadoneste lugar também significa uma bactéria que é capaz de produzir e causaracumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura em uma quantidademaior do que uma cepa tipo selvagem ou parental de E. coli, tal como E. coliK-12, e preferivelmente significa que o microorganismo á capaz de causaracumulação em um meio de uma quantidade não menor do que 0,5 g/L, maispreferivelmente não menor do que 1,0 g/L, do L-aminoácido alvo. O termo"L-aminoácidos" inclui L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácidoaspártico, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, L-glicina, L-histidina,L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L-valina.

O termo "L-aminoácido aromático" compreende L- fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano. O termo "L-aminoácido nãoaromático" compreende L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, eL-arginina. L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-leucina, L-histidina, L-ácido glutâmico, L-fenilalanina, L-triptofano, L-prolina e L-arginina sãoparticularmente preferidos.

A família Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencendo aosgêneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea,Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella Yersinia, etc. Especificamente, aquelas classificadas na Enterobacteriaceaede acordo com a taxonomia usada no banco de dados do NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock) podem ser usadas. Uma bactériapertencendo ao gênero de Escherichia ou Pantoea é preferida.

A frase "uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia"significa que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com aclassificação conhecida por uma pessoa versada na arte de microbiologia.

Exemplos de uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia como usado napresente invenção incluem, mas não são limitados a, Escherichia coli (E.colí).

A bactéria pertencendo ao gênero Escherichia que pode serusada na presente invenção não é particularmente limitada, entretanto por exemplo, bactérias descritas por Neidhardt, F.C. et al. {Escherichia coli andSalmonella typhimurium, American Society for Microbiology, WashingtonD.C., 1208, Tabela 1) são abrangidas pela presente invenção.

A frase "uma bactéria pertencendo ao gênero Pantoea"significa que a bactéria é classificada no gênero Pantoea de acordo com aclassificação conhecida por uma pessoa versada na arte de microbiologia.Algumas espécies de Enterobacter agglomerans foram recentemente re-classificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartiiou as semelhantes com base em análise de seqüência de nucleotídeos de 16SrRNA, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)). Tais cepas são abrangidas por "bactérias pertencendo ao gênero Pantoea".

A frase "bactéria foi modificada para ter a via de biossíntesedo glicogênio interrompida" significa que a bactéria foi modificada de umamaneira tal que a bactéria modificada tem uma capacidade reduzida parasintetizar glicogênio se comparado com uma bactéria não modificada ou é incapaz de sintetizar e acumular glicogênio. Interrupção de via biossintéticado glicogênio pode ser realizada por atenuação de expressão de genescodificando enzimas envolvidas em biossíntese de glicogênio, tal como GlgB,GlgX, GlgC, GlgA, GlgP, e GlgS, e é preferivelmente realizada porinativação de ditos genes.A frase "atenuação de expressão dos operons glgBX e/ouglgCAP" ou "atenuação de expressão do gene g/gS"significa que o operon ougene alvo é modificado de uma maneira tal que o operon ou gene modificadocodifica uma(s) proteína(s) mutante(s) que tem (têm) uma atividadediminuída. A frase "inativação dos operons glgBX e/ou glgCAP" ou"inativação do gene glgS" significa que tal operon ou gene modificadocodifica uma(s) proteína(s) completamente inativa(s). Também é possível quea região modificada de DNA seja incapaz de expressar naturalmente o(s)gene(s) devido à deleção de uma parte do(s) gene(s), à mudança do quadro deleitura do(s) gene(s), à introdução de mutação(ões) de sentido incorreto/semsentido, ou à modificação de uma região adjacente do(s) gene(s), incluindoseqüências controlando expressão de gene, tal como promotor(es),intensificador(es), atenuador(es), sítio(s) de ligação de ribossomo, etc.

O nível de expressão gênica pode ser estimado medindo aquantidade de mRNA transcrito a partir do gene usando vários métodosconhecidos incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativo, e ossemelhantes. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medidapor métodos conhecidos incluindo SDS-PAGE seguido por ensaio deimmunoblotting (análise western blotting) e os semelhantes.

O gene glgC codifica glicose-1-fosfato adenililtransferase(sinônimo - B3430). O gene glgC (gi: 16131304; nucleotídeoscomplementares aos nucleotídeos 3566056 a 3567351 no número de acessodo GenBank NC_000913.2; SEQ ID NO: 1) é localizado entre os genes glgAe glgXno cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene glgC e a seqüência de aminoácidos da glicose-1-fosfato adenililtransferasecodificada pelo gene glgC são mostradas em SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2,respectivamente.

O gene glgA codifica uma subunidade de glicogênio sintase(sinônimo - B3429). O gene glgA (posições de nucleotídeos: 3.566.056 a3.564.623; no. de acesso do GenBank NC_000913.2; gi: 49175990) élocalizado entre os genes glgP e glgC no cromossomo de E. coli K-12. Aseqüência de nucleotídeos do gene glgA e a seqüência de aminoácidos dasubunidade de glicogênio sintase codificada pelo gene glgA são mostradas em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente.

O gene glgP codifica uma subunidade de glicogêniofosforilase / glicogênio-maltotetraose fosforilase (sinônimos - B3428, GlgY).O gene glgP (posições de nucleotídeos: 3.564.604 a 3.562.157; no. de acessodo GenBank NC_000913.2; gi: 49175990) é localizado entre os genes yzgL eglgA no cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do geneglgP e a seqüência de aminoácidos da subunidade de glicogênio fosforilase /glicogênio-maltotetraose fosforilase codificada pelo gene glgP são mostradasem SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectivamente.

O gene glgX codifica glicogênio fosforilase-dextrina limite a- 1,6-glicohidrolase (sinônimos - B3431, GlyX). O gene glgX (posições denucleotídeos: 3.569.342 a 3.567.369; no. de acesso do GenBankNC_000913.2; gi: 49175990) é localizado entre os genes glgC e glgB nocromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene glgX e aseqüência de aminoácidos da glicogênio fosforilase-dextrina limite a-1,6- glicohidrolase codificada pelo gene glgX são mostradas em SEQ ID NO: 15 eSEQ ID NO: 16, respectivamente.

O gene glgB codifica uma enzima de ramificação doglicogênio (sinônimo - B3432). O gene glgB (posições de nucleotídeos:3.571.525 a 3.569.339; no. de acesso do GenBank NC_000913.2; gi:49175990) é localizado entre os genes glgX e asd no cromossomo de E. coliK-12. A seqüência de nucleotídeos do gene glgB e a seqüência deaminoácidos da enzima de ramificação do glicogênio codificada pelo geneglgB são mostradas em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, respectivamente.

O glgS gene codifica uma proteína dependente de rpoS debiossíntese de glicogênio (sinônimo - B3049). O gene glgS (posições denucleotídeos: 3.189.961 a 3.189.731; no. de acesso do GenBankNC_000913.2; gi: 49175990) é localizado entre os ORFs yqil e yqif nocromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene glgS e aseqüência de aminoácidos da proteína dependente de rpoS de biossíntese deglicogênio codificada pelo gene glgS são mostradas em SEQ ID NO: 19 e SEQID NO:20, respectivamente.

Uma vez que podem haver algumas diferenças em seqüênciasde DNA entre os gêneros ou cepas da família Enterobacteriaceae, o geneglgC a ser deletado no cromossomo não é limitado ao gene mostrado em SEQID No:l, mas pode incluir um gene homólogo de SEQ ID No:l. Portanto, avariante de proteína codificada pelo gene glgC pode ter uma homologia denão menos do que 80%, preferivelmente não menos do que 90%, e o maispreferivelmente não menos do que 95%, com respeito à seqüência deaminoácidos inteira codificada mostrada em SEQ ID NO. 2, contanto que aatividade de glicose-1-fosfato adenililtransferase antes de inativação sejamantida.

Além disso, o gene glgC gene pode ser uma variante quehibridiza sob condições estringentes com a seqüência de nucleotídeosmostrada em SEQ ID NO: 1, ou uma sonda que pode ser preparada a partir daseqüência de nucleotídeos, contanto que ela codifique uma 1-fosfatoadenililtransferase antes de inativação. "Condições estringentes" incluemaquelas sob as quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendohomologia de não menos do que 60%, preferivelmente não menos do que70%, mais preferivelmente não menos do que 80%, e ainda maispreferivelmente não menos do que 90%, e o mais preferivelmente não menosdo que 95% é formado e um híbrido não específico, por exemplo, um híbridotendo homologia inferior do que a acima não é formado. Por exemplo,condições estringentes são exemplificadas lavando uma vez, preferivelmenteduas ou três vezes em uma concentração de sal correspondendo a lxSSC,0,1% de SDS, preferivelmente 0,1><SSC, 0,1% de SDS a 60°C. Ocomprimento da sonda pode ser adequadamente selecionado dependendo dascondições de hibridização, e normalmente é 100 bp a 1 kbp.

A expressão similar como descrito acima para o gene glgCpode ser aplicada para as variantes de outros genes dos operons glgBX eglgCAP.

Inativação do gene pode ser realizada por métodosconvencionais, tal como tratamento por mutagênese usando radiação UV ou tratamento por nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina),mutagênese sítio dirigida, ruptura gênica usando recombinação homóloga,ou/e mutagênese por inserção-deleção (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 2000, 97:12: 5978-83) e (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 2000, 97:12: 6640-45) também chamado "Integração vermelho-dirigida".

Atividade de glicose-1-fosfato adenililtransferase codificadapelo gene glgC pode ser medida pelo método descrito por, por exemplo,Haugen, T.H. et al (J. Biol. Chem. 251 (24), 7880-5 (1976)). Assim, aatividade decrescente ou ausente de glicose-1-fosfato adenililtransferase na bactéria de acordo com a presente invenção pode ser determinada quandocomparada com a bactéria não modificada parental.

Atividade de glicogênio sintase codificada pelo gene glgApode ser medida pelo método descrito por, por exemplo, Fox, J. et al(Methods Enzymol., 28, 539-544 (1972)). Assim, a atividade decrescente ou ausente de glicogênio sintase na bactéria de acordo com a presente invençãopode ser determinada quando comparada com a bactéria não modificadaparental.

Atividade de glicogênio fosforilase / glicogênio-maltotetraosefosforilase codificada pelo gene glgP pode ser medida pelo método descritopor, por exemplo, Graves, D.J. and Wang, J.H. (The Enzymes, 7 (3rd ed.),435-482 (1972)). Assim, a atividade decrescente ou ausente de glicogêniofosforilase / glicogênio-maltotetraose fosforilase na bactéria de acordo com apresente invenção pode ser determinada quando comparada com a bactéria não modificada parental.

Atividade de glicogênio fosforilase-dextrina limite a-1,6-glicohidrolase codificada pelo gene glgX pode ser medida pelo métododescrito por, por exemplo, Jeanningros, R. et al (Biochim Biophys Acta,438(1), 186-199 (1976)). Assim, a atividade decrescente ou ausente de glicogênio fosforilase-dextrina limite a-l,6-glicohidrolase na bactéria deacordo com a presente invenção pode ser determinada quando comparadacom a bactéria não modificada parental.

Atividade de enzima de ramificação de glicogênio codificadapelo gene glgB pode ser medida pelo método descrito por, por exemplo,

Illingworth, B.B. and Brown, D.H. (Methods Enzymol., 8, 395-403 (1966)).Assim, a atividade decrescente ou ausente de enzima de ramificação deglicogênio na bactéria de acordo com a presente invenção pode serdeterminada quando comparada com a bactéria não modificada parental.

Atividade de proteína dependente de rpoS de biossíntese de glicogênio codificada pelo gene glgS pode ser detectada por complementaçãode mutação nula de glgS que inibe síntese de glicogênio como descrito por,por exemplo, Hengge-Aronis, R, and Fischer, D. (Mol. Microbiol., 6, 14,1877-1886 (1992)). Assim, a atividade decrescente ou ausente de proteínadependente de rpoS de biossíntese de glicogênio na bactéria de acordo com a presente invenção pode ser determinada quando comparada com a bactérianão modificada parental.

Métodos para preparação de DNA de plasmídeo, digestão eligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo comoiniciador e os semelhantes podem ser métodos habituais bem conhecidos poralguém versado na arte. Estes métodos são descritos, por exemplo, emSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning ALaboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989).

Bactérias produtoras de L-aminoácido

Como uma bactéria da presente invenção, que é modificadapara inativar os operons glgBX q/ou glgCAP ou o gene glgS, bactérias que sãocapazes de produzir L-aminoácidos ou aromáticos ou não aromáticos podemser usadas.

A bactéria da presente invenção pode ser obtida inativando osoperons glgBX e/ou glgCAP ou o gene glgS em uma bactéria queinerentemente tem a capacidade de produzir L-aminoácidos.Alternativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida concedendoa capacidade de produzir L-aminoácidos a uma bactéria já tendo os operonsglgBX e/ou glgCAP ou o gene glgS inativado.

Bactérias produtoras de L-treonina

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasprodutoras de L-treonina da presente invenção incluem, mas não sãolimitados a, cepas pertencendo ao gênero Escherichia, tal como E. coli TDH- 6/pVIC40 (VKPM B-3996) (US No. 5.175.107, US No. 5.705.371), E. coliNRRL-21593 (US No. 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (US No.5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (US No. 5.376.538), E.coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em Russo), 14, 947-956 (1978)), E.coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), e os semelhantes.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC gene, assim como éassimiladora de sacarose, e o gene ilvA tem uma mutação defeituosa. Estacepa também tem uma mutação no gene rhtA, que concede resistência a altasconcentrações de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 contém oplasmídeo pVIC40 que foi obtido inserindo um operon thrA*BC que incluium gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thrAmutante codifica aspartoquinase homosserina desidrogenase I que teminibição por retroalimentação substancialmente dessensibilizada por treonina.A cepa B-3996 foi depositada em 10 de Novembro de 1987 no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow,Russian Federation) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foidepositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd,. 1) em 7 de Abril de1987 sob o número de acesso B-3996.

Preferivelmente, a bactéria da presente invenção éadicionalmente modificada para realçar expressão de um ou mais dosseguintes genes:

o gene thrA mutante que codifica para aspartoquinasehomosserina desidrogenase I resistente a inibição por retroalimentação portreonina;

o gene thrB que codifica para homosserina quinase;o gene thrC que codifica para treonina sintase;

- o gene rhtA que codifica para uma proteína transmembranahipotética;

- o gene asd que codifica para aspartato-/3-semialdeídodesidrogenase; e

- o gene aspC que codifica para aspartato aminotransferase(aspartato transaminase);

O gene thrA que codifica aspartoquinase homosserina desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (posições de nucleotídeos337 a 2799, acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA élocalizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O genethrB que codifica homosserina quinase de Escherichia coli foi elucidado(posições de nucleotídeos 2801 a 3733, acesso do GenBank NC_000913.2, gi:49175990). O gene thrB é localizado entre os genes thrA e thrC nocromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica treonina sintase deEscherichia coli foi elucidado (posições de nucleotídeos 3734 a 5020, acessodo GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrC é localizado entre ogene thrB e o quadro de leitura aberto de yaaXno cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon de treonina.

Um gene thrA mutante que codifica para aspartoquinasehomosserina desidrogenase I resistente a inibição por retroalimentação portreonina, assim como, os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon a partir de um plasmídeo pVIC40 bem conhecido que é apresentado nacepa de E. coli produtora de treonina VKPM B-3996. Plasmídeo pVIC40 édescrito em detalhe em US No. 5.705.371.

O gene rhtA existe em 18 min no cromossomo de E. coli pertodo operon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte deglutamina. O gene rhtA é idêntico a ORF1 (gene ybiF, posições denucleotídeos 764 a 1651, número de acesso do GenBank AAA218541,gi:440181) e localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade expressandouma proteína codificada pelo ORF1 foi designada o gene rhtA (rht: resistênciaa homosserina e treonina). Também, foi revelado que a mutação rhtA23 é umasubstituição de A por G na posição -1 com respeito ao códon de início ATG(RESUMOS do 17th International Congress of Biochemistry and MolecularBiology em conjugação com Annual Meeting of the American Society forBiochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia August 24-29, 1997, resumo No. 457, EP 1013765 A).

O gene asd de E.coli já foi elucidado (posições de nucleotídeos3572511 a 3571408, acesso do GenBank NC 000913.1, gi: 16131307), e podeser obtido por PCR (reação em cadeia da polimerase; referir a White, T.J. etai, Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados baseadosna seqüência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outrosmicroorganismos podem ser obtidos de uma maneira similar.

Também, o gene aspC de E.coli já foi elucidado (posições denucleotídeos 983742 a 984932, acesso do GenBank NC_000913.1,gi: 16128895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outrosmicroorganismos podem ser obtidos de uma maneira similar.

Bactérias produtoras de L-lisina

Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina pertencendo aogênero Escherichia incluem mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-lisina inibe crescimento de bactérias pertencendo aogênero Escherichia, mas esta inibição é completamente ou parcialmentedessensibilizada quando L-lisina coexiste em um meio. Exemplos do análogode L-lisina incluem, mas não são limitados a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), 7-metil-lisina, a-clorocaprolactam e assimpor diante. Mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem serobtidos sujeitando bactérias pertencendo ao gênero Escherichia sl umtratamento por mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos decepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem Escherichia coliAJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; veja US No. 4.346.170) eEscherichia coli VL611. Nestes microorganismos, inibição porretroalimentação de aspartoquinase por L-lisina é dessensibilizada.

A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtorade L-lisina de Escherichia coli. Esta cepa bacteriana foi criada conferindoresistência AEC à cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12. Acepa resultante foi designada cepa AJ13069 de Escherichia coli e foidepositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology (atualmente National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology, International PatentOrganism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 6 de Dezembro de 1994 e recebeu umnúmero de acesso de FERM P-14690. Então, ela foi convertida para umdepósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 deSetembro de 1995, e recebeu um número de acesso de FERM BP-5252 (USNo. 5.827.698).

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-lisina da presente invenção também incluem cepas nas quais expressãode um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-lisina érealçada. Exemplos das enzimas envolvidas em biossíntese de L-lisinaincluem, mas não são limitados a, dihidrodipicolinato sintase (dapA),aspartoquinase (lysC), dihidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelatodescarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (US No.6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeídodesidrogenase (asd), nicotinamida adenina dinucleotídeo transhidrogenase(pntAB), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A).

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-lisina da presente invenção também incluem cepas tendo atividadediminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa uma reação para gerar umcomposto outro do que L-lisina se ramificando a partir da via biossintética deL-lisina. Exemplos das enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto outro do que L-lisina se ramificando a partir da via biossintética deL-lisina incluem homosserina desidrogenase e lisina descarboxilase (US No. 5.827.698).

Bactérias produtoras de L-cisteína

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-cisteína da presente invenção incluem, mas não são limitados a, cepaspertencendo ao gênero Escherichia, tal como E. coli JM15 que é transformadacom diferentes alelos de cysE codificando para serina acetiltransferasesresistentes a retroalimentação (US No. 6.218.168, pedido de patente Russa2003121601); E. coli W3110 tendo super-expressado genes que codificamproteínas adequadas para secretar substância tóxicas para células (US No.5.972.663); cepas de E. coli tendo diminuída atividade de cisteínadessulfohidrase (JP11155571A2); E. coli W3110 com aumentada atividade deum regulador transcricional positivo para regulador de cisteína codificadopelo gene cysB (WO0127307A1), e os semelhantes.

Bactérias produtoras de L-leucina

Exemplos de cepas parentais derivando bactérias produtoras deL-leucina da presente invenção incluem, mas não são limitados a, cepaspertencendo ao gênero Escherichia, tal como cepas de E. coli resistentes aleucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, US 6.124.121)) ou análogosde leucina incluindo como P-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina,5,5,5-trifluorleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); cepas E. coli obtidaspelo método de engenharia de gene descrito em WO96/06926; E. coli H-9068(JP 8-70879 A), e os semelhantes.

A bactéria da presente invenção pode ser melhorada realçandoa expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-leucina.Exemplos incluem genes do operon leuABCD, que são preferivelmenterepresentados por um gene leuA mutante codificando para isopropilmalatosintase livre de inibição por retroalimentação por L-leucina (US 6.403.342).

Em adição, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada realçando aexpressão de um ou mais genes codificando para proteínas que excretam L-aminoácido de uma célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem osgenes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias produtoras de L-histidina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-histidina da presente invenção incluem, mas não são limitados a, cepaspertencendo ao gênero Escherichia, tal como cepa 24 de E. coli (VKPM B-5945, RU2003677); cepa 80 de E. coli (VKPM B-7270, RU2119536); E. coliNRRL B-12116 - B12121 (US No. 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (US No. 6.344.347); E. coli H-9341(FERM BP-6674) (EP 1085087); E. coli AI80/pFM201 (US No. 6.258.554) eos semelhantes.

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-histidina da presente invenção também incluem cepas nas quaisexpressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-histidina é realçada. Exemplos das enzimas biossintéticas de L-histidinaincluem ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP ciclohidrolase(hisl), fosforibosil-ATP pirofosfohidrolase (hisIE), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase(hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisQ, histidinol fosfatase (hisB),histidinol desidrogenase (hisD), e assim por diante.

É conhecido que os genes codificando a enzima biossintéticade L-histidina (hisG, hisBHAFI) são inibidos por L-histidina, e portanto umacapacidade de produzir L-histidina também pode ser eficientemente realçadaintroduzindo uma mutação conferindo resistência à inibição porretroalimentação em ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patentes Russas Nos.2003677 e 2119536).

Exemplos específicos de cepas tendo uma capacidade deproduzir L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048 que foramintroduzidas com um vetor carregando um DNA codificando uma enzimabiossintética de L-histidina (JP 56-005099 A), cepas de E.coli introduzidascom rht, um gene para uma exportação de aminoácido (EP 1016710A), cepa80 de E. coli concedida com sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina, e resistência a estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Russa No. 2119536), eassim por diante.

Bactérias produtoras de L-ácido glutâmico

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-ácido glutâmico da presente invenção incluem, mas não são limitados a,cepas pertencendo ao gênero Escherichia, tal como E. coli VL334thrC+ (EP1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica de L-isoleucina e L-treonina tendo mutações em genes thrC e ilvA (US No.4.278.765). Um alelo tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo métodode transdução geral usando um bacteriófago PI crescido nas células de cepaKl2 de E. coli tipo selvagem (VKPM B-7). Como um resultado, uma cepaauxotrófica de L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B-8961) foi obtida. Estacepa é capaz de produzir L-ácido glutâmico.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasprodutoras de L-ácido glutâmico da presente invenção incluem, mas não sãolimitados a, cepas nas quais expressão de um ou mais genes codificando umaenzima biossintética de L-ácido glutâmico é realçada. Exemplos das enzimasenvolvidas em biossíntese de L-ácido glutâmico incluem glutamatodesidrogenase, glutamina sintetase, glutamato sintetase, isocitratodesidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, fosfoenolpiruvatocarboxilase, piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato quinase,fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase,gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, frutosebisfosfato aldolase, fosfofrutoquinase, e glicose fosfato isomerase.

Exemplos de cepas modificadas de forma que expressão dogene de citrato sintetase, do gene de fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou dogene de glutamato desidrogenase é/são realçada(s) incluem aqueles descritosem EP 1078989A, EP 955368A, e EP 952221A.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasprodutoras de L-ácido glutâmico da presente invenção também incluem cepastendo atividade diminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa síntese deum composto outro do que L-ácido glutâmico, e se ramificando a partir deuma via de biossíntese de L-ácido glutâmico. Exemplos de tais enzimasincluem isocitrato liase, a-cetoglutarato desidrogenase, fosfotransacetilase,acetato quinase, ácido acetohidroxi sintase, acetolactato sintase, formatoacetiltransferase, lactato desidrogenase, e glutamato descarboxilase. Bactériaspertencendo ao gênero Escherichia deficientes na atividade de a-cetoglutaratodesidrogenase ou tendo uma reduzida atividade de a-cetoglutarato e métodospara obter elas são descritos em US Nos. 5.378.616 e 5.573.945.

Especificamente, estas cepas incluem as seguintes:

£.co/zW3110sucA::Kmr

E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E. coli AJ 12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr é uma cepa obtida interrompendo ogene de ce-cetoglutarato desidrogenase (daqui por diante referido como "genesucA") de E. coli W3110. Esta cepa is completamente deficiente na acetoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos de bactéria produtora de L-ácido glutâmicoincluem aqueles que pertencem ao gênero Escherichia e têm resistência a umantimetabólito de ácido aspártico. Estas cepas também podem ser deficientesna atividade de ce-cetoglutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coliAJ13199 (FERM BP-5807) (US No. 5.908.768), FFRM P-12379, queadicionalmente tem uma baixa capacidade de decomposição de L-ácidoglutâmico (US No. 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (US No. 6.110.714), e as semelhantes.

Exemplos de bactérias produtoras de L-ácido glutâmico,incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Pantoea que são deficientesna atividade de a-cetoglutarato desidrogenase ou têm uma diminuídaatividade de a-cetoglutarato desidrogenase, e podem ser obtidas comodescrito acima. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ 13356. (US No. 6.331.419). Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute ofBioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science andTechnology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 19 de Fevereiro de 1998 sobum número de acesso de FERM P-16645. Ela foi então convertida para umdepósito internacional sob as provisões de Tratado de Budapeste em 11 deJaneiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. Pantoeaananatis AJ13356 é deficiente na atividade de a-cetoglutarato desidrogenasecomo um resultado de interrupção do gene de subunidade aKGDH-El (sueA).

A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando ela foiisolada e depositada como a Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto,ela foi recentemente re-classificada como Pantoea ananatis com base emseqüenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA e assim por diante. EmboraAJ13356 tenha sido depositada no depósito acima mencionado comoEnterobacter agglomerans, para os propósitos deste relatório, elas sãodescritas como Pantoea ananatis.

Bactérias produtoras de L-fenilalanina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-fenilalanina da presente invenção incluem, mas não são limitados a,cepas pertencendo ao gênero Escherichia, tal como E.coli AJ12739(tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197); E.coli HW1089 (ATCC 55371)abrigando o gene pheA34 (US No. 5.354.672); E.coli MWEClOl-b(KR8903681); E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 eNRRL B-12147 (US No. 4.407.952). Também, como uma cepa parental, E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB]nomeada como AJ 12604 (FERM BP-3579) podem ser usadas (EP 488424BI). Além disso, bactérias produtoras de L-fenilalanina pertencendo aogênero Escherichia com uma realçada atividade da proteína codificada pelogene yedA ou o gene yddG também podem ser usadas (pedidos de patente US2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Bactérias produtoras de L-triptofano

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasprodutoras de L-triptofano da presente invenção incluem, mas não sãolimitados a, cepas pertencendo ao gênero Escherichia, tal como E. coliJP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficientesna triptofanil-tRNA sintetase codificada pelo gene trpS mutante (US No. 5.756.345); E. coli SV164 (pGH5) tendo alelo de serA codificandofosfoglicerato desidrogenase livre de inibição por retroalimentação por serinae o alelo de trpE codificando antranilato sintase livre de inibição porretroalimentação por triptofano (US No. 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44)(NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficientes naenzima triptofanase (US No. 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps na qual uma capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é realçada(WO9708333, US No. 6.319.696), e as semelhantes podem ser usadas.

Previamente, foi identificado que o gene yddG codificandouma proteína de membrana, que não está envolvido em via biossintética de nenhum L-aminoácido, e concede a um microorganismo resistência a L-fenilalanina e diversos análogos de aminoácidos quando o alelo tipo selvagemdo gene foi amplificado em um vetor de múltiplas cópias no microorganismo.Além disso, o gene yddG pode realçar produção de L-fenilalanina ou L-triptofano quando cópias adicionais são introduzidas nas células da cepaprodutora respectiva (WO03044192). Portanto é desejável que a bactériaprodutora de L-triptofano seja adicionalmente modificada para ter expressãorealçada do quadro de leitura aberto de yddG.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasprodutoras de L-triptofano da presente invenção também incluem cepas nasquais uma ou mais atividades das enzimas selecionadas a partir de antranilatosintase, fosfoglicerato desidrogenase, e triptofano sintase são realçadas. Aantranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase são ambas sujeitas ainibição por retroalimentação por L-triptofano e L-serina, de forma que uma mutação dessensibilizando a inibição por retroalimentação pode serintroduzida nestas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo uma talmutação incluem uma E. coli SV164 que abriga antranilato sintasedessensibilizado e uma cepa transformante obtida introduzindo na E. coliSV164 o plasmídeo pGH5 (WO 94/08031), que contém um gene ser A mutante codificando fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada porretroalimentação.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasprodutoras de L-triptofano da presente invenção também incluem cepas nasquais o operon de triptofano que contém um gene codificando antranilatosintase dessensibilizado foi introduzido (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, USNo. 4.371.614). Além disso, capacidade de produzir L-triptofano pode serconcedida realçando expressão de um gene que codifica triptofano sintase,entre operons de triptofano {trpBÁ). A triptofano sintase consiste desubunidades a e P que são codificadas por trpA e trpB, respectivamente.

Bactérias produtoras de L-prolina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-prolina da presente invenção incluem, mas não são limitados a, cepaspertencendo ao gênero Escherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433). A bactéria da presente invenção pode ser melhorada realçando aexpressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-prolina.Exemplos de tais genes para bactérias produtoras de L-prolina que sãopreferidos incluem o gene proB codificando para glutamato quinase da qualinibição por retroalimentação por L-prolina é dessensibilizada (DE Patent3127361). Em adição, a bactéria da presente invenção pode ser melhoradarealçando a expressão de um ou mais genes codificando para proteínasexcretando L-aminoácido a partir de célula bacteriana. Tais genes sãoexemplificados por genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, quetêm uma atividade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E.coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente Britânica 2075056), VKPMB-8012 (pedido de patente Russa 2000124295), mutantes de plasmideosdescritos em DE Patent 3127361, mutantes de plasmideos descritos porBloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), e ossemelhantes.

Bactérias produtoras de L-arginina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-arginina da presente invenção incluem, mas não são limitados a, cepaspertencendo ao gênero Escherichia, tal como cepa 237 de E. coli (VKPM B-7925) (Pedido de US 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas abrigando N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russa No. 2001112869),cepa 382 de E. coli (VKPM B-7926) (EP1170358A1), uma cepa produtora dearginina na qual gene argA codificando N-acetilglutamato sintetase éintroduzido nessa (JP 57-5693 A), e as semelhantes.

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtorasde L-arginina da presente invenção também incluem cepas nas quaisexpressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-arginina é realçada. Exemplos das enzimas biossintéticas de L-argininaincluem N-acetil-glutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase(argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetil-ornitina transaminase (argD),ornitina carbamoil transferase (argF), ácido argininosuccínico sintetase(argG), ácido argininosuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase.

2. Método da presente invençãoO método da presente invenção é um método para produzir umL-aminoácido compreendendo cultivar a bactéria da presente invenção em ummeio de cultura para produzir e excretar o L-aminoácido no meio, e coletar oL-aminoácido do meio.

Na presente invenção, o cultivo, coleta, e purificação de um L-aminoácido do meio e os semelhantes podem ser realizados de uma maneirasimilar a métodos de fermentação convencionais caracterizados pelo fato deque um aminoácido é produzido usando uma bactéria.

Um meio usado para cultura pode ser ou um meio sintético ounatural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte denitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientesque a bactéria requer para crescimento. A fonte de carbono pode incluir várioscarboidratos tal como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos.

Dependendo do modo de assimilação do microorganismo usado, álcool, incluindo etanol e glicerol, pode ser usado. Como a fonte de nitrogênio, váriossais de amônio tal como sulfato de amônia e amônio, outros compostos enitrogênio tal como aminas, uma fonte natural de nitrogênio tal comopeptona, hidrolisado de soja, e microorganismo fermentador digerido podemser usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e ossemelhantes põem ser usados. Como vitaminas, tiamina, extrato de levedura,e os semelhantes, podem ser usados.

O cultivo é preferivelmente realizado sob condições aeróbicas,tal como uma cultura agitada, e uma cultura movimentada com aeração, em uma temperatura de 20 a 40 °C, preferivelmente 30 a 38 °C. O pH da culturanormalmente é entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da culturapode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, váriasbases, e tampões. Normalmente, um cultivo de 1 a 5 dias leva a acumulaçãodo L-aminoácido alvo no meio líquido.Depois de cultivo, sólidos tal como células podem serremovidos do meio líquido por centrifugação ou filtração em membrana, eentão o L-aminoácido pode ser coletado e purificado por métodos de trocaiônica, concentração, e/ou cristalização.

Exemplos

A presente invenção será mais concretamente explicada abaixocom referência aos seguintes Exemplos não limitantes.

Exemplo 1. Construção de uma cepa com um gene glgCinativado

1. Deleção do gene glgC

Uma cepa tendo deleção do gene glgC pode ser construídapelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko, K.A. and Wanner, B.L.(Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) chamado "Integraçãovermelho-dirigida". De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR glgCL (SEQ ID NO: 3) e glgCR (SEQ ID NO: 4) complementares tanto àregião adjacente ao gene glgC como ao gene conferindo resistência aantibiótico no plasmídeo modelo podem ser construídos. O plasmídeopACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (número de acesso doGenBank/EMBL X06403) pode ser usado como um modelo em reação de PCR. Condições para PCR podem ser como segue: etapa de desnaturação a95°C por 3 min; perfil para dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 seg a50°C, 40 seg a 72°C; perfil para os últimos 25 ciclos: 30 seg a 95°C, 30 seg a54°C, 40 seg a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C.

Um produto de PCR de 1093-bp (Fig. 1) pode ser obtido e purificado em gel de agarose e pode ser usado para eletroporação de E. coliMG1655 (ATCC 700926), que contém o plasmídeo pKD46 tendo replicaçãosensível a temperatura. O plasmídeo pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner,B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:12:6640-45) inclui um fragmentode DNA de 2.154 nucleotídeos (31088-33241) de fago X (No. de acesso doGenBank J02459), e contém genes do sistema de recombinação homólogavermelho X (y, p\ genes exo) sob o controle do promotor ParaB induzível porarabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integração do produto dePCR no cromossomo de cepa MG1655.

Células eletrocompetentes podem ser preparadas como segue:uma cultura noturna de E. coli MG1655 pode ser crescida a 30°C em meio LBsuplementado com ampicilina (100 mg/l) e então diluída 100 vezes com 5 mlde meio SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) contendoampicilina e L-arabinose (1 mM). A cultura obtida pode ser crescida comaeração a 30°C para uma OD60o de «0,6 e então pode ser feitaeletrocompetente concentrando 100 vezes e lavando três vezes com H20deionizada congelada. Eletroporação pode ser realizada usando 70 ul decélulas e «100 ng do produto de PCR. Células depois de eletroporação podemser incubadas com 1 ml de meio SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning ALaboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) a 37°C por 2,5 horas e depois disso podem ser emplacadas em L-ágare crescidas a 37°C para selecionar CmR recombinantes. Então, para eliminar oplasmídeo pKD46, 2 passagens em L-ágar com Cm a 42°C podem serrealizadas e as colônias obtidas podem ser testadas por sensibilidade paraampicilina.

2. Verificação da deleção do gene glgC por PCROs mutantes, contendo a deleção do gene glgC, marcados comgene de resistência a Cm, podem ser verificados por PCR. Iniciadores locus-específicos glgCl (SEQ ID NO: 5) e glgC2 (SEQ ID NO: 6) podem serusados em PCR para verificação. Condições para verificação por PCR podemser como segue: etapa de desnaturação a 94°C por 3 min; perfil para os 30ciclos: 30 seg a 94°C, 30 seg a 54°C, 1 min a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C.O produto de PCR, que pode ser obtido na reação com a cepa parentalMG1655 glgC+ como um modelo, deve ter 1471 bp de comprimento. Oproduto de PCR, que pode ser obtido na reação com a cepa mutante MG 165 5AglgC::cat como um modelo, deve ter 1197 bp de comprimento (Fig.2).

Exemplo 2. Produção de L-glutamato por E. coli VL334thrC+-AglgC

A deleção do gene glgC no cromossomo da cepa de E. coliprodutora de L-glutamato VL334thrC+ (EP 1172433) pode ser realizada porum método habitual bem conhecido, por exemplo, por transdução Pia partirde cepa MG1655 AglgC::cat, para obter a cepa VL334thrC+-AglgC. A cepa VL334thrC+ foi depositada na Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)em 6 de Dezembro de 2004 sob o número de acesso VKPM B-8961 e entãoconvertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 8 de Dezembrode 2004.

Ambas cepas, VL334thrC+ e VL334thrC+-AglgC, podem sercrescidas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então, uma alça dascélulas pode ser transferida para tubos de teste contendo 2ml de um meio defermentação. O meio de fermentação (pH 7,2) deve conter glicose (60g/l),sulfato de amônio (25 g/l), KH2P04 (2g/l), MgS04 (1 g/l), tiamina (0,1 mg/ml), L-isoleucina (70 /ig/ml), e CaC03 (25 g/l). Glicose e CaC03 devemser esterilizados separadamente. Cultivo pode ser realizado a 30°C por 3 diascom agitação. Depois do cultivo, a quantidade de L-ácido glutâmicoproduzido pode ser determinada por cromatografia em papel (composição dafase líquida: butanol-ácido acético-água=4:l:l) com subseqüente marcaçãopor ninhidrina (1% de solução em acetona) e eluição adicional dos compostosem 50% de etanol com 0,5% de CdCl2.

Exemplo 3.

Produção de L-prolina por E. coli 702ilvA-AglgCA deleção do gene glgC no cromossomo da cepa de E. coliprodutora de L-prolina 702ilvA (VKPM B-8012, pedido de patente Russa2000124295, EP1172433) pode ser realizada por um método habitual bemconhecido como descrito acima para obter a cepa 702ilvA-AglgC. A cepa702ilvA foi depositada na Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)em 18 de Julho de 2000 sob o número de acesso VKPM B-8012.

Ambas cepas de E. coli, 702ilvA e 702ilvA-AglgC, podem sercrescidas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então estas cepaspodem ser cultivadas sob as mesmas condições que descrito acima.

Exemplo 4. Produção de L-arginina por E. coli 237-AglgC

A deleção do gene glgC no cromossomo da cepa 237 de E. coliprodutora de L-arginina (VKPM B-7925) pode ser realizada por um métodohabitual bem conhecido como descrito acima para obter a cepa 237-AglgC. Acepa 237 foi depositada na Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM) (Rússia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)em 10 de Abril de 2000 sob número de acesso VKPM B-7925 e entãoconvertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 18 de Maio de2001.

Ambas cepas de E. coli, 237 e 237-AglgC, podem ser crescidaspor 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então estas cepas podem sercultivadas sob as mesmas condições que descrito acima.

Exemplo 5. Produção de L-leucina por E. coli 57-AglgC

A deleção do gene glgC no cromossomo da cepa 57 de E. coliprodutora de L-leucina (VKPM B-7386, US 6,124,121) pode ser realizada porum método habitual bem conhecido como descrito acima para obter a cepa57-pMW-AglgC. A cepa 57 foi depositada na Russian National Collection ofIndustrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhnyproezd, 1) em 19 de Maio de 1997 sob o número de acesso VKPM B-7386.

Ambas cepas de E. coli, 57 e 57-ÁglgC, podem ser crescidaspor 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então estas cepas podem sercultivadas sob as mesmas condições que descrito acima sem adição deisoleucina no meio.

Exemplo 6. Produção de L-cisteína por E. coli JM15(ydeD)-AglgC

A deleção do gene glgC no cromossomo da cepa de E. coliprodutora de L-cisteína JM15(ydeD) pode ser realizada por um métodohabitual bem conhecido como descrito acima para obter a cepa JM15(ydeD)-AglgC.

E. coli JM15(ydeD), um derivado de E. coli JM15 (US 6.218.168), pode ser transformada com DNA tendo o gene jWe£>, que codificauma proteína de membrana e não está envolvido em uma via biossintética denenhum L-aminoácido (US 5.972.663).

Condições de fermentação para avaliação de produção de L-cisteína foram descritas em detalhe em Exemplo 6 de US 6.218.168.

Exemplo 7. Produção de L-treonina por E. coli B-3996-AglgC

A deleção do gene glgC no cromossomo da cepa de E. coliprodutora de L-treonina B-3996 (VKPM B-3996) pode ser realizada por ummétodo habitual bem conhecido como descrito acima para obter cepa B-3996-AglgC.

Ambas cepas de E. coli, B-3996 e B-3996-AglgC, podem sercrescidas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então estas cepaspodem ser cultivadas sob as mesmas condições que descrito acima.

Exemplo 8. Produção de L-lisina por E. coli AJ11442-AglgCA deleção do gene glgC no cromossomo da cepa de E. coliprodutora de L-lisina AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185) pode serrealizada por um método habitual bem conhecido como descrito acima paraobter cepa AJ11442-AglgC. A cepa AJ11442 foi depositada no FermentationResearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology (atualmenteNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology,International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 1 de Maio de 1981 erecebeu um número de acesso de FERM P-5084. Então, ela foi convertidapara um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em29 de Outubro de 1987, e recebeu um número de acesso de FERM BP-1543.

Ambas cepas de E. coli, AJ11442 e AJ11442-AglgC, podemser crescidas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então estas cepaspodem ser cultivadas sob as mesmas condições que descrito acima.

Exemplo 9. Produção de L-fenilalanina por E. coli AJ12739-AglgC

A deleção do gene glgC no cromossomo da cepa de E. coliprodutora de L-fenilalanina AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197)pode ser realizada por um método habitual bem conhecido como descritoacima para obter a cepa AJ12739-AglgC. A cepa AJ12739 foi depositada naRussian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia,117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) em 6 de Novembro de 2001 sob no.de acesso VKPM B-8197.

Ambas cepas de E. coli, AJ 12739 e AJ 12739-AglgC, podemser crescidas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então estas cepaspodem ser cultivadas sob as mesmas condições que descrito acima.

Exemplo 10. Construção de uma cepa com os operons glgBXçglgCAP inativados

1. Deleção dos operons glgBXe glgCAP

Uma cepa tendo deleção dos operons glgBX e glgCAP foiconstruída pelo método desenvolvido inicialmente por Datsenko, K.A. andWanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)chamado "Integração vermelho-dirigida". De acordo com este procedimento,os iniciadores de PCR glgBXCAPL (SEQ ID NO: 7) e glgBXCAPR (SEQ IDNO: 8) complementares tanto à região adjacente aos operons glgBXç, glgCAPcomo ao gene conferindo resistência a antibiótico no plasmídeo modelo foramconstruídos. O plasmídeo pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK)(número de acesso do GenBank/EMBL X06403) foi usado como um modeloem PCR. Condições para PCR foram descritas em detalhe em Exemplo 1.

Um produto de PCR de 1152-bp purificado em gel de agarosefoi usado para eletroporação de E. coli MG1655 (ATCC 700926) contendo oplasmídeo pKD46 tendo replicação sensível a temperatura, como descrito emExemplo 1.

2. Verificação da deleção dos operons glgBX e glgCAP por PCR

Os mutantes contendo a deleção dos operons glgBX e glgCAPe marcados com gene de resistência a Cm foram verificados por PCR.

Iniciadores locus-específicos glgBXCAPl (SEQ ID NO: 9) e glgBXCAP2

(SEQ ID NO: 10) foram usados em PCR para a verificação. Condições paraverificação por PCR foram descritas em Exemplo 1. O produto de PCR obtidona reação com a cepa parental MG1655 glgBXCAP+ como um modelo foi de9425 bp de comprimento. O produto de PCR obtido na reação com a cepamutante MG 1655 AglgBXCAP::cat como um modelo foi de 1208 bp decomprimento (Fig. 3).

Exemplo 11. Produção de L-treonina por cepa de E. coli B-3996-AglgBXCAP

Para testar o efeito de inativação dos operons glgBX e glgCAPem produção de treonina, fragmentos de DNA do cromossomo da cepa de E.coli MG1655 AglgBXCAP::cat descrita acima foram transferidos para a cepa de E. coli produtora de treonina B-3996 por transdução PI (Miller, J.H.

Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY).

Ambas cepas de E. coli, B-3996 e B-3996-AglgBXCAP, foramcrescidas por 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Para obter uma culturaseminal, as cepas foram crescidas em um agitador rotatório (250 rpm) a 32°Cpor 18 horas em tubos de teste de 20x200-mm contendo 2 ml de L-caldosuplementado com 4% de glicose. Então o meio de fermentação foi inoculadocom 0,21 ml (10%) de material seminal. A fermentação foi realizada em 2 mlde meio mínimo para fermentação em tubos de teste de 20x200-mm. Célulasforam crescidas por 65 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.

Depois de cultivo, a quantidade de L-treonina acumulada nomeio foi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fasemóvel: butanol - ácido acético - água = 4: 1: 1 (v/v). Uma solução deninhidrina (2%) em acetona foi usada como um reagente de visualização. Umponto contendo L-treonina foi cortado, L-treonina foi eluída com 0,5% desolução aquosa de CdCl2, e a quantidade de L-treonina foi estimadaespectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados de dez fermentações emtubo de teste independentes são mostrados em Tabela 1.

A composição do meio de fermentação (g/l) foi como segue: <table>table see original document page 35</column></row><table>

Glicose e sulfato de magnésio foram esterilizadosseparadamente. CaCC>3 foi esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. OpH foi ajustado para 7,0. O antibiótico foi adicionado ao meio depois deesterilização.Como segue de Tabela 1, B-3996-AglgBXCAP causouacumulação de uma quantidade superior de L-treonina, se comparado com B-3996.

Exemplo 12. Produção de L-lisina por E. coli WC196-AglgBXCAP

Para testar o efeito de inativação dos operons glgBX e glgCAPem produção de L-lisina, fragmentos de DNA do cromossomo da cepa de E.coli MG1655 AglgBXCAP::cat descrita acima foram transferidos para a cepade E. coli produtora de L-lisina WC196 (FERM BP-5252) por transdução PI (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.Press, 1972, Plainview, NY).

Para obter uma cultura seminal, ambas cepas de E. coli,WC196 e WC196-AglgBXCAP, foram crescidas em um agitador rotatório(250 rpm) a 32 °C por 18 horas em tubos de teste de 20x200-mm contendo 2 ml de meio diluído duas vezes comparado ao meio de fermentação descritoabaixo. Então o meio de fermentação foi inoculado com 0,21 ml (10%) dematerial seminal. A fermentação foi realizada em 2 ml de meio mínimo parafermentação em tubos de teste de 20x200-mm. Células foram crescidas por 24horas a 32 °C com agitação a 250 rpm.

Depois de cultivo, a quantidade de L-lisina acumulada no meiofoi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel:butanol - ácido acético - água = 4: 1: 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%)em acetona foi usada como um reagente de visualização. Um ponto contendoL-lisina foi cortado, L-lisina foi eluída com 0,5% de solução aquosa de CdCl2, e a quantidade de L-lisina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm.Os resultados de dez fermentações em tubo de teste independentes sãomostrados em Tabela 2.

A composição do meio de fermentação (g/l) foi como segue:Glicose 40,0<table>table see original document page 37</column></row><table>

Glicose, fosfato de potássio e sulfato de magnésio foram esterilizados separadamente. CaC03 foi esterilizado por calor seco a 180°Cpor 2 horas. O pH foi ajustado para 7,0.

Como segue de Tabela 2, WC196-AglgBXCAP causouacumulação de uma quantidade superior de L-lisina, se comparado comWC196.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe comreferência a formas de realização preferidas desta, será perceptível paraalguém versado na arte que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentesempregados, sem se afastar do escopo da invenção. Todas as referênciascitadas neste lugar são incorporadas como uma parte deste pedido porreferência.

Tabela 1.

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Tabela 2. <table>table see original document page 37</column></row><table>

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, produção de um L-aminoácido aromático ou um L-aminoácido não aromático de uma bactéria da família Enterobacteriaceae pode ser realçada.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Ajinomoto Co./ Inc.

<120> UM MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÃCIDO USANDO UMA

BACTÉRIA DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE TENDO UMA VIA DEBIOSSÍNTESE DO GLICOGÊNIO INTERROMPIDA

<130> C440-C5323

<150> RU2005101110<151> 2005-01-19

<160> 20

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 1296

<212> DNA

<213> Escherichia coli<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1296)

<400> 1

atg gtt agt tta gag aag aac gat cac tta atg ttg gcg cgc cag ctg 48Met Vai Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu15 10 15

cca ttg aaa tct gtt gcc ctg ata ctg gcg gga gga cgt ggt acc cgc 96Pro Leu Lys Ser Vai Ala Leu lie Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg20 25 30

ctg aag gat tta acc aat aag cga gca aaa ccg gcc gta cac ttc ggc 144Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Vai His Phe Gly35 40 45

ggt aag ttc cgc att ate gac ttt gcg ctg tct aac tgc ate aac tec 192Gly Lys Phe Arg lie lie Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys lie Asn Ser50 55 60

ggg ate cgt cgt atg ggc gtg ate acc cag tac cag tec cac act ctg 240Gly lie Arg Arg Met Gly Vai lie Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu65 70 75 80

gtg cag cac att cag cgc ggc tgg tca ttc ttc aat gaa gaa atg aac 288Vai Gln His lie Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn85 90 95

gag ttt gtc gat ctg ctg cca gca cag cag aga atg aaa ggg gaa aac 336Glu Phe Vai Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn100 105 110

tgg tat cgc ggc acc gca gat gcg gtc acc caa aac etc gac att ate 384Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Vai Thr Gln Asn Leu Asp lie lie115 120 125

cgc cgt tat aaa gcg gaa tac gtg gtg ate ctg gcg ggc gac cat ate 432Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Vai Vai lie Leu Ala Gly Asp His lie130 135 140<table>table see original document page 39</column></row><table>385 390 395 400

gag gaa gat gca cgt cgt ttc tat cgt tca gaa gaa ggc ate gtg ctg 1248

Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly lie Vai Leu405 410 415

gta acg cgc gaa atg cta cgg aag tta ggg cat aaa cag gag cga taa 1296

Vai Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg

420 425 430

<210> 2<211> 431<212> PRT

<213> Escherichia coli<400> 2

Met Vai Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu15 10 15

Pro Leu Lys Ser Vai Ala Leu lie Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg20 25 30

Leu Lys Asp Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Vai His Phe Gly35 40 45

Gly Lys Phe Arg lie lie Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys lie Asn Ser50 55 60

Gly lie Arg Arg Met Gly Vai lie Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu65 70 75 80

Vai Gln His lie Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn85 90 95

Glu Phe Vai Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn100 105 110

Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Vai Thr Gln Asn Leu Asp lie lie115 120 125

Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Vai Vai lie Leu Ala Gly Asp His lie130 135 140

Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu lie Asp His Vai Glu Lys Gly145 150 155 160

Ala Arg Cys Thr Vai Ala Cys Met Pro Vai Pro lie Glu Glu Ala Ser165 170 175

Ala Phe Gly Vai Met Ala Vai Asp Glu Asn Asp Lys lie lie Glu Phe180 185 190

Vai Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys

195 200 205

Ser Leu Ala Ser Met Gly lie Tyr Vai Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr210 215 220

Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe225 230 235 240Gly Lys Asp Leu lie Pro Lys lie Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala245 250 255

His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Vai Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro260 265 270

Tyr Trp Arg Asp Vai Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu275 280 285

Asp Leu Ala Ser Vai Vai Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp290 295 300

Pro lie Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Vai Gln305 310 315 320

Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Vai Ser Gly325 330 335

Gly Cys Vai lie Ser Gly Ser Vai Vai Vai Gln Ser Vai Leu Phe Ser340 345 350

Arg Vai Arg Vai Asn Ser Phe Cys Asn lie Asp Ser Ala Vai Leu Leu355 360 365

Pro Glu Vai Trp Vai Gly Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Cys Vai lie370 375 380

Asp Arg Ala Cys Vai lie Pro Glu Gly Met Vai lie Gly Glu Asn Ala385 390 395 400

Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser Glu Glu Gly lie Vai Leu405 410 415

Vai Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg420 425 430

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 3

gtgtgtgttc cagagatgat aaaaaaggag ttagtctgat gtccggcggt gcttttgcc 59

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 4

cgggaacatc tctgaacata catgtaaaac ctgcatttac gccccgccct gccactc 57

<210> 5<211> 23<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador<400> 5

ataacccagt gattacggct gtc

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 6

cgatttgtgc tgcgggtaat g

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 7

atgtccgatc gtatcgatag agacgtgatt aacgcgtagt aagccagtat acactcc

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 8

ttacaatctc accggatcga tatgccagat atgatcttaa gggcaccaat aactgcc

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > iniciador

<400> 9

ggggtgacac aataaaacag g

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> iniciador <400> 10

tggccccgtt ctatttattg g 21

<210> 11

<211> 1434

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1434)

<400> 11

atg cag gtt tta cat gta tgt tca gag atg ttc ccg ctg ctt aaa acc 48

Met Gln Vai Leu His Vai Cys Ser Glu Met Phe Pro Leu Leu Lys Thr

15 10 15

ggc ggt ctg gct gat gtt att ggg gca tta ccc gca gca caa ate gea 96 Gly Gly Leu Ala Asp Vai lie Gly Ala Leu Pro Ala Ala Gln lie Ala 20 25 30

gac ggc gtt gac gct cgc gta ctg ttg cet gca ttt ccc gat att cgc 144 Asp Gly Vai Asp Ala Arg Vai Leu Leu Pro Ala Phe Pro Asp lie Arg 35 40 45

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<400> 13

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<212> DNA

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<222> (1) .. (2187)

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15 10 15

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gga ctg gaa gtc cgt gcc ctt tta cec gac gct acc gat gtg tgg gtg 144 Gly Leu Glu Vai Arg Ala Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Vai Trp Vai 35 40 45

att gaa ceg aaa acc ggg cgc aaa etc gea aaa ctg gag tgt etc gac 192 lie Glu Pro Lys Thr Gly Arg Lys Leu Ala Lys Leu Glu Cys Leu Asp 50 55 60tca cgg gga ttc ttt age ggc gtc att ceg cga cgt aag aat ttt ttc 240 Ser Arg Gly Phe Phe Ser Gly Vai lie Pro Arg Arg Lys Asn Phe Phe 65 70 75 80

cgc tat cag ttg gct gtt gtc tgg cat ggt cag caa aac ctg att gat 288 Arg Tyr Gln Leu Ala Vai Vai Trp His Gly Gln Gln Asn Leu lie Asp 85 90 95

gat cet tac cgt ttt ggt ceg cta ate cag gaa atg gat gcc tgg cta 336 Asp Pro Tyr Arg Phe Gly Pro Leu lie Gln Glu Met Asp Ala Trp Leu 100 105 110

tta tet gaa ggt act cac ctg cgc ceg tat gaa acc tta ggc gcg cat 384 Leu Ser Glu Gly Thr His Leu Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His 115 120 125

gea gat act atg gat ggc gtc aca ggt acg cgt ttc tet gtc tgg gct 432 Ala Asp Thr Met Asp Gly Vai Thr Gly Thr Arg Phe Ser Vai Trp Ala 130 135 140

cca aac gcc cgt cgg gtc tcg gtg gtt ggg caa ttc aac tac tgg gac 480 Pro Asn Ala Arg Arg Vai Ser Vai Vai Gly Gln Phe Asn Tyr Trp Asp 145 150 155 160

ggt cgc cgt cac ceg atg cgc ctg cgt aaa gag age ggc ate tgg gaa 528 Gly Arg Arg His Pro Met Arg Leu Arg Lys Glu Ser Gly lie Trp Glu 165 170 175

ctg ttt ate cet ggg gcg cat aac ggt cag etc tat aaa tac gag atg 57 6

Leu Phe lie Pro Gly Ala His Asn Gly Gln Leu Tyr Lys Tyr Glu Met 180 185 190

att gat gcc aat ggc aac ttg cgt ctg aag tec gac cet tat gcc ttt 624 lie Asp Ala Asn Gly Asn Leu Arg Leu Lys Ser Asp Pro Tyr Ala Phe 195 200 205

gaa gcg caa atg cgc ceg gaa acc gcg tet ctt att tgc ggg ctg ceg 672 Glu Ala Gln Met Arg Pro Glu Thr Ala Ser Leu lie Cys Gly Leu Pro 210 215 220

gaa aag gtt gta cag act gaa gag cgc aaa aaa gcg aat cag ttt gat 720 Glu Lys Vai Vai Gln Thr Glu Glu Arg Lys Lys Ala Asn Gln Phe Asp 225 230 235 240

gcg cca ate tet att tat gaa gtt cac ctg ggt tec tgg cgt cgc cac 768 Ala Pro lie Ser lie Tyr Glu Vai His Leu Gly Ser Trp Arg Arg His 245 250 255

acc gac aac aat ttc tgg ttg age tac cgc gag ctg gcc gat caa ctg 816 Thr Asp Asn Asn Phe Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Gln Leu 260 265 270

gtg cet tat gct aaa tgg atg ggc ttt acc cac etc gaa cta ctg cec 864 Vai Pro Tyr Ala Lys Trp Met Gly Phe Thr His Leu Glu Leu Leu Pro 275 280 285

att aac gag cat cec ttc gat ggc agt tgg ggt tat cag cca acc ggc 912 lie Asn Glu His Pro Phe Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Pro Thr Gly 290 295 300

ctg tat gcg cca acc cgc cgt ttt ggt act cgc gac gac ttc cgt tat 960 Leu Tyr Ala Pro Thr Arg Arg Phe Gly Thr Arg Asp Asp Phe Arg Tyr<table>table see original document page 59</column></row><table>Pro Gly Lys

gag tgg aac Glu Trp Asn

gat aac tgg Asp Asn Trp 595

acc tac cgc Thr Tyr Arg 610

ggc ttt gaa Gly Phe Glu 625

ttt gtg cgt Phe Vai Arg

ttt acg ccg Phe Thr Pro

ggc aaa tgg Gly Lys Trp 675

agt aat gca Ser Asn Ala 690

cac ggt cgt His Gly Arg 705

ate tgg ctg lie Trp Leu

Lys Leu Leu 565

cat gac gcc His Asp Ala 580

cac cac ggt His His Gly

cac cat aaa His His Lys

tgg ctg gtg Trp Leu Vai 630

cgc gat aaa Arg Asp Lys 645

gta ccg cgt Vai Pro Arg 660

cgt gaa ate Arg Glu lie

ggc aat ggc Gly Asn Gly

cag cat tca Gln His Ser 710

gtt cgg gag Vai Arg Glu 725

Phe Met Gly

age etc gac Ser Leu Asp 585

gtc cag cgt Vai Gln Arg 600

gca atg cat Ala Met His 615

gtg gat gac Vai Asp Asp

gag ggt aac Glu Gly Asn

cat gat tat His Asp Tyr 665

etc aat acc Leu Asn Thr 680

ggc acg gta Gly Thr Vai 695

cta age ctg Leu Ser Leu

gca gaa tga Ala Glu

Asn Glu Phe 570

tgg cat ctg Trp His Leu

ctg gtg cgc Leu Vai Arg

gaa ctg gat Glu Leu Asp 620

aaa gaa cgc Lys Glu Arg 635

gaa ate ate Glu lie lie 650

cgc ttc ggc Arg Phe Gly

gat tec atg Asp Ser Met

cac age gat His Ser Asp 700

acg cta cca Thr Leu Pro 715

Ala Gln Gly 575

ttg gaa ggc Leu Glu Gly 590

gat ctg aac Asp Leu Asn 605

ttt gac ccg Phe Asp Pro

tcg gtg ctg Ser Vai Leu

gtt gcc agt Vai Ala Ser 655

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cac tat cac His Tyr His 685

gag att gcc Glu lie Ala

ccg ctg gcc Pro Leu Ala

Arg

ggc 1776 Gly

etc 1824 Leu

tac 1872 Tyr

ate 1920

lie

640

aac 1968 Asn

ccg 2016 Pro

ggc 2064 Gly

age 2112 Ser

act 2160

Thr

720

2187

<210> 18 <211> 728 <212> PRT

<213> Escherichia coli <400> 18

Met Ser Asp Arg lie Asp Arg Asp Vai lie Asn Ala Leu lie Ala Gly 15 10 15

His Phe Ala Asp Pro Phe Ser Vai Leu Gly Met His Lys Thr Thr Ala 20 25 30

Gly Leu Glu Vai Arg Ala Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Vai Trp Vai 35 40 45

lie Glu Pro Lys Thr Gly Arg Lys Leu Ala Lys Leu Glu Cys Leu Asp 50 55 60

Ser Arg Gly Phe Phe Ser Gly Vai lie Pro Arg Arg Lys Asn Phe Phe65 70 75 80

Arg Tyr Gln Leu Ala Vai Vai Trp His Gly Gln Gln Asn Leu lie Asp 85 90 95

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Leu Ser Glu Gly Thr His Leu Arg Pro Tyr Glu Thr Leu Gly Ala His 115 120 125

Ala Asp Thr Met Asp Gly Vai Thr Gly Thr Arg Phe Ser Vai Trp Ala 130 135 140

Pro Asn Ala Arg Arg Vai Ser Vai Vai Gly Gln Phe Asn Tyr Trp Asp 145 150 155 160

Gly Arg Arg His Pro Met Arg Leu Arg Lys Glu Ser Gly lie Trp Glu 165 170 175

Leu Phe lie Pro Gly Ala His Asn Gly Gln Leu Tyr Lys Tyr Glu Met 180 185 190

Xle Asp Ala Asn Gly Asn Leu Arg Leu Lys Ser Asp Pro Tyr Ala Phe 195 200 205

Glu Ala Gln Met Arg Pro Glu Thr Ala Ser Leu lie Cys Gly Leu Pro 210 215 220

Glu Lys Vai Vai Gln Thr Glu Glu Arg Lys Lys Ala Asn Gln Phe Asp 225 230 235 240

Ala Pro lie Ser lie Tyr Glu Vai His Leu Gly Ser Trp Arg Arg His 245 250 255

Thr Asp Asn Asn Phe Trp Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Gln Leu 260 265 270

Vai Pro Tyr Ala Lys Trp Met Gly Phe Thr His Leu Glu Leu Leu Pro 275 280 285

lie Asn Glu His Pro Phe Asp Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Pro Thr Gly 290 295 300

Leu Tyr Ala Pro Thr Arg Arg Phe Gly Thr Arg Asp Asp Phe Arg Tyr 305 310 315 320

Phe lie Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Asn Vai lie Leu Asp Trp 325 330 335

Vai Pro Gly His Phe Pro Thr Asp Asp Phe Ala Leu Ala Glu Phe Asp 340 345 350

Gly Thr Asn Leu Tyr Glu His Ser Asp Pro Arg Glu Gly Tyr His Gln 355 360 365

Asp Trp Asn Thr Leu lie Tyr Asn Tyr Gly Arg Arg Glu Vai Ser Asn 370 375 380

Phe Leu Vai Gly Asn Ala Leu Tyr Trp lie Glu Arg Phe Gly lie Asp 385 390 395 400

Ala Leu Arg Vai Asp Ala Vai Ala Ser Met lie Tyr Arg Asp Tyr Ser405 410 415

Arg Lys Glu Gly Glu Trp lie Pro Asn Glu Phe Gly Gly Arg Glu Asn 420 425 430

Leu Glu Ala lie Glu Phe Leu Arg Asn Thr Asn Arg lie Leu Gly Glu 435 440 445

Gln Vai Ser Gly Ala Vai Thr Met Ala Glu Glu Ser Thr Asp Phe Pro 450 455 460

Gly Vai Ser Arg Pro Gln Asp Met Gly Gly Leu Gly Phe Trp Tyr Lys 465 470 475 480

Trp Asn Leu Gly Trp Met His Asp Thr Leu Asp Tyr Met Lys Leu Asp 485 490 495

Pro Vai Tyr Arg Gln Tyr His His Asp Lys Leu Thr Phe Gly lie Leu 500 505 510

Tyr Asn Tyr Thr Glu Asn Phe Vai Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Vai 515 520 525

Vai His Gly Lys Lys Ser lie Leu Asp Arg Met Pro Gly Asp Ala Trp 530 535 540

Gln Lys Phe Ala Asn Leu Arg Ala Tyr Tyr Gly Trp Met Trp Ala Phe 545 550 555 560

Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Asn Glu Phe Ala Gln Gly Arg 565 570 575

Glu Trp Asn His Asp Ala Ser Leu Asp Trp His Leu Leu Glu Gly Gly 580 585 590

Asp Asn Trp His His Gly Vai Gln Arg Leu Vai Arg Asp Leu Asn Leu 595 600 605

Thr Tyr Arg His His Lys Ala Met His Glu Leu Asp Phe Asp Pro Tyr 610 615 620

Gly Phe Glu Trp Leu Vai Vai Asp Asp Lys Glu Arg Ser Vai Leu lie 625 630 635 640

Phe Vai Arg Arg Asp Lys Glu Gly Asn Glu lie lie Vai Ala Ser Asn 645 650 655

Phe Thr Pro Vai Pro Arg His Asp Tyr Arg Phe Gly lie Asn Gln Pro 660 665 670

Gly Lys Trp Arg Glu lie Leu Asn Thr Asp Ser Met His Tyr His Gly 675 680 685

Ser Asn Ala Gly Asn Gly Gly Thr Vai His Ser Asp Glu lie Ala Ser 690 695 700

His Gly Arg Gln His Ser Leu Ser Leu Thr Leu Pro Pro Leu Ala Thr 705 710 715 720

lie Trp Leu Vai Arg Glu Ala Glu 725<210> 19

<211> 201

<212> DNA

<213> Escherichia coli <220>

<221> CDS

<222> (1)..(201)

<400> 19

atg gat cat agt ctt aat tct tta aat aat ttc gat ttc ctg gcg cgt 48

Met Asp His Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Phe Asp Phe Leu Ala Arg 15 10 15

agt ttt gcc aga atg cac gca gaa ggt cgc ccg gtc gat att ctg gcc 96 Ser Phe Ala Arg Met His Ala Glu Gly Arg Pro Vai Asp lie Leu Ala 20 25 30

gtt act ggt aac atg gat gaa gaa cat aga acc tgg ttt tgc gca cgt 144 Vai Thr Gly Asn Met Asp Glu Glu His Arg Thr Trp Phe Cys Ala Arg 35 40 45

tat gcc tgg tat tgt caa cag atg atg cag gca aga gag ctg gag tta 192 Tyr Ala Trp Tyr Cys Gln Gln Met Met Gln Ala Arg Glu Leu Glu Leu 50 55 60

gag cac tga 201

Glu His

65

<210> 20 <211> 66 <212> PRT

<213> Escherichia coli <400> 20

Met Asp His Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Phe Asp Phe Leu Ala Arg 15 10 15

Ser Phe Ala Arg Met His Ala Glu Gly Arg Pro Vai Asp lie Leu Ala 20 25 30

Vai Thr Gly Asn Met Asp Glu Glu His Arg Thr Trp Phe Cys Ala Arg 35 40 45

Tyr Ala Trp Tyr Cys Gln Gln Met Met Gln Ala Arg Glu Leu Glu Leu 50 55 60

Glu His 65

Claims (15)

1. Bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de que a bactéria foi modificada de forma que a via biossintética do glicogênio é interrompida.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita via biossintética do glicogênio é interrompida por atenuação de expressão dos operons glgBX e/ou glgCAP.

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita via biossintética do glicogênio é interrompida por inativação dos operons glgBX e/ou glgCAP.

4. Bactéria de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a inativação dos operons glgBX e/ou glgCAP é realizada por deleção de um gene selecionado a partir de um grupo consistindo de glgB, glgX, glgC, glgA, glgP e combinações destes.

5. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que dita via biossintética do glicogênio é interrompida por atenuação da expressão do gene glgS.

6. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita via biossintética do glicogênio é interrompida por inativação do gene glgS.

7. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita bactéria pertence ao gênero Escherichia.

8. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita bactéria pertence ao gênero Pantoea.

9. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dito L-aminoácido é selecionado a partir do grupo consistindo de um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não aromático.

10. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que dito L-aminoácido aromático é selecionado a partir do grupo consistindo de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

11. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com a 5 reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que dito L-aminoácido não aromático é selecionado a partir do grupo consistindo de L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, e L-arginina.

12. Método para produzir L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender:- cultivar a bactéria como definida na reivindicação 1 em um meio para produzir e excretar dito L-aminoácido no meio, e- coletar dito L-aminoácido do meio.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que dito L-aminoácido é selecionado a partir do grupo consistindo de um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não aromático.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizada 20 pelo fato de que dito L-aminoácido aromático é selecionado a partir do grupoconsistindo de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dito L-aminoácido não aromático é selecionado a partir do grupo consistindo de L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, e L-arginina.