BRPI0609019A2 - processo para a preparação de um biomaterial compósito, biomaterial compósito, material ósseo sintético, implante ósseo, enxerto ósseo, substituto ósseo, estrutura óssea, enchedor, revestimento ou cimento, e, estrutura óssea monolìtica ou em camadas para o uso na engenharia de tecidos - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE UM BIOMATERIAL COMPóSITO, BIOMATERIAL COMPóSITO, MATERIAL óSSEO SINTéTICO, IMPLANTE óSSEO, ENXERTO óSSEO, SUBSTITUTO óSSEO, ESTRUTURA óSSEA, ENCHEDOR, REVESTIMENTO OU CIMENTO, E, ESTRUTURA óSSEA MONOLìTICA OU EM CAMADAS PARA O USO NA ENGENHARIA DE TECIDOS. Um processo para a preparação de um biomaterial compósito que compreende um material inorgânico e um material orgânico, o processo compreendendo: (a) fornecer uma primeira composição de suspensão que compreende um carreador líquido, um material inorgânico e um material orgânico; (b) fornecer um molde para a suspensão; (c) depositar a suspensão no molde; (d) esfriar a suspensão depositada no molde a uma temperatura em que o carreador líquido transforma-se em uma pluralidade de cristais ou partículas sólidas; (e) remover pelo menos alguns da pluralidade de cristais ou partículas sólidas por sublimação e/ou evaporação para deixar um material composto poroso que compreende um material inorgânico e um material orgânico e (f) remover o material do molde.

Description

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM BIOMATERIALCOMPÓSITO, BIOMATERIAL COMPÓSITO, MATERIAL ÓSSEOSINTÉTICO, IMPLANTE ÓSSEO, ENXERTO ÓSSEO, SUBSTITUTOÓSSEO, ESTRUTURA ÓSSEA, ENCHEDOR, REVESTIMENTO OUCIMENTO, E, ESTRUTURA ÓSSEA MONOLÍTICA OU EM CAMADASPARA O USO NA ENGENHARIA DE TECIDOS"

A presente invenção diz respeito ao campo de materiais ósseossintéticos para aplicações biomédicas e, em particular, uma estruturamonolítica porosa e em camadas porosa que compreende colágeno, fosfato decálcio e opcionalmente um glicosaminoglicano para o uso na engenharia detecido.

O osso natural é um biocompósito de colágeno, fasesorgânicas não colagenosas que incluem glicosaminoglicanos e fosfato decálcio. Sua estrutura hierárquica complexa leva a propriedades mecânicasexcepcionais que incluem dureza alta, força e resistência à fratura, que por suavez permite ao osso resistir a tensões fisiológicas aos quais são submetidosem uma base diária. O desafio enfrentado pelos pesquisadores no campo éfabricar um material sintético que tenha uma composição e uma estrutura quepermitirá o desenvolvimento do osso natural e em torno do material sintéticono corpo humano ou animal.

Foi observado que o osso liga-se diretamente aos fosfatos decálcio no corpo humano (uma propriedade referida como bioatividade)através de uma camada de apatita semelhante ao osso formada no ambientecorporal. O colágeno e os copolímeros que compreendem colágeno e outrosbioorgânicos, tais como glicosaminoglicanos por outro lado, são conhecidosserem substratos ótimos para a ligação e para a proliferação de numerosostipos de células, incluindo aquelas responsáveis pela produção e manutençãodo osso no corpo humano.

A hidroxiapatita é o fosfato de cálcio mais comumente usadocomo um constituinte nos materiais ósseos substitutos. Isto é, entretanto, ummaterial relativamente insolúvel quando comparado com outras formas demateriais de fosfato de cálcio, tais como brushita, trifosfato de cálcio eoctafosfato de cálcio. A solubilidade relativamente baixa de apatita pode seruma desvantagem quando se produz um biomaterial quando a taxa deresorção do material no corpo é particularmente baixa.

Os fosfatos de cálcio, tais como hidroxiapatita são materiaismecanicamente duros. Entretanto, estes são relativamente frágeis emcomparação com o osso natural.

O colágeno é um material mecanicamenteflexível, mas tem dureza relativamente baixa em comparação com o ossonatural. Os materiais que compreendem os copolímeros de colágeno eglicosaminoglicanos são ambos mais flexíveis e mais duros do que o colágenosozinho, mas terá dureza relativamente baixa em comparação com o ossonatural.

Tentativas prévias de se produzir um material substituto ósseosintético tendo flexibilidade mecânica melhorada sobre a hidroxiapatita edureza melhorada sobre o colágeno e copolímeros de colágeno eglicosaminoglicanos incluem combinar colágeno e apatita pela misturamecânica. Um tal método mecânico é descrito em EP-A-0164 484.

Os últimos desenvolvimentos incluem a produção de ummaterial de substituição óssea que compreende hidroxiapatita, colágeno econdroitin-4-sulfato pela mistura mecânica destes componentes. Isto édescrito no EP-A-0214070. Este documento ainda descreve reticulaçãodesidrotérmica da condroitin-4-sulfato ao colágeno. Os materiais quecompreendem compreende apatita, colágeno e condroitin-4-sulfato foramobservados ter boa biocompatibilidade. A mistura mecânica da apatita com ocolágeno e, opcionalmente, condroitin-4-sulfato, essencialmente formapartículas revestidas com colágeno / condroitin-4-sulfato de apatita. Foiobservado que um tal material, embora biocompatível, produz diminuiçãolimitado do osso natural quando no corpo humano ou animal e nenhumaremodelagem da fase de fosfato de cálcio do material sintético.

O reparo de locais esqueletais comprometidos por trauma,deformidade ou doença possui um desafio especial a cirurgiões ortopédicosem que, defeitos diferentes na pele, nervo e na maioria dos outros tipos detecido, defeitos esqueletais abrangem tipos de tecido distintos múltiplos (istoé, osso, cartilagem, tendão e ligamento), envolve locais que sofrem cargamecânica regular e interfaces transversas entre tecidos mineralizados paratecidos desmineralizados (por exemplo, pontos de inserções de ligamento, o"marca" na interface osso/cartilagem).

Métodos clínicos existentes dirigem-se ao reparo de defeitosesqueletais com implantes protéticos não reabsorvíveis, enxertos de tecidosautólogos ou alogenosos, agentes químicos, transplante celular oucombinações destes métodos.

Enquanto estes métodos atingiram algumsucesso para o tratamento de tipos de tecidos simples, casos onde interfacesentre tecido mineralizado ou não mineralizado estão envolvidos, tais comodefeitos de juntas articulares, por exemplo, resulta na cura, na melhor dashipóteses, incompleta. Além disso, mesmo o mais bem sucedido dostratamentos existentes requerem a coleta de tecido de um local doador e/ou asutura ao osso, cartilagem, ligamento ou tendão. O procedimento formadorsofre de perda de locais doadores e da morbidez de locais doadores, enquantoo último é difícil de se implementar e cira defeitos adicionais na forma deorifícios de sutura.

Os termos estrutura de compósito e estrutura em camadas sãosinônimos e referem-se a estruturas que compreendem duas ou mais camadas,com a composição de material de cada camada diferindo substancialmente dacomposição de material de sua camada ou camadas adjacentes. O termoestrutura de camada simples ou estrutura monolítica são sinônimos e referem-se a estruturas que compreendem uma camada apenas, com a composição dematerial dentro de cada camada sendo grandemente homogênea do começo ao fim.

Um número limitado de esforços recentes pretenderamdesenvolver estratégias de engenharia de tecido que utilizam estruturas emcamada porosas para o tratamento de defeitos de juntas articulares queenvolvem cartilagem sozinho ou, tanto osso quanto cartilagem. Estasconstruções buscam induzir a regeneração do osso e da cartilagem de maneiraconcorrente, mas usando-se estruturas separadas para cada uma (Niederauer etal., 2000; Schaefer et al, 2000; Gao et al., 2001; Gao et al., 2002; Schaefer etal., 2002; Sherwood et al., 2002; Hung et al., 2003; Hunziker and Driesang,2003).

Uma característica adicional das estruturas em camadas é opotencial que estes mantém para atingir a fixação sem sutura por intermédioda ligação direta da camada óssea à placa óssea subcondrial. Contanto que aporção cartilaginosa permaneça firmemente ligada à porção óssea, nenhumafixação adicional é requerida.

A fixação sem sutura também pode permitir o tratamento dedefeitos que envolvem os pontos de inserção de tendão e ligamento ao osso.

A despeito da promessa deste novo método, duas deficiênciaspodem limitar a eficácia das estruturas em camadas relatadas até hoje. Oprimeiro diz respeito aos materiais usados para as respectivas camadas daestrutura. Os polímeros sintéticos reabsorvíveis foram o único material usadopara a camada cartilaginosa e freqüentemente também foram um componenteda porção óssea em muitas destas estruturas. Embora fáceis de se fabricar, ospolímeros sintéticos são conhecidos por serem menos condutores para aligação e proliferação celular do que os polímeros naturais, tais comocolágeno e podem, portanto, liberar altas concentrações de ácido quando estesse degradam. Além disso, para aplicações onde o reparo de tendão ou deligamento é necessário, polímeros sintéticos reabsorvíveis, com respeito àmaneira em que estes são reticulados têm força e dureza inadequados pararesistir mesmo à carga reduzida aplicada durante os exercícios de reabilitação.

A segunda deficiência de estruturas em camadasconvencionais diz respeito à interface entre as camadas respectivas.

As juntas articulares naturais e os pontos de inserção detendão/ligamento são caracterizados pela continuidade de fíbrilas de colágenoentre as regiões mineralizadas e não mineralizadas. O sistema resultante detransições macias (interfaces moles) comunica uma estabilidade mecânicaintrínseca a estes locais, permitindo que estes suportem carregamentofisiológico sem falência mecânica.

Em contraste, a maioria das estruturas emcamada existentes contém interfaces duras, que formam uma fronteira distintaentre dois materiais diferentes. Sutura (Schaefer et al., 2000), ligação adesivade fíbrina (Gao et al., 2001) e outras técnicas (Gao et al., 2004 Hung et al.,2003) foram usadas para o fortalecimento desta interface. Entretanto, odesligamento interfacial ainda foi relatado mesmo em modelos animaiscontrolados. Estes métodos de sutura e de ligação também são delicados edeficientemente reprodutíveis.

O trabalho prévio desenvolveu meios através dos quais osparâmetros de protocolos de secagem por congelamento podem sercontrolados para produzir estruturas porosas de colágeno e um ou maisglicosaminoglicanos (GAGs) (Yannas et al., 1989; 0'Brien et al, 2004;OfBrien et al., 2005; Loree et al 1989).

Estas técnicas permitem características de estrutura, tais comotamanho de poro e taxa de aspecto sejam variados de uma maneira controlada,parâmetros conhecidos tiveram efeitos marcados na resposta de cura emlocais de trauma ou dano. Entretanto, para o tratamento de danos queenvolvem defeitos esqueletais e musculoesqueletais, é necessário desenvolvertecnologias para a produção de estruturas porosas com composições dematerial e características mecânicas que igualam-se intimamente com aquelasdo osso, em oposição àquelas de estruturas de colágeno-GAG nãomineralizadas.

A presente invenção procura resolver pelo menos alguns dosproblemas associados com a técnica anterior.

Um processo para a preparação de um biomaterial compostoque compreende um material inorgânico e um material orgânico, o processocompreendendo :

(a) fornecer uma primeira composição de pasta quecompreende um carregador líquido, um material inorgânico e um materialorgânico;

(b) fornecer um molde para a pasta;

(c) depositar a pasta no molde;

(d) esfriar a pasta depositada no molde a uma temperatura emque o carregador líquido transforma-se em uma pluralidade de cristais oupartículas sólidas;

(e) remover pelo menos alguns da pluralidade de cristais oupartículas sólidos, preferivelmente por sublimação e/ou evaporação, paradeixar um material composto poroso que compreende um material inorgânicoe um material orgânico e

(f) remover o material do molde.

O termo biomaterial como usado neste, significa um materialque é biocompatível com o corpo humano ou animal.

O termo pasta como usado neste, abrange pastas, soluções,suspensões, colóides e dispersões.

O material inorgânico compreenderá, tipicamente um materialde fosfato de cálcio.

O material orgânico compreenderá, tipicamente espéciesbioorgânicas, por exemplo, uma que possa se solubilizar ou ser colocada emsuspensão em um meio aquoso para a formação de uma pasta. Os exemplosincluem um ou mais de albumina, glicosaminoglicanos, hialuronano,quitosano e polipeptideos sintéticos que compreendem uma porção daseqüência polipeptídica de colágeno. O colágeno é o material preferido,opcionalmente junto com um glicosaminoglicano.

O termo colágeno como usado neste abrange o colágenohumano recombinante (rh).

Em uma forma de realização preferida, o material inorgânicocompreende um material de fosfato de cálcio, o material orgânicocompreende colágeno e opcionalmente um glicosaminoglicano. Isto resultaem um material de compósito poroso que compreende o material de fosfato decálcio e colágeno e opcionalmente um glicosaminoglicano. Preferivelmente, aprimeira pasta compreende um co-precipitado de colágeno e o material defosfato de cálcio. Mais preferivelmente, a primeira pasta compreende um co-precipitado triplo de colágeno, um material de fosfato de cálcio e umglicosaminoglicano.

Alternativamente, a primeira pasta pode compreendersimplesmente uma mistura mecânica de colágeno e o material de fosfato decálcio e, opcionalmente, o glicosaminoglicano. Este pode ser produzido poruma técnica convencional, tal como descrito em, por exemplo, EP-A-0164484 e EP-A-0214070. Enquanto uma mistura mecânica pode ser usada para aformação da pasta, um co-precipitado de colágeno e o material de fosfato decálcio ou um co-precipitado triplo de colágeno, o material de fosfato de cálcioe um glicosaminoglicano são preferidos.

O material de fosfato de cálcio, pode ser selecionado, porexemplo, a partir de um ou mais de brushita, octafosfato de cálcio e/ouapatita. O material de fosfato de cálcio preferivelmente compreende brushita.

O pH da pasta é preferivelmente de 2,5 a 6,5, maispreferivelmente de 2,5 a 5,5, ainda mais preferivelmente de 3,0 a 4,5, e aindamais preferivelmente de 3,8 a 4,2.A composição de pasta pode compreender um ou maisglicosaminoglicanos. A composição de pasta pode compreender um ou maismateriais de fosfato de cálcio.

A presença de outras espécies (por exemplo, prata, silício,sílica, sal de mesa, açúcar, etc) na pasta precursora não é evitada.

Pelo menos alguns da pluralidade de cristais ou partículassólidas podem ser removidos por sublimação e/ou evaporação para deixar ummaterial composto poroso que compreende colágeno, um material de fosfatode cálcio, e opcionalmente um glicosaminoglicano. O método preferido é asublimação.

As Etapas (d) e (e) podem ser realizadas pela técnica desecagem por congelamento. Se o carregador líquido for água, a etapa desublimação compreende reduzir a pressão no ambiente em torno da pastamoldada e congelada abaixo do ponto triplo de do sistema de vaporágua/gelo/água, seguido pela elevação da temperatura a mais do que atemperatura da temperatura de transição de sólido-vapor na pressão de vácuoatingida. O gelo no produto é diretamente convertido em vapor, porintermédio da sublimação contanto que a pressão de líquido vapor parcialambiente seja menor do que a pressão parcial do líquido congelado em suatemperatura corrente. A temperatura é tipicamente elevada a ou acima de O0C.Esta etapa é realizada para a remoção dos cristais de gelo da pasta congeladapor intermédio da sublimação.

Os parâmetros de secagem por congelamento podem serajustados para controlar a taxa de tamanho de poro e aspecto como desejado.No geral, taxas de esfriamento mais lentas e temperaturas de congelamentofinais mais altas (por exemplo, esfriando em aproximadamente 0,250C porminuto a uma temperatura de cerca de -10°C) favorece poros grandes comtaxas de aspecto mais altas, enquanto taxas de esfriamento mais rápidas etemperaturas de congelamento final mais baixas (por exemplo, esfriamentoem aproximadamente 2,5°C por minuto a uma temperatura de cerca de -40°C)favorece a formação de poros com eixos iguais pequenos.

O termo "molde" como usado neste é pretendido abrangerqualquer molde, recipiente ou substrato capaz de formar, manter ou suportar acomposição de pasta. Desta maneira, o molde, em sua forma mais simplespode simplesmente compreender uma superfície de suporte. O molde pode serqualquer forma desejada e pode ser fabricado a partir de qualquer materialadequado incluindo polímeros (tais como polisulfona, polipropileno,polietileno), metais (tais como aço inoxidável, titânio, cobalto cromo),cerâmicas (tais como alumina, zircônia), cerâmicas vítreas e vidros, (taiscomo vidro de borossilicato).

O pedido anterior do requerente, PCT/GB04/004550,depositado em 28 de outubro de 2004, descreve um co-precipitado triplo decolágeno, brushita e um glicosaminoglicano e um processo para a suapreparação. O teor do PCT/GB04/004550 é incorporado neste por referência.

Uma cópia do PCT/GB04/004550 é fornecida no Anexo 1.

O processo descrito no PCT/GB04/004550 envolve : forneceruma solução ácida aquosa que compreende colágeno, uma fonte de cálcio euma fonte de fósforo e um glicosaminoglicano e que precipita o colágeno, abrushita e o glicosaminoglicano juntos a partir da solução aquosa para aformação de um co-precipitado triplo.

O termo co-precipitado significa a precipitação dos dois outrês compostos onde os compostos foram precipitados substancialmente aomesmo tempo a partir da mesma solução/dispersão. Isto deve ser distinguido apartir de um material formado da mistura mecânica dos componentes,particularmente onde estes componentes foram precipitados separadamente,por exemplo, em soluções diferentes. A microestrutura de um co-precipitado ésubstancialmente diferente de um material formado a partir da misturamecânica de seus componentes.No processo para a preparação do co-precipitado, a fonte decálcio é preferivelmente selecionada a partir de um ou mais de nitrato decálcio, acetato de cálcio, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, alcóxido decálcio, hidróxido de cálcio, silicato de cálcio, sulfato de cálcio, gliconato decálcio e o sal de cálcio de heparina. Um sal de cálcio de heparina pode serderivado da mucosa intestinal porcina. Os sais de cálcio adequados sãocomercialmente disponíveis, por exemplo, a partir da Sigma-Aldrich Inc. Afonte de fósforo é, preferivelmente selecionada a partir de um ou mais defosfato de diidrogênio-amônio, fosfato de diamônio hidrogênio, ácidofosfórico, 2-hidrato de ortofosfato de hidrogênio dissódico (Na2HPO4^H2O,algumas vezes denominado sal GPR de Sorensen) e fosfato de trimetila, saisde metal alcalino (por exemplo, Na ou K) de fosfato, sais alcalinos terrosos(por exemplo, Mg ou Ca) de fosfato.

Glicosaminoglicanos são uma família de macromoléculascontendo polissacarídeos não ramificados longos contendo uma unidade dedissacarídeo de repetição. Preferivelmente, o glicosaminoglicano éselecionado a partir de um ou mais de sulfato de condroitina, sulfato dedermatina, heparina, sulfato de heparina, sulfato de queratina e ácidohialurônico. O sulfato de condroitina pode ser condroitin-4-sulfato condroitin-6-sulfato, ambos os quais são comercialmente disponíveis, por exemplo, daSigma-Aldrich Inc. O condroitin-6-sulfato pode ser derivado de cartilagem detubarão. O ácido hialurônico pode ser derivado de cordão umbilical humano.A heparina pode ser derivada da mucosa intestinal porcina.

O colágeno pode ser solúvel ou insolúvel e pode ser derivadode qualquer tecido em qualquer animal e pode ser extraído usando qualquernúmero de técnicas convencionais.

A precipitação pode ser realizada combinando-se o colágeno, afonte de cálcio, a fonte de fósforo e o glicosaminoglicano em uma soluçãoácida aquosa e deixando a solução repousar até a precipitação ocorrer,agitando-se a solução, titulação usando-se titulantes básicos, tais comoamônia, adição de um agente de nucleação, tal como brushita pré-fabricada,que varia a taxa de adição de uma fonte de cálcio ou qualquer combinaçãodestes ou numerosas outras técnicas conhecidas na técnica.

Será estimado que outros componentes possam estar presentesna pasta. Por exemplo, fatores de crescimento, genes, medicamentos ou outrasespécies biologicamente ativas podem ser opcionalmente adicionadas,sozinhas ou em combinação, à pasta.

Em uma forma de realização preferida, o processo de acordocom a invenção ainda compreende, vantajosamente : fornecer uma segundacomposição de pasta que compreende um carregador líquido e um materialorgânico e opcionalmente um material inorgânico e

antes da dita etapa de esfriamento, depositar a dita segundacomposição de pasta no molde antes ou após a dita primeira composição depasta ser depositada.

Como antes, o material orgânico compreenderá tipicamenteum ou mais de colágeno (incluindo colágeno recombinante humano (rh)), umglicosaminoglicano, albumina, hialuronano, quitosano e polipeptídeossintéticos que compreendem uma porção da seqüência polipeptídica decolágeno.

A segunda composição de pasta pode compreender ummaterial inorgânico tal como, por exemplo, um material de fosfato de cálcio.

Preferivelmente, a segunda composição de pasta compreendeum carregador líquido, colágeno, opcionalmente um material de fosfato decálcio, e opcionalmente um glicosaminoglicano. Neste forma de realização, asegunda composição de pasta preferivelmente compreende um co-precipitadode colágeno e um glicosaminoglicano ou um co-precipitado de colágeno e ummaterial de fosfato de cálcio ou um co-precipitado triplo de colágeno, umglicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio. A co-precipitação jáfoi debatida em relação à preparação da primeira pasta

Alternativamente, a segunda pasta pode compreendersimplesmente uma mistura mecânica de colágeno e opcionalmente um ouambos de um material de fosfato de cálcio e um glicosaminoglicano. Asmisturas mecânicas já foram debatidas com relação à preparação da primeirapasta.

Se presente, o material de fosfato de cálcio na segunda pastapode ser selecionado a partir de um ou mais de brushita, octafosfato de cálcioe/ou apatita.

A primeira e a segunda composições de pasta, tipicamenteserão depositadas como primeira e segunda camadas no molde. Por exemplo,a primeira pasta é depositada no molde, seguido pela Segunda pasta. Osconteúdos dos moldes podem ser então submetidos às etapas (d), (e) e (f).

Conseqüentemente, o processo pode ser usado para formar um material decamada múltipla, em pelo menos uma camada que preferivelmentecompreende um material de compósito poroso que compreende colágeno, ummaterial de fosfato de cálcio e, opcionalmente um glicosaminoglicano. Acamada que resulta da segunda composição de pasta pode ser uma camadaporosa ou não porosa. Se uma camada porosa for desejada, então, os porospodem ser criados por sublimação e/ou evaporação de uma pluralidade decristais ou partículas sólidas formados na Segunda pasta. Esta técnica já foidebatida com relação à primeira pasta e preferivelmente compreende umatécnica de secagem por congelamento.

O processo é realizado na fase líquida e este é condutor para adifusão entre a primeira camada de pasta e a Segunda camada de pasta.

As camadas podem ser depositadas de qualquer maneira deordens ou geometria de formação de camadas. As camadas podem, porexemplo, estar situadas verticalmente (isto é, uma em cima da outra),horizontalmente (isto é, um do lado do outro) e/ou radialmente (uma camadaesférica no topo da seguinte).

O processo de fundição de acordo com a presente invençãopermite a fabricação de estruturas em monolíticas porosas e em camadasporosas para o uso na engenharia de tecido.

Após a primeira e a segunda composições de pasta seremdepositadas no molde, os teores dos moldes são preferivelmente deixadosrepousar por até 24 horas antes da etapa de esfriamento. Isto é vantajoso porque isto permite a inter-difusão dos vários constituintes de pasta entre ascamadas adjacentes. Isto resulta em uma melhora na força de ligação inter-camada.

O carregador líquido na primeira pasta preferivelmentecompreende água. O carregador líquido na segunda pasta, preferivelmente,também compreende água.

Será estimado que as camadas de pasta adicionais podem serdepositadas no molde antes da dita etapa de esfriamento, antes ou após a ditaprimeira e/ou segunda composições de pasta serem depositadas.

A temperatura da pasta depositada no molde antes da etapa deesfriamento terá, no geral, um efeito na viscosidade da pasta. Se a temperaturafor muito alta, então isto pode resultar em pastas de viscosidadeexcessivamente baixa, que pode resultar na intermistura completa (e portanto,indesejável) da primeira e da segunda camadas uma vez que a Segunda pastaé depositada. Também deve ser observado que uma temperatura muito altapode resultar em desnaturação do colágeno. Por outro lado, uma temperaturamuito baixa pode resultar em pastas com viscosidades muito altas parapermitir a dispersão, uniformização ou formação eficientes e pode arriscar aformação prematura de cristais de gelo. Conseqüentemente, os inventoresobservaram que a temperatura da primeira pasta depositada no molde antes daetapa de esfriamento está preferivelmente na faixa de 2 a 40°C, maispreferivelmente de 4 a 37°C, ainda mais preferivelmente de 20 a 37°C. Secomposições de pasta de camada múltipla forem usadas, então estas faixastambém são aplicáveis às pastas adicionais.

A etapa de esfriamento da primeira pasta depositada no moldeé preferivelmente realizada em uma temperatura de < 0°C. Maispreferivelmente, a etapa de esfriamento é realizada a temperatura na faixa de -100 a 0°C, preferivelmente de -80 a -IO0C, mais preferivelmente de -40 a -20°C. Se as composições de pasta de camada múltipla forem usadas, entãoestas faixas devem ser aplicáveis às pastas adicionais.

A etapa de esfriamento da primeira pasta depositada no moldeé preferivelmente realizada em uma taxa de esfriamento de 0,02 a10°C/minuto, mais preferivelmente de 0,02 a 6,0°C/minuto, ainda maispreferivelmente de 0,2 a 2,7°C/minuto. Se composições de pasta de camadasmúltiplas forem usadas, então estas faixas também serão aplicáveis às pastasadicionais.

No geral, taxas de esfriamento mais lentas e temperaturas decongelamento final mais altas (por exemplo, esfriamento a 0,25°C por minutoa uma temperatura de -10°C) favorecem poros grandes com razões de aspectomais altas, enquanto taxas de esfriamento mais rápidas e temperaturas decongelamento final mais baixas (por exemplo, esfriamento de 2,5°C porminuto a uma temperatura de -40°C) favorece a formação de porosequiangulares iguais.

A etapa de esfriar a pasta depositada no molde épreferivelmente realizada em uma pressão de 1 a 200 kPa, maispreferivelmente de 50 a 150 kPa, ainda mais preferivelmente de 50 a 101,3kPa. Se composições de pasta de camada múltipla forem usadas, então estaspastas também são aplicáveis às pastas adicionais. Os inventores observaramque pressões abaixo de 50 kPa podem resultar na formação de bolhas dentroda pasta, enquanto pressões mais altas do que 200 kPa podem induzir amistura excessiva de camadas adjacentes.A espessura da primeira pasta depositada no mole épreferivelmente de O5I a 500 mm, mais preferivelmente de 0,5 a 20 mm, aindamais preferivelmente de 1,0 a 10 mm. Se composições de pasta de camadamúltipla forem usadas, então estas faixas também serão aplicáveis às pastasadicionais. As camadas em excesso de 500 mm de espessura podem serdifíceis de solidificar completamente, enquanto camadas com espessurasmenores do que 0,1 mm podem congelar quase que instantaneamente,tornando difícil controlar precisamente a progressão da nucleação de cristaisde gelo e desenvolvimento.

A viscosidade da primeira pasta anterior a esta sendodepositada no molde é preferivelmente de 0,1 a 50 Pa*s, mais preferivelmentede 0,1 a 10 Pa»s, ainda mais preferivelmente de 0,5 a 5 Pa.s. Se composiçõesde pasta de camada múltipla forem usadas, então estas faixas também serãoaplicáveis às pastas adicionais. As pastas com viscosidade excessivamentealta pode ser difícil de dispersar, uniformizar e formar, enquanto aqueles comviscosidade excessivamente baixa pode resultar na intermistura completa (eportanto, indesejável) da primeira e segunda camadas uma vez que a pastasecundária é depositada.

A etapa de remover pelo menos alguns dos cristais oupartículas sólidas na primeira pasta por sublimação é preferivelmenterealizada em uma pressão de 0 a 0,08 kPa, mais preferivelmente de 0,0025 a0,08 kPa, ainda mais preferivelmente de 0,0025 a 0,04 kPa. Se composiçõesde pasta de camada múltipla forem usadas, então estas faixas também sãoaplicáveis às pastas adicionais. Pressões acima daquelas do ponto triplo daágua (aproximadamente 0,08 kPa) podem colocar em risco a ocorrência defusão no lugar da sublimação, enquanto pressões excessivamente baixas sãodifíceis de se atingir e desnecessárias para encorajar a sublimação.

Com respeito à a etapa de remover pelo menos alguns doscristais ou partículas sólidas na primeira pasta por sublimação, se a duraçãoda sublimação for muito curta, água e solventes residuais podem causar aredissolução das paredes estruturais, desse modo, comprometendo aarquitetura porosa. Conseqüentemente, os inventores observaram que estaetapa é preferivelmente realizada por até 96 horas, mais preferivelmente de 12a 72 horas, ainda mais preferivelmente de 24 a 36 horas. Se as composiçõesde pasta de camada múltipla forem usadas, então estas faixas também sãoaplicáveis às pastas adicionais.

A etapa de remover pelo menos alguns dos cristais oupartículas sólidas na primeira pasta por sublimação é preferivelmenterealizada em uma temperatura de -10 a 60°C, mais preferivelmente de 0 a40°C, ainda mais preferivelmente de 20 a 37°C, ainda mais preferivelmentede 25 a 37°C. Se as composições de pasta de camada múltipla forem usadas,então, estas faixas também são aplicáveis às pastas adicionais. Se atemperatura durante a sublimação for muito baixa, o tempo até a sublimaçãoestar completa pode tornar-se excessivamente longo, enquanto temperaturasexcessivamente altas (isto é acima de 40°C) pode colocar em risco adesnaturação do colágeno.

Se o material compreender colágeno e um glicosaminoglicano,então o processo de acordo com a presente invenção ainda pode compreendera etapa de reticular o colágeno e o glicosaminoglicano no biomaterialcomposto poroso. A reticulação acontecerá, tipicamente após o material serremovido do molde seguindo a sublimação. A reticulação pode ser realizadasubmetendo-se o co-precipitado a uma ou mais de radiação gama, radiaçãoultravioleta, um tratamento desidrotérmico, glicação não enzimática com umaçúcar simples, tal como glicose, manose, ribose e sacarose, contatando-se oco-precipitado triplo com um ou mais de glutaraldeído, carbodiimida (porexemplo, etil dimetilaminopropil carbodiimida) e/ou ácido nor-diidroguariarético ou qualquer combinação destes métodos. Estes métodossão convencionais na técnica.Se o material compreender fosfato de cálcio, então, o processode acordo com a presente invenção ainda pode compreender a etapa deconverter pelo menos algum do material de fosfato de cálcio no biomaterialcomposto poroso a uma outra fase de fosfato de cálcio. Por exemplo, oprocesso pode compreender a etapa de pelo menos algum de brushita nobiomaterial composto poroso ao octafosfato de cálcio e/ou apatita. Aconversão da brushita ao octafosfato de cálcio e/ou apatita é preferivelmenterealizada por hidrolisação. A conversão de fase acontecerá tipicamente após omaterial ter sido removido do molde (e opcionalmente reticulado).

A apatita é uma classe de minerais que compreende cálcio efosfato e tem a fórmula geral : Ca5(PO4)3(X), em que X pode ser um íon que étipicamente OH", F" e Cl", bem como outros íons conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. O termo apatita também inclui apatitas substituídas,tais como apatitas substituídas por silício. O termo apatita incluihidroxiapatita, que é um exemplo específico de uma apatita. A hidroxiapatitatambém pode ser substituída por outras espécies, tais como, por exemplo,silício.

Como mencionado acima, camadas de pastas adicionaispodem ser depositadas no molde antes da dita etapa de esfriamento, antes ouapós a dita primeira e/ou segunda composições de pasta serem depositadas.

As camadas de pasta adicionais também compreenderão, tipicamente, porexemplo, um carregador líquido, colágeno, opcionalmente um material defosfato de cálcio e opcionalmente um glicosaminoglicano. Os conteúdos dosmoldes são preferivelmente deixados repousar por até 24 horas antes da etapade esfriamento a fim de permitir a inter-difusão dos vários constituintes depasta entre as camadas adjacentes.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um processopara a preparação de um biomaterial composto que compreende uma duas oumais camadas. Pelo menos uma das camadas, preferivelmente, compreendeum biocompósito poroso de colágeno, um material de fosfato de cálcio etambém preferivelmente, um glicosaminoglicano. Todas as camadaspreferivelmente contém colágeno.

O biomaterial compósito de acordo com a presente invençãopode ser suado para fabricar, por exemplo, uma estrutura porosa monolíticaou uma estrutura de camada múltipla em que pelo menos uma camada éporosa. O biomaterial compósito de acordo com a presente invenção évantajosamente usado como uma estrutura para a regeneração de tecido paraaplicações musculoesqueletais e dentais.

O processo de acordo com a presente invençãopreferivelmente envolve incorporar colágeno como um constituinte orgânicona primeira e segunda camadas (colágeno é, preferivelmente, o principalconstituinte orgânico na primeira e segunda camadas). Se camadas adicionaisestiverem presentes, então o processo, preferivelmente, envolve aincorporação do colágeno como um constituinte orgânico em uma ou maisdestas camadas adicionais (colágeno também é, preferivelmente, o principalconstituinte orgânico em uma ou mais camadas adicionais). O processoenvolve fabricar todas as camadas e, desta maneira, as interfaces entre estas,simultaneamente na fase líquida. Isto resulta na criação de uma interface forteentre as camadas através da inter-difusão. O termo inter-difusão refere-se àmistura que ocorre como um resultado da difusão molecular ou movimentoBrownian quando as pastas de composição diferentes são colocadas emcontato integral.

Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece umbiomaterial composto sintético, em que pelo menos parte do biomaterial éformado de um co-precipitado poroso que compreende um material de fosfatode cálcio e um ou mais de colágeno (incluindo colágeno recombinantehumano (rh)), um glicosaminoglicano, albumina, hialuronano, quitosano ouum polipeptídeo sintético que compreende uma porção da seqüênciapolipeptídica de colágeno, em que a faixa de tamanho de macroporo(diâmetro de poro) é preferivelmente de 1 a 1000 mícrons, maispreferivelmente de 200 a 600 mícrons. O material preferivelmentecompreende colágeno. O material de fosfato de cálcio é preferivelmenteselecionado a partir de um ou mais de brushita, octafosfato de cálcio e/ouapatita. O material poroso preferivelmente compreende um co-precipitado docolágeno e o material de fosfato de cálcio. Isto já foi descrito com relação aoprimeiro aspecto da invenção.

O termo poroso como usado neste significa que o materialpode conter macroporos e/ou microporos. A macroporosidade tipicamenterefere-se às características associadas com os poros na escala maior do queaproximadamente 10 mícrons.

A microporosidade tipicamente refere-se à característicasassociadas com poros na escala menor do que aproximadamente 10 mícrons.Será estimado que estes possam ser de qualquer combinação de célulasabertas ou fechadas dentro do material. Por exemplo, o material no geral,conterá, tanto macroporos quanto microporos. A macroporosidade é, no geral,de célula aberta, embora estes possam ser um componente de célula fechada.

A faixa de tamanho de macroporo (diâmetro de poro) nomaterial poroso de acordo com o segundo aspecto da presente invenção é,tipicamente de 1 a 1200 mícrons, preferivelmente de 10 a 1000 mícrons, maispreferivelmente de 100 a 800 mícrons, ainda mais preferivelmente de 200 a600 mícrons.

A taxa de aspecto média varia no material poroso de acordocom o segundo aspecto da presente invenção é preferivelmente de 1 a 50,mais preferivelmente de 1 a 10 e mais preferivelmente, aproximadamente 1.

A distribuição de tamanho de poro (o desvio padrão dodiâmetro médio de poro) no material poroso de acordo com o segundo aspectoda presente invenção é preferivelmente de 1 a 800 mícrons, maispreferivelmente de 10 a 400 mícrons e ainda mais preferivelmente de 20 a200 mícrons.

A porosidade no material poroso de acordo com o segundoaspecto da presente invenção é preferivelmente de 50 a 99,99 % em volume emais preferivelmente de 70 a 98 % em volume.

A porcentagem da porosidade de célula aberta (medido comouma porcentagem do número total de poros tanto de célula aberta quantofechada) no material poroso de acordo com o segundo aspecto da presenteinvenção é preferivelmente de 1 a 100 %, mais preferivelmente de 20 a 100 %e ainda mais preferivelmente de 90 a 100 %.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece umbiomaterial composto sintético, em que pelo menos parte do biomaterial éformado de um poroso material que compreende um material de fosfato decálcio e dois ou mais de colágeno (incluindo colágeno recombinante humano(rh)), um glicosaminoglicano, albumina, hialuronano, quitosano e umpolipeptídeo sintético que compreende uma porção da seqüência polipeptídicade colágeno. O material preferivelmente compreende colágeno e umglicosaminoglicano. O material de fosfato de cálcio é preferivelmenteselecionado a partir de um ou mais de brushita, octafosfato de cálcio e/ouapatita. O material poroso preferivelmente compreende um co-precipitadotriplo de colágeno, um glicosaminoglicano e o material de fosfato de cálcio.Isto já foi descrito com relação ao primeiro aspecto da invenção. A faixa detamanho de macroporo (diâmetro de poro) no material poroso de acordo como segundo aspecto da presente invenção também é aplicável ao terceiroaspecto. O mesmo é verdade a partir da faixa da taxa de aspecto principal, adistribuição de tamanho de poro, a porosidade e a porcentagem da porosidadede célula aberta.

Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece umbiomaterial composto sintético que compreende :uma primeira camada formada de um biomaterial composto deacordo com o segundo ou terceiro aspecto da presente invenção e umasegunda camada unida à primeira camada e formada de um material quecompreende colágeno ou um co-precipitado de colágeno e umglicosaminoglicano ou um co-precipitado de colágeno e um material defosfato de cálcio ou um co-precipitado triplo de colágeno, umglicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio. O material de fosfatode cálcio é preferivelmente selecionado a partir de um ou mais de brushita,octafosfato de cálcio e/ou apatita.

A primeira e a segunda camadas são, preferivelmente,formadas integralmente, vantajosamente, isto pode ser atingido por umprocesso que envolve a co-síntese da fase líquida. Isto abrange quaisquerprocessos em que as camadas adjacentes, densas ou porosas, de um materialque compreende camadas múltiplas são formadas colocando-se as pastas quecompreendem os precursores em cada camada em contato integral um com ooutro antes da remoção do carregador líquido ou carregadores a partir dasditas pastas e em que a remoção do dito carregador ou carregadores líquidos apartir de todas as camadas é preferivelmente realizada substancialmente aomesmo tempo. Colocando-se as pastas precursoras em contato integral antesda remoção do carregador líquido (isto é, enquanto ainda na fase líquida)permite que a interdifusão ocorra entre as pastas adjacentes. Isto resulta emuma zona de interdifusão na interface entre as camadas adjacentes do materialresultante, dentro das quais a composição de material é intermediária àscomposições de material das camadas adjacentes. A existência de uma zonade interdifusão pode comunicar força e estabilidade mecânica à interface entreas camadas adjacentes. Conseqüentemente, a primeira e segunda camadas sãopreferivelmente unidas uma à outra através de uma camada de inter-difusão.

Alternativamente, a primeira e a segunda camadas podem serunidas uma à outra através de uma camada interna. O termo inter-camadarefere-se a qualquer camada depositada independentemente entre as duascamadas para o propósito de melhorar a força de ligação inter-camada oubloqueio da passagem das células, moléculas ou fluidos entre as camadasadjacentes da estrutura resultante e pode, por exemplo, conter colágeno,glicosaminoglicanos, fibrina, medicamentos anti-angiogênicos (por exemplo,suramina), fatores de crescimento, genes ou quaisquer outros constituintes.

Uma inter-camada é distinguida a partir de uma camada de inter-difusão pelofato que uma inter-camada é depositada separadamente como uma pasta cujacomposição é diferente da composição de suas camadas adjacentes, enquantouma camada de inter-difusão é formada exclusivamente como um resultadoda inter-difusão entre as camadas adjacentes.

A primeira camada é porosa. A Segunda camada também épreferivelmente porosa, embora esta possa ser camada não porosa ousubstancialmente não porosa se desejado.

A faixa de tamanho de macroporo (diâmetro de poro) nomaterial poroso de acordo com o segundo aspecto da presente invençãotambém é aplicável à primeira e/ou Segunda camadas na forma de realizaçãode acordo com o quarto aspecto. O mesmo é verdade para a faixa da taxa deaspecto média, a distribuição de tamanho de poro, a porosidade e aporcentagem de porosidade de célula aberta.

Em qualquer um dos segundo, terceiro e quarto aspectos, obiomaterial pode compreender uma ou mais camadas adicionais unidas àprimeira e/ou segunda camadas, cada uma das ditas camadas adicionaispreferivelmente sendo formadas de um material que compreende, colágeno ouum co-precipitado de colágeno e um glicosaminoglicano ou um co-precipitado de colágeno e um material de fosfato de cálcio ou um co-precipitado triplo de colágeno, um glicosaminoglicano e um material defosfato de cálcio. O material de fosfato de cálcio é preferivelmenteselecionado a partir de um ou mais de brushita, octafosfato de cálcio e/ouapatita. A primeira e segunda camadas e a dita uma ou mais camadasadicionais são preferivelmente formados de maneira integral e camadasadjacentes são preferivelmente unidas uma à outra através de uma camada deinter-difusão, que é tipicamente formada pela co-síntese de fase líquida. Nogeral, pelo menos uma das ditas camadas adicionais serão porosas.Novamente, a faixa de tamanho de macroporo (diâmetro de poro) no materialporoso de acordo com o segundo aspecto da presente invenção também éaplicável uma à outra a uma ou mais destas camadas adicionais. O mesmo éverdade para a faixa da taxa de aspecto média, a distribuição de tamanho deporo, a porosidade e a porcentagem da porosidade de célula aberta.

As diferenças nos tamanhos de poro entre as camadasadjacentes podem variar de quase negligível a tão grande quanto +/- 1000mícrons.

A não ser que estabelecido de outra maneira, o seguinterelatório descritivo é aplicável a qualquer aspecto da presente invenção.

Se o material compreender colágeno e um glicosaminoglicano,então o colágeno e o glicosaminoglicano podem ser reticulados.

O colágeno está preferivelmente presente no material em umaquantidade de 1 a 99 % em peso, preferivelmente de 5 a 90 % em peso, maispreferivelmente de 15 a 60 % em peso.

O glicosaminoglicano está preferivelmente presente nomaterial em uma quantidade de 0,01 a 20 % em peso, mais preferivelmente de1 a 12 % em peso, ainda mais preferivelmente de 1 a 5,5 % em peso.

Se o material compreender brushita, então a razão de colágenoà brushita é preferivelmente de 10 :1 a 1 :100 em peso, mais preferivelmentede 5 :1 a 1 :20 em peso.

Se o material compreender octafosfato de cálcio, então a taxade colágeno para o octafosfato de cálcio é preferivelmente 10 :1 a 1 :100 empeso, mais preferivelmente de 5 :1 a 1 :20 em peso.A razão de colágeno para o glicosaminoglicano épreferivelmente de 8 :1 a 30 :1 em peso.

O biomaterial de acordo com a presente invenção pode serusado como um osso ou material dental substituto. Conseqüentemente, apresente invenção fornece um material ósseo sintético, implante ósseo,enxerto ósseo, substituto ósseo, estrutura óssea, enchedor, revestimento oucemento que compreende um biomaterial como descrito neste.

O biomaterial é vantajosamente fornecido na forma de umaestrutura de camada múltipla. Em particular, a presente invenção forneceestruturas de regeneração de tecido para aplicações musculoesqueletal edental. As estruturas de camadas múltiplas (isto é, duas ou mais camadas) deacordo com a presente invenção pode encontrar aplicação, por exemplo, eminterfaces de osso/cartilagem (por exemplo, juntas articulares), interfaces deosso/tendão (por exemplo, pontos de inserção de tendão), interfaces deosso/ligamento (por exemplo, pontos de inserção de ligamento) e interfacesde dente/ligamento (por exemplo, junção de ligamento dente/periodontal).

Embora a presente invenção esteja primariamente relacionadacom as estruturas para as aplicações de engenharia de tecido, o material deacordo com a presente invenção pode ser usado para a fabricação deimplantes que persistem no corpo por exatamente algum tempo. Por exemplo,um implante semi-permanente pode ser necessário para aplicações de tendão eligamento.

A presente invenção ainda fornece um biomaterial decompósito poroso obtenível por um processo como descrito neste.

Método de Síntese

A presente invenção ainda será descrita agora por meio deexemplo. O método preferido de síntese compreende uma seqüência deetapas, que pode ser aplicado em todo ou em parte, para a produção deestruturas porosas tendo uma ou mais camadas em pelo menos um dos quaispreferivelmente compreende um co-precipitado triplo de colágeno, umglicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio.

Etapa 0 : Preparação de pasta

A preparação de pasta ou pastas de colágeno/GAG/brushitamineralizada pode ser atingida usando-se o método resumido no pedido depatente anterior do requerente, PCT/GB04/004550, depositado em 28 deoutubro de 2004. O teor do PCT/GB04/004550 é incorporado neste porreferência. Uma cópia do PCT/GB04/004550 é fornecido no anexo 1.

A preparação de pasta ou pastas de colágeno/GAGdesmineralizadas pode ser atingida usando-se um método como resumido emYannas et ai, 1989; 0'Brien et ai, 2004; O1Brien et ai, 2005); Loree et al.,(1989).

Os fatores de crescimento, genes, medicamentos ou outrasespécies biologicamente ativas podem ser opcionalmente adicionados,sozinhos ou em combinação, à pasta por intermédio da mistura mecânicaneste estágio para facilitar sua incorporação na estrutura. No caso deestruturas com mais do que uma camada, as espécies biologicamente ativasincorporadas em uma camada necessitam ser os mesmos como as espéciesincorporadas a seguir.

Etapa I: FundiçãoEtapa I-a : Fundição da 10CamadaEtapa I-b : Fundição da 2°CamadaEtapa I-c : Fundição da 3°CamadaEtapa I-n : Fundição da n°Camada

As etapas de fusão envolvem a deposição sucessiva de umapasta ou pastas, em forma de solução, suspensão, colóide ou dispersão, onde aágua compreende o diluente principal, em um molde, em que pelo menos umadas pastas compreende um co-precipitado triplo de colágeno, um ou maisglicosaminoglicanos e a brushita de fosfato de cálcio e todas as pastas contêmcolágeno.

O molde pode ser de qualquer forma desejada e pode serfabricado de qualquer um de uma variedade de materiais que incluempolímeros (tais como polissulfona, polipropileno, polietileno), metais (taiscomo aço inoxidável, titânio, cobalto cromo) ou cerâmicas (tais comoalumina, zircônia), cerâmicas vítreas ou vidros (tais como vidro deborossilicato).

O molde pode ser construído especificamente a fim de facilitara formação de camadas. Os exemplos de projetos adequados são mostradosnas Figuras 1 e 2.

As camadas podem, por exemplo, estar situadas verticalmente(isto é, uma em cima da outra), horizontalmente (isto é, um do lado do outro)e/ou radialmente (uma camada esférica em cima da seguinte).

No evento que a estrutura compreende uma camada, a camadasimples a ser fundida compreende uma pasta de um co-precipitado quecompreende colágeno, um material de fosfato de cálcio, que é preferivelmentebrushita, e opcionalmente um glicosaminoglicano. Preferivelmente, a pastacompreende um co-precipitado triplo que compreende colágeno, brushita eum glicosaminoglicano. A espessura preferida da camada é especificada naseção apropriada da Tabela 1.

No evento que a estrutura compreende duas camadas, pelomenos uma das camadas a serem fundidas compreendem uma pasta de um co-precipitado que compreende colágeno, um material de fosfato de cálcio, que épreferivelmente brushita e opcionalmente um glicosaminoglicano.

Preferivelmente, a pasta compreende um co-precipitado triplo quecompreende colágeno, brushita e um glicosaminoglicano. A espessurapreferida desta camada é especificada na seção apropriada da Tabela 1. Aoutra camada compreende uma pasta que compreende colágeno,opcionalmente um material de fosfato de cálcio e opcionalmente umglicosaminoglicano. Esta composição de pasta preferivelmente compreendeum co-precipitado de colágeno e um glicosaminoglicano, um co-precipitadode colágeno e um material de fosfato de cálcio, tal como brushita ou um co-precipitado triplo de colágeno, um glicosaminoglicano e um material defosfato de cálcio, que é preferivelmente brushita.

As camadas adicionais podem estar incluídas como desejado eestas camadas adicionais são, preferivelmente, formadas a partir e uma pastaque compreende colágeno, opcionalmente um material de fosfato de cálcio eopcionalmente um glicosaminoglicano. As composições de pasta adicionais,preferivelmente, compreendem um co-precipitado de colágeno e umglicosaminoglicano, um co-precipitado de colágeno e um material de fosfatode cálcio, tal como brushita ou um co-precipitado triplo de colágeno, umglicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio, que é preferivelmentebrushita.

A composição das pastas e cada camada subseqüente pode seridêntica, pode variar levemente ou variar significantemente, contanto que ocolágeno e preferivelmente também um glicosaminoglicano estão presentesem cada camada e que pelo menos uma das camadas também contém ummaterial de fosfato de cálcio tal como, por exemplo, brushita.

Etapa II: Inter-Difusão

A etapa de co-difusão envolve deixar as respectivas camadasda fusão, pasta em camadas inter-difundir. Esta etapa é realizada para opropósito de deixar a inter-difusão de constituinte de pasta entre as camadasadjacentes, desse modo, aumentando a força de ligação inter-camada após asolidificação e a sublimação. As condições preferidas para a etapa de inter-difusão são listadas na seção apropriada da Tabela 2.

Etapa III: Esfriamento Controlado

A etapa de esfriamento controlado envolve colocar o moldecontendo a pasta em um ambiente, que é então esfriado em uma taxacontrolada a uma temperatura final menor do que 0°C. Esta etapa é realizadapara iniciar e controlar a taxa de nucleação e desenvolvimento de cristal degelo dentro da pasta. Os cristais de gelo são então subseqüentementeremovidos por sublimação deixando uma estrutura porosa. A arquitetura darede de cristal de gelo determinará a última estrutura de poro da estrutura. Osparâmetros preferidos para o esfriamento são listados na Tabela 3.

Etapa IV : Recozimento

A etapa de recozimento envolve deixar a pasta permanecer natemperatura final da etapa de esfriamento controlado por uma quantidadedesignada de tempo. Esta etapa é realizada para garantir que a pasta congelecompletamente ou de maneira substancialmente completa. Os parâmetrospreferidos para o recozimento são listados na Tabela 4.

Etapa V : Sublimação

A etapa de sublimação que compreende a redução, enquanto apasta congelada é mantida irregularmente na temperatura final das etapas deesfriamento e recozimento controladas, a pressão no ambiente em torno domolde e da pasta congelada abaixo do ponto triplo do sistema deágua/gelo/vapor de água, seguido pela elevação da a mais do que atemperatura da temperatura de transição sólido vapor na pressão de vácuoatingida (tipicamente > 0°C). Esta etapa é realizada para remover os cristaisde gelo da pasta congelada por intermédio da sublimação. A vantagem dasublimação sobre a evaporação como um meio de remoção de água é que estadeixa uma rede de espaços vazios (isto é, poros) que imita precisamente aarquitetura da rede previamente existente de cristais de gelo. Se o gelo fordeixado fundir, a rede de cristal de gelo perde sua forma e a arquitetura darede de poro resultante é comprometida. Os parâmetros preferidos para aetapa de sublimação são mostrados na Tabela 5.

Etapa V + I: Reticulação

Se desejado, o processo também pode envolver a etapa dereticulação para a reticulação do colágeno e do glicosaminoglicano. Isto édescrito no pedido de patente anterior do requerente, PCT/GB04/004550,depositado em 28 de outubro de 2004. O teor do PCT/GB04/004550 éincorporado neste por referência. Uma cópia do PCT/GB04/004550 éfornecida no anexo 1.

Exemplos

Exemplo I : Estrutura de Camada Simples deColágeno/GAG/CaP

Materiais

Colágeno : Tipo I, colágeno microfibrilar de tendão bovino,Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA

GAG : Condroitin-6-sulfato de cartilagem de tubarão, sal desódio, Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Fontes de cálcio : (i) Hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO5 USA); (ii) Nitrato de cálcio (CaNO3)vH2O),Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Fonte de fósforo : Ácido ortofosfórico (H3PO4), BDHLaboratory Supplies (Poole, United Kingdom)

Agentes de reticulação : l-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)Carbodiimida (=EDAC), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA); N-Hidroxissuccinimida (=NHS), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Procedimento

Etapa O : Preparação de pasta

3,8644 g de colágeno foram dispersados em 171,4 mel de0,1383 M de H3PO4 esfriado em um banho de gelo misturando-se por 90minutos a 15.000 rpm usando-se um homogeneizador equipado com umestator de 19 mm de diâmetro para criar uma dispersão de colágeno altamenteviscosa. Em paralelo, 0,3436 g de condroitin-6-sulfato (GAG) foi deixadodissolver em 14,3 ml de 0,1383 M de H3PO4 em temperatura ambienteagitando-se periodicamente para dispersar a dissolução de GAG a fim deproduzir uma solução de GAG. Após 90 minutos, os 14,3 ml de solução deGAG foi adicionado à mistura de dispersão de colágeno em uma taxa deaproximadamente 0,5 ml/minuto sob condições de homogeneização em 1.500rpm e o colágeno altamente viscoso resultante/dispersão de GAG combinadopor um adicional de 90 minutos. Após 90 minutos de mistura, 1,804 gCa(OH)2 e 0,780 g Ca(N03)24H20 foram adicionados à dispersão decolágeno/GAG altamente viscoso durante 30 minutos em combinaçãoconstante em 1.500 rpm, criando uma pasta de colágeno/GAG/CaP, cujo pHfoi de aproximadamente 4,0. A pasta de colágeno/GAG/CaP foi deixadapermanecer em 25 0C por um período de 48 horas de mistura em uma placa deagitação e foi então colocado em 4°C por 12 horas subseqüentes. A pastaesfriada foi então desgaseifícada em um frasco de vácuo durante 25 horas emuma pressão de 25 Pa.

Etapa I: Fundição

15 ml da pasta de colágeno/GAG/CaP mineralizada foifundida em um molde de polissulfona, 50 mm de comprimento por 30 mm delargura por 10 mm de profundidade, usando-se um auto-pipetador. Todas asbolhas grandes foram removidas da pasta usando-se um pipetador manual.

Etapa II: Inter-difusão

Como a estrutura para o exemplo I compreendia apenas umacamada, a etapa de inter-difusão foi desnecessária.

Etapa III: Esfriamento controlado

O molde e a pasta foram colocados em um secador porcongelamento VirTis Genesis (equipado com prateleiras de aço inoxidávelcom temperatura controlada) e a temperatura da prateleira do secador porcongelamento mudada de 4°C a -20°C em uma taxa de aproximadamente2,4°C por minuto.

Etapa IV : RecozimentoA temperatura da prateleira do secador por congelamento foimantida a -20°C por 10 horas.

Etapa V : Sublimação

Enquanto ainda em uma temperatura de prateleira de -20°C,um vácuo abaixo de 25Pa (aproximadamente 200 mTorr) foi aplicado àcâmera contendo o molde e a (agora congelada) pasta. A temperatura dacâmara foi então elevada à 37°C e a sublimação deixada continuar por 36horas. O vácuo foi então removido e a temperatura retornou à temperaturaambiente, deixando uma estrutura de camada simples de colágeno/GAG/CaP,50 mm por 30 mm por 10 mm de tamanho.

Etapa V + I: Reticulação

Estruturas foram hidratadas em 40 ml de água deionizada por20 minutos. 20 ml de uma solução de 0,035 M de EDAC e 0,014 M de NHSforam adicionados ao recipiente contendo as estruturas e água deionizada e asestruturas foram deixadas reticular por 2 horas em temperatura ambiente sobagitação leve. a solução de EDAC foi removida e as estruturas foramenxaguadas com solução de tampão de fosfato (PBS) e depois deixadaincubar a 37°C por 2 horas em PBS fresco sob agitação branda. Após duashoras em PBS, as estruturas foram enxaguadas deixando-as incubar em águadeionizada por dois intervalos de dois minutos a 37°C sob agitação branda.

As estruturas foram então secadas por congelamento para remover qualquerágua residual por esfriamento controlado da temperatura ambiente a -20°C emuma taxa de aproximadamente 2,4°C por minuto, seguido por recozimento a -20°C for aproximadamente 5 horas e depois sublimação abaixo de 25Pa a37°C, resultando em uma estrutura colágeno/GAG/CaP reticuladairregularmente de 50 mm por 30 mm por 10 mm de tamanho.

Digno de nota é a natureza substancialmente uniforme tanto dacomposição de material quanto da porosidade por toda a estrutura.

As seções transversais seqüenciais da mesma estrutura sãomostradas na Figura 4, que ilustra novamente a natureza uniforme da estruturade poro estrutural; também está evidente na Figura 4 o alto grau deinterconectividade de poro, a morfologia porosa equiangular e o tamanho demacroporo grande (diâmetro médio de 500 mícrons). Na Figura 5, osmicrográfícos SEM mostram novamente a morfologia de macroporo enquantotambém mostram a presença de microporosidade limitada, visível dentro dasparedes de certos macroporos. A ampliação alta (4000x) secundária (isto é,sensível à topografia) e imagens de elétron retro dispersadas (isto é, sensível àcomposição) de uma região da parede da estrutura (Figura 6) demonstra umahomogeneidade composicional das paredes da estrutura, a despeito dasvariações topológicas limitadas na forma de nódulos de protrusão deaproximadamente 1 a 2 mícrons de tamanho. Os mapas de cálcio e de fósforomostrados na Figura 7 conformam a conclusão da homogeneidadecomposicional por toda a estrutura, com ambos os elementos distribuídosuniformemente por toda a estrutura. A Figura 8 mostra estruturas de camadasimples no estado seco e ilustra a sua capacidade de ser cortada em qualquerforma desejada sem desintegração, craqueamento ou perda de sua integridadeusando-se ferramentas cirúrgicas comuns, tais como bisturis, lâminas denavalha e lâminas de trépano (ferramentas de corte circular usadas durante otransplante de córnea); A Figura 8 também ilustra a capacidade de carregarpeso das estruturas de camada simples secas sob o peso de um mancai deesferas de aço sólido. Na Figura 9, o comportamento de estruturas de camadasimples no estado seco é mostrado. Este comportamento apresenta os trêsestágios de deformação típica de sólidos porosos, com um módulo elástico de762+/-188 kPa e uma tensão de rendimento compressivo de 85,2+/-11,7 kPa.Significantemente, é digno de nota que a força de rendimento das estruturassecas as permite resistir à pressão firme do polegar (durante a inserção em umlocal defeituoso, por exemplo) sem se deformar de maneira permanente eainda será formado quando pressão firme de for aplicada (por um cirurgiãoque modifica a forma do implante, por exemplo). Na figura 10; a deformaçãocompressiva de estruturas de camada simples no estado hidratado é mostrado.

Como no estado seco, as estruturas de colágeno/GAG mineralisadashidratadas apresentam comportamento mecâmico de três estágios sob ocarregamento compressivo, mas com módulos elásticos (4,12+/-0,76 kPa) etensões de rendimento de (0,29+/-0,ll kPa) de maneira irregular uma ordemde magnitude menor do que as propriedades correspondentes de estruturassecas. Além disso, evidência de recuperação de cepa viscoelástica foiobservado seguindo a liberação de tensões compressivas na região de platô decolapso.

Exemplo II : Materiais de Estrutura Mineralisados-Desminaralisados de Duas Camadas

Colágeno (para pasta mineralizada) : Colágeno microfibrilarTipo I de tendão bovino, Integra Life Sciences Plainsboro, NJ, USA

GAG (para pasta mineralizada) : Condroitin-6-sulfato decartilagem de tubarão, sal de sódio, Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)Colágeno Tipo II

+ GAG (para pasta não mineralizada) : Colágeno Tipo II epasta de GAG (Colágeno/GAG) solubilizada a partir de cartilagem porcina,Gelstlich Biomaterials (Wolhusen, Switzerland).

Fontes de cálcio : (i) Hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA); (ii) Nitrato de cálcio, Ca(NO3)2j4H2O,Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) Fonte de fósforo : Ácidoortofosfórico (H3PO4), BDH Laboratory Supplies (Poole, United Kingdom)

Agentes de reticulação : l-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)Carbodiimida (=EDAC), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, NO, USA); N-Hidroxissuccinimida (=NHS), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)Etapa O : Preparação de pastaPreparação de pasta mineralizada3,8644 g de colágeno foram dispersados em 171,4 ml de0,1383 M de H3PO4 esfriado em um banho de gelo misturando-se por 90minutos em 1.500 rpm usando-se um homogeneizador equipado com a estatorde 19 mm de diâmetro para criar uma dispersão de colágeno altamenteviscosa. Em paralelo, 0,3436 g de condroitin-6-sulfato (GAG) foi deixadodissolver em 14,3 ml de 0,1383 M de H3PO4 em temperatura ambienteagitando-se periodicamente para dispersar a dissolução de GAG a fim deproduzir uma solução de GAG. Após 90 minutos, os 14,3 ml de solução deGAG foi adicionado à mistura de dispersão de colágeno em uma taxa deaproximadamente 0,5 ml/minutos, sob homogeneização contínua em 1.500rpm e o colágeno altamente viscoso resultante/dispersão de GAG combinadopor um adicional de 90 minutos. Após 90 minutos de mistura, 1,804 gCa(OH)2 e 0,780 g de Ca(N03)2.4H20 foram adicionados à dispersão decolágeno/GAG altamente viscoso durante 30 minutos sob combinaçãoconstante em 1.500 rpm, criando uma pasta de colágeno/GAG/CaP, cujo pHfoi de aproximadamente 4,0. A pasta esfriada foi então desgaseificada em umfrasco de vácuo durante 25 horas em uma pressão de 25 Pa, recombinadousando-se o homogeneizador durante 30 minutos e depois desgaseifícadanovamente por 48 horas.

Preparação de pasta não mineralizada

A pasta de colágeno Tipo II/GAG foi removida do refrigeradore deixada retornar até a temperatura ambiente.

Etapa I: Fundição

2,5 ml da pasta de Colágeno Tipo II/GAG desmineralizadasforam colocados na porção inferior de um molde de polissulfona decombinação, cuja porção inferior mediu 50 mm de comprimento por 30 mmde largura por 2 mm de profundidade. A pasta foi alisada até uma superfícieplana usando-se uma lâmina de navalha. Um colar superior, também feito depolissulfona e medindo 50 mm de comprimento por 30 mm de largura por 6mm de profundidade, foi ligado à porção inferior do molde contendo a pastadesmineralizadas alisada. 9 ml da pasta de colágeno/GAG/CaP mineralizadaforam colocados, de uma maneira uniformemente distribuída, na partesuperior da camada não mineralizada alisada e dentro do colar superiorpreviamente vazio. Todas as bolhas grandes foram removidas da pastausando-se um pipetador manual.

Etapa II: Inter-difusão

A pasta em camadas foi deixada permanecer em temperatura epressão ambientes por um total de 4 horas, antes de serem colocadas nosecador por congelamento.

Etapa III: Esfriamento controlado

O molde e a pasta em camadas foram colocados em umsecador por congelamento VirTis Genesis (equipado com prateleiras de açoinoxidável com temperatura controlada prateleiras de aço inoxidável comtemperatura controlada) e a temperatura da prateleira do secador porcongelamento mudada de 4°C a -40°C em uma taxa de aproximadamente -2,4°C por minuto.

Etapa IV : Recozimento

A temperatura da prateleira do secador por congelamento foimantida a -40°C por 10 horas.

Etapa V : Sublimação

Enquanto ainda em uma temperatura de prateleira de -40°C,um vácuo abaixo de 25Pa (aproximadamente 200mTorr) foi aplicado àcâmera contendo o molde e a (agora congelada) pasta em camadas. Atemperatura da câmara foi então elevada à 37°C e sublimação deixadacontinuar por 36 horas. O vácuo foi então removido e a temperatura retornouà temperatura ambiente, deixando uma estrutura de duas camadas decolágeno/GAG/CaP, 50 mm por 30 mm por 8 mm de tamanho, compreendidode uma camada não mineralizada de 2 mm de espessura e uma camadamineralizada de 6 mm de espessura.

Etapa V + I; Reticul ação

As estruturas foram hidratadas em 32 ml de água deionizadapor 20 minutos. 18 ml de uma solução de 0,035 M de EDAC e 0,014 M deNHS foram adicionados ao recipiente contendo as estruturas e águadeionizada e as estruturas foram deixadas reticular por 2 horas emtemperatura ambiente sob agitação leve. A solução de EDAC foi removida eas estruturas foram então enxaguadas com solução de tampão de fosfato(PBS) e então deixadas incubar a 37°C por 2 horas em PBS fresco sobagitação branda. Após duas horas em PBS5 as estruturas foram enxaguadasdeixando-as incubar em água deionizada por dois intervalos de 10 minutos a37°C sob agitação branda. As estruturas foram então secadas porcongelamento para remover qualquer água residual por esfriamentocontrolado da temperatura ambiente a -20°C em uma taxa deaproximadamente -2,4°C por minuto, seguido por recozimento a -20°C por 5horas e finalmente por sublimação abaixo de 25 Pa a 37°C por 24 horas,resultando em um estrutura de colágeno/GAG/CaP em camadas reticuladaimperfeitamente 50 mm por 30 mm por 8 mm de tamanho, compreendido deuma camada não mineralizada de 2 mm de espessura e a camada mineralizadade 6 mm de espessura.

As imagens microfotográficas de raio X, imagens demicroscópio de varredura de elétron e mapas de distribuição de elétron dasestruturas de duas camadas resultantes são mostrados nas Figuras 11 a 17.Uma imagem microtomográfíca de raio χ de uma seção cilíndrica de 9,5 mmχ 9,5 mm das estruturas de duas camadas produzidos pelo procedimentodescrito acima é mostrado na Figura 11. A região inferior opaca mostra acamada mineralizada, enquanto a região superior mais translúcida representaa camada desmineralizada. Pode ser visto que ambas as camadas sãograndemente uniformes, tanto em termos de porosidade quanto decomposição. A seção transversal serial mostrada na Figura 12 mostra otamanho de poro médio na camada mineralizada ser de aproximadamente 400mícrons, enquanto que na camada não desmineralizada está na ordem de 700mícrons; os poros tanto na camada mineralizada quanto desmineralizadasapresentam uma morfologia equiangular. A imagem SEM na Figura 13apresenta uma visão de topo da camada não mineralizada, ilustrando quepouca evidência de microporosidade está presente, enquanto as imagens daregião de interface mostrado na Figura 14 demonstram a carência dequaisquer vácuos grandes ou outras descontinuidades que separam ascamadas mineralizadas e não mineralizadas. Na Figura 15 o comportamentode estruturas de duas camadas sob o carregamento compressivo é mostrado.

Na aplicação de carga compressiva, a camada complacente nãodesmineralizada começa a comprimir, resultando em compactação quasecompleta do compartimento cartilaginoso em tensões cartilaginosasinsuficientes para induzir qualquer deformação significante em estruturasmineralizadas. Após a carga ser liberada, a camada de colágeno/GAGdesmineralizado à sua forma original quase instantaneamente (Figura 15d). AFigura 16 ilustra o comportamento mecânico de estruturas de duas camadasno estado hidratado. Uma vez hidratada, a camada colágeno/GAG nãomineralizada pode ser comprimida sob cargas de magnitude baixa (Figura16a-c). De modo diferente no estado seco, o compartimento não mineralizadohidratado não recupera totalmente sua espessura original após a primeiraaplicação de carga compressiva (Figura 16d), mas em vez disso coberturas naseção transversal do compartimento mineralizado. Após a compressão inicial,entretanto, a camada não desmineralizada retorna à sua espessura comprimida(Figura 16d) após cada aplicação subseqüente da carga compressiva. NaFigura 17, a capacidade da camada não desmineralizada de uma estrutura deduas camadas para aderir às paredes de um defeito cirúrgico que abrange ainterface do osso e cartilagem nas juntas articulares é ilustrado por analogia.O deslizamento do vidro na Figura 17 é análogo à parede de um defeitoosteocondral e a capacidade da camada não desmineralizada para aderir a estasuperfície ilustra a capacidade destas estruturas para preencher tais defeitos àsua periferia sem a persistência de fendas entre a camada não desmineralizadada estrutura e a cartilagem articular adjacente.

Exemplo III : Estrutura Mineralizada - Não Mineralizada deTrês Camadas

Estrutura MineralizadaMateriais

Colágeno (para pasta mineralizada) : Colágeno microfibrilarTipo I de tendão bovino, Integra Life Sciences (Plainsboro, NJ, USA)

GAG (para pasta mineralizada) : Condroitin-6-sulfato decartilagem de tubarão, sal de sódio, Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)Fontes de cálcio : (i) Hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA); (ii) Nitrato de cálcio (Ca(NO3)2j4H2O),Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) Fonte de fósforo : Acidoortofosfórico (H3PO4), BDH Laboratory Supplies (Poole, United Kingdom)

Colágeno (para pasta de colágeno-GAG desmineralizado) :Pepsina Tipo I a 85 %, Tipo III a 15 % solubilizada a partir da derme porcina,Japan Meat Packers (Osaka, Japan)

GAG (para pasta não mineralizada) : Condroitin-6-sulfato decartilagem de tubarão, sal de sódio, Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)Diluentes para colágeno desmineralizado e GAG : ácidoacético glacial (CH3COOH), Fischer Scientific (Loughborough, UK)

Agentes de reticulação : ácido nordiidroguariarético (NDGA),Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA);

Diidrogeno fosfato de sódio (NaH2PO4), BDH LaboratoiySupplies (Poole, United Kingdom)

Cloreto de sódio (NaCl), Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO,15 USA)

Etapa O : Preparação de pasta

Preparação de pasta mineralizada

3,8644 g de colágeno foram dispersados em 171,4 ml de0,1383 M de H3PO4 esfriado em um banho de gelo misturando-se por 90minutos em 1.500 rpm, usando-se um homogeneizador equipado com umestator de 19 mm de diâmetro para criar uma dispersão de colágeno altamenteviscosa. Em paralelo, 0,3436 g de condroitin-6-sulfato (GAG) deixadodissolver em 14,3 ml de 0,1383 M de H3PO4 em temperatura ambienteagitando-se periodicamente para dispersar a dissolução de GAG a fim deproduzir uma solução de GAG. Após 90 minutos, os 14,3 ml de solução deGAG foi adicionado à mistura de dispersão de colágeno em uma taxa deaproximadamente 0,5 ml/minutos, sob condições de homogeneização em1.500 rpm e o colágeno altamente viscoso resultante/dispersão de GAGcombinado por um adicional de 90 minutos. Após 90 minutos de mistura,1,804 g Ca(OH)2 e 0,780 g Ca(NO3)24H2O foram adicionados à dispersão decolágeno/GAG altamente viscoso durante 30 minutos em combinaçãoconstante em 1.500 rpm, criando uma pasta de colágeno/GAG/CaP, cujo pHfoi de aproximadamente 4.0. A pasta esfriada foi então desgaseifícada em umfrasco de vácuo durante 25 horas em uma pressão de 25Pa, recombinadousando-se o homogeneizador durante 30 minutos, depois desgaseifícadanovamente por 48 horas.

Preparação de pasta não mineralizada

1,9322 g do colágeno Tipo I/III foram dispersados em 171,4ml de ácido acético 0,05 M esfriado em um banho de gelo misturando-se por90 minutos em 1.500 rpm, usando-se um homogeneizador equipado com umestator de 19 mm de diâmetro a fim de para criar uma dispersão de colágenoaltamente viscosa. Em paralelo, 0,1718 g de condroitin-6-sulfato (GAG) foideixado dissolver em 28,6 ml de ácido acético 0,05 M em temperaturaambiente, agitando-se periodicamente para dispersar a dissolução de GAG afim de produzir uma solução de GAG.

Após 90 minutos, os 14,3 ml de solução de GAG foiadicionado à mistura de dispersão de colágeno em uma taxa deaproximadamente 0,5 ml/minutos, sob condições de homogeneização em1.500 rpm e o colágeno altamente viscoso resultante/dispersão de GAGcombinado por um adicional de 90 minutos.

Etapa I: Fundição

3,5 ml da pasta de colágeno/GAG/CaP mineralizada foramcolocados na porção inferior de um molde de combinação de polissulfona,cuja porção inferior mediu 50 mm de comprimento por 30 mm de largura por3 mm de profundidade. A pasta foi alisada até uma superfície plana usando-seuma lâmina de navalha. Um colar médio, também feito de polissulfona emedindo 50 mm de comprimento por 30 mm de largura por 5 mm deprofundidade, foi ligado à porção inferior do molde contendo a pastamineralizada alisada. 7,5 ml da pasta de colágeno/GAG não mineralizada foicolocada de uma maneira uniformemente distribuída, na parte superior dacamada não mineralizada alisada e dentro do colar médio previamente vazio.

Um colar superior, também feito de polissulfona e medindo 50 mm decomprimento por 30 mm de largura por 3 mm de profundidade, foi ligado àporção média do molde acima da pasta não mineralizada alisada. 3,5 ml dapasta de colágeno/GAG/CaP mineralizada foram colocados, de uma maneirauniformemente distribuída, na parte superior da camada não mineralizadaalisada e dentro do colar superior previamente vazio. Todas as bolhas grandesforam removidas da pasta usando-se um pipetador manual.

Etapa II: Inter-difusão

A pasta de três camadas foi deixada permanecer emtemperatura ambiente e pressão por 20 minutos antes de ser colocada nosecador por congelamento.Etapa III: Esfriamento controlado

O molde e a pasta de três camadas foram colocados em umsecador por congelamento VirTis AdVantage (equipado com prateleiras deaço inoxidável com temperatura controlada) e a temperatura da prateleira dosecador por congelamento mudada de 4°C a -40°C em uma taxa deaproximadamente -2,4°C por minuto.

A temperatura da prateleira do secador por congelamento foimantida a -40°C por 10 horas.

Etapa V : Sublimação

Enquanto ainda em uma temperatura de prateleira de -40°C,um vácuo abaixo de 25 Pa (aproximadamente 200mTorr) foi aplicado àcâmera contendo o molde e a (agora congelada) pasta de três camadas. Atemperatura da câmara foi então elevada a 37°C e a sublimação deixadacontinuar por 36 horas. O vácuo foi então removido e a temperatura retornouà temperatura ambiente, deixando uma estrutura de três camadas de 50 mmpor 30 mm por 11 mm de tamanho, compreendida de uma camada média nãomineralizada de 5 mm de espessura, circundada por duas camadasmineralisadas de 3 mm de espessura.

Etapa VI: Reticulação

A estrutura de três camadas foi hidratada em 0,1 M deNaH2PO4 e 0,15 M de NaCl em salmoura tamponada por fosfato (PBS; pH7,0) por 30 minutos. NDGA foi colocado em suspensão em IN NaOH eadicionado ao PBS para a produção de uma solução de 3 mg / ml de soluçãode NGDA em PBS; as estruturas foram então hidratadas nesta solução sobagitação por 24 horas. A estrutura de três camadas foi removida das soluçõesde NGDA-PBS e enxaguadas com água deionizada. As estruturas foram entãosecadas por congelamento para remover qualquer água residual poresfriamento controlado da temperatura ambiente a -20°C em uma taxa deaproximadamente 2,4°C por minuto, seguido por recozimento a -20°C por 5horas e finalmente sublimação abaixo de 25 Pa a 37°C for 24 horas,resultando em uma estrutura reticulada seca. Um tratamento subseqüente foientão realizado em uma concentração de 0,1 mg/ml de NDGA. As estruturasforam então lavadas em etanol a 70 % por 6 horas e subseqüentemente lavadopor 24 horas em PBS em temperatura ambiente. As estruturas foram entãosecadas por congelamento por um segundo período para remover qualquerágua residual por esfriamento controlado da temperatura ambiente a -20°C emuma taxa de aproximadamente 2,4°C por minuto, seguido por recozimento a -20°C por 5 horas e finalmente sublimação abaixo de 25 Pa a 37°C por 24horas.

Os parâmetros nas tabelas abaixo são aplicáveis singularmenteou em combinação com qualquer aspecto da presente invenção a não ser queestabelecido de outra maneira.

Tabela 1 : Parâmetros Preferidos para Fundição

<table>table see original document page 43</column></row><table>Tabela 3 : Parâmetros Preferidos para Esfriamento Controlado

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Referências

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A presente invenção encontra aplicação em várias áreas e osseguintes são fornecidos por meio de exemplo.

Produto de Reparo da Cartilagem Articular : Estrutura de duascamadas

As estruturas de duas camadas mantêm o potencial deintensificar a eficácia de procedimentos cirúrgicos de primeira linhaexistentes que recrutam células tronco derivadas da medula ao local de danoarticular-cartilagem. Liberado como, por exemplo, um bloco seco de 2 cm χ 2cm χ 1 cm de material seco esterilizado por gama embalado à vácuo que temsemelhança com estiroespuma, destas estruturas pode ser cortado usando-seum bisturi ou outras ferramentas, são facilmente inseridos no defeito usando-se pressão do dedo ou instrumento de agulha e ligando-se diretamente ao localsem suturas ou cola.

Produto de Reparo de Local Doador de Ligamento Patelar:

Estruturas de Três Camadas

As estrutura de três camadas mantêm o potencial deintensificar a regeneração nos locais doadores de ligamento patelar (tendão dapatela) durante a reconstrução do ligamento cruciforme anterior (ACL),reduzindo a dor no joelho frontal e reduzindo o risco de ruptura do ligamentopatelar e fratura patelar.

Produto de Reparo Tendão: Estruturas de duas camadas

A estrutura de duas camadas com componentes nãomineralizados estendidos mantêm o potencial para melhorar a eficácia doreparo de tensão durante os procedimentos de punho rotador e indicar asaplicações de tendão pequeno para que nenhuma solução eficaz exista.

A presente invenção ainda foi estudada na base de testesanimais grandes e um sumário é apresentado abaixo.

Teste 1: Modelo de Defeito Osseo Bovino

A presente invenção permite a produção de estruturas deregeneração de tecido em camadas cuja estrutura e composição imitam ossode um lado, tecido não mineralizado (por exemplo, cartilagem, ligamento,tendão) do outro lado e uma interface macia estável entre estes. A presenteinvenção, além disso, oferece a capacidade de alterar sistematicamente acomposição química da fase mineral do compartimento ósseo de taisimplantes.

Animal: Ovelha Texcel Continental esqueltalmente madura(fêmea).

Defeito: defeito ósseo canceloso profundo de 9 mm dediâmetro por 9 mm de profundidade no implante de côndilo femoral lateral.

Período de implante: 6 semanas.

Grupos experimentais: Seis implantes de cada grupoexperimental implantados contralateralmente com o mesmo tipo de implanteem cada lado do mesmo animal.

Grupos de Controle:

Controle positivo: quatro locais foram enchidos comautoenxerto canceloso coletado da tuberosidade tibial.

Controle negativo: quatro locais foram enchidos comimplantes de controle que compreende implantes que não contém nenhumafase mineral em todos (isto é, contendo os constituintes orgânicos do ladoósseo de Condromimético apenas).

Objetivo do estudo: identificar diferenças no desempenho dequatro grupos de implantes experimentais diferenciados pela composiçãoquímica e identificar os mais desejável destes como a composição final para ocompartimento ósseo de Condromimético.

Descobertas significantes: nenhum dos três gruposexperimentais iniciaram respostas imunes adversas de qualquer tipo; todos ostrês grupos experimentais mais o grupo de controle negativo não mineralizadosuportaram o encravamento ósseo por intermédio de um mecanismo desubstituição direto mediado por célula; nenhuma diferença estatisticamentesignificante entre estes três grupos de implante foram observados e aformação óssea observada em todos os três grupos experimentais foi mais altado que aquela no grupo de controle negativo a um nível estatisticamentesignificante.

Implicações para o projeto do implante: o mecanismo desubstituição direta implicado neste estudo sugere que o mecanismo deformação óssea mais intimamente assemelha-se à formação óssea padronizadaque ocorre na placa de desenvolvimento em animais fetais e neonatais(incluindo seres humanos) do que o mecanismo de aposição típico observadoem substitutos do enxerto ósseo tradicional. A presença deste mecanismo desubstituição no controle não mineralizado sugere que este seja o constituinteorgânico dos implantes que comunicam esta característica.

O tamanho de poro para os implantes deve ser alterado paralevar em conta este mecanismo de substituição reduzindo-se o tamanho deporo médio do compartimento ósseo dos implantes.

A falta de diferenças estatisticamente significantes nocomportamento de formação óssea dos três grupos experimentais sugere queos parâmetros de processamento podem ser usados para identificar acomposição mineral mais apropriada dos implantes.

Teste 2: Modelo de Defeito Osteocôndrico Caprino

O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho docondromimético como um meio de melhorar os resultados de uma técnica deestímulo da medula (perfuração subcôndrica).

Animal: cabras Spanish esqueletalmente maduras (fêmeas).

Defeitos: defeitos subcondrais com 4 mm de diâmetro por 6mm de profundidade (1 no sulco troclear; 1 no côndilo lateral).

Período de implante: 16 semanas.

Grupos experimentais: seis implantes do protótipo de trabalhocondromimético.

Grupo de controle: Seis defeitos de perfuração subcondrialtradicional (isto é, não contendo implantes).

Objetivo do estudo: avaliar o desempenho Condromiméticocomo um auxílio ao estímulo da medula.

Descobertas: O auxílio dos cirurgiões com relação àscaracterísticas de manuseio do Condromimético foi, sem exceção,completamente positivo.

Anexo 1

Texto do relatório descritivo do PCT/GB04/004550,depositado em 28 de outubro de 2004.

A presente invenção diz respeito ao campo de osso sintético,materiais dentais e estruturas de regeneração para aplicações biomédicas e,em particular, um osso sintético, materiais dentais e estruturas de regeneraçãoe seus precursores que compreendem colágeno, um material de fosfato decálcio e um ou mais glicosaminoglicanos.

O osso natural é um biocompósito de of colágeno, fasesorgânicas não colagenosas que incluem glicosaminoglicanos e fosfato decálcio. Sua estrutura herárquica complexa leva a propriedades mecânicasexcepcionais que inclui dureza, força e resistência à fratura altas, que, por suavez, permite aos ossos suportar as tensões fisiológicas às quais estes sãosubmetidos em uma base diária. O desafio enfrentado pelos pesquisadores nocampo é fabricar um material sintético que tenha uma composição e estruturaque permitirá ao osso natural desenvolver-se em e em torno do materialsintético no corpo humano ou animal.

Foi observado que o osso ligar-se-á aos fosfatos de cálcio nocorpo humano (uma propriedade referida como bioatividade) através de umacamada de apatita semelhante ao osso formada no ambiente corporal. Ocolágeno e os copolímeros que compreendem colágeno e outros bioorgânicos,tais como glicosaminoglicanos por outro lado, são conhecidos, por seremsubstratos ótimos para a ligação e proliferação de numerosos tipos de células,incluindo aqueles responsáveis pela produção e manutenção do osso no corpohumano.

A hidroxiapatita é o fosfato de cálcio mais comumente usadocomo constituinte no materiais ósseos substitutos. Este é, entretanto, ummaterial relativamente insolúvel quando comparado com outras formas demateriais de fosfato de cálcio, tais como brushita, trifosfato de cálcio eoctafosfato de cálcio. A solubilidade relativamente baixa de apatita pode seruma desvantagem quando se produz um biomaterial assim como a taxa deressorção do material no corpo é particularmente lenta.

Os fosfatos de cálcio tais como hidroxiapatita são materiaismecanicamente duros. Entretanto, estes são relativamente frágeis quandocomparados como o osso natural. O colágeno é um material mecanicamenteflexível, mas tem dureza relativamente baixa quando comparado com o ossonatural. Os materiais que compreendem copolímeros de colágeno eglicosaminoglicanos são ambos mais flexíveis e mais duros do que o colágenosozinho, mas terão, relativamente dureza baixa quando comparado com o ossonatural.

Tentativas prévias na técnica de produzir um material sintéticosubstituto do osso sintético tendo flexibilidade mecânica melhorada sobre ahidroxiapatita e dureza melhorada sobre o colágeno e copolímeros decolágeno e glicosaminoglicanos incluem a combinação do colágeno e daapatita pela mistura mecânica. Um tal método mecânico é descrito no EP-A-0164 484.

Desenvolvimento posteriores na tecnologia incluem aprodução de um material de substituição óssea que compreendehidroxiapatita, colágeno e condroitin-4-sulfato pela mistura mecânica destescomponentes. Isto está descrito no EP-A-0214070. Este documento aindadescreve a reticulação desidromimética do condroitin-4-sulfato ao colágeno.

Os materiais que compreendem apatita, colágeno e condroitin-4-sulfato foramobservados ter boa biocompatibilidade. A mistura mecânica da apatita com ocolágeno e opcionalmente condroitin-4-sulfato, essencialmente formapartículas revestidas por colágeno / condroitin-4-sulfato de apatita. Foiobservado que um tal material, embora biocompatível, produza diminuiçãolimitada do osso natural quando no corpo humano ou animal e nenhumaremodelagem da fase de fosfato de cálcio do material sintético.

A presente invenção procura tratar pelo menos alguns dosproblemas associados com a técnica anterior.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece umprocesso para a produção de um material de compósito que compreendecolágeno, brushita e um ou mais glicosaminoglicanos, o dito processocompreendendo as etapas de fornecer uma solução ácida aquosa quecompreende colágeno, uma fonte de cálcio e uma fonte de fósforo e um oumais glicosaminoglicanos e precipitação do colágeno, da brushita e os um oumais glicosaminoglicanos juntos a partir da solução aquosa para formar umco-precipitado triplo.

O termo co-precipitado triplo abrange a precipitação dos trêscompostos quando os compostos foram precipitados substancialmente aomesmo tempo a partir da mesma solução/dispersão. Este deve ser distinguidode um material formado a partir da mistura mecânica dos componentes,particularmente quando estes componentes foram precipitados de maneiraseparada, por exemplo, em soluções diferentes. A microestrutura de um co-precipitado é substancialmente diferente de um material formado a partir damistura mecânica destes componentes.

No primeiro aspecto, a solução preferivelmente tem um pH de2,5 a 6,5, mais preferivelmente de 2,5 a 5,5. Mais preferivelmente, a soluçãotem um pH de 3,0 a 4,5. Ainda mais preferivelmente, a solução tem um pH de3,8 a 4,2. Mais preferivelmente, a solução tem um pH em torno de 4.

A fonte de cálcio é preferivelmente selecionada a partir de umou mais de nitrato de cálcio, acetato de cálcio, cloreto de cálcio, carbonato decálcio, alcóxido de cálcio, hidróxido de cálcio, silicato de cálcio, sulfato decálcio, gliconato de cálcio e o sal de cálcio de heparina. Um sal de cálcio deheparina derivado da mucosa intestinal porcina. Os sais de cálcio adequadosestão comercialmente disponíveis da Sigma-Aldrich Inc.

A fonte de fósforo é preferivelmente selecionada a partir deum ou mais de fosfato de amônio-diidrogênio, fosfato de diamôniohidrogênio, ácido fosfórico, ortofosfato de dissódio hidrogênio 2-hidratado(Na2HPO4JH2O, algumas vezes denominado sal GPR de Sorensen) e fosfatode trimetila, sais de metal alcalino (por exemplo, Na ou K) de fosfato, saisalcalinos terrosos (por exemplo, Mg ou Ca) de fosfato.

Os glicosaminoglicanos são uma família de macromoléculascontendo polissacarídeos não ramificados longos contendo uma unidade dedissacarídeo de repetição. Preferivelmente, os um ou maisglicosaminoglicanos são selecionados de sulfato de condroitina, sulfato dedermatina, heparina, sulfato de heparina, sulfato de queratina e ácidohialurônico. O sulfato de condroitina pode ser condroitin-4-sulfato oucondroitin-6-sulfato, ambos os quais estão disponíveis da Sigma-Aldrich Inc.

O condroitin-6-sulfato pode ser derivado de cartilagem de tubarão. O Acidohialurônico pode ser derivado de cordão umbilical humano.

A Heparina pode ser derivada de mucosa intestinal porcina.

Preferivelmente, na precipitação do co-precipitado triplo, asolução tem uma temperatura de 4,0 a 50°C. Mais preferivelmente, a soluçãotem uma temperatura de 15 a 40°C. A solução pode estar na temperaturaambiente, que é de 20 a 30°C, com uma temperatura de 20 a 27°C sendopreferida. Mais preferivelmente, a temperatura está em torno de 25°C.

A concentração de íons de cálcio na solução aquosa étipicamente de 0,00025 a 1 moldm° e prefenvelmente de 0,001 a 1 moldm" .Quando o processo inclui as outras etapas adicionais de filtração e/ousecagem em baixa temperatura, a concentração de íons de cálcio na soluçãoaquosa é mais prefenvelmente de 0,05 a 0,5 moldm" (por exemplo de 0,08 a0,25 moldm") e mais prefenvelmente de 0,1 a 0.5 moldm" . Quando oprocesso inclui as outras etapas adicionais de secagem por congelamento eopcionalmente moldagem por injeção, a concentração na solução aquosa émais preferivelmente de 0,01 a 0,3 moldm" e mais prefenvelmente de 0,05 a0,18 moldm"3.

Preferivelmente, a solução compreende íons de fosfato e aconcentração de íons de fosfato na solução é de tipicamente 0,00025 a 1moldm"3 e preferivelmente de 0,001 a 1 M. Quando o processo inclui asoutras etapas adicionais de filtração e/ou secagem em baixa temperatura, aconcentração de íons de fosfato na solução é mais preferivelmente 0,05 a 0,5moldm"3, ainda mais preferivelmente 0,1 a 0,5 M, por exemplo 0,1 a 0,35moldm"3. Quando o processo inclui as outras etapas adicionais de secagem porcongelamento e opcionalmente, moldagem por injeção, a concentração deíons de fosfato na solução é mais preferivelmente de 0,01 a 0,3 moldm" ,ainda mais preferivelmente 0,05 a 0,18 M.

Preferivelmente, a razão de colágeno para a quantidade totalde um ou mais glicosaminoglicanos na solução antes da precipitação é de 8:1a 30:1 em peso. Mais preferivelmente, a razão de colágeno para a quantidadetotal de um ou mais glicosaminoglicanos é de 10:1 a 12:1 e maispreferivelmente, a razão é de 11:1 a 23:2.

Preferivelmente, a razão de colágeno para brushita no co-precipitado triplo é de 10:1 a 1:100 em peso, mais preferivelmente de 5:1 a1:20, ainda mais preferivelmente de 3:2 a 1:10, mais preferivelmente de 3:2 a1:4.

A concentração de colágeno na solução antes da precipitaçãoé, tipicamente de 1 a 20 g/litro, mais preferivelmente de 1 a 10 g/litro, quandoo processo inclui as etapas de fíltração e/ou secagem em temperatura baixa, aconcentração de colágeno na solução é mais preferivelmente de 1 a 10 g/litro,ainda mais preferivelmente de 1,5 a 2,5 g/litro e mais preferivelmente 1,5 a2,0 g/litro, quando o processo incluía secagem por congelamento eopcionalmente a moldagem por injeção, a concentração de colágeno nasolução antes da precipitação é de 5 a 20 g/litro, mais preferivelmente de 5 a12 g/litro e mais preferivelmente de 9 a 10,5 g/litro.

A concentração total dos um ou mais glicosaminoglicanos nasolução antes da precipitação é de, tipicamente 0,01 a 1,5 g/litro, maispreferivelmente de 0,01 a 1 g/litro. Quando o processo inclui as outras etapasadicionais de fíltração e/ou secagem em temperatura baixa, a concentraçãototal dos um ou mais glicosaminoglicanos na solução é mais preferivelmentede 0,03 a 1,25 g/litro, ainda mais preferivelmente de 0,125 a 0,25 g/litro emais preferivelmente de 0,13 a 0,182 g/litro, quando o processo inclui asoutras etapas adicionais de secagem por congelamento e opcionalmentemoldagem por injeção, a concentração total dos um ou maisglicosaminoglicanos na solução é mais preferivelmente de 0,15 a 1,5 g/litro,ainda mais preferivelmente de 0,41 a 1,2 g/litro e mais preferivelmente de0,78 a 0,96 g/litro.

Preferivelmente a solução compreende íons de cálcio e umarazão de colágeno para os íons de cálcio é de tipicamente de 1:40 a 500:1 empeso. Quando o processo inclui as outras etapas adicionais de fíltração e/ousecagem em temperatura baixa, a razão de colágeno para os íons de cálcio émais preferivelmente de 1:40 a 250:1, ainda mais preferivelmente 1:13 a 5:4 emais preferivelmente 1:13 a 1:2. Quando o processo inclui as outras etapasadicionais de secagem por congelamento e opcionalmente moldagem porinjeção, a razão de colágeno para os íons de cálcio é mais preferivelmente de1:8 a 500:1, ainda mais preferivelmente 5:12 to 30:1 e mais preferivelmente5:5 a 5:1.

A precipitação pode ser realizada combinando-se o colágeno, afonte de cálcio, a fonte de fósforo e um ou mais glicosaminoglicanos em umasolução ácida aquosa e deixando a solução repousar até a precipitação ocorrer,agitação da solução, titulação usando-se titulantes básicos como amônio,adição de um agente de nucleação, tal como brushita pré-fabricada, variaçãoda taxa de adição da fonte de cálcio e qualquer combinação destas técnicas.

Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece umprocesso para a produção de um biomaterial composto que compreendecolágeno, octafosfato de cálcio e um ou mais glicosaminoglicanos, o ditoprocesso que compreende as etapas de fornecer um material de compósito quecompreende colágeno, brushita e um ou mais glicosaminoglicanos e pelomenos algum de brushita no material de compósito para o octafosfato decálcio por hidrolisação.

O termo biomaterial abrange um material que é biocompatívelcom o corpo humano ou animal.

No segundo aspecto, o material de compósito preferivelmentecompreende ou consiste essencialmente de um co-precipitado triplo quecompreende colágeno, brushita e um ou mais glicosaminoglicanos. O co-precipitado triplo pode ser formado por um processo como descrito neste comrelação ao primeiro aspecto da presente invenção.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação (hidrólise) de brushitapara octafosfato de cálcio compreende contatar o co-precipitado triplo comuma solução aquosa, a dita solução aquosa estando em ou acima do pH m queo octafosfato de cálcio torna-se mais termodinamicamente estável do que abrushita. Preferivelmente, esta solução aquosa tem um pH de 6 a 8. Maispreferivelmente, esta solução aquosa tem um pH de 6,3 a 7. Maispreferivelmente, esta solução aquosa tem pH de cerca de 6,65. A soluçãoaquosa pode compreender, por exemplo, água deionizada cujo pH écontrolado por um titulante, uma solução de tampão, uma solução saturadacom respeito a um outro composto contendo cálcio e/ou composto contendofósforo. Uma solução aquosa preferida compreende ácido acético titulado aopH desejado usando-se amônia.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação da brushita paraoctafosfato de cálcio é realizada em uma temperatura de 20 a 50°C, maispreferivelmente de 30 a 40°C, ainda mais preferivelmente de 36 a 38°C, maispreferivelmente em torno de 37°C.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação de brushita paraoctafosfato de cálcio é realizada por um período de 12 a 144 horas, maispreferivelmente de 18 a 72 horas, mais preferivelmente de 24 a 48 horas.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece umprocesso para a produção de um biomaterial composto que compreendecolágeno, apatita e um ou mais glicosaminoglicanos, os ditos processo quecompreendem as etapas de fornecer um material de compósito quecompreende colágeno, brushita e um ou mais glicosaminoglicanos e pelomenos algum de brushita no material de compósito para apatita porhidrolisação.

A apatita é uma classe de minerais que compreende cálcio efosfato e tem a fórmula geral: Ca5(PO4)3(X), em que X pode ser um íon que étipicamente OH", F" e Cl", bem como outros íons conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. A apatita também inclui apatitas substituídas tais comoapatitas substituídas por silicona. A apatita inclui hidroxiapatita, que é umexemplo específico de apatita. A hidroxiapatita também pode ser substituídapor silício.

No terceiro aspecto, o material de compósito preferivelmentecompreende ou consiste essencialmente de um co-precipitado triplo quecompreende colágeno, brushita e um ou mais glicosaminoglicanos. O co-precipitado triplo pode ser formado de acordo com o processo como descritoneste com relação ao primeiro aspecto da presente invenção.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação (hidrólise) de brushitapara apatita compreende contatar o co-precipitado triplo com uma soluçãoaquosa, a dita solução aquosa estando em ou acima do pH em que a apatitatorna-se termodinamicamente mais estável do que a brushita. Preferivelmente,para a conversão de brushita para apatita, a solução aquosa tem um pH de6,65 a 9, mais preferivelmente de 7 a 8,5, ainda mais preferivelmente de 7,2 a8,5. A solução aquosa pode compreender, por exemplo, água deionizada cujopH é controlado com um titulante, uma solução de tampão, uma soluçãosaturada com respeito a um outro composto contendo cálcio e/ou compostocontendo fósforo.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação de brushita paraapatita é realizada em uma temperatura de 20 a 50°C, mais preferivelmente de30 a 40°C, ainda mais preferivelmente de 36 a 38°C, mais preferivelmente emtorno de 37°C.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação de brushita paraapatita é realizada por um período de 12 a 288 horas, mais preferivelmente de18 a 72 horas, mais preferivelmente de 24 a 48 horas.

Os métodos para aumentar a taxa de conversão de brushitapara octafosfato de cálcio e/ou apatita inclui (i) aumentar a temperatura, (ii) aconcentração de brushita na solução e/ou (iii) a velocidade de agitação.

Pode ser desejável produzir um biomaterial de acordo com apresente invenção que compreende tanto apatita quanto octafosfato de cálcio.

Os processos do segundo e terceiro aspectos da presente invenção podem sercombinados para a produção de um material que compreende ambosoctafosfato de cálcio e apatita. A brushita no co-precipitado triplo pode serprimeiro convertida a octafosfato de cálcio e então o octafosfato de cálciopode ser parcialmente convertido a apatita. Total ou quase total (isto é, pelomenos 98 %), a conversão de brushita ou octafosfato de cálcio a apatita ocorretipicamente por hidrolisação em um pH de 8,0 ou mais por um período decerca de 12 horas. A conversão parcial da brushita e/ou apatita no material,portanto, pode ser realizada por hidrolisação por um período de menos do que12 horas.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação de octafosfato decálcio para apatita é realizada em um pH de 6,65 a 10, mais preferivelmentede 7,2 a 10, ainda mais preferivelmente de 8 a 9.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação de octafosfato decálcio para apatita é realizada em uma temperatura de 20 a 50°C, maispreferivelmente de 30 a 40°C, ainda mais preferivelmente de 36 a 38°C, maispreferivelmente em torno de 37°C.

Preferivelmente, a etapa de hidrolisação de octafosfato decálcio a apatita é realizada por um período de 2 a 144 horas, maispreferivelmente de 12 a 96 horas, mais preferivelmente de 24 a 72 horas.

No segundo e terceiro aspectos da presente invenção, aconversão de brushita para octafosfato de cálcio e/ou apatita é preferivelmenteconduzida em uma temperatura de 30 a 40 graus Celsius. Maispreferivelmente, a conversão é conduzida em uma temperatura de 36 a 38graus Celsius. Mais preferivelmente, a conversão é conduzida em umatemperatura de cerca de 37 graus Celsius.

Preferivelmente, os processos da presente invenção aindacompreendem a etapa de reticulação dos um ou mais glicosaminoglicanos e ocolágeno no co-precipitado triplo. Por co-precipitado triplo este inclui o co-precipitado triplo que compreende colágeno, brushita e um ou maisglicosaminoglicanos e derivados do co-precipitado. Os derivados incluem oco-precipitado em que pelo menos algumas das brushitas foram convertidas aoctafosfato de cálcio e/ou apatita e o co-precipitado foi formado ou moldadoou submetido a qualquer outro processamento químico ou mecânico. Areticulação pode ser atingida usando-se qualquer uma das técnicasconvencionais.

Preferivelmente5 pelo menos algum de brushita é convertido aoctafosfato de cálcio e/ou apatita, o glicosaminoglicano e o colágeno sãoreticulados antes da conversão da brushita para octafosfato de cálcio e/ouapatita. Esta reticulação pode ser realizada submetendo-se o co-precipitadotriplo a um ou miais de uma radiação gama, radiação ultravioleta, umtratamento desidrotérmico, glicação não enzimática com uma açúcar simples,tal como glicose, manose, ribose e sacarose, que contata o co-precipitadotriplo com um ou mais de glutaraldeído, etil dimetilaminopropil carbodiimidae/ou ácido nordiidroguariarético ou qualquer combinação destes métodos.

Estes métodos são convencionais na técnica.

Preferivelmente, se pelo menos alguns de brushita foremconvertidos a octafosfato de cálcio e/ou apatita, o glicosaminoglicano ecolágeno são reticulados subseqüentes à conversão da brushita a octafosfatode cálcio e/ou apatita. A reticulação subseqüente à conversão da brushita paraapatita/octafosfato de cálcio pode ser realizada por um ou mais dos métodosmencionados acima ou um tratamento desidrotérmico ou qualquercombinação destes. Um tratamento desidrotérmico inclui submeter umsubstrato a um atmosfera de pressão baixa em uma temperatura elevada. Atemperatura no tratamento desidrotérmico pode ser de 95°C a 135°C. Atemperatura pode, preferivelmente, ser de IOO0C a IlO0C e maispreferivelmente de 105°C a IlO0C, se a finalização do tratamentodesidrotérmico for desejado em tipicamente 18 a 36 horas. A temperaturapode ser, preferivelmente de 120°C a 135°C e mais preferivelmente de 125°Ca 135°C, se a finalização do tratamento desidrotérmico for desejado emtipicamente de 4 a 8 horas.

Preferivelmente, o colágeno e o glicosaminoglicano sãoreticulados tanto antes quanto subseqüente à da brushita ao octafosfato decálcio e/ou apatita.Os processos presente invenção podem compreender a etapade formar o biomaterial compósito em uma estrutura adequada para o usocomo um substituto ósseo ou dental. Uma tal etapa pode ocorrer após aformação do co-precipitado triplo, mas antes de qualquer conversão dabrushita ou reticulação do colágeno e glicosaminoglicano que possa ocorrer.

Alternativamente, a etapa de formar o biomaterial pode ocorrersubseqüente à conversão da brushita para apatita e/ou octafosfato de cálcio oureticulação do colágeno e o glicosaminoglicano.

Preferivelmente, o material de compósito é formado usando-seuma técnica selecionada de (i) filtração e/ou secagem em temperatura baixa,(ii) secagem por congelamento, (iii) moldagem por injeção e (iv) compressãoa frio. Filtração e/ou secagem em baixa temperatura, em que a temperatura éde 15°C a 40°C, mais preferivelmente de 35°C a 40°C, tipicamente resulta emuma forma granular densa de material. A secagem por congelamentotipicamente resulta em uma forma porosa aberta. A moldagem por injeçãoresulta em uma ampla variedade de formas/morfologias de um materialdependendo da forma da matriz usada. A compressão a frio tipicamenteresulta em uma forma de grânulo denso.

A presente invenção ainda fornece um material precursoradequado para a transformação em um biomaterial sintético, o dito materialprecursor que compreende um material de compósito que compreendecolágeno, brushita e um ou mais glicosaminoglicanos. Preferivelmente, omaterial de compósito compreende ou consiste essencialmente de um co-precipitado triplo que compreende colágeno, brushita e um ou maisglicosaminoglicanos. O co-precipitado triplo pode ser produzido de acordocom o processo do primeiro aspecto da presente invenção.

A presente invenção também fornece um biomaterialcompósito que compreende colágeno, brushita e um ou maisglicosaminoglicanos, cujo biomaterial é obtenível por um processo de acordocom a presente invenção como descrito neste.

A presente invenção também fornece um biomaterialcomposto que compreende colágeno, octafosfato de cálcio e um ou maisglicosaminoglicanos, cujo biomaterial é obtenível por um processo de acordocom o segundo aspecto da presente invenção.

A presente invenção também fornece um biomaterialcompósito que compreende colágeno, apatita e um ou maisglicosaminoglicanos, cujo biomaterial é obtenível por um processo de acordocom o terceiro aspecto da presente invenção.

A presente invenção também fornece um biomaterialcomposto que compreende um co-precipitado triplo de colágeno,glicosaminoglicano e brushita.

A presente invenção também fornece um biomaterial quecompreende partículas de um ou mais materiais de fosfatos de cálcio,colágeno e um ou mais glicosaminoglicanos, em que o dito colágeno e o ditoum ou mais glicosaminoglicanos são reticulados e formam uma matriz, asditas partículas de material de fosfato de cálcio são dispersados na dita matrize o dito material de fosfato de cálcio é selecionado a partir de um ou mais debrushita, octafosfato de cálcio e/ou apatita.

O seguinte relatório descritivo diz respeito a todos os aspectosdo biomaterial compósito de acordo com a presente invenção a não ser queestabelecido de outra maneira.

O colágeno e o um ou mais glicosaminoglicanos forampreferivelmente reticulados.

O colágeno está preferivelmente presente no material em umaquantidade de 5 a 90 (seco) % em peso, mais preferivelmente de 15 a 60(seco) % em peso, mais preferivelmente de 20 a 40 (seco) % em peso.

Preferivelmente, os um ou mais glicosaminoglicanos estãopresentes no material em uma quantidade de 0,01 a 12 (seco) % em peso,mais preferivelmente de 1 a 5,5 (seco) % em peso mais preferivelmente de 1,8a 2,3 (seco) % em peso.

Preferivelmente, se o material compreender brushita, a razãode colágeno para brushita é de 10:1 a 1:100 em peso (seco), maispreferivelmente 5:1 a 1:20 em peso (seco), mais preferivelmente 3:2 a 1:10em peso (seco), por exemplo 3:2 a 1:4 em peso (seco).

Preferivelmente se o material compreender octafosfato decálcio, a razão de colágeno a octafosfato de cálcio é 10:1 a 1:100 em peso(seco), mais preferivelmente 5:1 a 1:20 em peso (seco), mais preferivelmente3:2 a 1:10 em peso (seco).

Preferivelmente, a razão de colágeno para a quantidade totalde um ou mais glicosaminoglicanos é de 8:1 a 30:1 em peso (seco), maispreferivelmente de 10:1 a 30:1 em peso (seco), ainda mais preferivelmente10:1 a 12:1 em peso (seco) e mais preferivelmente 11:1 a 23:2 em peso(seco).

O biomaterial compósito de acordo com a presente invençãopode ser usado como um material ósseo ou dental substituto.

A presente invenção também fornece um material ósseosintético, implante ósseo, enxerto ósseo, substituto ósseo, estrutura óssea,enchedor, revestimento ou cemento que compreende um biomaterialcomposto da presente invenção. O termo revestimento inclui qualquerrevestimento que compreende o biomaterial ou precursor da presenteinvenção. O revestimento pode ser aplicado às superfícies externas ouinternas de membros protéticos, ossos ou qualquer substrato pretendido para ouso no corpo humano ou animal, que inclui materiais particulados. Acomposição da presente invenção pode ser usado tanto para o reparo in vivo eex vivo reparo tanto de material biológico mineralizado, que inclui, mas nãolimitando-se ao osso quanto materiais dentais. Os biomateriais da presenteinvenção podem ser usados no desenvolvimento de aloenxertos eautoenxertos.

O biomaterial de acordo com a presente invenção quecompreende octafosfato de cálcio pode ser livre ou essencialmente livre dequalquer fase precursora de brushita. Este biomaterial pode compreendermenos do que 2 % em peso de brushita em uma quantidade total de materiaisde fosfato de cálcio no biomaterial.

O material de fosfato de cálcio pode compreender ou consistiressencialmente de octafosfato de cálcio ou apatita de fase pura.

Por fase pura, é entendido, preferivelmente que contém pelomenos 98 %, mais preferivelmente pelo menos 99 % e mais preferivelmente,pelo menos 99,5 % da fase desejada (como medido por difração de raio x).

Alternativamente, o biomaterial pode compreender uma mistura deoctafosfato de cálcio e apatita, dependendo das propriedades desejadas dobiomaterial.

O material da presente invenção que compreende brushitapodem ser usados como uma material precursor para a fabricação de umbiomaterial ou pode ser adequado por si só para o uso como um biomaterial.

Os processos de acordo com a presente invenção podem serrealizados seguindo o método seqüencial, que podem ser aplicados inteiros ouem partes, para a produção de biocompósitos de colágeno, um ou maisglicosaminoglicano e um ou mais constituintes de fosfato de cálcio. Oseguinte relatório descritivo é fornecido por meio de exemplo e é aplicável aqualquer aspecto dos processos de acordo com a presente invenção.

I: Co-precipitação Tripla de Colágeno, GAG e da Brushita deFosfato de Cálcio em pH Acido

Esta etapa é realizada para iniciar a formação simultânea, porintermédio da precipitação da solução, dos três (ou mais) constituintes doscompósitos e um controle da razão das três (ou mais) fases respectivas.Controle das propriedades de composição do compósito (e em particular arazão colágeno:GAG:CaP) pode ser atingida pela variação de um ou mais depH, temperatura, tempo de envelhecimento, concentração de íon de cálcio,concentração de íon de fósforo, concentração de colágeno e concentração deGAG. O pH pode ser mantido constante (usando-se, por exemplo, tampões,titulação de pH-stat ou outros métodos) ou ser deixados variar. As fasessecundárias possíveis (contaminantes) incluem outros fosfatos de cálcioácidos (por exemplo, monetita, hidrogeno fosfato de cálcio) e complexos queincluem sub-produtos de titulação e adição de reagente (por exemplo, fosfatode amônio, nitrato de amônio). Aditivos para auxiliar a reticulação (porexemplo, glicose, ribose) ou uma resposta intensificadora in vivo (porexemplo, fatores de crescimento, fatores de transcrição de gene, silício,peptídeos natriuréticos) também podem ser adicionados durante esta etapa.

II: Formação da Configuração em Rede

Esta etapa pode ser realizada para a produção da arquiteturadesejada da forma de compósito final, com ênfase particular do controle daarquiteutura deficiente. Os exemplos de técnicas que incluem a filtração e asecagem em baixa temperatura (resultando em uma forma granular densa),secagem por congelamento (resultando em uma forma porosa aberta),moldagem por injeção (resultando em uma ampla faixa de formas dependendodo tipo de matriz) e compressão a frio (resultando em uma forma de grânulodensa).

III: Reticulação Primária

Esta etapa pode ser realizada para, preferivelmente, garantirque, quando colocados em uma solução de pH elevado, o teor de GAG docompósito não elui rapidamente e, portanto, para intensificar as propriedadesmecânicas e de degradação do compósito. Os exemplos de técnicas incluemas técnicas físicas de baixa temperatura (por exemplo, irradiação de gama,radiação ultravioleta, tratamento desidrotérmico), técnicas químicas (porexemplo, glicação não enzimática com um açúcar simples, glutaraldeído, etildimetilaminopropil carbodiimida, ácido nordiidroguariarético) ου métodos decombinação (por exemplo, glicação não enzimática simultânea e irradiaçãogama).

No evento que a conversão e um a octafosfato de cálcio (isto é,como na etapa IV) é desejável, a reticulação primária é vantajosamenterealizada em uma temperatura abaixo de cerca de 37°C para evitar aconversão da fase de brushita à sua forma desidratada, monetita, que é umfosfato de cálcio que não hidrolisa-se facilmente para octafosfato de cálcio.

IV: Hidrólise

Esta etapa pode ser realizada para hidrolisar parcial outotalmente a fase CaP da brushita (fase com solubilidade alta em pHfisiológico) a octafosfato de cálcio e/ou apatita (fases com solubilidade maisbaixa em pH fisiológico) e para remover substancialmente quaisquer fasescontaminantes solúveis (por exemplo, nitrato de amônio, hidrogeno fosfato decálcio). No caso de hidrólise para OCP, o pH selecionados é vantajosamentemantido constante em torno de 6,65 (usando-se um tampão, pH stat ou outrométodo) e a temperatura em torno de 37°C em torno de 24 a 48 horas. Comofoi o caso na Etapa I, os aditivos para auxiliar na reticulação (por exemplo,glicose, ribose) ou para intensificar uma resposta in vivo (por exemplo, fatoresde crescimento, fatores de transcrição genética, silício, peptídeosnatriuréticos) também podem ser adicionados durante a etapa de hidrólise(Etapa IV).

V: Reticulação Secundária

Esta etapa pode ser realizada para ainda adaptar aspropriedades mecânicas e de degradação do compósito. Qualquer um ou todosos procedimentos de reticulação listado na Etapa III acima podem ser usadospara realizar a reticulação secundária.

Os seguintes Exemplos e as figuras anexas são fornecidas paraainda auxiliar no entendimento da presente invenção. Os exemplos e asfiguras não devem ser considerados limitantes ao escopo da invenção.Qualquer característica descrita nos Exemplos ou Figuras é aplicável aqualquer aspecto da descrição precedente.

Exemplo 1

O Exemplo 1 é um exemplo do método de síntese descritoacima, executado por intermédio da aplicação das etapas I até III apenas. Aco-precipitação tripla é realizada em temperatura ambiente (20 a 25 0C), emum pH em torno de 3,2 (mentido pela titulação com amônia). Neste exemplo,os co-precipitados são secados a 37°C e reticulados por intermédio de umtratamento desidrotérmico. Nem a conversão hidrolítica do CaP nem areticulação secundária realizada neste exemplo.

Materiais

Colágeno: reconstituído, colágeno dérmico porcino extraído dapepsina (atelocolágeno); 85 % Tipo I, 15 % Tipo III; Japan Meat Packers(Osaka, Japan)

GAG: Condroitin-6-suIfato de cartilagem de tubarão; sal desódio; Sigma-AIdrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Fontes de cálcio: (i) Hidróxido de cálcio; Ca(OH)2 Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA), (ii) Nitrato de cálcio; CaN03)2;4H20;Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) Fonte de fósforo: Ácidoortofosfórico; H3PO4; BDH Laboratory Supplies (Poole, United Kingdom)

Titulante: Amônia; NH3; BDH Laboratory Supplies (Poole,United Kingdom)

Procedimento

Etapa I

Solução A:

- Ca(OH)2 é dissolvido em 0,48 M de H3PO4 em umaconcentração de 0,12M em temperatura ambiente e a solução resultantetitulada ao pH = 3,2 usando-se amônia.Suspensão Β:

- Condroitin-6-sulfato é dissolvido em água deionizada emuma concentração de 3,2 g/litro, sob agitação constante, CaN03)2,4H20 eCa(OH)2 é então adicionado à solução de sulfato de condroitina em uma razãomolar de nitrato:hidróxido de 1,5, para produzir uma suspensão com umaconcentração de cálcio total de 2,4 M.

0,144 g de colágeno é adicionado a 20 ml da Solução A ecombinado usando-se um homogeneizador até ser dissolvido. 4 ml deSuspensão B é então adicionado à Solução A sob agitação constante.

- A agitação é continuada por 60 minutos e o pH monitoradopara garantir que este permaneça na faixa 3,15<pH<3,30. A pasta resultante éentão deixada envelhecer por 24 horas em temperatura ambiente.

Etapa II

A pasta é deixada secar a 37°C em ar por 5 dias e o co-precipitado triplo remanescente enxaguado com água deionizada esubseqüentemente secado novamente a 37°C por um adicional de 24 horas.

O padrão de difração em raio χ do co-precipitado triploresultante é mostrado na Figura 1 (radiação Cu-K(alfa)) e uma imagem SEMé mostrada na Figura 2.

Etapa III

Os co-precipitados triplos são reticulados por intermédio dotratamento desidrotérmico (DHT) a 105°C, sob um vácuo de 50 mTorr, por48 horas. Uma imagem TEM do co-precipitado triplo seguindo o DHT émostrada na Figura 3. A Figura 4 mostra o padrão de difração de raio χ do co-precipitado triplo seguindo DHT e indica que a fase de brushita foi convertidaà sua forma desidratada monetita.

Exemplo 2

O Exemplo 2 é um exemplo do método de síntese descritoacima, executado por intermédio da aplicação das etapas I até IV apenas. Aco-precipitação tripla é realizada em temperatura ambiente e um pH de 4,0.Neste exemplo, o controle do pH é realizado pelo controle cuidadoso dasconcentrações de hidróxido de cálcio e nitrato de cálcio - um método quetambém permite o controle da razão de massa de brushita para o colágenomais GAG no co-precipitado triplo. Os co-precipitados triplos resultantes sãoentão congelados a -20°C, colocados sob vácuo e depois aquecidos parainduzir a sublimação da água não ligada (isto é, gelo). A reticulação primáriaé realizada usando-se tratamento com 1-etil 3-(3-dimetil aminopropil)carbodiimida. O co-precipitado triplo seco resultante é então convertido aoctafosfato de cálcio por intermédio da hidrólise em um pH de 6,67 em tornode 37°C. Neste exemplo, a reticulação secundária não é realizada.

Materiais

Tipo I: Ácido solubilizado de tendão bovinoIntegra Life Sciences Plainsboro, NJ, USAGAG: Condroitin-6-sulfato de cartilagem de tubarão; sal desódio; Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Fontes de cálcio: (i) Hidróxido de cálcio; Ca(OH)2 Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) e (ii) Nitrato de cálcio; CaN03)2,4H20;Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) Fonte de fósforo: Ácidoortofosfórico; H3PO4; BDH Laboratory Supplies (Poole, United Kingdom)Titulante: nenhum

Agentes de reticulação: (i) l-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)Carbodiimida (=EDAC); Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) e (ii) N-Hidroxissuccinimida (=NHS.); Sigma-Aldrich. Inc (St. Louis, MO, USA)

Procedimento

Etapa I

- Uma razão de massa alvo de brushita para colágeno maisglicosaminoglicano de 1:1 é selecionada.

- A concentração de colágeno mais GAG em um volume dereação total de 200 ml é ajustado em 21 mg/ml.

- Usando-se um mapa de três dimensões empírico de variaçãode pH (produzido em uma razão de íon reagente [Ca" ] a [P] constante de 1,0)com diferenciação (1) de concentrações iônicas (isto é, [Ca2+] = [H3PO4]) e(ii) razões de nitrato de cálcio:hidróxido de cálcio, um local de pontos sobreos quais o pH permaneceu constante em 4,0 é identificado. Isto é mostrado naFigura 5 (séries de combinações de concentração iônica e razão de nitrato decálcio:hidróxido de cálcio para a manutenção do pH = 4.0).

- Superimpor este local de pontos em uma mapa de rendimentode massa de brushita com eixos idênticos e identificação de sua intersecçãocom o contorno de 21 mg/ml permite o ajuste das concentrações de reagentepara os quais a pasta de co-precipitado triplo contendo uma razão de massa de1:1 de fosfato de cálcio (21 mg/ ml) a colágeno mais GAG (21 mg/ ml) podeser produzido em pH 4,0 ([Ca2+] = [H3PO4] = 0,1383 M; Ca(NO3) . 4H20:Ca(OH)2 = 0,1356). Ver Figura 6: identificação das condições para a sínteseem pH 4,0 de uma pasta de co-precipitado triplo contendo uma razão demassa 1:1 de fosfato de cálcio para colágeno mais GAG.

- 3,8644 g de colágeno é dispersado em 171,4 ml de 0,1383 Mde H3PO4 esfriado em um banho de gelo, combinando-se durante 90 minutosem 1.500 rpm, usando-se um homogeneizador equipado com um estator de 19mm de diâmetro, para criar uma dispersão de colágeno altamente viscosa.

- 0,3436g de condroitin-6-sulfato (GAG) é deixado dissolverem 14,3 ml de 0,1383 M em temperatura ambiente, agitando-seperiodicamente para dispersar a dissolução de GAG, produzindo a solução de GAG.

- Após 90 minutos, os 14,3 ml de solução de GAG sãoadicionados à mistura de dispersão de colágeno em uma taxa deaproximadamente 0,5 ml/minuto, sob condições de homogeneização em 1.500rpm e o colágeno altamente viscoso resultante/dispersão de GAG combinadopor um total de 90 minutos

- Após 90 minutos de mistura, 1,804 g de Ca(OH)2 e 0,780gCa(NO3)2j4H2O são adicionados à dispersão de colágeno/GAG altamenteviscosa durante 30 minutos em combinação constante em 1.500 rpm, criandouma pasta de co-precipitado triplo colágeno/GAG/CaP, tempo após o qual umadicional de 14,3 ml de 0,1383 M de H3PO4 é combinado na pasta.

- O pH da pasta de co-precipitado triplo pasta é deaproximadamente 4,0

- A pasta de co-precipitado triplo é deixado permanecer a 25°Cpor um período de 48 horas.

Etapa II

- A pasta de co-precipitado triplo é colocada em umcongelador a -20°C e deixado solidificar durante a noite.

- A pasta congelada é então removida do congelador, colocadaem um vácuo de aproximadamente 80 mTorr e a temperatura deixada atingir atemperatura ambiente, desta maneira induzindo à sublimação do gelo a partirda pasta, que é deixada proceder durante 48 horas.

- O padrão de difração de raio χ do co-precipitado triplo decolágeno/GAG/brushita seguindo a remoção da água não ligada (radiação Cu-K (alfa)) é mostrado na Figura 7 e uma imagem SEM da superfície de um co-precipitado é mostrada na Figura 8 (imagens secundárias (SE) e de elétronreto-dispersadas (BSE) da superfície do co-precipitado triplo com CaP:colágeno + GAG =1:1).

Etapa III

- Após a remoção completa da água não ligada, 1,25 g do co-precipitado triplo seco resultante é hidratado em 40 ml de água deionizada por20 minutos.

- 20 ml de uma solução de 0,035M EDAC e 0,014M NHS sãoadicionados ao recipiente contendo os co-precipitados triplos e águadeionizada e os co-precipitados triplos deixados reticular por 2 horas emtemperatura ambiente sob agitação leve.

- A solução de EDAC é removida e os co-precipitados triplosenxaguados com solução de tampão de fosfato (PBS) e deixados incubar a37°C por 2 horas em PBS fresco sob agitação branda.

- Após duas horas em PBS, os co-precipitados triplo sãoenxaguados com água deionizada e deixados a incubar por dois intervalos de10 minutos a 37°C sob agitação branda.

- Os co-precipitados triplos são então secados a 37°C por 72horas. A Figura 9 mostra um padrão de difração em raio χ do co-precipitadotriplo de colágeno/GAG/brushita seguindo a radiação Cu-K (alfa) dereticulação EDAC).

Etapa IV

- Os grânulos de co-precipitado triplo reticulados sãocolocados em 50 ml de água deionizada a 37°C e o pH da solução ajustado a6,67 usando-se amônia.

- A temperatura e o pH são mantidos constantes por 48 horas,tempo após o qual os co-precipitados são filtrados, enxaguados em águadeionizada e secados a 37°C em ar.

- padrão de difração de raio χ dos co-precipitados seguindo aconversão para OCP é mostrado na Figura 10 (co-precipitado triplo decolágeno/GAG/CaP reticulado por EDAC seguindo a conversão a 37°C aoOCP durante 72 horas em pH 6,67, para formar um biocompósito decolágeno/GAG/OCP, radiação Cu-K (alfa)).

Exemplo 3

O Exemplo 3 é um exemplo do método de síntese descritoacima, executado por intermédio das etapas I até V inclusive. A co-precipitação tripla é realizada em temperatura ambiente e um pH de cerca de4,5. Como no exemplo 2, o controle do pH é realizado pelo controlecuidadoso das concentrações de hidróxido de cálcio e nitrato de cálcio, sem ouso de titulantes. Os co-precipitados resultantes são então congelados a -20°C, colocados sob vácuo e depois aquecidos para induzir a sublimação daágua não ligada (isto é, gelo). A reticulação primária é realizada usando-se umtratamento com 1-etil 3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida. O co-precipitado seco resultante é então convertido à apatita em pH 8,50, a 37°C. Areticulação secundária realizada usando-se radiação gama.

Materiais

Tipo I: Ácido solubilizado de tendão bovino Integra LifeSciences Plainsboro, NJ, USA

GAG: Condroitin-6-sulfato de cartilagem de tubarão; sal desódio; Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Fontes de cálcio: (i) Hidróxido de cálcio; Ca(OH)2 Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) e (ii) Nitrato de cálcio; Ca(NO3)2j4H2O;Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) Fonte de fósforo: Ácidoortofosfórico; H3PO4; BDH Laboratory Supplies (Poole, United Kingdom)

Titulante: Nenhum

Agentes de reticulação: (i) l-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)Carbodiimida (=EDAC); Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO5 USA) e (ii) N-Hidroxissuccinimida (=NHS); Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Procedimento

Etapa I

- Uma razão de massa alvo de brushita para colágeno maisglicosaminoglicano de 3:1 é selecionada.

- A concentração de colágeno mais GAG em um volume dereação total de 200 ml é ajustado em 10 mg/ml.

- Usando-se um mapa de 3 dimensões empírico de variação depH (em uma razão de íon reagente [Ca ] a [P] constante de 1,0) comconcentrações iônicas diferentes i) (isto é, [Ca~ ] = [H3PO4]) e ii) as razões denitrato de cálcio: hidróxido de cálcio, um local de pontos durante o qual o pHpermaneceu constante em 4,5 é identificado. Isto é mostrado na Figura 11(ajuste de combinações de concentração iônica e razão de nitrato de cálcio:hidróxido de cálcio para manter o pH = 4,5).

- Superimpor este local de pontos em um mapa de rendimentode massa de brushita (com eixos idênticos) e identificação de sua intersecçãocom o contorno de 30 mg/ ml (isto é, 3 vezes a concentração de colágenomais GAG) permite o ajuste de concentrações de reagente para os quais umapasta de co-precipitado triplo contendo uma razão de massa 3:1 de fosfato decálcio (30 mg/ml) para colágeno mais GAG (10 mg/ml) pode ser produzidoem um pH de 4,5 ([Ca2+] = [H3PO4] = 0,1768 M; CaN03).4H20:Ca(0H)2 =0,049). Isto é mostrado na Figura 12:

Identificação das condições para a síntese de pH 4,5 de umapasta de co-precipitado triplo pasta contendo uma razão em massa de 3:1 defosfato de cálcio a colágeno mais GAG.

- l,837g de colágeno é dispersado em 171,4 ml de 0,1768 Mde H3PO4 esfriado em um banho de gelo, combinando-se por 90 minutos em1.500 rpm, usando-se um homogeneizador equipado com um estator de 19mm de diâmetro, para criar uma dispersão de colágeno.

- 0,163g de condroitin-6-sulfato (GAG) é deixado dissolver em14,3 ml de 0,1768 M em temperatura ambiente, agitando-se periodicamentepara dispersar a dissolução de GAG, para produzir a solução de GAG.

- Após 90 minutos, os 14,3 ml de solução de GAG sãoadicionados à mistura de dispersão de colágeno em uma taxa deaproximadamente 0,5 ml/minutos, sob condições de homogeneização em1.500 rpm e a dispersão de colágeno/GAG combinada por um total de 90minutos.

- Após 90 minutos de mistura, 2,498 g de Ca(OH)2 e 0,380 gde Ca(NO3)2j4H2O são adicionados ao colágeno/dispersão de GAG durante 30minutos em combinação constante em 1.500 rpm, criando uma pasta de co-precipitado triplo colágeno/GAG/CaP pasta, tempo após o qual um adicionalde 14,3 ml de 0,1768 M de H3PO4 foram adicionados à pasta de mistura.

O pH da pasta de co-precipitado triplo é de aproximadamente 4,5.

- A pasta de co-precipitado triplo é deixado permanecer a 25°Cpor um período de 48 horas.

Etapa II

- A pasta de co-precipitado triplo é colocada em umcongelador a -20°C e deixada congelar durante a noite.

- A pasta congelada é então removida do congelador, colocadaem um vácuo de aproximadamente 80 mTorr e a temperatura deixada atingir atemperatura ambiente, desta maneira induzindo a sublimação do gelo a partirda pasta, que é deixada proceder por 48 horas. O traço de difração de raio χdo co-precipitado triplo colágeno/GAG/brushita que segue a remoção da águanão ligada (RADIAÇÃO Cu-K(alFa)) é mostrado na Figura 13.

Etapa III

- Após a remoção completa da água não ligada, 1,25 g do co-precipitado triplo seco resultante é hidratado em 40 ml de água deionizada por20 minutos.

- 20 ml de uma solução de 0,018 M de EDAC e 0,007 M deNHS é adicionado e o recipiente contendo os co-precipitados triplos e águadeionizada e os co-precipitados triplos deixados reticular por 2 horas emtemperatura ambiente, sob agitação leve.

- A solução de EDAC é removida e os co-precipitados triplossão enxaguados com solução de tampão de fosfato (PBS) e deixados incubar a37°C por 2 horas em PBS fresco sob agitação branda.

- Após duas horas em PBS, os co-precipitados triplos sãoenxaguados com água deionizada e deixados incubar por dois intervalos de 10minutos a 37°C sob agitação branda.

- Os co-precipitados triplos são então secados a 370C por 72horas. O padrão de difração de raio χ de co-precipitado triplo decolágeno/GAG/brushita seguindo a reticulação de EDAC (radiação Cu-K(alfa)) é mostrado na Figura 14.

Etapa IV

- Os grânulos de co-precipitado triplo reticulados sãocolocados em 50 ml de água deionizada pré-saturada com respeito à brushita a37°C e o pH da solução ajustado a 8,50 usando-se amônia.

- A temperatura o pH are são mantidos constantes por 72horas, tempo após o qual os co-precipitados são filtrados, enxaguados emágua deionizada e secados a 37°C em ar. um padrão de difração de raio χ dosco-precipitados seguindo a conversão à apatita é mostrado na Figura 15 (co-precipitado triplo de colágeno/GAG/CaP reticulado por EDAC seguindo aconversão a 37°C a apatita durante 72 horas em pH 8,50, para formar umbiocompósito de colágeno/GAG/apatita (radiação Cu-K(alfa)).

Etapa V

- Os co-precipitado triplos colágeno/GAG/Ap secos sãosubmetidos a uma dose de 32,1 kGy de irradiação gama. A Figura 16 mostra opadrão de difração de raio χ seguindo a irradiação gama (co-precipitadotriplos colágeno/GAG/Ap reticulados por EDAC após a reticulaçãosecundária por intermédio da irradiação gama).

Exemplo 4

Materiais

Colágeno: colágeno dérmico porcino extraído da pepsinareconstituído, (atelocolágeno); 85 % em peso do Tipo I, 15 % em peso doTipo III; Japan Meat Packers (Osaka, Japan) GAG: Condroitin-6-sulfato decartilagem de tubarão; sal de sódio; Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA)

Fontes de cálcio: (i) Hidróxido de cálcio; Ca(OH)2Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO3 USA) e (ii) Nitrato de cálcio;Ca(NO3)2i4H2O; Sigma-Aldrich Inc (St. Louis, MO, USA) Fonte de fósforo:Ácido ortofosfórico; H3PO4; BDH Laboratory Supplies (Poole, UnitedKingdom)

Titulante: Amônia; NH3; BDH Laboratory Supplies (Poole,United Kingdom)

Procedimento

Etapa I

- A solução A foi preparada dissolvendo-se Ca(OH)2 em 0,48M de H3PO4 em uma concentração de 0,12 M em temperatura ambiente e asolução resultante titulada em um pH de 3,2.

- A suspensão B foi preparada dissolvendo-se a Condroitin-6-sulfato em água deionizada em uma concentração de 3,2 g/litro.

- sob agitação constante, Ca(NO3)2,4H20 e Ca(OH)2 entãoadicionado à solução de sulfato de condroitina em uma razão molar denitrato:hidróxido de 1,5, para a produção da de uma suspensão comconcentração total de cálcio de 2,4 M.

- 0,144 g de colágeno foram adicionados a 20 ml de soluçãoAe combinado usando-se um homogeneizador até dissolver. 4 ml deSuspensão B foi então adicionado à Solução A sob agitação constante. Aagitação continuou por 60 minutos e pH monitorado para garantir que estepermaneça na faixa de 3,15<pH<3,30. A pasta resultante foi então deixadaenvelhecer por 24 horas em temperatura ambiente.

Etapa II

A pasta foi deixada secar a 37°C em ar por 5 dias e o co-precipitado triplo remanescente enxaguada com água deionizada esubseqüentemente segada novamente a 37°C por um adicional de 24 horas.

Etapa III

Os co-precipitados foram colocados em ácido acético diluído(pH = 3,2) e irradiados com uma dose de irradiação gama de 30 kGy. Osprecipitados então removidos da solução, enxaguados e secados a 370C em ar.

Etapa IV

- Os grânulos de co-precipitado reticulados foram colocadosem 50ml de água deionizada a 37°C e o pH da solução ajustado a 6,65usando-se amônia. A temperatura e o pH foram mantidos constantes por 48horas, após o que os co-precipitados foram filtrados, enxaguados em águadeionizada e secados a 37°C em ar.

Etapa V

Os grânulos de co-precipitado hidrolisados reticulados foramcolocados em um forno a vácuo em temperatura ambiente e um vácuo de 50mTorr aplicado, após o que a temperatura foi então aumentada a 105°C. Após24 horas, a temperatura foi reduzida até a temperatura ambiente e o vácuoliberado.

A Figura 17 mostra o padrão de difração de raio χ docompósito imediatamente seguindo a co-precipitação tripla e a secagem(Etapas I e II). Este padrão confirma fase principal presente é brushita.

A Figura 18 mostra uma micrografia SEM da estrutura degrânulos co-precipitados que segue a reticulação primária (Etapa III). E dignode nota a natureza microestruturalmente homogênea dos grânulos.

A progressão da hidrólise ao octafosfato de cálcio (Etapa IV) éilustrada no padrão XRD da Figura 19. Diminuições progressivas naintensidade do pico de brushita em 12.5° e aumento do pico de fosfato deoctacálcio principal (OCP) em 4.5° indica a conversão da fase orgânica paraOCP por um período de 48 horas.

A imagem TEM do compósito é mostrada na Figura 20. Umadistribuição aleatória de 10 a 20 nm de cristais de fosfato de cálcio de taxa deaspecto baixa dispersados em uma matriz de colágeno/GAG é evidente.

Os biomateriais compósitos da presente invenção podem serusados como um material biorreabsorvível. Seguindo o implante, é esperadoque um dispositivo fabricado do material deve reabsorver completamente,deixando para trás, apenas tecido regenerado saudável sem nenhum traçoremanescente de implante por si só. [Fim do anexo 1].

Claims (55)

1. Processo para a preparação de um biomaterial compósitoque compreende um material inorgânico e um material orgânico, o processo,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) fornecer uma primeira composição de suspensão quecompreende um carreador líquido, um material inorgânico e um materialorgânico;(b) fornecer um molde para a suspensão;(c) depositar a suspensão no molde;(d) esfriar a suspensão depositada no molde a uma temperaturaem que o carreador líquido transforma-se em uma pluralidade de cristais oupartículas sólidas;(e) remover pelo menos alguns da pluralidade de cristais oupartículas sólidas por sublimação e/ou evaporação para deixar um materialcomposto poroso que compreende um material inorgânico e um materialorgânico e(f) remover o material do molde.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material inorgânico compreende um material de fosfato decálcio.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o material de fosfato de cálcio compreende brushita.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 3, caracterizado pelo fato de que o material orgânico compreende um oumais de colágeno (incluindo colágeno recombinante humano (rh)), umglicosaminoglicano, albumina, hialuronano, quitosan e polipeptídeossintéticos que compreende uma porção da seqüência polipeptídica decolágeno.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 4, caracterizado pelo fato de que o material inorgânico compreende ummaterial de fosfato de cálcio, o material orgânico compreende colágeno eopcionalmente um glicosaminoglicano e em que o material composto porosocompreende o material de fosfato de cálcio e colágeno e opcionalmente umglicosaminoglicano.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a primeira suspensão compreende um co-precipitado decolágeno e o material de fosfato de cálcio.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a primeira suspensão compreende um co-precipitado triplo decolágeno, o material de fosfato de cálcio e um glicosaminoglicano.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de-5 a 7, caracterizado pelo fato de que o material de fosfato de cálciocompreende brushita.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que ainda compreende:fornecer uma segunda composição de suspensão quecompreende um carreador líquido e um material orgânico e opcionalmente ummaterial inorgânico eantes da dita etapa de esfriamento, depositar a dita segundacomposição de suspensão no molde antes ou após a dita primeira composiçãode suspensão ser depositada.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o material orgânico compreende um ou mais de colágeno(incluindo colágeno recombinante humano (rh)), um glicosaminoglicano,albumina, hialuronano, quitosan e polipeptídeos sintéticos que compreendeuma porção da seqüência polipeptídica de colágeno.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação-10, caracterizado pelo fato de que a segunda composição de suspensãocompreende um material inorgânico, preferivelmente um material de fosfatode cálcio.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a segunda composição de suspensãocompreende um carreador líquido, colágeno, opcionalmente um material defosfato de cálcio e opcionalmente um glicosaminoglicano.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a segunda composição de suspensão compreende um co-precipitado de colágeno e um glicosaminoglicano ou um co-precipitado decolágeno e um material de fosfato de cálcio ou um co-precipitado triplo decolágeno, um glicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12 oureivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a segunda composição desuspensão compreende um material de fosfato de cálcio que é brushita.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda composiçõesde suspensões são depositadas como primeira e segunda camadas no molde.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o processo resulta na formação deum material de camada múltipla, pelo menos uma camada que compreendeum material compósito poroso que compreende colágeno, um material defosfato de cálcio e opcionalmente um glicosaminoglicano.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a camada resultante da segunda composição de suspensão éporosa.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 9 a 17, caracterizado pelo fato de que após a primeira e segundacomposições de suspensão foram depositadas no molde, os teores dos moldessão deixados repousar até 24 horas antes da etapa de esfriamento.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a etapa de deixar os teores dos moldes repousar é realizadaem uma pressão de 1 a 200 kPa, preferivelmente de 50 a 150 kPa, maispreferivelmente de 50 a 101,3 kPa.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o carreador líquido compreendeágua.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a temperatura da suspensãodepositada no molde antes da etapa de esfriamento está na faixa de 2 a 40° C,preferivelmente de 4 a 37° C, mais preferivelmente de 20 a 37° C.

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de esfriar a suspensãodepositada no molde é realizada em uma temperatura de < 0o C.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a etapa de esfriar a suspensão depositada no molde érealizada na temperatura na faixa de -100 a 0o C5 preferivelmente de -80 a --10° C, mais preferivelmente de -40 a -20° C.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de esfriar a suspensãodepositada no molde é realizada em uma taxa de esfriamento de 0,02 a-10° C/minuto, preferivelmente de 0,02 a 6,0° C/minutos, maispreferivelmente de 0,2 a 2,7° C/minutos.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a espessura da suspensãodepositada no molde é de 0,1 a 500 mm, preferivelmente de 0,5 a 20 mm,mais preferivelmente de 1,0 a 10 mm.

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a viscosidade da suspensão antesde ser depositada no molde é de 0,1 - 50 Pa*s, preferivelmente de 0,1 a 10Pa»s, mais preferivelmente de 0,5 a 5 Pa*s.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de remover pelo menosalguns dos cristais ou partículas sólidas por sublimação é realizada em umapressão de 0 a 0,08 kPa, preferivelmente de 0,0025 a 0,08 kPa, maispreferivelmente de 0,0025 a 0,04 kPa.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de remover pelo menosalguns dos cristais ou partículas sólidas por sublimação é realizada por até-120 horas, preferivelmente de 12 a 72 horas, mais preferivelmente de 24 a 36horas.

29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de remover pelo menosalguns dos cristais ou partículas sólidas por sublimação é realizada em umatemperatura de -10 a 60° C, preferivelmente de 0 a 40° C, maispreferivelmente de 20 a 37° C.

30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 5 a 8 e 12 a 29, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa dereticular o colágeno e o um ou mais glicosaminoglicanos no biomaterialcompósito poroso.

31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 8 e 11 a 30, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa deconverter pelo menos algum do material de fosfato de cálcio no biomaterialcompósito poroso a uma fase de fosfato de cálcio diferente.

32. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o material de fosfato de cálcio compreende brushita e éconvertido um fosfato de octacálcio e/ou apatita.

33. Biomaterial compósito sintético, caracterizado pelo fato deque pelo menos parte do biomaterial é formado de um co-precipitado porosoque compreende um material de fosfato de cálcio e um de colágeno (incluindocolágeno recombinante humano (rh)), um glicosaminoglicano, albumina,hialuronano, quitosan ou um polipeptídeo sintético que compreende umaporção da seqüência polipeptídica de colágeno, em que a faixa de tamanho demacroporo (diâmetro de poro) é preferivelmente de 1 a 1000 mícrons, maispreferivelmente de 200 a 600 mícrons.

34. Biomaterial compósito sintético de acordo com areivindicação 33, caracterizado pelo fato de que pelo menos parte dobiomaterial é formado de um co-precipitado poroso que compreende ummaterial de fosfato de cálcio e colágeno.

35. Biomaterial compósito sintético, caracterizado pelo fato deque pelo menos parte do biomaterial é formado de um co-precipitado triploporoso que compreende um material de fosfato de cálcio e dois ou mais decolágeno (incluindo colágeno recombinante humano (rh)), umglicosaminoglicano, albumina, hialuronano, quitosan e um polipeptídeosintético que compreende uma porção da seqüência polipeptídica de colágeno,em que a faixa de tamanho de macroporo (diâmetro de poro) épreferivelmente de 1 a 1000 mícrons, mais preferivelmente de 200 a 600mícrons.

36. Biomaterial compósito sintético de acordo com areivindicação 35, caracterizado pelo fato de que pelo menos parte dobiomaterial é formado de um co-precipitado triplo poroso que compreendecolágeno, um glicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio.

37. Biomaterial compósito sintético caracterizado pelo fato deque compreende: uma primeira camada formada de um material poroso quecompreende colágeno e um material de fosfato de cálcio e opcionalmente umglicosaminoglicano euma segunda camada unida à primeira camada e formada deum material que compreende colágeno ou um co-precipitado de colágeno eum glicosaminoglicano ou um co-precipitado de colágeno e um material defosfato de cálcio ou um co-precipitado triplo de colágeno, umglicosaminoglicano e um material de fosfato de cálcio.

38. Biomaterial de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a primeira camada é formada de um materialcomo definido em qualquer uma das reivindicações 33 ou reivindicação 36.

39. Biomaterial de acordo com a reivindicação 37 oureivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segundacamadas são integralmente formadas, preferivelmente pela co-síntese de faselíquida.

40. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 39, caracterizado pelo fato de que a primeira e asegunda camadas são unidas uma à outra através de uma camada de inter-difusão.

41. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 39, caracterizado pelo fato de que a primeira e asegunda camadas são unidas uma à outra através de uma camada interna.

42. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 41, caracterizado pelo fato de que a segunda camada éporosa ou não porosa.

43. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 42, caracterizado pelo fato de que compreende uma oumais camadas adicionais unidas à primeira e/ou segunda camadas, cada umadas ditas camadas adicionais sendo formadas de um material que compreendecolágeno ou um co-precipitado de colágeno e um glicosaminoglicano ou umco-precipitado de colágeno e um material de fosfato de cálcio ou um co-precipitado triplo de colágeno, um glicosaminoglicano e pelo menos ummaterial de fosfato de cálcio.

44. Biomaterial de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda camadas e a dita uma oumais camadas adicionais são integralmente formadas.

45. Biomaterial de acordo com a reivindicação 43 oureivindicação 44, caracterizado pelo fato de que as camadas adjacentes sãounidas uma à outra através de uma camada de inter-difusão.

46. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 43 a 45, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dadita uma ou mais camadas adicionais e/são porosas ou não porosas.

47. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 46, caracterizado pelo fato de que o materialcompreende colágeno e um glicosaminoglicano e em que o colágeno e oglicosaminoglicano são reticulados.

48. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 47, caracterizado pelo fato de que o materialcompreende colágeno e em que o colágeno está presente no material em umaquantidade de 1 a 99 % em peso, preferivelmente de 5 a 90 % em peso, maispreferivelmente de 15 a 60 % em peso.

49. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 48, caracterizado pelo fato de que o materialcompreende um glicosaminoglicano e em que o glicosaminoglicano estápresente no material em uma quantidade de 0,01 a 20 % em peso,preferivelmente de 1 a 5,5 % em peso.

50. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 49, caracterizado pelo fato de que o materialcompreende colágeno e em que, se o fosfato de cálcio compreender brushita,a razão de colágeno para brushita é de 10:1 a 1:100 em peso, preferivelmentede 5:1 a 1:20 em peso.

51. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 49, caracterizado pelo fato de que o materialcompreende - colágeno e em que, se o material de fosfato de cálciocompreender fosfato de octacálcio, a razão de colágeno para fosfato deoctacálcio é de 10:1 a 1:100 em peso, preferivelmente de 5:1 a 1:20 em peso.

52. Biomaterial de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 33 a 51, caracterizado pelo fato de que o materialcompreende colágeno e um glicosaminoglicano e em que a razão de colágenopara o glicosaminoglicano é de 8:1 a 30:1 em peso.

53. Material ósseo sintético, implante ósseo, enxerto ósseo,substituto ósseo, estrutura óssea, enchedor, revestimento ou cemento,caracterizados pelo fato de que compreendem um biomaterial como definidoem qualquer uma das reivindicações 33 a 52.

54. Estrutura óssea monolítica ou em camadas para o uso naengenharia de tecidos, caracterizada pelo fato de que compreende umbiomaterial como definido em qualquer uma das reivindicações de 33 a 52.

55. Biomaterial compósito poroso, caracterizado pelo fato deque é obtenível por um processo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 32.