BRPI0608769A2

BRPI0608769A2 - variantes de eritropoietina

Info

Publication number: BRPI0608769A2
Application number: BRPI0608769-8A
Authority: BR
Inventors: Andreas Meisel; Josef Priller; Christel Bonnas; Ulrich Dirnagl
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Be
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2010-01-26
Also published as: CA2608379A1; AU2006245916A1; CN101175768B; EP1885747A1; JP5231214B2; KR20080021595A; EP1885747B1; CN101175768A; CA2608379C; AU2006245916B2; ZA200709091B; WO2006120030A1; EP1736481A1; ES2457398T3; DK1885747T3; JP2008539745A; WO2006120030A8; KR101468737B1; RU2007146455A; RU2430162C2

Abstract

VARIANTES DE ERITROPOIETINA. A presente invenção refere-se a novas variantes endógenas de eritropoietina (EPO) e seu uso para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com o dano tecidual causado pela morte celular (apoptose, necrose) e inflamação, partícularmente para neuroproteção, por exemplo, tratamento de doença aguda (por exemplo, apoplexia) e crónica (por exemplo, ALS) do sistema nervoso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE ERITROPOIETINA".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a novas variantes endógenas de eritropoietina (EPO) e seus usos para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com o dano tecidual devido à morte celular (apoptose, necrose) e inflamação, particularmente para neuroproteção, por exemplo, tratamento de doença aguda (por exemplo, apoplexia) e crônica (por exemplo, ALS) do sistema nervoso.

Antecedentes da invenção

Apoplexia é uma doença debilitante a qual afeta mais de 400.000 pessoas por ano nos Estados Unidos e é a terceira causa mais comum de morte nos Estados Unidos. Além disso, metade dos pacientes internados tem problemas relacionados com apoplexia. Nas tendências atuais, essa quantidade é projetada para pular para um milhão por ano por volta do ano 2050. Quando os custos diretos (cuidado e tratamento) e os custos indiretos (perda de produtividade) das apoplexias são considerados juntos, apo-plexias colocam um encargo de $ 43,3 bilhões por ano somente na sociedade americana. Cerca de 1/3 dos pacientes morrem nos primeiros três meses, 1/3 permanece com incapacidade severa, e 1/3 se recupera com um resul-. tado aceitável. Em 1990, doenças cerebrovasculares foram a segunda causa principal de morte no mundo, matando mais de 4,3 milhões de pessoas por todo o mundo. Dessa forma, de uma perspectiva de saúde pública, apoplexia é uma das doenças mais relevantes.

Apoplexia é caracterizado pela perda repentina de circulação a

uma área do cérebro, resultando em uma perda correspondente de função neurológica. Também chamado de acidente neurovascular ou síndrome do apoplexia, apoplexia é um termo não-específico englobando um grupo heterogêneo de causas patofisiológicas, incluindo trombose, embolismo e hemor-ragia. Apoplexias são atualmente classificados ou como hemorrágicos ou como isquêmicos. Apoplexia isquêmico agudo refere-se aos apoplexias causados por trombose ou embolismo e respondem por 80% de todos os apo-plexias.

Apoplexias isquêmicos resultam do bloqueio das artérias que suprem o cérebro, mais comumente nas ramificações das artérias carótidas internas. O bloqueio geralmente resulta quando um pedaço de um coágulo sangüíneo (trombo) ou de um depósito de gordura (ateroma) devido ao rompimento de aterosclerose (se tornando um embolo) viaja pela corrente sangüínea e se aloja em uma artéria que supre o cérebro. Os coágulos sangüíneos podem se formar quando um depósito de gordura se deposita na parede de uma ruptura de artéria. A ruptura de tal depósito de gordura também

pode se formar quando um grande depósito de gordura reduz o fluxo sangüíneo, reduzindo ele até um gotejamento. Sangue que flui lentamente é mais provável de coagular. Dessa forma, o risco de formação de um coágulo e de bloqueio em uma artéria estreita é alto. Coágulos sangüíneos também podem se formar em outras áreas, tais como no coração ou em uma válvula

cardíaca. Apoplexias devido a tais coágulos sangüíneos são mais comuns entre pessoas as quais tiveram recentemente cirurgia do coração e pessoas que têm um distúrbio de válvula cardíaca ou um ritmo cardíaco anormal (ar-ritmia), especialmente fibrilação atrial. Também, em certos distúrbios tais como excesso de hemácias (policitemia), o risco de coágulos sangüíneos é

aumentado porque o sangue é espessado.

Um apoplexia isquêmico também pode resultar, se o fluxo sangüíneo para o cérebro for reduzido, como pode ocorrer quando uma pessoa perde muito sangue ou tem uma pressão sangüínea muito baixa. Ocasionalmente, um apoplexia isquêmico ocorre quando o fluxo sangüíneo para o

cérebro é normal, mas o sangue não contém oxigênio suficiente. Distúrbios que reduzem o conteúdo de oxigênio do sangue incluem anemia severa (u-ma deficiência das hemácias), sufocação e envenenamento por monóxido de carbono. Geralmente, o dano cerebral em tais casos é muito difundido (difuso) e resulta em coma. Um apoplexia isquêmico pode ocorrer se infla-

mação ou infecção estreitar os vasos sangüíneos que alimentam o cérebro. Similarmente, drogas tais como cocaína e anfetaminas podem causar espasmo das artérias, o que pode levar a um estreitamento das artérias quealimentam o cérebro até uma extensão tal que cause um apoplexia.

O cérebro necessita de glicose e oxigênio para manter o metabolismo e a função neuronal. A distribuição inadequada de oxigênio para o cérebro leva a uma hipóxia e a isquemia resulta do fluxo sangüíneo cerebral 5 insuficiente. As conseqüências da isquemia cerebral dependem do grau e da duração do fluxo sangüíneo cerebral reduzido. Os neurônios podem tolerar isquemia por 30 - 60 minutos. Se o fluxo não for restabelecido para a área isquêmica, isso resulta em uma série de processos metabólicos. Os neurônios ficam esgotados de ATP e mudam para a glicólise anaeróbica, uma via

muito menos eficiente. Lactato se acumula e o pH intracelular diminui. Sem um fornecimento adequado de ATP, as bombas de íons na membrana plas-mática falham. O influxo resultante de sódio, água e cálcio na célula causa o rápido inchaço dos neurônios e das células da glia. A despolarização da membrana também estimula a liberação massiva dos aminoácidos glutamato

e aspartato, ambos os quais agem como neurotransmissores excitatórios no cérebro. Glutamato ativa ainda os canais de íons sódio e cálcio na membrana celular neuronal, a saber, o canal de cálcio N-metil-D-aspartato (NMDA) bem-caracterizado. Influxo de cálcio excessivo causa a ativação desordenada de uma ampla faixa de sistemas enzimáticos (proteases, lipases e nucle-

ases). Essas enzimas e seus produtos metabólicos, tais como radicais livres . de oxigênio, danificam as membranas celulares, o material genético e as proteínas estruturais nos neurônios, levando como resultado à morte celular dos neurônios (Dirnagl, U. et al. (1999) Trends Neurosci. 22: 391-397).

Apoplexias se iniciam repentinamente, se desenvolvem rapida-

mente e causam a morte do tecido cerebral de minutos até dias. No cérebro isquêmico, comumente distingui-se dois volumes de tecido - o núcleo do enfarte e a zona circundante, conhecida como peem umbra isquêmica - a margem subperfundida e metabolicamente comprometida ao redor do núcleo irrevogavelmente danificado. O núcleo e a peem umbra são caracterizados

por dois diferentes tipos de morte celular: necrose e apoptose (a qual é também chamada de morte celular programada ou morte celular neuronal retardada). O déficit de perfusão severa no núcleo causa uma quebra dos pro-cessos metabólicos, do fornecimento de energia celular e da homeostase iônica, o que causa a perda da integridade celular em minutos. Dessa forma, a necrose aguda da célula e do tecido prevalece no núcleo. Na peem umbra, alguma reperfusão residual é mantida pelos vasos colaterais, os quais po- dem ser incapazes de manter o metabolismo funcional completo, mas previ-ne a desintegração estrutural imediata. Entretanto, no decorrer do tempo (de horas até vários dias), a alteração da homeostase celular faz com que mais e mais células morram, e o volume do enfarte aumenta. A peem umbra, dessa forma, tem que ser considerada como tecido em risco durante a matura-

ção do enfarte. Nessa região, apoptose e cascatas de sinalização inflamató-ria desempenham um importante papel. Ela pode inicialmente constituir 50% do volume que irá terminar como enfarte. Os mecanismos que levam à morte celular retardada proporcionam alvos para uma terapia neuroprotetora específica nas regiões cerebrais desafiadas pela isquemia, mas as quais

ainda são viáveis.

Opções terapêuticas até aqui são altamente frustrantes: Trombó-lise com rtPA, a única terapia com eficácia comprovada em um teste clínico maior (NINDS), somente é eficaz em uma janela de tempo de três horas, limitando sua aplicação para somente uma pequena porcentagem de pacien-

tes com apoplexia isquêmico. Em outras palavras, além da terapia aprobati-va básica, atualmente mais de 95% das apoplexias não podem ser tratadas especificamente. Isso está em contraste pronunciado com o conhecimento envolvendo a patofisiologia básica dessa doença, a qual se desenvolveu na última década. Particularmente, conhecimento extensivo tem se acumulado

nos mecanismos do dano cerebral parenquimal e da neuroproteção endóge-na, assim como na reorganização funcional e estrutural.

Recentemente, atenção tem se focado nos papéis terapêuticos potenciais para as proteínas cerebrais endógenas que possuem propriedades neuroprotetoras. EPO, um hormônio de glicoproteína produzido primari-

amente pelas células do endotélio capilar peritubular do rim, o qual é um membro do hormônio do crescimento/família de citocina prolactona (Zhu Y. e D'Andrea A.D: (1994) Curr. Opin. Hematol. 1: 113-118) é um candidato pro-missor. Embora EPO fosse primeiramente caracterizada e é agora amplamente conhecida por seu papel como um hormônio hematopoiético, a detecção de EPO e seu receptor (EPOR) no tecido cerebral de roedor e ser humano, assim como em neurônios e astrócitos cultivados expandiu a busca por outros papéis biológicos do EPO.

No cérebro, um sistema EPO parácrino/(Epo-R)2 existe independentemente do sistema endócrino da eritropoiese adulta; neurônios expressam (Epo-R)2 e astrócitos produzem EPO (Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Prass et al. (2003) Stroke 34,1981-1986). Foi demonstrado in

vitro e in vivo que EPO é um potente inibidor da apoptose neuronal induzida por isquemia e hipóxia (Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Bernaudin, M., et al. (1999) J Cereb Blood Flow Metab. 19: 643-51; Morishi-ta, E., et al. (1997) Neuroscience. 76: 105-16). Foi reportado por vários grupos que a adição de EPO em culturas neuronais protege contra a toxicidade

do ácido glutâmico e hipóxica (Henn F. A: e Braus D.F. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249: 48-56, Vogeley K. et al. (2000) Am. J. Psy-chiatry 157: 34-39) e reduz a disfunção neurológica em modelos de roedores de isca (Brines M. L et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 97: 10526-10531 e Bernaudin et al. (1999) J. Cereb. Blood Flow Metab. 10: 643-.651).

Os resultados promissores desses experimentos confirmaram em estudos . humanos em que foi demonstrado que a terapia com EPO para apoplexia agudo é segura e deve ser benéfica (Ehrenreich H. et al. (2002) Mol. Medicine 8: 495-505) e WO 00/35475 A2. Essas células e propriedades neuropro-tetoras mais particulares do EPO levaram a pesquisas adicionais nessa área

para substanciar essas descobertas em um teste mais amplo e o uso de EPO é agora proposto em outra indicação assim como incluindo, por exemplo, esquizofrenia (Ehrenreich H et al. (2004) Molecular Psychiatry 9: 42-54 e WO 02/20031 A2).

Para a aplicação do EPO prevenir o dano tecidual, a atividade

hematopoiética não é geralmente requerida e deve ser prejudicial se grandes quantidades de EPO forem administradas para tratar ou melhorar os efeitos de hipóxia ou de dano tecidual induzido por isquemia. Conseqüente-mente, têm sido feitas tentativas para criar variantes de EPO, as quais somente exibam a propriedade protetora celular, porém não as propriedades hematopoiéticas. US 2003/0130197 descreve peptidomiméticos de EPO para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, os quais não apresentam 5 homologia de seqüência com EPO de ocorrência natural ou fragmentos seus. US 6.531.121 descreve uma asialoeritropoietina a qual é gerada por desialilação completa do EPO recombinante mostrou uma capacidade aumentada de cruzar a barreira da célula endotelial e tinha uma atividade he-matopoiética diminuída. Eritropoietina carbamilada (CEPO) também foi de- monstrada por exibir um efeito protetor tecidual, porém nenhum efeito eritro-poiético (Leist et al. (2004) Science 305: 239-242 e WO 2005/025606 Al.

Finalmente, foi demonstrado que um peptídeo de 17-mer de EPO inibiu a morte celular de duas linhagens celulares neuronais, SK-N-MC e NS20Y (Campana W. M. et al (1998) Int. J. Mol. Medicine 1: 235-241), en-

quanto ao mesmo tempo não teve atividade hematopoiética. Entretanto, 1 ng/mL do peptídeo EPO foi necessário para eliciar o mesmo efeito antiapop-tótico que 100 pg/mL de EPO recombinante (rhEPO) em células NS20Y e que 400 pg/mL de rhEPO em células SK-N-MC. Dado o peso molecular aparente do rhEPO de cerca de 66.000 g/mol (o peso molecular calculado é de

cerca de 33.000 g/mol, mas não inclui o peso dos resíduos de oligossacarí-deo compreendidos no rhEPO) e de cerca de 1.900 g/mol do peptídeo EPO em uma concentração de 1,52 pmol/L e 6,06 pmol/L, respectivamente, de rhEPO e 1 nmol/L do peptídeo EPO eliciaram o mesmo nível de um efeito protetor celular. Conseqüentemente, o peptídeo EPO está entre 650 vezes e

165 vezes menos ativo do que o do rhEPO na prevenção da morte celular. É evidente a partir desses dados que a região do EPO compreendida no 17-mer não desempenha um papel principal na função protetora celular do E-PO. Conseqüentemente, todas as variantes de EPO, as quais têm uma atividade hematopoiética diminuída conhecida na técnica anterior, sofrem da

desvantagem de que elas não são de ocorrência natural, uma vez que elas ou perderam sua glicosilação natural ou elas são mutilações artificiais e/ou elas diminuíram vastamente a atividade protetora celular, em comparaçãocom o rhEPO. Conseqüentemente, existe uma necessidade na técnica anterior de proporcionar um derivado de EPO, o qual é próximo ao EPO de ocorrência natural e o qual tem uma atividade protetora tecidual igual ou melhor que o rhEPO, mas com menos ou sem hematopoiética, particularmente sem 5 atividade eritropoiética.

Esse problema é solucionado pela provisão de novas variantes EPO, as quais foram descobertas como ocorrendo naturalmente no tecido humano e de camundongo (cérebro, rim) e as quais exibem uma atividade protetora celular semelhante ou melhor ao rhEPO, mas as quais não exibem 10 qualquer atividade hematopoiética significativa. Sumário da invenção

Em um aspecto, a presente invenção diz respeito com uma variante de EPO que codifica o polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) polinucleotídeos codificando pelo menos a forma madura dos

polipeptídeos nomeados como hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1-1, h2-l, mS, mG3, mG5, m301 e mK3 com a seqüência de aminoácidos deduzida conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22, respectivamente;

(b) polinucleotídeos com a seqüência codificadora, conforme

. mostrado nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 codificando pelo menos a forma madura do polipeptídeo;

(c) polinucleotídeo codificando uma versão humanizada dos polipeptídeos mS, mG3, mG5, m301 e mK3 com a seqüência de aminoácidos deduzida conforme mostrado na SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20 e 22,

(d) polinucleotídeos codificando um polipeptídeo compreendendo uma fusão de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo de seqüências de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 24, 26, 28 e 30, no N-terminal de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo

de seqüências de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 32, 34, 36 e 38;

(e) polinucleotídeos compreendendo uma fusão de seqüênciasde polinucleotídeo selecionados do grupo de seqüências de polinucleotídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 23, 25, 27 e 29, 5' de uma seqüência de polinucleotídeo selecionada do grupo de seqüências de polinucleotídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 31, 33, 35 e 37; 5 (f) polinucleotídeos codificando um derivado de um polipeptídeo

codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) até (e), em que no referido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservativa-mente substituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o referido derivado tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, 10 mas essencialmente não tem atividade hematopoiética;

(g) polinucleotídeos que codificam um fragmento de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) até (f), em que no referido fragmento entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são N- e/ou C-terminalmente anulados e/ou entre 1 e 10 aminoácidos são anulados N- e/ou C-terminalmente da junção em comparação com o referido polipeptídeo, e o referido fragmento tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

(h) polinucleotídeos os quais são pelo menos 50% idênticos a um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer um de (a) a (g) e os

quais codificam para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética; e

(i) polinucleotídeos, o filamento complementar dos quais hibridi-zam sob condições estringentes com um polinucleotídeo conforme definido

em qualquer um de (a) até (h), e os quais codificam para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

Ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo. Outro aspecto da presente invenção é um homólogo de um poli-30 nucleotídeo que codifica uma variante de eritropoietina (EPO) de outra espécie eucariótica superior.

Outro aspecto da presente invenção é uma variante EPO quecodifica um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo variante E-PO, os quais compreendem a parte N-terminal do EPO de comprimento total incluindo a hélice A, e os quais não têm pelo menos um dos seguintes:

(i) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos entre a hélice A e a hélice B;

(ii) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ,22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 ami- noácidos da hélice B;

(iii) um fragmento de pelo menos 2 aminoácidos, preferivelmente 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos entre a hélice B e a hélice C;

(iv) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos da hélice C;

(v) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmen-

te 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25,26 ou 27 aminoácidos entre as hélices C e D; e/ou

(vi) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 da hélice D; em que o referido variante tem atividade protetora celular e, par-

■ ticularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoi-ética.

(b) polinucleotídeos que codificam um derivado de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a), em que no

referido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservativa-mente substituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o referido derivado tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

(c) polinucleotídeos, o filamento complementar dos quais hibridi- za sob condições estringentes para um polinucleotídeo conforme definido

em qualquer um de (a) até (b) e o qual codifica para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essenci-almente sem atividade hematopoiética;

ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo.

Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo da presente invenção o qual é DNA, DNA genômico ou RNA. Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um vetor

contendo o polinucleotídeo da presente invenção. É preferível que o polinucleotídeo contido no vetor esteja operativamente ligado às seqüências de controle de expressão que permitem a expressão nas células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas. Outro aspecto da invenção é uma célula hospedeira genetica-

mente projetada com o polinucleotídeo da presente invenção ou com o vetor da presente invenção.

Outro aspecto da invenção é um animal não-humano transgêni-co contendo um polinucleotídeo da presente invenção, um vetor da presente invenção e/ou uma célula hospedeira da presente invenção.

Outro aspecto da invenção é um processo para produzir um po-lipeptídeo variante de EPO codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção compreendendo: o cultivo da célula hospedeira da presente invenção e a recuperação do polipeptídeo codificado pelo referido polinucleotídeo. Em uma modalidade preferida, o processo da presente invenção

compreende ainda a etapa de modificar a referida variante de EPO, em que a modificação é selecionada do grupo consistindo em oxidação, sulfatação, fosforilação, adição de oligossacarídeos ou combinações destes.

Outro aspecto da invenção é um processo para produzir células capazes de expressar pelo menos uma das variantes EPO compreendendo células geneticamente projetadas in vitro com o vetor da invenção, em que a(s) referida(s) variante(s) de EPO é/são codificadas por um polinucleotídeo da invenção.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos codificada por um polinucleotídeo da presente invenção ou obtenível pelo processo da presente invenção.

Outro aspecto da invenção é um anticorpo que se liga especifi-camente ao polipeptídeo da presente invenção.

Outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um vetor da presente invenção, uma célula hospedeira da presente invenção, um polipeptí- deo da presente invenção e/ou um anticorpo da presente invenção e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Outro aspecto da invenção é o uso de um polinucleotídeo da presente invenção, um vetor da presente invenção, uma célula hospedeira da presente invenção, um polipeptídeo da presente invenção para a produ- ção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com o dano tecidual devido à morte celular, por exemplo, apopto-se e necrose, assim como por inflamação.

Em um uso preferido da presente invenção, a morte celular é induzida por isquemia, hipóxia, infecção bacteriana, infecção viral, induzida auto-imunológica, traumática ou quimicamente (por exemplo, metabólica, toxicamente), ou induzida por radiação.

Em um uso preferido da presente invenção, a condição é um distúrbio neurodegenerativo/neuroinflamatório agudo ou um distúrbio neuro-degenerativo/neuroinflamatório crônico, é um distúrbio agudo ou crônico do coração (por exemplo, enfarte do miocárdio), pulmão (por exemplo, asma, . doença pulmonar obstrutiva crônica, rim (glomerulonefrite), fígado (por e-xemplo, falência hepática crônica) ou pâncreas (por exemplo, pancreatite) ou a referida condição está associada com um órgão (por exemplo, rim ou fígado) ou transplante de célula (por exemplo, célula tronco).

Preferivelmente, o distúrbio neurodegenerativo e/ou neuroinfla-

matório agudo é selecionado do grupo consistindo em enfarte ou isquemia cerebral incluindo oclusão embólica e oclusão trombótica, reperfusão seguido de isquemia aguda, injúria hipóxica-isquêmica perinatal, parada cardíaca, hemorragia intracranial, hemorragia subaraquinóide e lesões intracranianas(por exemplo, trauma do SNC), lesões da medula espinal lesões intraverte-brais, síndrome de criança sacudida ("whiplash shaken infant syndrome"), encefalite infecciosa (por exemplo, encefalite por herpes), meningite (porexemplo, bacteriana)dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca).

Preferivelmente, o distúrbio neurodegenerativo/neuroinflamatório crônico é selecionado do grupo consistindo em demências (por exemplo, doença de Alzheimer, demências vasculares), doença de Pick, doença do 5 corpo de Lewy difuso, paralisia supranuclear progressiva (síndrome de Ste-el-Richardson), esclerose múltipla, atrofia sistêmica múltipla (incluindo a síndrome de Shy-Drager), condições epilépticas crônicas associadas com neu-rodegeneração, doenças neuronais motoras, ataxias degenerativas, degene-ração basal cortical, complexo de Guam-Parkinson-demência-SLA, panence-

falite esclerosante subaguda, doença de Huntington, doença de Parkinson, sinucleinopatias, afasia progressiva primária, degeneração estriatonigral, doença de Machado/Joseph/ataxia espinocerebelar tipo 3 e degenerações olivopontocerebelares, doença de Gilles de La Tourette, paralisia bulbar e pseudobulbar, atrofia muscular espinal e espinobulbar (doença de Kennedy),

esclerose lateral primária, paraplegia espástica familial, doença de Werdnig-Hoffman, doença de Kugelberg-Welander, doença de Tay-Sach, doença de Sandhoff, doença espástica familial, paraparese espástica, leucoencefalopa-tia multifocal progressiva, disautonomia familial (síndrome de Riley-Day), polineuropatias (por exemplo, diabética, álcool-tóxica, síndrome Guillain-

Barre, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica), doenças de prí-on, vício, distúrbios afetivos (por exemplo, depressão), distúrbios esquizofrênicos, síndrome da fadiga crônica, dor crônica (por exemplo, dor nas costas inferiores).

Em um uso preferido da presente invenção, a condição é o en-25 velhecimento.

Em um uso preferido da presente invenção, o medicamento é administrado antes de ou depois do início da referida condição. Descrição detalhada da invenção

A não ser que seja definido de outra forma, todos os termos téc-30 nicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que os comumente entendidos por uma pessoa versada na técnica para a qual essa invenção pertence. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo definições,irá controlar. Métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou testagem da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas 5 são incorporadas por referência na sua totalidade. Os materiais, métodos e exemplos aqui descritos são somente ilustrativos e não pretendem ser limi-tantes.

A presente invenção é baseada na surpreendente observação de que variantes de EPO são expressas no tecido neuronal e na determina-

ção de que as variantes protegeram os neurônios de danos induzidos por oxigênio e privação de glicose, mas não apresentaram atividade hematopoi-ética. Esse comportamento os tornam adequados para uso como terapêuticos em situações onde a função hematopoiética do EPO não é requerida ou prejudicial. De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção está uma variante de EPO que codifica polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) polinucleotídeos que codificam pelo menos a forma madura dos polipeptídeos nomeados hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1-1, h2-1, mS, mG3, mG5, m301 e mK3 com a seqüência de aminoácidos deduzida conforme

mostrado nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22, respecti-. vãmente;

(b) polinucleotídeos com a seqüência codificante, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19621, codificando pelo menos a forma madura do polipeptídeo;

(c) polinucleotídeo que codifica uma versão humanizada dos po-

lipeptídeos mS, mG3, mG5, m301 e mK3 com a seqüência de aminoácidos deduzida conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 14,16, 18, 20 e 22,

(d) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo uma fusão de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo

de seqüências de aminoácidos conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 24, 26, 28 e 30, no N-terminal, preferivelmente diretamente, isto é, sem quaisquer aminoácidos intervenientes, de uma seqüência de aminoácidos selecionadado grupo de seqüências de aminoácidos conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36 e 38;

(e) polinucleotídeos compreendendo uma fusão de seqüências de polinucleotídeo selecionadas do grupo de seqüências de polinucleotídeo

conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 23, 25, 27 e 29, 5', preferivelmente diretamente 5', isto é, sem quaisquer polinucleotídeos intervenientes, de uma seqüência de polinucleotídeo selecionada do grupo de seqüências de polinucleotídeo conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 31, 33, 35 e 37;

(f) polinucleotídeos que codificam um derivado de um polipeptí- deo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) a (e), em que

no referido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservati-vamente substituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o referido derivado tem atividade celular protetora e, particularmente, neuroprote-tora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

(g) polinucleotídeos que codificam um fragmento de um polipep-

tídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) até (f), em que no referido fragmento entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são N- e/ou C-terminalmente anulados e/ou entre 1 e 10 aminoácidos são anulados N-e/ou C-terminalmente da junção em comparação com o referido polipeptí- deo, e o referido fragmento tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente não tem atividade hematopoiética;

(h) polinucleotídeos os quais são pelo menos 50% idênticos a um polinucleotídeo conforme definido em qualquer um de (a) até (g) e os quais codificam para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, par-

ticularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética; e

(i) polinucleotídeos, o filamento complementar dos quais hibridi-za sob condições estringentes em um polinucleotídeo conforme definido em qualquer um de (a) até (h) e o qual codifica para um polipeptídeo com ativi-

dade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo.A invenção refere-se ainda a um peptídeo de uma variante EPO que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos nomeados seqüências ha, hAma, hAme, ha-20 e ha- de transporte, com a seqüência de aminoácido deduzida conforme mostrado nas SEQ ID NOS: 50, 51, 52, 53 e 60, respectivamente;

(b) polinucleotídeos com a seqüência codificadora, conforme mostrado nas SEQ ID NOS: 55, 56, 57 58 e 61 codificam pelo menos a forma madura do polipeptídeo;

(c) polinucleotídeos que codificam um derivado de um polipeptí-

deo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) a (b), em que no referido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservati-vamente substituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o referido derivado tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprote-

tora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

(d) polinucleotídeos codificando um fragmento de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) a (b), em que no referido fragmento entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são N- e/ou C-terminalmente anulados e/ou entre 1 e 10 aminoácidos são anulados N- e/ou C-terminalmente da junção em comparação com o referido polipeptídeo, e o . fragmento derivado tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

(e) polinucleotídeos, os quais são pelo menos 50% idênticos a um polinucleotídeo conforme definido em qualquer um de (a) a (b), e os

(f) polinucleotídeos, o filamento complementar do qual hibridiza sob condições estringentes para um nucleotídeo conforme definido em qual-

quer um de (a) a (h), e os quais codificam para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo. Em um outro aspecto, os polinucleotídeos da presente invenção compreendem homólogos das variantes EPO da presente invenção derivados de outra espécie eucariótica superior, particularmente de mamíferos, mais preferivelmente de primatas não-humanos; de roedores, por exemplo, rato ou porquinho-da-índia; ruminante, por exemplo, vaca; ou ovelha; cavalo; porco; coelho; cachorro; ou gato, os quais têm atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hema-topoiética. Nesse contexto, o termo homólogo refere-se a um polinucleotídeo codificando uma variante EPO derivada de outra espécie, a qual compreen-de essencialmente a mesma anulação que os polinucleotídeos de acordo com as SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,1 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57, 58 ou 61. Uma anulação de um polinucleotídeo é considerada como sendo essencialmente a mesma, se ela envolver a anulação de polinucleotídeos codifi- cando um polipeptídeo, o qual seja homólogo aos polipeptídeos respectivamente anulados nos polipeptídeos da variante EPO de acordo com as SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 50, 51, 52, 53 ou 60. Os critérios para determinar a homologia entre duas seqüências de peptídeos são bem-estabelecidos. Para esse propósito, programas como BLASTP podem ser usados. Uma anulação é ainda considerada como sendo essencialmente a mesma se ela envolver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 55, 56, 57, 58 ou 61 mais ou menos nucleotídeos que a respectiva anulação nas SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, ou 21, as quais também são representadas na figura 1 e 2.

Outro aspecto da presente invenção é uma variante EPO que codifica um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em:

(a) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo variante de EPO, o qual compreende a parte N-terminal do comprimento total do EPO, incluindo a hélice A a qual não tem pelo menos um dos seguintes:

(i) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos entre a hélice A e a hé-lice B;

(ii) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmen-te 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 aminoácidos da hélice B; (iii) um fragmento de pelo menos 2 aminoácidos, preferivelmente

3, 4, 5 ou 6 aminoácidos entre a hélice B e a hélice C;

(iv) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos de hélice C;

(v) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmen- te 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 aminoácidos entre as hélices C e D; e/ou

(vi) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 de hélice D;

em que a referida variante tem atividade protetora celular e, par-15 ticularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoi-ética.

(b) polinucleotídeos codificando um derivado de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a), em que no referido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservativãmente subs- tituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o referido derivado . tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

(c) polinucleotídeos, o filamento complementar do qual hibridiza sob condições estringentes para um polinucleotídeo conforme definido em qualquer um de (a) a (b), e o qual codifica para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;

ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo. Nesse contexto, a hélice A, B, C e D do polipeptídeo EPO são regiões homólogas às respectivas regiões da hélice A, B, C e D do EPO de comprimento total de camundongo e humano conforme delineado na figura

4. É bem-conhecido na técnica como determinar homologias entre duas se-qüências de polipeptídeos e alguém versado na técnica será capaz de alinhar uma dada seqüência de polipeptídeo EPO derivada, por exemplo, de outra espécie, e de determinar a respectiva posição da hélice A, B, C e D nesse polipeptídeo EPO. É preferível que o polinucleotídeo variante do EPO 5 seja derivado de um eucarioto superior, particularmente de um mamífero ou pássaro. Mamíferos preferidos são seres humanos, primatas não-humanos; roedores, por exemplo, rato ou porquinho-da-índia; ruminante, por exemplo, vaca; ou ovelha; cavalo; porco; coelho; cachorro; ou gato. Um grande número de tais polinucleotídeos que codificam EPO de comprimento total de vá-

rias espécies é conhecido, incluindo sem limitação gato (Acesso Gene Bank L10606), porco (Acesso Gene Bank 10607), ovelha )Acesso Gene Bank 10610), cachorro (Acesso Gene Bank L13027), macaco (Acesso Gene Bank M18189), macaco resus (Acesso Gene Bank L10609), camundongo (Acesso Gene Bank 12930), rato (Acesso Gene Bank L10608), humano (Acesso Ge-

ne Bank M11319), Bos taurus (Acesso Gene Bank U44762) e Bos indicus (Acesso Gene Bank L41354).

Preferivelmente, os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo variante de EPO não têm o seguinte: (i); (ii); (iii); (iv); (v); (vi); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e

(iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (vi); (i), (ii) e (iii); (i), (ii) e

(iv) , (i), (ii) e (v), (i), (ii), (vi), (i), (iii) e (iv); (i), (iii) e (v); (i), (iii) e (vi); (i), (iv) e

(v) ; (i), (iv) e (vi); (i), (v) e (vi); (ii), (iii) e (iv); (ii), (iii) e (v); (ii), (iii) e (vi); (ii), (iv) e (v); (ii), (iv) e (vi); (ii), (v) e (vi); (iii), (iv) e (v); (iii), (iv) e (vi); (iii), (v) e

(vi) ; ou (iv), (v) e (vi).

Um polipeptídeo que exibe atividade protetora celular é um poli-

peptídeo que tem pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos: 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5%; ou 100% ou mesmo mais) da capacidade do respectivo variante de EPO de proteger os neurônios de danos por apoptose, em que a apoptose é induzida por oxigê-

nio ou privação de glicose, por exposição química ou radioativa ou por infec-ção viral ou bacteriana. Ensaios para determinar danos em células, particularmente em células neuronais, são conhecidos na técnica. Um ensaio ade-quado é o ensaio de privação de glicose oxigênio, conforme descrito aqui abaixo. No ensaio descrito, a leitura para exibição é a quantidade de atividade de lactato desidrogenase (LDH). Entretanto, uma variedade de outros métodos existem, os quais permitem a avaliação dos danos induzidos em uma célula e, particularmente, a quantidade de morte celular (por exemplo, apoptose, necrose). Esses ensaios incluem, sem limitação, ensaios Tunnel, ensaio MTT, ensaio de vida/morte por manchamento (por exemplo, man-chamento com brometo de etídio e laranja acridina), ensaio da caspase, mi-croscopia de elétron, corrida de DNA, os quais são bem-conhecidos na técnica. Um polipeptídeo variante do EPO que exibe não essencialmente

atividade homeopática é um polipeptídeo, o qual elicia na técnica conhecida os ensaios de formação de colônia, um exemplo do qual é descrito abaixo, na mesma concentração molar que o rhEPO eowt mEPO, respectivamente, menos do que 10% da CFU-E (unidade de eritroblasto formadora de colô- nia), preferivelmente menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1%. As quantidades da CFU-E respectivas são calculadas para um dado rhEPO, wt mEPO ou variante EPO pela subtração de cada valor da quantidade de CFU-E observada em uma reação de controle (sem wt ou variante EPO).

No contexto dos polipeptídeos da presente invenção, o termo "junção" refere-se ao sítio em que dois aminoácidos seguem um ao outro, os . quais não são consecutivos no rhEPO ou wt EPO de camundongo, e os quais são potencialmente o resultado de eventos de união ou outros rearran-jos no RNAm de EPO. A respectiva junção das variantes EPO da presente invenção pode ser derivada da figura 4, por exemplo, é ENIT | RVGQ para hS3, VGQQ | ALLV para h1-4, VNFY | ALLV para h1-5, KRME | PWEP para hS4, ITVP | GPVG para h1-1, LNEN | NHC para h2-l, KRME | KELM para mS, LLAN | FLRG para mG3, DTFC | RRGD para mG5, KVNF | LRGK para m301 ou LSEA | VHGR para mK3.

As moléculas de polinucleotídeo da invenção podem ser sinteti- zadas in vitro (por exemplo, por síntese baseada em fosforoamidita) ou podem ser obtidas de uma célula, tal como a célula de um mamífero.

As variantes de EPO nomeadas mS, mG3, mG5, m301 e mK3com a seqüência de aminoácido deduzida conforme mostrado nas SEQ ID NOS: 14, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, foram isoladas de camundongo. a seqüência de camundongo é altamente homóloga à seqüência humana. Um alinhamento das seqüências de aminoácido do EPO derivado de seres humanos e camundongo é fornecido na figura 4. Conforme é aparente, a seqüência de camundongo é distinguida da seqüência humana pela falta de um resíduo de alanina na posição 8 e pelas seguintes 39 substituições (a em umeração é de acordo com a respectiva posição de aminoácido no EPO humano, o primeiro aminoácido indicado é o aminoácido humano naquela posição e o segundo é aminoácido de camundongo correspondente): 4H 4P, 6C — 6R, °W -» ^ 11W — 11L, 18S - 18L; 19L -> 19l; 27G — 27C; 43L -+ ^l;

52| 52y. 54j _^ 54y. 60^ _^ 60q. 61q _^ 61 p 62g _^ 62p. 64^ _^ 64g. 84q _^ 84^. 85q _^ 85^. 95^ _^ 95g. 101y _^ 1011. 103p _^ 103q. 104q _^ 104^. 109y _^ 109^.

115w —». 115p- 117p __> 117j- 122v —> 122|- 126v —> 126l- 134t —* 134s- 138a —»■ 138v' 145a —> 145l 146l —> 146m- 151a —» 151"p 152a —► 152"t 153S —» 153P- 154a —► 154P-

160| _^ 160|_. 162^ _^ 162y. 166p _^ 166q. 173g _^ 173^. 187^ _^ 187y Q 190j _^ 190p

Um mS, mG3, mG5, m301 ou mK3 humanizado carrega o resíduo de alanina adicional na posição 8 e/ou em um ou mais preferivelmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,

28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 posições da seqüência de aminoáci-dos humana ao invés da de camundongo. É particularmente preferido que mS, mG3, mG5, m301 e mK3 sejam completamente humanizados, isto é, que todo aminoácido mas posições de equilíbrio delineadas acima, até a extensão deles estarem presentes na respectiva variante, é de seqüência

humana ao invés de ser da seqüência de camundongo. É esperado que a humanização das variantes de camundongo vá diminuir quaisquer problemas imunológicos, os quais devem ser encontrados quando do uso no tratamento de seres humanos.

As moléculas de ácido nucléico variante do EPO da invenção

podem ser DNA, CDNA, DNA genômico, DNA sintético ou RNA, e podem ser de filamento duplo ou de filamento único, o filamento de sentido ou de anti-sentido. Essas moléculas podem ser produzidas, por exemplo, pela rea-ção em cadeia da polimerase (PCR) ou geradas por tratamento com uma ou mais endonucleases de restrição. Uma molécula de ácido ribonucléico (RNA) pode ser produzida por transcrição in vitro.

As moléculas de polinucleotídeo da invenção podem conter se- qüências de ocorrência natural, ou seqüências que diferem daquelas que ocorrem naturalmente mas, devido à degeneração do código genético, codificam o mesmo polipeptídeo, isto é, os polipeptídeos com as SEQ ID NOS: 2; 47; 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22. Alérrrdisso, essas moléculas de ácido nucléico não estão limitadas às seqüências codificantes, por exemplo, elas podem incluir algumas ou todas as seqüências não-codificantes que se encontram a montante ou a jusante de uma seqüência codificadora.

Além disso, as moléculas de ácido nucléico isoladas da invenção podem englobar segmentos que não são encontrados como tais no estado natural. Dessa forma, a invenção engloba moléculas de ácido nucléico re- combinantes incorporadas em um vetor (por exemplo, em um plasmideo ou vetor viral), ou no genoma de uma célula homóloga (ou o genoma de uma célula homóloga, em uma posição diferente do local cromossomal natural). Moléculas de ácido nucléico recombinantes e seus usos são discutidos adicionalmente abaixo. Em modalidades preferidas, os polinucleotídeos da presente in-

. venção também compreendem moléculas de ácido nucléico as quais são pelo menos 50%, preferivelmente 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a: (a) uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipep- tídeo das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 50, 51, 52, 53 ou 60 e (b) a seqüência de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57, 58 ou 61, respectivamente, e os quais apresentam ao mesmo tempo atividade protetora celular e, particularmente, neu-roprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética.

A determinação da identidade porcentual entre duas seqüências

é conseguida usando o algoritmo matemático de Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873- 5877. Tal algoritmo é incorporado nosprogramas BLASTN e BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Buscas por nucleotídeo BLAST são efetuadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências de nucleotídeos homólogas ao polipeptídeo variante EPO que codi-5 fica ácidos nucléicos. Buscas de proteína BLAST são efetuadas com o programa BLASTP, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogas ao polipeptídeo variante EPO, respectivamente. Para obter alinhamentos intervalados para propósitos comparativos, gapped BLAST é utilizado conforme descrito em Altschul et al. 10 (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e gapped BLAST, os parâmetros predefinidos dos respectivos programas são usados.

A hibridização também pode ser usada como uma medida de homologia entre duas seqüências de ácidos nucléicos. Uma seqüência de

ácidos nucléicos codificando qualquer uma das variantes EPO aqui descritas, ou um derivado ou fragmento seu, pode ser usada como uma sonda de hibridização de acordo com técnicas de hibridização padrão. A hibridização de uma sonda de variante EPO em DNA ou RNA de uma fonte de teste (por exemplo, uma célula de mamífero) é uma indicação da presença do DNA ou

RNA relevante do EPO na melhor fonte. As condições de hibridização são conhecidas pelas pessoas versadas na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Condições estringentes são definidas como equivalentes à hibridização em cloreto de sódio/citrato de sódio 6X (SSC) a 459C, seguido por

uma lavagem em 0,2X SSC, SDS 0,1% a 65-C. Ao selecionar uma sonda específica para uma variante carregando uma anulação interna, é preferível que a sonda usada para detectar ácidos nucléicos homólogos sobrepõe os limites da anulação, por exemplo, hs3, h1-4, h1-5, hS4, mS, mG3, mG5 ou m301. Em casos onde a união leva a um C-terminal alternado da proteína,

por exemplo, h1-1, h2-l ou mK3 é preferido que a sonda usada para detectar seqüências de DNA homólogas sobrepõe os limites entre a seqüência EPO conhecida e o C-terminal alternado. Por exemplo, uma sonda poderia serprojetada, a qual compreende 10 bases complementares ' do sítio de união e 10 bases complementares 3' do sítio de união.

Um "DNA isolado" é ou (1) um DNA que contém seqüência não-idêntica àquela de qualquer seqüência de ocorrência natural, ou (2), no con-5 texto de um DNA com uma seqüência de ocorrência natural (por exemplo, um CDNA ou um DNA genômico), um DNA livre de pelo menos um dos genes que flanqueiam o gene contendo o DNA de interesse no genoma do organismo no qual o gene contendo o DNA de interesse ocorre naturalmente. O termo, dessa forma, inclui um DNA recombinante incorporado em um ve- tor, em um plasmídeo autonomicamente replicante ou vírus, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. O termo também inclui uma molécula separada tal como um CDNA onde o DNA genômico correspondente tem íntrons e, conseqüentemente, uma seqüência diferente; um fragmento genômico que não tem pelo menos um dos genes flanqueadores; um fragmen- to de CDNA ou DNA genômico produzido pela reação em cadeia da polime-rase (PCR) e que não tem pelo menos um dos genes flanqueadores; um fragmento de restrição que não tem pelo menos um dos genes flanqueadores; um DNA que codifica uma proteína de ocorrência não-natural tal como uma proteína d efusão, muteína ou fragmento de uma dada proteína; e um ácido nucléico o qual é uma variante degenerada de um CDNA ou de um . ácido nucléico de ocorrência natural. Além disso, ele inclui uma seqüência de nucleotídeos recombinante que é parte de um gene híbrido, isto é, um gene que codifica uma proteína de fusão de ocorrência não-natural. Será aparente a partir do precedente que DNA isolado não significa um DNA pre- sente dentre centenas a milhões de outras moléculas de DNA em, por e-xemplo, bibliotecas de CDNA ou de DNA genômico ou de digestos de restrição de DNA genômico em, por exemplo, uma mistura reacional de digesto de restrição ou uma fatia de gel eletroforético.

Outro aspecto da presente invenção é um vetor contendo o(s) polinucleotídeo(s) da presente invenção ou uma proteína codificada por um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "vetor" refere-se a uma proteína ou polinucleotídeo ou uma mistura desses a qual é capaz de ser introdu-zida ou de introduzir as proteínas e/ou ácidos nucleicos compreendidos na célula. É preferível que as proteínas codificadas pelo polinucleotídeo introduzido sejam expressas na célula na introdução do vetor.

Em uma modalidade preferida, o vetor da presente invenção compreende plasmideos, fagemídeos, fagos, cosmideos, cromossomos de mamífero artificiais, constructos "knock-out" e "knock-in", vírus, particularmente adenovírus, vírus vaccinia, vírus vaccinia atenuados, vírus pox canário, lentivírus (Chang, LJ. e Gay, E.E. (20001) Curr. Gene Therap. 1:237-251), herpes vírus, particularmente vírus herpes simplex (HSV-1, Carlezon, W. A. et al. (2000) Crit. Rev. Neurobiol.), baculovírus, retrovírus, vírus adeno-associado (AAV, Carter, P.J. e Samulski, RJ. (2000) J. Mol. Med. 6:17-27), rinovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), filovírus e versões projetadas suas (ver, por exemplo, Cobinger G. P. et al (2001) Nat. Biotechnol. 19:225-30), virossomas, lipossomas de DNA "nus" e partículas revestidas de ácido nucleico, particularmente esferas de ouro. Particularmente preferidos são os vetores virais como vetores adenovirais ou vetores retrovirais (Lin-demann et al. (1997) Mol. Med. 3:466-76 e Springer et al. (1998) Mol. Cell. 2:549-58). Lipossomas são geralmente pequenas vesículas unilamelares ou multilamelares feitas de lipídeos catiônicos, neutros e/ou aniônicos, por e- xemplo, por tratamento de ultra-som de suspensões lipossomais. O DNA pode, por exemplo, estar ligado ionicamente à superfície dos lipossomas ou internamente encerrado no lipossoma. Misturas de lipídeos adequadas são conhecidas na técnica e compreendem, por exemplo, DOTMA (brometo de 1,2-dioleiloxpropil-3-trimetilamônio) e DPOE (dioleoilfosfatidiletanolamina), os quais ambos têm sido usados em uma variedade de linhagens celulares.

Partículas revestidas de ácido nucleico são outro instrumento para a introdução de ácidos nucleicos nas células usando as chamadas "armas de gene", as quais permitem a introdução mecânica de partículas nas células. Preferivelmente, as partículas por si só são inertes, e conseqüente- mente, estão em uma modalidade preferida feita de esferas de ouro.

Em outro aspecto, o polinucleotídeo da presente invenção é ope-rativamente ligado às seqüências de controle de expressão que permitem aexpressão em células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas. Os elementos regulatórios transcricionais/traducionais referidos acima incluem, mas não estão limitados, a promotores, intensificadores, operadores, silenci-adores, repressores e outros elementos induzíveis e não-induzíveis, consti- tutivos, regulados por ciclo celular e regulados metabolicamente que são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e que direcionam ou, de outra forma, regulam a expressão gênica. Tais elementos regulatórios incluem, mas não estão limitados, a elementos regulatórios que direcionam a expressão constitutiva como, por exemplo, promotores transcritos pela RNA poli-

merase do tipo III, por exemplo, promotores do gene RNAsn U6 ou RNAsc 7SK, o gene inicial imediato hCMV de citomegalovírus, os promotores inicial ou tardio do SV40 de adenovírus, promotor viral e as seqüências ativadoras derivadas de, por exemplo, NBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, MMTV ou HIV; as quais permitem a expressão induzível como, por exemplo, o promo-

tor CUP-1, o repressor tet, conforme empregado, por exemplo, nos sistemas tet-on e tet-off, o sistema ]aç, o sistema trpj elementos regulatórios direcionando a expressão tecido-específica, preferivelmente a expressão específica de célula nervosa, por exemplo, promotor (por exemplo, Thy-1.2, NSE, cadeia leve de miosina II, tirosina hidroxilase, promotor CaMKIIalfa, cadeia be-

ta do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), dopamina bea-. hidroxilase, Tau, elementos regulatórios (por exemplo, NRSE/RE-1; elemento silenciador neurônio-restritivo/elemento repressor 1) direcionando a expressão específica do ciclo celular como, por exemplo, cdc2, cdc25C ou ci-clina A; ou o sistema TAC, o sistema TRC, as principais regiões operadora e

promotora do fago A, as regiões de controle da proteína revestida fd, o promotor da 3-fosfoglicerato quinase, os promotores da fosfatase ácida e os promotores dos fatores de emparelhamento a- ou a- de levedura.

Conforme aqui utilizado, "operativamente ligado" significa incorporado em um constructo genético de forma que as seqüências de controle

de expressão eficaz controlam a expressão de uma seqüência codificadora de interesse.

Semelhantemente, os polinucleotídeos da presente invençãopodem formar parte de um gene híbrido que codifica seqüências de polipep-tídeo adicionais, por exemplo, uma seqüência a qual codifica uma proteína que funciona como um marcador ou repórter. O gene híbrido pode levar a uma proteína de fusão ou as duas ou mais partes podem ser separadas por 5 sítios de entrada ribossomais internos (IRES), os quais levam à expressão de duas ou mais proteínas separadas. Exemplos de genes marcador e repórter incluem da p-lactamase, cloranfenicol acetiltransferase, (CAT), ade-nosina desaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase (neor, G418r), diidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina

quinase (TK), lacZ (codificando a (3-galactosidase), proteína fluorescente verde (GFP) e variantes suas e xantina guanina fosforibosiltransferase (XG-PRT). Como com muitos dos procedimentos padrão associados com a prática da invenção, artesãos versados estarão informados dos reagentes úteis adicionais, por exemplo, seqüências adicionais que podem servir a função

de um marcador ou repórter. Se a expressão do gene híbrido leva a um poli-peptídeo, o polipeptídeo híbrido irá geralmente incluir uma primeira porção e uma segunda porção; a primeira porção sendo um polipeptídeo variante EPO e a segunda porção sendo, por exemplo, o repórter descrito acima de uma região constante de Ig ou parte de uma região constante Ig, por exem-

pio, os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada de lgG2. Outros híbridos po-; deriam incluir uma seqüência de peptídeo heteróloga para facilitar a purificação e/ou detecção, por exemplo, de um sinalizador antigênico como, por e-xemplo, um sinalizador myc, ou um sinalizador com ligação preferencial a uma região, por exemplo, taq de quitina ou sinalizador His. Moléculas de

ácido nucléico recombinantes também podem conter uma seqüência de po-linucleotídeo codificando um polipeptídeo variante EPO operativamente ligado a uma seqüência de sinal heteróloga. Tais seqüências de sinal podem direcionar a proteína para diferentes compartimentos na célula e são bem-conhecidas por alguém versado na técnica. Uma seqüência de sinalização

preferida é uma seqüência que facilita a secreção da proteína resultante. Preferivelmente, essas seqüências de sinalização e/ou taq são projetadas de forma que elas possam ser clivadas da variante EPO depois da purificaçãopara proporcionar uma proteína essencialmente pura sem dois muitos ami-noácidos , preferivelmente não mais do que 10 aminoácidos adicionais para o EPO final. Tais sítios de clivagem são bem-conhecidos na técnica e compreendem, por exemplo, sítios de clivagem de endopeptidase e sítios de cli- vagem de inteína.

Outro aspecto da presente invenção é uma célula hospedeira geneticamente projetada com o polinucleotídeo ou o vetor conforme delineado acima. As células hospedeiras que podem ser usadas para propósitos da invenção incluem, mas não estão limitadas, a células procarióticas tais como bactérias (por exemplo, E. colie B. subtilis), as quais podem ser transformadas com, por exemplo, vetores de expressão de DNA de cosmídeo, DNA bacteriófago recombinante ou DNA de plasmídeo contendo as moléculas de polinucleotídeo da invenção; células eucarióticas simples como levedura (por exemplo, Saccharomyces e Pichia), as quais podem ser transformadas com, por exemplo, vetores de expressão de levedura recombinantes contendo a molécula de polinucleotídeo da invenção; sistemas de célula de inseto como, por exemplo, células Sf9 ou Hi5, as quais podem ser infectadas com, por exemplo, vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculo-vírus) contendo as moléculas de polinucleotídeo da invenção; oócitos Xeno- pus, os quais podem ser injetados com, por exemplo, plasmídeos; sistemas ■ de célula vegetal, os quais podem ser infectados com, por exemplo, vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor (CaMV) ou vírus mosaico de tabaco (TMV)) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo uma seqüência de nucleotídeo variante EPO; ou sistemas de célula de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 e NIH 3T3) as quais podem ser transformadas com constructos de expressão recombinantes contendo, por exemplo, promotores derivados, por exemplo, do genoma de células de mamíferos (por exemplo, o promotor de metalotioneína) de vírus mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus, CMV IE e o promotor 7,5K do vírus vaccinia) ou de células bacterianas (por exemplo, a ligação do repressor teté empregada nos sistemas tet-on e tet-off). Também úteis como células hospedeiras são as células primárias ou secundárias obtidas diretamente de um mamífero e transfectadas co um vetor de plasmídeo ou infectadas com um vetor viral. Dependendo da célula hospedeira e do respectivo vetor usa- do para introduzir o polinucleotídeo da invenção o polinucleotídeo pode integrar, por exemplo, no cromossomo ou no DNA mitocondrial ou pode ser mantido extracromossomalmente como, por exemplo, epissomalmente ou pode estar somente temporariamente compreendido nas células.

Uma vez que o EPO é altamente glicosilado in vivo, é desejável

escolher um sistema de expressão, o qual proporcione a glicosilação fiel da proteína. Conseqüentemente, é preferível introduzir os polinucleotídeos que codificam variantes de partes do EPO da presente invenção em células eu-carióticas superiores, particularmente em células de mamífero, por exemplo, células COS, CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3

0UNIH3T3.

Outro aspecto da presente invenção é um animal não-humano transgênico contendo um polinucleotídeo, um vetor e/ou uma célula hospedeira conforme descrito acima. O animal pode ser um animal mosaico, o que significa que somente parte das células compondo o corpo compreendem

polinucleotídeos, vetores e/ou células da presente invenção ou o animal pode ser um animal transgênico o que significa que todas as células do animal compreendem os polinucleotídeos e/ou vetores da presente invenção ou são derivadas de uma célula da presente invenção. Animais mosaicos ou trans-gênicos podem ser ou homo- ou heterozigóticos, em relação aos polinucleo-

tídeos da presente invenção contidos na célula. Em uma modalidade preferida, os animais transgênicos são ou animais "knock-out" ou "knock-in" homo-ou heterozigóticos com relação aos genes os quais codificam para as proteínas da presente invenção. Os animais podem, em princípio, ser qualquer animal, preferivelmente, entretanto, ele é um mamífero, selecionado do grupo

de primatas não-humanos, cavalo, bovino, ovelha, cabra, porco, cachorro, gato, bode, coelho, camundongo, rato, porquinho-da-índia, hâmster ou gerbo.

Outro aspecto da presente invenção é um processo para produ-zir um polipeptídeo variante EPO codificado por um polinucleotídeo da presente invenção compreendendo: o cultivo da célula hospedeira descrita acima e a recuperação do polipeptídeo codificado pelo referido polinucleotídeo. Combinações preferidas de células hospedeiras e vetores são delineadas 5 acima e a combinação adicional será prontamente aparente para alguém versado na técnica. Dependendo do uso posterior tencionado do peptídeo recuperado, um tipo celular adequado pode ser escolhido. Conforme delineado acima, células eucarióticas são preferivelmente escolhidas, se for desejado que as proteínas produzidas pelas células exibam um padrão essenci-

almente natural de glicosilação e células procarioticas são escolhidas se, por exemplo, glicosilação ou outras modificações, as quais são normalmente introduzidas nas proteínas somente em células eucarióticas, não forem desejadas ou necessárias.

É conhecido na técnica anterior que a farmacocinética dos fár-

maços de proteína pode ser significativamente alterada por modificação da proteína. Para EPO de comprimento total, foi descrito que a glicosilação, particularmente a presença de resíduos de ácido siálico no final das cadeias laterais de oligossacarídeo, atribui para o tempo de circulação (WO 95/05465) e que a remoção dos grupos de ácido siálico expõe os resíduos de galactose, o que aumenta a depuração pelo fígado. Conseqüentemente, . uma tentativa tomada para aumentar o tempo de circulação do EPO foi o aumento nos resíduos de ácido siálico. Várias tentativas, dessa forma, envolvem o fornecimento de sítios de glicosilação adicionais (ver, por exemplo, WO 91/05867, WO 94/09257 e WO 01/81405. Tais análogos de EPO modifi-

cados podem ter pelo menos uma cadeia de carboidrato N-ligada ou O-ligada adicional. Outras tentativas de aumentar a meia-vida do EPO envolveram a adição de resíduos de polietilenoglicol (PEG) de comprimento de estrutura de aminoácido variada (ver, por exemplo, WO 00/32772, WO 01/02017, WO 03/029291. Outra tentativa usou a modificação de moléculas

EPO com pelo menos um oligossacarídeo N-ligado ou O-ligado, as quais foram ainda modificadas por oxidação, sulfatação, fosforilação PEGilação ou uma combinação destes (ver WO 2005/025606). Todas essas tentativas po-dem ser igualmente empregadas para estender a meia vida das variantes EPO da presente invenção e, concordantemente, em uma modalidade preferida acima, o processo compreendendo ainda a etapa de modificação da variante EPO, em que a modificação é selecionada do grupo consistindo em oxidação, sulfatação, fosforilação, adição de oligossacarídeos ou combinações destes. Se a adição de outros oíigonucleotídeos N-ligados ou O-ligados for desejada, é possível introduzi-las pela introdução de sítios de glicosilação adicionais conforme tem sido descrito na técnica anterior, por exemplo, nas posições 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 e/ou 138, se a respectiva posição esti- ver presente na variante da presente invenção (ver WO 01/81405).

Outro aspecto da invenção é um processo para produzir células capazes de expressar pelo menos uma das variantes EPO compreendendo células geneticamente projetadas in vitro com o vetor da reivindicação 3 ou 4, em que o(s) referido(s) polipeptídeo(s) variante(s) é(são) codificado(s) por um polinucleotídeo da presente invenção.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos codificada por um polinucleotídeo da invenção ou obtenível pelo processo mencionado acima. Os polipeptídeos da invenção incluem todos aqueles descritos aqui e fragmentos desses polipeptídeos, os quais carregam entre anulações 1 e 10N- e/ou C-terminais. Preferivelmente, as anulações são de menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2 ou menos de 1 aminoácido. Os polipeptídeos embarcados pela invenção também incluem proteínas de fusão que contêm ou a variante da porção EPO conforme indi-cado nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22 ou a versão humanizada de 14, 16, 18, 20 e 22 ou um fragmento seu conforme definido acima fundido com uma seqüência de aminoácido não-relacionada. As seqüências não-relacionadas podem compreender domínios funcionais adicionais ou peptídeos de sinalização. Peptídeos de sinalização estão descritos em maiores detalhes e exemplificados abaixo.

Os polipeptídeos podem ser qualquer um daqueles descritos acima, mas com não mais do que 10 (por exemplo, não mais do que: 10,nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou uma) substituições conservativas. Substituições conservativas são conhecidas na técnica e tipicamente incluem a substituição de, por exemplo, um aminoácido polar com outro aminoácido polar e um aminoácido ácido com outro aminoácido ácido. Con- cordantemente, substituições conservativas preferivelmente incluem substituições com os seguintes grupos de aminoácidos: glicina, alanina, valina, prolina, isoleucina e leucina (cadeia lateral alifática, não-polar); ácido aspár-tico e ácido glutâmico (cadeia lateral negativamente carregada); asparagina, glutamina, metionina, cisteína, serina e treonina (cadeia lateral polar não-

carregada); lisina, histidina e arginina; e fenilalanina, triptofano e tirosina (cadeia lateral aromática); e lisina, arginina e histidina (cadeia lateral positivamente carregada). É bem-conhecido na técnica como determinar o efeito de uma dada substituição, por exemplo, no pK-i, etc. Tudo o que é requerido de um polipeptídeo com uma ou mais substituições conservativas é que ele

tenha pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos: 55%; 60%; 65%, 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5%; ou 100% ou mais) da capacidade da variante EPO inalterada de proteger os neurônios de dano/morte celular (por exemplo, por apoptose ou necrose), em que a morte celular é induzida por privação de oxigênio e/ou glicose, por exposição tóxica, quími-

ca, física, mecânica, inflamatória ou de radiação ou por infecção viral ou bac-. teriana.

Tanto polipeptídeos quanto peptídeos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante in vitro padrão e transgênese in vivo, usando seqüências de nucleotídeos codificando os polipeptídeos ou peptídeos apro-

priados. Métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo seqüências codifi-cantes relevantes e sinais de controle de transcrição/tradução apropriados. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual (2- Ed.) [Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.,

1989] e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology [Green Publi-shing Associates e Wiley Interscience, N.Y., 1989].

Polipeptídeos e fragmentos da invenção também incluem aque-les descritos acima, porém modificados para uso in vivo pela adição, nas extremidades amino- e/ou carbóxi-terminais, de agentes e bloqueio para facilitar a sobrevivência do polipeptídeo relevante in vivo. Isso pode ser útil naquelas situações nas quais o peptídeo terminal tende a ser degradado pelas proteases antes da absorção celular. Tais agentes bloqueadores podem incluir, sem limitação, seqüências peptídicas relacionadas ou não-relacionadas adicionais que podem ser ligadas aos resíduos amino e carbóxi-terminais do peptídeo a ser administrado. Isso pode ser feito ou quimica-mente durante a síntese do peptídeo ou por tecnologia do DNA recombinan-

te por métodos familiares aos artesãos de habilidade mediana.

Alternativamente, agentes bloqueadores, tais como ácido piro-glutâmico ou outras moléculas conhecidas na técnica podem ser ligadas aos resíduos amino- e carbóxi-terminais, ou o grupo amino no amino terminal ou o grupo carboxila no carbóxi-terminal pode ser substituído com uma diferen- te porção. Da mesma forma, os peptídeos podem ser covalentemente ou não-covalentemente acoplados a proteínas "carreadoras" farmaceuticamen-te aceitáveis antes da administração.

O termo fragmento de peptídeo ou polipeptídeo "isolado", conforme aqui utilizado, refere-se a um fragmento de peptídeo ou polipeptídeo o qual ou não tem uma contraparte de ocorrência natural ou foi separado ou purificado de componentes os quais naturalmente o acompanham, por e-xemplo, em tecidos tais como língua, pâncreas, fígado, baço, ovário, testículo, músculo, tecido de articulação, tecido neural, tecido gastrointestinal ou tecido tumoral ou fluidos corporais tais como sangue, soro ou urina. Tipica- mente, o fragmento de peptídeo ou polipeptídeo é considerado "isolado" quando ele está pelo menos 70%, por peso seco, livre das proteínas e outras moléculas orgânicas de ocorrência natural com a qual ele está naturalmente associado. Preferivelmente, uma preparação de um polipeptídeo (ou fragmento de peptídeo seu) da invenção é pelo menos 80%, mais preferi- velmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 99%, em peso seco, o polipeptídeo (ou o fragmento de peptídeo seu), respectivamente, da invenção. Dessa forma, por exemplo, uma preparação do polipeptídeo x épelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivel-mente 99% em peso seco, de polipeptídeo x. Uma vez que um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado é, por sua natureza, separado dos componentes que naturalmente o acompanham, o polipeptídeo sintético é "isolado". 5 Um polipeptídeo isolado (ou fragmento de peptídeo) da invenção

pode ser obtido, por exemplo, pela extração de uma fonte natural (por e-xemplo, de fluidos de tecidos ou corporais); pela expressão de um ácido nu-cléico recombinante que codifica o polipeptídeo; ou por síntese química. Um polipeptídeo que é produzido em um sistema celular diferente da fonte da qual ele naturalmente se origina é "isolado", porque será necessário ser livre de componentes os quais naturalmente o acompanham. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por um método apropriado, por exemplo, croma-tografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise de HPLC.

Outro aspecto da invenção é um anticorpo, o qual especifica- mente se liga ao polipeptídeo variante EPO codificado por polinucleotídeos da invenção ou obteníveis pelo processo mencionado acima. O termo "anticorpo" compreende anticorpos monoclonais ou policlonais e seus fragmentos de ligação, particularmente fragmentos Fc assim como os chamados "anticorpos de cadeia individual" (Bird R. E. et al (1988) Science 242:423-6), anticorpos quiméricos, humanizados, particularmente CDR-enxertados, e dia . por tetracorpos (Holliger P. et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:6444-8). São também compreendidas imunoglobulinas como proteínas que são selecionadas através de técnicas incluindo, por exemplo, exposição de fago para se ligar especificamente aos polipeptídeos da presente inven- ção. Nesse contexto, o termo "ligação específica" refere-se a anticorpos promovidos contra peptídeos derivados de junções de união ou junções criadas por outros processos, por exemplo, ENIT | RVGQ de hS3, VGQQ | AL-LV de h1-4, VNFY | ALLV de h1-5, KRME | PWEP de hS4, ITVP | GPVG de h1-1, LNEN | NHC de h2-l, KRME | KELM de mS, LLAN | FLRG de mG3, DTFC | RRGD de mG5, KVNF | LRGK de m301 ou LSEA | VHGR de mK3. Tais peptídeos podem compreender mais ou menos aminoácidos N- ou C-terminais. Um anticorpo é considerado como sendo específico para a varian-te EPO, se sua afinidade para a variante for pelo menos 50 vezes superior, preferivelmente 100 vezes superior, mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes superior do que para o EPO humano ou de murino de comprimento total. Preferivelmente anticorpos específicos da presente invenção não se ligam ou essencialmente não se ligam ao EPO humano ou de murino de comprimento total. É bem-conhecido na técnica como fazer anticorpos e selecionar anticorpos com uma dada especificidade.

Outro aspecto da presente invenção envolve o uso de um poli-nucleotídeo, um vetor, uma célula hospedeira ou um polipeptídeo da presen-

te invenção para a produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com o dano tecidual devido à morte celular (por exemplo, apoptose e necrose). A apoptose ou necrose leva à destruição celular, a qual pode ser prevenida ou melhorada ao usar um polinu-cleotídeo, vetor, célula hospedeira ou polipeptídeo da presente invenção. A

morte celular pode ser induzida por muitos estímulos internos e -externos diferentes e incluem, preferivelmente, isquemia, hipóxia, infecção bacteriana ou viral, radiação, ou induzida por estímulos metabólicos, tóxicos, químicos, auto-imunológicos ou traumáticos. É bem-conhecido na técnica como detectar morte celular como, por exemplo, usando critérios morfológicos, um en-

saio de TUNNEL, ensaio de MTT, ensaio de vida/morte por manchamento (por exemplo, manchamento com brometo de etídio e laranja acridina), ensaio de caspase, microscopia eletrônica, corrida de DNA ou o ensaio de liberação de LDH descrito abaixo. Por exemplo, apoptose é caracterizada por fragmentação de cromatina, extravasamento dos conteúdos celulares e e-

ventualmente morte da célula. Ela foi reconhecida por desempenhar um papel em muitos processos patológicos agudos ou crônicos. Concordantemen-te, um uso preferido da presente invenção compreende a administração de polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras ou polipeptídeos da presente invenção para prevenir, tratar ou melhorar distúrbios neurodegenerativos ou

neurinflamatórios agudos e crônicos, distúrbio agudo ou crônico do coração (por exemplo, enfarte do miocárdio), pulmão (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica), rim (por exemplo, glomerulonefrite), fígado (porexemplo, falência hepática crônica) ou pâncreas (por exemplo, pancreatite), assim como condições associadas com transplante de célula (por exemplo, célula tronco) ou órgão (por exemplo, rim ou fígado). Nesse aspecto, é também previsto que as variantes EPO da presente invenção podem ser incluí-5 das em soluções de estocagem usadas para estocar órgãos ou membros para transporte e/ou depois de injúria traumática.

Distúrbios neurodegenerativos agudos incluem, mas não estão limitados, a vários tipos de distúrbios neurodegenerativos agudos associados com a morte celular neuronal, incluindo insuficiência cerebrovascular,

trauma cerebral focai ou difuso, dano cerebral difuso e injúria da medula es-pinal. Exemplos de distúrbios neurodegenerativos agudos são: isquemia ou enfarte cerebral incluindo oclusão embólica e oclusão trombótica, reperfusão seguido de isquemia aguda, injúria hipóxica-isquêmica perinatal, parada cardíaca, assim como hemorragia intracranial de qualquer tipo (tal como epidu-

ral, subdural, subaraquinóide e intracerebral) e lesões intracraniais e intra-vertebrais (tais como contusão, penetração, corte, compressão e laceração), encefalite infecciosa da síndrome de criança sacudida ("whiplash shaken infant syndrome") (por exemplo, herpes encefalite), meningite (por exemplo, bacteriana), dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca).

Distúrbios neurodegenerativos crônicos que podem ser tratados

. como as variantes EPO da presente invenção incluem, mas não estão limitadas, a demências (por exemplo, doença de Alzheimer, demências vasculares), doença de Pick, doença do corpo de Lewy difuso, paralisia supranucle-ar progressiva (síndrome de Steel-Richardson), esclerose múltipla, atrofia

sistêmica múltipla (incluindo síndrome de Shy-Drager), condições epiléticas crônicas associadas com neurodegeneração, doenças neuronais motoras incluindo esclerose lateral amiotrófica, ataxias degenerativas, degeneração basal cortical, complexo de Guam-Parkinson-demência-SLA, panencefalite esclerosante subaguda, doença de Huntington, doença de Parkinson, sinu-

cleinopatias (incluindo atrofia sistêmica múltipla), afasia progressiva primária, degeneração estriatonigral, doença de Machado-Joseph/ataxia espinocere-belar tipo 3 e degenerações olivopontocerebelares, doença de Gilles de LaTourette, paralisia bulbar e pseudobulbar, atrofia muscular espinal e espino-bulbar (doença de Kennedy), esclerose lateral primária, paraplegia espástica familial, doença de Werdnig-Hoffman, doença de Kugelberg-Welander, doença de Tay-Sach, doença de Sandhoff, doença espástica familial, parapa- rese espástica, leucoencefalopatia multifocal progressiva, disautonomia familial (síndrome de Riley-Day), e doenças de príon (incluindo, mas sem se limitar, a doença de Creutzfeldt-Jakob, Gerstmann-Strussler-Scheinker, Kuru e insônia familial fatal), polineuropatias (por exemplo, diabética, álcool-tóxica, síndrome Guillain-Barré, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica), doenças de príon, vício, distúrbios afetivos (por exemplo, depressão), distúrbios esquizofrênicos, síndrome da fadiga crônica, dor crônica (por exemplo, dor nas costas inferior).

Outro aspecto da presente invenção envolve o uso de um poli-nucleotídeo, um vetor, uma célula hospedeira ou um polipeptídeo da presen- te invenção para a produção de um agente antienvelhecimento. A base para essa aplicação das variantes EPO da presente invenção é o fato de que a deterioração progressiva da maioria das funções corporais, as quais acompanham o envelhecimento, tem sido associadas com a morte celular e é, dessa forma, previsto que as variantes EPO da presente invenção, as quais somente fornecem o efeito protetor celular benéfico, podem ser tomadas continuamente sem sofrer os efeitos colaterais geralmente associados com a administração contínua de EPO, o que, entretanto, pode ser atribuído ao efeito eritropoiético do EPO.

Os inventores também descobriram surpreendentemente que os ácidos nucléicos e proteínas de acordo com a invenção possuem propriedades antiinflamatórias surpreendentes (ver figuras e experimentos). Dessa forma, essas variantes EPO são úteis no tratamento da inflamação e de doenças degenerativas. Doenças inflamatórias são doenças tais como, porém sem se limitar, a esclerose múltipla, infecções virais e bacterianas ou sepsia. Doenças degenerativas são doenças tais como, porém não limitadas, a apo-plexia, enfartes do miocárdio.

A invenção também refere-se a todos os tipos e formas de ex-pressão in vivo dos ácidos nucléicos de acordo com a invenção. Ela ainda refere-se a células transformadas, particularmente a células tronco as quais são usadas como agentes terapêuticos. Tais células podem ser estavelmen-te transformadas com um ácido nucléico de acordo com a invenção. O ácido nucléico pode estar em um casssete onde ele é operativamente ligado a um promotor. O promotor pode ser capaz de direcionar a expressão somente em tecidos particulares, tais como, porém sem se limitar, a tecido neuronal ou ao cérebro ou tecido o qual exibe inflamação ou degeneração. Ensinamentos respectivos podem ser tomados do WO 97/14307.

A atividade (em unidades) de polipeptídeo EPO é tradicional-

mente definida baseando-se na sua eficácia na estimulação da produção de hemácias em modelos de roedores (e conforme derivado por padrões internacionais de EPO). Uma unidade (U) de EPO regular (PM de cerca de 34.000) é cerca de 10 ng de proteína (1 mg de proteína é aproximadamente

100.000 U). Entretanto, conforme mencionado, a invenção envolve o uso de formas não-hematopoiéticas da eritropoietina, e como tais, essa definição baseada na atividade hematopoiética é inapropriada. Dessa forma, conforme aqui utilizado, a unidade de atividade da variante EPO é definida como a quantidade de proteína necessária para eliciar a mesma atividade em siste- mas celulares neurais ou outro responsivo à eritropoietina conforme é elicia-. do por EPO natural no mesmo sistema. O artesão versado irá prontamente determinar as unidades de um EPO não-hematopoiético seguindo as orientações aqui.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma compo- sição farmacêutica compreendendo um polinucleotídeo, um vetor, uma célula hospedeira, um polipeptídeo e/ou um anticorpo da presente invenção e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Na prática de um aspecto da presente invenção, uma composição farmacêutica conforme descrito acima pode ser administrada a um ma- mífero por qualquer via a qual proporcione um nível suficiente de uma variante de eritropoietina. Ela pode ser administrada sistematicamente ou localmente. Tal administração pode ser de forma parenteral, transmucosal, por38

exemplo, oral, nasal, retal, intravaginal, sublingual, submucosal ou transdér-mica. Preferivelmente, a administração é parenteral, por exemplo, através de injeção intravenosa ou intraperitoneal, e também incluindo, mas sem se limitar, à administração intra-arterial, intramuscular, intradérmica e subcutânea. 5 Se a composição farmacêutica da presente invenção for administrada localmente, ela pode ser injetada diretamente no órgão ou tecido a ser tratado. Em casos de tratamento do sistema nervoso, essa via de administração inclui, porém não está limitada, às vias de administração intracerebral, intra-ventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intra-espinal e/ou

peri-espinal, as quais podem empregar agulhas intracraniais e intraverte-brais, e cateteres com ou sem dispositivos de bomba.

Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica compreende um polipetídeo variante EPO em uma forma de unidade de dosagem adaptada para a proteção ou intensificação de células, tecidos ou

órgãos EPO-responsivos, os quais compreendem, por unidade de dosagem, uma quantidade não-tóxica eficaz na faixa de cerca de 0,5 mg até 5 mg de variantes EPO/ 0,6 mg até 5 mg de variantes EPO; 0,7 mg até 5 mg de variantes EPO; 0,8 mg até 5 mg de variantes EPO; 0,9 mg até 5 mg de variantes EPO; 1 até 5 mg de variantes EPO; 1,5 até 5 mg de variantes EPO; 2 até 5

mg de variantes EPO; 2,5 até 5 mg de variantes EPO; 3,5 até 5 mg de variantes EPO; 4 mg até 5 mg de variantes EPO; ou 4,5 até 5 mg de variantes EPO e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade preferida, um polipeptídeo variante EPO pode ser administrado sistematicamente em uma dosagem entre 100 nano-

gramas até cerca de 50 microgramas por Kg de peso corporal, preferivelmente de cerca de 20 microgramas até cerca de 50 microgramas por Kg de peso corporal. Tais níveis de soro podem ser alcançados em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas pós-administração. Tais dosagens podem ser repetidas conforme necessário. Por exemplo, a administração pode ser repe-

tida diariamente, ou a cada outro, terceiro, quarto, quinto, sexto ou sétimo dia, contanto que seja clinicamente necessário, ou depois de um intervalo apropriado, por exemplo, a cada 1 a 12 semanas, preferivelmente, a cada 3a 8 semanas. Em uma modalidade, a quantidade eficaz de variante EPO e um veículo farmaceuticamente aceitável pode ser empacotada em um única frasco de dose individual ou outro recipiente. Dependendo da doença ou condição respectivamente tratada, a variante EPO pode ser administrada em uma única dose, por um período predeterminado de tempo ou continuamente. Quando uma condição ou doença aguda é tratada, ele deve ser suficiente para proporcionar o paciente com uma única dose de variante EPO ou por um período de, por exemplo, por 2 dias até 12 meses, preferivelmente 1 semana até 6 meses, mais preferivelmente 2 semanas até 3 meses. Se uma doença ou condição crônica é tratada ou se a variante EPO é usada para prevenir ou reduzir a deterioração associada com o envelhecimento, a variante EPO pode ser administrada continuamente. Se a variante EPO da presente invenção for administrada por um dado período de tempo ou continuamente, ela é preferivelmente administrada nos intervalos e intervalos prefe- ridos indicados acima. Os intervalos necessários irão depender em parte do nível de soro da variante EPO necessário para tratar ou melhorar a doença respectiva e na farmacocinética da variante EPO respectiva, a qual irá em parte depender das modificações do EPO, por exemplo, por PEG. Estará na discrição do médico determinar a duração, dose e tipo exatos da variante EPO levando em consideração, por exemplo, a condição do paciente a ser • tratado, a severidade da condição, etc.

Para outras vias de administração, tais como pelo uso de um perfusato, injeção em um órgão ou outra administração local, uma composição farmacêutica irá ser fornecida, a qual resulta em níveis similares de uma variante EPO conforme descrito acima. Um nível de cerca de 10 pg/mL até cerca de 1000 ng/mL é desejado.

As composições farmacêuticas da invenção podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, por exemplo, polinucleotídeo, polipeptídeo, célula ou vetor, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Em uma modalidade específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulatória do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopéia Americana ou outra farmaco-péia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos. O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como soluções salinas em água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo se sésamo e similars. Uma solução salina é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser emprega- das como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipi-entes farmaceuticamente adequados incluem amido, glicose, lactose, saca-rose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, mono-estearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e similars. A composição, caso desejado, tam- bém pode conter quantidades menores de agentes umidificantes ou emulsi-ficantes, ou agentes tamponantes de pH. Essas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e similars. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutínantes tradicionais e veículos tais como triglicerídeos. Os compostos da invenção podem ser formulados como formas de sal ou neutras. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres tais como aqueles derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc, e aqueles formados com grupos carboxila livres tais como aqueles derivados de hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc. Exemplos de veículos farmaceuticamente adequados estão descritos em "Remingtoris Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade tera-peuticamente eficaz do composto, preferivelmente na forma purificada, jun- tamente com uma quantidade adequada de veículo de forma a fornecer a forma para a administração própria para o paciente. A formulação deve de adequar ao modo de administração.Composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem ser fornecidas como cápsulas ou comprimidos; como pós ou grânu-los; como soluções, xaropes ou suspensões (em líquidos aquosos ou não-aquosos); como espumas ou sobremesas comestíveis. Comprimidos ou 5 cápsulas de gelatina dura podem compreender lactose, amido ou seus derivados, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, ácido esteárico ou seus sais. Cápsulas de gelatina mole podem compreender óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis líquidos ou semi-sólidos, etc. Soluções e xaropes podem compreender água, polióis e açúcares.

Um agente ativo tencionado para administração oral pode ser

revestido com ou misturado com um material que retarde a desintegração e/ou absorção do agente ativo no trato gastrointestinal (por exemplo, mono-estearato de glicerila ou diestearato de glicerila podem ser usados). Dessa forma, a liberação sustentada do agente ativo pode ser alcançada durante

muitas horas e, caso necessário, o agente ativo pode ser protegido de ser degradado no estômago. Composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas para facilitar a liberação de um agente ativo em um local gastrointestinal particular devido a condições enzimáticas ou pH específico.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração

transdérmica podem ser fornecidas como placas discretas tencionados a permanecer em contato íntimo com a epiderme do receptor por um período prolongado de tempo. Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser fornecidas como ungüentos, cremes, suspensões,

loções, pós, soluções, pastas, géis, borrifos, aerossóis ou óleos. Para administração tópica à pele, boca, olho ou outros tecidos externos, um ungüento tópico ou creme é preferivelmente usado. Quando formulado em um ungüento, o ingrediente ativo pode ser empregado ou com uma base de ungüento parafínico ou miscível em água. Alternativamente, o ingrediente ativo pode

ser formulado em um creme com uma base óleo-em-água ou com uma base água-em-óleo. Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica ao olho inclui gotas oftálmicas. Nessas composições, o ingredienteativo pode ser dissolvido ou suspenso em um veículo adequado, por exemplo, em um solvente aquoso. Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica na boca inclui "lozenges" pastilhas e enxágües bucais.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração na- sal podem compreender veículos sólidos tais como pós (preferivelmente com um tamanho de partícula na faixa de 20 a 500 mícrons). Pós podem ser administrados de forma na qual a dose é consumida, isto é, por inalação rápida através do nariz de um recipiente de pó mantido próximo ao nariz. Alternativamente, composições adotadas para administração nasal podem compre-

ender veículos líquidos, por exemplo, borrifos nasais ou gotas nasais. Essas composições podem compreender soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo. Composições para administração por inalação podem ser fornecidas em dispositivos especialmente adaptados incluindo, mas sem se limitar, a aerossóis pressurizados, nebulizadores ou insufladores, os quais po-

dem ser construídos de forma a fornecer dosagens predeterminadas do ingrediente ativo. Em uma modalidade preferida, composições farmacêuticas da invenção são administradas através da cavidade nasal para os pulmões.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração retal podem ser fornecidas como supositórios ou enemas. Composições farma-

cêuticas para administração vaginal podem ser fornecidas como formulações de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou borrifos.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração pa-renteral incluem soluções ou suspensões injetáveis estéreis aquosas e não-aquosas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e

solutos que tornam as composições substancialmente isotônicas com o sangue de um receptor tencionado. Outros componentes que podem estar presentes em tais composições incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. Composições adaptadas para administração parente-ral podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de dose múl-

tipla, por exemplo ampolas fechadas e frasquinhos, e podem ser estocadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) requerendo somente a adição de um veículo líquido estéril, por exemplo, solução salina estéril parainjeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de granulos, comprimidos e pós estéreis. Em uma modalidade, um auto-injetor compreendendo uma solução injetável de um variante EPO pode ser fornecida para uso emergencial por ambulâncias, salas de emergência e situações de campo de guerra, e mesmo para auto-administração em um ambiente doméstico, particularmente onde a possibilidade de amputação traumática pode ocorrer, tal como pelo uso imprudente de uma segadeira. A probabilidade de que as células e tecidos em um pé ou dedo grave irá sobreviver depois do religamento pode ser aumentada pela administração de um variante EPO em sítios múltiplos na parte em gravidade tão logo quanto praticável, mesmo antes da chegada do pessoal médico no local, ou a chegada do indivíduo afligido gravemente com o dedo na sala de emergência.

Em uma modalidade preferida, a composição é formulada de acordo com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, composições para administração intravenosa são soluções em tampão a-quoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como lidocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos ou se-. paradamente ou misturados juntos em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou um concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado tal como em uma ampla ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição é para ser adminis- trada por infusão, ela pode ser dispersa com uma garrafa de infusão contendo solução salina ou água de grau farmacêutico estéril. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de solução salina estéril pode ser fornecida de forma que os ingredientes podem ser misturados antes da administração.

Supositórios geralmente contêm ingrediente ativo na faixa de

0,5% até 10% em peso; formulações orais preferivelmente contêm 10% a 95% de ingrediente ativo.Uma composição perfusato pode ser fornecida para uso em banhos de órgãos transplantados, para perfusão in situ, ou para administração à vasculatura de um órgão doador antes da coleta do órgão.

Tais composições farmacêuticas podem compreender níveis de uma variante EPO ou de uma forma de uma variante EPO não adequada para administração aguda ou crônica, local ou sistêmica a um indivíduo, mas irá servir às funções tencionadas aqui em um cadáver, banho de órgão, perfusato de órgão ou em um perfusato in situ antes da remoção ou redução dos níveis de variante EPO contidos ali antes da exposição ou retorno do

órgão ou tecido tratado à circulação regular.

A invenção também fornece uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associado com tal(s)is recipiente(s) pode ser um boletim na forma prescrita por

uma agência governamental regulando o produto, o uso ou a venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo boletim reflete a aprovação pela a-gência de produção, uso ou venda para administração humana.

Em outra modalidade ,por exemplo, variante EPO pode ser distribuída em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o polipeptídeo

pode ser administrado usando infusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, uma placa transdérmico, lipossomas ou outras formas de administração. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574). Em outra modalida-

de, o composto pode ser distribuído em uma vesícula, particularmente em um lipossoma (ver Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, N. Y., 353-365; WO 91/04014; U.S. 4.704.355). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados

(ver Medicai Applications of Controlled Release (1974) Langer e Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fia.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen e Bali (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger ePeppas (1953) J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; ver também Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351 , ; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105).

Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, isto é, as células, tecido ou órgão alvo, requerendo dessa forma uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson (1984) 115-138 em Medicai Applications ofCon-trolled Release, vol. 2). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249: 1527-1533). 10 Em outra modalidade, variante EPO, conforme propriamente

formulada, pode ser administrada por administração nasal, oral, retal, vaginal ou sublingual.

Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente para a área necessi- tada de tratamento; isso pode ser alcançado, por exemplo, e não a título de limitação, por infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, juntamente com um curativo de ferimento após a cirurgia, por aplicação tópica, por exemplo, juntamente com um curativo de ferimento depois de cirurgi-a, por injeção, através de um cateter, através de um supositório ou através de um implante, o referido implante sendo um material poroso, não-poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas suásticas, ou fibras.

A seleção da dose eficaz preferida será determinada por um artesão versado baseando-se na consideração de vários fatores os quais se- rão conhecidos por uma pessoa normalmente versada na técnica. Tais fatores incluem a forma particular da composição farmacêutica, por exemplo, polipeptídeo ou vetor, e seus parâmetros farmacocinéticos tais como biodis-ponibilidade, metabolismo, meia-vida, etc, os quais foram estabelecidos durante os procedimentos de desenvolvimento usuais tipicamente empregados na obtenção da aprovação regulatória para um composto farmacêutico. Outros fatores na consideração da dose incluem a condição ou doença a ser tratada ou o benefício a ser alcançado em um indivíduo normal, a massacorporal do paciente, a via de administração, se a administração é aguda ou crônica, medicamentos concomitantes e outros fatores bem-conhecidos por afetar a eficácia dos agentes farmacêuticos administrados. Dessa forma, a dosagem precisa deve ser decidida de acordo com o julgamento do clínico e cada circunstância do paciente, por exemplo, dependendo da condição e do status imune do paciente individual, de acordo com técnicas clínicas padronizadas.

Em outro aspecto da invenção, uma solução de perfusão ou per-fusato é fornecida para a perfusão e estocagem de órgãos para transplante, a solução de perfusão incluindo uma quantidade de composições farmacêuticas eficazes para proteger células responsivas ao variante EPO e células, tecidos ou órgãos associados.

Transplante inclui, mas não está limitado, ao xenotransplante, onde um órgão (incluindo células, tecido ou outra parte corporal) é coletado de um doador e transplantado em um receptor diferente; um autotransplante, onde o órgão é tomado de uma parte de um corpo e recolocado em outra, incluindo procedimentos cirúrgicos de bancada, nos quais um órgão pode ser removido, e enquanto ex vivo, ressecado, reparado ou, de outra forma, manipulado, tal como para remoção tumoral, e a seguir retornado para o lo- 0 cal original. Em uma modalidade, a solução de perfusão é a solução da Universidade de Wisconsin (UW) (U.S. 4.798.824), a qual contém de cerca de 1 até cerca de 25 U/mL de eritropoietina, 5% de hidroxietilamino (com um peso molecular de cerca de 200.000 até cerca de 300.000 e substancialmente livre de etilenoglicol, etilenocloridrina, cloreto de sódio e acetona): KH2P04 25 mM/ glutationa 3 mM; adenosina 5 mM; glicose 10 mM; tampão HEPES 10 mM; gluconato de magnésio 5 mM; CaCI2 1,5 mM; gliconato de sódio 105 mM; 200.000 unidades de penicilina; 40 unidades de insulina; 16 mg de de-xametasona; 12 mg de vermelho de fenol; e tem um pH de 7,4 - 7,5 e uma osmolalidade de cerca de 320 mOSm/L. A solução é usada para manter rins e pâncreas cadavéricos antes do transplante. Ao usar a solução, a conservação pode ser prolongada além do limite de 30 horas recomendado para a conservação do rim cadavérico. Esse perfusato particular é meramente ilus-47

trativo de uma variedade de tais soluções que podem ser adaptadas para o presente uso pela inclusão de uma quantidade eficaz a composição farmacêutica. Em uma outra modalidade, a solução de perfusato contém o equivalente de cerca de até cerca de 35 U/mL de eritropoietina, ou de cerca de 10 até cerca de 30 U/mL de eritropoietina.

Enquanto o receptor preferido de um variante EPO para os propósitos aqui inteiramente é um humano, os métodos aqui se aplicam igualmente a outros mamíferos, particularmente animais domesticados, gado, animais de companhia e de zoológico. Entretanto, a invenção não é tão limi- tante e os benefícios pode ser aplicados a qualquer mamífero.

Se uma pessoa for conhecida por estar em risco de desenvolver uma apoplexia, a administração profilática da composição farmacêutica da presente invenção é possível. Nesses casos, as composições farmacêuticas, particularmente o polipeptídeo variante EPO é preferivelmente administrado em doses preferidas delineadas acima e particulares preferidas com base diária. Preferivelmente, entre 100 nanogramas até cerca de 50 microgramas por Kg de peso corporal, preferivelmente cerca de 20 microgramas até cerca de 50 microgramas por Kg de peso corporal. Essa administração pode continuar até a redução do risco de desenvolver uma apoplexia. Na maioria dos exemplos, entretanto, a composição farmacêutica será administrada uma vez que a apoplexia tenha sido diagnosticada. Nesses casos, é preferível que uma primeira dose da composição farmacêutica seja administrada pela primeira vez dentro de 24 horas depois dos primeiros sintomas de uma apoplexia serem evidentes, preferivelmente dentro de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 hora ou menos. Preferivelmente, a administração é, a seguir continuada por preferivelmente pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 14 e, mais preferivelmente, por pelo menos 21 dias. As doses são administradas preferivelmente uma vez por dia e, preferivelmente, nas doses indicadas acima.

Breve descrição das figuras e desenhos

A figura 1: comparação dos produtos de PCR do EPO: Painel A representa os produtos de DNA de várias reações de PCR efetuadas ou complasmídeo puro compreendendo as variantes EPO de murino diferentes ouCDNA de cérebro ou rim de camundongo, os quais são separados em umgel de agarose 1,2%. Da esquerda para a direita as raias compreendem:marcador de peso molecular de 1 Kb, o produto de mK3 puro, mG3 puro, mG5 puro, m301 puro, mS puro, mWT puro, CDNA puro, CDNA de rim. Pai-nel B representa o produto de DNA de um PCR efetuado com CDNA de cé-rebro humano. Da esquerda para a direita as raias compreendem padrão depeso molecular de 1 Kb e o produto de PCR do CDNA de cérebro humano.

A figura 2: Alinhamento de seqüências de nucleotídeos das vari- antes EPO identificadas no CDNA de cérebro de murino e de EPO de muri-no do "tipo selvagem", isto é, a seqüência do EPO anteriormente descrita.

A figura 3: Alinhamento de seqüências de nucleotídeos das vari-antes EPO identificadas no CDNA de cérebro humano e de EPO humano do"tipo selvagem".

A figura 4: Alinhamento de seqüências de nucleotídeos das vari-

antes EPO identificadas em camundongo e humano com o EPO de "tipo sel-vagem" respectivo.

A figura 5: Atividade hematopoiética de variantes EPO e de EPOhumano e de murino da presente invenção. Painel A representa os resulta-

dos de um ensaio formador de colônia para variantes EPO e EPO de murinoe o Painel B representa o ensaio de formação de colônia para variantes EPOe EPO humano.

A figura 6: ajuste experimental para ensaios de neuroproteçãocom rhEPO e isômeros EPO.

A figura 7: painel A mostra um experimento com extensão de

privação de glicose oxigênio (OGD) de 1 h 40 min e 1 h 50 min. Em ambosos pontos de tempo uma taa de proteção de 40 - 50% para os neuroguardi-ões, mas sem proteção com mEPO e rhEPO foi observada. Painel B repre-senta um experimento com dois pontos de tempo diferentes (extensão de

OGD entre dois experimentos varia de acordo com a densidade de neurô-nios). Em 2 h 45 min somente uma fraca proteção é alcançada com wtEPO(23 - 30%) em comparação com os neuroguardiões (60 - 70%). A capaci-dade de proteção total do rhEPO somente é observada em níveis de danosmais elevados (3 h 15 min).

A figura 8: painel amostra um experimento com 2 h 00 min, 2 h15 min e 2 h 20 min de extensão de OGD com uma concentração de proteí- na se igualando a 100 U/L de hEPO. Em todos os três pontos de tempo umataxa de proteção de 40 - 50% para seres humanos, porém sem proteçãocom mEPO e rhEPO. Painel B mostra um experimento com dois diferentespontos de tempo (extensão de PGD entre dois experimentos varia de acordocom a densidade de neurônios). Em 2 h 45 min somente uma fraca proteção

é alcançada com wtEPO (20 - 30%) em comparação com os neuroguardi-ões (60 - 70%). A capacidade de proteção total do EPO é somente observa-da em níveis de danos mais elevados (3 h 15 min).

A figura 9: painel A mostra um Western Blot de meio de célulasHEK293 transfectadas com pcDNA3.1-V5/His-hEPO, pcDNA3.1-V5/His-hS3

ou pcDNA3.1 -V5/His-hS4, respectivamente. Esses meios foram usados paraos experimentos mostrados na figura 8. A concentração de hEPO, quantifi-cada por ELISA-EPO de camundongo (R & D) foi de 2 U/mL. rhEPO (= 2,5ng forma carregados no gel), hEPO (=0,4 ng foram carregados no gel), hS3e hS4; cada 20 uL de meio (coletado 2 dias depois da transfecção). Marca-

dor = 5 [ú- de proteína padrão sinalizada com His BenchMark® (Invitrogen).. Painel B mostra um Western Blot de EPO do tipo selvagem de camundongopurificado sinalizado com His (mEPO), variantes do EPO hS3 e hS4 huma-no. mEPO foi quantificado com o ELISA de EPO de camundongo. 130 pg deEPO foram carregados no gel (anticorpo primário: rhEPO-Antikórper anticoe-

lho; Santa-Cruz).

A figura 10. Alinhamento das seqüências de aminoácidos dasvariantes EPO criadas recombinantemente (mutantes alfa-hélice) e identifi-cadas in vivo. Aqui, SEQ ID NO: 50 é a seqüência do tipo selvagem alfa-hélice humana; SEQ ID NO: 51 é hAmA (mutação pontual de alanina); SEQ ID NO: 52 é hAmE (mutação pontual de ácido glutâmico); SEQ ID NO: 53 é hA-10 (mutante por anulação) e SEQ ID NO: 54 é hA-20 (mutante por anulação).

A figura 11: citoproteção mediada por hEPO e hS3 em um mo-delo de isquemia consistindo em privação de soro e hipóxia em mioblastoscardíacos H9c2. Células H9c2 foram incubadas em meio DMEM privado desoro seja em condições normóxicas ou hipóxicas por 24 h.

Apoptose foi avaliada 24 h mais tarde por ensaio LDH. Os dados foram normalizados pelo ajuste da liberação de delta LDH delta de célulasnão-tratadas em condições normóxicas ou hipóxicas até 100%. A: diagramade coluna representando os valores médios da liberação de LDH normaliza-da. B: dados foram representados como um diagrama de "box plot" mos-trando a mediana (linha transversal à caixa), o 25° percentil (dobradiça infe-

rior), o 75° percentil (dobradiça superior), o valor máximo e o valor mínimo. Aquantidade de experimentos n = 7. P* < 0,001 (ANOVA1).

A figura 12: imunoprecipitação de variantes EPO usando um an-ticorpo anti-mEPO de R&D (cabra, marcado com biotina); A: detecção deuma segunda isoforma de EPO (30 KDa) em uma proteína de rim extraída de camundongos tratados com CoCI2 (129S6). B: bloqueio da interação an-ticorpo-antígeno por DarbpoietinA.

A figura 13. Neuroproteção mediada por eritropoietina alfa-hélice(hA; n = 4). 100/UL hA: 30 pM; 50 U/L de hA: 15 pM; hEPO: 30 pM = 100U/L; P* < 0,05; ANOVA1 versus controle. A figura 14. Neuroproteção mediada por várias isoformas de

EPO humanas (n = 6) P* < 0,05; ANOVA1 versus controle.

A figura 15. Neuroproteção mediada por variantes de anulaçãode alfa-hélice de eritropoietina (n = 6) P* < 0,05; ANOVA1 versus controle A:diagrama de coluna mostrando os valores médios da liberação de LDH nor-

malizada. B: "Box plot" mostrando os valores das medianas e percentis(25%, 75%) da liberação de LDH normalizada.

A figura 16. Efeitos das variantes EPO e do EPO humano decomprimento completo na produção de citocina induzida por LPS por macró-fagos humanos. Monócitos humanos purificados foram diferenciados em macrófagos na presença de rhu M-CS (50 ng/mL) por 6 dias. Macrófagos (1x 106/mL) foram pré-incubados com hS4, hS3 ou hEPO (300 mU/mL cada)por 3 h e, a seguir, estimulados com 10 ng/mL de endotoxina (LPS de E. coli51

i

! 0127:B8) por 4 h. A concentração de citocina nos sobrenadantes foi deter-

! minada por ELISA (Cytometric Beads Array , Becton Dickinson, Heidelberg,

Alemanha). Os dados são apresentados como média ± SD. "Resultadosdiferiram do grupo de controle (PBS) (p < 0,01; teste U de Mann-Whitney; n = 3 - 9 por grupo).

A figura 17: alinhamento das seqüências de ácido nucléico devariantes de anulação EPO.

A figura 18: seqüências de DNA de mutantes e variantes de anu-lação criadas de forma recombinante assim como hélice A do tipo selvagem(hélice A Hwt-epo). Aqui, SEQ ID NO: 55 é hA (hélice A do tipo selvagem),SEQ ID NO: 56 é hAmA (mutante de anulação com alanina), SEQ ID NO: 57é hAmE (mutante de anulação com ácido glutâmico), SEQ ID NO: 58 é hA-10 (mutante de anulação e hélice A menos 10 aa) e SEQ ID NO: 59 é hA-20(mutante de anulação de hélice A menos 20 aa). A figura 19: uma modalidade preferida em que as seqüências de

transporte líder são anuladas é demonstrada. A mostra a seqüência de hADNA sem líder como SEQ ID NO: 60. Essa é a proteína exportada madura.Ele também mostra a seqüência líder (SEQ ID NO: 63). B mostra o aminoá-cido hA sem líder como SEQ ID NO: 61 e a seqüência de aminoácidos da seqüência líder como SEQ ID NO: 62.. ExemplosSíntese de CDNA de EPO de murino

RNA foi isolado dos rins de camundongos C57BL/6 ou SV129S6do tipo selvagem ou de dois diferentes cérebros de camundongo (1 hora de- pois da apoplexia) por extração com trizol. O RNA foi precipitado com cloro-fórmio e isopropanol e finalmente dissolvido em DEPC-H20. DNA foi digeridopara o protocolo de DNase sem RNase RQ1 da Promega. A reação foi inter-rompida pela adição de 200 |iL de fenol/clorofórmio/álcool isopropílico(25/24/1) à mistura reacional e centrifugada por 10 min a 10000 rpm e 109C. O sobrenadante foi misturado com 200 jiL de clorofórmio/álcool isopropílico(24/1) e centrifugado por 10 min a 10000 rpm e 10QC. 20 \iL de cloreto delítio 8 M e 550 |iL de etanol absoluto foram adicionados ao sobrenadante.Essa mistura foi, a seguir, incubada por 1 h a -70eC e subseqüentementeprecipitada por 30 min por centrifugação a 11000 rpm e 0eC. O pélete resul-tante foi lavado com 600 uL de etanol 75%, centrifugado a 8000 rpm (49C,10 min) e seco a temperatura ambiente. O RNA foi dissolvido em 20 jllL de DEPC-H20.

A transcriptase reversa de vírus de leucemia de murino Monoley(MuLV, RNase menos H, comprada da Promega) foi empregada na síntesede CDNA do primeiro filamento em um volume reacional de 15 uL comDEPC-H2O compreendendo 3 u.g de RNA e 3 |iL de iniciador hexâmero alea- tório (10 jiM). A transcrição reversa foi executada com 6 (xL de tampão rea-cional M-MuLV (5 x), dNTP 2 (2,5 mM cada), 1 i± de inibidor da RNase(1 U/jllL), 1 uL de transcriptase reversa M-MuLV e 5 |iL de DEPC-H20 emuma máquina de PCR correndo o seguinte programa: 5 min a 21 eC; 1 ha379C; 5 min a 959C.

O "pool" de CDNA resultante foi usado par amplificar o CDNA de

EPO completo por uma aproximação de PCR "nested". A primeira etapaempregou iniciadores posicionados fora da região codificadora do gene EPO(genepo_sentido (SEQ ID NO 39) gaa ctt cca agg atg aag act tgc age e ge-nepo-anti-sentido; SEQ ID NO 40): gtg gea gea gea tgt cac ctg tc). A segun-

da etapa usou iniciadores projetados para amplificar o gene do códon deinício ao de parada, o qual se ligou aos sítios de clivagem BamHI para a clo-nagem subseqüente (epo_sentido (SEQ ID NO 41 tat gga tec atg ggg gtg cecgaa cgt cec ac e epo_antisentido (SEQ ID NO 42 tat gga tec tca cet gtc cectet cet gea gac). Todos os iniciadores foram da MWG-Biotech AG. Um PCR

nested foi efetuado em uma máquina PCR Hybaid em dois etapas, primeiroPCR (3 min a 959C; 35 ciclos; 30 seg a 659C, 1 min a 72SC, 30 seg a 959C;10 min a 729C; 49C de parada) e um segundo PCR (3 min a 95eC; 5 ciclos: seg a 679C, 1 min a 729C, 30 seg a 959C; 15 ciclos: 30 seg a 709C, 1 mina 729C, 30 seg a 959C; 10 min a 729C; 49C).

Em ambos os PCRs, a DNA Polimerase Pfu Turbo Hotstart (S-

tratagene) foi usada de acordo com o protocolo do fabricante. O produto dePCR do primeira etapa foi diluído 1:50 para o segundo PCR. Um segundoprotocolo de síntese de CDNA foi efetuado usando o sistema RT-PCR deacesso (Invitrogen) com os seguintes parâmetros: 48°C por 5 min; 94°C por2 min; 40 ciclos: 94°C por 30 seg, 65°C por 1 min, 70eC por 2 min; 70°C por7 min; 4°C. O segundo PCR foi efetuado conforme descrito acima. O CDNA de EPO de comprimento total amplificado e os isôme-

ros EPO foram separados em um gel de TAE-agarose 1,2%. Uma figura dosvários produtos de PCR é mostrada na figura 1a. Os fragmentos foram, aseguir, purificados usando o sistema de limpeza total Wizard SV-Gel (Pro-mega) ou o Kit de Extração de Gel (Qiagen, Hilden, Alemanha). Uma vez

que a Pfu polimerase gera produtos terminais cegos, o CDNA foi subclonadono vetor ll-TOPO pCR-Cego (pCR-Blunt) usando células Top10 One Shotquimicamente competentes da (ambas da Invitrogen).

DNA de plasmídeo foi isolado de colônias individuais pelo uso dokit de preparação QIA da Qiagen. As inserções foram seqüenciadas em um

seqüenciador de DNA ALFexpress® (Pharmacia Biotech) usando o kit deseqüenciamento de ciclo de iniciador (Primer Cycle Sequencing Kit) ThermoSequenase® (Amersham Biosciences). Os iniciadores M13FWDCY (SEQ IDNO 43: gtc gtg act ggg aaa acc ctg gcg) e M13REVCY (SEQ ID NO 44 agegga taa caa ttt cac aca gga) foram marcados com Cy5. Os parâmetros para

o seqüenciamento foram: t = 900 min; T = 55QC; 800 V; 55 mA e 30 W. A. análise de seqüência revelou a existência de uma nova variante de EPOsem o éxon 4 e três variantes internamente anuladas. As seqüências de nu-cleotídeos estão demonstradas na figura 2a e figura 2b e as seqüências depeptídeo codificadas estão demonstradas na figura 4. A seqüência de nucle-

otídeo e de peptídeo da variante EPO mS corresponde à SEQ ID NO 13 eSEQ ID NO 14, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo e peptídeo davariante EPO mG3 corresponde à SEQ ID NO 15 e SEQ ID NO 16, respecti-vamente. A seqüência de nucleotídeo e peptídeo da variante EPO mG5 cor-responde à SEQ ID NO 17 e SEQ ID NO 18, respectivamente. A seqüência

de nucleotídeo e peptídeo da variante EPO m301 corresponde à SEQ ID NO19 e SEQ ID NO 20, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo e peptí-deo da variante EPO mK3 corresponde à SEQ ID NO 21 e SEQ ID NO 22,respectivamente.

Síntese do CDNA de EPO humano

Poli A + RNA de rim adulto humano (macho) e cérebro fetal (ma-cho) foi comprado da Stratagene. CDNA foi gerado de 250 ng de RNA de rim ou 200 ng de RNA de cérebro de acordo com a transcriptase reversa de ví-rus de leucemia de murino Moloney (MuLV, RNase menos H) conforme des-crito acima. O "pool" de CDNA resultante foi usado para amplificar o CDNAde EPO completo usando Pfu polimerase (Stratagene) com os seguintesiniciadores: Hepo_sentido (SEQ ID NO 45): gat ggg ggt gca cga atg tcc tgc e

Hepo_antisentido (SEQ ID NO 46): cac acc tgg tca tct gtc ccc tgt c.

O PCR foi efetuado em uma máquina de PCR da Invitrogen (3min a 95QC; 35 ciclos; 30 seg a 67-C, 1 min a 729C, 30 seg a 95gC; 10 min a72eC). No caso de CDNA de cérebro fetal, uma aproximação de PCR nestedfoi usada, efetuando um segunda etapa de amplificação no produto de PCR de 20 ciclos. Os produtos de PCR amplificados foram separados em um gelde TAE-agarose 1,2% (figura 1b) e purificados usando o Kit de Extração deGel (Qiagen, Hilden, Alemanha). O CDNA purificado foi subclonado no vetorll-TOPO de pCR-cego (pCR-Blunt) usando células Top10 One Shot quimi-camente competentes (ambos da Invitrogen). DNA de plasmídeo foi isolado de colônias individuais pelo uso do kit de preparação QIA (Qiagen, hilden,Alemanha). As inserções foram seqüenciadas em um seqüenciador de DNAALFexpress® (Pharmacia Biotech) usando o kit de seqüenciamento de ciclode iniciador Thermo Sequenase® (Amersham Biosciences). Os iniciadoresM13FWDCY (SEQ ID NO 43) e M13REVCY (SEQ ID NO 44) foram marca- dos com Cy5. Os parâmetros para o seqüenciamento foram: t = 900 min; T =55eC; 800 V; 55 mA e 30 W. A análise de seqüência revelou a existência dedois novos variantes de EPO sem o éxon 3 e a primeira metade do éxon 4,respectivamente, e uma variedade de variantes que seguem a regra de trí-meros ou hexâmeros repetidos conforme detectado no camundongo. As se- qüências de nucleotídeos estão demonstradas na figura 3a e na figura 3b eas seqüências de peptídeos codificadas estão mostradas na figura 4. A se-qüência de nucleotídeo e de peptídeo da variante EPO hS3 corresponde àSEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, respectivamente. A seqüência de nucleotídeoe peptídeo da variante EPO h1-4 corresponde à SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO4, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo e peptídeo da variante EPO1-5 corresponde à SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, respectivamente. A se- qüência de nucleotídeo e peptídeo da variante EPO hS4 corresponde à SEQID NO 7 e SEQ ID NO 8, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo epeptídeo da variante EPO h1-1 corresponde à SEQ ID NO 9 e SEQ ID NO10, respectivamente. A seqüência de nucleotídeo e peptídeo da varianteEPO h2-1 corresponde à SEQ ID NO 11 e SEQ ID NO 12, respectivamente.

Expressão das proteínas sinalizadas com His nas células HEK

Sítios de restrição BamHI e EcoRI para clonagem foram adicio-nados tanto às variantes EPO de camundongo quanto de humanos pelo usode projeções de iniciadores sentido e projeções de iniciadores anti-sentidosem códon de parada (para variantes de camundongo: epo_sentido (SEQ ID

NO 41) e epoeco_anti-sentido (SEQ ID NO 47): aaa gaa ttc cct gtc ccc tct cctgca gac etc; para variantes humanas; hepobam_se (SEQ ID NO 48): tat ggatec atg ggg gtg cac gaa tgt cc, hepoeco_as [SEQ ID NO 49]: aga gaa ttc tctgtc ccc tgt cct gca g). Os produtos de PCR foram clonados em pcDNA-3.1-HIS/V5 A (Invitrogen) usando os sítios de restrição BamHI e EcoRI. Os

plasmídeos foram amplificados em células XL-1 azul competentes (recAI. endAI gyrA96 thil hsdR17 supE44 relAI lac [F proAB laclqZAM15 Tn10 (Te-tR)]) (Stratagene). O protocolo de transformação das células XL-1 azul com-petentes foi efetuado sem [3-mercaptoetanol e com um pulso de aquecimen-to prolongado de 60 segundos. DNA de plasmídeo foi extraído usando o Kit

de Minipreparação QIAprep (Qiagen, Hilden, Alemanha). Para transfecçãoem células de mamíferos o DNA foi extraído usando o Kit Maxi de PlasmídeoEndoFree (Qiagen, Hilden, Alemanha). Células HEK 293 (BD biosciences)cresceram por 18 dias em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM; Bio-chrom, Berlim, 1 g/1 de glicose, 3.7 g/L de NaHC03; suplementado com 10%

de soro de bezerro fetal GOLD, 1% de penicilina/estreptavidina e 1% de L-glutamina) em frascos de cultura de tecido (25 cm2) a 37eC e 5% de C02. Ascélulas foram divididas a cada 2-3 dias depois de alcançar 80 - 90% deconfluência. Na DIV18, 120.000 células foram plaqueadas por cavidade emuma placa de 12 cavidades contendo meio Eagle modificado da Dulbeccosem antibióticos. As células cresceram por aproximadamente 48 h até 50%de confluência. A transfecção foi efetuada com Lipofectamine 2000 (Invitro- gen) adaptando o protocolo fornecido para células HEK.

O meio de plaqueamento das células HEK foi substituído 10 mi-nutos antes da transfecção por DMEM sem soro sem antibióticos. As célulasforam incubadas 5 h a 37eC com exemplos DNA-lipofectamina. O meio foi, aseguir, alterado para um DMEM contendo soro fresco sem antibióticos. Na DIV12, as células foram divididas e plaqueadas em Eagle modificado daDulbecco com antibióticos.

Expressão e purificação de variantes EPO sinalizadas com His

Proteínas sinalizadas com His foram expressas de forma transi-tória em células HEK. Meio das células HEK293 foi coletado 2-6 dias de-

pois da transfecção com constructos - pcDNA-3.1-HIS/V5 A. Os fragmentoscelulares foram peletizados a 3500 rpm, 4SC por 15 min. Resina de Afinidadecom Metal BD TALON® (BD Biosciences) foi usada para purificação de pro-teínas sinalizadas com his. Todas as etapas (equilírio, lavagem e eluição)foram efetuadas em pH 7,1. O protocolo fornecido foi modificado para uma

etapa de ligação de um dia para o outro prolongado a 49C. O eluato foi cole-tado em frações de 500 uL. As frações foram analisadas por Western Blotsusando um anticorpo anti-rhEPO da Santa Cruz ou um Kit de ELISA de EPOde murino (R&D). Imidazol foi removido das frações contendo proteína u-sando colunas dessalinizadoras HiTrap® (5 ml_) da Amersham Biosciences

de acordo com o protocolo dos fabricantes. Isso incluiu uma alteração dotampão para PBS.Western Blot

Um gel SDS 16% foi preparado usando protocolos padronizadose correu a 110 V. O "blot" foi feito em membranas de nitrocelulose por 45 min a 200 mA. O "blot" foi bloqueado por pelo menos uma hora em tampãode bloqueio contendo 5% de leite em pó desnatado em 0,1% de Tween-20.A incubação com o primeiro anticorpo (IgG policlonal de coelho EPO (H-162)sc-7956, Santa Cruz, 1:500) foi efetuada de um dia para o outro a 4QC. Oanticorpo secundário (HRP anti-coelho de cabra; 1:1000) foi adicionado por2 horas em temperatura ambiente. O "blot" foi descrito pelo uso de Luminol;as fotos foram expostas por 2 minutos. As membranas oram manchadas com Vermelho Ponceau. O anticorpo EPO específico foi capaz de detectartodas as variantes EPO.Ensaio de formação de colônia eritróide

Células da medula óssea foram coletadas da tíbia e fêmur decamundongos machos C57BL/6 (8-11 semanas) e ressuspensas em meio a (suplementado com 10% de soro de bezerro fetal GOLD, 1% de penicili-na/estreptavidina e 1% de L-glutamina). As células foram semeadas em pla-cas de Petri de 35 mm2 (225.000 células/plaaca) contendo 8 partes de metil-celulose Metho Cult SF 3236 ((StemCell Technologie Inc), 1 parte de célulase 2 partes de meio a misturado com meio pré-condicionado de célula HEK contendo os derivados EPO (150 U/L no caso de EPO de murino). 150 U/Lde rhEPO (Roche) foi usado como controle positivo. As placas foram incu-badas a 37QC em uma atmosfera umidifiçada contendo 5% de CO2 por 48. horas. Para avaliação, somente as colônias avermelhadas contendo pelomenos 6 células hemoglobinizadas foram levadas em consideração.

Potencial hematopoiético das variantes EPO

Metho Cult SF 3236 dispara a formação de colônias (CFU-M,CFU-G ou CFU-E) somente depois da adição das citocinas apropriadas. Aformação da CFU-E (unidade de eritroblasto formadora de colônia) pode serobservada, depois da adição de eritropoietina, depois de 2 dias. As peque- nas colônias avermelhadas irregulares desaparecem pelo dia 3.

Nesse ensaio, o potencial hematopoiético das variantes foi tes-tado e comparado com a forma de tipo selvagem do EPO, assim como dorhEPO. As seguintes condições foram preparadas por comparação: meiodas células HEK transfectado com pZ/EG como controle negativo, meio das células HEK transfectado com células pZ/EG mais 150 U/L de rhEPO (Ro-che) como um controle positivo, e meio das células HEK transfectado oucom pZ/EG-EPO-IRES (150 U/L de EPO murino), pZ/EG-união-IRES (vari-ante S; mS) ou pZ/EG-G3-IRES (variante G3; mG3). Na DIV2 somente ascolônias avermelhadas foram contadas contendo pelo menos 6 células he-moglobinizadas. Os resultados dos três experimentos independentes estãodemonstrados na figura 5. Em comparação com EPO de murino e rhEPO, as variantes de

EPO de murino (variante mG3 e mS) não tiveram potencial hematopoiético.Culturas neuronais primárias

Culturas neuronais primárias de rato foram obtidas dos E16 atéos embriões iniciais E19 de ratos Wistar (Bundesinstitut fur gesundheitlichen

Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, Berlim, Alemanha). Os neurôniosde camundongo que expressam Cre foram obtidos dos embriões E16 decamundongos transgênicos heterozigóticos expressando Cre-recombinasesob o controle do promotor a-1 de tubulina (fornecido pelo Dr. U. Schweitzer;Experimental Endocrinology, Charité). Culturas de rato e murino foram pre-

paradas de acordo com um protocolo modificado de Brewer (1995) J Neu-rosci Res. 42: 674-83. O córtex cerebral foi isolado depois da remoção dasmeninges e rinsado duas vezes em PBS (Biochrom, Berlim, Alemanha). De-pois de 15 min de incubação em tripsina/EDTA (0,05/0,02% p/v em PBS) a37QC, os tecidos foram rinsados duas vezes em N-Med (meio Eagle modifi-

cado da Gibco com 10% de soro de bezerro fetal, 100 U de penicilina maisestreptomicina da Biochrom, L-glutamina 2 mM, 100 IE de insulina/L, HEPES10 mM e glicose 44 mM) e dissociados cuidadosamente em um pequenovolume de N-med usando uma pipeta Pasteur. As células foram peletizadasem temperatura ambiente por 2 min de centrifugação a 210 g e ressuspen- sas em meio iniciador NBM (meio neurobasal da Gibco com B27 2% suple-mentado da Gibco, 1% de Pen/Strep, L-glutamina 0,5 mM e glutamato 25 \jM).Preparação de placas de cultura

Placas de 24 cavidades e placas de 6 cavidades foram pré-tratadas por incubação de um dia para o outro a 4eC com poli-L-lisina da Bi-

ochrom (2,5 ug/mL em PBS). A rinsagem das cavidades com PBS foi segui-da por 1 h de incubação a 37eC com meio de revestimento (meio Eagle mo-dificado com 5% de FCS Gold de PAA, 1% de Pen/Strep, HEPES 10 mm e0,03 p/v de colágeno G da Biochrom), a seguir as cavidades foram cuidado-samente rinsados duas vezes com PBS. O volume e o tipo do meio de pla-queamento foram escolhidos dependendo do procedimento experimental.Privação de oxigênio glicose em neurônios corticais primários de rato - um modelo de cultura celular de isguemia cerebral

Para OGD, o meio de cultura foi removido por lavagem pela rin-sagem de uma vez com PBS. OGD foi induzida com 500 jiL de uma soluçãoaglicêmica desoxigenada (BSSo-02; 143,8 mM de Na+, 5,5 mM de K+, 1,8mM de Ca2+, 0,8 mM de Mg2+, 125,3 mM de Cl", 26,2 mM de HC03" e 0,8 mM de S042", pH 7,4) em uma atmosfera hipóxica gerada por um incubadorque não permite a entrada ou saída de gás umidificado (Concept 400, Rus-kinn Technologies, Bridgend, RU) esguichado com uma mistura de gás con-tendo 5% de C02, 85% de N2 w 10% de H2. O tempo de OGD dependeu dadensidade e da idade da cultura e variou entre 2 h 30 min e 2 h 40 min. Em experimentos de controle, as cavidades foram tratadas com 500 jjL da solu-ção de BSS0 glicêmica oxigenada (BSS0+O2; 143,8 mM de Na+, 5,5 mM deK+, 1,8 mM de Ca2+, 0,8 mM de Mg2+, 125,3 mM de Cl", 26,2 mM de HC03",0,8 mM de S042" e 20 mM de glicose, pH 7,4) e incubados a 37QC em umaatmosfera normóxica contendo 5% de C02. Imediatamente após OGD, os controles e as células tratadas foram alterados da solução de BSS para 500. \xL de meio contendo 40% de NBM condicionado mais 60% de NBM fresco.Depois de 24 h, a atividade da lactato desidrogenase (LDH) foi medida nossobrenadantes como um indicador de morte celular.

Para a medição de LDH, 25 |iL de meio foi misturado com 100 uL de solução de p-NADH fresco (0,15 mg/mL em tampão 1 x LDH; Sigma,forma reduzida) em placa de 96 cavidades (Greiner). 25 uL de piruvato 22,7mM (Sigma) foi adicionado imediatamente antes da colocação da placa noleitor (Thermo Labsystems; MRXTC Revelation). Os parâmetros foram esco-lhidos como se segue: filtro de 340 nm, tempo de agitação: 5 seg, intervalo: 30 seg, contagens: 10. A concentração de LDH foi calculada proporcional-mente ao padrão de LDH (Greiner, calibrador de sistema).Indução da neuroproteção por meio condicionado a partir de células HEK293transfectadas expressando variantes EPO

Nos seguintes experimentos rhEPO (EPO recombinante humanoda Sigma Aldrich, Deisen-hofen, Alemanha) foi usado como um controle po-sitivo. Ensaios de neuroproteção estão esquematicamente demonstrados na figura 6. Os neurônios foram plaqueados em placas de 24 cavidades emuma densidade de 300.000 células em um volume final de 600 \iL de meioiniciador NBM. Depois de 4 dias, 200 |il_ do meio foram substituídos por 250|j.L de NBM fresco (o mesmo que o NBM iniciador sem glutamato).

Para o pré-tratamento com rhEPO, mEPO de tipo selvagem,

hEPO de tipo selvagem ou variantes EPO, o meio foi removido até um volu-me final de 200 \xL e enchido com 200 jiL de NBM+B27 contendo quantida-des equimolares (correspondendo a 200 U/L de rhEPO) de EPO e variantesEPO, respectivamente. Concentrações equivalentes das várias variantesEPO (assim como mEPO e hEPO) no meio condicionado de células HEK293

foram estimadas por Western blot e Elisa-EPO. Depois disso, os neurônioscresceram por 48 h sob condições umidificadas e normóxicas a 37eC antesda privação de oxigênio e glicose (OGD) ser efetuada (intervalo de OGDconforme indicado). A morte celular foi avaliada 24 h depois de OGD pelamedição da liberação de LDH. A redução na liberação de LDH, em compa-

ração com os neurônios falsamente tratados (meio das células HEK293transfectado com o plasmídeo da estrutura; ko; 100%) é uma medida quanti-tativa da neuroproteção. Em todos os experimentos observou-se um efeitoneuroprotetor mais robusto fornecido pelas variantes EPO, se comparadocom EPO do tipo selvagem (wt) (ver figura 7 painel A e B para EPO de muri-

no e suas variantes e figura 8 painel A e B para EPO humano e suas variantes).

A neuroproteção induzida pelas variantes de EPO de murino émais robusta do que aquela induzida pelo EPO (rhEPO assim como EPO decamundongo do tipo selvagem). Por exemplo, a neuroproteção mediada porEPO pode somente ser observada em uma janela claramente definida de

extensão OGD (correspondendo a um nível de dano claramente definido).Em baixa concentração, a neuroproteção por hS3 e hS4 foi igual ou melhor àneuroproteção de wt hEPO. no total, a neuroproteção induzida pelas varian-tes é mais forte do que aquela induzida pelo rhEPO. Além disso, as varian-tes têm um potencial neuroprotetor mais elevado do que tanto as formas dotipo selvagem mEPO quanto hEPO, as quais foram produzidas pelo mesmoprocedimento que as variantes EPO. H9c2 - modelo de isquemia

A linhagem celular de mioblasto de coração BDIX de rato (obtidada European Collection of Cell Cultures) foi cultivada em DMEM (biochrom)contendo 4,5 g/L de glicose suplementado com L-glutamina 2 mM, 10% desoro de bezerro fetal inativado e 1% de penicilina-estreptavidina. Culturas subconfluentes (70%) foram subcultivadas 1:4. As células foram plaqueadasem 400 |iL de meio contendo hEPO ou hS3 120 pM, respectivamente, emuma densidade de 15.000 células por cavidade em placas de 24 cavidades ecultivadas por 48 horas. Hipóxia foi alcançada pelo cultivo das células em400 |iL de DMEM deficiente de soro contendo 4,5 g/L de glicose suplemen- tado com L-glutamina 2 mM e 1% de penicilina/estreptavidina e deixando-aspor 24 horas em uma estação de trabalho anaeróbica (Concept 400, RuskinnTechnologies, Bridgend, RU) saturada com uma mistura de gás contendo5% de C02, 85% de N2 e 10% de H2 a 37eC. As células de controle foramdeixadas em DMEM deficiente de soro em um incubador normóxico. No fim

do experimento o meio foi substituído para 400 pL de DMEM deficiente de. soro fresco e LDH foi medida de acordo com os protocolos padronizados 24horas antes.Imunoprecipitacão

Camundongos 129S6 machos ou camundongos C57BI6 machos

(8-10 semanas, Bundesinstituts fur Risikobewertung, Berlim) com livre a-cesso para comida e água foram usados para os experimentos. C0CI2 foiinjetado subcutaneamente em uma dose de 60 mg/Kg e os animais forammortos 18 horas mais tarde. A expressão de proteína foi medida nos extratosde proteína de soro, rim e cérebro por um ELISA comercialmente disponível

(R&D, mEPO).

Anticorpos para a imunoprecipitacão foram comprados da R&D(anticorpo anti-mEPO, cabra, marcado com biotina) e Santa-Cruz (anti-rhEPO, coelho). A imunoprecipitação foi efetuada de acordo com os protoco-los padronizados e avaliada por western blot).

O bloqueio do anticorpo de detecção do western blot foi conse-guido por duas horas de incubação com 10 u.g de darbpoietina A em tempe- ratura ambiente antes da incubação em "blot".Geração de mutantes de alfa-hélice (figura 10)

Mutantes de alfa-hélice humanos foram todos gerados por apro-ximações baseadas em PCR usando protocolos padronizados.

Mutante A (hAmA) e mutante E (hAmE) são variantes da alfa- hélice com troca de aminoácido na posição 41 (arginina). A seqüência deCDNA foi alterada de AGG para GCG para o mutante A (alanina) ou paraGAG para o mutante E (glutamato) - 20aa e -10aa são variantes de anula-ção da alfa-hélice sem 20 aminoacidos ou 10 aminoacidos, respectivamente,no c-terminal. Todos os mutantes foram gerados sem V5 e sinalizados com His e expressos em células HEK 293. Experimentos de neuroproteção foramefetuados conforme descrito anteriormente usando meio de células HEKtransfectado expressando as diferentes variantes.

Citoproteção mediada por hEPO e hS3 em um modelo de isquemia em célu-las H9c2 (figura 11)

O potencial citoprotetor das variantes EPO foi mostrado de for-

ma exemplar para hEPO e hS3 purificado em um modelo de isquemia con-sistindo em privação de soro e hipóxia em mioblastos cardíacos H9c2 (figura1). A liberação de LDH foi avaliada como um marcador de morte celular a-poptótica. Descobriu-se capacidades citoprotetoras para ambas as variantes

(aproximadamente 20% e 25% para hEPO e hS3).

Imunoproteção descreve a isoforma de união EPO em extratos de proteínade rim de camundonqos tratados com CoCI? (figura, 12)

Para reforçar nossa descoberta das isoformas de união EPO emtecidos de murino e humano por uma aproximação baseada em PCR efetu- ou-se a imunoprecipitação no soro de murino, extratos de proteína de cére-bro e rim de camundongos tratados com C0CI2 usando anticorpos testadospara reconhecer ambas as isoformas. Injeção subcutânea de C0CI2 é co-nhecida por aumentar os níveis de eritropoietina em vários tecidos de ca-mundongo, a saber sangue, cérebro, fígado e rim.

Foi-se capazes de precipitar eritropoietina (aproximadamente 40KDa) de extratos de proteína de soro, cérebro e rim de camundongos trata- dos de CoCI2 (figura 2); a precipitação de eritropoietina de um extrato de pro-teína de rim de um camundongo não-tratado falhou devido ao baixo nível deexpressão. Além disso, foi-se capaz de provar a existência de uma segundaproteína menor (aproximadamente 30 KDa) no extrato de proteína de rim decamundongos tratados com CoCI2. Essa proteína é especificamente reco- nhecida pelo anticorpo anti-rhEPO conforme mostrado pelo bloqueio comple-to da interação antígeno-anticorpo com Darbpoietina A. Essas descobertassuportam fortemente a existência de uma isoforma de união de eritropoietinade murino. Esses resultados foram produzidos em uma segunda cepa decamundongo, a saber, C57BI6.

Neuroproteção mediada por diferentes isoformas da alfa-hélice de eritropoie-tina (figura 13)

Analisando os potenciais neuroprotetores das variantes de eri-tropoietina até aqui identificadas sugeriu-se que a alfa-hélice é o domíniofuncionalmente importante para o caráter neuroprotetor da eritropoietina. Para testar essa hipótese, expressou-se uma forma encurtada de eritropoie-. tina humana, a saber o domínio alfa-hélice, em células HKE 293 e testou-seesse peptídeo no modelo de OGD. Descobriu-se um potencial protetor equi-valente com 30 pM e 15 pM desse peptídeo para 30 pM do hEPO conformemostrado na figura 13. Para identificar os resíduos funcionais importantes nos domínios

de alfa-hélice de eritropoietina humana gerou-se diferentes mutantes de eri-tropoietina contendo ou trocas de aminoácido (hAmA e hAmE) ou anulaçõesde domínio completas (hA-10 e hA-20).

Nem a troca de aminoácido neutro ou ácido na posição 41 foi capaz de destruir o potencial neuroprotetor da alfa-hélice no nosso modeloOGD (figura 14).

Neuroproteção mediada por várias isoformas de EPO humano (n= 6) P* < 0,05; ANOVA1 versus controle (figura 14).

Variantes de anulação sem 10 ou 20 aminoácidos no c-terminalda alfa-hélice foram expressas em células HEK293 e também testadas nomodelo de OGD. A variante de anulação hA-10 ainda tinha propriedades neuroprotetoras compráveis com a isoforma de união de hS3. A anulação de20 aminoácidos (hA-20) levou a um peptídeo que não foi mais protetor (figu-ra 15).

Imunomodulação por variantes de eritropoietina humana (figura 16)

As variantes de EPO humano hS3 e hS4 exibem fortes efeitos

imunomodulatórios. Nos macrófagos humanos estimulados com a endotoxi-na lipopolissacarídeo (LPS) hS3 e hS4 induzem a citocina antiinflamatória IL-10 e reduzem a expressão das citocinas proinflamatórias IL-6 e IL-8. Emcomparação o EPO, os efeitos antiinflamatórios de hS3 e hS4 são muitomais pronunciados. Essas propriedades antiinflamatórias das variantes EPO

são úteis no tratamento de doenças inflamatórias (por exemplo, esclerosemúltipla, infecções virais e bacterianas, sepsia) e degenerativas (por exem-plo, apoplexia, enfartes do miocárdio).Listagem de Seqüência

<110> Charité - Universitátsmedizin Berlin

<120> VARIANTES DE ERITROPOIETINA

<130> U60011PCT ■<160> 63

<170> Patentln Versão 3.3

<210> 1

<211> 495

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacgg tcgggcagca ggccgtagaa 180

gtctggcagg gcctggccct gctgtcggaá gctgtcctgc ggggccaggc cctgttggtc 240

aactcttccc agccgtggga gcccctgcag ctgcatgtgg -ataaagccgt cagtggcctt 300

cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg cgagcccaga aggaagccat ctcccctcca 360

gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca atcactgctg acactttccg caaactcttc 420

cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg 480

acaggggaca gatga 495

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala. Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10- " '15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu" Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Vai Gly Gln Gln Ala Vai Glu Vai Trp Gln50 55 60

Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Vai Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu

65 70 75 80Vai Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Vai Asp Lys

85 90 95

Ala Vai Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly100 105 110

Ala Gln Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro115 120 125

Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr130 135 140

Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys145 . 150 155

Arg Thr Gly Asp Arg160 164

<210> 3

<211> 525

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3 . e

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct' gtgacagccg agtcctggag . 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggaggtcg ggcagcaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga gcccctgcag 300

ctgcatgtgg atãaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg 360

ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca 420

atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag 480

ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatga 525

<210> 4

<211> 174

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60

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Met Glu Vai Gly Gln Gln Ala Leu Leu Vai Asn Ser Ser Gln Pro Trp85 90 95

Glu Pro Leu Gln Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser Gly Leu Arg Ser100 105 110

t--

Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala lie Ser115 120 125

Pró Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp130 135 140

Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn; Phe Leu Arg Gly Lys145 150 . 155 160

Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

<21Ó> 5

<211> 495

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atgggggtgc acgaacgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgág aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc cctgttggtc 240

aactcttccc agccgtggga gcccctgcag ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt 300

cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca 360

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cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg 480

acaggggaca gatga 49568

<210> 6

<211> - 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Gly Vai Kis Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu■35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60

Asn lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Leu Leu Vai65 70 75 80

Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Vai Asp Lys Ala85 90 95

Vai Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala100 105 110

Gln Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu115 120 125

Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser130 135 140

Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg145 150 155 160

Thr Gly Asp Arg

<210> 7

<211> 489

<212> DNA"

<213> Homo sapiens

<400> 7

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 18069

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggagccgt gggagcccct gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg ccttcgcagc 300

ctcaccactc tgcttcgggc tctgggagcc cagaaggaag ccatctcccc tccagatgcg 360

gcctcagctg ctccactccg aacaatcact gctgacactt tccgcaaact cttccgagtc 420

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gacagatga 489

<210> 8

<211> 162

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60

Asn lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai "Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80

Met Glu Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser85 90 95

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys100 105 110

Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro-Leu Arg Thr115 120 125

lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe130 135 140

Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly145 150 155 160

Asp Arg<210> 9

<211> 475

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

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ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatga 475

<210> 10

<211> 87

<212> .PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1. 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60 -

Asn lie Thr Vai Pro Gly Pro Vai Gly Gln Leu Phe Pro Ala Vai Gly65 70 75 80

Ala Pro Ala Ala Ala Cys Gly85

<210> 11

<211> 301

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

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agcttgaatg agaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa ctcttccgag tctactccaa 240

tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc tgcaggacag gggacagatg 300

a 301

<210> 12

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Gly Vai His GÍu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1.5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60

Asn Asn His Cys65

<210> 13

<211> 399

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 13

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

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ctgtacacgg gagaggtctg caggagaggg gacaggtga 399

<210> ■ 14

<211> 132

<212> PRT

<213> Mus musculus72

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

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<210> 12

<211> 68

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<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

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Asn Asn His Cys65

<210> 13

<211> 399

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 13

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ctgtacacgg gagaggtctg caggagaggg gacaggtga 399

<210> ■ 14

<211> 132

<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 14

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15

Leu lie Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu lie20 25 30

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Glu Asn Vai Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn50 55 60

lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80

Glu Lys Glu Leu Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu85 90 95

Arg Thr Leu Thr Vai Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ala100 105 110

Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr • Gly Glu Vai Cys Arg115 120 125

Arg Gly Asp Arg130

<210> 15

<211> 387

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 15

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ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagccatc 300

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gaggtctgca ggagagggga caggtga 387

<210> 16<211> 128<212> PRT<213> Mus. musculus<400> 16

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu15 10 15

Leu lie Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu lie20 25 30

Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr lie Leu Glu Ala Lys Glu Ala35 40 45

Glu Asn Vai Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn.50 55 60

lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80

Glu Vai Glu Glu Gln Ala lie Glu Vai Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu85 90 95

Ser Glu Ala lie Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Phe Leu Arg100 105 110

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu. Vai Cys Arg Arg Gly Asp Arg115 120 125

<210> 17

<211> 513

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 17

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120"

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

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gtggatactt tctgcaggag aggggacagg tga 513

<210> 18<211> 170<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 .5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile20 25 30

Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala35 40 45

Glu Asn Vai Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn50 55 60

Ile Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80

Glu Vai Glu Glu Gln Ala Ile Glu Vai Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu85 90 95

Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln100 105 110

Pro Pro Glu Thr Leu Gln Leu His Ile Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu115 120 125

Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Vai Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu130 135 140

Met Ser Pro Pro Asp. Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Arg Thr Leu Thr145 150 155 160

Vai Asp Thr Phe Cys Arg Arg■Gly Asp Arg165 170

<210> 19

<211> 279

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 19

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattçctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tcctccgggg gaaactgaag 240ctgtacacgg gagaggtctg caggagaggg gacaggtga 279

<21Ò> 20

<211> 92

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15

Leu lie Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu lie20 25 30

Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr lie Leu Glu Ala Lys Glu Ala35 40 45

Glu Asn Vai Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn50 55 60

lie Thr Vai Fro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys65 70 75 80

Leu Tyr Thr Gly Glu Vai Cys Arg Arg Gly Asp Arg85 90

<210> 21

<211> 591

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 21

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagctgta 300

cacgggagag gtctgcagga gaggggacag gtgacatgct gctgccaccg tggtggaccg 360

acgaacttgc tccccgtcac tgtgtcatgc caaccctcca ccactcccaa ccctcatcaa 420

acgggtcatt accttcttac cagtctgtcc catggacact ccagcaccag cagtgacatc 480

ctcggggcca gaagaacttc ccagagctcc attctgaaat ctaaagatgt cgctggacaa 540

gcccgaggcc ccagagaaga agagcctcag aatcagctcg gatttgttta g 591

<210> 22<211> 196<212> PRT " * ■

<213> Mus musculus

<400> 22

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 '5 10 15

Leu lie Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu lie20 25 30

Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr lie Leu Glu Ala Lys Glu Ala35 40 45

Glu Asn Vai Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly'Pro Arg Leu Ser Glu Asn50 55 60

Ilè, Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80

Glu Vai Glu Glu Gln Ala lie Glu Vai Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu85 90 95

Ser Glu Ala Vai His Gly Arg Gly Leu Gln Glu Arg Gly Gln Vai Thr100 105 110

Cys Cys Cys His Arg Gly Gly Pro Thr Asn Leu Leu Pro Vai Thr Vai115 120 , 125

Ser Cys Gln Pro Ser Thr Thr Pro Asn Pro His Gln Thr Gly His Tyr130 135 140

Leu Leu Thr Ser Leu Ser His Gly His Ser Ser Thr Ser Ser Asp lie145 150 155 160

Leu Gly Ala Arg Arg Thr Ser Gln Ser Ser lie Leu Lys Ser Lys Asp165 170 175

Vai Ala Gly Gln Ala Arg Gly Pro Arg Glu Glu Glu Pro Gln Asn Gln180 185 190

Leu Gly Phe Vai195

<210> 23

<211> 159

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg ágtcctggag 120aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210> 24

<211> 53

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 * 45

Ala Glu Asn lie Thr50

<210> 25

<211> 225

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg ágtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgt.cccagac accaaagtta atttc 225

<210> 26 -

<211> 82

. <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60

Asn lie Thr Vai Pr o Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80

Met Glu

<210> 27

<211> 243

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 27-

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tçtggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 24 0

gag 2 43

<210> 28

<211> 81

<212> PRT

<213> Mus

<400> 28

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15

Leu lie Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu lie20 25 30

Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr lie Leu Glu Ala Lys Glu Ala35 40 45

Glu Asn. Vai Thr Jíet Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn50 55 60

lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80

Glu

<210> 29<211> 326<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 29

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcçtcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagccatc 300

ctgcaggccc aggccctgct agccaa 326

<210> 30

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

Met Gly Vai Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15

Leu lie Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu lie20 25 30

Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr lie Leu Glu Ala Lys Glu Ala35 40 45

Glu Asn Vai Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn50 55 60

lie Thr Vai Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80

Glu Vai Glu Glu Gln Ala lie Glu Vai Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu85 90 95

Ser Glu Ala lie Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn100 105

<210> 31

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31

gtcgggcagc aggccgtaga agtctggcag ggcctggccc tgctgtcgga agctgtcctg 60

cggggccagg ccctgttggt caactcttcc cagccgtggg agcccctgca gctgcatgtg 120

gataaagccg tcagtggcct tcgcagcctc accactctgc ttcgggctct gggagcccag 180aaggaagcca tctcccctcc agatgcggcc tcagctgctc cactccgaac aatcactgct 240gacactttcc gcaaactctt ccgagtçtac tccaatttcc tccggggaaa gctgaagctg 300tacacagggg aggcctgcag gacaggggac agatga 336

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Vai Gly Gln Gln Ala Vai Glu Vai Trp- Gln Gly Leu Ala Leu Leu1 5 .10 15

Ser Glu Ala Vai Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Vai Asn Ser Ser Gln20 25 30

Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser Gly Leu35 40 45

Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala50 55 60

lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr65 70 .75

Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe Leu Arg80 85 90 95

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg100 105 110

<210> 33

<211> 234

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

cccctgcagc tgcatgtgga taaagccgtc agtggccttc gcagcctcac cactctgctt 60

cgggctctgg gagcccagaa ggaagccatc tcccctccag atgcggcctc agctgctcca 120

ctccgaacaa tcactgctga cactttccgc aaactcttcç gagtctactc caatttcctc 180

cggggaaagc tgaagctgta cacaggggag gcctgcagga caggggacag atga 234

<210> 34

<211> 80

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 34

Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Vai Asp Lys Ala Vai Ser Gly Leu15 10 15

Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala20 25 30

lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr35 40 45

-Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe Leu Arg50 55 60

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

70 75 80

65

<210> .35

<211> 156

<212> DNA

<213> Mus

<400> 35

aaggaattga tgtcgcctcc agataccacc ccacctgctc cactccgaac actcacagtg 60gatactttct gcaagctctt ccgggtctac gccaacttcc tccgggggaa actgaagctg 120tacacgggag aggtctgcag gagaggggac aggtga 156

<210> 36

<211> 51

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 36

Lys Glu Leu Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Arg15 10 15

Thr Leu Thr Vai Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ala Asn20 25 30

Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Vai Cys Arg Arg35 40 45

Gly Asp Arg50

<210> 37

<211> 61

<212> DNA

<213> Mus musculus<400> 37

cttcctccgg gggaaactga agctgtacac gggagaggtc tgcaggagag gggacaggtga

<210> 38<211> 19<212>. PRT

<213> Mus musculus -<400> 38

Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Vai Cys Arg Arg1*5 10 15

Gly Asp Arg

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 39

gaacttccaa ggatgaagac ttgcagc

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 40

gtggcagcag catgtcacct gtc

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<212> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 41

tatggatcca tgggggtgcc cgaacgtccc ac

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial<223> pcr iniciador

<400> 42

tatggatcct cacctgtccc ctctcctgca gac

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 43

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcg

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 44

agcggataac aatttcacac agga

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 45

gatgggggtg cacgaatgtc ctgc

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 46

cacacctggt catctgtccc ctgtc

<210> 47

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 47aaagaattcc ctgtcccctc tcctgcagac etc

<210> 48

<2i1> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pcr iniciador

<400> 48

tatggatcca tgggggtgca cgaatgtcc

<210> 49

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PCR iniciador

<400> 49

agagaattct ctgtcccctg <210> 50

<211> 53

<212> prt

<213> Homo sapiens

<400> 50

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu. Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr50

<210> 51

<211> 53

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> ponto de mutação do Homo sapiens

<400> 51

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr50

<210> 52

<211> 53

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> ponto de mutação do Homo sapiens

<400> 52

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pró Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45

Ala Glu Asn lie Thr50

<210> 53

<211> 43

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> deleção mutante ha-10 do Homo sapiens

<400> 53

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu35 40

<210> 54<211> 33<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> deleção mutante ha-20 do homo sapiens

<400> 54

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30

lie

<210> 55

<211> 159

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 55

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210> 56

<211> 159

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> hAmA (hélice A da hWT-EPO da alanina mutante)

<400> 56

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

gcgtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210> 57

<211> Í59

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> hAmE (hélice A da hwt-EPO do ácido glutâmico mutante)

<400> 57

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

gagtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159<210> 58

<211> 129

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> hA-10 (hWT-EPO Hélia A minus lOaa

<400> 58

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120aggtacctc 129

<210> .59

<211> 99

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> hA-20 (hWT-EPO Hélia A minus20aa)<400> .59

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatc 99

<210> 60

<211> 78

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 60

gccccaccacg cctcatctgt gacagccgag tcctggagag gtacctcttg gaggccaaggaggccgagaa tatcacg 78

<210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 61

Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Vai Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15

<210> 62

<211> 27

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 62

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly20 25

<210> 63

<211> 81

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 63

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg c

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Variante da eritropoietina (EPO) que codifica um polinucleotí-deo, selecionada do grupo consistindo em:(a) polinucleotídeos que codificam pelo menos a forma madura dos polipeptídeos nomeados hs3, h1-4, h1- , hs4, h1-1, h2-1, mS, mG3,mG5, m301 e mK3 com a seqüência de aminoácidos deduzida conformemostrado nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22, respecti-vamente;(b) polinucleotídeos com a seqüência codificante, conforme mos- trado nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21, codificando pelomenos a forma madura do polipeptídeo;(c) polinucleotídeo que codifica uma versão humanizada dos po-lipeptídeos mS, mG3, mG5, m301 e mK3 com a seqüência de aminoácidosdeduzida conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 14, 16, 18, 20 e 22, (d) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreen-dendo uma fusão de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupode seqüências de aminoácidos conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 24, 26,28 e 30, no N-terminal de uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo de seqüências de aminoácidos conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 32, 34, 36 e 38;(e) polinucleotídeos compreendendo uma fusão de seqüênciasde polinucleotídeo selecionadas do grupo de seqüências de polinucleotídeoconforme mostrado nas SEQ ID NOs: 23, 25, 27 e 29, 5' de uma seqüênciade polinucleotídeo selecionada do grupo de seqüências de polinucleotídeo conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 31, 33, 35 e 37;(f) polinucleotídeos que codificam um derivado de um polipeptí-deo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) a (e), em queno referido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservati-vamente substituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o refe- rido derivado tem atividade celular protetora e, particularmente, neuroprote-tora, mas essencialmente sem atividade hematopoiética;(g) polinucleotídeos que codificam um fragmento de um polipep-tídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a) até (f), emque no referido fragmento entre 1 e 10 resíduos de aminoacidos são N- e/ouC-terminalmente anulados e/ou entre 1 e 10 aminoacidos são anulados N-e/ou C-terminalmente da junção em comparação com o referido polipeptí- deo, e o referido fragmento tem atividade protetora celular e, particularmen-te, neuroprotetora, mas essencialmente não tem atividade hematopoiética;(h) polinucleotídeos os quais são pelo menos 50% idênticos aum polinucleotídeo conforme definido em qualquer um de (a) até (g) e osquais codificam para um polipeptídeo com atividade protetora celular e, par- ticularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoi-ética; e(i) polinucleotídeos, o filamento complementar dos quais hibridi-za sob condições estringentes em um polinucleotídeo conforme definido emqualquer um de (a) até (h) e o qual codifica para um polipeptídeo com ativi- dade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencial-mente sem atividade hematopoiética;ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo.

2. Homólogo de uma variante de eritropoietina (EPO) que codifi-ca um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, a partir de outra es- pécie eucariótica superior.

3. Variante de eritropoietina (EPO) que codifica um polinucleotí-deo selecionado do grupo consistindo em:(a) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo variante E-PO, os quais compreendem a parte N-terminal do EPO de comprimento total incluindo a hélice A, e os quais não têm pelo menos um dos seguintes:(i) um fragmento de pelo menos 10 aminoacidos entre a hélice Ae a hélice B;(ii) um fragmento de pelo menos 10 aminoacidos de hélice B;(iii) um fragmento de pelo menos 2 aminoacidos entre a hélice B e a hélice C;(iv) um fragmento de pelo menos 10 aminoacidos de hélice C;(v) um fragmento de pelo menos 10 aminoacidos entre as héli-ces C e D; e/ou(vi) um fragmento de pelo menos 10 aminoácidos de hélice D;em que o referido variante tem atividade protetora celular e, par-ticularmente, neuroprotetora, mas essencialmente sem atividade hematopoi- ética;(b) polinucleotídeos que codificam um derivado de um polipeptí-deo codificado por um polinucleotídeo de qualquer um de (a), em que noreferido derivado entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos são conservativa-mente substituídos em comparação com o referido polipeptídeo, e o referidoderivado tem atividade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora,mas essencialmente sem atividade hematopoiética;(c) polinucleotídeos, o filamento complementar dos quais hibridi-za sob condições estringentes em um polinucleotídeo conforme definido emqualquer um de (a) até (b) e o qual codifica para um polipeptídeo com ativi- dade protetora celular e, particularmente, neuroprotetora, mas essencial-mente sem atividade hematopoiética;ou o filamento complementar de tal polinucleotídeo.

4. Polinucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindi-cações de 1 a 3, o qual é DNA, RNA ou DNA genômico.

5. Vetor contendo o polinucleotídeo como definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 4.

6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, no qual o polinucleo-tídeo está operativamente ligado às seqüências de controle de expressão,permitindo a expressão nas células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas.

7. Célula hospedeira geneticamente projetada com o polinucleo-tídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, ou aovetor como definido na reivindicação 5 ou 6.

8. Animal não-humano transgênico compreendendo o polinu-cleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, um vetor como definido na reivindicação 5 ou 6 e/ou uma célula hospedeira co-mo definido na reivindicação 7.

9. Processo para produzir um polipeptídeo variante EPO codifi-cado pelo polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 4, compreendendo: o cultivo da célula hospedeira como definidona reivindicação 7, e a recuperação do polipeptídeo codificado pelo referidopolinucleotídeo.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, compreendendoainda a etapa de modificar a referida variante EPO, em que a modificação éselecionada de um grupo consistindo em oxidação, sulfatação, fosforilação,adição de oligossacarídeos ou combinações destes.

11. Processo para produzir células capazes de expressar pelo menos uma das variantes EPO compreendendo células geneticamente pro-jetadas in vitro com o vetor como definido na reivindicação 5 ou 6, em queo(s) referido(s) polipeptídeo(s) da variante EPO é/são codificados pelo poli-nucleotídeo como definido nas reivindicações 1 a 4.

12. Polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos codificada pelo polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a4 ou obtenível pelo processo como definido na reivindicação 9 ou 10.

13. Anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo comodefinido na reivindicação 12.

14. Composição farmacêutica compreendendo o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, um vetor como. definido na reivindicação 5 ou 6, uma célula hospedeira como definido nareivindicação 7, um polipeptídeo como definido na reivindicação 12, e/ou umanticorpo como definido na reivindicação 13, e um ou mais veículos farma-ceuticamente aceitáveis.

15. Uso do polinucleotídeo, como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 4, um vetor como definido na reivindicação 5 ou 6, umacélula hospedeira como definido na reivindicação 7, um polipeptídeo comodefinido na reivindicação 12, para a produção de um medicamento para otratamento ou prevenção de uma condição associada com o dano tecidual devido à morte celular.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, em que a referidamorte celular é induzida por isquemia, hipóxia, infecção bacteriana, infecçãoviral, auto-imunológica, traumática ou quimicamente induzida ou induzida porradiação.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a refe-rida condição é um distúrbio neurodegenerativo e/ou neuroinflamatório agu- do ou crônico, é um distúrbio agudo ou crônico do coração, pulmão, rim, fí-gado ou pâncreas ou a referida condição está associada com um transplantede órgão ou célula.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, em que o referidodistúrbio neurodegenerativo e/ou neuroinflamatório agudo é selecionado do grupo consistindo em isquemia cerebral ou enfarte, incluindo oclusão embó-lica e oclusão trombótica, reperfusão após isquemia aguda, injúria isquêmi-ca/hipóxica perinatal, parada cardíaca, hemorragia intracranial, hemorragiasubaraquinoidal e lesões intracraniais, lesões da corda espinal, lesões intra-vertebrais, síndrome infantil agitada por lesão em chicotada, encefalite infec- ciosa, meningite, dor de cabeça.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, em que o referidodistúrbio neurodegenerativo e/ou neuroinflamatório crônico é selecionado dogrupo consistindo em demências, doença de Pick, doença do corpo de Lewydifuso, paralisia supranuclear progressiva (síndrome de Steel-Richardson), esclerose múltipla, atrofia do sistema múltipla, condições epiléticas crônicasassociadas com neurodegeneração, doenças neuronais motoras, ataxiasdegenerativas, degeneração basal cortical, complexo demência de ALS-Parkinson de Guam, panencefalite esclerosante subaguda, doença de Hun-tington, doença de Parkinson, sinucleinopatias, afasia progressiva primária, degeneração estriatonigral, doença de Machado-Joseph/ataxia espinocere-belar tipo 3 e degenerações olivopontocerebelares, doença de Gilles de LaTourette, paralisia bulbar e pseudobulbar, atrofia muscular espinal e espino-bulbar (doença de Kennedy), esclerose lateral primária, paraplegia espásticafamilial, doença de Werdnig-Hoffmann, doença de Kugelberg-Welander, do- ença de Tay-Sach, doença de Sandhoff, doença espástica familial, parapa-rese espástica, leucoencefalopatia multifocal progressiva, disautonomia fa-milial (síndrome de Riley-Day), polineuropatias, doenças de príon, desejocompulsivo, distúrbios afetivos, distúrbios esquizofrênicos, síndrome da fadi-ga crônica, dor crônica.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a refe-rida condição é o envelhecimento.

21. Uso, de acordo com as reivindicações 15 a 20, em que omedicamento é administrado antes de ou depois do início da referida condi-ção.