BRPI0608376A2

BRPI0608376A2 - composição de ligação, método de uso de uma composição de ligação, e, kit de detecção

Info

Publication number: BRPI0608376A2
Application number: BRPI0608376-5A
Authority: BR
Inventors: Julian Davies; Graig Duane Dickinson; Lihua Huang; Bryan Edward Jones; Scott William Rowlinson; Peter Edward Vaillancourt; David Matthew Marquis; Ying Tang; Jeffry Dean Watkins
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2006-04-20
Publication date: 2010-11-16
Also published as: CA2607448A1; KR100978684B1; US20100040633A1; ATE505489T1; JP5070200B2; IL186775A; WO2006116002A9; KR20070114220A; UA93201C2; WO2006116002A2; AU2006240056A1; RS51845B; JP2008538564A; DE602006021292D1; EA016038B1; CA2607448C; HRP20110334T1; US8128927B2; CN101163719A; CY1111518T1

Abstract

COMPOSIçãO DE LIGAçãO, METODO DE USO DE UMA COMPOSIçãO DE LIGAçãO, E, KIT DE DETECçãO. São fornecidos anticorpos específicos para TGF Beta 1 madura mais do que para TGF Beta 2 madura e TGF Beta 3 madura. Os anticorpos compreendem CDR3 da cadeia pesada GYRX1X2X3Y em que Xl é W ou A, X2 é F ou L, X3 é A, E ou Y.

Description

"COMPOSIÇÃO DE LIGAÇÃO, MÉTODO DE USO DE UMACOMPOSIÇÃO DE LIGAÇÃO, E, KIT DE DETECÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção geralmente se refere a composições relacionadas aproteínas TGF Beta 1. Em particular, ela fornece composições de ligaçãopurificadas, e reagentes relacionados úteis, e.g., na diagnose, tratamento, eprevenção de desordens celulares proliferativas, autoimunes/inflamatórias,cardiovasculares, e fibróticas, e na verificação dos efeitos de compostosexógenos na expressão de seqüências de ácidos nucleicos e de aminoácidos detais proteínas.

ARTE DE FUNDO DA INVENÇÃO

O primeiro membro da superfamília de fator de crescimentotransformante-beta (TGF-Beta) de fatores de polipeptídeos secretados, TGF-Beta 1, foi descoberto aproximadamente vinte anos atrás. Subseqüentemente,a família cresceu consideravelmente e agora compreende mais de trintamembros de vertebrados e uma dúzia ou aproximadamente de proteínasestruturalmente e funcionalmente relacionadas em invertebrados tal comovermes e moscas (veja, e.g.4 Attisano & Lee-Hoeflich, 2001 Gen. Biol. 2,revisão 30101; Moustakas, et al., 2001 J. Cell Sei. 114:4359; Wrana, 2000Cell 100:189). Membros da família TGF Beta controlam muitas funçõescelulares, e sua atividade é crítica para regular numerosos processos dedesenvolvimento e homeostáticos. Experimentos revelaram que uma viaconservada de sinalização de TGF-Beta existe entre vertebrados, vermes, emoscas.

Um membro desta família, TGF Beta 1, está envolvido emuma variedade de processos celulares tal como, por exemplo, proliferação ediferenciação celular, migração, diferenciação, apoptose, desenvolvimentoembriônico, formação de matriz extracelular, desenvolvimento ósseo, cura deferida, hematopoiese, e respostas imunes e inflamatórias (veja, e.g., Roberts,& Sporn 1990 Peptide Growth Factors and Their Receptors, pp. 419-72,Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; Massague, J. 1998 Annu. Rev.Biochem 67:753).

Adicionalmente, dados pré-clínieos e clínicos indicam queTGF-Beta 1 é um grande contribuidor para deposição de proteína de matrizem fibrose intersticial, e está envolvido no início e progressão de diversosestados associados de doença fibrótica, incluindo fibrose renal - que é comuma todas as formas de doença renal crônica (CRD). O grau de fibrose renal secorrelaciona positivamente com progressão para falência renal crônica (CFR,também conhecida como insuficiência renal crônica terminal (ESRD)), e poderesultar em morte, diálise crônica, ou transplante renal.

TGF Beta está associado com CRF através de eventoscomplexos e diversos que impactam a maioria de células do rim (Bottinger,2002, J. Am. Soe. Nephrol. 13:2600). Estes eventos no final das contasresultam tanto em fibrose tubulointersticial como glomerulosclerose levando aperda de função de néfron e no final das contas falência renal crônica. Dastrês isoformas de TGF-Beta, TGF-Beta 1 parece predominar em mediação daprogressão de doença renal crônica, não apenas porque é a isoforma maispredominantemente expressa, mas também porque TGF-Beta 2 e -Beta 3parecem mediar seus efeitos através de aumento de expressão de TGF-Beta 1(Yu, 2003, Kid. Int. 64, 844). Conseqüentemente, para prevenir os efeitosdeletérios de desordens tal como CRD, existe uma necessidade de modularexpressão de TGF Beta 1.

Por conseguinte, descoberta de novas composições de ligaçãode TGF Beta 1 satisfaz uma necessidade na arte fornecendo composições quesão úteis na diagnose, prevenção, e tratamento de desordens fibróticas talcomo doença renal crônica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção é baseada em parte na descoberta de composiçõesde ligação com propriedades melhoradas que especificamente e/ouseletivamente se ligam a TGF Beta 1 maduro sobre TGF Beta 2 maduro e/ouTGF Beta 3 maduro e que neutralizam TGF Beta 1 maduro.

Estas composições de ligação compreendem a) uma primeiraporção compreendendo pelo menos uma das seqüências seguintes:

GYRX1X2X3Y [SEQ ID NO: 4]; caracterizada pelo fato de que: Xi é ou W ouA; X2 é ou F ou L; e X3 é ou A, E, ou Y; b) GYXiFX2DYNX3X4 [SEQ IDNO: 2]; caracterizada pelo fato de que: Xj é ou T ou D; X2 é ou Τ, E, ou F;

X3 é ou Μ, I, L, ou V; e X4 é ou Η, V, ou A; ou c)XiX2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS [SEQ ID NO: 3]; caracterizada pelo fato deque: Xl é ou Y, Q, ou S; X2 é ou I, ou V; X3 é ou D, ou Ε; X4 é ou Υ, Τ, H,ou L; X5 é ou Q, Κ, P, ou S; e X6 é ou F ou Y; e/ou b) uma segunda porçãocompreendendo pelo menos uma das seqüências seguintes:XiQWDX2X3X4PA [SEQ ID NO: 7]; caracterizada pelo fato de que: Xl é ou

Q ou S; X2 é ou L, D, ou Ρ; X3 é ou N ou R; e X4 é ou P, F, Y, ou R;XiAX2X3X4VX5YMH [SEQ ID NO: 5]; caracterizada pelo fato de que: Xi éou R, Υ, E, ou Q; X2 é ou S ou Τ; X3 é ou S, V, ou A; X4 é ou S ou L; X5 éou S, P, L, ou Y; ou ATSNX1AX2 [SEQID NO: 6]; caracterizada pelo fato deque: X1 é ou L, N, ou P; e X2 é ou S, Κ, Y, L, M, F, E, Q, R, ou H; acomposição de ligação também pode ter: a) dita primeira porção compreendepelo menos duas ditas seqüências; b) dita primeira porção compreende trêsditas seqüências; c) dita segunda porção compreende pelo menos duas ditasseqüências; d) dita segunda porção compreende três ditas seqüências; e) ditaprimeira porção compreende pelo menos duas ditas seqüências e dita segundaporção compreende três ditas seqüências; f) dita segunda porção compreendepelo menos duas ditas seqüências e dita primeira porção compreende trêsditas seqüências; ou g) dita primeira porção compreende três ditas seqüênciase dita segunda porção compreende três ditas seqüências; caracterizada pelofato de que um sítio de ligação da composição de ligação: é especificamenteimunorreativo com um polipeptídeo de TGF Beta-I humano éespecificamente imunorreativo com um polipeptídeo de TGF Beta-1 murino éconstruído contra uma proteína TGF Beta-I humano purificada ourecombinantemente produzida ou fragmento desta; está em um anticorpomonoclonal, Fab5 Fv, scFv, F(ab)2, ou um domínio variável de um anticorpo;tem pelo menos uma, duas, ou três substituições conservativas; ou está em umarcabouço de anticorpo humano ou um humanizado; caracterizada pelo fatode que a composição de ligação: é uma molécula de anticorpo; é umamolécula de anticorpo monoclonal; é uma molécula de diacorpo; é umamolécula de triacorpo; é uma molécula de tetracorpo; é uma molécula deminicorpo; é um anti-soro monoclonal; é detectavelmente marcada; éliofilizada; é estéril; ou está em uma composição tamponada; caracterizadapelo fato de que a composição de ligação: é um anticorpo monoclonal compropriedades melhoradas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃOPREFERIDAS

I. Geral

É para ser entendido que esta invenção não é limitada àscomposições, métodos, e técnicas particulares descritas neste lugar, pois taiscomposições, métodos, e técnicas podem, como se sabe, variar. Também épara ser entendido que a terminologia usada neste lugar é para descreverapenas formas de realização particulares, e não é pretendida para limitar oescopo da invenção, que é limitado apenas pelas reivindicações anexadas.

Como usado neste lugar, incluindo as reivindicações anexadas,formas singulares de palavras tal como "um," "uma," e "o" incluem, e.g., seusreferentes plurais correspondentes a menos que o contexto claramente dite deoutra maneira. Assim, por exemplo, referência a "um organismo" inclui, e.g.,um ou mais organismos diferentes, referência a "uma célula" inclui, e.g., umaou mais de tais células, e referência a "um método" inclui, e.g., referência aetapas equivalentes e métodos conhecidos por uma pessoa de habitual versona arte, e assim por diante.

A menos que definido de outra maneira, todos os termostécnicos e científicos usados neste lugar têm o mesmo significado quecomumente entendido por uma pessoa de habitual verso na arte à qual estainvenção pertence.

Embora métodos e materiais similares ou equivalentesàqueles descritos neste lugar possam ser usados para praticar ou testar ainvenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo.

Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências discutidasneste lugar são fornecidas somente por sua descrição antes da data de depósitodo presente pedido. Nada neste lugar é para ser construído como umaadmissão de que a invenção não é designada para antedatar qualquer taldescrição por virtude de sua invenção anterior.

Todas as publicações, pedidosde patentes, patentes, e outras referências mencionadas neste lugar sãoincorporadas por referência em sua totalidade para os ensinamentos para osquais elas são citadas (como o contexto claramente dita), incluindo todas asfiguras, ilustrações, fotos, gráficos, hiperligações, e outra forma de códigoexecutável por navegador.

II. Definições

Uma "composição de ligação" é uma entidade molecular comafinidade de ligação seletiva e/ou específica para pelo menos uma outraentidade molecular ou parceira de ligação. Tipicamente, a associação será emuma interação naturalmente relevante fisiologicamente, ou covalentemente ounão covalente, e pode incluir membros de um complexo multiprotéico,incluindo, sem limitação, compostos carreadores, parceiros de dimerização oumultimerização.

Uma composição de ligação pode ser naturalmente derivada(e.g., isolada e/ou purificada) ou sinteticamente produzida, ou no total ou emparte. Tipicamente, uma composição de ligação tem pelo menos uma regiãotal como, como forma de exemplo não limitante, uma área superficial, umaforma (tal como, e.g., uma cavidade, fissura, fenda, ou protuberância), umarranjo molecular, ou uma configuração espacial, que especificamente e/ouseletivamente "combina com," "se liga a," ou é "complementar a" umaorganização particular espacial e/ou de uma área ou região em uma parceirade ligação. Assim, por exemplo, quando uma composição de ligação ésuficientemente próxima a uma parceira de ligação potencial, a composiçãode ligação e parceira irão especificamente e/ou seletivamente se ligar uma aoutra.

Exemplos não limitantes de uma composição de ligação pareada comuma parceira de ligação incluem: antígeno-anticorpo, e sítio de ligação dehapteno. Exemplos não limitantes de composições de ligação de anticorpoincluem: anticorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos,fragmentos Fab (incluindo, tal como, e.g., Fabs diméricos ou triméricos),fragmentos Fv, fragmentos scFv, fragmentos F(ab)2, etc. (veja, e.g., Hudson& Souriau 2003 Nature Medicine 9:129-34 para exemplos não limitantes decomposições de ligação de anticorpo abrangidas pela invenção). Umacomposição de ligação de anticorpo monoclonal é monoclonal no sentido deque ela é derivada de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos (i.e., os anticorpos individuais compreendendo a população sãosubstancialmente idênticos (e.g., eles podem ser derivados de um clone de umúnico tipo celular)).

Entretanto, isto não é pretendido para o limitar a umaorigem particular. Um tal anticorpo pode ser prontamente produzido emcélulas que geralmente não produzem anticorpos, tal como células CHO,NSO, ou COS. Em adição, um tal anticorpo pode ser produzido em outrostipos de células, especialmente células de mamíferos e mesmo vegetais,modificando geneticamente tais células para expressar e reunir as cadeiasleves e pesadas de polipeptídeo formando o produto de anticorpo. Em adição,tais cadeias podem ser quimicamente sintetizadas mas, uma vez que elasseriam específicas para um dado determinante antigênico, ainda constituiriamum anticorpo "monoclonal" dentro do espírito no qual aquele termo é usadoaqui. Assim, como usado neste lugar, o termo anticorpo monoclonal épretendido para denotar mais especialmente a especificidade e pureza damolécula de anticorpos do que o mero mecanismo usado para produção deditos anticorpos.

Um "sítio de ligação" é uma região específica, área, ouconfiguração de uma entidade molecular que participa na ligação específicae/ou seletiva com outra entidade molecular. Um exemplo não limitante de umsítio de ligação é a seqüência de aminoácidos contíguos compreendendo umaregião determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo. Em umaforma de realização, um sítio de ligação da invenção compreende seqüênciatendo a fórmula mostrada em Tabela I. Em outra forma de realização nãolimitante, um sítio de ligação compreende uma combinação das seqüências deTabela 1. Outro exemplo não limitante é um sítio de ligação formado a partirda configuração tridimensional e organização espacial das seqüências deaminoácidos compreendendo as seis alças de CDR das cadeias variáveispesadas e leves no rim do cilindro beta de oito fitas de um fragmento Fab(veja, e.g., Chothia & Lesk, 1987 J. Mol. Biol. 196:901-17). Uma CDR dainvenção descrito pode ser incorporado/embebido com um arcabouço ouestrutura molecular tal como, por exemplo, como feito em enxerto de CDR.

Em uma forma de realização, a estrutura para carregar uma CDR da invençãogeralmente será de uma seqüência de anticorpo de cadeia pesada ou leve ouporção substancial desta na qual a CDR está localizada em uma localizaçãocorrespondente a CDR de domínios variáveis de anticorpo VH e VLnaturalmente ocorrente codificada por genes de imunoglobulina rearranjados.

As estruturas e localizações de domínios variáveis de imunoglobulina podemser determinadas por referência a (Kabat, et al, 1987 Sequences of Proteins ofImmunological Interest. 4th Ed. US Department of Health and HumanServices, e atualizações deste, agora disponíveis na rede mundial decomputadores (http://immuno.b-me.nwu.edu)). CDRs geralmente são comodefinido por Kabat mas também podem ser informados pelas definições deChothia (J. MoL Biol. 196:901-17) e/ou MacCallum (J. Mol. Biol. 262:732-45). Aqueles versados na arte podem rotineiramente determinar quais resíduoscompreendem um CDR particular dada a seqüência de aminoácidos da regiãovariável dentro da qual ela está embebida. Adicionalmente, em resíduos deenxerto de CDR da alça definida por Chothia adjacente a Kabat CDRl de VHpode ser enxertada.

Em uma forma de realização, seqüências de CDR da invençãopodem ser introduzidas em um repertório de domínios variáveis carecendo deregiões CDR, usando tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, Markset al (1992 BioTechnology 10:779-83) descrevem métodos de produzirrepertórios de domínios variáveis de anticorpos nos quais iniciadoresconsenso dirigidos para ou adjacentes à extremidade 5' da área de domíniovariável são usados em conjunção com iniciadores consenso para a terceiraregião de arcabouço de genes de VH humanos para fornecer um repertório dedomínios variáveis de VH carecendo de uma CDR3. Marks et al descrevemadicionalmente como este repertório pode ser combinado com uma CDR3 deum anticorpo particular (tal como descrito neste lugar). Usando técnicasanálogas, as seqüências de CDR3 da presente invenção podem ser misturadascom repertórios de domínios VH ou VL carecendo de uma CDR3, e osdomínios VH ou VL completos misturados combinados com um domínio VLou VH cognato para fornecer membros específicos de composição de ligaçãoda invenção. Alternativamente, as seqüências de CDR3 podem sercombinadas com outras CDRs da invenção usando uma estratégia similar. Orepertório pode então ser apresentada em um sistema hospedeiro adequado talcomo o sistema de apresentação em fagos de W092/01047 de forma quemembros adequados de ligação específica podem ser selecionados.

Complexo de Composição de Ligação:TGF Beta 1

O termo "complexo de composição de ligação:TGF Beta 1",como usado neste lugar, se refere a um complexo de uma composição deligação e proteína TGF Beta 1 formado por ligação específica e/ou seletiva dacomposição de ligação a uma proteína TGF Beta 1. Em uma forma derealização preferida, a TGF Beta 1 referida o tempo todo é uma proteína TGFBeta 1 "madura" de primata. Em uma forma de realização mais preferida, aTGF Beta 1 referida o tempo todo é uma proteína TGF Beta 1 madurahumana (veja, e.g., No. de acesso de NCBI: POl 137, que descreve a seqüênciade aminoácidos do precursor de fator de crescimento transformante beta 1humano (TGF-beta 1) e sua porção madura). Em cada instância, a TGF Beta 1referida o tempo todo é TGF Beta 1 em sua forma madura, biologicamenteativa [(TGF Beta 1 é liberado das células como um complexo inativo 'latente',compreendendo um homodímero de TGF Beta 1 em um complexo nãocovalente com dois pró-segmentos, ao qual uma das diversas proteínas deligação de TGF latente Beta 1 está freqüentemente ligada (veja, e.g., Annes,et al., 2003 J. Cell Science 116:217-24; Miyazono, et al., 1993 GrowthFactors 8:11-22; Munger, et al. 1997 Kidney Int. 51:1376-82; Oklu &Hesketh 2000 Biochem. J. 352:601-10). Este complexo latente de TGF Beta 1representa um importante meio de proteção contra ativação 'inadvertida', epode estabilizar e direcionar TGF beta 1 latente para a matriz extracelular,onde ele é seqüestrado (Taipale, et al. 1998 Adv. Câncer Res. 75:87-134). Amatriz extracelular assim atua como um reservatório a partir do qual TGF-Beta 1 pode ser prontamente ativada sem a necessidade de nova síntesecelular. A secreção de TGF Beta 1 como um complexo latente necessita daexistência de um processo regulado de ativação, que é mais provavelmentemediada através das atividades de proteases que degradam preferencialmenteos pró-segmentos de TGF Beta 1 e com isso liberam a forma altamenteestável, madura, de dímero ativo de TGF-Beta 1)].

Ligação específica da composição de ligação significa que acomposição de ligação tem um sítio de ligação que reconhece uma região deTGF Beta 1, tipicamente em sua conformação ativa nativa. Por exemplo,anticorpos produzidos para uma TGF Beta 1 e reconhecendo um epítopo deTGF Beta 1 são capazes de formar um complexo de composição deligação:TGF Beta 1 por ligação específica. Tipicamente, a formação de umcomplexo de composição de ligação: proteína TGF Beta 1 permite a medidade TGF Beta 1 em uma amostra biológica, e.g., uma mistura com outrasproteínas e biológicos. Um epítopo de uma composição de ligação dainvenção pode ser determinado usando técnicas descritas neste lugar ou naarte (veja, e.g., G. Tribbick 2002 Journal of Immunological Methods 267:27-35; Woods & Hamuro 2001 Journal of Cellular Biochemistry Supplement37:89-98) e/ou como determinado por ligação competitiva como descritoneste lugar. Em uma forma de realização preferida, um epítopo de umacomposição de ligação da invenção compreende os resíduos de aminoácidosYYVGRK de SEQ ID NO: 1; em outra forma de realização; um epítopo deuma composição de ligação da invenção compreende os resíduos deaminoácidos YYVGRK de SEQ ID NO: 1 e YSKV de SEQ ID NO:l; emuma forma de realização adicional, um epítopo de uma composição de ligaçãoda invenção compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 resíduos (contíguos ounão contíguos) de YYVGRK de SEQ ID NO: 1 e/ou pelo menos 1, 2, 3, ou 4resíduos (contíguos ou não contíguos) de YSKV de SEQ ID NO:1 (uma talforma de realização é abrangida para incluir qualquer e todas as combinaçõesdestes tais como, e.g. sem limitação: YYVGRK e KV de SEQ ID NO:l; ouYVGRK e Y e KV de SEQ ID NO:1 (todas tais combinações estãodisponíveis usando meramente um algoritmo computacional e fórmulasmatemáticas bem conhecidas para permutações e combinações)). Em umaforma de realização preferida ainda adicional, um epítopo da invenção édefinido funcionalmente, por exemplo, pela capacidade de uma composiçãode ligação da invenção para prevenir formação de um complexo de ligaçãosubseqüente competindo composições de ligação para o mesmo antígeno talcomo, e.g., TGF Beta 1 (tal ligação competitiva é descrita neste lugar).

O termo "ligação específica" como usado neste lugar se refereà situação na qual um membro de um par de ligação específica não irá mostrarligação significante para moléculas outras do que sua(s) parceira(s) de ligaçãoespecífica(s). O termo também é aplicável onde e.g. um domínio de ligaçãode antígeno é específico para um epítopo particular que é carregado pordiversos antígenos, em cujo caso o membro de ligação específica carregandoo domínio de ligação de antígeno será capaz de se ligar aos vários antígenoscarregando o epítopo. Por conseguinte, uma composição de ligação específicapara TGF Beta 1 madura "não irá mostrar qualquer ligação significante paramoléculas outras do que sua(s) parceira(s) de ligação específica(s)" isto é,TGF Beta 1 madura.

As frases "se liga especificamente a" ou "especificamenteimunorreativo com", com respeito a uma composição de ligação, se refere auma reação de ligação que é determinante da presença da composição deligação na presença de uma população heterogênea de proteínas e outroscomponentes biológicos. Assim, em condições designadas de imunoensaio, acomposição de ligação especificada se liga a uma proteína específica e não seliga significantemente a outras proteínas presentes na amostra. Ligaçãoespecífica a uma composição de ligação em tais condições pode requerer umacomposição de ligação que seja selecionada por sua especificidade para umaproteína particular. Por exemplo, uma composição de ligação, tal como umanticorpo, pode ser produzido para a forma dimérica ativa humana da TGFBeta 1, cujo monômero maduro de seqüência de aminoácidos representada em[SEQ ID NO:l] e subseqüentemente selecionada para obter anticorposespecificamente imunorreativo com aquela proteína TGF Beta 1 e não comoutras proteínas. Uma tal composição de ligação poderia diferenciar proteínasaltamente homólogas para a proteína TGF Beta 1 humana, e.g., tal como, porexemplo, outras isoformas de TGF Beta humana (e.g., tal como, TGF Beta 2humana, ou TGF Beta 3 humana). Em uma forma de realização preferida, aespecificidade de uma composição de ligação da invenção para TGF Beta 1madura é igual a ou maior do que 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0,7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100,125, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800-900, 1000, 1500, 2000, 2500,3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500,9000, 9500, ou 10,000 vezes em relação a sua especificidade para TGF Beta 2madura e/ou TGF Beta 3 madura. Em outra forma de realização preferida, aespecificidade de uma composição da invenção pode ter um valor deespecificidade particular para TGF Beta 2 humana da lista acima e um valorde especificidade diferente para TGF Beta 3 humana tal como, por exemplo,uma especificidade para TGF Beta 1 madura que é igual ou maior do que 100vezes em sua especificidade em relação a TGF Beta 2 madura e igual oumaior do que 900 vezes em sua especificidade em relação a TGF Beta 3madura. Quaisquer tais combinações são abrangidas.

Uma composição de ligação da invenção preferivelmenteneutraliza TGF Beta 1 e tem uma constante de dissociação (Kd) para TGFBeta 1 preferivelmente de menos do que cerca de: IOOpM, 95pM, 90pM,85pM, 80pM, 75pM, 70pM, 65pM, 60pM, 55pM, 50pM, 45pM, 40pM,35pM, 30pM, 25pM, 20pM, 15pM, 14pM, 13pM, 12pM, IlpM5 ou IOpM;mais preferivelmente menos do que cerca de: IOpM, 9,9pM, 9,8pM, 9,7pM,9,6pM, 9,5pM, 9,4pM, 9,3pM, 9,2pM, 9,lpM, 9,0pM, 8,9pM, 8,8pM, 8,7pM,8,6pM, 8,5pM, 8,4pM, 8,3pM, 8,2pM, 8,IpM 8,0pM, 7,9pM, 7,8pM, 7,7pM,7,6pM, 7,5pM, 7,4pM, 7,3pM, 7,2pM, 7,IpM 7,0pM, 6,9pM, 6,8pM, 6,7pM,6,6pM, 6,5pM, 6,4pM, 6,3pM, 6,2pM, 6,lpM, 6,0pM, 5,9pM, 5,8pM, 5,7pM,5,6pM, 5,5pM, 5,4pM, 5,3pM, 5,2pM, 5,IpM ou 5,0pM; ainda maispreferivelmente de menos do que cerca de 5,0pM, 4,9pM, 4,8pM, 4,7pM,4,6pM, 4,5pM, 4,4pM, 4,3pM, 4,2pM, 4,IpM 4,0pM, 3,9pM, 3,8pM, 3,7pM,3,6pM, 3,5pM, 3,4pM, 3,3pM, 3,2pM, 3,IpM 3,OpM 2,9pM, 2,8pM, 2,7pM,2,6ρΜ, 2,5ρΜ, 2,4ρΜ, 2,3ρΜ, 2,2ρΜ, 2,IpM 2,0ρΜ, 1,9ρΜ, 1,8ρΜ, 1,7ρΜ,1,6ρΜ, 1,5ρΜ, 1,4ρΜ, 1,3ρΜ, 1,2ρΜ, Ι,ΙρΜ, Ι,ΟρΜ; e ainda maispreferivelmente 9,9ρΜ, 9,8ρΜ, 9,7ρΜ, 9,6ρΜ, 9,5ρΜ, 9,4ρΜ, 9,3ρΜ,9,2ρΜ, 9,IpM 9,0ρΜ, 8,9ρΜ, 8,8ρΜ, 8,7ρΜ, 8,6ρΜ, 8,5ρΜ, 8,4ρΜ, 8,3ρΜ,8,2ρΜ, 8,IpM 8,0ρΜ, 7,9ρΜ, 7,8ρΜ, 7,7ρΜ, 7,6ρΜ, 7,5ρΜ, 7,4ρΜ, 7,3ρΜ,7,2ρΜ, 7,IpM 7,OpM5 6,9ρΜ, 6,8ρΜ, 6,7ρΜ, 6,6ρΜ, 6,5ρΜ, 6,4ρΜ, 6,3ρΜ,6,2ρΜ, 6,1ρΜ, 6,0ρΜ, 5,9ρΜ, 5,8ρΜ, 5,7ρΜ, 5,6ρΜ, 5,5ρΜ, 5,4ρΜ, 5,3ρΜ,5,2ρΜ, 5,1ρΜ, 5,0ρΜ, 5,OnMj 4,9ρΜ, 4,8ρΜ, 4,7ρΜ, 4,6ρΜ, 4,5ρΜ, 4,4ρΜ,4,3ρΜ, 4,2ρΜ, 4,IpM 4,OpM5 3,9ρΜ, 3,8ρΜ, 3,7ρΜ, 3,6ρΜ, 3,5ρΜ, 3,4ρΜ,3,3ρΜ, 3,2ρΜ, 3,IpM 3,OpM 2,9ρΜ, 2,8ρΜ, 2,7ρΜ, 2,6ρΜ, 2,5ρΜ, 2,4ρΜ,2,3ρΜ, 2,2ρΜ, 2,1ρΜ2,0ρΜ, 1,9ρΜ, 1,8ρΜ, 1,7ρΜ, 1,6ρΜ, 1,5ρΜ, 1,4ρΜ,1,3ρΜ, 1,2ρΜ, Ι,ΙρΜ, Ι,ΟρΜ, 0,9ρΜ, 0,8ρΜ, 0,7ρΜ, 0,6ρΜ, 0,5ρΜ, 0,4ρΜ,0,3ρΜ, 0,2ρΜ, Ο,ΙρΜ, ou 0,0IpM. A constante de dissociação (Kd) de umacomposição de ligação pode ser determinada usando qualquer método da arte,por exemplo, por BIACoreTM, adaptando o método de Karlsson et al., 1991J. Immunol. Methods 145, 299-340. Para outras descrições, veja Jonsson, etal. 1993 Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, et al. 1991 Biotechniques11:620-7; Johnsson, et al. 1995 J. Mol. Recognit. 8:125-31; e Johnnson, et al.1991 Anal. Biochem. 198:268-77.

O termo "kon", como usado neste lugar é pretendido para sereferir à associação ou constante de associação, ou taxa de reação específica,do adiante, ou reação de formação de complexo, medida em unidades: M-Isec-1. O termo "IW, como usado neste lugar, é pretendido para se referir àdissociação ou constante de dissociação, ou taxa de reação específica, paradissociação de um anticorpo co complexo anticorpo/antígeno, medida emunidades: l/segundo. O termo "Kd," como usado neste lugar, é pretendidopara se referir à constante de dissociação de uma interação particular deanticorpo-antígeno. Ela é calculada pela fórmula: IcoffZkon = Kd. A afinidadede uma composição de ligação freqüentemente é correlacionada com um Icoffinferior mais do que com um Icon superior, entretanto, não se atendo a teoria,tanto formas de realização com Icoff como com Icon melhorado, são abrangidas.

Em uma forma de realização mais preferida, composições de ligação dapresente invenção são anticorpos de alta potência ou fragmentos destes,geralmente exibindo valores baixos de Icoff. Em uma forma de realização aindamais preferida, a taxa Kon de uma forma de realização de Fab da invenção temuma taxa Kon melhorada pelo menos 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3,ou 2,4 vezes em relação a um Fab comparável tal como, e.g., o mAb2471descrito PCT/US2004/018921; US60/485.820. Em outra forma de realização,uma composição da invenção tem uma taxa Ieoff melhorada que é uma melhorade pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 130, 150, 195, 200,225, 250, 260, 270, 280, 290, ou 300 vezes sobre uma composição de ligaçãocomparável (e.g., tal como um Fab ou ritAb).

Preferivelmente, uma composição de ligação a anticorpo seliga especificamente e/ou seletivamente a TGF Beta 1 se comparado comTGF Beta 2 e/ou TGF Beta 3; mais preferivelmente, uma composição deligação a anticorpo se liga especificamente e/ou seletivamente a TGF Beta 1humana se comparado com TGF Beta 2 humana e/ou TGF Beta 3 humana.

Preferivelmente, um tal anticorpo tem menos do que cerca de 20% dereatividade cruzada com TGF Beta 2 e/ou TGF Beta 3 (se medido pelaproporção das constantes de dissociação), mais preferivelmente menos do quecerca de 15% de reatividade cruzada, e ainda mais preferivelmente tem menosdo que cerca de 10% de reatividade cruzada; e ainda mais preferivelmentemenos do que cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1% de reatividade cruzada.

Ademais, uma composição de ligação a anticorpopreferivelmente reconhece a forma ativa mas não a latente de TGF Beta 1;mais preferivelmente a forma ativa, mas não a latente de TGF Beta 1 humana.

Neutralização

O termo "neutraliza" ou "antagoniza" com respeito a umacomposição de ligação se refere à situação na qual a ligação específica e/ouseletiva de uma composição de ligação à outra entidade molecular resulta naanulação ou inibição da função efetora biológica da entidade molecular ligadapela composição de ligação. Com respeito a TGF Beta 1, o termo "neutraliza"ou "antagoniza" é pretendido para se referir a uma composição de ligação cujaligação a, ou interação com, TGF Beta 1 resulta em inibição de uma atividadebiológica induzida por TGF Beta 1. Inibição de atividade biológica de TGFBeta 1 pode ser verificada medindo um ou mais indicadores in vitro ou in vivode atividade biológica de TGF Beta 1 incluindo por exemplo, sem limite,inibição de ligação de receptor, inibição de fibrose, inibição de quimiotaxia,ou inibição de transdução de sinal em um ensaio de ligação de TGF Beta 1(veja, e.g., Patente Européia 0 945 464 para exemplos não limitantes deensaios de neutralização abrangidos). Em uma forma de realização nãolimitante, a capacidade de uma composição de ligação para neutralizar ouantagonizar atividade de TGF Beta 1 é verificada por uso do ensaio comodescrito em um exemplo neste lugar.

A atividade neutralizante de uma composição de ligação, talcomo, por exemplo, uma forma de realização de anticorpo pode ser testadapor método aceito na arte. Em um exemplo não limitante, verificação érealizada adotando/modificando o ensaio de TGF de Randall et al (1993) J.Immunol Methods 164, 61-67. Este ensaio é baseado na capacidade de TGFBeta 1 e TGF Beta 2 para inibir a proliferação induzida por interleucina-5 (IL-5) do TFl de linhagem celular de eritroleucemia e na capacidade de reverter ainibição de TGF Beta com composições de ligação específicas para TGFBeta. O ensaio é relatado como sendo rápido, reproduzível, e sensível amenos do que 500 fg/ml de TGF-beta 1, e 5-10 pg/ml de TGF-beta 2. Oensaio também é relatado como sendo 100-1000 vezes menos sensível aoutras moléculas inibidoras tal como interferon-beta, interferon-gama, e TNF-alfa. O ensaio também é relatado como sendo capaz de ser tornado específicopara TGF-beta 1 ou TGF-beta 2 incluindo anticorpos neutralizantesespecíficos para TGF-beta 1 ou TGF-beta 2 e de reconhecer todas as espéciesmoleculares recombinantes prontamente disponíveis destas moléculas assimcomo as proteínas naturais produzidas a partir de plaquetas humanas ebovinas e de detectar TGF-beta em amostras de soro.

Outros ensaios, relatadas neste lugar ou conhecidos na arte,também são abrangidos. Por exemplo, o modelo anti-Thyl.l de rato é ummodelo bem estabelecido de glomerulonefrite mesangioproliferativa (veja,e.g., Morita, et al., 1998 Am J Kidney Dis 31:559-73; Bagchus, et al., 1986Lab. Invest. 55:680-7 e Yamamoto & Wilson 1987 Kidney Int. 32:514-25) noqual injeção de um anticorpo direcionado contra o antígeno Thy localizado nasuperfície de células mesangiais induz mesangiólise seguido por uma fase deproliferação excessiva compensatória de células mesangiais resultando emníveis elevados de proteína urinária (proteinúria). O modelo de nefrite anti-Thy 1,1 parece nefrite humana IgA ou púrpura de Henoch-Schonlein emmuitos aspectos (0'Donoghue, et al., 1991 J Clin Invest 88:1522-30) e foiusado para testar abordagens potencialmente terapêuticas para doença renaldeterminando a capacidade de testar composições para efetuar diminuiçõesdose-relacionadas em proteinúria (veja, e.g., Burg, et al., 1997 Lab Invest76:505-16; Johnson, et al., 1995 Kidney Int 47:62-9). Em uma forma derealização preferida, uma composição de ligação da invenção diminuiproteinúria em um tal modelo em mais do que ou igual a 10%, 11%, 12%,13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%,26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%,39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%,52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,78%, 79%, ou 80%. Adicionalmente abrangidas são formas de realizaçãotendo uma variação de proteinúria diminuída (em um tal modelo) entrequaisquer dois tais valores indicados, cuja variação pode incluir ou não um ououtro ou ambos valores numéricos de extremidades finais (e.g., uma variaçãode > 12% e <42%).

Adicionalmente, alguém pode adotar o ensaio de modelo decamundongo db/db diabético de Sharma (veja, e.g., 2000 PNAS 97:8015-20),demonstrando que inibição crônica de das ações biológicas de TGF-beta norim efetivamente previne falência renal resultando de diabete u.c. ou, alguémpode adotar ou o modelo de camundongo STZ diabético de Sharma (1996Diabetes 45, 522-30) para testar capacidade de uma composição de ligaçãopara melhorar ou prevenir nefropatia diabética. Ademais, Ueberham et al.,2003 Hepatology 37(5): 1067-78, descrevem um sistema de expressão gênicaregulada por tetraciclina em um modelo de camundongo duplo-transgênico defibrose de fígado onde a expressão de TGF-Beta 1 é regulada pela adição ouremoção de cloridrato de doxiciclina à água potável assim permitindo ativarou desativar expressão de TGFBeta 1 por vontade própria. Expressãocrescente de TGF-Beta 1 no fígado de tais animais leva a estados de doençafibrótica que são reversíveis desativando expressão de TGF Beta 1— mesmodepois de massa do fígado ter reduzido 59%. Uso deste modelo permitealguém avaliar os efeitos de composições de ligação da invenção em inibiçãode funções biológicas de TGF Beta 1 comparando uma composição de ligaçãoda invenção com os efeitos de cloridrato de doxiciclina desativando expressãode TGF Beta 1. Em uma forma de realização particular usando um ensaio deproliferação de célula HT-2 (como descrito neste lugar) requerentes abrangempreferivelmente formas de realização de composição de ligação com um IC5opelo menos uma melhora de: 50, 60, 70, 80, 90, 100, 105, 125, 150, 175, 200,225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, ou 450 vezes comparada com umvalor de IC5o, obtido usando uma composição de ligação similar, porexemplo, tal como mAb2471 (descrita em PCT/US2004/018921; US60/485.820) nas mesmas ou em condições similares de ensaio.Adicionalmente abrangidas são formas de realização tendo uma variação demelhora de IC5o (como definido acima) de dois tais valores que podem ou nãoincluir uma ou outra ou ambas extremidades finais (e.g., uma melhora de IC5ona variação de >80 e <100 vezes de melhora sobre, e.g., mAb2471).

Anticorpos

Composições de ligação de anticorpos da invenção incluem,e.g., sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos,humanos, humanizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia única,fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por umabiblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id)(incluindo, e.g., anticorpos anti-Id para anticorpos da invenção), e umfragmento de ligação a epítopo de qualquer dos acima.

O termo "anticorpo" como usado neste lugar, se refere acomposições de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas decomposições de imunoglobulina, e.g., uma molécula de composição deligação que contém um sítio de ligação que se liga especificamente e/ouseletivamente a um antígeno. Uma composição de imunoglobulina dainvenção pode ser de qualquer tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY),classe (e.g., IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2) ou uma subclasse deuma molécula de imunoglobulina. Preferivelmente um anticorpo é umfragmento de anticorpo humano de ligação a antígeno da invenção tal como,e.g., sem limitação, Fab, Fab' e F(ab')2, Fe, Fvs de cadeia única (scFv),anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), e fragmentoscompreendendo ou um domínio VL ou VH. Fragmentos de anticorpos deligação a antígeno, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreendera(s) região(regiões) variável(variáveis) apenas ou em combinação com atotalidade ou uma porção dos seguintes: uma região de dobradiça, umdomínio CHI, um domínio CH2, ou um domínio CH3 ou combinaçõesdestes. Também incluído na invenção está, e.g., sem limitação, um fragmentode ligação a antígeno que também pode compreender qualquer combinação deregião(regiões) variável(variáveis) com uma região de dobradiça, e.g., talcomo um domínio CHI, CH2, ou um CH3 ou combinações destes. Umanticorpo da invenção pode ser de qualquer origem animal incluindo aves emamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são humanos, de primatas, murinos(e.g., camundongo e rato), asno, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo,cavalo, ou galinha.

Como usado neste lugar, a frase "anticorpos humanos" inclui,e.g., sem limitação, anticorpos tendo uma seqüência de aminoácidos de umaimunoglobulina humana incluindo, e.g., sem limitação, um anticorpo isoladode uma biblioteca de imunoglobulina humana (tal como, e.g., uma bibliotecade linhagem germinativa humana) ou de um animal transgênico para uma oumais imunoglobulinas humanas e que não expressa imunoglobulinasendógenas, como descrito neste lugar ou, como pensado, e.g., em PatenteNorte-AmericanaNo. 5.939.598.

Uma composição de ligação pode ser monoespecífica,biespecífica, triespecífica, ou tendo maior multiespecificidade. Anticorposmultiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de umaproteína alvo, polipeptídeo (ou fragmento deste) ou podem ser específicospara tanto uma TGF Beta 1 assim como para um epítopo heterólogo, tal comouma isoforma heteróloga de TGF Beta ou material de suporte sólido (veja,e.g., WO 2093/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, etai. (1991) J. Immunol. 147:60-69; Patente Norte-Americana Nos. 4.474.893;4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; ou 5.601.819; ou Kostelny, et al. (1992) J.Immunol. 148:1547-1553).

Uma composição de ligação pode ser descrita ou especificadaem termos de um epítopo(s) ou porção(s) de uma proteína TGF Beta 1 (oufragmento desta) que ela reconhece ou se liga seletivamente e/ouespecificamente. Um epítopo(s) ou porção(s) de polipeptídeo pode serespecificado como descrito neste lugar, e.g., por posições N terminais e Cterminais, por tamanho em resíduos de aminoácidos contíguos, ou comolistado em uma Tabela e/ou Figura acompanhante, ou como descrito nestelugar. Adicionalmente, um anticorpo que se liga especificamente a umepítopo, polipeptídeo, proteína, ou fragmento de um polipeptídeo ou proteína,também pode ser especificamente excluído desta invenção. Por exemplo,Requerentes se reservam ao direito de condicionar qualquer anticorpo que seliga especificamente a um epítopo, polipeptídeo, proteína, ou fragmento deum polipeptídeo ou proteína. Por conseguinte, a invenção pode abranger um10 primeiro (ou outro) anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeoou proteína, ou fragmento destes, e, ao mesmo tempo, ela pode excluir umsegundo (ou outro) anticorpo que também pode se ligar seletivamente àmesma proteína ou polipeptídeo, ou fragmento destes, e.g., ligando umepítopo diferente. Em uma forma de realização preferida, Requerentescondicionam uma composição de ligação que se liga especificamente e/ouseletivamente a isoforma TGF Beta 1 em relação a TGF Beta 2 e/ou TGFBeta 3 e que neutraliza TGF Beta 1 compreendendo pelo menos um sítio deligação compreendendo pelo menos: quatro aminoácidos contíguos deQQWNGNPPA [SEQ ID NO: 126]; pelo menos seis aminoácidos contíguosde QQWDSNPPA [SEQ ID NO: 127]; pelo menos cinco aminoácidoscontíguos de YIYPYNGDTGYNQKFKS [SEQ ID NO: 128] (caracterizadopelo fato de que um dos ditos pelo menos cinco aminoácidos contíguos é D);ou pelo menos cinco aminoácidos contíguos de GYTFTDYTMH [SEQ IDNO: 129].

Anticorpos da invenção também podem ser descritos ouespecificados em termos de sua reatividade cruzada. Anticorpos que não seligam a qualquer outro análogo, ortólogo, parálogo, ou homólogo de umaproteína, polipeptídeo alvo (ou fragmento destes) são incluídos.

Adicionalmente abrangido pela invenção é um anticorpo quese liga seletivamente a um polipeptídeo, que é codificado por umpolinucleotídeo que hibridiza estavelmente, em condições estringentes dehibridização (como descrito neste lugar), com uma seqüência depolinucleotídeos de TGF Beta 1 humano.

Uma composição de ligação também pode ser caracterizada ouespecificada em termos de sua afinidade de ligação com uma proteína oupolipeptídeo (fragmento destes), ou epítopo. Em outra forma de realização,uma afinidade de ligação preferida de uma composição de ligação, e.g., umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, inclui, e.g., uma afinidade deligação (usando um ensaio descrito neste lugar) que demonstra umaconstante de dissociação ou Kd de menos do que (ou em uma variaçãoentre dois números definidos abaixo, cuja variação pode ou não incluiruma ou outra ou ambas extremidades): 5 X 10"2M, 10"2M, 5 X ICT3M, 10"3M, 5 X IO-4M, 10'4M, 5 X IO-5M, IO-5M, 5 X IO- 6M, IO-6M, 5 X IO-7M,IO-7M, 5 X 10"8M, IO-8M, 5 X IO-9M, IO-9M, 5 X IO-10M, 10- 10M, 5 X 10"11M, IO-11M, 5 X IO-12M, 4,9 X IO-12M, 4,8 X IO-12M, 4,7 X IO-12M, 4,6 XIO-12M, 4,5 X IO-12M, 4,4 X IO-12M, 4,3 X IO-12M, 4,2 X IO-12M, 4,1 X 10"12M5 4,0 X 10- 12M, 3,9 X IO-12M, 3,8 X IO-12M, 3,7 X IO-12M, 3,6 X IO-12M, 3,5 X IO-12M, 3,4 X 10- 12M, 3,3 X IO-12M, 3,2X IO-12M, 3,1 X IO-12M, 3,0 X IO-12M, 2,9 X IO-12M, 2,8 X 10-12M, 2,7 X IO-12M, 2,6 X IO-12M, 2,5 X IO-12M, 2,4 X IO-12M, 2,3 X IO-12M, 2,2 X IO-12M, 2,1 X IO-12M, 2,0 X IO-12M, 1,9 X 10"12M, 1,8 X 10"12M, 1,7 X 10"12M, 1,6 X 10"12M, 1,5 X IO-12M, 1,4 X IO-12M, 1,3 X IO-12M, 1,2 X IO-12M, 1,1 X IO-12M, 1,0 X IO-12M, 0,9 X 10- 12M, 0,8 X 10"12M, 0,7 X IO-12M, 0,6 X IO-12M, 0,5 X 10"12M, 0,4 X 10"12M, 0,3 X 10- 12M, 0,2 X 10'12M, 0,1 X 10'12M, IO-12M, 5 X IO-13M, IO-13M, 5 X IO-14M, IO-14M, 5 X IO-15M, ou ΙΟ-Ι 5M.

A invenção também abrange anticorpos que inibemcompetitivamente ligação de uma composição de ligação a um epítopo de umTGF Beta 1 como determinado por qualquer método conhecido na artepara determinar ligação competitiva, e.g., um imunoensaio descrito oureferenciado neste lugar. Em formas de realização preferidas, o anticorpoinibe competitivamente ligação ao epítopo em pelo menos 99%, 98%,97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, ou 91%, pelo menos 90%, 89%, 88%,87%, 86%,; pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelomenos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50% (ou em uma variaçãoentre dois tais valores, cuja variação pode ou não incluir uma ou outra ouambas extremidades).

Anticorpos da invenção podem atuar como antagonistas deTGF Beta 1 (ou um fragmento deste). Por exemplo, um anticorpo oucomposição de ligação da invenção pode romper, e.g., uma interação, ouparcialmente ou completamente, de TGF Beta 1 com um receptor/ligantecognato. Preferivelmente, anticorpos da invenção se ligam a um epítopoantigênico de TGF Beta 1, ou uma porção deste.

Da mesma maneira abrangidos pela invenção, são anticorposque se ligam a um ligante e previnem sua ligação a um receptor (e.g., porimpedimento estérico). Similarmente abrangidos são anticorpos de ligação aligante que inibem ativação de receptor sem inibir ligação de receptor.

Anticorpos da invenção podem ser usados, e.g., sem limitação,para purificar, detectar, ou direcionar um TGF Beta 1 (ou fragmento deste)para, e.g., métodos diagnósticos e terapêuticos in vitro e/ou in vivo. Porexemplo, os anticorpos têm uso em imunoensaios para medir qualitativamentee/ou quantitativamente níveis de TGF Beta 1 (ou fragmento deste) dainvenção em uma amostra biológica (veja, e.g., Harlow & Lane, UsingAntibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)).

Uma composição de ligação pode ser usada ou sozinha ou emcombinação com outras composições. Além disso, uma composição deligação tal como um anticorpo pode ser fundido recombinantemente com umpolipeptídeo heterólogo no término N ou C, ou quimicamente conjugado(incluindo conjugações covalentemente e não covalentemente) a umpolipeptídeo ou outras composições. Por exemplo, anticorpos da invençãopodem ser fundidos recombinantemente ou conjugados a moléculas úteiscomo etiquetas em ensaios de detecção e moléculas efetoras tal comopolipeptídeos heterólogos, drogas, radionuclídeos, ou toxinas (veja, e.g., WO92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente Norte-Americana No.5.314.995; e Patente Européia 396.387).

Uma composição de ligação inclui, e.g., derivados que sãomodificados, e.g., pelo acoplamento covalente de qualquer tipo de molécula a,e.g., um anticorpo de forma que o acoplamento covalente não previne oanticorpo de gerar uma resposta anti-idiotípica. Por exemplo, um derivado deanticorpo inclui sem limitação anticorpos modificados, e.g., por glicosilação,acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por gruposprotetores/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligantecelular ou outra proteína, etc. Qualquer das numerosas modificações químicaspode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, e.g., mas não limitadoa, clivagem química específica, acetilação, formulação, síntese metabólica detunicamicina, etc. Adicionalmente, um derivado pode conter um ou maisaminoácidos não clássicos. Uma composição de ligação pode ser gerada porqualquer método adequado conhecido na arte. Por exemplo, anticorposmonoclonais podem ser preparados usando qualquer técnica conhecida na artetal como, e.g., Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1988); Harlow & Lane, Using Antibodies: ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Breitling& Diibel 1999 Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, New York); H.Zola, Monoclonal Antibodies (Garland Press); e James W. Goding,Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Academic Press).O termo "anticorpo monoclonal" como usado neste lugar nãoé limitado a anticorpos produzidos por uma técnica particular, (e.g.,tecnologia de hibridoma). Métodos para produzir e triar por anticorposespecíficos usando tecnologia de hibridoma são de rotina e conhecidos naarte. O termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo derivado deum único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico, ou defago, e não o método pelo qual ele é produzido.

Fragmentos de anticorpos que reconhecem epítoposespecíficos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo,fragmentos Fab e F(ab')2 da invenção podem ser produzidos por clivagemproteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tal comopapaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentosF(ab')2). Fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante decadeia leve e o domínio CHl da cadeia leve. Por exemplo, uma composiçãode ligação também pode ser gerada usando vários métodos de apresentaçãoem fago conhecidos na arte nos quais domínios funcionais de anticorpos sãoapresentados na superfície de partículas de fago, que carregam uma seqüênciade polinucleotídeos codificando eles.

Em uma forma de realização particular, um método deapresentação em fago é usado para apresentar domínios de ligação deantígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatória deanticorpos (e.g., humanos ou murinos). Fagos que expressam um domínio deligação de antígeno que se liga a um antígeno de interesse podem serselecionados ou identificados com antígeno, e.g., usando antígeno etiquetadoou antígeno ligado ou capturado para uma superfície sólida ou microesfera.

Depois de seleção de fagos, regiões de codificação de anticorpo de um fagosão isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorposhumanos, ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado, eexpressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos,células de insetos, células vegetais, levedura, e bactérias, e.g., como descritoneste lugar ou na literatura.

Técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab,Fab' e F(ab')2 também podem ser empregadas usando métodos conhecidos naarte tal como, e.g., WO 92/122324; Mullinax, et al., BioTechniques 199212(6):864-9; e Sawai, et al., 1995 AJRI 34:26-34; e Better, et al., 1988Science 240:1041-3. Exemplos de Fvs de cadeia única produtores eanticorpos incluem, e.g., Patentes Norte-Americanas 4.946.778 e 5.258.498;Huston, et al., 1991 Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, et al., 1993PNAS USA 90:7995-9; e Skerra, et al., 1988 Science 240: 1038-40. Paraalguns usos, incluindo uso in vivo de anticorpos em humanos e ensaios dedetecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos humanizados, ouhumanos produzidos por técnicas conhecidas na arte.

Anticorpos humanizados neste lugar são composições deligação que se ligam a um antígeno desejado tendo um ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) como descrito neste lugar,embebidas dentro de uma região de arcabouço que é menos propensa a criaruma reação de imunogenicidade prejudicial sob introdução in vivo em umsistema de hospedeiro de humano (e.g., depois de administração parenteral).

Freqüentemente, regiões doadoras de CDR são apropriadamente embebidasdentro de regiões de arcabouço humanas para melhorar ligação de antígenoe/ou reduzir imunogenicidade. Regiões de arcabouço úteis podem seridentificadas usando métodos conhecidos na arte, e.g., (1) modelando asinterações de uma CDR e resíduos de arcabouço para identificar resíduos dearcabouço importantes para ligação de antígeno; (2) comparação deseqüências para identificar resíduos de arcabouço não usuais em posiçõesparticulares (veja, e.g., Patente Norte-Americana No. 5.585.089, Riechmann,et al., Nature 332:323 (1988); ou (3) empiricamente).

Regiões determinantes de complementaridade (CDRs)variáveis de cadeia pesada e leve de formas de realização particulares decomposição de ligação de anticorpo monoclonal da invenção são mostradasabaixo em Tabela l(a & b). As regiões CDR são indicadas usando códigopadrão de uma letra de aminoácido e numeração padrão de CDR, (i.e., com ocrescente valor numérico de uma CDR correspondente com sua crescenteproximidade com o domínio constante de uma estrutura típica de cadeiapesada ou leve de IgG; e.g., VH CDR3 é mais próxima ao domínio CHl doque VH CDRl).

Formas de realização específicas de CDR são representadasgenericamente usando fórmulas de aminoácidos para descrever um gênero deCDRs (de novo, usando código de aminoácido de letra única padrão comresíduos de aminoácidos substituíveis indicados pela letra "X" e sualocalização de resíduo dentro de uma CDR particular indicada por um índicenumérico cujo valor aumenta de resíduo inferior (mais amino) para superior(mais carboxi) na CDR (e.g., Xj em VHCDR2 é o resíduo mais amino daCDR enquanto que o resíduo substituível mais carboxi é X6.)). Usando estasformulas genéricas, alguém de habitual verso na arte é capaz de determinartodas as formas de realização de CDR possíveis em cada posição designadaem uma forma de realização de domínio variável de cadeia pesada ou leve(VL ou Vh) abrangida pela invenção. Qualquer particular instanciação de umaseqüência de aminoácidos possível é determinada meramente gerando todasas substituições possíveis em cada resíduo X particular dentro da fórmula deCDR particular usando o código de aminoácido. Todas as tais formas derealização são abrangidas neste lugar.)).

Ademais, todas as formas de realização possíveis de Vl ou Vhdas combinações possíveis de CDR são igualmente abrangidas pela invenção(e.g., usando a informação fornecida, alguém pode calcular prontamente queexistem 72 possíveis de VHCDRl; 384 possíveis de VHCDR2 e 12 possíveisde VHCDR3, que são capazes de gerar 72x384x12 combinações possíveistotais de VH CDR dentro de uma forma de realização particular de anticorpode cadeia pesada variável de uma composição de ligação da invenção. Todasas tais combinações são abrangidas neste lugar da mesma forma. Raciocíniosimilar se aplica a qualquer VL CDR e a todas as combinações possíveisabrangidas no domínio variável de cadeia leve VL. Por exemplo, existem 192possíveis de VLCDRl; 12 possíveis de VLCDR2 e 48 possíveis de VLCDR3,que são capazes de gerar 192x12x48 combinações possíveis totais de Vl CDRdentro de uma forma de realização particular de anticorpo de cadeia levevariável de uma composição de ligação da invenção.). Similarmente, todas ascombinações possíveis de pareamentos de VH e Vl dentro de uma forma derealização particular de composição de ligação são da mesma maneiraabrangidas.

Tabela Ia Fórmula de CDR de Cadeia Pesada de Composições de ligação

<table>table see original document page 28</column></row><table>

* Para VHCDR1: Xi é ou T ou D; X2 é ou Τ, E, ou F; X3 é ou Μ, I, L,ou V; e X4 é ou Η, V, ou A.

**Para VHCDR2: Xi é ou Y, Q, ou S; X2 é ou I, ou V; X3 é ou D, ouΕ; X4 é ou Υ, Τ, H, ou L; X5 é ou Q, Κ, P, ou S; e X6 é ou F ou Y.

*** Para VHCDR3: X1 é ou W ou A; X2 é ou F ou L; e X3 é ou A, E,ou Y.

Tabela Ib Fórmula de CDR de Cadeia Leve de Composições de ligação

<table>table see original document page 28</column></row><table>

• * Para VLCDR1: X: é ou R, Υ, E, ou Q; X2 é ou S ou Τ; X3 éou S, V, ou A; X4 é ou S ou L; X5 é ou S, P, L, ou Y.

**Para VLCDR2: X1 é ou L, N, ou P; e X2 é ou S, Κ, Y, L5 M,F, Ε, Q, R, ou Η.

***Para VLCDR3: Xi é ou Q ou S; X2 é ou L, D, ou Ρ; X3 éou N ou R; e X4 é ou P, F, Y, ou R.

Ademais, são abrangidas composições de ligação de anticorpousando CDRs abrangidas neste lugar que estão embebidas (em orientaçãoapropriada) ou carregadas dentro de regiões de arcabouço de anticorpohumano para possibilitar que a composição de ligaçao resultante se ligueespecificamente e/ou seletivamente a TGF Beta 1 maduro mais do que TGFBeta 2 maduro e/ou TGF Beta 3 maduro e para neutralizar TGF Beta 1maduro. Técnicas conhecidas na arte podem ser usadas para embeber ouposicionar CDRs particulares dentro de arcabouços apropriados. Domíniosvariáveis empregados na invenção podem ser derivados de qualquer domíniovariável humano de linhagem germinativa ou rearranjado, ou pode ser umdomínio variável sintético baseado em seqüências consenso de domíniosvariáveis humanos conhecidos.

Arcabouços de domínios variáveis preferidos são aqueles quenão afetam significantemente as propriedades biológicas de uma forma derealização de composição de ligação de anticorpo anti-TGF Beta 1 isto é, acapacidade de se ligar especificamente e/ou seletivamente a e neutralizar TGFBeta 1 maduro mais do que TGF Beta 2 maduro e/ou TGF Beta 3. Maispreferivelmente, são arcabouços que adicionalmente não extraem reaçõesimunogênicas significantes quando administrados a um sujeito humano (e.g.,parenteralmente). Seqüências preferidas de arcabouços podem ser seqüênciasde anticorpos humanos naturalmente ocorrentes ou seqüências consenso dediversos anticorpos humanos. Exemplos não limitantes de seqüências dearcabouços para a região variável de cadeia pesada de formas de realização deanticorpos da invenção incluem o segmento VH DP-5 (Tomlinson, et al 1992J. Mol. Biol. 227:776-98) e o segmento J JH4, JHl ou JH5 (Ravetch, et al1981 Cell 27:583-91). O segmento Vk Ll (Cox, et al 1994 Eur. J. Iminunol.24:827-36) e o segmento J Jk4 (Hieter, et al 1982 J. Biol. Chem. 10:1516-22)são seqüências de arcabouços exemplares não limitantes para a regiãovariável de cadeia leve. Em uma forma de realização preferida, o arcabouçoFR 1 de HCVR compreende QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS [SEQID NO: 8]; o arcabouço FR2 de HCVR compreende WVRQAPGQGLEWMG[SEQ ID NO: 9]; o arcabouço FR3 de HCVR compreendeRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR [SEQ ID NO: 10]; e oarcabouço FR4 de HCVR compreende WGQGTLVTVSS [SEQ ID NO: 11].

Em outra forma de realização preferida, o arcabouço FR 1 de LCVRcompreende DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC [SEQ ID NO: 12]; oarcabouço FR2 de LCVR compreende uma seqüência selecionada a partir de:

[SEQ ID NO: 13-36], o arcabouço FR3 de LCVR compreendeGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC [SEQ ID NO: 37]; e oarcabouço FR4 de LCVR compreende FGQGTKLEIK [SEQ ID NO: 38]. Emuma forma de realização mais preferível, tais regiões de arcabouços podemconter alterações, deleções, adições, substituições, ou qualquer combinaçãodestes. Além disso, arcabouços nos quais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10aminoácidos são substituídos, deletados, ou adicionados em qualquercombinação também são preferidos.

Em uma forma de realização, uma região constante de cadeiapesada preferida para uso em embebição de CDRs de composição de ligaçãode anticorpo da invenção inclui, por exemplo, uma região constante de IgG.

Em uma forma de realização mais preferida, a região constante de IgG é umaregião constante de IgGl ou uma região constante de IgG4 como mostradoabaixo:

IgGl [SEQ ID NO: 39]:

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDICK

VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYYDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYR VVSVLTVLHQD WLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PG; ouIgG4 [SEQ ID NO: 40]

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP A VLQS SGL YSLS S WTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFPLYSRLTVDKSRWQEGNVESCSVMHEALBNHYTQKSLSLSLG

Uma seqüência de região constante de cadeia leve preferida dainvenção é a região constante de cadeia kappa mostrada abaixo:

RTV AAPSVFIWPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPRE AKVQ WK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 41]

Em outra forma de realização preferida, composições deligação de anticorpos contêm a região constante de cadeia pesada de IgGl oua região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve kappade IgG4.

Usando a informação fornecida neste lugar, alguém de versohabitual poderia criar uma forma de realização de mAb da invenção, porexemplo, tal como No. 46P-L1-6, que teria uma Cadeia Leve compreendendo:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCEASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDLNPPAFGQGTKLEIKRTVAAPSVIIWPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [SEQ ID NO: 130] onde:o arcabouço FRl de LCVR = DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC;a CDRl de VL = EASSSVSYMH da fórmula X1AX2X3X4VX5YMH, onde Xlé ou R, Υ, E, ou Q; X2 é ou S ou Τ; X3 é ou S, V, ou A; X4 é ou S ou L; e X5é ou S, P, L, ou Y;o arcabouço FR2 de LCVR = WYQQKPGKAPKPLIY;

a CDR2 de VL = ATSNLAS da fórmula ATSNXiAX2, onde X1 é ou L, N, ouP; e X2 é ou S, Κ, Y, L, M, F, E, Q, R, ou H;

o arcabouço FR3 de LCVR = GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC;

a CDR3 de VL = QQWDLNPPA da fórmula XiQWDX2X3X4PA, onde Xi éou Q ou S; X2 é ou L, D, ou Ρ; X3 é ou N ou R; e X4 é ou P, F, Y, ou R;o arcabouço FR4 de LCVR = FGQGTKLEIK; ea região constante de cadeia leve =

RTV AAPSWIFPFSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPRE AKVQ WK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHK VY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC;

e uma Cadeia Pesada compreendendo:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWMGYIYPYDGDTGYNQKFKSRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYRWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFF A VLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHICPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQD WLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG [SEQ ID NO: 131] onde:

o arcabouço FRl de HCVR = QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS;a CDRl de VH = GYTFTDYNMH da fórmula GYXiFX2DYNX3X4; Xi é ouT ou D; X2 é ou Τ, E, ou F; X3 é ou Μ, I, L, ou V; e X4 é ou Η, V, ou A;o arcabouço FR2 de HCVR = WYRQAPGQGLEWMG;

a CDR2 de VH = YIYPYDGDTGYNQKFKS da fórmulaX1X2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS; Xi é ou Y, Q, ou S; X2 é ou I, ou V; X3é ou D, ou Ε; X4 é ou Υ, T, ou L; X5 é ou Q, Κ, P, ou S; e X6 é ou F ou Y;

0 arcabouço FR3 de HCVR = RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCAR;

a CDR3 de VH = GYRWFAY da fórmula GYRXjX2X3Y; onde X1 é ou Wou A; X2 é ou F ou L; e X3 é ou A, E, ou Y;

o arcabouço FR4 de HCVR = WGQGTLVTVSS; ea Região constante de cadeia pesada =

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP A VLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHICPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPICDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWS VLTVLHQDWLNGICEYKCKVSNKGLPSSIEKTISICAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTICNQVSLTCLVICGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

1 -FLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG.Polinucleotídeos Codificando Anticorpos.

A invenção abrange adicionalmente moléculas de ácidosnucleicos compreendendo seqüências de polinucleotídeos que codificam umacomposição de ligação (ou fragmento desta), ou seqüência de polipeptídeosda invenção. Os polinucleotídeos podem ser obtidos, e a seqüência denucleotídeos dos polinucleotídeos determinada por qualquer métodoconhecido na arte, por exemplo, se a seqüência de polipeptídeos (e.g., de umanticorpo ou fragmento deste) é conhecida, um polinucleotídeo codificando opolipeptídeo pode ser determinado simplesmente usando a degenerescênciado código genético em qualquer algoritmo computacional e a informação deseqüência resultante pode ser usada para reunir, por exemplo,oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (e.g., como descrito emKutmeier, et al., (1994) BioTechniques 17:242), o que, resumidamentedescrito, envolve sintetizar oligonucleotídeos sobrepostos contendo porçõesda seqüência codificando a seqüência de polipeptídeos, anelar, e ligar estesoligonucleotídeos, então, amplificar os oligonucleotídeos ligados usando umareação em cadeia da polimerase.

Alternativamente, um polinucleotídeo codificando a seqüênciade polipeptídeos da invenção pode ser gerado a partir de ácido nucleico dequalquer fonte adequada. Se um clone contendo uma molécula de ácidonucleico codificando um anticorpo particular não está disponível, mas,entretanto, a seqüência da molécula de anticorpo é conhecida, então um ácidonucleico codificando a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ouobtido de uma fonte adequada. Por exemplo a fonte pode ser uma bibliotecade cDNA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de poli A+RNA, isolados de qualquer tecido ou célula expressando o anticorpo deinteresse, tal como, e.g., umas células de hibridoma selecionadas paraexpressar um anticorpo da invenção por amplificação por PCR usandoiniciadores sintéticos hibridizáveis com as extremidades 3' e 5' de umaseqüência de polinucleotídeos de interesse ou por clonagem usando umasonda de oligonucleotídeo específica para a seqüência gênica particular paraidentificar, e.g., um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codificao anticorpo, uma molécula de ácido nucleico para o anticorpo pode sergerada.

Ácidos nucleicos amplificados podem ser clonados em vetoresreplicáveis de clonagem usando qualquer método conhecido na arte. Uma vezque o nucleotídeo e seqüência de aminoácidos correspondente do anticorpoestão determinados, a seqüência de nucleotídeos do anticorpo pode sermanipulada usando qualquer método conhecido na arte, e.g., técnicas de DNArecombinante, mutagênese sítio dirigida, PCR, etc. para gerar anticorpostendo uma seqüência de aminoácidos diferente para criar substituições,deleções, e/ou inserções de aminoácidos (veja, e.g., Sambrook, et al., eAusubel, et al., eds., cur. ed., Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley & Sons, NY).

Em uma forma de realização específica, a seqüência deaminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode serinspecionada para identificar as seqüências de regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) por métodos conhecidos, e.g., comparandoseqüências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeiapesada e leve para determinar, regiões de hipervariabilidade de seqüência.

Usando técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais CDRsdescritas neste lugar podem ser inseridas dentro de regiões de arcabouçosadequadas, e.g., em regiões de arcabouço humanas para reduzirimunogenicidade. Regiões de arcabouço podem ser naturalmente ocorrentesou regiões de arcabouços consenso (ou como pensado neste lugar) e sãopreferivelmente regiões de arcabouço humanas (para uma listagem de regiõesde arcabouço humanas veja, e.g., Chothia, et al. 1998 J. Mol. Biol. 278: 457-79). De forma geral, para identificar resíduos dentro dos arcabouços humanospropensos a influenciar a integridade do sítio de ligação a antígeno, e portantoligação de antígeno, tanto seqüências doadoras como aceptoras humanasselecionadas podem ser alinhadas a diversos modelos de seqüências derivadosde repertórios de anticorpos. 'Resíduos invariantes' (Kabat et al., 1991) e'Resíduos chave' (Chothia et al., 1989) são identificados, e verificações declasse canônica das alças de ligação de antígeno doador L1-L3, Hl e H2,respectivamente, são determinadas triando a seqüência contra modelos deseqüências (Martin & Thornton, 1996 Mol. Biol. 263:800-15 emhttp://www.bioinf. org.ukl). Além disso, resíduos na interface VH/VL(Chothia et al., 1985) e resíduos conhecidos por serem estruturalmenteconservados em sítios centrais (Chothia et al., 1998), são comparados comresíduos doadores e aceptores correspondentes. Resíduos de arcabouçodoadores e aceptores incompatíveis nestes sítios são analisados baseado eminformação de outros anticorpos de estrutura conhecida do Banco de Dadosde Proteínas (Berman, et al., 2000 Nucl. Acids Res. 28(l):235-42). Seleçãodos arcabouços humanos para usar como modelos para humanização deregiões V exógenas pode definir decisões subseqüentes considerando quaisresíduos humanizar. Escolher modelos homólogos de anticorpos comestrutura cristalina conhecida, de linhagem germinativa, de linhagem nãogerminativa, ou seqüências consenso derivadas de bases de dados disponíveissão opções (para uma revisão, veja Routledge et al. (Routledge, et al., 1993 inProtein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man (Clark, M., ed) pp. 14-44, Academic Titles, Nottingham,UK; e B. Lo, 2004 Antibodv Engineering: Methods and Protocols, HumanaPress)). Outra estratégia para humanizar anticorpos é escolher a seqüência delinhagem germinativa humana mais próxima (Tomlinson et al., 1992) como oarcabouço para receber as CDRs de doador. Esta abordagem de linhagemgerminativa é baseada na mesma base lógica que a estratégia de melhorajuste, mas apenas seqüências de linhagem germinativa são procuradas nosbancos de dados (veja, e.g./V BASE, que é um diretório compreensivo detodas as seqüências de região variável de linhagem germinativa humanacompiladas a partir de mais de mil seqüências publicadas, incluindo aquelasnos comunicados atuais das bibliotecas de dados de Genbank e EMBL. Obanco de dados V BASE foi desenvolvido por diversos anos no MRC Centerfor Protein Engineering (Cambridge, UK) como uma extensão de trabalho noseqüenciamento e mapeamento de genes de anticorpos humanos e como umaferramenta amigável ao usuário para sua análise). O método de arcabouço delinhagem germinativa é um muito útil pois uma seqüência de linhagemgerminativa humana não apresenta hipermutações somáticas que sãopotencialmente imunogênicas. CDRs também podem ser enxertadas ouembebidas em arcabouços humanos usando uma estratégia consenso delinhagem germinativa humana, na qual um dos subgrupos humanos é usadocomo o arcabouço (veja, e.g., Presta et al., 1993 J. Immunol 151:2623-32;Couto et al., 1994 Hybridoma, 13:2159; Couto et al., 1995 Câncer Res.(Suppl.), 55, 5973s-7s; Werther et al., 1996 3. Immunol., 157:4986-95;O1Connor et al., 1998 Protein Engng 11:321-8).

Preferivelmente, o polinucleotídeo gerado pela combinaçãodas regiões de arcabouços e CDRs codifica um anticorpo (ou fragmentodeste) que se liga especificamente e/ou seletivamente a TGF Beta 1 (ouepítopo deste). Preferivelmente, como discutido neste lugar, uma ou maissubstituições de aminoácidos podem ser feitas dentro das regiões dearcabouços para melhorar ligação do anticorpo a seu antígeno.

Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazersubstituições de aminoácidos ou deleções de um ou mais cisteína resíduos deregião variável participando em uma ligação dissulfeto intracadeia para gerarmoléculas de anticorpos carecendo de uma ou mais ligações dissulfetointracadeias. Outras alterações para o polinucleotídeo são abrangidas pelainvenção e dentro do verso de um artesão habitual, e.g., tal como um biólogomolecular.

Alternativamente, técnicas podem ser adaptadas para produziranticorpos de cadeia única (veja, e.g., Patente Norte-Americana No.4.946.778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston, et al., PNAS 85:5879-5883 (1988); e Ward, et al., Nature 334:544-54 (1989)). Anticorpos de cadeiaúnica são formados ligando os fragmentos de cadeia pesada e leve da regiãoFv através de uma ponte de aminoácidos, resultando em um polipeptídeo decadeia única. Técnicas para a reunião de fragmentos Fv funcionais em E. colitambém podem ser usadas (Skerra, et al. (1988) Science 242: 1038- 1041).

Fragmentos de Polipeptídeo

A invenção também abrange fragmentos de uma composiçãode ligação. Um "fragmento ou segmento polipeptídeo" abrange umaseqüência de aminoácidos que é uma porção de uma seqüência descrita nestelugar ou uma porção de uma seqüência de polipeptídeos de uma SEQ ID NO:.Fragmentos ou segmentos de proteína e/ou polipeptídeo podem ser "avulsos,"ou eles pode compreender parte de um polipeptídeo ou proteína maior, decujo fragmento ou segmento forma uma porção ou região, e.g., uma regiãocontínua única de uma SEQ ID NO: neste lugar conectada em uma proteínade fusão.

Preferivelmente, um segmento de polipeptídeo pode ter umcomprimento de aminoácidos contíguos que é pelo menos cerca de: 7, 8, 9,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50,52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 96, 98, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150 aminoácidos contíguos decomprimento. Neste contexto "cerca de" inclui, e.g., as variações ou valoresespecificamente relatados descritos neste lugar, e também abrange valores quediferem destes valores relatados em diversos resíduos de aminoácidos (e.g.,mais ou menos 5, mais ou menos 4, mais ou menos 3, mais ou menos 2, ou;mais ou menos 1 resíduos de aminoácidos), em uma ou outra ou ambasextremidades do fragmento. Polinucleotídeos codificando um tal fragmentode polipeptídeo também são abrangidos pela invenção.

Além disso, a invenção abrange proteínas ou polipeptídeoscompreendendo uma pluralidade de ditos segmentos ou fragmentos deaminoácidos, e.g., segmentos não sobrepostos de um comprimentoespecificado. Tipicamente, uma pluralidade será pelo menos dois, maisnormalmente pelo menos três, e preferivelmente pelo menos: quatro, cinco,seis, sete, oito, nove, ou mais.

Embora comprimentos mínimos de umsegmento sejam fornecidos, comprimentos máximos de vários tamanhostambém são abrangidos para qualquer pluralidade específica de segmentos,e.g., uma pluralidade de três segmentos in toto poderia ter um segmento de 7aminoácidos contíguos de comprimento, e dois segmentos não sobrepostosadicionais, cada um tendo um comprimento de 12.

Também são preferidos fragmentos ou segmentos depolipeptídeos (e seus fragmentos de polinucleotídeos correspondentes) quecaracterizam domínios estruturais ou funcionais, tal como, fragmentos, oucombinações destes, que compreendem e.g., regiões determinantes decomplementaridade (CDRs tal como VL ou VH: CDRl, CDR2, ou CDR3),regiões variáveis (e.g., das cadeias pesadas ou leves, VL ou VH), regiões dearcabouços (FH1, 2, 3, ou 4), regiões D ou J, domínios constantes (e.g., talcomo, Cl, Ch 1, CH2 ou Ch3), regiões de dobradiça, Fc regiões de ligação dereceptor gama, alfa-hélice, e regiões formadoras de alfa-hélice, folha beta, eregiões formadoras de folha beta, curva, e regiões formadoras de curva,espiral, e regiões formadoras de espiral, regiões hidrofílicas, regiõeshidrofóbicas, regiões anfipáticas alfa, regiões anfipáticas beta, regiõesflexíveis, regiões de alça, domínios em forma de grampo de cabelo, motivosbeta-alfa-beta, feixes de hélices, barris alfa/beta, barris beta paralelos, motivossanduíche ou chave-grega, domínios transmembrana, regiões formadoras desuperfície, regiões de ligação de substrato, regiões transmembrana, ligantes,regiões imunogênicas, regiões epitópicas, e regiões de índice antigênico alto.

Além disso, polinucleotídeos codificando estes domínios também sãoabrangidos.

Outros segmentos de polipeptídeo preferidos são fragmentosbiologicamente ativos. Fragmentos biologicamente ativos são aquelesexibindo atividade similar, mas não necessariamente idêntica, a uma atividadede um polipeptídeo de composição de ligação (ou fragmento deste) tal como,e.g., Fab, Fv, scFv, ou F(ab)2. Polinucleotídeos codificando estes fragmentosde polipeptídeo também são abrangidos pela invenção.

Preferivelmente, os fragmentos de polinucleotídeos codificamum polipeptídeo que demonstra uma atividade funcional. A frase "atividadefuncional" abrange um segmento de polipeptídeo que pode realizar uma oumais atividades funcionais conhecidas. Tais atividades funcionais incluem,e.g., sem limitação, atividade biológica, antigenicidade [capacidade de se ligar(ou competir com um polipeptídeo por ligação) a uma composição de ligaçãode anticorpo a um polipeptídeo da invenção], imunogenicidade (capacidadede gerar anticorpo que se liga a um polipeptídeo da invenção), capacidade deformar multímeros com um polipeptídeo da invenção, e a capacidade de seligar a um receptor ou ligante de um polipeptídeo descrito neste lugar.

A atividade funcional de um polipeptídeo (incluindofragmentos, variantes, derivados, e análogos destes) pode ser ensaiada porvários métodos. Por exemplo, onde alguém está ensaiando para a capacidadede se ligar ou competir com um polipeptídeo de comprimento completo dainvenção por ligação a um anticorpo de um polipeptídeo da invenção, váriosimunoensaios conhecidos na arte podem ser usados, incluindo, e.g., semlimitação, sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usandotécnicas tal como radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligadoà enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios imuno-radiométricos, reaçõesde precipitação por difusão em gel, ensaios de imuno-difusão, imunoensaiosin situ (usando etiquetas de ouro coloidal, enzima ou radioisótopo, porexemplo), western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (e.g.,ensaios de aglutinação em gel, ensaios de hemaglutinação, ensaios de fixaçãode complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, eensaios de imuno-eletroforese, etc.).

Em outra forma de realização, ligação de anticorpo é realizadadetectando uma etiqueta no anticorpo primário. Em outra forma de realização,o anticorpo primário é detectado detectando ligação de um anticorposecundário ou reagente ao anticorpo primário. Em uma forma de realizaçãoadicional, o anticorpo secundário é etiquetado. Muitas maneiras sãoconhecidas na arte para detectar ligação em um imunoensaio e estão dentro doescopo da invenção.

Em outra forma de realização, onde um ligante é identificado,ou a capacidade de um fragmento, variante ou derivado de polipeptídeo dainvenção de multimerizar está sendo avaliada, ligação pode ser ensaiada, e.g.,usando cromatografia em gel redutor e não redutor, cromatografia deafinidade em proteína, e affinity blotting (veja geralmente, Phizicky, et al.(1995) Microbial. Rev. 59:94-123). Em outra forma de realização, correlaçõesfisiológicas de ligação de um polipeptídeo aos seus substratos (transdução desinal) podem ser ensaiadas com técnicas comuns. Em adição, ensaiosdescritos neste lugar (veja, e.g., a seção "Exemplos" do pedido), ou de outramaneira conhecidos na arte, podem ser aplicados rotineiramente para medir acapacidade de uma composição de ligação (seus fragmentos, variantesderivados e análogos destes) de modular uma atividade biológica relacionada(ou in vitro ou in vivo) de TGF Beta 1.

Métodos de produzir Anticorpos

Um anticorpo composição de ligação pode ser produzidousando qualquer método conhecido na arte, em particular, por síntese químicaou preferivelmente, por técnicas de expressão recombinante.

Expressão recombinante de uma composição de ligação, oufragmento, derivado ou análogo desta, (e.g., uma cadeia pesada ou leve de umanticorpo da invenção ou um anticorpo de cadeia única da invenção), requerconstrução de um vetor de expressão contendo uma seqüência depolinucleotídeos que codifica o anticorpo. Uma vez que uma seqüência depolinucleotídeos codificando uma molécula de anticorpo ou uma cadeiapesada ou leve de um anticorpo, ou porção deste (preferivelmente contendo odomínio variável de cadeia pesada ou leve), da invenção tenha sido obtida, ovetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido portécnicas conhecidas de tecnologia de DNA recombinante.

Métodos conhecidos na arte podem ser usados para construirvetores de expressão contendo seqüências de codificação de composição deligação e sinais de controle transcricional e traducional apropriados. Estesmétodos incluem, e.g., sem limitação, técnicas de DNA recombinante in vitro,técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, assim,abrange vetores replicáveis compreendendo seqüência de nucleotídeoscodificando um anticorpo da invenção (ou fragmento deste), ou uma cadeiapesada ou leve deste, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ouuma CDR operavelmente ligada a um promotor. Tais vetores podem incluir,e.g., a seqüência de nucleotídeos codificando a região constante da moléculade anticorpo (veja, e.g., WO 86/05807; WO 89/01036; ou Patente Norte-Americana No. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode serclonado em um tal vetor para expressão da cadeia pesada ou leve inteira ouqualquer porção destas.

De forma geral, um vetor de expressão é transferido para umacélula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas sãoentão cultivadas para produzir um anticorpo ou porção deste. Assim, ainvenção também abrange, e.g., células hospedeiras contendo umpolinucleotídeo codificando um anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesadaou leve deste, ou um anticorpo de cadeia única da invenção, operavelmenteligada a um promotor heterólogo. Em formas de realização preferidas para aexpressão de anticorpos de cadeia dupla, vetores codificando tanto as cadeiaspesadas como leves podem ser co-expressos em uma célula hospedeira paraexpressão da molécula de imunoglobulina inteira, como detalhado neste lugarou conhecido na arte.

Diversos sistemas hospedeiro-vetor de expressão podem serutilizados para expressar moléculas de anticorpos da invenção. Tais sistemashospedeiro-expressão representam veículos pelos quais qualquer seqüência decodificação de interesse pode ser produzida e subseqüentemente purificada.

Entretanto, quando transformado ou transfectado com uma seqüência decodificação de nucleotídeo apropriada, células de sistema hospedeiro-expressão também podem representar uma molécula de anticorpo da invençãoin situ.

Estas células incluem, e.g., sem limitação, microorganismostal como bactérias (e.g., E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores deexpressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo, ouDNA de cosmídeo contendo seqüências de codificação de anticorpos;levedura (e.g., Saccharomyces, Piehia) transformada com vetores deexpressão de levedura recombinante contendo seqüências de codificação deanticorpos; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressãode vírus recombinante (e.g., baculovírus) contendo seqüências de codificaçãode anticorpos; sistemas de células vegetais infectadas com vetores deexpressão de vírus recombinante (e.g., vírus do mosaico da couve-flor,CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores deexpressão de plasmídeo recombinante (e.g., plasmídeo Ti) contendoseqüências de codificação de anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos(e.g., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) abrigando construtos de expressãorecombinante contendo promotores derivados do genoma de células demamíferos (e.g., promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (e.g.,o promotor tardio de adenovírus; o promotor de 7,5K de vírus vaccinia).

Preferivelmente, células bacterianas tal como Eseheriehia coli,e mais preferivelmente, células eucarióticas são usadas para a expressão deuma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamíferostal como células de ovário de hamster Chinês (CHO), em conjunção com umvetor tal como o elemento principal do promotor de gene precoceintermediário de citomegalovírus humano é um sistema de expressão efetivopara anticorpos (Foecking, et al. (1986) Gene 45:101; Cockett, et al. (1990)Bio/Technology 8:2).

Em sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podemser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido da moléculade anticorpo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade deproteína está para ser produzida, tipo, e.g., para a geração de composiçõesfarmacêuticas de uma molécula de anticorpo, então vetores que dirigem aexpressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão, que sãoprontamente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, e.g., semlimitação, o vetor de expressão pUR278 de E. coli (Ruther, et ai., EMBO J. 2:1791 (1983)), no qual a seqüência de codificação de anticorpo pode ser ligadaindividualmente no vetor em quadro com a região de codificação de Iac Z deforma que uma proteína de fusão é produzida; vetores pIN (Inouye andInouye, Nucleic Acids Res. 13:3 1013 109 (1985); Van Heeke and Schuster,J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e os semelhantes. Os vetores pGEXtambém podem ser usados para expressar polipeptídeos exógenos comoproteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST).

Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem serfacilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação amicroesferas de glutationa-agarose de matriz seguido por eluição na presençade glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir, e.g., sítiosde clivagem da protease de trombina, ou fator Xa de forma que o produto degene alvo clonado pode ser liberado a partir de uma unidade de GST. Umsistema de inseto usado como um vetor para expressar um gene exógeno, é osistema de vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV).

O vírus AcNPV cresce em células de Spodopteru frugiperda. A seqüência decodificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões nãoessenciais (e.g., o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob controle de umpromotor de AcNPV (e.g., o promotor de poliedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, diversos sistemas deexpressão baseados em vírus podem ser utilizados. Em casos onde umadenovírus é usado como um vetor de expressão, a seqüência de codificaçãode anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle detranscrição/tradução de adenovírus, e.g., o promotor tardio e seqüência lídertripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma deadenovírus usando recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma regiãonão essencial do genoma viral (e.g., região El ou E3) resulta em um vírusrecombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo emhospedeiros infectados (veja, e.g., Logan & Shenk, 1984 PNAS 8 1:355-9).

Sinais de iniciação específicos podem ser requeridos para tradução eficientede seqüências de codificação de anticorpos inseridas. Estes sinais incluem,e.g., o códon de iniciação ATG, e seqüências adjacentes. Além disso, o códonde iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da seqüência decodificação desejada para assegurar tradução apropriada do inserto inteiro.

Estes sinais exógenos de controle traducional e códons de iniciação podem serde uma variedade de origens, tanto natural como sintética.

A eficiência de expressão pode ser estimulada pela inclusão deelementos estimuladores de transcrição apropriados, terminadores detranscrição, etc. (veja, e.g., Bittner, et al., 1987 Methods in Enzymol. 153:5 1-4). Em adição, pode ser escolhida uma linhagem de célula hospedeira quemodula a expressão da seqüência inserida, ou modifica e processa o produtode gene da maneira específica desejada. Tais modificações (e.g., glicosilação)e processamentos (e.g., clivagem) de produtos protéicos podem serimportantes para a função de uma proteína.

Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicose específicos para o processamento pós-traducional e modificação deproteínas e produtos de genes. Linhagens celulares ou sistemas hospedeirosadequados podem ser escolhidos para assegurar a modificação eprocessamento correto de uma proteína exógena que é expressa. Para estafinalidade, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celularpara processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação, efosforílação podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamíferosincluem, e.g., sem limitação, CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293,3T3, Wl38, e, em particular, linhagens celulares de câncer de mama tal como,e.g., BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e linhagem celular de glândulamamária normal tal como, e.g., CRL7030 e Hs578Bst.

A invenção abrange anticorpos fundidos recombinantementeou quimicamente conjugados (incluindo tanto conjugações covalentes comonão covalente) a um polipeptídeo (ou porção deste, preferivelmentecompreendendo pelo menos: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100aminoácidos contíguos do polipeptídeo) para gerar proteínas de fusão. Afusão não necessariamente precisa ser direta, mas pode ocorrer através deseqüências ligantes.

Anticorpos fundidos ou conjugados a um polipeptídeo tambémpodem ser usados em imunoensaios in vitro e em métodos de purificaçãousando métodos conhecidos na arte (veja e.g., Harbor, et al., supra, e WO9312 1232; Patente Européia 439.095; Naramura et al. (1994) Immunol. Lett.39:9 1- 9; Patente Norte-Americana No. 5.474.981; Gillies, et al. 1992 PNAS89:1428-32; Fell, etal. 1991 J. Immunol. 146:2446-52).

A invenção adicionalmente inclui composiçõescompreendendo um polipeptídeo (ou fragmento deste) fundido ou conjugadoa um domínio anticorpo outro do que uma região variável. Por exemplo, umpolipeptídeo da invenção (ou fragmento deste) pode ser fundido ou conjugadoa uma região constante de anticorpo, região D ou J, ou uma região Fc, ouporção destas. A porção de anticorpo que é fundida a um polipeptídeo dainvenção (ou fragmento deste) pode compreender uma região constante, umaregião de dobradiça, um domínio CHI, um domínio CH2, e/ou um domínioCH3 ou qualquer combinação de domínios inteiros ou porções destes. Umpolipeptídeo (ou fragmento deste) também pode ser fundido ou conjugado auma porção de anticorpo descrita neste lugar para formar multímeros. Porexemplo, porções Fc fundidas a um polipeptídeo da invenção (ou fragmentodeste) podem formar dímeros através de ligação dissulfeto entre as porçõesFc. Formas multiméricas maiores podem ser feitas fundindo os polipeptídeosa porções de IgA e IgM. Métodos para fundir ou conjugar um polipeptídeo dainvenção (ou fragmento deste) a uma porção de anticorpo são conhecidos(veja, e.g., Patente Norte-Americana Nos. 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046;5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; Patente Européia 307.434; Patente Européia367.166; WO 96/04388; W09106,570; Ashkenazi, et al. (1991) PNAS 88:10535-10539; Zheng, et al. (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; e Vie, et al.(1992) PNAS 89: 11337-11341).

Como discutido neste lugar, um polipeptídeo, fragmento depolipeptídeo, pode ser fundido ou conjugado a uma porção de anticorpodescrita neste lugar ou conhecida na arte para aumentar a meia vida in vivo.

Ademais, um polipeptídeo, fragmento de polipeptídeo, pode ser fundido ouconjugado a uma porção de anticorpo para facilitar purificação. Um exemplousa proteínas quiméricas compreendendo os primeiros dois domínios dopolipeptídeo CD4 humano e vários domínios das regiões constantes dascadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas de mamíferos, (veja, e.g.,Patente Européia 394.827; Traunecker, et al. (1988) Nature 33 1:84-86).

Em muitos casos, a parte Fc de uma proteína de fusão ébenéfica em terapia e diagnose, e assim pode resultar em, e.g., propriedadesfarmacocinéticas melhoradas (veja, e.g., Patente Européia A232.262).

Alternativamente, deletar a parte Fc depois da proteína de fusão ter sidoexpressa, detectada, e purificada, pode ser favorecido. Por exemplo, a porçãoFc pode atrapalhar terapia e diagnose se a proteína de fusão é usada como umantígeno para imunizações. Em descoberta de droga, e.g., proteínas humanas,tal como hIL-5, foram fundidas com porções Fc para o propósito de ensaiosde triagem em larga escala para identificar antagonistas de hIL-5 (veja, e.g.,Bennett, et al. (1995) J. Molecular Recognition 8:52-58; Johanson, et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:9459-9471).

Além disso, uma composição de ligação (ou fragmento desta)pode ser fundida a seqüências marcadoras, tal como um peptídeo para facilitarpurificação. Em formas de realização preferidas, a seqüência marcadora deaminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida emum vetor pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), entre outras, muitas dasquais são comercialmente disponíveis. Hexa-histidina sustenta purificaçãoconveniente de uma proteína de fusão (Gentz, et ai. (1989) PNAS 86:821-824). Outras etiquetas de peptídeo úteis para purificação incluem, e.g., aetiqueta "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteínahemaglutinina de influenza (Wilson, et al. (1984) Cell 37:767) e a etiqueta"flag".

A invenção abrange adicionalmente anticorpos ou fragmentosdestes conjugados a um agente diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpospodem ser usados diagnosticamente para, por exemplo, monitorar odesenvolvimento ou progressão de um tumor como parte de um procedimentode teste clínico para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.

Detecção pode ser facilitada acoplando o anticorpo a uma substânciadetectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem, e.g., várias enzimas,grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiaisbioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de posítron usandovárias tomografias de emissão de posítron, e íons metálicos paramagnéticosnão radioativos. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada oudiretamente ao anticorpo (ou fragmento deste) ou indiretamente, através deum intermediário (tal como, e.g., um ligante conhecido na arte) usandotécnicas estabelecidas (veja, e.g., Patente Norte-Americana No. 4.741.900para íons metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para uso comodiagnósticos de acordo com a invenção). Exemplos de enzimas adequadasincluem, e.g., sem limitação, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de gruposprostéticos adequados incluem, e.g., sem limite, estreptavidina/biotina eavidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem, semlimitação, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína,rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansil, ou ficoeritrina;um exemplo de um material luminescente inclui, e.g., sem limitação, luminol;exemplos de materiais bioluminescentes incluem, e.g., sem limitação,luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de um material radioativoadequado incluem, e.g., 1/25,11315I111 ou Tc99.

Uma composição de ligação da invenção também pode seracoplada a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaiosou purificação de um antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, e.g., semlimitação, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto depolivinil, ou polipropileno. Técnicas para conjugar uma porção terapêutica aum anticorpo são conhecidas, veja, e.g., Amon, et al., "MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer TherapyinMonoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld, et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom, et al., "Antibodies For DrugDelivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson, et al. (eds.), pp.623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers OfCytotoxicAgents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinicai Applications, Pinchera, et al. (eds.), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody in Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies forCâncer Detection and Therapy, Baldwin, et al. (eds.), pp. 303-16 (AcademicPress 1985), e Thorpe, et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties ofAntibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).

B. Imunoensaios

Uma proteína particular tal como TGF Beta 1 pode ser medidapor uma variedade de métodos de imunoensaio incluindo, e.g., sem limitação,sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usando técnicas talcomo, e.g., sem limitação, western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaioimunoabsorvente ligado à enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios deimunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusãoem gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixaçãode complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, eimunoensaios de proteína A. Para uma revisão de procedimentosimunológicos e de imunoensaio em geral, veja Stites and Teri: (eds.) (1991)Basic and Clinicai Immunology (7th ed.). Além disso, os imunoensaios dainvenção podem ser realizados em muitas configurações, que são revistasextensivamente em Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press,Boca Raton, Florida; Gosling J P 2000 Immunoassays: A Practical Approach(Practical Approach Series) Oxford Univ Press; Diamandis & Christopoulus,1996 Immunoassay Academic Press, San Diego, CA; Tijan (1985) "Practiceand Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam; Wild, D. (Ed.), 2001 The Immunoassay Handbook (2nd edition)Nature Pub Group; James T. Wu, 2000 Quantitative Immunoassay: APractical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and ClinicaiApplication, Amer Assn for Clinicai Chemistry, Brousseau & Beaudet (Eds.)Manual of Immunological Methods CRC Press Boca Raton, Florida; eHarlow and Lane Antibodies1 A Laboratory Manual, supra. Veja tambémChan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando,FL; Price and Newman (eds.) (1991) Principies and Practice ofImmunoassays Stockton Press, NY; e Ngo (ed.) (1988) Non-isotopicImmunoassays Plenum Press, NY.

Imunoensaios para mensuração podem ser realizados por umavariedade de métodos conhecidos na arte. Em resumo, imunoensaios paramedir a proteína podem ser ou ensaios de ligação competitiva ou nãocompetitiva. Em ensaios de ligação competitiva, a amostra a ser analisadacompete com um analito marcado por sítios de ligação específicos em umaligação de agente de captura com uma superfície sólida. Preferivelmente, oagente de captura é um anticorpo especificamente reativo com uma proteínaTGF Beta 1 como descrito neste lugar. A concentração de analito marcadoligado ao agente de captura é inversamente proporcional à quantidade deanalito livre presente na amostra.

Em um imunoensaio de ligação competitiva, a proteína alvopresente na amostra compete com proteína marcada por ligação a umacomposição de ligação específica, por exemplo, uma composição de ligação,tal como um anticorpo, que é especificamente e/ou seletivamente reativo coma proteína alvo. A composição de ligação pode ser ligada a uma superfíciesólida para efetuar separação de proteína marcada ligada da proteína marcadanão ligada. Alternativamente, o ensaio de ligação competitiva pode serconduzido em fase líquida e uma variedade de técnicas conhecidas na artepode ser usada para separar a proteína marcada ligada da proteína marcadanão ligada. Seguindo separação, a quantidade de proteína marcada ligada édeterminada. A quantidade de proteína presente na amostra é inversamenteproporcional à quantidade de ligação de proteína marcada.

Alternativamente, pode ser realizado um imunoensaiohomogêneo no qual uma etapa de separação não é necessária. Nestesimunoensaios, a marca na proteína é alterada pela ligação da proteína a suacomposição de ligação específica. Esta alteração na proteína marcada resultaem um diminuição ou aumento no sinal emitido por marca, de forma quemedida da marca no fim do imunoensaio leva em conta detecção ouquantificação da proteína.

Ensaios competitivos também são particularmente úteis, ondeas células estão em contato e incubadas com um parceiro de ligação ouanticorpo marcado tendo afinidade de ligação conhecida para a proteína, talcomo anticorpo I, e uma amostra de teste cuja afinidade de ligação com acomposição de ligação está sendo medida. As composições de ligaçãomarcadas ligadas e livres são então separadas para verificar o grau de ligaçãoprotéica. A quantidade de composto teste ligado é inversamente proporcionalà quantidade de parceiro de ligação marcado se ligando à fonte conhecida.

Qualquer uma das numerosas técnicas pode ser usada para separar proteínaligada de livre para verificar o grau de ligação protéica. Esta etapa deseparação pode tipicamente envolver um procedimento tal como adesão afiltros seguida por lavagem, adesão a plástico seguida por lavagem, oucentrifugação das membranas celulares. Células viáveis também podem serusadas para triar para os efeitos de drogas em uma função mediada porproteína TGF beta (e.g., segundo níveis de mensageiro, tal como, e.g.,proliferação celular; mudanças combinadas de fosfato de inositol, transcriçãousando um ensaio tipo luciferase; e outros). Alguns métodos de detecçãolevam em conta eliminação de uma etapa de separação, e.g., um sistema dedetecção sensível à proximidade.

Análise qualitativa ou quantitativa de proteínas também podeser determinada por uma variedade de métodos de imunoensaio nãocompetitivo. Por exemplo, um imunoensaio sanduíche de fase sólida de doissítios pode ser usado. Neste tipo de ensaio, uma composição de ligação para aproteína, por exemplo um anticorpo, é acoplado a um suporte sólido. Umasegunda composição de ligação de proteína, que também pode ser umanticorpo, e que se liga à proteína em um sítio diferente, é marcada. Depoisque ligação em ambos os sítios na proteína ocorreu, a composição de ligaçãomarcada não ligada é removida e a quantidade de composição de ligaçãomarcada ligada à fase sólida é medida. A quantidade de composição deligação marcada ligada é diretamente proporcional à quantidade de proteínana amostra.Os formatos de imunoensaio descritos acima empregamcomponentes de ensaios marcados. A marca pode ser acoplada diretamente ouindiretamente ao componente desejado do ensaio de acordo com métodos bemconhecidos na arte. Diversas marcas e métodos podem ser usados.

Tradicionalmente, uma marca radioativa incorporando 3H, 12515 35S5 14c, ouP foi usada. Marcas não radioativas incluem proteínas, que se ligam aanticorpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminescentes, enzimas, eanticorpos, que podem servir como membros de pares de ligação específicospara uma proteína marcada. A escolha de marca depende de sensibilidaderequerida, facilidade de conjugação com o composto, requerimentos deestabilidade, e instrumentação disponível. Para uma revisão de váriossistemas produtores de marcação ou sinal, que podem ser usados, veja PatenteNorte-AmericanaNo. 4.391.904.

Composições de ligação de anticorpo reativas com umaproteína particular também podem ser medidas por uma variedade de métodosde imunoensaio. Para uma revisão de procedimentos imunológicos e deimunoensaio aplicáveis à medida de anticorpos por técnicas de imunoensaio,veja Stites and Ten (eds.) Basic and Clinicai Immunology (7th ed.) supra;Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, supra; e Harlow and Lane UsingAntibodies, A Laboratory Manual, supra.

Em resumo, imunoensaios para medir antisoros reativos com aproteína almejada podem ser ou ensaios de ligação competitiva ou nãocompetitiva. Em ensaios de ligação competitiva, o analito de amostra competecom um analito marcado por sítios de ligação específicos em um agente decaptura ligado a uma superfície sólida. Preferivelmente, o agente de captura éuma proteína recombinante purificada. Outras fontes de proteínas, incluindoproteína naturalmente ocorrente isolada ou parcialmente purificada, tambémpodem ser usadas. Ensaios não competitivos incluem ensaios sanduíche, nosquais o analito de amostra é ligado entre dois reagentes de ligação específicade analito. Uma das composições de ligação é usada como um agente decaptura e é ligada a uma superfície sólida. A segunda composição de ligação émarcada e é usada para medir ou detectar o complexo resultante por meiovisual ou instrumental. Diversas combinações de agente de captura ecomposição de ligação marcada podem ser usadas. Uma variedade dediferentes formatos de imunoensaio, técnicas de separação, e marcas pode serusada similar àquelas descritas acima para a mensuração de uma proteína.

A capacidade do anticorpo de interesse de imunoprecipitar umantígeno particular pode ser verificada por, e.g., análise Western. Alguém deverso na arte será versado sobre como os parâmetros são modificáveis paraaumentar ligação de um anticorpo a um antígeno e para diminuir requisitos(e.g., pré-liberando o lisado celular com microesferas de sefarose). Discussãoadicional de protocolos de imunoprecipitação pode ser encontrada em, e.g.,Ausubel et al, eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1,John Wiley & Sons, Inc., New York.

Um ensaio ELISA compreende preparar um antígeno, revestiro poço de uma placa de microtítulo de 96 poços com o antígeno, adicionandoo anticorpo de interesse conjugado a um composto detectável tal como umsubstrato enzimático (e.g., peroxidase de raiz forte ou fosfatase alcalina) aopoço e incubando por um período de tempo, e detectando a presença doantígeno. Em ELISAs, o anticorpo de interesse não tem que ser conjugado aum composto detectável; ao contrário, um segundo anticorpo (que reconheceo anticorpo de interesse) conjugado a um composto detectável pode seradicionado ao poço.

Ademais, ao invés de revestir o poço com o antígeno, oanticorpo pode ser revestido para o poço. Neste caso, um segundo anticorpoconjugado a um composto detectável pode ser adicionado seguindo a adiçãodo antígeno de interesse ao poço revestido. Um artesão comum podedeterminar sem experimentação indevida quais parâmetros a ajustar, e.g., paraaumentar sinal assim como quais outras variações para um ELISA devem serusadas (veja, e.g., Ausubel, et al., eds., 1994, Current Protocols in MolecularBiology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).

A afinidade de ligação de um anticorpo com um antígeno e ataxa de associação e dissociação de uma interação anticorpo-antígeno podeser determinada, e.g., usando um ensaio de ligação competitiva. Um exemplonão limitante é um radioimunoensaio compreendendo incubar antígenomarcado (e.g., usando H ou 1) com um anticorpo de interesse na presençade quantidades crescentes de antígeno não marcado, e então detectar aquantidade de anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade doanticorpo de interesse por um antígeno particular e as taxas de dissociação deligação podem ser determinadas a partir dos dados por, e.g., análise deScatchard. Competição com um segundo anticorpo também pode serdeterminada usando, e.g., radioimunoensaios. Neste caso, o antígeno éincubado com anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado (e.g.,3H ou 125I) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorponão marcado.

Variantes Físicas

A invenção também abrange seqüências de polipeptídeostendo similaridade e/ou de identidade substancial de seqüência deaminoácidos com uma seqüência de aminoácidos descrita neste lugar.

Similaridade de seqüência de aminoácidos, ou identidade de seqüência, édeterminada otimizando compatibilidades de resíduos. Estas mudançasquando considerando substituições conservativas como compatibilidades.

Substituições conservativas tipicamente incluem substituições dentro dosseguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico,ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; efenilalanina, tirosina. Veja também Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol.48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Time Warps, String Edits, andMacromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison ChapterOne, Addison-Wesley, Reading, MA; e pacotes de aplicativos computacionaisde IntelliGenetics, Mountain View, CA; e o University of Wisconsin GeneticsComputer Group, Madison, WI.

A invenção abrange, mas não é limitada a, seqüências depolipeptídeos que são funcionalmente relacionadas a um polipeptídeocodificado por um identificador de seqüência específico do presente pedido.

Polipeptídeos funcionalmente relacionados incluem qualquer polipeptídeocompartilhando uma característica funcional com uma composição de ligação(e.g., a capacidade de se ligar seletivamente e/ou especificamente a TGF Beta1 e não se ligar a TGF Beta 2 e/ou 3). Tais polipeptídeos funcionalmenterelacionados incluem, sem limitação, adições ou substituições de resíduos deaminoácidos dentro da seqüência de aminoácidos codificada pelas seqüênciasdescritas neste lugar; particularmente, aquelas que resultam em uma mudançasilenciosa, assim produzindo um polipeptídeo funcionalmente equivalente.

Substituições de aminoácidos podem ser feitas baseadas em similaridade empolaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou anatureza anfipática dos resíduos envolvidos.

Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluemalanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, emetionina; aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina,cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; aminoácidos carregadospositivamente (básicos) incluem arginina, lisina, e histidina; e aminoácidoscarregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Além disso, aminoácidos não clássicos ou análogos químicosde aminoácidos podem ser substituídos ou adicionados em uma seqüência depolipeptídeos. Aminoácidos não clássicos incluem, e.g., sem limitação, D-isômeros dos aminoácidos comuns; 2,4-ácido diaminobutírico; a-ácido aminoisobutírico, 4-ácido aminobutírico, Abu, 2-ácido aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, 6-ácido amino hexanóico, Aid, 2-ácido amino isobutírico, 3-ácido aminopropiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina,citrulina, homocitrulina, ácido cístico, tbutilglicina, t-butilalanina,fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidosprojetados tal como b-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metilaminoácidos, e análogos de aminoácidos em geral. Além disso, o aminoácidopode ser ou dextrógero (D) ou levógero (L).

Adições de porções de peptídeos para facilitar manipulaçãosão técnicas familiares e de rotina na arte. Além disso, uma composição deligação (incluindo qualquer fragmento desta, e especificamente um epítopo)pode ser combinada com partes do domínio constante de uma imunoglobulinae.g., (IgA, IgE, IgG, IgM) porções destas (CH 1, CH2, CH3), e qualquercombinação destas incluindo tanto domínios inteiros como porções destes,resultando em um polipeptídeo quimérico. Tais proteínas de fusão podemfacilitar purificação e freqüentemente são úteis para aumentar a meia vida invivo da proteína. Por exemplo, isto foi demonstrado para proteínas quiméricascompreendendo os dois primeiros domínios de um polipeptídeo CD4 humanoe vários domínios das regiões constantes das cadeias pesadas ou leves deimunoglobulinas de mamíferos (Patente Européia 394.827; Traunecker, et al.,1988 Nature 331:84-6). Proteínas de fusão com estruturas diméricas ligadaspor dissulfeto (devido ao domínio IgG) também podem ser mais eficientespara ligar e neutralizar outras moléculas do que uma proteína monoméricasecretada ou fragmento único de proteína (Fountoulakis, et al. 1995 J.Biochem.15 270:3958-64). Liberação estimulada de um antígeno através deuma barreira epitelial para o sistema imune foi demonstrada para antígenos(e.g., insulina) conjugados a um parceiro de ligação FcyR tal como IgG oufragmentos Fc (veja, e.g., WO 96/22024 e WO 99/104813).

Adicionalmente, uma proteína de fusão pode compreendervárias porções da região constante de uma molécula de imunoglobulina juntocom uma proteína humana (ou parte desta). Em muitos casos, a parte Fc emuma proteína de fusão é benéfica em terapia e diagnose, e assim, pode resultarem, e.g., propriedades farmacocinéticas melhoradas. Alternativamente, deletara parte Fc depois da proteína de fusão ter sido expressa, detectada, epurificada, pode ser desejado. Por exemplo, a porção Fc pode atrapalharterapia e/ou diagnose se a proteína de fusão é usada como um imunogene paraimunizações. Em descoberta de droga por exemplo, proteínas humanas foramfundidas com porções Fc para o propósito de ensaios de triagem em largaescala para identificar antagonistas.

Além disso, novos construtos podem ser feitos combinandodomínios funcionais similar de outras proteínas. Por exemplo, segmentos deligação de proteína ou outros podem ser "trocados" entre' novos polipeptídeosou fragmentos de fusão diferentes. Assim, novos polipeptídeos quiméricosexibindo novas combinações de especificidades irão resultar da ligaçãofuncional de especificidades de ligação de proteína e outros domíniosfuncionais. Adicionalmente, construções de fusão podem ser geradas atravésdas técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivo,embaralhamento de éxon, e/ou embaralhamento de códon.

"Substancialmente puro" se refere a ácido nucleico, proteína,ou polipeptídeo que são removidos de seu ambiente natural e são isoladose/ou separados de outras proteínas, ácidos nucleicos, e outros biológicoscontaminantes. Pureza, ou "isolamento" pode ser ensaiado por métodospadrão, e será geralmente pelo menos cerca de 50% puro, mais geralmentepelo menos cerca de 60% puro, geralmente pelo menos cerca de 70% puro,mais geralmente pelo menos cerca de 80% puro, freqüentemente pelo menoscerca de 85% puro, mais freqüentemente pelo menos cerca de 90% puro,preferivelmente pelo menos cerca de 95% puro, mais preferivelmente pelomenos cerca de 98% puro, e em formas de realização mais preferidas, pelomenos 99% puro. Conceitos similares se aplicam, e.g., a composições deligação, e.g., tal como anticorpos da invenção. Por exemplo, pode serdesejável purificar um polipeptídeo a partir de proteínas ou polipeptídeos decélula recombinante.

"Solubilidade" de uma proteína ou polipeptídeo é refletida porsedimentação medida em unidades Svedberg, que são uma medida davelocidade de sedimentação de uma molécula em condições particulares. Adeterminação da velocidade de sedimentação foi classicamente realizada emuma ultracentrífuga analítica, mas agora é tipicamente realizada em umaultracentrífuga padrão (veja, Freifelder 1982 Physical Biochemistry (2d Ed.)W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; e Cantor and Schimmel (1980)Biophysical Chemistry parts 13, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA).

Como uma determinação grosseira, uma amostra contendo um polipeptídeopresumidamente solúvel é girada em uma ultracentrífuga padrão de tamanhocompleto a cerca de 50K rpm por cerca de 10 minutos, e moléculas solúveisirão permanecer no sobrenadante. Uma partícula ou polipeptídeo solúveltipicamente será de menos do que cerca de 30S, mais tipicamente menos doque cerca de 15S, normalmente menos do que cerca de 10S, maisnormalmente menos do que cerca de 6S, e, em formas de realizaçãoparticulares, preferivelmente menos do que cerca de 4S, e maispreferivelmente menos do que cerca de 3S. Solubilidade de um polipeptídeoou fragmento depende do ambiente e do polipeptídeo. Muitos parâmetrosafetam solubilidade de polipeptídeo, incluindo temperatura, ambiente deeletrólito, tamanho e características moleculares do polipeptídeo, e naturezado solvente. Tipicamente, a temperatura na qual o polipeptídeo é usado variade cerca de 4°C a cerca de 65°C. Normalmente a temperatura em uso é maiordo que cerca de 18°C e mais normalmente maior do que cerca de 22°C. Parapropósitos diagnósticos, a temperatura normalmente será de cerca detemperatura ambiente ou mais quente, mas menos do que a temperatura dedesnaturação de componentes no ensaio. Para propósitos terapêuticos, atemperatura normalmente será temperatura corporal, tipicamente cerca de37°C para humanos, embora em certas situações a temperatura possa seraumentada ou diminuída in situ ou in vitro. O tamanho e estrutura dopolipeptídeo geralmente devem ser em um estado substancialmente estável, enormalmente não em um estado desnaturado. O polipeptídeo pode serassociado com outros polipeptídeos em uma estrutura quaternária, e.g., paraconferir solubilidade, ou associado com lipídios ou detergentes de umamaneira que aproxima interações naturais de bicamada lipídica.

O solvente normalmente será um tampão biologicamentecompatível, de um tipo usado para preservação de atividades biológicas, enormalmente irá se aproximar de um solvente fisiológico. Normalmente osolvente terá um pH neutro, tipicamente entre cerca de 5 e 10, epreferivelmente cerca de 7,5. Em algumas ocasiões, um detergente seráadicionado, tipicamente um não desnaturante brando, e.g., CHS(hemisuccinato de colesteril) ou CHAPS (3-[3-(colamidopropil)-dimetilamônio]-l-propano sulfonato), ou uma concentração baixa o suficientepara evitar distúrbio significante de propriedades estruturais ou fisiológicas daproteína. Em uma forma de realização preferida, a solubilidade de umacomposição de ligação da invenção (pH 5,0-6,0 e 150mM de NaC 1) é maiordo que 10, 15, 20, 25, 30, 35, ou 40 mg/mL; em uma forma de realização maispreferida, maior do que 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mg/mL; em umaforma de realização ainda mais preferida, maior do que 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59 ou 60 mg/mL, em uma forma de realização ainda mais preferívelmaior do que 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130,135, 140, ou 150 mg/mL (ou em uma variação entre qualquer dois taisvalores, cuja variação pode ou não incluir uma ou outra ou ambasextremidades).

Variantes

A invenção é dirigida a polipeptídeos que compreendem, oualternativamente consistem de, uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos: 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica a, e.g., umaseqüência de polipeptídeos da invenção (ou fragmentos desta). Determinar seuma seqüência particular exibe identidade com uma seqüência de composiçãode ligação pode ser realizada usando métodos conhecidos na arte.

Tipicamente, em uma tal comparação de seqüências, umaseqüência atua como uma seqüência referência, à qual seqüências de teste sãocomparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de seqüências,seqüências teste e referência são inseridas em um computador, coordenadassubseqüentes são designadas, se necessário, e parâmetros de programa dealgoritmo de seqüências são designados. O algoritmo de comparação deseqüências então calcula a identidade de seqüência percentual para uma(s)seqüência(s) teste em relação à seqüência referência, baseado nos parâmetrosde um programa designado.

Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode serconduzido, e.g., pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologiade Needlman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de busca desimilaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP,BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o aplicativocomputacional integrado de bioinformática LASERGENE, que é produzidopor DNASTAR (Madison, Wisconsin), pelos métodos de alinhamento demúltiplas seqüências desenvolvidos por Notredame, et al. (e.g., 3Dcoffee ouTcoffee em, e.g., Nucleic Acids Res. 2004:32(Web Server issue):W37-40;Nucleic Acids Res. 2003 Jul l;31(13):3503-6; ou Pharmacogenomics. 2002Jan;3(l):131-4)).ou por inspeção visual (veja geralmente, Ausubel, et al.supra). Outros métodos para comparar seqüências de nucleotídeos ou deaminoácidos determinando alinhamento ótimo são bem conhecidos (veja, e.g.,Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genumicand Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu, et al. (eds.),"Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids andProteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press,Inc. 1997); ou Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing. 2ndEdition (Academic Press, Inc. 1998)).

Um polipeptídeo exibindo ou tendo pelo menos cerca de, e.g.,95% de "identidade de seqüência" com outra seqüência de aminoácidos podeincluir, e.g., até cinco alterações de aminoácidos por cada trecho de 100aminoácidos da seqüência de aminoácidos teste. Em outras palavras, umaprimeira seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a umasegunda seqüência de aminoácidos, pode ter até 5% de seu número total deresíduos de aminoácidos diferentes da segunda seqüência, e.g., por inserção,deleção, ou substituição de um resíduo de aminoácido. Alterações emresíduos amino de uma seqüência de polipeptídeos podem ocorrer, e.g., nasposições amino ou carboxi terminais ou em qualquer lugar entre estasposições terminais, intercaladas ou individualmente entre resíduos naseqüência ou em uma ou mais seções, porções, ou fragmentos de resíduosamino contíguos dentro da seqüência. Como uma questão prática, se qualquerseqüência de polipeptídeos particular exibe pelo menos cerca de: 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de similaridade com outra seqüência,por exemplo, tal como mostrado em uma Tabela neste lugar pode serdeterminado usando métodos conhecidos na arte.

Variantes abrangidas pela invenção podem conter alteraçõesnas regiões codificantes, regiões não codificantes, ou ambas. Além disso,variantes nas quais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos são substituídos,deletados, ou adicionados em qualquer combinação também são preferidas.Variantes não naturalmente ocorrentes podem ser produzidas por técnicas demutagênese ou por síntese direta usando métodos conhecidos de engenhariade proteínas e tecnologia de DNA recombinante. Tais variantes podem sergeradas para melhorar ou alterar as características de um polipeptídeo decomposição de ligação (ou fragmento deste). Por exemplo, um ou maisaminoácidos podem ser deletados do término N ou término C de umpolipeptídeo secretado da invenção (ou fragmento deste) sem uma perdasubstancial de função biológica. Por exemplo, Ron5 et al. 1993 J. Biol. Chem.268:2984-8, relataram proteínas KGF variantes tendo atividade de ligação deheparina mesmo depois de deletar 3, 8, ou 27 resíduos de aminoácidos aminoterminais. Por exemplo, antigenicidade e/ou imunogenicidade pode ser retida(e.g., a capacidade de uma variante de deleção de induzir e/ou de se ligar aanticorpos que reconhecem uma forma madura de um polipeptídeo) quandomenos do que a maioria dos resíduos da forma secretada é removida dotérmino N ou término C. Se um polipeptídeo carecendo de resíduos N ou Cterminais de uma proteína retém tais atividade pode prontamente serdeterminado por métodos de rotina descritos neste lugar ou conhecidos naarte. Assim, a invenção também abrange, e.g., variantes de polipeptídeos quemostram atividade biológica tal como, e.g., imunogenicidade, ouantigenicidade. Tais variantes incluem, e.g., deleções, inserções, inversões,repetições, e substituições selecionadas de forma a ter pouco efeito ematividade usando regras gerais conhecidas na arte. Por exemplo, ensinamentospara fazer substituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosas sãofornecidos, e.g., por Bowie, et al. (1990) Science 247: 1306-1310.

Além de usar substituições de aminoácidos conservativas,outras variantes da invenção incluem, e.g., mas são restritas a, e.g., (i)substituições com um ou mais dos resíduos de aminoácidos não conservados,onde os resíduos de aminoácidos substituídos podem ou não ser umcodificado pelo código genético, ou (ii) substituição com um ou mais dosresíduos de aminoácidos tendo um grupo substituinte, ou (iii) fusão dopolipeptídeo maduro com outro composto, tal como um composto paraaumentar a estabilidade e/ou solubilidade do polipeptídeo (e.g.,polietilenoglicol), ou (iv) fusão do polipeptídeo com aminoácidos adicionais,tal como, e.g., um peptídeo de região de fusão IgG Fe, ou seqüência líder ousecretora, ou uma seqüência facilitando purificação. Todas as tais variantesestariam dentro do escopo daqueles versados na arte de biologia molecularbiology dados ensinamentos de Requerentes neste lugar, e.g., especificandoseqüências únicas de polinucleotídeos e polipeptídeos.

Por exemplo, variantes de polipeptídeo contendo substituiçõesde aminoácidos de aminoácidos carregados com outros aminoácidoscarregados ou neutros pode produzir polipeptídeos com característicasmelhoradas e.g., tal como menos agregação. Agregação de formulaçõesfarmacêuticas tanto reduz atividade como aumenta depuração devido àatividade imunogênica do agregado (Pinckard, et al. (1967) Clin. Exp.Immunol. 2:331-340; Robbins, et al. (1987) Diabetes 36:838-845; Cleland, etal. (1993) Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377). Em umaforma de realização preferida, uma composição de ligação da invençãoformulada em um sistema apropriado de pH/tampão (como descrito nestelugar ou conhecido na arte) não exibe agregação significante seguindoincubação por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 meses em condições detemperatura na variação de cerca de 1-10°C, mais preferivelmente 2-8°C,ainda mais preferivelmente 3-7°C, e ainda mais preferivelmente 5-6°C.

Uma forma de realização adicional da invenção abrange umacomposição que compreende uma seqüência de aminoácidos da invençãocontendo pelo menos uma substituição de aminoácido, mas não mais do que50 substituições de aminoácidos, ainda mais preferivelmente, não mais do que40 substituições de aminoácidos, ainda mais preferivelmente, não mais do quesubstituições de aminoácidos, e ainda mais ainda preferivelmente, nãomais do que 20 substituições de aminoácidos, não mais do que 15substituições de aminoácidos. Como se sabe, a fim de preferência semprecrescente, é altamente preferível para um peptídeo ou polipeptídeo ter umaseqüência de aminoácidos que compreende uma seqüência de aminoácidos dainvenção, que contém pelo menos: uma, mas não mais do que: 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, ou 1 substituições de aminoácidos. Em formas de realizaçãoespecíficas, o número de adições, substituições, e/ou deleções em umaseqüência de polipeptídeos da invenção ou fragmentos desta é pelo menos: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 10-50, ou 50-150; caracterizado pelo fato de que substituições deaminoácidos conservativas são mais preferíveis do que substituições nãoconservativas.

Usos Terapêuticos

Esta invenção também fornece reagentes com valor terapêuticoútil. Composições de ligação terapêuticas da invenção incluem, e.g., semlimitação, composições de ligação de anticorpo da invenção (incluindofragmentos, análogos e derivados destas como descrito neste lugar) emoléculas de ácidos nucleicos as codificando (incluindo fragmentos, análogose derivados destas e anticorpos anti-idiotípicos como descritos neste lugar).Um tal anticorpo pode ser usado para modular, tratar, inibir, melhorar, ouprevenir doenças, desordens, ou condições associadas com expressão e/ouatividade aberrante de TGF Beta 1 (ou fragmento deste), incluindo, e.g., semlimitação, qualquer uma ou mais das doenças, desordens, síndromes oucondições descritas neste lugar. O tratamento, melhora, e/ou prevenção dedoenças, desordens, ou condições associadas com expressão e/ou atividadeaberrante de TGF Beta 1 incluem, e.g., sem limitação, melhorar sintomasassociados com aquelas doenças, desordens, ou condições.

Por exemplo, uma doença ou desordem associada comexpressão anormal ou sinalização anormal por TGF Beta 1 é um alvo para umantagonista de TGF Beta 1 tal como uma composição de ligação da invenção.A invenção abrange terapias baseadas em composição de ligação queenvolvem administrar uma composição de ligação a um animal,preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um primata (e.g., umhumano), para modular, tratar, inibir, efetuar, ou melhorar uma ou mais dasdoenças descritas, desordens, ou condições descritas neste lugar. Porexemplo, embora não se atendo a teoria, anticorpos específicos para TGFBeta humano mostraram ser efetivos em modelos animais para o tratamentode doenças onde o receptor de TGF (TGFR) é superexpresso. Antisoro contraTGF Beta mostrou ser efetivo no tratamento de glomerulonefrite (Border, etal. 1990 Nature 346:371-4); e fibrose pulmonar (Girl, et al. 1993 Thorax48:959-66). Conseqüentemente, novas composições de ligação da invençãocom características melhoradas também seriam efetivas na melhora decondições, estados, ou doenças, tal como, e.g., doenças fibróticas e condiçõesassociadas com TGF Beta 1.

Composições de ligação recombinantes e/ou isoladas dainvenção, tal como, e.g., anticorpos, podem ser purificadas e administradas aum sujeito para tratamento. Estes reagentes podem ser combinados para usocom ingredientes ativos ou inertes adicionais, e.g., em carreadores oudiluentes aceitáveis farmaceuticamente convencionais, e.g., adjuvantesimunogênicos, junto com estabilizantes e excipientes fisiologicamenteinócuos. Estas combinações podem ser estéreis filtradas e colocadas emformas de dosagem como por liofilização em frascos de dosagem ouarmazenamento em preparações aquosas estabilizadas. Esta invenção tambémcontempla uso de anticorpos ou fragmentos de ligação destes, incluindoformas que não são de ligação complementar.

Outra abordagem terapêutica incluída dentro da invençãoenvolve administração direta de reagentes, formulações, ou composições porquaisquer técnicas convencionais de administração (tal como, e.g., sem limite,injeção local, inalação, ou administração sistêmica) a um sujeito. A invençãotambém fornece um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou maisrecipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições dainvenção e instruções tal como, e.g., para descarte (tipicamente, em umaforma prescrita por uma agência governamental regulando a fabricação, usoou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos). Métodos paraadministração incluem administração intravenosa, intraperitoneal, ouintramuscular, difusão transdérmica, e outros. Carreadores farmaceuticamenteaceitáveis irão incluir água, salina, tampões, e outros compostos descritos,e.g., no Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ.

Outras condições de desenvolvimento anormal abrangidasneste lugar são conhecidas em tipos celulares que mostram possuir mRNA deTGF Beta 1 por análise northern blot (veja, e.g., Berkow (ed.) The MerckManual and Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn et al.Harrison's Principies of Internai Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; e Rich (ed.)Clinicai Immunology; Principies and Practice, Mosby, St. Louis (cur. ed.); eabaixo). Anormalidades de desenvolvimento ou funcionais, (e.g., do sistemaneuronal, imune, ou hematopoiético) causam anormalidades médicassignificantes e condições que podem ser susceptíveis para prevenção outratamento usando composições fornecidas neste lugar.

Outra abordagem terapêutica incluída dentro da invençãoenvolve administração direta de reagentes, formulações, ou composições porquaisquer técnicas convencionais de administração (tal como, e.g., sem limite,injeção local, inalação, ou administração sistêmica) a um sujeito. Osreagentes, formulações, ou composições abrangidas podem ser direcionadospor qualquer método descrito neste lugar ou conhecido na arte. A dosagematual de reagente, formulação, ou composição que modula ma doença,desordem, condição, síndrome, etc., depende de muitos fatores, incluindo otamanho e saúde de um organismo, entretanto alguém de habitual verso naarte pode usar os seguintes ensinamentos descrevendo métodos e técnicaspara determinar dosagens clínicas (veja, e.g., Spilker (1984) Guide to ClinicaiStudies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, pp.7-13, 54-60; Spilker (1991) Guide to Clinicai Trials, Raven Press, Ltd., NewYork, pp. 93-101; Craig and Stitzel (eds. 1986) Modern Pharmacology, 2ded., Little, Brown e Co., Boston, pp. 127-33; Speight (ed. 1987) Avery's DrugTreatment: Principies and Practice of Clinicai Pharmacology andTherapeutics, 3d ed., Williams and Wilkins, Baltimore, pp. 50-56; Tallarida,et al. (1988) Principies in General Pharmacology, Springer-Verlag, NewYork, pp. 18-20; e Patente Norte-Americana Nos. 4.657.760; 5.206.344; ou5.225.212.). Geralmente, na variação de cerca de entre 0,5 fg/ml e 500ug/mlinclusive concentração final é administrada por dia a um adulto humano emqualquer carreador farmaceuticamente aceitável. Além disso, experimentosanimais fornecem orientação confiável para a determinação de dose efetivapara terapia humana. Escalonamento interespécies de doses efetivas pode serrealizado seguindo princípios conhecidos na arte (e.g., veja, Mordenti andChappell (1989) "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," inToxicokinetics and New Drug Development; Yacobi, et al. (eds.) PergamonPress, NY).

Doses efetivas também podem ser extrapoladas usando curvasdose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.Por exemplo, para anticorpos uma dosagem é tipicamente 0,1 mg/kg a 100mg/kg do peso corporal de um destinatário. Preferivelmente, uma dosagem éentre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal de um destinatário, maispreferivelmente 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corporal de um destinatário.Geralmente, anticorpos homo-específicos têm uma meia vida maior do queanticorpos hetero-específicos, (e.g., anticorpos humanos duram mais dentrode um hospedeiro humano do que anticorpos de outras espécies, e.g., tal comoum camundongo, provavelmente, devido à resposta imune do hospedeiro àcomposição exógena). Assim, dosagem inferior de anticorpos humanos eadministração menos freqüente são freqüentemente possíveis se os anticorpossão administrados a um sujeito humano. Além disso, a dosagem e freqüênciade administração de anticorpos da invenção podem ser reduzidas estimulandoabsorção e penetração em tecido (e.g., no cérebro) usando modificações talcomo, e.g., lipidação.

A invenção também fornece um pacote ou kit farmacêuticocompreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dosingredientes das composições da invenção e instruções tal como, e.g., paradescarte (tipicamente, em uma forma prescrita por uma agênciagovernamental regulando a fabricação, uso ou venda de produtosfarmacêuticos ou biológicos).

As quantidades de reagentes necessárias para tratamentoefetivo irão depender de muitos fatores diferentes, incluindo meios deadministração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, e outrosmedicamentos administrados. Assim, dosagens de tratamento devem sertituladas para otimizar segurança e eficácia. Tipicamente, dosagens usadas invitro podem fornecer orientação útil nas quantidades úteis para administraçãoin situ destes reagentes. Verificação animal de doses efetivas para tratamentode desordens particulares irá fornecer indicação preditiva adicional dedosagem humana. Várias considerações são descritas, e.g., em Gilman, et al.(eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases ofTherapeutics (8th ed.) Pergamon Press; e (1990) Remington1S PharmaceuticalSciences (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Métodos paraadministração são discutidos nesses e abaixo, e.g., para administração oral,intravenosa, intraperitoneal, ou intramuscular, difusão transdérmica, e outros.

Carreadores farmaceuticamente aceitáveis irão incluir água, salina, tampões, eoutros compostos descritos, e.g., no Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ.Variações de dosagem geralmente seriam esperadas serem em quantidadesmenores do que concentrações de 1 mM, tipicamente menos do que cerca deconcentrações de 10 μΜ, normalmente menos do que cerca de 100 nM,preferivelmente menos do que cerca de 10 pM (picomolar), e maispreferivelmente menos do que cerca de 1 fM (femtomolar), com um carreadorapropriado. Formulações de liberação lenta, ou um aparelho de liberação lentafreqüentemente serão utilizados para administração contínua.

Composições de ligação podem ser administradas diretamenteao hospedeiro a ser tratado ou, dependendo do tamanho dos compostos, podeser desejável conjugar estas a proteínas carreadoras tal como ovalbumina oualbumina no soro antes de sua administração. Formulações terapêuticaspodem ser administradas em qualquer formulação de dosagem convencional.Embora seja possível para o ingrediente ativo ser administrado sozinho, épreferível o apresentar como uma formulação farmacêutica. Formulaçõestipicamente compreendem pelo menos um ingrediente ativo, como definidoneste lugar, junto com um ou mais carreadores aceitáveis deste. Cadacarreador deve ser tanto farmaceuticamente como fisiologicamente aceitávelno sentido de ser compatível com os outros ingredientes e não prejudicial aopaciente. Formulações incluem aquelas adequadas para administração oral,retal, nasal, ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa eintradérmica). As formulações convenientemente podem ser apresentadas emforma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodosbem conhecidos na arte de farmácia. Veja, e.g., Gilman, et ai. (eds.) (1990)Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.)Pergamon Press; e (1990) Remington1S Pharmaceutical Sciences (17th ed.)Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al. (eds.) (1993) PharmaceuticalDosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; e Lieberman, etal. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker,NY. O tratamento desta invenção pode ser combinado com ou usado emassociação com outros agentes terapêuticos tal como, e.g., inibidores de ACE.A invenção também fornece uma composição farmacêutica.Uma tal composição compreende, e.g., uma quantidade terapeuticamenteefetiva de uma composição da invenção em um carreador farmaceuticamenteaceitável. Como usado neste lugar, o termo "carreador farmaceuticamenteaceitável" significa um carreador aprovado por uma agência reguladorafederal dos Estados Unidos da América, ou uma agênciareguladora/administrativa de um governo estadual dos Estados Unidos ou umcarreador que é listado na Farmacopéia Norte-Americana ou outrafarmacopoéia; que geralmente é reconhecida por aqueles na arte para uso emum animal, e.g., um mamífero, e, mais particularmente, em um primata, e.g.,um primata humano.

O termo "carreador" como usado neste lugar se refere a umdiluente, adjuvante, excipiente, ou veículo que é administrado com umacomposição da invenção. Um carreador farmacêutico tipicamente pode ser umlíquido estéril, tal como água ou óleos, (incluindo aqueles de origem depetróleo, animal, vegetal, ou sintética, e.g., tal como óleo de amendoim, óleode soja, óleo mineral, óleo de gergelim e os semelhantes). Tipicamente, águaestéril é um carreador preferido quando uma composição farmacêutica éadministrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções aquosas dedextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos,particularmente para soluções injetáveis.

Excipientes farmacêuticos adequados incluem, e.g., semlimite, amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, trigo, giz, gelde sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio,leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e ossemelhantes. Uma composição da invenção, se desejado, também pode conterpequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentestamponantes de pH.

Uma composição da invenção pode estar em uma solução,suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, pó, formulação de liberaçãosustentada, etc., ou ela pode ser formulada como um supositório (com ligantestradicionais, e/ou carreadores, e.g., tal como triglicerídeos). Exemplosadicionais de carreadoras farmacêuticos adequados são descritos na ediçãoatual de Remington1S Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Taisformulações irão conter uma quantidade terapeuticamente efetiva de umacomposição da invenção, preferivelmente em forma purificada, junto comuma quantidade adequada de carreador para sustentar administraçãoapropriada a um sujeito. Tradicionalmente, uma formulação irá se adaptar aomodo de administração.

Em uma forma de realização preferida, uma composição éformulada em conformidade com procedimentos de rotina como umacomposição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a, e.g., ahumano. Tipicamente, composições para administração intravenosa sãosoluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composiçãotambém pode incluir, e.g., um agente solubilizante e um anestésico local talcomo lidocaína para promover conforto no sítio de injeção. Geralmente,ingredientes são fornecidos ou separadamente ou misturados em forma dedosagem unitária, e.g., como um pó liofilizado seco ou concentrado livre deágua em um recipiente hermeticamente fechado (tal como uma ampola ousachê indicando a quantidade de agente ativo). Onde uma composição estápara ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada usando um frascode infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou salina. Onde umacomposição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril parainjeção ou salina pode ser fornecida de forma que os ingredientes possam sermisturados antes de administração.

Composições da invenção podem ser formuladas como formasneutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, e.g., semlimite, sais aniônicos (tal como aqueles derivados de ácidos hidroclórico,fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc.,) e sais catiônicos, (e.g., tal comoaqueles derivados de hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, férrico,isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc).

Doenças, Desordens, ou Condições Fibróticas

Uma composição de ligação, e.g., tal como um anticorpo, é útilno tratamento de condições associadas com doenças fibróticas. Acumulaçãode componentes da matriz extracelular (ECM) ou a substituição de materialcelular normal por componentes de ECM em uma ampla variedade de células,tecidos, e órgãos pode resultar em fibrose produtora de doença. Fibroseprogressiva pode ser fatal, levando a falência de órgão terminal em múltiplosórgãos, tal como, por exemplo o rim. Tanto dados pré-clínicos como clínicosindicam que TGFBeta 1 é um grande contribuidor para deposição de proteínade matriz em fibrose intersticial, e está envolvido no início e progressão dediversos estados associados de doença fibrótica, incluindo fibrose renal —que é comum a todas as formas de doença renal crônica (CRD). O grau defibrose renal se correlaciona positivamente com progressão para falência renalcrônica (CRF, também conhecida como insuficiência renal crônica terminal(ESRD)), o que pode resultar em diálise crônica ou transplante renal, e morte.TGF-Beta 1 é a citocina mais consistentemente ligada tantoexperimentalmente como por associação em estudos humanos e animais comtais processos fibróticos.

Os profundos efeitos de TGF-Beta 1 na ECM incluindo seupapel na estimulação da síntese e na inibição de degradação de componentesda matriz extracelular foram sujeitos a numerosas revisões (veja, e.g., Rocco& Ziyadeh 1991 in Contemporary Issues in Nephrology v.23, "Hormones,autocoids and the kidney" Ed. Jay Stein, Churchill Livingston, New Yorkpp.391-410; Roberts5 et al. 1988 Rec. Prog. Hormone Res. 44:157-97). TGF-Beta 1 pode induzir acumulação de ECM de maneiras múltiplas ecooperativas, por exemplo, TGF-Beta 1 estimula expressão de mRNA eprodução protéica de componentes chave da ECM incluindo colágeno tipo I,colágeno tipo IV, fibronectina, e laminina (Sharma & Ziyadeh 1997 SeminNephrol 17:80-92). Ao mesmo tempo, TGF-Beta 1 impede degradação deECM inibindo produção de proteases (tal como, e.g., ativador deplasminogênio, colagenase, elastase, e estromelisina) que digerem a matriz eativando inibidores daquelas proteases tal como, e.g., inibidores teciduais demetaloproteinases e inibidor de ativador de plasminogênio 1 (Sharma &Ziyadeh 1995 Kidney Int 51:S34-6). TGF-Beta 1 também aumenta integrinase receptores de superfície celular para ECM, estimulando com isso acapacidade de células para interagir com proteínas específicas da ECM(Heino, et al. 1989 J Biol Chem 264:380-8). Adicionalmente, TGF-Beta 1 temuma propriedade quimiotática potente para atrair células da ECM tal comofibroblastos e células fagocíticas (Reibman, et al. 1991 PNAS 88:6805-9).

Além disso, TGF-Beta 1 tem uma capacidade peculiar de induzir sua própriaexpressão amplificando potencialmente processos fibróticos aberrantes (Kim,et al. 1990 Mol Cell Biol 10:1492-7).

TGF-Beta 1 está implicado nas seguintes doenças, síndromes,e/ou condições:

•Doença renal — tal como, e.g., doença renal crônica (CRD);falência renal crônica (CRF); insuficiência renal crônica terminal (ESRD);glomerulonefrite (GN), incluindo, e.g., GN proliferativa mesangial, GNmesangiocapilar, GN membranosa, GN focai e segmentar, GN imune, e GNcrescente; glomerulosclerose; nefroesclerose, nefropatia membranosa,nefropatia de imunoglobulina A (IgA); renal fibrose intersticial; escleroseglomerular segmentar focai, fibrose renal em pacientes transplantadosrecebendo ciclosporina; rejeição crônica de transplante renal; nefropatiaassociada a HIV; hipertrofia de célula renal; tubulofibrose intersticialacompanhando doenças renais crônicas, incluindo aquelas resultando deobstrução de trato urinário ou nefropatia associada a analgésico ou seguindoum episódio de falência renal aguda, tal como falência renal aguda resultandode isquemia renal (Spurgeon et al. Am. J Physiol Renal Physiol 288:F568-F577, 2005); microangiopatia trombótica renal tal como associada com e.g.,injúria de célula endotelial glomerular ou outras injúrias de células endoteliaismicrovasculares, tal como associadas com pré-eclampsia, endotoxemia, eexposição à radiação; vasculite renal; glomerulonefrite necrotizante focai;nefropatia diabética [TGF Beta 1 está associado com CRF através de eventoscomplexos e diversos que impactam a maioria das células do rim (Bottinger,2002, J. Am. Soe. Nephrol. 13, 2600). Estes eventos no final das contasresultam tanto em tubulofibrose intersticial como glomerulosclerose levando aperda de função de néfron e no final das contas falência renal crônica. Dastrês isoformas de TGF-Beta, TGF-Beta 1 parece predominar na mediação daprogressão de doença renal crônica, não apenas como sendo a isoforma maispredominantemente expressa, mas também porque tanto TGF-Beta 2 comoBeta 3 parecem mediar seus efeitos através de aumento de expressão de TGF-Beta 1 (Yu, 2003 Kid. Int. 64:844). Tanto estudos in vitro como in vivoimplicam TGF-Beta 1 na patogênese de doença renal diabética incluindocomplicações associadas com diabete melito tipo 1 ou tipo 2 tal como, e.g.,glomerulosclerose e tubulofibrose intersticial (Ziyadeh 1998 Cur. Pract. Med.1:87-9). Antisoro contra TGF beta é efetivo no tratamento deglomerulonefrite (Border et al. 1990 Nature 346:371-4)]; doença fibróticarenal [TGF-Beta 1 media hipertrofia celular renal, outra característica denefropatia diabética interferindo na regulação normal do ciclo celularinduzindo inibidores de quinase dependentes de ciclina tal como p27Kipl ep21Cipl (Wolf & Ziyadeh 1999 Kidney Int 56:393-405). Estes inibidorestambém são aumentados por glicose alta e o estado diabético (Wolf, et al.2001 Am J Pathol;158:1091-1100; Wolf, et al. 1999 Diabetologia 42:1425-32; Wolf, et al. 1997 Am J Physiol 273:F348-56). Eles suprimem a atividadede quinases dependentes de ciclina, predominantemente quinase dependentede ciclina 2/ciclina E quinase (Liu & Preisig 1999 Am J Physiol 277:F186-94), assim inibindo a fosforilação de proteína de retinoblastoma eseqüestrando uma célula na fase Gl tardia. A célula entra em um período desíntese protéica sem replicação de DNA e passa por hipertrofia. Assim, TGF-Beta 1 causa mudanças no nível celular que se traduzem nas característicaspatofisiológicas de nefropatia diabética.]; nefropatia diabética experimental;nefroesclerose hipertensiva [Uma vez que a estrutura e propriedades defiltração do glomérulo são amplamente determinadas pela composição damatriz extracelular do mesângio e membrana glomerular, não é surpreendenteque TGF-Beta 1 tenha profundos efeitos no rim. TGF-Beta 1 media mudançaspatológicas de doença renal diabética (Ziyadeh 1998 Cur Prac Med 1:87-89).

A acumulação de matriz mesangial em glomerulonefrite proliferativa (Border,et al. 1990 Kidney Int. 37:689-695) e nefropatia diabética (Mauer, et al.(1984) J., Clin. Invest. 74:1143-1155) são características patológicas claras edominantes das doenças. Níveis de TGF-Beta 1 são elevados emglomerulosclerose diabética humana (neuropatia avançada) (Yamamoto, et al.1993 Proc. Natl. Acad. Sei. 90:1814-1818). Também foi encontrado queTGF-Beta 1 é um importante mediador na gênese de fibrose renal em diversosmodelos animais (Phan, et al. 1990 Kidney Int. 37:426; Okuda, et al. 1990 J.Clin. Invest. 86:453). Supressão de glomerulonefrite induzidaexperimentalmente em ratos foi demonstrada usando antisoro contra TGF-Beta (Border, et al. 1990 Nature 346:371) e por uma proteína da matrizextracelular, decorina, que pode se ligar a TGF-Beta 1 (Border, et al. 1992Nature 360:361-363; veja, também, e.g., Border & Noble 1994 N. Engl. J.Med. 331:1286-92; Border, et al. 1989 Semin. Nephrol. 9:307-17; Han, et al.2000 Am J Physiol Renal Physiol 278:F628-34; e Ziyadeh, et al. 2000 PNAS97:8015-20)]. Conseqüentemente, uma composição de ligação da invençãoseria útil para o tratamento, melhora, modulação, diagnose, e/ou inibição deuma doença, desordem, síndrome, e/ou condição como descrito acima.• Doença Hepática — tal como, e.g., cirrose; fibrose hepática;[Fibrose hepática é uma resposta comum à necrose ou lesão hepatocelular,que pode ser induzida por uma ampla variedade de agentes, e.g., qualquerprocesso perturbando homeostase hepática (especialmente inflamação, lesãotóxica, ou fluxo sangüíneo hepático alterado) e infecções do fígado (virais,bacterianas, fungicas, e parasíticas)]. Numerosas desordens de acumulaçãoresultando de erros congênitos de metabolismo são freqüentemente associadoscom fibrose, incluindo anormalidades lipídicas (doença de Gaucher); doençasde acumulação de glicogênio (especialmente tipos III, IV, VI, IX, e X);deficiência de 1-antitripsina; acumulação de substâncias exógenas, como vistoem síndromes da sobrecarga de ferro (hemocromatose) e doenças deacumulação de cobre (doença de Wilson); acumulação de metabólitos tóxicos(como em tirosinemia, fructosemia, e galactosemia); e desordensperoxissomais (síndrome de Zellweger). Numerosos produtos químicos edrogas causam fibrose, especialmente álcool, metotrexato, isoniazida,oxifenisatina, metildopa, clorpromazina, tolbutamida, e amiodarona.

Perturbações de circulação hepática (e.g., falência cardíaca crônica, síndromede Budd-Chiari, doença veno-oclusiva, trombose da veia porta) e obstruçãocrônica para fluxo biliar podem levar a fibrose. Finalmente, fibrose hepáticacongênita é uma má-formação recessiva autossômica.

A maioria das pessoas ao redor do mundo tem hepatite viralcrônica, ou esteatohepatite associada ou com álcool ou obesidade, mas outrosinsultos indutores de fibrose incluem, por exemplo, doença parasítica (e.g.,esquistossomíase), ataque autoimune em hepatócitos ou epitélio biliar, doençahepática neonatal, desordens metabólicas incluindo hemocromatose deWilson e uma variedade de doenças de acumulação, condições inflamatóriascrônicas (e.g. sarcoidose), toxicidade de droga (e.g. metotrexato ouhipervitaminose A), e transtornos vasculares, ou congênitos ou adquiridos.

Células hepáticas estrelares (HSC) são uma importante fontecelular de ECM em fibrose hepática (Li & Friedman 1999 J. Gastroenterol.Hepatol. 14:618-33). HSC reside no espaço perisinusoidal de Disse, quesepara hepatócitos do endotélio sinusoidal. Insultos hepáticos, como descrito,ativam HSC normalmente quiescentes levando a sua subseqüente proliferaçãoe ativação. HSC ativadas passam por uma subseqüente transdiferenciaçãofenotípica para miofibroblastos contráteis (MFB), que expressam actina demúsculo liso e um excesso de moléculas de ECM vistos em fibrose hepática.A transdiferenciação de HSC em MFB é devido à expressão de TGF-βΙ emseu papel como um regulador chave da resposta fibrótica do fígado a estressee lesão. (Gressner, et al. 2002 Front Biosci. 7:d793-807). TGF-βΙ é o indutormais forte conhecido de fibrogênese nas células efetoras de fibrose hepática(Schuppan, et al. 2003 Cell Death Differ. 10 Supl 1:55967). Por conseguinte,níveis em tecido e soro de TGF-βΙ ativo são elevados em fibrose hepática esuperexpressão de TGF-βΙ em camundongos transgênicos e aplicação deTGF-βΙ exógeno mostraram induzir fibrose do órgão (Kanzler, et al. 1999Am. 3. Physiol. 276:G1059-68; Sanderson, et al. 1995 PNAS 2572-76).Ademais, fibrose experimental pode ser inibida por tratamentos anti-TGF-βΙ,e.g. com anticorpos neutralizantes ou receptores solúveis de TGF (George, etal. 1999 PNAS 12719-24; Qi, et al. 1999 PNAS 2345-49). A expressão deTGF-βΙ observada de HSC/MFB ativadas, a potência de TGF-βΙ paraaumentar expressão de ECM, e a expressão de receptores TGF em HSClevaram a um modelo amplamente aceito no qual a estimulaçãoautócrina/parácrina persistente de HSC/MFB ativadas por TGF-βΙ é aresposta fibrinogênica chave em promoção de fibrose do órgão.

Conseqüentemente, a redução em TGF-βΙ é prevista reduzirfibrogênese hepática (Wu & Zera 2000 J. Gastroenterol. 35:665-72)];

• Doença pulmonar — tal como, e.g.: fibrose pulmonar (Gin etal. Thorax 48, 959966, 1993); fibrose pulmonar idiopática; síndrome dedesconforto respiratório adulto; pneumonia em organização criptogênica,bronquiolite obliterante (BO), bronquiolite obliterante (associada atransplante); doença pulmonar induzida por droga; doença pulmonar induzidapor radiação; fibrose localizada ao redor das vias aéreas em asma e enfisema;pneumonite de hipersensibilidade; pneumonia em organização criptogênica(COP); doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); pneumonite intersticialaguda (AR); asbestose; fibrose pulmonar intersticial associada com desordensauto-imunes, tal como lúpus eritematoso sistêmico e escleroderma, contatoquímico, ou alergias; asma; doença pulmonar crônica de recém-nascido(CLD) [Expressão desregulada de TGF-βΙ desempenha um importante papelem patogênese de desenvolvimento aberrante de via aérea em diversas dasdoenças pulmonares crônicas incluindo asma, fibrose pulmonar, e doençapulmonar crônica de recém-nascido (CLD) (Holgate, et al. 2001 Int ArchAllergy Immunol 124 1-3:253-8; Khalil, et al. 2001 Thorax 56 12:907-15;Lecart, et al. 2000 Biol Neonate 77 4:217-23; Pulleyn, et al., 2001 Hum Genet109 6:623-7; Sagara, et al. 2002 3 Allergy Clin Immunol 110 2:249-54;Sheppard, 2001 Chest 120 1 Suppl:49S53S; Strieter, 2001 Chest 120 1Supp:77S-85S; Toti, et al. 1997 PediatrPulmonol 24 1:22-8). Superexpressãode TGF-β 1 ativo junto a superfícies alveolares de camundongos leva a umaresposta fibrótica vigorosa, e inibição de TGF-β 1 por anticorpos ouarmadilhas anula fibrose induzida por bleomicina (Kelly, et al. 2003 Cur.Pharm. Des. 9:3949). Além disso, análise de microarranjo de mRNA total depulmão mostra que a maioria dos genes induzíveis por TGF-β 1 é aumentadodurante fibrose induzida experimentalmente (Kaminski, et al. 2000 PNAS97:1778-83)];

Doença cardiovascular— arteriosclerose; [TGF-β estáassociado com arteriosclerose (veja, e.g., T.A. McCaffrey: 2000 "TGF^s eTGF-β Receptors in Atherosclerosis" Cytokine and Growth Factor Reviews11:103-114)]; crescimento hipertrófico cardíaco (Schultz, et al. 2002 J ClinInvest. 109 (6): 787-96; Brand & Schneider 1995 J. Mol. Cell Cardiol.27:518); esclerose sistêmica progressiva [comparando ao aumento em níveisde TGF-βΙ na vasculatura envelhecida são aumentos marcados em níveis defibronectina (Li et al. 1999). Estas mudanças sem dúvida contribuem para atroca de um vaso elástico para um fibrótico/rígido]; fibrose micro vascularinduzida mecanicamente; sarcoidose; fibrose ventricular; doença cardíacaisquêmica induzida por radiação [um risco significantemente maior de mortedevido a doença cardíaca isquêmica foi relatado para pacientes tratados comradiação para doença de Hodgkin e câncer de mama. Certas citocinas e fatoresde crescimento, tal como TGF-βΙ, podem estimular proliferação endotelialinduzida por radiação, proliferação de fibroblasto, deposição de colágeno, efibrose levando a lesões avançadas de arteriosclerose]; lesão arterial (Wolf, etal. 1994 J. Clin. Invest. 93, 1172-8); insuficiência venosa crônica (CVI); lesãorestenótica depois de angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA)ou utilização de endoprótese auto-expansível; síndrome de Hermansky-Pudlak; polimiosite; escleroderma; dermatomiosite; fasciite eosinofílica;morféia, ou aquelas associadas com a ocorrência de síndrome de Raynaud;fibrose perivascular de vasculatura coronária intramural de miocárdio nãoinfartado; hiperplasias induzidas por lesão tal como, e.g., reestenose; fibrosearteriosclerótica com doença vascular de colágeno [TGF-βΙ pode ser um fatorno espessamento progressivo da parede arterial que resulta da proliferação decélulas de músculo liso e deposição de matriz extracelular na artéria depois deangioplastia com balão. O diâmetro da artéria com reestenose pode serreduzido 90% por este espessamento, e uma vez que a maioria da redução emdiâmetro è devido a matriz extracelular ao invés de corpos celulares demúsculo liso, pode ser possível abrir estes vasos em 50% simplesmentereduzindo deposição extensiva da matriz extracelular. Em artérias suínas nãolesionadas transfectadas in vivo com um gene TGF-βΙ, expressão gênicaTGF-βΙ foi associada tanto com síntese de matriz extracelular comohiperplasia (Nabel, et al. 1993 PNAS 90:1075963)]; histiocitose X(granuloma eosinofílico);

• Fibroses de Tecido Mole — (Border & Ruoslahti 1992 JClin Inv 90:1-7; Border & Noble 1994 N Engl J Med 331:1286-91); disfunçãoerétil (Moreland, R. 1998 Int J Impot Res 10:113-20); artrite reumatóide(Wahl, et al 1993 J. Exp. Medicine 177, 225-30);

• Cicatrização de Ferida — cicatrização dérmica; lesão porqueimadura; cicatrização hipertrófica; formação de quelóide; cicatrizaçãoconjunctival (Cordeiro MF5 2003 Clin Sci (Loud). 104(2): 181-7) [Tratamentode feridas fetais com diferentes concentrações de TGF-βΙ causou cicatrizaçãomarcada destas feridas, mostrando um envolvimento direto de TGF-βΙ emcicatrização cutânea (Sullivan, et al. 1995 J Pediatr Surg 30:198-203).

Neutralizar anticorpos de TGF-βΙ injetados nas margens de feridas emcicatrização em ratos mostrou inibir cicatrização sem interferir na taxa decicatrização de ferida ou na força tênsil da ferida.

Ao mesmo tempo, houve angiogênese reduzida, reduzidonúmero de macrófagos e monócitos na ferida, e uma quantidade reduzida dedeposição desorganizada de fibras de colágeno no tecido de cicatriz (Shah, etal. 1992 Lancet 339:213-4; Shah et al. 1994 J. Cell Science 107:1137-57;Shah et al. 1995 J Cell Sei. 108:985-1002). Resposta reduzida de cicatrizaçãoocorre em feridas de camundongo tratadas topicamente com TGF-βΙantisentido (Choi, et al. 1996 Immunol Cell Biol 74:144-50). Aplicação tópicade um antagonista de TGF-βΙ sintético reduziu cicatrização em nádegasporcinas e feridas excisionais assim como em excisões de pele de coelho(Huang, et al. 2002 FASEB J 16:1269-70; Werner & Grose 2003 Physiol Rev83(3): 83570)];

• Doença inflamatória — doença intestinal inflamatória (IBD)tal como, e.g., mal de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC) [inflamaçãointestinal é dependente do equilíbrio entre citocinas inflamatórias,especialmente IFN-γ, e atividade de TGF-βΙ (Strober, et al. 1997 Immunol.Today 18:61-4; Neurath, et al. 1996 J. Exp. Med. 183, 2605-16; Ludviksson,et al. 1997 J. Immunol. 159; Boirivant, et al. 1998 J. Exp. Med. 188, 1929-39;Powrie, et al. 1996 J. Exp. Med. 183, 2669-74). Lesão tecidual mediadaimunologicamente no intestino está associado com produção aumentada decitocinas pró-inflamatórias, que ativam o fator de transcrição NF kappa-B emuma variedade de tipos celulares diferentes.]; artrite reumatóide (RA);hiperplasia sinovial [TGF-βΙ é elevado em fluido sinovial de artritereumatóide humana (Lotz, et al. 1990 J. Immunol. 144:4189-94). TGF-βΙexcessivo forma proliferações ósseas nas margens osteoarticulares chamadososteófitos (van Beuningen, et al. 1994 Lab. Invest. 71:279-90), hiperplasiasinovial, e inflamação em RA (Hamilton, et al. 1991 PNAS 88:7180-4).Inibição de TGF-βΙ endógeno em um modelo murino de artrite resulta emprevenção de formação de osteófíto e prejudica reparo de cartilagem,sugerindo seu papel nestes eventos patológicos (Scharstuhl, et al. 2002Immunol. 169:507-14)];

• Doenças Proliferativas Celulares — Numerosos dadosdemonstram que TGF-βΙ não apenas tem potencial transformador, mastambém pode dirigir progressão maligna, invasão, e metástase tanto in vitrocomo in vivo (Derynck, et al. 2001 Nat. Genet 29:117-29; Cui, et al. 1996Cell 86:531-42). Exemplos de estados, doenças, desordens, síndromes, e/oucondições hiperproliferativas incluem, e.g., sem limitação, um neoplasma docólon, abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio,sistema endócrino (e.g., uma glândula adrenal, uma glândula paratireóide, apituitária, os testículos, o ovário, o timo, ou a tireóide), olho, cabeça, pescoço,sistema nervoso (central ou periférico), o sistema linfático, pélvis, pele, baço,tórax, e sistema urogenital. Similarmente, outras condições hiperproliferativasincluem, e.g., sem limite hipergamaglobulinemia, condiçõeshiperproliferativas, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, Hamartoma,Síndrome de Sezary, Macroglobulinemia de Waldenstron, síndrome dedoença de Gaucher, histiocitose, e outros estados hiperproliferativos.

Apesar da atividade supressora de tumor de TGF-βΙ, célulastumorosas freqüentemente mostram produção aumentada deste fator decrescimento (Derynck, et al. 1987 Câncer Res. 47:707-12; Dickson, et al.1987 PNAS 84:837-41), e evidência considerável documenta seu papelpromotor de tumor através de seus efeitos em invasão de célula tumorosa emudanças no microambiente de tumor. Agora está claro que TGF-βΙ podeatuar tanto como um supressor de tumor quanto como um estimuladorsignificante de progressão, invasão, e metástase de tumor. Em estágiosprecoces de tumorigênese, tal como quando o tumor ainda é benigno, TGF-βatua diretamente na célula cancerosa para suprimir crescimento de tumor. Amedida que o tumor progride, entretanto, mudanças genéticas e/oubioquímicas permitem que TGF-β 1 estimule progressão de tumor por suasatividades pleiotrópicas tanto na célula cancerosa por si como em tipos decélulas estromais não malignas do tumor. A estimulação de invasão emetástase por TGF-β 1 por ter conseqüência clínica maior do que seu papelsupressor de tumor, como a maioria de tumores humanos retém uma via desinalização de TGF-β funcional (Akhurst & Derynck 2001 Trends Cell Biol.11:S44-51).

Existe um corpo substancial de evidência que produção emexcesso de TGF-β 1 em doenças proliferativas celulares está associada comfraca prognose (Tsushima et al. 1996 Gastroenterology 110:375-82; Adler etal. 1999 J. Urol. 161:182-7). Existem diversos tipos de câncer onde TGF-β 1produzidos pelo tumor pode ser deletério. Células cancerosas de próstata derato MATLyLu (Steiner & Barrack 1992 Mol. Endocrinol 6:15-25) e célulascancerosas de mama humana MCF-7 (Arteaga, et al. 1993 Cell Growth andDiffer. 4:193-201) se tornaram mais tumorigênicas e metastáticas depois detransfecção com um vetor expressando TGF-β 1 de camundongo. TGF-β 1 estáassociado com angiogênese, metástase, e fraca prognose em câncer humanode próstata e gástrico avançado (Wikstrom, P., et al. (1998) Próstata 37:19-29;Saito, H. et al. (1999) Câncer 86: 1455-62). Em câncer de mama, fracaprognose está associada com TGF-βΙ elevado (Dickson, et al. 1987 PNAS84:837-41; Kasid, et al. 1987; Câncer Res. 47:5733-8; Daly, et al. 1990 J. CellBiochem. 43:199-211; Barrett-Lee, et al. 1990 Br. J Câncer 61:612-7; King, etal. 1989 J. Steroid Biochem. 34:133-8; Welch, et al. 1990 PNAS 87:7678-82;Walker, et al. 1992 Eur. J. Câncer 238:641-4) e indução de TGF-β 1 portratamento com tamoxifeno (Butta, et al. 1992 Câncer Res. 52:4261-4) estáassociada com fracasso de tratamento com tamoxifeno para câncer de mama(Thompson, et al. 1991 Br. J. Câncer 63:609-14). Anticorpos anti-TGF-βΙinibem o crescimento de células de câncer de mama humano MDA-231 emcamundongos atímicos (Arteaga, et al. 1993 J. Clin. Invest. 92:256976), umtratamento que é correlacionado com um aumento em atividade de célulaassassina natural de baço. Células CHO transfectadas com TGF-βΙ latentetambém mostram atividade de NK diminuída e crescimento de tumoraumentado em camundongos nus (Wallick, et al. 1990 J. Exp. Med.172:1777-84). Assim, TGF-βΙ secretado por tumores de mama podem causaruma supressão imune endócrina. Altas concentrações plasmáticas de TGF-βΙindicam fraca prognose para pacientes com câncer de mama avançado(Anscher, et al. 1993 N. Engl. J. Med. 328:1592-8). Pacientes com alto GF-βΙcirculante antes de quimioterapia de dose alta e transplante autólogo demedula óssea estão em alto risco de doença veno-oclusiva hepática (15-50%de todos os pacientes com uma taxa de mortalidade de até 50%) e pneumoniteintersticial idiopática (40-60% de todos os pacientes). As implicações destesresultados são que níveis plasmáticos elevados de TGF-βΙ podem identificarpacientes em risco e que redução de TGF-βΙ pode diminuir morbidez emortalidade destes tratamentos em pacientes com câncer de mama.

Muitas células malignas secretam TGF-β 1 sugerindo queprodução de TGF-βΙ pode fornecer um mecanismo de escape de célulastumorosas de imunovigilância de hospedeiro. Estabelecimento de umasubpopulação de leucócitos com sinalização de TGF-βΙ interrompida nohospedeiro produzindo tumor oferece um meio potencial para imunoterapiade câncer. Um modelo de animal transgênico com sinalização de TGF-βΙinterrompida em células T é capaz de erradicar um TGF-β 1 normalmente letalsuperexpressando tumor de linfoma, EL4 (Gorelik & Flavell, 2001 NatureMedicine 7(10): 1118-22). Diminuição de secreção de TGF-β 1 em célulastumorosas resulta em restauração de imunogenicidade no hospedeiro,enquanto que insensibilidade de célula T para TGF-β 1 resulta em aceleradadiferenciação e autoimunidade, elementos dos quais podem ser requeridospara combater tumores expressando auto-antígeno em um hospedeirotolerizado. Os efeitos imunossupressores de TGF-β 1 também foramimplicados em uma subpopulação de pacientes com HTV com resposta imunemenor do que previsto baseado em suas contagens de célula T CD4/CD8(Garba, et al. 2002 J. Immunology 168:2247-54). Um anticorpo neutralizantede TGF-β 1 foi capaz de reverter o efeito em cultura, indicando que outrosinibidores de anticorpo de TGF-β 1 podem ter utilidade para reverter asupressão imune presente neste subconjunto de pacientes com HIV.

Os papéis duais de supressão de tumor/promoção de tumor deTGF-β 1 estão claramente elucidados em um sistema transgênicosuperexpressando TGF-β 1 em queratinócitos. Embora os transgênicos tenhamsido mais resistentes à formação de lesões dérmicas benignas, a taxa deconversão metastática nos transgênicos foi dramaticamente aumentada (Cui,et al 1996 Cell 86(4): 53142). A produção de TGF-β 1 por células malignasem tumores primários aumenta com estágios avançados de progressão detumor. Estudos em muitos dos principais cânceres epiteliais sugerem que aprodução aumentada de TGF-β 1 por cânceres humanos ocorre como umevento relativamente tardio durante progressão de tumor. Ademais, TGF-β 1associado a tumor fornece células tumorosas com uma vantagem seletiva epromove progressão de tumor. Os efeitos de TGF-βΙ em interaçõescélula/célula e célula/estroma resultam em uma maior propensão para invasãoe metástase. TGF-βΙ associado a tumor pode permitir que células tumorosasescapem de vigilância imune uma vez que ele é um inibidor potente daexpansão clonal de linfócitos ativados, como visto por exemplo, em pacientescom tumores agressivos de cérebro ou mama (Arteaga, et al. 1993 J. Clin.Invest. 92:2569-76). TGF-βΙ inibe a produção de angiostatina. Modalidadesterapêuticas para câncer tal como radioterapia e quimioterapia induzemprodução de TGF-βΙ ativado no tumor, selecionando com isso para ocrescimento de células malignas resistentes a efeitos inibidores decrescimento de TGF-βΙ. Assim, estes tratamentos anticâncer aumentam orisco e apressar o desenvolvimento de malignidade de tumor. Transdução desinal mediada por agentes prevenindo TGF-βΙ pode ser uma estratégiaterapêutica muito efetiva em tais situações. Resistência de células tumorosas aTGF-βΙ neutraliza muitos dos efeitos citotóxicos de radioterapia equimioterapia e a ativação dependente de tratamento de TGF-βΙ no estromapode ainda ser prejudicial pois ela pode tornar o microambiente maisconducente para progressão de tumor e contribui para lesão tecidual levando afibrose. Células de câncer de próstata expressam altos níveis de TGF-βΙ, oque parece estimular crescimento e metástase de câncer de próstataestimulando angiogênese e inibindo respostas imunes dirigidas contra célulastumorosas. Células de câncer de próstata freqüentemente perdem seusreceptores de TGF-beta e adquirem resistência aos efeitos antiproliferativos epró-apoptóticos de TGF-βΙ. Por conseguinte, alta expressão de TGF-βΙ eperda de expressão de receptor de TGFbeta foram associadas com umaprognose particularmente ruim em pacientes humanos com câncer de próstata(Wikstrom, et al. 2000 Scand J Urol Nephrol. 34(2): 85-94). Em carcinomahepatocelular (HCC), a indução de expressão de TGF-βΙ com perdaconcomitante de expressão de receptor de TGF-βΙ em focos e nódulos defígado faz com que hepatócitos alterados escapem de apoptose induzida porTGF-βΙ, favorecendo com isso os hepatócitos alterados com vantagem decrescimento durante hepatocarcinogênese (Urn 2003 Mech Ageing Dev.124(5): 697-708). Em carcinomas de célula esquamosa de cabeça e pescoço,superexpressão de TGF-βΙ em estágios precoces fornece um microambientepromotor de tumor (Lu, et al. 2004 Câncer Res 64(13): 4405-10); umacomposição de ligação pode ser usada para modular, melhorar, tratar,prevenir, e/ou diagnosticar uma doença, condição, desordem, ou síndromehiperproliferativa (tal como, e.g., um neoplasma) através de interações diretasou indiretas. Por exemplo, tal como prevenindo a inibição da proliferação decélulas que, uma por uma, modulam um estado hiperproliferativo (e.g., TGFBeta 1 inibe a proliferação e diferenciação funcional de linfócitos T, célulasassassinas ativadas por linfocinas, células NK, neutrófilos, macrófagos, ecélulas B (Letterio & Roberts 1998 "Regulation of the immune response byTGF Beta" Ann Rev Immunol 16:137-61)); ou aumentando uma respostaimune (e.g., aumentando a antigenicidade de uma proteína envolvida em umacondição hiperproliferativa); ou causando a proliferação, diferenciação, oumobilização de um tipo celular específico (e.g., uma célula T). Um efeitodesejado usando uma composição da invenção também pode ser logrado ou,e.g., estimulando uma resposta imune existente, ou iniciando uma novaresposta imune. Alternativamente, o resultado desejado pode ser afetado ou,e.g., diminuindo ou bloqueando uma resposta imune existente, ou prevenindoa iniciação de uma nova resposta imune. Administração local a uma célulaproliferando anormalmente pode ser atingida por qualquer método conhecidona arte ou técnica discutida neste lugar incluindo, e.g., sem limite paratransfecção, eletroporação, microinjeção de células, ou em veículos (tal comoum lipossomo, lipofectina, ou um polinucleotídeo purificado). Por "condiçãoproliferativa celular" é pretendida qualquer doença, síndrome, desordem,condição, ou estado, humana ou animal, afetando qualquer célula, tecido,qualquer sítio ou qualquer combinação de órgãos, tecidos, ou partes corporais,que é caracterizada por uma proliferação anormal em local único ou múltiplode células, grupos de células, ou tecidos, que benignas ou malignas.];

• Doença Neuronal— cicatrização neural (Logan et al. 1994Eur. J. Neurosci. 6:355-63); anormalidades cerebrovasculares; mal deAlzheimer (Masliah, et al. 2001 Neurochemistry International 39:393-400)[Níveis de mRNA de TGF-βΙ no giro médio-frontal se correlacionampositivamente com o grau relativo de deposição amilóide cerebrovascularnaquela região do cérebro, sugerindo um possível papel para TGF-βΙ emanormalidades cerebrovasculares humanas. Camundongos transgênicossuperexpressando TGF-βΙ em astrócitos desenvolvem anormalidadescerebrovasculares tipo mal de Alzheimer (AD), incluindo astrocitoseperivascular, espessamento de membrana basal microvascular, e acumulaçãode amilóide positivo para tioflavina S na ausência de degeneração deparênquima. Superprodução crônica de TGF-βΙ no cérebro resulta emdefeitos estruturais e funcionais recordatórios daqueles em casos de AD comangiopatia amilóide (Buckwalter, et al. 2002 Ann N Y Acad Sei. 977:87-95];retinopatia proliferativa (Chaturvedi, et al. 2002 Diabete Care 25:2320-7));outras doenças oculares associadas com uma condição fibroproliferativaassociada com superprodução de TGF-βΙ incluem cirurgia de resolução dodesacoplamento retiniano acompanhando vitreoretinopatia proliferativa;extração de catarata com implantação de lentes intraoculares; e pós cirurgiade drenagem de glaucoma;

• Estados/Condições Hemopoiéticas — [O equilíbrionaturalmente ocorrente entre estimuladores endógenos e inibidores deangiogênese é um no qual influências inibidoras tipicamente predominam(veja, e.g., Rastinejad, et al., Cell 56345-355 (1989)). Quandoneovascularização ocorre em condições fisiológicas normais, tal comocicatrização de ferida, regeneração de órgão, desenvolvimento embriônico, eprocessos reprodutivos femininos, angiogênese é estringentemente regulada, edelimitada espacialmente e temporalmente. Em angiogênese patológica talcomo, e.g., durante formação de tumor sólido, estes controles reguladoresdeixam de funcionar e angiogênese desregulada pode se tornar patológicasustentando progressão de muitas doenças neoplásicas e não neoplásicas.Diversas doenças sérias são dominadas por neovascularização anormal(incluindo, e.g., crescimento e metástase de tumor sólido, artrite, alguns tiposde condições oculares, e psoríase; veja, e.g., revisões por Moses, et al., 1991Biotech. 9630-634; Folkman, et al., 1995 N. Engl. J. Med., 333:1757-63;Auerbach, et al., 1985 J. Microvasc. Res. 29:401-11; Folkman, "Advances inCâncer Research," Eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York,pp. 175203 (1985); Patz, 1982 Am. J. Opthalmol. 94:715-43; e Folkman, etal., 1983 Science 221:719-25). Angiogênese de tumor é crucial paracrescimento e invasão de tumor, pois vasos sangüíneos fornecem nutrientes eoxigênio para as células tumorosas e permitem que elas penetrem o sistemasangüíneo, o que leva a metástase. TGF-Beta 1 atua como um indutor potentede angiogênese em diversos ensaios (Roberts, et al. 1986 PNAS 83:4167-71;Madri, et al. 1988 J. Cell Biol. 106:1375-84; Yang & Moses 1990 J. CellBiol. 111:731-74; Gajdusek, et al. 1993 J. Cell. Physiol. 157:133-44; Choi &Ballermann 1995 J. Biol. Chem. 270:2114450), e modelos de camundongodefectivos em componentes de sinalização de TGF indicam a importância deTGF-I em desenvolvimento vascular normal. Além disso, TGF beta 1 e seusreceptores ALK5 e ALK-1, estão implicados na fase de maturação vascular deangiogênese (veja, e.g., Bull Acad Natl Med. 2000; 184 (3):537-44). Emdiversas condições patológicas, angiogênese contribui para um estado dedoença, e.g., por exemplo, dados significantes foram acumulados sugerindoque formação de tumor sólido é dependente de angiogênese (veja, e.g.,Folkman Klagsbrun 1987 Science 235:442-7). Em outra forma de realizaçãoda invenção, administração de uma composição de ligação sustenta otratamento, melhora, modulação, diagnose, e/ou inibição de uma doença,desordem, síndrome, e/ou condição associada com neovascularização ouexpansão de célula hematopoiética. Condições malignas e metastáticas quepodem ser efetuadas de uma maneira desejada usando uma composição deligação incluem, e.g., sem limitação, uma malignidade, tumor, e um câncercomo descritos neste lugar ou como de outra maneira conhecidos na arte (parauma revisão de tais desordens, síndromes, etc. veja, e.g., Fishman, et al.,Medicine, Current Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia 2002). Por exemplo,cânceres que podem ser assim afetados usando uma composição da invençãoincluem, e.g., sem limite um tumor sólido, incluindo e.g., câncer de próstata,pulmão, mama, ovariano, estômago, pâncreas, laringe, esôfago, testículos,fígado, parótida, trato biliar, cólon, reto, cérvice, útero, endométrio, rim,bexiga, tireóide; tumores primários e metástases; melanomas; glioblastoma;sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; câncer de pulmão de célula nãopequena; câncer colorretal; malignidades avançadas; e tumores de origemsangüínea tal como e.g., leucemia;

• Infecçôes — sepse; [o curso de infecção por Leishmaniaem camundongos é drasticamente alterado por TGF-βΙ. Camundongosgeneticamente resistentes se tornam susceptíveis a infecção por Leishmaniacom administração de TGF-βΙ. TGF-βΙ exacerbou a doença, ao passo queanticorpos TGF-βΙ pararam a progressão de doença (Barral-Netto, et al. 1992Science 257:545-7)];.

• Perda de cabelo — alopécia; perda de cabelo [umanticorpo neutralizante anti-TGF-βΙ reverteu a inibição de crescimentoproduzida por andrógeno de queratinócitos de uma maneira dose-dependentesugerindo que TGF-βΙ induzível por andrógeno derivado de células depapilas dérmicas de queda de cabelo mediam supressão de crescimentocapilar em alopécia androgenética e assim podem desempenhar um papel emcalvície humana padrão (Inui, et al. 2002 FASEB J. 16(14): 1967-9)]; assim, ainvenção fornece um método de melhorar, modular, tratar, prevenir, e/oudiagnosticar uma doença e/ou desordem relacionada a angiogênese,compreendendo administrar a um sujeito com necessidade deste umaquantidade beneficamente efetiva de uma composição de ligação.

O amplo escopo desta invenção é melhor compreendido comreferência aos seguintes exemplos, que não são pretendidos para limitar ainvenção a formas de realização específicas.

EXEMPLOS

Métodos Gerais

Muitos dos métodos padrão descritos neste lugar são descritosou referenciados, e.g., em Sambrook, et ai. (2001) Molecular Cloning, ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborPress, NY; e seu associado sítio na rede mundial de computadores:(www.MolecularCloning.com); Ausubel, et al., Biology Greene PublishingAssociates, Brooklyn, NY; ou Ausubel, et al. (1987 e Supplements) CurrentProtocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Bartlett & Stirling (2003)PCR Protocols: Methods in Molecular Biology Vol. 226 Humana Press, NJ.Métodos para purificação de proteína incluem tais métodos como precipitaçãopor sulfato de amônio, cromatografia em coluna, eletroforese, centrifugação,cristalização, e outros; veja, e.g., Ausubel, et al. (1987 e suplementosperiódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods inEnzymology vol. 182, e outros volumes nesta série: Coligan, et al. (1995 esuplementos) Current Protocols in Protein Science John Wiley and Sons, NewYork, NY; Matsudaira (ed.) (1993) A Practical Guide to Protein and PeptidePurification for Microsequencing, Academic Press, San Diego, CA; eliteratura do fabricante em uso de produtos para purificação de proteína, e.g.,Pharmacia, Piscataway, NJ, ou Bio-Rad, Richmond, CA. Combinação comtécnicas recombinante permite fusão a segmentos apropriados (etiquetas deepítopo), e.g., a uma seqüência FLAG ou um equivalente que pode serfundido, e.g., através de uma seqüência removível de protease. Veja, e.g.,Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purifieationof Recombinant Proteins com Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.)Genetic Engineering., Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; eCrowe, et al. (1992) OlAexpress: The High Levei Expression and ProteinPurifieation System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Técnicas imunológicas padrão são descritas, e.g., emHertzenberg, et al. (eds.) 5 ed. 1996 Weir1S Handbook of ExperimentalImmunology vols. 1-4, Blackwell Science; Bierer, et al., Eds. (2004) CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene, NY; e Methods in Enzymologyvolumes: 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, e 163 Elsevier,USA.

Exemplo 1: Construção e Triagem de Fragmentos Fab Usando CDRs eArcabouços Humanos

Abordagens padrão para caracterizar e sintetizar bibliotecas deCDR de região variável de anticorpo de mutações únicas são usadas (veja,e.g., Wu et al, 1998 PNAS 95:6037-42). Bibliotecas são construídas emvetores de expressão de bacteriófago Ml3 contendo genes de cadeia leve ecadeia pesada de anticorpo composto de seqüências de arcabouços humanosde região constante e região variável descritas neste lugar junto comseqüências de CDR da invenção. Em alguns casos, a CDR alvo primeiro édeletada antes de anelar os nucleotídeos. Mutagênese baseada em códon parasíntese de oligonucleotídeo para produzir seqüências de CDR da invenção éempregada.

Bibliotecas são inicialmente tríadas por aprimoramento decaptura para identificar as variantes de maior afinidade. O procedimento deaprimoramento de captura (Watkins, 2002 Methods Mol. Biol. 178:187-93) éconhecido na arte e descrito em WO/0164751 e US2002/0098189.

Subseqüentemente, clones desejados são adicionalmente caracterizados portitulação em antígeno imobilizado em um ELISA e um ensaio de potência deproliferação como descritos neste lugar. Seguindo tal triagem, constantes dedissociação (Ka), taxas de associação (Kon) e taxas de dissociação (Koff), sãodeterminadas para um clone de interesse.

Para identificar composições de ligação de anticorpopotenciais compreendendo embeber CDRs de doador da invenção, bibliotecasde CDRs sintéticas são inseridas em um modelo de deleção como descritoneste lugar ou conhecido na arte. Técnicas de mutagênese padrão (Kunkel,1985 PNAS 82:488-92) são empregadas para substituir uma CDR particularusando uma combinação de oligonucleotídeos mutagênicos. Tipicamente,posicionamento de CDR dentro de um arcabouço é logrado usando o sistemacomo definido por Kabat com a exceção de CDRH1, que é a soma dedefinições de Kabat e Chothia. Oligonucleotídeos mutagênicos são anelados aum modelo de fago uridinilado no qual a CDR correspondente é deletada.

Anelamento é realizado incubando uma reação a 850C por 5minutos seguido por resfriamento lento para 20°C no decurso de 45 minutos.Amostras aneladas são colocadas em gelo, DNA polimerase T4 e DNA ligaseT4 são adicionadas para gerar DNA de dupla fita, e a reação é incubada por 5minutos a 4°C seguido por 90 minutos a 37°C. A reação é extraída com fenol,precipitada com etanol e o DNA resultante eletroporado em células DHl OB.Células XLOLR são adicionadas à reação para permitir amplificação de fagoantes das bibliotecas serem emplacadas. Estoques de fagos são preparadospela adição de 8 ml de meio de crescimento às placas seguido por incubação a4oC por um mínimo de 4 horas. O meio contendo fago é coletado e clarificadopor centrifugação e azida de sódio (0,02%) é adicionada como umconservante.

Triagem inicial das bibliotecas é feita por aprimoramentos deplaca como descrito em Watkins, et al 1998 Anal Biochem 256: 169-77; eWatkins, 2002 Methods Mol. Biol., 178:187-93. Filtros contendo Fabsexpressos de placas individuais ligados a anticorpo kappa imobilizadoanti-humano são seqüencialmente incubados com TGF Beta-I biotinilado(bio-TGF Beta-1), Neutravidina-fosfatase alcalina (NA-AP), com breveslavagens no meio. Clones de interesse são seqüenciados e adicionalmentecaracterizados por ELISA. O ELISA geralmente usou placas de microtítuloCostar 3366 revestidas durante a noite a 4°C com 0,4 ug/ml de TGF Beta-1,TGF-Beta-2 ou TGF-Beta 3. Placas são subseqüentemente lavadas 2X vezesantes da adição de 100 uL de solução bloqueadora (10 mg/ml de BSA emtampão de lavagem) em cada poço. Diluições de Fabs são incubadas nospoços revestidos por 1,5 h a 22°C. Depois de lavagem, um conjugado kappaanti-humano-fosfatase alcalina é adicionado e incubado por 1 hora a 22°C.Um substrato colorimétrico é adicionado depois de lavagem extensiva eabsorbância é a A560 é medida para identificar clones positivos.Ensaiando Fabs por ELISA

Em um exemplo não limitante, é empregado em ELISA queusa placas de microtítulo Costar 3366 revestidas durante a noite a 4°C com0,4 ug/ml de TGF Beta-1, TGF-Beta-2, ou TGF-Beta-3 (TGF-Beta-1 (R&DSystems, Cat # 240-B/CF, 239 ug/ml), TGF-Beta-2 (RDI, Cat # RDI-1035, 50ug/ml) e TGF-Beta-3 (RDI, Cat # RDI-103 6/CF, 50 ug/ml) diluídas para 0,4ug/mL em tampão de revestimento). A placa é subseqüentemente lavada (2X)antes da adição de 100 uL de solução bloqueadora (10 mg/ml BSA emtampão de lavagem) em cada poço. Diluições de Fabs da invenção sãoincubadas nos poços revestidos (l,5hr a 22°C). Depois de lavagem, umconjugado kappa anti-humano-fosfatase alcalina é adicionado e incubado (1hora a 22°C). Um substrato colorimétrico é adicionado depois de lavagemextensiva e absorbância é medida a A560.

Em outro exemplo, composições de ligação da invenção sãotestadas em um ensaio competitivo de ELISA. Tipicamente, é realizado umensaio de fase de solução no qual um composto que pode competir com umantígeno por ligação a uma composição de ligação, tal como um anticorpo, écombinado primeiro com o anticorpo em fase de solução, então o grau deligação do anticorpo com o antígeno é subseqüentemente medido.

Materiais:

Tampão de revestimento de carbonato consiste de 50 mM decarbonato de sódio pH 9,6. Antígenos são TGF-Beta 1 (R&D Systems, Cat #240-B/CF, 239 ug/ml), TGF-Beta 2 (RDI, Cat # RDI-1035, 50 ug/ml) e TGF-Beta 3 (RDI, Cat # RDI-1036/CF, 50 ug/ml) diluídos para 0,4 ug/mL emtampão de revestimento. Tampão de lavagem consiste de 0,02 M de Tris pH7,4, 0,15 M de NaC 1, 0,1% de Tween 20 e solução bloqueadora de 10 mg/mlBSA (Sigma A-4503) dissolvida em tampão de lavagem. Proteínas usadascomo controles positivos são TGF-Beta 1, 2, ou 3 anti-humano decamundongo (R&D Systems, cat# IDl 1), TGF-Beta 2 anti-humano decamundongo (R&D Systems, cat# BAF302) e TGF-Beta 3 anti-humano decamundongo (R&D Systems, cat# BAF243), que são diluídos para lug/ml emtampão de bloqueio. O conjugado de detecção de anticorpo usado é conjugadokappa anti-camundongo- peroxidase (Southern Biotech, cat# 1050-05), emuma concentração funcional de 1:2000 em solução bloqueadora. O substratousado para a reação de cor é comprimido de 0-fenilenodiamina (OPD) (Sigmacat# P-6912), que é dissolvido em taínpão de substrato: 0,1 M de Na2HPO4,pH a 5,0 com 0,05 M de ácido cítrico. A solução funcional de substrato deOPD (i.e., o volume para uma placa de 196 poços) é feita recentemente antesde desenvolvimento de cada placa dissolvendo 1 χ 5mg de comprimido deOPD em 12,5 mL de tampão de substrato seguido pela adição de 5 ul de 30%de H2O2.

Protocolo:

Uma única placa de 96 poços é revestida com antígeno (TGF-Beta 1, 2, ou 3 a 0,4 ug/ml e dispensa 50 uL por poço) e então vedada comfita adesiva antes de armazenamento (16-20 horas a 4°C). A placa ésubseqüentemente lavada (2X) em tampão de lavagem (descrito acima) antesde adicionar 100 uL de solução bloqueadora (10 mg/ml de BSA em tampãode lavagem) em cada poço. Depois de incubação (aproximadamente 1 hora a22°C), a placa é lavada (2X) com tampão de lavagem. Então, 100 uL ou deamostra (diluída em tampão) ou controle (diluído em PB S) é adicionado acada poço e incubado (1,5 hora a 22°C). Depois de incubação, a placa élavada (6X) com tampão de lavagem antes de adicionar 100 uL por poço oude conjugado kappa anti-camundongo—peroxidase (diluído para 1:2000 emsolução bloqueadora) ou SA-HRP (diluído 1:10,000 em solução bloqueadora).

As amostras de teste são deixadas para incubar (1 hora a 22°C) antes deadicionar 100 uL de substrato de OPD a cada poço. Depois dedesenvolvimento de cor (aproximadamente 10 minutos), a placa de 96 poços émedida em uma absorbância de 490nm.

Resultados bem sucedidos em tais condições são formas derealização de Fab que produzem uma absorbância maior do que 1,6 unidadesa 490 nm com TGF-Beta 1 mas mostram valores significantemente inferiorescom TGF-Beta 2 e TGF-Beta 3 assim demonstrando ligação específica e/ouseletiva para TGF-Beta 1.

Ensaiando mAbs em um Ensaio Baseado em Célula,

Para testar a capacidade de uma composição de ligação dainvenção de neutralizar bioatividade de TGF e de neutralizar uma isoformaparticular de TGF Beta, alguém pode adaptar o ensaio de proliferação decélula HT-2 de Tsang, et al., (1995 Cytokine 7:389-97). O ensaio deproliferação de célula HT-2 é utilizado para determinar a potência in vitro decomposições Fab e mAb. Resumidamente, células HT-2 proliferam napresença de IL-4 mas passam por apoptose na presença de TGF-Beta. Amorte celular induzida por TGF-Beta é prevenida pela adição de um Fab ouniAb neutralizante de TGF-Beta 1.

A linhagem de célula humana HT-2 prolifera em resposta a IL-4 mas a proliferação induzida por IL-4 é inibida por TGF-Beta 1, TGF-B eta2, ou TGF-Beta 3. Conseqüentemente, uma composição de ligação que éespecífica e/ou seletiva para TGF-Beta 1 é neutralizante se ela previne oefeito inibidor normal que TGF-B eta 1 tem em células HT-2 induzidas porIL-4. Por conseguinte, proliferação celular induzida por IL-4 deve prosseguirilimitada se composição de ligação específica para TGF Beta 1 suficiente éadicionada a uma mistura de células HT-2 contendo TGF Beta 1.Conseqüentemente, a capacidade neutralizante dose resposta de composiçõesde ligação dâ invenção é verificada usando o ensaio de HT-2 na presença deisoformas particulares de TGF e o sinal de proliferação de IL-4. O grau deproliferação celular é verificado usando uma medida comercial deproliferação celular colorimétrica (e.g., CellTiter 96® AQueous One SolutionCell Proliferation Assay de Promega).

Células HT-2 são mantidas em RPMI 1640 suplementado com10% de FBS, penicilina/estreptomicina a 100 U/ml e 100 ug/mlrespectivamente, 50 uM beta-

<table>table see original document page 97</column></row><table>

mercaptoetanol e 10 ng/ml de IL-2 humana (R&D Systems). Células sãocentrifugadas a 1000 RPM in uma centrífuga Jouan CR422 e ressuspensas emPB S. Depois de duas lavagens com PB S, células são finalmente ressuspensasa 0,15 χ IO6 células/ml em Meio de Ensaio que consiste de RPMI livre defenol vermelho 1640 suplementado com 2% de FBS,penicilina/estreptomicina a 100 U/ml e 100 ug/ml respectivamente e 50 uMde beta- mercaptoetanol. A cada poço de uma placa de 96 poços é adicionado50 ul de células em Meio de Ensaio. Antes de adicionar mAbs teste abioensaio celular, concentrações variadas de mAb são pré-incubadas com 300pg/ml de TGF-Beta 1, TGF-Beta 2, ou TGF-Beta 3 (em Meio de Ensaio).Seguindo uma incubação de 30 min, 50 ul da mistura de TGF-Beta /Fab éadicionado às células, seguido imediatamente depois disso por 50 ul de Meiode Ensaio contendo 45 ng/ml de IL-4 murina (15 ng/ml final). Depois de umaincubação de 20-48hr, 35 ul de solução CellTiter 96 Aquous (Promega Corp)é adicionado. Depois de uma incubação adicional de 2 a 3 hr (37°C em umaatmosfera umidificada de 5% de C02), o ensaio é quantificado por análise emum leitor de placa de ELISA a 490 nM usando o ensaio colorimétricoCellTiter 96® (a quantidade de produto de formazana gerada —e se medidapela quantidade de absorbância a 490nm— é diretamente proporcional aonúmero de células vivas em cultura). Dados modais são mostrados abaixo emTabela 2.

Tabela 2 Bioensaio celular de HT-2 in Vitro: Um ensaio de proliferação decélula HT-2 é utilizado para determinar potência in vitro de composições deligação de Fab e mAb da invenção. Células HT-2 proliferam na presença deIL-4 mas passam por apoptose na presença de TGF-Beta. Uma morte celularinduzida por TGF-Beta é prevenida pela adição de uma composiçãoneutralizante de TGF-Beta (tal como, e.g., um Fab ou mAb da invenção). Emcomparação com a IgGl FAb #2471 murina, composições de ligação dainvenção mostram pelo menos uma melhora maior do que 100 vezes ou maisem potência de neutralização para prevenir morte celular induzida por TGF-Beta. Os IC50's para composições de mAb variam de aproximadamente 0,1-1,0 ng/ml (o IC50 de mAb 2471 é aproximadamente 0,1 ng/ml).

Medindo Constantes Cinéticas para Fabs

Um instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Inst. Inc.) é usadopara medir cinética de ligação. Resumidamente, um antígeno écovalentemente acoplado a microesferas de alzactone e a ligação de umacomposição de ligação livre de Fab da invenção às microesferas é detectadano instrumento.

Para medir Kd, tubos individuais contendo 20 pM de Fab (200pM para o mAb) com antígeno diluído serialmente decrescente (0-2 5 OnM), éincubado por 1-6 dias a 25°C em PBS contendo 1% de BSA, 0,02% de azidae 0,01% de Tween20. Depois da incubação, Fab livre em cada amostraequilibrada é determinado no KinExA 3000 de acordo com as instruções dofabricante. Valores de Kd são determinados usando aplicativo computacionalKinExA 3000.

Para medir Icon, Fabs individuais a 2nM são misturados com 0-240nM de antígeno usando o método de injeção de acordo com as instruçõesdo fabricante, e o Fab não ligado é detectado. O dado resultante é usado paracalcular a Icon com aplicativo computacional KinExA 3000. A kogf é calculadausando a fórmula Ka = koffikon.

Medindo Constantes Cinéticas para Mabs

Métodos alternados de medir constantes cinéticas sãoconhecidos, por exemplo: afinidade de uma composição de ligação para TGF-Beta 1 humano (R&D Systems, Cat # 240-B/CF), TGFBeta 2 (RDI, Cat #RDI-1035) e TGF-Beta 3 (RDI, Cat # RDI-1036/CF) é medida usando uminstrumento BlAcore® 2000. O BlAcore® utiliza as propriedades óticas deressonância de plasmônio de superfície para detectar alteração emconcentração protéica de moléculas interagindo dentro de uma matriz debiosensor de dextrana. Exceto se observado, todos os reagentes e materiaissão adquiridos de BlAcore® AB (Upsala, Sweden). Todas as medidas sãorealizadas em temperatura ambiente. Amostras são dissolvidas em tampãoHBS-EP (150mM de cloreto de sódio, 3mM de EDTA, 0,01% (w/v) detensoativo P-20, e IOmM de HEPES, pH7,4). Proteína A Recombinante éimobilizada em todas as quatro células de fluxo de um circuito integradosensor de CM4 em um nível de 400-450 unidades de resposta (RUs) usandoum kit de acoplamento de amina.

Ligação é avaliada usando múltiplos ciclos analíticos. Cadaciclo é realizado em uma vazão de 50μΙ7ηιίηπΐο e consiste das seguintesetapas: injeção de \2\xL de uma composição de ligação de anticorpo at 0,5μg/mL, injeção de 250μΙ^, de TGF-Beta 1 (começando em 5nM e usandodiluições seriais de duas vezes para 0,13nM para cada ciclo, com duasinjeções para cada concentração) seguido por um atraso ou curto (5 minutos)ou longo (120 minutos) para dissociação, e regeneração usando duas injeçõesde 50μΙ. de IOmM de cloridrato de glicina, pHl,5. Taxas de associação edissociação para cada ciclo são determinadas por ajuste dos dados dobiosensor usando para um modelo de associação simples usando ClampXP(Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. of Utah) para extrair asconstantes de taxas kon e kw; a constante de ligação de equilíbrio Kd écalculada usando a relação Ka = IcoffZkon. Dados modais para composições dainvenção estão em Tabela 3 mostrada abaixo.

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Tabela 3 Afinidade de ligação e medidas cinéticas Fabs emAbs da invenção. Parâmetros de ligação de equilíbrio (Kd) e cinéticos (kon)são determinados usando Kinexa (koff é calculada a partir de Kd e km).Propriedades de ligação de equilíbrio e cinéticas de mAbs são determinadasusando Biacore. A constante de ligação de equilíbrio Kd é calculada a partirdas km e koff determinadas. Comparação é com IgGl Fab #2471 murina.Devido à dissociação muito lenta, as koff para 2IDl e DM7 é o limitesuperior detectável, e são provavelmente muito mais lentas, e portanto, osvalores de Kd calculados também são limites superiores. Valores são a médiade medidas repetidas (n = 3-4).

Determinação de Especificidade de Mab

Métodos de BlAcore são usados para determinar a capacidadede composições de mAb da invenção de se ligar a outras entidades,especificamente a forma latente de TGF-Beta 1 ou TGF-Beta 3. Todas asmedidas são realizadas em temperatura ambiente. Amostras são dissolvidasem tampão HBS-EP (150mM de cloreto de sódio, 3mM de EDTA, 0,01%(w/v) de tensoativo P-20, e IOmM de HEPES, pH7,4). Proteína ARecombinante é imobilizada em todas as quatro células de fluxo de umcircuito integrado sensor de CM4 em um nível de 400-450 unidades deresposta (RUs) usando um kit de acoplamento de amina.

Ligação é avaliada usando múltiplos ciclos analíticos. Cadaciclo é realizado em uma vazão de 100μΙ7ιηιηυίο consistindo das seguintesetapas: injeção de 15μί, de uma composição de ligação de anticorpo a 1Kg/mL, injeção de 250μΙ., ou de 5 nM de TGF-Beta 1, 5 nM de TGF-Beta 1latente, ou 5 nM de TGF-Beta 3 seguido por um atraso curto (5 min) paradissociação, e regeneração usando duas injeções de 50μί de IOmM decloridrato de glicina, pHl,5. A quantidade de sinal depois de capturarprimeiro o Mab, e então o ligante, são determinadas usando o aplicativocomputacional de controle de instrumento. Uma vez que o sinal éproporcional à massa de proteína capturada, a estequiometria do ligantecapturado é prontamente calculável (Tabela 4).

<table>table see original document page 101</column></row><table>

Tabela 4 Ligação de TGF-Beta 1, TGF-Beta 1 latente e TGF-Beta 3 a Mabs (testado em 5 nM de ligante).

Especificidade para TGF-Beta 1

Afinidades de mAbs de composição de ligação para TGF- □ 3são determinadas usando métodos de BlAcore. Todas as medidas sãorealizadas em temperatura ambiente. Amostras são dissolvidas em tampãoHBS-EP (150mM de cloreto de sódio, 3mM de EDTA, 0,01% (w/v) detensoativo P-20, e IOmM de HEPES, pH7,4). Proteína A Recombinante éimobilizada em quatro células de fluxo de um circuito integrado sensor deCM4 em um nível de 400-450 unidades de resposta (RUs) usando um kit deacoplamento de amina. Ligação é avaliada no decurso de múltiplos ciclosanalíticos. Cada ciclo é realizado em uma vazão de 100μL/minuto consistindodas seguintes etapas: injeção de 15μί de uma composição de ligação deanticorpo em 0,5 μg/mL, injeção de 250μΙ. de TGF-D3 (começando em 5nMe usando diluições seriais de duas vezes para 0,13nM para cada ciclo, comduas injeções para cada concentração) seguido por um atraso curto (5minutos) para dissociação, e regeneração usando duas injeções de 50μΙ. de10mM de cloridrato de glicina, pH1.5.

Afinidades são determinadas baseadas no sinal de equilíbrio seatingido em concentrações variadas de TGF-D 3 medindo o sinal médiodurante os últimos 10 segundos das injeções de TGF-D3, e então ajustando ossinais resultantes em todas as concentrações de TGF-D3 para um modelosimples de equilíbrio de ligação em SCRUBBER (Center for BiomolecularInteraction Analysis, Univ. of Utah). Dados de modelo determinados paracomposição de mab humana testada da invenção de Kd e especificidade —calculada dividindo a Kd para ligação de TGF-D 3 pela Kd para ligação deTGF- □ 1 (neste lugar)— é mostrada abaixo em Tabela 5.

<table>table see original document page 102</column></row><table>

Tabela 5 Afinidade e especificidade relativa de mAbs decomposição de ligação testada para ligação de TGF-Beta 3. Erros, ondemostrados, representam o desvio padrão de múltiplas medidas repetidas (n =3).Exemplo 2: Modelo In Vivo de Ligação de Duto Biliar de FibroseHepática

Um modelo de ligação de duto biliar é utilizado de umamaneira similar àquela relatada por Arias et al (BMC Gastroenterology 3(29),2003) para avaliar eficácia in vivo de terapia anti-TGF-βΙ. Resumidamente,ratos machos Sprague Dawley (250-300 g) são anestesiados com inalação deisoflurano (2-3%) para efeito. O abdômen é barbeado e esfregado combetadina e 70% de álcool etílico. Em condições estéreis, uma incisão mediana(-4cm) é feita e o duto biliar comum é isolado e ligado com seda cirúrgica 6-0em duas posições, afastadas aproximadamente 1 cm e então transfectado entreataduras. A parede abdominal é fechada com sutura de seda 4-0 e a pelegrampeada junto. Administração de uma composição anti-TGF-β 1 e mAb deisotipo controle de camundongo (IgG) são iniciadas no dia de cirurgia e acada 7 dias depois disso. Em 4 e 12 dias após cirurgia, ratos são eutanizados eenzimas hepáticas no soro, contagem sangüínea completa, e histologiahepática (tricromo e corantes H&E) são processadas para determinar efeito detratamento.

Exemplo 3: Modelo In Vivo de Fibrose pulmonar

Diversos modelos são disponíveis para avaliar a eficácia invivo de composições anti-TGF-beta em fibrose pulmonar. Por exemplo, ummodelo de bleomicina aplicado de uma maneira relatada por Pittet, et al (JCI107, 1537-1544, (2001)) é usado para verificar melhora em uma abordagemanti-TGF-beta. Outro modelo é o modelo de reovírus respiratório l/L (veja,e.g., Bellum et al., Am. J. Pathol, 150, 2243; ou London et al, Clin. Immunol.103, 284; e London et al, Exp.Mol.Pathol, 72, 24-36). Resumidamente,usando camundongos, em dia 1, Reovírus l/L, i.n. 1 χ 10 pfu (30 ul total) éaplicado através da narina seguido em dias 3, 7, 12 com concentraçõesvariadas de composição de ligação anti-TGF-beta da invenção ou um mAb deisotipo de controle como descrito neste lugar ou conhecido na arte. Animaissão monitorados durante o curso de tratamento por sinais de desconfortorespiratório, perda de peso, e mortalidade. Em dia 14 depois de início detratamento, animais são eutanizados e amostras de pulmão preparadas paraavaliação histopatológica (H/E) para verificar o desenvolvimento e/ouprogressão de doença pulmonar (com teor de hidroxiprolina analisado paramedida de fibrose).

Exemplo 4: Modelo In Vivo de Anti-Thyl,l GlomeruIonefrite

O modelo de rato anti-Thyl.l é um modelo bem estabelecidode glomerulonefrite mesangioproliferativa (veja, e.g., Morita, et al., 1998 AmJ Kidney Dis 31:559-73; Bagchus, et al., 1986 Lab. Invest. 55:680-7 eYamamoto & Wilson 1987 Kidney Int. 32:514-25) no qual injeção de umanticorpo dirigido contra o antígeno Thy localizado na superfície de célulasmesangiais induz mesangiólise seguido por uma fase de proliferaçãocompensatória excessiva de células mesangiais resultando em níveis elevadosde proteína urinária (proteinúria). O modelo de nefrite anti-Thyl,l parecenefrite de IgA humana ou purpurea de Henoch-Schonlein em muitos aspectos(O1Donoghue, et al., 1991 J Clin Invest 88:1522-30) e ele foi usado para testarabordagens potencialmente terapêuticas para doença renal determinando acapacidade de composições teste de efetuar diminuições relacionadas à doseem proteinúria (veja, e.g., Burg, et al., 1997 Lab Invest 76:505-16; Johnson, etal., 1995 Kidney Int 47:62-9).

Para testar composições de ligação da invenção em um talmodelo, ratos machos Sprague Dawley (200-260 gramas; aproximadamentede 9 semanas de idade), individualmente marcados, são aclimatados por cincodias pré-tratamento com acesso livre a comida e água em uma dieta padrão.Determinação de uma pré-proteína urinária é feita em pré-tratamento dia-5.Ratos recebem uma identificação individual marcando na cauda com ummarcador colorido assim como etiquetados na orelha antes de seremsangrados por retro-orbital, e aleatorizados 5 grupos baseado em pesocorporal em dia 1.

O estudo é realizado cego para os grupos de tratamento e nãocego no fim do estudo. Grupos recebem ou 1,25 mg de mAb anti-Thyl,l ouPBS como uma injeção de controle através da veia peniana em dia 0.

Composições de ligação são preparadas e purificadas em condições padrão oucomo descrito neste lugar. O mAb IgGl de controle de camundongo (11513)é material purificado de proteína A ressuspenso em PBS pH7,2 e é adquiridode Harlan Bioproducts for Science, Indianapolis, EST 46229-0176.

Camundongo Q-Thy 1,1 é produzido em culturas de 2 χ IOLde hibridoma de camundongo. Meio condicionado é combinado, concentradopara 18X e subseqüentemente purificado. Aproximadamente, 764mLs dosobrenadante coletado concentrado é misturado com 1,5M de Glicina/3,0M deNaCI pH 8,9 e aplicado a uma coluna virgem de Proteína A Sefarose de137ml que é pré-equilibrada em 1,5M de Glicina/3,0M de NaCI pH 8,9. Acoluna de Proteína A é então equilibrada com 1,5M de Glicina/3,0M de NaClpH 8,9. A coluna é eluída com 100 mM de Ácido cítrico pH 3,0. Fraçõesselecionadas do eluato que correspondem a IgG são combinadas, ajustadaspara pH 7,4 com IM de NaOH, e aplicadas a uma coluna Pharmacia Superdex200 de 318ml equilibrada em PBS, cloreto de sódio pH 7,4. O picocorrespondendo em tamanho a IgG é combinado, aliquotado e armazenado a -20°C.

Uma hora depois de administração de mAb anti-Thyl,l,animais são dosados subcutaneamente com composições da invenção deanticorpo isotipo ou anti-TGF-Beta 1. Anticorpos são dosados de novo em dia7, animais são testados nos seguintes quatro grupos de tratamento:

1) Simulações; injeção de PBS

2) Anti-thyl,l com anticorpo de isotipo controle a - 12,5mg/kg ou 2,5 mg/dose

3) Anti-thyl,l com anticorpo DM4 a -5 mg/kg, ou 1 mg/dose4) Anti-thyl,l com anticorpo DM7 a -12,5 mg/kg, ou 2,5mg/dose

5) Anti-thyl,l com anticorpo C27 a -12,5 mg/kg, ou 2,5mg/dose

Ratos são colocados em gaiolas metabólicas por um período detempo de 24 hr em dias -5 e 13. Em dia 14, ratos são sacrificados por CO2 esangrados através de punção cardíaca para obter sangue para análise. O rimesquerdo é fixado com 4% de Paraformaldeído em PBS e armazenado em70% de etanol para análise histológica posterior. Se qualquer rato se tornamoribundo, ele é sacrificado (C02) e processado para concentrações deproteína urinária e nitrogênio de uréia de sangue. Concentrações de proteínaurinária e nitrogênio de uréia de sangue (BUN) são analisadas em umanalisador automático HITACHI 911 com controles de Biorad de acordo comas instruções do fabricante.

Dados de modelo em Tabela 6 abaixo mostram que ascomposições de ligação da invenção têm uma capacidade significante deatenuar lesão renal in vivo e de reduzir a protoneúria associada com lesãorenal induzida por mAb anti-Thy 1,1.

<table>table see original document page 106</column></row><table><figure>figure see original document page 107</figure>

Tabela 6. Ratos são injetados i.v. com 2,5mg/kg de va-Thyl,lseguido 30 min depois com Img de Herceptina para os estudos de 2IDl eDM4. Uma segunda dose de anti-TGF-Beta 1 e mAb controle é administradaem dia 7, e animais são eutanizados em dia 14. Tanto composições de ligaçãode mAb 2IDl como DM4 diminuem níveis de proteína urinária (proteinúria)de uma maneira dose dependente.

EXEMPLO 5: Mapeamento de Epítopo de Composições de ligação de TGFDI

Uma combinação de H/Dex e marcação química são usadaspara mapear epítopos de composições de ligação TGF-α 1 da invenção talcomo, por exemplo, anticorpos. Como tanto troca de H/D como modificaçãoquímica dependem de acessibilidade de solvente a resíduos de aminoácidos,mudanças em acessibilidade de solvente depois de formação de um complexode composição de ligação:TGF Beta 1 podem ser usadas para identificarresíduos envolvidos em ligação de anticorpo. Subseqüente a troca de H/D oumodificação química, digestão proteolítica em fragmentos de clivagem depeptídeo do antígeno anteriormente ligado permite comparações de pesomolecular entre fragmentos (usando LC/MS) para determinar quais resíduosde aminoácidos são bloqueados a partir de troca de H/D ou modificaçãoquímica depois de formação de complexo de ligação.

Marcação Química de Superfície de Proteína Alíquotas de 15□g de 1 mg/mL de TGF-D1 em solução de 4 mM de HCI são transferidas parafrascos de plástico, aos quais 180 Dg ou de uma composição de anticorpocontrole ou um TGF-D1 da invenção é adicionado (TGF-dI /anticorpo:= xHem proporção molar). Salina tamponada com fosfato (PBS) é adicionada emcada frasco a um volume final volume de 150 d L e as soluções sãopermitidas para incubar (para permitir formação de um complexo de ligação)em temperatura ambiente por pelo menos 10 mM antes de marcação desuperfície de proteína. Para marcação química, 7,5 d L de uma solução de 5mg/mL de éster hidroxilsuccinimida de ácido acético (AHSE) é adicionadoem cada frasco de complexo e as misturas são então incubadas emtemperatura ambiente (AHSE/anticorpo = 200/1 em proporção molar). Emtempos variados (e.g., 10, 20, e 60 min), 50 QL da solução de mistura édissipada misturando com 50 QL de 1 mg/mL K em tampão 0,1 M e tris, pH8,0. A solução é analisada diretamente por LC/MS (como descrito nestelugar). A solução remanescente de cada amostra é tratada com 3-5 QL de 50mg/mL de solução DTT a 37°C (10-15 min) para reduzir as pontes dissulfetode TGF-Q1 maduro.

A solução reduzida de proteína é subseqüentemente tratadacom 3 QL de 0,1 mg/mL de solução de quimotripsina a 37°C por 2-3 horas, eentão tratada com 1 QL de 0,25 mg/mL de solução de Glu-C a 37°C poroutras 2-3 horas. Esta reação é dissipada adicionando 0,5 QL de ácido acéticoglacial, e então analisada por LC/MS, usando um Waters 2795 HPLC eEspectrômetro de Massa Micromass LTC Premier. O HPLC usou um Zorbax,SS C18, 2,1x50 mm, em temperatura ambiente, e proteínas e peptídeos sãoeluídos com um gradiente de acetonitrila em 0,15% de ácido fórmico; umtempo de corrida de 14 minutos é usado para a proteína intacta, e um tempode corrida de 75 minutos é usado para digestos proteolíticos.

Para resíduos de lisina (K) na superfície de TGF- Ql oudentro de ou estruturalmente perto do epítopo, acetilação do grupo amino K ébloqueada (ou parcialmente ou completamente) depois que uma composiçãoteste se liga a TGF- □ 1. Comparando o grau de acetilação entre um peptídeode uma amostra complexada (TGF-Q 1 + anticorpo que se liga a TGF- □ 1)ou não complexada (TGF- Ql+ anticorpo controle que não se liga a TGF- □1) permite que alguém identifique resíduos de aminoácidos bloqueados apartir de acetilação pela formação do complexo de ligação. Dado de ummodelo de acetilação obtidos em uma tal análise LC/MS é mostrado abaixoem Tabela 7.

Tabela 7. Mol de Grupo Amino Acetilado por Mol de Peptídeo Obtido porLC/MS para

<table>table see original document page 109</column></row><table>

* e # indica os dois diferentes lotes do anticorpo DM4 são caracterizadosseparadamente

Dado tal dado de modelo, diferenças entre os complexos TGF-□ 1 :anticorpo e controles são discerníveis para diversos fragmentos depeptídeo de TGF- □ 1, especialmente como mostrado para períodos curtos deacetilação (e.g., 10 min). Fragmentos abrangendo resíduos 31-39, 3343, 53-62, e 91-112 demonstram tais diferenças discerníveis. Tanto fragmentos 31-39 como 33-43 compreendem o resíduo K37. Fragmento 22-32, quecompreende K26 & K31, não mostra diferença significante sobre controles,assim as diferenças de acetilação de fragmento 31-39 são atribuíveis abloqueio de K37 a partir de acetilação depois de formação do complexoantígeno: anticorpo.

Fragmentos 53-62 e 91-112 exibem diferenças persistentessobre a variação testada e para cada anticorpo testado. Fragmento 53-62,mostra diferenças diminuídas na variação superior de acetilação (60 min),entretanto, em condições de menor proporção AHSE/anticorpo, taisdiferenças permanecem inalteradas ao longo da variação. Não se atendo àteoria, uma interpretação de tal dado é que K60 não está diretamenteenvolvido em ligação de antígeno:anticorpo mas que sua proximidade com ocomplexo de ligação é suficientemente perto para bloquear acessibilidade deAHSE ao resíduo K60, assim bloqueando acetilação. Alternativamente,entretanto, K60 pode compreender o epítopo definido pelo anticorpo testado.

Fragmento 91-112 mostra diferenças de acetilação ao longo davariação testada, sugerindo que pelo menos um dos três resíduos de lisinadeste fragmento (K95, K97, ou Kl 10) participa no complexo de composiçãode ligação:TGF Beta 1. Para identificar o(s) resíduo(s) de lisina envolvido(s),o digesto quimotríptico é adicionalmente tratado com Glu-C produzindo doisfragmentos adicionais — 91-99 e 100-112. O último (fragmento 100-112)contém Kl 10, entretanto, ele não mostra em diferença significante deacetilação sugerindo que ele é inacessível ou a solvente ou a modificaçãoquímica.

O primeiro (fragmento 91-99) contendo K95 e K97 éadicionalmente testado usando TGF- 1 não complexado tratado com AHSE eanálise MS/MS para determinar tampões de eluição das espécies acetiladasisoladamente, e para quantificar o grau de acetilação de K95 ou K97 (dadosde modelos em tais condições são mostrados abaixo em Tabela 8). Tais dadosmostram que acetilação de K97 permanece não modificada com ou semformação de complexo, entretanto, presença de uma composição de anticorpoda invenção afeta significantemente acetilação de K95 indicando que K95está diretamente envolvido em formação de complexo de ligação.

Tabela 8. Acetilação de K95 & K97

<table>table see original document page 111</column></row><table>

* e # indicam que dois diferentes lotes do anticorpo DM4 são caracterizadospor troca de H/D.

Em mapeamento de epítopo, a técnica de troca dedeutério/hidrogênio (H/D) parece marcação de superfície de proteína /MS,entretanto, troca H/D não é específica para resíduo, e assim pode detectarmudanças em qualquer resíduo de aminoácido. Ao comparar um complexo decomposição de ligação:TGF Beta 1 com uma proteína TGF-D1 madura nãocomplexada, o peso molecular da proteína complexada é cerca de 20 Da (ou30Da a 100% D2O) menor do que TGF-D1 não complexada assim, calculandodiferenças de peso DoO entre TGF-D1 complexada e não complexada, podeser mostrado que aproximadamente trinta resíduos de aminoácidos no dímeroTGF-d 1 maduro podem participar em formação de um complexo de ligaçãoda invenção.

Alíquotas de 120 Dg (-140 ou 280 dL) de soluções deanticorpo têm o tampão trocado para PBS por concentração e diluiçãosucessiva usando um concentrador de proteína por ultrafiltração Microcon (30kD) (Millipore). Depois de duas concentrações e diluições sucessivas comPBS, as soluções de anticorpo são concentradas, removidas, ajustadas paraum volume final de 70 dL com PBS. Então, 10 dL de 1 mg/mL de TGF-d 1em solução 4 mM de HCI e 2 dL de tampão 1 M tris, pH 8,0, é adicionado emcada frasco de anticorpo para formar um complexo TGF-d 1:anticorpo. Umaamostra de TGF-d 1 controle é preparada misturando 70 dL de lxPBS, 20 dLde TGF-d 1 em solução 4 mM de HO, e 2 QL de tampão 1 M tris, pH 8,0.

Subseqüentemente, 9 dL de TGF-d 1 ou do complexo de TGF-d 1 e anticorpoé transferido para um micro frasco de plástico, e então 21 dL de 100% D2O éadicionado para formar uma solução de 70% de D2O. A solução é incubadaem temperatura ambiente por 10 min e então a 0°C por 1 min.

Depois de incubação, troca de H/D é dissipada e a proteínadigerida adicionando 15 QL de solução de 1% de ácido fórmico (a 0°C) e 4□L de 2 mg/mL de solução de pepsina (a 0°C), e então incubando a 0°C por5 mM. O digesto é imediatamente injetado na coluna manualmente paraanálise LC/MS (como descrito acima, exceto que as colunas de tubagem eHPLC são imersas em um banho de gelo).

TGF-d 1 maduro resiste a digestão por pepsina em pH baixo (-2,5) e temperatura baixa (O0C) devido à formação de ligação dissulfeto. Comoum resultado, poucos peptídeos de clivagem são produzidos e a maioria deTGF-d 1 é ainda intacta apesar de maiores tempos de digestão e maioresconcentrações de enzima:proteína. fragmentos proteolíticos de TGF-d 1identificáveis são tipicamente gerados em regiões C terminais e medianas daproteína (e.g., fragmentos 58-64 ou 61-64). Dado de modelo para a mudançaem massa (massa delta) depois de troca de D/H usando tais fragmentos émostrado abaixo em Tabela 9. A massa delta para fragmento 61-64 éaproximadamente zero enquanto que a massa delta para fragmento 58-64 écerca de 1 Da sugerindo que a região protegida de troca de deutério—depoisde formação de complexo com uma composição de ligação da invenção—compreende resíduos de aminoácidos 58-61.

Tabela 9. Massas Delta do Peptídeo Péptico Identificado de TGF-Beta 1Depois de Troca D/H

<table>table see original document page 113</column></row><table>

Mutagênese de TGF Betai

1 50

TGFbl (normal) (1); ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYEDFRKDLGWKWMEPKGYHANFCLGPCPYTGFbl (muteína) (1);ALDTNYCFSSTEKNCCVNLY1DFKRDLGWKV,/VBEPKGYHANFCLGPCPY

51 100

TGFb I (normal) (51) fWSLDTQYSKVLALYNQUNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKFICVEQTGFbI (muteína) (51) ÍWSLDTQYSKVIALYNOINPG4SAAPCCVPQALEpLTILYINGRTpKVEQ101 113

TGFb I (normal) (101) I.SNMIVRSCKCS-TGFbl (muteína) (101) LSNIAIVRSCECSASEQ ID NO. 130]

Para definir adicionalmente epítopos para composições deligação da invenção, técnicas tradicionais de mutagênese são usadas paraidentificar resíduos de TGF Beta 1 críticos para formação de complexos deligação com composições da invenção. A estrutura cristalina do complexoTGFBeta 3/TGF-Beta RII (2002 Nat Struct Biol. 3:203-8) é usada como ummodelo para definir sítios de mutagênese significantes de proteína TGF-Beta1—R25K, K26R, V331, P87T, V89L, e K95T (mostrados acima).

Capacidade de se ligar a muteína TGF Beta 1 é testada usandocomposições de ligação específicas para isoformas de TGF Beta e mAbscomercialmente disponíveis (1D11 e 240; R&D Systems), que previnemligação de TGF Beta 1 a seu receptor cognato (TGF-Beta RII). Verificação érealizada em uma análise em espectrômetro de massa de tempo-de-vôo dedessorção/ionização induzido por laser. mAbs de teste, tal como, e.g., mAb3821 e 2471, que se ligam especificamente a TGF Beta 1 (descrito emPCT/US2004/018921; Patente Norte-Americana 60/485.820) e controles, talcomo, e.g., mAb IDl 1, que se ligam a todas três isoformas de TGF Beta, sãomisturados (fornecendo uma oportunidade para complexar com a proteínaTGF Beta 1 (ou muteína ou tipo selvagem)), imobilizados em circuitosintegrados de detecção, gazeteados, e subseqüentemente analisados usandoaplicativo computacional padronizado em condições de fabricação (Ciphergen Diagnostics).

Resultados de modelo mostram que um subconjunto distintode resíduos de aminoácidos na interface de ligação de TGF Beta 1/TGF-BetaRll diferem das outras isoformas de TGF-beta (TGF Beta 2, e TGF Beta 3.mAb de teste #2471 (com afinidade de ligação específica para TGF Beta 1) seliga a TGF-Beta 1 tipo selvagem em uma taxa cinco vezes maior do que amuteína TGF Beta 1, enquanto que mAbs 3821, e IDll se liga a muteínaTGF-Beta 1 em uma taxa que é duas e uma vez e meio menor do que TGFBeta 1 tipo selvagem.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 é seqüência de aminoácidos madura de TGF Beta 1 de primataSEQ ID NO: 2 é seqüência de aminoácidos de VHCDRI de primata.SEQ ID NO: 3 é seqüência de aminoácidos de VHCDR2 de primata.SEQ ID NO: 4 é seqüência de aminoácidos de VHCDR3 de primata.SEQ ID NO: 5 é seqüência de aminoácidos de VLCDRI de primata.SEQ ID NO: 6 é seqüência de aminoácidos de VLCDR2 de primataSEQ ID NO: 7 é seqüência de aminoácidos de VLCDR3 de primata.SEQ ID NO: 8 é seqüência de aminoácidos de arcabouço HCVR FRl deprimata.

SEQ ID NO: 9 é seqüência de aminoácidos de arcabouço HCVR 1FR2 deprimata.

SEQ ID NO: 10 é seqüência de aminoácidos de arcabouço HCVR FR3 deprimata.

SEQ ID NO: 11 é seqüência de aminoácidos de arcabouço HCVR FR4 deprimata.

SEQ ID NO: 12 é seqüência de aminoácidos de arcabouço LCVR FRl deprimata.

SEQ ID NO: 13-36 são seqüências de aminoácidos de arcabouço LCVR FR2de primata.

SEQ ID NO: 37 é seqüência de aminoácidos de arcabouço LCVR de primata.

SEQ ID NO: 38 é seqüência de aminoácidos de arcabouço LCVR FR4 deprimata.

SEQ ID NO: 39 é seqüência de aminoácidos de região constante de cadeiapesada de IgGl de primata.

SEQ ID NO: 40 é seqüência de aminoácidos de região constante de cadeiapesada de IgG4 de primata.

SEQ ID NO: 41 é seqüência de aminoácidos de região constante de cadeialeve de IgG4 de primata.

SEQ ID NO: 42-86 são seqüências de aminoácidos de região variável decadeia leve de primata. SEQ ID NO: 87-125 são seqüências de aminoácidosde cadeia pesada HCVR de primata.LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Eli Lilly & Company

<120> COMPOSIÇÕES DE LIGAÇÃO; REAGENTES RELACIONADOS

<130> X-16598

<140> PCT/US2006/014 94 3

<141> 2006-04-06

<150> US 60/674082

<151> 2005-04-22

<160> 145

<170> PatentIn versão 3.4

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala 1 Leu Asp Thr Asn 5 Tyr Cys Phe Ser Ser 10 Thr Glu Lys Asn Cys 15 CysVal Arg Gln Leu 20 Tyr Ile Asp Phe Arg 25 Lys Asp Leu Gly Trp 30 Lys TrpIle His Glu 35 Pro Lys Gly Tyr His 40 Ala Asn Phe Cys Leu 45 Gly Pro CysPro Tyr 50 Ile Trp Ser Leu Asp 55 Thr Gln Tyr Ser Lys 60 Val Leu Ala LeuTyr 65 Asn Gln His Asn Pro 70 Gly Ala Ser Ala Ala 75 Pro Cys Cys Val Pro 80Gln Ala Leu Glu Pro 85 Leu Pro Ile Val Tyr 90 Tyr Val Gly Arg Lys 95 ProLys Val Glu Gln 100 Leu Ser Asn Met Ile 105 Val Arg Ser Cys Lys 110 Cys Ser

<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><4 00>

210PRT

Artificial

Construção sintética

misc_aspecto(3) . . (3)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

misc_aspecto(5) . . (5)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

misc_aspecto(9) .. (10)Xaa pode ser2

qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

Gly Tyr Xaa Phe Xaa Asp Tyr Asn Xaa Xaa5 10

1

<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220>

3

17PRT

Artificial

Construção sintética

misc_aspecto(1)··(2)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<221> mi s c aspecto<222> (8) . - (8)<223> Xaa pode ser<220> <221> mi sc aspecto<222> (11) • · (H)<223> Xaa pode ser<220> <221> mi s c aspecto<222> (13) .·(13)<223> Xaa pode ser<220> <221> mi s c aspecto<222> (15) •·(15)<223> Xaa pode ser<400> 3 Xaa Xaa Tyr Pro Tyr1 5Ser <210> 4 <211> 7

qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

Asp Gly Xaa Thr Gly10

Xaa Asn Xaa Lys Xaa Lys15

<212><213><220><223><220><221><222><223><400>

PRT

Artificial

Construção sintética

misc_aspecto(4) .. (6)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente4

Gly Tyr Arg Xaa Xaa Xaa Tyr

1

510PRT

Artificial

Construção sintética

misc_aspecto(1) · · (1)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

misc_aspecto(3) . . (5)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente

misc_aspecto(7)..(7)

Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente5

Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Val Xaa Tyr Met His

1

<210><211><212><213><220><223><220><221><222>

10

67

PRT

Artificial

Construção sintética

misc_aspecto(5) . . (5)<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> misc_aspecto<222> (7).. (7)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<4 00> 6

Ala Thr Ser Asn Xaa Ala Xaa

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<220>

<221> misc_aspecto<222> (1).. (1)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<220>

<221> misc_aspecto<222> (5) .. (7)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido ocorrendo naturalmente<4 00> 7

Xaa Gln Trp Asp Xaa Xaa Xaa Pro Ala1 5

<210> 8<211> 25<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser20 25

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 9

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly15 10

<210> 10<211> 32<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 10

Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu15 10 15

Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 11

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser15 10

<210> 12<211> 23<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10Asp Arg ■ Val Thr Ile 20 Thr Cys <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <40Ó> 13 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 15 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 16 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 17 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 18 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 19 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 20 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

15

15<400> 21 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 22 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Trp Phe : Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 25 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 26 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 27 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro1 5 10<210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 28 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 29 Trp Tyr ■ Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro1 5 10<210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

Tyr15

Pro Leu Ile Tyr15

15

15<400> 30 Trp Tyr Gln Gln Lys1 5<210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 31 Trp Phe Gln Gln Lys1 5<210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<4 00> 32 Trp Phe Gln Gln Lys1 5<210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<4 00> 33 Trp Phe Gln Gln Lys1 5<210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<4 00> 34 Trp Phe Gln Gln Lys1 5<210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<4 00> 35 Trp Phe Gln Gln Lys1 5<210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 36 Trp Phe Gln Gln Lys1 5<210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens<4 00> 37 Gly Val Pro Ser Arg1 5Leu Thr Ile Ser Ser 20<210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Trp Ile Tyr10 15

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr10 15

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr10 15

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Trp Ile Tyr10 15

Pro Glu Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr10 15

Pro Glu Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr10 15

Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Trp Ile Tyr10 15

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

10 15

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys25 30

<400> 38

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys15 10

<210> 39<211> 328<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln305 310 . 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly325

<210> 40

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp145 150 155 160Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys225 230 235 240Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser305 310 • 315 320Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu65 70 75 80Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 106 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 43 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 45 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Leu Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 46 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Tyr Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 47 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Glu Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg , Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Gln Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Asn Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 50 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Met Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 51 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 52 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Pro 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Phe Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 53 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Pro 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Asp Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Pro 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Arg Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 55 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Pro 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Ser Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 56 <211> 106 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 56 - Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 57 <211> 106 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Pro Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu-65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 58<211> 106 <212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 59 <211> 106 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 60 <211> 106 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Lys 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 61<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 62<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Val Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 63<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Leu Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala85 90 95Phe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 64 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Thr Ser Ser Val Leu 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 65 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Tyr 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 66 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr Ser Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu100

<210> 67<211> 106<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Gln 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys

<210> 68

<2il> 106

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética

<4 00> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Tyr Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 69 <211> 106 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Tyr MetHis Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

Ile Lys10585 90 95 Phe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 70 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 71 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 72 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 73<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 74<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ala Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 75<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 75

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ala Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 76<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 77<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 77

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 ■ 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 78<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Arg Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 79<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 79

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

. 35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Pro Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 80<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 81<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 82<211> 106<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 82

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Phe 35 Gln Gln Lys Pro Glu 40 Lys Ala Pro Lys Ser 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Tyr 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys

<210> 83

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética

<4 00> 83

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Phe 35 Gln Gln Lys Pro Glu 40 Lys Ala Pro Lys Ser 45 Leu Ile TyrAla Thr 50 Ser Asn Leu Ala Leu 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys

<210> 84

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 85 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 85 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 86 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Ser Ser Val Pro 30 Tyr MetHis Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr35 40 45 Ala Thr Ser Asn Pro Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Asp Leu Asn Pro Pro 95 AlaPhe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys <210> 87 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 87 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Glu 30 Asp TyrAsn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 88<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 88

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 89<211> 115<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 89

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser15 10 15

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr Asn

20 25 30

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80

Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110

Val Ser Ser115<210> 90<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 90

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr20 25 30Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 91<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 91

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 92<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 92

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 93<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220><223> Construção sintética<4 00> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 94<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 95<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser115 <210> 96 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 96 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 97 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 97 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Val Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 98 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Arg Gly Tyr 100 Arg Trp Phe Ala Tyr 105 Trp Gly Gln Gly Thr 110 Leu ValThr Val Ser 115 Ser <210> 99 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 99 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Phe 30 Asp TyrAsn Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro. Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp MetGly Tyr 50 Ile Tyr Pro Tyr Asp 55 Gly Asp Thr Gly Tyr 60 Asn Gln Lys PheLys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Arg Gly Tyr 100 Arg Trp Phe Ala Tyr 105 Trp Gly Gln Gly Thr 110 Leu ValThr Val Ser 115 Ser <210> 100 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 100 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15 Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Asp TyrAsn Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp MetGly Tyr 50 Ile Tyr Pro Tyr Asp 55 Gly Asp Thr Gly Thr 60 Asn Gln Lys PheLys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Arg Gly Tyr 100 Arg Trp Phe Ala Tyr 105 Trp Gly Gln Gly Thr 110 Leu ValThr Val Ser 115 Ser <210> 101 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 101 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly His Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 102<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 103<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 103

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Lys Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 104<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 104

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Ile Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 105<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 105

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 106<211> 115<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 106

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser15 10 15

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr Asn

20 25 30

Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Ser Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Pro Lys Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80

Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210> 107<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 108<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 108

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 109<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 109

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 110<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 110

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 111<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 111

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser. Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Pro Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr- Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 112<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 112

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 113<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 113

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 .30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 114<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 114

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 115<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 115

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Val Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 116<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 116

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 117<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 117

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 118<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 118

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 119 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 119 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 120 <211> 116 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> ' Construção sintética <400> 120 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Ser Lys Phe50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 121<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 121

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Tyr

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 122<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 122

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Ser Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 123<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 123

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 124<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 124

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 125<211> 116<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 125

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Pro Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115<210> 126<211> 9<212> PRT

<213> Unknown<220>

<223> Construção sintética

<400> 126

Gln Gln Trp Asn Gly Asn Pro Pro Ala

1 5

<210> 127

<211> 9

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Construção sintética

<400> 127

Gln Gln Trp Asp Ser Asn Pro Pro Ala1 5

<210> 128

<211> 17

<212> PRT

<213> Unknown<220>

<223> Construção sintética

<400> 128

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys15 10 15

Ser

<210> 129

<211><212>

10PRT

<213> Unknown<220>

<223> Construção sintética<400> 129

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met His

15 10

<210> 130

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<400> 130

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

15 10

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Glu Ala Ser Ser Ser Val

20 25

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu65 70 75

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn

85 90

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn145 150 155

Ser Val Gly15

Ser Tyr Met30

Leu Ile Tyr

Ser Gly Ser

Gln Pro Glu80

Pro Pro Ala95

Ala Ala Pro110

Ser Gly Thr

Glu Ala Lys

Ser Gln Glu160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys210<210> 131<211> 442<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 131

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu370 375 380Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe385 390 395 400Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 132 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 132 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Pro Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 133 <211> 442 <212> PRT <213> . Artificial <220> <223> Construção sintética <4 00> 133 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 134<211> 442<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 134

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 135<211> 213<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<4 00> 135

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 .75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys210<210> 136<211> 6<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 136

Tyr Tyr Val Gly Arg Lys1 5

<210> 137<211> 5<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 137Tyr Val Gly Arg Lys1 5

<210> 138<211> 10<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 138

Glu Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

15 10

<210> 139

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<4 00> 139

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 140

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<4 00> 140

Gln Gln Trp Asp Leu Asn Pro Pro Ala

1 5

<210> 141

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<400> 141Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 142

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<400> 142

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys15 10 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His20 25

<210> 143<211> 7<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Construção sintética<400> 143

Gly Tyr Arg Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 144

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética<4 00> 144

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys1 5 10 15 Val Arg Gln Leu 20 Tyr Ile Asp Phe Lys 25 Arg Asp Leu Gly Trp 30 Lys TrpVal His Glu 35 Pro Lys Gly Tyr His 40 Ala Asn Phe Cys Leu 45 Gly Pro CysPro Tyr 50 Ile Trp Ser Leu Asp 55 Thr Gln Tyr Ser Lys 60 Val Leu Ala LeuTyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro65 70 75 80Gln Ala Leu Glu Pro 85 Leu Thr Ile Leu Tyr 90 Tyr Val Gly Arg Thr 95 ProLys Val Glu Gln 100 Leu Ser Asn Met Ile 105 Val Arg Ser Cys Lys 110 Cys Ser

<210> 145

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 145Tyr Ser Lys Val1

Claims

1. Composição de ligação isolada que se liga especificamentea TGF Beta 1 madura mais do que TGF Beta 2 madura e TGF Beta 3 madura,dita composição caracterizada pelo fato de que compreende uma primeiraporção tendo um sítio de ligação compreendendo GYRX1X2X3Y (SEQ IDNO: 4); em que: Xi é W ou A; X2 é F ou L; e X3 é A, E, ou Y.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que dita primeira porção compreende adicionalmente pelo menosuma das seqüências seguintes:i. GYX1FX2DYNX3X4 (SEQ ID NO: 2); em que: Xi é T ouD; X2 é Τ, E, ou F; X3 é Μ, I, L, ou V; e X4 é Η, V, ou A5j; ouii. XiX2YPYDGX3TGX4NX5KX6KS (SEQ ID NO: 3); em que:Xi é Y, Q, ou S; X2 é I, ou V; X3 é D, ou E; X4 é Υ, Τ, H, ou L; X5 é Q, Κ, P,ou S; e X6 é F ou Y.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de compreender adicionalmente uma segunda porçãocompreendendo um sítio de ligação de XiQWDX2X3X4PA (SEQ ID NO: 7);em que: Xj é Q ou S; X2 é L, D, ou P; X3 é N ou R; e X4 é P, F, Y, ou R.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que dita segunda porção compreende adicionalmente pelo menosuma das seqüências seguintes:i. X1AX2X3X4VX5YMH (SEQ ID NO: 5); em que: Xi é R,Υ, E, ou Q; X2 é S ou T; X3 é S, V, ou A; X4 é S ou L; X5 é S, P, L, ou Y; ouii. ATSNXiAX2 (SEQ ID NO: 6); em que: Xj é L, N, ou P; eX2 é £ Κ, Y, L, M, F, E, Q, R, ou H.

5. Composição de ligação recombinante de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que:a) dita primeira porção:i) é imunorreativa com TGF Beta-I madura humana;ii) é imunorreativa com TGF Beta-1 madura de primata;iii) é construída contra uma proteína TGF Beta-I humanapurificada ou recombinantemente produzida ou fragmento desta;iv) é parte de um anticorpo monoclonal, Fab, Fv, scFv, F(ab)2,ou um domínio variável de um anticorpo;v) tem pelo menos uma, duas, três, ou quatro substituiçõesconservativas;vi) está embebida dentro de um arcabouço de anticorpohumano ou humanizado; ouvii) compreende parte da região variável de uma cadeia pesadade um anticorpo, Fab, Fv, scFv, F(ab)2.

6. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de ser um anticorpo monoclonal compreende:a) uma região variável de cadeia pesada (HCVR) com:I) CDRl selecionada a partir de uma seqüênciacompreendendo GYXIFX2DYNX3X4 [SEQ ID NO: 2]; em que: X1 é ou Tou D; X2 é ou Τ, E, ou F; X3 é ou Μ, I, L, ou V; e X4 é ou Η, V, ou A; eII) CDR2 selecionada a partir de uma seqüênciacompreendendo Xix2YpydgX3TGX4NX5KX6KS [SEQ ID NO: 3]; em que:Xj é ou Y, Q, ou S; X2 é ou I, ou V; X3 é ou D, ou E; X4 é ou Υ, Τ, H, ou L;X5 é ou Q, Κ, P, ou S; e X6 é ou F ou Y; eIII) CDR3 selecionada a partir de uma seqüênciacompreendendo GYRXiX2X3Y [SEQ ID NO: 4]; em que: X1 é ou W ou A; X2é ou F ou L; e X3 é ou A ou E; eb) uma região variável de cadeia leve (LCVR) com:I. CDRl selecionada a partir de uma seqüênciacompreendendo XIAX2X3X4VX5YMH [SEQ ID NO: 5]; em que: X1 é ou R,Υ, E, ou Q; X2 é ou S ou T; X3 é ou S, V, ou A; X4 é ou S ou L; X5 é ou S, P,L, ou Y; eII. CDR2 selecionada a partir de uma seqüênciacompreendendo ATSNXiAX2 [SEQ ID NO: 6]; em que: Xi é ou L, N, ou P; eX2é ou S, Κ, Y, L, M, F, E, Q, R, ou H; eIII. CDR3 selecionada a partir de uma seqüênciacompreendendo XiQWDX2X3X4PA [SEQ ID NO: 7]; em que: X1 é ou Q ouS; X2 é ou L, D, ou P; X3 é ou N ou R; e X4 é ou P, F, Y, ou R.

7. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que:a) dita HCVR tem um:I. Arcabouço FRl compreendendo SEQ ID NO: 8;II. Arcabouço FR2 compreendendo SEQ ID NO: 9;III. Arcabouço FR3 compreendendo SEQ ID NO: 10; eIV. Arcabouço FR4 compreendendo SEQ ID NO: 11; eb) dita FCVR tem um:I. Arcabouço FRl compreendendo SEQ ID NO: 12;II. Arcabouço FR2 compreendendo seqüência selecionada apartir de SEQ ID NOs: 13-36;III. Arcabouço FR3 compreendendo SEQ ID NO: 37; eIV. Arcabouço FR4 compreendendo SEQ ID NO: 38.

8. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que:a) compreende adicionalmente regiões constantes humanas ouhumanizadas;b) compreende adicionalmente uma região constante de IgG4compreendendoI. uma seqüência de cadeia pesada compreendendo: SEQ IDNO: 40; eII. uma seqüência de cadeia pesada compreendendo: SEQ IDNO: 41c) é um fragmento Fab;d) é um fragmento Fv;e) é um fragmento scFv;f) é um fragmento F(ab)2;g) é fundido a uma região constante humana;h) é detectavelmente etiquetado;i) é liofilizado;j) é codificado em uma molécula isolada de ácido nucleico;k) é codificado em uma molécula isolada de ácido nucleicoque é operavelmente ligada em um vetor de expressão;1) é codificado em uma molécula isolada de ácido nucleico queé operavelmente ligada em um vetor de expressão que é incorporado em umacélula hospedeira;m) é um anticorpo quimérico;n) é conjugado com outra unidade quimérica;o) é estéril; oup) é uma composição farmacêutica.

9. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de compreender:a) uma LCVR tendo uma seqüência selecionada a partir deSEQ ID NOs: 42-86; eb) uma HCVR tendo uma seqüência selecionada a partir deSEQ ID NOs: 87-125.

10. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que é:a) humanizado;b) é fundido a uma região constante humana;c) é um fragmento Fab;d) é um fragmento Fv;e) é um fragmento scFv;f) é um fragmento F(ab)2;g) compreende uma região constante selecionada a partir de:IgGl5 IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, e IgD;h) detectavelmente etiquetado;i) liofilizado;j) um anticorpo quimérico;k) usado na fabricação de um medicamento para administraçãoa um primata para o tratamento de uma condição tal como:-1. doença renal;-2. doença renal crônica;-3. doença renal de estágio final;-4. doença, distúrbio, ou condição fibrótica; ou-5. fibrose renal;-1) conjugado com outra unidade quimérica;-m) estéril; oun) compreendendo uma composição farmacêutica.

11. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de compreender:-1. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 42 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90, 91, 92;-2. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 43 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 90, 95;-3. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 44 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 93 ou 94;-4. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 45, 46, 47,-48, 49, 50, 52, 53, 54, ou 55 e uma HCVR compreendendo SEQ ID NO: 96;-5. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 51 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104;

12. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de compreender uma LCVR e HCVR de:- 1. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 56 e umaHCVRcompreendendo SEQ ID NO: 105, 106, 107, 109, 110;- 2. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 57 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 107;- 3. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 58 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 106;- 4. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 60 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 108;- 5. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 61 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 110, 111;- 6. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, e uma HCVR compreendendo SEQ ID NO: 112;- 7. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 69 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 112, 113, 114, 155; ou- 8. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 70, 71, 72,e uma HCVR compreendendo SEQ ID NO: 116;

13. Composição de ligação de acordo com a reivindicação 8,caracterizada por compreender uma LCVR e HCVR de:- 1. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 72, 73 euma HCVR compreendendo SEQ ID NO: 117;- 2. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 74 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 118, 119;- 3. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 73 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 119;- 4. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 75 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 96, 117;- 5. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 76 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 117;-6. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 77, 78, 79,e uma HCVR compreendendo SEQ ID NO: 96;-7. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 80 e uma-HCVR compreendendo SEQ ID NO: 120, 121, 122;-8. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 81 e umaHCVRcompreendendo SEQ ID NO: 117, 120, 121, 122, 123;-9. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 82, 84, euma HCVR compreendendo SEQID NO: 117;-10. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 83 e uma-HCVR compreendendo SEQ ID NO: 117, 124;-11. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 84 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 117;-12. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 85 e uma-HCVR compreendendo SEQ ID NO: 91;-13. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 86 e umaHCVR compreendendo SEQID NO: 117, 125;-14. uma LCVR compreendendo SEQ ID NO: 82 e umaHCVR compreendendo SEQ ID NO: 89.

14. Método de uso de uma composição de ligação comodefinida na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender colocarem contato dita composição de ligação com uma amostra biológicacompreendendo um antígeno, formando com isso um complexo decomposição de ligação: antígeno.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que dita amostra biológica é de um humano, e em que ditacomposição de ligação é um anticorpo monoclonal.

16. Kit de detecção, caracterizado pelo fato de compreenderdita composição de ligação como definida na reivindicação 6, e:a) material instrucional para o uso de dita composição deligação para dita detecção; oub) um compartimento fornecendo segregação de ditacomposição de ligação.