BRPI0608661A2

BRPI0608661A2 - formulaÇço farmacÊutica, uso de formulaÇço farmacÊutica, e, mÉtodo de preparaÇço de uma formulaÇço farmacÊutica

Info

Publication number: BRPI0608661A2
Application number: BRPI0608661-6A
Authority: BR
Inventors: Edgar H Ulm; Robert K Mansfield; Gregg A Timony; Markus F Boehm
Original assignee: Conforma Therapeutics Corp
Priority date: 2005-04-07
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2010-01-19
Also published as: CA2603462A1; CN101189006A; US20090238880A1; WO2006110473A2; WO2006110473A3; JP2008535844A; EP1871361A2; US20060228405A1; AU2006235105A1

Abstract

FORMULAÇçO FARMACÊUTICA, USO DE UMA FORMULAÇçO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO DE PREPARAÇçO DE UMA FORMULAÇçO FARMACÊUTICA. Formulações farmacêuticas e métodos de produzir e de usar as mesmas são descritos e reivindicados. As formulações são dispersões de fosfolipídeos e um ou mais compostos farmacologicamente ativos, seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ou suas pró-drogas. Em modalidades específicas, os compostos farmaceuticamente aceitáveis são ansamicinas e a formulação total está substancialmente destituída de triglicerídeos de cadeia média e longa.

Description

"FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO OUDE PREVENÇÃO DE UM DISTÚRBIO EM UM MAMÍFERO, USO DEFORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DEUMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA" REFERÊNCIA CRUZADA

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.de No. 60/669.591, depositado aos 7 de abril de 2005, que é aqui incorporadocomo referência em sua totalidade.CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se em geral às formulações farmacêuticas e

aos métodos de produzir e de usar as mesmas; mais particularmente, ainvenção refere-se às formulações de fosfolipídeo de ansamicinas, que estãosubstancialmente destituídas de triglicerídeos de cadeia média e longa; maisparticularmente, às formulações farmacêuticas de fosfolipídeo de 17-alil- amino-17-desmetil-geldanamicina (17-AAG).FUNDAMENTOS

A seguinte descrição inclui informação que pode ser útil noentendimento da presente invenção. Não é uma admissão de que qualqueruma informação aqui proporcionada seja a técnica anterior ou relevante para

as invenções presentemente reivindicadas, ou que qualquer publicaçãoespecífica ou implicitamente referida seja a técnica anterior.

Ansamicinas são moléculas antibióticas caracterizadas poruma estrutura "ansa" que compreende qualquer um dos grupos benzoquinona,benzo-hidro-quinona, naftoquinona ou nafto-hidro-quinona ligados por ponte por uma cadeia longa. Geldanamicina (GDM) e seu análogo semi-sintéticosintético 17-alil-amino-17-desmetil-geldanamicina (17-AAG) pertencem àclasse de benzoquinona de ansamicinas. GDM, como primeiro isolada domicroorganismo a Streptomyces hygroscopicus, foi originalmente identificadacomo um inibidor potente de certas quinases, e mais tarde foi mostrado que

PI0608661-6atua por estimulação da degradação de quinase, especificamente por seleçãode "chaperonas moleculares", por exemplo, proteínas de choque térmico 90s(HSP90s). Subseqüentemente, várias outras têm demonstrado mais ou menostal atividade, com 17-AAG estando entre as mais promissoras e sendo o temade estudos clínicos intensivos correntemente sendo conduzidos pelo NationalCâncer Institute (NCI). Veja, por exemplo, Federal Register, 66(129): 35443-35444; Erlichman et al, Proc. AACR 2001, 42, abstract 4474.

HSP90s são proteínas chaperona ubíquas envolvidas emdobramento, ativação e montagem de uma ampla variedade de proteínas,incluindo proteínas chave envolvidas em transdução de sinal, controle deciclo celular e regulação de transcrição. Pesquisadores têm relatado queproteínas chaperona HSP90 estão associadas com proteínas de sinalizaçãoimportantes, tais como receptores de hormônio esteroidal e proteína-quinases,incluindo, por exemplo, Raf-1, EGFR, quinases da família v-Src, Cdk4, e

ErbB-2 (Buchner J., TIBS, 1999, 24:136-141; Stepanova, L. et al, Genin Dev.1996, 10:1491-502; Dai, K. et al, JBiol Chem. 1996, 271:22030-4). Estudosadicionalmente indicam que certas co-chaperonas, por exemplo, HSP70,p60/Hop/Stil, Hip, Bagl, HSP40/Hdj2/Hsjl, imunofilinas, p23, e p50, podemauxiliar HSP90 em sua função (veja, por exemplo, Caplan, A., Trends in Cell BioL, 1999, 9: 262-68).

É considerado que antibióticos de ansamicina, por exemplo,herbimicina A (HA), geldanamicina, e 17-AAG, exercem seus efeitosanticancerosos por ligação forte na cavidade de ligação de terminação-N deHSP90 (Stebbins, C. et al, Cell, 1997, 89:239-250). Esta cavidade estáelevadamente conservada e possui homologia fraca com o sítio de ligação deATP de DNA girase (Stebbins, C. et al, supra; Grenert, J.P. et al, J. Biol.Chem. 1997, 272:23843-50). Além disso, tem sido mostrado que ambos ATPe ADP se ligam nesta cavidade com afinidade baixa e possuem atividade deATPase fraca (Proromou, C. et al, Cell, 1997, 90: 65-75; Panaretou, B. et al,EMBO J., 1998, 17: 482936). Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado quea ocupação desta cavidade N-terminal pelas ansamicinas e outros inibidoresde HSP90 altera a função de HSP90 e inibe o dobramento. Em concentraçõesaltas, tem sido mostrado que ansamicinas e outros inibidores de HSP90 previnem a ligação de substratos de proteína em HSP90 (Scheibel, T., H. etal, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96:1297-302; Schulte, T. W. et al, J.Biol Chem. 1995, 270:24585-8; Whitesell, L., et ai, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 1994, 91:8324-8328). Também tem sido demonstrado que ansamicinasinibem a liberação dependente de ATP dos substratos de proteína associada à

chaperona (Schneider, C, L. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996,93:14536-41; Sepp-Lorenzino etal.,J. Biol. Chem. 1995, 270:16580-16587).Em qualquer caso, os substratos são degradados por um processo dependentede ubiquitina no proteassoma (Schneider, C, L., supra; Sepp-Lorenzino, L.,et ai, J. Biol. Chem., 1995, 270:16580-16587; Whitesell, L. et ai, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 1994, 91: 8324-8328).

Esta desestabilização de substrato ocorre em tumor e emcélulas não-transformadas semelhantes e tem sido mostrado que éespecificamente eficaz sobre um subconjunto de reguladores de sinalização,por exemplo, Raf (Schulte, T. W. et ai, Biochem. Biophys. Res. Commun.

1997, 239:655-9; Schulte, T. W., et al, J. Biol. Chem. 1995, 270:24585-8),receptores de esteróide nuclear (Segnitz, B., e U. Gehring. J. Biol. Chem.1997, 272:18694-18701; Smith, D. F. et al, Mol Cell. Biol. 1995,15:6804-12), v-src (Whitesell, L., et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1994, 91:8324-8328)e certas tirosina quinases de transmembrana (Sepp-Lorenzino, L. et al, J. Biol. Chem. 1995, 270:16580-16587) tal como receptor de EGF (EGFR),Her2/Neu (Hartmann, F. et al, Int. J. Câncer 1997, 70:221-9; Miller, P. et al,Câncer Res. 1994, 54:2724-2730; Mimnaugh, E. G. et al, J. Biol. Chem.1996, 271:22796-801; Schnur, R. et al, J. Med. Chem. 1995, 38:3806-3812),CDK4, e p53 mutante (Erlichman et al, Proc. AACR 2001, 42, abstract4474). A perda induzida por ansamicina destas proteínas acarreta rompimentode certas rotas regulatórias e resulta em parada de crescimento em fasesespecíficas do ciclo celular (Muise-Heimericks, R. C. et ai, J. Biol. Chem.1998, 273:29864-72), e apoptose, e/ou diferenciação de células assim tratadas(Vasilevskaya, A. et ai, Câncer Res., 1999, 59:3935-40).

Em adição à atividade anti-câncer e antitumorogênica,inibidores de HSP90 também têm estado implicados em uma ampla variedadede outras utilidades, incluindo o uso como agentes antiinflamação, agentes dedoença anti-infecciosa, agentes para tratamento de autoimunidade, agentes para tratamento de derrame cerebral, isquemia, distúrbios cardíacos e agentesúteis na promoção de regeneração de nervo (veja, por exemplo, Rosen et ai,Publicação PCT de No. WO 02/09696 (PCT/USO1/23640); Degranco et ai,WO 99/51223 (PCT/US99/07242); Gold, Patente U.S. de No. 6.210.974 BI;DeFranco et ai, Patente U.S. de No.6.174.875). Sobrepondo um pouco com oacima, há relatórios na literatura de que distúrbios fibrogenéticos, incluindomas não limitados a escleroderma, polimiosite, lúpus sistêmico, artritereumatóide, cirrose hepática, formação de quelóide, nefrite intersticial, efibrose pulmonar, também podem ser tratáveis. (Strehlow, WO 02/02123(PCT/USO 1/20578)). Ainda mais modulação de HSP90, seus moduladores eusos estão relatados nos Pedidos Internacionais de Nos. PCT/US03/04283,PCT/US02/35938, PCT/US02/16287, PCT/US02/06518, PCT/US98/09805,PCT/US00/09512, PCT/US01/09512, PCT/USO 1/23640, PCT/USO 1/46303,PCT/US01/46304, PCT/US02/06518, PCT/US02/29715, PCT/US02/35069,PCT/US02/35938, PCT/US02/39993, PCT/US03/10533, PCT/US03/02686, e Pedidos Provisórios U.S. de Nos. 60/293,246, 60/371,668, 60/331,893,60/335,391, 60/128,593, 60/337,919, 60/340,762, e 60/359,484. Ansamicinasassim são grandemente promissoras para o tratamento e/ou a prevenção demuitos tipos de distúrbios. Contudo, como muitas outras drogas lipofílicas,são difíceis de preparar para aplicações farmacêuticas, especialmenteformulações intravenosas injetáveis. Até agora, tentativas têm sido feitas parausar vesículas lipídicas e emulsões do tipo óleo-em-água, mas estas têm atéaqui incluindo etapas de processamento complicadas, uso de solvente irritanteou clinicamente inaceitável, instabilidade de formulação, e/ou irritação nosítio de injeção. Veja geralmente Vemuri, S. e Rhodes, C.T., "Preparation andcharacterization of liposomin as therapeutic delivery systems: a review",Pharmaceutica Acta Helvetiae 1995, 70, pp. 95-111; veja tambémPCT/US99/30631, publicado aos 29 de junho de 2000 como WO 00/37050.

Portanto existe uma necessidade por métodos de formulação eprodutos alternativos que possam melhorar ou negar uma ou mais destasdeficiências, e a presente invenção satisfaz esta necessidade.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção caracteriza-se por formulações farmacêuticas emétodos de produção e de uso das mesmas. As formulações são dispersõescompreendidas de complexos de fosfolipídeos e um ou mais compostosfarmaceuticamente ativos, ou uma forma polimorfa, solvato, éster, tautômero,enanciômero, sal farmaceuticamente aceitável, ou uma pró-droga dosmesmos.

Em muitas das modalidades, os compostos farmaceuticamenteativos são ansamicinas e a formulação total está substancialmente destituídade triglicerídeos de cadeia média e longa. As formulações podem seresterilizadas por filtração, liofilizadas e/ou congeladas e, dependendo dalipofilicidade / hidrofobicidade específica do(s) composto(s) usado(s),oferecem a vantagem de proporcionarem concentrações mais altas decomposto Iipofílico por volume unitário fisiológico aquoso do que seriapossível de outro modo na forma não-complexada usando métodosconhecidos tal como emulsificação. Capacidade de diluição também éintensificada pelas formulações e pelos métodos da invenção, do mesmomodo a tolerabilidade do indivíduo no sítio de injeção intravenosa quandousada para tal. Sem se ligar a teoria, os Requerentes acreditam que o último édevido à compatibilidade fisiológica maior dos fosfolipídeos e suasproporções relativamente grandes usadas nas formulações da invenção.

Um primeiro aspecto da invenção refere-se às formulações farmacêuticas. Cada uma destas formulações farmacêuticas contém uma quantidadefarmaceuticamente eficaz de uma ansamicina, ou uma forma polimorfa, um solvato,um éster, um tautômero, um enanciômero, um sal farmaceuticamente aceitável ouuma pró-droga da mesma, e um fosfolipídeo farmaceuticamente aceitável paraformar partículas dispersáveis em água, no qual a formulação está substancialmente

destituída de triglicerídeos de cadeia média e longa, e o fosfolipídeo está presenteem uma concentração de pelo menos 5% p/p de citada formulação. Em algumasmodalidades, os triglicerídeos de cadeia média e longa estão presentes em umaconcentração combinada de cerca de 1% p/v ou menor.

Quaisquer ansamicinas farmaceuticamente ativas podem ser

usadas nas formulações farmacêuticas da invenção. Em algumas modalidades,a ansamicina é selecionada dos seguintes compostos:

<table>table see original document page 7</column></row><table>Em algumas modalidades, a ansamicina é 17-AAG. Emalgumas outras modalidades, a 17-AAG está na forma de um sal dehidrocloreto ou de um sal de fosfato. Em algumas outras modalidades, a 17-AAG é a forma polimorfa ou de alto ponto de fusão, a forma de baixo ponto de fusão, a forma amorfa, ou quaisquer combinações das formas acima. Emalgumas modalidades, a forma de baixo ponto de fusão de 17-AAG écaracterizada por temperaturas de fusão de DSC abaixo de 175°C e por umpadrão de difração de raios-X em pó compreendendo picos localizados em a5,85 graus, 4,35 graus e 7,90 graus de ângulos dois-teta. Em algumas outras modalidades, a forma de baixo ponto de fusão de 17-AAG é caracterizada poruma temperatura de fusão de DSC de cerca de 156°C e por um padrão dedifração de raios-X em pó compreendendo picos localizados em 5,85 graus,4,35 graus e 7,90 graus de ângulos dois-teta. Em ainda outras modalidades, aforma polimorfa de baixo ponto de fusão de 17-AAG é caracterizada por umatemperatura de fusão de DSC de cerca de 172°C.

Adicionalmente, a concentração de ansamicina, ou de umaforma polimorfa, um solvato, um éster, um tautômero, um enanciômero, umsal farmaceuticamente aceitável ou uma pró-droga da mesma, nasformulações farmacêuticas da invenção pode estar em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL, cerca de 5,0 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, ou maior.

Os fosfolipídeos em algumas modalidades das formulaçõesfarmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais membros selecionadosde fosfatidilcolina, fosfatidalserina, fosfatidilinositol, fosfatidil-etanol-amina,e Phospholipon 90G. Em muitas modalidades particulares, os fosfolipídeos incluem Phospholipon 90G. O tamanho de partícula das partículasdispersáveis em água pode ser reduzido usando um ou mais de sonicação,homogeneização de cisalhamento alto, microfluidização, e extrusão através defiltros de poro controlado. O tamanho de partícula das partículas dispersáveisem água é de cerca de 200 nm ou menor. Em algumas modalidades, otamanho de partícula está entre 100 nm e 200 nm. Em outras modalidades, otamanho de partícula está entre cerca de 50 nm e 200 nm, e em outrasmodalidades o tamanho de partícula é coloidal. Além disso, algumasmodalidades das formulações farmacêuticas da invenção incluem um ou maisexcipientes que podem servir como um ou mais de crioprotetor, modificadorde tonicidade e agente encorpante.

Um segundo aspecto da invenção refere-se aos métodos depreparação de formulações farmacêuticas de ansamicina. O métodopreparativo inclui as seguintes etapas:

(a) formar partículas de dispersão compreendendo umaansamicina, ou uma forma polimorfa, um solvato, um éster, um tautômero,um enanciômero, um sal farmaceuticamente aceitável ou uma pró-droga damesma; e um fosfolipídeo farmaceuticamente aceitável;

(b) opcionalmente reduzir o tamanho de citadas partículas de

dispersão;

(c) opcionalmente congelar o produto de etapa (a) ou (b);

(d) opcionalmente descongelar o produto de etapa (c);

(e) opcionalmente liofilizar o produto de qualquer uma dasetapas (a)-(d); e

(f) opcionalmente reidratar o produto de etapa (e); e

no qual a citada formulação está substancialmente destituídade triglicerídeos de cadeia média e longa.

O método da invenção, em algumas modalidades, mudeadicionalmente incluir adicionar um ou mais excipientes que servem comoum ou mais de crioprotetor, modificador de tonicidade e agente encorpante.O método é para a preparação de formulações farmacêuticasde ansamicina, em particular, geldanamicina, 17-AAG, DMAG, Composto563, Composto 237, Composto 956, Composto 1236, ou suas combinações.Em algumas modalidades, o método é para a preparação de formulaçõesfarmacêuticas de 17-AAG, geldanamicina ou DMAG. Em modalidadesparticulares, o método é para a preparação de formulações farmacêuticas de,17-AAG. Em outras modalidades, o método é para a preparação deformulações farmacêuticas de formas de alto ponto de fusão, de baixo pontode fusão, formas amorfas ou quaisquer combinações das mesmas, de 17-AAG. Em algumas modalidades particulares, o método é para a preparação deforma finamente dividida de uma forma de baixo ponto de fusão de, 17-AAG.A concentração da ansamicina, de seu sal farmaceuticamenteaceitável, de sua pró-droga, na formulação farmacêutica preparada pelométodo da invenção é pelo menos cerca de 5,0 mg/mL em outras modalidadese é pelo menos de cerca de 50 mg/mL ou maior em ainda outras modalidades.

Os fosfolipídeos usados nos métodos da invenção incluemfosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidil-etanol-amina,Phospholipon 90G, ou qualquer combinação das mesmas. Em algumasmodalidades, os fosfolipídeos usados incluem fosfatidilcolina, Phospholipon90G, Phospholipon 90G, ou qualquer combinação das mesmas. Em outrasmodalidades, os fosfolipídeos usados incluem fosfatidilcolina, fosfatidil-etanol-amina, Phospholipon 90G, ou qualquer combinação das mesmas. Emalgumas modalidades particulares, os fosfolipídeos usados incluemPhospholipon 90G.

O método de preparar as formulações farmacêuticas podeincluir uma etapa de reduzir o tamanho de partícula das partículas dedispersão. Em algumas modalidades, a redução de tamanho de partícula érealizada usando um ou mais de sonicação, homogeneização de cisalhamentoalto, microfluidização, e extrusão através de filtros de tamanho de porocontrolado. Em algumas modalidades, a redução é realizada usandohomogeneização de cisalhamento alto e/ou microfluidização. Em outrasmodalidades, a redução é realizada usando homogeneização de cisalhamentoalto e/ou extrusão através de filtros de tamanho de poro controlado. Ométodo, em algumas modalidades, produz partículas de dispersão possuindotamanhos de partícula que são coloidais, que estão entre cerca de 50 nm e 200nm, que estão entre cerca de 100 nm e 200 nm, ou que são de cerca de 200 nmou menores. Em algumas modalidades, os tamanhos de partícula estão entrecerca de 100 nm e 200 nm. Em outras modalidades, os tamanhos de partículasão de 200 nm ou menores. Em ainda outras modalidades, os tamanhos departícula são coloidais.

Um terceiro aspecto da invenção está relacionado com osmétodos de tratamento ou de prevenção de um distúrbio em um mamífero,pela administração a um mamífero de uma quantidade farmaceuticamenteeficaz de qualquer uma das formulações farmacêuticas que é o primeiroaspecto da invenção ou de uma formulação farmacêutica preparada porqualquer um dos métodos preparativos.

O método de tratamento pode ser usado para tratar isquemia,distúrbios proliferativos, infecções, distúrbios neurológicos, tumores,leucemias, leucemia linfocítica crônica, neoplasmas, cânceres, carcinomas,síndrome de imunodeficiência adquirida, e doenças malignas. Dentre asdoenças proliferativas, contra as quais o método é aplicável encontram-setumores, doenças inflamatórias, infecção fúngica, infecção por levedura, einfecção viral.

Em algumas modalidades do método de tratamento dainvenção, a ansamicina, ou uma forma polimorfa, solvato, éster, tautômero,enanciômero, sal farmaceuticamente aceitável ou uma pró-droga da mesma, éadministrada em uma concentração de cerca de 1-1,5% (p/p) na formulaçãofarmacêutica, ou em uma concentração entre cerca de 0,5 mg/mL e 50mg/mL.

Em algumas modalidades do método de tratamento, aansamicina nas formulações farmacêuticas é selecionada de geldanamicina,DMAG, 17-AAG, Composto 563, Composto 237, Composto 956, eComposto 1236. Em algumas modalidades, a ansamicina é 17-AAG. Emoutras modalidades, a 17-AAG é selecionada de uma forma de alto ponto defusão, forma de baixo ponto de fusão, uma forma amorfa de 17-AAG, ouquaisquer combinações das mesmas. Em ainda outras modalidades, aansamicina compreende uma forma de baixo ponto de fusão de 17-AAG.

Um quarto aspecto da invenção é o uso de formulações defosfolipídeo da invenção na manufatura de um medicamento.

Ainda outro aspecto da invenção é o uso das formulações defosfolipídeo da invenção na manufatura de medicamentos para o tratamentoprofilático ou terapêutico de condições e doenças mediadas por HSP90discutidas acima.

Deve ser entendido que qualquer um dos aspectos emodalidades da invenção podem ser combinados em qualquer maneira ondeprática; aquelas pessoas experientes na técnica reconhecerão os meios com osquais as várias modalidades podem ser combinadas de maneira útil dentro doespírito da invenção.

INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA

Todas as publicações e pedidos de patente neste relatóriodescritivo são aqui incorporados como referência na mesma extensão como secada publicação ou pedido de patente individual fosse específica eindividualmente indicado para ser incorporado como referência.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As características novas da invenção são descritas comparticularidade nas reivindicações anexas. Um entendimento melhor dascaracterísticas e das vantagens da presente invenção será obtido comreferência à seguinte descrição detalhada que relata modalidades ilustrativas,nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhosacompanhantes dos quais:

FIGURA 1 mostra o padrão de difração de raios-X em pó daforma de alto ponto de fusão de 17-AAG mostrando picos em ângulos dois-tetade 7,40, 6,08 e 11,84.

FIGURA 2 mostra o padrão de difração de raios-X em pó daforma de baixo ponto de fusão de 17-AAG mostrando picos em ângulos dois-teta de 5,85, 4,35 e 7,90.

FIGURA 3 mostra varredura de calorimetria diferencial devarredura (DSC) da forma de alto ponto de fusão de 17-AAG.

FIGURA 4 mostra uma varredura de DSC da forma de baixoponto de fusão de 17-AAG.

FIGURA 5 mostra a taxa de dissolução intrínseca (mg/cm2) de17-AAG de baixo ponto de fusão e de alto ponto de fusão versus o tempo(min) em etanol.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Embora modalidades preferidas da presente invenção tenhamsido aqui mostradas e descritas, será óbvio para aquelas pessoas experientesna técnica que tais modalidades são proporcionadas apenas como meio deexemplo. Numerosas variações, mudanças, e substituições ocorrerão paraaquelas pessoas experientes na técnica sem se desviarem da invenção. Deveser entendido que várias alternativas às modalidades da invenção aquidescritas podem ser empregadas na prática da invenção. É intencionado queas reivindicações seguintes definam o escopo da invenção e que os métodos eas estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejamcobertos pelas mesmas.

A invenção é caracterizada por formulações farmacêuticasbaseadas em fosfolipídeo de ansamicinas e por método de produção e de usodas mesmas. Os requerentes têm observado que as ansamicinas solúveis emágua ou ligeiramente solúveis em água ou sais solúveis em água deansamicinas insolúveis em água podem ser formulados em dispersões defosfolipídeos farmaceuticamente aceitáveis. Requerentes observaramadicionalmente que formas polimórficas diferentes de ansamicinas cristalinaspossuem características de dissolução diferentes, por exemplo, 17-AAGpossui formas de baixo ponto de fusão que exibem taxas de dissoluçãosignificativamente mais altas do que as formas de alto ponto de fusão. Beneficiando-se das vantagens destas propriedades, os Requerentes têmplanejado formulações para drogas insolúveis em água, por exemplo,ansamicinas, que são adequadas para administração a um paciente. Apreparação de uma tal formulação é relativamente simples, tipicamente utilizareagentes clinicamente aceitáveis, e resulta em um produto que dáestabilidade na armazenagem.

A presente invenção difere das formulações de emulsãodescritas em PCT/US03/10533 pelo fato de que as presentes formulaçõescontêm níveis menores de triglicerídeos de cadeia média (MCT) e detriglicerídeos de cadeia longa. MCT podem acarretar formação metabólica de octanoato, que pode ocasionar efeitos no sistema nervoso central tais comosonolência, náusea, entorpecimento e mudanças em EEG. Veja Cotter et al,Am. J. Clin. Nutr. 1090 50:794-800; Miles et al, Journal of Parenteral andEnteral Nutrition 1991 15:37-41; Traul et al, Food Chem. Toxicol 200038:79-98. Adicionalmente, as formulações presentemente reivindicadas dos Requerentes são bem toleradas durante administração intravenosa.

Embora a invenção seja aqui ilustrada usando uma ansamicina,17-AAG, deve ser entendido que o método novo de formulação de droga aquidescrito aplica-se às outras drogas lipofílicas, de solubilidade baixa emágua.Também deve ser entendido que o método adicionalmente se aplica a muitas outras ansamicinas incluindo, mas não limitadas a, àquelasexemplificadas nos Exemplos 1-12 da seção de EXEMPLO, tais comogeldanamicina, 17-N,N-dimetil-amino-etil-amino-geldanamicina (DMAG), e17-AAG. Deve ser entendido adicionalmente que o método novo deformulação de droga aqui descrito aplica-se a ambas as formas de baixo pontode fusão e de alto ponto de fusão de 17-AAG. Ainda mais, a formulaçãoadicionalmente se aplica às formas polimorfas, tautômeros, enanciômeros,sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos compostos descritos.I. DEFINIÇÕESOs seguintes termos de reivindicação possuem os seguintes

significados, e os termos de reivindicação não aparecendo especificamenteabaixo possuem seu significado costumeiro comum como usado na técnica:

O termo "pró-droga" ou "pró-droga farmaceuticamenteaceitável" é uma droga farmaceuticamente ativa covalentemente ligada em um veículo no qual a liberação da droga farmaceuticamente aceitável ocorrein vivo quando a pró-droga é administrada a um indivíduo mamífero. Pró-drogas dos compostos da presente invenção são preparadas por modificaçãode grupos funcionais presentes nos compostos em um tal modo que os gruposmodificados são clivados, quer em manipulação rotineira quer in vivo, para dar o composto desejado. Pró-drogas incluem compostos nos quais gruposhidroxila, amina, ou sulfidrila estão ligados em qualquer grupo que, quandoadministradas a um indivíduo mamífero, é clivado para formar um grupohidroxila, amino, ou sulfidrila livre, respectivamente. Exemplos de pró-drogasincluem, mas não são limitados a, derivados acetato, formiato ou benzoato degrupos funcionais álcool ou amina nos compostos da presente invenção;ésteres fosfato, ésteres de dimetil-glicina, amino-alquil-benzil-ésteres, amino-alquil-ésteres ou carbóxi-alquil-ésteres de grupos funcionais álcool ou fenolnos compostos da presente invenção; ou semelhante. Pró-drogas podemproporcionar múltiplas vantagens para a liberação de droga, por exemplo, como explicado em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20*Edition, Ch. 47, pp. 913-914.

"Sais farmaceuticamente aceitáveis" incluem aquelesderivados de bases e ácidos orgânicos e inorgânicos farmaceuticamenteaceitáveis. Exemplos de ácido adequados incluem ácido clorídrico, ácidobromídrico, ácido sulfürico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fumárico,ácido maleico, ácido fosfórico, ácido glicólico, ácido glicônico, ácido lático,ácido salicílico, ácido succínico, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido tartárico,ácido acético, ácido cítrico, ácido metano-sulfônico, ácido fórmico, ácidobenzóico, ácido malônico, ácido naftaleno-2-sulfônico, ácido benzeno-sulfônico, ácido 1,2-etano-sulfônico (edisilato), ácido galacosil-d-glicônico esemelhante. Outros ácidos, tal como ácido oxálico, embora em si mesmos nãofarmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados na preparação de saisúteis como intermediários na obtenção de compostos desta invenção e seussais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. Sais derivados de basesapropriadas incluem sais de metal alcalino (por exemplo, sódio), de metalalcalino-terroso (por exemplo, magnésio), de amônio e de N-(Ci-C4 alquila)/,e semelhante. Exemplos ilustrativos de alguns destes incluem hidróxido desódio, hidróxido de potássio, hidróxido de colina, carbonato de sódio, esemelhante. Onde a reivindicação recita "um composto (por exemplo,composto 'x') ou "seu sal farmaceuticamente aceitável" e apenas o composto émostrado, aquelas reivindicações são para serem interpretadas comoincluindo, alternativa ou conjuntamente, um sal farmaceuticamente aceitávelou sais farmaceuticamente aceitáveis de tal composto.

Uma "quantidade farmaceuticamente eficaz" significa umaquantidade que é capaz de proporcionar um efeito terapêutico e/ou profílático.Claro que a dose específica de composto administrada de acordo com estainvenção para obter o efeito profílático e/ou terapêutico será determinadapelas circunstâncias particulares circundando o caso, incluindo, por exemplo,o composto específico administrado, a rota de administração, a condiçãosendo tratada, e o indivíduo sendo tratado. Uma dose diária típica(administrada em doses únicas ou divididas) conterá um nível de dosagem decerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50-100 mg/kg de peso corporal de umcomposto ativo da invenção. Doses diárias preferidas serão de cerca de 0,05mg/kg a cerca de 20 mg/kg e idealmente de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10mg/kg. Fatores tais como taxa de depuração, meia-vida, e dose toleradamáxima (MTD) ainda têm que ser determinadas por uma pessoaordinariamente experiente na técnica que pode determinar estes usandoprocedimentos padrão.

Alguns dos compostos aqui descritos podem conter um oumais centros quirais e portanto podem existir em formas enancioméricas ediastereoméricas. O escopo da presente invenção é intencionado para cobrirtodos os isômeros per se, bem como misturas de isômeros eis e trans, misturasde diastereômeros e também misturas racêmicas de enanciômeros (isômerosópticos). Além disso, é possível o uso de técnicas bem conhecidas paraseparar as várias formas, e algumas modalidades da invenção podem sercaracterizadas por espécies purificadas ou enriquecidas de um dadoenanciômero ou diastereômero. Em adição, alguns dos compostos da presenteinvenção podem existir como tautômeros, que são isômeros que diferem peloposicionamento de um próton e a localização correspondente de uma ligaçãodupla. O escopo da presente invenção é intencionado para cobrir todas asformas tautoméricas. Além disso, os compostos aqui descritos podem existircomo solvatos, que refere-se à combinação de citados compostos, ou de íonsde citados compostos, com uma ou mais moléculas de solvente. O escopo dapresente invenção é intencionado para cobrir todas as formas solvatadas doscompostos aqui descritos.

Os termos "dispersão", "colóide" e "emulsão" possuem ossignificados na técnica consistentes com REMINGTON'S THE SCIENCEAND PRACTICE OF PHARMACY, 20th Edition, Gennaro, A.R. Ed., (2000)e denotam sistemas multifásicos compreendidos de dois ou mais ingredientesque não são completamente miscíveis uns nos outros. Dispersões podem serclassificadas em grupos diferentes baseados no tamanho das partículasdispersadas. Dispersões coloidais são caracterizadas por partículasdispersadas dentro da faixa de aproximadamente 1 nm a 0,5 um. Dispersõesgrosseiras são caracterizadas por tamanhos de partícula acima de 0,5 um, eincluem suspensões e emulsões. Para a maior parte, os tipos diferentes dedispersões podem ser detectados por técnicas microscópicas e/ou espalhamento de luz, incluindo, por exemplo microscopia eletrônica.

"Liofilização" é a remoção ou a remoção substancial delíquido de uma amostra, por exemplo, por sublimação. Remoção de faseaquosa / de solvente pode ser realizada usando qualquer procedimento mas égeralmente realizada sob pressão reduzida, isto é, vácuo, em quaisquer pressão e temperatura razoáveis, incluindo temperatura ambiente com umacorrente de nitrogênio, desde que adequada para conservar a integridadefuncional da droga farmaceuticamente ativa. Os termos "liofilização" e"liofilizado" não implicam necessariamente eliminação de 100% de solventee/ou solução, e podem requerer percentagens menores de remoção. Remoção substancial é tipicamente remoção de cerca de 95%.

Uma "condição atmosférica inerte" é uma que é relativamentemenos reativa do que o ar das condições atmosféricas padrão. O uso de gásnitrogênio puro ou substancialmente puro é um exemplo de uma condiçãoatmosférica inerte. Pessoas ordinariamente experientes na técnica estão familiarizadas com outras.

O termo "hidratação" ou "reidratação" significa adição de umasolução aquosa, por exemplo, água ou um tampão fisiologicamentecompatível tal como solução de Hank, solução de Ringer, tampão salinofisiológica, ou dextrose 5% em água.Um "veículo fisiologicamente aceitável" refere-se a um

veículo ou diluente que não causa irritação a um organismo e não anula aatividade biológica e as propriedades do composto administrado.

O termo "excipiente" refere-se a uma substânciasfarmaceuticamente aceitável não-tóxica adequada para uma composiçãofarmacológica para facilitar o processamento, a administração e acaracterística física de um composto. Exemplos de excipientes podem incluir,mas não são limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, váriosaçúcares incluindo manitol, sacarose, e/ou dextrose, e tipos de amido,derivados de celulose, gelatina, vários agentes tamponantes tais como fosfato,lactato, tartarato, maleato e/ou acetato de sódio, aminoácidos, ácidos deaçúcar (por exemplo, glicocoronato e/ou gliconato), e agentes tixotrópicos taiscomo poli(etileno-glicol), poli(vinil-pirrolidona) e/ou poloxâmeros (co-polímeros).

O termo "estabilizador" pode ser sinônimo de "agenteencorpante" ou "agente de congelamento-descongelamento" e vice versa,embora não necessite sê-lo. "Agentes encorpantes" são um tipo de excipienteque geralmente proporciona um suporte mecânico para uma formulaçãoliofilica pela permissão de que a matriz de formulação seca mantenha suaconformação. Tipicamente, os agentes encorpantes são açúcares. Açúcarescomo aqui usados incluem mas não são limitados a monossacarídeos,dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Exemplos específicosincluem mas não são limitados a frutose, glicose, manose, trealose, sorbose,xilose, maltose, lactose, sacarose, dextrose, e dextrano. Açúcar também incluialcoóis de açúcar, tais como manitol, sorbitol, inositol, dulcitol, xilitol earabitol. Misturas de açúcares também podem ser usadas de acordo com estainvenção. Vários agentes encorpantes, por exemplo, glicerol, açúcares,alcoóis de açúcar, e mono- e dl-sacarídeos também servem com a função deagentes isotônicos. Agentes encorpantes para uso na invenção não limitadosapenas pelas consideração físico-químicas, tais como solubilidade, capacidadede conservar o tamanho de gotícula e a integridade da emulsão durantecongelamento, secagem, armazenagem e reidratação e falta de reatividadecom o composto / droga ativo(a), e limitados também pela rota deadministração. Geralmente, os agentes encorpantes são quimicamente inertesà(s) droga(s) e não possuem ou possuem toxicidade ou efeitos colateraisprejudiciais extremamente limitados sob as condições de uso. Em adição aosveículos agente encorpante, outros veículos que podem ou não servir para opropósito de agentes encorpantes incluem, por exemplo, adjuvantes,excipientes, e diluentes bem conhecidos e prontamente disponíveis na técnica.

Um agente encorpante exemplar para a invenção é sacarose.Sem ser ligado à teoria, é considerado que sacarose forma um vidro amorfosob congelamento e subseqüente liofilização, permitindo a intensificação deestabilidade potencial da formulação pela formação de uma dispersão na qualo complexo de droga-fosfolipídeo está contido dentro de um vidro rígido.Estabilidade também pode ser intensificada em virtude do açúcar atuandocomo uma reposição de água perdida sob liofilização. As moléculas deaçúcar, em vez das moléculas de água, tornam-se ligadas no fosfolipídeointerfacial por meio de ligações de hidrogênio. Outros agentes encorpantesque possuem estas características e que podem ser substituídos incluem masnão são limitados a poli(vinil-pirrolidona) (PVP) e manitol.

O termo "ansamicina" é um termo amplo que caracteriza oscompostos possuindo uma estrutura "ansa" que compreende qualquer um dosgrupos benzoquinona, benzo-hidro-quinona, naftoquinona ou nafto-hidro-quinona ligados por ponte por uma cadeia alifática longa. Compostos daclasse de naftoquinona ou de nafto-hidro-quinona são exemplificados poragentes clinicamente importantes rifampicina e rifamicina, respectivamente.Compostos da classe de benzoquinona são exemplificados por geldanamicina(incluindo seus derivados sintéticos 17-alil-amino-17-demetóxi-geldanamicina (17-AAG), 17-N,N-dimetil-amino-etil-amino-17-demetóxi-geldanamicina (DMAG)), di-hidro-geldanamicina e herbamicina. A classe debenzo-hidro-quinona é exemplificada por macbecina. O termo "ansamicinas"como aqui usado também pode incluir sais farmaceuticamente aceitáveis deansamicinas, bem como pró-drogas de ansamicina, que sob administração aum indivíduo é metabolizado em compostos mais ou menosfarmacologicamente ativos. Pró-drogas são tipicamente empregadas paraintensificar um ou mais de solubilidade, liberação e/ou persistência e presençabiológica de um composto farmacológico em um paciente individual.

O termo "fosfolipídeo" inclui qualquer lipídeo contendo ácidofosfórico como mono- ou di-éster. Os fosfolipídeos da invenção podem sersintéticos, naturais, ou semi-sintéticos e podem, embora não necessariamente,compartilhar identidade com fosfolipídeos de membrana celular conhecidostais como fosfoglicerídeos e esfingomielina.

O termo "fosfoglicerídeo" como aqui usado, refere-se a umcomposto derivado de glicerol, um álcool de três carbonos, e possuindo umaestrutura principal de glicerol esterificada em duas cadeias de ácido graxo viadois grupos hidroxila de glicerol para formar um intermediário, fosfatidato.As cadeias de ácido graxo tipicamente contêm entre 14 e 24 átomos decarbono, com 16 e 18 sendo mais comuns. As cadeias podem estar quersaturadas quer insaturadas. O próprio grupo fosfato é então esterificado para ogrupo hidroxila de um dos vários alcoóis diferentes, com o mais comumsendo serina, etanol-amina, colina, glicerol, e inositol. Fosfoglicerídeosexemplares incluem, mas não são limitados a, fosfatidilcolina (PC),fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), fosfatidil-etanol-amina (PE).Esfingomielina é derivada de esfingosina, um amino-álcool que contém umacadeia de hidrocarboneto insaturada, longa. Em esfingomielina, o grupoamino da estrutura principal de esfingosina é ligado em um ácido graxo poruma ligação amida. Em adição, o grupo hidroxila primário de esfingosina estáesterificado em fosforil-colina. Veja, por exemplo, Stryer, BIOCHEMISTRY,Second Edition, pp. 206-211 (1981).

Adicionalmente, fosfoglicerídeos também incluem lecitinas."Lecitinas" são misturas naturalmente ocorrentes de diglicerídeos de ácidosesteárico, palmítico, e oleico, ligados no colina-éster de ácido fosfórico.Fosfolipídeos preferidos para uso com a invenção são lecitina de soja, porexemplo, Phospholipon 90G como fornecida por American LecithenCompany (Oxford, CT, USA). Outras fontes comerciais e métodos depreparação são conhecidos pelo técnico experiente. Por exemplo, TWEEN®80 (monooleato de polioxietileno-sorbitana) e Poloxâmero 188 são outrosreagentes comerciais previstos para trabalhar.

Os fosfolipídeos da invenção estão tipicamente presentes emconcentrações de cerca de 0,5-20% p/v baseado na quantidade de água e/oude outros componentes na qual o tensoativo está dissolvido. Geralmente, ofosfolipídeo está presente em uma concentração de cerca de 0,5-10% p/v,tipicamente de cerca de 1-8% p/v.

Para prevenir ou minimizar degradação oxidativa ouperoxidação de lipídeo, antioxidantes, por exemplo, alfa-tocoferol e hidróxi-tolueno butilado, podem ser incluídos em adição à, ou alternativamente à,privação de oxigênio (por exemplo, formulação na presença de gases inertestais como nitrogênio e argônio, e/ou o uso de recipientes resistentes à luz).

O termo "triglicerídeo" como aqui usado refere-se a um triésterde glicerol (HO-CH(CH2OH)2). Os três grupos éster podem ser idênticos, dostrês podem ser iguais, com o terceiro sendo diferente ou todos os três podemser diferentes.

O termo "triglicerídeo de cadeia curta" como aqui usado,refere-se a um triglicerídeo compreendendo grupos éster contendo menos doque 8 átomos de carbono lineares.

O termo "triglicerídeo de cadeia média" como aqui usado,refere-se a um triglicerídeo compreendendo grupos éster contendo 8 a 12átomos de carbono lineares.

O termo "triglicerídeo de cadeia longa" como aqui usado,refere-se a um triglicerídeo compreendendo grupos éster contendo mais doque 12 átomos de carbono lineares.O termo "cerca de" significa incluir e acima até 20% ponto(s)extremo(s) específico(s) designado(s).

O termo "opcionalmente" denota que a etapa ou o componenteapós o termo pode, mas não precisa ser, uma parte do método ou daformulação.

O termo "substancialmente destituído de" em referência aostriglicerídeos de cadeia média e longa significa que estes itens singularmentecompreendem 5% p/v (coletivamente 10% p/v) ou menos da formulaçãointeira. Assim qualquer faixa de cerca de 0% a 5% de espécies de triglicerídeode cadeia média ou longa constitui "substancialmente destituído".II. PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕESA. Preparação de Ansamicinas

Ansamicinas de acordo com esta invenção podem sersintéticas, naturalmente ocorrentes, ou uma combinação das duas, isto é,"semi-sintéticas", e podem incluir dímeros e formas de pró-droga e variantesconjugadas. Algumas benzoquinona ansamicinas exemplares úteis nas váriasmodalidades da invenção e seus métodos de preparação incluem mas não sãolimitadas àquelas descritas, por exemplo, em Patentes U.S. de No. 3.595.955(descrevendo a preparação de geldanamicina), No. 4.261.989, No. 5.387.584,e No. 5.932.566 e aquelas descritas na seção "EXEMPLO" (Exemplos 1-12),abaixo. A purificação bioquímica do derivado de geldanamicina, 4,5-di-hidro-geldanamicina e de sua hidroquinona de culturas de Streptomyceshygroscopicus (ATCC 55256) é descrita em Cullen et al. como WO93/14215; um método alternativo de síntese para 4,5-di-hidro-geldanamicinapor hidrogenação catalítica de geldanamicina também é conhecida. Veja porexemplo, "Progress in the Chemistry of Organic Natural Products," Chemistryof the Ansamicina Antibiotics, 1976 33:278. Outras ansamicinas que podemser usadas em conexão com várias modalidades da invenção são descritas naliteratura citada em seção "FUNDAMENTOS" acima. Em adição,geldanamicina e DMAG também estão comercialmente disponíveis, porexemplo, na CN Biosciences, uma filiada daMerck KGaA, Darmstadt,Alemanha, localizada em San Diego, Califórnia, USA (cat. no. 345805) e naEMD/Calbiochem uma filiada da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha,respectivamente.

17-AAG pode ser preparado a partir de geldanamicina viareação com aliamina em THF seco sob uma atmosfera de nitrogênio. Oproduto bruto pode ser transformado em lama em H20:EtOH (90:10), e oscristais lavados obtidos possuem um ponto de fusão de 206-212°C pelatécnica de ponto de fusão em capilar. Um segundo produto de 17-AAG podeser obtido por dissolução e recristalização de produto bruto em 2-propil-álcool(isopropanol). Este segundo produto de 17-AAG possui um ponto de fusãoentre 147°C e 153°C pela técnica de ponto de fusão em capilar. Os doisprodutos de 17-AAG são designados como a forma polimórfica ou de altoponto de fusão" e a "forma de baixo ponto de fusão". A estabilidade da formade baixo ponto de fusão pode ser testada pela transformação em lama doscristais no solvente (H20:EtOH (90:10)) dos quais a forma de alto ponto defusão foi purificada; nenhuma conversão para a forma de alto ponto de fusãofoi observada. Veja Exemplos 1-2 para detalhes de preparação das duasformas polimórficas de 17-AAG. Em adição às formas de alto ponto de fusãoe de baixo ponto de fusão, é bem sabido que 17-AAG possui uma formaamorfa.

A presença de formas polimórficas diferentes pode seravaliada por difração de raios-X em pó e por calorimetria diferencial devarredura (DSC). Padrões de difração de raios-X em pó distintamentediferentes são indicativos de que os materiais são de estruturas cristalinasdiferentes. FIG. 1 mostra o padrão de difração de raios-X em pó da forma dealto ponto de fusão que inclui picos em 7,40 graus, 6,08 graus e 11,84 grausde ângulos dois-teta. FIG. 2 mostra padrão de difração de raios-X em pó de17-AAG de baixo ponto de fusão que inclui picos em 5,85 graus, 4,35 graus e7,90 graus de ângulos dois-teta. Visto que os padrões de difração de raios-Xem pó são distintamente diferentes, a 17-AGG de alto ponto de fusão e debaixo ponto de fusão contêm formas cristalinas diferentes de 17-AAG.

As localizações e intensidades dos padrões de difração deraios-X em pó para a forma de alto ponto de fusão e a forma de baixo pontode fusão de 17-AAG estão sumariadas na Tabela 1 e na Tabela 2,respectivamente.

TABELA 1. Padrão de Difração de Raios-X em Pó de uma 17-AAG de alto

ponto de fusão

3 jiie* lítíãí t ataHO. rtc d*pitt

1 2Z 1

Forma de 17-AAG de alto ponto de fusão

2 Teti

(deg)7.40426.0824

11.8400

nele 2Mapüí (dôg>

1 6.0824

2 7.4042

3 8.6000

4 10.7200

5 11.6400€ 12.4800

7 13.8800

8 14.7200

9 16.3120

10 17.3200

11 18.1600

12 20.4400

13 22.2400

14 23.1340

15 24.1200

16 25.3229

17 26.6400

18 28.7575

19 36.0400

20 36.3200

d

11.9298914.519167.46851

d

14.5191611.9298910;273588.246157.468517.0869X6.375086.013125.429665.115874.881084.341473,994003.841633.686783.514313.343473.101912.490072.43271

I/Il

1005752

1/21

57100144524016

11452221

3*528

1221

3

444

FWHHídeg)0.889400.736900.81900

F5Í3M

ídeg)

0.73630

0.88940

0.63020

0.34660

0.81908

0.91960

0.00000

0.88790

8.00000

1.36660

1.38660

0.93120

0.82570

0.00000

0.86220

0.66660

1.19500

1.77600

1.60000

34621964

leio

Intaiõdal*(ccmtagou)

19643462472125181013065463661566746711110524961400717116153143130

fri iníegrala

776784094232565

btí.integrada(ccmfagenf)409427767899071866325653660800

50640-0

26508492411702222150

203923106684270214256

TABELA 2. Padrão de Difração de Raios-X em Pó de uma 17-AAG de baixoponto de fusão<table>table see original document page 26</column></row><table>As formas polimórficas de um composto podem sercaracterizadas por suas temperaturas de fusão. Calorimetria diferencial de5 varredura (DSC) é uma técnica comum usada para determinar as temperaturasde fusão de compostos. FIG. 3 é uma varredura de DSC de 17-AAG de altoponto de fusão que mostra uma endoterma única a 204°C. FIG. 4 é umavarredura de DSC de 17-AAG de baixo ponto de fusão que mostra duasendotermas distintas, uma maior centrada a 156°C e uma menor centrada a 172°C. Cada uma das endotermas é indicativa da presença de pelo menos umaforma polimórfica. Assim, a presença de duas endotermas é indicativa de quea 17-AAG de baixo ponto de fusão pode ser composta de pelo menos duasformas polimórficas. Em adição, o evento endotérmico termina a cerca de176°C que marca o limite superior da temperatura de fusão das formas polimorfas de baixo ponto de fusão.

Em adição à DSC, outras técnicas de análise podem ser usadaspara determinar as temperaturas de fusão das formas polimorfas, análisetermogravimétrica (TGA) e ponto de fusão em capilar são outros métodoscomuns usados.Os dados de análise térmica (isto é, DSC e TGA) das formasde alto ponto de fusão e de baixo ponto de fusão de 17-AAG estão sumariadosna TABELA 3 abaixo. As temperaturas de fusão das formas de baixo pontode fusão e de alto ponto de fusão também foram analisadas pelo método deponto de fusão em capilar e os resultados são relatados nos Exemplos 1-3. Éobservado que quando se comparam as temperaturas de fusão obtidas peloponto de fusão em capilar com aquelas obtidas via DSC, há uma discrepânciade uns poucos graus em cada conjunto de dados. Esta discrepância pode seratribuída à técnica analítica usada. Medição de ponto de fusão em capilardepende da determinação visual do início e da completitude do ciclo de fusão,e os cristais coloridos muito escuros de 17-AAG tornam difícil estadeterminação.

TABELA 3. Análise térmica de 17-AAG de alto ponto de fusão versus de<table>table see original document page 27</column></row><table>A taxa de dissolução de um ingrediente farmacêutico pode ser

afetada por seu estado polimórfico. As taxas de dissolução intrínsecas dasformas de alto ponto de fusão e de baixo ponto de fusão de 17-AAG foramdeterminadas em etanol, no qual 17-AAG é solúvel. A forma de baixo pontode fusão de 17-AAG teve uma taxa de dissolução intrínseca 60% maior(0,885 mg/cm2/min) do que a da forma de alto ponto de fusão (0,550mg/cm2/min), Veja FIGURA 5.

A taxa de dissolução mais alta da forma de baixo ponto defusão pode proporcionar um processo de manufatura mais eficiente.Adicionalmente, a dissolução mais rápida pode melhorar a biodisponibilidadedo composto quando ingerido oralmente, porque à medida que o compostoestá sendo absorvido da solução no trato GI, a forma de baixo ponto de fusãopossui a vantagem de que ela pode se dissolver rapidamente de tal modo queuma solução saturada pode ser mantida e estar disponível para absorção.

A invenção contempla o uso de todas as formas polimórficasdas ansamicinas, particularmente, de todas as formas polimórficas de 17-AAG, quer em uma mistura polimórfica quer em uma forma polimórficaúnica, ou forma amorfa na preparação das formulações.B.Preparação da formulação de dosagem

Formulações da invenção podem ser preparadas de acordocom quaisquer métodos conhecidos na técnica para a manufatura decomposições farmacêuticas. Geralmente, o composto farmaceuticamente ativoé dissolvido em uma dispersão de fosfolipídeo aquosa bruta seguido porredução do tamanho de partícula da dispersão. Estas dispersões podem serprontamente esterilizadas por filtração, são estáveis aos ciclos decongelamento-descongelamento repetidos, e também podem ser armazenadascomo liofilizados.

O pH das formulações da invenção pode ser manipuladousando ácidos e bases adequadas, por exemplo, ácido clorídrico e hidróxidode sódio. Geralmente, as partículas de fosfolipídeo são dispersadas em ummeio aquoso tamponado, por exemplo, tampão acetato de sódio. Em adiçãoou alternativamente ao uso de acetato de sódio, outros tampões podem serutilizados, por exemplo, histidina (não mais do que 5 raM; pH~5), ácidolático (10-20 mM; pH~4), valina (~10-50mM; pH~3), etc.

Dispersão e redução de tamanho de partícula podem serrealizadas por uma variedade de técnicas bem conhecidas, por exemplo,misturação mecânica, homogeneização (por exemplo, usando um instrumentodo tipo energia alta Gaulin ou polytron), agitação turbulenta, e sonicação.Sonicação pode ser realizada usando um instrumento do tipo banho ou do tiposonda. Microfluidizadores estão comercialmente disponíveis, por exemplo, naMicrofluidics Corp., Newton, Mass., e são adicionalmente descritos emPatente U.S. 4.533.254, que fazem uso de passagem auxiliada por pressãoatravés orifícios estreitos, por exemplo, como contidos em várias membranasde policarbonato comercialmente disponíveis. Dispositivos de pressão baixatambém existem os quais podem ser usados. Estes dispositivos de pressãobaixa e alta podem ser usados para selecionar e/ou modular tamanho devesícula. Passagem de filtro de filtros de microcanais sob pressão alta podeser selecionada para um dado diâmetro de tamanho de partícula dispersada.Aquecimento, agitação, e/ou sonicação também podem ser usados parareduzir o tamanho de partícula.

Esterilização de uma dispersão líquida pode ser realizada porvárias técnicas de filtração. Filtração pode incluir uma pré-filtração através deum filtro de diâmetro maior, por exemplo, um filtro de 0,45 micrômetro (umfiltro de minicápsula Gelman, Pall Corp., East Hills, N.Y., USA) e entãoatravés de um filtro menor, por exemplo, um filtro de 0,2 micrômetro.Geralmente, o meio filtrante é acetato de celulose (por exemplo, Sartobran™,Sartorius AG, Goettingen, Alemanha). Uma pressão estática pode ser aplicadapara manter um fluxo contínuo e uniforme. Alternativamente, a formulaçãopode ser diretamente extrusada através de um filtro de 0,2 micrômetro oumenor. Em qualquer caso, extrusão através de um filtro de microcanal detamanho de poro de 0,2 micrômetro ou menor eficazmente esteriliza porfiltração, tornando esterilização por filtração adicional desnecessária.

Certas modalidades das formulações e dos métodos dainvenção podem incluir liofilização e reidratação em um instante de tempoadequado. Liofilização resulta em um produto que é relativamente estável econveniente para armazenagem, transporte, e manuseio. Dispositivos deevaporação rotativa comercialmente disponíveis existem para realizarremoção de solvente. Outros dispositivos e métodos são conhecidos pelotécnico experiente. Condições exemplares para liofilização podem serencontradas no Exemplo 15 mas outras condições são conhecidas por aquelaspessoas experientes na técnica. Sob hidratação e ajuste para uma concentraçãoadequada, administração pode ser convenientemente feita a um paciente,

intravenosamente ou de outro modo.

Em uma modalidade, o ingrediente farmacêutico ativo, por

exemplo, 17-AAG, é formulado como uma dispersão aquosa de fosfolipídeo 1% (p/p). A formulação é preparada por misturação de 17-AAG

em uma dispersão aquosa de fosfolipídeos em uma mistura de cisalhamento

alto por uma duração curta e então agitação lenta para remover ar aprisionado.

Quaisquer fosfolipídeos previamente descritos, tais como Phospholipon 90G,

fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidil-etanol-amina, podem ser usados. Durante o processo de formulação, outros excipientes tais

como tampões, agentes ajustadores de tonicidade, e auxiliares de processo

podem ser adicionados.

A dispersão de 17-AAG pode ser microfluidizada para reduzir

o tamanho de partícula da dispersão, tipicamente para menor do que 200 nm (tamanho de partícula médio). As dispersões podem ser esterilizadas por

filtração usando um filtro de cápsula Sartorius Sartobran P de 0,2 micrômetro

estéril (500 cm2) (Sartorius AG, Goettingen, Alemanha), com pressão de até

414 kPa usada para manter um fluxo contínuo e uniforme. O filtrado pode ser

imediatamente processado em outras formulações tais como soluções orais, injetáveis, tabletes ou cápsulas usando técnicas padrão que são conhecidas na

técnica. O filtrado também pode ser colhido, congelado, ou liofilizado para

uso futuro.

Alternativamente, a formulação pode ser preparada primeiropor preparação de uma dispersão de fosfolipídeo antes da adição dos ingredientes farmaceuticamente ativos como segue. Misturar um fosfolipídeo1-20% (p/v) em água estéril e homogeneizar a mistura para proporcionar umadispersão mais uniforme para microfluidização subseqüente. A dispersão detensoativo pode ser microfluidizada pela passagem através de umMicrofluidizador para alcançar um tamanho de partícula de, geralmente,menor do que 200 nm e tipicamente entre 100 nm e 200 nm. Os ingredientesfarmacêuticos ativos e outros excipientes são então adicionados e o pH éajustado para entre cerca de 5 e 8 usando hidróxido de sódio e/ou ácidoclorídrico diluído, e fosfato, acetato de sódio tri-hidratado 10 mM, ou tampãoequivalente. Preparação de formulações específicas é discutida nos Exemplos13el4.

III. CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA FORMULAÇÃO DEDROGA

A. Determinação de Estabilidade do Ingrediente Ativo Usando HPLC

A estabilidade química de ingrediente farmacêutico ativo, porexemplo, 17-AAG, pode ser avaliada por cromatografia líquida dedesempenho alto (HPLC).Podem ser desenvolvidos procedimentos de ensaioespecíficos que permitem a separação da ansamicina farmaceuticamenteaceitável de seus produtos de degradação. A extensão de degradação pode seravaliada quer da diminuição no sinal no pico de HPLC associado com asansamicinas farmaceuticamente ativas e/ou pelo aumento em sinal no(s)pico(s) de HPLC associado(s) com produtos de degradação. Ansamicinas,relativas aos outros componentes da formulação, são facilmente e bastanteespecificamente detectadas em seu máximo de absorbância de 345 nm.

B. Caracterização e Avaliação de Estabilidades Química e Física dosFospolipídeos

Fosfolipídeos e produtos de degradação podem serdeterminados após serem extraídos de dispersões / emulsões. A mistura delipídeo pode ser então separada em um sistema de cromatografia de camadafina (TLC) bidimensional ou em sistema de HPLC. Em TLC, manchascorrespondendo aos constituintes individuais podem ser removidas eensaiadas para conteúdo de fósforo. O conteúdo de fósforo total em umaamostra pode ser quantitativamente determinado, por exemplo, por umprocedimento usando um espectrofotômetro para medir a intensidade da corazul desenvolvida a 825 nm contra água. Em HPLC, fosfatidilcolina (PC) efosfatidilglicerol (PG) podem ser separados e quantificados com acurácia eprecisão. Lipídeos podem ser detectados na região de 203-205 nm. Ácidosgraxos insaturados exibem um máximo de absorbância alto enquanto queácidos graxos saturados exibem um máximo de absorbância menor na regiãode comprimento de onda de 200 nm do espectro de UV. Como um exemplo,Vemuri e Rhodes, supra, descreverem a separação de PC e de PG de gema deovo em Licrosorb Diol e Licrosorb S 1-60. As separações usaram uma fasemóvel de acetonitrila-metanol com 1% de hexano-água (74:16:10 v/v/v). Em8 minutos, separação de PG de PC foi observada. Tempos de retenção foramaproximadamente de 1,1 min e 3,2 min, respectivamente.C. Avaliação da Dispersão

Aparência visual da dispersão, tamanho médio de gotícula, edistribuição de tamanhos são parâmetros importantes para observar e manter.Há numerosos métodos para avaliar estes parâmetros. Por exemplo,microscopia eletrônica e de espalhamento dinâmico de luz são duas técnicasque podem ser usadas. Veja, por exemplo, Szoka e Papahadjopoulos, Annu.Rev. Biophys. Bioeng., 1980 9:467-508. Caracterização morfológica, emparticular, pode ser realizada usando microscopia eletrônica de fratura porcongelamento. Microscópios de luz menos poderosos também podem serusados. A presença de sólido cristalino pode ser determinada por microscopiaóptica de luz polarizada. Estas técnicas microscópicas são bem conhecidas natécnica.

Distribuição de tamanhos de gotícula de dispersão pode serdeterminada, por exemplo, usando um analisador de distribuição de tamanhosde partícula tal como o CAPA-500 fabricado por Horiba Limited (Ann Arbor,MI, USA), Nanatrac (Mierotrac, Largo, FL, USA), Coulter Counter(Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA), ou um Zetasizer (MalvernInstruments, Southborough, MA, USA).IV. OUTROS MODOS DE FORMULAÇÃO E ADMINISTRAÇÃOA. Outras Formulações

Embora administração intravenosa seja descrita em váriosaspectos e modalidades da invenção, uma pessoa ordinariamente experientena técnica reconhecerá que os métodos podem ser modificados ourapidamente adaptados para acomodar outros modos de administração, porexemplo, oral, aerossol, parenteral, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal,retal, vaginal, intratumoral, ou peritumoral. A seguinte discussão é largamenteconhecida pela pessoa experiente na técnica mas é contido proporcionadacomo um cenário para ilustrar outras possibilidades para a invenção. Seráreconhecido que a seguinte discussão duplica em parte as discussões préviasaqui incluídas.

Composições farmacêuticas podem ser manufaturadasutilizando processos de misturação, dissolução, granulação, preparação dedrágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ouliofilização convencionais. Composições farmaceuticamente aceitáveis podemser formuladas na maneira convencional usando um ou mais veículosfisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares quefacilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podemser usadas farmaceuticamente. Formulação apropriada é dependente da rotade administração escolhida. Alguns excipientes e seu uso na preparação deformulações já têm sido descritos. Outros são conhecidos na técnica, porexemplo, como descritos em PCT/US99/30631, REMINGTONSPHARMACEUTICAL SCIENCES, Meade Publishing Co., Easton, PA(edição mais recente), e Goodman e Gilman's THE PHARMACEUTICALBASIS OF THERAPEUTICS, Pergamon Press, New York, N.Y. (ediçãomais recente).

Para injeção, os agentes podem ser formulados em soluçõesaquosas, geralmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais comosolução de Hank, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Paraadministração mucosal, agentes de penetração apropriados para a barreira aser permeada são usados na formulação. Tais agentes de penetração sãogeralmente conhecidos na técnica.

Formulações da invenção, como descritas previamente, e sobhidratação dos bolos liofilizados, são bem adequadas para administraçãoparenteral quase-imediata ou imediata por injeção, por exemplo, por injeçãode bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção podem serapresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou emrecipientes de multidoses. Como previamente discutido, produtos liofilizadossão modalidades para a invenção; e ampolas ou outra embalagem,opcionalmente resistentes à luz, podem conter este produto liofilizado, quepode ser então convenientemente (re)-hidratado antes da administração a umpaciente.

B. Faixa de Dose

Um estudo de farmacologia de fase I de 17-AAG em pacientesadultos com tumores sólidos avançados determinou uma dose toleradamáxima (MTD) de 40 mg/m2 quando administrada diariamente por infusão de1 hora por 5 dias a cada três semanas. Wilson et ai, 2001 Am. Soe. Clin.Oncol, abstract, Phase I Pharmacologic Study of 17-(Allil-amino)-17-Demethoxygeldanamicina (AAG) in Adult Patients with Advanced SolidTumors. Neste estudo, valores de média +/- SD para meia-vida terminal,depuração e volume no estado de equilíbrio determinados foram 2,5 horas ±0,5 hora, 41,0 L/h ± 13.5 L/h, e 86,6 L/m2 ± 34,6 L/m2, respectivamente.Níveis de Cmáx em plasma determinados foraml860+/-660 nM e 3170+/-1310nM a 40 mg/m2 e 56 mg/m2. Usando estes valores como guia, é antecipadoque a faixa de dosagens de paciente úteis para formulações da presenteinvenção incluirá entre cerca de 0,40 mg/m2 e 400 mg/m 2 de ingredienteativo, na qual m2 representa a área superficial. Existem algoritmos padrãopara converter mg/m2 para mg droga/kg de peso corporal.EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de 17-AAG

Em 45,0 g (80,4 mmol) de geldanamicina em 1,45 L de THFseco em um frasco seco de 2 L foram adicionados em gotas durante 30minutos 36,0 mL (470 mmol) de alil-amina em 50 mL de THF seco. Amistura reacional foi agitada na temperatura ambiente sob nitrogênio por 4 hem cujo tempo a análise por TLC indicou que a reação estava completa[(GDM: amarelo brilhante: Rf=0,40; (5% MeOH-95% CHC13); 17-AAG:púrpura: Rf=0,42 (5% MeOH-95% CHC13)]. O solvente foi removido porevaporação rotativa e o material bruto foi transformado em lama em 420 mLde H20:EtOH (90:10) a 25°C, filtrado e seco a 45°C por 8 h para dar 40,9 g(66,4 mmol) de 17-AAG como cristais púrpuras (rendimento de 82,6%, >98% puro por HPLC monitorado a 254 nm). p.f. 206-212°C. 'H NMR eHPLC estão consistentes com o produto desejado.

Exemplo 2: Preparação de uma forma de baixo ponto de fusão de 17-AAG

A 17-AAG bruto do Exemplo 1 foi dissolvido em 800 mL de2-propil-álcool (isopropanol) a 80°C e então esfriada para a temperaturaambiente. Filtração seguida por secagem a 45°C por 8 h deu 44,6 g (72,36mmol) de 17-AAG como cristais púrpuras (rendimento de 90%, > 99% puropor HPLC monitorado a 254 nm). p.f. = 147-153°C. JH NMR e HPLC estãoconsistentes com o produto desejado.

Exemplo 3: Estabilidade em solvente de uma forma de baixo ponto defusão de 17-AAG

O produto 17-AAG de Exemplo 2 foi dissolvido em 400 mLde H20:EtOH (90:10) a 25°C. Filtração seguida por maturação a 45°C por 8 hdeu 42,4 g (68,6 mmol) de 17-AAG como cristais púrpuras (rendimento de95%, > 99% puro por HPLC monitorado a 254 nm). m.p. = 147-175°C. JHNMR e HPLC estão consistentes com o produto desejado.Exemplo 4: Preparação de Composto 237:

A dímero de 3,3-diamino-dipropil-amina (1,32 g, 9,1 mmol)foi adicionado em gotas em uma solução de geldanamicina (10 g, 17,83mmol) em DMSO (200 mL) em um frasco seco por chama sob N2 e agitadona temperatura ambiente. A mistura reacional foi diluída com água após 12horas. Um precipitado foi formado e filtrado para dar o produto bruto. Oproduto bruto foi cromatografado por cromatografia em sílica (5%CH3OH/CH2CI2) para dar o dímero desejado como um sólido púrpura. Oproduto púrpura puro foi obtido após cromatografia flash (gel de sílica);rendimento: 93%; p.f. 165°C; !H NMR (CDC13) 0,97 (d, J = 6,6 Hz, 6H,2CH3), 1,0 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2CH3), 1,72 (m, 4H, 2 CH2), 1,78 (m, 4H,2CH2), 1,80 (s, 6H, 2CH3), 1,85 (m, 2H, 2CH), 2,0 (s, 6H, 2CH3), 2,4 (dd, J =11 Hz, 2H, 2CH), 2,67 (d, J = 15 Hz, 2H, 2CH), 2,63 (t, J = 10 HZ, 2H, 2CH),2,78 (t, J = 6,5 Hz, 4H, 2CH2), 3,26 (s, 6H, 20CH3), 3,38 (s, 6H, 20CH3), 3,40(m, 2H, 2CH), 3,60 (m, 4H, 2CH2), 3,75 (m, 2H, 2CH), 4,60 (d, J = 10 Hz,2H, 2CH), 4,65 (Bs, 2H, 20H), 4,80 (bs, 4H, 2NH2), 5,19 (s, 2H, 2CH), 5,83(t, J =15 Hz, 2H, 2CH=), 5,89 (d, J = 10 Hz, 2H, 2CH=), 6,58 (t, J =15 Hz,2H, 2CH=), 6,94 (d, J = 10 Hz, 2H, 2CH=), 7,17 (m, 2H, 2N-H), 7,24 (s, 2H,2CH=), 9,20 (s, 2H, 2N-H); MS (m/z) 1189 (M+H).

O sal de HC1 correspondente foi preparado pelo seguintemétodo: uma solução de HC1 em EtOH (5 mL, 0,12 3N) foi adicionada emuma solução de Composto 237 (1 g como preparado acima) em THF (15 mL)e EtOH (50 mL) na temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada por10 min. O sal foi precipitado, filtrado e lavado com uma quantidade grande deEtOH e seco em vácuo. Alternativamente, um sal de "mesilato" pode serformado usando ácido metano-sulfonato de HC1.Exemplo 5: Preparação de Composto 914

Em geldanamicina (500 mg, 0,89 mmol) em 10 mL de dioxanofoi adicionado dióxido de selênio (IV) (198 mg, 1,78 mmol) na temperaturaambiente. A mistura reacional foi aquecida para 100°C e agitada por 3 horas.Após esfriamento para a temperatura ambiente, a solução foi diluída comacetato de etila, lavada com água e salmoura, seca sobre sulfato de magnésio,filtrada e evaporada em vácuo. O produto amarelo final foi obtido apóscromatografía em coluna (gel de sílica); rendimento: 75%; *H NMR (CDCI3)8 0,97(d, J=7,0Hz, 3H, CH3), 1,01 (d, J=7,0Hz, 3H, CH3), l,75(m, 3H,CH2+CH), 2,04(s, 3H, CH3), 2,41(d, J=9,9Hz, 1H, CH2), 2,53(t, J=9,9Hz, 1H,CH2), 2,95(m, 1H, CH), 3,30(m, 2H, CH+OH), 3,34(s, 6H, 2CH3), 3,55(m,1H, CH), 4,09(m, 1H, CH2), 4,15(s, 3H, CH3), 4,25(m, 1H, CH2), 4,41(d,J=9,8Hz, 1H, CH), 4,80(bs, 2H, CONH2), 5,32(s, 1H, CH), 5,88(t, J=10,4Hz,1H, CH=), 6,04(d, J=9,7Hz, 1H, CH=), 6,65(t, J=ll,5Hz, 1H, CH=), 6,95(d,J=ll,5Hz, 1H, CH=), 7,32(s, 1H, CH-Ar), 8,69(s, 1H, NH); MS (m/z) 575,6(M-l).

Exemplo 6: Preparação de Composto 967

Em Composto 914 (50 mg, 0,05 mmol) em 3mL de THF foiadicionada alil-amina (3,5 mg, 0,06 mmol). A mistura reacional foi agitada natemperatura ambiente por 24 horas. O solvente foi removido por evaporaçãorotativa. O produto púrpura bruto foi obtido após cromatografía em coluna(gel de sílica); rendimento: 90%; *H NMR (CDC13) ô 0,89(d, J=6,6Hz, 3H,CH3), 1,03 (d, J=6,9Hz, 3H, CH3), l,78(m, 1H, CH), l,82(m, 2H, CH2), 2,04(s, 3H, CH3), 2,37(dd, J=13,7Hz, 1H, CH2), 2,65(d, J=13,7Hz, 1H, CH2),2,90(m, 1H, CH), 3,33(s, 3H, CH3), 3,34(s, 3H, CH3), 3,45(m, 2H, CH+OH),3,58(m, 1H, CH), 4,14(m, 3H, CH2+CH2), 4,16(m, 1H, CH2), 4,42(s, 1H,OH), 4,43(d, J=10Hz, 1H, CH), 4,75(bs, 2H, CONH2), 5,33(m, 2H, CH2=),5,35(s, 1H, CH), 5,91(m, 2H, CH=+CH=), 6,09(d, J=9,9Hz, 1H, CH=), 6,46(t,J=5,8Hz, 1H, NH), 6,66(t, J=ll,6Hz, 1H, CH=), 6,97(d, J=ll,6Hz, 1H, CH=),7,30(s, 1H, CH), 9,15(s, 1H, NH).Exemplo 7: Preparação de Composto 956Composto 956 foi preparado pelo mesmo método descrito paraComposto 967 exceto que azetidina foi usada no lugar de alil-amina. Oproduto púrpura puro final foi obtido após cromatografia em coluna (gel desílica); rendimento: 89%; !H NMR (CDC13) 6 0,99 (d, J = 6,8 Hz, 3H, CH3),1,04 (d, J = 6,8 Hz, 3H, CH3), 1,77 (m, 1H, CH), 1,80 (m, 2H, CH2), 2,06 (s,3H, CH3), 2,26(m, 1H, CH2), 2,50(m, 2H, CH2), 2,67 (d, 1H, CH2), 2,90 (m,1H, CH), 3,34 (s, 3H, CH3), 3,36 (s, 3H, CH3), 3,48 (m, 2H, OH+CH), 3,60 (t,J = 6,8Hz, 1H, CH), 4,11 (dd, J=12Hz, J=4,5Hz, 1H, CH2), 4,30 (dd, J=12Hz,J=4,5Hz, 1H, CH2), 4,45 (d, J = 10,0Hz, 1H, CH), 4,72 (m, 5H, 2CH2+OH),4,78 (bs, 2H, NH2), 5,37 (s, 1H, CH), 5,89 (t, J = 10,5Hz, 1 H, CH=), 6,10 (d,J = 10 Hz, 1 H, CH=), 6,66 (t, J = 12Hz, 1 H, CH=), 7,00 (d, J = 12Hz, 1H,CH=), 7,17 (s, 1H, CH=), 9,20 (s, 1H, CONH); MS(m/z) 602 (M+l).Exemplo 8: Preparação de Composto 529

Uma solução de 17-amino-geldanamicina (1 mmol) em EtOAcfoi tratada com Na2S204 (0,1 M, 300 mL) na temperatura ambiente. Após 2 h,a camada aquosa foi extraída duas vezes com EtOAc e as camadas orgânicascombinadas foram secas sobre Na2S04, concentradas sob pressão reduzidapara dar 18,21-di-hidro-l 7-amino-geldanamicina como um sólido amarelo.Este sólido foi dissolvido em THF anidro e transferido via cânula para umamistura de cloreto de picolinoíla (1,1 mmol) e MS4A (1,2 g). Duas horasdepois, EtN(i-Pr)2 (2,5 mmol) foi ulteriormente adicionado na misturareacional. Após agitação durante a noite, a mistura reacional foi filtrada econcentrada sob pressão reduzida. Água foi então adicionada no resíduo, quefoi extraído com EtOAc três vezes; as camadas orgânicas combinadas foramsecas sobre Na2S04 e concentradas sob pressão reduzida para dar o produtobruto que foi purificado por cromatografia flash para dar 7-picolinoil-amino-geldanamicina, Composto 529, como um sólido amarelo. Rf= 0,52 em80:15:5 CH2C12: EtOAc: MeOH. p.f. = 195- 197°C. JH NMR (CDC13) 6 0,91(d, 3H), 0,96 (d, 3H), 1,71-1,73 (m, 2H), 1,75-1,79 (m, 4H), 2,04 (s, 3H),2,70-2,72 (m, 2H), 2,74-2,80 (m, 1H), 3,33-3,35 (m, 7H), 3,46-3,49 (m, 1H),4,33 (d, 1H), 5,18 (s, 1H), 5,77 (d, 1H), 5,91 (t, 1H), 6,57 (t, 1H), 6,94 (d,1H), 7,51-7,56 (m, 2H), 7,91 (dt, 1H), 8,23 (d, 1H), 8,69-8,70 (m, 1H), 8,75(s,1H), 10,51 (s, 1 H).

Exemplo 9: Preparação de Composto 1046

Composto 1046 foi preparado de acordo com o procedimentodescrito para o Composto 529 usando cloreto de 4-cloro-metil-benzoíla nolugar de cloreto de picolinoíla (3,1 g, 81%). Rf 0,45 em 80:15:5 CH2C12:EtOAc: MeOH. !H NMR CDC13 ô 0,89 (d, 3H), 0,93 (d, 3H), 1,70 (br s, 2H),1,79 (br s, 4H), 2,04 (s, 3H), 2,52-2,58 (m, 2H), 2,62-2,63 (m, 1H), 2,76-2,79(m, 1H), 3,33 (br s, 7H), 3,43-3,45 (m, 1H), 4,33 (d, 1H), 4,64 (s, 2H), 5,17(s, 1H), 5,76 (d, 1H), 5,92 (t, 1H), 6,57 (t, 1H), 6,94 (d, 1H), 7,49 (s, 1H),7,55 (d, 2H), 7,91 (d, 2H), 8,46 (s, 1H), 8,77 (s, 1H).Exemplo 10: Preparação de Composto 1059

Em uma solução de Composto 1046 (0,14 g, 0,2 mmol) emTHF (5 ml) foram adicionados iodeto de sódio (30 mg, 0,2 mmol) e morfolina(350,4 mmol). A mistura resultante foi aquecida para refluxar por 10 h depoisdas quais ela foi esfriada para a temperatura ambiente sob pressão reduzida. Oresíduo foi redissolvido em EtOAc (30 ml), lavado com água (10 mL), secocom Na2S04 e de novo concentrado. O resíduo foi então recristalizado emEtOH (10 mL) para dar o Composto 1059 como um sólido amarelo (100 mg,66%). R£= 0,10 em 80:15:5 CH2C12: EtOAc: MeOH. !H NMR CDC13 ô 0,93(s, 3H), 0,95 (d, 3H), 1,70 (br s, 2H), 1,78 (br s, 4H), 2,03 (s, 3H), 2,48 (br s,4H), 2,55-2,62 (m, 3H), 2,74-2,79 (m, 1H), 3,32 (br s, 7H), 3,45 (m, 1H), 3,59(s, 2H), 3,72-3,74 (m, 4H), 4,32 (d, 1H), 5,15 (s, 1H), 5,76 (d, 1H), 5,91 (t,1H), 6,56 (t,lH), 6,94 (d, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,50 (d, 2H), 7,87 (d, 2H), 8,47 (s,IH), 8,77 (s, 1H).

Exemplo 11: Preparação de Composto 1236

Composto 1236 foi preparado de acordo com o procedimentodescrito para o Composto 1059 usando benzil-etil-amina no lugar demorfolina Rf = 0,43 em 80:15:5 CH2C12: EtOAc: MeOH. *H NMR CDC13 S0,925 (s, 3H), 0,95 (d, 3H), 1,09 (t, 3H), 1,70 (br s, 2H), 1,79 (br s, 4H), 2,04(s, 3H), 2,50-2,62 (m, 511), 2,75-2,79 (m, 1H), 3,32 (br s, 7H), 3,46 (m, 1H),3,59 (s, 2H), 3,63 (s, 2H), 4,33 (d, 1H), 5,16 (s, 1H), 5,78 (d, 1H), 5,91 (t,1H), 6,57 (t, 1H), 6,94 (d, 1H), 7,25-7,27 (m, 1H), 7,32-7,38 (m, 4H), 7,48 (s,1H), 7,53 (d, 2H), 7,85 (d, 2H), 8,47 (s, 1H), 8,77 (s, 1H).Exemplo 12: Preparação de Composto 563: 7-(benzoil)-amino-geldanamicina Uma solução de 17-amino-geldanamicina (1 mmol) em EtOAc

foi tratada com Na2S204 (0,1 M, 300 mL) na temperatura ambiente. Após 2 h,a camada aquosa foi extraída duas vezes com EtOAc e as camadas orgânicascombinas foram secas sobre Na2S04, concentrada sob pressão reduzida paradar 18,21-di-hidro-17amino-geldanamicina como um sólido amarelo. Este sólido foi dissolvido em THF anidro e transferido via cânula para uma misturade cloreto de benzoíla (1,1 mmol) e MS4A (1,2 g). Duas horas depois, EtN(i-Pr)2 (2,5 mmol) foi ulteriormente adicionado na mistura reacional. Apósagitação durante a noite, a mistura reacional foi filtrada e concentrada sobpressão reduzida. Água foi então adicionada no resíduo, que foi extraído comEtOAc três vezes; as camadas orgânicas combinadas foram secas sobreNa2S04 e concentradas sob pressão reduzida para dar o produto bruto que foipurificado por cromatografia flash para dar 17-(benzoil)-amino-geldanamicina. Rf = 0,50 em 80:15:5 CH2C12: EtOAc: MeOH. p.f. = 218-220°C. !H NMR (CDC13) 0,94 (t, 6H), 1,70 (br s, 2H), 1,79 (br s, 4H), 2,03 (s,3H), 2,56 (dd, 1H), 2,64 (dd, 1H), 2,76-2,79 (m, 1H), 3,33 (br s, 7H), 3,44-3,46 (m, 1H), 4,325 (d, 1H), 5,16 (s, 1H), 5,77 (d, 1H), 5,91 (t, 1H), 6,57 (t,1H), 6,94 (d, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,52 (t, 214 7,62 (t, 1H), 7,91 (d, 2H), 8,47 (s,1H), 8,77 (s, 1H).

Exemplo 13: Modalidades de Formulação EspecíficaSoluções aquosas / tensoativo - fosfolipídeos 1-20% (p/v)foram preparadas em água estéril para injeção. As soluções aquosas defosfolipídeos foram homogeneizadas para proporcionarem uma dispersãomais uniforme para microfluidização subseqüente. A dispersão de tensoativofoi então microfluidizada pela passagem através de um microfluidizadorModel 11 OS (Microfluidics Inc., Newton, MA, USA) operado em umapressão estática de cerca de 758 kPa (pressão operacional de 414-655 kPa).Drogas foram dissolvidas na solução aquosa de fosfolipídeo (1-20 mg/mL)em razões molares variando de 1:1 a 1:20 (droga:solução de fosfolipídeo). Asdrogas usadas foram Composto 237, Composto 956 e Composto 1236 e seussais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas. Sacarose, manitol e/oudextrose foram adicionados na faixa de 110% p/v e o pH foi ajustado paraentre cerca de 5 e 8 usando hidróxido de sódio diluído e/ou ácido clorídricodiluído, e acetato de sódio tri-hidratado 10 mM, fosfato, ou tampãoequivalente. O tamanho de partícula médio dos complexos de droga:fosfolipídeo está entre cerca de 20 nm e 150 nm conforme determinado portécnicas de espalhamento de luz-laser. As dispersões foram passadas atravésde uma filtro de minicápsula Gelman de 0,45 micrômetro (Pall Corp., EastHills, NY, USA), e então através de um filtro de cápsula estéril SartoriusSartobran P de 0,2 micrômetro (500 cm2) (Sartorius AG, Goettingen,Alemanha). Foi usada pressão de até 414 kPa para manter o fluxo contínuo euniforme.

Formulações específicas feitas dentro destes parâmetros demodalidade incluíram:

Uma solução de dispersão de tensoativo-fosfolipídeo(Phospholipon 90) a 6,2% possuindo -2-8 mg/mL de droga (razões molaresde droga: fosfolipídeo de 1:8 a 1:20), 10% de sacarose, e tamponada para pH5 ou 7 usando tampão acetato de sódio tri-hidratado 10 mM e/ou hidróxido desódio diluído.Uma solução de dispersão de tensoativo-fosfolipídeo(Phospholipon 90) a 1,2% possuindo ~2 mg/mL de droga (razões molares de1:10 de droga: fosfolipídeos) e 1% de manitol, 5% de dextrose, e tamponadapara pH 5 usando tampão acetato de sódio tri-hidratado 10 mM e ácidoclorídrico diluído.

Uma solução a 2-4 mg/mL de droga dissolvida em tensoativoTWEEN® 80 em uma razão molar de droga: TWEEN® 80 de 1:5 a 1:20,ajustada para pH 7,0 ou tamponada para pH 7,2 usando tampão fosfato 10mM.

Uma solução 13,2% p/v de Poloxâmero 188 foi preparadapossuindo uma razão molar de droga: Poloxâmero de 1:5 (concentração finalda droga ~4 mg/mL), e tamponada para pH 7 usando tampão fosfato 10 mM.Exemplo 14: Preparação de uma Dispersão Aquosa de Fosfolipídeo de17-AAG

17-AAG foi formulado como uma dispersão aquosa defosfolipídeo 1% (p/p). L-histidina e sacarose foram dissolvidos em água.Os fosfolipídeos foram adicionados e um misturador de cisalhamento altofoi usado para dispersar os fosfolipídeos por cinco minutos a cerca de3500 rpm.

17-AAG foi adicionado na dispersão de fosfolipídeo emisturado com o misturador de cisalhamento alto para misturar / dispersar17-AAG nos fosfolipídeos. O produto foi removido do misturador decisalhamento alto, então lentamente misturado (sem vórtice) para permitiro escape da maior parte de ar. Então 0,7 g de uma mistura 50/50 (p/p) deetanol e TWEEN® 80 foram adicionados na dispersão agitada de 17-AAGe misturados por uma hora para permitir que mais ar aprisionadoescapasse. A dispersão de 17-AAG foi microfluidizada a 110 -131.000kPa para reduzir o tamanho de partícula da dispersão para 0,1-0,5 um(tamanho de partícula médio). A composição da formulação foi comoabaixo:

Ingrediente

17-AAG

L-histidina

Sacarose

Fosfolipídeo

Etanol

Tween 80

Água

% em peso_Função_

1,0 Ingrediente ativo

0,1 Tampão

7,5 Agente de tonicidade/crioprotetor

18,8 Veículo/complexo de lipídeo

0,5 Auxiliar de processo

71,5 Diluente

Exemplo 15: Liofilização

Esquemas de liofilização ilustrativos que podem ser usadosincluem aquele descrito na seguinte Tabela.<table>table see original document page 43</column></row><table> Fechar os frascos sob N2 a aproximadamente 91 kPa Exemplo 16: Injeção Intravenosa e Tolerância

Foi verificado que um sal solúvel em água de uma ansamicinafracamente solúvel em água (por exemplo, Composto 237-mesilato) quandoformulado em uma solução aquosa torna-se irritante para a veia da cauda derato sob infusão intravenosa. A formulação de dispersão de Composto 237-mesilato descrita acima não produziu evidência de irritação de veia quandodada na mesma dose e durante o mesmo intervalo de infusão como o daformulação de solução. Farmacocinéticas para a formulação de solução e aformulação de dispersão foram muito similares. O método da invençãotambém foi usado para preparar formulações de dispersão com os sais dehidrocloreto e de fosfato de Composto 237. Estas formulações foram muitomais toleradas do que a solução aquosa de Composto 237. Formulações dedispersão também foram preparadas usando derivados de geldanamicinasolúveis em água ou fracamente solúveis em água. Especificamente,dispersões similares contendo DMAG foram similarmente formuladas e bemtoleradas sob injeção em veia de cauda de ratos e camundongos.

Os exemplos acima não são intencionados para seremlimitantes das e são meramente representativos das várias modalidades dainvenção. Será prontamente evidente para uma pessoa experiente na técnicaque várias substituições e modificações podem ser feitas na invenção sem sedesviarem do escopo e do espírito da invenção. Assim, tais modalidadesadicionais estão dentro do escopo da invenção e das reivindicações seguintes.

Os reagentes aqui descritos quer estão comercialmentedisponíveis, por exemplo, na Sigma-Aldrich, quer se não são prontamenteproduzíveis sem experimentação indevida usando procedimentos rotineirosconhecidos por aquelas pessoas ordinariamente experientes na técnica e/oudescritos nas publicações aqui incorporadas como referências.

Claims

1 . Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender partículas dispersáveis em água, compreendendo:uma ansamicina, ou uma forma polimorfa, um solvato, uméster, um tautômero, um enanciômero, um sal farmaceuticamente aceitável ouuma pró-droga da mesma; eum fosfolipídeo farmaceuticamente aceitável;sendo que a citada formulação está substancialmente destituídade triglicerídeos de cadeia média e longa, e o citado fosfolipídeo está presenteem uma concentração de pelo menos 5% p/p da citada formulação.

2. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que os citados triglicerídeos de cadeia média elonga estão presentes em uma concentração combinada de cerca de 1% p/v oumenor.

3. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada ansamicina é selecionada do grupoconsistindo de:(Composto 237)(Composto 123d)(Composto 956)

4. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada ansamicina é 17-AAG.

5. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que o citado 17-AAG é um 17-AAG de alto pontode fusão, um 17-AAG de baixo ponto de fusão, uma forma amorfa de 17-AAG ou qualquer combinação dos mesmos.

6. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada ansamicina compreende formas debaixo ponto de fusão de 17-AAG distinguidas por temperaturas de fusão porDSC abaixo de 175°C e por um padrão de difração de raios-X em pócompreendendo picos localizados em 5,85 graus, 4,35 graus e 7,90 graus deângulos dois-teta.

7. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada ansamicina compreende uma formapolimorfa de baixo ponto de fusão de 17-AAG distinguida por umatemperatura de fusão por DSC abaixo de 156°C e por um padrão de difraçãode raios-X em pó compreendendo picos localizados em 5,85 graus, 4,35 grause 7,90 graus de ângulos dois-teta.

8. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada ansamicina é uma forma polimorfa debaixo ponto de fusão de 17-AAG caracterizada por uma temperatura de fusãopor DSC de cerca de 172°C.

9. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada ansamicina é um salfarmaceuticamente aceitável de hidrocloreto ou de fosfato de 17-AAG.

10. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a concentração de citada ansamicina, ou formapolimorfa, solvato, éster, tautômero, enanciômero, sal farmaceuticamenteaceitável ou pró-droga da mesma, na citada formulação é pelo menos 0,5mg/mL.

11. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a concentração de citada ansamicina, ou formapolimorfa, solvato, éster, tautômero, enanciômero, sal farmaceuticamenteaceitável ou pró-droga da mesma, na citada formulação é pelo menos 5,0mg/mL.

12. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a concentração de citada ansamicina, ou formapolimorfa, solvato, éster, tautômero, enanciômero, sal farmaceuticamenteaceitável ou pró-droga da mesma, na citada formulação é pelo menos 50mg/mL.

13. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que as citadas partículas dispersáveis têm sidotratadas para reduzir o tamanho de partícula, na qual o citado tratamentocompreende sonicação, homogeneização de cisalhamento alto,microfluidização, extrusão através de filtros de tamanho de poro controlado,ou qualquer combinação das mesmas.

14. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o tamanho de partícula de citadas partículasdispersáveis em água é de cerca de 100 nm a cerca de 200 nm.

15. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o tamanho de partícula de citadas partículasdispersáveis em água é de cerca de 200 nm ou menor.

16. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que as citadas partículas dispersáveis em água sãocoloidais.

17. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o citado fosfolipídeo compreendefosfatidilcolina, fosfatidalserina, fosfatidilinositol, fosfatidil-etanol-amina,Phospholipon 90G ou qualquer combinação das mesmas.

18. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de compreender um ou mais excipientes.

19. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que um ou mais excipientes compreendem umcrioprotetor, um modificador de tonicidade, um agente encorpante ouqualquer combinação dos mesmos.

20. Método de tratamento ou de prevenção de um distúrbio emum mamífero, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao citadomamífero uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma formulaçãofarmacêutica como definida na reivindicação 1.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o citado distúrbio envolve isquemia, um distúrbioproliferativo, infecção, síndrome de imunodeficiência adquirida, um distúrbioneurológico, um tumor, leucemia, leucemia linfocítica crônica, umneoplasma, câncer, um carcinoma ou outras doenças malignas.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o citado distúrbio proliferativo é selecionado do grupoconsistindo de tumores, doenças inflamatórias, infecção fungica, infecção porlevedura, e infecção viral.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a concentração de citada ansamicina, ou forma polimorfa,solvato, éster, tautômero, enanciômero, sal farmaceuticamente aceitável oupró-droga da mesma, em citada formulação é de cerca de 1% a cerca de 1,5%(p/p)-

24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a concentração de citada ansamicina, ou forma polimorfa,solvato, éster, tautômero, enanciômero, sal farmaceuticamente aceitável oupró-droga da mesma, em citada formulação é de cerca de 0,5 mg/mL a cercade 50 mg/mL.

25. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina é selecionada do grupo consistindo de:(Composto 956)

26. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina é 17-AAG.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o citado 17-AAG é um 17-AAG de alto ponto de fusão, um17-AAG de baixo ponto de fusão, uma forma amorfa de 17-AAG ou qualquercombinação dos mesmos.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o citado 17-AAG compreende uma forma de fusão lenta de17-AAG.

29. Uso de formulação farmacêutica como definida nareivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de ummedicamento.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de que o citado medicamento é para o tratamento profilático outerapêutico de doenças mediadas por HSP90.

31. Método de preparação de uma formulação farmacêutica,caracterizado pelo fato de compreender:(a) formar partículas de dispersão compreendendo umaansamicina, ou uma forma polimorfa, solvato, éster, tautômero, enanciômero,sal farmaceuticamente aceitável ou pró-droga da mesma; e um fosfolipídeofarmaceuticamente aceitável;(b) opcionalmente reduzir o tamanho de citadas partículas dedispersão;(c) opcionalmente congelar o produto de etapa (a) ou (b);(d) opcionalmente descongelar o produto de etapa (c);(e) opcionalmente liofilizar o produto de qualquer uma dasetapas (a)-(d); e(f) opcionalmente reidratar o produto de etapa (e); eno qual a citada formulação está substancialmente destituídade triglicerídeos de cadeia média e longa.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que os citados triglicerídeos de cadeia média e longa estãopresentes em uma concentração combinada de cerca de 1% p/v ou menor.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina é selecionada do grupo consistindo de:<formula>formula see original document page 51</formula>

34. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina é 17-AAG.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o citado 17-AAG é um 17-AAG de alto ponto de fusão, um 17-AAG de baixo ponto de fusão, uma forma amorfa de 17-AAG ou qualquercombinação dos mesmos..

36. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina compreende uma forma de baixo pontode fusão de 17-AAG.

37. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o citado fosfolipídeo compreende fosfatidilcolina,fosfatidalserina, fosfatidilinositol, fosfatidil-etanol-amina, Phospholipon 90Gou qualquer combinação das mesmas.

38. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o citado fosfolipídeo compreende Phospholipon 90G.

39. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a citada etapa de redução está presente e compreendesonicação, homogeneização de cisalhamento alto, microfluidização, extrusãoatravés de filtros de tamanho de poro controlado ou qualquer combinação dasmesmas.

40. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o citado tamanho de partícula de citada dispersão é de cercade 200 nm ou menor.

41. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a citada formulação é uma dispersão coloidal.

42. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a citada formulação adicionalmente compreende um ou maisexcipientes.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que um ou mais excipientes compreendem um crioprotetor, ummodificador de tonicidade, um agente encorpante ou qualquer combinaçãodos mesmos.

44. Método de tratamento ou de prevenção de um distúrbio emum mamífero, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao citadomamífero uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma formulaçãofarmacêutica preparada pelo método como definido na reivindicação 31

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina é selecionada do grupo consistindo de:(Composto 956)

46. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que a citada ansamicina é 17-AAG.