BRPI0608516A2

BRPI0608516A2 - análogo de glp-1, método para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo de glp-1, composição farmacêutica, e, uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0608516A2
Application number: BRPI0608516-4A
Authority: BR
Inventors: Florencio Zaragoza D Doerwald; Lauge Schaeffer; Jesper Lau; Thomas Kruse Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-20
Publication date: 2010-11-16
Also published as: JP5755398B2; AU2006224537A1; KR20070120112A; US20080207507A1; RU2007134155A; JP2008533106A; EP1863521A1; ES2484796T3; MX2007011307A; EP1863521B1; WO2006097538A1; CA2596926A1; US8603972B2; CN101128214A

Abstract

ANáLOGO DE GLP-1, MéTODO PARA AUMENTAR O TEMPO DE AçãO EM UM PACIENTE DE UM ANáLOGO DE GLP-1, COMPOSIçáO FARMACêUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO. Compostos de GLP-1 projetados e seu uso terapêutico.

Description

"ANÁLOGO DE GLP-1, MÉTODO PARA AUMENTAR O TEMPO DEAÇÃO EM UM PACIENTE DE UM ANÁLOGO DE GLP-1,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito ao campo de peptídeos terapêuticos,isto é, a novos compostos de GLP-I projetados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O GLP-I humano é um peptídeo 37 resíduos de aminoácidosque se origina de pré-pró-glucagon que é sintetizado i.a. nas células L no íleodistai, no pâncreas e no cérebro. O GLP-I é um hormônio intestinalimportante com função reguladora no metabolismo de glicose e secreção emetabolismo gastrintestinal. O GLP-I estimula a secreção de insulina em umamaneira dependente de glicose, estimula a biossíntese de insulina, promove oresgate da célula beta, diminui a secreção de glucagon, esvaziamento gástricoe captação de alimento. O GLP-I humano é hidrolisado em GLP-I (7-37) eGLP-I (7-36)-amida que são ambos peptídeos insulinotrópicos. Um sistemasimples é usado para descrever os fragmentos e análogos deste peptídeo.Assim, por exemplo, [Gly8]GLP-l (7-37) designa um análogo de GLP-I (7-37) formalmente derivado de GLP-I (7-37) mediante a substituição doresíduo de aminoácido de ocorrência natural na posição 8 (Ala) por Gly.Similarmente, (Ns34-tetradecanoil)[Lys34]GLP-I (7-37) designa GLP-I (7-37)em que o grupo de ε-amino do resíduo de Lys na posição 34 foi submetido atetradecanoíla.

Na última década vários peptídeos foram isolados do venenodos lagartos monstros de Gila (.Heloderma suspectum e Helodermahorridum). A exendina-4 é um peptídeo de 39 resíduos de aminoácidosisolado do veneno de Heloderma suspectum, e este peptídeo compartilha 52%de homologia com o GLP-I (7-37) na região de sobreposição. A exendina-4 éum potente agonista do receptor de GLP-I que foi mostrado de estimular aliberação de insulina e a diminuição resultante do nível de glicose no sanguequando injetada em cachorros. O grupo de exendina-4(l-39), certosfragmentos destes, seus análogos e seus derivados, são potentes agentesinsulinotrópicos.

Uma faixa de diferentes métodos foi usada para modificar aestrutura de compostos de peptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-I) demodo a fornecer uma duração mais longa de ação in vivo.

A WO 96/29342 apresenta derivados de hormônio de peptídeoem que o hormônio de peptídeo de origem foi modificado mediante aintrodução de um substituinte lipofilico no resíduo de aminoácido C-terminalou no resíduo de aminoácido N-terminal.

A WO 98/08871 apresenta os derivados de GLP-I em que pelomenos um resíduo de aminoácido do peptídeo de origem possui umsubstituinte lipofilico ligado.

A WO 99/43708 divulga os derivados de GLP-I (7-35) e GLP-1 (7-36) que possuem um substituinte lipofilico ligado ao resíduo deaminoácido C-terminal.

A WO 00/34331 divulga análogos de GLP-I submetidos acila.

A WO 00/69911 apresenta peptídeos insulinotrópicos ativadosa serem injetados em pacientes onde eles são supostos de reagir com oscomponentes sangüíneos para formar conjugados e desse modo supostamentefornecendo duração mais longa de ação in vivo.

A WO 02/46227 apresenta análogos de GLP-I e exendina-4fundidos em albumina de soro humano de modo a prolongar o prazo devalidade in vivo.

Muitos pacientes diabéticos são tratados com agenteshipoglicêmicos orais, e visto que os compostos de GLP-I são esperados deserem o primeiro produto injetável nestes pacientes que será administrado, omedo de injeções pode se tornar um sério obstáculo para o uso corrente doscompostos de GLP-I clinicamente muito promissores. Assim, existe umanecessidade de se desenvolver novos compostos de GLP-I que possam seradministrados menos do que uma vez ao dia, por exemplo, uma vez a cadasegundo ou terceiro dia, preferivelmente uma vez por semana, enquanto retémum perfil clínico aceitável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece um análogo de GLP-I tendo umamodificação de pelo menos um resíduo de aminoácido não proteogênico nasposições 7 e/ou 8 em relação à seqüência de GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1),que é acilada com um componente no resíduo de lisina na posição 37 ou 38, eonde dito componente compreende pelo menos dois grupos acídicos, em queum grupo acídico é ligado terminalmente. A invenção fornece umacomposição farmacêutica que compreende tal análogo de GLP-1.

A invenção fornece o uso de um tal análogo de GLP-I para afabricação de um medicamento para o tratamento de várias doenças.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

No presente relatório descritivo, os seguintes termos possuemo significado indicado:

O termo "polipeptídeo" e "peptídeo" como aqui usadosignifica um composto constituído de pelo menos cinco aminoácidosconstituintes conectados por ligações de peptídeo. Os aminoácidosconstituintes podem ser do grupo dos aminoácidos codificados pelo códigogenético e eles podem ser aminoácidos naturais que não são codificados pelocódigo genético, assim como os aminoácidos sintéticos. Os aminoácidosnaturais que não são codificados pelo código genético são por exemplo, γ-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina e D-glutamina. Osaminoácidos sintéticos compreendem os aminoácidos fabricados pela síntesequímica, isto é, D-isômeros dos aminoácidos codificados pelo códigogenético tal como D-alanina e D-leucina, Aib (ácido a-aminoisobutírico),Abu (ácido α-aminobutírico), Tle (terc-butilglicina), β-alanina, ácido 3-aminometil benzóico, ácido antranílico.

Os 22 aminoácidos proteogênicos são:

Alanina, Arginina, Asparagina, Acido aspártico, Cisteína,Cistina, Glutamina, Ácido glutâmico, Glicina, Histidina, Hidroxiprolina,Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina,Treonina, Triptofano, Tirosina, Valina.

Assim um aminoácido não proteogênico é um componente quepode ser incorporado em um peptídeo através das ligações de peptídeo, masnão é um aminoácido proteogênico. Exemplos são γ-carboxiglutamato,ornitina, fosfoserina, os D-aminoácidos tais como D-alanina e D-glutamina.Os aminoácidos não proteogênicos sintéticos compreendem aminoácidosfabricados pela síntese química, isto é, D-isômeros dos aminoácidoscodificados pelo código genético tal como D-alanina e D-leucina, Aib (ácidoα-aminoisobutírico), Abu (ácido α-aminobutírico), Tle (terc-butilglicina),ácido 3-aminometil benzóico, ácido antranílico, des-amino-Histidina, osanálogos beta de aminoácidos tais como β-alanina etc. D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina, homoistidina, N^acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, α-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina, (1-aminociclopropil) ácido carboxílico,ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico,ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-heptil)carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;

O termo "análogo" como aqui usado que se refere a umpolipeptídeo significa um peptídeo modificado em que um ou mais resíduosde aminoácido do peptídeo foram substituídos por outros resíduos deaminoácido e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram anuladosdo peptídeo e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram anuladosdo peptídeo e ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foramadicionados ao peptídeo. Tal adição ou anulação de resíduos de aminoácidopode ocorrer no N-terminal do peptídeo e/ou no C-terminal do peptídeo. Umsistema simples é freqüentemente usado para descrever os análogos: Porexemplo [Arg34]GLP-l (7-37)Lys designa um análogo de GLP-I (7-37) emque a lisina de ocorrência natural na posição 34 foi substituída com arginina eem que uma lisina foi adicionada ao resíduo de aminoácido terminal, isto é,no Gly . Todos os aminoácidos para os quais o isômero ótico não émencionado devem ser compreendidos para significar o L-isômero. Nasformas de realização da invenção um máximo de 17 aminoácidos foimodificado. Nas formas de realização da invenção um máximo de 15aminoácidos foi modificado. Nas formas de realização da invenção ummáximo de 10 aminoácidos foi modificado. Nas formas de realização dainvenção um máximo de 8 aminoácidos foi modificado. Nas formas derealização da invenção um máximo de 7 aminoácidos foi modificado. Nasformas de realização da invenção um máximo de 6 aminoácidos foimodificado. Nas formas de realização da invenção um máximo de 5aminoácidos foi modificado. Nas formas de realização da invenção ummáximo de 4 aminoácidos foi modificado. Nas formas de realização dainvenção um máximo de 3 aminoácidos foi modificado. Nas formas derealização da invenção um máximo de 2 aminoácidos foi modificado. Nasformas de realização da invenção 1 aminoácido foi modificado.

O termo "derivado" como aqui usado em relação a umpeptídeo significa um peptídeo quimicamente modificado ou um análogodeste, em que pelo menos um substituinte não está presente no peptídeo nãomodificado ou um análogo deste, isto é, um peptídeo que foi covalentementemodificado. As modificações típicas são amidas, carboidratos, grupos dealquila, grupos de acila, ésteres e outros mais. Um exemplo de um derivadode GLP-I (7-37) é NE26-((4S)-4-(hexadecanoilamino)-carbóxi-butanoil)[Arg34,Li s26] GLP-1 -(7-3 7).O termo "peptídeo GLP-1" como aqui usado significa GLP-I(7-37) (SEQ ID No 1), um análogo de GLP-I (7-37), um derivado de GLP-I(7-37) ou um derivado de um análogo de GLP-I (7-37). Em uma forma derealização o peptídeo de GLP-I é um agente insulinotrópico.

O termo "agente insulinotrópico" como aqui usado significaum composto que é um agonista do receptor de GLP-I humano, isto é, umcomposto que estimula a formação de cAMP em um meio adequado contendoo receptor de GLP-I humano (um tal meio apresentado abaixo). A potência deum agente insulinotrópico é determinada mediante o cálculo do valor de EC50da curva de dose-resposta como descrito abaixo.

Células renais de hamster bebê (BHK) que expressam oreceptor de GLP-I humano clonado (BHK-467-12A) foram cultivadas emmeio DMEM com a adição de 100 IU/mL penicilina, 100 μg/mlestreptomicina, 5% soro de bezerro fetal e 0,5 mg/ml Geneticin G-418 (LifeTechnologies).

As células foram lavadas duas vezes em salina tamponada defosfato e colhidas com Versene. As membranas plasmáticas foram preparadasa partir das células mediante a homogeneização com um Ultraturrax emtampão 1 (20 mM HEPES-Na, 10 mM EDTA, pH 7,4). O homogeneizado foicentrifugado a 48.000 χ g durante 15 min a 4 0C. O grânulo foi colocado emsuspensão por homogeneização em tampão 2 (20 mM HEPES-Na, 0,1 mMEDTA, pH 7,4), depois centrifugado em 48.000 χ g durante 15 min a 4 0C. Oprocedimento de lavagem foi repetido mais uma vez. O grânulo final foicolocado em suspensão em tampão 2 e usado imediatamente para ensaios ouarmazenado em -80 0C.

O ensaio de receptor funcional foi realizado pela medição deAMP cíclico (cAMP) como uma resposta ao estímulo pelo agenteinsulinotrópico. O cAMP formado foi quantificado pelo AlphaScreen™cAMP Kit (Perkin Elmer Life Sciences). As incubações foram realizadas emplacas de microtítulo de 96 reservatórios de meia área em um volume total de50 μl tampão 3 (50 mM Tris-HCI, 5 mM HEPES, 10 mM MgCl2, pH 7,4) ecom as seguintes adições: 1 mM ATP, 1 μΜ GTP3 0,5 mM 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX), 0,01% Tween-20, 0,1% BSA, 6 μg de preparação demembrana, 15 μg/mL glóbulos aceitantes, 20 μg/ml glóbulos doadores pré-incubados com 6 nM biotinil-cAMP. Os compostos a serem testados comrelação a atividade de agonista foram dissolvidos e diluídos em tampão 3. OGTP foi recentemente preparado para cada experiência. O paca foi incubadano escuro com agitação baixa durante três horas em temperatura ambienteseguindo pela contagem no instrumento Fusion™ (Perkin Elmer LifeSciences). As curvas de concentração-resposta foram traçadas em gráfico paraos compostos individuais e os valores de EC50 estimados usando um modelologístico de quatro parâmetros com Prism v. 4.0 (GraphPad, Carlsbad, CA).

O termo "DPP-IV protegido" como aqui usado que se refere aum polipeptídeo significa um polipeptídeo que foi quimicamente modificadode modo a tornar dito composto resistente à peptidase dipeptidilaminopeptidase-4 (DPP-IV) plasmática. A enzima DPP-IV no plasma éconhecida de estar envolvida na degradação de vários hormônios de peptídeo,por exemplo, GLP-1, GLP-2, Exendina-4 etc. Desta maneira, um esforçoconsiderável está sendo feito para desenvolver análogos e derivados dospolipeptídeos suscetíveis à hidrólise medida por DPP-IV de modo a reduzir ataxa de degradação por DPP-IV. Em uma forma de realização um peptídeoprotegido por DPP-IV é mais resistente à DPP-IV do que ao GLP-I (7-37) ouExendina-4( 1-39).

A resistência de um peptídeo à degradação por dipeptidilaminopeptidase IV é determinada pelo seguinte ensaio de degradação:

Alíquotas do peptídeo (5 nmol) são incubadas a 37 0C com 1μί de dipeptidil aminopeptidase IV purificada correspondente a umaatividade enzimática de 5 mU durante 10 a 180 minutos em 100 μί de 0,1 Mtampão de trietilamina-HCl, pH 7,4. As reações enzimáticas são terminadaspela adição de 5 μί de 10% ácido trifluoroacético, e os produtos dedegradação de peptídeo são separados e quantificados usando análise deHPLC. Um método para executar esta análise é: As misturas são aplicadas emum Vydac Cl8 widepore (30 nm poros, 5 μηι partículas) 250 χ 4,6 mm decoluna e eluídas em uma taxa de fluxo de 1 ml/min com gradientesescalonados lineares de acetonitrila em 0,1% ácido trifluoroacético (0%acetonitrila durante 3 min, 0 a 24% de acetonitrila durante 17 min, de 24 a48% de acetonitrila durante 1 min) de acordo com Siegel et al., Regul. Pept.1999;79:93-102 e Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35. Ospeptídeos e seus produtos de degradação podem ser monitorados por suaabsorção em 220 nm (ligações de peptídeo) ou 280 nm (aminoácidosaromáticos), e são quantificados pela integração de suas áreas de picorelacionadas com aqueles dos padrões. A taxa de hidrólise de um peptídeo pordipeptidil aminopeptidase IV é estimada em tempos de incubação queresultam em menos do que 10% de o peptídeo sendo hidrolisado.

O termo "Ci_6-alquila" como aqui usado significa um grupo dehidrocarboneto saturado, ramificado, reto ou cíclico tendo de 1 a 6 átomos decarbono. Exemplos representativos incluem, mas não são limitados a eles,metila, etila, n-propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, neopentila, terc-pentila, n-hexila, isoexila, ciclo-hexano eoutros mais. O termo "farmaceuticamente aceitável" como aqui usadosignifica adequado para aplicações farmacêuticas normais, isto é, dandoorigem a nenhum evento adverso nos pacientes etc.

O termo "excipiente" como aqui usado significa os compostosquímicos que são normalmente adicionados às composições farmacêuticas,por exemplo, tamponantes, agentes de tonicidade, conservantes e outros mais.

O termo "quantidade eficaz" como aqui usado significa umadosagem que é suficiente para ser eficaz para o tratamento do pacientecomparado sem tratamento.O termo "composição farmacêutica" como aqui usadosignifica um produto que compreende um composto ativo ou um sal destejuntamente com os excipientes farmacêuticos tais como tampão, conservante,e opcionalmente um modificador da tonicidade e/ou um estabilizante. Assim,uma composição farmacêutica é também conhecida na técnica como umaformulação farmacêutica. O termo "tratamento de uma doença" como aquiusado significa o manejo e cuidado de um paciente tendo desenvolvido adoença, condição ou distúrbio. O propósito de tratamento é combater adoença, condição ou distúrbio. O tratamento inclui a administração doscompostos ativos para eliminar ou controlar a doença, condição ou distúrbioassim como para aliviar os sintomas ou complicações associadas com adoença, condição ou distúrbio. Em um outro aspecto a presente invenção serefere a um análogo de GLP-I submetido a acila que pode se ligar à albuminae ao receptor de GLP-I simultaneamente.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a umanálogo de GLP-I acilado que se liga ao receptor de GLP-I com umaafinidade abaixo de 100 nM, preferível abaixo 30 nM na presença de 2%albumina.

Em um outro aspecto a presente invenção se refere a umanálogo de GLP-I submetido a acila cuja afinidade ao receptor de GLP-I éapenas parcialmente diminuída quando se compara a afinidade na presença deconcentração muito baixa (por exemplo, 0,005% a 0,2%) de albuminahumana com a afinidade na presença de 2% albumina humana. A mudança naafinidade de ligação sob estas condições é menor do que 50 vezes, preferívelabaixo de 30 vezes e mais preferível abaixo de 10 vezes.

O termo "componente de ligação de albumina" como aquiusado significa um resíduo que se liga não covalentemente à albumina de sorohumano. O resíduo de ligação de albumina ligado ao polipeptídeo terapêuticopossui uma afinidade abaixo de 10 μΜ para a albumina de soro humano epreferivelmente abaixo de 1 μΜ. Uma faixa de resíduos de ligação dealbumina é conhecida entre os componentes lipofílicos lineares e ramificadoscontendo de 4 a 40 átomos de carbono tendo um grupo acídico distai.

O termo "ligador hidrofilico" como aqui usado significa umespaçador que separa um peptídeo e um resíduo de ligação de albumina comum componente química que compreende pelo menos 5 átomos nãohidrogênio onde de 30 a 50 destes são N ou O.

O termo "grupos acídicos" como aqui usado significa gruposquímicos orgânicos que são completa ou parcialmente de modo negativocarregados em pH fisiológico. O valor pKa de tais grupos está abaixo de 7,preferível abaixo de 5. Isto inclui, mas não são limitados a eles, ácidoscarboxílicos, ácidos sulfônicos, ácidos fosfóricos ou sistemas de anelheterocíclico que são completa ou parcialmente de modo negativo carregadoem pH fisiológico.

A presente invenção fornece um análogo de GLP-1, submetidoa acila com um componente de ligação de albumina lipofilico contendo pelomenos dois grupos químicos acídicos livres ligados através de um ligador deaminoácido não natural a um resíduo de lisina na posição 37 ou 38. Em umaforma de realização da invenção a lisina está na posição 38.

A presente invenção também fornece um análogo de GLP-Isubmetido a acila onde dito análogo de GLP-I é estabilizado contra DPP-IVpela modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido nas posições 7 e 8em relação à seqüência GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1), e onde dita acilação éum diácido ligado a um resíduo de lisina na posição 37 ou 38 opcionalmenteatravés de ligador hidrofilico de aminoácido não natural. Em uma forma derealização da invenção a lisina esta na posição 38. A presente invençãotambém fornece um método para aumentar o tempo de ação em um pacientede um análogo de GLP-1, caracterizado na acilação de dito análogo de GLP-Icom um diácido sobre o resíduo de lisina na posição 37 ou 38 de dito análogode GLP-1. Em uma forma de realização da invenção a lisina está na posição 38.

A presente invenção também fornece um método paraaumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo de GLP-I em maisdo que cerca de 40 horas, caracterizado na modificação de pelo menos um dosresíduos de aminoácido nas posições 7 e 8 de um peptídeo GLP-I (7-37)Lysou um análogo deste, e acilação do resíduo aminoácido C-terminal Lys38 doanálogo de GLP-I com um diácido através do espaçador hidrofílico.

A presente invenção também fornece composiçõesfarmacêuticas compreendendo um composto de acordo com a presenteinvenção e o uso de compostos de acordo com a presente invenção para apreparação de medicamentos para o tratamento de doença. Em uma forma derealização da invenção dito análogo de GLP-I é Aib°,ArgZDJ-GLP-l (7-37)Lys,Aib8'22,Arg2634-GLP-I (7-37)Lys, ou Gly85Arg2634GLP-I-(7-37)Lys.

Na fórmula estrutural II abaixo o componente U é um di-radical, pode ser ligado aos grupos terminais B e ao grupo de amino doaminoácido de lisina no peptídeo em duas maneiras diferentes. Nas formas derealização da invenção o U ma fórmula II é ligado com o grupo B ligado naextremidade da cadeia de alquila e o peptídeo na outra extremidade.

Nas fórmulas abaixo as ligações terminais dos grupos ligadosdevem ser consideradas como ligações de conexão e não a terminação nosgrupos de metileno a não ser que mencionado.

Nas fórmulas abaixo

<formula>formula see original document page 12</formula>

significa o H2N-His-Aib- N-terminal do análogo de GLP-1.

Em um aspecto a presente invenção se refere a um análogo deGLP-I5 acilado com um componente de ligação de albumina lipofílicocontendo pelo menos dois grupos químicos acídicos livres ligados através deum ligador de aminoácido não natural à um resíduo de lisina na posição 37 ou38.

Em uma forma de realização da invenção a lisina está naposição 38.

Em uma forma de realização, o termo grupos químicosacídicos livres deve ser entendido como tendo o mesmo significado como"grupos acídicos" como aqui usado.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a umanálogo de GLP-I submetido a acila onde dito análogo de GLP-I éestabilizado contra DPP-IV pela modificação de pelo menos um resíduo deaminoácido nas posições 7 e 8 em relação à seqüência GLP-I (7-37) (SEQ IDNo 1), e onde dita acilação é um diácido ligado a uma resíduo de lisina naposição 37 ou 38 opcionalmente através de um ligador hidrofílico deaminoácido não natural. Em uma forma de realização da invenção a lisina estána posição 38.

Em uma forma de realização da invenção um análogo de GLP-1 tendo uma modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido nãoproteogênico nas posições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-I (7-37)(SEQ ID No 1), que é acilada com um componente no resíduo de lisina naposição 37 ou 38, e onde dito componente compreende pelo menos doisgrupos acídicos, em que um grupo acídico é ligado de modo terminal. Emuma forma de realização da invenção a lisina está na posição 38.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que o componente ligado naposição 37 ou 38 compreende um ligador hidrofílico. Em uma forma derealização da invenção a lisina está na posição 38.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com as formas de realização acima, em que o ligador hidrofílicocompreende pelo menos 5 átomos de não hidrogênio onde de 30 a 50% destessão N ou O.Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ocomponente ligado na posição 37 ou 38 compreende um componente deligação de albumina separado do peptídeo pelo ligador hidrofílico. Em umaforma de realização da invenção a lisina está na posição 38.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que o componente de ligação dealbumina é um componente lipofílico linear ou ramificado contendo de 4 a 40átomos de carbono tendo um grupo acídico distai.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ocomponente submetido acima é B-U1, onde U' é selecionado de

<formula>formula see original document page 14</formula>

m é Ο, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,η é 1, 2 ou 3

s é 0, 1, 2, ou 3,

t é O, 1,2, 3, ou 4

pé 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, ou 23;

e onde B é um grupo acídico selecionado de

<formula>formula see original document page 15</formula>

onde 1 é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, que é umcomposto de fórmula I (SEQ ID No. 2):

Xaa7-Xaa3-Glu-Gty-Thr-Phe-Thr-Sef-Asf^Xaa^-Ser-Xaa.g-Xaa^-Xaa^^lij-Xaaje-

q

Xââ^-Ala-Xaa^-Xaa^-Xa^-Phe-lle-Xaa^-Tip-Leu-Xà^ —z

histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina,homoistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina,α-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina

Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, II, Thr, Ser, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico,ácido (1-aminociclo-heptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil)carboxílico;

Xaai6 é Val ou Leu;

B-

<formula>formula see original document page 15</formula>

em que

Xaa7 é L-histidina, imidazopropionila, α-hidróxi-histidina, D-Xaaig é Ser, Lys ou Arg;Xaa19 é Tyr ou Gln;Xaa2o é Leu ou Met;Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;

Xaa25 é Ala ou Vai;Xaa26 é Lys, Glu ou Arg;Xaa27 é Glu ou Leu;Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;Xaa33 é Val ou Lis;

Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;Xaa35 é GIy ou Aib;

Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou está ausente;Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Asn ou está ausente;Se Xaa36 ou Xaa37 está ausente, o aminoácido C-terminal é

lisina como mencionado na fórmula acima.Z é OH ou NH2

U' é um espaçador selecionado de

<formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 17</formula>

m é 0, I5 2, 3, 4, 5, ou 6,η é 1, 2 ou 3s é O, 1, 2, ou 3,té O, 1,2, 3, ou 4

ρ é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22, ou 23;

onde I é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20

Em uma forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I é Aib8, Arg2634-GLP-1 (7-37)Lys, Aib8'22,Arg2634-GLP-I (7-37)Lys, ouGly85Arg2634GLP-1 -(7-3 7)Ly s.

Em uma outra forma de realização a invenção diz respeito aum composto de fórmula II (Seq. id. No. 3)

<formula>formula see original document page 17</formula>

Fórmula IIA fórmula II é idêntica à fórmula I como mencionado em umaforma de realização acima, onde o componente B-U é substituído por B-U'. Adiferença sendo apenas a incorporação do grupo de carbóxi no U' em relaçãoao U, que está sem o grupo de carbóxi de ligação.

Na fórmula II cada um dos Xaa1S possui o seguinte significado:Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina, homoistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, α-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina;

Xaa é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido (1-

aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico,ácido (1-aminociclo-heptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil)carboxílico;

Xaa16 é Val ou Leu;

Xaa18 é Ser, Lys ou Arg;

Xaa19 é Tyr ou Gln;

Xaa2O e Leu ou Met;

Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;

Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;

Xaa25 é Ala ou Vai;

Xaa26 é Lys, Glu ou Arg;

Xaa27 é Glu ou Leu;

Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;

Xaa33 é Val ou Lys;

Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;

Xaa35 é Gly ou Aib;

Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou está ausente;

Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou está ausente;Z é OH ou NH2

U é um espaçador selecionado de

<formula>formula see original document page 19</formula>

onde η for 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 181 é 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18,

m é O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,

s é O, 1, 2, ou 3,

ρ é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, ou 23

B é um grupo acídico selecionado dehv ho-v

<formula>formula see original document page 19</formula>

Em uma outra forma de realização da invenção U é

<formula>formula see original document page 19</formula>

em que 1 é 14, 15 ou 16

n é 15, 16, 17 ou 18,

p é 3, 7, 11 ou 24Nas formas de realização abaixo quando se refere ao U' nafórmula I deve ser compreendido como também se referindo à fórmula II e U,com a única diferença sendo o grupo de carbóxi.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com as formas de realização acima, em que U' é selecionado de

<formula>formula see original document page 20</formula>

m é 2, 3, 4 ou 5,η é 1 ou 2s é O, 1, ou 2,t é O, 1, 2, ou 3pé 1,2,3,4, 7, 11 ou 23

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com as formas de realização acima, em que B-U'- é<formula>formula see original document page 21</formula>

onde 1 for 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;pé 1,2,3,4, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12;s é 0, 1 ou 2t é 0 ou 1;

Uma forma de realização de acordo com o acima em queonde Ifor 14, 15, 16, 17 ou 18ρ é 1, 2, 3, 4 ou 11;s é 0, 1 ou 2;t é 0 ou 1;

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que B-U' é

<formula>formula see original document page 22</formula>

onde i for 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;pé 1, 2, 3, ou 4.s é O, 1 ou 2η é O, 1 ou 2

Uma forma de realização de acordo com qualquer uma dasformas de realização acima é em que B é

<formula>formula see original document page 22</formula>

elé 14, 16, 18 ou 20;

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que B é

<formula>formula see original document page 22</formula>

onde 1 é 14, 15, ou 16Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que s é 1.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que η é 1.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que I é 14, 15ou 16; Nas formas de realização 1 é 17, 18, 19 ou 20. Nas formas derealização 1 é 15, 16 ou 17. Nas formas de realização 1 é 18, 19 ou 20. Nasformas de realização 1 é 14. Nas formas de realização 1 é 16. Nas formas derealização 1 é 18. Nas formas de realização 1 é 20.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ρ é 1.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ρ é 2.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ρ é 3.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ρ é 4.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que B-U' é<formula>formula see original document page 24</formula>

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que B-U' é

<formula>formula see original document page 24</formula>

Em outra forma de realização da invenção a fórmula I ou afórmula II é definida por

Xaa7 é His ou desamino-histidina,

Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys ou Aib; Xaai6 é Vai; Xaa]8é Ser; Xaai9 é Tyr; Xaa2O é Leu; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gln ou Glu;Xaa25 é Ala; Xaa26 é Lys ou Arg; Xaa27 é Glu; Xaa30 é Ala ou Glu; Xaa33 éVai; Xaa34 é Lys ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg, Lys, ou estáausente; Xaa37 é Gly, Asn ou está ausente; Z é OH ou NH2

Em uma outra forma de realização da invenção a fórmula I ouII é definida porXaa7 é His; Xaag é Aib; Xaai6 é Vai; Xaaig é Ser; Xaai9 é Tyr;Xaa2O é Leu; Xaa22 é Gly; Xaa23 é Gln; Xaa25 é Ala; Xaa26 é Arg; Xaa27 é Glu;Xaa3o é Ala; Xaa33 é Vai; Xaa34 é Arg; Xaa35 é Gly; Xaa36 é Arg; Xaa37 é Gly;Zé OH OuNH2;

Em uma forma de realização da invençãoXaa7 é His; Xaa8 é Aib; Xaa]6 é Vai; Xaaj8 é Ser; Xaaj9 é Tyr;Xaa20 é Leu; Xaa22 é Gly; Xaa23 é Gln; Xaa25 é Ala; Xaa26 é Arg; Xaa27 é Glu;Xaa30 é Ala; Xaa33 é Vai; Xaa34 é Arg; Xaa35 é Gly; Xaa36 é Arg; Xaa37 é Asn;Z é OH ou NH2;

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-I compreende uma modificação do L-histidina N-terminal naposição 7 da seqüência de GLP-I (7-37).

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-Icompreende imidazopropionil , α-hidróxi-histidina ou N-metil-histidina , D-histidina , desamino-histidina , 2-amino-histidina , β-hidróxi-histidina ,homoistidina7, Na-acetil-histidina7, α-fluorometil-histidina7, a-metil-histidina , 3-piridilalanina , 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina .

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-1 compreende uma substituição da L-alanina na posição 8 daseqüência de GLP-I (7-37) por outro resíduo de aminoácido.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-Icompreende Aib8, Gly8, Val8, Ile8, Leu8, Ser8, Thr8, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico,ácido (1-aminociclo-heptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil)carboxílico.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-1 compreende Aib ;

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-I compreende não mais do que quinze resíduos deaminoácido que foram trocados, adicionados ou anulados quando comparadoao GLP-I (7-37) (SEQ ID No. 1).

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que não mais do que dezresíduos de aminoácido que foram traçados, adicionados ou anulados quandocomparado ao GLP-I (7-37) (SEQ ID No. 1).

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-Icompreende não mais do que seis resíduos de aminoácido que foram trocados,adicionados ou anulados quando comparado ao GLP-I (7-37) (SEQ ID No. 1).

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-1 compreende não mais do que 3 resíduos de aminoácido quenão são codificados pelo código genético.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-I compreende apenas um resíduo de lisina.

Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-I deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, que éSEOTrTSD V SS YL. EBOAAHEF I AWLVRSRa.Lyse38((4- {[N-(2-carboxietil)-N-(l 5-carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil) [Gly8;Arg26,34;Lys38]GLP-l-(7-37) peptídeo,

<formula>formula see original document page 27</formula>

[Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-carbóxi-heptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino] etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi] etóxi)acetil] -OH,

<formula>formula see original document page 27</formula><formula>formula see original document page 28</formula>

Em uma outra forma de realização da invenção dito diácido éum ácido dicarboxílico.Em uma outra forma de realização da invenção o grupo deacilação é um ácido alcano α,ω-dicarboxílico de cadeia reta ou ramificada.

Em uma outra forma de realização da invenção o grupo deacilação possui a estrutura HOOC-(CH2)nCO-, em que η é de 12 a 20.

Em uma outra forma de realização da invenção o grupo deacilação possui uma estrutura selecionada de HOOC-(CH2)i4CO-, HOOC-(CH2)15CO-, HOOC-(CH2)16CO-, HOOC-(CH2)17CO-, e HOOC-(CH2)18CO-.

Em uma outra forma de realização da invenção o grupo deacilação possui a estrutura HOOC-(CH2)16CO-.

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende um modificação da L-histidina N-terminal na posição 7da seqüência de GLP-I (7-37). Esta modificação confere estabilidadeaumentada contra a degradação pela enzima DPPIV, por exemplo, umaestabilização de DPPIV.

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende imidazopropionil , α-hidróxi-histidina ou N-metil-histidina .

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende D-histidina , desamino-histidina , 2-amino-histidina , β-hidróxi-histidina7, homoistidina7, Na-acetil-histidina7, a-fluorometil-histidina , α-metil-histidina , 3-piridilalanina , 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina .

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende uma substituição da L-alanina na posição 8 da seqüênciade GLP-I (7-37) por outro resíduo de aminoácido.

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende Aib8, Gly8, Val8, Ile8, Leu8, Ser8 ou Thr8.

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende uma substituição da L-alanina na posição 8 da seqüênciade GLP-I (7-37) para o ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-heptil) carboxílico, ouácido (1-aminociclooctil) carboxílico.

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende não mais do que quinze resíduos de aminoácido queforam trocados, adicionados ou anulados quando comparados ao GLP-I (7-37) (SEQ ID No. 1), ou não mais do que dez resíduos de aminoácido queforam trocados, adicionados ou anulados quando comparados ao GLP-I (7-37) (SEQ ID No. 1).

Em mais uma outra forma de realização da invenção ditoanálogo de GLP-I compreende não mais do que seis resíduos de aminoácidoque foram trocados, adicionados ou anulados quando comparados com oGLP-I (7-37) (SEQ ID No. 1).

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende não mais do que 3 resíduos de aminoácido que não sãocodificados pelo código genético.

Em uma outra forma de realização da invenção dito análogo deGLP-I compreende apenas um resíduo de lisina.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a ummétodo para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo deGLP-1, caracterizado em acilar dito análogo de GLP-I com um diácido noresíduo de lisina na posição 37 ou 38 de dito análogo de GLP-1.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a ummétodo para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo deGLP-I para mais do que cerca de 40 horas, caracterizado em modificar pelomenos um dos resíduos de aminoácido nas posições 7 e 8 de um peptídeoGLP-I (7-37)Lys ou um análogo deste, e acilar o resíduo de aminoácidoLys38 C-terminal do análogo de GLP-I com um diácido através de umespaçador hidrofílico.

Uma forma de realização fornece uma composiçãofarmacêutica que compreende um composto de acordo com qualquer uma dasformas de realização acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Uma forma de realização fornece uma composiçãofarmacêutica de acordo com a forma de realização acima, que é adequadapara a administração parenteral.

Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento.

Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia,diabetes tipo 2, tolerância a glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade,hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, aterosclerose,infarto do miocárdio, doença cardíaca coronariana e outros distúrbioscardiovasculares, acidente vascular cerebral, síndrome intestinal inflamatória,dispepsia e úlceras gástricas.

Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento para o retardo ou prevenção do progresso da doença emdiabetes tipo 2.

Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para preparação deum medicamento para a diminuição da captação de alimento, diminuição daapoptose de β-célula, aumento da função β-celular e massa β-celular, e/oupara a restauração da sensibilidade a glicose para as β-células.

Um outro objetivo da presente invenção é fornecer umaformulação farmacêutica que compreende um composto de acordo com apresente invenção que está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 25mg/ml, e em que dita formulação possui um pH de 3,0 a 9,0. A formulaçãopode ainda compreender um sistema tampão, conservante(s), agente(s) detonicidade, agente(s) de quelação, estabilizantes e tensoativos. Em uma formade realização da invenção a formulação farmacêutica é uma formulaçãoaquosa, isto é, formulação compreendendo água. Tal formulação étipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma outra forma derealização da invenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. Otermo "formulação aquosa" é definido como uma formulação quecompreende pelo menos 50% p/p de água. Da mesma maneira, o termo"solução aquosa" é definido como uma solução que compreende pelo menos50% p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como umasuspensão que compreende pelo menos 50% p/p de água.

Em uma outra forma de realização a formulação farmacêuticaé uma formulação secada por congelamento, ao qual o médico ou o pacienteadiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

Em uma outra forma de realização a formulação farmacêuticaé uma formulação seca (por exemplo, secada por congelamento ou secada porpulverização) pronta par uso sem qualquer dissolução anterior.

Em um outro aspecto a invenção diz respeito à um formulaçãofarmacêutica que compreende uma solução aquosa de um composto de acordocom a presente invenção, e um tampão, em que dito composto está presenteem uma concentração de 0,1 mg/ml ou acima, e em que dita formulaçãopossui um pH de cerca de 3,0 a cerca de 9,0.

Em uma outra forma de realização da invenção o pH daformulação é de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. Em uma outra forma derealização da invenção o pH da formulação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0.

Em uma outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cercade 5,0 a cerca de 7,5. Em uma outra forma de realização da invenção o pH daformulação é de cerca de 7,5 a cerca de 9,0. Em uma outra forma derealização da invenção o pH da formulação é de cerca de 7,5 a cerca de 8,5.Em uma outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cercade 6,0 a cerca de 7,5. Em uma outra forma de realização da invenção o pH daformulação é de cerca de 6,0 a cerca de 7,0. Em uma outra forma derealização a formulação farmacêutica é de 8,0 a 8,5.

Em uma outra forma de realização da invenção o tampão éselecionado do grupo consistindo de acetato de sódio, carbonato de sódio,citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogênio fosfatode sódio, hidrogênio fosfato de dissódio, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácidofumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um destestampões específicos constitui uma forma de realização alternativa dainvenção.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãoainda compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Em umaoutra forma de realização da invenção o conservante é selecionado do grupoconsistindo de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato demetila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato debutila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol,ácido benzóico, imiduréia, cloroexidina, deidroacetato de sódio, clorocresol,p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-l,2-diol) ou misturas destes. Em uma forma de realizaçãoo conservante é fenol ou m-cresol. Em uma outra forma de realização dainvenção o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante estápresente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma outra formade realização da invenção o conservante está presente em um concentração de5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção oconservante está presente em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml.Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma de realizaçãoalternativa da invenção. O uso de um conservante em composiçõesfarmacêuticas é bem conhecido a uma pessoa versada. Por conveniênciareferência é feita à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19thedition, 1995.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãoainda compreende um agente isotônico. Em uma outra forma de realização dainvenção o agente isotônico é selecionado do grupo consistindo de um sal(por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, umaminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina,ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol(glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo, PEG400), ou misturas destes. Emuma forma de realização o agente de isotonicidade é propilenoglicol.

Qualquer açúcar tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanossolúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose,xilose, maltose, lactose, sucrose, trealose, dextrano, pululan, dextrina,ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietila e carboximetilcelulose-Napodem ser usados. Em uma forma de realização o aditivo de açúcar é sucrose.

O álcool de açúcar é definido como um C4-C8 hidrocarboneto tendo pelomenos um grupo de -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol,galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma forma de realização o aditivo deálcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionadosacima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não existenenhum limite fixado para a quantidade usada, contanto que o açúcar ouálcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não adversamente afeteos efeitos de estabilização obtidos usando os métodos da invenção. Em umaforma de realização, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar está entrecerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma outra forma de realização dainvenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a50 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônicoestá presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma forma derealização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentraçãode 5 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção oagente isotônico está presente em uma concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml.

Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônico estápresente em uma concentração de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destesagentes isotônicos específicos constitui uma forma de realização alternativada invenção. O use de um agente isotônico em composições farmacêuticas ébem conhecido da pessoa versada. Por conveniência referência é feita àRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãoainda compreende um agente de quelação. Em uma outra forma de realizaçãoda invenção o agente de quelação é selecionado de sais de ácidoetilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido cítrico, e ácido aspártico, emisturas destes. Em uma outra forma de realização da invenção o agente dequelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5mg/ml. Em umaoutra forma de realização da invenção o agente de quelação está presente emuma concentração de 0,1 mg/ml a 2mg/ml. Em uma outra forma de realizaçãoda invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de2mg/ml a 5mg/ml. Cada um destes agentes de quelação específicos constituiuma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente dequelação nas composições farmacêuticas é bem conhecido da pessoa versada.Por conveniência referência é feita à Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 19th edition, 1995.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãoainda compreende um estabilizante. O uso de um estabilizante nascomposições farmacêuticas é bem conhecido da pessoa versada. Porconveniência referência é feita à Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 19th edition, 1995.

Mais particularmente, as composições da invenção sãocomposições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentesterapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmenteapresenta formação de agregados durante a armazenagem em formulaçõesfarmacêuticas líquidas. Por "formação de agregados" é planejada umainteração física entre as moléculas de polipeptídeo que resulta na formação deoligômeros, que podem permanecer solúveis, ou agregados visíveis grandesque se precipitam da solução. Por "durante a armazenagem" é planejada umacomposição ou formulação farmacêutica líquida assim que preparada, não éimediatamente administrada a um indivíduo. De preferência, seguinte apreparação, é acondicionada para armazenagem, ou em uma forma líquida,em um estado congelado, ou em uma forma seca para posterior reconstituiçãoem uma forma líquida ou outra forma adequada para administração a umindivíduo. Por "forma seca" é planejada a composição ou formulaçãofarmacêutica líquida ser secada ou por secagem por congelamento (isto é,liofilização; ver, por exemplo, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sei.Technol. 38:48-59), secagem por pulverização (ver Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.),pp. 491 - 676; Broadhead et al. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1 169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou secagem porar (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991)Biopharm. 4:47-53). A formação de agregado por um polipeptídeo durante aarmazenagem de uma composição farmacêutica líquida pode adversamenteafetar a atividade biológica deste polipeptídeo, resultando na perda de eficáciaterapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregadopode causar outros problemas tais como bloqueio da tubulação, membranas,ou bombas quando a composição farmacêutica contendo polipeptídeo foradministrada usando um sistema de infusão.

As composições farmacêuticas da invenção podem aindacompreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente paradiminuir a formação de agregados pelo polipeptídeo durante a armazenagemda composição. Por "base de aminoácido" é planejado um aminoácido ou umacombinação de aminoácidos, onde qualquer dado aminoácido está presente ouem sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Onde uma combinação deaminoácidos for usada, todos os aminoácidos podem estar presentes em suasformas de base livre, todos podem estar presentes em suas formas de sal, oualguns podem estar presentes em suas formas de base livre enquanto outrosestão presentes em suas formas de sal. Em uma forma de realização, osaminoácidos utilizados na preparação das composições da invenção sãoaqueles que carregam uma cadeia lateral carregada, tal como arginina, lisina,ácido aspártico, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, L, D, ouuma mistura destes) de um aminoácido particular (por exemplo, metionina,histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano,treonina e misturas destes) ou combinações destes estereoisômeros, pode estarpresente nas composições farmacêuticas da invenção contanto que oaminoácido particular esteja presente ou em sua forma de base livre ou suaforma de sal. Em uma forma de realização o L-estereoisômero é usado. Ascomposições da invenção podem também ser formuladas com análogos destesaminoácidos. Por "análogo de aminoácido" é planejado um derivado doaminoácido de ocorrência natural que realiza o efeito desejado de diminuiçãoda formação de agregados pelo polipeptídeo durante a armazenagem dascomposições farmacêuticas líquidas da invenção. Os análogos de argininaadequados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina, os análogos de metionina adequados incluem etionina e butionina eanálogos de cisteína adequados incluem S-metil-L cisteína. Tal como com osoutros aminoácidos, os análogos de aminoácido são incorporados nascomposições em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma outraforma de realização da invenção os aminoácidos ou análogos de aminoácidosão usados em uma concentração, que é suficiente para impedir ou retardar aagregação da proteína. Em uma outra forma de realização da invençãometionina (ou outros aminoácidos ou análogos de aminoácido sulfóricos)pode ser adicionada para inibir a oxidação dos resíduos de metionina nosulfóxido de metionina quando o polipeptídeo que atua como o agenteterapêutico for um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo demetionina suscetível a tal oxidação. Por "inibir" é planejado o acúmulomínimo de espécies oxidadas por metionina durante um tempo. A inibição daoxidação de metionina resulta em maior retenção do polipeptídeo em suaprópria forma molecular. Qualquer estereoisômero de metionina (L ou D) oucombinações destes podem ser usados. A quantidade a ser adicionada deve seruma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina talque a quantidade de sulfóxido de metionina é aceitável pelas agênciasreguladoras. Tipicamente, isto significa que a composição contém não maisdo que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente,isto pode ser obtido pela adição de metionina tal que a relação de metioninaadicionada para resíduos de metionina varia de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1,tal como 10:1 a cerca de 100:1.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãoainda compreende um estabilizante selecionado do grupo de polímeros depeso molecular elevado ou compostos moleculares inferiores. Em uma outraforma de realização da invenção o estabilizante é selecionado de polietilenoglicol (por exemplo, PEG 3350), álcool polivinílico (PV A),polivinilpirrolidona, carbóxi- /hidroxicelulose ou derivados destes (porexemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substânciascontendo enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol,e diferentes sais (por exemplo, cloreto de sódio). Cada um destesestabilizantes específicos constitui uma forma de realização alternativa dainvenção.

As composições farmacêuticas podem também compreenderagentes estabilizantes adicionais, que ainda intensificam a estabilidade de umpolipeptídeo terapeuticamente ativo nelas. Os agentes estabilizantes deinteresse particular para a presente invenção incluem, mas não são limitados aeles, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra a oxidação demetionina, e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contra aagregação associada com o congelamento-descongelamento ou cisalhamentomecânico. Em uma outra forma de realização da invenção a formulação aindacompreende um tensoativo. Em uma outra forma de realização da invenção acomposição farmacêutica compreende dois tensoativos diferentes. O termo"Tensoativo" como aqui usado se refere a quaisquer moléculas ou íons quesão compreendidos de uma parte solúvel em água (hidrófila), a parte superior,e um segmento solúvel em gordura (lipofílica). Os tensoativos se acumulampreferivelmente em interfaces, em que a parte hidrófila é orientada em direçãoà água (fase hidrófila) e a parte lipofílica em direção à fase oleosa ouhidrofóbica (isto é, vidro, ar, óleo etc.). A concentração em que os tensoativoscomeçam a formar micelas é conhecida como a concentração de micela críticaou CMC. Além disso, os tensoativos diminuem a tensão superficial de umlíquido. Os tensoativos são também conhecidos como compostos anfipáticos.O termo "Detergente" é um sinônimo usado para tensoativos em geral.

Os tensoativos aniônicos podem ser selecionados do grupo de:ácido quenodeoxicólico, sal de sódio de ácido quenodeoxicólico, ácidoCólico, ácido Deidrocólico, ácido Deoxicóolico, éster metílico de ácidoDeoxicólico, Digitonina, Digitoxigenina, N,N-Dimetildodecilamina N-óxido,Docusato sódio, ácido Glicoquenodeoxicólico sódico, hidrato de ácidoGlicocólico, moniidrato de ácido Glícodeoxicólico, sal de sódio de ácidoGlicodeoxicólico, sal de sódio de ácido Glicodeoxicólico, sal de 3-sulfatodissódio de ácido Glicolitocólico, éster etílico de ácido Glicolitocólico, sal desódio N-Lauroil sarcosina, sal de N-Lauroilsarcosina sódico, N-Lauroilsarcosina, N-Lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, Lugol, sal desódio de ácido 1-Octanossulfônico, sal de sódio de ácido 1-Octanossulfônico,1-butanossulfonato de sódio, 1-decanossulfonato de sódio, 1-dodecanossulfonato de sódio, 1-heptanossulfonato de sódio, 1-heptanossulfonato de sódio, 1-nonanossulfonato de sódio, 1-propanossulfonato monoidrato de sódio, 2-bromoetanossulfonato de sódio,coleato hidrato de sódio, bílis de boi ou ovelha, coleato hidrato de sódio,coleato de sódio, deoxicoleato de sódio, dodecil sulfato de sódio, dodecilsulfato de sódio, hexanossulfonato de sódio, octil sulfato de sódio,pentanossulfonato de sódio, taurocoleato de sódio, sal de sódio de ácidotauroquenodeoxicólico, moniidrato de sal de sódio de ácido taurodeoxicólico,sal de 3-sulfato dissódio de ácido Taurolitocólico, sal de sódio de ácidoTauroursodeoxicólico, Trizma® dodecil sulfato, DSS (docusato sódico, CASregistry no [577-11-7]), docusato cálcio, CAS registry no [128-49-4]),docusato potássio, CAS registry no [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato desódio ou lauril sulfato de sódio), Dodecilfosfocolina (FOS-Cholina-12),Decilfosfocolina (FOS-Choline-lO), Nonilfosfocolina (FOS-Choline-9), ácidodipalmitoil fosfatídico, caprilato de sódio, e/ou ácido Ursodeoxicóolico.

Os tensoativos catiônicos podem ser selecionados do grupo de:brometo de Alquiltrimetilamônio, cloreto de Benzalcônio, cloreto deBenzalcônio, cloreto de Benzildimetilexadecilamônio, cloreto deBenzildimetiltetradecilamônio, tetracloroiodato de Benziltrimetilamônio,brometo de Dimetildioctadecilamônio, brometo de Dodeciletildimetilamônio,brometo de Dodeciltrimetilamônio, brometo de Dodeciltrimetilamônio,brometo de Etilexadecildimetilamônio, brometo de Hexadeciltrimetilamônio,brometo de Hexadeciltrimetilamônio, Polioxietileno(10)-N-sebo-l,3-diaminopropano, brometo de Tonzônio, e/ou brometo deTrimetil(tetradecil)amônio.

Os tensoativos não iônicos podem ser selecionados do grupode: BigCHAP, Bis(polietileno glicol bis[imidazoil carbonil]), copolímeros debloco como copolímeros de bloco de polietilenoóxido/polipropilenoóxido taiscomo poloxâmeros, poloxâmero 188 e poloxâmero 407, Brij®35, Brij®56,Brij®72, Brij®76, Brij®92V, Brij®97, Brij®58P, Cremophor®EL, étermonododecílico de Decaetileno glicol, N-Decanoil-N-metilglucamina, n-Dodecanoil-N-metilglucamida, alquil-poliglucosídeos, óleo de mamonaetoxilado, éter monodecílico de Heptaetileno glicol, éter monododecílico deHeptaetileno glicol, éter monotetradecílico de Heptaetileno glicol, étermonododecílico de Hexaetileno glicol, éter monoexadecílico de Hexaetilenoglicol, éter monooctadecílico de Hexaetileno glicol, éter monotetradecílico deHexaetileno glicol, Igepal CA-630, Igepal CA-630, Metil-6-0-(N-heptilcarbamoil)-beta-D-glucopiranosídeo, éter monododecílico deNonaetileno glicol, N-Nonanoil-N-metilglucamina, N-Nonanoil-N-metilglucamina, éter monodecílico de Octaetileno glicol, éter monododecílicode Octaetileno glicol, éter monoexadecílico de Octaetileno glicol, étermonooctadecílico de Octaetileno glicol, éter monotetradecílico de Octaetilenoglicol, Octil-β-D-glucopiranosídeo, éter monodecílico de Pentaetileno glicol,éter monododecílico de Pentaetileno glicol, éter monoexadecílico dePentaetileno glicol, éter monoexílico de Pentaetileno glicol, étermonooctadecílico de Pentaetileno glicol, éter monooctílico de Pentaetilenoglicol, éter diglicidílico de Polietileno glicol, Polietileno glicol éter W-1, éterPolioxietileno 10 tridecílico, estearato de Polioxietileno 100, éterPolioxietileno 20 isoexadecílico, éter Polioxietileno 20 oleílico, estearato dePolioxietileno 40, estearato de Polioxietileno 50, estearato de Polioxietileno 8,Polioxietileno bis(imidazolil carbonil), estearato de Polioxietileno 25propileno glicol, Saponina de Quillaja bark, Span® 20, Span® 40, Span® 60,Span® 65, Span® 80, Span® 85, Tergitol, Tipo 15-S-12, Tergitol, Tipo 15-S-30, Tergitol, Tipo 15-S-5, Tergitol, Tipo 15-S-7, Tergitol, Tipo 15-S-9,Tergitol, Tipo NP-10, Tergitol, Tipo NP-4, Tergitol, Tipo NP-40, Tergitol,Tipo NP-7, Tergitol, Tipo NP-9, Tetradecil-P-D-maltosídeo, éter Tetraetilenoglicol monodecílico, éter Tetraetileno glicol monododecílico, éter Tetraetilenoglicol monotetradecílico, éter Trietileno glicol monodecílico, éter Trietilenoglicol monododecílico, éter Trietileno glicol monoexadecílico, éter Trietilenoglicol monooctílico, éter Trietileno glicol monotetradecílico, Triton CF-21,Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15,Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, TritonX-200, Triton X-207, Triton® X-100, Triton® X-114, Triton® X-165solução, Triton® X-305 solução, Triton® X-405, Triton® X-45, Triton® X-705-70, TWEEN® 20, TWEEN® 40, TWEEN® 60, TWEEN® 6, TWEEN®65, TWEEN® 80, TWEEN® 81, TWEEN® 85, Tiloxapol,esfingofosfolipídeos (esfingomielina), e esfingoglicolipídeos (ceramidas,gangliosídeos), fosfolipídeos, e/ou n-Undecil β-D-glucopiranoside.

Os tensoativos zwitteriônicos podem ser selecionados dogrupo de: CHAPS, CHAPSO, sal interno de 3-(Decildimetilamônio)propanossulfonato, sal interno de 3-(Dodecildimetilamônio)-propanossulfonato, sal interno de 3-(Dodecildimetilamônio)propanossulfonato, 3-(N,N-Dimetilmiristilamônio)propanossulfonato, 3 -(N,N-Dimetiloctadecilamônio)-propanossulfonato, sal interno de 3-(N,N-Dimetiloctilamônio)propanossulfonato, 3 -(N,N-Dimetilpalmitilamônio)propanossulfonato, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1 -propanossulfonatos, 3-colamido-1 -propildimetilamônio-1 -propanossulfonato,Dodecilfosfocolina, miristoil lisofosfatidilcolina, Zwittergent 3-12 (N-dodecil-N,N-dimetil-3-amônio-l -propanossulfonato), Zwittergent 3-10 (salinterno de 3-(Decildimetilamônio)-propanossulfonato), Zwittergent 3-08 (3-(Octildimetilamônio)propanossulfonato), glicerofosfolipídeos (lecitinas,cefalinas, fosfatidil serina), gliceroglicolipídeos (galactopiranosídeo), alquila,alcóxil (éster alquílico), alcóxi (éter alquílico)- derivados de lisofosfatidila efosfatidilcolinas, por exemplo, derivados de lauroíla e miristoíla delisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do gruposuperior polar, que é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas,treoninas, glicerol, inositol, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina,acilcarnitinas e derivados, derivados Nbeta-acilados de lisina, arginina ouhistidina, ou derivados acilados de cadeia lateral de lisina ou arginina,derivados Nbeta-acilados de dipeptídeos compreendendo qualquer combinaçãode lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou acídico, derivadoNbeta-acilado de um tripeptídeo que compreende qualquer combinação de umaminoácido neutro e dois aminoácidos, ou o tensoativo pode ser selecionadodo grupo de derivados de imidazolina, ácidos graxos de cadeia longa e saisdestes Ce-Cj2 (por exemplo, ácido oléico e ácido caprílico), N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-l-propanossulfonato, tensoativos aniônicos (alquil-aril-sulfonatos) monovalente, palmitoil lisofosfatidil-L-serina,lisofosfolipídeos (por exemplo, ésteres l-acil-sn-glicero-3-fosfato deetanolamina, colina, serina ou treonina), ou misturas destes.

O termo "alquil-poliglucosídeos" como aqui usado se refere auma cadeia de C5.20 alquila, alquenila ou alquinila reta ou ramificada que ésubstituída por um ou mais componentes de glicosídeo tais como maltosídeo,sacarídeo etc. As formas de realização destes alquil-poliglucosídeos incluemCó-is alquil-poliglicosídeos. As formas de realização específicas destes alquil-poliglicosídeos incluem as mesmas cadeias de carbono numeradas tais comocadeia de alquila C6, C8, Ci0, Ci2, Ci4, Cj6, Ci8 e C20. As formas de realizaçãoespecíficas dos componentes de glicosídeo incluem piranosídeo,glucopiranosídeo, maltosídeo, maltotriosídeo e sacarose. Nas formas derealização da invenção menos do que 6 componentes de glicosídeo sãoligados no grupo de alquila. Nas formas de realização da invenção menos doque 5 componentes de glicosídeo são ligados ao grupo de alquila. Nas formasde realização da invenção menos do que 4 componentes de glicosídeo sãoligados ao grupo de alquila. Nas formas de realização da invenção menos doque 3 componentes de glicosídeo são ligados ao grupo de alquila. Nas formasde realização da invenção menos do que 2 componentes de glicosídeo sãoligados ao grupo de alquila. As formas de realização específicas de alquil-poliglicosídeos são glicosídeos de alquila tais como n-decil β-D-glicopiranosídeo, decil β-D-maltopiranosídeo, dodecil β-D-glicopiranosídeo,n-dodecil β-D-maltosídeo, n-dodecil β-D-maltosídeo, n-dodecil β-D-maltosídeo, tetradecil β-D-glicopiranosídeo, decil β-D-maltosídeo, hexadecilβ-D-maltosídeo, decil β-D-maltotriosídeo, dodecil β-D-maltotriosídeo,tetradecil β-D-maltotriosídeo, hexadecil β-D-maltotriosídeo, n-dodecil-sacarose, n-decil-sacarose, monocaprato de sacarose, monolaurato desacarose, monomiristato de sacarose, e monopalmitato de sacarose.

O uso de um tensoativo nas composições farmacêuticas é bemconhecido da pessoa versada. Por conveniência referência é feita àRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãoainda compreende inibidores da protease tais como EDTA (ácidoetilenodiamina tetraacético) e benzamidinaHCl, mas outros inibidores daprotease comercialmente disponíveis podem também ser usados. O uso de uminibidor da protease é particularmente útil nas composições farmacêuticascompreendendo zimogênios de proteases de modo a inibir a autocatálise.

E possível que outros ingredientes possam estar presentes naformulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Tais ingredientesadicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes,agentes de volume, modificadores da tonicidade, agentes de quelação, íons demetal, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de sorohumano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um aminoácidotal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Taisingredientes adicionais, naturalmente, não devem adversamente afetar aestabilidade total da formulação farmacêutica da presente invenção.

As composições farmacêuticas contendo um composto deacordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente comnecessidade de tal tratamento em vários sítios, por exemplo, em sítios tópicos,por exemplo, pele e sítios da mucosa, em sítios que desviam a absorção, porexemplo, administração em um artéria, em um veia, no coração, e em sítiosque envolvem a absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele, emum músculo ou no abdome. A administração das composições farmacêuticasde acordo com a invenção podem ser através de várias vias de administração,por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago eintestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos brônquios e alvéolos ouuma combinação destes, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal,ocular, por exemplo, através da conjuntiva, uretra, e parenteral para pacientescom necessidade de um tal tratamento.

As composições da invenção corrente podem ser administradasem várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões,emulsões, microemulsões, múltiplas emulsões, espumas, pomadas, pastas,emplastros, ungüentos, tabletes, tabletes revestidos, bochechos, cápsulas, porexemplo, cápsulas de gelatina sólidas e cápsulas de gelatina macias,supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, pulverizadores, pós, aerossóis,inalantes, colírios, ungüentos oftálmicos, enxágües oftálmicos, pessáriosvaginais, anéis vaginais, ungüentos vaginais, solução de injeção, soluçõestransformantes in situ, por exemplo, formação de gel in situ, colocação in situ,precipitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão, e implantes.

As composições da invenção podem ainda ser combinadas, ouligadas, por exemplo, através de interações covalentes, hidrofóbicas eeletrostáticas, um portador de medicamento, sistema de liberação demedicamento e sistema de liberação de medicamento avançado de modo aainda intensificar a estabilidade do composto da presente invenção, aumentara biodisponibilidade, aumentar a solubilidade, diminuir os efeitos adversos,alcançar a cronoterapia bem conhecida por aqueles versados na técnica, eaumentar a obediência do paciente ou qualquer combinação destes. Exemplosde portadores, sistemas de liberação de medicamento e sistemas de liberaçãode medicamento avançados incluem, mas não são limitados a eles, polímeros,por exemplo, celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo, dextrano ederivados, amido e derivados, poli(álcool vinílico), polímeros de acrilato emetacrilato, ácido poliláctico e poliglicólico e co-polímeros de bloco destes,polietileno glicóis, proteínas portadoras, por exemplo, albumina, géis, porexemplo, sistemas de termo-formação de gel, por exemplo sistemas co-poliméricos de bloco bem conhecidos por aqueles qualificados na técnica,micelas, lipossomas, microsferas, nanoparticulados, cristais líquidos edispersões destes, L2 fase e dispersões destes, bem conhecidos por aquelesqualificados na técnica de comportamento de fase em sistemas de lipídeo-água, micelas poliméricas, múltiplas emulsões, auto-emulsificantes, auto-microemulsificantes, ciclodextrinas e derivados destes, e dendrímeros.

As composições da corrente invenção são úteis na formulaçãode sólidos, semi-sólidos, pó e soluções para a administração pulmonar decompostos da presente invenção, usando, por exemplo, um inalador de dosemedida, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bemconhecidos por aqueles qualificados na técnica.

As composições da corrente invenção são especificamenteúteis na formulação de sistemas de liberação de medicamento de dispensacontrolada, prolongada, protelada, retardada e lenta. Mais especificamente,mas não limitado, as composições são úteis na formulação de sistemas deliberação controlada e liberação prolongada parenteral (ambos os sistemaslevando a uma redução de muitas vezes no número de administrações), bemconhecidos por aqueles versados na técnica. Ainda mais preferivelmente, sãoos sistemas de liberação controlada e liberação prolongada administradossubcutaneamente. Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sistema ecomposições de liberação controlada úteis são hidrogéis, géis oleaginosos,cristais líquidos, micelas poliméricas, microsferas, nanopartícuias. Osmétodos para produzir sistemas de liberação controlada úteis paracomposições da invenção corrente incluem, mas não são limitados a eles,cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação,emulsificação, dispersão, homogeneização de alta pressão, encapsulação,secagem por pulverização, microencapsulação, coacervação, separação defase, evaporação de solvente para produzir microsferas, extrusão e processosfluidos supercríticos. Referência geral é feita à Handbook of PharmaceuticalControlled Release (Wise, D.L., ed. Mareei Dekker, New York, 2000) andDrug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation andDelivery (MacNally, E.J., ed. Mareei Dekker, New York, 2000). Aadministração parenteral pode ser executada por injeção subeutânea,intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma seringa,opcionalmente uma seringa semelhante a caneta. Alternativamente, aadministração parenteral pode ser executada por meio de uma bomba deinfusão. Uma outra opção é uma composição que pode ser uma solução oususpensão ou um pó para a administração do composto da presente invençãona forma de um líquido nasal ou pulmonar ou pulverização de pó. Como maisuma outra opção, as composições farmacêuticas contendo o composto dainvenção podem também ser adaptadas para a administração transdérmica,por exemplo, por injeção livre de agulha ou a partir de um emplastro,opcionalmente um emplastro iontoforético, ou transmucosal, por exemplo,administração bucal.

Os compostos de a presente invenção podem ser administradosatravés da via pulmonar em um veículo, como uma solução, suspensão ou póseco usando qualquer um dos tipos conhecidos de dispositivos adequados paraa liberação de medicamento pulmonar. Exemplos destes compreendem, masnão são limitados a eles, os três tipos gerais de aerossol-gerador para aliberação de medicamento pulmonar, e podem incluir nebulizadores de jato ouultra-sônicos, inaladores de dose medida, ou inaladores de pó seco (Cf. Yu J,Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects.Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).

Com base na metodologia de teste padronizado, o diâmetroaerodinâmico (da) de uma partícula é definido como o diâmetro equivalentegeométrico de uma partícula esférica padrão de referência de densidadeunitaria (1 g/cm ). No caso mais simples, para partículas esféricas, da érelacionado com um diâmetro de referência (d) como uma função da raizquadrada da relação de densidade como descrito por: Modifications to thisrelationship occur for non-spherical particles (cf. Edwards DA, Ben- Jebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porousinhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Os termos "MMAD"e "MMEAD" são bem descritos e conhecidos na técnica (cf. Edwards DA,Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of anaerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drugdelivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379-385). O diâmetro aerodinâmico médio da massa (MMAD) e o diâmetroaerodinâmico efetivo médio da massa (MMEAD) são usados de moto trocávelentre si, são parâmetros estatísticos, e empiricamente descrevem o tamanhodas partículas de aerossol em relação ao seu potencial em depositar nospulmões, independente da forma atual, tamanho, ou densidade (cf. EdwardsDA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug deliveryusing large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). OMMAD é normalmente calculado a partir da medição feita com impactadores,um instrumento que mede o comportamento inercial da partícula no ar. Emuma outra forma de realização, a formulação pode ser aerossolizada porqualquer tecnologia de aerossolização conhecida, tal como nebulização, paraobter um MMAD de partículas de aerossol menor do que 10 μηι, maispreferivelmente entre 1 a 5 μηι, e o mais preferível entre 1 a 3 μιη. O tamanhode partícula preferido se baseia no tamanho mais eficaz para a liberação demedicamento até o fundo do pulmão, onde a proteína é idealmente absorvida(cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonarydrug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385).

O depósito no fundo do pulmão das formulações pulmonaresque compreendem o composto da presente invenção pode opcionalmente serainda otimizada mediante o uso de modificações das técnicas de inalação, porexemplo, mas não limitado a elas: fluxo lento de inalação (por exemplo, 30L/min), sustentação da respiração e marcação do tempo de atuação.

O termo "formulação estabilizada" se refere a uma formulaçãocom estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ouestabilidade física e química aumentada.

O termo "estabilidade física" da formulação de proteína comoaqui usado se refere à tendência da proteína de formar agregadosbiologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado deexposição da proteína aos estresses termo-mecânicos e/ou interação cominterfaces e superfícies que são desestabilizadas, tais como superfícies einterfaces hidrofóbicas. A estabilidade física das formulações aquosas deproteína é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medições da turbidezapós a exposição da formulação enchida em recipientes adequados (porexemplo, cartuchos ou frascos) ao estresse mecânico/físico (por exemplo,agitação) em diferentes temperaturas durante vários períodos de tempo. Ainspeção visual das formulações é executada em uma luz focalizada brilhantecom um segundo plano escuro. A turbidez da formulação é caracterizada poruma contagem visual que ordena o grau de turbidez. Por exemplo, em umaescala de 0 a 3 (um formulação apresentando nenhuma turbidez corresponde auma contagem visual 0, e uma formulação apresentando turbidez visual na luzdo dia correspondes à contagem visual 3). Uma formulação é classificadainstável fisicamente com respeito à agregação de proteína, quando mostraturbidez visual na luz do dia. Alternativamente, a turbidez da formulaçãopode ser avaliada por medições de turbidez simples bem conhecidas pelapessoa versada. A estabilidade física das formulações aquosas de proteínapode também ser avaliada mediante o uso de um agente espectroscópico ousonda do status conformacional da proteína. A sonda é preferivelmente umamolécula pequena que preferencialmente se liga um adaptador não nativo daproteína. Um exemplo de uma sonda espectroscópica molecular da estruturade proteína é Tioflavina T. A Tioflavina T é uma tintura fluorescente que foiamplamente usada para a detecção de fibrilas de amilóide. Na presença defibrilas, e talvez outras configurações de proteína também, a Tioflavina T dáorigem a uma nova excitação máxima em cerca de 450 nm e emissãointensificada em cerca de 482 nm quando ligada a uma forma de proteínafibrila. A Tioflavina T não ligada é essencialmente não-fluorescente noscomprimentos de onda.

Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas dasmudanças na estrutura da proteína a partir dos estados nativos para nãonativos. Por exemplo, as sondas de "emplastro hidrofóbico" que se ligampreferencialmente aos emplastros hidrofóbicos expostos de uma proteína. Osemplastros hidrofóbicos são geralmente escondidos dentro da estruturaterciária de uma proteína em seu estado nativo, mas se tornam expostosquando uma proteína começa a desdobrar ou desnaturar. Exemplos destassondas espectroscópicas moleculares pequenas são tinturas hidrofóbicasaromáticas, tais como antraceno, acridina, fenantrolina ou coisa parecida.Outras sondas espectroscópicas são complexos de metal-aminoácido, taiscomo complexos de metal cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tais comofenilalanina, leucina, isoleucina, metionina e valina, ou coisa parecida.

O termo "estabilidade química" da formulação de proteínacomo aqui usado se refere às mudanças covalentes químicas na estrutura daproteína que resulta na formação de produtos de degradação química compotência biológica menos potencial e/ou propriedades imunogênicasaumentadas potenciais comparados com a estrutura da proteína nativa. Váriosprodutos de degradação química podem ser formados dependendo do tipo enatureza da proteína nativa e o ambiente a qual a proteína está exposta. Aeliminação da degradação química pode mais provavelmente não sercompletamente evitada e quantidades crescentes de produtos de degradaçãoquímica é muitas vezes vista durante a armazenagem e uso da formulação deproteína como bem sabido pela pessoa versada na técnica. A maioria dasproteínas são propensas à desamidação, um processo em que o grupo deamida de cadeia lateral em resíduos de glutaminila ou asparaginila éhidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outros caminhos dedegradação envolvem a formação de produtos de transformação de pesomolecular elevado onde duas ou mais moléculas de proteína sãocovalentemente ligadas uma com a outra através da transamidação e/ouinterações de dissulfeto que leva à formação de produtos de degradação dedímero, oligômero e polímero covalentemente ligados (Stability of ProteinPharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C, Plenum Press, New York1992). A oxidação (de, por exemplo, resíduos de metionina) pode sermencionada como uma outra variante de degradação química. A estabilidadequímica da formulação de proteína pode ser avaliada mediante a medição daquantidade dos produtos de degradação química em vários pontos do tempoapós a exposição a diferentes condições ambientais (a formação de produtosde degradação pode freqüentemente ser acelerada mediante, por exemplo, oaumento da temperaturas). A quantidade de cada produto de degradaçãoindividual é freqüentemente determinada pela separação dos produtos dedegradação dependendo do tamanho e/ou carga da molécula usando váriastécnicas de cromatografia (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).

Em conseqüência, como delineado acima, uma "formulaçãoestabilizada" se refere à uma formulação com estabilidade física aumentada,estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentadas.

Em geral, uma formulação deve ser estável durante o uso e armazenagem (naconcordância com as condições de uso e armazenagem recomendadas) até quea data de expiração seja alcançada.

Em uma forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica que compreende o composto da presente invenção é estável pormais do que 6 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenagem.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica que compreende o composto da presente invenção é estável pormais do que 4 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenagem.

Em uma outra forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica que compreende o composto da presente invenção é estável pormais do que 4 semanas de uso e por mais do que dois anos de armazenagem.

Em mais uma outra forma de realização da invenção aformulação farmacêutica que compreende o composto da presente invenção éestável por mais do que 2 semanas de uso e por mais do que dois anos dearmazenagem.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito ao usode um composto de acordo com a invenção para a preparação de ummedicamento.

Em uma forma de realização um composto de acordo com ainvenção é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento ouprevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância a glicose prejudicada,diabetes tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbioscognitivos, aterosclerose, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral,doenças cardíaca coronariana e outros distúrbios cardiovasculares, síndromeintestinal inflamatória, dispepsia e úlceras gástricas.

Em uma outra forma de realização um composto de acordocom a invenção é usado para a preparação de um medicamento para retardarou prevenir o progresso da doença em diabetes tipo 2.

Em uma outra forma de realização um composto de acordocom a invenção é usado para a preparação de um medicamento para diminuira captação de alimento, diminuir a apoptose da célula β, aumentar a função dacélula β e massa da célula β, e/ou para restaurar a sensibilidade de glicose nascélulas β.

O tratamento com um composto de acordo com a presenteinvenção pode também ser combinado com uma segunda ou mais substânciasfarmacologicamente ativas, por exemplo, selecionadas de agentesantidiabéticos, agentes antiobesidade, agentes reguladores do apetite, agentesanti-hipertensivos, agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicaçõesresultantes de ou associadas com diabetes e agentes para o tratamento e/ouprevenção de complicações e distúrbios resultantes de ou associados com aobesidade. Exemplos destas substâncias farmacologicamente ativas são:Insulina, sulfoniluréias, biguanidas, meglitinidas, inibidores da glucosidase,antagonistas de glucagon, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV),inibidores de enzimas hepáticas envolvidas no estímulo de gliconeogênesee/ou glicogenose, moduladores da absorção de glicose, compostosmodificadores do metabolismo de lipídeo tais como agentes anti-hiperlipidêmicos como inibidores de HMG CoA (estatinas), PolipeptídeosInibidores Gástricos (análogos de GIP), compostos redutores da captação dealimento, agonistas de RXR e agentes que atuam no canal de potássiodependente de ATP das células β; Colestiramina, colestipol, clofíbrato,genfibrozil, lovastatina, pravastatina, sinvastatina, probucol, dextrotiroxina,neteglinide, repaglinide; bloqueadores β tais como alprenolol, atenolol,timolol, pindolol, propranolol e metoprolol, inibidores de ACE (enzima deconversão da angiotensina) tais como benazepril, captopril, enalapril,fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril e ramipril, bloqueadores do canal decálcio tais como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina,diltiazem e verapamil, e bloqueadores α tais como doxazosin, urapidil,prazosina e terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocaínaanfetamina), antagonistas de NPY (neuropeptídeo Y), agonista de PYY,agonistas de PYY2, agonitas de PYY4, agonistas PPY2/PYY4 misturados,agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas deTNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF (fator de liberação dacorticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de ligação do fator deliberação da corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas β3, agonistasde MSH (hormônio de estimulação de melanócito), antagonistas de MCH(hormônio de concentração de melanócito), agonistas de CCK(colecistocinina), inibidores da reabsorção de serotonina, inibidores dareabsorção de serotonina e noradrenalina, compostos de serotonina enoradrenérgicos misturados, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas debombesina, antagonistas de galanina, hormônio do crescimento, compostos deliberação do hormônio do crescimento, agonistas de TRH (hormônio deliberação de tireotropina), moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína dedesacoplamento 2 ou 3), agonistas de leptina, agonistas de DA(bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores deRXR (receptor de retinóide Χ), β agonistas de TR; antagonistas de histaminaH3, agonistas ou antagonistas de Polipeptídeo Inibidor Gástrico (análogos deGIP), gastrina e análogos de gastrina.

O tratamento com um composto de acordo com esta invençãopode também ser combinado com cirurgia- uma cirurgia que influencie osníveis de glicose e/ou homeostasia de lipídeo tal como associação gástrica oudesvio gástrico.

Deve ficar compreendido que qualquer combinação adequadados compostos de acordo com a invenção com um ou mais dos compostosacima mencionados e opcionalmente uma ou mais de outras substânciasfarmacologicamente ativas é considerada de estar dentro do escopo dapresente invenção.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos queseguem que, no entanto, não devem ser interpretados como limitativos doescopo de proteção. Os aspectos apresentados na descrição precedente e nosseguintes exemplos podem, tanto separadamente quanto em qualquercombinação destes, ser material para realizar a invenção nas suas diversasformas.

EXEMPLOS

Abreviações usadas:

r.t Temperatura ambiente

DIEA diisopropiletilamina

H2O água

CH3CN acetonitrila

DMF NN dimetilformamida

HBTU hexafluorofosfato de 2-( 1 H-Benzotriazol-1 -il-)-1,1,3,3tetrametilurônio

Fmoc 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonila

Boc terc butiloxicarbonila

OtBu éster terc butílico

tBu terc butila

Trt trifenilmetila

Pmc 2,2,5,7,8-Pentametil-croman-6-sulfonila

Dde 1 -(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclo-hexilideno)etilaIvDde 1 -(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclo-hexilideno)-3-metilbutila

Mtt 4-metiltritila

Mmt 4-metoxitritila

DCM diclorometano

TIS triisopropilsilano

TFA: ácido trifluoroacético

Et20: dietiléter

NMP l-Metil-pirrolidin-2-ona

DIPEA: Diisopropiletilamina

HATU: hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametilurônio

HOAt: 1 -Hidróxi-7-azabenzotriazol

HOBt: I-Hidroxibenzotriazol

DIC: Diisopropilcarbodiimida

A: Síntese de peptídeo ligado a resina.

A resina de peptidila protegida foi sintetizada de acordo com aestratégia Fmoc em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems 433 emescala de 0,25 mmol ou 1,0 mmol usando os protocolos FastMoc UVfornecidos pelo fabricante que empregam acoplamentos mediados por HBTU(hexafluorofosfato de 2-(lH-Benzotriazol-1 —il-)-1,1,3,3 tetrametilurônio) ouHATU (hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametilurônio) em NMP (N-metil pirrolidona), e monitoramento de UV dadesproteção do grupo de proteção Fmoc. A resina de partida usada para asíntese das amidas de peptídeo GLP-1 foi resina Rink-Amide e resina Wangou de clorotritila foi usada para os peptídeos de GLP-I com um carbóxi C-terminal. Os derivados de aminoácido protegidos usados foram Fmoc-aminoácidos padrão (fornecidos da por exemplo, Anaspec, ou Novabiochem)fornecidos em cartuchos pré-pesados adequados para o sintetizador ABI433Acom a exceção de aminoácidos não natural tal como Fmoc-Aib-OH (ácidoFmoc-aminoisobutírico). O aminoácido N terminal era Boc protegido nogrupo de alfa amino (por exemplo, Boc-His(Boc)OH foi usado para peptídeoscom His no N-terminal). O grupo de amino épsilon de lisina na posição 37 ou38 foi ou protegido com Mtt5 Mmt, Dde, ivDde ou Boc, dependendo da viapara ligação do componente de ligação de albumina e espaçador. A síntesedos peptídeos pode em alguns casos ser melhorada para o uso de dipeptídeosprotegidos na ligação de dipeptídeo amida com um grupo que pode serclivado sob condições acídicas tais como, mas não limitados a eles, 2-Fmoc-óxi-4-metoxibenzila ou 2,4,6-trimetoxibenzila. Nos casos onde uma serina ouuma treonina está presente no peptídeo, o uso de dipeptídeos de pseudoprolinapode ser utilizado (ver, por exemplo, o catálogo da Novobiochem 2002/2003ou versão mais nova, ou W. R. Sampson (1999), J. Pep. Sei. 5, 403.

Procedimento para a remoção de proteção de ivDde ou Dde.

A resina (0,25 mmol) foi colocada em um mecanismoagitador/filtração manual e tratada com 2% hidrazina em N-metil pirrolidona(20 ml, 2x12 min) para remover o grupo de Dde ou ivDde e lavada com N-metil pirrolidona (4 χ 20 ml).

Procedimento para remoção da proteção de Mtt ou Mmt.

A resina (0,25 mmol) foi colocada em um mecanismoagitador/filtração manual e tratada com 2% TFA e 2 a 3% TIS em DCM (20ml, 5 a 10 min repetido 6 a 12 vezes) para remover o grupo de Mtt ou Mmt elavada com DCM (2 χ 20 ml), 10% MeOH e 5% DIPEA em DCM (2 χ 20 ml)e N-metil pirrolidona (4 χ 20 ml).

Procedimento para a ligação de cadeias laterais ao resíduo de Lisina.

O resíduo de ligação a albumina (cadeia lateral B-U- defórmula I) pode ser ligado ao peptídeo de GLP-I mediante acilação aopeptídeo ligado à resina ou acilação em solução ao peptídeo desprotegidousando reagente de acilação padrão tal como, mas não limitado a, DIC,HOBt/DIC, HOAt/DIC, ou HBTU.Ligação ao peptídeo ligado à resina:

Caminho I

Resíduo de ligação a albumina ativado (éster ativo ou anidridosimétrico) (cadeia lateral B-U- de fórmula I) tal como éster mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-1 -il) de ácido octadecanodióico (Ebashi et al. EP511600, 4equivalentes molares relativos ao peptídeo ligado a resina) foi dissolvido emNMP (25 ml), adicionado à resina e agitado durante a noite em temperaturaambiente. A mistura de reação foi filtrada e a resina foi lavadaextensivamente com NMP, diclorometano, 2-propanol, metanol e éterdietílico.

Caminho II

O resíduo de ligação à albumina (cadeia lateral B-U- defórmula I) foi dissolvido em N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1, 10ml). O reagente de ativação tal como hidroxibenzotriazol (HOBt) (4equivalentes molar em relação à resina) e diisopropilcarbodiimida (4equivalentes molar em relação à resina) foi adicionado e a solução foi agitadadurante 15 min. A solução foi adicionada à resina e diisopropietilamina (4equivalentes molares em relação à resina) foi adicionada. A resina foi agitada2 a 24 horas em temperatura ambiente. A resina foi lavada com N-metilpirrolidona (2 χ 20 ml), N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1) (2 χ 20ml) e cloreto de metileno (2 χ 20 ml).

Caminho III

Resíduo de ligação a albumina ativado (éster ativo ou anidridosimétrico) (cadeia lateral B-U- de fórmula I) tal como éster mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-l-il) de ácido octadecanodióico (Ebashi et al. EP511600), 1 a 1,5equivalentes molar em relação ao peptídeo GLP-I foi dissolvido emacetonitrila (1 ml) ou THF (1 ml) e adicionado a um solução do peptídeo emágua (10 a 20 ml) juntamente com 10 equivalentes molares de DIPEA. Nocaso de grupos de proteção no resíduo de ligação à albumina tal como terc-butila, a mistura de reação foi liofilizada O/N e o peptídeo bruto isolado foidissolvido em uma mistura de ácido trifluoroacético, água e triisopropilsilano(90:5:5) e em repouso durante 30 min, evaporado in vácuo e por HPLCpreparativa.

Procedimento para remoção de proteção Fmoc: A resina (0,25mmol) foi colocada em um frasco de filtro em um mecanismo de agitaçãomanual e tratada com N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1) (2 χ 20ml) e com N-metil pirrolidona (1 χ 20 ml), uma solução de 20% piperidinaem N-metil pirrolidona (3 χ 20 ml, 10 min cada). A resina foi lavada com Ν-metil pirrolidona (2 χ 20 ml), N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1) (2χ 20 ml) e cloreto de metileno (2 χ 20 ml).

Procedimento para clivagem do peptídeo fora da resina:

O peptídeo foi clivado da resina mediante agitação durante 180min em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético,água e triisopropilsilano (95:2,5:2,5 a 92:4:4). A mistura de clivagem foifiltrada e o filtrado foi concentrado em um óleo por uma corrente denitrogênio. O peptídeo bruto foi precipitado deste óleo com 45 ml de éterdietílico e lavado de 1 a 3 vezes com 45 ml de éter dietílico.

Purificação: O peptídeo bruto foi purificado por HPLC semi-preparativa em uma coluna de 20 mm χ 250 mm acondicionada com 5μ ou 7μC-18 sílica. Dependendo do peptídeo um ou dois sistemas de purificaçãoforam usados.

TFA: Após secagem o peptídeo bruto foi dissolvido em 5 mlde 50% ácido acético H2O e diluído em 20 ml com H2O e injetado na colunaque depois foi eluída com um gradiente de 40 - 60% CH3CN em 0,1% TFA10 ml/min durante 50 min em 40 0C. As frações contendo peptídeo foramcoletadas. O peptídeo purificado foi liofilizado após diluição do eluato comágua.

Sulfato de amônio: A coluna foi equilibrada com 40% CH3CNem 0,05 M (NH4)2SO4, que foi ajustada para o pH 2,5 com H2SO4concentrado. Após secagem o peptídeo bruto foi dissolvido em 5 ml 50%ácido acético H2O e diluído com 20 ml com H2O e injetado na coluna quedepois foi eluída com um gradiente de 40% - 60% CH3CN em 0,05 M(NH4)2SO4, pH 2,5 em 10 ml/min durante 50 min a 40 0C. As fraçõescontendo peptídeo foram coletadas e diluídas com 3 volumes de H2O epassadas através de um cartucho Sep-Pak® C18 (Waters part. #:51910) quefoi equilibrado com 0,1% TFA. Foi depois eluído com 70% CH3CN contendo0,1% TFA e o peptídeo purificado foi isolado por liofilização após diluição doeluato com água.

O produto final obtido foi caracterizado por RP-HPLCanálitico (tempo de retenção) e por LCMS.

A análise de RP-HPLC foi executada usando a detecção UVem 214 nm e uma coluna C-18 Vydac 218TP54 4,6 mm χ 250 mm 5μ (TheSeparations Group, Hesperia, USA) que foi eluída em 1 ml/min em 42 0C.Duas condições de eluição diferentes foram usadas:

Al: Equilíbrio da coluna em um tampão consistindo de0,1 M (NH4)2SO4, que foi ajustado para pH 2,5 com H2SO4 concentrado eeluição por um gradiente de 0% a 60% CH3CN no mesmo tampão durante 50 min.

BI: Equilíbrio da coluna com 0,1% TFA / H2O e eluiçãopor um gradiente de 0% CH3CN / 0,1% TFA / H2O a 60% CH3CN / 0,1%TFA / H2O durante 50 min. Alternativa a análise de RP-HPLC foi executadausando detecção de UV em 214 nm e uma coluna de sílica C-18Symmetry300, 3,6 mm χ 150 mm, de 3,5 μ (Waters) que foi eluída em 1ml/min a 42 0C.

B4: Equilíbrio da coluna com 0,05% TFA / H2O eeluição por um gradiente de 5% CH3CN / 0,05% TFA / H2O a 95% CH3CN /0,05% TFA / H2O durante 15 min.A seguinte instrumentação foi usada:

LCMS foi executado em uma configuração consistindo deespectrômetro de massa Sciex APl 100 Single quadropole, bomba PerkinElmer Series 200 Quard, auto-amostrador Perkin Elmer Series 200, detectorde UV Applied Biosistems 785A UV, detector de dispersão de luzevaporativa Sedex 75.

O controle de instrumento e aquisição de dados foram feitospelo software de controle Sciex Sample que opera em um computadorWindows 2000.

A bomba de HPLC é conectada a dois reservatórios eluentescontendo:

A: 0,05% ácido trifluoro acético em águaB: 0,05% ácido trifluoro acético em acetonitrila

A análise é executada em temperatura ambiente mediante ainjeção de um volume apropriado da amostra (preferivelmente 20 μΐ) nacoluna que é eluída com um gradiente de acetonitrila.

As condições de HPLC, montagens de detector e montagensde espectrômetro de massa usadas são dadas na seguinte tabela.

Coluna: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 μηιGradiente: 5% - 90% acetonitrila linear durante 7,5 min em 1,5 ml/minDetecção: 210 nm (produção análoga de DAD)ELS (produção análoga de ELS), 40 0CMS modo de ionização API-ES

Alternativamente LCMS foi executado em configuraçãoconsistindo de Hewlett Packard series 1100 G1312A Bin Pump, HewlettPackard series 1100 Column compartment, Hewlett Packard series 1100G1315A DAD diode array detector, Hewlett Packard series 1100 MSD eSedere 75 Evaporative Light Scattering detector controlled by HPChemstation software. A bomba de HPLC é conectada a dois reservatórioseluentes contendo:

A: 10 mM NH4OH em água

B: 10 mM NH4OH em 90% acetonitrila

A análise foi executada em 23 0C mediante a injeção de umvolume apropriado da amostra (preferivelmente 20 μΐ) na coluna que é eluídacom um gradiente de A e B.

Coluna Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 mGradiente 5% - 100% acetonitrila linear durante 6,5 min em 1,5 ml/minDetecção 210 nm (produção análoga de DAD)ELS (produção análoga de ELS)

MS modo de ionização API-ES. Varredura 100-1000 amu etapa 0,1 amuLigação de radioligando às membranas plasmáticas que expressam o receptorde GLP-I humano

O ensaio de ligação foi executado com membranas plasmáticaspurificadas contendo o receptor de GLP-I humano. As membranasplasmáticas contendo os receptores foram purificadas a partir de células BHKtk-ts 13 de expressão estável. As membranas foram diluídas em Tampão deEnsaio (50 mM HEPES, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 0,005% Tween 20, pH= 7,4) em uma concentração final de 0,2 mg/ml de proteína e distribuídas emplacas de microtítulo de 96 reservatórios pré-revestidas com 0,3% PEI. Asmembranas na presença de 0,05 nM [ I]GLP-I, ligandos não rotulados emconcentrações crescentes e diferentes concentrações de HSA (0,005%, 0,05%,e 2%) foram incubadas 2 hr a 30 0C. Após incubação, os ligandos não ligadosforam separados dos ligandos ligados mediante filtração através de um tubode distribuição a vácuo seguido por lavagem de 2 X 100 μΐ com tamponantede ensaio gelado. Os filtros foram secados durante a noite em RT,puncionados e quantificados em um contador γ.Exemplo 1

<formula>formula see original document page 63</formula>

peptídeo LysE38((4- {[N-(2-carboxietil)-N-( 15-carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil) [Gly8;Arg26,34;Lys38]GLP-l-(7-37)

Peptídeo [Gly8;Arg26,34;Lys38]GLP-l-(7-37) foi preparadopela síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc padrão e purificado por HPLCpreparativa. Ácido 4-{ [N-(2-terc-Butoxicarboniletil)-N-( 15-tercbutoxicarbonilpentadecanoil)amino]metil}benzóico (36 mg) foi dissolvido em THF (1,0 ml),e DIPEA (7 μΐ) e TSTU (17 mg) foram adicionados. Após agitação emtemperatura ambiente durante lha mistura foi diluída com THF (1 ml). Dasuspensão resultante, 200 μΐ foram adicionados a uma solução de peptídeo[Gly8;Arg26,34;Lys38]GLP-l-(7-37) (15 mg) e DIPEA (15 μΐ) em água (1,0ml). Após 0,5 h mais agente de acilação (50 μΐ da solução acima) foiadicionado. Após 1,5 h a mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e osésteres terc-butílicos submetidos a solvólise mediante o tratamento com 95%TFA durante 15 min. O produto final foi purificado por HPLC preparativa.1,3 mg de o composto do título foi obtido.

HPLC (método B4): RT = 9,13 min (93%)

LCMS: m/z = 1334 (MH33+). Calculado para (MH33+): 13 3 4

Exemplo 2

<formula>formula see original document page 63</formula>

[Aib8,Arg26,34] GLP-I (7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi] etóxi)acetil] -OH.

Peptídeo [Aib8;Arg26,34]GLP-l-(7-37)Lisina foi preparadopela síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc padrão e purificado por HPLCpreparativa. [Aib8;Arg26,34]GLP-l-(7-37)Lisina foi dissolvida em água (10ml) e DIPEA (37 ul) foi adicionado. Ácido 4-[N- Hexadecanoilsulfamoil]butírico de éster terc-butílico de ácido 17-((S)-l-terc-Butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-l-iloxicarbonilmetóxi)etóxi]etilcarbamoil}metóxi)etóxi]etilcarbamoil}propilcarbamoil) heptadecanóico (16 mg) foi dissolvidoem acetonitrila (1 ml) e adicionado em pequenas porções. Após agitação emtemperatura ambiente durante 40 min a mistura de reação foi liofilizada O/N.

Ao composto isolado foi adicionado 10 ml de 90% TFA / 5% TIS/ 5% água ea mistura de reação foi estagnada durante 30 min, evaporada in vácuo, e co-evaporada com heptano. O óleo residual foi dissolvido em 15 ml de águacontendo 1% de NH3-aq e purificado por HPLC preparativa para fornecer ocomposto do título.

HPLC (método B4): RT = 9,25 min (100%)

LCMS: m/z = 1423 (MH33+). Calculado para (MH33+): 1423

Exemplo 3

<formula>formula see original document page 64</formula>

Exemplo 4

<formula>formula see original document page 64</formula>

[Aib8,Arg26,34]GLP-1 (7-37)Lys(4-{[N-(2-carboxietil)-N-(15-carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil)-peptídeo

Peptídeo [Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys partindo de 150mg de resina de cloreto de 2-clorotritila (1,4 mmol/g) foi preparado porsíntese de peptídeo de fase sólida Fmoc usando Apex396 da AdvancedChemtech. O resíduo de Lys foi protegido como Lys(ivDde) enquanto ascadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas comgrupos de proteção lábeis de ácido padrão. Depois, ácido 4-((N-(2-terc-utoxicarboniletil)-N-(15-terc-butoxicarbonilpentadecanoil)amino)metil)benzóico (126 mg) dissolvido em NMP (1 ml) foi acoplado ao peptídeo ligadoa resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivadoa partir da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.

HPLC: Eluatos em 51,5% acetonitrilaMALDI-MS: 4025.<formula>formula see original document page 65</formula>

Exemplo 5

[Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys(4-{N-(2-carboxietil)-N-(17-carboxieptadecanoil)amino]metil}benzoil)-peptídeo

Peptídeo [Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys partindo de 150mg de resina de cloreto de 2-clorotritila (1,4 mmol/g) foi preparado pelasíntese de peptídeo de fase sólida Fmoc usando Apex396 da AdvancedChemtech. O resíduo de Lys foi protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos de proteção lábeis de ácido padrão. Depois, ácido 4-((N-(2-terc-butoxicarboniletil)-N-(17-terc-butoxicarbonileptadecanoil)amino)metil)benzóico (126 mg) dissolvido em NMP (1 ml) foi acoplado ao peptídeo ligadoa resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado a partir da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foiisolado por LC-MS.HPLC: Eluatos em 54,4% acetonitrilaMALDI-MS: 4057.

Exemplo 6

<formula>formula see original document page 65</formula>N-s37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carboxi-ys37], GLP-I-(7-37)peptídeo.

HPLC (método B6): RT = 32,4 min

HPLC (método Al): RT = 43,4 min

LCMS: m/z = 1419,3 (MH33+). Calculado para M+: 4254.8

Exemplo 7

<formula>formula see original document page 66</formula>

Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil]-amida

[Aib8,Arg26,34]GLP-1 (7-37)Lys amida partindo de 200 mgde resina Tentagel RAM S (0,26 mmol/g) foi preparado pela síntese depeptídeo de fase sólida Fmoc usando Apex396 da Advanced Chemtech. Oresíduo de Lys foi protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias lateraisfuncionais para os outros aminoácidos foram protegidos com grupos deproteção lábeis de ácido padrão. As duas unidades de OEG, Glu e ácidooctadecanodióico foram acopladas ao peptídeo ligado a resina usandoDIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado a partir daresina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.

HPLC: Eluatos em 47% acetonitrila

MALDI-MS: 4267.

Exemplo 8

<formula>formula see original document page 66</formula>[Aib8,Arg26,34]GLP-l

(7-37)Lys(4- {[N-(2-carboxietil)-N-( 15-

carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil)-amida

[Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys amida partindo de 200 mgde resina Tentagel RAM S (0,26 mmol/g) foi preparado pela síntese depeptídeo de fase sólida Fmoc usando Apex396 da Advanced Chemtech. Oresíduo de Lys foi protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias lateraisfuncionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos deproteção lábeis de ácido padrão. Depois, ácido 4-((N-(2-terc-butoxicarboniletil)-N-( 15-terc-butoxicarbonilpentadecanoil)amino) metil)benzóico (119 mg) dissolvido em NMP (1 ml) foi acoplado ao peptídeo ligadoa resina mediante o uso de DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmentedesprotegido e clivado a partir da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol(90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por HPLC preparativa.HPLC: Eluatos em 51,5% acetonitrilaMALDI-MS: 4028Exemplo 9

Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil]-peptídeo

Peptídeo [Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys partindo de 150mg de resina de cloreto de 2-clorotritila (1,4 mmol/g) foi preparado pelasíntese de peptídeo de fase sólida Fmoc usando Apex396 da AdvancedChemtech. O resíduo de Lys foi protegido como Lys(Mtt) enquanto as cadeiaslaterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com gruposde proteção lábeis de ácido padrão. As duas unidades de OEG, yGlu e ácidooctadecanodióico monoprotegido foram acopladas ao peptídeo ligado a resina

[Aib8,Arg26,34,Glu30]GLP-l

(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado a partir

da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por

LC-MS preparativa.

HPLC: Eluatos em 48,5% acetonitrila

MALDI-MS: 4328

Outros compostos desta invenção incluem

H:2CWCH3

COTFTSOVSSYLEOOAAREF t AWLVRQiRi OH

O OH °

H1C CH,

ΝΗ^-Μ-Ν^Ιι-ε Q T

H 0

FTSPVSSYlEeQAA Η. EF !AWltfROR β-íL "

O QH

H1C CH1

^-H-N^r-ECTF'T®OVS5VLEGOAAREF I AWL V RO RGtI J^qm

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Estudo Farmacodinâmico usando camundongos db/dbEm um aspecto desta invenção os agonistas de GLP-Ipossuem uma duração de ação de pelo menos 24 h após a dosagem 30nmol/kg em camundongos db/db.

A eficácia e a duração de ação são medidas nos camundongos

5 db/db.

Os camundongos db/db machos são expedidos da Taconic,Denmark na idade de 8 a 10 semanas. A partir do tempo de chegada, oscamundongos são alojados sob condições padrão, mas a 24 0C. Oscamundongos são mantidos 10 por gaiola até a experiência com acesso livre à

10 comida padrão (Altromin, Brogaarden APS., Denmark) e água da bica em umdia normal: ciclo de luz (luz às 6 am). Os camundongos são usados para 1experiência por semana durante 3 semanas. Após isto, os camundongos sãosubmetidos à eutanásia.

Após um período de aclimatização de 1 semana, a glicose no

15 sangue é medida por tirar amostra do vaso capilar da ponta da cauda. Emresumo, 5 μΐ de sangue é testada em tubos capilares de vidro heparinizados eimediatamente colocados em suspensão a 250 μΐ de solução tampão EBIO(Eppendorf, Germany) em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. A concentração deglicose no sangue é medida pelo método de glicose oxidase no analisador

20 EBIO Plus Auto (Eppendorf, Germany).

O corte de valor para a glicose sangüínea é 10 mM. Quando seavalia o camundongo, é essencial que todos os 42 camundongos que entramna experiência possuam valores de glicose no sangue acima de 10 mM, mastambém que a diferença inter-camundongos seja pequena. Portanto, se muitos

25 camundongos não forem gravemente diabéticos, visto que alguns são, o iníciodas experiências deve ser adiado uma semana e novas medições de glicose nosangue basal serem feitas.

Com base nos valores de glicose no sangue basal, oscamundongos são alocados em 7 grupos de η = 6 com valores de glicose nosangue médios no grupo de equiparação.No dia do teste os valores matutinos de glicose no sanguebasal são avaliados como descrito acima e o peso corporal basal de cadacamundongo é avaliado. Um tempo O, o composto é dosado subcutaneamente

5 na nuca do pescoço (volume de dosagem ap. 300 μ1/50 g de camundongo). Osvalores de glicose no sangue são acompanhados até 48 horas (tempo 1, 3, 6,24 e 48 h) e o peso corporal terminal é avaliado.

Todos os dados são introduzidos em Graphpad Prism onde aglicose média no sangue e os pesos corporais delta médios são calculados.

10 Um aspecto desta invenção é preparar os análogos/derivados

de GLP-I com meias-vidas no plasma prolongadas que são adequadas paraadministração de uma vez por semana. As propriedades cinéticas do fármacopodem ser avaliadas em mini porcos ou porcos domésticos como descritoabaixo.

15 Triagem Farmacocinética de análogos de GLP-I uma vez por semana

A triagem farmacocinética de análogos de GLP-I para aidentificação de candidatos adequados de uma vez por semana foramexecutados em candidatos que de acordo com planos de triagem projetadosforam mostrados serem suficientemente potentes com respeito ao potencial de

20 diminuição da glicose em um modelo de camundongo diabético(camundongos db/db) e subseqüentemente tinha um tempo de duração de 48horas ou mais no modelo de camundongo db/db.Triagem primária

A primeira parte da triagem farmacocinética consistia de uma

25 administração subcutânea de dose única de 2 nmol/kg em três miniporcospesando de 8 a 12 kg. As amostras de sangue foram tiradas de cada animal empré-dose, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas pós-injeção. Todasas amostras sangüíneas foram estabilizadas com um tampão de estabilizaçãoespecial consistindo de: EDTA (di-sódio) 0,18 M, Aprotenin 15000 KIE/ml,Val-Pyr 0,30 mM, pH ajustado para 7,4 de modo a prevenir a degradaçãoenzimática dos análogos de GLP-1. O plasma foi coletado de cada amostra desangue estabilizada mediante centrifugação (4 0C, 10 min., 1270 G (4000rpm), e analisado com relação ao teor de análogo de GLP-I por ensaios

5 ELISA. Três diferentes ensaios ELISA foram usados para a análise deplasma: O "Ensaio total" usando a combinação de anticorpos Fl/Ra2135 quedetecta tanto a molécula 7-37GLP-1 N-terminalmente intacta quanto amolécula 9-37GLP-1 N-terminal enzimaticamente degradada com um limitede detecção (LOD) de 35 pM e uma faixa analítica dinâmica de 35-30000 pM.

10 O "Ensaio intacto" usando a combinação de anticorpos Fl/Mab26.1. Esteensaio foi o que detecta a molécula 7-37GLP-1 N-terminalmente intactaapenas. O LOD foi 35 pM e uma faixa analítica dinâmica de 35-30000 pM. O"ensaio Aib-intacto" usando a combinação de anticorpos F1/GLP162-3F15.Este ensaio foi o que detecta o N-terminal estabilizado com Aib da molécula

15 de GLP-I que permite a detecção dos análogos de GLP-I estabilizados. OLOD foi 45 pM e a faixa analítica dinâmica 45-30000 pM.

Todos os perfis concentração no plasma-tempo foramanalisados farmacocineticamente mediante uma análise não comportamental.O seguintes parâmetros farmacocinéticos foram calculados se os dados

20 permitirem: tmax, Cmax, AUC, AUC/Dose, AUCo/oExtrapol, Xz, t1/2, CL/F, Vz/F eMRT.

Triagem secundária

Uma segunda parte da triagem farmacocinética foi conduzidanaqueles compostos com uma meia-vida terminal inicial de 60 a 70 horas ou

25 mais. Esta triagem consistia de uma administração intravenosa e subcutâneaem dose única de 2 nmol/kg em seis miniporcos para cada via deadministração. O plano de tirar amostra de sangue foi prolongado de 0 a 120horas para 0 a 432 horas e 0 a 504 horas após a administração intravenosa esubcutânea respectivamente. Isto foi feito de modo a aumentar a precisão eexatidão das estimativas do parâmetro farmacocinético, especialmente a meia-vida terminal, AUC e a separação dos parâmetros derivados e volume dedistribuição, e estimar a biodisponibilidde após a administração subcutânea.ENSAIO DE GLP-I (AIB8- INTACTO)

5 O ensaio foi um ensaio de dois sítios com incubação

simultânea do analisado com anticorpo pegador e detector. Um substratoquimioluminescente pronto para uso foi usado para maximizar o sinal. Oensaio nem reconhece o GLP-I (7-37) endógeno nem o GLP-I (9-37) clivadopor DPPIV.

10 Plasma de referência para ensaios de GLP-I

Plasma 0 foi preparado a partir de plasma EDTA reunido semValina Pirrolidida e Aprotinina de animais em jejum. O plasma EDTAreunido foi incubado a 37 0C durante 4 horas para remover os traços de GLP-1 e após incubação Valina Pirrolidida e Aprotinina foram adicionados.

15 Tamponantes

Tampão de revestimento

PBS foi usado como tampão de revestimento: 10 mM fosfatode sódio e 145 mM cloreto de sódio ajustado para pH 7,4.Tampão de lavagem

20 PBS com 0,05% (v/v) Tween 20

Tampão de ensaio

PBS com 0,05% (v/v) Tween 20, 10 g/L BSA e 10 mg/L anti-

TNP.

Tampão de estreptavidina

25 Tampão de lavagem com um adicional de 0,5 M NaCl.

Substrato

Substrato pronto para uso SuperSignal ELISA Femto (Pierce,cat. no. 37075).PadrõesPadrões foram preparados de uma solução de matéria-prima a25 μΜ de 0113-0000-0217. O peptídeo foi de modo serial diluído no plasmade referência para produzir padrões com concentrações finais de 30000-10000-3333-1111-370-123-41 e 0 pM. Os padrões foram armazenados emtubos Micronic em alíquotas de 100 μΐ., a -20 0C.

Procedimento de ensaio

Crystal 2000 Microplates (pretas) foram revestidas comanticorpo monoclonal GLPM-7F1, 100 μΐ de 5 μg/ml em PBS durante a noitea 4 0C.

As placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem emuma lavadora de placa automática (SkanWasher, Skatron) e deixadas repousardurante pelo menos 30 min. com o tampão de lavagem para bloquear os sítiosremanescentes.

20 μΐ de amostra ou protótipo foram adicionados em cadareservatório em duplicata imediatamente seguido por 100 μΐ de GLP162-3F15submetido a biotina, 1 μg/ml em tampão de ensaio. As placas foramincubadas durante 2 horas em temperatura ambiente em um agitador de placaseguido por 5 ciclos de lavagem como anteriormente descrito. 100 μΐ desolução de estreptavidina-peroxidase (KPL, código 14-30-00, 1:20000 emtampão de estreptavidina) foram adicionados em cada reservatório eincubados durante 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placa.

As placas foram lavadas como anteriormente descrito e após esvaziar 100 μιde SuperSignal femto foram adicionados. As placas foram colocadas em umagitador durante 1 minuto e medidas em Orion Luminometer (Berthold). Osdados foram transferidos para MultiCalc e as curvas padrão calculadas usandoo método 4PL pesado. As concentrações de amostra foram calculadas a partirda curva padrão.

ENSAIO DE GLP-I (TOTAL)

O ensaio foi um ensaio de dois sítios com incubaçãosimultânea do analisado com anticorpo pegador e detector. O ensaioreconhece o GLP-I N-terminalmente clivado até o GLP-I (12-37).

Tamponantes

Tampão de revestimento

PBS com 0,05% (v/v) Tween 20

Tampão de ensaio

PBS com 0,05% (v/v) Tween 20, 10 g/L BSA e 10 mg/L anti-TNP.

Tampão de estreptavidina

Tampão de lavagem com um adicional de 0,5 M NaCl.

Substrato

Substrato pronto para uso TMB (KemEnTec code 4380A).

Padrões

Padrões foram preparados de uma solução de matéria-prima a25 μΜ de 0113-0000-0217. O peptídeo foi de modo serial diluído no plasmade referência para produzir padrões com concentrações finais de 30000-10000-3333-1111-370-123-41 e 0 pM. Os padrões foram armazenados emtubos Micronic em alíquotas de 100 μΤ a -20 0C.

Procedimento de ensaio

Placas de microtítulo Maxisorp (NUNC) foram revestidas comanticorpo monoclonal GLPM-7F1, 100 μΐ de 5 μg/ml em PBS durante a noitea 4 0C.

As placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem emuma lavadora de placa automática (SkanWasher, Skatron) e deixadas repousardurante pelo menos 30 min. com o tampão de lavagem para bloquear os sítiosremanescentes.20 μΐ de amostra ou protótipo foram adicionados em cadareservatório imediatamente seguido por 100 μΐ de Ra2135 submetido abiotina, 1 μ^/ηιΐ em tampão de ensaio. As placas foram incubadas durante 2horas em temperatura ambiente em um agitador de placa seguido por 5 ciclosde lavagem como anteriormente descrito.

100 μΐ de solução de estreptavidina-peroxidase (AmershamBioscinces código RPN4401V, 1:8000 em tampão de ensaio) foramadicionados em cada reservatório e incubados durante 1 hora em temperaturaambiente em um agitador de placa. As placas foram lavadas comoanteriormente descrito e após esvaziar 100 μΐ, de TMB foram adicionados eapós 5 minutos interrompidas com 100 μΐ de H3PO4.

As placas foram medidas em Victor Multilabel Reader(Wallac). Os dados foram transferidos para MultiCalc e as curvas padrãocalculadas usando o método 4PL pesado. As concentrações de amostra foramcalculadas a partir da curva padrão.

Os procedimentos experimentais em vida, análise de plasma eanálise farmacocinética foram idênticas àqueles descritos sob a triagemprimária.

Claims

1. Análogo de GLP-1, caracterizado pelo fato de que tem umamodificação de pelo menos um resíduo de aminoácido não proteogênico nasposições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1), que éacilado com um componente no resíduo de lisina na posição 37 ou 38, e ondedito componente compreende pelo menos dois grupos acídicos, em que umgrupo acídico é ligado terminalmente.

2. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente ligado na posição 37 ou 38compreende um ligador hidrofílico.

3. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o ligador hidrofílico compreende pelo menos 5átomos não hidrogênio onde 30 a 50% destes são N ou O.

4. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o componenteligado na posição 37 ou 38 compreende um componente de ligação dealbumina separado do peptídeo pelo ligador hidrofílico.

5. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o componente de ligação de albumina é umcomponente lipofílico linear ou ramificado contendo de 4 a 40 átomos decarbono tendo um grupo acídico distai.

6. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o componentecompreende B-U' em queU' é um espaçador selecionado de<formula>formula see original document page 77</formula> m é O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,η é 1, 2 ou 3s é O, 1, 2, ou 3,té O, 1,2, 3, ou4ρ é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,-20,21,22, ou 23;e onde B é um grupo acídico selecionado de <formula>formula see original document page 77</formula> onde 1 é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;

7. Análogo de GLP-I de acordo com as reivindicações de 1 a-6, caracterizado pelo fato de ser de fórmula IXaa7-Xaae-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaaie-Ser-Xaam-Xaa19-Xaa20-Qlu-Xaa22-Xaaa3-Ala-Xaags-Xaawi-Xaa2?-Phe-I(&-Xaa3fl-Trp-Leu-Xaa33-Xaa^-Xaaw-Xaaa6-B,-υ,-MHFórmula Iem queXaa7 é L-histidina, imidazopropionila, α-hidróxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina,homoistidina, TsT-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, α-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalaninaXaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Thr5 Ser, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico,ácido (1-aminociclo-heptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;Xaaj6 é Val ou Leu;Xaai8 é Ser, Lys ou Arg;Xaai9 é Tyr ou Gln;Xaa2O é Leu ou Met; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;Xaa25 é Ala ou Vai;Xaa26 é Lys, Glu ou Arg;Xaa27 é Glu ou Leu; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;Xaa33 é Val ou Lis;Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;Xaa35 é GIy ou Aib;Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou está ausente;Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, Asn ou está ausente;Z é OH ou NH2U' é um espaçador selecionado de <formula>formula see original document page 37</formula> m é O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,η é 1, 2 ou 3s é O, 1, 2, ou 3,té O, 1, 2, 3, ou 4ρ é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, IO5 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,-20, 21,22, ou 23;e onde B é um grupo acídico selecionado de <formula>formula see original document page 37</formula> onde 1 é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20

8. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que U' é <formula>formula see original document page 37</formula> m é O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,η é 1, 2 ou 3s é O, 1, 2, ou 3,té O, 1, 2, 3, ou4ρ é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,-20, 21,22, ou 23;

9. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 6 a 8, caracterizado pelo fato de quem é 2, 3, 4 ou 5,η é 1 ou 2s é O, 1, ou 2,té O, 1,2, ou 3pé 1,2,3,4, ou 7.

10. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6-7, caracterizado pelo fato de que 1 é 14, 15, 16, 17 ou 18;

11. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6-9, caracterizado pelo fato de que s é 1.

12. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6-7 e 10, caracterizado pelo fato de que 1 é 16.

13. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6-9, caracterizado pelo fato de que ρ é 3 ou 4.

14. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações 6-9, caracterizado pelo fato de que η é 1.

15. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 14, caracterizado pelo fato de que:Xaa7 é His ou desamino-histidina,Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys ou Aib;Xaaj6 é Vai;Xaaj g é Ser; Xaaiç é Tyr;Xaa2O é Leu;Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;Xaa23 é Gln ou Glu;Xaa25 é Ala; Xaa26 é Lys ou Arg;Xaa27 é Glu;Xaa3O é Ala ou Glu;Xaa33 é Vai;Xaa34 é Lys ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib;Xaa36 é Arg, Lys, ou está ausente;Xaa37 é Gly, Asn ou está ausente;Z é OH ou NH2

16. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que:Xaa7 é His;Xaa8 é Aib;Xaaj6 é Vai;Xaai8 é Ser;Xaai9 é Tyr;Xaa2O e Leu;Xaa22 é Gly ou Glu;Xaa23 é Gln;Xaa25 é Ala;Xaa26 é Arg;Xaa27 é Glu;Xaa30 é Ala;Xaa33 é Vai;Xaa34 é Arg;Xaa35 é Gly;Xaa36 é Arg;Xaa37 é Gly ou Asn;Z é OH ou NH2.

17. Análogo de GLP-I de acordo com as reivindicações de 1 a-16, caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-I compreende umamodificação da posição 22 para um Glu.

18. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-I compreende uma modificação da L-histidina N-terminal na posição 7da seqüência de GLP-I (7-37).

19. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-I compreendeimidazopropionil , α-hidróxi-histidina ou N-metil-histidina , D-histidina ,desamino-histidina , 2-amino-histidina , β-hidróxi-histidina , homoistidina ,Na-acetil-histidina7, α-fluorometil-histidina7, a-metil-histidina7, 3-piridilalanina , 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina .

20. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-I compreende uma substituição da L-alanina na posição 8 da seqüênciade GLP-I (7-37) por um outro resíduo de aminoácido.

21. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1 compreende Aib , Gly , Val , Ile , Leu , Ser , Thr , ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-hexil) carboxílico, ácido (1-aminociclo-heptil) carboxílico, ouácido (1-aminociclooctil) carboxílico.

22. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-I compreende Aib .

23. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-I compreende não mais do que quinze resíduos de aminoácido queforam trocados, adicionados ou anulados quando comparados com GLP-1 (7-37) (SEQID No. 1).

24. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que não mais do que dez resíduos de aminoácidoque foram trocados, adicionados ou anulados quando comparados com GLP- I(7-37) (SEQ ID No. 1).

25. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-I compreende não maisdo que seis resíduos de aminoácido que foram trocados, adicionados ouanulados quando comparados com GLP- 1 (7-37) (SEQ ID No. 1).

26. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-I compreende não mais do que 3 resíduos de aminoácido que não sãocodificados pelo código genético.

27. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-I compreende apenas um resíduo de lisina.

28. Análogo de GLP-I de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dita Lisina está naposição 38 em relação à seqüência de GLP-I (7-37) (SEQ ID No 1).

29. Análogo de GLP-I de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é selecionado de <formula>formula see original document page 84</formula> Lys£38((4-{[N-(2-carboxietil)-N-(15-carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil) [Gly8;Arg26,34;Lys38]GLP-l-(7-37) peptídeo, <formula>formula see original document page 84</formula> [Aib8,Arg26,34]GLP-l (7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-carbóxi-heptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil]-OH, <formula>formula see original document page 84</formula><formula>formula see original document page 85</formula>

30. Método para aumentar o tempo de ação em um paciente deum análogo de GLP-1, caracterizado pelo fato de que na acilação dito análogode GLP-I com um componente B-U' como apresentado em qualquer uma dasreivindicações precedentes, no resíduo de lisina na posição 37 ou 38 de ditoanálogo de GLP-I.

31. Método para aumentar o tempo de ação em um paciente deum análogo de GLP-I para mais do que cerca de 40 horas, caracterizado pelofato de que na modificação pelo menos um dos resíduos de aminoácido naposições 7 e 8 de um peptídeo GLP-I (7-37) ou um análogo deste, e acilaçãode dito análogo de GLP-I com um componente B-U'- como apresentado emqualquer uma das reivindicações precedentes no resíduo de lisina na posição-37 ou 38 de dito análogo de GLP-I.

32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 29, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-32, caracterizada pelo fato de ser adequada para a administração parenteral.

34. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 29, caracterizado pelo fato de ser para a preparação deum medicamento.

35. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 29, caracterizado pelo fato de ser para a preparação deum medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabetestipo 2, tolerância a glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade,hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, aterosclerose,infarto do miocárdio, doença cardíaca coronariana e outros distúrbioscardiovasculares, acidente vascular cerebral, síndrome intestinal inflamatória,dispepsia e úlceras gástricas.

36. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 29, caracterizado pelo fato de ser para a preparação deum medicamento para o retardo ou prevenção do progresso da doença nodiabetes tipo 2.

37. Use de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 29, caracterizado pelo fato de ser para a preparação deum medicamento para a diminuição da captação de alimento, diminuição daapoptose de β-célula, aumento da função β-celular e massa β-celular, e/oupara a restauração da sensibilidade a glicose para as β-células.