BRPI0608373A2 - método para detectar e/ou obter e isolar um auto-anticorpo, e, imunoglobulina isolada - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA DETECTAR E/OU OBTER E ISOLAR UM AUTO-ANTICORPO, E, IMUNOGLOBULINA ISOLADA. A especificidade de ligação de pelo menos uma proteína suspensa ou dissolvida em um meio líquido é reversivelmente alterada expondo a proteína a um agente oxidante ou uma corrente elétrica. Uma proteína mascarada tal como um auto-anticorpo pode ser detectado, isolado e recuperado de um fluido biológico sujeitando o fluido biológico a um agente oxidante ou uma corrente elétrica para mudar a especificidade de ligação de proteínas mascaradas contidas neste.

Description

"MÉTODO PARA DETECTAR E/OU OBTER E ISOLAR UM AUTO-ANTICORPO, E, IMUNOGLOBULINA ISOLADA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método de alterar umaespecificidade de ligação de uma proteína que tem uma especificidade deligação que pode ser alterada por reações de oxidação-redução. A presenteinvenção se refere adicionalmente a um método de alterar reversivelmente aespecificidade de ligação de anticorpos, particularmente auto-anticorposmascarados que naturalmente estão presentes no sangue, plasma, soro ououtros fluidos corporais de indivíduos normais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O termo "doença autoimune" se refere a um grupo de doençascaracterizadas pelo fato de que o sistema imune ataca erroneamente células,tecidos e órgãos do próprio corpo de uma pessoa. Tipicamente, doençasautoimunes envolvem ligação de anticorpo aos componentes do própriocorpo, tal como proteínas e lipídeos comuns. Anticorpos que se ligam a auto-compostos (ou, mais tipicamente, a compostos que são tão comuns que sãoencontrados em cada organismo) são referidos como auto-anticorpos. Comoum exemplo, ligação de auto-anticorpo de fosfolipídeos e/ou proteínas deplasma de ligação a fosfolipídeo está associada com doenças tal como lúpuseritematoso sistêmico (SLE), trombose venosa profunda e arterial recorrente,embolia pulmonar, aborto espontâneo recorrente, trombocitopenia, coréia,epilepsia, livedo, hipertensão pulmonar idiopática, condições reumatológicase um grande número de doenças colagenosas. Outras doenças associadas comauto-anticorpos incluem esclerose múltipla, doença de Crohn, lúpuseritematoso discóide, tireoidite de Hashimoto, psoríase, diabete e artritereumatóide. Existem cerca de 80 doenças autoimunes diferentes, e como umgrupo, estas doenças afetam milhões de pessoas.

Uma teoria convencional considerando a etiologia de doençasautoimunes tem sido que estas doenças são causadas por uma superproduçãode auto-anticorpos no indivíduo adoentado, possivelmente devido a umasuperexpressão de um gene codificando tais auto-anticorpos. De acordo comesta teoria, o sangue de um indivíduo afetado contém um nível elevado doauto-anticorpo particular causando a doença, enquanto o sangue de umindivíduo normal contém nada dos auto-anticorpos ou apenas uma quantidadetrivial. Esta teoria é aparentemente sustentada por ensaios convencionais, nosquais auto-anticorpos abundantes podem ser detectados em sangue, ouprodutos sangüíneos tal como plasma ou soro, de indivíduos tendo umadoença autoimune, ao passo que apenas um zero ou quantidade mínima deauto-anticorpos podem ser detectados em sangue ou produtos sangüíneos deindivíduos que não têm uma doença autoimune.

A presente invenção é baseada na notável descoberta, relatadaneste lugar, de que sangue de indivíduos normais de fato contém um númerosignificante de auto-anticorpos, em uma ampla variedade de tipos eespecificidades. E possível detectar e isolar estes auto-anticorpos de sangueou um produto sangüíneo de um indivíduo normal se o sangue ou produtosangüíneo é tratado por oxidação, por, por exemplo com um agente oxidanteou corrente elétrica, de acordo com um método descrito neste lugar. Estadescoberta de auto-anticorpos em quantidades significantes em sangue normalnão é previamente relatada e, até o conhecimento dos requerentes, aexistência de tais auto-anticorpos em quantidades significantes em sanguenormal era completamente desconhecida antes da presente invenção.

A descoberta de auto-anticorpos em quantidades significantesem indivíduos normais levanta a questão de por que os auto-anticorpos nãosão detectados em um ensaio padrão (tipicamente baseado na ligação de umanticorpo a seu antígeno correspondente) e por que os auto-anticorpos nãocausam sintomas de doença em indivíduos normais.

Em experimentos descritos neste lugar, é mostrado que pelométodo da presente invenção, auto-anticorpos podem ser obtidos através defluidos biológicos tal como sangue de um indivíduo normal expondo o fluidobiológico a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica de CC, e que oprocesso é reversível. Ademais, foi encontrado que auto-anticorpos podem serobtidos tratando produtos comerciais de Ivlg. Baseada nestes experimentos,uma teoria para como sangue normal poderia conter auto-anticorpos sem taisanticorpos serem detectados através de procedimentos habituais de triagem esem tais anticorpos causarem doença é de que os auto-anticorpos circulamlivremente junto com outros anticorpos mas que o sítio de ligação a antígenode auto-anticorpos é de alguma maneira mascarado ou inativado emindivíduos normais. Por causa da grande quantidade e variedade de anticorposmascarados que são descobertos de acordo com a presente invenção, éevidente que tais anticorpos mascarados devem desempenhar um papel emindivíduos saudáveis. Um papel benéfico em tais anticorpos mascarados ésustentado pelo resultado de anticorpos mascarados em leite materno humano.

Além disso, sob a teoria de que o sítio de ligação de auto-anticorpos pode serdesmascarado por uma mudança no estado redox, pode ser teorizado quedoenças autoimunes são desencadeadas ou agravadas por oxidação quedesmascara o sítio de ligação a antígeno de auto-anticorpos. Além disso, adescoberta de auto-anticorpos mascarados em fluido espinhal cerebral sugereque auto-anticorpos podem ser envolvidos em doenças neurodegenerativas talcomo mal de Alzheimer e Parkinson, que podem ser desencadeadas ouagravadas por desmascaramento de auto-anticorpos. Sabe-se que nitrosilaçãode proteínas no CNS é uma das medidas mais precoces de início deAlzheimer. Se isto está ocorrendo no cérebro, então isto também podedesatrelar os auto-anticorpos redox reativos a aPL. Estes anticorpos aPLpoderiam por sua vez começar a interagir com fosfolipídeos no cérebro ecausar muitas das lesões e encolhimento do cérebro o que é visto em estudosMRI dos cérebros de pacientes com Alzheimer. Ademais, esta teoria sugereum mecanismo mais geral pelo qual a especificidade de ligação de certasproteínas de plasma pode ser alterada.

Um uso prático imediato da descoberta que forma a base dapresente invenção é que ele permite que um fornecimento quase ilimitado dosauto-anticorpos recentemente descobertos seja obtido, cujos auto-anticorpospodem ser usados como padrões em kits diagnósticos para a diagnose emlaboratório de doenças autoimunes e outras relacionadas a aPL. Previamente,coleção de grandes quantidades de auto-anticorpos para uso comercial foidifícil pois se pensava que os auto-anticorpos tinham que ser obtidos deindivíduos tendo uma doença autoimune ou testados positivos para auto-anticorpos em ensaios padrão. A quantidade de tal sangue que pode ser obtidaa partir de flebotomia de pacientes individuais ou combinando sangue de umgrupo de pacientes conhecidos por testar positivo para auto-anticorpos élimitada. Outros métodos de obter auto-anticorpos, tal como triar bibliotecasde fagos como descrito em Patente Norte-Americana No. 5.885.793, podemser difíceis e consumidores de tempo.

Testar amostras de sangue para a presença ou ausência deanticorpos mascarados pode ter importante valor diagnóstico pois isto podepressagiar ou prever que anticorpos podem aparecer subseqüente a estresseoxidativo em indivíduos particulares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O objetivo desta invenção é fornecer um método de alterarreversivelmente uma especificidade de ligação de uma proteína que tem umaespecificidade de ligação que pode ser reversivelmente alterada por umamudança em seu estado redox.

E um objetivo adicional da presente invenção fornecer ummétodo de obter auto-anticorpos de fluidos biológicos tal como sangue, soro,plasma, leite cru, fluido linfático, ou fluido de SNC, particularmente taisfluidos retirados de indivíduos normais.

E um objetivo adicional da presente invenção fornecer ummétodo para tratar um indivíduo tendo uma doença autoimune administrandoao indivíduo um antioxidante suficiente para inativar auto-anticorpos em ditoindivíduo.

E um objetivo adicional da presente invenção fornecer ummétodo para tratar um indivíduo tendo uma doença autoimune inativandoauto-anticorpos de dito indivíduo extracorporeamente.

É um objetivo adicional da presente invenção fornecer umaimunoglobulina isolada que tem um sítio de ligação que pode ser alterado poruma mudança em condições redox e um produto compreendendo um fluidobiológico ou um extrato contendo proteína de um fluido biológico que foiexposto a um agente oxidante ou uma corrente elétrica de CC suficiente paraalterar a especificidade de ligação de pelo menos uma proteína deste.

E um objetivo adicional da presente invenção fornecer umaamostra de um fluido biológico de uma ou mais pessoas que testam negativopara a presença de auto-anticorpos em ensaios clínicos de rotina e que foitratado de forma que o fluido biológico subseqüentemente demonstra apresença de auto-anticorpos.

Estes e outros objetivos são atingidos por um método dealterar uma especificidade de ligação de pelo menos uma proteína em umfluido biológico ou em um extrato contendo proteína de um fluido biológico,a proteína tendo um sítio de ligação com uma especificidade de ligação quepode ser reversivelmente alterada por uma mudança em um estado redox daproteína, expondo a proteína no fluido biológico ou extrato a um agenteoxidante ou a uma corrente elétrica direta (DC) para efetuar a alteraçãoreversível da especificidade de ligação da proteína circulante.

Os objetivos são adicionalmente atingidos por um métodocompreendendo as etapas de fornecer uma composição compreendendo pelomenos uma proteína suspensa ou dissolvida em um meio líquido, a proteínatendo uma especificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudançaem seu estado redox, e expondo a composição a um agente oxidante ou umpotencial elétrico DC suficiente para efetuar a alteração da especificidade deligação da proteína.

Em outra forma de realização, a invenção se refere a ummétodo para detectar ou obter auto-anticorpos ou outras proteínas mascaradasde um fluido biológico ou de um extrato de um fluido biológico expondo oauto-anticorpo ou outra proteína circulante mascarada no fluido biológico ouextrato a um agente oxidante ou a uma corrente elétrica de CC suficiente paraalterar a especificidade de ligação do auto-anticorpo ou outra proteínacirculante mascarada de forma que o auto-anticorpo ou outra proteínacirculante mascarada se torna capaz de se ligar a um antígeno ou ligante, comisso tornando detectável e recuperável do fluido biológico ou extrato, erecuperando o auto-anticorpo ou outra proteína circulante mascarada dofluido biológico.

Em outra forma de realização, a presente invenção se refere auma imunoglobulina isolada tendo um sítio de ligação com umaespecificidade de ligação que pode ser reversivelmente alterada por umamudança no estado redox.

Em outra forma de realização, a presente invenção se refere aum método para tratar uma doença autoimune administrando a um indivíduotendo uma doença autoimune uma quantidade de um antioxidante suficientepara inibir ou reverter uma ativação oxidativa de sítios de ligação de auto-anticorpos no indivíduo. Um tratamento de uma pessoa tendo uma doençaautoimune pode incluir tratamento extracorpóreo do sangue para reduzir asproteínas desmascaradas e repô-las como proteínas mascaradas.

Em outra forma de realização, a presente invenção se refere aum método de triar um fluido biológico ou extrato de indivíduo normal paradeterminar que auto-anticorpos são mascarados e assim construir um perfil deanticorpo potencial de auto-anticorpos que podem causar doença autoimunenaquele indivíduo se exposto ou desmascarado por oxidação ou uma forçaeletromotriz.

Como um exemplo não limitante particular, um fluido ouextrato biológico tal como uma mistura de imunoglobulinas, pode ser expostaa um agente oxidante ou a uma corrente elétrica de CC para efetuar aalteração da especificidade de ligação de pelo menos um auto-anticorpocontido no fluido ou extrato biológico, de forma que o auto-anticorpo se tornadetectável em e recuperável do sangue, plasma, soro ou extrato.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figura 1 é uma tabela listando os anticorpos antifosfolipídeosparticulares (aPL) que foram ensaiados pelo formato doméstico de ensaioimunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) usado em muitos dos Exemplos,descritos abaixo.

Figura 2 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos.

Figura 3 é uma tabela composta resumindo resultados deensaio de aPL de amostras de sangue de sete indivíduos normais aPL-negativos, incubadas de acordo com o método descrito na seção de aberturados Exemplos.

Figura 4 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de um indivíduo normal aPL-negativo, incubada de acordocom o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística de que células vermelhas do sangue (RBC) de cavalo foramsubstituídas por RBC humanas no procedimento.

Figura 5 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLde uma incubação de uma amostra de soro realizada de acordo com ummétodo descrito na seção de abertura dos Exemplos, exceto que soro decavalo foi substituído por soro humano.

Figura 6 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, excetoque a incubação foi realizada em temperatura ambiente (22°C).

Figura 7 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística de que microesferas de Degalan (plástico) de 0,7 mm foramusados como sólido particulado na mistura de incubação.

Figura 8 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, excetoque a mistura de incubação foi mantida estacionária, ao invés de ser agitadaou sacudida.

Figura 9 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística adicionada de que a mistura de incubação foi aquecida para 56°C por 30 minutos.

Figura 10 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística de que um meio de crescimento de cultura bacteriana de umfornecedor diferente (Becton Dickinson, Sparks, Md) foi usado no lugar domeio de crescimento de cultura bacteriana de Biomerieux.

Figura 11 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPL para uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística de que a incubação ocorreu em condições anaeróbicas.

Figura 12 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística de que células K562 (uma linhagem humana de célulatumorosa) foram usadas ao invés de RBC.

Figura 13 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, excetoque o meio de crescimento de cultura bacteriana foi substituído por um meiode cultura celular usado para crescer células humanas.

Figura 14 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de cordão umbilical de uma mãe e bebê normalaPL-negativos.

Figura 15 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de sangue de um indivíduo normal aPL-negativo, incubadade acordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos, com acaracterística de que nitroprussiato de sódio (SNP) foi usado no lugar de RBCna mistura de incubação.

Figura 16 é uma tabela resumindo resultados de um ensaio deatividade anticoagulante lúpico para uma amostra de sangue incubada deacordo com o método descrito na seção de abertura dos Exemplos. A amostrade sangue foi obtida de um indivíduo cujo sangue é anticoagulante lúpiconegativo antes de soroconversão por pelo processo da presente invenção.

Figura 17 é uma tabela listando outros tipos de auto-anticorposque foram identificados em amostras de sangue que são incubadas de acordocom o método descrito na seção de abertura dos Exemplos. Os anticorposlistados foram identificados por microscopia de imunofluorescência.

Figura 18 é um gráfico mostrando o perfil de dispersão frontal(tamanho) e dispersão lateral (granularidade) da população de células demonócitos como definido para células brancas isoladas de sangue humano porgradiente de densidade por citometria de fluxo.

Figuras 19 A - D são histogramas de citometria de fluxomostrando atividade de monócitos de vários soros. Nos histogramas, atividadede anticorpo, se presente, é medida por mudanças nos valores de canalmediano (escala logarítmica) ao longo do eixo horizontal. Figura 19A mostrareatividade de monócitos de soros humanos normais (NHS) agrupados. Figura19B mostra a atividade de monócitos de um soro de um único indivíduonormal. Figura 19C mostra a atividade de monócitos de uma amostra desangue do indivíduo mostrado em Figura 19B que foi tratado de acordo com ométodo descrito na seção de abertura dos Exemplos. Figura 19D mostra aatividade de monócitos de soros controle positivos.

Figura 20 é uma tabela resumindo os resultados de teste deanticorpo antinuclear (ANA) de várias amostras usando um ensaio de triagemRELISA®.

Figura 21 é uma tabela resumindo resultados de ensaio de aPLpara uma amostra de IvIg que foi incubada com hemina em um tampão tris.

Figura 22 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por densidade ótica, OD) detectada em uma sériede preparações de Ivlg que foram incubadas com hemina, como uma funçãoda quantidade de soro humano (in pl)adicionada às preparações.

Figura 23 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por densidade ótica, OD) detectada em uma sériede preparações diluídas de soro humano que foram incubadas com hemina,como uma função da quantidade de hemina (in pl) adicionada às preparações.

Figura 24 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectada em umasérie de preparações de Ivlg que foram incubadas com hemina e Vitamina C,como uma função da quantidade de Vitamina C (in pg) adicionada àspreparações.

Figura 25 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectada em umasérie de preparações de Ivlg que foram incubadas com hemina solubilizadacom NaOH, hematoporfirina IX (hplX) solubilizada com DMSO, hplXsolubilizada com NaOH, NaOH apenas, DMSO apenas, e hemina solubilizadacom DMSO.

Figura 26 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS (comomedido por densidade ótica, OD) detectada em uma série de preparações deIvlg que foram incubadas com quantidades crescentes de hemina equantidades crescentes de hemina e hemopexina (hpx).

Figura 27 mostra os Western blots obtidos para três lisadoscelulares com Ivlg tratado com hemina e Ivlg não tratado usados comoanticorpos primários, junto com um blot caracterizado pelo fato de queconjugado etiquetado com HRP anti-humano foi usado como um controle.

Figuras 28A e 28B são gráficos mostrando a quantidade dedependente de aPL e independente de aPL de aPS, aCL, aPE, e aPC (comomedido por múltiplos da média, MoMs) detectada em uma série depreparações de Ivlg nas quais eletrodos conectados a uma bateria de 9 voltsforam imersos em uma solução de salina tamponada com fosfato contendo oIvlg por 2 minutos.

Figura 29 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectada em umasérie de preparações de Ivlg nas quais eletrodos conectados a uma bateria de 6volts foram imersos em uma solução de salina tamponada com fosfatocontendo o Ivlg por 60 segundos.

Figura 30 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs) detectada em umasérie de preparações de Ivlg nas quais eletrodos conectados a uma bateria de 6volts foram imersos em uma solução de salina tamponada com fosfatocontendo o Ivlg, como uma função do tempo de imersão.

Figuras 31 A, 31Be31C são gráficos mostrando a quantidadede aCL, aPE, e aPS, respectivamente (como medido por múltiplos da média,MoMs),detectada em soluções de controle antes e depois de exposição por240 segundos a eletrodos conectados a uma bateria de 6 volts.

Figura 32 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS e aCL,respectivamente (como medido por múltiplos da média, MoMs), detectada nosoro diluído com PBS de um paciente aPS e aCL-positivo. No experimento,eletrodos de grafite conectados a uma bateria de 6 volts foram imersos nosoro diluído por uma quantidade variável de tempo.

Figura 33 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por múltiplos da média, MoMs),respectivamente,detectada no soro diluído com PBS de um paciente aPE-positivo. Noexperimento, eletrodos de grafite conectados a uma bateria de 6 volts foramimersos no soro diluído por uma quantidade variável de tempo.

Figura 34 é um gráfico mostrando a quantidade de aPS, aCL eaPE, (como medido por densidade ótica, OD), respectivamente, detectada nosoro diluído com PBS de um paciente aPE-positivo. No experimento, os 10%de plasma bovino adulto (ABP) usados na determinação de ligação de aPLdependente de proteína foram tratados imergindo eletrodos de grafiteconectados a uma bateria de 6 volts no ABP por uma quantidade variável detempo.

Figura 35 é um gráfico comparando a quantidade de aPS, aCL,aPE, e aPC (como medido por densidade ótica, OD) detectada em umaamostra não incubada de leite materno humano com a quantidade detectadaem uma amostra de leite materno humano que foi incubada com hemina.

Figuras 36A e 36B são gráficos mostrando a quantidade deaPS, aCL e aPE, (como medido por densidade ótica, OD), respectivamente,detectada no fluido CSF de um indivíduo normal, tanto para amostras nãoincubadas como amostras que foram incubadas com hemina. Resultados sãomostrados tanto para amostras diluídas com PBS como diluídas com ABP.

Figura 37 é um gráfico comparando a quantidade de IgGdetectável por antinitrotirosina monoclonal na amostra de IgG que foi tratadacom hemina e uma amostra de IgG que não foi tratada com hemina.

Figuras 38 A - D são histogramas de citometria de fluxomostrando atividade de neutrófilos de várias preparações de lvlg.

Figura 39A e 39B são gráficos comparando a quantidade deaPS, aCL, aPE, e aPC (como medido por densidade ótica, OD) detectada emuma amostra não incubada de soro de cavalo com a quantidade detectada emuma amostra de soro de cavalo que foi incubada com hemina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método de alterar aespecificidade de ligação de pelo menos uma proteína em um fluido biológicoou extrato de um fluido biológico.

Tipicamente, proteínas que são o indivíduo da presenteinvenção são aquelas que são naturalmente encontradas no sistema decirculação, sistema linfático, fluido espinhal cerebral ou leite materno deanimais. Exemplos de tais proteínas incluem anticorpos e outras proteínas deplasma. Como um exemplo não limitante, a proteína pode ser um anticorpo ouum auto-anticorpo do isotipo IgG, IgA ou IgM. Em particular, a presenteinvenção é dirigida a uma classe de proteínas como recentemente descobertoneste lugar que tem a propriedade de ter uma especificidade de ligação quepode ser reversivelmente alterada por uma mudança no estado redox daproteína. A descoberta pelo inventor de que existem proteínas circulantes, talcomo auto-anticorpos, que têm esta propriedade forma uma base da invenção.A presente invenção não é limitada a anticorpos ou auto-anticorpos, uma vezque também foi descoberto que certas proteínas não anticorpos têm umaespecificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança no estadoredox. Estas proteínas não anticorpos incluem cininogênio e protrombina e/oubeta2 glicoproteína.

O termo "proteína mascarada" é usado neste lugar paradesignar e descrever uma proteína tal como uma proteína circulante que, emindivíduos normais, está presente no sangue ou outros fluidos corporais, masnão é detectável por ensaios convencionais de ligação baseados em ligação dereceptor e ligante porque seu sítio de ligação é, no indivíduo normal ou emuma amostra tirada do indivíduo normal, mascarado ou bloqueado ou de outramaneira prevenido de se ligar a um antígeno, e que, quando uma amostracontendo a proteína mascarada é tratada mudando seu estado redox, tal comopor exposição a um agente oxidante ou corrente elétrica de acordo com ummétodo da presente invenção, se torna capaz de se ligar a um antígeno e comisso se torna detectável em uma amostra. Um exemplo de uma proteínamascarada é um auto-anticorpo de acordo com a presente invenção, incluindo,mas não limitado àqueles que são listados em Tabela 2, abaixo. Comodescoberto pelo presente inventor, auto-anticorpos mascarados circulam emquantidades significantes em sangue normal, mas eles não são detectáveis emensaios convencionais baseados em ligação de anticorpo e antígeno. Comodiscutido neste lugar, um auto-anticorpo se torna detectável e recuperávelquando o auto-anticorpo é indivíduo a condições de oxidação-reduçãosuficientes para alterar sua especificidade de ligação.

Depois da descoberta que forma a base da presente invenção,foi possível triar amostras tal como sangue, soro, leite materno, fluidoespinhal cerebral, e extratos de Ivlg com uma variedade de auto-antígenos eoutros tipos de antígenos para identificar auto-anticorpos mascarados quepodem ser desmascarados por oxidação. Auto-anticorpos que foramdesmascarados por oxidação incluem os seguintes em Tabela 2:

Tabela 2: Auto-anticorpos mascarados identificados até o momentodepois de conversão redox de plasma ou IgG normal

<table>table see original document page 16</column></row><table>

* Reatividade de membrana basal de trofoblasto visivelmente similar àquelarelatada por Faulk et al. usando eluatos placentários [27].

Tabela 2 abreviações usadas:

aCL, anticardiolipina

aPC, antifosfatidilcolina

aPE, antifosfatidiletanolamina

aPS, antifosfatidilserina

APPT, tempo de tromboplastina parcial ativada

dRWT, tempo de veneno de víbora de Russell diluído

ELISA, ensaio imunoabsorvente ligado à enzimaRIA, radioimunoensaio

Por conseguinte, a presente invenção inclui métodos de alterara especificidade de ligação de qualquer das imunoglobulinas acima de umestado de não ligação para um estado de ligação com respeito a seu antígenoparticular. Além disso, acredita-se que as imunoglobulinas acima que sãodesmascaradas pelos métodos da presente invenção representam uma classepreviamente não descoberta de auto-anticorpos. Por conseguinte, a presenteinvenção inclui adicionalmente imunoglobulinas isoladas que têm um sítio deligação a antígeno com uma especificidade de ligação que pode serreversivelmente alterada por uma mudança no estado redox. O termo"imunoglobulina isolada" se refere a uma imunoglobulina que foi removidade seu estado natural. Por exemplo, uma imunoglobulina da presente invençãoé tipicamente uma que foi previamente indetectável em uma amostrabiológica porque seu sítio de ligação a antígeno foi mantido em seu ambientenatural em um estado de não ligação. Entretanto, com tratamento da amostrapara mudar o estado redox, tal como tratamento com um agente oxidante oucorrente elétrica de CC, a imunoglobulina se torna capaz de ligação específicade um antígeno respectivo particular. Explorando a capacidade alterada daimunoglobulina para se ligar especificamente a um antígeno particular, aimunoglobulina pode ser detectada, isolada e/ou recuperada da amostra.

Ademais, também foi encontrado que amostras de sangue, soroou Ivlg que inicialmente testam negativas para HCV (vírus da hepatite C)testam positivas para HCV depois de um tratamento de acordo com a presenteinvenção, sugerindo que indivíduos normais têm anticorpos anti-HCVmascarados em sua circulação.

O termo "alterar a especificidade de ligação" de uma proteínase refere a um processo por meio do qual uma proteína é mudada ou alterada,tal como por oxidação ou redução, de forma que ela se torna capaz de ligaçãoespecífica de um antígeno ou ligante que ela previamente não foi capaz de seligar especificamente. O termo também pode se aplicar a um processo pormeio do qual uma proteína é mudada ou alterada, tal como por oxidação ouredução de forma que ela se torna incapaz de ligação específica de umantígeno ou ligante que ela previamente não foi capaz de se ligarespecificamente, mas é para ser entendido que neste contexto, o termo serefere a uma mudança reversível e não uma mudança irreversível permanentetal como desnaturação da proteína. O termo "desmascarar" se refere a umprocesso caracterizado pelo fato de que a especificidade de ligação daproteína mascarada é alterada por uma mudança em estado redox de formaque a proteína se torna detectável por um ensaio de ligação baseado naespecificidade de ligação alterada. Em particular, a especificidade de ligaçãoda proteína mascarada pode ser mudada de um estado de não ligação para umestado de ligação com respeito a um antígeno ou ligante, por meio do que aproteína é considerada sendo desmascarada.

O termo "auto-anticorpo" se refere a qualquer anticorponaturalmente ocorrente produzido pelo sistema imune de um animal e que seliga a um auto-antígeno, isto é, a um composto ou antígeno produzido pelopróprio animal.

Os termos "fluido corporal" ou "fluido biológico" incluemqualquer fluido corporal incluindo plasma, soro e todo o sangue, saliva, urina,fluidos de lactação, fluido do sistema nervoso central (CNS), tal como fluidoespinhal cerebral e outros fluidos e secreções e que podem proteínas tal comoproteínas circulantes. O fluido corporal pode ser de qualquer vertebrado queproduz anticorpos, particularmente mamíferos e aves e mais particularmentehumanos. O termo "extrato contendo proteína de um fluido biológico" serefere a qualquer preparação que é coletada ou separada de um fluidobiológico, tal como frações de imunoglobulina. Fluidos biológicos incluindosangue, soro ou plasma que podem ser usados na presente invenção podemser obtidos recentemente de um indivíduo, ou podem ser obtidos de fontes taiscomo preparações agrupadas de sangue ou plasma obtidas de bancos desangue ou outras facilidades de coleção de sangue. Para os propósitos dapresente invenção, sangue, soro ou plasma também podem ser de coleçõesque estão fora de validade ou de outra maneira consideradas como subpadrãopor bancos de sangue ou facilidades de coleção de sangue. Embora estadescrição foque em sangue, plasma e soro e outros fluidos biológicoshumanos, o processo idêntico desta invenção também pode ser aplicado afluidos biológicos obtidos de animais e não deve resultar em obter anticorposanimais análogos para propósitos relacionados à medicina veterinária. Porexemplo, auto-anticorpos análogos foram detectados em amostras de cavalose galinhas (dados não mostrados). Preferivelmente, fluidos biológicos usadosno método da invenção podem ser diluídos para reduzir o efeito de quaisquerantioxidantes que podem estar contidos nestes.

Além disso, o método da presente invenção pode ser realizadoem um extrato tal como uma preparação de Ivlg ou qualquer outro extratoisolado ou concentração de imunoglobulinas. Como detalhado nos Exemplos,abaixo, tais preparações quando elas não são tratadas, mostram níveismínimos de auto-anticorpos. Proteínas mascaradas tal como auto-anticorposmascarados podem ser detectados e recuperados de tais preparações mediantetratamento com um agente oxidante ou corrente elétrica de CC de acordo comum método da presente invenção.

No método da presente invenção, a especificidade de ligaçãode pelo menos uma proteína circulante ou proteína de plasma em um fluidobiológico é alterada expondo a proteína a um oxidante ou a uma correnteelétrica. Por exemplo, a especificidade de ligação de uma proteína circulantemascarada pode ser alterada de forma que a proteína seja desmascarada, istoé, de forma que ela seja capaz de se ligar a um antígeno que ela não era capazde se ligar antes do método ter sido realizado. Uma proteína que teve suaespecificidade de ligação alterada pode então ser isolada e recuperada porqualquer método de separação baseada em ligação específica.

Se um agente oxidante é usado para realizar o método dainvenção, o agente oxidante pode ser qualquer composto que é capaz dealterar o estado redox de uma molécula biológica. Mais especificamente, oagente oxidante é uma molécula que tem a capacidade de ser reduzidaatuando como um aceptor de elétrons para outras moléculas que atuam comodoadoras de elétrons. Agentes oxidantes adequados incluem compostoscíclicos que contém um metal coordenado, particularmente um metal oxidantetal como ferro. Exemplos de agentes oxidantes incluem, mas não sãolimitados a hemina e clorofila. Outros agentes oxidantes tal como periodatode sódio (NaIO4) ou permanganato de potássio (KMnO4). Tipicamente,quando um agente oxidante é usado, uma mistura do fluido ou extratobiológico e o agente oxidante deve ser incubada por um período de tempo,tipicamente por cerca de um dia ou durante a noite. O agente oxidante deveser usado em uma concentração grande o suficiente para alterar aespecificidade de ligação de uma proteína tendo uma especificidade deligação alterável, mas não em uma concentração que pode destruir oudesnaturar a proteína. No caso de auto-anticorpos, foi encontrado quediferentes tipos de auto-anticorpos podem interagir diferentemente comdiferentes antioxidantes. Por exemplo, para o desmascaramento de auto-anticorpos de aPC, os resultados são muito bons com KMnO4 e não tão bonscom hemina.

Se uma corrente elétrica de CC é usada para realizar o métododa invenção, o método pode ser realizado por qualquer meio de fornecer umacorrente elétrica, tal como imergindo eletrodos positivos e negativos em umasolução condutora contendo a amostra a ser tratada. Tipicamente, umasolução contendo um fluido biológico pode ser exposta a um potencialelétrico de uma magnitude suficiente e de uma duração suficiente para alterara especificidade de ligação de uma proteína tendo uma especificidade deligação alterável. Foi encontrado que resultados positivos podem ser obtidosexpondo uma solução a um potencial elétrico de 6 - 24 volts por uns poucossegundos a uns poucos minutos. Como discutido nos exemplos, umaexposição estendida a uma corrente elétrica pode resultar em reversibilidadeda alteração da especificidade de ligação.

Sem se ater a uma teoria específica, é preferido, no caso de umauto-anticorpo, que o auto-anticorpo seja exposto ao agente oxidante oucorrente elétrica em uma quantidade ou por um tempo suficiente para oxidarum sítio de ligação a antígeno em uma porção Fab do auto-anticorpo. Foiencontrado por experimentos adicionais usando detecção por anticorposantinitrotirosina que IgG que foi exposta à oxidação por hemina tem um graumaior de nitrosilação do que IgG não tratada. Por conseguinte, pode serteorizado que a alteração do sítio de ligação a antígeno de proteínas, eparticularmente a alteração do sítio de ligação a antígeno de auto-anticorpos éefetuada por nitrosilação reversível de resíduos de tirosina em e ao redor daregião hipervariável do anticorpo, o que pode produzir mudançasconformacionais no sítio de ligação a antígeno.

Se uma proteína de interesse particular é uma que tem umaespecificidade de ligação que pode ser alterada mudando seu estado redox e aefetividade de qualquer conjunto de condições para alterar a especificidade deligação da proteína de interesse particular pode ser prontamente determinadapor sujeição da proteína ou um fluido biológico contendo uma proteína a umamudança em estado redox, por exemplo, expondo a proteína ou fluidobiológico a um agente oxidante e então usando ELISA ou outros ensaios deligante e receptor para determinar se a especificidade de ligação da proteínafoi alterada. Em outras palavras, um ensaio de uma amostra ou de uma sériede amostras tiradas de um indivíduo pode ser realizado antes e depois de umaproteína ser sujeita a uma mudança em condições redox para ver se oprocesso alterou a especificidade de ligação da proteína. Por exemplo, omelhor agente oxidante para recuperar um auto-anticorpo específico pode serprontamente determinado por experimentação simples.

Um aspecto adicional da presente invenção é a possibilidadede tratar um indivíduo tendo uma doença autoimune, baseada em uma novacompreensão de como estas doenças podem surgir. Por exemplo, se éconhecido que doenças autoimunes surgem pelo desmascaramento de auto-anticorpos que estão presentes em uma forma mascarada em indivíduossaudáveis, então tratamento e prevenção podem focar em inibir ou reverter odesmascaramento de auto-anticorpos, tal como tratando o indivíduo com umantioxidante ou agente redutor para causar reversão de auto-anticorpos paraum estado mascarado. Agentes que foram encontrados inibindo uma reaçãode desmascaramento de auto-anticorpos incluem antioxidantes tal como ácidoascórbico, hemopexina e apotransferrina. Similarmente, um método detratamento pode incluir tomar uma amostra de sangue do indivíduo, expor aamostra de sangue a um antioxidante, agente redutor ou corrente elétricasuficiente para inativar auto-anticorpos em dita amostra de sangue, e retornara amostra de sangue para o indivíduo.

Um aspecto adicional da presente invenção é um método detriar o fluido ou extrato biológico de um indivíduo para determinar quais auto-anticorpos são mascarados e assim construir um perfil de anticorpo potencialde auto-anticorpos que poderiam causar doença autoimune naquele indivíduose exposto ou desmascarado por oxidação ou uma força eletromotriz. Porexemplo, em termos gerais, uma amostra biológica de um indivíduo pode serensaiada para determinar uma quantidade e/ou tipo de auto-anticorposdetectáveis na amostra. Depois disso, uma amostra biológica do indivíduopode ser tratada expondo a amostra a um agente oxidante ou uma correnteelétrica de CC, e a amostra do indivíduo pode ser ensaiada para determinaruma quantidade e/ou tipo de auto-anticorpos detectáveis na amostra tratada.Depois disso, a quantidade e/ou tipo de auto-anticorpos detectáveis naamostra antes da etapa de tratamento pode ser comparada com a quantidadee/ou tipo de auto-anticorpos detectáveis na amostra depois da etapa detratamento. Estas mesmas etapas do método podem ser realizadas paradeterminar a efetividade de qualquer composto particular, composição oucondições para atingir uma alteração de um sítio de ligação de proteínas emqualquer amostra particular.

Foi encontrado que amostras não tratadas de sangue, plasma,soro ou Ivlg e amostras tratadas de sangue, plasma ou soro ou Ivlg de acordocom o método da presente invenção podem ser liofilizadas e transportadas ouarmazenadas. Quando as amostras são reconstituídas, elas retêm sua atividaderespectiva.

EXEMPLOS

Tendo descrito a invenção, os exemplos seguintes são dadospara ilustrar aplicações específicas da invenção, incluindo a melhor maneiraagora conhecida para realizar a invenção. Os exemplos são apresentados emordem cronológica aproximada e assim mostram uma progressão nacompreensão de componentes e procedimentos requeridos para atingir osefeitos da invenção. Estes exemplos específicos não são pretendidos paralimitar o escopo da invenção descrita neste pedido.

Considerando cada um dos exemplos 1-17 descritos nestelugar, a menos que de outra maneira observado, o procedimento seguinte foitipicamente usado: Uma amostra de 10 ml de sangue integral ou 5 ml de soroou plasma de um indivíduo normal aPL-negativo e 4-5 ml de célulasvermelhas de sangue de mamífero empacotadas foram adicionadas a umfrasco contendo 30 ml de meio de crescimento de cultura bacteriana da marcaBiomerieux (contendo pelo menos os seguintes ingredientes: água destilada,caldo de digerido de soja e caseína, extrato de levedura; dextrose; sacarose;hemina; menadiona (vitamina K3); piridoxal HCI (vitamina B6); epolianetolsulfonato de sódio (SPS) e carvão vegetal). Então, a mistura foiincubada, com sacudida ou agitação, a 37°C por um período de 18-22 horas.Seguindo a incubação e centrifugação, uma amostra do sangue ou soro/RBCincubado foi testada para a presença de anticorpos antifosfolipídeos (aPL)usando um formato compreensivo doméstico de ELISA aPL que fornece 24resultados separados de teste de aPL. O procedimento de teste é descrito emmaior detalhe nas seguintes publicações, incorporadas neste lugar porreferência: Wagenknecht DR, et al., The Evolution, Evaluation andInterpretation of Anti-phospholipid Antibody Assays, Clinicai ImmunologyNewsletter, Vol. 15, No. 2/3 (1995) pp. 28 - 38 e McIntyre JA, et al.,Frequency and Specificities of Anti-phospholipid Antibodies (aPL) inVolunteerBlood Donors, lmmunobiology 207(1): 59-63, 2003.

Figura 1 mostra as 24 especificidades separadas de aPL queforam testadas para usar o formato compreensivo doméstico de ELISA aPL.Quatro especificidades foram ensaiadas, 1) aPS = antifosfatidilserina, 2) aCL= anticardiolipina, 3) aPE = antifosfatidiletanolamina, e 4) aPC =antifosfatidilcolina. Para cada uma destas especificidades de aPL, três isotiposde imunoglobulina foram procurados, IgG, IgA e IgM. Cada especificidade ecada isotipo foram ensaiados na presença (dependente) e ausência(independente) de um suplemento diluente de tampão, 10% de plasma bovinoadulto (ABP), que contém as proteínas de plasma de ligação a fosfolipídeo ou1% de albumina no soro bovino, (BSA, que é desprovido de proteínas deplasma de ligação a fosfolipídeo), respectivamente. A diluição final dasamostras de sangue do indivíduo foi entre 1/50 e 1/100.

Os resultados nas 24 especificidades de aPL obtidas para osvários experimentos descritos neste lugar são dados nas figurasacompanhantes. Os resultados positivos/negativos são expressos em múltiplosdas médias (MoM) baseados em teste de amostras de plasma de 775 doadoressangüíneos normais, como descrito em McIntyre JA, lmmunobiology, acima.A presença de +++ indica forte atividade de anticorpo. Os marcadores de + e++ indicam atividade de anticorpo baixa e intermediária, respectivamente. Asfiguras também fornecem os valores normais de variação de cadaespecificidade de aPL e combinação de isotipos.

Um resultado positivo na coluna indicada como "dependente"de proteína de ligação significa que o anticorpo antifosfolipídeo (aPL) estáatualmente ligado a uma proteína de plasma que inicialmente se ligou aofosfolipídeo particular indicado. Proteínas de plasma que tipicamente podemser ligadas por PS e CL incluem as seguintes: beta2 glicoproteína I,protrombina, proteína C, proteína S, anexina V, e componentes decomplemento Fator H e C4 (veja, por exemplo, Mclntyre, J.A., Wagenknecht,D.R. and Faulk, W.P. Anti-phospholipid antibodies: Discovery, definition,detection and disease. Prog. Lipid Res. 42(3): 176-237, na página 182). Anatureza fisiológica da ligação de proteína de plasma não é precisamenteconhecida para todos os fosfolipídeos, mas acredita-se que tal ligação induzamudanças conformacionais na estrutura de proteína de plasma, com issoexpondo epítopos novos ou críticos que então são direcionados pelos auto-anticorpos dos indivíduos. Proteínas de plasma que tipicamente podem serligadas por fosfolipídeo PE incluem as seguintes: cininogênios de pesomolecular alto e baixo, e fator XI e precalicreína. As últimas duas proteínaspodem ser detectadas por virtude de sua fidelidade em ligação a cininogêniode peso molecular alto. As proteínas de plasma que se ligam a PC ainda nãoforam definidas. Em certos experimentos, aPL independente de proteína deplasma são observados (veja Figura 3). Uma possível explicação para estaatividade é que ela representa a presença de proteínas de plasma de ligação afosfolipídeos residuais que estão presentes na amostra de sangue original.

Exemplo 1

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento descrito acima. Os resultados do aPLELISA são mostrados em Figura 2. Como mostrado em Figura 2, a amostrade sangue incubada mostra uma presença dramática de autoatividade deanticorpo, em comparação com a amostra de sangue normal não tratadamostrada na coluna de variação Normal. Em particular, forte autoatividade deanticorpo é mostrada em uma categoria dependente de proteína para aPS(IgG), aCL (todos os isotipos), e aPE (IgG). A baixa ou ausente autoatividadede anticorpo IgG aPC foi um resultado característico nos primeiros exemplose em procedimentos nos quais hemina foi usada como o agente oxidante. Esteresultado indica que auto-anticorpos para PC, especialmente do isotipo IgGsão diferentes e talvez não se tornem ativados da mesma maneira que osoutros são. Em experimentos posteriores, foi encontrado que níveissignificantes de aPC podem ser detectados em amostras que foram tratadascom KMnC>4 (dados não mostrados).

Exemplo 2

Amostras de sangue extraídas de sete indivíduos saudáveisforam incubadas e testadas de acordo com o procedimento descrito acima. Emparticular, todos os sangues dos sete indivíduos foram extraídos dentro de umperíodo de 20 minutos e incubados por 20 horas em condições idênticas.Figura 3 é uma tabela composta mostrando a variação de soroconservação deaPL para estas sete amostras. Estes resultados mostram que existem variaçõesnos níveis de aPL detectados assim como nos isotipos presentes entreindivíduos diferentes. Todavia, como mostrado pela invenção, cada indivíduoteve anticorpos aPL que puderam ser detectados depois de incubação.

Exemplo 3

Em um primeiro experimento, uma amostra de soro de umindivíduo normal foi incubada e testada de acordo com o procedimento básicodescrito acima. Na mistura de incubação, células vermelhas do sangue decavalo (RBC) foram usadas ao invés de RBC humanas. Os resultados do aPLELISA são mostrados em Figura 4. Como mostrado em Figura 4, atividadesignificante de aPL foi obtida, particularmente com respeito a aPS (IgG eIgM) e aCL (IgA e IgM).

Em um segundo experimento, um soro de cavalo, ao invés desoro humano, foi incubado com RBC humanas e testado de acordo com oprocedimento básico descrito acima. Os resultados do aPL ELISA sãomostrados em Figura 5. Como mostrado em Figura 5, atividade de aPL nãofoi obtida. (O ensaio de ELISA usado neste experimento utilizou sondas deanticorpo marcado com fosfatase alcalina específica de anticorpo humanopara detectar aPL, portanto se a amostra incubada continha aPL de cavalo édesconhecido.)

Os resultados mostrados resumidos em Figuras 4 e 5inequivocamente demonstram que todos os aPL que são obtidos durante oprocesso de soroconversão da presente invenção se originam do soro humanoe não são liberados das RBC humanas, uma vez que o primeiro experimentousa RBC de cavalo, que são destituídos de anticorpos humanos, em lugar deRBC humanas e ainda mostra resultados positivos, ao passo que o segundoexperimento usa soro de cavalo na presença de RBC humanas e mostraresultados negativos.

Exemplo 4

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, exceto que aincubação foi realizada em temperatura ambiente (22°C), ao invés de em umatemperatura elevada. Figura 6 mostra que a amostra não passou porsoroconversão quando incubada em temperatura ambiente. Estes resultadossugerem que o processo de soroconversão pode ser sensível à temperatura.

Exemplo 5

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com acaracterística de que microesferas de Degalan (plástico) de 0,7 mm foramusados como sólido particulado na mistura de incubação ao invés de carvãovegetal. Uma vez que carvão vegetal foi usado em experimentos iniciaismostrando soroconversão, este experimento foi realizado para determinar secarvão vegetal desempenha um papel específico na soroconversão. Figura 7mostra que a amostra exibiu soroconversão mesmo quando microesferas deplástico foram usados em lugar de carvão vegetal. Estes resultados sugeremque o papel de carvão vegetal é mecânico, preferivelmente do que químico, nanatureza, e que qualquer sólido particulado, tal como microesferas de plástico,resina ou vidro, pode ser usado. Sem ser limitado a qualquer teoria particular,pode ser teorizado que o componente particulado atua como um abrasivo namembrana de RBC, provavelmente causando liberação do íon de NO dasRBC, ou interagindo com a proteína RBC AEl/Banda 3 ou com as moléculasde transição de SNO-hemoglobina ou ambas. A possibilidade de abrasãomecânica é sustentada pela observação em Exemplo 6, caracterizado pelo fatode que resultados negativos de ensaio são mostrados para uma mistura deincubação que não é sacudida ou agitada. Os sólidos particulados tambémpodem servir uma função mecânica de assistir liberação de auto-anticorpo.

Exemplo 6

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima exceto que amistura de incubação foi mantida estacionária, ao invés de ser agitada ousacudida. Figura 8 mostra que a amostra não passou por soroconversãoquando ela foi mantida estacionária. Estes resultados sugerem que movimentopode facilitar interação entre partículas sólidas e RBC. Condições deincubação estacionária não facilitam liberação de aPL, embora uma pequenaquantidade de movimento tal como produzido por transporte das amostraspara o incubador possa produzir pequenas quantidades de liberação de aPL.

Exemplo 7

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com acaracterística adicionada de que depois de incubação e remoção de RBC ecarvão vegetal por centrifiigação, a mistura de incubação foi aquecida para56° C por 30 minutos. Figura 9 mostra que a quantidade de aPL detectado foisignificantemente aumentada por este procedimento.

Exemplo 8

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com acaracterística de que um meio de crescimento de cultura bacteriana de umfornecedor diferente (Becton Dickinson, Sparks, MD) foi usado no lugar domeio de crescimento de cultura bacteriana de Biomerieux. Figura 10 mostraque a amostra exibiu soroconversão no meio de Becton Dickinson, indicandoque o método da presente invenção não é dependente de um meio decrescimento de cultura bacteriana de uma fonte particular.

Exemplo 9

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com acaracterística de que a incubação ocorreu em condições anaeróbicas (sobnitrogênio) ao invés de em condições aeróbicas (na presença de oxigênio eCO2). Figura 11 mostra que a amostra exibiu soroconversão mesmo emcondições anaeróbicas e que o método da presente invenção não é dependentede um ambiente aeróbico.

Exemplo 10

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, com acaracterística de que células K562 (uma linhagem celular humana de tumorhematopoiético) foram usadas ao invés de células vermelhas do sangue.Ademais, apenas 11,3 milhões de células K562 estiveram presentes nos meiosde cultura, comparado com 3-4 ml de RBC empacotadas tipicamente usadosno método da invenção. Figura 12 mostra que a amostra exibiusoroconversão.

Outros experimentos mostraram que amostras que sãoincubadas com outros tipos celulares isolados, linfócitos, monócitos eneutrófilos tipicamente não exibem soroconversão de aPL. Em particular,células brancas de sangue da série linfóide e mielóide não sustentaramliberação de aPL, nem uma linhagem celular de linfócitos B porcinosdesignada como L14 (dados não mostrados). Estes resultados sugerem quehemoglobina pode ser um componente chave na mistura de incubação, umavez que células K562 e RBC contêm hemoglobina, e linfócitos, monócitos eneutrófilos não.

Exemplo 11

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima, exceto que omeio de crescimento de cultura bacteriana foi substituído por um meio decultura celular usado para crescer células humanas: RPML Figura 13 mostraque soroconversão não ocorreu. Este experimento mostra a importância dealguns ingredientes no meio de cultura bacteriana para o propósito destainvenção. Embora RPMI seja um meio de cultura designado para célulashumanas, ele não sustenta liberação de aPL quando substituído por caldo defrasco. Listagens e comparações dos ingredientes nos dois diferentes caldosde frasco de microbiologia com RPMI mostram que RPMI carece de hemina emenadiona (uma provitamina K feita pelo homem) chamada vitamina K3. Econhecido que hemina é um quelante de porfirina de ferro (Fe+++) derivadode RBC, e menadiona é uma vitamina solúvel em gordura. Isto indica quereações de redox podem desempenhar um papel em liberação de auto-anticorpo.

Exemplo 12

Uma amostra de sangue de cordão umbilical placentárioincubada e testada de acordo com o procedimento básico descrito acima. Aamostra de sangue de cordão umbilical placentária foi extraída depois donascimento do bebê, mas antes da placenta ser desacoplada da parede uterina.Nem o sangue da mãe nem o sangue da corda do bebê mostraram a presençade aPL em ensaios convencionais de laboratório. Quando processado deacordo com a invenção descrita neste lugar, anticorpo aPL forte foidemonstrado presente nas amostras de sangue de cordão umbilical, comomostrado em Figura 14. Os anticorpos foram IgG apenas, uma observaçãoque é compatível com anticorpos de origem maternal. Uma vez que a mãetransporta IgG para o feto antes de nascimento, este experimento pareceindicar que os auto-anticorpos maternais mascarados transportados para o fetopor meio de receptores de Fcy especializados no trofoblasto (FcyRn)permanecem mascarados pelo feto no sangue fetal. Uma vez que o sangue damãe e o sangue da corda mostraram ser aPL-negativos antes de soroconversãopelo método da invenção, e uma vez que não foram detectadasimunoglobulinas IgM ou IgA, estes resultados sustentam o ponto de vista deque a IgG aPL observada no sangue de cordão umbilical subseqüente asoroconversão são maternais em origem. Também é de interesse que otrofoblasto que expressa o FcyRn não expresse antígenos HLA.

Exemplo 13

Uma amostra de plasma de um indivíduo normal foi incubadae testada de acordo com o procedimento básico descrito acima; com acaracterística de que nitroprussiato de sódio (SNP, 200 micromolar) foi usadono lugar de RBC na mistura de incubação. Figura 15 mostra que a amostraexibiu soroconversão.

Uma vez que SNP é um doador potente de óxido nítrico (NO),estes resultados fornecem evidência assistente de que o radical NO estáenvolvida na liberação de auto-anticorpo e sustentam adicionalmente umateoria de que RBC e particulados sólidos cumprem um papel de fornecerdoação de NO da RBC. Outras reações mediadas por radical livre foranitroprussiato de sódio também podem causar liberação de auto-anticorpo.

Exemplo 14

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadade acordo com o procedimento básico descrito acima e foi testada paraatividade anticoagulante lúpico. Anticoagulante ou inibidor de lúpus é outrotipo de aPL e é tipicamente detectável apenas por ensaios funcionais delaboratório. Os resultados em Figura 16 mostram um forte anticoagulantelúpico (LA) no sangue soroconvertido tirado de um indivíduo negativo parainibidor de lúpus e processado pelo método desta invenção. Emborainicialmente corrigido adicionando plasma normal ao caldo soroconvertido noensaio dRWT, incubação por 1-2 horas resultou no reaparecimento doinibidor. Este quadro de tempo é proposto como o tempo que leva pra o LAou anticorpos desmascarados se ligarem a proteínas de plasma de ligação afosfolipídeos relevantes introduzidas pelo estudo de mistura. Isto tambémdescarta a possibilidade de deficiências de fator de coagulação uma vez queuma mistura 1:1 fornece níveis suficientes de fatores de coagulação paracorrigir tempos de coagulação em uma amostra deficiente de fator. O tempode diluição de protrombina (dPT) não corrigiu na presença de plasma normale prolongamento aumentado de tempos de coagulação foi observado depoisde incubação com plasma normal, o que é indicativo de um forte inibidor delúpus.

Exemplo 15

Amostras de sangue de cinco indivíduos normais foramincubadas de acordo com o procedimento básico descrito acima e foramtestadas por microscopia de fluorescência para a presença de outros tipos deauto-anticorpos. Amostras de soro e plasma destes cinco indivíduos foramnegativas antes de processamento de acordo com os ensinamentos dainvenção. Figura 17 lista especificidades adicionais de auto-anticorpoidentificadas usando a linhagem celular Hep-2. Foram identificadosantinucleolar (associado a escleroderma), antilaminas (muito brilhosas emporos nucleares), antimitocondrianos (citoplásmicos), e anticentríolo. Osresultados mostram que auto-anticorpos liberados pelo o método da presenteinvenção também podem ser detectados por uma diferente metodologia dedetecção, microscopia de fluorescência, em contraste com teste baseado emELISA. Os resultados confirmam que muitos tipos de auto-anticorpos além deaPL são mascarados no sangue de indivíduos cujos soros e plasmas testamnegativos para estes anticorpos em análise de rotina de laboratório.

A partir destes resultados, pode ser esperado que muito maisespecificidades de auto-anticorpo aguardem ser encontradas testando sanguesprocessados por esta invenção.

Exemplo 16

Uma amostra de sangue de um indivíduo normal foi incubadade acordo com o procedimento básico descrito acima e foi testada parareatividade com monócitos usando citometria de fluxo e anticorpos IgG anti-humanos conjugados fluorescentes. Teste comparativo foi feito com soroshumanos normais agrupados não tratados (NHS), com soro do mesmoindivíduo normal usado com a invenção e com soros humanos de controlepositivo. (O sangue tratado não mostrou nenhuma auto-reatividade comlinfócitos e neutrófilos; estes dados não são mostrados.) Figura 18 descreve operfil de dispersão direta (tamanho) e dispersão lateral (granularidade) dapopulação de células de monócitos do indivíduo normal como definido porcitometria de fluxo. Esta população de células de monócitos foi confirmadamostrando reatividade com anticorpos monoclonais CD 14. Figura 19Amostra reatividade antimonócito com NHS. A reatividade média mostrada é743,50 em uma escala linear. Figura 19B mostra a atividade auto-antimonócitos do soro do indivíduo normal; este indivíduo não tem atividadede anticorpo para monócitos autólogos. A reatividade média mostrada é737,00. Figura 19C mostra atividade auto-antimonócitos de uma amostra desangue do indivíduo mostrada em Figura 19B depois dela ser tratada deacordo com o método da invenção. O valor médio mostrado é 864,00,indicando forte atividade auto-antimonócitos. Apesar do fato de que plasmasprocessados de acordo com os ensinamentos da invenção foram usados emuma diluição de 1/8, eles mostraram mais reatividade com monócitos do queos soros não diluídos de controle positivo. Assim, este exemplo mostra queamostras de sangue ou soro processadas de acordo com o método destainvenção liberam auto-anticorpos que almejam especificamente monócitos.Os mesmos resultados foram documentados para quatro amostras adicionaisde outros indivíduos quando processadas de acordo com os ensinamentos dainvenção.

Exemplo 17

Testes comparativos para a presença de anticorposantinucleares (ANA) usando um ensaio de triagem RELISA® foramrealizados em soro não tratado de sangue de cordão umbilical; sangue decordão umbilical incubado de acordo com o método da presente invenção,com nenhuma sacudida; sangue de cordão umbilical tratado de acordo com ométodo da presente invenção, com sacudida; soro não tratado de um doadorsaudável ΑΝΑ-negativo (identificado como ACS) e soro do mesmo doadorsaudável ΑΝΑ-negativo que foi incubado de acordo com o método dapresente invenção. Como mostrado em Figura 20, uma quantidadesignificante de ANA foi identificada nas amostras de sangue de cordãoumbilical e soro que foram tratadas pelo método da presente invenção. Apartir dos resultados em Figuras 16 e 17, pode ser esperado que muito maisespecificidades de auto-anticorpo aguardem ser encontradas testando sanguesprocessados por esta invenção.

Exemplo 18

Para entender o papel de células vermelhas do sangue nofenômeno de liberação de auto-anticorpo, experimentos foram projetados parasubstituir as células vermelhas do sangue por ingredientes mais simples quepodem mimetizar a ação das células vermelhas do sangue. No presenteexperimento, as células vermelhas do sangue e carvão vegetal foramsubstituídos por nitroprussiato de sódio (SNP) e cloreto férrico. Estasubstituição foi feita porque nitroprussiato de sódio é um produtor poderosode óxido nítrico, e é conhecido que as RBC são carreadoras de NU. Cloretoférrico (solução estoque de FeCl3, 25 uM), foi adicionado como um substitutopara o ferro em hemoglobina.

Frascos de cultura contendo o meio de crescimento de culturabacteriana e 5 ml de plasma ou soro humano e concentrações variadas denitroprussiato de sódio (SNP, 200 pm) e cloreto férrico exógeno(concentração final de 4,1 pm) foram usados no lugar de células vermelhas dosangue e carvão vegetal, foram incubados a 37°C e então aquecidos para 56°Cpor 30 minutos. As amostras mostraram soroconversão de aPL, mas apenasIgG (dados não mostrados).

Os resultados sugerem que NO" pode ser envolvido emdesmascaramento de anticorpo, e sugerem que a ação mecânica de ummaterial de fase sólida no frasco de cultura rompa as células vermelhas dosangue e libere NU. Alternativamente, a liberação ou modificação de NOpode possibilitar que a molécula de hemoglobina participe em reações redox.

Exemplo 19

Em um esforço para determinar se o efeito de desmascararauto-anticorpos foi devido à degradação de estruturas macromolecularescontendo auto-anticorpo dentro de soro ou sangue ou se ele foi devido amudanças diretas na especificidade de ligação de anticorpos por si só, umasérie de experimentos foram realizados nos quais imunoglobulina intravenosacomercial (Ivlg) foi substituída por plasma ou soro humano. Ivlg comercial éuma fração de precipitado de álcool de plasma agrupado de múltiplosdoadores, tipicamente de 1.000 - 10.000 doadores. Tipicamente, Ivlg contémprimariamente IgG5 e é principalmente desprovido de IgA, IgM e outrasproteínas de plasma. Quando Ivlg não tratado é testado para a presença deauto-anticorpos por teste ELISA, os resultados de teste são negativos. Porcausa desta maneira de preparação, Ivlg também é livre de micelas delipoproteína, vesículas ou outras estruturas macromoleculares. Portanto, sefosse para Ivlg testar positiva para a presença de auto-anticorpos depois de umtratamento de incubação, os auto-anticorpos teriam que ter sido obtidos poruma alteração de anticorpos IgG já presentes na preparação de Ivlg e não poruma degradação de estruturas ou vesículas ocultando os auto-anticorpos.

Nos exemplos que seguem, a preparação comercial de Ivlgusada foi Ivlg liofilizada (Immune Globulin Intravenous (Human) Gammar-PI.V., Aventis Behring, Kankakee, Illinois).

Uma preparação comercial de 5 gramas de Ivlg liofilizada foireconstituída em salina tamponada com fosfato estéril (PBS, lOOmg/ml). 1,7ml da solução reconstituída de Ivlg foi adicionado a um frasco de culturacontendo o meio de crescimento de cultura bacteriana (sem células vermelhasdo sangue ou carvão vegetal) e foi incubada a 37°C por 20 horas. A misturaincubada mostrou soroconversão e a presença de aPL IgG (dados nãomostrados). (Como esperado, apenas IgG foi detectada, nem IgA nem IgM.)

Em experimentos similares, auto-anticorpos foram detectadosem uma mistura que foi incubada em temperatura ambiente em um frasco deagitação, mas os resultados não foram tão bons como a 37 graus (resultadosnão mostrados).

Aquecer a mistura de Ivlg e meio de crescimento bacterianoacima de 37°C não resultou em aumentos adicionais em auto-anticorpos.

Como um controle, Ivlg direto fora do frasco foi testada paraaPL e outros auto-anticorpos, e os resultados foram negativos.

Exemplo 20

Em Exemplo 19, é mostrado que auto-anticorpos podem serobtidos incubando uma preparação comercial de Ivlg em um meio decrescimento bacteriano. A etapa seguinte foi tentar determinar quaisingredientes no meio de crescimento de cultura bacteriana desempenham umpapel na produção de auto-anticorpos detectáveis.

Primeiro, Ivlg em 2% de caldo de soja tríptica (TSB), (quecontém peptonas em uma proporção de 17 para 3 de digerido pancreático decaseína para digerido de mamão de soja, respectivamente) (o remanescentesendo água) foi incubada a 37°C por 20 horas com agitação. A misturaincubada foi testada para a presença de aPL, e os resultados foram negativos.

Em seguida, Ivlg foi incubada em um tubo de teste em caldode soja, nitroprussiato de sódio (SNP) e hemina (uma protoporfirina contendoferro (férrica)) a 37°C por 20 horas com agitação. As quantidades usadasforam 60 microlitros de Ivlg, 5 microlitros de SNP e 5 microlitros de heminaem um total de 1 ml de caldo de soja. A mistura incubada testou positiva paraa presença de aPL, particularmente aPS (15 MoM) e aPE (41 MoM). (dadosnão mostrados)

Exemplo 21

Uma série de experimentos foi conduzida para determinar seincubação com apenas hemina seria suficiente para causar o aparecimento deauto-anticorpos em Ivlg ou em plasma ou soro.

Ivlg liofilizada reconstituída (em uma concentração de 100Ivlg/ml) foi adicionada a e incubada em uma solução de salina tamponadacom fosfato (PBS) com hemina por 20 horas a 37°C. As quantidades usadasforam 300 pl de solução de Ivlg e 5 pl de uma solução de hemina (75 pg) emum volume total de 1 ml.

Como mostrado em Figura 21, a mistura incubada mostrouquantidades significantes de aPS e aPE IgG, e, em um menor grau, aCL IgG.

Quando soro ou plasma foram incubados com hemina emcondições similares, nenhum auto-anticorpo foi detectado.Exemplo 22

O fato de que resultados positivos para a presença de auto-anticorpos podem ser obtidos quando Ivlg foi incubada com hemina, ao passoque resultados negativos foram obtidos quando soro ou plasma foramincubados com hemina sugere que soro ou plasma poderiam contersubstâncias que inibem ou interferem no processo de obter auto-anticorpos.

Em uma série de experimentos, Ivlg foi incubada em umtampão Tris com hemina, por 20 horas a 37°C, similar ao processo deExemplo 21, com a característica adicionada de que uma quantidade crescentede soro humano (do inventor) foi adicionada aos grupos antes de incubação.Cada grupo separado foi testado para a presença de auto-anticorpos de aPS,aCL, aPE e aPC, e os resultados são mostrados em Figura 22. Os resultadosmostrados em Figura 22 demonstram que quantidades crescentes de sorotiveram um efeito inibidor na liberação de anticorpos antifosfolipídeos.Resultados similares foram mostrados com substituição de plasma por soro(dados não mostrados). Uma possível explicação para estes resultados é quehemina, que contém uma molécula de ferro no estado férrico e que éconhecida como um agente oxidante ativo, pode atuar para oxidar um sítio deligação de certas moléculas de imunoglobulina de forma que o sítio de ligaçãoalterado seja capaz de se ligara à auto-antígenos. Este processo pode serinibido por substâncias, talvez antioxidantes, no sangue.

Exemplo 23

Soro humano (do inventor) foi diluído 1/10 em tampão Tris.Em uma série de experimentos, este soro diluído, em grupos de 1 ml, foiincubado com umas quantidades crescentes de hemina, especificamente, 0 pl,10 pl, 25 pl e 50 pl. (Previamente, foi encontrado que hemina por si só não ésuficiente para causar a liberação de auto-anticorpos de sangue ou soro,embora ela tenha sido suficiente para causar tal liberação de Ivlg. Portanto, opropósito de diluir o soro foi diluir o efeito de quaisquer substânciasinterferentes encontradas no sangue, tal como antioxidantes.) Os gruposforam testados para a presença de auto-anticorpos de aPS, aCL, aPE e aPC, eos resultados são mostrados em Figura 23. Os resultados mostrados em Figura23 mostram que embora nenhuma quantidade significante de auto-anticorpostenha sido detectada em soro diluído quando O ou 10 pl de hemina éadicionada, quantidades significantes são detectadas com 25 pl de hemina.Por uma razão desconhecida, as quantidades de auto-anticorpos detectadosforam menores com 50 pl de hemina.

Exemplo 24

A próxima série de experimentos foi projetada para determinarse um antioxidante tal como vitamina C, que está presente em sangue, iriainibir a liberação de auto-anticorpos. Em uma série de experimentos, Ivlg foiincubada em um tampão Tris com hemina, com a característica adicionada deque uma quantidade crescente de ácido ascórbico (Vitamina C) foi adicionadaao tampão contendo hemina e permitida para misturar por 30 minutos antes deadicionar a Ivlg e antes de incubação. Como mostrado em Figura 24, houvecerca de 78% de inibição de liberação de aPE induzida por hemina com 1 Ivlgde Vitamina C, uma quantidade que representa uma concentração fisiológicade Vitamina C. Existe uma curva bifásica com liberação de aPS, que levanta apossibilidade de que Vitamina C em baixas concentrações possa atuar comoum agente oxidante, mas se torne um agente antioxidante (redutor) emconcentrações maiores.

Exemplo 25

A próxima série de experimentos foi projetada para determinarse o veículo no qual hemina está dissolvida tem um impacto nos resultadosobtidos e se o átomo de ferro em hemina é necessário. Em uma série deexperimentos, Ivlg foi incubada em um tampão Tris com hemina, ou comoutros aditivos. Em particular, em um exemplo, hemina foi solubilizada comNaOH. Em outro exemplo, ela foi solubilizada com DMSO. Em outrosexemplos, hematoporfirina IX (hplX), que é a mesma molécula que hemina,mas sem o ferro (Fe+++), foi usada no lugar de hemina e foi solubilizada comNaOH ou DMSO. Em outros exemplos, NaOH e DMSO foram testados comocontroles (sem hemina ou hplX). Como mostrado em Figura 25, o uso dehemina solubilizada com NaOH produziu resultados positivos para a presençade auto-anticorpos, ao passo que hemina + DMSO, hplX + NaOH, hplX +DMSO, NaOH apenas, e DMSO apenas não produziram resultados positivos.

Exemplo 26

Para estabelecer adicionalmente que hemina estava causandooxidação de anticorpos, quantidades equimolares de hemopexina (Hpx) foramadicionadas à mistura de Ivlg PBS hemina. Hpx é uma molécula antioxidantecom uma afinidade de ligação extremamente alta para ferro heme. Hpxliofilizada adquirida de SciPac (Kent, England) foi reconstituída em PBS a10mg/mi. Mostrados em Fig. 26 são os dados redox de aPS resultando deadição de concentrações crescentes de hemina a IvlgG reagida com adição deconcentrações equimolares de Hpx. Por causa da existência de uma interaçãode ligação 1:1 entre hemina e Hpx, a Hpx foi capaz de neutralizar acapacidade redox do ferro férrico presente em hemina.

Exemplo 27

Para ilustrar a ampla variação e atividade de auto-anticorposque podem ser obtidos por um tratamento de oxidação de Ivlg, uma série deWestern blots foram ajustados usando lisados celulares de 3 diferenteslinhagens celulares usando Ivlg tratada com hemina ou Ivlg não tratada comoanticorpos primários e usando conjugado anti-humano HRP etiquetado comoum controle (HRP = peroxidase de raiz forte). Os blots são mostrados emFigura 27. O lisado "B" é uma linhagem celular de linfócito B chamada Rajade um paciente com um linfoma. O lisado "T" é uma linhagem celularderivada de linfócito T chamada Jurkat de novo de um paciente leucêmico. Olisado U87MG é uma linhagem de blastócito de glioblastoma (câncer decérebro). Os lisados reduzidos foram corridos no gel em concentração de 50Ivlg/ml. Para obter a preparação de Ivlg tratada com hemina, 75 pg de heminafoi agrupada com Iml de PBS contendo 6 Ivlg de IvlgG. Incubação foi por 20horas a 37 graus. Em Figura 27, o blot caracterizado pelo fato de que Ivlgtratada com hemina foi usada como os anticorpos primários é rotulada "IgGde teste"; o blot caracterizado pelo fato de que Ivlg não tratada foi usadacomo os anticorpos primários é rotulado "Controle", e o blot ao qualconjugado anti-humano HRP etiquetado foi aplicado sem anticorposprimários é rotulado "Secundário". As preparações de IgG tratadas comhemina e não tratadas foram diluídas 1/1000 respectivamente. O conjugadoanti-humano HRP etiquetado foi usado em uma diluição de 1/5000.

Estes resultados mostram claramente que a IvIg tratada comhemina tem atividade abundante para componentes celulares humanos emcomparação com IvlgG não tratada e o conjugado controle, que não.

Exemplo 28

O próximo experimento foi realizado para determinar seagentes oxidantes outros do que hemina, e em particular, agentes oxidantesque não contêm ferro, seriam efetivos para desmascarar auto-anticorpos. Umamistura de 25 μg de permanganato de potássio (KMnO4) em umaconcentração de 100 μμΜ, e 2 Ivlg de IvIg em um volume total de 1 ml desalina tamponada com fosfato foi incubada durante a noite a 37°C. Na misturaincubada, aPC e aPS puderam ser detectados. aCL foi normalmente detectado,mas não aPE (dados não mostrados). Foi posteriormente determinado queuma razão pela qual aPE não é detectado é porque KMnO4 altera o antígenode fosfolipídeo PE usado no teste ELISA.

Exemplo 29

Depois de ter sido mostrado que auto-anticorpos podem serdesmascarados por reações de oxidação, a próxima questão foi se métodoseletroquímicos, tal como uma força eletromotriz de uma bateria, podematingir o mesmo efeito.

Ivlg foi dissolvida em uma solução de salina tamponada comfosfato, e, em experimentos separados, eletrodos de aço galvanizado, cobre,ou aço inoxidável foram conectados aos terminais positivos e negativos deuma bateria de 9 volts e foram submersos na solução por 1-2 minutos.Durante este período, borbulhar foi observado na solução e a solução de PBSmudou de cor (azul quando fios de cobre foram usados, marrom quando fiosde aço inoxidável foram usados e verde quando fios de aço galvanizado foramusados). Como mostrado em Figuras 28A e 28B, a solução tratada testoupositiva para a presença de auto-anticorpos de aPS, aCL, aPE e aPC, em testedependente de aPL, e positiva para a presença de auto-anticorpos de aPS, aPEe aPC em teste independente de aPL.

Exemplo 30

Para evitar a interação de metais com a solução e com issodeterminar o efeito apenas de uma corrente elétrica, eletrodos de grafite foramusados em lugar dos eletrodos de metal. Grafite é inerte, mas é capaz depassar elétrons em soluções condutoras sem participar em reações.

Ivlg foi dissolvida em uma solução de salina tamponada comfosfato, e eletrodos de grafite conectados aos terminais positivos e negativosde uma bateria de 6 volts foram submersos na solução por 60 segundos. Comomostrado em Figura 29, a solução tratada testou positiva para a presença deauto-anticorpos de aPS, aPE e aPC.

Exemplo 31

Nos experimentos envolvendo aplicar corrente elétrica asoluções de Ivlg em salina tamponada com fosfato, um aumento significanteem pH foi observado, possivelmente devido à formação de NaOH. A fim demanter as reações em níveis de pH fisiológico, um meio de cultura celular,RMPI, foi substituído pela salina tamponada com fosfato.

A próxima série de experimentos foi realizada para determinaros efeitos do tempo de exposição à corrente elétrica no desmascaramento deauto-anticorpos. Ivlg foi dissolvida em RMPI5 um meio de cultura celular eeletrodos de grafite conectados aos terminais positivos e negativos de umabateria de 6 volts foram submersos na solução por uma quantidade variável detempo. Como mostrado em Figura 30, a liberação máxima de aPL dependentefoi obtida depois de 60 segundos de exposição à corrente. Curiosamente, entre2 minutos e 4 minutos, a quantidade de aPL declinou ou desapareceu.

Exemplo 32

Uma vez que o experimento prévio mostrou que anticorposaPL podem ser obtidos a partir de Ivlg depois de exposição a uma correnteelétrica, mas que os anticorpos aPL desapareceram depois de exposiçãoadicional à corrente, a próxima questão foi se o desmascaramento de auto-anticorpos poderia ser revertido por uma corrente elétrica. Isto é, poderia umsoro de controle positivo ser tratado de forma que auto-anticorpos não fossemmais detectáveis?

Em experimentos separados, soro de controle positivo de aCL,em uma diluição de 1:400, soro de controle positivo de aPE em uma diluiçãode 1:75, e aPS em uma diluição de 1:400 foram expostos a uma correnteelétrica imergindo eletrodos de grafite conectados aos terminais positivos enegativos de uma bateria de 6 volts por até 240 segundos. Como mostrado emFiguras 3IA - 31C, cada soro de controle se tornou negativo para suarespectiva especificidade.

Exemplo 33

Baseado nos resultados em Exemplo 32, a próxima questãoque foi perguntada foi se auto-anticorpos de um paciente tendo uma doençaautoimune poderia ser remascarado se o soro do paciente fosse exposto a umacorrente elétrica. Soro de um paciente tendo níveis elevados de aPS e aCL foidiluído 1/400 com salina tamponada com fosfato (a diluição em PBS foi emuma quantidade que iria atingir um valor de OD de 1.000 em 10-15 minutos)e eletrodos de grafite conectados aos terminais positivos e negativos de umabateria de 6 volts foram submersos na solução por uma quantidade variável detempo. Como mostrado em Figura 32, a quantidade de aCL e aPS detectávelna amostras do soro do paciente autoimune declinou significantemente depoisde 30 segundos e não foi mais detectável depois de 2 minutos. Estesexperimentos foram repetidos para outros anticorpos do paciente e o mesmoresultado foi obtido (dados não mostrados).

Exemplo 34

Em um experimento anterior, uma amostra de sangue de umpaciente que teve um título IgA aPE muito específico e alto foi exposta ahemina em um frasco de cultura de microbiologia de rotina. Foi observadoque depois de exposição a hemina her IgA aPE desapareceu, e a emergênciade IgG aPS, aCL e mais espetacularmente, IgG aPE foi detectada no ELISAde aPL. No momento, uma explicação para este fenômeno não foiprontamente perceptível.

Com a descoberta de um processo de desmascaramento maisrápido usando corrente elétrica, se tornou possível confirmar os resultadosanteriores com outro paciente tendo um alto aPE. Neste experimento, soro deum paciente tendo um alto aPE foi diluído em PBS por 1/75 e eletrodos degrafite conectados aos terminais positivos e negativos de uma bateria de 6volts foram submersos na solução por uma quantidade variável de tempo.Como mostrado em Fig. 33, o aPE se tornou indetectável (mascarado) dentrode 30 segundos de aplicação de uma corrente DC de 6 volts, com umdesmascaramento concomitante e detecção de IgG de aPS e aCL. O aPLrecentemente desmascarado atingiu pico por volta de 30 segundos apenas parase tornar mascarado de novo depois de 2-4 minutos de exposição.

Um aspecto técnico importante tratado pelo experimentoacima foi que o paciente aPE foi tratado separado da proteína de plasmadiluente usada no ensaio, no presente caso, 10% de plasma bovino adulto(ABP). Em outros experimentos não mostrados, os soros diluídos de pacientesforam expostos a condições de EMF de 6 volts antes de adicionar as proteínasde plasma usada no diluente de ELISA. O aspecto importante destesexperimentos foi mostrar que os efeitos de EMF estavam sendo aplicados aosanticorpos dos pacientes e não a mudanças de EMF nas proteínas de plasmausadas no diluente.

Estes dados experimentais sustentam as observações de quereações redox estão determinando o aparecimento e desaparecimento dediferentes especificidades de anticorpos. O que também é aprendido a partirdestes experimentos é que os efeitos redox parecem ser limitados ao(s) sítio(s)de ligação do anticorpo, a porção Fab da molécula de anticorpo. Isto se deveao fato dos conjugados marcados com anticorpo anti-humano heterólogousados no ELISA não serem afetados pois os conjugados continuam areconhecer os diferentes alvos de cadeia pesada de anticorpo (porções Fc) damolécula de anticorpos. Assim, como o anticorpo humano não é consumidoou destruído por redox, a explicação mais plausível é que o sítio de ligação deanticorpo na porção Fab da molécula de anticorpo contenha elétronsacessíveis que podem participar no processo de oxidação/redução.

Exemplo 35

Os próximos experimentos foram realizados para ver seproteínas de plasma outras do que auto-anticorpos podem ter sua especificidadede ligação alterada por oxidação-redução. Nestes experimentos, uma soluçãode 10% de plasma bovino adulto (ABP), a mesma solução contendo proteínasde ligação a fosfolipídeos que foram usadas para determinar ligação de aPLdependente de proteína, foi exposta a uma corrente elétrica de uma bateria de 6volts por um período de tempo variável. As amostras de ABP tratadas foramentão usadas em ensaios ELISA com soros de pacientes positivos para aPS,aCL e aPE para ver se o tratamento do ABP afetaria o resultado do ELISA.Como mostrado em Figura 34, no tempo zero (ABP não tratado), os soros depacientes positivos dão uma resposta de aPL em ABP que é rotineiramentevista. À medida que o 10% de ABP é exposto à oxidação-redução (EMF) como tempo, quantidade de aPL detectada diminui e depois de 2 minutos, o soroaPE positivo não é mais positivo. Estes resultados indicam que as proteínas deplasma que são responsáveis pela reatividade aPL dos pacientes são alteradaspela exposição à corrente elétrica. Por exemplo, como cininogênio é a proteínade plasma responsável por fornecer um sinal de ELISA positivo para reaçõesdependentes de aPE (o cininogênio se liga a PE, então o anticorpo se liga aocininogênio, o aPE entretanto não irá se ligar nem a PE ou cininogênioindependentemente), isto mostra que o cininogênio na amostra de ABP estásendo alterado pela exposição redox. aCL também é negativo em exposição de240 segundos e uma vez que este soro de paciente requer ou protrombina e/oubeta2 glicoproteína (ou ambos podem estar envolvidos) para produzir um sinalpositivo no ELISA de aPL, estas duas proteínas também devem ser alteradaspelas reações redox. As mesmas duas proteínas de plasma estão envolvidas noexemplo de aPS.

Exemplo 35

Um experimento foi realizado para ver se leite maternohumano contém auto-anticorpos. Nestes experimentos, os níveis de aPS, aCL,aPE e aPC em leite materno tirado de uma mãe de um bebê de 5 meses deidade foram determinados antes e depois de tratamento com hemina. Comomostrado em Figura 36, a quantidade detectada de cada auto-anticorpo, comodeterminado por OD foi dramaticamente aumentada na amostras que foramtratadas com hemina. Por conseguinte, pode ser concluído que leite maternohumano contém anticorpos mascarados. Portanto, a presente invenção forneceadicionalmente um produto compreendendo leite não humano tal como leitede vaca ou cabra que é suplementado com anticorpos humanos mascarados.

Exemplo 36

Um experimento foi realizado para ver se fluido espinhalcerebral humano contém auto-anticorpos. Neste experimento, fluido espinhalfoi tirado por punção lombar de um indivíduo normal e amostras em tampõesde diluição BSA e ABP foram ensaiadas para níveis de aPS, aCL, aPE e aPCantes e depois de tratamento com hemina. Como mostrado em Figuras 36A e36B, amostras mostraram nenhum ou níveis mínimos de anticorposantifosfolipídeos antes de tratamento, e aumentos substanciais nos níveisdepois de tratamento, com aPE e aPC mostrando os maiores níveis em umtampão BSA e aPS e aCL mostrando os maiores níveis no tampão ABP.

Exemplo 37

Um ensaio antinitrotirosina foi conduzido em IgG tratada comhemina e controle para determinar se houve uma diferença na quantidade deresíduos de nitrotirosina entre as amostras de IgG tratadas com hemina econtrole. Poços de placa de ELISA foram revestidos com IgG tratada comhemina e controle, secos durante a noite, bloqueados com 1% de BSA,lavados e reagidos com antinitrotirosina de camundongo (1/3000, Upstate,USA, clone 1A6). Depois de lavagem, IgG anticamundongo de cabraconjugada com fosfatase alcalina (Sigma, St. Louis, Missouri), foi adicionada.Lavagem adicional foi seguida por desenvolvimento de substrato por 2 h a37°C e determinações quantitativas. Como mostrado em Figura 37, nitraçãoconsideravelmente maior é mostrada na IgG tratada. Este resultado fornecesuporte para a teoria de que a alteração de especificidade de ligação deanticorpos de acordo com o método da presente invenção é efetuada pornitrosilação de resíduos de tirosina em ou perto do o sítio de ligação aantígeno, o que pode induzir mudanças conformacionais que afetam aespecificidade de ligação do sítio de ligação.

Exemplo 38

Ivlg foi incubada com hemina e foi testada para reatividadecom neutrófilos usando citometria de fluxo e anticorpos IgG anti-humanosconjugados fluorescentes. Teste comparativo foi feito com Ivlg não tratada.Figura 38A mostra reatividade antineutrófilo sem Ivlg NHS. Figura 38Bmostra a atividade auto-antineutrófilos de Ivlg não tratada. Figura 38C mostraa atividade auto-antineutrófilos de 1 Ivlg de Ivlg tratada com hemina e Figura38D mostra a atividade auto-antineutrófilos de 3 Ivlg de Ivlg tratada comhemina, mostrando forte atividade auto-antineutrófilos. Por conseguinte, foiencontrado que Ivlg processada de acordo com o método desta invençãolibera auto-anticorpos que almejam especificamente neutrófilos, que contêmperoxidases ligadas a membrana, especialmente NADPH oxidase. Estesresultados sugerem que anticorpos desmascarados podem participar emqualquer reação que envolve um "metabolismo oxidativo" e formação de íonsde superóxido.

Exemplo 39

Experimentos foram realizados para ver se auto-anticorpospodem ser detectados em outros animais. Nestes experimentos, os níveis deaPS, aCL, aPE e aPC em plasma de cavalo foram determinados antes e depoisde tratamento com hemina.

Como mostrado em Figuras 39A e 39B, a quantidadedetectada de cada auto-anticorpo, como determinado por OD foidramaticamente aumentada na amostras que foram tratadas com hemina. Porconseguinte, pode ser concluído que plasma de cavalo contém anticorposmascarados. Em experimentos similares, auto-anticorpos de um isotipo IgYforam detectados em galinhas (dados não mostrados).

Obviamente, muitas modificações e variações da presenteinvenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. É portanto para sercompreendido que, dentro do escopo das reivindicações anexadas, a invençãopode ser praticada de outra maneira do que as especificamente descritas.

Claims (56)

1. Método, caracterizado pelo fato de compreender as etapasde:fornecer uma composição compreendendo pelo menos umaproteína suspensa ou dissolvida em um meio líquido, a proteína tendo umaespecificidade de ligação que pode ser reversivelmente alterada por umamudança em seu estado redox, eexpor a composição a um agente oxidante ou um potencialelétrico suficiente para efetuar reversivelmente a alteração da especificidadede ligação de dita proteína.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o meio líquido compreende um fluido corporal que naturalmentecontém dita proteína.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que dito fluido corporal é de um vertebrado.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que dito fluido corporal é de um mamífero ou ave.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que dito fluido corporal é de um humano.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que dito fluido corporal compreende diluído ou não diluído sangueintegral, soro, plasma, leite cru, fluido linfático, ou fluido de SNC.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a composição compreende imunoglobulina intravenosa (Ivlg).

8. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelofato de que a proteína é um anticorpo de isotipo IgG, IgA, ou IgM.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína é um auto-anticorpo de isotipo IgG, IgA, ou IgM.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a proteína é uma proteína outra do que um anticorpo.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é um composto cíclico contendo um átomode metal coordenado.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é um composto cíclico contendo um átomode ferro coordenado.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é hemina.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é KMnO4 ou NaIO4.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é clorofila.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é uma molécula que tem a capacidade deser reduzida atuando como um aceptor de elétrons para outras moléculas queatuam como doadoras de elétrons.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a proteína contém pelo menos um resíduo de tirosina em umsítio de ligação de antígeno ou ligante da proteína e em que o agente oxidanteou potencial elétrico altera a especificidade de ligação da proteínapromovendo uma nitrosilação reversível de tirosina de pelo menos um resíduode tirosina no sítio de ligação de antígeno ou ligante.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a especificidade de ligação da proteína alterada de um estadoem que a proteína não tem capacidade de ligação com respeito a um antígenoou ligante específico para um estado em que a proteína tem capacidade deligação com respeito ao antígeno ou ligante específico.

19. Método, caracterizado pelo fato de compreender as etapasdefornecer uma composição compreendendo um fluido biológicoou extrato de um fluido biológico, em que o fluido biológico ou extratocontém pelo menos proteína mascarada tendo um sítio de ligação com umaespecificidade de ligação que pode ser alterada por uma mudança em seuestado redox,expor a composição a um agente oxidante ou um potencialelétrico suficiente para efetuar a alteração da especificidade de ligação de ditaproteína mascarada, com isso desmascarando a proteína, edetectar a proteína desmascarada na composição e/ourecuperar a proteína desmascarada da composição.

20. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que dito fluido biológico é diluído ou não diluído sangue integral,soro, plasma, sangue de cordão umbilical placentária, leite, fluido linfático oufluido de SNC.

21. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que o fluido biológico é sangue integral, soro ou plasma que éagrupado a partir de uma pluralidade de indivíduos.

22. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada é um anticorpo.

23. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada é um auto-anticorpo IgA e o fluidobiológico é leite de mamífero.

24. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada é um auto-anticorpo IgG e o em que ofluido biológico é fluido de SNC.

25. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada é selecionada a partir do grupoconsistindo deum anticorpo específico para ácido glutâmico descarboxilase(GAD);um anticorpo específico para tirosina fosfatase (IA-2);um anticorpo antianticoagulante anti-lupus;um anticorpo antifosfolipídeo;um anticorpo antinuclear (ANA);um anticorpo antilamina;um anticorpo antinucléolo;um anticorpo antimembrana nuclear;um anticorpo antimitocôndria;um anticorpo antiGolgi;um anticorpo antigranulócito;um anticorpo antineutrófilo;um anticorpo antimonócito;um anticorpo antilinfócito B;um anticorpo antimieloperoxidase;um anticorpo anticélula tumorosa;um anticorpo antitrofoblasto;um anticorpo anti-HLA;um anticorpo antifator VIII;um anticorpo anticomplexo fator de plaqueta 4/heparina; eum anticorpo antibeta2-glicoproteína I.

26. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada é selecionada a partir do grupoconsistindo de anticardiolipina, antifosfatidilcolina, antifosfatidiletanolaminae antifosfatidilserina.

27. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada contém pelo menos um resíduo detirosina em um sítio de ligação de antígeno ou ligante da proteína e em que oagente oxidante ou potencial elétrico altera a especificidade de ligação daproteína promovendo uma nitrosilação reversível de tirosina de pelo menosum resíduo de tirosina no sítio de ligação de antígeno ou ligante.

28. Método para detectar e/ou obter e isolar um auto-anticorpode um fluido biológico contendo anticorpo ou de um extrato de um fluidobiológico contendo anticorpo, dito fluido biológico ou extrato contendo auto-anticorpos que, antes do método ser realizado, não são capazes de se ligar aum auto-antígeno e portanto não são detectáveis por um ensaio baseado emligação de receptor-ligante de um auto-antígeno, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:expor o fluido biológico ou extrato a um agente oxidante ou auma corrente elétrica de CC suficiente para alterar uma especificidade deligação do auto-anticorpo de forma que o dito auto-anticorpo se torna capazde se ligar a um antígeno, com isso se tornando detectável e recuperável dofluido biológico ou extrato por um método de separação de ligação dereceptor-ligante, edetectar o auto-anticorpo no fluido biológico e/ou isolar erecuperar o auto-anticorpo do fluido biológico.

29. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizadopelo fato de que dito fluido biológico é de um vertebrado.

30. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizadopelo fato de que dito fluido biológico é de um mamífero ou ave.

31. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizadopelo fato de que dito fluido biológico é de um humano.

32. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizadopelo fato de que dito fluido biológico compreende diluído ou não diluídosangue integral, soro, plasma, leite cru, fluido linfático, ou fluido de SNC.

33. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizadopelo fato de que dito fluido biológico compreende diluído ou não diluídosangue integral, soro, plasma, leite cru, fluido linfático, ou fluido de SNC queé agrupado a partir de uma pluralidade de indivíduos.

34. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a composição compreende imunoglobulina intravenosa(Ivlg).

35. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que auto-anticorpo é um isotipo IgG, IgA, ou IgM.

36. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o fluido biológico é leite de mamífero e o auto-anticorpo éum auto-anticorpo IgA.

37. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o fluido biológico é fluido de SNC e o auto-anticorpo é umauto-anticorpo IgG.

38. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é um composto cíclico contendo um metalcoordenado.

39. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é um composto cíclico contendo um ferrocoordenado.

40. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é hemina.

41. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é KMnO4 ou NaIO4.

42. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é clorofila.

43. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o agente oxidante é uma molécula que tem a capacidade deser reduzida atuando como um aceptor de elétrons para outras moléculas queatuam como doadoras de elétrons.

44. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o auto-anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindodeum anticorpo específico para ácido glutâmico descarboxilase (GAD);um anticorpo específico para tirosina fosfatase (IA-2);um anticorpo antianticoagulante anti-lupus;um anticorpo antifosfolipídeo;um anticorpo antinuclear (ANA);um anticorpo antilamina;um anticorpo antinucléolo;um anticorpo antimembrana nuclear;um anticorpo antimitocôndria;um anticorpo antiGolgi;um anticorpo antigranulócito;um anticorpo antineutrófilo;um anticorpo antimonócito;um anticorpo antilinfócito B;um anticorpo antimieloperoxidase;um anticorpo anticélula tumorosa;um anticorpo anticélula de ilha;um anticorpo antitrofoblasto;um anticorpo anti-HLA;um anticorpo antifator VIII;um anticorpo anticomplexo fator de plaqueta 4/heparina; eum anticorpo antibeta2-glicoproteína I.

45. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a proteína mascarada é selecionada a partir do grupoconsistindo de anticardiolipina, antifosfatidilcolina, antifosfatidiletanolaminae antifosfatidilserina.

46. Imunoglobulina isolada, caracterizada pelo fato de ter umsítio de ligação a antígeno com uma especificidade de ligação que pode serreversivelmente alterada por uma mudança em seu estado redox.

47. Imunoglobulina isolada de acordo com a reivindicação 45,caracterizada pelo fato de que a molécula de imunoglobulina se torna capazde se ligar especificamente a um auto-antígeno depois da imunoglobulina serexposta a um agente oxidante.

48. Imunoglobulina isolada de acordo com a reivindicação 45,caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina tem pelo menos um resíduode tirosina em um sítio de ligação a antígeno e em que uma mudança noestado redox altera a especificidade de ligação da imunoglobulina efetuando aadição ou remoção de um grupo nitrato de pelo menos um resíduo de tirosina.

49. Imunoglobulina isolada de acordo com a reivindicação 47,caracterizada pelo fato de que a adição ou remoção de um grupo nitrato depelo menos um resíduo de tirosina da imunoglobulina induz uma mudançaconformacional no sítio de ligação a antígeno da imunoglobulina.

50. Imunoglobulina isolada de acordo com a reivindicação 45,caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina é selecionada a partir dogrupo consistindo deum anticorpo específico para ácido glutâmico descarboxilase(GAD);um anticorpo específico para tirosina fosfatase (IA-2);um anticorpo antianticoagulante anti-lupus;um anticorpo antifosfolipídeo;um anticorpo antinuclear (ANA);um anticorpo antilamina;um anticorpo antinucléolo;um anticorpo antimembrana nuclear;um anticorpo antimitocôndria;um anticorpo antiGolgi;um anticorpo antigranulócito;um anticorpo antineutrófilo;um anticorpo antimonócito;um anticorpo antilinfócito B;um anticorpo antimieloperoxidase;um anticorpo anticélula tumorosa;um anticorpo anticélula de ilha;um anticorpo antitrofoblasto;um anticorpo anti-HLA;um anticorpo antifator VIII;um anticorpo anticomplexo fator de plaqueta 4/heparina; eum anticorpo antibeta2-glicoproteína I.

51. Método para tratar uma doença autoimune em umindivíduo, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar a umindivíduo tendo uma doença autoimune uma quantidade de um antioxidantesuficiente para inibir ou reverter uma ativação oxidativa de sítios de ligaçãode auto-anticorpos em dito indivíduo.

52. Método para tratar uma doença autoimune, caracterizadopelo fato de compreender as etapas de:tirar uma amostra de sangue de um indivíduo tendo umadoença autoimune,expor a amostra de sangue a um antioxidante ou correnteelétrica de CC suficiente para reverter uma ativação oxidativa de sítios deligação de auto-anticorpos em dita amostra de sangue, eretornar a amostra de sangue ao indivíduo.

53. Método, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:ensaiar uma primeira amostra de um fluido biológico de umindivíduo para determinar uma quantidade e/ou tipo de auto-anticorposdetectáveis na amostra,tratar uma segunda amostra de um fluido biológico do mesmotipo do indivíduo expondo a segunda amostra a um agente oxidante ou umacorrente elétrica de CC e ensaiar a segunda amostra para determinar umaquantidade e/ou tipo de auto-anticorpos detectáveis na segunda amostra, ecomparar a quantidade e/ou tipo de auto-anticorpos detectáveisna primeira amostra com a quantidade e/ou tipo de auto-anticorposdetectáveis na segunda amostra.

54. Método para determinar o efeito de um composto oumudança em um estado redox em uma quantidade ou tipo de anticorpos emum fluido biológico de um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderas etapas deensaiar uma primeira amostra de um fluido biológico de umindivíduo para determinar uma quantidade e/ou tipo de auto-anticorposdetectáveis na amostra,tratar uma segunda amostra de um fluido biológico do mesmotipo do indivíduo expondo a segunda amostra a um composto ou mudança emum estado redox da amostra e ensaiar a segunda amostra para determinar umaquantidade e/ou tipo de auto-anticorpos detectáveis na segunda amostra, ecomparar a quantidade e/ou tipo de auto-anticorpos detectáveisna primeira amostra com a quantidade e/ou tipo de auto-anticorposdetectáveis na segunda amostra.

55. Produto, caracterizado pelo fato de compreender um fluidobiológico ou um extrato contendo proteína de um fluido biológico que foiexposto a um agente oxidante ou uma corrente elétrica de CC suficiente paraalterar reversivelmente uma especificidade de ligação de pelo menos umaproteína deste.

56. Produto, caracterizado pelo fato de compreender leite nãohumano ao qual foram adicionados anticorpos mascarados de leite maternohumano.