BRPI0608726A2 - uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e, composição farmacêutica - Google Patents

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Rose Mary Sheridan
Mingqiang Zhang
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Abstract

USO DE UM ANALOGO DE 39-DESMETOXIRAPAMICINA OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITáVEL DO MESMO, E, COMPOSIçãO FARMACêUTICA A invenção refere-se a usos médicos de análogos de 39- desmetoxirapamicina.

Description

"USO DE UM ANÁLOGO DE 39-DESMETOXIRAPAMICINA OU UMSAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DO MESMO, E5COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Rapamicina (sirolimus) (Figura 1) é um macrolídeo lipofílicoproduzido por Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 (Sehgal et al., 1975;Vêzina et aL., 1975; U.S. 3.929.992; U.S. 3.993.749) com uma parte 1,2,3-tricarbonil ligada a uma lactona de ácido pipecólico (Paiva et al., 1991). Parao propósito da presente invenção, rapamicina é descrita pela convençãonumérica de McAlpine et al (1991) em preferência às convenções denumeração de Findlay et al. (1980) ou Chemical Abstracts (Ilth CumulativeIndex, 1982-1986 p60719CS).
Repamicina tem valor terapêutico significativo devido a seuamplo espectro de atividades biológicas (Huang et al, 2003). O composto éum inibidor potente do alvo mamífero de rapamicina (mTOR), uma serina-treonina quinase à jusante da via de sinalização de fosfatidilinositol 3-quinase(PI3K)/Akt (proteína quinase B) que media a sobrevivência e a proliferaçãode células. A atividade inibidora é ganha após a rapamicina se ligar à proteína12 de ligação de immunofilina FK506 (FKBP12) (Dumont, F. J. and Q. X.Su, 1995). Em células T, a rapamicina inibe a sinalização do receptor de IL-2e a subseqüente autoproliferação das células T, resultando emimunossupressão. A rapamicina é comercializada como um imunossupressorpara o tratamento de pacientes com transplante de órgãos para evitar arejeição de enxerto (Huang et al, 2003). Em adição à imunossupressão,rapamicina tem uso terapêutico potencial no tratamento de várias doenças, porexemplo, câncer, doenças cardiovasculares, tais como restenose, doençasautoimunes, tais como esclerose múltipla, artrite reumatóide, infecção porfungos e doenças neurodegenerativas, tais como Mal de Alzheimer, Mal deParkinson e Mal de Huntington.Apesar de sua utilidade em uma variedade de estados dedoença, a rapamicina tem várias desvantagens. Primeiramente, ela é umsubstrato de P-glicoproteína de bomba de efluxo de membrana celular (P-gp, LaPlante et al, 2002, Crowe et a/, 1999) que bombeai o composto parafora da célula, tornando pobre a penetração de membranas celulares porrapamicina. Isto causa pouca absorção do composto após a dosagem. Emadição, como um mecanismo principal de resistência a várias drogas decélulas com câncer é através de uma bomba de efluxo de membranacelular, rapamicina é menos efetiva contra células cancerosas comresistência a várias drogas (MDR). Depois, a rapamicina é extensivamentemetabolizada por enzimas citocromo P450 (Lampen et al, 1998). Suaperda na primeira passagem hepática é alta, o que contribui também parasua pouca biodisponibilidade oral. O papel de CYP3A4 e P-gp na poucabiodisponibilidade de rapamicina foi confirmada em estudos,demonstrando que a administração de inibidores de CYP3A4 e/ou P-gpdiminuiu o efluxo de rapamicina de células Caco-2 transfectadas porCYP3A4 (Cummins et al, 2004) e que a administração de inibidores deCYP3A4 diminuiu o metabolismo do intestino delgado de rapamicina(Lampen et al, 1998). A pouca biodisponibilidade oral de rapamicinacausa uma variabilidade inter-individual significativa, resultando emresultado terapêutico inconsistente e dificuldade em gerenciamentoclínico (Kuhn et ai, 2001, Crowe et al, 1999).
Portanto, há uma necessidade de se desenvolver novoscomposto semelhantes à rapamicina que não sejam substratos de P-gp,que podem ser metabolicamente mais estáveis e portanto podem terbiodisponibilidade melhorada. Quando usados como agentes anti-câncer,estes compostos podem ter melhor eficácia contra células cancerosasMDR, em particular, contra células de câncer expressando P-gp.
Uma faixa de análogos de rapamicina sintetizados usandoos sítios quimicamente disponíveis da molécula foi relatada. A descriçãodos seguintes compostos foi adaptada ao sistema de numeração damolécula de rapamicina descrito na Figura 1. Os sítios de quimicamentedisponíveis na molécula para derivação ou substituição incluem gruposhidroxila C40 e C28 (e.g. U.S. 5.665.772; U.S. 5.362.718), grupos metoxiC39 e C16 (e.g. WO 96/41807; U.S. 5.728.710), grupos ceto C32, C26 eC9 (e.g. U.S. 5.378.836; U.S. 5.138.051; U.S. 5.665.772). A hidrogenaçãoem C17, Cl9 e/ou C21, alvejando o trieno, resultou na retenção deatividade anti-fungo, mas perda relativa de imunossupressão (e.g. U.S.5.391.730; U.S. 5.023.262). Melhoras significativas na estabilidade damolécula (e.g., formação de oximas de C32, C40 e/ou C28, U.S.5.563.145, U.S. 5.446.048), resistência a ataque metabólico (e.g. U.S.5.912.253), biodisponibilidade (e.g. U.S. 5.221.670; U.S. 5.955.457; WO98/04279) e a produção de pró-drogas (e.g. U.S. 6.015.815; U.S.5.432.183) foram alcançados através da derivação.
Dois dos derivados de rapamicina mais avançados nodesenvolvimento clínico são 40-0-(2hidroxi)etil-rapamicina (RAJD001,Certican, everolimus), um análogo semi-sintético de rapamicina que mostraefeitos farmacológicos imunossupressivos (Sedrani, R. et al., 1998; Kirchneret al., 2000; U.S. 5.665.772) e 40-0-[2,2-bis(hidroximetil)propioniloxi]rapamicina, CCI-779 (Wyeth-Ayerst), um ésterde rapamicina que inibe o crescimento celular in vitro e inibe o crescimentode tumor in vivo (Yu et al. 2001). CCI-779 está hoje em vários ensaiosclínicos como uma droga anti-câncer potencial. Uma publicação recente deestudo de CCI-779 em fase II em pacientes com glioblastoma multiformerecorrente (Chang, et al., 2005) sugere que a baixa eficácia desta droga nestespacientes pode ser devida à sua baixa penetração de barreira sangue-cérebro.
Estudos investigando os farmacocinéticos de RAD001 mostram que,similarmente à rapamicina, são um substrato para P-gp (Crowe et a), 1999,LaPlante et al, 2002).
Apesar de sua similaridade estrutural com rapamicina, oscompostos da presente invenção exibem um perfil faarmacológicosurpreendentemente diferente. Em particular, eles mostram umapermeabilidade de membrana de célula aumentada e efluxo diminuído emcomparação com rapamicina, e eles não são um substrato para P-gp.
Adicionalmente, 39-desmetoxirapamicina mostra uma atividade mais potentecontra linhagens celulares de câncer resistentes a várias drogas e expressão P-gp do que rapamicina. Quando comparada com rapamicina, a 39-desmetoxirapamicina mostra um perfil inibidor significativamente diferentecontra os painéis de linhagem celular NCl 60.
Adicionalmente, os análogos de 39-desmetoxirapamicinamostram um perfil farmacocinético significativamente diferente quandocomparada com rapamicina, e os seus derivados em testes clínicos.
Inesperadamente, os análogos de 39-desmetoxirapamicina mostram umacapacidade aumentada de cruzar a barreira do cérebro e portanto demonstramuma disponibilidade melhorada no cérebro.
Portanto, a presente invenção fornece o uso médico deanálogos de 39-desmetoxirapamicina, estes análogos de rapamicina têmfarmacocinéticas significativamente alteradas, uma capacidade melhoradade cruzar a barreira do cérebro, estabilidade metabólica melhorada,permeabilidade de membrana celular melhorada, uma taxa de efluxodiminuída e um perfil inibidor de células com tumor diferentes pararapamicina. Estes compostos são úteis em medicina, em particular, para otratamento de câncer e/ou doenças de células B, na indução oumanutenção de imunossupressão, na estimulação de regeneração neuronalou no tratamento de infecções por fungos, na rejeição de transplante,enxerto vs. doença de hospedeiro, distúrbios autoimunes, doençasvasculares inflamatórias e doenças fibróticas. A presente invençãoparticularmente fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamentode câncer e/ou malignâncias de célula B.
Rapamicina tem sido demonstrada estimular autofagia Raughtet al., 2001). A autofagia prejudicada da desregulação de autofagia tem sidoimplicada em vários distúrbios incluindo Mal de Alzheimer, Mal deParkinson, Mal de Huntington e outras doenças (incluindo doença deCreutzfeldt-Jacob), sugerindo que a manipulação desta via pode provar serbenéfica nestas doenças. Um recente estudo in vitro demonstrou que aadministração de rapamicina foi capaz de reduzir a aparência de agregados e amorte celular associada com expansões de poli(Q) e poli(A) em células COS-7 transfectadas (Ravikumar et al, 2002). Portanto, se rapamicina fosse capazde cruzar a barreira cerebral ao sangue, estes resultados indicam que ela seriaum candidato adequado para o tratamento de Mal de Huntington e outrosdistúrbios relacionados. Isto sugere que há uma necessidade dodesenvolvimento de análogos de rapamicina que são capazes de cruzar abarreira cerebral ao sangue.
A hiperfosforilação da proteína associada commicrotúbulos tau e sua agregação em filamentos helicoidais emparelhadossolúveis que formam "emaranhamentos" intracelulares é uma dascaracterísticas do Mal de Alzheimer, e a acumulação desta patologianeurofibrilar e a morte celular neuronal está associada relacionadas com odeclínio cognitivo. Um estudo recente por An et al (2003) demonstrou quep70 S6 quinase é co-distribuída com patologia neurofibrilar em cérebroscom Mal de Alzheimer e, particularmente, p70 S6 quinase ativada foiobviamente aumentada no neurônios antes do desenvolvimento deemaranhamento (An et al, 2003). Em um ensaio in vitro onde aadministração de sulfato de zinco resulta na ativação de p70 S6 quinase eníveis aumentados de tau total, normal e hiperfosforilada, o pré-tratamento das células com rapamicina foi mostrado reduzir a ativação dep70 S6 quinase três vezes e significativamente reduzir os níveis de tautotal, normal e hiperfosforilada. Portanto, estes resultados indicam que aadministração de rapamicina ou análogos de rapamicina pode ser debenefício na redução de patologia neurofibrilar de Mal de Alzheimer,contanto que os compostos sejam capazes de alcançar o sítio de ação.
Adicionalmente, foi relatado que a rapamicina aumenta ocrescimento neurítico e a sobrevivência neuronal em vários modelos in vitro ein vivo (Avramut and Achim, 2002) indicando que a rapamicina e seusanálogos podem ser de uso no tratamento de distúrbios onde a regeneraçãoneuronal pode ser de benefício terapêutico significativo. Contudo, estautilidade é dependente de este ser capaz de alcançar o sítio de ação e,portanto, os análogos de rapamicina com uma capacidade melhorada paracruzar a barreira cerebral ao sangue seriam particularmente preferidos.
A presente invenção fornece o novo e surpreendente uso deanálogos de 39-desmetoxirapamicina em medicina, particularmente o uso de39-desmetoxirapamicina, particularmente no tratamento de câncer oumalignâncias de célula B, na indução ou manutenção de imunossupressão, naestimulação de regeneração neuronal ou no tratamento de infecções porfungos, na rejeição de transplante, enxerto vs. doença de hospedeiro,distúrbios autoimunes, condições neurodegenerativas, doenças vascularesinflamatórias e doenças fibróticas. Em particular, a presente invenção forneceo uso de análogos de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de câncer emalignâncias de célula B. Em uma forma de realização preferida, a presenteinvenção fornece o uso de análogos de 39-desmetoxirapamicina no tratamentode distúrbios neurodegenerativos. Em uma outra forma de realizaçãopreferida, a presente invenção fornece o uso de análogos de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de tumores cerebrais, particularmente,glioblastoma multiforme. Em um aspecto específico da presente invenção, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina e 39-desmetoxirapamicina.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere ao uso médico de análogos de39-desmetoxirapamicina, em particular, 39-desmetoxirapamicina,particularmente no tratamento de câncer e/ou malignâncias de célula B, naindução ou manutenção de imunossupressão, no tratamento de rejeição detransplante, enxerto vs. doença de hospedeiro, distúrbios autoimunes,condições neurodegenerativas, doenças vasculares inflamatórias e doençasfibróticas, na estimulação de regeneração neuronal ou no tratamento deinfecções fungicas. Em particular, a presente invenção se refere ao uso deanálogos de 39-desmetoxirapamicina para o tratamento de câncer emalignâncias de célula B. Em uma forma de realização específica, a presenteinvenção se refere ao uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de câncere malignâncias de célula B. A presente invenção também forneceespecificamente o uso de análogos de 39-desmetoxirapamicina no tratamentode tumor(es) no cérebro ou condições neurodegenerativas. Em uma forma derealização específica, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de tumor(es) no cérebro ou condiçõesneurodegenerativas. A presente invenção também fornece especificamente ouso de análogos de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de condiçõesneurodegenerativas. Em particular, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de condições neurodegenerativas.
DEFINIÇÕES
Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referirem aum ou mais que um (i.e., pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo.
Por meio de exemplo, "um análogo" significa um análogo ou mais que umanálogo.
Como usado aqui, o termo "distúrbio(s) autoimune(s)" inclui,sem limitação: lupus eritrematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide,miasteria grave e esclerose múltipla.Como usado aqui, o termo "doenças de inflamação" inclui,mas não está limitado a: psoríase, dermatite, eczema, seborréia, doença deintestino inflamatória (que inclui, mas não está limitada a, colite ulcerativa eMal de Crohn), inflamação pulmonar (incluindo asma, doença pulmonarobstrutiva crônica, efisema, síndrome de sofrimento respiratório agudo ebronquite), artrite reumatóide e uveíte ocular.
Como usado aqui, o termo "câncer" se refere a um crescimentomaligno ou benigno de células na pele ou em órgãos do corpo, por exemplo,mas sem limitação, mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, cérebro, estômagoou intestino. Um câncer tende a se infiltrar no tecido adjacente e se espalhar(metástase) até órgãos distantes, por exemplo, para o osso, fígado, pulmão oucérebro. Como usado aqui, o termo câncer inclui tipos de células de tumormetastático, tais como, mas não limitadas a, melanoma, linfoma, leucemia,fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, e mastocitoma e tipos de carcinoma detecido, tais como, mas não limitados a, câncer colo-retal, câncer de próstata,câncer de pulmão de célula pequena e câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal,câncer gástrico, glioblastoma, câncer de fígado primário e câncer de ovário. Otermo também especificamente engloba tumor(es) de cérebro, como descritomais completamente abaixo.
Como usado aqui, o termo "tumor(es) de cérebro" se refere aum crescimento maligno ou benigno de células no cérebro, ele inclui tumores(metastáticos) primários e secundários. Os tumores cerebrais primáriosincluem, mas não estão limitados a, gliomas (e.g., glioblastoma multiforme,astrocitoma, glioma tronco do cérebro, ependimoma e oligodendroglioma),meduloblastoma, meningioma, schwanoma (ou neuroma acústico),craniofaringioma, tumor de célula germinativa do cérebro (e.g., germinoma),ou tumor da região pineal. O termo "câncer no cérebro" é também usado paradescrever o conjunto de distúrbios acima e estes termos são usados entre si.Como usado aqui, o termo "malignâncias de célula B" incluium grupo de distúrbios que incluem leucemia linfótica crônica (CLL),mieloma múltiplo, e linfoma de não-Hodgkin (NHL). Elas são doençasneoplásticas do sangue e de órgãos formadores de sangue. Elas causamdisfunção do sistema imune e da medula óssea, que torna o hospedeiroaltamente suscetível a infecção e sangramento.
Como usado aqui, o termo "doença vascular" inclui, semlimitação: distúrbios vasculares hiperproliferativos (e.g., restenose e oclusãovascular), aterosclerose vascular de enxerto, doenças cardiovasculares, doençavascular cerebral e doença vascular periférica (e.g., doença da artériacoronária, arterosclerose, aterosclerose, arterosclerose não-ateromatosa oudano da parede vascular). E também usado para se referir a doenças queenvolvem a neogênese ou proliferação de vasos sangüíneos no olho, emparticular neovascularização coroidal.
Como usado aqui, o termo "regeneração neuronal" se refere àestimulação do crescimento de células neuronais e inclui o crescimento deneutritos e a recuperação funcional de células neuronais. As doenças edistúrbios onde a regeneração neuronal pode ter benefício terapêuticosignificativo incluem, mas não estão limitados a, Mal de Alzheimer, Mal deParkinson, Mal de Huntington (doença), esclerose lateral amiotrófica,neuralgia trigeminal, neuralgia glossofaringeal, paralisia de Bell, distrofiamuscular, derrame, atrofia muscular progressiva, atrofia muscular herdadabulbar progressiva, espondilose cervical, síndrome de Gullain-Barre,demência, neuropatias periféricas e dano no nervo periférico, se causado pordano físico (e.g., dano ou trauma no cordão espinhal, lesão ou dano no nervociático ou facial) ou um estado doentio (e.g., diabetes).
Como usado aqui, o termo "condição médica resultante dedano ou doença neural" inclui, sem limitação, condição(ões)neurodegenerativa(s), tumor(es) cerebral(is), infecção ou inflamação docérebro e outras condições que podem levar à morte ou disfunção de célulasou tecidos nervosos ou gliais.
Como usado aqui, o termo "condição(ões)neurodegenerativa(s)" inclui, sem limitação, Mal de Alzheimer, Mal deParkinson, Mal de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (ALS), distrofiamuscular (oculofaringeal), incluindo distrofia muscular oculofaringeal,esclerose múltipla, doenças por príon (e.g., doença de Creutzfeldt-Jacob(CJD)), doença de Pick, demência de corpo de Lewy (ou doença de corpo deLewe) e/ou doença neuronal motor.
Como usado aqui, o termo "condição médica que afeta osistema nervoso central que requer o medicamento para cruzar a barreiracerebral ao sangue" inclui, sem limitação, condições médicas que resultam dedano ou doenças neurais, e qualquer outra condição para a qual o acesso domedicamento às células neuronais é requerido para terapia efetiva.
Como usado aqui, o termo "doenças fibróticas" se refere adoenças associadas com a produção em excesso da matriz extracelular e inclui(sem limitação) sarcoidose, quelóides, glomerulonefrite, doença renal emestágio final, fibrose de fígado (incluindo, mas não limitada a, cirrose, doençade fígado por álcool e esteato-hepatite), nefropatia de enxerto crônica, adesõescirúrgicas, vasculopatia, fibrose cardíaca, fibrose pulmonar (incluindo, masnão limitada a, fibrose pulmonar idiopática e alveolite de fibrosamentocriptogênico), degeneração macular, retinopatia retinal e vítrea equimioterapia ou fibrose induzida por radiação.
Como usado aqui, o termo "enxerto vs. doença de hospedeiro"se refere a uma complicação que é observada após o transplante de célulatronco alogênica/medula óssea. Ela ocorre quando as células que combateminfecção do doador reconhecem o corpo do paciente como sendo diferente ouestranho. Estas células de combate à infecção então atacam os tecidos nocorpo do paciente como se elas estivessem atacando uma infecção. GvHD écategorizada como aguda quando ela ocorre dentro dos primeiros 100 diasapós o transplante e crônica se ela ocorrer mais que 100 dias após otransplante. Os tecidos tipicamente envolvidos incluem o fígado, tratogastrintestinal e pele. Enxerto crônico vs. doença hospedeira ocorreaproximadamente em 10-40 por cento dos pacientes após o transplante decélula tronco/medula óssea.
Como usado aqui, o termo "biodisponibilidade" se refere aograu no qual ou a uma taxa na qual uma droga ou outra substância é absorvidaou se torna disponível no local de atividade biológica após a administração.
Esta propriedade é dependente de vários fatores incluindo a solubilidade docomposto, da taxa de absorção no intestino, da extensão da ligação deproteína e do metabolismo etc. Vários testes para a biodisponibilidade queseriam familiares para alguém versado na técnica são descritos aqui (vertambém Trepanier et al, 1998, Gallant-Haidner et al, 2000).
Como usado aqui, o termo "câncer ou malignância de célula Bresistente a um ou mais agentes anticâncer existentes" se refere a cânceres oumalignâncias de célula B para os quais pelo menos uma terapia tipicamenteusada é ineficaz. Estes cânceres são caracterizados como sendo capazes desobreviver após a administração de pelo menos um agente neoplástico onde acontra-parte de célula normal (i.e., uma célula com crescimento regulado damesma origem) mostraria sinais de toxidade de célula, morte celular ouquiescência celular (i.e., não se dividiria). Em particular, isto inclui cânceresde MDR ou malignâncias de célula B, exemplos particulares são cânceres emalignâncias de célula B que expressam altos níveis de P-gp. A identificaçãode tais cânceres resistentes ou malignâncias de célula B está dentro dacapacidade e atividades usuais de um médico ou outra pessoa versada natécnica.
Como usado aqui, o termo "análogos de 39-desmetoxirapamicina" se refere a um composto de acordo com a fórmula (!)abaixo, ou a um sal farmaceuticamente aceitavel do mesmo.
<formula>formula see original document page 13</formula>
em que R1 representa (H,H) ou =O, e R2 e R3independentemente representam H, OH ou OCH3. Estes compostos sãotambém referidos como "os compostos da presente invenção" e estes termossão usados intercambiavelmente no presente pedido.
No presente pedido, o termo "análogo de 39-desmetoxirapamicina" inclui 39-desmetoxirapamicina sozinha.
Como usado aqui, o termo "39-desmetoxirapamicina" se referea um composto de acordo com a fórmula (I) acima, ou a um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, em que Rj representa =O, e R2 e R3representam OCH3.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis de análogos de 39-desmetoxirapamicina incluem sais convencionais formados a partir de ácidosou bases inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, bem comosais de adição de ácido de amônio quaternário. Exemplos mais específicos desais de ácido adequados incluem ácido hidroclórico, hidrobrômico, sulfurico,fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiônico, succínico,glicólico, fórmico, láctico, maleico, tartárico, cítrico, palmóico, malônico,hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, fumárico,toluenesulfônico, methanesulfônico, naftaleno-2-sulfônico, benzenosulfônicohidroxinaftóico, hidroiódico, málico, esteróico, tânico e semelhantes. Outrosácidos, tais como oxálico, embora não sendo por si só farmaceuticamenteaceitáveis, podem ser úteis na preparação de sais úteis como intermediários naobtenção dos compostos da presente invenção e seus sais farmaceuticamenteaceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicos adequados incluemsódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio, cálcio, zinco, N,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina,N-metilglucamina e sais de procaína. Referências a seguir a um composto deacordo com a presente invenção incluem 39-desmetoxirapamicina e seus saisfarmaceuticamente aceitáveis.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere ao uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina em medicina, particularmente no tratamento de câncer,malignâncias de célula B, na indução ou manutenção de imunossupressão, notratamento de rejeição de transplante, enxerto vs. doença de hospedeiro,distúrbios autoimunes, condições neurodegenerativas, doenças de inflamação,doença vascular e doenças fibróticas, na estimulação de regeneração neuronal,no tratamento de doenças neurológicas ou condições neurodegenerativas ouno tratamento de infecções fungicas. Portanto, a presente invenção fornece ouso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina, ou de um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, no tratamento de uma condiçãomédica que resulta de dano ou doença neural. Em uma forma de realizaçãoespecífica, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina, oude um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, no tratamento de umacondição médica resultando de dano ou doença neural. Em uma outra formade realização, a presente invenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais posições 9, 16 ou 27 no tratamento de uma condição médica resultandode dano ou doença neural.A presente invenção também fornece o uso de um análogo de39-desmetoxirapamicina, i.e., um análogo de rapamicina com umapermeabilidade de barreira cerebral ao sangue aumentada, ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, no tratamento de condições médicasque afetam o sistema nervoso central que requerem o medicamento paracruzar a barreira cerebral ao sangue i.e., condições médicas onde a barreiracerebral ao sangue impede o fornecimento do composto. Em uma forma derealização específica, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,no tratamento de condições médicas que afetam o sistema nervoso centralonde a barreira cerebral ao sangue impede o fornecimento do composto. Emuma outra forma de realização, a presente invenção fornece o uso de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicinaem uma ou mais das posições 9, 16 ou 27, no tratamento de condiçõesmédicas que afetam o sistema nervoso central onde a barreira cerebral aosangue impede o fornecimento do composto.
Em uma forma de realização particular, a presente invenção serefere ao uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina para o tratamento decâncer e de malignâncias de célula B. Em uma outra forma de realização, apresente invenção se refere ao uso de 39-desmetoxirapamicina para otratamento de câncer e malignâncias de célula B. Em uma outra forma derealização, a presente invenção se refere ao uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27 para o tratamento de câncer e malignâncias decélula B. A presente invenção também especificamente fornece o uso de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de tumor(es) cerebral(is).
A presente invenção também fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina notratamento de tumor(es) cerebral(is). Em uma outra forma de realização, apresente invenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicinaque adicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16ou 27 no tratamento de tumor(es) cerebral(is). Em particular, a presenteinvenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina notratamento de glioblastoma multiforme. Em uma forma de realizaçãoespecífica, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina notratamento de glioblastoma multiforme. Em uma outra forma de realização, apresente invenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicinaque adicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais posições 9, 16 ou27 no tratamento de glioblastoma multiforme.
A presente invenção também fornece o uso de um análogo de39-desmetoxirapamicina no tratamento de condições neurodegenerativas. Emuma outra forma de realização, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de condições neurodegenerativas. Emuma outra forma de realização, a presente invenção fornece o uso de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicinaem uma ou mais das posições 9, 16 ou 27 no tratamento de condiçõesneurodegenerativas. Particularmente, a condição neurodegenerativa pode serselecionada do grupo que consiste de Mal de Alzheimer, esclerose múltipla e
Mal de Huntington. Portanto, em uma forma de realização, a presenteinvenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina notratamento de Mal de Alzheimer. Em uma outra forma de realização, apresente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento deMal de Alzheimer. Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmentedifere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27 no tratamentode Mal de Alzheimer. Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina no tratamento deesclerose múltipla. Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de esclerosemúltipla. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece ouso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere derapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27 no tratamento deesclerose múltipla. Em uma forma de realização alternativa, a presenteinvenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina notratamento de Mal de Huntington. Em uma outra forma de realização, apresente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento deMal de Huntington. Em uma outra forma de realização, a presente invençãofornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmentedifere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27 no tratamentode Mal de Huntington.
Em uma forma de realização alternativa, a presente invençãofornece um método para o tratamento de câncer ou malignâncias de célula B,um método de indução ou manutenção de imunossupressão, a estimulação deregeneração neuronal, um método para o tratamento de infecções fúngicas,rejeição a transplante, rejeição, enxerto vs. doenças de hospedeiro, distúrbiosautoimunes, condições neurodegenerativas, doenças de doença vascularinflamatória ou doenças fibróticas, que compreende a administração a umpaciente de uma quantidade eficaz de um análogo de 39-desmetoxirapamicina, em particular 39-desmetoxirapamicina ou um análogode 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difira de rapamicina em umaou mais das posições 98, 16 ou 27. Especificamente, a presente invençãofornece um método de tratamento de uma condição médica resultante de danoou doença neural, que compreende a administração de um análogo de 39-desmetoxirapamicina, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em uma forma de realização particular, a presente invenção fornece ummétodo de tratamento de uma condição médica que resulta de dano ou doençaneural, que compreende a administração de 39-desmetoxirapamicina. Em umaoutra forma de realização, a presente invenção fornece um método detratamento de uma condição médica resultante de dano ou doença neural, quecompreende a administração de um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou27. A presente invenção também fornece um método de tratamento decondições médicas que afetam o sistema nervoso central, em que a barreiracerebral ao sangue impede o fornecimento do composto, pela administraçãode uma quantidade efetiva de um análogo de 39-desmetoxirapamicina, i.e.,um análogo de rapamicina com uma permeabilidade de barreira cerebral aosangue aumentada, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em umaspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outros aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27.
Preferivelmente, a presente invenção fornece um método detratamento de câncer ou malignâncias de célula B que compreende aadministração a um paciente de uma quantidade efetiva de um análogo de 39-desmetoxirapamicina. Em uma outra forma de realização preferida, a presenteinvenção fornece um método de tratamento de tumor(es) cerebral(is), quecompreende a administração a um paciente de uma quantidade efetiva de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina. Em um aspecto específico, o análogo de39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Em uma forma de realização particular, apresente invenção fornece um método de tratamento de glioblastomamultiforme, que compreende a administração a um paciente de umaquantidade efetiva de um análogo de 39-desmetoxirapamicina. Em umaspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicin. Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27.
Em uma outra forma de realização preferida, a presenteinvenção fornece um método de tratamento de uma condiçãoneurodegenerativa que compreende a administração a um paciente de umaquantidade efetiva de um análogo de 39-desmetoxirapamicina. Em umaspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou27. Particularmente, a condição neurodegenerativa pode ser selecionada dogrupo que consiste de Mal de Alzheimer, esclerose múltipla e Mal deHuntington. Portanto, em uma forma de realização, a presente invençãofornece um método de tratamento de Mal de Alzheimer que compreende aadministração a um paciente de uma quantidade efetiva de um análogo de 39-desmetoxirapamicina. Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicin. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Em uma outra forma de realização, a presenteinvenção fornece um método de tratamento de esclerose múltipla quecompreende a administração a um paciente de uma quantidade efetiva de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina. Em um aspecto específico, o análogo de39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicin. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Em uma outra forma de realização, a presenteinvenção fornece um método de tratamento de Mal de Huntington quecompreende a administração a um paciente de uma quantidade efetiva de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina. Em um aspecto específico, o análogo de39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicin. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27.
A presente invenção também fornece o uso de um análogo de39-desmetoxirapamicina na fabricação de um medicamento para o tratamentode câncer ou malignâncias de célula B, para a indução ou manutenção deimunossupressão, para a estimulação de regeneração neuronal, para otratamento de infecções por fungos, rejeição de transplante, enxerto vs.doença de hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças vascularesinflamatórias e doenças fibróticas. Especificamente, a presente invençãofornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina, ou de um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, na preparação de um medicamentopara o tratamento de uma condição médica que resulta de dano ou doençaneural. Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27.
A presente invenção também fornece o uso de um análogo de39-desmetoxirapamicina, i.e., um análogo de rapamicina com umapermeabilidade de barreira cerebral ao sangue aumentada, ou de um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, na preparação de um medicamentopara o tratamento de condições médicas que afetam o sistema nervoso central,onde a barreira cerebral ao sangue impede o fornecimento do composto. Emum aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27.
A presente invenção também especificamente fornece o uso deum análogo de 39-desmetoxirapamicina na fabricação de um medicamentopara o tratamento de tumor(es) cerebral(is). Em um aspecto específico, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outroaspecto o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Em uma forma de realização particular, apresente invenção especificamente fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina na fabricação de um medicamento para o tratamento deglioblastoma multiforme. Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27.
A presente invenção também especificamente fornece o uso deum análogo de 39-desmetoxirapamicina na fabricação de um medicamentopara o tratamento de condições neurodegenerativas. Em um aspectoespecífico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina.
Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Preferivelmente, a condição neurodegenerativapode ser selecionada do grupo que consiste de Mal de Alzheimer, Mal deParkinson e Mal de Huntington. Portanto, em uma forma de realização, apresente invenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicinana fabricação de um medicamento para o tratamento de Mal de Alzheimer.Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou27. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina na fabricação de um medicamento para otratamento de esclerose múltipla. Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Em uma outra forma de realização alternativa,a presente invenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicinana fabricação de um medicamento para o tratamento de Mal de Huntington.
Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27.
Os análogos de 39-desmetoxirapamicina são análogosestruturais próximos de rapamicina que são feitos usando os métodosdescritos em WO 04/007709. Contudo, eles mostram um espectro diferente deatividade para rapamicina, por exemplo, como mostrado pela análiseCOMPARAR do painel de linhagem com 60 células NCI para 39-desmetoxirapamicina e análogos relacionados (ver Tabela 1 abaixo). Aanálise COMPARAR usa uma análise de Pearson para comparar a atividadede dois compostos no painel de linhagem com 60 células NCI e produz umcoeficiente de correlação que indica quão similar os dois espectros deatividade dos compostos são e isto pode indicar quão relacionados seusmecanismos de ação são. Como um exemplo específico, o coeficiente dePearson para rapamicina e 39-desmetoxirapamicina é 0,614, isto deve sercomparado com o coeficiente de Pearson entre rapamicina e CCI-779 (umderivado de 40-hidroxi éster de rapamicina) que é 0,86 (Dancey, 2002).Portanto, pode ser visto que os análogos de 39-desmetoxirapamicina têm umdiferente espectro de atividade quando comparados com rapamicina.
TABELA 1
<table>table see original document page 23</column></row><table>
A Resistência a várias drogas (MDR) é um problemasignificativo no tratamento de câncer e malignâncias de célula B. Ela é aprincipal razão atrás do desenvolvimento de resistência de droga em muitoscânceres (Persidis A, 1999). Drogas que trabalharam inicialmente se tornaramtotalmente ineficazes após um período de tempo. MDR está associada comnível aumentado de transportadores de cassete se ligando a trifosfato deadenosina (transportadores de ABC), em particular, um aumento na expressãodo gene MDRl que codifica para P-glicoproteína (P-gp) ou o gene MRPl quecodifica MRP1. O nível de expressão de gene MDRl varia amplamenteatravés de diferentes linhagens derivadas de câncer diferentes, em algumaslinhagens celulares, ele é indetectável, enquanto que em outras, ele podemostrar uma expressão aumentada de 10 ou 100 vezes em relação aoscontroles padrão.
Algumas das diferenças indicadas no espectro de atividadeentre rapamicina e 39-desmetoxirapamicina podem ser explicadas porque osanálogos de 39-desmetoxirapamicina não são um substrato para P-gp. Osanálogos de 39-desmetoxirapamicina têm um efluxo diminuído de célulasCaco-2 quando comparados com rapamicina e 39-desmetoxirapamicina foimostrada não ser um substrato para P-gp em um ensaio de substrato de P-gpin vitro (ver exemplos aqui).
Portanto, um outro aspecto da presente invenção fornece o usode um análogo de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de um câncer oumalignância de célula B resistente a um ou mais agentes anti-câncerexistentes, i.e., cânceres de MDR ou malignâncias de célula B. Em umaspecto específico, a presente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento de cânceres de expressão de P-gp oumalignâncias de célula B. Em ainda uma forma de realização mais preferida, apresente invenção fornece o uso de 39-desmetoxirapamicina no tratamento decânceres ou malignâncias de célula B com alta expressão de P-gp.
Particularmente, os cânceres ou malignâncias de célula B com alta expressãode P-gp podem ter uma expressão aumentada em 2, 5, 10, 20, 25, 50 ou 100vezes em relação aos níveis de controle. Em um aspecto específico dos usosacima, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicin. Emum outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Os controles adequados são células que nãoexpressam P-gp, que têm um baixo nível de expressão de P-gp ou que têmbaixa função de MDR, alguém versado na técnica está ciente de ou podeidentificar tais linhagens de células; por meio de exemplo (mas semlimitação), linhagens celulares adequadas incluem: MDA435/LCC6, SBC-3/CDDP, MCF7, NCI-H23, NCI-H522, A549/ATCC, EKVX, NCI-H226,NCI-H322M, NCI-H460, HOP-18, HOP-92, LXFL 529, DMS 114, DMS273, HT29, HCC-2998, HCT-116, COLO 205, KM12, KM20L2, MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T-47D, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, IGROV1, SK-OV-3, K-562, MOLT-4, HL-60(TB),RPMI-8226, SR, SN12C, RXF-631, 786-0, TK-10, LOX IMVI, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, M14, UACC-62, UACC-257, PC-3, DU-145, SNB-19, SNB-75, SNB-78, U251, SF-268, SF-539, XF 498.Em um aspecto alternativo, a presente invenção fornece o usode um análogo de 39-desmetoxirapamicina na preparação de ummedicamento para uso no tratamento de cânceres ou malignâncias de célula Bde MDR. Em um aspecto específico, a presente invenção fornece o uso de umanálogo de 39-desmetoxirapamicina na preparação de um medicamento parauso no tratamento de cânceres ou malignâncias de célula B de expressão de P-gp. Em uma forma de realização ainda mais preferida, a presente invençãofornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina na preparação deum medicamento para uso no tratamento de cânceres ou malignâncias decélula B com alta expressão de P-gp. Particularmente, os cânceres oumalignâncias de célula B com alta expressão de P-gp podem ter umaexpressão aumentada em 2, 5, 10, 20, 25, 50 ou 100 vezes em relação aosníveis de controle. Em um aspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, oanálogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Os controles adequados são descritos acima.
Os métodos para a determinação do nível de expressão de P-gpem uma amostra são discutidos também aqui.
Portanto, em um outro aspecto, a presente invenção forneceum método para o tratamento de cânceres ou malignâncias de célula B comalta expressão de P-gp compreendendo a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um análogo de 39-desmetoxirapamicina. Em umaspecto específico, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, o análogo de 39-desmetoxirapamicina é um análogo de 39-desmetoxirapamicina queadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou27. O nível de expressão de P-glicoproteína (P-gp) em um tipo de câncerparticular pode ser determinado por alguém versado na técnica usandotécnicas que incluem, mas não estão limitadas a, RT-PCR em tempo real(Szakács et ai, 2004; Stein et ai, 2002; Langmann et al; 2003), por imuno-histoquímica (Stein et a/, 2002) ou usando micro-arranjos (Lee et al, 2003),estes métodos são fornecidos como exemplos somente, outros métodosadequados vão ocorrer para alguém versado na técnica.
A 39-desmetoxirapamicina mostra estabilidade metabólicaaumentada quando comparada com rapamicina, como mostrado aqui nosexemplos. Vários relatos identificaram previamente o grupo 39-metoxi emrapamicina como sendo um sítio principal de ataque metabólico paraconverter rapamicina em 39-O-desmetilrapamicina (Trepanier et al, 1998). Osprincipais metabólitos de rapamicina têm atividade significativamenteaumentada quando comparados com o composto originário (Gallant-Haidneret ai, 2000, Trepanier et al, 1998). Em contraste, a 39-desmetoxirapamicinanão tem mais disponíveis os sítios mais significativos de ataque metabólito,que resulta em uma solubilidade aumentada dos compostos (ver exemplos).
Acoplado com uma maior ou equivalente potência de 39-desmetoxirapamicina com o composto originário de 39-desmetoxirapamicina,esta fornece uma maior meia-vida para o composto da presente invenção. Istoé uma outra vantagem surpreendente de 39-desmetoxirapamicina sobrerapamicina.
As propriedades de 39-desmetoxirapamicina descritas acima(não é um substrato para P-gp, tem estabilidade metabólica aumentada eefluxo diminuído das células através de P-gp) indicam que a 39-desmetoxirapamicina tem melhorada biodisponibilidade quando comparadacom seu composto originário, rapamicina. Portanto, a presente invençãofornece o uso de 39-desmetoxirapamicina, um análogo de rapamicina comestabilidade metabólica melhorada, permeabilidade de membrana celularmelhorada e um perfil de inibição de células com câncer distinto, emmedicina, particularmente no tratamento de cânceres ou malignâncias decélula B.
A presente invenção também fornece uma composiçãofarmacêutica compreendendo um análogo de 39-desmetoxirapamicina, ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo, juntamente com um carreadorfarmaceuticamente aceitável. Em um aspecto específico, a presente invençãofornece uma composição farmacêutica compreendendo 39-desmetoxirapamicina. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica compreendendo um análogo de 39-desmetoxirapamicina que adicionalmente difere de rapamicina em uma oumais das posições 9, 16 ou 27. Em uma forma de realização específica, apresente invenção fornece uma composição farmacêutica como descrita acimaque é especificamente formulada para administração intravenosa.
A rapamicina e os compostos relacionados que são ou foramusados em ensaios clínicos, tais como CCI-779 e RADOO1, têm pobres perfisfarmacológicos, incluindo pouca estabilidade metabólica, poucapermeabilidade, altos níveis de efluxo através de P-gp e poucabiodisponibilidade. A presente invenção fornece o uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmoque tem melhoradas propriedades farmacêuticas quando comparado comrapamicina.
Um outro aspecto surpreendente da presente invenção é que osanálogos de 39-desmetoxirapamicina exibem um perfil farmacocinético bemdiferente quando comparados com os análogos de rapamicina existentes. Emparticular, os análogos de 39-desmetoxirapamicina mostram umapermeabilidade de barreira cerebral ao sangue melhorada, e, assim, umamaior exposição destes compostos é vista no cérebro quando comparados comanálogos relacionados para um dado nível de sangue.
Esta diferença em farmacocinéticos é completamenteinesperada e não é sugerida em ligar nenhum na técnica anterior. Umadesvantagem conhecida vai, hoje, disponibilizar terapias para distúrbiosincluindo condições neurodegenerativas e tumores no cérebro é o desafio dese conseguir as drogas no sítio de ação (ver Pardridge, 2005). Isto foi relatadocomo sendo um problema com análogos de rapamicina existentes quandousados em terapia, em particular, um estudo investigando a eficácia de CCI-779 no tratamento de glioblastoma multiforme concluiu que, embora asconcentrações sistêmicas fossem adequadas, a barreira cerebral ao sanguetinha agido como uma barreira para o fornecimento da droga ao tumor(Chang, 2005). A presente invenção, portanto, descreve, por um primeiromomento, um análogo de rapamicina com uma permeabilidade de barreiracerebral ao sangue e, portanto, utilidade significativa para tratar tumores nocérebro e condições neurodegenerativas.
Os análogos de 39-desmetoxirapamicina preferidos para usoem qualquer dos aspectos da presente invenção descritos acima incluemaqueles que adicionalmente diferem de rapamicina em uma ou mais dasposições 9, 16 ou 27, i.e., é preferido que o análogo de 39-desmetoxirapamicina não seja 39-desmetoxirapamicina sozinho. Outrosanálogos de 39-desmetoxirapamicina preferidos incluem aqueles em que:
- o análogo de 39-desmetoxirapamicina tem um grupohidroxila na posição 27, i.e., R3 representa OH;
- o análogo de 39-desmetoxirapamicina tem um hidrogênio naposição 27, i.e., R3 representa OH; ou
- o análogo de 39-desmetoxirapamicina tem um grupohidroxila na posição 16, i.e., R2 representa OH.
Alguém versado na técnica vai ser capaz de determinar osfarmacocinéticos e a biodisponibilidade de um composto da presenteinvenção usando métodos in vivo e in vitro conhecidos por alguém versado natécnica, incluindo, mas não limitados a, aqueles descritos abaixo e emGallant-Haidner et al, 2000 e Trepanier et al, 1998 e as suas referências. Abiodisponibilidade de um composto é determinada por vários fatores, (e.g.,solubilidade em água, permeabilidade de membrana celular, a extensão daligação de proteína e metabolismo e estabilidade), cada um dos quais pode serdeterminado por testes in vitro como descrito nos exemplos aqui, seráapreciado por alguém versado na técnica que uma melhora em um ou maisdestes fatores vai levar a uma melhora na biodisponibilidade de um composto.
Alternativamente, a biodisponibilidade de 39-desmetoxirapamicina ou de umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser medida usando métodosin vivo como descritos em mais detalhes abaixo, ou nos exemplos aqui.
Ensaios in vivo
Os ensaios in vivo podem também ser usados para medir abiodisponibilidade de um composto tal como 39-desmetoxirapamicina.Geralmente, o dito composto é administrado a um animal de teste (e.g., ratoou camundongo) intraperitonealmente (i.p.) ou intravenosamente (i.v.) eoralmente (p.o.) e amostras de sangue são tomadas em intervalos regularespara examinar como a concentração de plasma da droga varia com o tempo. Ocurso de tempo de concentração de plasma com o tempo pode ser usado paracalcular a biodisponibilidade absoluta do composto como uma percentagemusando modelos padrão. Um exemplo de um protocolo típico é descritoabaixo.
Os ratos recebem uma dose de 3 mg/kg de 39-desmetoxirapamicina i.v. ou 10 mg/kg de 39-desmetoxirapamicina p.o.. Asamostras de sangue são tomadas em intervalos de 5 min, 15 min, 1 h, 4 h e 24h, e a concentração de 39-desmetoxirapamicina na amostra é determinadaatravés de HPLC. O curso de tempo de plasma ou concentrações de sangueintegrais podem então ser usados para derivar parâmetros chave, tais como aárea sob a curva concentração-tempo de plasma ou sangue (AUC - que édiretamente proporcional à quantidade total de droga inalterada que alcança acirculação sistêmica), a concentração máxima (pico) de droga no plasma ouno sangue, o tempo no qual a concentração máxima de droga no plasma ou nosangue ocorre (tempo de pico), fatores adicionais que são usados nadeterminação precisa de biodisponibilidade incluem: a meia via terminal docomposto, a distribuição no corpo total, o volume em estado estacionário dedistribuição e F%. Estes parâmetros são então analisados por métodos não-compartimentais ou compartimentais para dar uma percentagem debiodisponibilidade calculada, para um exemplo deste tipo de método verGallant-Haidner et ai, 2000 e Trepanier et al, 1998, e suas referências.
A eficácia de 39-desmetoxirapamicina pode ser testada emmodelos in vivo para doenças neurodegenerativas que são descritas aqui e quesão conhecidas para alguém versado na técnica. Tais modelos incluem, masnão estão limitados a, Mal de Alzheimer - animais que expressam umprecursor de p-amilóide (APP) de Mal de Alzheimer familiar humano (FAD),animais que sobre-expressam APP tipo selvagem humano, animais que sobre-expressam p-amilóide l-42(pA), animais que expressam presenilina-1 (PS-I)de FAD (e.g., German e Eisch, 2004). Para esclerose múltipla - o modelo deencefalomielite autoimune experimental (EAE) (ver Bradi, 2003 e Exemplo7). Para Mal de Parkinson - o modelo de l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) ou o modelo 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (ver e.g.Emborg, 2004; Schober A. 2004). Para o Mal de Huntington há váriosmodelos que incluem o modelo de linhagens R6 gerado pela introdução deexon 1 do gene de Mal de Huntington (HD) carregando repetições de CAGaltamente expandidas na linhagem germinativa de rato (Sathasivam et al,1999) e outros (ver Hersch and Ferrante, 2004).
O composto mencionado acima da presente invenção ou umaformulação deste pode ser administrado por qualquer método convencional,por exemplo, mas sem limitação, eles podem ser administradosparenteralmente, oralmente, topicamente (incluindo bucal, sublingual outransdérmica), através de um dispositivo médico (e.g., um stent), por inalaçãoou através de injeção (subcutânea ou intramuscular). O tratamento podeconsistir de uma dose única ou de uma pluralidade de doses durante umperíodo de tempo.
Embora seja possível que um análogo de 39-desmetoxirapamicina seja administrado sozinho, é preferível se apresentá-locomo uma formulação farmacêutica, juntamente com um ou mais carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis. O(s) carreador(es) deve(m) ser "aceitável(is)"no sentido de serem compatíveis com o composto da presente invenção e nãoprejudiciais aos seus recipientes. Exemplos de carreadores adequados sãodescritos em mais detalhes abaixo.
Um análogo de 39-desmetoxirapamicina pode seradministrado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos, co-administração de dois (ou mais) agentes permite que doses significativamentemenores de cada um sejam usadas, desta forma reduzindo os efeitos colateraisvistos. A estabilidade metabólica aumentada de 39-desmetoxirapamicina temuma vantagem extra sobre rapamicina pelo fato de que ela é menos provávelde causar interações droga-droga quando usada em combinação com drogasque são substratos de enzimas P450 como ocorre com rapamicina (Lampen etal, 1998).
Portanto, em uma forma de realização, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outro agente terapêutico para ainduçãao ou manutenção de imunossupressão, para o tratamento de rejeição atransplante, enxerto vs. doença de hospedeiro, distúrbios ou doençasautoimunes de inflamação, os agentes preferidos incluem, mas não estãolimitados a, agentes imuno-regulatórios, e.g., azatioprina, corticosteróides,ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, Mycophenolate Mofetii, OKT-3 e ATG.
Em uma forma de realização alternativa, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outro agente terapêutico para otratamento de câncer e malignâncias de célula B, os agentes preferidosincluem, mas não estão limitados a, metotrexato, leukovorin, adriamycin,prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracil, paclitaxel, docetaxel,vincristina, vinblastina, vinorelbina, doxorubicina, tamoxifen, toremifene,acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal antiHER2(e.g. Herceptin™), capecitabina, hidrocloreto de raloxifena, inibidores deEGFR (e.g. Iressa TarcevaTM, ErbitUXTM), inibidores de VEGF (e.g.Avastin™), inibidores de proteasoma (e.g. VelcadeTM), inibidores deGlivec® ou hsp90 (e.g. 17-AAG). Adicionalmente, 39-desmetoxirapamicinapode ser administrada em combinação com outras terapias incluindo, mas nãolimitadas à, radioterapia e cirurgia.
Em uma forma de realização, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outro agente terapêutico para otratamento de doença vascular, agentes preferidos incluem, mas não estãolimitados a, inibidores de ACE, antagonistas de receptor de angiotensina II,derivados de ácido fíbrico, inibidores de HMG-CoA redutase, agentes debloqueio beta adrenérgicos, bloqueadores de canal de cálcio, antioxidantes,anticoagulantes e inibidores de plaquetas (PlaviX™).
Em uma forma de realização, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outros agentes terapêuticos paraa estimulação de regeneração neuronal, agentes preferidos incluem, mas nãoestão limitados a, fatores neurotróficos, e.g., fator de crescimento de nervos,fator de crescimento derivado de glial, fator de crescimento derivado docérebro, fator neurotrófico ciliar e neurotrofina-3.
Em uma forma de realização, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outro agente terapêutico para otratamento de infecções fungicas; agentes preferidos incluem, mas não estãolimitados a, anfotericina B, flucitosina, echinocandinas (e.g. caspofungina,anidulafungina ou micafungina), griseofulvina, um imidazol ou um agenteantifüngico de triazol (e.g. clotrimazol, miconazol, ketoconazol, econazol,butoconazol, oxiconazol, terconazol, itraconazol, fluconazol ou voriconazol).
Em uma forma de realização, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outro agente terapêutico para otratamento de Mal de Alzheimer; agentes preferidos incluem, mas não estãolimitados a, inibidores de colinesterase, e.g., donepezil, rivastigmina, egalantamina; antagonistas de receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), e.g,Memantina.
Em uma forma de realização, um análogo de 39-desmetoxirapamicina é co-administrado com outro agente terapêutico para otratamento de esclerose múltipla; agentes preferidos incluem, mas não estãolimitados a, interferon beta-1 b, Interferon beta-1 a, glatiramer, mitoxantrona,ciclofosphamida, corticosteróides (e.g. metilprednisolona, prednisona,dexametasona).
Por co-administração é incluído qualquer meio defornecimento de dois ou mais agentes terapêuticos ao paciente como parte domesmo regime de tratamento, como será aparente para alguém versado natécnica. Embora os dois ou mais agentes possam ser administradossimultaneamente em uma formulação única, isto não é essencial. Os agentespodem ser administrados em diferentes formulações e em diferentes períodos.
As formulações podem convenientemente ser apresentadas emdosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer dos métodosconhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de colocarem associação o ingrediente ativo (compostos da presente invenção) com ocarreador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, asformulações são preparadas pela colocação uniforme e íntima em associaçãodo ingrediente ativo com os carreadores líquidos ou carreadores sólidosfinamente divididos ou ambos, e então, se necessário, conformação doproduto.Um análogo de 39-desmetoxirapamicina vai normalmente seradministrados intravenosamente, oralmente ou por qualquer via parenteral, naforma de uma formulação farmacêutica compreendendo o ingrediente ativo,opcionalmente na forma de um sal de adição de ácido ou base, orgânico ouinorgânico não-tóxico, em uma forma de dosagem farmaceuticamenteaceitável. Dependendo do distúrbio e do paciente a ser tratado, bem como davia de administração, as composições podem ser administradas em dosesvariáveis.
As composições farmacêuticas da presente invençãoadequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis.Além disso, as composições podem estar na forma de pós estéreis para apreparação extemporânea de tais soluções ou dispersões injetáveis estéreis.Em todos os casos, a forma injetável final deve ser estéril e deve serefetivamente fluida para fácil colocação em seringa.
As composições farmacêuticas devem ser estáveis sob ascondições de fabricação e armazenagem; assim, preferivelmente, devem serpreservadas contra a ação contaminante de microorganismos, tais comobactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou um meio dedispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (e.g., glicerol, propilenoglicol e polietileno glicol líquido), óleos vegetais, e misturas adequadasdestes.
Por exemplo, um análogo de 39-desmetoxirapamicina pode seradministrado oralmente, bucalmente ou sublingualmente na forma de tabletes,cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentesflavorizantes ou colorantes, para aplicações de liberação retardada oucontrolada.
As soluções ou suspensões de um análogo de 39-desmetoxirapamicina adequado para administração oral podem tambémconter excipientes, e.g., N,N-dimetilacetamida, dispersantes, e.g., polysorbate80, tensoativos, e solubilizantes, e.g., polietileno glicol, Phosal 50 PG (queconsiste de fosfatidilcolina, ácidos graxos de soja, etanol, etanol,mono/diglicerídeos, propileno glicol e palmitato de ascorbila).
Tais tabletes podem conter excipientes, tais como celulosemicrocristalina, lactose (e.g., Iactose monoidratada ou lactose anidra), citratode sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina,hidroxitolueno butilado (E321), crospovidona, hipromelose, desintegrantes,tais como amido (preferivelmente, amido de milho, batata ou tapioca),glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódio, e certos silicatoscomplexos, e aglutinantes de granulação, tais como polivinilpirrolidona,hidroxipropilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), macrogol 8000,sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, os agentes lubrificantes, taiscomo estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talcopodem ser incluídos.
As composições sólidas de um tipo similar podem também serempregadas como cargas em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferidosincluem lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou polietileno glicóis dealto peso molecular. Para suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos dapresente invenção podem ser combinados com vários agentes adoçantes ouflavorizantes, agentes colorantes ou corantes, com agentes emulsificantes e/oude suspensão e com diluentes, tais como água, etanol, propileno glicol eglicerina, e combinações destes.
Um tablete pode ser feito por compressão ou moldagem,opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os tabletescomprimidos podem ser preparados por compressão em uma máquinaadequada do ingrediente ativo em uma forma de fluxo livre, tal como um póou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante (e.g., povidona,gelatina, hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte,conservante, desintegrante (e.g., glicolato de amido de sódio, povidonareticulada, carboximetil celulose de sódio reticulada), agente tensoativo oudispersivo. Os tabletes moldados podem ser feitos por moldagem em umamáquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecido com umdiluente líquido inerte. Os tabletes podem opcionalmente ser revestidos epodem ser formulados de forma a fornecer uma liberação vagarosa oucontrolada do ingrediente ativo usando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em várias proporções para fornecer um perfil de liberação desejado.
As formulações de acordo com a presente invenção adequadaspara administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, taiscomo cápsulas, pastilhas ou tabletes, cada um contendo uma quantidadepredeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como umasolução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não-aquoso; ou comouma emulsão líquida de óleo-em-água ou uma emulsão líquida de água-em-óleo. O ingrediente ativo pode também ser apresentado como um bolo,eletuário ou pasta.
As formulações adequadas para administração tópica na bocaincluem losangos compreendendo o ingrediente ativo em uma baseflavorizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhascompreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tal como gelatina eglicerina, ou sacarose e acácia; e colutórios compreendendo o ingredienteativo em um carreador líquido adequado.
Deve ser entendido que, em adição aos ingredientesparticularmente mencionados acima, as formulações da presente invençãopodem incluir outros agentes convencionais na técnica tendo relação com otipo de formulação em questão, por exemplo, aqueles adequados paraadministração oral podem incluir agentes flavorizantes.
As composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotópica podem ser formuladas como ungüentos, cremes, suspensões, loções,pós, soluções, pastas, géis, curativos impregnados, aspersões, aerossóis ouóleos, dispositivos transdérmicos, pós, e semelhantes. Estas composiçõespodem ser preparadas através de métodos convencionais contendo o agenteativo. Assim, elas podem também compreender carreadores e aditivosconvencionais compatíveis, tais como conservantes, solventes para ajudar napenetração da droga, emoliente em cremes ou ungüentos e etanol ou álcoololeílico para loções. Tais carreadores podem estar presentes como de cerca de1% a cerca de 98% da composição. Mais usualmente, eles vão formar atécerca de 80% da composição. Como uma ilustração somente, um creme ouungüento é preparado pela mistura de quantidades suficientes de materialhidrofílico e água, contendo de cerca de 5-10% em peso do composto, emquantidades suficientes para produzir um creme ou ungüento tendo aconsistência desejada.
As composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotransdérmica podem ser apresentadas como emplastros discretos voltados parapermanecer em contato íntimo com a epiderme do receptor por um períodoprolongado de tempo. Por exemplo, o agente ativo pode ser fornecido a partirdo emplastro por iontoforese.
Para aplicações aos tecidos externos, por exemplo, a boca e apele, as composições são preferivelmente aplicadas como um ungüento oucreme tópico. Quando formulado com um ungüento, o agente ativo pode serempregado com uma base de ungüento parafínica ou miscível em água.
Alternativamente, o agente ativo pode ser formulado em umcreme com uma base de creme óleo-em-água ou uma base água-em-óleo.
Para administração parenteral, as formas de dosagem unitáriade fluido são preparadas utilizando o ingrediente ativo e um veículo estéril,por exemplo, mas sem limitação, água, álcoois, polióis, glicerina e óleosvegetais, com água sendo preferida. O ingrediente ativo, dependendo doveículo e da concentração usada, pode ser suspenso ou dissolvido no veículo.No preparo das soluções, o ingrediente ativo pode ser dissolvido em água parainjeção e esterilizado em filtro antes do enchimento em um frasco ou ampolaadequado(a) e vedação.
Vantajosamente, os agentes tais como anestésicos locais,conservantes e agentes de tamponamento podem ser dissolvidos no veículo.Para melhorar a estabilidade, a composição pode ser congelada após oenchimento no frasco e a água removida sob vácuo. O pó liofilizado seco éentão vedado no frasco e um frasco acompanhante de água para injeção podeser fornecido para reconstituir o líquido antes do uso.
As suspensões parenterais são preparadas substancialmente damesma maneira que as soluções, com a exceção de que o ingrediente ativo ésuspenso no veículo ao invés de ser dissolvido e esterilização não pode serrealizada por filtração. O ingrediente ativo pode ser esterilizado pelaexposição a óxido de etileno antes da suspensão no veículo estéril.Vantajosamente, um tensoativo ou agente umectante é incluído nacomposição para facilitar uma distribuição uniforme do ingrediente ativo.
Um análogo de 39-desmetoxirapamicina pode também seradministrado usado dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo,em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da presenteinvenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmicosem agulha, tal como os dispositivos descritos nas Patentes U.S. 5.399.163;U.S. 5.383.851; U.S. 5.312.335; U.S. 5.064.413; U.S. 4.941.880; U.S.4.790.824; ou U.S. 4.596.556. Exemplos de implantes bem conhecidos emódulos úteis na presente invenção incluem: patente U.S. 4.487.603, quedescreve uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar ummedicamento em uma taxa controlada; patente U.S. 4.486.194, que descreveum dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através dapele; U.S. 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicamentopara fornecer o medicamento em uma taxa de infusão precisa; U.S. 4.447.224,que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável parafornecimento de droga contínuo; U.S. 4.439.196, que descreve um sistema deliberação de droga osmótico tendo compartimentos multi-câmara; e U.S.4,475,196, que descreve um sistema de liberação de droga osmótico. Em umaforma de realização específica, um análogo de 39-desmetoxirapamicina podeser administrado usando um stent de eluição de droga, por exemplo, umcorrespondente àqueles descritos na WO 01/87263 e publicações relacionadasou aqueles descritos por Perin (Perin, EC, 2005). Muitos outros taisimplantes, sistemas de fornecimento, e módulos são conhecidos por aquelesversados na técnica.
A dosagem a ser administrada de um composto da presenteinvenção vai variar de acordo com o composto particular, com a doençaenvolvida, com o indivíduo, e com a natureza e a severidade da doença e coma condição física do indivíduo, e com a via de administração selecionada. Adosagem apropriada pode ser prontamente determinada por alguém versadona técnica.
As composições podem conter de 0,1% em peso,preferivelmente de5-60% em peso, mais preferivelmente de 10-30% em peso,de um composto da presente invenção, dependendo do método deadministração.
Será reconhecido por alguém versado na técnica que aquantidade ótima e o espaçamento de dosagem individuais de umcomposto da presente invenção vão ser determinados pela natureza e pelaextensão da condição sendo tratada, da forma, da via e do sítio deadministração, e da idade e da condição do indivíduo particular sendotratado, e que um médio vai finalmente determinar as dosagensapropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida quando forapropriado. Se os efeitos colaterais se desenvolverem, a quantidade e/oufreqüência da dosagem podem ser alteradas ou reduzidas, de acordo com aprática clínica normal.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 - mostra a estrutura da rapamicina
Figura 2 - mostra a via de fragmentação para 39-desmetoxirapamicina
Figura 3 - mostra as western blots sumarizando a atividadeinibitória de mTOR de 39-desmetoxirapamicina e rapamicina.
Figura 4 - os valores %T/C em todas as concentrações de testepara paclitaxel (A e C) e 39-desmetoxirapamicina (B e C) em linhagenscelulares normais (A ou B) ou com alta expressão de P-gp (C e D).
Figura 5
A- mostra a área total sob a curva (AUC) de 0-24 h paraamostras de tecido cerebral e sangue após uma administração i.v. ou p.o.única de rapamicina e 39-desmetoxirapamicina
B- mostra o nível de 39-desmetoxirapamicina e rapamicinadetectadas no tecido cerebral com o tempo após uma administração i.v. única.
Figura 6
A- mostra a progressão da doença no modelo EAE sob oregime profilático. Os valores dados são a média do veículo ou grupo tratado.
B- mostra a progressão da doença no modelo EAE sob oregime terapêutico. Os valores dados são a média do veículo ou grupo tratado.
Figura l-o gráfico indica o % relativo de sobrevivência apósa indução de glioma por injeção esteroetáxica de células U87-MG. Osdiamantes preenchidos representam o grupo não tratado, os quadradospreenchidos representam o grupo tratado com veículo e os círculos abertosrepresentam o grupo tratado com 39-desmetoxirapamicina.
EXEMPLOS
Materiais e Métodos
Materiais
A não ser que de outra forma indicado, todos os reagentesusados nos exemplos abaixo foram obtidos de fontes comerciais.
Cultura
S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] (WO 04/007709;Gregory et ai, 2004) foi mantido em placas de ágar no meio 1 (ver abaixo) a28°C. As cargas de esporos foram preparadas após o crescimento no meio 1,conservadas em 20% p/v de glicerol; 10% p/v de lactose em água destilada earmazenadas a -80°C. As culturas vegetativas foram preparadas por inoculaçãode 0,1 ml de carga congelada em 50 ml de meio 2 (ver abaixo) em um frasco de250 ml. A cultura foi incubada por de 36 a 48 horas a 28°C, 300 rpm.
Método de Produção:
As culturas vegetativas foram inoculadas a 25 - 5% v/v nomeio 3. O cultivo foi realizado por 6-7 dias, 26°C, 300 rpm.
Procedimento de alimentação:
A alimentação/adição de ácido cicloexano carboxílico foirealizada 24-48 horas após a inoculação e foi alimentada em umaconcentração final de 1-2 mM, a não ser que de outra forma estabelecido.
Meio 1:
<table>table see original document page 41</column></row><table>
O meio foi então esterilizado pela colocação em autoclave a1210C, 20 min.
Meio 2: meio de semente Rap V7
<table>table see original document page 41</column></row><table>O meio foi então esterilizado pela colocação em autoclave a121°C, 20 min.
Após a esterilização, 0,16 ml de 40% de glucose é adicionadoa cada 7 ml de meio.
Meio 3: meio MD6 (meio de fragmentação)
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Antes da esterilização, 0,4 ml de Sigma a-amilase (BAN 250)foi adicionado a 1 1 de meio. O meio foi esterilizado por 20 min a 121°C.
Após a esterilização, 0,35 ml de frutose 40% estéril e 0,10 mlde L-Iisina (140 mg/ml em água, esterilizada por filtro) foi adicionada a cada7 ml.
Meio 4: meio de semente RapV7a
<table>table see original document page 42</column></row><table>
O meio foi então esterilizado pela colocação em autoclave a1210C5 20 min.
Meio 5: meio MD6/5-1 (meio de fragmentação)
<table>table see original document page 43</column></row><table>
O meio foi esterilizado por 30 min a 121°C.
Após a esterilização, 15 g de frutose por 1 foram adicionados.
Após 48 h, 0,5 g/l de L-Iisina foi adicionado.
Métodos Analíticos
Método A
Volume de injeção: 0,005 - 0,1 ml (como requeridodependendo da sensibilidade). HPLC foi realizada em cartuchos de "RapidaResolução" "Spherisorb" Agilent SB C8, 3 mícrons, 30 mm x 2,1 mm,correndo uma fase móvel de:
fase móvel A: 0,01% de ácido fórmico em água purafase móvel B: 0,01% de ácido fórmico em acetonitrilavazão: 1 ml/min
O gradiente linear foi usado, de 5% BaO min até 95% B a 2,5min, mantendo a 95% B até 4 min, retornando para 5% B até o clico seguinte.A detecção foi por absorbância de UV a 254 nm e/ou por ionização deeletroaspersão de espectrometria de massa (positiva ou negativa) usando uminstrumento Micromasss QuattroMicro.Método B
Volume de injeção: 0,02 ml. HPLC foi realizada em umacoluna BDS Cl8 Hypersil (ThermoHypersil-Keystone Ltd) de 3 mícron, 150χ 4,6 mm, mantida a 50°C, correndo uma fase móvel de:
Fase Móvel A: acetonitrila (100 ml), ácido trifluoroacético (1ml), acetato de amônio 1 M (10 ml) completado até 1 1 com água deionizada.
Fase Móvel B: água deionizada (100 ml), ácidotrifluoroacético (1 ml), acetato de amônio 1 M (10 ml) completado até 1 1 comacetonitrila.
Vazão: 1 ml/min
Um gradiente linear de 55% B - 95% B foi usado durante 10minutos, seguido por 2 minutos a 95% B, 0,5 minuto para 55% B e outros 2,5minutos a 55% Β. A detecção do composto foi por absorbância de UV a 280nm.
Método C
O sistema de HPLC compreendia um Agilent HPllOO e foirealizado em uma coluna BDS Cl8 Hypersil (ThermoHypersil-Keystone Ltd)de 3 mícron, 150 χ 4,6 mm, mantida a 40°C, correndo uma fase móvel de:
Fase Móvel A: água deionizada.
Fase Móvel B: acetonitrila.
Vazão: 1 ml/min
Este sistema foi acoplado a um espectrômetro de massa deeletroaspersão Bruker Daltonics Esquire3000. A comutação positivo paranegativo foi usada sobre uma faixa de varredura de 500 a 1000 Daltons. Umgradiente linear de 55% B - 95% B foi usado durante 10 minutos, seguido por2 minutos a 95% B, 0,5 minuto para 55% B e outros 2,5 minutos a 55% B.Bioensaio in vitro para atividade anti-câncer
A avaliação in vitro de compostos para atividade anti-câncerem um painel de 12 linhagens celulares com tumor humanas em um ensaio deproliferação de monocamada foi realizada na Oncotest Testing Facility,Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg.
TABELA 2 - Linhagens Celulares de Teste
<table>table see original document page 45</column></row><table>
As linhagens celulares de Oncotest foram estabelecidas dexeno-enxertos de tumor humano como descrito por Roth et al. 1999. Estaorigem dos xeno-enxertos doadores foi descrita por Fiebig et al. 1992. Outraslinhagens celulares foram obtidas de NCl (H460, SF-268, OVCAR-3, DU145,MDA-MB-231, MDA-MB-468) ou compradas da DSMZ, Braunschweig5Alemanha (LNCAP).
Todas as linhagens celulares, a não ser que de outra formaespecificadas, são crescidas a 37°C em uma atmosfera umedecida (95% de ar,5% de CO2) em um meio de "mistura pronta" contendo meio RPMI 1640,10% de soro de bezerro fetal, e 0,1 mg/ml de gentamicina (PAA, Cõlbe,Alemanha).
Ensaio de Monocamada - Protocolo 1:
Um ensaio de iodeto de propídeo modificado foi usado paraavaliar os efeitos do(s) composto(s) de teste no crescimento de doze linhagenscelulares de tumor humanas (Dengler et al, 1995).
Brevemente, as células foram colhidas das culturas de faseexponencial por tripsinização, contadas e colocadas em placas demicrotitulação com fundo plano de 96 poços em uma densidade celulardependente da linhagem celular (5 - 10.000 células viáveis/poço). Apósrecuperação de 24 h para permitir que as células retomem o crescimentoexponencial, 0,01 ml de meio de cultura (6 poços de controle por placa) oumeio de cultura contendo 39-desmetoxirapamicina foi adicionado aos poços.Cada concentração foi colocada nas placas em triplicata. 39-desmetoxirapamicina foi aplicada em duas concentrações (0,001 mM e 0,01mM). Após 4 dias de incubação contínua, o meio de cultura celular com ousem 39-desmetoxirapamicina foi substituído por 0,2 ml de uma soluçãoaquosa de iodeto de propídio (PI) (7 mg/l). Para medir a proporção de célulasvivas, as células foram permeabilizadas por congelamento das placas. Após odescongelamento das placas, a fluorescência foi medida usando a leitora demicroplacas Cytofluor 4000 (excitação de 530 nm, emissão de 620 nm),dando uma relação direta para o número total de células viáveis.
A inibição do crescimento foi expressada comotratadas/controle χ 100 (% T/C). Para os compostos ativos, os valores de IC5oe IC70 foram estimados pela plotagem da concentração do composto versusviabilidade de célula.
£nsaio de Monocamada - Protocolo 2:
As linhagens de células com tumor humanas do painel detriagem de câncer do Instituto Nacional do Câncer (NCI) foram crescidas emmeio RPMI 1640 contendo 5% de soro bovino fetal e 2 mM de L-glutamina(Boyd and Paull, 1995). As células foram inoculadas em placas demicrotitulaç.ão de 96 poços em 0,1 ml nas densidades de deposição em placavariando de 5.000 a 40.000 células/poço, dependendo do tempo em dobro daslinhagens celulares individuais. Após a inoculação celular, as placas demicrotitulação foram incubadas a 37°C, 5% de CO2, 95% de ar e 100% deumidade relativa por 24 h antes da adição de drogas experimentais.
Após 24 h, duas placas de cada linhagem celular foram fixadasin situ com ácido tricloroacético (TCA), para representar uma medição dapopulação de células para cada linhagem celular no tempo de adição de droga(Tz). As drogas experimentais foram solubilizadas em sulfóxido de dimetilaem 400 vezes a concentração de teste máxima final desejada e armazenadascongeladas antes do uso. No tempo de adição de droga, uma alíquota deconcentrado congelado foi descongelada e diluída até duas vezes aconcentração de teste máxima final desejada com meio completo contendo0,05 mg/ml de gentamicina. Quatro adicionais diluições em série de 10 vezesou 1/2 Iog foram feitas para fornecer um total de cinco concentrações dedroga mais controle. Alíquotas de 0,1 ml destas diluições de droga diferentesforam adicionadas aos poços de microtitulação apropriados já contendo 0,1ml de meio, resultando nas concentrações de droga finais requeridas.
Após a adição da droga, as placas foram incubadas por umadicional de 48 h a 37°C, 5% de CO2, 95% de ar e 100% de umidade relativa.Para as células aderentes, o ensaio foi terminado pela adição de TCA frio. Ascélulas foram fixadas in situ pela adição suave de 0,05 ml de 50% (p/v) deTCA frio (concentração final, 10% de TCA) e incubadas por 60 minutos a4°c. O sobrenadante foi descartado, e as placas foram lavadas cinco vezescom água de torneira e secas com ar. Uma solução de sufordamina B (SRB)(0,1 ml) a 0,4% (p/v) em 1% de ácido acético foi adicionada a cada poço, e asplacas foram incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente. Após omanchamento, o corante não ligado foi removido pela lavagem cinco vezescom ácido acético 1% e as placas foram secas com ar. A mancha ligada foisubseqüentemente solubilizada com 1 OmM de base trizma, e a absorbância foilida em uma leitora de placa automatizada em um comprimento de onda de515 nm.
Para as células em suspensão, a metodologia foi a mesma, exceto queo ensaio foi terminado pela fixação de células decantadas no fundo dos poçospela adição gential de 0,05 ml de TCA 80% (concentração final, 16% deTCA). O uso das sete medições de absorbância [tempo zero, (Tz),crescimento de controle, (C), e crescimento de teste na presença de droga noscinco níveis de concentração Ti], a percentagem de crescimento foi calculadaem cada um dos níveis de concentração de droga. A percentagem de inibiçãode crescimento foi calculada como:
[(Ti-Tz)/(C-Tz)] χ 100 para concentrações onde Ti > Tz[(Ti-Tz)/Tz] χ 100 para concentrações onde Ti < Tz.
Três parâmetros de resposta de dose foram calculados paracada agente experimental. A inibição do crescimento de 50% (GI50) foicalculada de [(Ti-Tz)/(C-Tz)] χ 100 = 50, que é a concentração de drogaresultando em uma redução de 50% no aumento de proteína líquido (comomedido por manchamento de SRB) no controle de células durante a incubaçãode droga. A concentração de droga resultando em inibição de crescimentototal (TGI) foi calculada de Ti = Tz. A LC50 (concentração de drogaresultando em uma redução de 50% na proteína medida no final do tratamentode droga quando comparada com aquela do início), indicando uma perdalíquida de células após o tratamento, foi calculada de [(Ti-Tz)/Tz] χ 100 = - 50.
As linhagens celulares resistentes a várias drogas dentro dopainel de linhagem de 60 células foram identificadas por NCI como linhagenscelulares contendo muito P-gp, como identificado por efluxo de rodamina B(Lee et al., 1994) e por detecção de PCR de mRNA de mdr-1 (Alvarez et al, 1995).
Análise Farmacocinética - Protocolo 1:
Os compostos de teste foram preparados em um veículo queconsiste de 4% de etanol, 5% de Tween-20, 5% de polietilenoglicol 400 em0,15 M de NaCl. Uma dose única de 10 mg/kb p.o. ou 3 mg/kg i.v. foiadministradas a grupos de ratos CDl fêmeas (3 ratos para cada composto porponto de tempo). Em 0 min, 4 min, 15 min, 1 h, 4 h e 24 h, os grupos foramsacrificados e o sangue e o cérebro foram coletados de cada rato para outraanálise.
As amostras de cérebro foram congeladas instantaneamenteem nitrogênio líquido e armazenadas a -20°C. Um mínimo de 0,2 ml desangue integral de cada animal foi coletado em tubos contendo ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) como anticoagulante, completamentemisturados, e armazenados a -20°C.
Análise Farmacocinética - Protocolo 2:
Para preparar a solução de dosagem, 5 mg de composto deteste foram dissolvidos em 100 μΐ de etanol, resultando em uma solução decomposto de 50 mg/ml. A solução foi então diluída até 2 mg/ml pela adiçãode aproximadamente 2,4 ml de NaCl 0,15 M (0,9% p/v de solução salina), 5%v/v Tween 20 e 5% v/v PEG 400 (conc. final de etanol de 4% v/v).
Uma dose única de 10 mg/kg p.o. ou 2 mg/kg i.v. de compostode teste em uma concentração de 10 mg/kg p.o. ou 2 mg/kg i.v. foiadministrada em grupos de 3 ratos Malb C fêmeas. Em 5 min, 15 min, 10min, 4 h, 8 h e 24 h, os grupos foram sacrificados e amostras de sangueintegral de aproximadamente 0,2 ml foram recuperadas em EDTA para daruma concentração final de 0,5 mM, adicionalmente os cérebros foramremovidos. O sangue integral e os cérebros foram congeladosinstantaneamente em nitrogênio líquido e armazenados a -20°C até otransporte em dióxido de carbono sólido para análise.
Análise das amostras de estudo farmacocinéticas:
A análise foi realizada por ASI Limited, (St George's HospitalMedicai School, Londres). A concentração do composto de teste nas amostrasde sangue e cérebro fornecidas foi determinada por HPLC com detecção MS.As amostras de sangue de controle, livres de composto de teste, foram obtidasde Harlan Sera-Lab Limited, (Loughborough, Inglaterra). As amostras decérebro em tempo zero foram supridas como as amostras de cérebro decontrole livres de composto de teste.
Preparação de amostras de cérebro:
Um hemisfério de cada cérebro foi homogeneizado com 5 mlde água.
Extração das amostras:
O controle ou amostra de teste de cérebro ou sangue de rato(0,05 ml), uma solução padrão interna (0,1 ml), solução de sulfato de zinco5% (0,5 ml), e acetona (0,5 ml) foram pipetadas em um tubo de polipropilenode 2 ml (Sarstedt Limited, Beaumont Leys, Leicester, UK) e os conteúdosforam misturados por um mínimo de 5 minutos (misturador IKA-Vibrax-VXR, Merck (BDH) Limited, Poole Dorset, UK). Os tubos foram entãocentrifugados em uma microcentrífuga por um mínimo de 2 minutos. Acamada de solvente foi decantada em um tubo de polipropileno de 4,5 mlcontendo hidróxido de sódio (0,1 M, 0,1 ml) e metil-terc-butil éteres (MTBE,2 ml). O tubo foi então misturado por um mínimo de 5 minutos (misturadorIKA-Vibrax-VXR) e então centrifugado a 3500 rpm por 5 minutos. A camadade solvente foi transferida para um tubo de polipropileno cônico de 4,5 ml,colocada em um SpeedVac®, e evaporada até a secura.
Os extratos secos foram reconstituídos com 0,15 ml demetanol 80% e misturados por um mínimo de 5 minutos (misturador IKA-Vibrax-VXR) e centrifugados a 350 rpm por 5 minutos. O extrato foitransferido para tubos auto amostradores (NLG Analytical, Adelphi Mil(,Bollington, Cheshire, UK) e colocados em uma bandeja auto-amostradora quefoi ajustada em temperatura ambiente. O auto-amostrador foi programadopara injetar uma alíquota de 0,03 ml de cada extrato na coluna analítica.
Exemplo 1. Fermentação e isolamento dos compostos de teste
1.1- Fermentação e isolamento de 39-desmetoxirapamicina
A 39-desmetoxirapamicina foi produzida pelo crescimento deculturas de S. hygroscopicus MG235 [IJMNOQLhis] e alimentação com ácidociclohexanocarboxílico (CHCA) como descrito aqui.
S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] foi produzido pelaintrodução na cepa de MG2-10 descrita na WO 20041007709 de umplasmídeo contendo os genes rapi, rapJ, rapM, rapN, rapo, rapo e rapL. Ocassete de gene foi construído com o gene rapL contendo um rótulo dehistidina na estrutura 5'. Como descrito na WO 2004/007709, o plasmídeotambém continha uma origem de transferência e um marcador de resistência aapramicina para a transformação de MG2-10 pela conjugação e seleção deexconjugantes e um sítio de ligação de phiBTl para integração específica paraum local no cromossomo. O isolamento de cada um destes genes e o métodousado para a construção de cassetes de gene contendo combinações de genespós-PKS foi realizado como descrito na WO 2004/007709.
Cultura Líquida
Uma cultura vegetativa de S. hygroscopicus MG2-10[IJMNOQLhis] foi cultivada como descrito em Materiais e Métodos. Asculturas de produção foram inoculadas com cultura vegetativa em 0,5 ml em 7ml de meio 3 em tubos de 50 ml. A cultivação foi realizada por 7 dias, 26°C,300 rpm. Amostras de 1 ml foram extraídas em 1:1 acetonitrila comchacoalhamento por 30 min, centrifugadas 10 min, 13.000 rpm e analisadas equantificadas de acordo com o Método de análise B (ver Materiais eMétodos). A confirmação do produto foi determinada por espectrometria demassa usando o Método de análise B (ver Materiais e Métodos).
O análogo de rapamicina observado foi proposto para ser a 39-desmetoxirapamicina desejada na base dos dados analíticos descritos sobcaracterização abaixo.
Fermentação
Uma cultura vegetativa primária no Meio 4 de S.hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] foi cultivada essencialmente comodescrito em Materiais e Métodos. Uma cultura vegetativa secundária no Meio4 foi inoculada em 10% v/v, 28°C, 250 rpm, por 24 h. As culturas vegetativasforam inoculadas a 5% v/v no meio 5 (ver Materiais e Métodos) em umfermentador de 20 1. O cultivo foi realizado por 6 dias a 26°C, 0,5 vvm. >30% de oxigênio dissolvido foi mantido por alteração da velocidade doimpelidor, velocidade mínima de 1,18 ms"1, velocidade máxima de 2,75 ms"1.A alimentação de ácido cicloexanocarboxílico foi realizada em 24 e 48 h apósa incubação para dar uma concentração final de 2 mM.
Extração e Purificação
O caldo de fermentação (30 1) foi agitado com um volumeigual de metanol por 2 horas e então centrifugado para empelotar as células(10 min, 3500 rpm). O sobrenadante foi agitado com resina Diaion® HP20 (43g/L) por lhe então filtrado. A resina foi lavada em batelada com acetonapara retirar o análogo de rapamicina e o solvente foi removido in vácuo. Oconcentrado aquoso foi então diluído até 2 1 com água e extraído com EtOAc(3x2 1). O solvente foi removido in vácuo para dar um óleo marrom (20,5 g).
O extrato foi dissolvido em acetona, seco sobre sílica, aplicadoa uma coluna de sílica (diâmetro de 6 χ 6,5 cm) e eluído com um gradienteem etapas de acetona/hexano (20% - 40%). As frações contendo análogo derapamicina foram aglomeradas e o solvente removido in vácuo. O resíduo(2,6 g) foi também cromatografado (em três bateladas) sobre Sephadex LH20,eluindo com 10:10:1 clorofórmio/heptano/etanol. O análogo de rapamicinasemi-purificado (1,7 g) foi purificado por HPLC preparativa em fase reversa(Cl8) usando uma HPLC, eluindo uma coluna Phenomenex 21.2 χ 250 mmLuna 5 μιη Cl8 BDS com 21 ml/min de 65% de acetonitrila/água. As fraçõesmais puras (identificadas por HPLC analítica, Método B) foram combinadas eo solvente removido in vácuo para dar 39-desmetoxirapamicina (563 mg).
Caracterização
O espectro 1H RMN de 39-desmetoxirapamicina foiequivalente àquele de um padrão (P. Lowden, Ph.D. Dissertation, Universityof Cambridge, 1997).
As análises de LCMS e LCMSn de extratos de cultura mostramque a relação m/z para o análogo de rapamicina é 30 unidades de massamenor que para rapamicina, consistente com a ausência de um grupo metoxi,íons observados: [M-H] 882.3, [M+NH4]+ 901.4, [M+Na]+ 906.2, [M+K]+922.2. A fragmentação do aduto de sódio deu os íons previstos para 39-desmetoxirapamicina após um caminho de fragmentação previamenteidentificado (Figura 2) (J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University ofCambridge, 2000). Estes dados de fragmentação de espectrometria de massaestreitam a região do análogo de rapamicina onde a perda de um metoxiocorreu no fragmento C28-C42 que contém a parte cicloexil.
Estes dados de fragmentação de espectrometria de massa sãocompletamente consistentes com a estrutura de 39-desmetoxirapamicina.
1.2- Fermentação e isolamento de 27-Q-desmetil-39-desmetoxirapamicina
27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina foi produzida pelocrescimento de culturas de S. hygroscopicus MG2-10 [JMNOLhis] ealimentação com ácido cicloexanocarboxílico (CHCA) como descrito abaixo.
S. hygroscopicus MG2-10 [JMNOLhis] foi produzido pelaintrodução na cepa de MG2-10 descrita na WO 2004/007709 de umplasmídeo contendo os genes rapJ, rapM, rapN, rapO, e rapL. O cassete degene foi construído com o gene rapL contendo um rótulo de histidina em-estrutura 5'. Como descrito na WO 2004/007709, o plasmídeo tambémcontinha uma origem de transferência e um marcador de resistência deapramicina para transformação de MG2-10 por conjugação e seleção deexconjugantes e um sítio de ligação de phiBTl para integração específica nolocal no cromossomo. O isolamento de cada um destes genes e o métodousado para a construção de cassetes de gene contendo combinações de genespós-PKS foram realizados como descrito na WO 2004/007709.
Cultura líquida
Uma cultura vegetativa de S. hygroscopicus MG2-10[JMNOLhis] foi cultivada como descrito em Materiais e Métodos. As culturasde produção foram inoculadas com cultura vegetativa a 0,5 ml em 7 ml demeio 3 em tubos de 50 ml. O cultivo foi realizado por 7 dias, 26°C, 300 rpm.Amostras de 1 ml foram extraídas em 1:1 acetonitrila com chacoalhamentopor 30 min, centrifugadas 10 min, 13.000 rpm e analisadas e quantificadas deacordo com o Método de análise B (ver Materiais e Métodos). A confirmaçãodo produto foi determinada por espectrometria de massa usando o Método deanálise C (ver Materiais e Métodos).
O análogo de rapamicina observado foi proposto para ser a 27-O-desmetil-39-desmetoxirapamicina desejada na base dos dados analíticosdescritos sob caracterização abaixo.
Fermentação
Uma cultura vegetativa primária no Meio 2 de S.hygroscopicus MG2-10 [JMNOLhis] foi cultivada essencialmente comodescrito em Materiais e Métodos. Uma cultura vegetativa secundária no Meio2 foi inoculada em 10% v/v, 28°C, 250 rpm, por 24 h. As culturas vegetativasforam inoculadas a 10% v/v no meio 5 (ver Materiais e Métodos) em umfermentador de 20 1. O cultivo foi realizado por 6 dias a 26°C, 0,75 wm. >30% de oxigênio dissolvido foi mantido por alteração da velocidade doimpelidor, velocidade mínima de 1,18 ms"1, velocidade máxima de 2,75 ms"1.A alimentação de ácido cicloexanocarboxílico foi realizada em 24h e 48 hapós a incubação para dar uma concentração final de 2 mM.
Extração e Purificação
O caldo de fermentação (15 1) foi agitado com um volumeigual de metanol por 2 horas e então centrifugado para empelotar as células(10 min, 3500 rpm). O sobrenadante foi agitado com resina Diaion® HP20 (43g/L) por lhe então filtrado. A resina foi lavada em batelada com acetonapara retirar o análogo de rapamicina e o solvente foi removido in vácuo. Oconcentrado aquoso foi então diluído até 2 1 com água e extraído com EtOAc(3x2 1). O solvente foi removido in vácuo para dar um óleo marrom (12 g).O extrato foi dissolvido em acetona, seco sobre sílica, aplicadoa uma coluna de sílica (diâmetro de 4 χ 6,5 cm) e eluído com um gradienteem etapas de acetona/hexano (20% - 40%). As frações contendo análogo derapamicina foram aglomeradas e o solvente removido in vácuo. O resíduo(0,203 g) foi enriquecido por HPLC preparativa em fase reversa (Cl8) usandouma HPLC de Gilson, eluindo uma coluna Phenomenex 21.2 χ 250 mm Luna5 μπι Cl8 BDS com 21 ml/min de 65% de acetonitrila/água. As frações maispuras (identificadas por HPLC analítica, Método B) foram combinadas e osolvente removido in vácuo para dar o resíduo (25,8 mg). O resíduo foipurificado por HPLC preparativa em fase reversa (C18) usando uma HPLC deGilson, eluindo uma coluna Hypersil 4,6 χ 150 mm 3 μηι Cl8 BDS com 1ml/min de 60% de acetonitrila/água. As frações mais puras (identificadas porHPLC analítico, Método B) foram combinados e o solvente removido invácuo para dar 27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina (19,9 mg).
Caracterização
Os espectros 1H e 13C RMN são consistentes com a estruturapara 27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina e as designações são mostradasna Tabela 3 abaixo.
TABELA 3: Danos de RMN de 27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina emCDCl3 a 500 MHz para 1H RMN e 125 para 13C RMN.<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>
• *Valor mostrado como integração dupla quando comparado com outrovalor 13C no espectro 13C RMN.
• A estereoquímica não foi determinada, pois foram precisos maisexperimentos de RMN (tal como ID e 2D NOESY), pois esta causa no1H axial e equatorial de metileno não foi designada.
As análises de LCMS e LCMSn de extratos de cultura mostramque a relação m/z para o análogo de rapamicina é 44 unidades de massamenor que para rapamicina, consistente com a ausência de um grupo metil emetoxi. íons observados: [M-H] 868,7, [M+NHJ* 887,8, [M+Na]+ 892,8. Afragmentação do aduto de sódio deu os íons previstos para 27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina após um caminho de fragmentação previamenteidentificado (Figura 2) (J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University ofCambridge, 2000). Estes dados de fragmentação de espectrometria de massaestreitam a região do análogo de rapamicina onde a perda de um metoxiocorreu no fragmento C28-C42 que contém a parte cicloexil e estreitam aregião do análogo de rapamicina onde a perda de um O-metil tenha ocorridopara o fragmento C15-C27.
Estes dados de fragmentação de espectrometria de massa sãocompletamente consistentes com a estrutura de 27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina.
1.3- Fermentação e isolamento de 16-Q-desmetil-27-Q-desmetil-39-desmetoxirapamicina
16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina foiproduzida pelo crescimento de culturas de S. hygroscopicus MG2-10[IJNOLhis] e alimentação com ácido cicloexanocarboxílico (CHCA) comodescrito abaixo.
S. hygroscopicus MG2-10 [IJNOLhis] foi produzido pelaintrodução na cepa de MG2-10 descrita na WO 2004/007709 de umplasmídeo contendo os genes rapl, rapJ, rapN, rapO, e rapL. O cassete degene foi construído com o gene rapL contendo um rótulo de histidina em-estrutura 5'. Como descrito na WO 2004/007709, o plasmídeo tambémcontinha uma origem de transferência e um marcador de resistência deapramicina para transformação de MG2-10 por conjugação e seleção deexconjugantes e um sítio de ligação de phiBTl para integração específica nolocal no cromossomo. O isolamento de cada um destes genes e o métodousado para a construção de cassetes de gene contendo combinações de genespós-PKS foram realizados como descrito na WO 2004/007709.
Cultura líquida
Uma cultura vegetativa de S. hygroscopicus MG2-10[IJNOLhis] foi cultivada como descrito em Materiais e Métodos. As culturasde produção foram inoculadas com cultura vegetativa a 0,5 ml em 7 ml demeio 3 em tubos de 50 ml. O cultivo foi realizado por 7 dias, 26°C, 300 rpm.Amostras de 1 ml foram extraídas em 1:1 acetonitrila com chacoalhamentopor 30 min, centrifugadas 10 min, 13.000 rpm e analisadas e quantificadas deacordo com o Método de análise B (ver Materiais e Métodos). A confirmaçãodo produto foi determinada por espectrometria de massa usando o Método deanálise C (ver Materiais e Métodos).
O análogo de rapamicina observado foi proposto para ser a 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina desejada na base dosdados analíticos descritos sob caracterização abaixo.
Fermentação
Uma cultura vegetativa primária no Meio 2 de S.hygroscopicus MG2-10 [IJNOLhis] foi cultivada essencialmente comodescrito em Materiais e Métodos. Uma cultura vegetativa secundária no Meio2 foi inoculada em 10% v/v, 28°C, 250 rpm, por 48 h e uma cultura terciáriafoi inoculada a 10% v/v, 28°C, 250 rpm, por 24 h. As culturas vegetativasforam inoculadas a 10% v/v no meio 5 (ver Materiais e Métodos) emfermentadores de 3 χ 7 1. O cultivo foi realizado por 6 dias a 26°C, 0,75 wm.> 30% de oxigênio dissolvido foi mantido por alteração da velocidade doimpelidor, velocidade mínima de 0,94 ms"1, velocidade máxima de 1,88 ms"1.
A alimentação de ácido cicloexanocarboxílico foi realizada em 24h após aincubação para dar uma concentração final de 1 mM. L-Iisina foi alimentadaem t = 0.
Extração e Purificação
O caldo de fermentação (12 1) foi agitado com um volumeigual de metanol por 2 horas e então centrifugado para empelotar as células(10 min, 3500 rpm). O sobrenadante foi agitado com resina Diaion® HP20 (43g/L) por lhe então filtrado. A resina foi lavada em batelada com acetonapara retirar o análogo de rapamicina e o solvente foi removido in vácuo. Oconcentrado aquoso foi então diluído até 2 1 com água e extraído com EtOAc(3x2 1). O solvente foi removido in vácuo para dar um óleo marrom (8,75 g).
O extrato foi dissolvido em acetona, seco sobre sílica, aplicadoa uma coluna de sílica (diâmetro de 4 χ 6,5 cm) e eluído com um gradienteem etapas de acetona/hexano (20% - 40%). As frações contendo análogo derapamicina foram aglomeradas e o solvente removido in vácuo. O resíduo(0,488 g) foi também cromatografado (em três bateladas) sobre SephadexLH20, eluindo com 10:10:1 de clorofórmio/heptano/etanol. As fraçõescontendo o análogo de rapamicina foram aglomeradas e o solvente removidoin vácuo. O análogo de rapamicina semi-purificado (162 mg) foi purificadopor HPLC preparativa em fase reversa (Cl8) usando uma HPLC de Gilson,eluindo uma coluna Phenomenex 21.2 χ 250 mm Luna 5 μηι Cl8 BDS com21 ml/min de 65% de acetonitrila/água. As frações mais puras (identificadaspor HPLC analítica, Método B) foram combinadas e o solvente removido invácuo para dar 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina (44,7 mg).
Caracterização
As análises de LCMS e LCMSn de extratos de culturamostraram a presença de um novo análogo de rapamicina eluindo muito antesdo que todos os outros análogos de 39-desmetoxi. A relação m/z para osvários íons do análogo de rapamicina é 58 unidades de massa menor que pararapamicina, consistente com a ausência de dois grupos O-metil e metoxi. Ionsobservados: [M-H]" 854,7, [IMKNH4]+ 877,8, [M+Na]+ 892,7, [M+K]+ 908,8.
A fragmentação do aduto de sódio deu os íons previstos para 16-O-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina após um caminho de fragmentaçãopreviamente identificado (Figura 2) (J. A. Reather, Ph.D. Dissertation,University of Cambridge, 2000). Estes dados de fragmentação deespectrometria de massa estreitam a região do análogo de rapamicina onde aperda de um metoxi ocorreu no fragmento C28-C42 que contém a partecicloexil e estreitam a região do análogo de rapamicina onde a perda de umO-metil tenha ocorrido para o fragmento C15-C27. Estes dados defragmentação de espectometria de RMN e massa são completamenteconsistentes com a estrutura de 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxirapamicina.
Exemplo 2. Bioensaios in vitro para atividade anticâncerAvaliação in vitro de atividade anticâncer de 39-desmetoxirapamicina
A avaliação in vitro de 39-desmetoxirapamicina para atividadeanticâncer em um painel de 12 linhagens celulares com tumor humanas emum ensaio de proliferação de monocamada foi realizada como descrito comoProtocolo 1 nos métodos gerais acima usando um ensaio de iodeto de propídiomodificado.
Os resultados são exibidos na Tabela 4 abaixo, cada resultadorepresenta a média de experimentos em duplicata. A Tabela 5 mostra a IC50 ea IC70 para os compostos e rapamicina através das linhagens celularestestadas.
TABELA 4
<table>table see original document page 61</column></row><table>
TABELA 5
<table>table see original document page 61</column></row><table>Avaliação in vitro de atividade anticâncer seletiva resistente a váriasdrogas (MDR) de 39-desmetoxirapamicina
A avaliação in vitro de 39-desmetoxirapamicina para atividadeanticâncer MDR seletiva no painel de linhagem celular NCI 60 de linhagenscelulares de tumor humano em um ensaio de proliferação de monocamada foirealizada como descrito no Protocolo 2, Materiais e Métodos usando umensaio baseado em SRB. Os resultados são exibidos na Tabela 6 abaixo:
TABELA 6 - Atividade in vitro contra linhagens celulares com altaexpressão de MDR
<table>table see original document page 61</column></row><table>
Pode ser visto que com exceção de uma linhagem celular, a39-desmetoxirapamicina tem eficácia equivalente ou melhorada contralinhagens celulares com alta expressão de MDR quando comparada comrapamicina.
Exemplo 3. Ensaios in vitro ADME
Ensaio de permeação de Caco-2
As células de Caco-2 confluentes (Li, A.P., 1992; Grass, G.M.,et al, 1992, Volpe, D.A., et al, 2001) em um formato Corning CostarTranswell com 24 poços foram fornecidos por In Vitro Technologies Inc.(IVT Inc., Baltimore, Maryland, USA). A câmara apical continha 0,15 ml desolução de tampão equilibrada de Hank (HBBS), pH 7,4, 1% DMSO, 0,1 mMde Lucifer Yellow. A câmara basal continha 0,6 ml de HBBS, pH 7,4, 1%DMSO. Os controles e os testes foram incubados a 37°C em uma incubadoraumedecida, chacoalhados a 130 rpm por 1 h. Lucifer Yellow permeia atravésda via paracelular (entre as junções apertadas) somente, uma altaPermeabilidade Aparente (Papp) para Lucifer Yellow indica dano celulardurante o ensaio e todos os poços foram rejeitados. Propranolol (boapermeação passiva sem efeitos no transportados) e acebulol (poucapermeação passiva atenuada por efluxo ativo ou P-glicoproteína) foramusados como compostos de referência. Os compostos foram testados em umformato uni- ou bi-direcional pela aplicação do composto à câmara apical oubasal (em 0,01 mM). Os compostos nas câmaras apical ou basal foramanalisados por HPLC-MS (Método A, ver Materiais e Métodos). Osresultados foram expressados como Permeabilidade Aparente, Papp, (nm/s) ecomo a Relação de Fluxo (A para B versus B para A).
Papp (nm/s) = Volume do receptor A[receptor]área χ [doador] Atempo
volume do receptor: 0,6 ml (A>B) e 0,15 ml (B>A)
área de monocamada: 0,33 cm
Atempo: 60 min
Um valor positivo para a Relação de Fluxo indica o efluxoativo da superfície apical das células.
Ensaio de estabilidade MicrossomaI de Fígado Humano (HLM)
Os homogeneizados de fígado fornecem uma medição de umavulnerabilidade inerente de compostos a enzimas de Fase 1 (oxidativa),incluindo CYP450s (e.g. CYP2C8, CYP2D6, CYP1A, CYP3A4, CYP2E1),esterases, amidases e flavin monooxigenases (FMOs).
A meia vida (TI/2) dos compostos de teste foi determinada,na exposição a Microssomas de Fígado Humano, pela monitoração de seudesaparecimento com o tempo por LC-MS. Os compostos em 0,001 mMforam injetados por 40 min a 37°C, 0,1 M de Tris HCl, pH 7,4, com fraçãosub-celular microssomal humana de fígado a 0,25 mg/ml de proteína eníveis de saturação de NADPH como co-fator. Em intervalos de tempo,acetonitrila foi adicionada às amostras de teste para precipitar proteína eparar o metabolismo. As amostras foram centrifugadas e analisadas para ocomposto originário usando o Método Analítico A (ver Materiais eMétodos).TABELA 7- Resultados de Ensaio ADME in vitro
<table>table see original document page 64</column></row><table>
Exemplo 4. Ensaios de ligação in vitro
FKBP12
FKBP12 se desdobra reversivelmente no hidrocloreto deguanidínio desnaturante químico (GdnHCl) e o desdobramento pode sermonitorado pela mudança na fluorescência intrínseca da proteína (Main et al,1998). Os ligandos que especificamente se ligam e estabilizam o estado nativode FKBP12 alteram a curva de desnaturação de tal forma que a proteína sedesdobre em maiores concentrações de desnaturante químico (Main et al,1999). Da diferença na estabilidade, a constante ligando-aglutinante pode serdeterminada usando a equação 1.
AGapp = AGhdI0n + i?rin(l + ^) (l)onde AGapp é adiferença aparente na energia livre de desdobramento entre formas livre eligadas a ligando,
AG":°n é a energia livre de desdobramento em água de proteína livre, [L] aconcentração de ligando e Kd a constante de dissociação para o complexoproteína-ligando (Meiering et al, 1992). A energia livre de desdobramentopode ser relacionada ao ponto médio da transição de desdobramentousando a seguinte equação:
AG"DfN =mD_N[D]50% (2)
onde nio-N é uma constante para uma dada proteína e um dadodesnaturante e que é proporcional à mudança no grau de exposição deresíduos no desdobramento (Tanford 1968 e Tanford 1970), e [D]50o/o é aconcentração de desnaturante correspondente ao ponto médio dedesdobramento. Foi definido
AAGLD_N a diferença na estabilidade de FKBP12 com rapamicina e ligandodesconhecido (na mesma concentração de ligando), como:
àAGLD_N =< mD_N > Δ[£>]50% (3)
onde <mD-N> é o valor m médio da transição dedesdobramento e Δ[ϋ]50% a diferença nos pontos médios para a transição dedesdobramento de rapamicina-FKBP12 e transição de desdobramento decomplexo ligando- FKBPl desconhecido. Sob condições onde [L] > Kd,então, AAGD-n pode ser relacionado com KdS relativos dos dois compostosatravés da equação 4:
<formula>formula see original document page 65</formula>
onde Kdp
é a constante de dissociação para rapamicina e Kdé a constante de dissociação para o ligando X desconhecido.
Portanto,
Kxd = K7 exp(<WD-^rA[D]5°%) (5)
Para a determinação do Kd de 3 9-desmetoxirapamicina, acurva de desnaturação foi ajustada para gerar valores para mD„N e [D]50o/o queforam usados para calcular um valor m médio, <mD.N> e A[D]50%, e entãoKxA literatura de Krdap de 0,2 nM é usada.
TABELA 8- Resultados de Ensaio de ligação de FKBP12 in vitro
<table>table see original document page 65</column></row><table>
mTOR
A inibição de mTOR pode ser estabelecida indiretamenteatravés da medição do nível de fosforilação dos marcadores substituídos davia mTOR e p70S6 quinase e S6 (Brunn et al., 1997; Mothe-Satney et al.,2000; Tee and Proud, 2002; Huang and Houghton, 2002).
As células HEK193 foram co-transfectadas com mTORrotulado com FLAG e Raptor rotulado com myc, cultivadas por 24 h, entãosaciadas com soro durante a noite. As células foram estimuladas com insulina10 nM, então colhidas e lisadas por 3 ciclos decongelamento/descongelamento. Os lisados foram aglomerados e quantidadesiguais foram imuno-precipitados com anticorpo FLAG para o complexomTOR/Raptor. Os imuno-precipitados foram então processados: amostrastratadas com o composto (0,00001 a 0,003 mM) foram pré-incubados por 30min a 3 0o C com FKBP12/rapamicina, FKBPl 2/3 9-desmetoxirapamicina ouveículo (DMSO), amostras não-tratadas foram incubadas em tampão dequinase. Os imuno-precipitados foram então submetidos a um ensaio dequinase in vitro na presença de 3 mM ATP, 3 mM ATP, 10 mM Mn2+ e GST4E-BP1 como substrato. As reações foram paradas com tampão de amostra4x, então submetidas a SDS-PAGE 15%, transfectadas a úmido para amembrana PVDF, então colocadas em sonda para fosfo-4E-BPl (T37/46).
Alternativamente, as células HEK293 foram semeadas emplacas de 6 poços e pré-incubadas por 24 horas e então saciadas com sorodurante a noite. As células foram então pré-tratadas com veículo ou compostopor 30 min a 30°C, então estimuladas com insulina 100 nM por 30 minutos a30°C e lisadas por 3 ciclos de congelamento/descongelamento e avaliadasquanto à concentração de proteína. Quantidades iguais de proteína foramcarregadas e separadas em géis de SDS-PAGE. A proteína foi entãotransferida a úmido para a membrana de PVDF e colocada em solda parafosfo-S6 (S235/36) ou fosfo-p70 S6K (T389).
Os resultados destes experimentos são sumarizados na FiguraExemplo 5: Ensaio de substrato de P-gp in vitro
Linhagens celulares
As linhagens celulares usadas no presente estudo (MACLMCF7 e MACL MCF7 ADR) foram fornecidas pelo Instituto Nacional doCâncer, USA.
As células foram rotineiramente passadas uma vez ou duas nasemana. Elas foram mantidas em cultura por não mais que 20 passagens.Todas as células cresceram a 37°C em uma atmosfera umedecida (95% de ar,5% de CO2) em meio RPMI 1640 (PAA, Cõlbe, Alemanha) suplementadocom 5% de soro de bezerro fetal (PAA, Cõlbe, Alemanha), e 0,1% deGentamicina (PAA, Cõlbe, Alemanha).
Protocolo de Ensaio
Um ensaio de iodeto de propídio modificado baseado noprotocolo 1 descrito acima foi usado para avaliar os efeitos de 39-desmetoxirapamicina (Dengler et al, 1995). Brevemente, as células foramcolhidas de culturas em fase exponencial por tripsinação, contadas ecolocadas em placas de microtitulação com fundo plano com 96 poços emuma densidade celular de 5.000 células/poço. Após uma recuperação de 24 hpara deixar as células retomarem o crescimento exponencial, 0,01 ml deVerapamil em uma concentração de 0,18 mg/ml ou 0,01 ml de meio decultura foram adicionados às células para produzir uma concentração final deVerapamil nos poços de 0,01 mg/ml. Esta concentração foi verificada emexperimentos prévios como sendo não-tóxica para as células. O meio decultura contendo 39-desmetoxirapamicina, taxol ou meio de cultura sozinho(para os poços de controle) foi adicionado em 0,01 ml por poço. Oscompostos foram aplicados em triplicata em 8 concentrações em etapas demeio Iog variando de 0,03 mM até 10 nM. Após 3 dias de contínua exposiçãoa droga, o meio ou composto com meio foi substituído por 0,2 ml de umasolução de iodeto de propídio (PI) aquosa (7 mg/l). Como Pi somente passapor membranas vazantes ou lisadas, DNA das células mortas vai sermanchado e medido, enquanto que as células vivas não vão ser manchadas.Para medir a proporção de células vivas, as células foram permeabilizadas porcongelamento das placas, resultando na morte de todas as células. Após odescongelamento das placas, a fluorescência foi medida usando a leitora demicroplacas Cytofluor 4000 (excitação a 530 nm, emissão a 620 nm), dandouma relação direta com o número de células total. A inibição do crescimentofoi expressada como Teste/Controle χ 100 (%T/C). As avaliações foramsomente consideradas avaliáveis se o controle positivo (Taxol) induzisse umamudança da inibição de crescimento de tumor na presença e na ausência deVerapamil e se as células de controle tratadas com veículo tivessem umaintensidade de fluorescência >500.
Preparação de soluções de teste de 39-desmetoxirapamicina
Uma solução de carga de 3,3 mM de 39-desmetoxirapamicinafoi preparada em DMSO e armazenadas a -20°C. A solução de carga foi entãodescongelada no dia de uso e armazenada à temperatura ambiente antes edurante a dosagem. As etapas de diluição foram realizadas usando meioRPMI 1640 e para resultar em soluções de 18 vezes a concentração final.
Resultados
A Figura 4 mostra quatro gráficos que demonstram os valoresde %T/C em todas as concentrações de teste para paclitaxel (A e C) e 39-desmetoxirapamicina (B e D) em linhagens celulares normais (A e B) ou comalta expressão de P-gp (C e D). Os diamantes preenchidos representam osvalores após a administração de paclitaxel ou 39-desmetoxirapamicinasozinho, os quadrados abertos representam os valores após a administração depaclitaxel ou 39-desmetoxirapamicina na presença de 0,01 mg/ml deVerapamil (um inibidor de P-gp).
Paclitaxel, um substrato de P-gp conhecido mostrou umapotência reduzida na inibição da linhagem celular com câncer expressando P-gp MCF7 ADR e esta potência reduzida foi restaurada pela co-administraçãode verapamil, um inibidor de P-gp (Figuras 4A e 4C).
A 39-desmetoxirapamicina não mostrou uma mudançasignificativa nas curvas de proliferação de crescimento na linhagem celularexpressando P-gp MCF7 ADR com ou sem verapamil (Figuras 4B e 4D)demonstrando que 39-desmetoxirapamicina não é um substrato para P-gp.
Exemplo 6: Análise Farmacocinética
6.1- Análise de PK de rapamicina e 39-desmetoxirapamicina
A análise farmacocinética usando os métodos padrão comodescrito acima foi realizada para rapamicina e 39-desmetoxirapamicina, (oprotocolo usado para cada composto é indicado na Tabela 9).
A AUC para cada composto no tecido de cérebro ou no sanguefoi calculada usando Kinetica 4.4 (OnnaPhase Corporation), usando ummodelo não-comportamenetal e o método trapezoidal para o cálculo de AUC.
O coeficiente de partição (Ri) para cada composto apósadministração p.o. e i.v. foi calculado como mostrado abaixo:
Rl — AUCçérebro
AUCsangue
Os resultados desta análise são sumarizados na Tabela 9 e na
Figura 5
TABELA 9 - Sumário de dados farmacocinéticos
<table>table see original document page 69</column></row><table>
6.2- Análise de PK de rapamicinam, 39-desmetoxirapamicinae 27-0-desmetil-3 9-desmetoxirapamicina
A análise farmacocinética usando os métodos padrão comodescritos acima foi realizada para rapamicina, 39-desmetoxirapamicina e 27-O-desmetil-3 9-desmetoxirapamicina, (usando o Protocolo 1 descrito acima).
A AUC para cada composto no sangue ou tecido do cérebrofoi calculada usando Kinetica 4.4 (InnaPhase Corporatin), usando um modelonão-compartimental e o método trapezoidal para o cálculo de AUC.
O coeficiente de partição (Ri) para cada composto apósadministração i.v. foi calculado como mostrado abaixo:
<formula>formula see original document page 70</formula>
TABELA 10 - Dados farmacocinéticos
<table>table see original document page 70</column></row><table>
Exemplo 7 - Atividade no Modelo de Encefalomielite Alérgica
Experimental (EAE) de Esclerose Múltipla
A Encefalomielite Alérgica Experimental (EAE) é uma doençade desmielação e inflamatória autoimune do sistema nervoso central (CNS), eé considerada a melhor contra-parte animal disponível para esclerose múltipla(MS). A doença pode ser induzida em animais geneticamente suscetíveis pelainjeção de cordão espinhal integral, ou proteína básica de mielina (MBP) emadjuvante de Freund completo (CFA). As células efetoras específicas paraantígeno envolvidas no dano de CNS são linfócitos de CD4*T restringidospor complexo de histocompatibilidade principal (MHO) da classe II.
Recentemente, o papel de citocinas tais como interleucina-1 (IL-1), fatores denecrose de tumor (TNF) ou interferonas (IFN) em respostas inflamatórias temrecebido atenção aumentada. Na ativação por antígeno, as células T produzemvárias linfocinas que no caso de EAE podem ser diretamente ou indiretamenteresponsável pelo dano de DNS. As linfocinas provavelmente a estaremenvolvidas na patogênese de EAE são EL-2, IFN-γ e TNF-β. IL-2 tem umimportante papel na ativação e proliferação de células B, enquanto que IFN-γé um mediador potente de ativação de macrófago. Em adição, IFN-γ induz aprodução de citocinas inflamatórias, tais como IL-1, TNF, e também aexpressão de moléculas de MHC de Classe II, dentre outros, nas célulasendoteliais de vasos sangüíneos no CNS, e, em astrócitos, que exercem umpapel importante na apresentação de antígeno às células T encefalitogênicas.
7.1- Animais e procedimento de imunização
Ratos de Lewis machos com de 8 a 10 anos de idade forammantidos sob condições de laboratório padrão (livre de patógeno não-específico) com livre acesso a alimento e água. EAE foi induzido por umainjeção única na base da cauda de 50 ml de adjuvante incompleto de Freund(Difco, Detroit, MI) mais 50 ml de solução salina contendo 25 mg de cordãoespinhal de porco da índia e 1 mg de cepa de Mycobacterium tuberculosis H37 RA (Difco).
7.2- Classificação Clínica e Histológica
Os ratos foram examinados a cada dia pela medição de seuspesos corporais e sinais clínicos de EAE até 30 dias após a imunização. Estesdados clínicos foram realizados por um observador que não sabia dotratamento: 0 = nenhuma doença, 1 = cauda flácida, 2= paraparesis moderada,3 = paraparesis severa, 4 = estado moribundo, 5 = morte. O final da doençafoi definido como ausência completa de sintomas clínicos e retorno àmotilidade do período de pré-imunização, com o rato sendo graduado de 0 a 5dias consecutivos.
7.3- Tratamento Experimental
Os compostos de teste foram dados em diferentes doses (5 ou15 mg/kg de peso corporal) sob um regime profilático e terapêutico. Para aparte profilática do estudo, o tratamento foi iniciado um dia antes daimunização, e para a parte terapêutica do estudo, ele foi iniciado no dia 7 apósa imunização (p.i.). Os ratos tratados com veículo tratados sob as mesmascondições experimentais, profilática ou terapeuticamente, como foram usadospara os controles. O tratamento foi dado p.o. diariamente seis vezes porsemana até o dia 30 p.i.. A ciclofosfamida foi usada como um controlepositivo.
Os resultados do experimento são mostrados na Figura 6 e naTabela 11 abaixo. A Figura 6A mostra o efeito do regime profilático de 39-desmetoxirapamicina em 5 e 15 mg/kg, a figura 6B mostra o efeito do regimeterapêutico de 39-desmetoxirapamicina em 5 e 15 mg/kg. Para cada regime,os efeitos de 40 mg/kg de ciclofosfamida são mostrados como um controlepositivo. Em ambos os gráficos, a classificação média de cada grupo émostrada. Pode ser visto que 39-desmetoxirapamicina tem eficáciaequivalente neste modelo para ciclofosfamida e que reduz não somente aseveridade de sintomas, mas também reduz a duração do episódio. Deve sernotado que devido à morte durante o estudo de 5 dentre 7 ratos tratados comveículo, o valor médio para este grupo permaneceu em 5, contudo, os doisratos sobreviventes não retornaram eventualmente nos valores de linha debase no dia 28.
TABELA 11
<table>table see original document page 72</column></row><table>
*- estatisticamente diferente do controle tratado com veículo, P < 0,05, testede Mann Whitney Rank SumExemplo 8 - Estudo de Atividade antitumor de 39-desmetoxirapamicina emum modelo de glioma ortotopicamente xenografado em ratos nus
8.1- Preparação para estudo
8.1.1- Preparação de amostras
O composto de teste foi dissolvido em etanol (0,027 ml/mg decomposto) e misturados com vórtex por 20 minutos até que a soluçãoestivesse clara. As soluções etanólicas tiveram alíquotas retiradas quandoapropriado e armazenadas a -20°C. A solução etanólica foi então completadaaté a concentração correta com veículo (4% de etanol, 5% de Tween-20, 55de polietilenoglicol 400 em 0,15 M NaCl, preparado com componentes livresde endotoxina estéril, quando possível).
8.1.2- Meio de administração
A substância de teste e o veículo de controle foramadministrados intravenosamente (IV, bolus) por injeção na veia caudal do ratode teste. Um volume de injeção de 10 ml/kg foi usado, baseado no pesocorporal mais recente do rato.
8.1.3- Linhagem celular com câncer
A linhagem celular usada para o estudo foi U87-MG, umalinhagem celular de glioblastoma iniciada por J. Ponten de um glioblastomade grau III de um Caucasian fêmea com 44 anos de idade (Poten et al. 1968).
8.1.4- Condições de cultura celular para o estabelecimento da linhagemcelular
As células com tumor foram crescidos como uma conocamadaa 37°C em uma atmosfera umedecida (5% de CO2, 95% de ar). O meio decultura foi RPMI (Ref. BE12-702F, Cambrex) contendo 2 mM de L-glutamina suplementado com 10% de soro bovino fetal (Ref. DEl 4-801E,Cambrex). As células estavam aderidas aos frascos de plástico. Para usoexperimental, as células com tumor foram destacadas do frasco de cultura portratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (Ref. BEl7-161E, Cambrex),em meio de Hank sem cálcio ou magnésio (Ref. BE10-543F, Cambrex). Ascélulas foram contadas em um hemocitômetro e sua viabilidade foi avaliadapor 0,25% de exclusão de trypan azul.
8.2- Indução de glioma por injeção estereotáxica no cérebro de ratos nus
Os ratos foram estereotaxicamente injetados com células U87-MG em DO, de 24 a 48 horas após uma irradiação de corpo integral com umafonte γ (2.5 Gy, Co80, INRA BRETENIERE, Dijon). Para a injeçãoestereotáxica de células com tumor, os ratos foram anestesiados por injeçãointraperitoneal de Ketamine 100 mg/kg (Ketamine500®, Ref 043KET204,Centravet, França) e Xylazine 5 mg/kg (Rompun®, Ref 002ROM001,Centravet, França) em solução 0,9% de NaCl em 10 ml/kg/inj. As célulasforam estereotaxicamente injetadas usando 3 aparelhos estereotáxicosindependentes (Kopf Instrument, Alemanha and Stoelting Company, USA) nolóbulo frontal direito com 1 χ IO5 células com tumor U87/MG ressuspensasem 0,002 ml de meio RPMI-1640. 0,002 ml da suspensão celular foraminjetados em 500 nl/min.
8.3- Programação de Tratamento
Em D7, os ratos foram pesados e colocados aleatoriamente deacordo com seu peso corporal individual em 3 grupos de ratos. Quatro ratosadicionais foram adicionados a cada grupo de tratamento para formação deimagem MRL Os grupos foram selecionados de tal forma que o peso corporalmédio de cada grupo não fosse estatisticamente diferente dos outros (análisede variância). As substâncias de teste foram administradas como definidoabaixo.
8.3.1. Os ratos do grupo 1 receberam 5 ciclos de injeções IVdiárias de veículo de substâncias de teste por 3 dias consecutivos (em D7 aD9, D14 a D16, D21 a D23, D28 a D30 e D35 a D37: (Q1 Dx3)x5W). Cadaciclo foi separado por um período de 4 dias de lavagem
8.3.2. Os ratos do grupo 2 receberam 5 ciclos de injeções IVdiárias de veículo de 39-desmetoxirapamicina a 3 mg/kg/inj por 3 diasconsecutivos em D7 a D9, D14 a D16, D21 a D23, D28 a D30 e D35 a D37:(Q1 Dx3)x5W. Cada ciclo foi separado por um período de 4 dias de lavagem8.3.3. Os ratos do grupo 3 não foram tratados
A programação de tratamento é sumarizada na Tabela 12abaixo:
TABELA 12
<table>table see original document page 75</column></row><table>
8.4- Análise MRI
A análise MRI do cérebro foi realizada em D23 e D37. Todasas análises de MRI foram realizadas em 4,7T no magneto Pharmascan(Bruker, Wissembourg). Os ratos foram posicionados dentro do berço de ratodedicado e a bobina cilíndrica de diâmetro de 38 mm sob condições deanestesia com isoflurano.
Após as aquisições de tripilot, uma seqüência ponderada deturboRare T2 foi realizada. As aquisições cobriram todos o cérebro incluindoo tumor. O volume de tumor foi determinado por remoção manual de umaregião de interesse (RO) em torno do tumor em cada pedaço e pela soma detodas as superfícies.
8.5- Resultados
A Figura 7 mostra o gráfico de sobrevivência para cada grupode tratamento até o dia 43.
Adicionalmente, os resultados foram expressados como umapercentagem (T/C%), onde T representa os tempos de sobrevivência médiosde animais tratados com 39-desmetoxirapamicina e C representa os tempos desobrevivência médios de animais de controle tratados com o veículo. T/C%foi calculado como a seguir:
T/C% = ['T/C] χ 100Adicionalmente, a análise de MRI foi usada para calcular ovolume de tumor calculado médio por grupo de tratamento, os resultados sãosumarizados na Tabela 13 abaixo. Como todos os animais tratados com oveículo tinham morrido no dia 37, não foi possível se comparar os tamanhosde tumor neste estágio.
TABELA 13
<table>table see original document page 76</column></row><table>
Cada ponto de dados representa a média de 4 valores.
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Claims (23)

1. Uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a Fórmula (I): <formula>formula see original document page 84</formula> em que, Ri representa (H5H) ou =O, e R2 e R3independentemente representam H, OH ou OCH3, caracterizado pelo fato deser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma condiçãomédica resultando de dano ou doença neural.
2. Uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina de acordocom a Fórmula (I) <formula>formula see original document page 84</formula> em que Ri representa (H,H) ou =O, e R2 e R3independentemente representam Η, OH ou OCH3, caracterizado pelo fato deser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma condiçãomédica que afeta o sistema nervoso central, em que a condição médica requerque o medicamento cruze a barreira cerebral ao sangue.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a condição médica é selecionada do grupo que consiste detumor(es) cerebral(is) e condições neurodegenerativas.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o medicamento é para o tratamento de tumores cerebrais.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o tumor cerebral é glioblastoma multiforme.
6. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o medicamento é para o tratamento de condiçõesneurodegenerativas.
7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a condição neurodegenerativa é Mal de Alzheimer.
8. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a condição neurodegenerativa é esclerose múltipla.
9. Uso de um análogo de 39-desmetoxirapamicina ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a Fórmula (1) <formula>formula see original document page 48</formula> em que R1 representa (H,H) ou = O, e R2 e R3independentemente representam Η, OH ou OCH3, caracterizado pelo fato deser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer oumalignâncias de célula B, em que o câncer ou a malignância de célula B éresistente a um ou mais agentes anticâncer existentes.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o câncer ou a malignância de célula B expressa P-glicoproteína.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o câncer ou a malignância de célula B tem um alto nível deexpressão de P-glicoproteína.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-11, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a administração deum análogo de 39-desmetoxirapamicina ou de um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo intravenosamente.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-11, caracterizado pelo fato de que o medicamento também compreende um oumais outros agentes terapeuticamente eficazes.
14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5ou 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o tratamentode câncer ou malignâncias de célula B e em que o medicamento tambémcompreende um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste demetotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida,-5-fluorouracil, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorelbina,doxorubicina, tamoxifen, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol,goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (e.g. Herceptin™) capecitabina,hidrocloreto de raloxifene, inibidores de EGFR, inibidores de VEGF,inibidores de proteasome, e inibidores de hsp90.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-14, caracterizado pelo fato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicina é 39-desmetoxirapamicina.
16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14,caracterizado pelo fato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicinaadicionalmente difere de rapamicina em uma ou mais das posições 9, 16 ou 27.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicina difere de rapamicina emuma ou mais das posições 16 ou 27.
18. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicina difere de rapamicina emuma ou mais das posições 16 e 27.
19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicina temum grupo hidroxila na posição 27, i.e., R3 representa OH.
20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicina temum hidrogênio na posição 27, i.e., R3 representa OH.
21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que o análogo de 39-desmetoxirapamicina temum grupo hidroxila na posição 16, i.e., R2 representa OH.
22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um análogo de 39-desmetoxirapamicina ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo como definido na Fórmula (!)<formula>formula see original document page 87</formula>em que R1 representa (H3H) ou =0, e R2 e R3independentemente representam H, OH ou OCH3, juntamente com umcarreador farmaceuticamente aceitável.
23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que é especificamente formulado paraadministração intravenosa.
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