BRPI0608838A2 - agente de controle de rodente, métodos de matar rodente e de evitar sua reprodução, epitopo de peptìdeo especìfico para rodente, anticorpo ou seu fragmento de ligação a antìgeno e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

AGENTE DE CONTROLE DE RODENTE, MéTODOS DE MATAR RODENTE E DE EVITAR SUA REPRODUçãO, EPITOPO DE PEPTìDEO ESPECìFICO PARA RODENTE, ANTICORPO OU SEU FRAGMENTO DE LIGAçãO A ANTìGENO E USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se aos novos agentes de controle de rodentes que compreendem anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígenos, que se ligam a proteínas expressas em rodentes e, em particular, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos que se ligam a proteínas expressas no trato gastrointestinal (GI) de rodentes, bem como aos métodos de preparar tais novos agentes de controle de rodentes. A invenção adicionalmente se estende aos novos anticorpos e fragmentos de ligação a antigenos para uso no controle de rodentes, bem como aos métodos de controlar os rodentes através do uso de tais anticorpos, fragmentos de ligação a antígenos e novos agentes de controle de rodentes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONTROLEDE PRAGAS".
A presente invenção refere-se aos novos agentes de controle derodentes que compreendem anticorpos, ou seus fragmentos de ligação aantígenos, que se ligam a proteínas expressas em rodentes e, em particular,anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos que se ligam a proteínasexpressas no trato gastrointestinal (Gl) de rodentes, bem como aos métodosde preparar tais novos agentes de controle de rodentes. A invençãoadicionalmente se estende aos novos anticorpos e fragmentos de ligação aantígenos para uso no controle de rodentes, bem como aos métodos decontrolar os rodentes através do uso de tais anticorpos, fragmentos deligação a antígenos e novos agentes de controle de rodentes.
Por muito tempo os rodentes têm sido reconhecidos comopragas e causam uma variedade de problemas. Eles freqüentemente catamo seu alimento a partir do que é destinado para o consumo humano e deanimais domesticados, assim eles causam dano a, e contaminam (com aruína, as fezes e doença), não somente as colheitas em desenvolvimento,como também os materiais de alimentos armazenados. Os rodentes sãotambém sabidos serem veículos de uma ampla variedade de doenças,incluindo, por exemplo, a Triquinose, a Leptospirose, a Cólera, a PesteBubônica, o Tifo, a Disenteria, o o Vírus Hanta, a Salmonelose, aPasteurelose, a Toxoplasmose, e a Febre por mordida de rato, que podemser espalhadas através de contato direto (por exemplo, através de mordidas)ou indireto (por exemplo, através do pó gerado das fezes, urina, e/ou saliva,e/ou de insetos que vivem sobre, ou se alimentam de, rodentes, etc.) com ohomem e/ou outras espécies mamíferas. Além disso, os rodentesfreqüentemente causam dano físico à propriedade, às instalações e aoequipamento através do roer e da escavação.
Assim, têm sido desenvolvido métodos de controlar os rodentesdurante os anos e estes podem, em geral, ser divididos em três categorias: i)pegar em armadilhas; ii) matar através da exposição a agentes químicos; eiii) esterilizar ou reduzir a capacidade dos rodentes de reproduzir. Todas astrês destas metodologias sofrem de uma ou mais deficiências.
Por exemplo, as armadilhas mecânicas que são projetadas parapegar e/ou matar os rodentes são, por sua natureza, limitadas em seu usopelo número de animais que elas podem lidar, isto é, elas podem somenteser capazes de lidar com um animal em um tempo antes que elas requeirama intervenção humana para serem restabelecidas. Quando se considera aalta taxa na qual os rodentes podem se reproduzir (com um tamanho médioda ninhada de 6-8 e entre 10 e 12 ninhadas por ano, um único par de ratospode produzir tanto quanto 15.000 descendentes em um ano), pode ser vistoque pegar em armadilhas não é adequado para grandes infestações. Alémdisso, pegar em armadilhas é relativamente dependente de mão-de-obra,requerendo a intervenção humana regular, e isto resulta não somente nocusto aumentado com o controle da praga, como também pode espantar osrodentes que são alvejados pelas armadilhas.
O uso de rodenticidas químicos é atualmente o principal métodopara programas práticos de controle de rodentes em ambientes tantourbanos quanto agrícolas. Em geral, os rodenticidas químicos são agudos oucrônicos em sua ação, isto é, a substância química media a toxicose rápidaou lentamente após uma dose efetiva ter sido ingerida pelo rodente. Osrodenticidas agudos incluem o fosfeto de zinco, o fosfeto de trizinco, a cilavermelha (ingrediente ativo cilirosida), o (mono)fluoracetato de sódio, afluoracetamida, a alfacloralose, e o sulfato de tálio. Algumas substânciasquímicas rodenticidas, tais como o caliciferol, a brometalina e afluopropadina, podem ser descritas como rodenticidas subagudos, pelo fatode que uma dose letal é ingerida nas primeiras 24 horas, porém ocorre aalimentação repetida e a morte é normalmente retardada por diversos dias,entretanto a distinção entre os rodenticidas de ação aguda e subaguda nãoestá sempre clara. Embora os rodenticidas agudos sejam vantajosos pelofato de que eles atuam muito rapidamente, eles são, em geral, substânciasquímicas muito tóxicas e existem preocupações de segurança e ambientaisassociadas com o seu uso. Além disso, os sobreviventes da isca comveneno agudo podem tornar-se desconfiados da isca, assim reduzindo aeficácia global deste método de controle de rodentes.
Os rodenticidas crônicos mediam o seu efeito atuando comoanticoagulantes, cujos exemplos incluem os anticoagulantes de primeirageração hidroxicumarinas (por exemplo, warfarina, coumaclor, coumafurila,coumatetralila) e indano-dionas (por exemplo, pindona, difacinona,clorfacinona); e os anticoagulantes de segunda geração bromadiolona,brodifacoum, difenacoum, flocumafeno, e difetialona. O uso dos rodenticidasde segunda geração tem sido expandido durante as últimas 2 a 3 décadas, eainda mais longo (3 a 5 décadas) para os anticoagulantes de primeirageração. Assim, a população de rodentes tem tido amplo tempo paradesenvolver resistência a este método de controle, e tem sido descrita umaresistência/tolerância para cada um dos ingredientes ativos mencionadosacima em diversas populações e/ou espécies de rodentes (ver Kerrins et al.,2001, "Distribution of resistances to anticoagulant rodenticides in England,1995-98", págs. 149-159 Proceedings, Advances in Vertebrate PestManagement II, Second European Vertebrate Pest Management Conference,Braunschweig, Alemanha).
Uma desvantagem adicional dos anticoagulantes de segundageração procede de seu modo de ação não específico para as espécies,acoplado ao seu uso difundido. Por muitos anos tem havido preocupaçõessobre o envenenamento secundário dos mamíferos e das aves predatórios eque se alimentam de carniça que consomem rodentes que carregamresíduos de anticoagulantes. Tanto o brodifacoum quanto o flocumafeno têmestado restritos ao uso caseiro no Reino Unido, visto que eles sãoacreditados criarem um risco inaceitavelmente alto de envenenamentosecundário, se usados exteriormente. Entretanto, a resistência difundida aodifenacoum e à bromadiolona mais amplamente usados pode encorajar ouso impróprio dos anticoagulantes mais potentes, cujo uso esteja restrito adentro de casa. Mais recentemente, têm sido observados baixos níveis deresíduos e um impacto letal de tais resíduos em uma ampla faixa deespécies que não sejam alvos que são de importância de conservaçãoconsiderável, por exemplo, as Corujas, os Arminhos, as Doninhas, os Furõese os Francelhos.
Um terceiro método de controle de rodentes que foi proposto,porém que até agora não obteve qualquer sucesso comercial real, baseia-sena redução da taxa de natalidade dos rodentes. O uso de inibidoresreprodutivos, tais como os contraceptivos e os gametocidas, bem como ouso de esterilizantes biológicos e químicos tem tudo sido investigado.Entretanto, cada abordagem sofre de alguma desvantagem. Por exemplo,embora o uso de compostos químicos ou esteroidais como agentesantifertilidade tenha provado ser bem-sucedido para os animais cativos, elessão mais difíceis de empregar com populações de pragas de livremovimento. Os compostos não são agradáveis ao paladar e, assim, é difícilassegurar que os rodentes obtêm uma dose adequada. O gametocidaalfacloroidrina tem sido comercializado como um esterilizante tóxico,entretanto, ele tem efeitos variáveis em diferentes espécies e é tóxico(resultando em até 50% de mortalidade) em doses mais elevadas. Umapesquisa mais recente examinou a imunocontracepção como um método decontrole de rodentes (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US N-2005/0009188; Moore e Wong 1997, Reproduction Fertility & Development9:125-9; Smith et al., 1997, Reproduction, Fertility & Development, 9:85-9).
Entretanto, existem dificuldades com a eficácia quando a rota deadministração for oral, devido a problemas de tolerância oral, e osadjuvantes podem ser requeridos.
Há, assim, uma necessidade por novos agentes de controle derodentes (isto é, agentes que sejam capazes de controlar uma população derodentes, por exemplo, através do extermínio dos rodentes ou por regulaçãoda capacidade de uma população de rodentes de procriar), que superemalgumas das desvantagens sofridas pelos métodos atuais de controle derodentes. A presente invenção lida com esta necessidade proporcionandonovos agentes de controle de rodentes que compreendem um componentede anticorpo, o qual de liga a um epitopo extracelular de uma proteína que éexpressa em rodentes (tal proteína é referida aqui como uma proteína-alvo).Assim, em um primeiro aspecto da invenção, proporciona-se um agente decontrole de rodente compreendendo um componente de anticorpo que seliga a um epitopo extracelular de uma proteína que é expressa em umrodente.
Por alvejamento do agente de controle de rodente a umaproteína específica e/ou tecido específico em um rodente, por exemplo, auma proteína expressa no tecido do intestino do rodente/no trato Gl dorodente, a duração de tempo que o novo agente de controle de rodente estáem contato com o intestino do rodente é aumentada em relação àquela deagentes de controle de rodentes não específicos, que meramenteatravessam o intestino e não são retardados através de ligação específica.Isto pode, por sua vez, resultar em aumento eficaz na potência do novoagente de controle de rodente, assim capacitando que ele seja usado emconcentrações mais baixas do que os rodenticidas não específicostradicionais, tais como os rodenticidas de anticoagulantes.
De preferência, o componente de anticorpo confere ao novoagente de controle de rodente seletividade para os rodentes sobre osanimais que não sejam alvos (por exemplo, os seres humanos, as aves, osanimais domésticos, os animais da fazenda, e os animais selvagens que nãosejam pragas). Esta seletividade para tecido de rodente/proteína de rodentesobre as espécies que não sejam alvos é adicionalmente vantajosa, vistoque ela é provável de reduzir a necessidade por antídotos e tem o potencialde reduzir o impacto ambiental do novo agente de controle de rodente sobreas espécies que não sejam alvos.
Onde o componente de anticorpo reconhecer uma proteína-alvoque efetua uma função não essencial no rodente, será necessário para oagente de controle de rodente compreender adicionalmente um componentetóxico ou um componente contraceptivo.
Assim, em uma modalidade, a invenção proporciona um agentede controle de rodente que compreende um componente de anticorpo ligadoa um componente tóxico ou a um componente contraceptivo. Tais novosagentes de controle de rodentes podem estar na forma de uma proteína defusão, onde o componente tóxico ou o componente contraceptivo é umaporção de proteína ou de peptídeo que está ligada direta ou indiretamente(isto é, através de um ligante peptídico) ao componente de anticorpo atravésde uma ligação peptídica, ou na forma de um conjugado de proteína, onde ocomponente tóxico ou contraceptivo é uma molécula pequena (isto é, umaentidade não proteinácea, química) ou porção de proteína ou peptídeo queestá direta e quimicamente conjugada ao componente de anticorpo.
Onde o componente de anticorpo reconhecer uma proteína-alvoque efetue uma função essencial no rodente (por exemplo, uma proteína queefetue uma função essencial no trato Gl de um rodente), o componente deanticorpo pode atingir a função de controle de rodente como o único agentefuncional. Tal agente de controle de rodente mediaria o seu efeito em virtudeda ligação do componente de anticorpo à proteína-alvo essencial e, dessemodo, bloquearia ou inibiria a função da proteína essencial. Assim, em umamodalidade adicional, a presente invenção proporciona um agente decontrole de rodente compreendendo um componente de anticorpo que seliga a um epitopo extracelular de uma proteína que é expressa em umrodente, onde a proteína efetua uma função essencial no rodente. Osexemplos de proteínas-alvo adequadas, contra as quais os componentes deanticorpos de acordo com este aspecto da invenção se ligam (e, dessemodo, que podem ser usadas na produção de componentes de anticorposde- acordo com este aspecto da invenção), incluem o produto de gene derodente Sox10, um receptor do endotélio de rodente B (EDNRB), um ligantede endotélio-3 de rodente (EDN3), um CFTR de rodente (ver a Tabela 1abaixo e os Exemplos quanto a mais detalhe), a IL-2 de rodente, a IL-10 derodente, as cadeias alfa e/ou beta do receptor de células T de rodente, oscomponentes do rodente do complexo de histocompatibilidade principal declasse II. A pessoa versada apreciará que alguns produtos degenes/proteínas mencionados acima não estão prontamente acessíveissobre uma superfície epitelial de um rodente e, desse modo, requereminternalização antes deles serem capazes de mediar a sua atividade. Em talcaso, pode ser desejável combinar um componente de anticorpo dirigidopara uma das proteínas acima mencionadas com um componente deanticorpo de alvejamento adicional, que aumenta a probabilidade deinternalização. Assim, dois ou mais componentes de anticorpos, um dirigidocontra uma das proteínas antes mencionadas, e um segundo atuando comoanticorpo de alvejamento para um alvo epitelial adequado para aumentar ainternalização, podem estar ligados, através de conjugação ou em virtudeuma proteína de fusão, como descrito nas partes que seguem.
O termo "componente de anticorpo" é usado neste documentopara significar um anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antígeno, que seliga a um epitopo extracelular de uma proteína que é expressa em umrodente. De preferência, o epitopo ao qual o componente de anticorpo seliga tem uma seqüência de aminoácidos que é somente encontrada em umaproteína de rodente, isto é, o anticorpo se liga a um epitopo específico pararodente ou RSE. Os epítopos específicos para rodentes (RSEs), os quaispodem ser usados na geração de componentes de anticorpos para uso nosagentes de controle de rodentes da invenção e aos quais se liga o agente decontrole de rodente da invenção, formam um segundo aspecto da invençãodescrita neste documento. Os componentes de anticorpos que se ligam aosRSEs são considerados como um terceiro aspecto da invenção descrita aqui.
O RSE será extracelular para facilitar o acesso do anticorpo (oudo fragmento de ligação a antígeno) ao seu sítio de ligação. De preferência,a proteína-alvo que proporciona o RSE será expressa em, ou sobre, umasuperfície epitelial do rodente, incluindo, por exemplo, os epitélios do nariz,boca, olhos, trato gastrointestinal, trato geniturinário e epiderme. Maispreferivelmente, a proteína será expressa no (ou sobre o) epitéliogastrointestinal de um rodente.
Em uma modalidade, o RSE será proporcionado por umaseqüência de peptídeos contínua (isto é, seqüencial) (isto é, o primeiroresíduo de aminoácido do epitopo será diretamente ligado, através de umaligação peptídica, ao segundo resíduo de aminoácido do epitopo, o segundoresíduo de aminoácido do epitopo será ligado, através de uma ligaçãopeptídica, ao terceiro resíduo de aminoácido, etc). Tal epitopo de peptídeocontínuo é referido neste documento como um epitopo de peptídeoespecífico para rodente ou RSPE. Os RSPEs aos quais se ligam oscomponentes de anticorpos da invenção, e os quais podem, assim, serusados na geração de componentes de anticorpos (e também agentes decontrole de rodentes) da invenção, podem ser determinados por análisebioinformática comparativa das proteínas que são expressas notecido/camada celular alvo desejado, como indicada por literatura einformação de base de dados, seguida por análise imunológica confirmatória.O RSPEs, como os RSEs, são encontrados na natureza somente nasproteínas de rodentes. Um RSPE é definido aqui como um fragmento deoligopeptídeo de uma proteína-alvo, onde a seqüência de oligopepfídeosrepresenta um epitopo de peptídeo contínuo extracelular que tem umaporcentagem de identidade de 60% ou menos com uma seqüência depeptídeos linear correspondente a partir de uma proteína homóloga de umanimal que não seja alvo (isto é, um não rodente, por exemplo, o serhumano).
O termo "fragmento de oligopeptídeo", como usado nestedocumento, refere-se a um fragmento de uma proteína-alvo, o ditofragmento consistindo em pelo menos cerca de 4 e no máximo cerca de 50aminoácidos. De preferência, o dito fragmento de oligopeptídeo será entre 9e 45 (inclusive) aminoácidos de comprimento e, mais preferivelmente, o ditofragmento de oligopeptídeo será entre 9 a 30 (inclusive) aminoácidos decomprimento. Nas modalidades específicas, o dito fragmento deoligopeptídeo será 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 24 ou 44aminoácidos de comprimento.
De preferência, a porcentagem de identidade entre o RSPE e aproteína que não é alvo será tal que um componente de anticorpo dainvenção tenha especificidade e afinidade altas pelo RSPE e não reagirácruzado com uma proteína que não seja de rodente da mesma classe/famíliaque aquela a partir da qual o RSPE foi derivado. Nas modalidades preferidas,a porcentagem de identidade entre o RSPE e a proteína que não é alvo e,em particular, entre o RSPE e uma seqüência de peptídeos linear (isto é,contínua ou seqüencial) correspondente a partir de uma proteína homólogade um animal que não seja alvo, é menos do que, ou igual a, 50%, 45%,40%, 35%, 30%, ou 25%.
De preferência, os RSPEs serão altamente conservados entretodas as espécies-alvo de rodentes, em particular altamente conservadosentre os ratos e os camundongos, especialrr^nte entre dois ou mais deRattus rattus, Rattus norvegicus e Müs musculus/Mus domesticus. Poraltamente conservado pretende-se que a porcentagem de identidade entreum RSPE de uma espécie de rodente e o RSPE correspondente de umasegunda espécie de rodente seja alta. De preferência, a porcentagem deidentidade entre dois RSPEs de rodentes será pelo menos 75%. Maispreferivelmente, a porcentagem de identidade será maior do que, ou igual a,80%, 85%, 90% ou 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Mais preferivelmenteainda, o RSPE será 100% idêntico entre duas ou mais espécies de rodentes.
Embora seja preferido que a porcentagem de identidade entreum RSPE seja altamente conservada entre duas ou mais espécies, comodiscutido acima, se o alto nível desejado de conservação não for observado,podem ser usados diferentes RPSEs de proteínas (homólogas ou diferentes)de duas ou mais espécies de rodentes, para gerar diferentes componentesde anticorpos, os quais podem então ser combinados em um agente decontrole de rodente, como descrito a seguir (por exemplo, cada componentede anticorpo ligado a um componente tóxico/contraceptivo, com o agente decontrole de rodente assim compreendendo múltiplas moléculas deanticorpos tóxicas/contraceptivas diferentes ou o agente de controle derodente compreendendo um componente tóxico/contraceptivo ligado a doisou mais componentes de anticorpos diferentes, cada um dos dois ou maiscomponentes de anticorpos reconhecendo um RSPE de uma proteína deuma espécie de rodente diferente). Em uma modalidade específica, umcomponente de anticorpo que reconhece o MDR1 de camundongo (SEQ IDNO: 8) poderia ser combinado com um componente de anticorpo quereconhece o MDR1 de rato (SEQ ID NO: 9), nos agentes de controle derodentes da invenção.
Os exemplos de proteínas-alvo às quais os componentes deanticorpos da invenção se ligam, e as quais podem ser usadas na produçãoou na identificação dos componentes de anticorpos da invenção, são dadosna Tabela 1. Esta Tabela também proporciona exemplos de RSPEsespecíficos, os quais podem ser derivados das proteínas ilustrativas. Apessoa versada apreciará que nem a lista de proteínas dada na Tabela 1,nem a lista de RSPEs derivados delas, são exaustivas. Os RSPEsadequados adicionais podem ser identificados dentro das proteínas dadas(todas as quais são expressas no trato Gl), e as proteínas adicionais, porexemplo, a partir de outros tecidos-alvo de rodentes, tais como os epitéliosnasais, os epitélios bucais, a epiderme, os epitélios do trato geniturinário eos epitélios do olho, podem também ser usadas para produzir oscomponentes de anticorpos da invenção.
Tabela 1 Exemplos de Proteínas que podem ser alvejadas pelos anticorposda presente invenção, e exemplos específicos de RSPEs que podem ser
<table>table see original document page 11</column></row><table><table>table see original document page 12</column></row><table><table>table see original document page 13</column></row><table><table>table see original document page 14</column></row><table> Os exemplos de proteínas-alvo preferidas, para uso na invenção,são o transportador de oligopeptídeo PepT1 de rato, o CD155 de rato, oGTR2 de rato, o CFTR de rato, o CNT2 de rato, o CATB(0)+ de rato, oMDR1 de rato, o MDR1 de camundongo, a sàcarose-isomaltase de rato, oGLUT7 de camundongo, o OATP-B de rato, o ENT1 de rato, a GCC de rato,a PLB de rato, a LPH de rato, a AMPN de rato, a MCDL de rato, e a SCABde rato.
Os RSPEs preferidos da invenção têm as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 26, 27, 28, 29, 31, 32 e 34.
As proteínas-alvo particularmente preferidas, para uso nainvenção, são o transportador de oligopeptídeo PepT1 de rato, o CD155 derato, o CFTR de rato, o GLUT7 de camundongo, a GCC de rato, a PLB derato e a LPH de rato.
Os RSPEs particularmente preferidos da invenção têm as SEQIDNOs 1,3, 5, 6, 11,e27, 28 e 29.
A pessoa versada apreciará que os anticorpos reconhecem aestrutura de proteína terciária e que um epitopo pode compreender resíduosde aminoácidos que estão distribuídos por toda a seqüência de aminoácidosprimária de uma proteína, ao mesmo tempo em que estando estruturalmenteem proximidade íntima um com o outro. Assim, em uma modalidadeadicional, os componentes de anticorpos (e, desse modo, também osagentes de controle de rodentes) da invenção podem reconhecer um RSEextracelular descontínuo.Os anticorpos para uso na invenção podem ser policlonais oumonoclonais. Tais anticorpos podem ser obtidos por imunização de umanimal com um RSPE como descrito acima, ou por imunização de um animalcom a proteína-alvo de rodente intacta. Os anticorpos policlonais dainvenção podem ser obtidos a partir do soro de tal animal imunizado, ver, porexemplo, o Exemplo 2. Os anticorpos policlonais que reconhecem o RSPEou a proteína-alvo de rodente, porém que não reconhecem uma proteínahomóloga de um animal que não seja alvo, podem ser identificados usandotécnicas padrão imunológicas (por exemplo, através de ELISA, e/ou atravésde imunoistoquímica contra fontes de tecidos apropriadas).
Os anticorpos monoclonais para uso na invenção podem serobtidos por isolamento de linfócitos B do baço de um animal imunizado comum RSPE ou proteína-alvo de rodente e preparação de uma cepa celular dehibridoma com tais linfócitos. As cepas celulares de hibridomas são entãoclassificadas quanto àquelas que secretam anticorpos que reconhecem oRSPE ou a proteína-alvo de rodente, porém que não reconhecem umaproteína homóloga de um animal que não seja alvo, ver, por exemplo, osExemplos.
Os anticorpos policlonais e monoclonais preferidos, para uso nainvenção, são descritos neste documento nos Exemplos.
Os anticorpos e os fragmentos de ligação a antígenos, para usona invenção, podem também ser isolados a partir de uma biblioteca deexposição em bacteriófagos (simples, ou imune) de anticorpos oufragmentos de ligação a antígenos, ou a partir de uma biblioteca deexposição em levedura ou bacteriana de anticorpos ou fragmentos deligação a antígenos, ou a partir de uma biblioteca de exposição ribossômicade anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos. Tipicamente, taisbibliotecas de exposição serão classificadas para identificar as proteínasexpostas que se ligam aos RSPEs ou às proteínas-alvo de rodentes. Apessoa versada estará familiarizada com a metodologia para a classificaçãode tais bibliotecas, identificando os pares de ligação na biblioteca e isolandosubseqüentemente tais membros. As bibliotecas de exposição de anticorpose fragmentos de ligação a antígenos que podem ser usadas para aclassificação, e a sua constructo, são descritas na técnica (ver, por exemplo:Publicações de Patentes Internacionais N- WO 01/90190 e WO 93/19172;Patentes US N- 5.759.808 e 6.517.829; revisão por Hoogenboom 1997,Trends in Biotechnology 15(2): 62-70; Doo|ey et al., 2003 MolecularImmunology 40: 25-33; Nutall et al., 2001 Molecular Immunology 2001,38:313-326; e Hanes et al., 1998 Proceedings of the National Academy ofSciences USA 95: 14130-14135). Novamente os anticorpos ou osfragmentos de ligação a antígenos identificados neste modo serão checadospara confirmar que eles não se ligam a uma proteína homóloga de umanimal que não seja alvo.
Os anticorpos para uso na invenção podem ser de qualquerclasse de imunoglobulina, por exemplo, eles podem ser um anticorpo de IgA,IgD, IgE, IgG ou IgM. De preferência, um anticorpo da invenção será umanticorpo de IgG. Os anticorpos da invenção podem ser moléculas deimunoglobulina compreendendo cadeias tanto pesadas quanto leves, ou elespodem ser anticorpos de cadeias individuais. O termo "anticorpo de cadeiaindividual", como usado neste documento, inclui tanto os anticorpos deocorrência natural, os quais consistem em somente um único tipo de cadeia,por exemplo, os anticorpos derivados de Camelídeo ou Chondrichtyes(tubarão), que são desprovidos de cadeias leves, quanto os anticorposengenheirados que consistem em somente uma única cadeia polipeptídica.Os exemplos de tais anticorpos engenheirados incluem, por exemplo, osanticorpos de cadeias individuais ou "minicorpos", como descritos naPublicação de Patente Internacional Ns WO 94/09817, e os fragmentosvariáveis de cadeias individuais (scFv). Os anticorpos da invenção sãopreferivelmente anticorpos de cadeias individuais. Em uma modalidadepreferida, o anticorpo é um scFv. Em uma outra modalidade preferida, oanticorpo é um anticorpo de cadeia individual desprovido de cadeias leves,mais preferivelmente um anticorpo derivado de Camelídeo (por exemplo,como descrito na Publicação de Patente Internacional N- WO 94/04678).
Os fragmentos de ligação a antígenos, para uso na invenção,incluem as cadeias leves de imunoglobulina, as cadeias pesadas deimunoglobulina, os domínios VH, os domínios VL, os Fvs, os Fabs, os di-Fabs,os Fab's, os F(ab')2s, os domínios Vhh, ds domínios V de IgNAR e as CDRs.A pessoa versada estará bem familiarizada com os fragmentos de ligação aantígenos, tais como as cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas, osdomínios Vh e VL, os Fvs, os Fabs, os di-Fabs, os Fab's, os F(ab')2s, osdomínios Vhh. os domínios V de IgNAR e as CDRs, e a sua preparação. Umdomínio Vhh é o domínio variável de um anticorpo de Camelídeo. Osdomínios Vhh e o seu isolamento são descritos na técnica, ver, por exemplo,a Publicação de Patente Internacional N2 WO 94/04678, a Publicação dePatente Internacional N2 WO 01/90190 e as referências contidas nelas. Osanticorpos de IgNAR são anticorpos de cadeias individuais de tubarões, osquais, em comum com os anticorpos de Camelídeo, estão desprovidos decadeias leves (ver Greenberb et al., 1995 Nature 374:168-173). A região deligação ao antígeno destes anticorpos, o domínio variável de IgNAR(domínio V de IgNAR), também foi descrita na técnica, ver, por exemplo,Dooley et al., 2003 (Molecular Immunology 40:25-33) e as referênciascitadas no mesmo. Em algumas modalidades, o componente de anticorpopara uso na invenção será um anticorpo de Camelídeo, ou um domínio Vhh,que reconhece uma das proteínas-alvo preferidas descritas aqui antes. Emparticular, os anticorpos de Camelídeo ou os domínios de Vhh que se ligama qualquer uma das SEQ ID NOs 1, 3, 5, 6, 11, ou 27 são preferidos, emboraos domínios Vhh que se ligam a qualquer uma das SEQ ID NOs 5, 6, 11 ou27 sejam particularmente preferidos.
Os anticorpos e os fragmentos de ligação a antígenos usados nainvenção podem também ser engenheirados para aumentar a suaestabilidade, por exemplo, eles podem ser estabilizados por pontes dedissulfeto (ver, por exemplo, Reiter et al., 1996, Nature Biotechnology14(10):1239-1245).
Conforme descrito acima, os componentes de anticorpos podemser obtidos por utilização de proteínas de rodentes intactas ou RSEs (cujotermo inclui os RSPEs), como antígenos ou para classificar quanto aosanticorpos/fragmentos de ligação a antígenos adequados, que tenham sidoselecionados como tendo uma baixa porcentagem de identidade com asproteínas homólogas de animais que não sejam alvos (isto é, não rodentes,por exemplo, o ser humano). A probabilidade de um componente de1 anticorpo da presente invenção de reagir cruzado com uma proteínahomóloga de uma espécie que não seja alvo é, desse modo, reduzida.Assim, nas modalidades preferidas da invenção, os componentes deanticorpos (e, desse modo, também os agentes de controle de rodentes dainvenção) exibem seletividade para um epitopo sobre uma proteína-alvo derodente, em vez do epitopo correspondente sobre uma proteína homólogade um animal que não seja alvo. Em outras palavras, os componentes deanticorpos preferidos da invenção mostram seletividade para um RSE porligação ao mesmo (ou à proteína de rodente a partir da qual o RSE éderivado), com uma afinidade maior do que a um epitopo correspondentesobre uma proteína homóloga (ou a proteína homóloga) de um animal quenão seja alvo. Os animais que não são alvos incluem os seres humanos, asaves, os animais de estimação, os animais da fazenda, e os animaisselvagens que não sejam pragas.
De preferência, os componentes de anticorpos da invençãoexibirão ligação reduzida, e ainda mais preferivelmente não se ligarão, àsproteínas homólogas a partir de seres humanos. Ainda mais preferivelmente,os componentes de anticorpos da invenção não somente exibirão ligaçãoreduzida (ou não se ligarão) às proteínas homólogas a partir de sereshumanos, como também exibirão ligação reduzida (ou não se ligarão) àsproteínas homólogas de pelo menos um outro animal que não seja alvo.
Para a evitação de dúvida, o termo "ligar" é usado nestedocumento para descrever a interação de um componente de anticorpo dainvenção com um epitopo ou proteína em um modo qualitativo ouquantitativo.
Onde o termo for usado qualitativamente, a especificidade paraa ligação a uma proteína-alvo, um RSE ou um RSPE pode ser demonstradopela capacidade do componente de anticorpo de ligar-se à proteína-alvo, aoRSE, ou ao RSPE em um modo removível, onde a remoção da ligação doanticorpo resulta da presença do antígeno ao qual o componente deanticorpo foi produzido ou classificado (referido a seguir como o "antígenoespecífico"). Se a ligação de tal componente de anticorpo específico paraproteína-alvo/RSE/RSPE a uma proteína que não seja alvo (ou a um epitopocorrespondente de uma proteína que não seja alvo) não for observada, ouse alguma ligação a uma proteína que não seja alvo (ou epitopocorrespondente de uma proteína que não seja alvo) for observada, que nãoseja removível pelo antígeno específico, então o componente de anticorposerá considerado como mostrando seletividade para a proteína-alvo, o RSEou o RSPE (conforme apropriado) pelo fato de que o componente deanticorpo se liga à proteína-alvo/RSE/RSPE com uma afinidade maior doque a uma proteína que não seja alvo ou ao epitopo correspondente de umaproteína que não seja alvo. A especificidade e a seletividade podem, assim,ser determinadas através de análise imunoistoquímica de amostras detecidos apropriadas, e/ou através de ELISA com amostras apropriadas.
Onde o termo "ligar" for usado quantitativamente, isto significaque o componente de anticorpo tem uma afinidade de pelo menos 10"6 Mpelo epitopo ou a proteína com a qual ele interage. De preferência, aafinidade será pelo menos 10"7 M, mais preferivelmente 10"8 M, maispreferivelmente 10"9 M, ainda mais preferivelmente'10"10 M e maispreferivelmente de todas 10~11 M ou maior. Assim, onde o componente deanticorpo ligar-se a um RSE ou RSPE (ou à proteína a partir da qual o RSEou o RSPE é derivado), ele terá uma afinidade de pelo menos 10"6 M, e nasmodalidades adicionais, ele terá uma afinidade de pelo menos 10"7 M, pelomenos 10"8 M, pelo menos 10"9 M e pelo menos 10"10 M. Nas modalidadespreferidas, o componente de anticorpo não se ligará a um epitopocorrespondente sobre uma proteína homóloga a partir de uma ou maisespécies que não sejam alvos (preferivelmente o ser humano), isto é, aafinidade do componente de anticorpo por uma proteína homóloga de umaespécie que não seja alvo será menos do que 10"6 M, ou ele exibirá ligaçãoreduzida a ele, isto é, a afinidade do componente de anticorpo por umaproteína homóloga de uma espécie que não seja alvo será pelo menos 10vezes menor do que pela proteína-alvo de rodente. Assim, nas modalidadespreferidas, onde um componente de anticorpo da invenção tiver umaafinidade de pelo menos 10"6 M por um RSE ou RSPE (ou pela proteína apartir da qual o RSE ou o RSPE é derivado), a,afinidade do componente deanticorpo por uma proteína homóloga de uma espécie que não seja alvoserá menos do que 10"6 M, e preferivelmente 10"5 M ou menor; onde umcomponente de anticorpo da invenção tiver uma afinidade de pelo menos 10"7 M por um RSE ou RSPE (ou pela proteína a partir da qual o RSE ou oRSPE é derivado), a afinidade do componente de anticorpo por umaproteína homóloga de uma espécie que não seja alvo será 10"6 M ou menor;onde um componente de anticorpo da invenção tiver uma afinidade de pelomenos 10"8 M por um RSE ou RSPE (ou pela proteína a partir da qual o RSEou o RSPE é derivado), a afinidade do componente de anticorpo por umaproteína homóloga a partir de um espécie que não seja alvo será 10"7 M oumenos, e preferivelmente 10"6 M ou menos; onde um componente deanticorpo da invenção tiver uma afinidade de pelo menos 10"9 M por um RSEou RSPE (ou pela proteína a partir da qual o RSE ou o RSPE é derivado), aafinidade do componente de anticorpo por uma proteína homóloga a partirde uma espécie que não seja alvo será 10"8 M ou menos, e preferivelmente10"6 M ou menos.
A afinidade do componente de anticorpo pelas proteínas-alvo epelas que não são alvos (bem como pelos epítopos a partir delas) pode serdeterminada usando qualquer técnica apropriada; por exemplo, através douso de ressonância de plásmon de superfície (por exemplo, com BlAcore®).
Em uma modalidade da presente invenção, o agente de controlede rodente está na forma de uma proteína de fusão, onde a proteína defusão compreende um primeiro componente de proteína e um segundocomponente de proteína, o dito primeiro componente de proteína é umcomponente de anticorpo, como descrito aqui antes, e o dito segundocomponente de proteína é selecionado a partir do grupo que consiste emuma toxina, um imunógeno e um hormônio.O primeiro componente de proteína pode ser ligado diretamenteao segundo componente de proteína, entretanto, é preferido que os doiscomponentes sejam indiretamente ligados através de um peptídeo ligante. Opeptídeo ligante, em geral, será de um comprimento que seja suficiente parao primeiro componente e o segundo componente funcionarem conformedesejado, sem um componente afetar adversamente a função do outro (porexemplo, por impedimento estérico). Um exemplo de peptídeo ligantecomumente usado, adequado para uso neste aspecto da invenção, é oligante (Gly4Ser)n, onde "n" é um número inteiro maior do que, ou igual a, 1.Tipicamente, n é maior do que, ou igual a, 3. De preferência, a seqüênciaprimária do peptídeo ligante é projetada para ser estável em ambienteshidrolíticos e térmicos adversos. Isto pode ser atingido por remoção oumutação dos resíduos no ligante que atuam como sítios de reconhecimentopara o processamento do ligante através de, por exemplo, um mecanismoproteolítico. Os exemplos adicionais de peptídeos ligantes adequados sãoaqueles descritos por Gustavsson et al., 2001 (Protein Engineering 14:711 -715), Hennecke et al., 1998 (Protein Engineering 11:405-410) e Huston ét al.,1991 (Methods in Enzymology 203:46-88).
Em uma modalidade adicional, é desejável engenheirar ainstabilidade específica no peptídeo ligante, de modo tal que a separaçãocontrolada dos dois componentes de proteínas/a liberação do segundocomponente de proteína seja efetuada com a distribuição da proteína defusão para um lócus apropriado, por exemplo, assim que a proteína de fusãotiver sido internalizada, o segundo componente de proteína pode serliberado de modo intracelular. O controle da separação descrito pode servirpara aumentar a atividade de certas proteínas de fusão.
Conforme mencionado acima, em uma modalidade da proteínade fusão, o segundo componente de proteína é uma toxina. A toxina confereà proteína de fusão uma atividade rodenticida: ela efetua a toxicidade contrauma célula de rodente alvejada através de um modo de ação mediadoexterna ou internamente. As toxinas adequadas para uso neste aspecto dainvenção incluem inter alia as proteínas que rompem as membranas, asribosiltransferases, as serina proteases, os ativadores de guanilil cilase, asproteínas envolvidas no transporte de íons mediado pela ATP-ase, asadenilil ciclases dependentes de calmodulina, as RNA glicosidases e asribonucleases. Os exemplos específicos de toxinas adequadas são dadosabaixo, na Tabela 2. A pessoa versada apreciará que algumas das toxinaslistadas na Tabela 2 são representativas de uma família de moléculas detoxinas e, onde este for o caso, qualquer um daqueles membros podetambém ser usado na invenção.
Tabela 2 Exemplos de proteínas que podem ser usadas como toxinas nasproteínas de fusão da invenção.
<table>table see original document page 22</column></row><table><table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table>
As toxinas preferidas, para uso nas modalidades da invenção,incluem a granzima B, a cyt 2A, a B-purotionina, a VIP2A, a gelonina, e agranulisina. As toxinas particularmente preferidas são selecionadas a partirdo grupo que consiste em granzima B, cyt2A, p-purotionina, VIP2A egelonina.
As toxinas protéicas, como descritas acima, podem serincorporadas em sua totalidade nas proteínas de fusão da invenção.Alternativamente, onde um domínio ou fragmento de tal toxina conferir aatividade tóxica, este domínio ou fragmento pode ser empregado como osegundo componente de proteína na proteína de fusão.
Em uma outra modalidade, o segundo componente de proteínaem uma proteína de fusão da invenção é um imunógeno, isto é, um poli- ouoligopeptídeo, que é capaz de produzir uma resposta imune nos rodentes.Em uma modalidade preferida, as proteínas de fusão com imunógenos dainvenção serão capazes de atuar como imunocontraceptivos e, assim,atuarão como agentes de controle de rodentes por prevenção da reprodução.Os antígenos específicos para espermatozóides ou óvulo, tais como, porexemplo, a lactato desidrogenase C, o antígeno de espermatozóide PH-20(Primakoff et al., 1988 Nature 335:543-6), a fertilina (PH-30) e os antígenosda zona pelúcida, são, assim, imunógenos adequados para uso como osegundo componente de proteína nas proteínas de fusão da invenção.
Em mais uma outra modalidade, o segundo componente deproteína em uma proteína de fusão da invenção é um hormônio ou miméticode hormônio proteináceo. Nesta modalidade, o segundo componente deproteína interferirá com, e impedirá, a reprodução nos rodentes, e a proteínade fusão, desse modo, atua como um agente de controle de rodente atravésda prevenção da reprodução. Um exemplo de um hormônio que pode serusado nesta modalidade da invenção inclui o hormônio liberador degonadotrofina.
Nas modalidades adicionais, as proteínas de fusão comodescritas acima podem compreender pelo menos um componente deproteína adicional. Este componente (ou componentes) de proteína adicionalpode ser uma toxina, imunógeno, hormônio ou mimético de hormônioproteináceo, como descrito acima. Desse modo, uma proteína de fusão podeser construída compreendendo um componente de anticorpo e pelo menosdois componentes de proteínas adicionais, onde cada um dos componentesde proteínas adicionais confere à proteína de fusão uma função de controle(isto é, tóxica ou contraceptiva, ou ambas) do rodente. O segundo, eadicional, componente, ou componentes, de proteína pode, cada um, terfunções de controle de rodentes iguais ou diferentes (isto é, eles podem,cada um, independentemente, ser tóxicos ou contraceptivos) e, onde elestiverem a mesma função, eles podem, cada um, ter um modo de ação igual,ou independentemente diferente. Onde o(s) componente(s) de proteínasadicional(is) tiver(em) a mesma função de controle de rodente e onde pelomenos um componente de proteína adicional tiver um modo de açãodiferente em relação ao segundo componente de proteína, a eficácia doagente de controle de rodente pode ser aumentada (em relação a um agentede controle de rodente compreendendo um único componente de proteínaque confere a atividade de controle do rodente). Por exemplo, uma proteínade fusão, onde o segundo componente de proteína é uma toxina rompedorade células (por exemplo, é selecionada a partir do grupo que consiste emperfringolisina O, alfa hemolisina, esfingomielinase, delta-hemolisina, alfatoxina, toxina cyt, granulisina, melitina, perforina, equinatoxina, listeriolisina,aerolisina, hemolisina A, amebaporo, hemolisina El Tor, hemolisina de Vibríodamsela, pneumolisina, estreptolisina O, toxina de Kanagawa, hemolisina deleptospira, toxina cry, VIP3, tionina e p-purotionina) e o(s) componente(s) deproteína(s) adicional(is) pode(m) ser uma toxina que requeira internalizaçãodentro de uma célula para a atividade (por exemplo, selecionada a partir dogrupo que consiste em granzima B, toxina da difteria, endotoxina da cólera,VIP2, enterotoxina do acessório, colicina E1, CTX IV, uma proteína deinativação de ribossomo do tipo 2, tal como ricina, toxina do antraz,exotoxina de Pseudomonas A, barnase, uma proteína de inativação deribossomo do tipo 1, tal como a gelonina), pode ser um agente de controlede rodente particularmente eficaz, visto que a atividade de rompimento demembrana conferida pelo segundo componente de proteína pode auxiliar aatividade funcional do componente de proteína adicional, por facilitação doacesso do componente de proteína adicional ao lado de dentro de umacélula de rodente. Nas modalidades preferidas, a proteína de fusãocompreenderá pelo menos um componente de toxina selecionado a partir dogrupo que consiste em: cyt2A, (3-purotionina, e granulisina; e pelo menos umcomponente de toxina selecionado a partir do grupo que consiste em:granzima B, VIP2A, e gelonina.
As proteínas de fusão da invenção podem ser construídas demodo que o primeiro componente de proteína (o componente de anticorpo)seja N-terminal ao segundo componente de proteína, alternativamente elaspodem ser construídas de modo que o segundo componente de proteínaseja N-terminal ao primeiro componente de proteína. Como anteriormentemencionado, em algumas modalidades, é desejável ligar indiretamente osdois componentes de proteínas através de um peptídeo ligante. Desse modo,as proteínas de fusão da invenção podem compreender da extremidade Naté C, o primeiro componente de proteína ligado, através de uma ligaçãopeptídica, a um peptídeo ligante, que está, por sua vez, ligado, através deuma ligação peptídica, ao segundo componente de proteína, ou elas podemcompreender da extremidade N até C, o segundo componente de proteínaligado, através de uma ligação peptídica, a um peptídeo ligante, que está,por sua vez, ligado, através de uma ligação peptídica, ao primeirocomponente de proteína.
Onde a proteína de fusão compreender um componente deproteína adicional, este pode ser N-terminal ao primeiro componente deproteína, isto é, o componente de proteína adicional está ligado diretamente,através de seu resíduo C terminal, através de uma ligação peptídica, aoresíduo N terminal do primeiro componente de proteína, ou indiretamente,através de um ligante peptídico (ou um componente de proteína adicional),ao resíduo N terminal do primeiro componente de proteína. Em umamodalidade adicional, o componente de proteína adicional é N-terminal aosegundo componente de proteína, isto é, o componente de proteínaadicional está ligado diretamente, através de seu resíduo C terminal, atravésde uma ligação peptídica, ao resíduo N terminal do segundo componente deproteína, ou indiretamente, através de um ligante peptídico (ou umcomponente de proteína adicional), ao resíduo N terminal do segundocomponente de proteína. Nas modalidades ainda adicionais, o componentede proteína adicional pode estar i) C-terminal ao primeiro componente, isto é,o componente de proteína adicional está ligado diretamente, através de seuresíduo N terminal, através de uma ligação peptídica, ao resíduo C terminaldo primeiro componente de proteína, ou indiretamente, através de um ligantepeptídico (ou um componente de proteína adicional), ao resíduo C terminaldo primeiro componente de proteína; ou ii) C-terminal ao segundocomponente de proteína, isto é, o componente de proteína adicional estáligado diretamente, através de seu resíduo N-terminal, através de umaligação peptídica, ao resíduo C terminal do segundo componente de proteína,ou indiretamente, através de um ligante peptídico (ou um componente deproteína adicional), ao resíduo C terminal do segundo componente deproteína.
Os componentes de anticorpos e/ou as proteínas de fusão dainvenção podem ser produzidos por expressão dos ácidos nucléicos que oscodificam em qualquer sistema de expressão de proteína adequado. Assim,em um aspecto adicional, a invenção proporciona ácidos nucléicos quecodificam as proteínas de fusão da invenção. Os ácidos nucléicos quecodificam as proteínas de fusão da invenção podem ser obtidos porclonagem de um ácido nucléico que codifica o primeiro componente deproteína em quadro com um ácido nucléico que codifica o segundocomponente de proteína. Onde o primeiro e o segundo componentes deproteínas estiverem indiretamente ligados, através de um ligante peptídico,um ácido nucléico que codifica o ligante separar-se-á e estará em quadrocom os dois componentes de proteínas da proteína de fusão.
Os ácidos nucléicos que codificam os componentes deanticorpos podem ser isolados, usando técnicas biológicas molecularespadrão, a partir de células de hibridoma que expressam um anticorpo dainvenção. Alternativamente, os ácidos nucléicos que codificam oscomponentes de anticorpos podem ser obtidos, novamente usando técnicasbiológicas moleculares padrão, a partir de exposição em fago ou outrosclones de bibliotecas que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação aantígeno da invenção.
Os exemplos de codificação do segundo componente deproteína (o componente tóxico ou contraceptivo) pelas seqüências de ácidosnucléicos estão disponíveis na técnica, ver, por exemplo, as referências dosbancos de dados de EMBL na Tabela 2.
Os ácidos nucléicos que codificam os peptídeos ligantes podemser sintetizados de novo, por exemplo, a partir de oligonucleotídeos quecodificam a seqüência de peptídeos ligantes.
Para que um componente de anticorpo ou proteína de fusão sejaexpressa em um sistema de expressão de proteína adequado, o ácidonucléico que codifica a proteína de fusão estará operavelmente ligado a umpromotor adequado e, opcionalmente, a um terminador de transcriçãoadequado. Em geral, o promotor ao qual o ácido nucléico que codifica aproteína de fusão está operavelmente ligado será qualquer promotor capazde orientar a expressão da proteína de fusão na célula hospedeira na qual oácido nucléico é para ser introduzido. Assim, se for desejado que ocomponente de anticorpo ou a proteína de fusão seja expressa em umacélula bacteriana, o promotor será operável nesta célula bacteriana.Similarmente, se for desejado que o componente de anticorpo ou a proteínade fusão seja expressa em um sistema de expressão fúngico, o promotorserá operável em uma célula fúngica, e a mesma lógica prevalece se oconstructo for para ser introduzido em um sistema de expressão de culturade célula mamífera ou em um sistema de expressão de planta. O uso de umpromotor específico para semente é particularmente desejável quando ocomponente de anticorpo ou a proteína de fusão for para ser expressa emcélulas de plantas e/ou em plantas. Onde os ácidos nucléicos da invençãoestiverem operavelmente ligados a uma região de terminador transcricional,esta será uma que media a terminação da transcrição na célula hospedeirana qual o componente de anticorpo ou a proteína de fusão da invenção épara ser expresso. As regiões de terminadores transcricionais adequadaspara este propósito são descritas na técnica.Os sistemas de expressão adequados, para a expressão doscomponentes de anticorpos e/ou das proteínas de fusão da invenção,incluem os sistemas de expressão microbianos, tais como os sistemasbacterianos (por exemplo, os sistemas de expressão em E. coli, Bacillus) efúngicos, por exemplo, as leveduras (tais como, por exemplo,Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, espécie Pichia,espécie Hansenula), e outros sistemas de expressão fúngicos (por exemplo,os sistemas de expressão fúngicos filamentosos, derivados da espécieAspergillus, Trichoderma reesei, e Neurospora crassa); os sistemas deexpressão mamíferos, por exemplo, as células de CHO, e os sistemas deexpressão de plantas. As plantas e as células de plantas preferidas, parauso na expressão das proteínas de fusão da invenção, incluem o trigo, acevada, o milho, o sorgo, a aveia, o arroz e o painço. A pessoa versadaestará familiarizada com estes sistemas de expressão, os quais estãodescritos completamente na técnica.
Os novos agentes de controle de rodentes, como descritos nestedocumento, podem também estar na forma de um conjugado de proteína.Assim, em um aspecto adicional, a invenção proporciona um conjugado deproteína compreendendo um componente de anticorpo da invenção, comodescrito aqui, quimicamente conjugado a um componente tóxico oucomponente contraceptivo. Em uma modalidade, o componente tóxico ou ocomponente contraceptivo será uma pequena entidade química, enquantoque em uma modalidade adicional, o componente tóxico ou o componentecontraceptivo será uma proteína ou peptídeo, como descrito acima emrelação às proteínas de fusão da invenção. Onde o componente tóxico foruma pequena entidade química, os exemplos de compostos tóxicosadequados para uso neste aspecto da invenção incluem a colquicina; adoxorrubicina; a caliqueamicina; as moléculas da classe de fármacoantiinflamatório não esteroidal (NSAID); a citocalasina; os anticoagulantes,tais como o brodificoum, o difenacoum, a bromadiolona, o flocumafeno, adifetialona, as hidroxicumarinas, as indano-dionas; o calciferol; abrometalina; a flupropadina; o fosfeto de zinco; a cilirosida; o(mono)fluoracetato de sódio; a fluoracetamida; a alfacloralose; o sulfato detálio.
Onde o componente contráceptivo for uma pequena entidadequímica, os hormônios e os compostos semelhantes a hormôniosadequados, para uso neste aspecto da invenção, incluem, por exemplo, asprogesteronas e os estrogênios (tanto sintéticos quanto naturais) e odiazacom (isto é, 20,25 diazacolesterol).
O componente de anticorpo do conjugado de proteína pode serobtido como descrito anteriormente e pode ser direta e quimicamenteconjugado a um componente tóxico ou componente contráceptivo.Tipicamente, esta conjugação envolverá o uso de agentes heterobifuncionaisque resultam em ligações de dissulfeto ou tioéter, como descrito na técnica(ver, por exemplo, Hermanson, G.T. "Bioconjugate Techniques" AcademicPress, Londres, 1996, quanto às metodologias padrão relativas ao uso dereagentes reticuladores).
Em uma modalidade adicional, onde o componente tóxico oucontráceptivo for uma pequena entidade química, o composto tóxico, ohormônio ou o composto semelhante ao hormônio pode ser encapsulado, ea cápsula será ligada a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dainvenção. Em uma modalidade particular, a cápsula pode ser ligada atravésde conjugação química, conforme discutido acima. Em uma outramodalidade particular, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno dainvenção pode ser quimicamente conjugado, ou fundido através de umaligação peptídica, a um segundo componente de ligação que se liga àcápsula. Por exemplo, um fragmento de ligação a antígeno da invençãopode ser usado para proporcionar uma especificidade em uma molécula deligação biespecífica ou mesmo multiespecífica, onde a segundaespecificidade (ou uma especificidade adicional) é pela cápsula e estasegunda especificidade (ou especificidade adicional) é proporcionada poruma molécula (por exemplo, um fragmento de ligação a antígeno) que seliga especificamente à cápsula.
Em um aspecto adicional, o componente de anticorpo doconjugado de proteína é quimicamente conjugado a dois ou maiscomponentes tóxicos ou contraceptivos. O componente tóxico oucontraceptivo adicional pode estar na forma de uma porção protéica oupeptídica ou na forma de uma pequena entidade química. Onde pelo menosum componente tóxico ou contraceptivo adicional for uma porção protéica oupeptídica, o componente adicional pode ser uma toxina, imunógeno,hormônio ou mimético de hormônio proteináceo, como descritoanteriormente. Onde pelo menos um componente tóxico ou contraceptivoadicional for uma pequena entidade química, ele pode ser um compostotóxico ou um hormônio ou composto semelhante a hormônio, como descritoacima.
Em certas modalidades deste aspecto da invenção, osconjugados de proteínas são criados compreendendo um componente deanticorpo, conforme descrito aqui, quimicamente conjugado a pelo menosdois componentes adicionais, cada um dos quais confere ao conjugado deproteína uma função de controle (isto é, tóxica ou contraceptiva, ou ambas)de rodente. O segundo componente adicional (e o componente, oucomponentes, adicional) pode (cada um) ter funções de controle de rodenteiguais, ou diferentes, ao primeiro componente adicional, e, onde ele tiver(eles tiverem) a mesma função, ele (eles) pode(m) ter um modo de açãoigual, ou diferente (independentemente diferente), conforme acima descritoem relação às proteínas de fusão da invenção. Em uma modalidadeparticular, o conjugado de proteína compreenderá um componente deanticorpo, conforme descrito acima, quimicamente conjugado a uma ou maismoléculas de um segundo componente tóxico ou contraceptivo. O(s) local(is)de conjugação dependerá(ao) da química usada para a reação deconjugação. Onde for desejado que dois componentes adicionais diferentessejam conjugados ao primeiro componente (anticorpo), pode ser desejávelusar um método químico de conjugação diferente para cada componenteadicional, para assegurar que os diferentes componentes adicionais nãocompitam um com o outro pela conjugação ao mesmo local sobre o primeirocomponente.Ainda em um aspecto adicional da invenção, proporciona-se umagente de controle de rodente compreendendo uma proteína de fusão ouconjugado de proteína, como descrito acima, onde a proteína de fusão ou oconjugado de proteína compreende pelo menos dois componentes deanticorpos. Em uma modalidade, cada componente de anticorpo se liga àmesma proteína-alvo, desse modo aumentando a probabilidade de ligaçãodo agente de controle de rodente ao seu tecido-alvo e tambémpotencialmente aumentando a avidez de ligação do agente de controle derodente. Em tais modalidades, os componentes de anticorpos podem seridênticos ou diferentes. Onde os componentes de anticorpos foremdiferentes, isto inclui diferentes componentes de anticorpos que se ligam aomesmo RSE ou RSPE em uma proteína-alvo ou, mais preferivelmente,diferentes componentes de anticorpos com cada componente de anticorpose ligando a um RSE ou RSPE diferente, dentro da mesma proteína-alvo.Em uma modalidade adicional, o agente de controle de rodentecompreenderá componentes de anticorpos que se ligam a pelo menos duasproteínas-alvo diferentes. As modalidades compreendendo componentes deanticorpos que se ligam a diferentes RSEs ou RSPEs dentro de uma únicaproteína-alvo e/ou que compreendem componentes de anticorpos que seligam a diferentes proteínas-alvo podem ser particularmente úteis no retardodo início da resistência que ocorre ao agente de controle de rodente ou naoposição à resistência em um dos sítios-alvo potenciais.
Os anticorpos, os fragmentos de ligação a antígenos, asproteínas de fusão e os conjugados de proteínas da invenção são úteis nocontrole de rodentes, por exemplo, eles podem ser usados em métodos dematar rodentes ou em métodos de evitar a reprodução em rodentes. Assim,em um aspecto adicional, proporciona-se um agente de controle de rodentecompreendendo ou consistindo em um anticorpo, fragmento de ligação aantígeno, proteína de fusão ou conjugado de proteína, como descrito nestedocumento.
As proteínas de fusão e os conjugados de proteínas da invenção,onde o segundo componente de proteína for uma toxina ou onde o anticorpoou o fragmento de ligação a antígeno estiver conjugado a um compostotóxico ou toxina de proteína/peptídeo, obterão o controle dos rodentesmatando os rodentes (isto é, tais proteínas de fusão e conjugados deproteínas são rodenticidas em seu modo de ação). Onde o componente deanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno reconhecer uma proteínaexpressa no epitélio do trato Gl dos rodentes, a proteína de fusão ou oconjugado de proteína ligar-se-á ao epitélio. Dependendo do tipo de toxinaou composto tóxico presente na proteína de fusão/conjugado de proteína, atoxina ou o composto tóxico pode romper a membrana celular. A integridadedo epitélio do trato Gl está, assim, comprometida, e as lesões que ocorremno trato Gl resultarão na morte do rodente. Alternativamente, onde a toxinaou o composto tóxico mediar a toxicose através de um modo de açãointracelular, a proteína de fusão ou o conjugado de proteína ligado vale-seda internalização através da endocitose. Assim que a proteína dé fusão ou oconjugado de proteína tiver entrado na célula, a toxina/composto tóxico serácapaz de mediar a toxicose, que, no final, resultará na morte do rodente.
As proteínas de fusão, onde o segundo componente de proteínafor um imunógeno, também requerem a captação nas células dos rodentes.Uma vez presente dentro da célula do rodente, uma resposta imune émontada contra o imunógeno. Assim, onde o imunógeno for um antígenoespecífico para óvulo ou espermatozoide, isto resulta na geração de umaresposta imune que impede que a reprodução ocorra. Vantajosamente, oanticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da proteína de fusãoaumentará a quantidade de imunógeno que é absorvido no rodente (atravésda endocitose) e poderá também atuar como um adjuvante, assimaumentando a probabilidade da resposta imune adequada que está sendomontada.
As proteínas de fusão e os conjugados de proteínas da invenção,onde o segundo componente de proteína ou conjugado for um hormônio oucomponente semelhante ao hormônio, similarmente requerem a captaçãonas células dos rodente. Uma vez presente dentro de uma célula do rodente,o hormônio/composto semelhante ao hormônio interferirá com o controlehormonal de reprodução e, assim, controlará os rodentes por prevenção dareprodução.
A especificidade por rodehte da parte de anticorpo/ligação aantígeno das proteínas de fusão e dos conjugados de proteínas descritosneste documento confere diversas vantagens aos agentes de controle derodentes da invenção. A alta especificidade pelo tecido do rodente significaque o agente de controle dé rodente é alvejado especificamente para umtecido de rodente, desse modo facilitando a captação/atividade docomponente tóxico/imunogênico/hormonal. Por sua vez, este alvejamentoespecífico significa que menos agente de controle de rodente é provável deser requerido para o controle eficaz, menos agente de controle de rodenteestá presente no ambiente, e que o que está presente no ambiente não éespecífico para as, e é, assim, menos provável de ser absorvido pelas, ecausar dano às, espécies que não sejam alvos.
Os agentes de controle de rodentes da invenção podem serformulados como uma composição que compreende, como o ingredienteativo, uma proteína de fusão ou conjugado de proteína da invenção emcombinação com pelo menos um aditivo, diluente e/ou veículo. Os aditivosadequados incluem, por exemplo, os compostos que atuam como atraentespara os rodentes, os compostos que tornam a composição mais saborosapara o rodentes, os agentes de controle de rodentes adicionais, e oscompostos que servem para estabilizar ou proteger o agente, ou agentes, decontrole de rodente. Os compostos atraentes adequados incluem osmateriais alimentícios, tais como o trigo, a cevada, o milho, o sorgo, a aveia,o arroz e o painço. Os compostos intensificadores da palatabilidadeadequados, para uso na invenção, incluem os adoçantes (por exemplo, oacessulfame-K, o alitame, o aspartame, a brazzeína, o ciclamato, a sacarina,a sucralose, a sacarose, a glicose, o sorbitol, o manitol, o xilitol, a taumatina,a monelina, o isomalte, e a isomaltulose), os óleos vegetais ou animais (porexemplo, o óleo de milho, soja e amendoim, o óleo de peixe) e a levedurasecada. Os compostos intensificadores da estabilidade/protetoresadequados incluem aqueles que protegem ou impedem o agente, ou osagentes, de controle de rodente da proteólise ou da hidrólise com a ingestãopelo rodente, por exemplo, os antiácidos e os compostos que podem serusados na formação de cápsulas de liberação de pH.
Os diluentes e os veículos adequados, para uso nascomposições da invenção, incluem aqueles que, são usados como diluentese/ou veículos com agentes de controle de rodentes conhecidos, por exemplo,as ceras, e os agentes de ligação, por exemplo, os éteres de celulose, oamido, o poli(álcool vinílico), a polivinil pirrolidona, a goma guar, acarragenina, a gelatina, a goma caraia; a goma xantana, a goma acácia, aalfarroba, o tragacanto, a pectina e os poliacrilatos.
As composições da invenção podem compreender, além de,e/ou invés de, qualquer um dos aditivos, diluentes ou veículos antesmencionados, agentes de controle de rodentes adicionais, tais como aquelesmencionados acima na introdução da invenção. Em particular, a presenteinvenção também inclui as misturas de um ou mais dos novos agentes decontrole de rodentes descritos neste documento em combinação com pelomenos um anticoagulante de primeira geração e/ou pelo menos umanticoagulante de segunda geração. Os anticoagulantes de primeira geraçãopreferidos, para uso neste aspecto da invenção, incluem as hidroxicumarinase as indano-dionas, com a warfarina, o cumachor, a cumafurila e acumatetralila sendo hidroxicumarinas particularmente preferidas, e a pindona,a difacinona, e a clorfacinona sendo indano-dionas particularmentepreferidas. Os anticoagulantes de segunda geração preferidos, para usoneste aspecto da invenção, incluem a bromadiolona, o brodifacoum, odifenacoum, o flocumafeno, e a difetialona.
A presente invenção também inclui as misturas de pelo menosdois dos novos agentes de controle de rodentes, como descritos acima, bemcomo as composições (como descritas acima) compreendendo tais misturas.Por exemplo, onde um agente de controle de rodente for um componente deanticorpo que se liga a um epitopo extracelular de uma proteína que éexpressa em rodentes (isto é, o componente de anticorpo per se é o agentede controle de rodente funcional), este pode ser combinado com um ou maisagentes de controle de rodentes adicionais, onde o agente de controle derodente adicional compreende um componente de anticorpo e um ou maiscomponentes tóxicos ou contraceptivos (isto é, um ou mais agentes decontrole de rodentes são uma proteína de fusão ou um conjugado deproteína, como descrito neste documento). Nas modalidades adicionais, amistura compreenderá duas ou mais proteínas de fusão e/ou conjugados deproteínas, como descritos aqui.
Em uma modalidade, as proteínas de fusão da invenção sãoproduzidas em plantas e o material de planta que contém a proteína defusão expressa é usado como isca para o controle do rodente. Depreferência, a planta que produz a proteína de fusão será uma que sejacapaz de atuar como uma fonte de alimento para os rodentes, por exemplo,o trigo, a cevada, o milho, o sorgo, a aveia, o arroz e o painço, todos sãoplantas adequadas para a expressão das proteínas de fusão da invenção, deacordo com este aspecto da invenção. Em uma modalidade, éparticularmente preferido que a proteína de fusão seja expressa nassementes da planta. Neste modo, o grão de plantas que expressam umaproteína de fusão da invenção pode ser usado diretamente como isca.
Conforme acima mencionado, as composições da invenção,bem como as plantas e/ou o grão que contém as proteínas de fusão dainvenção, podem ser usados como agentes de controle de rodentes. Dessemodo, em mais um aspecto adicional, a invenção proporciona um método dematar os rodentes, compreendendo colocar um agente de controle derodente em uma área freqüentada por um rodente, de modo tal que, com aingestão pelo dito rodente do dito agente de controle de rodente, o ditorodente é morto. A pessoa versada também apreciará que a invençãotambém proporciona um método de evitar que os rodentes se reproduzam,compreendendo colocar um agente de controle de rodente em uma áreafreqüentada por um rodente, de modo tal que, com a ingestão pelo ditorodente do dito agente de controle de rodente, a capacidade reprodutiva dodito rodente é inibida.
Para testar a eficácia dos agentes de controle de rodentes dainvenção, podem ser conduzidos diversos estudos in vitro e in vivo. Umexemplo de um teste in vitro adequado é o ensaio da alça do intestino, comodescrito por Heylings 1991 (Toxicol. Appl. Pharmacol. 107:482-293) e noExemplo 9.
As estratégias típicas para a avaliação in vivo das propriedadesrodenticidas dos agentes de controle de rodentes da invenção são baseadasnas seguintes exigências: 1) minimizar o número de animais usados nostestes, 2) controlar os custos, 3) produzir informação útil rapidamente, 4) nãorejeitar substâncias ativas que possam ter potencial.
O teste inicial normalmente será conduzido no laboratório,porque as condições de teste podem ser cuidadosamente controladas. Umacascata de procedimentos de teste é usada. Esta cascata permite que assubstâncias ativas sejam aceitas ou rejeitadas por utilização de um processode decisão seqüencial. As cobaias usuais do teste são o rato pardo, Rattusnon/egicus, e o camundongo branco, Mus domesticus. O rato do telhado éuma outra cobaia de teste importante, porém, como ele não está disponívelcomo uma cepa de laboratório, ele é testado somente nos estágios finais deum programa de avaliação. As cepas de rodentes que são resistentes aosanticoagulantes podem também ser usadas nos estágios posteriores de umprograma de laboratório, para testar a eficácia contra estes animais.
Os agentes de controle de rodentes da invenção, que são ativose mostram potencial em testes de laboratório, podem então ser avaliados nocampo. Os ensaios de campo são conduzidos contra todas as espécies derodentes pragas importantes, em uma variedade de circunstâncias naturais.
A pessoa versada é referida aos documentos de diretriz queestão prontamente disponíveis e que descrevem procedimentos de testelógicos para rodenticidas no laboratório (EPPO/OEPP. 1999. Laboratorytests for evaluation of the toxicity and acceptability of rodenticides androdenticide preparations; OEPP/EPPO PP 1/113(2): 89-101) e no campo(EPPO/OEPP. 1999. Guidelines for the Efficacy Evaluation of PlantProtection Products: Field-tests against synanthropic rodents Mus musculus,Rattus norvegicus, R. rattus: OEPP/EPPO PP 1/114(2): 102-113). Asrecomendações estão também disponíveis para os procedimentos de testeque satisfazem as exigências reguladoras no UK (Anonymous. 2005.Guidelines on the Efficacy Data Requirements for Approval of Non-agricultural Pesticide Products Rodenticides. Health and Safety Executive,Bootle, UK, 30 pp), na União Européia (Anonymous. 2002. Technical notesfor guidance in support of the Annex VI of Directive 98/8/EC of the EuropeanParliament and the Council concerning the placing of biocidal products on themarket. Common principies and practical procedures for the authorizationand registration of products. European Commission, julho de 2002. 215 pp.)e nos Estados Unidos.
Uma cascata típica de testes, que pode ser seguida nolaboratório para avaliar a eficácia dos agentes de controle de rodentes dainvenção, pode incluir os testes de intubação oral, os testes de alimentaçãosem escolha, e os testes de alimentação com escolha. Os detalhesadicionais destes testes são resumidos abaixo.
Intubação Oral: os testes iniciais para estabelecer a potência dassubstâncias ativas envolvem a distribuição da substância ativa, carregadaem um líquido inerte, tal como o polietileno glicol, diretamente para oestômago das cobaias de teste, usando uma gavagem. As doses exataspodem ser distribuídas neste modo, para determinar a estatística percentilde dosagem letal. O teste proporciona informação sobre a capacidade dasubstância ativa de permanecer ativa nas condições encontradas nointestino da espécie de cobaia e sobre a sua transferência através dasmembranas do intestino. O teste também proporciona informação sobre atoxicidade intrínseca da substância ativa.
Testes de Alimentação Sem Escolha: virtualmente, todos osprodutos rodenticidas comerciais são apresentados como iscas formuladas.O estágio seguinte da cascata de teste envolve a preparação de uma iscacontendo a substância ativa (neste caso, um agente de controle de rodenteda invenção). Um teste 'sem escolha', no qual as cobaias de testeengaioladas individualmente têm somente a isca experimental apresentada aeles, é primeiramente conduzido para estabelecer se a substância ativa éativa quando distribuída como uma isca comestível. A isca de teste estánormalmente disponível ad libitum. Além de informação como aquela obtidanos testes de intubação oral, os testes de alimentação sem escolhaproporcionam informação sobre a capacidade da substância ativa de serremovida da isca pelos processos digestivos da, espécie de cobaia.
Testes de Alimentação, com Escolha: para serem capazes deserem controlados por uma substância ativa em uma isca formulada, osrodentes devem consumir quantidades suficientes da isca, para adquirir umadose letal na presença de alimentos naturais alternativos. Portanto, apalatabilidade da substância ativa (isto é, um agente de controle de rodenteda invenção) é um aspecto importante de avaliação. Os testes com escolhasão conduzidos, nos quais a substância ativa é adicionada a uma base deisca, em concentrações dosadas. As cobaias de teste engaioladasindividualmente são então deparadas com uma escolha entre uma isca deteste contendo a substância ativa e uma isca idêntica sem a substância ativa.Uma série de tais testes é conduzida para estabelecer a concentração dasubstância ativa que é detectada pelas cobaias de teste. Normalmente, taldetecção é demonstrada por uma aversão à isca contendo a substânciaativa. Uma consideração importante na avaliação é que a concentraçãodetectada pelas cobaias de teste, e que provocam aversão significativa, sejamenor do que a concentração requerida para distribuir uma dose letal emuma isca de teste.
São conduzidos testes com escolha adicionais em iscasexperimentais que são produzidas durante o desenvolvimento dasformulações comerciais. Estes testes com escolha envolvem a oferta daformulação experimental e uma 'dieta de desafio'. A dieta de desafio écomposta de modo que ela apresente uma alternativa razoavelmentesaborosa para a formulação experimental. Uma 'dieta de desafio' típica,usada em tais testes, é a 'refeição de EPA'. Esta é uma formulaçãocompreendendo quantidades fixas de aveia, grãos de milho, açúcar e óleo. Éprática normal que uma formulação experimental, cujo consumocompreenda um mínimo de 30% da dieta de desafio e da formulaçãoexperimental combinadas, consumidas pelas cobaias de teste, seriaconsiderada uma candidata potencial para os ensaios de campo.
Seguindo o teste de laboratório, a eficácia pode ser testada emum ambiente de campo. Os rodentes têm comportamentos complexos ealtamente adaptativos, que são somente exibidos de maneira completa sobcondições naturais. Portanto, os ensaios de campo podem ser conduzidospara avaliar a eficácia das substâncias ativas rodenticidas e dos produtosformulados sob condições de campo. Normalmente, os ensaios de camposão realizados contra uma faixa de espécies-alvo, em uma variedade deambientes naturais, que são típicos daqueles nos quais os tratamentos decontrole de rodentes práticos poderiam ser conduzidos.
Os ensaios de campo podem ser conduzidos em um estágioinicial do desenvolvimento do produto, usando formulações experimentais,não pretendidas para a comercialização, a fim de investigar os processoscomportamentais naturais nas espécies-alvo de rodentes, quando elas foremofertadas com uma isca típica contendo a substância ativa.
Os ensaios de campo podem também ser realizadossubseqüentemente em produtos de iscas comerciais, para demonstrar a suaeficácia sob condições práticas.
Diversos aspectos e modalidades da presente invenção serãoagora ilustrados em mais detalhe, como forma de exemplo. Será apreciadoque pode ser feita modificação do detalhe, sem sair do escopo da invenção.
Para evitar dúvidas sobre a referência literária, o pedido depatente, ou a patente citada dentro do texto deste pedido de patente, o textointeiro da dita citação é aqui incorporado por referência.Breve Descrição das Figuras
Figura 1 Inibição da tradução da luciferase pela geloninarecombinante.
Figura 2 Inibição da tradução da luciferase pelo conjugado deanticorpo policlonal anti-CNT2-gelonina recombinante. As amostras do "pool"A correspondem à fração reunida a partir da purificação por IMAC que foramdeterminadas conter anticorpo livre. As amostras do pool B correspondem àsfrações reunidas a partir da purificação por IMAC que foram determinadas
conter conjugado de anticorpo-toxina.
Exemplos
Exemplo 1 Geração e Preparação dos RSPES1.1 Seleção e síntese dos peptídeos
Os alvos protéicos potenciais, presentes sobre o epitélio dointestino dos rodentes, são identificados por abordagens da literatura e dabioinformática. Os epítopos de peptídeos específicos para rodentes (RSPEs)são identificados nestas proteínas com base nos seguintes critérios: altaidentidade de seqüência (preferivelmente entre 80 e 100% de identidade)entre as seqüências de camundongos e de ratos e baixa identidade deseqüência (preferivelmente entre 0 e 40% de identidade) entre a seqüênciade rodentes e humanas, e nenhum acerto significativo com as outrasespécies usando os alinhamentos de BLAST; seus perfis de hidrofilicidade(indicador da probabilidade de superfície); predições da flexibilidade e daestrutura secundária. Os algoritmos usados para predizer a hidrofilicidade, aflexibilidade e a estrutura secundária são proporcionados por programas nossoftwares integrados de programas DNAstar e Vector NTI.
Assim que um RSPE adequado tiver sido identificado, opeptídeo é sintetizado usando a síntese de fase sólida de Fmoc e purificadopara aproximadamente 90% de pureza. Os peptídeos mostrados na Tabela3 abaixo foram sintetizados.
Onde adequado, uma cisteína N-terminal é adicionada àseqüência, para capacitar a conjugação direta a uma proteína veículo.Alternativamente, e onde adequado, a seqüência é sintetizada com oaminoácido N-terminal deixado desbloqueado, para capacitar a conjugaçãodirecionada a uma proteína veículo. Quando não requerido para aconjugação, o aminoácido N-terminal é bloqueado por acetilaçao. Além disso,o aminoácido C-terminal é bloqueado com um grupo amida.<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table> 1.2 Conjugação dos peptídeos à BSA
Os peptídeos que contêm um resíduo de cisteína N-terminal sãoacoplados à BSA, usando o agente de reticulação hetero-bifuncional Esterde m-maleimidobenzoil-N-hidroxilsuccinimida. O acoplamento é através deas aminas primárias sobre os resíduos de lisina na BSA e os grupos sulfidrilasobre os resíduos de cisteína no peptídeo, conforme descrito por Kitagowa eAikawa. J. Biochemistry Vol. 79: págs. 233-236 (1976).
Uma solução a 25 mg/ml de BSA (Sigma, Poole, Dorset) épreparada em fosfato de sódio a 0,2 M, pH 7,0, e uma solução a 25 mg/mlde MBS (Perbio, Cheshire) formada em dimetil formamida (Sigma). 30 uJ desolução de MBS são adicionados, gota a gota, a 1 ml da solução de BSA,com mistura, e incubados no escuro, na temperatura ambiente, por 45minutos. A solução de BSA ativada é então passada para uma coluna defiltração em gel PD10 (GE Healthcare, Buckinghamshire), que tinha sidoanteriormente equilibrada com fosfato de sódio a 0,2 M, pH 7,0. As fraçõescontendo BSA são identificadas por absorbância a 280 nm e reunidas. 2 mg do peptídeo são dissolvidos em 1 ml de fosfato de sódio a 50 mM, pH 7,5. Adiciona-se solução de BSA ativada suficiente ao peptídeo, para atingir uma razão molar de peptídeo:BSA de 30:1. Este é incubado na temperatura ambiente por 4 horas, então durante a noite a 4°C no escuro, com mistura. Os peptídeos conjugados são armazenados a -20°C.
Os peptídeos que contêm resíduos de lisina ou aminas primárias na extremidade de N são acoplados à BSA usando o método de glutaraldeído em 2 etapas. O acoplamento é entre os grupos amina primários na BSA e o peptídeo, com base no método no Bio-conjugate Techniques, Academic Press 1996, págs. 583-584.
Uma solução a 10 mg/ml de BSA é formada em fosfato de sódio a 0,1 M, cloreto de sódio a 0,15 M, pH 6,8. O glutaraldeído (Sigma) é adicionado até uma concentração final de 1,25% e a mistura incubada, com mistura, por 12 horas na temperatura ambiente. A BSA ativada é passada para uma coluna de filtração em gel PD10, que tinha sido anteriormente equilibrada com PBS. As frações contendo BSA são identificadas por absorbância a 280 nm e reunidas. 2 mg do peptídeo são dissolvidos em 1 ml de carbonato de sódio a 0,5 M, pH 9,5, e solução de BSA ativada suficiente é adicionada ao peptídeo, para atingir pelo menos uma razão molar de peptídeo:BSA de 10:1. A mistura é incubada durante a noite, a 4°C. Os locais reativos em excesso são bloqueados por adição de 40 \ú de etanolamina a 1 M (Sigma). Os peptídeos conjugados são armazenados a -20°C.
Exemplo 2 Geração dos Componentes de Anticorpos
Os peptídeos que foram sintetizados e conjugados à BSA, conforme descrito no Exemplo 1 acima, são usados para gerar anticorpos que se ligam a um epitopo extracelular de uma proteína expressa em um rodente.
2.1 Protocolo de Imunização de Coelho
Os coelhos brancos da Nova Zelândia são usados para a produção de anticorpos policlonais. Os coelhos são imunizados com 100 ugde proteína administrada subcutaneamente usando o adjuvante de Freunds Completo (Sigma) para a primeira dose. Isto é seguido por três imunizações de reforço nos dias 28, 56 e 84 contendo 100 jig de proteína administrada subcutaneamente em adjuvante de Freunds Incompleto (Sigma). Os pré-' sangramentos são retirados antes da imunização inicial, os sangramentos de teste são retirados 10-14 dias após a terceira dose e os sangramentos de coleta são retirados 10-14 dias após a quarta dose.
Para cada um dos seguintes RSPEs, dois coelhos foram imunizados e os soros de anticorpos policlonais gerados: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 15.
Para cada um dos seguintes RSPEs, um coelho foi imunizado: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34.
2.2 Protocolo de Imunização de Camundongo/Hamster
Os camundongos e os hamsters são usados para a produção de anticorpos monoclonais, e são imunizados com 20 \ig de proteína administrada subcutaneamente em adjuvante de Freunds Completo para a primeira dose. Isto é seguido por duas imunizações de 20 jig de proteína administrada subcutaneamente nos dias 28 e 56. As doses são administradas em adjuvante de Freunds Incompleto no dia 28 e em solução salina tamponada com fosfato (PBS) no dia 56. Os sangramentos de teste são retirados 7 dias após a dose 3. Pelo menos 6 semanas após a terceira dose os camundongos são reforçados com 20 jug de proteína administrada intravenosamente em PBS. Os baços são coletados para as fusões 4 dias posteriormente.
Os camundongos foram imunizados com cada um dos seguintes RSPEs e os soros de anticorpos policlonais gerados: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29.2.3 Produção de anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais são gerados usando um método baseado em Kohler G. e Milstein C. Nature 256, 495-497 (1975). Os linfócitos são lavados dos baços coletados com Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Paisley) distribuídos por seringas com agulhas de escala 20. As células de mieloma NSO (Coleta Européia de Culturas de Células, Porton Down, Salisbury) são cultivadas em DMEM contendo 10% (v/v) de soro bovino fetal (PAA, Yeovil Somerset), L-glutamina a 2 mM, 1x suplemento HT e 50 unidades/ml de penicilina e 50 ug/ml de estreptomicina (todos da Invitrogen), a 37°C, em 5% de C02, até uma densidade de 5x105/mL. Os linfócitos de um único baço (aproximadamente 2x108) serão misturados com 2x107 células de mieloma NSO. Seguindo a centrifugação a 2000 x g por 4 minutos, o precipitado de célula é suavemente suspenso novamente e fundido por adição, gota a gota, de 1 ml de um polietileno glicol (1500) a 50% (p/v) em tampão de HEPES a 75 mM, pH 8 (Roche, Lewes, East Sussex), durante um minuto. O meio de cultura completo (como descrito acima) suplementado com suplemento de clonagem H1 (Roche) é adicionado lentamente, durante diversos minutos, até um volume final de 50 ml. A solução de fusão resultante é cultivada em cinco placas de cultura de células de microtítulo estéreis (Nunclon, Fisher, Loughborough, Leicestershire) a 100 ul/cavidade, por 4 horas, a 37°C, em 5% de C02, após o que 100 ul/cavidade de meio de cultura completo contendo 4% (v/v) de 1x meio de seleção HAT (Invitrogen) são adicionados. Quatorze dias após a fusão, os sobrenadantes da cultura são testados quanto aos anticorpos específicos para peptídeos usando um ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA) de captura de anticorpo, baseado nos métodos descritos por Engvall E., e Pewrlmann P. Immunochemistry 8, 871-874 (1971); Harlow E. et al., Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, págs. 182-183. As células de hibridoma selecionadas são retiradas através de pelo menos duas rodadas de clonagem por diluição limitante seguida por ensaio novamente, para assegurar tanto a clonalidade quanto a estabilidade dos hibridomas. Os bancos de hibridomas congelados sãopreparados em um meio de congelamento, composto de 10% (v/v) de DMSO (Sigma, Poole, Dorset) em soro bovino fetal, em uma taxa de congelamento de 1°C/minuto, por 80 minutos, seguido por armazenagem em nitrogênio líquido. A produção de anticorpos monoclonais selecionados é atingida por escalonamento da cultura de tecido.
As fusões de hibridomas foram obtidas usando linfócitos dos baços de camundongos imunizados com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO 6 e SEQ ID NO 27. 4 Cepas celulares monoclonais estáveis produzindo anticorpos contra o RSPE de GLUT7 de camundongo (SEQ ID NO 11) foram isoladas, desenvolvidas e congeladas. 4 Cepas celulares monoclonais estáveis contra o RSPE de CFTR de Rato (SEQ ID NO 5) foram isoladas. Sete cepas celulares monoclonais positivas produzindo anticorpos contra um RSPE de PepT1 de Rato (SEQ ID NO 1) foram isoladas, desenvolvidas e congeladas.
2.4 Identificação e isolamento dos componentes de anticorpos de bibliotecas de exposição em faqos
2.4.1 Classificação da biblioteca de exposição em faaos de Vhh de Camelídeo simples
Os RSPEs são preparados para a classificação de um repertório de exposição em fago filamentoso M13 de VHh de Uama glama simples por síntese química e conjugação subseqüente à BSA, como descrito no Exemplo 1.2 acima. A classificação de um repertório de domínio de ligação imune exposto em fago segue procedimentos estabelecidos, tais como aqueles descritos por McCafferty e Johnson (em "Phage Display of Peptides and Proteins", págs. 98-100, Eds. Kay, Wintere McCafferty, 1996, Academic press, Inc.). Os conjugados de RSPE::BSA são aderidos a superfície interior de Imunotubos Maxisorb (Nunc) por aplicação em tampão de hidrogeno carbonato de sódio a 50 mM, pH 9,6, em uma concentração de 100 (ig/ml, e incubação durante a noite. Os conjugados livres de RSPE::BSA são removidos por três enxágües em PBS, e então bloqueio da superfície por adição de PBS/2% de proteína de leite desnatado (PBSM) e incubação a 37°C por duas horas. Seguindo a sensibilização dos imunotubos com oRSPE requerido, a "bateia" é efetuada pela adição de 1012 a 1013 fagos em 4 ml de PBSM e incubação por duas horas, na temperatura ambiente. Após esta etapa, os conteúdos do tubo são aspirados e o tubo é lavado vinte vezes usando PBS/ 0,1% de Tween 20, seguidas por umas vinte lavagens adicionais com PBS. Os fagos ligados ao imunotubo (representando uma maioria de ligantes de VHh específicos para RSPE::BSA) são então eluídos pela adição de 1 ml de glicina a 100 mM, pH 3,0, por 10 minutos. A solução é transferida para um tubo novo contendo 0,5 ml de Tris-HCI a 1M, pH 7,4, para neutralizar. Os fagos eluídos são então usados para infectar as células de E. coli de fase log TG1 por mistura e incubação a 37°C por 30 minutos, seguidas por propagação sobre uma placa de 2x TY/2% de glicose/ 100 u.g/ml de ampicilina de 24 x 24 cm (Placa Nunc BioAssay), que é então incubada a 37°C durante a noite. No dia seguinte, a placa é raspada para remover as células (que representam uma população aumentada, enriquecida, de clones de fagomídios) contendo seqüências com especificidade de ligação pelo conjugado de RSPE::BSA. Para classificar/selecionar adicionalmente os clones a partir desta população, que demonstram alta afinidade pelo RSPE, as partículas de fagos são "resgatadas" pela adição de fagos auxiliadores, por exemplo, M13-K07, ou VCS-M13. Resumidamente, as células da última etapa são inoculadas em 50 ml de 2x YT/2% de glicose/100 |ig/ml de ampicilina em um frasco cônico de 250 ml e incubadas a 30°C até que a DOeoo seja cerca de 0,5. Os fagos auxiliadores são então adicionados para proporcionar uma razão de fagos auxiliadores para bactérias de 1:1, tipicamente 2x1010 pfu/50 ml, seguidos por incubação a 37°C por uma hora. A seguir, as células são sedimentadas por centrifugação a 3000g por 10 minutos, o sobrenadante é descartado, o precipitado de células é suspenso novamente e usado para inocular meio novo em um frasco de 2 litros: 500 ml de 2x YT7100 ug/ml de ampicilina/ 50 u,g/ml de canamicina (sem glicose). Esta cultura é incubada durante a noite, a 30°C, com agitação vigorosa, e as partículas de VHh em fagos são então coletadas pela adição de 100 ml de 20% de PEG/ NaCI a 2,5M por 30 minutos, a 4°C. Os fagos precipitados são então coletados por centrifugaçãoa 4000g, por 10 minutos, e suspensos novamente em 5 ml de PBS, prontos para a rodada seguinte de classificação. A eficiência do processo de seleção pode ser aperfeiçoada pela redução da quantidade de conjugado de RSPE::BSA usado para sensibilizar o imunotubo em cada rodada de bateia. Além disso, o processo de seleção pode ser ajustado para incluir etapas que influenciarão a seleção das partículas de VHh em fagos que exibem certas características físico-químicas, tais como a estabilidade proteolítica. Por exemplo, sabe-se que as partículas de fagos M13 são resistentes à proteólise por certas enzimas proteolíticas, tais como a tripsina e a quimotripsina (Schwind et al., 1992, Eur. J. Biochem. 210: 431-436), e que esta propriedade pode ser explorada na exposição em fago para a seleção de variantes estruturalmente estáveis (Kristensen e Winter, 1998, Folding & Design, 3:321-328).
Para selecionar os clones individuais que exibem a afinidade e a seletividade desejadas pelo RSPE, colônias únicas sobre uma placa de 2x TY/2% de glicose/ 100 ug/ml de ampicilina (obtida de amostras diluídas em série da E. coli TG1 infectada por fago eluído, após uma etapa de bateia) são coletadas e preparadas em um bloco de cultura de 96 cavidades contendo 150 uJ de 2x TY/2% de glicose/ 100 ng/ml de ampicilina por cavidade, e incubadas com agitação, a 30°C, até que a D06oo atinja aproximadamente 0,5. Os fagos auxiliadores são então adicionados a cada cavidade para proporcionar uma razão de fagos auxiliadores:bactérias de 1:1, seguidos por incubação adicional, com agitação, a 37°C, por uma hora. Então o meio é removido após sedimentação das células por centrifugação a 3000g, e substituído por 1,5 ml de 2x YT/100 [ig/ml de ampicilina/ 50 [ig/ml de canamicina (sem glicose), e a incubação é deixada continuar, com agitação vigorosa, a 30°C, durante a noite. As partículas de fagos são então coletadas de cada cavidade usando 20% de PEG/NaCI a 2,5 M, por 30 minutos, a 4°C, seguido por centrifugação a 4000g e suspensão novamente em PBS. Estas amostras de fagos clonais são usadas em um ELISA para determinar a afinidade de ligação relativa pelo RSPE imobilizado, usando um complexo de anticorpo anti-fago-HRP, ou, alternativamente, os VHh solúveissão expressos por infecção de um hospedeiro de E. coli supressor que não seja âmbar (tal como a cepa HB2151) com o fago. A cultura em 96 cavidades e a expressão dos VHh secrètados, solúveis, são então tornadas possíveis usando a indução por IPTG, e o meio de cultura bruto (contendo VHh solúveis), ou, os VHh purificados por IMAC (em virtude de uma marca de hexa-histidina integral) são usados no ELISA para determinar a ligação ao RSPE imobilizado. Um anticorpo de detecção adequado, neste caso, é o 9E10-HRP (Roche Molecular Biochemicals), que detecta a marca de c-Myc presente sobre a proteína de VHh solúvel.
Inicialmente, os seguintes RSPEs são classificados como conjugados de RSPE::BSA contra uma biblioteca de exposição em fago de Camelídeo simples, como descrito acima: RSPE com SEQ ID NO 5, RSPE com SEQ ID NO: 6, RSPE com SEQ ID NO: 11 e RSPE com SEQ ID NO 27. Os clones de VHh identificados a partir desta classificação são então usados na produção de proteínas de fusão e conjugados de anticorpos, como descrito neste documento.
2.5 Clonagem e Expressão dos Domínios de Ligação de Anticorpos Recombinantes
Para exemplificar o processo de criar anticorpos de cadeias individuais, mais especificamente scFv, o anticorpo monoclonal (MAb) de camundongo SV63 (que reconhece um epitopo da superfície celular a partir da fosfatase alcalina humana expressa por certos tumores colorretais) a partir do hibridoma HB-8766 (American Type Culture Collection; Rettig et al., 1989, US4851332) é usado como uma proteína de ligação a antígeno da superfície celular de modelo. Para derivar uma molécula de scFv a partir deste MAb de lgG1, as seqüências de Fv são clonadas do hibridoma, usando RT-PCR, com Fv de rodente e grupos de iniciadores específicos para domínios constantes, como descritos na literatura (por exemplo, Dubel et al. 1994, Journal of Immunological Methods 175: 89-95; McCafferty & Johnson em "Phage Display of Peptides and Proteins", pág. 95, Eds. Kay, Winter e McCafferty, 1996, Academic Press, Inc.), usando as modificações nos iniciadores individuais, como especificadas na literatura. As seqüênciasdos iniciadores usados neste Exemplo são dadas na Tabela 4 abaixo. Tabela 4 Iniciadores usados na clonagem dos scFv de SV63 a partir dos hibridomas HB-8766 da ATCC
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2.5.1 Isolamento do RNA do Hibridoma e síntese do cDNA
As células do hibridoma (107) foram centrifugadas e suspensas novamente em 1 ml de Trizol® e 200 pJ de clorofórmio. A amostra foi misturada vigorosamente por 15 minutos, na temperatura ambiente, e então centrifugada a 12000g por 15 minutos, a 4°C. A camada aquosa foi removida e uma quantidade igual de isopropanol foi adicionada. A amostra foi centrifugada a 12.000 rpm por 15 minutos, a 4°C, para precipitar o RNA, que foi lavado em etanol a 70% e então suspenso novamente em água sem RNase.
Os traços de DNA genômico foram removidos do RNA por tratamento com DNase sem RNase em uns 10 |il de reação contendo 5 fil de RNA, 0,1 U de DNase sem RNase I (Ambion) e 1U de RNasina. A mistura foi colocada a 37°C por 30 minutos, seguida por uma incubação a 80°C por 5 minutos.
O RNA tratado com DNase I foi então usado em uma reação de Accuscript (Stratagene), sob as condições padrão do fabricante (1,5 ul deRNA, 50 ul de volume de reação total, iniciador de oligo-dT), para produzir o cDNA de filamento simples.
2.5.2 Isolamento e clonagem da região Vh do SV63
A PCR foi efetuada usando 1 ul do cDNA de filamento simples iniciado com oligo-dT a partir do RNA do SV63 como molde e os oligonucleotídeos RoPro-9 (SEQ ID NO: 37) e RoPro-28 (SEQ ID NO: 38).
O Sistema de GC-RICH PCR da Roche foi usado com o tampão de resolução de GC-RICH em uma concentração de 0,5 M, em um volume de reação de 25 ul.
A reação foi efetuada em um Robocycler da Stratagene com as seguintes condições de ciclo:
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O rendimento de produto da PCR foi muito baixo a partir desta reação. Portanto, uma segunda PCR foi efetuada para amplificar adicionalmente as moléculas produzidas.
Usando como molde os 2 ul do produto da PCR a partir da reação descrita acima, duas reações foram estabelecidas usando os seguintes pares de oligonucleotídeos: i) RoPro-6 (SEQ ID NO 39, menos específico do que RoPro-9 (SEQ ID NO 37) e RoPro-25 (SEQ ID NO: 40, alojado em 3') e ii) RoPro-9 (SEQ ID NO 37) e RoPro-28 (SEQ ID NO: 38). A PCR foi efetuada conforme descrita acima.
Quando as amostras das reações acima mencionadas foram corridas sobre um gel de 1% de agarose/TBE e coloridas com brometo de etídio, ambas as PCRs continham fragmentos de DNA de aproximadamente 400 bp. O produto da PCR resultante da reação 2 acima descrita foi isolado e purificado usando o kit Geneclean Spin e clonado no pCRTOPO Bluntll (Invitrogen).
Oito clones TOPO foram completamente caracterizados por seqüenciamento de DNA, um destes clones tinha as características de umaseqüência de VH típica (porém única), como determinadas através de análise por BLASTP dos bancos de dados de UniProt/IPI.
2.5.3 Isolamento e clonagem da região VL do SV63
A PCR foi efetuada usando 2 ul do cDNA de filamento simples iniciado com oligo-dT derivado do RNA de. SV63 como molde e os oligonucleotídeos RoPro-3 (SEQ ID NO: 41) e RoPro-4 (SEQ ID NO: 42). A DNA polimerase de Pfu Ultra da Stratagene foi usada em um volume de reação de 50 ul e a reação foi efetuada em um termociclizador MJ Research Dyad, usando as seguintes condições de ciclo: 95 °C, 1 min, então [95 °C, 1 min; 52 °C, 1 min; 68 °C, 3 min por 40 ciclos, seguidos por uma extensão final de 68 °C, 10 min.
Uma amostra da reação acima descrita foi analisada sobre um gel de 1 % de agarose/TBE e colorida com brometo de etídio, um fragmento de aproximadamente 350 bp foi observado. Este produto da PCR foi isolado e purificado usando eluição com gel QiaQuick (Qiagen) e clonado no pCRTOPOBIunt II (Invitrogen).
Cinco clones TOPO foram completamente caracterizados por seqüenciamento de DNA, quatro destes clones eram idênticos e tinham as características de uma seqüência de VL típica (porém única), como determinadas através de análise por BLASTP dos bancos de dados de UniProt/IPI. Um dos cinco clones continha uma seqüência que era idêntica à seqüência variável de cadeia leve capa MOPC21 (Swissprot: P01634), uma seqüência irrelevante amplificada a partir do par de fusão de mieloma usado na criação do hibridoma.
2.5.4 Montagem das següências de Vh e VL nos constructos de scFv
A extensão de sobreposição da PCR (também conhecida como "Extensão de sobreposição da união"; SOE) foi usada para criar duas orientações do scFv do SV63: (i) VH-ligante [Gly4Ser]3-VL e (ii) VL-ligante [Gly4Ser]3-VH, cada uma contendo seqüências líderes de PelB N terminais e marcas de FLAG e de hexa-histidina C terminais nos vetores de expressão em E. coli pDGF (derivado do vetor de NEB pMALc-2, o pDGF contém todas as características do pMALc-2, exceto pela seqüência que codifica aproteína de ligação à maltose, que foi excisada) e plMS147 (Hayhurst e Harris, 1999, Protein Expression and Purification 15: 336-343). A Tabela 5 abaixo indica os iniciadores de oligonucleotídeos usados e o seu propósito.
Tabela 5 Iniciadores usados na montagem das seqüências de Vh e nos constructos de scFv
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Para criar a seqüência de scFv de VL-ligante de [Gly4Ser]3-VH, a PCR foi efetuada em duas etapas. A primeira etapa consistia em duas reações usando i) os oligo's 1 e 2 de scFv (SEQ ID NOs: 43 e 44, respectivamente) e um clone de pCRTOPOBIuntll SV63 VL como molde para amplificar a metade em 5' do constructo; ii) os oligo's 3 e 4 de scFv (SEQ ID NOs: 45 e 46, respectivamente) e um clone de pCRTOPOBIuntll SV63 VH como molde pra amplificar a metade em 3' do constructo. A segunda etapa usou a SOE para unir os dois fragmentos de (i) e (ii) por anelamento de suas extremidades 3' e 5' complementares (respectivamente) e extensão até o produto de tamanho natural pela adição de polimerase, com amplificaçãosubseqüente usando os oligo's 1 e 4 de scFv (SEQ ID NOs: 43 e 46, respectivamente).
A seqüência de scFv de VH-ligante de [Gly4Ser]3-VL foi criada em uma abordagem similar. A primeira etapa consistia em duas reações usando i) os oligo's 5 e 6 de scFv (SEQ ID NOs: 47 e 48, respectivamente) e um clone de pCRTOPOBIuntll SV63 VH como molde para amplificar a metade em 5' do constructo; ii) os oligo's 7 e 8 de scFv (SEQ ID NOs: 49 e 50, respectivamente) e um clone de pCRTOPOBIuntll SV63 VL como molde pra amplificar a metade em 3' do constructo. A segunda etapa usou a SOE para unir os dois fragmentos de (i) e (ii) por anelamento de suas extremidades 3' e 5' complementares (respectivamente) e extensão até o produto de tamanho natural pela adição de polimerase, com amplificação subseqüente usando os oligo's 5 e 8 de scFv (SEQ ID NOs: 47 e 50, respectivamente).
As reações da primeira etapa foram efetuadas usando um kit GC RICH da Roche e as condições do fabricante, com o tampão de resolução de GC-RICH em uma concentração de 0,5 M, em um volume de reação de 25 jliI. As reações foram efetuadas em um Robocycler da Stratagene com as seguintes condições de ciclo:
Ciclo 1-2 Ciclo 3-27 Extensão final
94°C 30s 94°C 30s
54°C 30s 65°C 30s
72°C60s 72°C60s 72°C 300s
As amostras das reações acima mencionadas foram analisadas sobre um gel de 1% de agarose/TBE e coloridas com brometo de etídio e estas revelaram que todos os quatro fragmentos de DNA esperados tinham sido produzidos.
As reações com SOE da segunda etapa foram realizadas por mistura dos pares de fragmentos apropriados em quantidades aproximadamente iguais, nas reações com o kit GC RICH da Roche, usando as condições do fabricante, com o tampão de resolução de GC-RICH em uma concentração de 0,5 M, em um volume de 25 ul. As reações foram efetuadas usando as condições de ciclo de 2 etapas abaixo:-Ciclo 1-2 94°C 30 s 65°C 30 s 72°C 60 s
Esta reação atua como uma extensão do iniciador produzindo fusões de tamanhos naturais. Os iniciadores de oligonucleotídeos foram então adicionados para amplificar por PCR as moléculas de tamanhos naturais, usando as condições de ciclo abaixo. Ciclo 3-15
94°C30s 65°C30s Extensão final
72°C60s 72°C300s
Quando as amostras das reações com SOE acima mencionadas foram analisadas sobre um gel de 1% de agarose/TBE e coloridas com brometo de etídio, ambas as reações foram mostradas conter fragmentos de DNA de aproximadamente 750 bp (o tamanho esperado).
Os produtos da SOE foram isolados e purificados usando os kits Geneclean Spin e clonados no pCRTOPO Bluntll (Invitrogen). Para cada produto da SOE (VH->VL e VL->VH), um clone TOPO foi completamente caracterizado por seqüenciamento de DNA. Os constructos de expressão de pDGF (pDGF-SV63-VHVL e pDGF-SV63-VLVH) foram então criadas pela excisão das seqüências de scFv a partir do pCRTOPOBIuntll usando Ndel e EcoRI, e ligação subseqüente no DNA da cadeia principal do vetor pDGF similarmente preparado. Os constructos de expressão de plMS147 (pIMS-SV63-VHVL e plMS-SV63-VLVH) foram também geradas por excisão das seqüências de scFv a partir do pCRTOPOBIuntll usando Nco\ e EcoRI, e ligação subseqüente no DNA da cadeia principal do vetor plMS147 similarmente preparado. As reações de ligação foram transformadas nas células de E. coli TOP10 (Invitrogen) seguindo as instruções dos fabricantes e os transformantes identificados. Os clones corretos de plMS147-SV63 scFV e pDGF-SV63 scFv foram identificados através de análise da seqüência de DNA, para confirmar a manutenção do quadro de leitura e aexatidão da seqüência.
2.5.5 Expressão da Proteína de scFv Recombinante em E. coli
Os clones de plMSSV63-scFv de E. coli TOP10 foram testados quanto à expressão da proteína de scFv solúvel seguindo as orientações descritas por Charlton (em "Antibody Engineering: methods & protocols" págs. 245-254, Ed. B.K.C. Lo, Humana Press, 2004). Resumidamente, as culturas da noite anterior dos clones selecionados foram usadas para inocular 500 ml de 2TY (amp/glu) (16 g de Bacto-peptona/ 5 g de Extrato de levedura/ 5 g de NaCI/ 2% (p/v) de glicose em 1 litro, pH 7,5, + 100 ug/ml de ampicilina) em frascos de 2,5 I, que foram então incubadas a 37°C e 250 rpm até que a D06oo atingisse aproximadamente 0,8. Neste ponto, as células foram coletadas por centrifugação a 3000g e transferidas para 500 ml de 2TY (amp/suc) novo (16 g de Bacto-peptona/ 5 g de Extrato de levedura/ 5 g de NaCI/sacarose a 0,4 M em 1 litro, pH 7,5, + 100 ug/ml de ampicilina) em frascos de 2,5 I. A incubação então começou a 30°C e 250 rpm por 1 hora, antes da adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM. A incubação então prosseguiu por umas 16 horas mais, em cujo ponto as células e os meios foram coletados e analisados quanto à presença de scFv recombinante usando procedimentos de SDS-PAGE e transferência Western. A análise por Western usando o anticorpo anti-FLAG M2-HRP (Sigma) em combinação com a solução de substrato cromogênico de BM POD (Roche) indicou bons níveis de expressão da proteína recombinante (do peso molecular de tamanho esperado de aproximadamente 30 kDa) em ambas as amostras de lisado de célula solúvel e meio para ambas as orientações do scFv.
A proteína de scFv recombinante foi purificada usando cromatografia em coluna IMAC e testada quanto à funcionalidade por competição com o MAb SV63 parental pela ligação ao antígeno, em um ensaio imunocitoquímico usando as células Caco2Bbel (CRL-2102, American Type Culture Collection). Ambas as orientações do scFv foram observadas inibir a ligação do MAb SV63 parental às superfícies celulares, indicando a manutenção da superfície de ligação ao antígeno no scFv engenheirado.Exemplo 3 Purificação do Anticorpo
3.1 Preparação das colunas de afinidade por peptídeo
Para a purificação dos anticorpos específicos para peptídeos a partir dos soros policlonais, são produzidas colunas de afinidade por peptídeo. Dependendo do resíduo N-terminal do peptídeo, um de dois métodos para a preparação da coluna foi usado. Estes usaram o gel de acoplamento SulfoLink ou AminoLink como a matriz de afinidade.
O gel de acoplamento SulfoLink (Perbio) permite a imobilização covalente dos peptídeos contendo sulfidrila a um suporte de gel de agarose para uso nos procedimentos de purificação por afinidade. Os RSPEs são acoplados a este gel, usando um protocolo fornecido pelo fabricante e resumido abaixo.
10 ml da pasta fluida de gel Sulfolink (volume de leito de gel de 5 ml) são equilibrados até a temperatura ambiente. A pasta fluida de gel é vertida em uma coluna e equilibrada com 20 ml de tampão de acoplamento (Tris a 50 mM, EDTA a 5 mM, pH 8,5) (Sigma). 1 mg de peptídeo sintético é dissolvido em 5 ml de tampão de acoplamento e adicionado à coluna. A coluna é vedada e incubada na temperatura ambiente, com mistura por inversão, por 15 minutos, então o gel é deixado assentar por 30 minutos. O tampão em excesso é deixado drenar, antes da coluna ser lavada com 15 ml de tampão de acoplamento. Os locais de ligação não específica são bloqueados com 5 ml de cloridrato de L-cisteína a 50 mM (Sigma) no tampão de acoplamento. A coluna é vedada e incubada com e sem mistura, conforme descrito acima. A coluna é lavada com 30 ml de cloreto de sódio a 1 M (Sigma) e preparada para armazenagem por aplicação de 10 ml de PBS degaseificado, pH 7,2, contendo 0,05% de azida sódica (Sigma). A coluna acoplada é armazenada a 4°C.
O gel de acoplamento AminoLink (Perbio) permite a imobilização covalente dos peptídeos, através da amina primária, a um suporte de gel de agarose, para uso em procedimentos de purificação por afinidade. Os RSPEs são acoplados a este gel, usando um protocolo fornecido pelo fabricante e resumido abaixo.10 ml de pasta fluida de gel AminoLink (volume de leito de gel de 5 ml) são equilibrados até a temperatura ambiente. A pasta fluida de gel é vertida na coluna e equilibrada com 20 ml de tampão de acoplamento (fosfato de sódio a 0,1 M, pH 7,5, 0,05% de azida sódica). 1 mg de peptídeo sintético é dissolvido em 5 ml de tampão de acoplamento. 250 ul de cianoboroidreto de sódio a 1 M misturados em hidróxido de sódio a 0,01 M (Sigma) são então adicionados à solução de peptídeo, a qual é vertida na coluna. A coluna é vedada e incubada na temperatura ambiente, com mistura por inversão, por 6 horas. A coluna é deixada em repouso e então o sobrenadante é removido. 5 ml de Tris-HCI a 1 M, pH 7,4 (Sigma) e 250 ul de cianoboroidreto de sódio a 1 M misturado em hidróxido de sódio a 0,01 M são adicionados. A coluna é vedada e incubada na temperatura ambiente, com mistura por inversão, por 30 minutos. A coluna é lavada com 30 ml de cloreto de sódio a 1 M e preparada para armazenagem por aplicação de 10 ml de PBS degaseificado contendo 0,05% de azida sódica. A coluna acoplada é armazenada a 4°C.
3.2 Purificação dos anticorpos específicos para peptídeos a partir dos soros policlonais
Os soros policlonais de ratos são centrifugados a 2500x g por 10 minutos, filtrados usando membranas de 0,45 mícron e então diluídos 1:1 com PBS. A coluna de afinidade por peptídeo é deixada atingir a temperatura ambiente e então equilibrada com 4 volumes de coluna de PBS. Uma solução de soro preparada é adicionada à coluna, com o fluxo sendo reaplicado à coluna. A coluna é lavada com 6 volumes de coluna de PBS. O anticorpo específico para peptídeo é eluído por aplicação de glicina-HCI a 0,1 M, pH 3,0 (Sigma), à coluna e coleta de frações de 1 ml em tubos contendo 0,1 ml de Tris-HCI a 1 M, pH 8,0. As frações contendo a proteína são então identificadas por absorbância a 280 nm e reunidas. O anticorpo purificado é dialisado em PBS usando um cassete Slide-a-Lyser com corte de peso molecular de 10.000 (Perbio) e armazenado a -20°C. Neste meio-tempo, a coluna é regenerada com 3 volumes de coluna de glicina-HCI a 0,1 M, pH 2,5, seguidos por 8 volumes de coluna de PBS.3.2 Purificação dos anticorpos monoclonais
A IgG monoclonal é purificada do sobrenadante da cultura através de cromatografia por afinidade de proteína G, usando uma coluna de 1 ml HP de proteína G HiTrap (GE Healthcare). O sobrenadante da coluna é centrifugado a 2500x g por 10 minutos e filtrado usando membranas de 0,45 mícron, antes do uso. A vazão máxima é 1 ml/minuto o tempo todo. A coluna é equilibrada com 10 volumes de coluna de PBS, pH 7, e a amostra é carregada. A coluna é lavada com 10 volumes de coluna de PBS. O anticorpo é eluído por aplicação de glicina-HCI a 0,1 M, pH 3,0 (Sigma), à coluna e coleta de frações de 1 ml em tubos contendo 0,1 ml de Tris-HCI a 1 M, pH 8,0. As frações contendo a proteína são então identificadas por absorbância a 280 nm e reunidas. O anticorpo purificado é dialisado em PBS usando um cassete Slide-a-Lyser com corte de peso molecular de 10.000 (Perbio) e armazenado a -20°C. Neste meio-tempo, a coluna é regenerada com 10 volumes de coluna de glicina a 0,1 M, pH 2,5, lavada com 10 volumes de coluna de PBS e armazenada em etanol a 20%, a 4°C.
Exemplo 4 Caracterização do Anticorpo
4.1 Título dos anticorpos antipeptídeos por ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA)
Os soros obtidos de coelhos, camundongos ou hamsters imunizados com os conjugados de peptídeos são testados por ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), para determinar a magnitude relativa das respostas dos anticorpos, com base nos métodos descritos por Engvall E., e Perlmann P. Immunochemistry 8, 871-874 (1971); Harlow E. et al., Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 págs. 182-183.
As soluções de peptídeos, a 2 \xg/m\, em bicarbonato de sódio a 35 mM, carbonato de sódio a 15 mM, pH 9,5, são adicionadas, a 100 fil/cavidade, às placas de microtítulo de 96 cavidades e incubadas por pelo menos quatro horas, a 4°C. As placas são então lavadas três vezes com PBS, 0,05% de Tween 20 (PBST) (Sigma). Os locais de ligação restantes são bloqueados com 200 ul/cavidade de PBS contendo 1% de pó de leitedesnatado (Marvel, Premier Foods, St Albans), por 30 minutos, natemperatura ambiente. Após a lavagem como acima descrito, o PBST éadicionado às placas, a 100 ul/cavidade. As diluições iniciais dos soros sãoadicionadas às placas em duplicata na coluna 1 e então duplamente diluídasatravés das cavidades das placas, deixando ,as cavidades na coluna 12contendo somente PBST. As placas são incubadas na temperatura ambiente,por 2 horas. Após lavagens adicionais como acima descritas, as placas sãoincubadas na temperatura ambiente por 1 hora com o anticorpo conjugadoantiespécie apropriado, diluído para 1/10.000 em PBST. As amostras desoros de coelhos são incubadas com o conjugado de anti-lgG de coelho emcabra peroxidase do rábano-silvestre (HRP) (Sigma); o conjugado anti-lgGde hamster sírio em coelho HRP (Stratec, Soham, Cambridgeshire) e asamostras de soros de camundongos serão incubadas tanto com o conjugadoanti-lgG de camundongo em coelho HRP (Sigma), quanto com o conjugadoanti-lgG de camundongo em cabra fragmento Fc HRP (Sigma). A solução desubstrato é preparada por diluição de um comprimido contendo 1 mg dedicloridrato de 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (Sigma) em 10 ml de ácido cítricoa 24 mM, fosfato de sódio a 60 mM, pH 5,0, e adição de 2 (il de solução a30% de peróxido de hidrogênio (Sigma). Após lavagem adicional, umasolução de substrato nova é adicionada às placas, a 100 ul/cavidade, e asplacas são deixadas no escuro, na temperatura ambiente; por 30 minutos. Odesenvolvimento de cor resultante é interrompido por adição de 50ul/cavidade de ácido sulfúrico a 3 M. A densidade óptica da placa é entãolida a 450 nm usando uma leitora de placa de microtítulo.
4.2 Resultados do ELISA
4.2.1 Anti-soros policlonais de Coelhos
Os soros retirados, após a terceira dose, de coelhos imunizadoscom RSPEs a partir das seguintes proteínas-alvo (ver o Exemplo 2.1 acimadescrito), transportador de oligopeptídeo PepT1 de Rato, CD155 (PVR -receptor do poliovírus; Tage4) de Rato, GTR2 de Rato, CFTR de Rato,CNT2 de Rato, MDR1 de Rato, MDR1 de Camundongo, sacarose-isomaltase de Rato, GLUT7 de Camundongo, GTR5 de Rato, OATP-B deRato, GCC de Rato, PLB de Rato, LPH de Rato, AMPN de Rato, MCDL deRato e SCAB de Rato, foram testados pelo ELISA de peptídeo como descritono Exemplo 4.1 acima mencionado. Os soros de teste e pré-imunes de cadacoelho foram testados por titulação contra o seu peptídeo de imunização. Aresposta imune foi avaliada por cálculo dos valores de título de ligação de50% (diluição requerida para reduzir o sinal máximo até 50%). Os resultadossão resumidos na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6 Resultados do ELISA mostrando que foram gerados anticorpospoliclonais de coelhos contra os RSPEs.
<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table>
Os soros de cada um dos sangramentos de teste forampurificados por afinidade, conforme descrito no Exemplo 3.2, e entãotestados por ELISA, conforme descrito anteriormente. Os resultados sãodados na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7 Resultados do ELISA para os anticorpos purificados por afinidadeobtidos de soros de teste de coelhos.
<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table>
Os sangramentos de coleta para os coelhos imunizados com oRSPE do transportador de nucleosídeo CNT2 de Rato foram tambémpurificados por afinidade e testados por ELISA. O sangramento de coleta docoelho 1 foi eluído em 36,5 ml, em uma concentração de 0,86 mg/ml, e otítulo de ligação de 50% foi testado em 1 em 47.000. O sangramento decoleta do coelho 2 foi eluído em 27,5 ml, em uma concentração de 0,57mg/ml, e o título de ligação de 50% foi testado em 1 em 44.000.
Os anticorpos policlonais purificados por afinidade do coelho 1foram adicionalmente purificados usando uma coluna de Proteína A(Amersham), dialisados contra a solução salina tamponada com fosfato(PBS), e testados por ELISA. Isto resultou em 13 ml de IgG policlonalpurificada adicional contra o RSPE derivado de CNT2 (SEQ ID NO: 6), quetinha uma concentração de 1,97 mg/ml e um título de ligação de 50% de 1em 90.000.4.2.2 Anti-soros policlonais de Camundonqos
Os soros retirados, após a terceira dose, de camundongosimunizados com RSPEs a partir das seguintes proteínas-alvo (ver o Exemplo2.2 acima descrito), transportador de oligopeptídeo PepT1 de Rato, CD155(PVR - receptor do poliovírus; Tage4) de Rato, GTR2 de Rato, CFTR deRato, CNT2 de Rato, MDR1 de Rato, MDR1 de Camundongo, sacarose-isomaltase de Rato, GLUT7 de Camundongo, GCC de Rato, PLB de Rato, eLPH de Rato, foram testados pelo ELISA de peptídeo como descrito noExemplo 4.1 acima mencionado. Os soros de teste de cada camundongoforam testados por titulação contra o peptídeo de imunização. A respostaimune foi avaliada por cálculo dos valores de título de ligação de 50%(diluição requerida para reduzir o sinal máximo até 50%). Os resultados sãoresumidos na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8 Resultados do ELISA mostrando que foram gerados anticorpospoliclonais de camundongos contra os RSPEs especificados.
<table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>
4.2.3 Anticorpos monoclonais para um RSPE a partir do transportador deolioopeptídeo PepT1 de rato
40 ml do sobrenadante de cultura de cada uma das sete cepascelulares monoclonais positivas, que produzem anticorpos contra o RSPEtendo SEQ ID NO 1 (ver o Exemplo 2.3 acima descrito), foram purificadospor afinidade, conforme descrito no Exemplo 3.2, e então testados porELISA, como descrito no Exemplo 4.1 acima mencionado. Os anticorposmonoclonais purificados foram testados por titulação contra o peptídeo deimunização (SEQ ID NO: 1). A resposta imune foi avaliada por cálculo dosvalores de título de ligação de 50% (diluição requerida para reduzir o sinalmáximo até 50%). Os resultados são resumidos na Tabela 9 abaixo.Tabela 9 Resultados do ELISA para sobrenadante de cultura purificado porafinidade a partir das cepas celulares de hibridomas geradas decamundonqos imunizados com um RSPE do transportador de oligopeptídeoPepT1 de Rato.
<table>table see original document page 70</column></row><table>As cepas celulares de hibridomas 1645.142.002, 1644.112.040 e1647.372.245 claramente produzem anticorpos monoclonais quereconhecem o RSPE tendo a seqüência de SEQ ID NO 1, que é derivada doPepT1 de Rato.
4.2.4 Anticorpos monoclonais para um RSPE a partir do transportadorGLUT7 de Camundongo
40 ml do sobrenadante de cultura de cada uma das quatro cepascelulares monoclonais positivas, que produzem anticorpos contra o RSPEtendo SEQ ID NO 11 (ver o Exemplo 2.3 acima descrito), foram purificadospor afinidade, conforme descrito no Exemplo 3.2, e então testados porELISA, como descrito no Exemplo 4.1 acima mencionado. Os anticorposmonoclonais purificados foram testados por titulação contra o peptídeo deimunização (SEQ ID NO: 11). A resposta imune foi avaliada por cálculo dosvalores de título de ligação de 50% (diluição requerida para reduzir o sinalmáximo até 50%). Os resultados para dois dos quatro anticorposmonoclonais anti-GLUT7 são resumidos na Tabela 10 abaixo.Tabela 10 Resultados do ELISA para sobrenadante de cultura purificado porafinidade a partir das cepas celulares de hibridomas geradas decamundonqos imunizados com um RSPE do transportador GLUT7 deCamundongo.
<table>table see original document page 71</column></row><table>
4.3 Imunoistoguímica das secções de tecido do intestino
O tecido do intestino do rato foi congelado rapidamente emnitrogênio líquido e armazenado a -80°C até o uso. Todo o tecido foiseccionado sobre um criostato a -20°C e o tecido foi colocado sobre lâminaspositivamente carregadas, fixado em acetona gelada por 10 min e deixadosecar ao ar. As lâminas foram armazenadas a -20°C e usadas dentro de 1mês do seccionamento. Antes de começar a imunoistoquímica, todas aslâminas foram deixadas aquecer até a temperatura ambiente. Elas foramentão carregadas para o Sequenza, para a IHM manual ser efetuada. Todasas lâminas foram bloqueadas para peroxidases endógenas por aplicação dobloco de peroxidase (fornecido no kit Envision® da Dako) por 6 min, natemperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas em solução salinatamponada com TRIS (10 mM) com tween 20 (0,1%) (TBST) por 5 min. Asproteínas não específicas foram bloqueadas por adição de proteínas do leitea 5% (Marvel®) por 30 min, na temperatura ambiente. As lâminas foramlavadas por 5 min em TBST. O anticorpo primário (misturado em TBST com1% de Marvel®, nas diluições estabelecidas na tabela) foi aplicado e aslâminas foram incubadas por 1 hora, na temperatura ambiente. As lâminasforam então lavadas em TBST (2x5 min). O polímero Envision® de coelhofoi aplicado e incubado sobre as lâminas por 30 min, na temperaturaambiente. As lâminas foram lavadas (2 x 5 min) em TBST. O DAB foiaplicado por 5 min, na temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas emH2O destilada, desidratadas através de álcoois graduados e xileno e entãomontadas em DPX.<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>Continuação...
<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>A coloração específica foi avaliada com o uso de peptídeos debloqueio. Os anticorpos primários, na diluição para dar uma coloração ótima,foram incubados com um excesso de 10 vezes de peptídeo, por 2 horas, natemperatura ambiente, em TBS com 1% de Marvel®, antes da aplicaçãosobre as lâminas, o protocolo restante foi cpnforme acima descrito. Osresultados são resumidos na Tabela 11 acima.
Exemplo 5 Produção de Toxinas Protéicas Recombinantes5.1 Produção de gelonina recombinante
O gene que codifica a proteína gelonina de 251 aminoácidos(ver Nolan et al., 1993, Gene 134:223-227) juntamente com a seqüêncialíder de pelB e uma marca de hexa-histidina C terminal foram otimizados nocódon para a expressão em E. coli e clonados em um vetor de expressãoem E. coli (pDGF - derivado do vetor de NEB pMALc-2, o pDGF contémtodas as características do pMALc-2, exceto pela seqüência que codifica aproteína de ligação à maltose, que foi excisada), sob o controle do promotorde tac híbrido. O vetor recombinante foi transformado na cepa de E. coliTOP10.
A expressão da gelonina foi obtida por desenvolvimento dascélulas TOP10 transformadas em meio LB com indução a 28°C com IPTG a1 mM, por 20 horas. Seguindo a coleta das células de E. coli, as célulasforam rompidas usando uma célula de pressão French (Constant Systems;rompimento a 137.895,1459 kPa (20.000 psi)) em 1xPBS/lmidazol a 30 mM.O extrato solúvel foi aplicado a uma coluna GraviTrap (GE Healthcare) e,após uma lavagem de 15 ml com 1xPBS/lmidazol a 30 mM, a gelonina foieluída em 1xPBS/lmidazol a 500 mM. Como uma segunda etapa depurificação, o eluato foi dessalinizado em tampão de fosfato de sódio a 20mM, pH 8,0, e aplicado a uma coluna de troca de cátion Resource S comuma eluição de gradiente de sal de 0 a 1 M.
Para determinar se a gelonina recombinante era ativa (funcional),a proteína gelonina purificada foi testada em um ensaio de inibição datradução da proteína (sistema de transcrição/tradução acoplado, rápido TNTT7, Promega) usando o DNA da luciferase T7 como o substrato. Como umcontrole positivo, usou-se a cicloeximida. Isto demonstrou que a geloninapurificada recombinante inibiu a tradução do DNA da luciferase T7.
5.2 Produção de VIP2A recombinante
O gene que codifica a proteína VIP2A de 464 aminoácidos (ver aUS 5.849.870), juntamente com uma marca de hexa-histidina C terminal, foiotimizado no códon para a expressão em E. coíi e clonado no vetor deexpressão pET24a (Novageh). O vetor recombinante foi transformado nacepa de E. coli BL21(DE3).
A expressão de VIP2A foi obtida por desenvolvimento dascélulas BL21(DE3) transformadas em meio LB, com indução a 28°C comIPTG a 1 mM, por 20 horas. Seguindo a coleta, as células foram rompidasusando uma célula de pressão French, como descrito no Exemplo 5.1 acimamencionado. O extrato solúvel foi aplicado a uma coluna HisTrapHP (GEHealthcare) e, após lavagem com 5 volumes de coluna de PBS/imidazol a 20mM, a proteína VIP2A foi eluída com um gradiente de até 500 mM deimidazol.
A análise por SDS-PAGE do extrato solúvel e da amostra dapurificação revelou uma banda no tamanho esperado para a VIP2A commarca de Histidina produzida de modo recombinante.
5.3 Constructo de expressão para a produção de Granzima B recombinante
Um gene que codifica a proteína Granzima B madura de 228aminoácidos a partir do rato (ver o N- de acesso do Genbank M34097quanto à informação sobre a seqüência) foi sintetizado artificialmente(fragmento de DNA 050031) e clonado no pCR-Script para dar o plasmídiop050031. Uma abordagem de PCR alojada foi usada para introduzir aseqüência de codificação de Granzima B no vetor de expressão pET32a(+)(Novagen).
A seqüência de codificação de Granzima B madura a partir doP050031 foi amplificada por PCR usando os iniciadores RoPro070petEK/rGrzB F1 (SEQ ID NO: 51) e RoPro067 rGrzB R (SEQ ID NO: 52),para introduzir uma extremidade de 5' homóloga ao sítio de enterocinasepresente na marca de fusão em pET32a(+). O produto da PCR resultante foiusado como um molde para a segunda parte da PCR alojada, que foirealizada usando os iniciadores RoPro076 petEK/rGrzB F2 (SEQ ID NO: 53)e RoPro067rGrzB R (SEQ ID NO: 52) para introduzir um sítio de Kpn\ em 5'.
O produto da PCR final foi digerido com Kpnl/Notl e ligado nopET32a(+) similarmente digerido, para dar o vetor de expressãopET32a(+)::rGrzB. Isto resulta em. uma fusão limpa entre a marca deexpressão N terminal a partir do vetor hospedeiro e a seqüência decodificação de Granzima B recombinante, assim permitindo a ativação daGranzima B recombinante por tratamento com a enterocinase seguindo aexpressão. O vetor de expressão final pET32a(+)::rGrzB pode sertransformado em qualquer hospedeiro de expressão de E. coli adequado(por exemplo, RosettaGami (DE3)).
As seqüências dos iniciadores usados no constructo depET32a(+)::rGrzB são como se segue (todas as seqüências de iniciadoressão dadas 5' até 3'): RoPro070 petEK/rGrzB F1 (SEQ ID NO: 51)GGTACCGACGACGACGACAAGATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAGCCAC; RoPro067 rGrzB R (SEQ ID NO: 52) AGCTGGCGGCCGCCTAGGAC;RoPro076 petEK/rGrzB F2 (SEQ ID NO: 53) AGATCTGGGTACCGACGACGACGAC.
Exemplo 6 Conjugação dos Componentes de Anticorpos às Toxinas
6.1 Conjugação da qelonina comercialmente disponível aos anticorpos policlonais anti-CNT2 de Rato
A estratégia escolhida para realizar este procedimento é ativar oanticorpo com o ligante SPDP (3-[2-piridilditio]propionato de N-succinimidila;Pierce Chemical Co.), que formará a ligação de dissulfeto à toxina tiolada. Ométodo usado veio de: Hermanson 1996 "Bioconjugate Techniques" (Aca-demic Press pág. 509), que estabeleceu que a conjugação não interfeririacom a atividade da toxina gelonina (30 kDa). Ambas as razões molares de5:1 e 10:1 de gelonina para anticorpo policlonal anti-CNT2 foram usadas pa-ra obter a mistura de reação mais eficiente.6.1.1 Tratamento do anticorpo policlonal par CNT2 com SPDP
Uma alíquota de 1 ml da IgG policlonal do coelho 1 purificadacom proteína A (ver o Exemplo 4.2.1, o sangramento de coleta a partir docoelho 1 foi purificado por afinidade e então purificado usando uma colunade Proteína A) foi concentrada usando um concentrador de rotação centriconcom corte de 10 kDa. Os 160 ul resultantes foram misturados com uma solu-ção a 10 mg/ml em PBS EDTA a 10 mM, pH 8. 6 ul de SPDP (3 mg/ml emDMF) foram adicionados a 200 ul de solução de anticorpo e incubados por30 min, na temperatura ambiente. A mistura de reação foi aplicada a umacoluna de dessalinização PD10 equilibrada com PBS + EDTA a 10 mM, pH 8.Todo o volume de 3,5 ml de amostra foi coletado e concentrado usando umconcentrador centricon, para obter o anticorpo anti-CNT2 tratado com SPDPem uma concentração final de 3,6 mg/ml.
6.1.2 Tiolação da gelonina
A gelonina foi obtida do Aczon SpA como uma amostra de 5 mgde proteína liofilizada, purificada a partir das sementes de Gelonium multiflo-rum. A amostra foi originalmente dissolvida em PBS em uma concentraçãode 5 mg/ml. 300 ul desta solução foram concentrados em um concentradorcentricon e o volume reduzido para 55 ul. Este foi então diluído em trietano-lamina a 50 mM EDTA a 10 mM, pH 8, para dar uma solução de gelonina a10 mg/ml. O 2-imunotiolano foi dissolvido para dar uma solução a 20 mg/mlem água destilada. 10,5 ul desta solução de 2-imunotiolano foram adiciona-dos a 150 ul de solução de gelonina e a mistura incubada sobre gelo, poruma hora. A gelonina ativada foi aplicada a uma coluna de dessalinizaçãoPD10, equilibrada com PBS + EDTA a 10 mM, pH 8. Todo o volume de 3,5ml de amostra foi coletado e concentrado em um concentrador centricon,para obter a gelonina tiolada em uma concentração final de 3 mg/ml.
6.1.3 Conjugação do anticorpo policlonal anti-CNT2 à gelonina
Para obter uma razão molar de 5:1 de gelonina para anticorpoanti-CNT2, 0,5 mg de gelonina tiolada necessitou ser reagido com 0,5 mg deanticorpo anti-CNT2. Desse modo, 138 ul de anticorpo anti-CNT2 tratadocom SPDP foram adicionados a 167 ul de gelonina tiolada.
A reação foi também efetuada em uma razão molar de 10:1 degelonina para anticorpo anti-CNT2 (1 mg de gelonina tiolada em 333 ul foiadicionado a 0,5 mg de anticorpo anti-CNT2 tratado com SPDP em 138 ul).Cada reação foi vedada sob nitrogênio e incubada por 20 horas, a 4°C. Apóseste tempo, quaisquer resíduos de sulfidrila não reagidos foram bloqueadospela adição de iodoacetamida até uma concentração final de 2 mM.
6.1.4 Análise do conjugado
Cada mistura de reação foi analisada por espectrometria demassa MALDI-TOF, SDS-PAGE e ELISA. Os dados (não mostrados) obtidosda separação por SDS-PAGE das misturas de reação e da espectrometriade massa revelaram que cada reação de conjugação foi bem-sucedida, e asespécies foram identificadas com 1, 2 e 3 moléculas de gelonina conjugadasa uma única molécula de anticorpo. Embora os dados de espectrometria demassa revelassem a presença de algum anticorpo não conjugado, a quanti-dade era insuficiente para ser observada sobre um gel de SDS-PAGE colori-do com coomassie. Pareceu não haver nenhuma diferença na eficiência deconjugação entre as 2 razões de reação.
Os ensaios de ELISA foram realizados como descritos anterior-mente sobre cada mistura de reação, para avaliar se a atividade de ligaçãodo anticorpo era afetada pela reação de conjugação. O dado obtido é resu-mido na Tabela 12 abaixo.
Tabela 12. Dado do ELISA para a conjugação de gelonina aos anticorpos
<table>table see original document page 82</column></row><table>
Pode ser visto que a ligação foi afetada tanto pela adição do poliligador de SPDP quanto pela conjugação à gelonina. Entretanto, a mistura de reação de anticorpo conjugado ainda exibe ligação significativa. Isto podeser atribuído ao anticorpo tanto conjugado quanto não conjugado na misturade reação. Visto que a quantidade de anticorpo não conjugado é baixa, as-sume-se que uma boa proporção da ligação observada pode ser atribuída aoanticorpo conjugado.
6.2 Conjugação da gelonina recombinante aos anticorpos policlonais anti-CNT2 de Rato
A mesma estratégia como resumida acima, no Exemplo 6.1, foiadotada para conjugar a gelonina recombinante, produzida conforme descri-to no Exemplo 5 acima, aos anticorpos policlonais anti-CNT2 de Rato. Umarazão molar de gelonina para anticorpo policlonal anti-CNT2 de 5:1 foi usadapara obter a mistura de reação mais eficiente.
6.2.1 Tratamento do anticorpo policlonal anti-CNT2 com SPDP
3,75 mg do policlonal do coelho 1 purificado com proteína A co-mo uma solução a 10 mg/ml em PBS/EDTA a 10 mM, pH 8, foram mistura-dos com 11,25 ul de SPDP (3 mg/ml em DMF) e incubados por-30-minrna-temperatura ambiente. A mistura de reação foi passada através de uma co-luna de dessalinização Zeba (Pierce Chemical Co.), pré-equilibrada comPBS/EDTA a 10 mM, pH 8.
6.2.2 Tiolacão da gelonina recombinante
3,75 mg da gelonina recombinante foram misturados, a 10 mg/ml,em trietanolamina a 50 mM EDTA a 10 mM, pH 8. O 2-iminotiolano (reagen-te de Traut; Sigma-AIdrich) foi dissolvido, a 20 mg/ml, em H20 deionizadadegaseificada e borbulhada com nitrogênio, 26,25 ul desta foram adiciona-dos à solução de gelonina e incubados em uma atmosfera de nitrogênio,sobre gelo, por uma hora. A gelonina tiolada foi passada através de umacoluna de dessalinização, pré-equilibrada com PBS/EDTA a 10 mM, pH 8.
6.2.3 Conjugação do anticorpo policlonal anti-CNT2 à gelonina recombinante
A solução de anticorpo reagida com SPDP foi misturada com asolução de gelonina recombinante tiolada, resultando em quantidades iguaisde cada constituinte de proteína, proporcionando uma razão molar de 5:1 degelonina recombinante para anticorpo. A reação foi vedada sob nitrogênio eincubada por 20 horas, a 4°C.
Após este tempo, quaisquer grupos sulfidrila não reagidos forambloqueados pela adição de iodoacetamida até uma concentração final de 2mM, seguida por um mínimo de uma hora de incubação, na temperaturaambiente.
6.2.4 Separação do conjugado da gelonina recombinante não conjugada
A filtração em gel com PBS foi usada para separar as moléculasde gelonina não conjugadas dos conjugados. Uma coluna 10/300 Superdex200 (Amersham-Pharmacia) foi equilibrada em PBS por 3 volumes de coluna(VCs) usando uma unidade de FPLC Akta (Amersham-Pharmacia). A croma-tografia foi controlada por um software Unicorn que executa em PC (Amer-sham-Pharmacia), que injetou a amostra e então manteve uma vazão de 0,5ml/min, com as frações de 0,5 ml coletadas para um bloco de 96 cavidadesapós 0,1 VC ter eluído. A eluição foi deixada processar por 1,4 VC.
As frações selecionadas foram analisadas sobre um gel de SDS-- PAGE não redutor (4-12% de bis-tris NuPage em tampão de MOPS; Invitro-gen), conforme descrito pelo fabricante. O gel foi colorido usando o corantecoomassie SimplyBlue (Invitrogen), conforme descrito pelo fabricante. Asfrações que foram determinadas conter os conjugados foram reunidas esubmetidas à etapa de purificação seguinte.
6.2.5 Separação do Conjugado do Anticorpo anti-CNT2 não conjugado
A presença da extremidade C terminal de hexa-histidina sobreas moléculas de gelonina recombinantes permitiu a aplicação de cromato-grafia por afinidade de quelato de metal imobilizado (IMAC) como uma se-gunda etapa cromatográfica na purificação dos conjugados. A ausência deum motivo de hexa-histidina sobre o anticorpo não conjugado (ainda presen-te nas frações de conjugado após a filtração em gel) permite a remoção doanticorpo livre dos conjugados que contêm hexa-histidina. Portanto, as fra-ções reunidas, obtidas em 6.2.4 acima mencionado, foram passadas atravésde uma coluna por afinidade de níquel de 1 ml HisTrap HP (pré-equilibradapor 5 VCs de PBS/imidazol a 15 mM; Amersham Biosciences) unida a umaunidade de FPLC Akta controlada por um software Unicorn que executa emPC (Amersham Biosciences). A carga e a lavagem da coluna foram efetua-das sobre 5 VCs usando PBS/imidazol a 15 mM como o tampão de car-ga/lavagem. A eluição das proteínas contendo hexa-histidina foi efetuadapela aplicação de um gradiente de 15 mM a 500 mM de imidazol (em PBS)sobre 20 VCs. As frações foram coletadas em volumes de 0,5 ml em um bloco de 96 cavidades.
As frações selecionadas foram analisadas sobre um gel de SDS-PAGE não redutor (4-12% de bis-tris NuPage em tampão de MOPS; Invitrogen), conforme descrito pelo fabricante. O gel foi colorido usando o corantecoomassie SimplyBlue® (Invitrogen), conforme descrito pelo fabricante.
O gel revelou que os conjugados foram substancialmente purificados do anticorpo livre pela etapa por IMAC. As frações contendo os conjugados foram reunidas e dessalinizadas em PBS usando concentradores derotação de 20 ml VivaSpin, com um corte de peso molecular de 10 kD.
6.2.6 Análise do conjugado
A espectrometria de massa MALDI-TOF foi usada para-analisar-a composição da amostra de conjugado reunida em relação ao anticorpoanti-CNT2 não conjugado. Os espectros de massa obtidos (não mostrados)indicaram a presença de razões de 1:1, 1:2 e 1:3 das espécies de conjuga-dos de anticorpo:gelonina na fração de conjugado reunida (Pool B). Nenhu-ma espécie unicamente carregada de anticorpo não conjugado foi observada,entretanto um pico sobre o espectro foi identificado, o qual correlaciona-secom uma espécie duplamente carregada de anticorpo não conjugado. Assim,embora a maior parte do anticorpo não conjugado fosse purificada do anti-corpo conjugado (conforme indicado através de análise por SDS-PAGE dapurificação por IMAC), pode ser deduzido que uma quantidade muito peque-na de anticorpo não conjugado permanece na amostra purificada reunida.
A atividade funcional do conjugado na amostra reunida purifica-da por IMAC foi avaliada por ELISA (para determinar o efeito da conjugaçãosobre a ligação do anticorpo) e por um ensaio de inibição da tradução in vitro(para determinar se a atividade funcional da gelonina tinha sido afetada pelaconjugação).
O ELISA (dados não mostrados) revelou resultados similaresàqueles observados para a conjugação à gelonina comercialmente fornecida(Exemplo 6.1.4 acima descrito): a ligação do anticorpo foi afetada tanto pelaadição do poliligante de SPDP quanto pelo conjugação à gelonina recombi-nante, porém a mistura de reação de anticorpo conjugado ainda exibia liga-ção significativa ao RSPE de CNT2 de Rato. Embora a análise por espec-trometria de massa indicasse que poderia ainda haver algum anticorpo nãoconjugado permanecendo, mesmo após a purificação por IMAC, a quantida-de de anticorpo não conjugado nas amostras purificadas por IMAC será me-nor do que na mistura de reação de conjugação para gelonina natu-ral/anticorpo anti-CNT2 como uma conseqüência da purificação por IMAC.Desse modo, a ligação do anticorpo observada pode ser atribuída comosendo principalmente devida ao conjugado de anticorpo anti-CNT2-geloninarecombinante.
A retenção da capacidade inibidora do ribossomo da geloninarecombinante conjugada ao anticorpo anti-GNT2, na amostra contendo conjugado reunida, a partir da purificação por IMAC, foi determinada usando osistema de transcrição/tradução acoplado rápido TNT (Promega), conformedescrito pelo fabricante. A figura 2 mostra os resultados. A inibição traducional exibida pelos conjugados na amostra reunida purificada por IMAC (PoolB) é equivalente àquela da gelonina recombinante original (rGelonina). Assim, a capacidade inibitória do ribossomo foi mantida após a conjugação.6.3 Conjugação da p-purotionina comercialmente disponível aos anticorpospoliclonais anti-CNT2 de Rato
A estratégia escolhida para esta conjugação foi usar o ligante deTFCS (Pierce), que tem um braço espaçador grande, para dar tanta exposição quanto possível à molécula de p-purotionina relativamente pequena (5kDa). O TFCS tem um grupo éster de NHS em uma extremidade, que se ligaaos grupos amina sobre o anticorpo, e um grupo amina protegido na outraextremidade, que é exposto para reagir com a p-purotionina apropriadamente tratada por elevação do pH para 8. Os grupos carboxila sobre a purotionina são reagidos com EDC para formar um intermediário reativo de aminainstável, o qual é então reagido com o sulfo-NHS para proporcionar uma ligação mais estável. A p-purotionina tratada com EDC/sulfo-NHS é entãoligada à extremidade de amina do ligante de TFCS.6.3.1 Tratamento do policlonal para CNT2 com TFCS
Uma alíquota de 1 ml de IgG policlonal do coelho 1 purificadacom Proteína A (ver o Exemplo 4.2.1, ú sangramento de coleta do coelho 1foi purificado por afinidade e então purificado usando uma coluna de Proteí-na A) foi concentrada usando um concentrador de rotação centricon comcorte de 10 kDa. O volume de amostra resultante foi misturado com 5 mg/mlde tampão de Fosfato de Sódio a 0,1 M NaCI a 0,15 M, pH 7,2. 15 ul deTFCS (3 mg/ml em DMF) foram adicionados por 500 ul de anticorpo e incu-bados por 1 hora, na temperatura ambiente. A mistura de reação foi aplicadaa uma coluna de dessalinização PD10, equilibrada com tampão de fosfato a0,1 M, pH 8. Todo o volume de 3,5 ml de amostra foi coletado e concentradousando um concentrador centricon, para obter o anticorpo anti-CNT2 tratadocom TFCS em uma concentração final de 10 mg/ml.
6.3.2 Tratamento da B-purotionina com EDC e sulfo-NHS
A p-purotionina liofilizada do endosperma de trigo (Takara) foidissolvida em tampão de Fosfato de Sódio a 0,1 M NaCI a 0,15 M, pH 7,2,até uma concentração final de 10 mg/ml. O EDC foi adicionado para dar umaconcentração final de 2 mM, juntamente com o sulfo-NHS até uma concen-tração final de 5 mM, e a mistura foi deixada reagir na temperatura ambiente,por 15 minutos. A reação foi interrompida por adição de 2-mercaptoetanolaté uma concentração final de 20 mM. A p-purotionina ativada foi aplicada auma coluna de dessalinização de poliacrilamida (limite da exclusão por ta-manho de 1.800 Da; Pierce), equilibrada com tampão de Fosfato de Sódio a0,1 M, NaCI a 0,15 M, pH 7,2. As frações foram coletadas e a DO280 nmchecada quanto à presença da toxina.
6.3.3 Conjugação do anticorpo policlonal anti-CNT2 à p-purotionina ativada
O anticorpo tratado com TFCS e a p-purotionina tratada comEDC/sulfo-NHS foram misturados para dar uma razão molar de 30:1 de p-purotionina:anticorpo anti-CNT2 e deixados reagir a 4°C, durante a noite. Areação foi então interrompida por adição de hidroxilamina até uma concen-tração final de 10 mM. A mistura de reação foi então aplicada a uma colunade cromatografia de exclusão por tamanho para separar a p-purotionina livredo conjugado de anticorpo-p-purotionina. As frações contendo o conjugado
foram reunidas.
6.3.4 Análise do conjugado
A espectrometria de massa MALDI-TOF foi processada para a-nalisar a composição da amostra de conjugadp reunida em relação ao anti-corpo anti-CNT2 não conjugado. Os espectros de massa obtidos (não mos-trados) indicaram a presença de razões de 1:1, 1:2 e 1:3 das espécies deconjugados de anticorpo:(3-purotionina nas frações de conjugados reunidas.Algumas espécies unicamente carregadas de anticorpos não conjugadosforam também observadas.
A atividade funcional do conjugado na amostra reunida foi avali-ada por ELISA, conforme anteriormente descrito. O título de ligação de 50%para o conjugado foi calculado a 0,067 ng/ml em comparação com 0,041u.g/ml para o anticorpo anti-CNT2 não conjugado.
Tabela 13 Análise imunoistoguímica do tecido gastrointestinal do rato com oconjugado de anti-CNT2::(3-purotionina
<table>table see original document page 88</column></row><table>
Uma amostra do conjugado de anti-CNT2::(3-purotionina foi usa-da para a análise imunoistoquímica do tecido gastrointestinal de rodente (vero Exemplo 4.2 quanto à metodologia). Os resultados são resumidos na Ta-bela 13 acima.Exemplo 7 Constructo do Vetor de Expressão de Proteína de Fusão
Os vetores de expressão de proteínas de fusão foram construí-dos entre um scFv que reconhece um antígeno da superfície celular e trêstoxinas protéicas diferentes, gelonina, granzima B, e cyt2A. Os scFvs usadosnesta exemplificação são os scFvs de SV63 descritos no Exemplo 2.5 acimamencionado. As técnicas padrão de biologia molecular para a preparação deplasmídio, digestão com enzima de restrição, ligação, transformação em E.coli etc. foram seguidas inteiramente.
7.1 Constructos de fusão de gelonina-scFv
O gene que codifica a proteína gelonina de 251 aminoácidos(ver Nolan et al. supra) foi sintetizado artificialmente com a seqüência de 5',projetada para permitir a fusão em quadro à seqüência de codificação de Vh(dando surgimento ao gene artificial 054014) ou VL (dando surgimento-ao-gene artificial 054013) a partir do anticorpo SV63, e subclonado no pCR-Script para dar as duas constructos p054013 e p054014.
O plasmídio p054013 foi digerido com Spel e NoÜ e o fragmentoque codifica a gelonina que foi gerada foi purificado e ligado ao pDGF-SV63-VHVL similarmente digerido, para dar o vetor pDGF-SV63-VHVLrGel. Istocriou uma fusão em quadro entre a extremidade de N do scFv de SV63, a-través de um único ligante Gly4Ser, à Gelonina recombinante. Assim, o cas-sete de expressão em pDGF-SV63-VHVLrGel compreende os seguintescomponentes na direção de 5' para 3': promotor de tac, seqüência líder depelB, seqüência de codificação de VH de SV63, ligante [Gly4Ser]3, seqüênciade codificação de VL de SV63, ligante Gly4Ser, seqüência de codificação deGelonina recombinante.
A seqüência de codificação de VH de SV63, o ligante [Gly4Ser]3,a seqüência de codificação de VL de SV63, o ligante Gly4Ser, e a seqüênciade codificação de Gelonina recombinante podem facilmente ser excisadoscomo um fragmento de Nco\/EcoR\ e ligados em vetores de expres-são/clonagem alternativos, por exemplo, no plMS147 ou no pET32a, se de-sejado.
O plasmídio p054014 foi digerido com BseRle Notl e o fragmôn-to gerado que codifica a gelonina foi purificado e ligado no pDGF-SV63-VLVH similarmente digerido, para dar o vetor pDGF-SV63-VHVLrGel. Istocriou uma fusão em quadro entre a extremidade de N do scFv, através deum único ligante Gly4Ser, à Gelonina recombinante. Assim, o cassete de ex-pressão em pDGF-SV63-VHVLrGel compreende os seguintes componentesna direção de 5' para 3': promotor de tac, seqüência líder de pelB, seqüênciade codificação de VL de SV63, ligante [Gly4Ser]3, seqüência de codificaçãode VH de SV63, ligante Gly4Ser, seqüência de codificação de Gelonina re-combinante.
A seqüência de codificação de VL de SV63, o ligante [Gly4Ser]3,a seqüência de codificação de VH de SV63, o ligante Gly4Ser, e a seqüênciade codificação de Gelonina recombinante podem facilmente ser excisadoscomo um fragmento de Nco\/EcoR\ e ligados em vetores de expres-são/clonagem alternativos, por exemplo, no plMS147 ou no pET32a, se de-sejado.
7.2 Constructos das fusões de Granzima B-scFv
Foram feitos dois constructos, cada um carregando a GranzimaB fundida N terminal a um scFv de SV63: pET32a::rGrzB::SV63 VHVL epET32a::rGrzB::SV63 VLVH.
O plasmídio pET32a::rGrzB::SV63 VHVL foi construído usandopET32a(+)::rGrzB (Exemplo 5.3 acima mencionado) como um molde, emconjugação com uma abordagem de extensão de sobreposição de iniciado-res, para fundir a seqüência de codificação de Granzima B madura ao scFvde SV63 na orientação VHVL (extremidade de N para C), através de um único ligante Gly4Ser.
(i) a seqüência 3' terminal que codifica um único ligante Gly4Serfoi adicionada à seqüência de codificação de Granzima B madura por utiliza-ção de pET32a(+)::rGrzB como um molde para a PCR com os iniciadorespET F (SEQ ID NO: 54) e RoPro 071 G4S/rGrzB R1 (SEQ ID NO: 55).
(ii) a seqüência 5' terminal que codifica um único ligante Gly4Sere parte da seqüência de codificação de Granzima B foi adicionada à se-qüência de codificação de VHVL de SV63, usando o pDGF-SV63-VHVL co-mo um molde para a PCR com os iniciadores RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F(SEQ ID NO: 56) e RoPro 075 pET/VHVL R (SEQ ID NO: 57).
Os produtos de (i) e (ii) acima mencionados foram purificados emisturados em quantidade equimolares, antes da extensão sem iniciadorese a PCR subseqüente usando pET F (SEQ ID NO: 54) e RoPro 075pET/VHVL R (SEQ ID NO: 57) para amplificar um produto de fusão de tama-nho natural que foi clonado nó pET32a(+) usando sítios de Sful e Notl únicos.
O plasmídio pET32a::rGrzB::SV63 VLVH foi também construídousando pET32a(+)::rGrzB (Exemplo 5.3 acima descrito) como um molde emconjunção com uma abordagem de extensão de sobreposição de iniciadores,para fundir a seqüência de codificação de Granzima B madura ao scFv deSV63 na orientação VLVH (extremidade de N para C), através de um únicoligante Gly4Ser.
(i) a seqüência 3' terminal que codifica um unido ligante Gly4Serfoi adicionada à seqüência de codificação de Granzima B, conforme descritoem (i) acima.
(ii) a seqüência 5' terminal que codifica um único ligante Gly4Sere parte da seqüência de codificação de Granzima B foi adicionada à se-qüência de codificação de VLVH de SV63, usando o pDGF-SV63-VLVH co-mo um molde para a PCR com os iniciadores RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F(SEQ ID NO: 58) e RoPro 073 VLVH/pET R (SEQ ID NO: 59).
Os produtos de (i) e (ii) acima mencionados foram purificados emisturados em quantidade equimolares, antes da extensão sem iniciadorese a PCR subseqüente usando pET F (SEQ ID NO 54) e RoPro 073 VL-VH/pET R (SEQ ID NO: 59) para amplificar um produto de fusão de tamanhonatural que foi subseqüentemente clonado no pET32a(+) usando sítios deSfu\ e A/o/l únicos.
As seqüências dos iniciadores usados no constructo das cons-tructos de fusão de Granzima B-scFv são como descritas no Exemplo 5.3acima mencionado e como a seguir (todos os iniciadores dados 5' até 3'):pET F (SEQ ID NO: 54) TCGGTGATGTCGGCGATATAG; RoPro 071G4S/rGrzB R1 (SEQ ID NO: 55) ACTACCTCCGCCACCGGACTTCTTCATAGTTTTCTTGATCCAGG; RoPro 074 rGrzB/G4SA/HVL F (SEQ ID NO: 56)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGG; RoPro 075 pET/VHVL R (SEQ ID NO: 57) TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTACTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCCACCGAACG; Ro-Pro 072 rGrzB/G4S/VLVH F (SEQ ID NO: 58) GAAGAAGTCCGG TGGCG-GAGGTAGTGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAGCAATC; RoPro 073 VL-VH/pET R (SEQ ID NO: 59) TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTA TGAGGA-GACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC.
7.3 Constructos da fusão de Cvt2A-scFv
Para criar fusões em quadro das seqüências de scFv de SV63 eCyt2A, o exemplo de Gurkan e Ellar (2003 Protein Expres. Purif. 29(1): 103-16) foi seguido. O gene que codifica os primeiros 237 aminoácidos deCyt2Aa1 (EMBLBTCYTBG) foi sintetizado artificialmente para conter umaseqüência 3' projetada para criar uma adição C terminal em quadro do epi-topo de 14 aminoácidos Xpress (Invitrogen). Esta seqüência de epitopo deCyt2A-Xpress artificialmente sintetizado é conhecida como 051072, e foisubclonada no pCR Script para dar o p051072. O plasmídio pDGF-SV63-VHVL (ver o Exemplo 2.5) foi alterado em duas etapas. Primeiramente, umaseqüência artificialmente sintetizada foi projetada e produzida (chamadap054247) que criaria um fragmento de ligação contendo parte da seqüência3' terminal da seqüência de VL de SV63, o ligante (Gly4Ser)3 e parte da se-qüência 5' terminal da proteína Cyt2Aa1 madura (como descrito por Gurkane Ellar, supra). Este fragmento foi excisado de p054247 usando Spe\ (5") eEcoRI (3'), e ligado no pDGF-SV63-VHVL similarmente preparado (ver o E-xemplo 2.5). O plasmídio resultante foi então adicionalmente modificado porcorte com Sfu\ e BamH\ e introdução do fragmento de Sfu\/BamH\ de apro-ximadamente 520 bp (representando a extremidade de 3' da seqüência deCyt2Aa1 madura mais o epitopo Xpress) a partir de p051072. O plasmídioresultante (pDGF-SV63-VHVL::Cyt2A) compreende uma fusão em quadrocompleta do scFv de VHVL de SV63, através de um ligante flexível, à formaativa (madura) do Cyt2Aa1 (aminoácidos 37 a 237) seguida pelo epitopo X-press.Similarmente, o plasmídio pDGF-SV63-VLVH foi modificado emum processo de duas etapas, para introduzir a seqüência de Cyt2Aa1. Pri-meiramente, uma seqüência artificialmente sintetizada foi projetada e produ-zida (chamada 054248) que criaria um fragmento de ligação contendo parteda seqüência 3' terminal da seqüência de VH de SV63, o ligante (Gly4Ser)3 eparte da seqüência 5' terminal da proteína Cyt2Aa1 madura (como descritopor Gurkan e Ellar, supra). A seqüência artificial foi subclonada no pCR S-cript para dar o plasmídio p05428. Este fragmento foi então excisado deP054248 usando SseRI (5') e EcoRI (3'), e ligado no pDGF-SV63-VLVH simi-larmente preparado. O plasmídio resultante foi então adicionalmente modifi-cado por corte com Sfu\ e BamH\ e introdução do fragmento de Sfu\IBamH\de aproximadamente 520 bp (representando a extremidade de 3' da se-qüência de Cyt2Aa1 madura mais o epitopo Xpress) a partir de p051.072.-©-plasmídio resultante (pDGF-SV63-VLVH::Cyt2A) compreende uma fusão emquadro completa do scFv de VLVH de SV63, através de um ligante flexível, àforma ativa (madura) do Cyt2Aa1 (aminoácidos 37 a 237) seguida pelo epi-topo Xpress.
Exemplo 8 Expressão das Proteínas de Fusão
Os vetores carregando os genes de fusão de scFv de SV63-gelonina (ver o Exemplo 7.1 acima descrito) foram transformados nas célu-las de E. coli TOP10. Os estudos de expressão pilotos foram efetuados de-senvolvendo as células transformadas em meio de 2x YT/2% de glicose, an-tes da indução a 20°C ou 15°C em meio 2 x YT suplementado com IPTG a 1mM por 16 horas. Pequenas amostras (10 ml) foram coletadas e centrifuga-das e cada precipitado de célula foi suspenso novamente em 1 ml de tam-pão de lise (PBS). As amostras foram sonicadas, centrifugadas novamente a13.000 rpm por 5 minutos, na temperatura ambiente, e os sobrenadantes(frações solúveis) decantados. Os péletes (frações insolúveis) foram sus-pensos novamente em 1 ml de tampão de lise.
As frações solúveis e insolúveis foram analisadas por transfe-rência Western usando um anticorpo dirigido para a marca de hexa-histidina.A análise revelou que a proteína de fusão de scFv-gelonina estava sendoproduzida a partir de ambos os vetores de expressão (isto é, onde o scFv estava na orientação VHVL e onde o scFv estava na orientação VLVH). Entretanto, a orientação VLVH do scFv deu um rendimento maior de proteína solúvel.
O desenvolvimento e a indução em maior escala foram realizados, e a proteína de fusão de scFv-gelonina foi adicionalmente purificada a partir da fração solúvel, através de purificação sobre uma coluna Gravitrap.
Exemplo 9 Teste in vitro dos Conjugados de Proteínas e das Proteínas de Fusão
A capacidade dos conjugados de proteínas e das proteínas de fusão da invenção de causar dano ao trato gastrointestinal superior é avaliada por medição da permeabilidade da mucosa ao marcador não absorvível, o manitol, usando secções do duodeno do rato isolado. Os tecidos isolados in vitro são expostos a estes agentes de controle de rodentes, usando uma modificação de um método publicado anteriormente (Heylings, 1991, Toxicol. Appl. Pharmacol. 107:482-493).
Resumidamente, uma secção de 10 cm do trato gastrointestinal (imediatamente distai ao estômago) de ratos da cepa Alderley Park machos adultos (Ap:AkfSD) é removida imediatamente após o fim misericordioso. O tecido é colocado em meio TC199 oxigenado e qualquer resto de alimento é cuidadosamente lavado do intestino usando meio TC199 a partir da extremidade mais distante do estômago. Duas secções do duodeno são preparadas, cada uma de 2,5 cm de comprimento, a secção proximal (imediatamente após o estômago) e a secção distai (imediatamente após a entrada do duto biliar).
As secções são cuidadosamente unidas firmes, por meio de ligaduras, às extremidades abertas de dois tubos de vidro conectados a um reservatório. Isto permite que as superfícies luminais (mucosas) e do lado do sangue (serosas) da mucosa isolada sejam banhadas por soluções separadas. A distância entre as extremidades dos bastões de vidro em cada câmara mucosa é 12 mm. Uma representação diagramática da aparelhagem é similar àquela mostrada na parte superior da figura 1 de Heylings 1991 supra.A câmara com a mucosa unida é enxaguada diversas vezes com meio TC199 oxigenado, para remover o muco em excesso sobre o lado luminal do tecido. O lado luminal (mucoso) é cheio com 4 ml de meio TO99 contendo 20 mg de manitol/ml (TC199-M), e a mucosa é checada quanto ao escoamento. A câmara mucosa é imersa em um vaso de vidro com formato de taça, externo, enchido com 40 ml de meio TC199 (solução do lado seroso), que é gaseificado com 95% de 02:5% de C02. A câmara está posicionada para evitar os gradientes de pressões hidrostáticas entre as duas soluções de banho. Ambas as soluções são mantidas a 37 ± 0,1 °C por meio de uma camisa de água conectada a uma bomba externa. Após um período de pré-incubação de 10 minutos, a câmara mucosa é removida e inundada com meio TC199-M para remover qualquer acúmulo de muco, finalmente o lado luminal é cheio com 4 ml de TC199-M contendo 14C-Manitol (um não eletróli-to que é insatisfatoriamente absorvido pelo trato gastrointestinal) em uma concentração de 5 x 105 dpm/ml e retornado para a câmara de vidro.
Para medir a permeabilidade da mucosa duodenal isolada ao manitol, alíquotas de 150 uJ em duplicata da solução do lado seroso são retiradas a 10, 20, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos, seguindo a sua adição ao lado mucoso. A quantidade de manitol absorvido é determinada através de contagem de cintilação líquida. Como um controle positivo, o paraquat (40 mg de íon de paraquat/ml), um irritante tópico conhecido ao trato gastrointestinal, é adicionado à câmara da mucosa, 30 minutos após o início da incuba-ção, para demonstrar que o modelo é capaz de detectar dano mucoso. Os agentes de controle de rodentes (proteínas de fusão ou conjugados de proteínas, ver, por exemplo, os Exemplos 6 a 8 acima mencionados) são adicionados por adição direta de um pequeno volume à câmara mucosa em 30 minutos após o início da incubação e o perfil do curso de tempo da absorção de manitol é monitorado. Este é comparado com os controles negativos atuais quanto aos segmentos proximais e distais do duodeno de rato corridos em paralelo.
A metodologia descrita acima utiliza o tecido duodenal, entretanto, outras áreas do trato gastrointestinal podem ser substituídas e testadasusando o mesmo procedimento como descrito acima.
Exemplo 10 Teste in vivo dos Conjugados de Proteínas e das Proteínas de Fusão
10.1 Teste quanto à eficácia por qavaaem oral em camundongo
Os camundongos (18 no total, 9 por grupo) serão dosados oralmente por gavagem com i) conjugado de proteína ou proteína de fusão (ver, em particular, os Exemplos 6 a 8 acima descritos; camundongos do grupo 1), ou ii) veículo inerte (por exemplo, polietileno glicol; camundongos do grupo 2). Os animais serão terminados 24, 48 e 72 horas após a dosagem, com asobservações clínicas sendo feitas regularmente por todo o estudo. Após a terminação, o tecido duodenal, jejunal, íleo e colônico será fixado em solução salina tamponada com formal, processado e incrustado em cera e tingido com H&E para a avaliação patológica.
As proteínas de fusão/conjugados de proteínas são empregadas nas seguintes concentrações de teste (dadas em mg de composto por kg de peso do corpo): 8 mg/kg, 5 mg/kg e 3 mg/kg.Listagem de Seqüências
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<160> 59
<170> Patentin version 3.1
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato oligopetídeo transportador PepT1 <400> 1
Vai lie Arg Ser Arg Ala Ser Asp Gly Cys Leu Glu Vai Lys Glu 15 10 15<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato oligopetídeo transportador PepT1
<400> 2
Cys Ser Ser Asp Phe Lys Ser Ser Asn Leu Asp 1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato CD155
<4 00> ;3
Ser Asn Vai Asn Gly Ser Tyr Arg 31u Met Lys Glu Thr Gly Ser Gln
1 5. 10 .15
Pro
<210>. 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220> <223>
RSPE de rato GTR2<400> 4
Gly Thr Asp Thr Pro Leu lie Vai Thr Pro Ala His Thr Thr Pro 15 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<223 > RSPE de rato CFTR cloreto transportador
<400> 5
Leu Lys Asn Asn Pro Vai Asn Gly Gly Asn Asn Gly Thr Lys lie Ala 15 10 15
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato CNT2 nucleosídeo transportador
<400> 6
Trp Gln Asp Lys Glu Ser Ser Leu Arg Asn Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 7
<211>
12
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> RSPE de rato CATB (0+) aminoácido colônico transportador <400> 7
Gly Gly Asp Met Phe Met Asn Ile Ser Trp Vai Asn 1 5 10
<210> 8 ;
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato MDRi
<4G0> 8
Ser Phe Thr Pro Ser Arg Asp Pro His Ser Asp Arg Ala lie Thr 1 5 10 15
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<22 3> RSPE de camundongo MDR1
<400> 9
Ser Phe Thr Lys Ala Glu Ala Ser Ile Leu Pro Ser Ile Thr 15 10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<22Q>
RSPE de rato sacarose-isomaltase
<223>
<400> 10
Tyr Asn Ala Glu Ser lie Thr Asn Glu Asn Ala Gly Leu Lys Ala Thr 15 10 15
Leu
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
< 213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE-de camundongo GLUT7
<400> 11
Asn Thr ?ro His Lys Vai Leu Lys Ser Phe Tyr Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<221> RSPE de camundongo GLUT7/rato.GTR5 ,
<400> 12
Tyr Tyr Asp Arg Asn Lys Glu Asn lie Glu Ser .
1 5 10<2I0> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato Npt2a
<400> 13
Pro Glu Thr Lys Glu Ala Ser Thr Ser Met Ser Arg Vai Glu Ala
1 5 10 15
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223 > RSPE de rat0 OATP-B
<400> 14
Leu Gly Ala Gln Pro Gly Pro Ser Leu Phe Pro Gly Cys Ser Glu Pro 1 5 10 15
Cys Ser Cys Gln Ser Asp Asp 20
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220><2 2 3 > RSPE de rato OATP-B <400> 15
Gln Pro Gly Pro Ser Leu Phe Pro Gly Cys Ser Glu Pro Cys Ser Cys 15 10 15
Gln
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
< 213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato ASBT
<400> 16
Asp Ala Glu Phe Leu Glu Lys Thr Asp Asn Asp Met Asp 1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
< 213 > Seqüência Artificial
<220>
<223 > RSPE de rato CaT1
<400> 17
Gln Ala Phe Gln Gln Gln Asp Asp Leu Tyr Ser Glu 1 5 10
<210> 18
<211> 16<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato OATP3
<400> 18
Ser Tyr Lys Gly Vai Gln His Gln Leu. Hie Vai Glu Ser Lys Vai Leu 1 5 10 15
<2I0> 19
<2ll> 14
<212> PRT
< 213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato ABCG8
<400> 19
Gln lie Gln Phe Asn Gly His lie Tyr Thr Thr Gln lie Gly
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato GTR8
<400> 20
His Vai Gly Leu Leu Vai Pro lie Ser Ala Glu Pro Ala Asp Vai His 1 5 io is
Leu Gly<210> 21
<21X> 14
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPEderatoMRPI
<400> 21
Met Phe. Ala Gly Pro Glu lie Leu Glu Leu lie lie Asn Phe 1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> RSPEde ratoCNTI
<400> 22
His Ser His Ser Ser Leu Pro Glu Gly Glu Gly Gly Leu Asn Lys Ala 1 5 10 15
<210> 23
<211> 12
<2I2> PRT
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPEde rato UT-B<400> 23
Pro Ser Lys Leu Phe Met Pro Vai Ser Ser Vai Pro 15 10
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato DRA1
<400> 24
Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp Ser Met lie Glu Glu Lys Vai 1 5 10 15
Met Vai
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de camundongo ENT1
<400> 25
Lys Ala Arg His Cys Gly Ala Gln Arg His His Phe Vàl Phe Lys His 1 5 10 15
<210> 26
<211> 18
<212> PRT<213> Seqüência Artificial <220>
<223 > RSPE de ra*° ENT1
<400> 26
Thr Asn Gln Ser Cys Glu Ser Thr Glu Ala Leu Ala Asp Pro Ser Vai 1 5 10 15
Ser Leu
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
< 2 2 3 > RSPE de rato GCC
<400> 27
Vai Ser Gly Arg Phe
1 5
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
Pro Ser Glu Arg Ser 10
<220>
<223> RSPE de rato PLB <400> 28
Ala Glu Asp Leu Trp lie Gln Ala Lys Glu Leu Vai Arg His Leu Lys 1 5 10 15Asp Asn Pro
<210> 29
<211> 12
<212> PRT -
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato LPH
<400> 29
Glu Asp Ala Ala Pro Thr Ala Ser Pro Vai Gln Ser 1 5 10
<210> 30
<211> 44
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de camundongo LPH
<400> 30
Arg Tyr Vai Gln Vai Cys Ala Leu Cys Arg Phe Ser Thr Vai Phe Ser 15 10 15
Pro Arg Leu Pro Glu Pro Vai Lys Gly Glu Arg Arg Phe Ser Kis lie 20 25 30
Ser Leu Asn Gln Asp Leu Pro Arg Pro Leu Phe Pro 35 40
<210> 31
<211> 13<212> PRT
<212> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato AMPN
<400> 31
Gly Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ser Thr Thr Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de. rato MCDL
<400> 32
Asn Lys Asp lie Leu Leu Thr Thr Vai Pro Met Glu Thr Glu Arg Thr 15 10 15
lie Arg
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato SCAB
<400> 33
Leu Pro Gln Asp Leu Vai Gly Met Gly Tyr Ala Pro Asp Arg lie1 5 10 15
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<2-23> RSPE de rato SCAB
<400> 34
Ser Ser Asn Pro Ala Pro Gly Ser Thr 1 5
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RSPE de rato KCV2
<400> 35
Asp Gln Arg His Gly Lys Gly Ser Pro Arg Glu His Asp Leu Glu 1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223>
RSPE de rato CATB (0+) aminoácido colônico transportador<400> 36
Asp Thr Gly Gly Asp Met Phe Met Asn lie Ser Trp Vai Asn Ser 1 5 10 15
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificiai
<220>
<223> RoPro-9 iniciador <400> 37
aggtscagct gcagsagtcw gg 22
<210> 38
<211> 38
<212> DITA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro-28 iniciador
<400> 38
ccaggggcca gtggatagac 38
<210> 39
<211> 36
<212> D3STA
<213> Seqüência Artificial
agatgggggt gtcgtttt
<220> <223>
RoPro-6 iniciador<400> 39
gaggtgaagc tgcaggagtc aggacctagc ctggtg 36
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro-25 iniciador
<400> 40
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc 32
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> FtoPro-3 iniciador <400> 41
ggtgatatcg tkctcacyca rtctccagca at 32
<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro-4 iniciador<400> 42
gggaagatgg atccagttgg tgcagcatca gc 32
<210> 43
<21I> 34
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> scFvoligo 1 iniciador
<400> 43
agcccgccat ggccgatatc gttctcactc aatc 34
<210> 44 <211> 57 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> scFv oligo 2 iniciador
<400> 44
cgccagagcc accgccaccg ctaccgccac cgcccttgat ctccagtttg gtgcctc 57
<210> 45
<211> 56
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> scFv oligo 3 iniciador<400> 45
cggtggcg gtggctctgg cggtggcggt agcgaggtcc agctgcagga gtctgg 56
<210> 46
<211> 76
<212> DWA
<213> Seqüência Artificial '
<220>
<223> scFvoligo4 iniciador <400> 46
ctatgaattc agtggtggtg gtggtggtgc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtctgaggag 60
actgtgagag tggtgc 56
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223 > scFv oligo 4 iniciador
<400> 47
agcccgccat ggccgaggtc cagctgcagg agtctg 36
<210> 48
<211> 58
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> scFv oligo 6 iniciador <400> 48
cgccagaacc acctccgccg cttccgccac 58
<210> 49
<211> 55
<212> DKA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> scFv oligo 7 iniciador
<400> 49
agcggcggag gtggttctgg cggtggcgga 55
<2I0> 50
<211> 76
<212> DNA
< 213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> scFv oligo 8 iniciador <400> 50
gtatgaattc agtggtggtg gtggtggtgc 60
tccagtttgg tgcctc 76
cgcctgagga gactgtgaga gtggtgcc
agcgatatcg ttctcactca atctc
ttgfccgtcgt cgtccttgta gtccttgatc
<210> <211> <212>
51 49 DKA<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro070 petEK/rGrzB F1 iniciador
<400> 51
ggtaccgacg acgacgacaa gatcatcggt ggtcacgaag ctaagccac 49
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro067 rGrzB R iniciador <400> 52
agctggcggc cgcctaggac 20
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro076 petEK/rGrzB F2 iniciador
<400> 53
agatctgggt accgacgacg acgac 25
<210> 54
<211> 21
<212> DNA<212> Seqüência Artificial <220>
<223> pET F iniciador <400> 54
tcggtgatgt cggcgatata g 21
<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro 071 G4S/rGrzB R1 iniciador
<400> 55
acfcacctccg ccaccggact tcttcatagt tttcttgatc cagg 44
<210> 56
<211> 54
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F iniciador
<400> se
gaagaagtcc ggtggcggag gtagtgaggt ccagctgcag gagtctggcc ctgg 54
<210> 57
<211> 55
<212> DSTA<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro 075 pET/VHVL R iniciador
<400> 57
tgctcgagtg cggccgctta ttacttgatc tccagtttgg tgdçtçcacc gaacg 55
<210> 58
<211> 55
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F iniciador
<400> 58
gaagaagtcc ggtggcggag gtagtgatat cgttctcact caatctccag caatc 55
<210> 59
<211> 53
<212> DNA
<2l3> Seqüência Artificial
<220>
<223> RoPro 073 VLVH/pET R iniciador
<400> 59
tgctcgagtg cggccgctta ttatgaggag actgtgagag tggtgçcttg gcc 53

Claims (51)

1. Agente de controle de rodente compreendendo um componente de anticorpo que se liga a um épitopo extracelular de uma proteína que é expressa em um rodente.
2. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 1, em que o dito agente de controle de rodente mata os rodentes ou impede a reprodução nos rodentes.
3. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o componente de anticorpo é ligado a um componente tóxico ou um componente contraceptivo.
4. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 3, compreendendo uma proteína de fusão, a dita proteína de fusão compreendendo um primeiro componente de proteína e um segundo componente de proteína, o dito primeiro componente de proteína sendo o componente de anticorpo e o dito segundo componente de proteína sendo selecionado a partir do grupo que consiste, em uma toxina, um imunógeno e um hormônio.
5. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 4, em que os ditos primeiro e segundo componentes de proteína estão ligados um ao outro através de um ligante peptídico.
6. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 5, em que o dito ligante peptídico compreende os resíduos de Glicina e Seri-na.
7. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 6, em que o dito ligante peptídico compreende pelo menos três motivos de (Gly4Ser).
8. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 3, compreendendo um conjugado de proteína, o dito conjugado de proteína compreendendo um componente de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, quimicamente conjugado a um componente tóxico ou um componente contraceptivo.
9. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, em que o componente tóxico é uma toxina de pro-teína.
10. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 9, em que a dita toxina é a) uma proteína de tamanho natural selecionada a partir do grupo de proteínas listadas no grupo 1, em que o grupo 1 consiste em uma proteína que rompe as membranas, uma ribosiltransferase, uma serina protease, um ativador de guanilil ciclase, uma proteína envolvida no transporte de íon mediado por ATPase, uma adenilil ciclase dependente de calmodulina e uma ribonuclease, ou é b) um domínio tóxico de uma proteína selecionada a partir do grupo 1.
11. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 9, em que a dita toxina é a) uma RNA glicosidase de tamanho natural ou é b) um domínio tóxico de uma RNA glicosidase.
12. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 10, em que a dita toxina é a) a 0-purotionina de tamanho natural ou uma proteína de tamanho natural selecionada a partir do grupo de proteínas listadas no grupo 2, em que o grupo 2 consiste em Perfingolisina O, alfa-hemolisina, Esfingomelinase, Delta-hemolisina, Ganzima B, Alfa toxina, toxina Cyt, Toxina da difteria, Granulisina, Melitina, Perforina, Enterotoxina da cólera, Enterotoxina estável ao calor, Equinatoxina, Listeriolisina, VIP2, Enterotoxina do acessório, Aerolisina, BinA, BinB, Colicina E1, Hemolisina A, CTX IV, Ricina, Amebaporo, Hemolisina El Tor, hemolisina de Virbio damse-la, Pneumolisina, Estreptolisina O, toxina de Kanagawa, hemolisina de Lep-tospira, toxina Cry, Toxina do antraz, Exotoxina de Pseudomonas A, Barna-se, e VIP3, ou é b) um domínio tóxico de b-purotionina ou um domínio tóxico de uma proteína selecionada a partir do grupo 2.
13. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 11, em que a toxina é a gelonina.
14. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, em que o componente contraceptivo é um imunógeno capaz de produzir uma resposta contra um antígeno específico para óvulo ou espermatozóide.
15. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer umadas reivindicações 3 a 8, em que o componente contraceptivo é um hormônio reprodutivo.
16. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 15, em que o hormônio reprodutivo é o hormônio liberador de gonadotrofina.
17. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 8, em que o componente tóxico é um composto tóxico selecionado a partir do grupo que consiste em: colquicina; doxorrubicina; caliqueamicina; um composto de fármaco antiinflamatório não esteroidal (NSAID); citocalasina; um anticoagulante; calciferol; brometalina; flupropadina; fosfeto de zinco; cilirosida; (mono)fluoracetato de sódio; fluoracetamida; alfacloralose; sulfato de tálio.
18. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 17, em que o anticoagulante é selecionado a partir do grupo que consiste em: brodificoum, difenacoum, bromadiolona, flocumafeno, difetialona, hi-droxicumarinas, e indano-dionas.
19. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 8, em que o componente contraceptivo é um hormônio ou composto semelhante ao hormônio.
20. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 19, em que o composto semelhante ao hormônio é o diazacom.
21. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a proteína à qual o componente de anticorpo se liga é uma proteína expressa no epitélio gastrointestinal de um rodente.
22. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em PEP T1 de Rato, CD155 de Rato, GTR2 de Rato, CFTR de Rato, CNT2 de Rato, CATB(0+) de Rato, MDR1 de Rato, MDR1 de Camundongo, Sacarose-lsomaltase de Rato, GLUT7 de Camundongo, GTR5 de Rato, Npt2A de Rato, OAT-B de Rato, ASBT de Rato, CAT1 de Rato, OATP3 de Rato, ABCG8 de Rato, GTR8 de Rato, MRP1 de Rato, CNT1 de Rato, UT-B deRato, DRA1 de Rato, ENT1 de Camundongo e ENT1 de Rato.
23. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em CATB(0+) de Rato, GCC de Rato, PLB de Rato, LPH de Rato, LPH de Camundongo, AMPN de Rato, MCDL de Rato, SCAB de Rato, KCV2 de Rato.
24. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 22, em que o epitopo extracelular é proporcionado por uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N-: 1-26.
25. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 24, em que o epitopo extracelular é proporcionado por uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5.
26. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 23, em que o epitopo extracelular é proporcionado por uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N—: 27-36.
27. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que o componente de anticorpo é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antígeno.
28. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 27, em que o anticorpo é policlonál.
29. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 27, em que o anticorpo é monoclonal.
30. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, em que o anticorpo é a) uma imunoglobulina compreendendo cadeias leves e pesadas ou b) um anticorpo de cadeia individual.
31. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 30, em que o anticorpo de cadeia individual é um scFv.
32. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 30, em que o anticorpo de cadeia individual é desprovido de cadeiasleves.
33. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 32, em que o anticorpo de cadeia individual é derivado da Camelidae ou da Chondrichtyes.
34. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, em que o componente de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em uma cadeia leve de imunoglobulina, uma cadeia pesada de imunoglobulina, um domínio VH, um domínio VL, Fv, Fab, di-Fab, Fab', F(ab')2) um domínio VHH, um domínio V de IgNAR e uma CDR.
35. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, em que o componente de anticorpo é o dissulfeto estabilizado.
36. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, em que o componente de anticorpo se liga a uma proteína de rodente com maior afinidade do que a uma proteína homóloga de pelo menos um animal que não seja alvo.
37. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 36, em que o animal que não é alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em seres humanos, aves, animal de estimação, animais da fazenda e animais selvagens que não sejam pragas.
38. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 37, em que o animal que não é alvo é o ser humano.
39. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, em que o componente de anticorpo exibe ligação removível ao epitopo extracelular da proteína de rodente, porém não exibe ligação removível a: i) uma proteína homóloga de um animal que não seja alvo, ou; ii) um epitopo correspondente a partir da proteína homóloga de um animal que não seja alvo.
40. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 39, em que o epitopo extracelular da proteína de rodente é representado por um epitopo de peptídeo específico para rodente como definido na reivindicação 48.
41. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína que é expressa em um rodente é uma proteína essencial.
42. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 41, em que a proteína essencial é expressa no epitélio gastrointestinal de um rodente.
43. Agente de controle de rodente compreendendo um componente de anticorpo ligado a uma toxina de proteína, em que o componente de anticorpo se liga a um epitopo extracelular de uma proteína que é expressa em um rodente e em que a afinidade de ligação do componente de anticorpo ao epitopo extracelular da proteína de rodente é maior do que a afinidade de ligação do componente de anticorpo a uma proteína homóloga de um animal que não seja alvo.
44. Agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, na forma de uma composição adicionalmente compreendendo pelo menos um aditivo.
45. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 44, em que pelo menos um aditivo é um agente de controle de rodente selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente de controle de rodente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, um anticoa-gulante de primeira geração e um anticoagulante de segunda geração.
46. Agente de controle de rodente de acordo com a reivindicação 44 ou 45, em que pelo menos um aditivo tem a função de tornar a composição saborosa para os rodentes.
47. Método de matar um rodente o qual compreende colocar um agente de controle de rodente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em uma área freqüentada pelo rodente, de modo tal que, com a ingestão pelo dito rodente do dito agente de controle de rodente, o dito rodente é morto.
48. Método de evitar que os rodentes se reproduzam, o qual compreende colocar um agente de controle de rodente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em uma área freqüentada pelo ro-dente, de modo tal que, com a ingestão pelo dito rodente do dito agente de controle de rodente, a capacidade reprodutiva do dito rodente é inibida.
49. Epitopo de peptídeo específico para rodente (RSPE) consistindo em um fragmento de oligopeptídeo de uma proteína expressa em um rodente, em que a seqüência do fragmento de oligopeptídeo representa um epitopo de peptídeo contínuo extracelular que tem uma porcentagem de identidade de 60% ou menos com uma seqüência de peptídeos linear correspondente a partir de uma proteína homóloga de um animal que não seja alvo.
50. Anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a antígeno, o qual se liga ao RSPE da reivindicação 48.
51. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de como definido na reivindicação 50 na fabricação de um agente de controle de rodente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 46.
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