BRPI0609153A2 - fontes para, e tipos de, proteìnas inseticidamente ativas e polinucleotìdeos que codificam as proteìnas - Google Patents

Abstract

FONTES PARA, E TIPOS DE, PROTEìNAS INSETICIDAMENTE ATIVAS E POLINUCLEOTìDEOS QUE CODIFICAM AS PROTEìNAS. A presente invenção provê novas fontes excitantes para novos tipos surpreendentes de proteínas de complexo toxina ("TC"). A presente invenção inclui estas novas classes e tipos de proteínas TC. A presente invenção também inclui polinucleotídeos que codificam as proteínas objetos. A presente invenção ainda provê vetores e células compreendendo estes polinucleotídeos. A presente invenção também provê novos processos de controle de insetos. A presente invenção refere-se em parte à surpreendente verificação de que novos tipos de proteínas TO podem ser obtidos a partir de um amplamente diverso espectro filogenético de organismos incluindo, mais notada e surpreendentemente, fungos eucarióticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FONTESPARA, E TIPOS DE, PROTEÍNAS INSETICIDAMENTE ATIVAS E POLI-NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM AS PROTEÍNAS".

Referência - Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados O pedido de patente objeto reivindica prioridade de pedido de

patente provisório US 60/657 965, depositado em 2 de março de 2005, e depedido de patente provisório US 60/704 533, depositado em 2 de agosto de2005.

Antecedentes

Bilhões de dólares são gastos cada ano para controle de inse-

tos, e adicionais bilhões de dólares são perdidos devido dano de colheitainfligido por insetos. Inseticidas químicos orgânicos sintéticos foram as fer-ramentas primárias usadas para controlar insetos, mas inseticidas biológicosestão desempenhando um importante papel em algumas áreas. Plantas re-

sistentes a insetos transformadas com genes de proteína inseticida, comoproteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (B.t.), revoluciona-ram agricultura moderna e elevaram a importância e valor de proteínas inse-ticidas e seus genes.

Proteínas de Complexo Toxina (TC) e genes, encontrados pri-

mariamente em bactérias dos gêneros Photorhabdus e Xenorhabdus (mastambém em outros gêneros de bactérias como Serratia, Pseudomonas, ePaenibacillus) são uma importante, relativamente nova fonte de proteínas egenes inseticidas. Existem pelo menos três classes distintas de proteínasTC. Proteínas TC classe A nativas são de aproximadamente 280 kDa em

tamanho e possuem atividade inseticida. Proteínas TC Classe B (aproxima-damente 170kDa) e proteínas TC Classe C (aproximadamente 107 kDa), emcombinação, aperfeiçoam a potência inseticida de proteínas TC Classe A,mas possuem pequena ou nenhuma atividade inseticida na ausência de umaproteína TC Classe A. Ou seja, proteínas TC Classe B e Classe C em com-

binação potencializam a atividade inseticida de proteínas TC Classe - Ver,por exemplo, US-2004-0208907 e WO 2004/067727 para uma revisão maisdetalhada da técnica. Proteínas TC Classe A possuem atividade inseticida,mas esta atividade é relativamente baixa. Quando uma proteína TC ClasseA é combinada com uma proteína TC Classe B e Classe C, elas formam umcomplexo que é muito mais potente que proteína TC Classe A sozinha.

Diferente de Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus, e Photorhab- dus, que são organismos que são conhecidos serem inseticidas e terem pro-teínas inseticidas, organismos tais como Fusarium graminaerum (agora co-nhecido como Gibberella zeae) e Methanosarcina não eram conhecidos se-rem inseticidas e não eram conhecidos produzirem proteínas inseticidamen-te ativas. Breve Sumário

A invenção objeto prove novas classes e tipos de proteínascomplexo toxina ("TC"), e novas fontes excitantes para proteínas TC. A in-venção objeto também inclui polinucleotídeos que codificam as proteínasobjeto. A invenção objeto ainda prove vetores e células compreendendo es- tes polinucleotídeos. A invenção objeto também prove novos processos decontrole de insetos.

A invenção objeto refere-se em parte à surpreendente verifica-ção de que novos tipos de proteínas TC podem ser obtidos a partir de umespectro filogenético amplamente diverso de organismos incluindo, mais no- tavelmente, fungos eucarióticos.Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 apresenta a produção gráfica de uma busca usando aseqüência de proteína de fusão artificial de SEQ ID NO: 6 em uma buscaBLAST proteína - proteína padrão da base de dados de proteína não- redundante NCBI, usando os seguintes valores default: Filtro fixado parabaixa complexidade; Espera: 10; Tamanho de palavra 3; Matriz BLOSUM62;Custos de Folga: Existência 11, Extensão 1.

Figura 2 mostra a seqüência de aminoacidos para a fusão BCnatural em Tannerella, onde aminoacidos sublinhados mostram o domínio spvB usando o modelo spvB-1s.hmm padrão; aminoacidos com sublinhadoduplo mostram o domínio FG-GAP usando o modelo Bmodel17.hmm; ami-noacidos em negrito mostram os domínios RHS usando modelo Pfamrhs_1s.hmm; e aminoácidos em itálico mostram o HVR mapeado através defalta de homologia a outras proteínas.

A Figura 3 mostra a seqüência de aminoácidos para a proteínahipotética FG10566.1 fundida à proteína toxina BC [Gibbrella zeae PH-1], onde os aminoácidos sublinhados indicam o domínio spvB usando o modelospvB-1s.hmm padrão; aminoácidos com sublinhado duplo indicam três do-mínios FG-GAP encontrados com o modelo Bmodels3.hmm; aminoácidosem negrito indicam domínios RHS usando o modelo Pfam rhs_1s.hmm; eitálicos indicam HVR mapeada por falta de homologia a outras proteínas. As Figuras 4A-D mostram o alinhamento global das duas proteí-

nas toxinas fundidas BC de Tannerella e Gibberella.Breve Descrição das Seqüências

SEQ ID NO:1 é a seqüência de DNA genômico nativo tcplGz quecodifica a proteína de SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:2 mostra a seqüência de aminoácidos nativa da pro-

teína TcplGz (incluindo leitura através de intron putativo).

SEQ ID NO:3 mostra a seqüência de ADNc hipotética, nativacom o intron putativo removido. Esta seqüência codifica a proteína de SEQID NO:4.

SEQ ID NO:4 é a seqüência de aminoácidos nativa da proteína

TcplGz com a seqüência codificada por intron removida.

SEQ ID NO:5 é uma seqüência de polinucleotídeos otimizada deE.colique codifica a proteína TcpGz de SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:6 é um exemplo de uma proteína de fusão gerada das seqüências de aminoácidos de TcaC (Acesso GenBank AAC38625.1) eTccC1 (Acesso GenBank AAL18473.1)(ambas de Photorhabdus lumines-cens linhagem W-14).

SEQ ID NO:7 é a seqüência genômica de Methanosarcina linha-gem C2A que codifica uma proteína de complexo de toxina de dois domí- nios.

SEQ ID NO:8 é a seqüência de aminoácidos codificada por SEQ

IDNO:7.SEQ ID N0:9 é a seqüência genômica (de Gibberella zeae PH-1linhagem PH-1; NRRL 31084 cromossomo 1) que codifica uma proteína TCClasse A.

SEQ ID NO:10 é a seqüência de aminoácidos codificada por SEQIDNO:9.

SEQ ID NO:11 é a seqüência de inteiro comprimento do gene defusão Classe B/C em Tannerella forsythensis (ATCC 43037).

SEQ ID NO:12 é a proteína codificada por SEQ ID NO:11.

SEQ ID NO: 13 é iniciador P1 usado para PCR de acordo com a invenção objeto.

SEQ ID NO: 14 é iniciador P2 usado para PCR de acordo com ainvenção objeto.

SEQ ID NO: 15 é iniciador P3 usado para PCR de acordo com ainvenção objeto.

SEQ ID NO:16 é iniciador P4 usado para PCR de acordo com a

invenção objeto.

SEQ ID NO: 17 é iniciador P5 usado para PCR de acordo com ainvenção objeto.

SEQ ID NO:18 é iniciador P6 usado para PCR de acordo com a invenção objeto.

SEQ ID NO: 19 é a seqüência de nucleotídeos de fusão 8884(TcdB2/Tcp1GzC). Nucleotídeos 1-4422 codificam TcdB2; nucleotídeos 4423-4464 codificam o peptídeo ligante TcdB2/TcplGZ; e nucleotídeos 4465-7539codifica Tcp1GzC.

' SEQ ID NO:20 é a seqüência de aminoácidos do peptídeo de

fusão 8884 TcdB2/Tcp1GzC codificado por SEQ ID NO:19. Aminoácidos 1-1474: TcdB2; aminoácidos 1475-1488: peptídeo ligante TcdB2/Tcp1Gz; ami-noácidos 1489-2513: Tcp1 GzC.

SEQ ID NO:21 é a seqüência de nucleotídeos de fusão 8883

(tcp1GzB/tccC3). Nucleotídeos 1-4536 codificam Tcp1GzB; nucleotídeos codi-ficam o peptídeo ligante Tcp1GzB/TccC3; e nucleotídeos 4576-7455 codifi-cam TccC3.SEQ ID NO:22 é a seqüência de aminoácidos da proteína defusão 8883 Tcp1GzB/TccC3 codificada por SEQ ID NO:21. Aminoácidos 1-1512: Tcp1GzB; aminoácidos 1513-1525: ligante; aminoácidos 1526-2485:TccC3.

5 SEQ ID NO:23 é a seqüência de nucleotídeos otimizada de plan-

ta codificando uma variante de proteína TcplGz Classe B/Classe C fundidade Gibberella zeae.

SEQ ID NO:24 é a variante de proteína Tcplcz Classe B/ClasseC fundida de Gibberella zeae codificada por SEQ ID NO:23.

SEQ ID NO:25 é a seqüência de nucleotídeos extraída de ACon-

tig12 de Fusarium verticillioides. O códon treonina (ACG) que serve como oinício do quadro de leitura aberto para a região codificante do primeiro seg-mento da proteína Classe A TC putativa deduzida é notado como umamisc_característica em nucleotídeos 21-23. O códon lisina AAA que serve

15 como o início do quadro de leitura aberto para a segunda porção da proteínaClasse A TC putativa deduzida é notado como uma misc_característica emnucleotídeos 3022-3024.

SEQ ID NO:26 é o primeiro segmento da proteína Classe A TCputativa deduzida codificada por SEQ ID NO:25.

20 SEQ ID NO:27 é o segundo segmento da proteína Classe A TC

putativa deduzida codificada por SEQ ID NO:25.

SEQ ID NO:28 é a seqüência de nucleotídeos extraída de Acon-tig34 de Fusarium verticillioides. O início da região codificante correspon-dendo à primeira asparagina da proteína codificada Classe A TC putativa em

25 SEQ ID NO:29 é notado como uma misc_característica em nucleotídeos 20-22. A segunda parte do quadro de leitura aberto começa 4 bases a jusantedo códon de parada TGA, compreende 690 bases, e codifica os 230 amino-ácidos mostrados em SEQ ID NO:30. A terceira porção do quadro de leituraaberto começa 11 bases a jusante do códon terminação TA A, compreende

30 1122 bases, e codifica os 374 aminoácidos mostrados em SEQ ID NO:31.Uma grande folga na seqüência de DNA, indicada como uma corda de 2098n's, é notada em uma misc_característica em nucleotídeos 3299-5396. Aporção da seqüência de DNA seguindo os Ns compreende uma quarta por-ção do quadro de leitura aberto da proteína Classe A TC putativa deduzida,e codifica os 1273 aminoácidos mostrados em SEQ ID NO: 32. O códonGGA para a primeira glicina desta porção da proteína Classe A TC putativa deduzida é indicado como uma misc_característica em nucleotídeos 5451-5453.

SEQ ID NO:29 é a primeira porção da proteína Classe A TC pu-tativa codificada por SEQ ID NO:28.

SEQ ID NO:30 é a segunda porção da proteína Classe A TC pu- tativa codificada por SEQ ID NO:28.

SEQ ID NO:31 é a terceira porção da proteína Classe A TC pu-tativa codificada por SEQ ID NO:28.

SEQ ID NO:32 é a quarta porção da proteína Classe A TC puta-tiva codificada por SEQ ID NO:28. SEQ ID NO:33 é a seqüência de nucleotídeos extraída de BC-

Contig12 de Fusarium verticillioides. O início da região codificante corres-pondendo à primeira alanina da proteína TC Classe B / Classe C fundidaputativa codificada em SEQ ID NO:34 (GCC) é notado como umamisc_característica a partir de nucleotídeos 22-24. Uma grande folga na se- qüência de DNA, indicada como uma corda de 659 n's, é notada como umamisc_característica a partir de nucleotídeos 5483-6141. o códon histidina naestrutura (CAT) que inicia a segunda porção da proteína TC Classe B / Clas-se C fundida putativa é notado como uma misc_característica a partir de nu-cleotídeos 6203-6205. SEQ ID NO:34 é a primeira porção da proteína TC Classe B /

Classe C fundida putativa codificada por SEQ ID NO:33.

SEQ ID NO:35 é a segunda porção da proteína TC Classe B /Classe C fundida putativa codificada por SEQ ID NO:33.

SEQ ID NO:36 é a seqüência de nucleotídeos extraída de BC- Contig6 de Fusarium verticillioides. O início da região codificante correspon-dendo à primeira glutamina da proteína TC Classe B / Classe C fundida pu-tativa deduzida (CAG) é notado como uma misc_característica a partir denucleotídeos 20-22. O códon ácido aspártico (GAT) que inicia a segundaporção da proteína TÇ Classe B / Classe C fundida putativa é notado comouma misc_característica em nucleotídeos 619-621.

SEQ ID NO:37 é a primeira porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa codificada por SEQ ID NO:36.

SEQ ID NO:38 é a segunda porção da proteína TC Classe B /Classe C fundida putativa codificada por SEQ ID NO:36.

SEQ ID NO:39 é a seqüência de nucleotídeos extraída de BC-Contig46 a partir de BCContig6 de Fusarium verticillioides. O início da região codificando (GAG), correspondendo ao primeiro ácido glutâmico da primeiraporção da SEQ ID NO:37 é a primeira porção da proteína TC Classe B /Classe C fundida putativa deduzida, é notado como uma misc_característicaem nucleotídeos 21-23. Uma grande folga na seqüência de DNA, indicadacomo uma corda de 1009 n's, é notada como uma misc_característica a par- tir de nucleotídeos 4324-4432. O códon TTG que especifica a primeira leuci-na da segunda porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida deduzidaseguindo os n's é notado como uma misc_característica em nucleotídeos4435-4437.

SEQ ID NO:40 é a primeira porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa codificada por SEQ ID NO:39.

SEQ ID NO:41 é a segunda porção da proteína TC Classe B /Classe C fundida putativa codificada por SEQ ID NO:39.Descrição Detalhada

A invenção objeto refere-se em parte à surpreendente descober- ta de que novos tipos de proteínas TC podem ser obtidos a partir de um es-pectro filogenético amplamente diverso de organismos incluindo, mais nota-velmente, fungos eucarióticos. Esta é a primeira exposição conhecida detoxinas antiinsetos em, por exemplo, Gibberella zeae (anteriormente conhe-cido como Fusarium graminaerum) e Methanosarcina. Estes organismos não eram conhecidos serem inseticidas e não eram, anteriormente, suspeitos depossuírem segmentos genômicos que codificam proteínas inseticidamenteativas.Esta descoberta amplia o escopo de organismos nos quais ge-nes semelhantes a TC foram encontrados. Assim, a invenção objeto refere-se genericamente a proteínas semelhantes a TC obteníveis de tais espécies,a processos de seleção destas espécies para tais proteínas, e semelhantes, Consideração do "papel" que alguns organismos fontes desem-

penham na natureza também pode conduzir a novas abordagens para des-cobrimento de adicionais proteínas TC e genes. Por exemplo, Gibberellazeae (anteriormente conhecido como Fusarium graminaerum) é um conheci-do patógeno de planta. Tendo o benefício da exposição objeto, uma teoria é

que micróbios que usam colheitas, como milho, como uma fonte de alimentoevoluíram toxinas antiinsetos para auxiliarem os mesmos a superarem inse-tos que também se alimentam sobre as colheitas. Assim, a invenção objetopode incluir processos de seleção de micróbios patogênicos de plantas paraproteínas antiinsetos e semelhantes.

Esta é também a primeira descoberta conhecida de proteínas

complexo toxina ("TC") de dois-domínios funcionalmente ativas, ocorrendonaturalmente, onde um domínio tem nível funcional e algum nível de relaçãode seqüência a proteínas TC "Classe B" (como discutido em mais detalhesabaixo), e o outro domínio tem nível funcional e algum nível de relação de

seqüência a proteínas TC "Classe C" (como discutido em mais detalhes a-baixo). Como aqui usado, "domínios B", "segmentos B", "domínios C", e"segmentos C" referem-se a domínios ou segmentos de polipeptídeos tendosimilaridades estruturais e funcionais a proteínas TC "Classe B" e "Classe C"como discutido em detalhes, por exemplo, em US-2004-0208907 e WO

2004/067727. Da mesma maneira, proteínas "Classe A" da invenção objetosão genericamente discutidas em, por exemplo, US-2004-0208907 e WO2004/067727.

Embora a seqüência do genoma de Gibberella zeae (por exem-plo) tenha sido publicada em GENBANK, anteriormente, não houve sugestão anterior ou expectativa de que as proteínas objetos podiam ser ativas comoproteínas TC conhecidas. Por exemplo, existe um grau muito baixo de rela-ção de seqüência e conformações únicas dos domínios presentemente iden-`tificados. O mesmo é verdade para as seqüências bacteriais aqui mostradas.Não houve mesmo uma motivação para testar estas seqüências genômicaspara qualquer atividade de proteínas hipoteticamente codificadas, conside-rando, por exemplo, o baixo grau de relação de seqüência, as conformaçõesúnicas das proteínas, e os organismos possuindo as seqüências genômicas.Não houve razão para esperar TCs nestas fontes, deixando sozinhas proteí-nas "fundidas" naturalmente, ativas como TcplGz. Certamente não houvemotivação para clonar estes genes em células de plantas, por exemplo.Também não houve motivação para seleção de coleções de cultura de iso-lados destas espécies para determinar se os genes objetos estão mais am-plamente presentes em várias linhagens destes organismos.

Uma proteína antiinseto exemplificada (um potencializador detoxinas Classe A) é aqui referida como TcplGz- Para facilidade de referência,estas proteínas de dois domínios da presente invenção são algumas vezesaqui referidas como "fusões naturais" e como proteínas semelhantes aTcp1Gz. A invenção objeto assim inclui estas novas classes e tipos de prote-ínas TC. A invenção objeto também inclui polinucleotídeos que codificam asproteínas objetos. A invenção objeto ainda prove vetores e células compre-endendo estes polinucleotídeos. Em algumas modalidades preferidas, a in- venção objeto também prove novos processos de controle de insetos e ou-tras pestes semelhantes, usando a nova proteína toxina da invenção objeto.

Tendo descoberto e mostrado que proteínas TC de dois domí-nios ocorrendo naturalmente (mas não anteriormente "isoladas") da inven-ção objeto são ativas, agora alguém será motivado a testar e usar outrasproteínas TC de dois domínios, ocorrendo naturalmente. Methanosarcina épreferido em tais modalidades. Em adição a Methanosarcina e Gibberella,novos organismos fontes para uso de acordo com a invenção objeto incluemespécies dos gêneros Treponema, Leptospira, Microbulbifer, Burkholderia, eNitrosospora.

A invenção objeto também refere-se à seleção de novos orga-nismos fontes para novas proteínas tipo Classe A e genes, como aqui mos-trados. Eucariotes, fungos, Gibberella, Fusarium e Aspergillus são algumasfontes preferidas, como são bactérias do gênero Burkholderia.

Proteínas semelhantes a Tcp1Gz (fusão natural) da invenção ob-jeto estão tipicamente na faixa de peso molecular de aproximadamente 220kDa a aproximadamente 295 kDa, embora esta seja justo uma faixa de ta- manho aproximada. Um peso preferido, por exemplo, está na faixa aproxi-mada de 280-285 kDa. Um outro exemplo de uma proteína complexo de to-xina tipo BC / dois-domínios, ocorrendo naturalmente é obtenível de Metha-nosarcina acetivorans str. C2A. As seqüências do gene nativo e proteína sãomostradas em SEQ ID NOs: 7-8.

Uma outra característica surpreendente da proteína TcplGz e-

xemplificada é que ela tem um intron aparente. Assim, a invenção objetoinclui proteínas TC isoladas compreendendo uma seqüência intron. A inven-ção objeto também inclui pesquisa, identificação, e/ou seleção de proteínasTC que contêm seqüências semelhantes a intron.

A invenção objeto prove novas fontes excitantes para novos ti-

pos surpreendentes de proteínas complexo toxina ("TC"). Assim, o objeto dainvenção refere-se genericamente a espécies Gibberella, Fusarium, e Me-thanosarcina, por exemplo, que têm proteínas TC ativas. A invenção objetotambém inclui processos de seleção destas e outras espécies (algumas das

quais são aqui identificadas) para estas novas classes de genes e proteínasTC (assim como para conhecidas proteínas TC tipo Classe A, Classe B, eClasse C). A invenção objeto também inclui processos de isolamento e/oupurificação de proteínas TC a partir destas espécies e testes das mesmaspara atividade toxina como aqui mostrado. A invenção objeto ainda inclui

' preparação e seleção de bibliotecas de genes clonados (ou de outro modoproduzidos)a partir destes organismos. Em algumas modalidades preferidas,os organismos são eucarióticos. As proteínas e genes objetos de origemeucariótica são particularmente promissores para altos níveis de expressãoem plantas.

Este é o primeiro relatório conhecido destes organismos tendo

proteínas semelhantes a TC funcionalmente ativas, de qualquer tipo. Estadescoberta foi mesmo mais surpreendente devido à conformação de doisdomínios, única, das proteínas da invenção objeto. Assim, a invenção objetorefere-se a processos de seleção destas espécies para genes e proteínassemelhantes a TC. Estas observações pioneiras têm amplas implicações eassim permitem aqueles versados na técnica selecionar apropriadas espé- cies de bactérias e fungos para óperons únicos da invenção objeto.

Proteínas semelhantes a Tcp1Gz da invenção objeto são aquimostradas serem úteis para aperfeiçoar ou potencializar a atividade de pro-teínas toxinas "Classe A" de Photorhabdus e/ou Xenorhabdus "deixada -sozinha", por exemplo. Uma ou mais proteínas TC da invenção objeto po-

dem ser usadas como um novo elemento combinado com técnicas conheci-das. Ver, por exemplo, US-2004-0208907 e WO 2004/067727.

A invenção objeto também prove novas proteínas TC tipo "Clas-se A", que, como uma Classe, têm atividade de toxina "deixada-sozinha".Ver, por exemplo, US-2004-0208907 e WO 2004/067727 para uma explica-

ção mais detalhada. Um gene e proteína Classe A exemplificado deste tipopode ser derivado do organismo Gibberella como aqui mostrado. Ver SEQID NOs:9-10.

Embora as proteínas semelhantes a TC objetos tenham algumarelação de seqüência a, e características em comum com, proteínas TC de

Xenorhabdus e Photorhabdus por exemplo, as seqüências das proteínassemelhantes a TC objetos são distintas de proteínas TC previamente conhe-cidas. Assim, o pedido objeto prove novas classes de proteínas semelhantesa TC e genes que codificam estas proteínas, que são obteníveis de gênerosde bactérias e fungos aqui identificados e sugeridos.

Outros objetos, vantagens, e características da invenção objeto

serão aparentes para aqueles versados na técnica tendo o benefício da ex-posição objeto.

Administração das Proteínas Objeto, e Sua Função, Atividade e Utilidade

Proteínas TC Classe A, Classe B, e Classe C individuais, como o termo é aqui usado, eram conhecidas na técnica. Tais proteínas toxinas"stand-alone" (proteínas TC Classe A) e potencializadores (proteínas TCClasse B e C). Bactérias conhecidas produzirem proteínas TC incluem aque-Ias dos seguintes gêneros: Photorhabdus, Xenorhabdus, Paenibacillus, Ser-ratia, e Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pseudomonas syringae pv. Syrin-gae B728a (GenBank Accession Numbers gi:23470933 e gi:23472543).

Como mencionado acima da seção de Antecedentes, embora proteínas "Toxina A" tenham alguma atividade inseticida, sozinhas, a altapotência inseticida do complexo "A+B+C" é muito preferida para aplicaçõescomerciais de proteínas TC. Entretanto, o exato mecanismo(s) de ação deproteínas TC permanece desconhecido. Da mesma maneira, é desconheci-do exatamente como (e se) cada um dos componentes A, B, e C interagem uns com os outros. Assim, não havia maneira a priori de prever se proteínasda invenção objeto podem permitir próprio funcionamento no intestino deinseto.

Foi com surpresa que as proteínas objetos foram verificadas se-rem altamente efetivas para controle de insetos. Não havia expectativa de que as proteínas de fusão naturais objetos pudessem ser ativas (isto é, tóxi-cas em combinação com uma proteína TC Classe A) após ingestão pelo in-seto alvo. É aqui mostrado que as proteínas objetos surpreendentementefuncionam bem no intestino de inseto.

A invenção objeto pode ser realizada em muitas maneiras dife-

rentes. Por exemplo, uma planta pode ser engenheirada para produzir um oumais tipos de proteínas TC Classe A junto com uma proteína tipo Tcp1Gz dainvenção objeto, a última das quais potencializa a atividade da proteína TCClasse A. Cada célula da planta, ou cada célula em um dado tipo de tecido(tal como raízes ou folhas) pode ser designada para ter genes que codificam as proteínas A e a proteína tipo TcplGz- Alternativamente, diferentes célulasda planta podem produzir somente uma (ou mais) de cada uma destas pro-teínas. Alternativamente, diferentes células da planta podem produzir so-mente uma (ou mais) de cada uma destas proteínas. Nesta situação, quandoum inseto morde e come tecidos da planta, ele pode comer uma célula que produz uma proteína TC Classe A, uma outra célula que produz uma segun-da proteína TC Classe A, e uma outra célula que produz a proteína tipoTcplGz- Assim, a planta (não necessariamente cada célula de planta) podeproduzir um ou mais tipos de proteínas TC Classe A e a proteína tipo Tcp1gzda invenção objeto de modo que pestes insetos comem todos estes tipos deproteínas quando eles comem tecido da planta.

Além de plantas transgênicas, existem muitas outras maneiras de administração de proteínas, em uma combinação da invenção objeto, àpeste alvo. Aplicações de espargimento sobre são conhecidas na técnica.Algumas ou todas as proteínas tipo TcplGz e Classe A podem ser espargi-das (a planta pode produzir uma ou mais das proteínas e as outras podemser espargidas). Vários tipos de grânulos iscas para aplicações ao solo, por

exemplo, também são conhecidas na técnica e podem ser suadas de acordocom a invenção objeto.

A presente invenção prove proteínas funcionais, facilmente ad-ministradas. A presente invenção também prove um processo para liberaçãode proteínas inseticidas que são funcionalmente ativas e efetivas contra mui-

tas ordens de insetos, preferivelmente insetos lepidópteros e/ou coleópteros.Por "atividade funcional" (ou "ativo contra") é aqui pretendido que as proteí-nas funcionam como agentes de controle de insetos ativos oralmente (sozi-nhos ou em combinação com outras proteínas), ou são capazes de inter-romper ou deter crescimento e/ou alimentação de inseto o que pode ou não

causar morte do inseto. Quando um inseto entra em contato com uma"quantidade efetiva" de uma "proteína inseticida" da invenção objeto liberadavia expressão em planta transgenica, composição (ões) de proteína formula-da, composição(ões) de proteína espargível, uma matriz isca ou outro siste-ma de liberação, os resultados são tipicamente morte do inseto, inibição do

crescimento e/ou proliferação do inseto, e/ou prevenção de alimentação dosinsetos sobre a fonte (preferivelmente uma planta transgenica) que torna asproteínas disponíveis para os insetos.

Assim, insetos que ingerem uma quantidade efetiva de uma pro-teína TC Classe A e uma proteína tipo Tcp1G2, por exemplo, podem ser im-

pedidos de alimentação, terem seu crescimento impedido, e/ou serem mor-tos, por exemplo. Uma proteína tipo TcplGz da invenção tem "funcionalida-de" ou atividade toxina se ela aperfeiçoa a atividade funcional de uma prote-ína TC Classe A quando usada em combinação com a mesma.

Completa letalidade para insetos se alimentando é preferida,mas não é requerida para obtenção de atividade funcional. Se um inseto evi-ta a proteína ou cessa alimentação, esta evitação será útil em algumas apli- cações, mesmo se os efeitos são sub-letais ou letalidade é retardada ou indi-reta. Por exemplo, se plantas transgênicas resistentes a insetos são deseja-das, a relutância de insetos para alimentação sobre as plantas é tão útil co-mo toxidez letal para os insetos porque o objetivo final é evitar dano de plan-ta induzido por inseto.

Transferência da atividade funcional para sistemas de planta,

bactérias ou outros tipicamente requer seqüências de ácidos nucléicos, codi-ficando as seqüências de aminoácidos para as toxinas, integradas em umvetor de expressão de proteína apropriado para o hospedeiro no qual o vetorresidirá. Uma maneira de se obter uma seqüência de ácidos nucléicos codi-

ficando uma proteína com atividade funcional é isolar o material genéticonativo das espécies fontes nativas que produzem as toxinas, usando infor-mação deduzida da seqüência de aminoácidos de toxina, como aqui mostra-do. As seqüências nativas podem ser otimizadas para expressão em plan-tas, por exemplo, como discutido em mais detalhes abaixo. Polinucleotídeos

otimizados também podem ser designados baseados na seqüência de prote-ína.

Existem muitas outras maneiras nas quais proteínas TC podemser incorporadas em uma dieta de inseto. Por exemplo, é possível adulterara fonte de alimentação de larva com a proteína tóxica através de espargi-do mento de alimento com uma solução de proteína, como aqui mostrado. Al-ternativamente, a proteína purificada pode ser geneticamente engenheiradaem uma bactéria de outro modo inofensiva, que então pode ser desenvolvidaem cultura, e tanto aplicada à fonte de alimento como permitida residir nosolo na área na qual erradicação de inseto foi desejável. Também, DNA para produção de proteína pode ser geneticamente engenheirado diretamente emuma fonte de alimento de inseto. Por exemplo, a principal fonte de alimentopara muitas larvas de insetos é material de planta. Por isso os genes codifi-cando toxinas podem ser transferidos para material de planta de modo que odito material de planta produza a toxina de interesse.

Quando proteínas tipo Tcp1Gz da invenção objeto são ditas te-rem dois domínios, deve ser notado que isto não exclui a existência de vá- rios sub-domínios, regiões, e motivos de proteína, por exemplo, em cada umdos dois domínios. Em adição, quando os dois domínios principais têm ho-mologia a proteínas TC Classe B e Classe C, respectivamente, e dado queproteínas tipo TcplGz da invenção objeto são aqui mostradas funcionaremcomo e serem úteis como proteínas TC Classe B e Classe C, a invenção objeto inclui o uso de qualquer ou ambos domínios das proteínas tipo Tcp1Gzindividualmente. Ou seja, o domínio semelhante a Classe C de uma proteínatipo TcplGz pode ser usado como na proteína Classe B de Xenorhabdus ouPhotorhabdus, por exemplo. O mesmo é verdade para o domínio semelhan-te a Classe B de proteína tipo Tçp1Gz- Vários processos para corte de prote- ínas e correspondente DNA, para isolar e religar fragmentos de interesse,são descritos abaixo na seção intitulada "Modificação de genes e proteínas",por exemplo. (Tais fragmentos de proteína e DNA, por exemplo, estão den-tro do escopo da invenção objeto). Um grande número de possíveis combi-nações e utilidades pode ser imaginado. Por exemplo, em algumas modali- dades, um fragmento de proteína tipo Tcp1Gz (preferivelmente um fragmentode domínio B ou um fragmento de domínio C) pode ser isolado (a partir dofragmento restante), permutado (fundido ou não-fundido) e "misturado e a-justado" de acordo com os ensinamentos de US-2004-0208907 e WO2004/067727. (Qualquer uma das seqüências de Classe B e Classe C, por exemplo, mostradas aqui também pode ser usada para definir modalidadesda invenção objeto. Por exemplo, nas seqüências de inteiro comprimentoaqui exemplificadas, os domínios Classe B e Classe C podem ser identifica-dos, através de comparação a seqüências em US-2004-0208907 e WO2004/067727, e usadas separadamente da mesma maneira). Como discuti- do abaixo, um domínio Classe C da invenção objeto também pode ser sinte-ticamente ligado a uma proteína TC Classe B. Da mesma maneira, um do-mínio Classe B pode ser sinteticamente ligado a uma proteína TC Classe C.Ligações e Outras Terminologias e Definições.

Proteínas tipo Tcp1G2 da invenção podem ser ligadas a proteínasTC Classe A. Ver, por exemplo, U.S. Serial No. 60/549 516, depositada em 2de março de 2004. Como mencionado acima, outras possibilidades são que um domínio Classe B e/ou Classe C da invenção objeto (correspondentesfragmentos de proteínas de dois domínios da invenção objeto) pode ser sin-teticamente ligado a uma outra proteína TC. Ver, por exemplo, U.S. SerialNo. 60/549 502, depositada em 2 de março de 2004. Como aqui usado, éentendido que ligação de proteínas normalmente separadas ou domínios de proteínas pode ser efetuada como uma conseqüência de tradução de umpolinucleotídeo contendo regiões de seqüência codificante que codifica asseqüências de aminoácidos das proteínas normalmente separadas ou domí-nios de proteínas.

Como aqui usados, os termos "ligante" e "seqüência ligadora" referem-se a nucleotídeos usados para ligar uma primeira região codificantede proteína a uma subseqüente, imeditamente seguinte região codificante deproteína, de modo que ambas primeira e segunda (e/ou subseqüente) regi-ões codificantes de proteína formam uma região codificante de proteína maislonga simples no quadro de leitura +1, como definido pelo quadro de leitura

aberto da primeira região codificante de proteína. Tal ligante ou seqüêncialigadora por isso não pode incluir códons de terminação de tradução no qua-dro de leitura +1. Como uma conseqüência de tradução do ligante ou se-qüência ligadora, a proteína codificada pela primeira região de codificaçãode proteína é ligada por um ou mais aminoácidos à proteína codificada pela segunda região de codificação de proteína. Um ligante é opcional, na medi-da em que os componentes polipeptídeos podem ser ligados diretamente,sem uma seqüência ligadora.

Como aqui usado, referência a polinucleotídeos e/ou proteínas"isolados", e proteínas "purificadas" refere-se a estas moléculas quando elas não estão associadas com as outras moléculas com as quais elas podemser encontradas em natureza. Assim, referência a "isolado" e/ou "purificado"significa o envolvimento da "mão humana" como aqui descrito. Por exemplo,um polinucleotídeo (ou gene) de bactéria ou fungo da presente invenção co-locado em uma planta para expressão é um "polinucleotídeo isolado". Damesma maneira, uma proteína da invenção objeto quando produzida poruma planta é uma "proteína isolada". O termo "ligado" também pode ser u- sado para significar envolvimento da "mão humana". Ou seja, um compo-nente polipeptídeo (tal como uma proteína tipo Tcp1Gz) pode ser sintetica-mente unido ou "ligado" a um outro componente polipeptídeo (tal como umaproteína Classe A) para formação de uma proteína de fusão da invençãoobjeto.

Uma molécula "recombinante" refere-se a uma molécula que foi

recombinada. Quando feita em referência a uma molécula de ácido nucléico,o termo refere-se a uma molécula que é compreendida por seqüências deácidos nucléicos que são ligadas por meio de técnicas biológicas molecula-res. O termo "recombinante" quando feito em referência a uma proteína ou

um polipeptídeo refere-se a uma molécula de proteína que é produzida u-sando uma ou mais moléculas de ácido nucléico recombinante.

O termo "heterólogo" quando feito em referência a uma seqüên-cia de ácidos nucléicos refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que éligada a, ou é manipulada para tornar-se ligada a , uma seqüência de ácido

nucléico à qual não está ligada em natureza, ou à qual está ligada em umalocalização diferente em natureza. O termo "heterólogo" por isso indica quea molécula de ácido nucléico foi manipulada usando engenharia genética,isto é, através de intervenção humana. Assim, um gene da invenção objetopode ser ligado operavelmente a um promotor heterólogo (ou uma "região

reguladora transcricional" que significa uma seqüência de nucleotídeos ca-paz de mediar ou modular transcrição de uma seqüência de nucleotídeos deinteresse, quando a região reguladora transcricional está operavelmente li-gada à seqüência de interesse). Promotores heterólogos preferidos podemser promotores de plantas. Um promotor e/ou uma região reguladora trans-

cricional e uma seqüência de interesse são "operavelmente ligadas" quandoas seqüências são funcionalmente conectadas de modo a permitir transcri-ção da seqüência de interesse a ser mediada ou modulada pela região regu-ladora transcricional. Em algumas modalidades, para ser operavelmente li-gada, uma região reguladora transcricional pode estar localizada no mesmofilamento como a seqüência de interesse. A região reguladora transcricionalpode em algumas modalidades estar localizada 5' da seqüência de interes- se. Em tais modalidades, a região reguladora transcricional pode estar dire-tamente 5' da seqüência de interesse ou podem existir seqüências interveni-entes entre estas regiões. A ligação operável da região reguladora transcri-cional e a seqüência de interesse pode requerer apropriadas moléculas (taiscomo proteínas ativadoras transgênicas) estarem ligadas à região regulado- ra transcricional, a invenção por isso abrange modalidades nas quais taismoléculas são providas, in vitro ou in vivo.

Existe um número de processos para obtenção de proteínas pa-ra uso de acordo com a invenção objeto. Por exemplo, anticorpos para asproteínas aqui mostradas podem ser usados para identificar e isolar outras proteínas a partir de uma mistura. Especificamente, anticorpos podem serelevados para as porções das proteínas que são mais constantes e maisdistintas de outras proteínas. Estes anticorpos então podem ser usados paraespecificamente identificarem proteínas equivalentes com a atividade carac-terística por imunoprecipitação, ensaio imuno-sorvente ligado a enzima (E- LISA), imuno-manchamento. Anticorpos para as proteínas aqui mostradas,ou para proteínas equivalentes, ou para fragmentos destas proteínas, podemser facilmente preparados usando procedimentos padrões. Tais anticorpossão um aspecto da invenção objeto. Proteínas da invenção objeto podem serobtidas de uma variedade de fontes / microorganismos fontes. Aqueles versados na técnica podem facilmente reconhecer que

proteínas (e genes) da invenção objeto podem ser obtidos a partir de umavariedade de fontes. Uma proteína "de" ou "obtenível de" qualquer um dosisolados objetos referidos ou aqui sugeridos significa que a proteína (ou umaproteína similar) pode ser obtida do isolado exemplificado ou alguma outra fonte, tal como uma outra cepa de fungo ou bactéria, ou uma planta (por e-xemplo, uma planta engenheirada para produzir a proteína). "Derivada de"também tem esta conotação, e inclui polinucleotídeos (e proteínas) obtení-veis de um dado tipo de fungo ou bactéria onde o polinucleotídeo é modifi-cado para expressão em uma planta, por exemplo. Aqueles versados natécnica facilmente reconhecerão que, dada a exposição de um gene e prote-ína de micróbio, uma planta pode ser engenheirada para produzir a proteína. Preparações de anticorpos, sondas de ácido nucléico (DNA e RNA), e seme-lhantes podem ser preparadas usando as seqüências de polinucleotídeose/ou aminoácidos aqui mostradas e usadas para selecionar e recuperar ou-tros genes de proteína de outras fontes (naturais).Identificação de Proteínas e Genes da Invenção Objeto.

Proteínas e genes para uso de acordo com a invenção objeto

podem ser identificados e obtidos através de uso de sondas de oligonucleo-tídeos, por exemplo. Estas sondas são seqüências de nucleotídeos detectá-veis que podem ser detectáveis em virtude de um apropriado marcador oupodem ser feitas inerentemente fluorescentes como descrito no pedido inter-

nacional WO 93/16094. As sondas (e os polinucleotídeos da invenção obje-to) podem ser DNA, RNA, ou PNA. Em adição a adenina (A), citosina (C),guanina (G), timina (T, e uracila (U; para moléculas de RNA), sondas sintéti-cas (e polinucleotídeos) da invenção objeto também podem ter inosina (umabase neutra capaz de emparelhar com todas as quatro bases; algumas ve-

zes usada no lugar de uma mistura de todas as quatro bases em sondassintéticas). Assim, onde um oligonucleotídeo degenerado, sintético é aquireferido, e "N" ou "n" é usado genericamente, "N" ou "n" pode ser G, A, T, C,ou inosina. Códigos de ambigüidades como aqui usados são de acordo comconvenções de nomenclatura IUPAC padrão como do depósito do pedido

objeto (por exemplo, R significa A ou G, Y significa C ou T, etc).

Como é bem conhecido na técnica, se uma molécula sonda hi-bridiza com uma amostra de ácido nucléico, pode ser razoavelmente assu-mido que a sonda e amostra têm substancial homologia / similaridade deidentidade. Preferivelmente, hibridização do polinucleotídeo é primeiro con-

duzida seguida por lavagens sob condições de rigorosidade baixa, modera-da ou alta através de técnicas bem conhecidas, como descrito, por exemplo,em Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, NewYork, NY, pp. 169-170. Por exemplo, como ali estabelecido, condições debaixa rigorosidade podem ser obtidas através de primeira lavagem com 2xSSC (Citrato Salino Padrão) / SDS 0,1% (dodecil sulfato de sódio) por 15minutos em temperatura ambiente. Duas lavagens são tipicamente realiza- das. Maior rigorosidade então pode ser obtida através de diminuição de con-centração de sal e/ou através de elevação de temperatura. Por exemplo, alavagem descrita acima pode ser seguida por duas lavagens com SSC 0,1x/SDS 0,1% por 15 minutos cada em temperatura ambiente seguida por sub-seqüentes lavagens com 0,1x SSC/SDS 0,1% por 30 minutos cada a 55°C.

Estas temperaturas podem ser usadas com outros protocolos de hibridiza-ção e lavagem aqui mostrados e como pode ser conhecido por aqueles ver-sados na técnica (SSPE pode ser usado como o sal ao invés de SSC, porexemplo). A 2x SSC/SDS 0,1% pode ser preparada através de adição de 50ml_ de 20x SSC e 5 ml_ de SDS 10% a 445 ml_ de água. 20x SSC pode ser

preparado através de combinação de NaCI (175,3 g/0,150 M), citrato de só-dio (88,2 g/0,015 M), e água, ajustando pH para 7,0 com NaOH 10 N, entãoajustando o volume para 1 litro . SDS 10% pode ser preparado através dedissolução de 10 g de SDS em 50 ml_ de água autoclavada, então diluindopara 100 mL.

Detecção da sonda prove um meio para determinar em uma

maneira conhecida se hibridização foi mantida. Uma tal análise de sondaprove um processo rápido para identificação de genes codificando toxina dainvenção objeto. Os segmentos de nucleotídeos que são usados como son-das de acordo com a invenção podem ser sintetizados usando um sintetiza-

" dor de DNA e procedimentos padrões. Estas seqüências de nucleotídeostambém podem ser usadas como iniciadores de PCR para amplificação degenes da invenção objeto.

Hibridização com um dado polinucleotídeo é uma técnica quepode ser usada para identificar, encontrar, e/ou definir proteínas e genes da

invenção objeto. Como aqui usadas, condições "rigorosas" para hibridizaçãoreferem-se a condições que obtêm o mesmo, ou cerca de mesmo grau deespecificidade como as condições empregadas pelos atuais requerentes.Especificamente, hibridização de DNA imobilizado sobre Southern blots comsondas específicas de gene marcadas com 32P foi realizada através de pro-cessos padrões (ver, por exemplo, Maniatis, T. E.F. Fritsch, J. Sambrook[1982] Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY). Em geral, hibridização e subseqüentes lava-gens foram realizadas sob condições que permitiram detecção de seqüên-cias alvos. Para sondas de gene de DNA de filamento duplo, hibridização foirealizada por toda a noite a 20-25°C abaixo de temperatura de fusão (Tm) dohíbrido DNA em 6x SSPE, %x solução de Denhardt, SDS 0,1%, DNA desna- turado 0,1 mg/mL. A temperatura de fusão é descrita pela seguinte fórmula(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, PT. Cherbas, e F.C. Kafatos [1983]Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Acade-mic Press, New York 100:266-285):

1) Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,61 (% for- mamida) - 600/comprimento de dúplex em pares de bases.

2) Lavagens são tipicamente realizadas como se segue:

3) Duas vezes em temperatura ambiente por 15 minutos em 1xSSPE, SDS 0,1% (lavagem de baixa rigorosidade).

4) Uma vez em Tm-20°C por 15 minutos em 0,2x SSPE, SDS 0,1% (lavagem de rigorosidade moderada).

Para sondas de oligonucleotídeos, hibridização foi realizada portoda noite a 10-20°C abaixo de temperatura de fusão (Tm) do híbrido 6xSSPE, 5x solução de Denhardt, SDS 0,1%, DNA desnaturado 0,1 mg/mL.Tm para sondas de oligonucleotídeos foi determinada pela seguinte fórmula: Tm (°C) = 2(número de pares de bases T/A) + 4(número de pares de basesG/C) (Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura, eR.B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D.Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

Lavagens foram tipicamente realizadas como se segue: 1) Duas vezes em temperatura ambiente por 15 minutos 1x SS-

PE, SDS 0,1% (lavagem de baixa rigorosidade).

2) Uma vez na temperatura de hibridização por 15 minutos em1x SSPE, SDS 0,1% (lavagem de rigorosidade moderada).

Em geral, sal e/ou temperatura podem ser alterados para mu-dança de rigorosidade. Com um fragmento de DNA marcado >70 ou tantasbases de comprimento, as seguintes condições podem ser usadas:5 Baixa: 1 ou 2x SSPE, temperatura ambiente

Baixa: 1 ou 2x SSPE, 42°C

Moderada: 0,2x ou 1 x SSPE, 65°C

Alta: 0,1xSSPE, 65°C.

Formação de dúplex e estabilidade dependem de substancial

complementaridade entre os dois filamentos de um híbrido, e, como notadoacima, um certo grau de desemparelhamento pode ser tolerado. Por isso, asseqüências de sonda da invenção objeto incluem mutações (ambas, simplese múltiplas), supressões, inserções das seqüências descritas, e suas combi-nações, onde as ditas mutações, inserções e supressões permitem forma-

ção de híbridos estáveis com o polinucleotídeo alvo de interesse. Mutações,inserções, e supressões podem ser produzidas em uma dada seqüência depolinucleotídeos em muitas maneiras, e estes processos são conhecidos poraqueles versados na técnica. Outros processos podem se tornar conhecidosno futuro.

Tecnologia PCR.

Reação de cadeia polimerase (PCR) é uma síntese iniciada, en-zimática, repetitiva, de uma seqüência de ácido nucléico. Este procedimentoé bem conhecido e comumente usado por aqueles versados na técnica (verMullis, patente US 4 683 195, 4 683 202, e 4 800 159; Saiki, Randall K., Ste-

"25 phen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich,Norman Arnheim [1985] "enzymatic Amplification of p-Globin Genomic Se-quences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia",Science 230:1350-1354). PCR é baseada na amplificação enzimática de umfragmento de DNA de interesse que é flanqueado por dois iniciadores oligo-

30 nucleotídeos que hibridizam para fitas opostas da seqüência alvo. Os inicia-dores são orientados com as extremidades 3' apontando na direção um dooutro. Repetidos ciclos de desnaturação térmica do molde, anelamento dosiniciadores para suas seqüências complementares, e expressão dos inicia-dores anelados com uma DNA polimerase resulta na amplificação do seg-mento definido pelas extremidades 5'dos iniciadores de PCR. O produto deextensão de cada iniciador pode servir como um molde para o outro inicia- dor, de modo que cada ciclo essencialmente dobre a quantidade de frag-mentos de DNA produzida no ciclo anterior. Isto resulta na acumulação ex-ponencial do fragmento alvo específico, até vários milhões de vezes empoucas horas. Através do uso de uma DNA polimerase termoestável tal co-mo Taq polimerase, isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, o processo de amplificação pode ser completamente automatizado. Outrasenzimas que podem ser usadas são conhecidas por aqueles versados natécnica.

As seqüências de DNA da invenção objeto podem ser usadascomo iniciadores para amplificação PCR. Na modalidade de amplificação

PCR, um certo grau de desemparelhamento pode ser tolerado entre iniciadore molde. Por isso, mutações, supressões, e inserções (especialmente adi-ções de nucleotídeos à extremidade 5") dos iniciadores exemplificados caemdentro do escopo da invenção objeto. Mutações, inserções, e supressõespodem ser produzidas em um dado iniciador através de processos conheci-

dos por aqueles versados na técnica.Modificação de Genes e Proteína.

Os genes e proteínas úteis de acordo com a invenção objetoincluem não somente as seqüências de inteiro comprimento exemplificadasespecificamente, mas também porções, segmentos e/ou fragmentos (inclu-

indo supressões internas e/ou terminais comparadas às moléculas de inteirocomprimento) destas seqüências, variantes, mutantes, quiméricos, e suasfusões. Proteínas usadas na invenção objeto podem ter aminoácidos substi-tuídos tanto quanto elas retenham a característica atividade pesticida / fun-cional das proteínas especificamente aqui exemplificadas. Genes "variantes"

têm seqüências de nucleotídeos que codificam as mesmas proteínas ou pro-teínas equivalentes tendo funcionalidade equivalente a uma proteína exem-plificada. Os termos "proteínas variantes" e "proteínas equivalentes" refe-rem-se a proteínas tendo a mesma ou essencialmente a mesma atividadebiológica / funcional como as proteínas exemplificadas. Como aqui usado,referência a uma seqüência "equivalente" refere-se a seqüências tendosubstituições, supressões, adições, ou inserções de aminoácidos que aper- feiçoam ou não afetam adversamente funcionalidade. Fragmentos retendofuncionalidade também são incluídos nesta definição. Fragmentos e outrosequivalentes que retêm a mesma ou similar função, como um corresponden-te fragmento de uma proteína exemplificada estão dentro do escopo da in-venção objeto. Mudanças, tais como substituições ou adições de aminoáci-

dos, podem ser feitas para uma variedade de propósitos, como aumento (oudiminuição) de estabilidade de protease da proteína (sem diminuição materi-al / substancial de funcionalidade da proteína).

Variações de genes podem ser facilmente construídas usandotécnicas padrões para fabricação de mutações de ponto, por exemplo. Em

adição, patente US 5.605.793, por exemplo, descreve processos para gera-ção de adicional diversidade molecular através de uso de remontagem deDNA após fragmentação randômica. Genes variantes podem ser usadospara produção de proteínas variantes; hospedeiros recombinantes podemser usados para produção de proteínas variantes. Usando estas técnicas de

"embaralhamento de gene", genes equivalentes e proteínas podem serconstruídos eu compreendem 5, 10, ou 20 resíduos contíguos (aminõácidoou nucleotídeo) de qualquer seqüência aqui exemplificada.

Fragmentos de genes de inteiro comprimento podem ser feitosusando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de a- cordo com procedimentos padrões. Por exemplo, enzimas como Bal31 oumutagênese direcionada a sítio pode ser usada para sistematicamente cortarnucleotídeos a partir das extremidades destes genes. Também, genes quecodificam fragmentos ativos podem ser obtidos usando uma variedade deenzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para obtenção direta de fragmentos ativos destas proteínas.

Está dentro do escopo da invenção como aqui mostrada queproteínas TC podem ser truncadas e ainda reterem atividade funcional. Por"proteína truncada" é pretendido que uma porção de uma proteína pode serclivada e ainda exibir atividade após clivagem. Clivagem pode ser obtida porproteases dentro ou fora do intestino de inseto. Além disso, proteínas efeti-vamente clivadas podem ser produzidas usando técnicas de biologia mole- cular onde as bases de DNA codificando a dita proteína são removidas atra-vés de digestão com endonucleases de restrição ou outras técnicas disponí-veis para aqueles versados. Após truncação, as ditas proteínas podem serexpressas em sistemas heterólogos como Escherichia coli, baculovírus, sis-temas virais baseados em plantas, levedura e semelhantes e então coloca- dos em ensaios de insetos como aqui mostrado para determinar atividade. Ébem conhecido na técnica que proteínas truncadas podem ser produzidascom sucesso de modo que elas retenham atividade funcional enquanto ten-do menos que a seqüência de comprimento inteiro, total. É bem conhecidona técnica que toxinas B.t. podem ser usadas em uma forma truncada (toxi-

na núcleo). Ver, por exemplo, Adang et al., Gene 36:289-300 (1985), "Char-acterized full-length and truncated plasmid clones of the crystal protein ofBacillus thuringiensis subsp kurstaki HD-73 and their toxicity to Manducasexta". Existem outros exemplos de proteínas truncadas que retêm atividadeinseticida, incluindo a esterase hormônio juvenil de inseto (patente US 5 674

20 485 para Regents of the University of Califórnia). Como aqui usado, o termo"toxina" é também pretendido incluir truncações funcionalmente ativas.

Devido à degenerescência / redundância do código genético,uma variedade de diferentes seqüências de DNA podem codificar as se-qüências de aminoácidos aqui mostradas. Está dentro do conhecimento da- queles versados na técnica criar seqüências de DNA que codificam as mes-mas, ou essencialmente as mesmas, toxinas. Estas seqüências de DNA va-riantes estão dentro do escopo da invenção objeto.

A invenção objeto inclui, por exemplo:

1) proteínas obtidas de organismos tipo selvagem; 2) variantes surgindo de mutações;

3) variantes designadas através de fabricação de substituiçõesconservativas de aminoácidos; e4) variantes produzidas por fragmentação randômica e remonta-gem de uma pluralidade de diferentes seqüências que codificam as proteí-nas TC objetos (embaralhamento de DNA). Ver, por exemplo, patente US 5605 793.

As seqüências de DNA codificando as proteínas objetos podem

ser seqüências tipo selvagem, seqüências mutantes, ou seqüências sintéti-cas designadas para expressarem uma proteína predeterminada. Seqüên-cias de DNA designadas para serem altamente expressas em plantas atra-vés de, por exemplo, evitação de sinais de poliadenilação, e usando códons

preferidos de plantas, são particularmente úteis.

Certas proteínas e genes foram aqui especificamente exemplifi-cados. Na medida em que estas proteínas e genes são meramente exempla-res, deve ser facilmente aparente que a invenção objeto compreende uso deproteínas equivalentes ou variantes (e seqüências de nucleotídeos codifi-

cando seus equivalentes) tendo a mesmo ou similar funcionalidade como asproteínas exemplificadas. Proteínas equivalentes terão similaridade de ami-noácido (e/ou homologia) com uma proteína TC exemplificada. Polinucleotí-deos e proteínas preferidos da invenção objeto podem ser definidas em ter-mos de faixas de identidade e/ou similaridade mais estreitas. Por exemplo, a

identidade e/ou similaridade da proteína TC Classe A, B e/ou C pode ser 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99%comparada a uma seqüência aqui exemplificada ou sugerida e, a identidade

" e/ou similaridade da proteína TC Classe C pode ser 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99%comparada a uma seqüência aqui exemplificada ou sugerida. Qualquer nú-

mero listado acima pode ser usado para definir os limites superior e inferior.Por exemplo, uma proteína da invenção objeto pode ser definida como tendo50-90% de identidade, por exemplo, com uma proteína exemplificada.A menos que de outro modo especificado, como aqui usado,porcentagem de identidade e/ou similaridade de seqüência de dois ácidosnucléicos é determinada usando o algoritmo de Karlin and Altschul (1990),Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin andAltschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Um tal algoritmo éincorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990), J.Mol. Biol. 215:402-410. Pesquisas de nucleotídeos BLAST são realizadascom o programa BLAST, escore = 100, comprimento de palavra = 12.BLAST com folga pode ser usado como descrito em Altschul et al. (1997), Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Quando utilizando programas BLAST eBLAST com folga, os parâmetros default dos respectivos programas (N-BLAST e XBLAST) são usados. Ver website NCBI/NIH. Os escores tambémpodem ser calculados usando os processos e algoritmos de Crickmore et al.,como descrito na seção de ANtecedentes, acima. Para obtenção de alinhamentos com folga para propósitos de

comparação, a função AlignX de Vector NTI Suíte 8 (InforMax, Inc., NorthBethesda, MD, U.S.A.) foi usado empregando os parâmetros default. Estesforam: uma penalidade de abertura de folga de 15, uma penalidade de ex-tensão de folga de 6,66, e uma faixa de penalidade de separação de folga de 8. Duas ou mais seqüências podem ser alinhadas e comparadas destamaneira ou usando outras técnicas que são bem conhecidas. Através deanálise de tais alinhamentos, áreas relativamente conservadas e não-conservadas dos polipeptídeos objetos podem ser identificadas. Isto podeser útil para, por exemplo, avaliação de mudança de uma seqüência de poli-peptídeos através de modificação ou substituição de um ou mais resíduos deaminoácidos pode ser esperada ser tolerada.

A homologia / similaridade / identidade dé aminoácido será tipi-camente (mas não necessariamente) mais alta em regiões da proteína quesão responsáveis por sua atividade ou que estão envolvidas na determina- ção de configurações tridimensionais que são por último responsáveis pelaatividade. Neste sentido, certas substituições de aminoácidos são aceitáveise podem ser esperadas serem toleradas. Por exemplo, estas substituiçõespodem estar em regiões da proteína que não são críticas para atividade. A-nálise de estrutura de cristal de uma proteína, e modelagem de estrutura deproteína baseada em software, podem ser usados para identificação de re-giões de uma proteína que podem ser modificadas (usando mutagênese di- recionada a sítio, embaralhamento, etc.) para realmente alterar as proprie-dades e/ou aumentar a funcionalidade da proteína.

Várias propriedades e características tridimensionais da proteínatambém podem ser alteradas sem afetar adversamente a atividade / funcio-nalidade de toxina da proteína. Substituições consèrvativas de aminoácidos

podem ser esperadas serem toleradas / não afetando adversamente a confi-guração tridimensional da molécula. Aminoácidos podem ser colocados nasseguintes classes: não-polar, polar não-carregado, básico, e ácido. Substitu-ições consèrvativas onde um aminoácido de uma classe é substituído comum outro aminoácido do mesmo tipo caem dentro do escopo da invenção

objeto tanto quanto a substituição não seja adversa para a atividade biológi-ca do composto. A Tabela 1 prove uma listagem de exemplos de aminoáci-dos pertencendo a cada classe.

Tabela 1. Classes de aminoácidos<table>table see original document page 29</column></row><table>

Em alguns exemplos, substituições não-conservativas também

■ podem ser feitas. O fator crítico é que estas substituições não devem preju-dicar significantemente a atividade funcional / biológica / toxina da proteína.

Proteínas TC equivalentes e/ou genes codificando estas proteí-nas equivalentes podem ser obtidas / derivadas de bactérias tipo selvagemou recombinante e/ou a partir de outros organismos tipo selvagem ou re-

combinante usando as técnicas aqui providas. Várias espécies de fungos ebactérias podem ser agora usadas como fontes isoladas, como aqui mostra-do.Otimização de seqüência para expressão em organismos heteróloqos

Para obter alta expressão de genes heterólogos em plantas, porexemplo, pode ser preferido re-engenheirar os ditos genes de modo que elessejam mais eficientemente expressos em células de plantas. Milho é uma tal planta onde pode ser preferido redesenhar o gene(s) heterólogo antes detransformação para aumento de seu nível de expressão na dita planta. Porisso, uma etapa adicional no projeto de genes codificando uma toxina bacte-rial ou de fungo, por exemplo, é reengenheirar um gene heterólogo para óti-ma expressão em um diferente tipo de organismo. Orientação com relação à produção de genes sintéticos que são otimizados para expressão de plantapode ser encontrada em, por exemplo, patente US 5 380 831. Uma seqüên-cia otimizada para expressão em E. coli é também exemplificada, como dis-cutido nos Exemplos abaixo.Hospedeiros Transgênicos.Os genes codificando proteínas de Complexo Toxina da inven-

ção objeto podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeirosmicrobiais ou plantas. Em modalidades preferidas, células de plantas trans-gênicas e plantas são usadas. Plantas (e células de plantas) preferidas sãomilho, algodão, canola, girassol, e soja. Em modalidades preferidas, expressão do gene resulta, direta

ou indiretamente, na produção (e manutenção) intracelular da proteína. Plan-tas podem ser tornadas resistentes a insetos desta maneira. Quando célulashospedeiras transgênicas / recombinantes / transformadas / transfectadas(ou seus conteúdos) são ingeridas pelas pestes, as pestes ingerirão a toxina.Esta é a maneira preferida para causar contato da peste com a toxina. Oresultado é controle (morte ou tornando doente) da peste. Pestes que sugamtambém podem ser controladas desta maneira. Alternativamente, apropria-dos hospedeiros microbiais, por exemplo, Pseudomonas como P. fluores-cens, podem ser aplicadas onde pestes alvos estão presentes; o micróbiospodem ali proliferar, e são ingeridos pelas pestes alvos. O micróbio hospe-dando o gene de toxina pode ser tratado sob condições que prolongam aatividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, que retém a ativi-dade tóxica, então pode ser aplicada ao ambiente da peste alvo. A invençãoobjeto também inclui a administração de uma combinação de células, comalgumas células expressando um o mais tipos de proteínas e outras célulasexpressando outros tipos de proteínas (tal como algumas células produzindo proteínas toxina Classe A e outras células produzindo proteínas tipo Tcp1gz"potencializantes" da presente invenção, por exemplo).

Onde o gene de toxina é introduzido via um vetor apropriado emum hospedeiro microbial, e o dito hospedeiro é aplicado ao ambiente em umestado vivo, certos micróbios hospedeiros devem ser usados. Hospedeiros

microorganismos são selecionados os quais são conhecidos ocuparem a"fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, e/ou rizoplano) de uma ou mais co-lheitas de interesse. Estes microorganismos são selecionados de modo aserem capazes de competirem com sucesso no particular ambiente (colheitaou outros habitats de insetos) com os microorganismos tipo selvagem, pro-

porcionarem estável manutenção e expressão do gene expressando o pesti-cida polipeptídeo, e, desejavelmente, provêm aperfeiçoada proteção do pes-ticida de degradação ambiental e inativação.

Um grande número de microorganismos são conhecidos habita-rem o filoplano (a superfície das folhas de plantas) e/ou a rizosfera (o solo

circundando raízes de plantas) de uma ampla variedade de importantes co-lheitas. Estes microorganismos incluem bactérias, algas, e fungos. De parti-cular interesse são microorganismos, tais como bactérias, por exemplo, gê-neros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomy-ces, Rhizobium, RhodoPseudomonas, Methylophilus, Agrobacterium, Aceto-

" bacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes;fungos, particularmente levedura, por exemplo, gêneros Saccharomyces,Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasi-dium. De particular interesse são tais espécies bacteriais fitosferacomoPseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens,

Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodo Pseudomonas s-pheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium meliloti, Alcaligenes entro-phus, e Azotobacter vinelandii; e espécies de levedura de fitosfera comoRhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albi-dus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cere-visiae, Sporobolomyces roseus, S, odorus, Kluyveromyces veronae, e Aure-obasidium pollulans. Também de interesse são microorganismos pigmenta-dos.

Inserção de genes para formar hospedeiros transqênicos.

Um aspecto da invenção objeto é a transformação / transfecçãode plantas, células de plantas, e outras células hospedeiras com polinucleo-tídeos da invenção objeto que expressam proteínas da invenção objeto.

Plantas transformadas desta maneira podem ser tornadas resistentes a ata-que pela peste(s) alvo.

Uma ampla variedade de processos são disponíveis para intro-dução de um gene codificando uma proteína no hospedeiro alvo sob condi-ções que permitem estável manutenção e expressão do gene. Estes proces-sos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos,por exemplo, na patente US 5 135 867.

Por exemplo, um grande número de vetores de clonagem com-preendendo um sistema de replicação em E. colie um marcador que permiteseleção das células transformadas são disponíveis para preparação para

inserção de genes estranhos em plantas superiores. Os vetores compreen-dem, por exemplo, pBR322, séries pUC, séries M13mp, pACYC184, etc. Damesma maneira, a seqüência codificando a toxina pode ser inserida no vetorem um apropriado sítio de restrição. O resultante plasmídeo é usado paratransformação em E. coli. As células de E. colisão cultivadas em um apro- priado meio nutriente, então colhidas e lisadas. O plasmídeo é recuperado.Análises de seqüência, análises de restrição, eletroforese, e outros proces-sos biológicos bioquímicos - moleculares são genericamente realizados co-mo processos de análises. Após cada manipulação, a seqüência de DNAusada pode ser clivada e ligada à seqüência de DNA seguinte. Cada se- qüência de plasmídeo pode ser clonada no mesmo ou outros plasmídeos.Dependendo do processo de inserção de genes desejados na planta, outrasseqüências de DNA podem ser necessárias. Se, por exemplo, o plasmídeoTi ou Ri é usado para a transformação da célula de planta, então pelo menosa borda direita, mas freqüentemente a borda direita e esquerda do DNA-Tplasmídeo Ti ou Ri, tem de ser ligada como a região flanqueante dos genesa serem inseridos. O uso de DNA-T para a transformação de células de plantas foi intensivamente pesquisada e descrita em EP 120 516; Hoekema(1985) em: The binary plant vector system, Offset-durkkerij Kanters B.V.,Alblasserdam, Chapter 5; Fraley et al., Crit. Ver. Plant Sei. 4:1-46; e Na et al.(1985) EMBO J. 4:277-287.

Um grande número de técnicas são disponíveis para inserção de

DNA em uma célula de planta hospedeira. Aquelas técnicas incluem tran-sormação com DNA-T usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacteriumrhizogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolísticas (bom-bardeio com micro-partícula), ou eletroporação assim como outros proces-sos possíveis. Se Agrobacterium é usado para a transformação, o DNA a ser

inserido tem de ser clonado em plasmídeos especiais, por exemplo em umvetor intermediário ou em um vetor binário. Os vetores intermediários podemser integrados no plasmídeo Ti ou Ri através de recombinação homólogadevido a seqüências que são homólogas a seqüências no DNA-T. O plasmí-deo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferên-

cia do DNA-T. Vetores intermediários não podem se replicar em Agrobacte-rium. O vetor intermediário pode ser transferido em Agrobacterium tumefaci-ens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Vetores binários po-dem se repplicar em E. colie em Agrobacterium. Eles compreendem um ge-ne marcador de seleção e um ligante ou poli-ligante que estão em estrutura

' através de regiões de borda direita e esquerda de DNA-T. Eles podem sertransformados diretamente em Agrobacterium (Holsters et al. [1978] Mol.Gen. Genet. 163:181-187). O agrobacterium usado como célula hospedeiraé para compreender um plasmídeo carreando uma região vir. A região vir énecessária para a transferência do DNA-T na célula de planta. Adicional

DNA-T pode ser contido. A bactéria assim transformada é usada para atransformação de células de plantas. Explantes de plantas podem ser vanta-josamente cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhi-zogenes para a transferência do DNA na célula de planta. Plantas inteirasentão podem ser regeneradas a partir do material de planta infectado (porexemplo, peças de folhas, segmentos de caule, raízes, mas também proto-plastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio apropriado, que pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. As plantas assim obtidasentão podem ser testadas para a presença do DNA inserido. Nenhuma de-manda especial é feita dos plasmídeos no caso de injeção e eletroporação.É possível usar plasmídeos comuns, tais como, por exemplo, derivados depUC. As células transformadas crescem dentro das plantas na manei-

ra usual. Elas podem formar células germes e transmitir a característica(s)transformada para plantas de progênie. Tais plantas podem ser crescidas namaneira normal e cruzadas com plantas que têm os mesmos fatores heredi-tários transformados ou outros fatores hereditários. Os resultantes indivíduos

híbridos têm as correspondentes propriedades fenotípicas.

Em algumas modalidades preferidas da invenção, genes codifi-cando a toxina são expressos a partir de unidades transcricionais inseridasno genoma de planta. Preferivelmente, as ditas unidades transcricionais sãovetores recombinantes capazes de integração estável no genoma de planta e permitirem seleção de linhas de plantas transformadas expressandoRNAm codificando as proteínas.

Uma vez o DNA inserido tenha sido integrado no genoma, ele érelativamente estável ali (e não sai novamente). Ele normalmente contémum marcador de seleção que confere sobre as células de planta transforma-das resistência a um biocida ou um antibiótico, como canamicina, G418, ble-omicina, higromicina, ou cloranfenicol, inter alia. O marcador empregado in-dividualmente da mesma maneira deve permitir a seleção de células trans-formadas antes que células que não contêm o DNA inserido. O gene(s) deinteresse são preferivelmente expressos tanto por promotores constitutivosou induzíveis na célula de planta. Uma vez expresso, o RNAm é traduzidoem proteínas, pelo que incorporando aminoácidos de interesse em proteína.Os genes codificando uma toxina expressa nas células de planta podem es-tar sob o controle de um promotor constitutivo, um promotor específico detecido, ou um promotor induzível.

Várias técnicas existem para introdução de vetores recombinan-tes estranhos em células de plantas, e para obtenção de plantas que man- têm e expressam estavelmente o gene introduzido. Tais técnicas incluem aintrodução de material genético revestido sobre micropartículas diretamenteem células (patentes US 4 945 050 para Cornell e 5 141 131 para DowElan-co, agora Dow AgroSciences, LLC). Em adição, plantas podem ser transfor-madas usando tecnologia de Agrobacterium, ver patente US 5 177 010 para

University of Toledo; 5 104 310 para Texas A&M; pedido de patente EP0131624B1; pedidos de patente EP 120515, 159418B1 e 176 112 para S-chilperoot; patente US 5 149 645, 5 469 976, 5 464 763, e 4 940 838 e 4 693976 para Schilperoot; pedidos de patente EP 116718, 290799, 320500 todospara Max Planck; pedidos de patente EP 604662 e 627752, e patente US 5

591 616, para Japan Tobacco; pedidos de patente EP 0267159 e 0292435, epatente US 5 231 019, todas para Ciba Geigy, agora Novartis; patentes US 5463 174 e 4 762 785, ambas para Clagene; e patentes US 5 004 863 e 5 159135, ambas para Agracetus. Outra tecnologia de transformação inclui tecno-logia barbas (whiskers). Ver patentes US 5 302 523 e 5 464 765, ambas pa-

ra Zeneca. Tecnologia de eletroporação também tem sido usada para trans-formar plantas. Ver WO 87/06614 para Boyce Thompson Institute; patenteUS 5 472 869 e 5 384 253, ambas para Dekalb; e WO 92/09696 e WO93/21335, ambas para Plant Genetic Systems. Além disso, vetores viraistambém podem ser usados para produção de plantas transgênicas produ-

' zindo a proteína de interesse. Por exemplo, planta monocotiledônea podeser transformada com um vetor viral usando os processos descritos na pa-tente US 5 569 597 para Mycogen Plant Science e Ciba-Geigy, agora Novar-tis, assim como patentes US 5 589 367 e 5 316 931, ambas para Biosource.

Como mencionado anteriormente, a maneira na qual o construc-

to de DNA é introduzido no hospedeiro planta não é crítica para esta inven-ção. Qualquer processo que proporcione eficiente transformação pode serempregado. Por exemplo, vários processos para transformação de célula deplanta são aqui descritos e incluem o uso de plasmídeos Ti ou Ri e seme-lhantes para realizar transformação mediada por Agrobacterium. Em muitosexemplos, será desejável ter a construção usada para transformação combordas em um ou ambos os lados por bordas de DNA-T, mais especifica- mente a borda direita. Isto é particularmente útil quando a constructo usaAgrobacterium tumefacines ou Agrobacterium rhizogenes como um modopara transformação, embora bordas de DNA-T possam encontrar uso comoutros modos de transformação. Onde Agrobacterium é usado para trans-formação de célula de planta, um vetor pode ser usado que pode ser intro-

duzido no hospedeiro para recombinação homóloga com DNA-T ou o plas-mídeo Ti ou Ri presente no hospedeiro. Introdução do vetor pode ser reali-zada via eletroporação, acasalamento parental e outras técnicas para trans-formação de bactérias gram-negativas que são conhecidas por aqueles ver-sados na técnica. A maneira de transformação de vetor no hospedeiro Agro-

bacterium não é crítica para esta invenção. O plasmídeo Ti ou Ri contendo oDNA-T para recombinação pode ser capaz ou incapaz de causar formaçãode galha, e não é crítico para a dita invenção tanto quanto os genes vir este-jam presentes no dito hospedeiro.

Em alguns casos onde Agrobacterium é usado para transforma-

20 ção, o constructo de expressão estando dentro de bordas de DNA-T seráinserida em um vetor de espectro amplo como pRK2 ou seus derivados co-mo descrito em Ditta et al., (PNAS USA (1980) 77:7347-7351 e EPO 0 120515, que são aqui incorporadas por referência. Incluídos no constructo de

r

expressão e o DNA-T serão um ou mais marcadores como aqui descritos25 que permitem seleção de Agrobacterium transformado e células de plantastransformadas. O particular marcador empregado não é essencial para estainvenção, com o marcador preferido dependendo de hospedeiro e constru-ção usada.

Para transformação de células de plantas usando Agrobacteri-30 um, explantes podem ser combinados e incubados com o Agrobacteriumtransformado por tempo suficiente para permitir sua transformação. Apóstransformação, os Agrobacterium são mortos através de seleção com o a-propriado antibiótico e células de plantas são cultivadas com o apropriadomeio seletivo. Uma vez calli sejam formados, formação de broto pode serencorajada através de emprego de apropriados hormônios de plantas deacordo com processos bem conhecidos na técnica de cultura de tecido deplanta e regeneração de planta. Entretanto, um estágio intermediário de calonão é sempre necessário. Após formação de broto, as ditas células de plantapodem ser transferidas para meio que encoraja formação de raiz pelo quecompletando regeneração de planta. As plantas então podem ser crescidaspara semente e a dita semente pode ser usada para gerações futuras. Inde- pendente de técnica de transformação, o gene codificando uma toxina é pre-ferivelmente incorporado em um vetor de transferência de gene adaptadopara expressar o dito gene em uma célula de planta através de inclusão novetor de um elemento regulador de promotor de planta, assim como regiõesde terminação de transcrição não-traduzidas 3' como Nos e semelhantes. Em adição a numerosas tecnologias para transformação de

planta, o tipo de tecido que é contatado com os genes estranhos tambémpode variar. Tal tecido pode incluir mas não é limitado a tecido embriogêni-co, tecido de calo tipos I, II e III, hipocótilo, meristema, tecido de raiz, tecidospara expressão em floema, e semelhantes. Quase todos os tecidos de plan- ta podem ser transformados durante desdiferenciação usando apropriadastécnicas aqui descritas.

Como mencionado acima, uma variedade de marcadores sele-cionáveis podem ser usados, se desejado. Preferência por um particularmarcador está no discernimento do técnico, mas qualquer um dos seguintesmarcadores selecionáveis pode ser usado junto com qualquer outro genenão listado aqui que possa funcionar como um marcador selecionável. Taismarcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a, gene aminogli-cosídeo fosfotransferase de transposon Tn5 (Aph II) que codifica resistênciaaos antibióticos canamicina, neomicina e G418, assim como aqueles genes que codificam para resistência ou tolerância a glifosato; higromicina; meto-trexato; fosfinotricina (bialafos); imidazolinonas, sulfonil uréias e herbicidastriazol pirimidina tais como clorsulfuron; bromoxinil, dalapon e semelhantes.Em adição a um marcador selecionável, pode ser desejável usarum gene repórter. Em alguns exemplos um gene repórter pode ser usadocom ou sem um marcador selecionável. Genes repórteres são genes quetipicamente não estão presentes no organismo ou tecido receptor e tipica- mente codificam proteínas resultando em alguma mudança fenotípica oupropriedade enzimática. Exemplos de tais genes são providos em K. Wisinget al. Ann. Ver. Genetics, 22, 421 (1988). Genes repórteres preferidos inclu-em o beta-glucuronidase (GUS) do locus uidA de E.coli, o gene cloranfenicolacetil transferase de Tn9 de E. coli. A proteína fluorescente verde da água-

viva bioluminescente Aequora Victoria, e os genes luciferase de vaga-lumePhotins pyralis. Um ensaio para detecção de expressão de gene repórterpode ser então realizado em um momento apropriado após o dito gene tersido introduzido em células receptoras. Um tal ensaio preferido acarreta ouso do gene codificando beta-glucuronidase (GU) do locus uidA de E. coli

como descrito por Jefferson et al., (1987, Biochem. Soe. Trans. 15, 17-19)para identificar células transformadas.

Em adição a elementos reguladores de promotores de planta,elementos reguladores de promotor a partir de uma variedade de fontes po-dem ser usados eficientemente em células de plantas para expressão de

genes estranhos. Por exemplo, elementos reguladores de promotores deorigem bacterial, como promotor de octopina sintase, o promotor nopalinasintase, o promotor manopina sintase; promotores de origem viral, como ovírus mosaico de couve-flor (35S e 19S), 35T (que é um promotor 35S reen-genheirado, ver patente US 6 166 302, especialmente Exemplo 7E) e seme-

lhantes podem ser usados. Elementos reguladores de promotor de plantaincluem mas não são limitados a subunidade pequena (ssu) de ribulose-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilase, promotor beta-conglicinina, promotor beta-faseolina, promotor ADH, promotores de choque - térmico, e promotoresespecíficos de tecido. Outros elementos tais como regiões de ligação de ma-

triz, regiões de ligação de tablado, introns, aperfeiçoadores, seqüências depoliadenilação e semelhantes podem estar presentes e assim podem aper-feiçoar a eficiência de transcrição ou integração de DNA. Tais elementospodem ou não ser necessários para função de DNA, embora eles possamprover melhor expressão ou funcionamento do DNA através de afetação detranscrição, estabilidade de RNAm, e semelhantes. Tais elementos podemser incluídos no DNA como desejado para obter performance ótima do DNA transformado na planta. Elementos típicos incluem mas não são limitados aAdh-intron 1, Adh-intron 6, a seqüência líder de proteína de revestimento devírus mosaico alfalfa, a seqüência líder de proteína de revestimento de vírusde risca de milho, assim como outros disponíveis para um técnico versado.Elementos reguladores de promotor constitutivo também podem ser usados

pelo que direcionando contínua expressão de gene em todos os tipos decélulas e em todos os momentos (por exemplo, actina, ubiquitina, CaMV35S, e semelhantes). Elementos reguladores de promotor específico de teci-do são responsáveis por expressão de gene em específicos tipos de tecidoou célula, tais como as folhas ou sementes (por exemplo, zeína, oleosina,

napina, ACP, globulina e semelhantes) e estes também podem ser usados.

Elementos reguladores de promotores também podem ser ativosdurante um certo estágio do desenvolvimento de planta assim como ativosem tecidos e órgãos de plantas. Exemplos de tais incluem, mas não são limi-tados a, elementos reguladores de promotor específico de pólen, específico

de embrião, específico de seda de milho, específico de fibra de algodão, es-pecífico de raiz, específico de endosperma de semente e semelhantes. Sobcertas circunstâncias pode ser desejável usar um elemento regulador depromotor induzível, que é responsável por expressão de genes em respostasa um específico sinal, tal como: estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RUBP carboxilase), hormônio (Em), metabólitos, químico, e tensão. Ou-tros elementos de tradução e transcrição desejáveis que funcionam em plan-tas podem ser usados. Numerosos vetores de transferência de gene especí-ficos de plantas são conhecidos na técnica.

Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para

clonar e seqüenciar os genes (e toxinas) aqui descritos. Adicional informa-ção pode ser encontrada em Sambrook, J., Fritsch, E.F., e Maniatis, T.(1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,que é aqui incorporado por referência.Gerenciamento de Resistência.

Com crescente uso comercial de proteínas inseticidas em plan-tas transgênicas, uma consideração é gerenciamento de resistência. Ou se- ja, existem numerosas companhias usando toxinas de Bacillus thuringiensisem seus produtos, e existe um conceito sobre insetos desenvolvendo resis-tência a toxinas de B.t. Uma estratégia para gerenciamento de resistência deinseto pode ser combinada as proteínas inseticidas TC produzidas por Xeno-rhabdus, Photorhabdus, Gibberella, e semelhantes com toxinas tais como

toxinas cristal de B.t., proteínas inseticidas solúveis de cepas Bacillus (ver,por exemplo, WO 98/18932 e WO 99/57282), ou outras toxinas de insetos.As combinações podem ser formuladas para uma aplicação espargível oupodem ser combinações moleculares. Plantas podem ser transformadascom genes que produzem duas ou mais diferentes toxinas de inseto (ver, por

exemplo, Gould, 38 Bioscience 26-33 (1988) e patente US 5 500 365; damesma maneira, pedido de patente EP 0 400 246 A1 e patentes US 5 866784; 5 908 970; e 6 172 281 também descrevem transformação de umaplanta com duas toxinas cristal de B.t.). Um outro processo de produção deuma planta transgênica que contém mais de um gene resistente a inseto

pode ser primeiro produzir duas plantas, com cada planta contendo um genede resistência a inseto. Estas plantas então podem ser cruzadas usando tra-dicionais técnicas de cultivo de planta para produzir uma planta contendomais de um gene de resistência a inseto. Assim, deve ser visível que a frase"compreendendo um polinucleotídeo" como aqui usada significa pelo menos

25 um polinucleotídeo (e possivelmente mais, contíguos ou não) a menos queespecificamente indicado de outro modo.Formulações e Outros Sistemas de Liberação.

Grânulos iscas formulados contendo células e/ou proteínas dainvenção objeto (incluindo micróbios recombinantes compreendendo os ge-

30 nes aqui descritos) podem ser aplicados ao solo. Produto formulado tambémpode ser aplicado como um revestimento de semente ou tratamento de raizou tratamento total de planta em estágios posteriores do ciclo de colheita.Tratamentos de planta e solo com células podem ser empregados como pul-verizados umedecíveis, grânulos ou pós, através de mistura com vários ma-teriais inertes, como minerais orgânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos,fosfatos, e semelhantes) ou materiais botânicos (sabugos de milho pulveri- zados, cascas de arroz, conchas de nozes, e semelhantes). As formulaçõespodem incluir adjuvantes espalhadores - pegajosos, agentes estabilizantes,outros aditivos pesticidas ou tensoativos. Formulações líquidas podem ser àbase de água ou não-aquosas e empregadas como espumas, géis, suspen-sões, concentrados emulsificáveis, ou semelhantes. Os ingredientes podemincluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificantes, dispersantes ou polí-meros.

Como pode ser apreciado por aqueles versados na técnica, aconcentração de pesticida irá variar amplamente dependendo da naturezada particular formulação, particularmente se ela é um concentrado ou para

ser usada diretamente. O pesticida estará presente em pelo menos 1% empeso e pode ser 100% em peso. As formulações secas terão de cerca de 1-95% em peso do pesticida enquanto as formulações líquidas genericamenteserão de cerca de 1-60% em peso dos sólidos na fase líquida. As formula-ções genericamente terão de cerca de 102 a cerca de 104 células/mg. Estas formulações serão administradas em cerca de 50 mg (líquida ou seca) a 1 kgou mais por hectare.

As formulações podem ser aplicadas aos ambientes da peste,por exemplo, solo e folhagem, através de espargimento, pulverização, chu-veirinho, ou semelhantes. Um outro esquema de liberação é a incorporação do material

genético de toxinas em um vetor baculovírus. Baculovírus infectam particula-res hospedeiros insetos, incluindo aqueles desejavelmente alvejados com astoxinas. Baculovírus infeccioso abrigando um constructo de expressão paraas toxinas podem ser introduzidos em áreas de infestação de insetos para

pelo que intoxicar ou envenenar insetos infectados.

Vírus de inseto, ou baculovírus, são conhecidos infectarem eafetarem adversamente certos insetos. O efeito dos vírus sobre insetos élento, e vírus não interrompem imediatamente a alimentação de insetos. As-sim, vírus não são vistos como sendo ótimos como agentes de controle depestes de insetos. Entretanto, combinação de genes de toxina em um vetorbaculovírus pode prover uma eficiente maneira de transmitir toxinas. Em adi- ção, uma vez que baculovírus são específicos para diferentes insetos, podeser possível usar uma particular toxina para seletivamente alvejar particu-larmente pestes de insetos danificantes. Um vetor particularmente útil paraos genes de toxinas é um vírus de poliedrose nuclear. Vetores de transfe-rência usando estes vírus foram descritos e são agora vetores de escolha

para transferência de genes estranhos em insetos. O vírus com gene de to-xina recombinante pode ser construído em uma forma oralmente transmissí-vel. Baculovírus normalmente infectam insetos vítimas através de mucosaintestinal de intestino-médio. O gene de toxina inserido atrás de um promotorde proteína re revestimento viral forte pode ser expresso e deve matar rapi-

damente o inseto infectado.

Em adição a um vírus de inseto ou baculovírus ou sistema deliberação de planta transgênica para as toxinas proteínas da presente inven-ção, as proteínas podem ser encapsuladas usando tecnologia de encapsula-ção de Bacillus thuringiensis tal como, mas não limitado a, patentes US

4.695.455; 4.695.462; 4.861.595 que são todas aqui incorporadas por refe-rência. Um outro sistema de liberação para as toxinas proteínas da presenteinvenção é formulação da proteína em uma matriz isca, que pode então sersaúda acima e abaixo de solo de estações de iscas de insetos. Exemplos detecnologia incluem, mas não são limitados a, pedido de patente PCT WO

93/23998, que é aqui incorporado por referência.

Sistemas baseados em RNA viral de planta também podem serusados para produção de uma proteína toxina antiinseto. Assim fazendo, ogene codificando uma toxina pode ser inserido na região promotora de re-vestimento de um apropriado vírus de planta que infectará a planta hospe-

deira de interesse. A toxina então pode ser expressa assim provendo prote-ção da planta a partir de dano por inseto. Sistemas baseados em RNA viralde planta são descritos nas patentes US 5.500.360 para Mycogen Plant Sei-ences, Inc. e patentes US 5.316.931 e 5.589.367 para Biosource GeneticsCorp.

Em adição a produção de uma planta transformada, existem ou-tros sistemas de liberação onde pode ser desejável engenheirar o gene(s)5 codificando a toxina. Por exemplo, uma toxina proteína pode ser construídaatravés de fusão de uma molécula atrativa para insetos como uma fonte dealimento com uma toxina. Após purificação na laboratório um tal agente tóxi-co com isca "construída dentro" pode ser embalado dentro de invólucros dearmadilha padrão de insetos. Mutantes.

Mutantes de isolados bacteriais e de fungos (e outros organis-mos) podem ser obtidos através de procedimentos que são bem conhecidosna técnica. Por exemplo, mutantes podem ser obtidos através de mutagêne-se com etil sulfonato de metano (SEM) de um isolado. Os mutantes podem ser obtidos usando luz ultravioleta e nitrosoguanidina através de procedi-mentos bem conhecidos na técnica.Exemplos de Várias Modalidades Específicas.

(Como usados neste relatório descritivo, os termos "um" e "uma"significam pelo menos um, a menos que de outro modo indicado). A inven-

ção objeto pode incluir, mas não é limitada a,uma proteína eucariótica, isola-da, compreendendo um domínio B e um domínio C, onde a dita proteína po-tencializa a atividade inseticida de uma proteína complexo toxina Classe A,onde o dito domínio B compreende um subdomínio spvB seguido por pelomenos um subdomínio FG-GAP, e o dito domínio C compreende pelo menos um suubdomínio RHS seguido por uma região hiper-variável. (Deve ser no-tado que estes subdomínios são algumas vezes referidos aqui como "domí-nios". Deve ser entendido que tais "domínios" podem ser subpartes de prote-ínas de fusão, da invenção objeto, tendo dois domínios principais - B e Ccom cada domínio principal tendo domínios de si próprio). Em algumas mo-

dalidades, a dita proteína ainda pode compreender um domínio transmem-brana (ou subdomínio). Em algumas modalidades, a dita proteína é uma pro-teína de fungo, incluindo uma proteína de Gibberella. Algumas proteínas pre-feridas têm um peso molecular de aproximadamente 200-300 kDa. Em algumas outras modalidades, a dita proteína tem os domínios como descrito acima mas é procariótica ou arqueal (não-eucariótica) obtenível de um organismo ocorrendo naturalmente de um gênero selecionado de Methanosarci-5 na, Treponema, Leptospira, Tannerella, e Microbulbifer. Novas fontes bacte-riais (outras que não Xenorahbdus, Photorhabdus, e semelhantes) também são aqui descritas. Variações (tais como substituições conservativas) das seqüências de aminoácidos ocorrendo naturalmente também são possíveis.

A invenção objeto inclui um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer uma destas proteínas. Alguns polinucleotídeos preferidos têm uma composição de códon otimizada para expressão em uma planta. A invenção inclui uma célula transgênica compreendendo qualquer um destes polinucleotídeos. Em algumas modalidades preferidas, a célula transgênica ainda compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica uma toxina Classe A.

A invenção objeto ainda inclui um processo de seleção de seqüências de polinucleotídeos para um polinucleotídeo que codifica uma proteína mencionada (e/ou sugerida) acima, onde o dito processo compreende provimento de uma seqüência de referência, comparação da dita seqüência referência a uma base de dados de seqüências usando um algoritmo, assinalando um escore para uma seqüência na dita base de dados, seleção de um valor mínimo, identificação do dito polinucleotídeo na dita base de dados que tem o dito escore acima do dito valor mínimo, produção de uma proteína que é codificada pelo dito polinucleotídeo, e ensaio da dita proteína para ha-

bilidade de potencializar a atividade de uma proteína complexo toxina Classe A.

Ainda é incluído um processo de seleção de uma cultura de células eucarióticas ocorrendo naturalmente para uma proteína selecionada do grupo de uma proteína complexo toxina Classe A e uma proteína de fusão BC mencionada acima. Um organismo ocorrendo naturalmente de um gênero selecionado de Methanosarcina, Treponema, Leptospira, Tannerella, e Microbulbifer pode ser substituto para o eucariócito em tais processos deseleção.

A invenção objeto também inclui um processo de identificação de uma proteína de fusão BC, mencionada acima, de um organismo ocorrendo naturalmente onde o dito processo compreende análise de uma se-5 qüência para uma seqüência de subdomínios discutida acima e em outros locais aqui.

A invenção objeto também inclui um processo de seleção de uma pluralidade de isolados ocorrendo naturalmente (microbiais) para uma proteína de aproximadamente 220 kDa a aproximadamente 295 kDa que

potencializa atividade de toxina antiinseto de uma proteína toxina de complexo toxina Classe A onde o dito processo compreende obtenção de proteína dos ditos isolados e seleção da dita proteína para dita atividade potencia-lizadora, a dita proteína compreendendo um domínio B e um domínio C, onde o dito domínio B e o dito domínio C compreendem subdomínios discuti-

dos acima e em outros locais aqui. Tais micróbios podem ser fungos. Os ditos micróbios também podem ser selecionados de Gibberella, Methanosar-cina, Treponema, Leptospira, Tannerella, e Microbulbifer.

A invenção objeto também inclui um processo de seleção de uma pluralidade de isolados de Gibberella para um gene que codifica uma

proteína de aproximadamente 220 kDa a aproximadamente 295 kDa que potencializa atividade de toxina antiinseto de uma toxina complexo toxina Classe A onde o dito processo compreende obtenção de moléculas de ácido nucléico dos ditos isolados e contato das ditas moléculas de ácido nucléico com um polinucleotídeo que hibridiza com o dito gene. A etapa de obtenção

de DNA a partir da dita cultura pode compreender criação de uma biblioteca de clones a partir do dito DNA e ensaio de pelo menos um dos ditos clones para a presença do dito gene. A etapa de ensaio do dito clone para a presença de dito polinucleotídeo pode compreender ensaio do dito clone para atividade de toxina de lepidóptero, pelo que indicando a presença do dito

polinucleotídeo. A etapa de ensaio do dito DNA pode compreender modalidade de reação de cadeia polimerase com pelo menos um iniciador que é projetada para indicar a presença do dito gene. A etapa de ensaio do ditoDNA pode compreender hibridização de uma sonda de ácido nucléico para o dito DNA onde a dita sonda é projetada para indicar a presença do dito gene. O processo também compreende ensaio para a dita proteína, compreendendo (por exemplo) imuno - reação de um anticorpo para a dita proteína com uma amostra de proteína onde o dito anticorpo é designado para indicar a presença da dita proteína.

A invenção objeto ainda prove um processo de controle de um inseto, ou peste semelhante, onde o dito processo compreende a etapa de contato do dito inseto com uma proteína de fusão BC discutida acima e uma

proteína toxina complexo toxina Classe A. É também incluído um processo de potencialização de atividade de toxina de uma proteína toxina complexo toxina Classe A onde o dito processo compreende provimento de uma proteína de fusão BC discutida acima a um inseto para ingestão. Novos domínios B e/ou Ca partir destas novas proteínas de fusão também podem ser usa-

dos individualmente (não em uma forma de uma fusão).

A invenção objeto ainda inclui uma proteína de fusão BC sintética compreendendo um domínio B ou C obtenível de (ou derivado de) um novo organismo fonte (ocorrendo naturalmente) discutido acima, onde o dito domínio B ou o dito domínio C está fundido a um domínio C ou domínio B

heterólogo. Várias combinações são possíveis. Tais fusões sintéticas também podem ser fundidas a uma proteína toxina complexo toxina Classe A,

Em algumas outras modalidades, a invenção objeto inclui um processo de produção de uma célula transgênica, onde o dito processo compreende inserção de um polinucleotídeo na dita célula, onde o dito polinucle-

otídeo codifica uma proteína de Gibberella (ou outro organismo objeto) de aproximadamente 220 kDa a aproximadamente 295 kDa, onde a dita proteína potencializa atividade de toxina antiinseto de uma proteína toxina complexo toxina ClasseA. A invenção objeto também inclui uma célula transgênica compreendendo um polinucleotídeo heterólogo a partir de uma cultura

de um isolado de Gibberella (ou outro organismo objeto), onde o dito polinucleotídeo codifica uma proteína de aproximadamente 220 kDa a aproximadamente 295 kDa que potencializa atividade de toxina antiinseto de uma pro-teína toxina complexo toxina Classe A. A invenção objeto inclui um processo de seleção de uma pluralidade de isolados de Gibberella para uma proteína de aproximadamente 220 kDa a aproximadamente 295 kDa que potencializa atividade de toxina antiinseto de uma proteína toxina de complexo toxina 5 Classe A onde o dito processo compreende obtenção de proteína dos ditos isolados e seleção da dita proteína para a dita atividade potencializante. A invenção objeto ainda inclui um processo de seleção de uma pluralidade de isolados de Gibberella para um gene que codifica uma proteína de aproximadamente 220 kDa a aproximadamente 295 kDa que potencializa atividade

de toxina antiinseto de uma proteína toxina de complexo toxina Classe A onde o dito processo compreende obtenção de moléculas de ácido nucléico a partir dos ditos isolados e contato das ditas moléculas de ácido nucléico com um polinucleotídeo que hibridiza com o dito gene.

Outros organismos, proteínas, e genes podem ser substituídos

nos processos e modalidades acima. Por exemplo, proteínas antiinseto de Methanosarcina e genes podem ser identificados ou usados de acordo com os processos acima. Da mesma maneira, proteínas TC Classe A e genes de Gibberella podem ser identificados ou usados de acordo com os processos acima. Novas cepas identificadas usando os processos objetos também es-

tão dentro do escopo da invenção objeto.

Várias abordagens podem ser usadas para modalidade dos processos acima. Por exemplo, uma biblioteca de clones pode ser construída na modalidade de alguns dos processos acima. Alguns destes processos podem incluir uma etapa de reação de cadeia polimerase com pelo menos

.'25 um iniciador que é projetado para indicar a presença de um gene de interesse. Os processos acima podem incluir uma etapa de hibridização de uma sonda de ácido nucléico a DNA de interesse onde a dita sonda é projetada para indicar a presença do dito gene. Proteínas podem ser ensaiadas através de imuno - reação de um anticorpo com a dita proteína onde o dito anti-

30 corpo é projetado para indicar a presença da dita proteína.

A invenção objeto também inclui uma proteína isolada que potencializa atividade de toxina antiinseto de uma toxina complexo toxina Cias-se A onde uma seqüência de polinucleotídeos que codifica a dita proteína hibridiza sob condições rigorosas com o complemento de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs:1, 3 ,5, 7, 9, e 11. Em algumas modalidades preferidas, a proteína compreende uma seqüência de aminoácidos selecio-5 nada de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 e 12. Um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer uma destas proteínas também está dentro do escopo da invenção objeto, como estão células transgênicas (tais como células de plantas e de micróbios) compreendendo os ditos polinucleotídeos. A invenção objeto ainda inclui um processo de controle de uma peste de insetos onde o

dito processo compreende a etapa de contato da dita peste com uma proteína da invenção objeto.

Novamente, outros organismos, proteínas, e genes podem ser substituídos nos processos e modalidades acima. Estes incluem, por exemplo, proteínas antiinseto Methanosarcina e genes, e proteínas TC Classe A e

genes de Gibberella.

Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos provisórios, e publicações referidas ou citadas aqui, são incorporados por referência em sua totalidade na extensão de que eles não são inconsistentes com os explícitos ensinamentos deste relatório descritivo.

O que se segue são exemplos que ilustram procedimentos para

prática da invenção. Estes exemplos não devem ser construídos como limi-tantes. Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mistura solvente são em volume a menos que de outro modo notado. Exemplo 1

Descoberta de Homólogos de Gene Classe B e Classe C em Gibberella Ze-ae

Uma seqüência de DNA codificando uma proteína hipotética com similaridade às proteínas TccC1 (Classe C) e TcaC (Classe B) de Complexo de Toxina de Photorhabdus luminescens (GenBank Accession Num-30 bers AAC38625.1 e AAL18473.1, respectivamente) foi descoberta através de análises tblastn do genoma de Gibberella zeae. As anpalises foram feitas usando o algoritmo BLAST genômico NCBI (National Center for Biotechno-logy Information) no World Wide Web site (nc-bi.nlm.nih.gov/genom_table.cgi), usando os seguintes valores default:

Expectativa 10; Default de filtro.

Um acerto para cada proteína foi encontrado dentro de GenBank

Accession Number AACM01000442 usando tblastn. Ambos acertos mapeados para uma proteína hipotética simples que foi anotada como se segue: CDS; ligação (52114..56781,56863. .59514); Locusjag ="FG10566.1"; 10 Códon_ início=1;

Produto = "proteína hipotética"; Proteína_id = "EAA68452.1"; Db_xref = "G 1:42545609".

A seqüência de DNA de AACM01000442 foi traduzida usando 15 programa Tradutor de DNA (um programa que permite o usuário selecionar

parâmetros de início e interrupção para regiões de codificação de proteína).

Os resultantes produtos de tradução previstos foram usados para pesquisa

de uma base de dados de proteína local não-redundante usando blastp.

Uma análise blastp similar foi realizada com todas as proteínas anotadas em 20 GenBank dentro da seqüência AACM01000442. Em ambos os casos, um

polipeptídeo simples (EAA68452.1) foi identificado que teve significante ho-

mologia a ambas proteínas de Complexo Toxina de Photorhabdus TcaC e

TccC1.

Ainda análises da relação entre a proteína EAA68452.1 e as pro-"25 teínas TcaC e TccC1 foram realizadas com o programa "Blast 2 sequences" que contem o algoritmo de comparação blastp [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250]. Os parâmetros de busca / comparação default foram usados, como listado abaixo: 30 Matriz Blosum62;

Folga Aberta 11; Folga de Extensão 1;Folga x queda 50; Valor Esperado 10; Tamanho de Palavra 3; Filtro Desligado.

Os resultados de comparação de "Blast2 sequences" para a pro-

teína TcaC são dados abaixo:

Comprimento = 2439 Escore = 318 acertos (814); Esperado = 9e-85; . Identidades = 333/1291 (25%);

Positivos = 527/1291 (40%), Folgas = 187/1291 (14%)

Análises do alinhamento de proteína - proteína identificado nesta busca revelaram que a região de homologia entre TcaC e a proteína hipo- tética EAA68452.1 de Gibberella zeae compreende aminoácidos 72-1266 de EAA68452.1.

Os resultados de comparação de "Blast 2 sequences" para a proteína TccC1 são dados abaixo: Comprimento = 2439; Escore = 192 acertos (489);

Esperado = 3e-47; Identidades = 198/723 (27%); Positivas = 317/723 (43%); Folgas = 89/723 (12%) Análises do alinhamento de proteína - proteína identificado nes-

ta busca revelaram que a região de homologia entre TccC1 e a proteína hipotética EAA68452.1 de Gibberella zeae compreende aminoácidos 1557-2239 de EAA68452.1. Assim, é aparente que a proteína hipotética EA-A68452.1 de Gibberella zeae compreende dois domínios consecutivos, o primeiro tendo alguma homologia à proteína TcaC Classe B, e um segundo domínio tendo alguma homologia à proteína TccC1 Classe C.

GenBank accession AACM01000442 é uma seqüência de D NAlinear de 95095 bases obtida via seqüenciamento de pistola de genoma da cepa PH1 de Gibberella zeae (NRRL 31084) cromossomo 1, e tem uma data de depósito de 13 de fevereiro de 2004. É notado que a anotação CDS acima sugere a presença de uma seqüência intron (interveniente) dentro da seqüência genômica, compreendendo bases 56782 a 56862. Embora anotado como uma seqüência intron, deve ser notado que todas as bases compreendendo o intron putativo estão no quadro de leitura +1 em relação a e-xonl precedendo o intron (isto é, bases 52114 a 56781 de Accession A-ACM01000442). Por isso, um quadro de leitura aberto ininterrupto estende-10 se a partir da base 52114 para base 59514 de Accession AACM01000442. O produto de tradução previsto provido pelo programa Tradutor de DNA, e que foi usado nas buscas e comparações acima, foi maior que aquele anotado dentro de AACM01000442, uma vez que o intron em-estrutura putativo não foi removido. A seqüência do DNA de Gibberella zeae que codifica uma prote-

ína hipotética com homologia a proteínas potencializadoras de complexo toxina, completa com intron traduzido, é mostrada em SEQ ID NO:1. A seqüência é também aqui referida como tcp1Gz (potencializador de complexo toxina 1 de Gibberella zeae). A tradução de SEQ ID NO:1 é mostrada em SEQ ID NO:2, e é aqui referida como Tcp1Gz. A seqüência de DNA de tcp1Gz sem o intron é mostrada em SEQ ID NO:3. A tradução de SEQ ID NO:3 é mostrada em SEQ ID NO:4. De acordo com algumas modalidades da invenção objeto, a proteína TcplGz pode potencializar as atividades das proteínas TC Classe A TcdA e XptA2 contra seus respectivos insetos alvos. Esta ob- servação é surpreendente e anteriormente inesperada, uma vez que a proteína TcplGz tem como sua fonte um organismo eucariótico, e as proteínas TcdA e XptA2 são derivadas de fontes bacteriais. Exemplo 2

Projeto e Síntese de um Gene Codificando Tcp1g7 Para Expressão Em Bac-30 férias

Este exemplo ensina o projeto de uma nova seqüência de DNA que codifica a proteína TcplGz de SEQ ID NO:2, mas é otimizada para ex-pressão em células de Escherichia coli. A Tabela 2, Colunas D e H, apresenta as distribuições (em % de utilização para todos os códons para aquele aminoácido) de códons sinônimos para cada aminoácido, como encontrado nas regiões de codificação de genes Classe II de E. coli [Genes de Classe II 5 são aqueles que são altamente expressos durante a fase de crescimento exponencial de células de E. coli, como reportado em: Henaut, A., and Dan-chin, A. (1996) Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology, vol. 2, pp. 2047-2066. [Neidhardt, F., Curtiss III, R., Ingra-ham, J., Lin, E., Low, B., Magasanik, B., Reznikoff, W., Riley, M., Schaech-

ter, M. and Umbarger, H. (eds.). American Society for Microbiology, Washington, DC]. É evidente que alguns códon sinônimos para alguns aminoá-cidos estão presentes somente raramente naqueles genes altamente expressos (por exemplo, códon leucina CTA e códon arginina CGG). No processo de projeto de criação de uma seqüência de DNA codificando proteína

que se aproxima de distribuição de códons de genes de E. coli altamente expressos, qualquer códon que seja usado não - freqüentemente em relação aos outros códons sinônimos para aquele aminoácido não foi incluído (indicado por NA em Colunas C e G de Tabela 2). Usualmente, um códon foi considerado ser raramente usado se ele foi representado nos genes de

Classe II em cerca de 18% ou menos do tempo para codificar o aminoácido relevante.

Para balancear a distribuição das escolhas de códon restante para um aminoácido, uma representação média pesada para cada códon foi calculada, usando a fórmula:

% pesada de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100

onde C1 é o códon em questão, C2, C3, etc. representam os códons sinônimos restantes, e os valor % para os códons relevantes são tomados das colunas D e H de Tabela 2(ignorando os valores de códon raro em fonte negrito). O valor de % pesada para cada códon é dado em colunas C e G de

Tabela 2.

Projeto da seqüência de DNA otimizada de E. coli foi iniciado por tradução reversa da seqüência de proteína de SEQ ID NO:2 usando umatabela de viés de códon construída a partir de Tabela 2, Colunas C e G. A seqüência inicial foi então modificada através de compensação de mudanças de códons (enquanto retendo representação média pesada total) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzima de restrição, re-5 mover estruturas secundárias intra-filamento altamente estáveis, e outras seqüências que podem ser prejudiciais para manipulações de clonagem ou expressão do gene engenheirado. Um exemplo de uma tal seqüência prejudicial para se evitar dentro de uma região codificante é uma seqüência de ligação de RNA ribossômico 16S ("seqüência Shine-Dalgarno") tal como

AGGAGG, que pode codificar, por exemplo, dois aminoácidos arginina consecutivos, mas que também pode servir como um sinal de iniciação de tradução intragênica (e por isso indesejável).

A seqüência de DNA desviada de E. coli que codifica a proteína de SEQ ID NO:2 é dada como bases 23-7420 de SEQ ID NO:5. Para facilitar

clonagem e assegurar eficiente iniciação de tradução, uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição Xbal terminal 5' (TCTAGA) e seqüência Shine-DIagarno (AAGAAGGAG) foram colocadas a montante do códon de início de tradução ATG (bases 1-22 de SEQ ID NO:5). Também para facilitar clonagem, e para assegurar própria terminação de tradução,

bases codificando dois códons de interrupção de tradução TAA e um sítio de reconhecimento de enzima de restrição Xhol (CTCGAG) foram incluídos na extremidade 3' da região codificante (bases 7421-7440 de SEQ ID NO:5). Síntese de um fragmento de DNA compreendendo SEQ ID NO:5 foi realizada através de um fornecedor comercial (Entelechon GmbH, Regensburg,

Germany).

É presentemente notado que a seqüência de DNA genômico de Gibberella zeae tcp1Gz, mostrada em SEQ ID NO:1, como anotada em Gen-Bank Accession AACM01000442, compreende uma seqüência intron putati-va (bases 4669-4749 de SEQ ID NO:1). Análises do quadro de leitura aberto 30 de SEQ ID NO:1 revelam que as bases compreendendo o íntron putativo mantêm o quadro de leitura +1 iniciado pelo códon de início ATG em bases 1-3. Em outras palavras, SEQ ID NO:1 compreende um quadro de leituraaberto simples de 7398 bases que codifica uma proteína teórica de 2466 aminoácidos. Assim, se o transcrito primário derivado do DNA de SEQ ID NO:1 não é unido (isto é, a seqüência intron não é clivada do RNAm) tradução pode produzir a proteína Tcp1G2 mostrada em SEQ ID NO:2. Por outro 5 lado, se o transcrito primário é unido (ou seja, as seqüências introns são removidas) o RNAm pode ter uma seqüência correspondendo a SEQ ID NO:3, e tradução pode produzir a proteína de 2439 aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:4.

Para os propósitos deste exemplo, uma seqüência de DNA des-10 viada de E. coli codificando a proteína teórica derivada do inteiro quadro de leitura aberto de 7398 bases de SEQ ID NO:1 foi projetada e sintetizada. A proteína codificada de 2466 aminoácidos é idêntica em seqüência a SEQ ID NO:2 (Tcp1Gz) e assim inclui os aminoácidos codificados pelo intron putativo identificado na seqüência genômica. Como visto ainda nos exemplos, esta 15 proteína, derivada de um organismo eucariótico, tem a surpreendente atividade de potencializar a toxidez para inseto de proteínas TC Classe A derivadas de bactérias.

Tabela 2. Representação de códons sinônimos em aenes altamente expressos de E. coli, e cálculo de um conjunto de representação de códon desviado para projeto de gene sintético otimizado de E. coli <table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>

Exemplo 3

Engenharia do DNA de Bactéria Sintético Codificando Tcpln;

O DNA desviado de bactéria, sintético (SEQ ID NO:5) codificando a proteína Tcp1Gz, foi engenheirado para expressão através de inserção do mesmo em dois diferentes vetores de expressão em E. coli para auxiliar em otimização de condições de expressão. O primeiro foi vetor pBT (pedidoUS No: 10/754 115, depositada em 7 de janeiro de 2003), que usa um promotor E. coli padrão. O plasmídeo baseado em pBT foi designado pDAB8828. O segundo foi um vetor de expressão pET (Novagen, Madison, Wl), que utiliza um promotor T7 bacteriófago. O plasmídeo de expressão baseado em pET foi designado pDAB8829. Cada um destes plasmídeos de expressão foi construído usando técnicas padrões de biologia molecular. A engenharia foi feita de modo a manter apropriados sinais de tradução e transcrição bacterial. Ambos plasmídeos pDAB8828 e pDAB8829 codificam a proteína TcplGz ainda diferem em promotor, marcador selecionável e vá- rias outras características das cadeias principais de vetor. Exemplo 4

Condições de Expressão de pDAB8828 e Preparações de Lisatos

Os plasmídeos de expressão pBT (controle vetor vazio descrito no pedido de patente US 10/754 115, depositado em 7 de janeiro de 2003),

e pDAB8828 foram transformados em E. coli linhagem BL21 (Novagen, Madison, Wl) usando processos padrões. Culturas de expressão foram iniciadas com 10-200 colônias recentemente transformadas colocadas em 250 ml_ de meio LB contendo 50 ug/mL de antibióticos e 75 IPTG (isopropil-a-D-tiogalactopiranosídeo). As culturas foram desenvolvidas a 28°C por 48 horas

em 180-200 rpm, e as células foram coletadas por centrifugação em 5000 x g por 20 minutos a 4°C. Péletes de células foram suspensas em 4-4,5 ml_ de solução de fosfato de Butterfield (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA; fosfato de potássio 0,3 mM pH 7,2), transferidas para tubos de centrífuga de tampa rosqueada de polipropileno de 50 ml_ com 1 ml_ de pérolas de vidro de

0,1 mm de diâmetro (Biospec, Bartlesville, OK, número de catálogo 1107901), e então foram resfriadas sobre gelo. As células foram lisadas por sonificação com duas explosões de 45 segundos usando uma sonda de 2 mm com um sonificador Branson 250 (Danbury CT) em uma saída de -30, resfriando completamente entre explosões. Os lisatos foram transferidos pa-

ra tubos Eppendorf de 2 ml_ e centrifugados 10 minutos em 16 000 x g. So-brenadantes foram coletados e a concentração de proteína medida. Reagen-te de ensaio de corante de proteína Bio-Rad foi diluído 1:5 com H20 e 1 ml_foi adicionado a 10 \iL de uma diluição 1:10 de cada amostra e a albumina de soro bovino (BSA) em concentrações de 5, 10,k 15, 20 e 25 ^ig/mL. As densidades óticas das amostras foram então lidas em comprimento de onda de 595 nm em um espectrofotômetro SpectraMax Plus (Sunnyvale, CA). Os lisatos foram ensaiados recentes. Exemplo 5

Condições de expressão de pDAB8829 e Preparações de Lisatos

Os plasmídeos de expressão pET (controle vetor vazio), pDAB8920 e pDAB8829 foram transformados em E. coli T7 expressão linha-

gem BL21(DE3) STAR (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando processos padrões. Plasmídeo pDAB8920 foi usado como um controle de potencialização positivo. Ele contém um gene potencializador fundido consistindo nos genes de Phtorhabdus luminescens tcdB2 e tccC3 fundidos via um ligante de 14 aminoácidos. Plasmídeo pDAB8920 é o objeto de um pedido separado (US

60/549 516, depositado em 2 de março de 2004). Culturas de expressão foram iniciadas com 10-200 colônias recentemente transformadas colocadas em 250 ml_ de meio LB contendo 50 fig/mL de antibiótico e 75 \M IPTG (i-sopropil-a-D-tiogalactopiranosídeo). As culturas foram crescidas, lisadas, e de outro modo processadas como descrito no Exemplo 4 acima.

Exemplo 6

Condições de Bioensaio para Lisatos de PDAB8828 e PDAB8829

Bioensaios com insetos foram conduzidos com larvas neonatais sobre dietas artificiais em bandejas de 128 cavidades especialmente projetadas para bioensaios com insetos (C-D International, Pitman, NJ). As espé-

"cies ensaiadas foram o verme de raiz de milho do sul, Diabrotica undecim-puctata howardi (Barber), e verme de espiga de milho, Helicoverpa zea (Boddie).

Bioensaios foram incubados sob condições ambientais controladas (28°C, -40% de umidade relativa, 16h : 8 h [luz : escuro]) por 5 dias, em cujo ponto o número total de insetos no tratamento, o número de insetos mortos, e os pesos de insetos sobreviventes foram anotados.

A atividade biológica dos lisatos brutos sozinhos ou com proteí-nas de Complexo Toxina Classe A TcdA ou XptA2,<wi foi ensaiada como se segue. Lisatos de E. coli brutos (40 \iL) (3-21 mg/mL) de tanto culturas controles como aquelas expressando proteínas potencializadoras foram aplicados à superfície de dieta artificial em 8 cavidads de uma bandeja de bioen-5 saio. A área de superfície média de dieta tratada em cada cavidade foi de -1,5 cm2. As proteínas TcdA ou XptA2XWi foram adicionadas como frações altamente purificadas a partir de culturas bacteriais expressando heterolo-gamente as proteínas individuais. As concentrações finais de XptA2xwi e TcdA na dieta foram 250 ng/cm2 e 50 ng/cm2, respectivamente. Nestas doses, 10 estas proteínas essencialmente não têm significante efeito sobre o crescimento das larvas de insetos testes. Exemplo 7

Resultados de Bioensaio Para Lisatos de pDAB8828

A Tabela 3 mostra os resultados de bioensaio para lisatos de

células programadas para expressão de proteína Tcploz a partir de plasmí-deo pDAB8828, comparado a lisatos de células controles. Exame dos dados mostra que TcdA (ativa em coleóptero) e XptA2XWi (ativa em lepidóptero) tiveram impacto desprezível quando misturadas com vetor somente lisatos controles. Deve ser notado que a quantidade TcdA e XptA2xwi adicionada aos

lisatos foi ajustada para destacar o efeito potencializador do genes codificando potencializador. Lisatos das células contendo pDAB8828 não matam insetos. Entretanto, quando misturados com proteínas TcdA ou XptA2xwi, significante inibição de crescimento foi notada, com o esperado espectro de atividade. Análises dos vários lisatos por SDS-PAGE mostrou a presença de

uma banda de -280 kDa nas amostras de pDAB8828 mas não nas amostras controles. A migração da banda é consistente com o tamanho calculado de Tcp1Gz (isto é, 277,7 kDa). Estes resultados demonstram que o plasmídeo pDAB8828 produz a proteína TcplGz e esta proteína exibe a surpreendente função de potencialização de atividade das proteínas Classe A TcdA e Xp- tA2 contra seus insetos alvos.Tabela 3. Resposta de espécies coleópteros e lepidópteros a lisatos de E. colie proteínas purificadas. Sete a nove insetos usados por réplica. Dados são para duas réplicas independentes. Escala de Inibição de Crescimento: 0 = 0-20%; + = 21-40%; ++ = 41 -60%; +++ = 61 -80%; ++++ = 81 -100%; nt = <table>table see original document page 59</column></row><table>Exemplo 8

Resultados de Bioensaio de Lisatos de PDAB8829

A Tabela 4 mostra os resultados de bioensaio para lisatos de células programadas para expressão de proteína Tcp1Gz a partir de plasmí-5 deo pDAB8829, comparado a lisatos de células controles, e lisatos de células programadas para expressão de potencializador fundido 8920. Exame dos dados mostra que TcdA (toxina de coleóptero) e XptA2xwi (toxina de le-pidóptero) tiveram impacto desprezível quando misturadas com lisatos controles de somente vetor. Deve ser notado que a quantidade de TcdA e Xp-

tA2XWi adicionada aos lisatos foi ajustada para destacar o efeito de potencia-lização dos genes codificando TcdB2 e TccC3. Lisatos de células contendo pDAB8920 sozinha não mata insetos. Entretanto, quando misturados com TcdA ou XptA2xwi, significante inibição de inseto foi notada com o esperado espectro. Surpreendentemente, lisatos de células programados para produ-

ção de proteína Tcp1Gz exibiram um perfil de atividade similar como o potencializador 8920. Análises dos vários lisatos por SDS-PAGE mostrou a presença de -280 kDa em amostras de pDAB8829 como comparadas a lisatos de vetores. A migração da banda é consistente com o peso molecular previsto de Tcp1Gz. Estes resultados demonstram que o plasmídeo pDAB8829

produz a proteína Tcp1Gz e esta proteína potencializa a atividade das proteínas TcdA e XptA2 Classe A ativas contra insetos.Tabela 4. Resposta de espécies de coleóptero e lepidóptero a lisatos de E. colie proteínas purificadas. Sete a nove insetos usados por réplica. Dados são para duas réplicas independentes. Inibição de Crescimento: 0 = 0-20%; +■= 21-40%; ++ = 41-60%; +++ = 61-80%; ++++ = 81-100%; nt = não testada <table>table see original document page 60</column></row><table>Exemplo 9

Identificação de Outras Proteínas Classe B / Classe C Fundidas Ocorrendo Naturalmente

Este exemplo prove ainda ilustração de uma abordagem que pode ser usada para pesquisa de uma base de dados de proteínas para proteínas candidatas tendo homologia a proteínas TC Classe B e Classe C. Uma seqüência de proteína de fusão gerada artificialmente foi primeiro construída usando um programa de análise de DNA / Proteína [Vector NTI (In-formax, Inc.)}. Aqueles versados na técnica podem reconhecer que vários outros programas de análise de DNA / Proteína podem ser alternativamente usados. Um exemplo de uma tal proteína de fusão, gerada a partir de seqüências de aminoácidos de TcaC (GenBank Accession AAC38625.1) e TccC1 (GenBank Accession AAL18473.1) (ambas de Phtorhabdus lumines-cens linhagem W-14) é mostrado em SEQ ID NO:6. Esta seqüência de pro-

teína de fusão artificial foi usada em uma busca BLAST proteína - proteína da base de dados de proteínas não-redundante NCBI, usando valores de-fault como listados abaixo:

Filtro fixado para baixa complexidade; Esperado 10; Tamanho de palavra 3; Matriz BLOSUM62

Custos de Folga: Existência 11, Extensão 1 A Figura 1 apresenta a produção gráfica de uma tal busca. [A real produção da busca de computador é apresentada em cores em um monitor de computador; é entendido que a figura, como impressa, não é exata-

mente a mesma como a produção de monitor de computador. Isto não limita as interpretações aqui apresentadas]. Através da parte superior da figura há uma barra com segmentos diferentemente sombreados para representação de Escores de Alinhamento calculados a partir de diferentes quantidades de homologia de seqüência de aminoácidos a uma seqüência identificada na

busca. Os valores mostrados são: <40, 40-50, 50-80, 80-200- e >=200. A linha horizontal seguinte sob a barra de Escore de Alinhamento representa a seqüência amino da seqüência questão de fusão artificial de 2858 aminoácidos, com divisões de 500 aminoácidos. Esta proteína de fusão artificial usada como a seqüência questão é compreendida por aminoácidos TcaC de

resíduos 1 a 1485, e aminoácidos de TccC1 de resíduos 1486 a 2858. As linhas horizontais na porção de dados de Figura 1 representam proteínas individuais, identificadas pelo algoritmo BLAST como possuindo uma seqüência de aminoácidos relacionada (dentro dos parâmetros da busca) à seqüência questão. Para clareza e facilidade de referência, números foram

adicionados a certas linhas marcos; tais números não são parte da produção original. Inspeção de Figura 1 revela que existiam 64 linhas representando seqüências de proteínas identificadas como tendo significantes regiões de homologia à seqüência questão. É notado que várias das linhas horizontais não representam proteínas simples. Por exemplo, a porção esquerda, maior,

de linha 1 foi identificada pela produção como "gi 132650371 gb |A-AC38625.1 | proteína de complexo toxina inseticida TcaC [Phtorhabdus lumi-nescens]" (isto é, parte da seqüência questão), enquanto a porção menor, àdireita, de linha 1 é identificada como ">gi 1536932491 ref |ZP_00127870.2 |COG3209:família de proteína Rhs [Pseudomonas syrin-gae B728a]". A folga na linha 1 entre as porções esquerda e direita da linha indica que as duas regiões de homologia pertencem a proteínas codificadas 5 separadamente.

Em alguns exemplos, entretanto, as linhas de homologia representam uma proteína simples. Por exemplo, linha 53 tem as regiões de homologia esquerda e direita ligadas por uma linha tracejada. A produção BLAST identificou esta proteína como o objeto desta invenção:

">gi 1425456091 gb | EAA68452.11 proteína hipotética FG10566.1 [Gibberella zeae PH-1]". Outras proteínas simples com regiões de homologia para a seqüência questão são identificadas na Tabela 5. Embora descobertas por suas homologias a uma proteína Classe B e Classe C, é entendido que as funções / atividades biológicas das proteínas deduzidas não foram confirmadas.

Entretanto, dada a exposição objeto (mas não antes dela), alguém é agora motivado a avaliar a funcionalidade destas proteínas para sua habilidade para potencializar a atividade de proteínas de Complexo Toxina Classe -

Tabela 5. Proteínas de fusão hipotéticas identificadas Dor busca BLAST de base de dados de proteína não-redundante NCBI <table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>Tabela 5. Proteínas de fusão hipotéticas identificadas oor busca BLAST de base de dados de proteína não-redundante NCBI <table>table see original document page 64</column></row><table>

Exemplo 10

Clonagem de um Gene Codificando Uma Proteína de Fusão Classe B/C de Potencializadores de Complexo Toxina de Tannerella Forsvthensis

Análises de modelo Pfam e varredura de bases de dados de se-qüências de proteína e DNA publicamente disponíveis (NCBI e TIGR Micro-bial) identificaram um gene codificando uma proteína potencializadora de Complexo Proteína (TC) Classe B/C fundida candidata e outros quatro potenciais genes TC Classe C no genoma de Tannerella forsythensis. (Também conhecido como Bacteroides forsythus. As da data de depósito objeto,

este genoma não era conhecido ser disponível de Entrez, e na base de dados TIGR Microbial ele foi listado como inacabado sem data alvo para término). Estes genes TC Classe C estão localizados a jusante do gene codificando a proteína TC Classe B/C fundida. O gene putativo codificando a proteína TC Classe B/C fundida foi clonado.

DNA genômico de Tannerella forsythensis (ATCC 43037) foi ad-

quirido de American Type Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Iniciadores para amplificação de várias regiões do gene TC Classe B/C fundida e suas seqüência flanqueantes foram projetados baseado na seqüência na base de dados pública. Nas reações PCR iniciais, um produto de 4541 bp correspondendo à região de 431 bp a montante do gene de fusão ClasseB/C para 4110 bp a jusante do códon de início putativo (ATG) foi obtido u-sando iniciadores P1 e P2 (Tabela 6) com PfuTurbo hotstart DNA polymera-se (Stratagene, La Jolla, CA). Este produto de PCR foi inserido no vetor p-CRII Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a seqüência de DNA do DNA inserido foi determinada. Os resultados de seqüenciamento mostraram que a homologia entre o fragmento de PCR e a correspondente região do gene Classe B/C fundida na base de dados públicxa foi somente 97,1%. Isto implicou que a cepa bacterial sobre a qual a seqüência na base de dados pública foi baseada pode ser diferente daquela obtida de ATCC (isto é, cepa

43037). Múltiplas tentativas foram feitas para amplificar a extremidade 3' do gene Classe B/C fundida baseado na seqüência na base de dados pública. Iniciadores alternativos foram projetados para amplificação de fragmentos de DNA iniciando na extremidade 3' da região de seqüência confirmada e se estendendo para várias regiões a jusante do gene de fusão Classe B/C (ba-seado na seqüência publicada). Um fragmento de PCR de aproximadamente 6,5 kb foi obtido usando iniciadores P3 e P4 (Tabela 6) com Takara EX Taq DNA polymerase (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Este fragmento de DNA foi clonado no vetor pCR2.1 -TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e seqüenciado parcialmente. Os resultados de seqüenciamento de duas extremidades des- te produto de PCR indicaram que, embora o iniciador dianteiro (P3) tenha se anelado para a localização esperada no gene de fusão Classe B/C, o iniciador reverso (P4) ligou-se à extremidade 5' do quarto gene relacionado a TC Classe C a jusante do gene de fusão Classe B/C. Além disso, o tamanho de produto de PCR (-6,5 kb) foi menor que o tamanho previsto a partir da se-"25 qüência genômica publicada (11201 bp), o que indicou que houve uma supressão ou rearranjo de seqüência de DNA naquela região. A inteira seqüência da extremidade 3' do gene de fusão Classe B/C no produto de PCR de 6,5 kb foi obtida por caminhada semelhante a etapa a partir da região confirmada na extremidade 5' todo o caminho para o primeiro códon de inter- rupção em estrutura. A seqüência de inteiro comprimento do gene de fusão Classe B/C em Tannerella forsythensis (ATCC 43037) é mostrada em SEQ IDNO:11.Em paralelo, três "bibliotecas" de caminhada de genoma foram construídas através de digestão de DNA genômico de T. forsythnesis (ATCC 43037) com enzimas de restrição Afe I, BsaB I, e Stu I e usando o BD Ge-nome Walker Univeral Kit (BD Biosciences, san Jose, CA). O primeiro ciclo 5 de PCR foi realizado usando primer P5 (Tabela 6) e AP1 (provido com o kit). O segundo ciclo de PCR foi realizado usando um par de primers aninhados, P6 (Tabela 6) e AP2 (provido com o kit). Takara LA Taq DNA polymerase foi usada em ambos os ciclos de reações PCR. Específica amplificação foi obtida a partir das bibliotecas geradas por digestões com BsaB I e Stu I. Estes

produtos de PCR foram clonados no vetor pCR2.1 TOPO e seqüenciados. Os resultados de sequenciamento ajustaram com a correspondente região de SEQ ID NO:11 exceto por uma poucas mutações de nucleotídeo simples que foram possivelmente introduzidas durante o processo de PCR. Estes resultados confirmaram que a seqüência mostrada em SEQ ID NO:11 foi a

reação seqüência do gene de fusão Classe B/C em Tannerella forsythensis (ATCC 43037), com muito poucas discrepâncias.

Para ainda confirmar este resultado, análises de Southern blot foram realizadas usando DNA genômico de 7. forsythensis digerido com Hind III e BsaB I em reações separadas. As manchas foram sondadas com

um fragmento de DNA de 1030 bp representando parte da região codificante para uma proteína relacionada TC Classe B no gene de fusão Classe B/C. Esta sonda foi o btida por amplificação com PCR do DNA genômico de T. forsythensis (ATCC 43037) usando primers P2/P3. Os resultados de análises Southern blot revelaram que a sonda hibridizou para fragmentos Hind III

e BsaB I de DNA genômico de T. forsythensis (ATCC 43037) com os mesmos tamanhos como aqueles previstos de SEQ ID NO:11 [2792 bp para digestão com Hind III, e 3598 bp para BsaB I].

É notado que a seqüência de DNA do gene de fusão Classe B/C de T. forsythensis (ATCC 43037) mostrada como SEQ ID NO: 11 foi obtida

de produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico. É bem conhecido na técnica que tais amplificações PCR podem introduzir pequenos números de erros de incorporação de base. Assim, é possível que a real se-qüência do gene como presente no genoma de T. forsythensis (ATCC 43037) possa ser levemente diferente daquela mostrada em SEQ ID NO:11. Dado que a seqüência mostrada em SEQ ID NO:11 foi determinada a partir de múltiplos produtos de PCR, é razoável esperar que a cópia genômica de 5 gene de fusão Classe B/C deve ser pelo menos 99% idêntica a SEQ ID NO:11. Comparação de SEQ ID NO:11 à correspondente seqüência do gene de fusão Classe B/C nas bases de dados públicas revela que as duas seqüências compartilham 97% de homologia na região compreendendo aproximadamente 5,2 kb na extremidade 5', que corresponde à inteira região co-

dificante para uma seqüência de aminoácidos relacionada a uma proteína TC Classe B plus a região núcleo de uma proteína TC Classe C. A jusante da região de 5,2 kb, há uma seqüência de aproximadamente 460 bp com alta homologia à região hiper-variável do terceiro gene relacionado TC Classe C a jusante do gene de fusão Classe B/C, então existem adicionais -420

bp na extremidade 3' que simultaneamente exibe homologia relativamente menor (menos que 60%) que qualquer outra parte da base de dados de seqüência de genoma parcial de Tannerella forsythensis (ATCC 43037) publicada. Isto indicou que a seqüência do gene putativo codificando a proteína TC Classe B/C clonado a partir de DNA genômico de Tannerella forsythensis

(ATCC 43037) (SEQ ID NO:11) foi diferente daquela nas bases de dados públicas.

Tabela 6. Iniciador usados para PCR <table>table see original document page 67</column></row><table>

Exemplo 11

Identificação de Outras Proteínas TC multidomínios

À luz da atividade revelada de proteínas de complexo toxina "BC" fundidas naturalmente, aqueles versados na técnica agora têm a moti-vação para encontrar outras tais proteínas de fusão com a expectativa de que elas possam potencializar a atividade inseticida de uma proteína toxina complexo toxina Classe A. É bem conhecido na técnica que pesquisas BLAST padrões de bases de dados de proteínas podem ser usadas para identificação de proteínas relacionadas umas às outras através de homolo-gia de seqüência de aminoácidos. Este exemplo ensina como alguém pode analisar uma base de dados de seqüências de proteínas e extrair aquelas tendo particulares estruturas de domínios que predizem sua função como potencializadores de Complexo Toxina (TC) Classe B ou Classe C. As famí-lias de gene TC Classe B e Classe C codificam proteínas que são relativamente grandes e têm distintas estruturas de domínio de proteína. Estes dois fatores podem ser usados em tandem para extração de seqüências de proteínas TC Classe B e Classe C individuais a partir de grandes bases de dados de proteínas. Similarmente, quando as proteínas TC Classe B e Classe C são fundidas em um polipeptídeo simples, seu grande tamanho e distintas combinações de domínios de proteínas podem ser usados estabelecer específicas buscas para extração de seqüências de estrutura e função relacionadas a partir de bases de dados de proteínas. Isto é agora possível devido à exposição objeto.

Buscas de domínios de proteínas são rotineiramente realizadas

utilizando um algoritmo de busca Pfam (E.L.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, and R. Durbin), tanto no web site Pfam (http://pfam.wustl.edu/), em um site "espelho" (por exemplo, http://www.sanaer.ac.uk/Software/Pfam/). ou com uma instalação local da base de dados. Embora estes modelos Pfam sejam muito úteis, eles podem perder domínios existentes, especialmente se aqueles domínios são razoavelmente divergentes do modelo. Por isso, para aumentar sensitividade de detecção de domínio, é desejável estabelecer modelos de domínio de proteína específicos para as famílias de genes sendo estudadas. Isto pode ser feito com o mesmo conjunto de ferramentas de análises que foi usado na geração de famílias Pfam (isto é, HMMER; R. Durbin, S.R. Eddy, A. Krogh, and G. Mitchison) e freqüentemente permitirá identificação de domínios de proteínas perdidos pelos modelos mais genéricos.O fluxograma de trabalho é conceitualmente simples. Primeiro,uma busca é realizada sobre uma base de dados de proteínas para extraçãode um subconjunto das seqüências de base de dados. Segundo, este sub-conjunto é testado contra um modelo HMM gerado usando HMMER. Os a- certos gerados contra o modelo, e que tem um apropriado nível de signifi-cância, tanto abrangerá o conjunto de proteínas que pode ser selecionadopara caracterização experimental, como pode servir como uma base de da-dos menor que é selecionada contra um segundo modelo HMM. Esta sele-ção pode ser repetida quando necessário até o desejado nível de resolução

ter sido obtido.

Os exemplos abaixo exemplificam a utilidade desta abordagempara quatro conjuntos distintos de famílias de proteína TC: as proteínas TCClasse B simples, as proteínas TC Classe C simples, e as proteínas TCClasse B/C fundidas a partir de fontes arqueais eucarióticas e procarióticas.

Proteínas TC Classe B.

Todos os genes TC Classe B descobertos até hoje provêem deprocariotes; por isso, o conjunto de busca inicial foi restrito a seqüências deproteína procariótica. Uma busca de proteínas emhttp://www.ncbi.nlm.nih.aov/ foi realizada usando os termos de busca:

"1400:1600{SLEN] AND Prokaryota". Estes termos restringiram a busca à-quelas proteínas que estão entre 1400 e 1600 aminoácidos em comprimentoe têm fontes procarióticas. Um total de 3522 seqüências de proteínas foramidentificadas e baixadas como uma base de dados pesquisável. Deve sernotado que, embora estas restrições sejam úteis no presente contexto, o

comprimento de intervalo das seqüências e o domínio pesquisado podemser modificados para satisfazerem os parâmetros de conjunto de proteínasindividual a ser examinado.

Todas as proteínas TC Classe B conhecidas examinadas atéhoje contêm dois distintos conjuntos de domínios. (A terminologia domínio aqui usada é tomada a partir do site Pfam e ao domínios podem ser pesqui-sados por nome naquele sítio). Na extremidade terminal amino está um do-mínio spvB altamente conservado. Este domínio é tão bem conservado quenão foi necessário construir um modelo de domínio HMM mais específico, eo modelo genérico (spvB_1s.hmm) foi baixado diretamente do web sitePfam. Ver também M.L Lesnick, N.E. Reiner, J. Fierer, and D.G.Guiney,Mol. Microbiol. Março 2001,39(6): 1464-70. O domínio spvB é seguido por múltiplos domínios FG-GAP. Ver,

por exemplo, T.A. Spring, "Folding of the N-terminal, ligand-binding region ofintegrin alpha-subunits into a beta-propeller domain", Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 1997, 94:65-72. O modelo de domínio FG-GAP utilizado pelo modeloPfam genérico perde muitos domínios dentro de uma proteína simples, e

todos os domínios em certas proteínas quando valores limites de reuniãoPfam default são usados (por exemplo GenBank Accessions 66047263,28871479 e 48730377, que são identificados por nosso modelo, ver abaixo).Se um valor de corte mais relaxado é usado, [E-valor = 1,0], mais domíniossão encontrados, incluindo aqueles nas proteínas acima, mas alguns domí- nios podem não ser descobertos. Por isso, foi necessário criar um modeloFG-GAP HMM talhado.

Criação de um modelo HMM de uma família de proteínas requertipicamente três etapas. Primeiro, um conjunto de domínios é escolhido co-mo uma "semente", e um alinhamento de seqüências múltiplas é criado u- sando ClustaIX. Segundo, o alinhamento de seqüências múltiplas é usadocomo uma entrada para hmmbuild, um programa que gera o modelo HMM.Finalmente, hmmcalibrate é usado para corrigir as estatísticas do particularmodelo (hmmcalibrate, hmmbuild, e hmmsearch são componentes da emba-lagem HMMER). O conjunto de domínios semente usado para gerar o mode-

Io HMM é um componente chave do sucesso do modelo. Ele tem de ser di-verso o suficiente para capturar toda a diversidade dos domínios relevantes.Entretanto, o conjunto semente não pode conter todos os membros de do-mínios conhecidos uma vez que o teste da energia anunciadora do modelorequer sua habilidade para identificar o domínio contendo membros não in-

cluídos no conjunto semente.

Um conjunto de proteínas TC Classe B a ser usado como a fontede domínios FG-GAP foi adquirido usando o recurso Blink para GenBankAccession 16416891 (TcaC de Photorhabdus luminescens). Esta extraçãorendeu 15 proteínas procarióticas não-redundantes, relacionadas com esco-res maiores que 2000. [O número de proteínas relacionadas acessível atra-vés de Blink de qualquer dada proteína pode variar com tempo, uma vez que GenBank pode ser uma lista dinâmica}. Os números de acesso de GenBankdas proteínas extraídas foram: 16416891, 37524951, 16416930, 37524959,27479675, 51597844, 22124105, 45443595, 50956508, 14041732,32699986, 10956817, 66047263, 28871479, e 48730377.

Um modelo HMM intermediário foi gerado por extração de domí- nios FG-GAP encontrados nas proteínas acima usando o modelo Pfam ge-nérico, suplementado com os domínios FG-GAP conhecidos de GenBankAccession 16416891 (isto é, TcaC). Os domínios usados no modelo finalforam obtidos através de extração de domínios de duas seqüências de pro-teínas que tiveram o melhor e pior escores de proteínas contendo seis do- mínios FG-GAP (GenBank Accessions 16416891 e 66047263, respectiva-mente). [Notar que seis representa o número canônico de domínios FG-GAPem maioria de proteínas contendo FG-GAP]. Não é surpreendente queGenBank Accession 16416891 seja o melhor acerto, uma vez que é parte dopróprio modelo. Os alinhamentos de seqüências múltiplas ClustalX dos seis domínios FG_GAP nestas duas proteínas são mostrados abaixo. Estes ali-nhamentos podem ser usados com hmmbuild para formação de modelo FG-GAP HMM usado neste exemplo.

Clustal (1,83) alinhamento de seqüências múltiplas de derivados de domí-

nios FG-GAP <table>table see original document page 71</column></row><table>Este alinhamento de seqüências múltiplas foi usado com hmm-build e hmmcalibrate para gerar Bmodels3.hmm. O modelo Bmodels3.hmmfoi então testado contra o conjunto de amostras de 15 proteínas acima e foicapaz de identificar todos os domínios FG-GAP esperados. Ao contrário,quando o modelo Bmodels3.hmm foi testado contra 20 proteínas seleciona-das randomicamente, nenhum domínio FG-GAP foi verificado. O modeloBmodels3.hmm foi então testado com hmmsearch contra a base de dadosde 3522 membros contendo todas as proteínas procarióticas entre 1400 e1600 aminoácidos, rendendo os resultados abaixo. Hmmsearch - busca de uma base de dados de seqüência com um perfilHMM

HMMER 2.3.1 (junho 2003)

Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of MedicineDistribuído livremente sob a GNU General Public License (GPL)

arquivo HMM: FinalTest/Bmodels3.hmm |

mainsModel3Sequences]

base de dados de seqüências: FinalTest/Prokaryotid 400-1600.fasta

corte de escore por seqüência: [nenhum]

corte de escore por domínio: [nenhum]

corte Eval por seqüência: <=10

corte Eval por domínio: [nenhum]

HMM Questão: BdomainsModel3Sequences

Acesso: [nenhum]

Descrição: [nenhuma]

[HMM foi calibrado; valores-E são estimativas empíricas]

Escores para seqüências completas (escore inclui todos os domínios):

Seqüência Descrição Escore Valor-E N

gi|16416891|gb|AAL18451.1| toxin complex pr 323 .9 l.le-94 6

gi|3265037|gb|AAC38625.11 insecticidal tox 323 .9 l.le-94 6

gi|66047263|ref|YP_237104.1| Salmonella virul 323 .7 1.3e-94 6

gi|63257970|gb|AAY39066.1| Salmonella virul 323 .7 1.3e-94 6gi |36783948|emb|CAE12810.1| Insecticidal tox 321. 0 8. 3e-94 6

gi (37524524|ref|NP_927868.1| Insecticidal tox 321. 0 8. 3e-94 6

gi |28854730|gb|AA057793.1| insecticidal tox 312. 1 4e-91 6

gi |28871479|ref|NP_794098.1| insecticidal tox 312. 1 4e-91 6

gi |36784385|emb|CAE13264.1| Insecticidal tox 248. 0 8e-72 6

gi |37524959|ref|NP_928303.1| Insecticidal tox 248. 0 8e-72 6

gi |51510118|emb|CAH19031.1| unnamed protein 244. 2 1. le-70 6

gi |49021690|emb|CAG38449.1| unnamed protein 244. 2 1. le-70 6

gi |27479675|gb|AAO17202.1| TcdB2 [Photorhab 244. 2 1. le-70 6

gi |36784377|emb|CAE13256.1| Insecticidal tox 229. 4 3. 2e-66 6

gi 37524951|ref|NP_928295.1| Insecticidal tox 229. 4 3. 2e-66 6

gi 50956508|gb|AAT90757.1| putative insecti 229. 0 4. 2e-66 6

gi 16416930|gb|AAL18487.1| TcdBl; toxin com 227. 6 1. le-65 6

gi 9963679|gb|AAG09643.1| SepB [Serratia e 214. 1 1. 2e-61 6

gi 10956817|ref|NP_065277.11 SepB [Serratia e 214. 1 1. 2e-61 6

gi 13444938|emb|CAC34920.1| unnamed protein 214. 1 1. 2e-61 6

gi 51591126|emb|CAH22791.11 insecticidal tox 211. 8 5. 9e-61 6

gi 51597844|ref|YP_072035.1| insecticidal tox 211. 8 5. 9e-61 6

gi 45477499|gb|AAS66065.1| Y0185-like prote 211. 8 5. 9e-61 6

gi 32699986|gb|AAP57764.11 TcYF2 [Yersinia 207. 9 8. 9e-60 6

gi 159816Ò0|emb|CAC93148.l| insecticidal tox 201. 9 6e-58 6

gi 45443595 | ref |NP_995134 .11 insecticidal tox 201. 9 6e-58 6

gii 25511233|pir||AH0447 insecticidal tox 201. 9 6e-58 6

gi| 16123821|ref|NP_407134.1| insecticidal tox 201. 9 6e-58 6

gi| 22124105|ref|NP_667528.1| putative toxin s 201. 9 6e-58 6

gi| 45438465|gb|AAS64011.1| insecticidal tox 201. 9 6e-58 6

gi 1 21956856|gb|AAM83779.1|AE013618. _4 putative toxin s 201. 9 6e-58 6

gi| 14041732|emb|CAC38403.1| XptCl protein [X 178. 3 7. 7e-51 5

qi | 48730377lrefIZP 00264125.ll hvpothetical Dro 138. 4 7. 5e-39 6

gi 1 39576632|emb|CAE80796.1| hypothetical pro 13.5 0 .044 2

gi 1 42524423|ref|NP_969803.1| hypothetical pro 13.5 0 .044 2

gi| 23129574|ref|ZP_00111400.1| COG2931: RTX tox 5.7 0 .39 2|11360961 |pir||H82802 fimbrial assembl 2. 4 0 .99 1

gi (15837080 |ref|NP_297768.1 fimbrial assembl 2. 4 0 .99 1

gi |28199488 |ref|NP_779802.1 fimbrial assembl 2. 4 0 99 1

gi |53800360 |ref|ZP_00359737 11 COG3419: Tfp pil 2. 4 0 99 1

gi | 9105326| gb|AAF83288.1|AE003897_ _13 fimbrial assembl 2. 4 0 .99 1

gi |28057603 |gb|AA029451.l| fimbrial assembl 2. 4 0 99 1

gi |19704886 |ref|NP_602381.1 Fusobacterium ou -2 .0 3. 4 1

gi |19712775 |gb|AAL93680.1| Fusobacterium ou -2 .0 3. 4 1

gi |67760705 |ref|ZP_00499423 11 COG3321: Polyket -2 .3 3. 7 1

gi (67756256 |ref|ZP_00495142 1| COG3321: Polyket -2 .3 3. 7 1

gi 167738861 ]ref|ZP_00489483 1| COG3321: Polyket -2 .3 3. 7 1

gi 67710424 |ref|ZP_00480230. 1| COG3321: Polyket -2 .3 3. 7 1

gi 67683110 |ref|ZP_00477256. 1| COG3321: Polyket -2 .3 3. 7 1

gi 52212615 |emb|CAH38641.l| putative non-rib -2 .3 3. 7 1

gi 53722201 !ref|YP_111186.1, putative non-rib -2 .3 3. 7 1

gi 28199386 ref|NP_779700.1 hemolysin-type c -2 .4 3. 8 1

gi 28057492 gb|AA029349.1| hemolysin-type c -2 .4 3. 8 1

gi 67157564 ref|ZP_00418813. 11 CobN/magnesium c -2 .7 4. 1 1

gi 67085472 gb|EAM04946.l| CobN/magnesium c -2 .7 4. 1 1

gi 49532277 emb|CAG69989.l| competence facto -2 .7 4. 2 1

gi 50086301 ref|YP_047811.1| competence facto -2 .7 4. 2 1

gi 20803923 emb|CAD31501.1| HYPOTHETICAL PRO -2 .8 4. 3 1

gi 52857125 ref|ZP_00341419. 1| COG3419: Tfp pil -3 .2 4. 8 1

gi! 67546318 ref|ZP_00424233. 1| Amino acid adeny -3 .5 5. 1 1

gií 67532466 gb|EAM29252.1| Amino acid adeny -3 .5 5. 1 1

gi| 56750225 ref|YP_170926.1| hypothetical pro -4 .0 6 1

gi| 56685184J dbj|BAD78406.1| hypothetical pro -4 .0 6 1

gi| 46129819J ref|ZP_00164431. 2| COG2931: RTX tox -4 .0 6 1

gi I 67935982] ref |ZP_J)0528997. 1| conserved hypoth -4 .7 7. 2 1

gi| 67775076| gb|EAM34747.l| conserved hypoth -4 .7 7. 2 1

gi| 18466717| ref|NP_569524.1| putative phage t -4 .9 7. 5 1

gi| 16506033| emb|CAD09919.l| putative phage t -4 .9 7 . 5 1gi |28199311|ref|NP_779625.1| bacteriocin [Xyl -5.4 8.7 1

gi |28057417|gb|AA029274.l| bacteriocin [Xyl -5.4 8.7 1

gi |5834691|emb|CAB55188.1| putative phage t -5.7 9.5 1

gi |7467447|pir||T14966 phage lambda-rel -5.7 9.5 1

gi |31795379|ref|NP_857832.1| host specificity -5.7 9.5 1

gi |45478595|ref|NP_995451.1| phage lambda-rel -5.7 9.5 1

gi |45357248|gb|AAS58642.1| phage lambda-rel -5.7 9.5 1

gi |16082788|ref|NP_395342.1| host specificity -5.7 9.5 1

gi |3883049|gb|AAC82709.l| lambda host spec -5.7 9.5 1

É notado que há uma ruptura muito limpa de valores-E entre gi 1487303771 e gi 1395766321 (sublinhado duplo para clareza). As proteí-nas com valores-E abaixo daquele de gi 1487303771 (7.5e-39) foram extraí-das. Este conjunto de dados foi então pesquisado usando o sbvB_1s.hmmmodel e hmmsearch. Os resultados são apresentados abaixo:

15 Hmmsearch - busca de uma base de dados de seqüências com um perfilHMM

HMMER 2.3.1 (Junho de 2003)

Copyright (C) 1992-2003 HHM/Washington University School of MedicineDistribuído livremente sob GNU General Public License (GPL)

arquivo HMM: FinalTest/spvB Is.hmm [SpvB]

base de dados de seqüências: FinalTest/ProBBModel3Hits.fasta

corte de escore por seqüência: [nenhum]

corte de escore por domínio: [nenhum]

corte Eval por seqüência: <= 10

corte Eval por domínio: [nenhum]

HMM questão: SpvBAcesso: PF03534.330 Descrição: proteína B de 65 kDa de plasmídeo de viru-

lência Salmonella[HMM foi calibrada; valores-E são estimativas empíricas]Escores para seqüências completasSeqüência:_

(escore inclui todos os domínios):descrição Escore valor-E N

gi |16416891 |gb|AAL18451.l| toxin complex pr 871 .6 1. 4e- 261 1

gi l 3265037| gb|AAC38625.l| insecticidal tox 871 .6 1. 4e- 261 1

5 gi |36783948 |emb|CAE12810.l| Insecticidal tox 843 .0 5. 6e- 253 1

gi |37524524 |ref|NP_927868.1| Insecticidal tox 843 .0 5. 6e- 253 1

gi |9963679|gb|AAG09643.l| SepB [Serratia e 821 .5 1. 7e- 246 1

gi |10956817 |ref|NP_065277.1| SepB [Serratia e 821 .5 1. 7e- 246 1

gi |13444938 |emb|CAC34920.l| unnamed protein 821 .5 1. 7e- 246 1

10 gi |32699986 |gb|AAP57764.1| TcYF2 [Yersinia 730 .4 4. 3e- 219 1

gi 36784377 |emb|CAE13256.l| Insecticidal tox 586 .6 8. 5e- 176 1

gi 37524951 |ref|NP_928295.1| Insecticidal tox 586 .6 8. 5e- 176 1

gi 16416930 |gb|AAL18487.1| TcdBl; toxin com 578 .4 2. 5e- 173 1

gi 36784385 |emb|CAE13264.l| Insecticidal tox 574 .5 3. 9e- 172 1

15 gi 37524959 |ref|NP_928303.1| Insecticidal tox 574 .5 3. 9e- 172 1

gi 51510118 emb|CAH19031.l| unnamed protein 572 .1 2e- 171 1

gi 49021690 !emb|CAG38449.l| unnamed protein 572 .1 2e- 171 1

gi 27479675 gb|AAO17202.1| TcdB2 [Photorhab 572 .1 2e- 171 1

gi 50956508 gb|AAT90757.l| putative insecti 472 .8 1. 6e- 141 1

gi 15981600 emb|CAC93148.l| insecticidal tox 465 .9 1. 8e- 139 1

gi 45443595 ref|NP_995134.1| insecticidal tox 465 .9 1. 8e- 139 1

gi 25511233 pir||AH0447 insecticidal tox 465 .9 1. 8e- 139 1

gi 16123821 ref|NP_407134.1| insecticidal tox 465 .9 1. 8e- 139 1

gi 22124105 ref|NP_667528.1| putative toxin s 465 .9 1. 8e- 139 1

gi 45438465 gb|AAS64011.l| insecticidal tox 465 .9 1. 8e- 139 1

gi I 21956856 gb|AAM83779.1|AE013618. _4 putative toxin s 465 .9 1. 8e- 139 1

gi; 51591126 emb|CAH22791.l| insecticidal tox 460 .1 le- 137 1

gi| 51597844 ref|YP_072035.1| insecticidal tox 460 .1 le- 137 1

gi| 45477499 gb|AAS66065.1| Y0185-like prote 460 .1 le- 137

gi| 14041732 emb|CAC38403.l| XptCl protein [X 451 .3 4. 6e- 135 1

gi I 66047263 ref|YP_237104.1| Salmonella virul 288 .4 5 .2e -86 1

gi I 63257970 gb|AAY39066.1| Salmonella virul 288 .4 5 .2e -86 1gi|28854730|gb|AAO57793.1| insecticidal tox 277.8 7.6e-83 1

gi|28871479|ref|NP_794098.1| insecticidal tox 277.8 7.6e-83 1

gi|48730377|ref|ZP_00264125.1| hypothetical pro 191.9 5.6e-57 1

O conjunto acima foi des-replicado para remoção de duplicatas,deixando um conjunto de proteínas que são conhecidas como proteínas TCClasse B, como previamente identificadas por buscas BLAST padrões. [Asduplicações são de dois tipos - entradas duplicatas do mesmo gene, e pro-teínas idênticas de linhagens relacionadas de perto do mesmo organismo]. Alista des-replicada é apresentada abaixo:

Seqüência: Descrição Escore Valor-E N

gi |16416891 |gb|AAL18451.1| toxin complex pr 871 6 1.4e-261 1

gi |36783948 |emb|CAE12810.l| Insecticidal tox 843 0 5.6e-253 1

gi |37524524 |ref|NP_927868.1| Insecticidal tox 843 0 5.6e-253 1

gi |10956817 |ref|NP_065277.1| SepB [Serratia e 821 5 1.7e-246 1

gi 113444938 |emb|CAC34920.1| unnamed protein 821 5 1.7e-246 1

gi 32699986 |gb|AAP57764.l| TcYF2 [Yersinia 730 4 4.3e-219 1

gi 37524951 |ref|NP_928295.1| Insecticidal tox 586 6 8.5e-176 1

gi 16416930 |gb|AAL18487.l| TcdBl; toxin com 578 4 2.5e-173 1

gi 37524959 |ref|NP_928303.1| Insecticidal tox 574 5 3.9e-172 1

gi 27479675 igb|AAO17202.1| TcdB2 [Photorhab 572 1 2e-171 1

gi 50956508 gb|AAT90757.l| putative insecti 472 8 1.6e-141 1

gi 15981600 emb|CAC93148.l| insecticidal tox 465 9 1.8e-139 1

gi 22124105 ref|NP_667528.1| putative toxin s 465 9 1.8e-139 1

gi 45443595 ref|NP_995134.1| insecticidal tox 465 9 1.8e-139 1

gi 51597844 ref|YP_072035.1| insecticidal tox 460 1 le-137 1

gi 14041732 emb|CAC38403.1| XptCl protein [X 451 3 4.6e-135 1

gi 66047263 ref|YP_237104.1| Salmonella virul 288 4 5.2e-86 1

gi 28871479 ref|NP_794098.1| insecticidal tox 277 8 7.6e-83 1

gi 48730377 ref|ZP_00264125.1| hypothetical pro 191 9 5.6e-57 1

gi 45443595 ref|NP_995134.1| insecticidal tox 465 9 1.8e-139 1

Assim, este exemplo demonstra o surpreendente resultado de

que, em contraste a buscas BLAST padrões usadas para identificação deproteínas relacionadas por homologia de seqüência de aminoácidos total, épossível adicionalmente identificar proteínas relacionadas através do uso decombinações de estratégias de busca de domínio de proteína. Estas estra-tégias de domínio de proteína podem ser adquiridas a partir de uns relativa- mente poucos exemplos de proteínas contendo domínios que podem nãoser revelados através de algoritmos de busca de domínio padrões. Para esteexemplo, é irrelevante para o resultado final de busca se a buscaspvB_1s.hmm é feita primeiro ou em segundo.Proteínas TC Classe C.

Proteínas TC Classe C como anotadas em GenBank são mem-

bros da super-família de domínio RHS, que são caracterizados por conteremmúltiplas cópias do domínio RHS. [Nota: A terminologia domínio aqui usadaé tomada do sítio Pfam e os domínios podem ser pesquisados pelo nomenaquele sítio]. Ver também, C.W. Hill, C.H. Sandt, e D.A. Vlazny, "Rhs ele-

ments of Escherichia coli: a family of genetics composites each encoding alarge mosaic protein", Mol. Microbiol. Junho de 1994, 12(6):865-71; A.D. Mi-net, B.P. Rubin, R.P. Tucker, S. Baumgartner, e R. Chiquet-Ehrismann,"Teneurin-1, a vertebrate homologue of the Drosophila pair-rule gene tem-m,is a neuronal protein with a novel type of heparin-binding domain", J. Cell

Sei. 1999, 112:2019-2032. Todos os genes TC Classe C descobertos atéagora provêem de procariotes; por isso, o conjunto de busca inicial foi restri-to a seqüências de proteína procariótica. Uma busca de proteína emhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ foi realizada usando os termos de busca:"800:1100[SLEN] AND Prokaryota". Estes termos restringiram a busca àque-

Ias proteínas que estão entre 800 e 1100 aminoácidos em comprimento etêm fontes procarióticas. Um total de 54323 seqüência de proteínas foramidentificadas e baixadas como uma base de dados de pesquisa. Deve sernotado que, embora estas restrições sejam úteis no presente contexto, ocomprimento de intervalo das seqüências e o reino pesquisado podem ser

modificados para satisfazerem os parâmetros do conjunto de proteínas indi-viduais a ser examinado.

Um conjunto de proteínas TC Classe C a ser usado como a fon-te de domínios RHS foi adquirido usando o recurso Blink para GenBank Ac-cession 27479677 (TccC3 de Photorhabdus luminescens). Esta extraçãorendeu 38 proteínas procarióticas não-redundantes, relacionadas com esco-res maiores que 800. [O número de proteínas relacionadas acessível através

de Blink de qualquer dada proteína pode variar como tempo, uma vez queGenBank pode ser uma lista dinâmica]. Os números de acesso GenBankdas proteínas extraídas foram: 27479677, 27479683, 27479669, 37524966,37528020, 37528005, 16416915, 27479639, 37524950, 37528309,42742522, 32699988, 10956818, 51596618, 51596557, 45441893,

45441958, 14041731, 45443601, 51597848, 25511229, 45443600,50956512, 28871477, 28871480, 66044304, 66043853, 66047265,66045648, 66047259, 66047264, 66047260, 28868442, 48730374,48730375, 48730376, 48732572, e 48732573.

Um modelo HMM intermediário foi gerado através de extração

de domínios RHS encontrados nas proteínas acima usando o modelo RHSPfam genérico como acima. A lista de domínios foi dividida em duas partes,uma para ser usada como um conjunto semente e uma para ser usada parateste de modelo. Os alinhamentos de seqüências múltiplas ClustalX dos do-mínios RHS do conjunto semente são mostrados abaixo. Estes alinhamentos

podem ser usados com hmmbuild para geração de modelo RHS HMM usadoneste exemplo.

CLUSTALX (1.83) multiple sequence alignment

gí |27479639|RHS_domain_l ---- --------------ADATGALLTQT----DAKGNI - -

gi | 37524966|RHS_domain_l ---- --------------FDATGALLTQT----DAKSNI - -

gi |45441893|RHS_domain_l ---- --------------ADATGAVLTTT----DAKGNL- -

gi |51596557|RHS_domain_l ---- --------------ADATGAVLTTT----DAKGNL—

gi |48730374|RHS_domain_2 ---- --------------YSPLGAVLTQT----DAGGHQ--

gi |48730376|RHS_domain_2 ---- --------------FSAVGALLQTT----DAGGHL- -

gi |28871477|RHS_domain_2 ----

gi |66047265|RHS_domain_l ----

gi |28871480|RHS_domain_l ----

gi| 28868442|RHS_domain_2 ----gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gigi.

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi

gi I

gi|

gi

gi

gi

gi

gi

4544360166044304660456486604726066043853660456486604726066047259

66047264274796392747968327479669274796774544189328871480

660472652886844266043853274796835159784827479677;37524950!66047264487303742887147766047259454436005159784827479639375249664544189351596557

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_3

RHS_domain_3

RHS_domain_2

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_3

RHS_domain_4

RHS_domain_2

RHS„domain_4

RHS_domain_4

RHS_domain_3

RHS_doma i n_4

RHS_domain_4

RHS_domain_4

RHS_domain_2

ref|RHS_domain_3

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_3

RHS_domain_4

RHS_domain_4

RHS_domain_3

ref|NP_995139.1|

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS domain 1

■YNRAGQLIGSWL---TIKNSAE-

■ YDAQQRWSET----AGNGVI - ■

YDAQGHVTSET----AGNGVM--

■ YDAFNQVEQET----AGNGW- ■

■ YDAHGRIESQT----AGNGVI - ■

■ YDAQLRPVAII

ENGRCV-

YDAQLRPLAIN-

ESGRMT-

YDSSLRPVSVT-

■EQGLW-

-YDLHLRPTRII-----EQNRCA-

- WTPRGELKQVN----NGPGN-- -

-WTPRGELKQAN----NSAGN- - -

-WNTRGELKQVTPVSRESAS--D--WNTRGELQQVTLVKRDKGANDD--WTARNELLKVTPWRDGSTD-D-

-----------------WDARNQLQHITTVQREDGSNDD----------

-----------------WDVRNQLQHITTVQREDGSSDD----------

FDASGNLLALQAGQHLSWDRRNQLQHVRPVIRENGMDDS----------

-----------------WDSGNRLIKVDAVTRSEQPEDG----------

-----------------YSAAGQ-----KLREEHGNGIV----------

_----------------YSAAGQ-----KLRE E SGNGVI ----------

-----------------YEPETQRLIGIKTRRPSDTKVL----------

------yoSL-------YQLISATGREMANIGQQNNQLP- SPALPS -NN

------YDTL------YQLIEASGREVRNGASHGPALPGLQSLPTIDPC

------YDTL-------YRLISATGYSDAPPSDR-LGLP----QSTNPD

----^ _ YDAAGNLLQMRHEGAHNFTRNMHVDPDSNRSLP-------DND

------YDAAGNLLQMRHEG AHNFTRNMHVD PDSNRS L P-------DDE

-----------------YDPVGNILAIHN—DAEATRF YR---------

------------YNAFGQLIASR----DPRLEVDN-

-QRLAYDVA---GQLKGCWLTLKGQA-----

-QRLAYNVA---GQLKGSWLTLKNQSEQV- -

■QRMAYDVA---GLLSGSW-TLKDGTE----

■QRMAYDVA---GLLSGSWLTLKDGTE----g gigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigigi

|48730374|48730376|28871477|66047265(28871480|28868442|45443601|66044304|66045648|66047260|66043853|66045648|66047260| 66047259| 66047264|27479639|27479683| 27479669j|27479677j|45441893|28871480|66047265|28868442|66043853|27479683|51597848|27479677[37524950(66047264|48730374|28871477|66047259

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_3

RHS_domain_3

RHS_domain_2

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_l

RHS_domain_3

RHS_domain_4

RHS_domain_2

RHS_domain_4

RHS_domain_4

RHS_domain_3

RHS_domain_4

RHS_domain_4

RHS_domain_4

RHS_domain_2

ref|RHS_domain_3

RHS_domain_2

RHS_domain_2

RHS_domain_3

RHS_domain_4

RHS_domain_4

RHS domain_3

•QQSTYDVA---GQLNRVQLQINGQT-----

■QQSTYDIA---GQLVQVQLQLDGQA-----

■QRFSHGVA---GQLHAVELTLANTAQRQT •

■QAFGMTVA---GQLKAAGLT----------

■QLSTHNLA---GQLHSTDL-----------

-QVLVSAIQY-DAQERWSETAGNGVM----

■QVILRSLTY-SAAGQKLREESGNG------

■ STALYATE--DGRLLALSARRADGLM----

•TKALHDAA--NGRLIELKGTRADGQL----

■ SRYVYDLQ--DGRLIELSALSADGSV----

■SCASFDLA--DGRMSELITYRP-GVK----

TQGHNQCNQCIRHDDPAGSRTAERNQCNQLIRHDDTAGSRAAEHNQCNQLIRHDDTAGSRAAAHNQCNQLVRHDDTAGSR

-GMRQLKVSEQPTQ------

-GIRQLKVNEQQTQ------

-GMRRLKVSEQQ--------

-GRRMLKINEQQASNNAQT-

-SQRILKVSRQKTNT-----

-GQRCRLISTAQASGRT---

-GQRCRKISTAQASGRM---

-GQRLRKVRTTQAKT-----

-GQRLR--KTAKA-------

--TEY--SYEPETQ---RLIGITTRRPSDAK-----

—TEY--RYEPQTQ---RLIGIKTTRP--AK-----

--QDL--RYEYDPV---GNV-1SIRNDAEAT-----

TYTNYTRRYS YDH S

--ERRQYGGAD---ERFTYGGPA-■-ERLAYGGAD-■-ERFTYGQAG-•-EWYRYDSN--•-EWYRYDSN--■REWYRYGND--•REWYRYSGD--SESYRYDAA--■E-RYVYDGQ--E-RYVYDGQ--E-RYSYDAS--E-HYAYDAS--

QVSNYTQSYSYDAA- ■DRRNYVEHYDYDHG- ■RYVDF—ATSFDAN—GEVDF--ATSFDAN- ■

-GNL-TQIRHSSSAT-•GNL-LQMRHEGA---

-DNL-VKTIHVRDGTS-

• GNL-LQLVRGQT •■GNL-LQLVRGQT ■gi | 45443600 |ref|NP_995139.1| -----NQKIVPETTYRYDALYQLIEATGREADT---

gi | 51597848 | RHS_domain_l ------FRYQYSLS---GVPLRTDSVDSGSTL----

Esse alinhamento de seqüências múltiplas foi usado com hmm-build e hmmcalibrate para gerar CmodeU .hmm. o modelo CmodeM .hmm foi5 então testado contra o conjunto de amostras de 38 proteínas e foi capaz deidentificar todos os domínios RHS esperados. Ao contrário, quando o modeloCmodeU .hmm foi testado contra 20 proteínas selecionadas randomicamen-te, nenhum domínio RHS foi encontrado. O modelo CmodeU.hmm foi entãotestado com hmmsearch contra a base de dados de 54323 membros con-10 tendo todas as proteínas procarióticas entre 800 e 1100 aminoácidos, ren-dendo os resultados abaixo.

Hmmsearch - busca de uma base dé dados de seqüências com um perfilHMM

HMMER 2.3.1 (junho de 2003)15 Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of MedicineDistribuído livremente sob GNU General Public License (GPL)

arquivo HMM: FinalTest/CmodeU.hmm [Cdomain-

sUniqueCreate2]

20 Base de dados de seqüências: FinalTest/Prokaryotic800-1100.fasta

Corte de escore por seqüência: [nenhum]

Corte de escore por domínio: [nenhum]

corte Eval por seqüência: <= 10

Corte Eval por domínio: [nenhum]

25

HMM questão: CdomainsUniqueCreate2

Acesso: [nenhum]

Descrição: [nenhuma]

[HMM foi calibrada; valores-E são estimativas empíricas]

30 Escores para seqüências completas (escore inclui todos os domínios):

Seqüência:_Descrição_Escore Valor-E N

gi|66047260|ref|YP_237101.1| YD repeat [Pseu 202.3 7e-57 6

gi|63257967|gb|AAY39063.1| YD repeat [Pseu 202.3 7e-57 610

15

20

"25

30

gi |28854728|gb|AA057791.11 insecticidal to 200. 6 2 .3e- 56 6

gi 128871477|ref|NP_794096.11 insecticidal to 200. 6 2 .3e- ■56 6

gi |660472 65|ref|YP_237106.1| YD repeat [Pseu 178. 4 1 .le- 49 7

gi |63257972|gb|AAY39068.11 YD repeat [Pseu 178. 4 1 .le- 49 7

gi |28854731|gb|AA057794.1| insecticidal to 171. 2 1 .6e- •47 7

gi |28871480|ref|NP_794099.1| insecticidal to 171. 2 1 .6e- 47 7

gi |66047264|ref|YP_237105.1| YD repeat [Pseu 155. 3 le- 42 7

gi |63257971|gb|AAY39067.1| YD repeat [Pseu 155. 3 le- 42 7

gi |66047259|ref|YP_237100.1| YD repeat [Pseu 146. 6 4e- 40 6

gi !63257966|gb|AAY39062.11 YD repeat [Pseu 146. 6 4e- 40 6

gi 151510120|emb|CAH19032.l| unnamed protein 143. 2 4 .3e- 39 4

gi 49021696|emb|CAG38450.1| unnamed protein 143. 2 4 .3e- 39 4

gi 27479677|gb|AAO17204.11 TccC3 [Photorha 143. 2 4 .3e- 39 4

gi 28851680|gb|AA054756.11 insecticidal to 135. 0 1 .3e- 36 5

gi 28868442|ref|NP_791061.1| insecticidal to 135. 0 1 .3e- 36 5

gi 66045648|ref|YP_235489 .11 YD repeat [Pseu 134. 9 1 .4e- 36 4

gi 632 56355|gb|AAY37451.1| YD repeat [Pseu 134. 9 1 .4e- 36 4

gi 15981595|emb|CAC93143.l| putative insect 134. 1 2 .3e- 36 6

gi 454436011ref|NP_995140 .11 putative insect 134. 1 2 .3e- 36 6

gi 25511227|pir||AC0447 probable insect 134. 1 2 .3e- 36 6

gi 16123816|ref|NP_407129.1| putative insect 134. 1 2 .3e- 36 6

gi 22124111|ref|NP_667534.1| putative toxin 134. 1 2 .3e- 36 6

gi 45438471|gb|AAS64017.11 putative insect 134. 1 2 .3e- 36 6

gi I 21956863|gb | AAM83785 .11 AE013619_6 putative toxin 134 .1 2 .3e- 36 6

gi I 15981596|emb|CAC93144.1| putative insect 128. 3 1 .3e- 34 6

gi| 45443600|ref|NP_995139.1| putative toxin 128. 3 1 ,3e- 34 6

gi| 25511229|pir|JAD0447 probable insect 128. 3 1 .3e- 34 6

gi I 16123817|ref|NP_407130.1| putative insect 128. 3 1 .3e- 34 6

gi I 22124110|ref|NP_667533.1| putative toxin 128. 3 1 .3e- 34 6

gi| 45438470|gb|AAS64016.1| putative toxin 128. 3 1 .3e- 34 6

gi| 21956862|gb|AAM83784.1|AE013619_5 putative toxin 128. 3 1 .3e- 34 6

gi I 51591130|emb|CAH22795.1| putative insect 127. 9 1 .7e- 34 683

10

15

20

25

30

gi |51597848|ref|YP_072039.11 putative insect 127. 9 1 ,7e- 34 6

gi (27479639|gb|AAL18492.2| TccC2 [Photorha 127. 0 3 .2e- 34 4

gi |36784376|emb|CAE13255.11 Insecticidal to 124. 0 2 .6e- 33 4

gi (37524950(ref|NP_928294.1| Insecticidal to 124. 0 2 ,6e- 33 4

gi (36784383(emb(CAE13262.1| Insecticidal to 122. 1 9 .4e- 33 5

gi | 37524957|ref|NP_928301.11 Insecticidal to 122. 1 9 .4e- 33 5

gi |49021701|emb(CAG38451.1| unnamed protein 120. 5 2 .9e- 32 4

gi |27479669|gb|AA017196.1| TccC4 [Photorha 120. 5 2 ^9e- 32 4

gi | 66044304(ref|YP_234145.11 YD repeat [Pseu 119. 1 7 .8e- 32 5

gi | 63255011 |gb.|AAY36107.1| YD repeat [Pseu 119. 1 7 .8e- 32 5

gi | 51589839(emb|CAH21471.1| putative insect 118. 6 1 . le- 31 5

gi 15980309|emb(CAC91117.1| putative insect 118. 6 1 .le- 31 5

gi 45441893|ref|NP_993432.1| putative insect 118. 6 1 . le- 31 5

gi 25510685|pir|(AI0281 probable insect 118. 6 1 . le- 31 5

gi 16122536|ref|NP_405849.1| putative insect 118. 6 1 .le- 31 5

gi 51596557(ref|YP_070748.11 putative insect 118. 6 1 .le- 31 5

gi 22125912(ref|NP_669335.1| putative compon 118. 6 1 .le- 31 5

gi 45436756|gb|AAS62309.1| putative insect 118. 6 1 .le- 31 5

gi 21958849|gb|AAM85586.1|AE013804. _10 putative compon 118 .6 1 .le- 31 5

gi 15980376 | emb |CAC9U85.1| insecticial tox 114. 6 1 .8e- 30 6

gi 45441958(ref|NP_993497.1| insecticial tox 114. 6 1 .8e- 30 6

gi 25510725|pir||AE0290 insecticial tox 114. 6 1 ,8e- 30 6

gi 16122603(ref|NP_405916.l| insecticial tox 114. 6 1 ,8e- 30 6

gi í 45436821|gb(AAS62374.1| insecticial tox 114; 6 1 .8e- 30 6

gi I 36784392|emb(CAE13271.1| Insecticidal to 114. 1 2 .5e- 30 4

gi I 37524966|ref|NP_928310.1| Insecticidal to 114. 1 2 .5e- 30 4

gi I 9963680|gb|AAG09644.1| SepC [Serratia 113. 9 2 .8e- 30 4

gi I 10956818(ref|NP_065279.1| SepC [Serratia 113. 9 2 .8e- 30 4

gi I 13444939|emb|CAC34921.1| unnamed protein 113. 9 2 .8e- 30 4

gi I 51589900|emb|CAH21532.1] insecticial tox 111. 8 1 .2e- 29 6

gi I 51596618|ref|YP_070809.1| insecticial tox 111; 8 1 .2e- 29 6

gi I 36787747|emb(CAE16860.1| Insecticidal to 110. 7 2 .6e- 29 4gi |37528309 |ref|NP_931654.1| Insecticidal to 110 .7 2 .6e- -29

gi (49021704 |emb|CAG38452.l| unnamed protein 107 .5 2 .4e- •28

gi (27479683 |gbJAAOl7210.l| TccC5 [Photorha 107 .5 2 .4e- ■28

gi |16416915 |gb|AALl8473.l| toxin complex p 106 .5 4 .6e- 28

gi |3265044| 3b|AAC38630.l| insecticidal to 106 .5 4 ,6e- 28

gi |36787442 |emb|CAE16539.l| Insecticidal to 105 .5 9 ,8e- 28

gi |37528005 |ref|NP_931350.1| Insecticidal to 105 .5 9 .8e- 28

gi |48730374 |ref|ZP_00264122.1| COG3209: Rhs fa 99 .0 8 .7e- 26

gi |36787457 |emb|CAE16554.l| Insecticidal to 98 .9 9e- 26

gi | 37528020 |ref|NP_931365.1| Insecticidal to 98 .9 9e- 26

gi |36784380 |emb|CAE13259.l| Insecticidal to 96 .0 6 9e- 25

gi 37524954 |ref|NP_928298.1| Insecticidal to 96 .0 6 9e- 25

gi 66043853 |ref|YP_233694.1| YD repeat [Pseu 93 1 5e- 24

gi 63254560 |gb|AAY35656.l| YD repeat [Pseu 93 1 5e- 24

gi 32699988 gb|AAP57765.1| TcYF3 [Yersinia 91 4 1 7e- 23

gi 66045559 ref|YP_235400.1| YD repeat [Pseu 86 1 6 8e- 22

gi 63256266 gb|AAY37362.1| YD repeat [Pseu 86 1 6 8e- 22

gi 56414584 ref|YP_151659.l| Rhs-family prot 83 2 4 9e- 21

gi 56128841 gb|AAV78347.l| Rhs-family prot 83 2 4 9e- 21

gi 16759284 reflNP_454901.il Rhs-family prot 82 2 9 6e- 21

gi 16501575 emb|CAD08754.1| Rhs-family prot 82 2 9 6e- 21

gi 25511763 pir||AB0539 Rhs-family prot 82 2 9 6e- 21

gi 29142943 ref|NP_806285.1| Rhs-family prot 82 2 9 6e- 21

gi 29138575 gb|AAO70145.1| Rhs-family prot 82 2 9 6e- 21

gi 58581261 ref|YP_200277.l| hypothetical pr 76. 0 7e- 19

gi, 58425855 gb|AAW74892.1| conserved hypot 76 0 7e- 19

gi! 50955422 ref|YP_062710.1| RHS-related pro 72. 4 8 4e- 18

gi| 50951904 gb|AAT89605.l| RHS-related pro 72 4 8 4e- 18

gi| 21223079| ref|NP_628858.1| putative Rhs pr 72 0 1 2e- 17

gi| 7321289|emb|CAB82067,l| putative Rhs pr 72 0 1 2e- 17

gi 1 50956512| gb|AAT90761.11 putative insect 69 9 4 8e- 17

gi 1 32042609| ref|ZP_00140192.l| COG3209: Rhs fa 65. 7 9 le- 1610

15

20

25

30

gi |25496542|pir|JB86084 hypothetical pr 64 8 1 .7e- io 6

gi |12518845|gb|AAG59134.1|AE005624. _10 orf; Unknown fu 64 8 1 .7e- 15 6

gi |15804530|ref|NP_290570.1 1 hypothetical pr 64 8 1 .7e- 15 6

gi | 46164196|ref|ZP_00136739 .2| COG3209: Rhs fa 64. 5 2 .le- 15 10

gi 114041731|emb|CAC38402.11 XptBl protein [ 63. 4 4 .5e- 15 5

gi (42742522|gb|AAS45281.1| TccCl/XptBl pro 63 4 4 -5e- 15 5

gi | 48730376|ref|ZP_00264124 COG3209: Rhs fa 61, 5 1 ,7e- 14 6

gi | 48730375|ref|ZP_00264123 •1.1 COG3209: Rhs fa 60. 2 4 .le- 14 6

gi 117547189|ref|NP_520591.1 1 PROBABLE RHS-RE 58. 5 1 .3e- 13 6

gi 117429491|emb|CAD16177.1| PROBABLE RHS-RE 58. 5 1 -3e- 13 6

gi I 58581262|ref|YP_200278.1 1 hypothetical pr 57. 7 2 .4e- 13 6

gi 58425856|gb|AAW74893.1| conserved hypot 57. 7 2 .4e- 13 6

gi 48732572|ref|ZP_00266315 COG3209: Rhs fa 56. 4 5 .8e- 13 4

gi 48732573|ref|ZP_00266316 •1| COG3209: Rhs fa 51. 5 1 .8e- 11 4

gi 17430552|emb|CAD17236.1| PUTATIVE RHS-RE 50. 3 4e- 11 5

gi 17548306|ref|NP_521646.1 PUTATIVE RHS-RE 50. 3 4e- 11 5

gi 67660484(ref|ZP_00457830 11 YD repeat [Burk 49. 0 9 .9e- 11 6

gi 67091947|gb|EAM09510.1| YD repeat [Burk 49. 0 9 .9e- 11 6

gi 67932920|ref|ZP_00526052. 1| YD repeat [Soli 47. 9 2e- 10 7

gi 67859831|gb|EAM54893.1| YD repeat [Soli 47. 9 2e- 10 7

gi 15981529|emb|CAC93077,l| putative export 45. 7 9 .5e- 10 5

gi i 45443670(ref|NP_995209.1| hypothetical pr 45. 7 9 .5e- 10 5

gi I 25511182|pir||AI0438 probable export 45. 7 9 .5e- 10 5

gi| 16123750|ref|NP_407063.1| hypothetical pr 45. 7 9 .5e- 10 5

gi I 22124186|ref|NP_667609.1| Rhs-like protei 45. 7 9 .5e- 10 5

gi| 45438540|gb|AAS64086.1| putative export 45. 7 9 .5e- 10 5

gi| 21956945|gb|AAM83860.1|AE013626_ .7 Rhs-like protei 45. 7 9 ^5e- 10 5

gi| 66048214|ref|YP_238055.1| YD repeat [Pseu 44. 1 3e- 09 5

gi I 63258921|gb|AAY40017.1| YD repeat [Pseu 44. 1 3e- 09 5

gi I 50841691|ref|YP_054918.1| RHS-family prot 43. 8 3 .5e- 09 3

gi I 50839293|gb|AAT81960.1| RHS-family prot 43. 8 3 . Se- 09 3

gi| 66963410|ref|ZP_00410982. 1| YD repeat [Arth 41. 8 1 me- 08 9gi (66871070 |gb|EAL98434.1| YD repeat [Arth 41. 8 1.4e-08 9

gi |17432059 |emb|CAD18736.l| PUTATIVE RHS-RE 36. 0 7.7e-07 4

gi 117549804 |reflNP_523144.ll PUTATIVE RHS-RE 36. 0 7.7e-07 4

gi | 67757182 |ref|ZP_00496060. 11 COG3209: Rhs fa 31. 1 2.4e-05 4

gi |17430924 |emb|CADl7606.1| PROBABLE RHS-RE 26. 8 0.00045 4

gi 117548676 lreflNP_522016.ll PROBABLE RHS-RE 26. 8 0.00045 4

gi |50841692 |ref|yp_054919.l| RHS-family prot 26. 6 0.00054 4

gi |50839294 |gb|AAT81961.1| RHS-family prot 26. 6 0.00054 4

gi '67760154 |ref|ZP_00498879. 1| COG3209: Rhs fa 24. 9 0.0018 5

gi 67756692 |ref|ZP_00495573. 1| COG3209: Rhs fa 24. 9 0.0018 5

gi 67711658 !ref|ZP_00481464. 1| COG3209: Rhs fa 24. 9 0.0018 5

gi 67685220 ref|ZP_00479096. 1| COG3209: Rhs fa 24. 9 0.0018 5

gi 67671863 ref|ZP_00468647. 1| COG3209: Rhs fa 24. 9 0.0018 5

gi 29826985 ref|NP_821619.1| putative cell w 23. 9 0.0036 4

gi 29604082 dbj|BAC68154.1| putative cell w 23. 9 0.0036 4

gi 67738391 ref|ZP_00489054. 1| COG3209: Rhs fa 23. 6 0.0042 5

gi 66963411 ref|ZP_00410983. 1| YD repeat [Arth 21. 8 0.015 3

gi 66871071 gb|EAL98435.1| YD repeat [Arth 21. 8 0.015 3

gi 28850838 gb|AA053917.l| Rhs faitvily prot 21. 0 0.026 3

gi 28867603 ref|NP_790222.1| Rhs family prot 21. 0 0.026 3

gi 67941206 ref|ZP_00533425. 1| YD repeat [Chio 19. 5 0.071 2

gi 67912581 gb|EAM62210.l| YD repeat [Chio 19. 5 0.071 2

gi 28852674 gb|AA055747.l| YD repeat prote 17. 8 0.24 2

gi 28869433 ref|NP_792052.1| YD repeat prote 17. 8 0.24 2

gi i 24112019 ref|NP_706529.1| putative Rhs-fa 16. 9 0.38 2

gi i 24050837 gb|AAN42236.l| putative Rhs-fa 16. 9 0.38 2

gi 1 67158725 ref|ZP_00419586. 1| PAS [Azotobacte 12. 9 1.6 1

gi 1 67084598; gb|EAM04080.l| PAS [Azotobacte 12. 9 1.6 1

gi 1 26988616, ref|NP_744041.1| hypothetical pr 12. 7 1.7 1

gi 1 24983394, gb|AAN67505.1|AE016378_4 hypothetical pr 12 .7 1.7 1

gi 1 46311839J ref|ZP_00212441. 1| COG3501: Unchar 10.0 4.3 1

Embora maioria dos acertos nesta lista sejam proteínas TCClasse C, em contraste às proteínas TC Classe B descritas acima, não háum corte claro de valor-E definindo um limite entre as proteínas TC Classe Ce todas as outras proteínas feitas escore. Não obstante, a vasta maioria deacertos melhores que e-10 são proteínas TC Classe C, e não existem prote-5 ínas TC Classe C conhecidas abaixo desta marca. De fato, os primeiros 80acertos (até gi 1326999881) são todas proteínas TC Classe C, e pelo menos75%[88/116] das proteínas com escores melhores que e-10 são conhecidasproteínas TC Classe C ou são anotadas como tal. Nenhuma das 38 proteí-nas TC Classe C selecionadas teve um escore abaixo de 1.8e-11. Por isso,

10 refino de critérios de busca como representado neste modelo HMM demons-tra que ele é uma efetiva ferramenta para busca para proteínas TC Classe Cem uma base de dados. A identificação de aproximadamente 88 acertos de54323 proteínas representa em aumento em eficiência de busca e rigorosi-dade por um fator de mais que 600 vezes. Algumas incertezas existem em

15 que algumas das proteínas feitas escore neste modelo, mas não anotadascomo proteínas TC Classe C podem, de fato, ser proteínas TC Classe C.

A inabilidade do Cmodell.hmm para gerar escores que permi-tam completa separação entre proteínas TC Classe C e todas as outras pro-teínas na classe de tamanho de 800-1100 aminoácidos é provavelmente

20 devida ao fato de que a família de proteína TC Classe C ser um membro deuma maior super-família de proteínas RHS. Embora a maioria de outrosmembros da superfamília sejam maiores que as proteínas TC Classe C, alipode haver uma sobreposição suficiente em tamanho para prevenir comple-ta discriminação. Como será visto abaixo, o uso de um modelo RHS em con-

25 junção com outros modelos de domínio é um processo efetivo de distinçãode proteínas TC Classe B/C fundidas de outras entradas em uma base dedados de proteínas.

Proteínas TC Classe B/C Fundidas Arqueais e Procarióticas.

Proteínas correspondendo a proteínas de Complexo Toxina30 Classe B/C fundidas são encontradas em todos os três reinos, e todas têm oformato de domínio genérico de um domínio spvB seguido por múltiplos do-mínios FG-GAP seguidos por domínios RHS múltiplos. Entretanto, algumasdiferenças na estrutura destes domínios (ou sub-domínios) não permitem umsimples conjunto de modelos HMM cobrir todos os três casos, de modo queeles são analisados separadamente.

Em contraste a proteínas TC Classe B simples (ver acima) os

1 domínios spvB de proteínas TC Classe B/c fundidas de procariotes não sãoaltamente conservados de modo que o modelo spvB Pfam foi impróprio parageração de modelo. Embora existam três classes de domínios representa-das nas proteínas TC Classe B/C fundidas arqueais e procarióticas, é pre-sentemente demonstrado que o uso de modelos HMM para somente duas

das mesmas é suficiente para selecionar as proteínas TC B/C fundidas apartir de um conjunto de dados.

Uma busca de proteína no website ncbi.nlm.nih.gov foi realizadausando os termos de busca: "1700:2800[SLEN] AND Prokaryota". Estes ter-mos restringiram a busca àquelas proteínas que estão entre 1700 e 2800

aminoácidos em comprimento e têm fontes procarióticas e arqueais. [É umacaracterística inerente de GenBank que uma busca limitada a procariotestambém extrairá genes arqueais]. Um total de 3303 seqüências de proteínasforam identificadas e baixadas como uma base de dados de pesquisa. Deveser notado que, embora estas restrições sejam úteis no presente contexto, o

comprimento de intervalo das seqüências e o reino pesquisado podem sermodificados para satisfazerem os parâmetros do conjunto de proteínas indi-viduais a ser examinado.

Nem o modelo FG-GAP Pfam nem o modelo de HMM proteínaTC Classe B (simples) não-fundida (acima) provaram satisfatórios para veri-

ficação de domínios FG-GAP em proteínas TC Classe B/C fundidas de pro-cariotes e arqueais. Um novo modelo satisfatório foi por isso criado a partirde números de acesso de GenBank 48862345 e 13475700 tomando-se osdomínios FG-GAP encontrados por Pfam e fixando o escore de corte para 1.Os alinhamentos de seqüências múltiplas ClustalX dos domínios FG-GAP

são mostrados abaixo. Estes alinhamentos podem ser usados com hmm-build para geração de modelo HMM FG-GAP (Bmodel17.hmm) usado nesteexemplo.Clustal X (1.83) alinhamento de seqüências múltiplas

gi 48862345 BDomain7 PESGISVGDINADGLTDVLYHNNGQV----EVYLS--

gi 13475700 BDomain5 ISSGTTIGDFNGDGLPDF-------------------

gi 48862345 BDomain3 PTTQFQPIDINGDGELDVAWL----------------

gi 48862345 BDomain4 --------DYNADGHADVAIY----------------

gi 48862345 BDomainl --ADYFSGDMNGDREEDYFIRGYQAG----EPAL---

gi 48862345 BDomain2 RRNTIALQDYNLDGRMDLVLLSGVGGY---WDVI--

gi 13475700 BDomain4 SGTTGVLRDFDNDGKADWTITG-GG-----IGS---

gi 48862345 BDomain5 --------DVNGDGLTDALTESR----:----VY----

gi 48862345 BDomain9 EDKVIRLLDVNGDGLLDLVSESKSDSTTKFNVYHW--

gi 48862345 BDomain8 GGANYVFSDVNGDSHTDLITFYDER----LSIH----

gi 13475700 BDomain3 G SGTCVLADVNGDGATDIVRYDGLN----LSAGVWLS

gi 48862345 BDomain6 -----GFGDFNGDGRLDLLVGD---------------

gi 13475700 BDomainl TEAPREVGDLDFDGRDEIFGDYSEATDQRSGGREGET

gi 13475700 BDomain2 --GASGIG----VG--DFLGN----------GR----

Domínio 1 da proteína TC Classe B/C fundida de número de a-cesso de GenBank 13475700 foi consideravelmente maior e foi cortado paraaperfeiçoar o modelo. O modelo Bmodel.hmm foi então testado com hmm-search contra a base de dados de 3303 membros contendo todas as proteí-5 nas procarióticas (e arqueais) entre 1700 e 2800 aminoácidos de compri-mento, rendendo os resultados abaixo. [A lista de produção original foi trun-cada para remoção de um grande número de proteínas com escores muitoaltos].

Hmmsearch - busca de uma base de dados de seqüências com um perfil10 HMM

HMMER 2.3.1 Qunho de 2003)

Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of MedicineDistribuído livremente sob GNU General Public License (GPL)

15 arquivo HMM: FinalTest/Bmodel7.hmm [BdomaisMo-

del7Sequences]

base de dados de seqüências: FinalTest/Prokaryotic1700-2800.fasta

corte de escore por seqüência: [nenhum]

corte de escore por domínio: [nenhum]

20 corte Eval por seqüência: <= 10

corte Eval por domínio: [nenhum]

HMM questão: BdomainsModel7SequencesAcesso: [nenhum]

Descrição: [nenhuma]

[HMM foi calibrado; valores-E são estimativas empíricas]

Escores para seqüências completas (escores incluem todos os domínios):

Seqüência: Descrição Escore Valor- -E N

gi |48862345 |ref|ZP_00316242.1| COG3209: Rhs f 236 .4 2 .2e- 68 10

gi 113475700 |ref|NP_107267.1| hypothetical p 124 .1 1 .5e- 34 5

gi |14026456 |dbj|BAB53053.1| mll6838 [Mesor 124 .1 1 ,5e- 34 5

gi |27367604 |ref|NP_763131.1| Rhs family pro 101 .4 le- 27 7

gi |27359176 |gb|AAO08121.1|AE016812 _103 Rhs family pro 101 .4 le- 27 7

gi |48863870 |ref|ZP_00317763.1| COG3209: Rhs f 95 .0 8 .6e- 26 8

gi 148833214 |ref|ZP_00290236.l| COG2931: RTX t 87 .0 2 .le- 23 11

gi '45657896 |ref|YP_001982.1| cytoplasmic me 79 .7 3 .4e- 21 7

gi 45601137 |gb|AAS70619.l| cytoplasmic me 79 .7 3 .4e- 21 7

gi 24214465 |ref|NP_711946.1| Rhs family pro 78 .2 9 • 3e- 21 7

gi 24195416 gb|AAN48964.1|AE011353. _4 Rhs family pro 78 .2 9 .3e- 21 7

gi 45656716 ref |YP__000802.1| cytoplasmic me 74 .8 le- 19 6

gi 45599952 gb|AAS69439.l| cytoplasmic me 74 .8 le- 19 6

gi 67919346 ref|ZP_00512927.l| Integrins alph 69 .1 5 .le- 18 6

gi 67783058 gb|EAM42456.l| Integrins alph 69 .1 5 .le- 18 6

gi 39576631 emb|CAE80795.1| hypothetical p 67 .9. 1 .2e- 17 8

gi 42524422 ref|NP_969802.1| hypothetical p 67 .9 1 .2e- 17 8

gi 20090892 ref|NP_616967.1| hypothetical p 63 .0 3 .6e- 16 6

gi 19915968 gb|AAM05447.1| hypothetical p 63 .0 3 .6e- 16 6

gi 24216032 ref|NP_713513.1| hypothetical p 59 .6 3 .9e- 15 7

gi 24197262 gb|AAN50531.1|AE011493. _4 conserved hypo 59 .6 3 .9e- 15 7

gi .33632688 emb|CAE07500.1| conserved hypo 58 .7 7 .2e- 15 0

gi 33865519; ref|NP_897078.1| hypothetical p 58 .7 7 .2e- 15 10

gi 48893475, ref|ZP_00326711.1| COG3391: Uncha 38 .5 8 .7e- 09 7

gi 67932250) ref|ZP_00525397.1| Integrins alph 38 .3 le- 08 2

gi 67860476) gb|EAM55523.1| Integrins alph 38 .3 le- 08 2

gi 67762147| ref|ZP_00500850.1| COG3209: Rhs f 32 .2 6 .5e- 07 4gi |67739010|ref|ZP_00489616.1| COG3209: Rhs f 32 .2 6. 5e-07 4

gi |67670205|ref|ZP_00467015.11 COG3209: Rhs f 32 .2 6. 5e-07 4

gi | 67653219|ref|ZP_00450636.11 COG3209: Rhs f 32 .2 6. 5e-07 4

gi | 67648765|ref|ZP_00446993.11 C0G32O9: Rhs f 32 .2 6. 5e-07 4

gi |67642373|ref|ZP_00441130.1| COG3209: Rhs f 32 .2 6. 5e-07 4

gi |67636722|ref|ZP_00435666.1| COG3209: Rhs f . 32 .2 6. 5e-07 4

gi |67629702|ref|ZP_00429560.1| COG3209: Rhs f 32 .2 6. 5e-07 4

gi | 53718233|ref|YP_107219.l| putative membr 32 .2 . 6. 5e-07 4

gi | 52208647|emb|CAH34583.11 putative membr 32 .2 6. 5e-07 4

gi | 53724907]ref|YP_101869.11 FG-GAP/YD repe 32 .2 6. 5e-07 4

gi 1 52428330|gb|AAU48923.11 FG-GAP/YD repe 32 .2 6. 5e-07 4

gi 67713631|ref|ZP_00482992.1| COG3209: Rhs f 31 .0 1. 6e-06 4

gi 67683974|ref|ZP_00478003.1| COG3209: Rhs f 31 .0 1. 6e-06 4

gi 20089734|ref|NP_615809.1| cell surface p 27 .6 1. 7e-05 6

gi 19914667lab1AAM04289.11 cell surface d 27 .6 1. 7e-05 6

gi 20092500|ref|NP_618575.1| cell surface p 21 .7 0. 00067 5

gi 19917767|gb|AAM07055.1| cell surface p 21 .7 0. 00067 5

gi 48838750|ref|ZP_00295689.1| COG3291: FOG: 16 .4 0 .0067 4

gi 32446373|emb|CAD76201.1| probable fibri 14 .6 0.014 2

gi 32475830)ref|NP_868824.1| probable fibri 14 .6 0.014 2

gi 20092499(ref|NP_618574.1| cell surface p 10 .0 0.1 2

gi 19917765|gb|AAM07054.1| cell surface p 10 .0 0.1 2

gi I 15597071|ref|NP_250565.1| hypothetical p 7 .9 0.26 1

gi I 11349338|pir||A83412 hypothetical p 7 .9 0.26 1

gi| 32041947|ref|ZP_00139530.1| COG5295: Autot 7 .9 0.26 1

gi| 9947864|gb|AAG05263.1|AE004613_8 hypothetical p 7 .9 0.26 1

gi I 67936217|ref|ZP_00529228.1| Hemolys in-type 7 .6 0.29 3

gi I 67774841|gb|EAM34516.1| Hemolysin-type 7 .6 0.29 3

gi| 33440441|gb|AAQ19127.1| putative adhes 7 .2 0.35 1

gi I 31616734|emb|CAD60101.1| peptide synthe 7 .0 0.38 1

gi| 31505496|gb|AA062586.l| peptide sythet 7 .0 0.38 1

gi I 67756274|ref|ZP_00495160.1| COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3gi |677542311ref|ZP_00493144 , •1| COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gi |67754221 |ref |ZP_00493134, ■11 COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gí |67752361 |ref |ZP_00491350.1| COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gi |67752064 |ref |ZP_00491084. ■1| COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gi |67710451 |ref | |ZP_00480257. •1| COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gi| |67710442 |ref | |ZP_00480248. ■11 COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gi| |67682395 |ref| |ZP_00476633. •1| COG3209: Rhs f 6 .6 0.45 3

gi| |17431402 |emb| |CAD18081.1| SKWP PROTEIN 3 6 .4 0.5 1

gi| 1175491511 |ref| NP_522491.l| 1 SKWP PROTEIN 3 6 .4 0.5 1

gi| 48731764| |ref| ZP_00265508. ■1| COG2132: Putat 6 .3 0.52 1

Ê notado que gi 1199146671, com um valor-E de 1.7e-5 (duplo

sublinhado para clareza), é a proteína de última entrada com 6 domínios FG-GAP. Proteínas com este escore ou melhor foram extraídas de GenBank eforam usadas para criação de um conjunto de dados de pesquisa para o se-15 guinte ciclo de análises. O modelo Pfam RHS genérico rhs_1s.hmm foi usa-do no lugar de criação de um novo modelo HMM RHS específico para prote-ínas B/C fundidas. Os resultados da busca são mostrados abaixo:Hmmsearch - busca de uma base de dados de seqüências com um perfilHMM

20 HMMER 2.3.1 (junho de 2003)

Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of MedicineDistribuído livremente sob GNU General Public License (GPL)

arquivo HMM: FinalTest/rhs_1s.hmm [RHS_repeat]

base de dados de seqüências: FinalTest/ProLargeModel7Hits.fasta

corte de escore por seqüência: [nenhum]

corte de escore por domínio: [nenhum]

corte Eval por seqüência: <=10

corte Eval por domínio: [nenhum]

HMM questão: RHS_repeat

Acesso: PF05593.3

descrição: repetição RHS[HMM foi calibrado; valores-E são estimativas empíricas]

Escores para seqüência completas (escore inclui todos os domínios):

Seqüência: Descrição Escore Valor-E N

gi 119915968 |gb|AAM05447.1| hypothetical p 153. 0 3 .5e- 45 9

gi |20090892 |ref|NP_616967.1| hypothetical p 153 . 0 3 .5e- 45 9

gi |45656716 |ref|YP_000802.1| cytoplasmic me 151. 7 9e- 45 1

gi |45599952 |gb|AAS69439.1| cytoplasmic me 151. 7 9e- 45 11

gi |24197262 |gb|AAN50531.1|AE011493. _4 conserved hypo 145. 6 6 .3e- 43 11

gi |24216032 |ref|NP_713513.1| hypothetical p 145. 6 6 .3e- 43 11

gi 114026456 |dbj|BAB53053.1| mll6838 [Mesor 133. 2 3 .4e- 39 7

gi |13475700 |ref|NP_107267.11 hypothetical p 133. 2 3 .4e- 39 7

gi |45601137 |gb|AAS70619.l| cytoplasmic me 125. 5 6 .8e- 37 8

gi 45657896 ref|YP_001982.1| cytoplasmic me 125. 5 6 .8e- 37 8

gi 24195416 |gb|AAN48964.1|AE011353. _4 Rhs family pro 122. 8 4 .5e- 36 8

gi 24214465 ref|NP_711946.1| Rhs family pro 122. 8 4 .5e- 36 8

gi 67739010 ref|ZP_00489616.1| COG3209: Rhs f 116. 4 3 .8e- 34 9

gi 53718233 ref|yP_107219.l| putative membr 116. 4 3 .8e- 34 9

gi 52208647 emb|CAH34583.l| putative membr 116. 4 3 .8e- 34 9

gi 67713631 ref |ZP_00482992.ir COG3209: Rhs f 116. 4 3 .8e- 34 9

gi 67683974 ref|ZP_00478003.1| COG3209: Rhs f 116. 4 3 .8e- 34 9

gi 67653219 ref|ZP_00450636.1| COG3209: Rhs f 114. 0 2e- 33 9

gi 67636722 ref|ZP_00435666.1| COG3209: Rhs f 114. 0 2e- 33 9

gi 67642373 ref|ZP_00441130.1| COG3209: Rhs f 114. 0 2e- 33 9

gi 53724907 ref|YP_101869.1| FG-GAP/YD repe 114. 0 2e- 33 9

gi 52428330 gb|AAU48923.l| FG-GAP/YD repe 114. 0 2e- 33 9

gi i 67762147| ref|ZP_00500850.1| COG3209: Rhs f 113. 4 2 .9e- 33 9

gi I 67648765| ref|ZP_00446993.l| COG3209: Rhs f 113. 4 3 -le- 33 9

gi I 67629702| ref|ZP_00429560.1| COG3209: Rhs f 113. 4 3 ,le- 33 9

gi| 67670205| ref|ZP_00467015.1| COG3209: Rhs f 113. 3 3 .2e- 33 9

gi I 27359176] gb|AAO08121.1|AE016812. _103 Rhs family pro 95. 5 7 .le- 28 8

gi I 27367604| ref|NP_763131.1| Rhs family pro 95. 5 7 .le- 28 8

gi I 48863870| ref|ZP_00317763.l| COG3209: Rhs f 67. 6 1 .8e- 19 9gi |19915968 |gb|AAM05447.1| hypothetical p 63 .0 3 6e-16 6

gi |24216032 |ref|NP_713513.1| hypothetical p 59 .6 3 .9e-15 7

qi 48862345 IreflZP 00316242. 11 COG3209: Rhs f 53 .3 3 ,6e-15 11

gi 48833214 |ref|ZP_00290236. 1| COG2931: RTX t -2 .4 0.41 1

gi 20089734 |ref|NP_615809.1| cell surface p -3 .5 0.57 1

gi 19914667 |gb|AAM04289.l| cell surface p -3 .5 0.57 1

gi 67860476 gb|EAM55523.1| Integrins alph -6 .1 1.2 1

gi 67932250 ref|ZP_00525397. 1| Integrins alph -6 1 1.2 1

gi 33632688 emb|CAE07500.1| conserved hypo -9 .5 3.3 1

gi 33865519 ref|NP_897078.1| hypothetical p -9 5 3.3 1

gi 67919346 ref|ZP_00512927. 1| Integrins alph -10 .2 4 1

gi 67783058 gb|EAM42456.l| Integrins alph -10 2 4 1

gi 39576631 emb|CAE80795.1| hypothetical p -12 .6 7.6 1

gi; 42524422 ref|NP_969802.1| hypothetical p -12 6 7.6 1

gi| 48893475 ref|ZP_00326711. 1| COG3391: Uncha -12 6 7.7 1

É notado que a uma ruptura muito limpa de valores-E entregi|48862345| (valor-E~e-15) e gi|48833214|(valor-E 0,41)(sublinhado du-plo por clareza). Uma lista des-replicada de proteínas segue-se abaixo:

Escores para seqüências completas (escore inclui todos os domínios):

Seqüência: Descrição Escore Valor-E N

gi |20090892 |ref|NP_616967.1| hypothetical p 153. 0 3 5e- 45 9

gi 45656716 |ref|YP_000802.1| cytoplasmic me 151. 7 9e- 45 1

gi 24197262 |gb|AAN50531.1|AE011493. _4 conserved hypo 145. 6 6 3e- 43 11

gi 14026456 dbj|BAB53053.1| m!16838 [Mesor 133. 2 3 4e- 39 7

gi 45601137 gb|AAS70619.1| cytoplasmic me 125. 5 6 8e- 37 8

gi 24195416 gb|AAN48964.1|AE011353. _4 Rhs family pro 122. 8 4 5e- 36 8

gi 67739010 ref|ZP_00489616.1| COG3209: Rhs f 116. 4 3 8e- 34 9

gi 67653219 ref|ZP_00450636.l| COG3209: Rhs f 114. 0 2e- 33 9

gi 67762147 ref|ZP_00500850.1| COG3209: Rhs f 113. 4 2 9e- 33 9

gi 67648765 ref|ZP_00446993.l| COG3209: Rhs f 113. 4 3 le- 33 9

gi 67670205 ref|ZP_00467015.1| COG3209: Rhs f 113. 3 3 2e- 33 9

gi 27359176 gb|AAO08121.1|AE016812. _103 Rhs family pro 95. 5 7 . le- 28 8gi|48863870|ref|ZP_00317763.1| COG3209: Rhs f 67.6 1.8e-19 9

gi|48862345|ref|ZP_00316242.1| COG3209: Rhs f 53.3 3.6e-15 11

Assim, este exemplo demonstra que seqüências de proteína TCClasse B/C fundidas dentro de grandes conjuntos de dados podem ser iden- tificadas a partir de suas estruturas de domínio de proteína compartilhadas,na ausência de outra informação de seqüência de aminoácidos além decomprimento.

Proteínas T/C Classe B/C Fundidas Eucarióticas.

Modelos para identificação de proteínas eucarióticas correspon-

dendo a proteínas TC Classe B/C fundidas foram desenvolvidos em umamaneira levemente diferente a partir do modelo procariótico / Arqueal. O úni-co exemplo conhecido, a partir de Gibberella zeae, tem um domínio spvB(raramente encontrado em proteínas eucarióticas) que se adapta de perto aomodelo Pfam. A proteína TC Classe B/C fundida G. zeae também tem domí-

nios FG-GAP que podem ser verificados usando o modelo FG-GAP Bmo-dels3.hmm desenvolvido para as proteínas TC Classe B não-fundidas acima.Quando usados juntos, estes dois modelos foram poderosos o suficientepara selecionar a proteína G. zeae a partir de uma base de dados, assim ummodelo HMM RHS não foi desenvolvido. Aqueles versados na técnica po-

dem perceber que um tal modelo RHS pode ser facilmente desenvolvido u-sando estes ensinamentos. Um tal modelo RHS adicional pode ser útil, porexemplo, se todas as proteínas de GenBank fossem pesquisadas ao invésdo subconjunto testado abaixo.

Uma busca de proteínas em http://www.ncbi.nlm.nih.QOv/ foi rea-

lizada usando os termos de busca: "1700:2800[SLEN] AND Eukaryota". Es-tes termos restringiram a busca àquelas proteínas que estão entre 1700 e2800 aminoácidos de comprimento e têm uma fonte eucariótica. Um total de19550 seqüências de proteínas foram identificadas e baixadas como umabase de dados de pesquisa. Deve ser notado que, embora estas restrições

sejam úteis no presente contexto, o comprimento de intervalo das seqüên-cias e o reino pesquisado podem ser modificados para satisfazerem os pa-râmetros do individual conjunto de proteínas a ser examinado.O conjunto de dados foi testado primeiro contra o modelo FG-GAP. Este modelo foi considerado ser o menos discriminante dos dois usa-dos, uma vez que proteínas eucarioticas contendo domínios FG-GAP sãoconhecidas existirem. Entretanto, como mostrado abaixo, somente um

membro simples das 19550 proteínas do conjunto de buscas teve um acertosignificante. [GenBank Accessions gi 1461381031 e gi 1425456091 são en-tradas duplicatas]. Este resultado indica que o modleo FG-GAP é substanci-almente discriminador para proteínas conhecidas dentro da faixa de compri-mento de seqüência de 1700 e 2800.

Hmmsearch - busca em uma base de dados de seqüências com um perfilHMM

HMMER 2.3.1 Qunho de 2003)

Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of MedicineDistribuído livremente sob GNU General Public License (GPL)

<formula>formula see original document page 97</formula>

arquivo HMM: FinalTest/Bmodels3.hmm [Bdo-

mainsModel3Sequences]

base de dados de seqüências: FinalTest/EukaryoticGenBankl 700-

2800.fasta

corte de escore por seqüência: [nenhum]

corte de escore por domínio: [nenhum]

corte Eval por seqüência: <= 10

corte Eval por domínio: [nenhum]

HMM questão: BdomainsModel3Sequences

Acesso: [nenhum]

Descrição: [nenhuma]

[HMM foi calibrado; valores-E são estimativas empíricas] Escores para seqüências completas (escore inclui todos os domínios):

Seqüência: Descrição Escore Valor-E N

gi|46138103|ref|XP_390742.1| hypothetical protei 61.6 5.5e-15 3

gi|42545609|gb|EAA68452.1| hypothetical protei 61.6 5.5e-15 3

gi|55620227|ref|XP_526172.1| PREDICTED: similar 8.3 1.1 1gi|34978363|sp|P39061|COIAl. _MOUSE Collagen alpha 1(XV 3 , .6 3. .9 1

gi|7446033|pir||B56101 collagen alpha 1(XV •3. .6 3. .9 1

gi|1167906|gb|AAC52903.1| alpha-1(XVIII) coll 3. .6 3. .9 1

gi|57916309|ref|XP_555970.1 | ENSANGP00000027590 1. .9 6. .4 1

gi|55238148|gb|EAL39797.1| ENSANGP00000027590 1, .9 6. .4 1

gi|55656175|ref|XP_531500.1 | PREDICTED: hypothet 1 .7 6, .6 1

gi| 40231526|gb|AAR83296.1| type XVIII collagen 1 .7 6, .6 1

gi|57112907|ref|XP_549331.1 | PREDICTED: similar 0 .3 9 .8 1

Esta proteína foi testada com o modelo spvB_1s.hmm para mos-

10 trar que este modelo pode encontrar a apropriada proteína. Os resultados estão abaixo:

Hmmsearch - busca em uma base de dados de seqüências com um perfil HMM

HMMER 2.3.1 (junho de 2003) 15 Copyright (C) 1992-2003 HHMI/Washington University School of Medicine Distribuído livremente sob GNU General Public License (GPL)

Arquivo HMM: FinalTest/spvB_1s.hmm [SpvB]

Base de dados de seqüência: FinalTest/EukBCModel3Hits.fasta

Corte de escore por seqüência: [nenhum]

Corte de escore por domínio: [nenhum]

Corte Eval por seqüência: <= 10

Corte Eval por domínio: [nenhum]

25 HMM questão: SpvB

Acesso: PF03534.3

Descrição: proteína B de 65 kDa de plasmídeo de virulência Salmonella

foi calibrado; valores-E são estimativas empíricas]

Escores para seqüências completas (escore inclui todos os domínios):

30 Seqüência:_Descrição_Escore Valor-E N

gi|46138103|ref|XP_390742.1| hypothetical protein FG1 159.7 1.7e-48 1 gi| 42545609|gb|EAA68452.11 hypothetical protein FG1 159. 1.7e-48 1

Uma vez que somente um simples exemplo de uma proteína defusão TC Classe B/C eucariótica foi descoberta até hoje, não é possível prover um teste rigoroso desta estratégia de busca. Entretanto, é claro que a estratégia de busca de modelo de dois domínios será útil para discriminar proteínas dentro de faixa de comprimento de seqüência que tem domínios 5 FG-GAP mas que não são proteínas TC Classe B/C fundidas. Em adição, os modelos aqui providos podem ser usados para extração de proteínas de fusão TC Classe B/C a partir de uma faixa de seqüências mais ampla, quando necessário. Como com demonstrações anteriores, a ordem na qual os modelos são usados não altera os resultados finais. Também é importante notar

que um modelo RHS pode ser adicionado aos critérios de busca acima se necessário para ainda obter discriminação.

Os exemplos acima ensinam que uma combinação de (1) filtra-ção de comprimento de seqüência e (2) pesquisa de domínio constitui um processo poderoso para extração de proteínas TC Classe B, Classe C e

Classe B/C fundidas a partir de bases de dados de seqüências de proteínas. Os domínios são tomados das famílias de domínios spvB, FG-GAP e RHS, usando modelos HMM Pfam genéricos ou modelos de domínio HMM particulares talhados para a particular classe de proteínas. Os intervalos de comprimento de seqüência usados nestes exemplos foram escolhidos para a-

brangerem a conhecida faixa destas proteínas, e para mostrarem que estas proteínas podem ser separadas, não justo a partir de todas as outras proteínas, mas também a partir de outros membros destas famílias de proteínas. Uma vez que os mesmos modelos HMM foram usados para ambas proteínas TC Classe B procariótica e as proteínas TC Classe B/C fundidas eucari-"'25 óticas, ambos conjuntos de resultados podem ter sido extraídos juntos se nenhum limite de reino ou comprimento de seqüência foi inicialmente colocado sobre a busca. Opcionalmente, um modelo RHS pode ser facilmente desenvolvido para discriminar entre estes conjuntos de proteínas. Se tal discriminação é indesejada ou desnecessária, todo o conjunto de dados de pro-

teínas de GenBank pode ser usado como entrada. Entretanto, dado o grande e sempre expansivo tamanho das bases de dados de GenBank, isto pode tornar as buscas significantemente mais lentas.Para ainda orientação, ver E.LL Sonnhammer, S.R. Eddy, e R. Durbin. Proteins 28:405-420, 1997 (descreve a base de dados Pfam de alinhamentos de seqüências múltiplas e HMMs, e seu uso em análises de ge-noma de larga escala), e Richard Durbin, Sean Eddy, Anders Krogh, and 5 Graeme Mitchison (Cambridge University Press, 1998), Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of proteins and Nucleic Acids. Exemplo 12

Localização de subdomínios spvB, FG-GAP. RHS. e HVR em Proteínas de Fusão BC de Tannerella e Gibberella

As Figuras 2 e 3 ilustram as localizações dos subdomínios acima

nos domínios B e C das proteínas de fusão de Tannerella e Gibberella, respectivamente. Para Tannerella (Figura 2), o domínio spvB (modelo spvB-Is.hmm padrão) é ilustrado sublinhado a partir de resíduos 51-374 (de Figura 2 e também SEQ ID NO:12). Os domínios FG-GAP (usando o modelo

Bmodel17.hmm; existem seis nesta molécula) são indicados com sublinhado duplo e ocorrem em resíduos 392-421, 453-486, 502-531, 552-581, 604-625, e 650-681. As características anteriores são observáveis no domínio B. Seguindo uma transição no domínio C, oito domínios RHS (usando modelo Pfam rhs_1s.hmm) são determináveis no domínio C em resíduos 1048-1085,

1168-1201, 1207-1243, 1248-1285, 1290-1326, 1331-1369, 1447-1482, e 1620-1652. Estes são indicados em negrito na Figura 2. Uma região hiper-variável (HVR), comum em proteínas TC "Classe C", é também identificada no terminus C da molécula (resíduos 1733-2027). Isto é indicado em itálico na Figura 2.

Similarmente, na Figura 3 (e SEQ ID NO:4) para Gibberella, um

subdomínio spvB (mostrado sublinhado na Figura 3) no domínio B é observável em resíduos 51-374. Três domínios / subdomíniosFG-GAP são da mesma maneira determinados ocorrerem em resíduos 570-609, 630-669, e 685-700. Estes são indicados com sublinhado duplo na Figura 3. (O intron

de SEQ ID NO:2, resíduos 1557-1583, não é mostrado na Figura 3). Dois domínios RHS estão localizados em resíduos 1738-1774 e 1972-2002 no domínio C (indicado em negrito na Figura 3), como está um HVR em resí-duos 2154-2439 (a região terminal C), indicada em itálico na Figura 3.

Para o modelo Gibberella discutido acima, o domínio spvB foi determinado usando o modelo spvB-1s.hmm padrão. Os três domínios FG-GAP foram verificados com o modelo Bmodels3.hmm. Como somente uma 5 proteína eucariótica é presentemente conhecida, é difícil testas o moldeo melhor. Quando mais proteínas toxinas BC fundidas eucarióticas forem descobertas o modelo provavelmente será aperfeiçoado. Os domínios RHS foram verificados usando o modelo Pfam rhs_1s.hmm. Como com os domínios FG-GAP, dois domínios RHS foram verificados. Quando mais exemplos eu-

carióticos são verificados, o modelo é esperado aperfeiçoar. Sob uma busca de domínio levemente diferente - busca CD (domínio conservado) de NCBI - a seção de resíduos de aminoácidos 1493-2153 é rotulada como RHSA [Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004), "CD-Search: protein domain annotati-ons on the fly", Nucleic Acids Res. 32:W327-331]. Como com o modelo Tan-

nerella, a HVR foi mapeada através de falta de homologia a outras proteínas. Entretanto, HVRs são reconhecíveis em outras proteínas TC "Classe C". Devido às diferenças em comprimento de várias proteínas naturais como ilustrado acima, as exatas localizações de resíduos para cada domínio não podem ser previstas para futuras proteínas. Entretanto, a invenção objeto

inclui proteínas ocorrendo naturalmente onde o domínio Spv está localizado na primeira metade da molécula seguido por pelo menos um domínio F-Gap, seguido por pelo menos um domínio RHS nos últimos dois terços da molécula, seguidoo por uma região hiper-variável no final da proteína. Alguns programas de software também podem prever um domínio transmembrana. Es-

te é o caso para o programa TMAP. Assim, é possível que as proteínas objetos ainda compreendam um domínio transmembrana. Exemplo 13

Alinhamento e ainda comparação de proteínas toxinas fundidas BC de Tan-nerella e Gibberella

Um alinhamento global das duas proteínas toxinas fundidas BC

de Tannerella e Gibberella foi realizado com needle, um programa EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suíte (2000),Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A., Trends in Genetics 16(6):276-277) usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (o mesmo como GCG's GAP). Ver Figura 4.

Fixações adicionais usadas foram: Align_formt: srspair; Re-5 portjile: outfile; Matriz: EBLOSUM62; Folga_penalidade: 10,0; Exten-são_penalidade: 0,5.

Para um comprimento de 2894 resíduos de aminoácidos, os seguintes escores foram obtidos: identidade: 517/2894 (17,9%); Similaridade: 796/2894 (27,5%); Folgas: 1322/2894 (45,7%); Escore: 441,0. 10 Exemplo 14

Construção de um gene codificando a proteína de fusão 8884 (TcdB2/Tcp1fi7C)

Proteína de fusão 8884 é compreendida pela TcdB2 de Photo-rhabdus inteira (uma proteína Classe B) fundida a uma porção da proteína

TcplGz de Gibberella zeae. O segmento da proteína Tcp1Gz presente na proteína de fusão 8884 é aqui chamado Tcp1GzC, para refletir sua similaridade funcional a outras proteínas Classe C.

Para construir a região codificante para a proteína de fusão 8884, a extremidade 3' da região codificante de TcdB2 foi modificada usando

técnicas padrão de biologia molecular. Da mesma maneira, a extremidade 5' da região codificante da região semelhante a C de TcplGz foi modificada em um processo de etapas múltiplas, e as duas regiões codificantes modificadas foram unidas com um fragmento ligante para criar um quadro de leitura aberto simples. O novo DNA codificando a fusão de gene 8884 é mostrado em

SEQ ID NO:19 e codifica polipeptíeo 8884 (apresentado em SEQ ID NO:20). Nucleotídeos 1-4422 da região codificante de proteína de fusão 8884 correspondem às mesmas bases numeradas do gene tcdB2 de Phtorhabdus luminescens linhagem W-14 (GenBank Accession AF346500.2) e codificam a inteira proteína TcdB2. Esta seqüência é seguida por 42 bases de seqüên-

cia ligadora (codificando 14 aminoácidos), que é então seguida por uma seqüência de DNA correspondendo a nucleotídeos 4346-7423 de uma seqüência de DNA codificando a proteína Tcp1Gz otimizada para expressão emcélulas de E. coli (SEQ ID NO:5). O gene fundido consistindo nas regiões codificantes para TcdB2 e Tcp1GzC (mostrada como SEQ ID NO:19) foi clo-nado em um vetor plasmídeo de expressão pET (Novagen, Madison, Wl). A construção foi feita de modo a manter apropriados sinais de tradução e 5 transcrição bacterial. O plasmídeo foi designado pDAB8884. O cassete em SEQ ID NO: 19 é de 7542 nucleotídeos em comprimento e contém regiões codificantes para TcdB2 (nts 1 -4422), o peptídeo ligante TcdB2/Tcp1 GzC (nts 4423-4464) e Tcp1G2C (nts 4465-7539). O polipeptídeo codificado pelo gene fundido em SEQ ID NO:19 é mostrado em SEQ ID NO:20. A proteína de fu-10 são é prevista conter 2513 aminoácidos com segmentos representando TcdB2 (resíduos 1-1474), o peptídeo ligante TcdB2/Tcp1GzC (resíduos 1475-1488), e Tcp1GzC (resíduos 1489-2513). Exemplo 15

Condições de expressão para PDAB8884 e preparações de lisatos

A proteína TC Classe A XptA2xWi foi utilizada em uma forma puri-

ficada preparada a partir de culturas de Pseudomonas fluorescens expressando heterologamente o gene. Os plasmídeos de expressão pET280 (controle vetor vazio), pDAB8920 (codificando uma proteína de fusão TcdB2/TccC3), pDAB8829 (codificando a proteína Tcp1Gz) e pDAB8884 fo-

ram transformados na expressão T7 E. coli cepa BL21(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando processos padrão. Culturas de expressão foram iniciadas com 10-200 colônias transformadas recentemente em 250 ml_ de meio LB contendo 50 u.g/ml_ de antibiótico e 75 IPTG (isopropil-alfa-D-tiogalacto piranosídeo). As culturas foram crescidas a 28°C por 24 horas em

180-200 rpm. As células foram coletadas por centrifugação em garrafas Nal-gene de 500 ml_ em 5000 x g por 20 minutos a 4°C. Os péletes foram suspensas em 4-4,5 mL de solução de fosfato de Butterfield (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA; fosfato de potássio 0,3 mM pH 7,2). As células suspensas foram transferidas para tubos de centrífuga de tampa rosqueada de polipro-

pileno de 50 mL com 1 mL de pérolas de vidro de 0,1 mm de diâmetro (Bios-pec, Bartlesville, OK, catalog number 1107901). A mistura de células - pérolas de vidro foi resfriada sobre gelo, então as células foram lisadas por soni-ficação com duas explosões de 45 segundos usando uma sonda de 2 mm com um Branson Sonifier 250 (Danbury CT) em uma produção de -30, res-friando completamente entre explosões. Os lisatos foram transferidos para tubos Eppendorf e centrifugados 5 minutos em 16000 x g. Exemplo 16

Condições de bioensaio para os lisatos 8884

Bioensaios com insetos foram conduzidos com larvas de verme de espiga de milho neònatais (Helicoverpa zea (Boddie)) sobre dietas artificiais em bandejas de 128 cavidades especificamente projetadas para bioen-10 saios com insetos (C-D International, Pitman, NJ). Bioensaios foram incubados sob condições ambientais controladas (28°C, -40% de umidade relativa, 16h:8h [luz:escuro]) por 5 dias, em cujo ponto o número total de insetos no tratamento, o número de insetos mortos, e os pesos de insetos sobreviventes foram anotados. A atividade biológica dos lisatos brutos sozinhos ou com proteí-

na toxina XptA2xwi adicionada foi avaliada como se segue. Lisatos de E. coli brutos (40 uL) de culturas controles ou aquelas expressando proteínas de Complexo Toxina foram aplicados à superfície de dieta artificial em 8 cavidades de uma bandeja de bioensaio. A área de superfície média de dieta tratada em cada cavidade foi -1,5 cm2. Os lisatos de culturas bacteriais abrigando o controle vetor vazio, ou lisatos de culturas produzindo a proteína de fusão TcdB2/TccC3 8920, a proteína Tcp1Gz 8829, e a proteína de fusão TcdB2/Tcp1 GzC 8884 foram aplicados com e sem XptA2Xwi- A proteína Xp-tA2Xwi adicionada foi uma preparação altamente purificada de culturas bacte- riais expressando heterologamente a proteína. Adicionalmente, XptA2xwi purificada sem qualquer lisato bruto foi misturada com solução de fosfato de Butterfield como um controle. A concentração final de XptA2Xwi sobre a dieta foi 250 ng/cm2. Exemplo 17 Construção de um gene codificando a proteína de fusão 8883 (Tcp1fi7B/TccC3)

Proteína de fusão 8883 é compreendida por uma porção da pro-teína TcplGz de Gibberella zeae fundida à inteira proteína TccC3 de Photo-rhabdus (uma proteína Classe C). O segmento da proteína Tcp1Gz presente na proteína de fusão 8883 é aqui chamado Tcp1G2B, para refletir sua similaridade funcional a outras proteínas Classe B.

Para construir a região codificante de proteína de fusão 8883, a

extremidade 3' da região codificante para a região semelhante a B de Tcp1Gz foi modificada em um processo de etapas múltiplas usando técnicas padrão de biologia molecular. Da mesma maneira, a extremidade 5' da região codificante de TccC3 foi modificada em um processo de etapas múltiplas, e as

duas regiões codificantes modificadas foram ligadas com um fragmento li-gante para criar um quadro de leitura aberto simples. O novo DNA codificando o gene de fusão 8883 é mostrado em SEQ ID NO:21 que codifica poli-peptídeo 8883 (apresentado em SEQ ID NO:22). A porção da proteína de Gibberella zeae Tcp1Gz correspondendo à proteína Tcp1GzB é codificada por

bases 23-4558 de uma seqüência de DNA codificando a proteína Tcp1Gz otimizada para expressão em células de E. coli (mostrada em SEQ ID NO:5). Esta seqüência compreende bases 1-4536 de SEQ ID NO:21. Estas bases são seguidas por um fragmento ligante de 39 bases (codificando 13 aminoá-cidos), então por inteira região codificante para a proteína TccC3 de Phto-

rhabdus luminescens cepa W-14 (uma proteína Classe C; Genbank Acces-sion AF346500.2). [Em SEQ ID NO:21, o número de base 12 (T da seqüência nativa) foi trocado para C para acomodar um sítio de reconhecimento de enzima de restrição Cla|. Esta troca de base silenciosa não altera a seqüência de aminoácidos codificada da proteína TccC3]. Este novo gene de fusão '"25 é chamado 8883 (SEQ ID NO:21) e codifica polipeptídeo 8883 (SEQ ID NO:22).

O gene fundido consistiu nas regiões codificantes para Tcp1GzB e TccC3 engenheirada como um quadro de leitura aberto simples em um vetor plasmídeo de expressão pET (Novagen, Madison, Wl). A construção 30 foi feita de maneira a manter apropriados sinais de tradução e transcrição bacterial. O plasmídeo foi designado pDAB8883. A seqüência de DNA do cassete de região codificante fundida é mostrada em SEQ ID NO:21. O cas-sete é de 7458 nucleotídeos de comprimento e contém regiões codificantes de Tcp1GzB (nts 1-4536), o peptídeo ligante Tcp1Gz/TccC3 (nts 4537-4575) e TccC3 (nts 4576-7455). O polipeptídeo codificado pelo gene fundido em SEQ ID NO:21 é mostrado em SEQ ID NO:22. A proteína de fusão é prevista 5 conter 2485 aminoácidos com segmentos representando Tcp1gzB (resíduos 1-1512), o peptídeo ligante Tcp1G2B/TccC3 (resíduos 1513-1525), e TccC3 (resíduos 1526-2485).

Lisatos contendo a proteína de fusão 8883 demonstraram excelente atividade funcional, como demonstrado nos exemplos que se seguem. 10 Assim, esta invenção demonstra a atividade sinergística retida de uma fusão entre o peptídeo Tcp1GzB, o produto de um gene eucariótico, com TccC3, o produto de um gene procariótico, quando usada em combinação com a proteína de complexo toxina XptA2xWi-Exemplo 18

Condições de expressão para pDAB8883 e preparações de lisatos

A proteína TC Classe A XptA2Xwi foi utilizada em uma forma purificada preparada a partir de culturas de Pseudomonas fluorescens expressando heterologamente o gene. Os plasmídeos de expressão pET280 (controle vetor vazio), pDAB8920 (codificando uma proteína de fusão

TcdB2/TccC3), pDAB8829 (codificando a proteína Tcp1Gz), e pDAB8883 foram transformados em E. coli expressão T7 linhagem BL21(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando processos padrões. Culturas de expressão foram iniciadas com 10-200 colônias recentemente transformadas em 250 ml_ de meio LB contendo 50 u.g/ml_ de antibiótico e 75 [M IPTG (isopropil-alfa-D-

tiogalacto piranosídeo). As culturas foram crescidas a 28°C por 24 horas em 180-200 rpm. As células foram coletadas por centrifugação em garrafas Nal-gene de 500 ml_ em 5000 x g por 20 minutos a 4°C. Os péletes foram suspensos em 4-4,5 ml_ de solução de fosfato de Butterfield (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA; fosfato de potássio 0,3 mM, pH 7,2). As células suspensas

foram transferidas para tubos de centrífuga de tampa de rosca de polipropi-leno de 50 ml_ com 1 ml_ de pérolas de vidro de 0,1 mm de diâmetro (Bios-pec, Bartlesville, OK, número de catálogo 1107901). A mistura de células -pérolas de vidro foi resfriada sobre gelo, então as células foram lisadas por sonificação com duas explosões de 45 segundos usando uma sonda de 2 mm com um Branson Sonifier 250 (Danbury CT) em uma produção de -30, resfriando completamente entre explosões. Os lisatos foram transferidos pa-' 5 ra tubos Eppendorf de 2 mL e centrifugados 5 minutos em 16000 x g. Exemplo 19

Condições de bioensaio para os lisatos 8883

Bioensaios com insetos foram conduzidos com larvas de verme de espiga de milho neonatais, Helicoverpa zea (Boddie), sobre dietas artifici-

ais em bandejas de 128 cavidades especificamente projetadas para bioensaios com insetos (C-D International, Pitman, NJ). Bioensaios foram incubados sob condições ambientais controladas (28°C, -40% de umidade relativa, 16h : 8h [luz : escuro]) por 5 dias, em cujo ponto o número total de insetos no tratamento, o número de insetos mortos, e os pesos de insetos sobrevi-

ventes foram anotados.

A atividade biológica dos lisatos brutos sozinhos ou com proteína toxina XptA2xw, adicionada foi ensaiada como se segue. Lisatos de E.coli brutos (40 jiL) de culturas controles ou aquelas expressando proteínas de Complexo Toxina foram aplicados à superfície de dieta artificial em 8 cavi-

dades de uma bandeja de bioensaio. A área de superfície média de dieta tratada em cada cavidade foi -1,5 cm2. Os lisatos de culturas bacteriais abrigando o controle vetor vazio, ou lisatos de culturas produzindo a proteína de fusão TcdB2/TccC3 8920, a proteína Tcp1Gz 8829, e a proteína de fusão Tcp1Gz/TccC3 8883 foram aplicados com e sem XptA2Xwi. A proteína Xp-"'25 tA2Xwi adicionada foi uma preparação altamente purificada de culturas bacteriais expressando heterologamente a proteína. Adicionalmente, XptA2Xwi purificada sem qualquer lisato bruto foi misturada com solução de fosfato de Butterfield como um controle. A concentração final de XptA2Xwi sobre a dieta foi de 250 ng/cm2. Exemplo 20

Resultados de bioensaios para lisatos de fusão de Tcp1r7B/TccC3 8883

A Tabela 7 mostra os resultados de bioensaio para lisatos con-troles, lisatos de células programadas para expressarem a proteína de fusão TcdB2/TccC3 8920, lisatos de células programadas para expressarem a proteína TcplGz 8829, e lisatos de células programadas para expressarem a proteína de fusão Tcp1GzB/TccC3 8883. Todos os lisatos foram bioensaia-5 dos plus e minus XptA2xwi purificada. Os dados mostram que lisatos controles, com e sem XptA2xwi, tiveram pequeno efeito sobre os insetos. Lisatos contendo somente a proteína de fusão TcdB27TccC3 8920 não tiveram efeito sem XptA2Xwi adicionada. Entretanto, com XptA2XWi adicionada, o lisato 8920 foi um potente inibidor de crescimento de inseto. Lisatos contendo somente

a proteína Tcp1Gz 8829 não tiveram efeito sem XptA2xWi adicionada. Entretanto, com XptA2Xwi adicionada, o lisato 8829 foi um potente inibidor de crescimento de inseto. Lisatos programados para expressarem a proteína de fusão TcplGzB/TccC3 8883 não tiveram efeito sem XptA2XWi adicionada. Entretanto, com XptA2Xwi adicionada, o lisato 8883 foi um potente inibidor de crescimento de inseto. Estes dados demonstram que quando os peptídeos Tcp1GzB e TccC3 são fundidos eles ret-em um efeito sinergístico quando combinados com XptA2xWi-

Tabela 7. Resposta de larvas neonatais de verme de esoiaa de milho (Heli-coverpa zea (Boddie) a lisatos de E. coli expressando proteínas de Complexo Toxina <table>table see original document page 108</column></row><table>24 insetos usados por teste. Escala de inibição de crescimento: 0 = 0-20%; + = 21-40%; ++ = 41-60%; +++ = 61-80%; ++++ = 81-100%.Exemplo 21

Projeto e síntese de um gene otimizado de planta codificando TcpIg, para expressão em plantas

Para obter altos níveis de expressão de um gene de fungo em

plantas, pode ser preferido reengenheirar a seqüência codificando proteína do gene de modo que ela seja mais eficientemente expressa em células de plantas. Este exemplo ensina o projeto de uma nova seqüência de DNA que codifica a proteína Tcp1cz de SERQ ID NO:2, mas é otimizada para expressão em células de plantas.

Um motivo para a reengenharia de um gene codificando uma

proteína de fungo para expressão em plantas é devido ao conteúdo G+C não-ótimo do gene heterólogo. Por exemplo, o baixo teor de G+C de muitos genes de fungos nativos (e conseqüentemente inclinando na direção de alto teor de A+T) resulta na geração de seqüências imitando ou duplicando se-

qüências de controle de gene de planta que são conhecidas serem altamente ricas em A+T. A presença de algumas seqüências ricas A+T dentro de DNA de gene(s) introduzido em plantas (por exemplo, regiões de caixa TA-TA normalmente encontradas em promotores de genes) pode resultar em aberrante transcrição do gene(s). Por outro lado, a presença de outras se-

qüências reguladoras residindo no RNAm transcrito (por exemplo, seqüências sinais de poliadenilação (AAUAAA), ou seqüências complementares para ARNs nucleares pequenos envolvidos em união pré-RNAm) pode conduzir a instabilidade de RNA. Por isso, uma meta no projeto de genes codificando uma proteína de fungo para expressão em planta, mais preferivelmen-

te referidos como gene(s) otimizado de planta, é gerar uma seqüência de DNA tendo um teor de G+C próximo daquele da média de regiões codifican-tes de gene de planta. Uma outra meta no projeto do gene(s) otimizado de planta codificando uma proteína de fungo é gerar uma seqüência de DNA na qual as modificações de seqüência não impedem tradução.

Devido à plasticidade proporcionada pela redundância / degene-

rescência do código genético (isto é, alguns aminoácidos são especificados por mais de um códon), evolução dos genomas em diferentes organismos,ou classes de organismos, resultou em utilização diferencial de códons redundantes. Este "viés de códon" é refletido na composição de base média de regiões codificando proteínas. Por exemplo, organismos com teores de G+C relativamente baixos utilizam códons tendo A ou T na terceira posição 5 de códons redundantes, enquanto aqueles tendo maiores teores de G+C utilizam códon tendo G ou C na terceira posição de códon. É pensado que a presença de códons "menores" dentro de um RNAm pode reduzir a taxa de tradução absoluta daquele RNAm, especialmente quando a relativa abundância do ARNt carregado correspondendo ao códon menor é baixa. Uma

extensão deste conceito é que a diminuição de taxa de tradução por códons menores individuais pode ser pelo menos aditiva para códon menores múltiplos. Por isso, ARNms tendo altos teores relativos de códons menores podem ter correspondentemente baixas taxas de tradução. Esta taxa pode ser refletida por subseqüentes baixos níveis da proteína codificada.

Para auxiliar na engenharia de genes codificando uma proteína

de fungo para expressão em plantas o viés de códon de genes de planta pode ser determinado. O viés de códon para genes de uma planta particular é representado pela distribuição estatística de códons encontrada nas regiões de codificação de proteína dos genes de planta. Na Tabela 8, Colunas

C, D, I, e J apresentam as distribuições (em % de utilização para todos os códon para aquele aminoácido) de códons sinônimos para cada aminoácido, como encontradas nas regiões de codificação de genes de dicotiledoneas e Zea mays (milho). Os códons mais preferidos por cada tipo de planta são indicados em fonte em negrito, e a segunda, terceira, ou quarta escolhas de

códons preferidos podem ser identificadas quando existem escolhas múltiplas. É evidente que alguns códons sinônimos para alguns aminoácidos são somente encontrados raramente em genes de plantas, e ainda, que plantas dicotiledoneas e milho diferem em utilização de códon (por exemplo, códon alanina GCG ocorre mais freqüentemente em genes de milho, enquanto có-

don arginina AGA é mais freqüentemente usado em genes de dicotiledoneas). Uma nova seqüência de DNA que codifica a seqüência de aminoácidos da proteína Tcp1gz de fungos foi projetada para ótima expressão emambos, milho e plantas dicotiledôneas. A nova seqüência de DNA difere da seqüência de DNA de fungo nativa codificando a proteína Tcp1gz através de substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido, ou quarto preferido) para especificar o apropriado aminoáci- do em cada posição dentro da seqüência de aminoácidos de proteína. No processo de projeto de criação de uma seqüência de DNA codificando proteína de fungo que se aproxime de uma distribuição de códons média de ambos, genes de milho e dicotiledôneas, qualquer códon que seja usado esporadicamente em relação aos outros códons sinônimos para aquele aminoá-cido em qualquer tipo de planta não foi incluído (indicado por DNU em Colunas F e L de Tabela 8). Usualmente, um códon foi considerado ser raramente usado se ele foi representado em cerca de 10% ou menos do tempo para codificar o aminoácido relevante em genes de qualquer tipo de planta (indicado por NA em Colunas E e K de Tabela 9).

Para balancear a distribuição das restantes escolhas de códons para um aminoácido, uma representação média pesada para cada códon foi calculada, usando a fórmula:

% pesada de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 onde C1 é o códon em questão e C2, C3, etc. representam as médias dos valores de % para milho e dicotiledôneas de códons sinônimos restantes (valores de % média para os códons relevantes são tomados de Colunas E e K) de Tabela 8. O valor de % pesado para cada códon é dado em Colunas F e L de Tabela 8.

Projeto da seqüência de DNA otimizada de planta foi iniciado '25 através de tradução reversa da seqüência de proteínas de SEQ ID NO:2 u-sando uma tabela de viés de códon de milho - dicotiledônea balanceado construída a partir de Tabela 8 Colunas F e L. A seqüência inicial foi então modificada através de mudanças de códon de compensação (enquanto retendo representação de códon média pesada total) para remover ou adicio-30 nar sítios de reconhecimento de enzima de restrição, remoção de estruturas secundárias intra-fita altamente estáveis, e outras seqüências que possam ser prejudiciais para manipulações de clonagem ou expressão do gene en-genheirado em plantas.

A nova seqüência foi então reanalisada para sítios de reconhecimento de enzima de restrição que possam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados são ainda modificados por substituição de có- dons relevantes com primeira, segunda, terceira, ou quarta escolha de có-dons preferidos. Outros sítios na seqüência que podem afetar transcrição ou tradução do gene de interesse incluem as junções exon : intron (51 ou 3'), sinais de adição poli A, ou sinais de terminação de RNA polimerase. A seqüência modificada é ainda analisada e ainda modificada para reduzir a fre-

qüência de dubletos TA ou CG, e para aumentar a freqüência de dubletos TG ou CT. Em adição a estes dubletos, bloqueios de seqüência que têm mais que cerca de cinco resíduos consecutivos de [G+C] ou [A+T] podem afetar transcrição ou tradução da seqüência. Por isso, estes bloqueios de seqüências também são modificados através de substituição de códons de

primeira ou segunda escolha, etc. com outros códons preferidos de escolha. Códons raramente usados não são incluídos em uma extensão substancial no projeto de gene, sendo usados somente quando necessário para acomodação de um critério de projeto diferente que composição de códon per se (por exemplo, adição ou supressão de sítios de reconhecimento de enzima de restrição).

O processo descrito acima permite que aqueles versados na técnica desenhem gene(s) modificado que são estranhos para uma planta particular de modo que os genes são otimamente expressos em plantas. O processo é ainda descrito e ilustrado na patente US 5 380 831 e pedido de

patente WO 97/13402.

Assim, de modo a desenhar genes otimizados de plantas codificando uma proteína de fungo, uma seqüência de DNA é projetada para codificar a seqüência de aminoácidos da dita proteína utilizando um código genético redundante estabelecido a partir de uma tabela de viés de códon compilada a partir de seqüências de genes para a particular planta ou plantas. A resultante seqüência de DNA tem um maior grau de diversidade de códon, uma desejável composição de base, pode conter sítios de reconhe-cimento de enzima de restrição estrategicamente colocados, e carecem de seqüências que possam interferir com transcrição do gene, ou tradução do RNAm produto. Assim, genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes às proteínas / genes da invenção objeto podem ser usados para trans-

formação de hospedeiros, incluindo plantas. Adicional orientação com relação a produção de genes sintéticos pode ser encontrada em, por exemplo, patente US5 380 831.

Uma vez a dita seqüência de DNA tenha sido projetada no papel ou in silico, reais moléculas de DNA podem ser sintetizadas no laboratório

para corresponderem em seqüência precisamente à seqüência projetada. Tais moléculas de DNA sintéticas podem ser clonadas e de outro modo manipuladas exatamente como se elas fossem derivadas de fontes naturais ou nativas.

A seqüência de DNA enviesada de códon, otimizada de planta

que codifica uma variante da proteína de fusão Tcp1g2 de SEQ ID NO:2 é dada como bases 3-7403 de SEQ ID NO:23 (aqui referida como o gene 8842). Para facilitar clonagem e assegurar eficiente iniciação de tradução, uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição Ncol terminal 5' (CCTAGG) foi engenheirada para incluir o códon de início der tradução ATG

(bases 1-6 de SEQ ID NO:23). Esta característica de projeto introduziu um códon GCT especificando Alanina como a segundo aminoácido da proteína codificada. Assim, a proteína codificada por SEQ ID NO:23, como mostrada em SEQ ID NO:24 (aqui referida como a proteína 8842), difere da proteína Tcp1gz nativa de SEQ ID NO:2 pela adição de uma Alanina no segundo resí-

duo. Também, para assegurar própria terminação de tradução e para facilitar clonagem, bases codificando códons de interrupção de tradução nos seis quadros de leitura de DNA de filamento duplo, plus um sítio de reconhecimento de enzima de restrição Saci (GAGCTC), foram incluídos na extremidade 3' da região codificante (bases 7404-7432 de SEQ ID NO:23). Síntese

de um fragmento de DNA compreendendo SEQ ID NO: 10 foi realizada por um fornecedor comercial (PicoScript, Houston, TX, USA).

É para ser notado que a seqüência de DNA genômico de Gibbe-rella zeae tcplGz, mostrada em SEQ ID NO:1, como anotada em GenBank Accession AACM01000442, compreende uma seqüência intron putativa (bases 4669-4749 de SEQ ID NO:1). A seqüência de DNA enviesado de códon, otimizada de planta que codifica uma variante da proteína de fusão Tcp1gz e mostrada em SEQ ID NO:23 foi projetada de maneira tal que seqüências de reconhecimento de sítio de união de intron de planta foram removidas. Assim, a proteína codificada por SEQ ID NO:23 e mostrada em SEQ ID NO:24, e esperada ser produzida por células de plantas, inclui aminoácidos codificados pelas seqüências de intron de fungos putativas.Tabela 8. Representação de códon sinônimo em regiões codificantes de 706 genes de Zea mays (Colunas C e I), e 154 genes de plantas dicotiledôneas (Colunas D e J). Valores para um conjunto de representação de códon balanceado - enviesado para um projeto de gene sintético otimizado de planta estão em Colunas F e L__

<table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table>Exemplo 22

Construção de um vetor de expressão em planta binário contendo uma primeira versão de um gene expressando a proteína 8842 (variante Tcplg;)

Proteína 8842 é compreendida por uma variante da inteira prote-5 ína Tcp1 Gz de Gibberella zeae (uma proteína Classe B fundida a uma proteína Classe C). O DNA codificando a fusão de gene 8842 como mostrado na SEQ ID NO:23 foi otimizado para expressão em plantas. Nucleotídeos 3-7403 de SEQ ID NO:23 codificam a inteira variante de proteí na Tcp1Gz como mostrado em SEQ ID NO:24.

O gene 8842 foi clonado sobre um fragmento de DNA Ncoi/Saci

em um plasmídeo intermediário através de técnicas padrões de biologia molecular. O cassete de expressão de gene 8842 no vetor intermediário consistiu em (na direção 5' para 3') um promotor de vírus mosaico de veia cassava (CsVMV) (essencialmente bases 7160 a 7678 de GenBank Accession

CVU58751), a seqüência de estabilização 5' osmotina de Nicotiana tabacum (ver publicação de pedido de patente US200050102713 A1), a região codifi-cante dgene variante 8842, uma seqüência de estabilização 3' osmotina de Nicotiana tabacum (ver publicação de pedido de patente US US200050102713 A1), e a região não-traduzida de ORF24 3' de Agrobacte-

ríum tumefaciens pTi-15955 (essencialmente o complemento de bases 18621 a 19148 de GenBank Accession ATACH5). O Cassete de expressão de gene de planta 8842 foi então movido via Gateway LR clonase (Invitro-gen, Carlsbad, CA) em um vetor binário de transformação de planta Agro-bacterium tumefaciens, e o resultante plasmídeo foi nomeado pDAB8842. O

cassete de expressão em planta de gene 8842 em pDAB8842 é diretamente precedido pela região de ligação de matriz (MAR) RB7 de Nicotiana tabacum (Hall, Gerald, Jr.; Allen, George C; Loer, Deborah S.; Thompson, William F.; Spiker, Steven, Nuclear scaffolds and scaffold-attachament regions in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88:9320-9324). Para prover sele-

ção em planta para célula transformadas, o vetor binário incluiu, imediatamente seguindo o cassete de expressão de gene de planta 8842, um gene marcador selecionável na forma de um promotor 10 ubiquitina de Arabidop-sis thaliana (Genbank Accession L05399), uma região codificante para fosfi-notricina acetil transferase (PAT; Genbank Accession I43995), e uma região não-traduzida 3* (3' UTR) de ORF1 de Agrobacterium tumefaciens pTi-15955 (essencialmente bases 2180 a 2887 de GenBank Accession ATACH5).

A ordem final dos elementos e cassetes de expressão no plas-

mideo binário pDAB8842 é como se segue: pTi 15955 DNA-T Borda B, Nico-tiana tabacum RB7 MAR, o casse de expressão de gene 8842, a cassete de expressão de gene PAT, e três cópias tandem de pTi-15955 DNA-T Borda A. As construções foram feitas de maneira a manter apropriados sinais de tra- dução e transcrição de planta. Para transformação de planta, o plasmideo pDAB8842 foi introduzido em células de Agrobacterium tumefaciens linhagem LBA4404 por eletroporação. Exemplo 23

Construção de um vetor de expressão binário de planta contendo uma se- gunda versão de um gene expressando a proteína 8842 (variante Tcplo;)

A região codificando proteína 8842 de SEQ ID NO:23 foi clonada em um fragmento de DNA Ncol/Sacl em um plasmideo intermediário através de técnicas padrão de biologia molecular. O cassete de expressão de gene no vetor intermediário consistiu em (na direção 5' para 3') um promotor Acti- na 2 de Arabidopsis thaliana (Act2; GenBank Accession U41998), a região codificante variante 8842, e a região não-traduzida 3' ORF24 de Agrobacterium tumefaciens pTi-15955 (essencialmente o complemento de bases 18621 a 19148 de GenBank Accession ATACH5). O cassete de expressão em planta de gene 8842 foi então movido via Gateway LR clonase (Invitro- gen, Carlsbad, CA) em um vetor binário de transformação de planta Agrobacterium tumefaciens, e o resultante plasmideo foi nomeado pDAB8844. Em plasmideo pDAB8844, todos os elementos e cassetes de expressão estão presentes na mesma ordem como descrito no Exemplo 22 para plasmideo pDAB8842, exceto que o cassete de gene 8842 sob o controle do pro-motor CsVMV presente em pDAB8842 foi substituído por esta versão do gene 8842 sob o controle do promotor Act2. Para transformação de planta, o plasmideo pDAB8844 foi introduzido em células de Agrobacterium tumefaci-ens linhagem LBA4404 através de eletroporação. Exemplo 24

Transformação de células de algodão

Sementes de algodão variedade Coker 310 foram esterilizadas na superfície em álcool 95% por 1 minuto, rinsadas com água destilada estéril, esterilizadas com alvejante comercial 50% por 20 minutos, então rinsadas novamente 3 vezes com água destilada estéril. Sementes tratadas foram germinadas a 28°C sobre meio-G [Murashige and Skoog, 1962 (MS) sais basais com vitaminas B5 (Gamborg et al., 1965) e sacarose 3%] em vasos

Magenta GA-7 mantidos sob uma alta intensidade de luz de 40-60 nE/m2, com um foto-período de 16 horas de luz e 8 horas de escuro.

Segmentos de cotiledôneas (~5 mm quadrados) foram isolados de plântulas de 7-10 dias de idade em meio-M líquido (meio baseado em MS com 1-5 fiM de ácido 2,4-dicloro fenóxi acético e 1-5 \lM de cinetina) em pla-

cas de Petri. Para cada constructo (isto é, pDAB8842 e pDAB8844), 200 cortes de segmentos foram tratados com uma suspensão de Agrobacterium tumefaciens recombinante da cepa LBA4404 (aproximadamente 106 célu-las/mL), então transferidas para meio-M semi-sólido e co-cultivadas por 2-3 dias (nesta e etapas subseqüentes), incubação foi realizada sob luz a 28°C).

Seguindo co-cultivação, segmentos foram transferidos para meio MG5, que contém 5 mg/mL de glufosinato - amônio (para selecionar células de plantas que contêm o gene transferido) e 500 mg/L de carbenicilina (para eliminar células residuais de Agrobacterium tumefaciens). Após 3 semanas, calo de segmentos de cotiledônea foram isolados e transferidos para meio MG5 re-"25 cente então uma segunda transferência para meio MG5 foi feita 3 semanas depois. Após 3 semanas adicionais, calo foi transferido para meio-C (meio baseado em MS contendo ácido naftaleno acético 10-20 u.M e cinetina 5-10 H.M) contendo glufosinato - amônio e carbenicilina como acima, e transferidos novamente para meio de seleção recente após 3 semanas. Para o cons-

tructo pDAB8842, 26 linhas de calos foram obtidas, e 25 linhas de calos foram obtidas para o constucto pDAB8844.Exemplo 25

Expressão de variante Tcplg; em calos de algodão

Tecidos de calos de planta (200 mg) isolados seguindo transformação com constructos DAB8842 e pDAB8844 foram congelados a -

: 80°C. O material de planta congelado foi colocado em um tubo de polipropi-leno de 1,2 ml_ contendo uma conta de tungstênio de 0,47 cm de diâmetro com 450 jxL de tampão de extração [solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 0,1%, ditiotreitol 10 mM e 5 |iL/mL de coquetel inibidor de protease (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; número de catálogo

P9599)] e homogeneizado por quatro minutos em velocidade máxima usando um Kleco Pulverizer bead Mill (Klexo, Visalia, CA). O resultante homogeneizado foi centrifugado em 4000 x g por 10 minutos a 4°C, e o sobrenadan-te removido usando uma pipeta. A concentração de proteína do sobrenadan-te foi determinada pelo processo de Bradford [Bradford, M. M., (1976) A ra-

pid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of pro-tein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem.:72:248-254]. O volume de sobrenadante requerido para prover 2-5 |ig de proteína total foi misturado 4:1 com 4X Tris-HCI, SDS, tampão de amostra 2-mercapto etanol (consistindo em Tris HCI 0,125 M, sacarose 10%, azul de bromo fenol

0,02%, SDS 2,0%, e 2-mercapto etanol 5%). A solução foi aquecida a 90°C por 4 minutos, carregada em cavidades de um gel de tris-glicina poliacrilami-da 4-20% (BioRad, Hercules, CA), e as proteínas foram separadas através de aplicação de 100 volts de eletricidade por 60 minutos usando o processo de Laemmli [Laemmli, U.K.; (1970) "Cleavage of structural proteins during

the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature:227:680-685].

Caracterização da proteína Tcplaz variante expressa foi feita por análises de imunoblot [Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J., (1979) E-lectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA

76:4350-4354]. Resumidamente, as amostras de proteína separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida - SDS (acima) foram transferidas ele-troforeticamente sobre nitrocelulose em 100 V por 1 hora, bloqueadas comleite sem gordura 1%, e sondadas com uma diluição 1:3000 de um de dois diferentes anticorpos monoclonais primários preparados de diferentes seqüências da proteína TcplGz- Um anticorpo (1184) foi derivado usando um peptídeo sintético de 17 aminoácidos contendo a seqüência de resíduos 1184-1200 de Tcp1Gz (SKTASAAEELKEARKSF como descrita em SEQ ID NO:2) na região correspondendo à proteína "B". O outro anticorpo (1929) foi derivado de um peptídeo sintético de 22 aminoácidos contendo a seqüência de resíduos 1929-1950 (YHYDDEKSLLSDDPRVKSNRLSR como descrita em SEQ ID NO:2) que reside na área da proteína correspondendo à proteína"C". A membrana de nitrocelulose contendo as proteínas transferidas foi deixada incubar com o anticorpo 1184 ou 1929 por toda noite a 4°C enquanto agitando suavemente. Após extensiva lavagem da membrana de nitrocelulose, proteínas relacionadas a Tcp1cz produzidas pelos tecidos de calos foram detectadas usando anticorpo secundário conjugado com ELC anti- camundongo (BioRad) e desenvolvidas usando reagentes ECL (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL) de acordo com instruções do fornecedor. Pesos moleculares relativos das bandas de proteínas foram determinados através de inclusão de uma amostra de marcadores de peso molecular de proteínas pré-manchados SeeBlue (Invitrogen) em uma cavidade do gel. Controles negativos consistiram em tecidos de plantas de calos não-transformados processados da mesma maneira como descrito acima. Controles positivos consistiram em proteínas insolúveis obtidas de um extrato de células de E.coli transformadas com o gene tcp1Gz otimizado de E. coli (constructo pDAB8829). '25 Quinze calos de algodão de constructo pDAB8842 e 13 calos de

constructo pDAB8844 foram analisados. Os extratos de proteína foram manchados em duplicata e sondados separadamente com anticorpos 1184 (peptídeo região-B) e 1929 (peptídeo região-C). Ambos anticorpos revelaram similares, mas não idênticos, padrões de formação de bandas. O tamanho calculado da proteína TcplGz variante intacta (2467 aminoácidos; SEQ ID NO:24) é de cerca de 278 kDa. Em todas as análises, as amostras de controle positivo mostraram uma formação de esfregaço de proteínas reativasaos anticorpos, começando justo abaixo da posição do padrão de peso molecular de 250 kDa, enquanto não houve sinal observado a partir das amostras de controles negativos de proteínas extraídas de calos de algodão não-transformados. Das amostras de constructo pDAB8842 (onde a expres-5 são de Tcp1Gz variante 8842 é dirigida pelo promotor CsVMV), 11 mostraram uma resposta positiva, exibindo uma forte banda de proteína em um peso molecular aparente justo abaixo de 250 kDa, e uma segunda banda de proteína de genericamente menos intensidade acima de marcador de peso molecular de 148 kDa. Amostras preparadas a partir de calos de algodão trans-

formados com o constructo pDAB8844 (onde a expressão de TcplGz variante 8842 é dirigida pelo promotor Act2) resultaram em significantemente menos respostas positivas comparada o constructo pDAB8842 (somente 2 das 13 amostras mostraram uma resposta positiva).

Calos de algodão que expressaram o gene tcp1Gz variante 8842

demonstraram diferentes padrões de formação de bandas quando sondados com os dois anticorpos específicos de peptídeo 1184 (peptídeo de região B) e 1929 (peptídeo de região C). Anticorpo 1184 ligou-se a uma espécie de proteína simples tendo um peso molecular aparente maior que 148 kDa, mas menos que 250 kDa. Anticorpo 1929 ligou-se a uma ou duas proteínas (de-

pendendo da amostra de calo), ambas tendo um peso molecular aparente maior que 148 kDa, mas menor que 250 kDa.

Assim, estes resultados mostram que proteínas que são reconhecidas por anticorpos preparados contra fragmentos de peptídeos da proteína TcplGz variante são produzidas por estes tecidos de planta. Dada o

tamanho muito grande desta proteína, e as limitações técnicas da resolução das análises de gel, é esperado que as bandas imunorreativas, de alto peso molecular observadas em ambas amostras controles e amostras de plantas representam proteínas TcplGz de inteiro comprimento. Exemplo 26

Complexo Toxina Classe A e Genes Classe B/C Fundida de Fusarium verti-cillioides

Este exemplo ensina um processo para descobrir novos genesClasse A e novos genes Classe B / Classe C fundidas na seqüência de ge-noma de Fusarium verticillioides (teleomorfo Gibberella moniliformis). É para ser notado que um estágio de vida (anamorfo) de Gibberella zeae é classificado como Fusarium graminearum. Determinação da seqüência de DNA do genoma do fungo Fusa-

rium verticillioides está em progresso no Broad Institute (Cambridge, MA) e o genoma parcial é acessível ao público a partir do website (broad.mit.Edu/annotation/fgi/). As seqüências de DNA do gene TC Classe A de Gibberella zeae (SEQ ID N0:9) e do gene tcp1Gz de Gibberella zeae (SEQ

ID N0:1) foram usadas separadamente como seqüências qustões em análises TBLASTN da seqüência parcial do genoma de F. verticillioides (T-BLASTN ver. 2.2.10; 19 de outubro de 2004).

Estas análises revelaram a presença de duas seqüências correspondendo a genes TC Classe A, duas seqüências correspondendo a ge-

nes TC Classe B / Classe C fundidas, assim como um gene TC Classe A parcial e um gene TC Classe B parcial. As seqüências contig incluindo e flanqueando estes genes TC presuntivos foram extraídos e ainda analisados. As seqüências contig extraídas foram nomeadas por conveniência: A-contig12, Acontig34, BCContig12, BCContig6, e BCContig46.

A seqüência de cada contig foi traduzida in silico para identificar

regiões codificantes para peptídeos de 100 aminoácidos ou maiores (termi-nador para terminador), e cada tal proteína putativa foi usada como uma seqüência questão em uma análise BLAST (BLASTP ver.2.2.3; 24 de abril de 2002) da base de dados de proteína não-redundante de GenBank (National "25 Center for Biotechnology Information; Database: db/nr.01; data de postagem: 18 de janeiro de 2006 4:00 PM; número de letras em base de dados: 11 166 549; número de seqüências em base de dados: 325 447).

Proteínas com escores BLAST significantes para um gene TC Classe A, Classe B ou Classe C foram mapeadas de volta para o DNA codi-

ficante da contig fonte. A partir de cada contig pertencendo a um gene TC Classe A ou TC Classe BC simples, a inteira seqüência de DNA abrangendo a região codificando a proteína, plus 20 pb em qualquer lado, foi extraída.Em alguns casos, foi necessário reverter e complementar a seqüência de bases de DNA como presente em um contig nativo de modo a obter uma região codificando proteína na orientação ' para 3' padrão.

A seqüência de DNA extraída de Acontig12 é apresentada como 5 SEQ ID NO:25. Esta seqüência de DNA codifica uma proteína TC Classe A putativa em dois segmentos em sobreposição, a seqüência deduzida da qual é mostrada em SEQ ID NOS: 26 e 27. O códon treonina (ACG) que serve como o início do quadro de leitura aberto para a região codificante do primeiro segmento da proteína TC Classe A putativa deduzida é resíduos 21-23

em SEQ ID NO:25. Há um provável erro de sequenciamento ao redor de base 3000 (não incomum em projetos de sequenciamento genômico de larga escala como este), quando o quadro de leitura aberto codificando os primeiros 1002 aminoácidos da proteína TC Classe A putativa é terminado por um códon de interrupção TGA. Entretanto, o códon lisina AAA (resíduos

3022-3024 em SEQ ID NO:25) que serve como o início do quadro de leitura aberto para a segunda porção da proteína TC Classe A putativa deduzida começa 5 bases a montante do códon TGA. Através de ligação de dois pep-tídeos codificados, compreendendo 1002 aminoácidos (SEQ ID NO:26) e 2057 aminoácidos (SEQ ID NO:26), e por analogia à seqüência de genoma

de G.zeae, é provável que SEQ ID NO:25 seja parte de um quadro de leitura aberto completo que codifica uma proteína TC Classe A de aproximadamente 3000 aminoácidos. O alto relacionamento desta proteína TC Classe A FV para uma proteína TC Classe A de G. zeae é refletida por um escore BLAST de e-146 para os primeiros 1002 aminoácidos, e 0,0 para os segundos 2057

aminoácidos.

A seqüência de DNA extraída de Acontig34 é apresentada como SEQ ID NO:28. Este DNA codifica uma segunda proteína TC Classe A putativa. A seqüência de DNA que codifica a proteína TC Classe A putativa compreende uma primeira porção de 3298 bases. Esta seqüência é seguida por

uma grande folga na seqüência de DNA, indicada por uma corda de 2098 Ns. Finalmente, a seqüência codificando TC compreende 3773 bases adicionais. Resíduos 20-22 (AAT) no início da região codificando em SEQ IDNO:28 correspondem à primeira asparagina da seqüência de proteína codificada TC Classe A putativa em SEQ ID NO:29. Esta primeira porção da seqüência de DNA precedendo os Ns provavelmente contém dois erros de se-qüenciamento que interrompem o quadro de leitura de proteína TC Classe A putativa deduzida em três partes. A primeira parte do quadro de leitura aberto compreende 1452 bases e codifica 484 aminoácidos (SEQ ID NO:29). Esta parte do quadro de leitura aberto é terminada com um códon de interrupção TGA. A segunda parte do quadro de leitura aberto começa 4 bases a jusante do códon de interrupção TGA, compreende 690 bases, e codifica

230 aminoácidos (SEQ ID NO:30). Esta porção do quadro de leitura aberto é terminada com um códon de interrupção TAA. A terceira porção do quadro de leitura aberto começa 11 bases a jusante do códon de interrupção TAA, compreende 1122 bases, e codifica 374 aminoácidos (SEQ ID NO:31). A porção da seqüência de DNA seguindo os Ns compreende uma quarta por-

ção do quadro de leitura aberto de proteína TC Classe A putativa deduzida, e codifica 1233 aminoácidos (SEQ ID NO:32). O códon GGA para a primeira glicina desta porção da proteína TC Classe A putativa deduzida corresponde a pares de bases 5453-5453 de SEQ ID NO: 28. A proteína total codificada por SEQ ID NO:28 assim é de pelo menos 2358 aminoácidos de comprimen- to. Por analogia à seqüência de genoma de G. zeae é provável que SEQ ID NO:28 seja parte de um quadro de leitura aberto completo que codifica uma proteína TC Classe A de aproximadamente 3000 aminoácidos. A alta relação desta proteína TC Classe A FV deduzida a uma proteína TC Classe A de G. zeae é refletida por um escore BLAST de 4e-43 para os primeiros 484 "aminoácidos, 0,001 para os segundos 230 aminoácidos, 2e-14 para os seguintes 374 aminoácidos, e 0,0 para os 1233 aminoácidos finais.

A seqüência de DNA extraída de BCContig12 é apresentada como SEQ ID NO:33. Esta seqüência de DNA codifica uma proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa e compreende uma primeira porção de

5482 bases. Esta seqüência é seguida por uma grande folga na seqüência de DNA, indicada como uma corda de 659 Ns. Finalmente, a seqüência BC-Contig 12 compreende 1563 bases adicionais. Pares de base 22-24 (GCC)no início da região de codificação em SEQ ID NO:33 correspondem à primeira alanina da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa codificada em SEQ ID NO:33. Esta primeira porção da proteína codificada compreende 1820 aminoácidos (SEQ ID NO:34). Existe um provável erro de seqüencia-5 mento justo após as séries de Ns, quando o códon histidina em estrutura (CAT, bases 6203-6205, de SEQ ID NO:33) que inicia a segunda porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa é precedido por 61 bases fora de estrutura. A segunda porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa codificada compreende 494 aminoácidos (SEQ ID NO:35). A

proteína total codificada por SEQ !D NO:33 é assim de pelo menos 2314 aminoácidos de comprimento. Através de analogia à seqüência de genoma de G. zeae é provável que SEQ ID NO:33 seja parte de um quadro de leitura aberto completo que codifica uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de aproximadamente 2400 aminoácidos. O alto relacionamento desta proteí-

na TC Classe B / Classe C fundida FV a uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de G. zeae é refletido por um escore BLAST de 0,0 para os primeiros 1820 aminoácidos e 5e-45 para os finais 494 aminoácidos.

A seqüência de DNA extraída de BCContig6 é apresentada como SEQ ID NO:36. Esta seqüência de DNA codifica uma porção de uma

proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa e compreende 962 bases. Resíduos 20-22 (CAG) no início da região codificante em SEQ ID NO:36 corresponde à primeira glutamina da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa deduzida. Esta primeira porção da proteína codificada deduzida compreende 194 aminoácidos (SEQ ID NO:37). Há um provável erro de se-

qüenciamento justo após o códon leucina (TTG), quando um códon Interrupção (TAG) termina o quadro de leitura. Entretanto, o códon ácido aspártico (GAT, resíduos 619-621 de SEQ ID NO:36) que começa a segunda porção da proteína TC Clase B / Clase C fundida putativa é encontrado 14 bases após o códon TAG. A segunda porção da proteína TC Classe B / Clase C

fundida putativa deduzida compreende 107 aminoácidos (SEQ ID NO:38). A proteína codificada por SEQ ID NO:36 é assim provável representar uma porção de uma região codificando TC Classe B / Classe C fundida. Por ana-logia à seqüência de genoma de G. zeae, é provável que SEQ ID NO:36 seja parte de um quadro de leitura aberto completo que codifica uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de aproximadamente 2400 aminoácidos. O alto relacionamento desta proteína TC Classe B / Classe C fundida FV a uma proteína TC Classe C de Photorhabdus é refletido por um escore BLAST de 1e-11 para os primeiros 194 aminoácidos. Os restantes 107 aminoácidos têm um escore BLAST de 1e-10 para uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de G.zeae.

A seqüência de DNA extraída de BCContig46 é apresentada como SEQ ID NO:39, Esta seqüência de DNA codifica uma proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa. A seqüência de DNA que codifica a proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa compreende uma primeira porção de 3423 bases. Esta seqüência é seguida por uma grande folga na seqüência de DNA, indicada como uma corda de 1009 Ns. Finalmente, a seqüência codificando TC compreende 3810 bases adicionais. Bases 21-23 (GAG) no início da região codificante em SEQ ID NO:39 correspondem ao primeiro ácido glutâmico da primeira porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa deduzida. Esta primeira porção da proteína codificada deduzida compreende 1134 aminoácidos (SEQ ID NO:40). A segunda por- ção da proteína TC Classe B / Classe C fundida putativa deduzida compreende 1263 aminoácidos (SEQ ID NO:41). O códon TTG, que especifica a primeira leucina da segunda porção da proteína TC Classe B / Classe C fundida deduzida seguindo os Ns, corresponde a resíduos 4435-4437 em SEQ ID NO:39. A proteína codificada por SEQ ID NO:39 assim é provável represo sentar uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de pelo menos 2309 aminoácidos. Por analogia à seqüência de genoma de G. zeae é provável que SEQ ID NO:39 seja parte de um quadro de leitura aberto completo que codifica uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de aproximadamente 2400 aminoácidos. O alto relacionamento desta proteína TC Classe B / Classe c fundida FV deduzida a uma proteína TC Classe B / Classe C fundida de G. zeae é refletido por um escore BLAST de e-168 para os primeiros 1134 aminoácidos e e-122 para os 1263 aminoácidos finais.Exemplo 27

Adicionais fusões B/C naturais de Burkholderia e Nitrosospora

À luz das verificações aqui reportadas, adicionais buscas BLAST (similares àquelas descritas em Exemplos acima) foram conduzidas. Os resultados de TBLASTN de base de dados de nucleotídeos não-redundantes de Genbank com a seqüência Classe B / Classe C fundida de Gibberella zeae são como se seguem:

LOCUS CP000125.1 3181762 pb DNA circular BCT 30-SEP-2005 Definição Burkholderia pseudomallei 1710b comossomo II,

seqüência completa.

Escore BLAST: 2e-92 LOCUS CP000103.1 Definição

Escore BLAST: LOCUS CP000086.1 Definição:

Escore BLAST: 7e-47 LOCUS BX571965 Definição

Escore BLAST: 1e-39 LOCUS CP000124.1 Definição

Escore BLAST: LOCUS CP000010.1 Definição

Escore BLAST:

3184243 pb DNA circular BCT-15-NOV-2005 Nitrosospira multiformis ATCC 25196, genoma completo. 4e-68

3809201 pb DNA circular BCT 05-JAN-2006 Burkholderia thailandensis E264 cromossomo I, seqüência completa.

4074542 pb DNA circular BCT 17-APR-2005 Burkholderia pseudomallei linhagem K96243, cromossomo 1, seqüência completa.

4126292 pb DNA circular BCT 30-SEP-2005 Burkholderia pseudomallei 1710b cromossomo I, seqüência completa. 3e-39

3510148 pb DNA circular BCT 22-SEP-2004 Burkholderia mallei ATCC 23344 cromossomo 1, seqüência completa. 3e-38

Como Burkholderia e Nitrosospira são gêneros bacteriais, estesresultados tomados com os outros resultados aqui reportados, ainda confirmam que novas proteínas de fusão BC podem ser encontradas em outros organismos ocorrendo naturalmente, particularmente estas novas fontes bacteriais.Exemplo 28

Adicionais proteínas Classe A de Burkholderia e Aspergillus

À luz das verificações aqui reportadas, adicionais buscas BLAST (similares àquelas descritas em Exemplos acima) foram conduzidas. Os resultados de TBLASTN de base de dados de nucleotídeos não-redundantes de Genbank com a seqüência Classe A de Gibberella zeae são como se segue:

2505489 pb AND linear PLN 23-DEC-2005 Aspergillus oryzae RIB40 AND genômico, SC011. 8e-97

LocusCP000125.1 3181762 pb DNA circular BCT 30-SEP-2005

Burkholderia pseudomallei 1710bcromossomo II, seqüência completa. 1e-63

3510148 pb DNA circular BCT 22-SEP-2004 Burkholderia mallei ATCC 23344 cromossomo 1, seqüência completa. 3e-08

4074542 pb DNA circular BCT 17-APR-2005 Burkholderia pseudomallei linhagem K96243, cromossomo 1, seqüência completa.

3e-08

4126292 pb DNA circular BCT 30-SEP-2005 Burkholderia pseudomallei 1710b cromossomo I, seqüência completa.Escore BLAST: 3e-08

3809201 pb DNA circular BCT 05-JAN-2006 Burkholderia thailandensis E264 cromossomo I,

Locus AP007171 Definição Escore BLAST: Locus CP000125.1 Definição:

Escore BLAST: Locus CP000010.1 Definição:

Escore BLAST: Locus BX571965.1 Definição:

Escore BLAST: Locus CP000124.1 Definição:

Escore BLAST: Locus CP000086.1 Definição:seqüência completa. Escore BLAST: 8e-08

Como Burkholderia é um gênero bacterial, estes resultados, tomados com os outros resultados aqui reportados, são particularmente dignos de nota porque eles confirmam que proteínas Classe A podem ser encontradas, junto com novas proteínas de fusão BC da invenção objeto, em novas fontes bacteriais. Como Aspergillus é um gênero fungo (eucariótico), estes resultados também são particularmente notáveis porque eles confirmam que proteínas Classe A podem ser encontradas em várias fontes fungos e euca- rióticas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Dow AgroSciences LLC

Patent Law Department

9330 Zionsville Road

Indianapolis, IN 46268-1054 <120> FONTES PARA, E TIPOS DE, PROTEÍNAS INSETICIDAMENTE ATIVAS E

POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM AS PROTEÍNAS <130> DAS-125CXC1 <150> US 60/704,533

<151> 2005-08-02 <150> US 60/657,695

<151> 2005-03-02 <160> 41

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 7401 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência genômica nativa de DNA tcplG2 codificando uma proteína

de fusão Classe A/Classe B de Gibberella zeae PH1 NRRL 31084 <400> 1

atgtcaactc tttccagtcg tcctggagac cctcgcgccc tccactctgg acagaacaac 60 ggagcacccg aaaccctgac caactcaaaa agcaatgcca ctctatctgg aaaccgcacc 120 acggctccag cctcggcatc ttcatttgct ccacaagtcc gtacactggg tgaaggaatc 180 ccaggctttc gtacctcatt caacgtcgca ggtaaaggcg gcggagcgtt caggtccatc 240 agcgaggact tcgaagtgag ccctgccaat ggcaccatgt cacttgccat ccctgtgcgc 300 acgtcaccta cccgtggagg ctacggacca gatctgaagc tctcgtacga ctcgggttcg 360 ggaaatggac cgttcggatt tggctggagt atgtcaatgc cgtccattca tcgtaagaca 420 acacatgcta taccgcgata tgtggacgat gaggatgatt ttctcatgtc tggtggagac 480 atcattaaga ggttgaatag tgagggtata caagagacaa gaaatgaatc tggcatttgt 540 ggaaagtttc ttgttaccac atatcgtcca cgagtcgact ctgggaacat acgaatcgag 600agatgggttc gcagagagga tctcgaagac gtgcactgga ggacaatctc gtccagcaac 660

gagactaaaa tctacggtga tagtgacagc agccgcatct ttgacgcttc tggcccatca 720

aagaggatct tctcttggct tttaagccga t.cttatgatg catcaggcaa tgcaattgag 780

tatgtataca aagaagaaga ctcgttgggc atttctgatg ctactggagc catgcctgtg 840

tgggaaaaga atcgggaaca agacgcaaga taccgcgaga gatatatcaa acgagtcaag 900

tacggaaaca gaaagccaaa ccgtgatctt actacttggg aagtatcgga ttggcccgaa 960

gaatggatgt ttgaggtcgt ctttgactat ggagaacacg ataaaggcag tccaagcact 1020

gaagaatccc attcctggcc agttcgtcaa gatgtgtttt cacagagtcg ccctggattt 1080

gaaatccgta cctatcgtct ttgtcgccga gttctcatgt tccaccactt ccccgaacac 1140 acccaagagt cagagacttt cgtcttctcg acagatcttc agtacaacga gtctcgacaa 1200

aggactgttt tggccagctt ggtcgcaaca ggatactcgt cctacaaaga caacaatgat 1260

gggaaacaaa ggtacagatc agagtctctg ccgccatggt catttgagta cacaagttcc 1320

cccgaggcca gcgagattga actcatggag gcaaagactt ttaacctact cgaacttcct 1380

acatctgatg cacgagtttc agagtggctg gatctcgacg gcgatggtat gccagggctg 1440

ttgacaaggt ctgtagatgg cgccctctat tatcaacgca atcttgggtc aatttctggt 1500

gacgatgacc cacagttctg tggtccagtc cttctcgcac aacagcccag tatgactggc 1560

gggactttcc aagaccttga tcgaaatgga aacctcaact acgttctccg taacgagcat 1620

ggtcaccttg agggatacta tgaacgaggc aattctgata cctggaagaa ctacatcgaa 1680

tttccagaaa caagcaacgg ggatatatgg cagagcacta tcgacatcga cttgacgggc 1740 gacggtcatc ccgaccttat ctgtgcagca gatgattccc aagtcttgat ttggcagcag 1800

aacctcggaa agaaaggcct ctccagctat caacgtgtca tatgcggaca tgattgggag 1860

tcttgtccac gcttgatcaa aaaccaagat gtccagacct atgttggaga tatgactggt 1920

agcggcatgt cggacctagt tgagatctca gtatcgtcgg ttagatattg gccaaacctt 1980

ggctatggaa catttggtgc tgcagtagat atgggaaacc caccagcatt tgctgccaag 2040 gactactttg atcacagtcg agttagactc atggacaccg atggtagtgg cactatggat 2100

ctcctctacg ctctgccaac agggggcgca gctttgtact acaaccttgc tggcaattca 2160

tggagtaaca tggtattcct tccccatctc ccggctatta tcacgcctat gtcgatattt 2220

accttggatc taattggcaa gggggcggat tgtctttgtt gggcagatac ttcaactgat 2280

gggaacagga ttatgtacct cgacatcacg ggagaaacaa aaccgcatct gttgaagtct 2340 tacagcaatg gttggggtgc aacaacgtca gtggactacg ctccatcgac caagttcttc 2400

gcggaagata ccagaaatgg acacccgtgg tcaagcaaat tgccattccc agttcaatgt 2460

gtctcaaagg tccaagtcga ggatgccatc actgggaatc gacagtctac cgaatacatc 2520taccacaacg gttgctacaa cccgaccgag cagtttcaga gcgaaagagt catcgttgga cacaccaagt cgtggttcaa cgttggtctg accaagccag ccattctctc tagtctacag aacgcactga aagggctcaa cgtgcgatcg tctcacttgc cctacgttat caaggaggtg gacacaaaca agtattccgc agtccaggta gagagggata tgagtgatcc acgtgtcaca ggagacgttg aggaaagcct gagtatcgtg gatgtgaaca agaatcaaaa ggctggaaac atggtgtcag aacctgaaca ggaacacttc cacgagatac tcagctttcc attcaatggg aacttcaatg gattgcccac cacaaaatgc aacaaggcgt tttacaaaga ctctctcttg acgttttcac tgcttgatca gacctatgcc gtcgaaatag gtttacggaa ttgcaatgtt gggtcatacg tgaagctgaa agacagtgac ttctgttcat ccaagactgc atcggcagct tacacccctt cgcgcttcgt cgacctgttt

gacttcctat tagccacaga agttgaggat agctacgagc acttgcagcc tgtggagatc gtgctggatc cactgggcga gtcgatcgcg atagaagaga tagacagcct ggagaatatg gacattcttc gcgatcctac gggcgaggtc .25 aggactatcc attaccgcga tagatatgcc acatcagtcg atccggaacc agcattgtca gagtccagta gtcctgagat tcgagtcatc taccaggagc agcacctgag tgacccaact cttgccattc cagacactca aggccaagtt

ttagcagcgc caattccatc cagtttgatg gcaatgggtc gcaatgttgc gtcccttgct accccatgga cgacagttga acatggagca

aagcaatttt ctggctttga gatggtagaa 2580

gaggatgaga catatgagcc tcctgttaca 2 640

agccttgtag ttgatgagtc gcgctttttg 2700

gattaccaca cggatcccgc ggagcttgtg 2760

gagatatata gtcaggatgg aagccccaag 2820

tcgtaccatg tcaagatctc gcaagcacga 2880

ctcccgcgtg agacattctc gagagcgtac 2940

cacgatatgg tgatcaagac caacgacttt 3000

tatcctcgtg ctgggaagac cacattcgaa 3060

atgtcctaca cccagaattg gtatacaaag 3120

cgcaagcctg cagcgtacag gcaacaggaa 3180

accctcaagt tcgacgacgc tcttgcgttc 3240

tcgaaaacat ggaaggctct acgcagcgag 3300

cagagaagac ttgacgaagg cgagctgcag 3360

ctggccttta caccagacat cctagccaaa 3420

cccggctcag tcgaagagct tttgaccaaa 3480

ggttggtggg ctccatcgtc tcagtcattt 3540

gaagagctca aagaggcacg caaatccttc 3600

ggcaactcgt cacggcttaa catggataag 3660

gctataggaa ctgcgacctc gttcaaaaac 3720

atcgatgcca atagtaattc cgtacaagtc 3780

gttgcagctt cgacaagacg cgacggggtt 3840

gtcttagatg ccagccctga agatgtagac 3900

tcgactcgtc ttttgggtaa tgctgcaagc 3960

caatggaagt ctcgtcagaa tgagacatca 4020

cttgttctat cacgggacct ttcattcaag 4080

gtttcgtaca tgaatggact tgggtcgcag 4140

acgttggaaa aacgatggtt ggtacctggc 4200

gtgtgcacat accaacctcg gtttgcaact 4260

aagactaacg ctgcattcac cttttacgat 4320

gccgattgca cttggtcgaa aacagtgtat 4380

ggaagcatgg tacttcagtc caacgcacga 4440gatgatcctg atgttggcca tttcttctcc cgaatcgcat cctcccgata ctctcaaagt 4500

tggtacgaca agcgcaagct tggaacagca caagagaagc gagctgcaga gaaatcagct 4560

gtatactccg atactccact tactactcat tcgggtagct gcggacttcc tgttagaact 4620

atccaacaag ccggtggcaa gacatacaca cggagctcca tgtatgatgt gagtggcaat 4680

aggattcgag atgtcgactc gtatgaacgg accgtagaaa agatgctata cgataaactt 4740

ggtcgacagc ttcagactac aggcatggac tgcggtgaat catggctgct gctagatgcc 4800

cagggagggg agattctgtc ctggaattgt cgtggatact ctttcatcac tcgttacgat 4860

cccctacgtc gggagactga gagattagtt gcgaaagccg cagagatgcc gaagctcatc 4920

tcacgaatca cgtacggaga gacctgtggc gatgccatca acctgaactt gaatggccaa 4980

gtatggaaag tggaagatca agctggtgtt catatcaata cccattacaa catccgcggc 5040

cactgtctag ggaaaacatt acagttcaca aaagagtata agcaactggt cgattggaaa 5100

cttgatcaga cgcttgaaac ggaagtctac ccgcatacat acttctatga taactatggt 5160

caagtgttac aggaagagga tgagcaggga aaccgcacaa gaagaaatta ttcacgacaa 5220

gggcatgtcg tttcggtcga tttcagttcc ataaagggtc gtgactggaa gtcatatctc 5280

tcaggggcaa ccttttcagc tgatgggctg cctataacta tcaagtatgg gaatggagtc 5340

gtttctgact ttttctacga tgacgagtcc agaaacctca tctcgcaaag aactacgcgc 5400

ccatgccggg gtagaagaga gttgcttcaa gacaggacac acgtttatga ctacgtaggg 5460

cgtcgaatat ttacctccga tggctcagaa caagtcaagt actttggtga aagtcgcgtc 5520

aagcccgagt gggactacac atacaatgcg accggtgccc tggtgattgc cacagggaga 5580

gctcaactct ctggaaagat tggaaatggc aaccagttga caccccacaa cgcaatgaac 5640

ggactgaacc catcgcgcgg tggtggcgat ggcaatttac tttaccaata tcgcgagaca 5700

tatgattatg atcgtgaggg caatatcttg atgatgaagc atgaggcgcc tgacatcaaa 5760

ggggttacaa gctggacgag aaactatcat tacgatgaga agagtttact aagcgacgat 5820

ccccgcgtta agagcaaccg tcttagtcgg acgtcaattg gagacacaaa cgagggcaag 5880

tacatgtatg aaggcagtgc cggtctctca ggctgcataa cgacgctacc gaaattctcc 5940

gagctcgatt ggaacatgaa caatatgctc tccttctcgt caacgcagta cgtcaacgct 6000

ggcactccag agagaacata ctatgtctac gaccacgcgg gcaaccgtgt gcgaaaggtg 6060

accgagactg cagccaaatc tggtgaggag cctcgtaaac aaagggatac attgtttttc 6120

ggtggagtcg aactgcaaac aaaaagcaac ggatcactct tatggaccac gcgtgtcaag 6180

ggtgatggta tcgtggctgt ggtggaggtc aatagaaatc aagagacacc gttggtgcga 6240

ttccaggcgg gacgcgacat ggagttcgac gaccaagcac agctcatctc atatgaagag 6300

tactcgccct tcggtgccgt ggtttacgcg gctatgtacg ggaatatcga agcgcctcgg 6360gcatatcgtt tcgccaggta tgagcatgac agcgagacgg gcttgtacca ctgtggacag 6420

cgctactatt gcccatggct gggccgttgg acgtctccag atcctcttgg tgacgtagat 6480

gggccgaacc tttttgtata tgtgaataac gatcctgtaa actcgcacga tccttcggga 6540

acatctggca agaaaacgaa agagggcacc agagaaatgt acgcggcacc cgacgatcaa 6600

gggaagagac gtcttgtgga tgagaataag gcagtggccg accgcatagc gaagtatgag 6660

aggaaattac aacgacaaga acggaaacag caacgagcca tagctagaat gtctggcaca 6720

gatcccatcc taggttccag ggcacggtac gcggttggca tagccgcaat gggcaatgca 6780

ctgggccgca tttcaggaag tacagaactc catcatacct atccacáaga gtacagggag 6840

gagttttccg acatcgacat caatgttgac aggacttcgg tgtctatttc aaaggaggca 6900

10 cattatatct gcacttatgg cagcattctg gacaaccttg ttgccaccaa caaacgatgg 6960

aagagcgagt attttgatac accggacact ggttattatg agcagatgga gcaacacgag 7020

tggtatgacg atgaccctgg tatgcagtac gcgatacgtc tgcatttggc ctatgaggct 7080

cgcaccctaa acggtaaaat catggctgat tttggcataa accccaaagg cgaagatggg 7140

aggagtatgt ttgtgaatta cgatgccgtg acaaaaatga ggacggcagg gcaaaggagg 7200

ggcgtgcgga atgataattt gatacaccac gaaacatggc ctggtaggcc gtttaatact 7260

ggtaacagcg atacggacaa cgctggcgga cctgtgcatt tccaagtggc tgaggagcag 7320

tataatggcc ttgatgctga tgcgcaggcg aagtttgatg acttaaggaa ccagatggaa 7380

gctcttttgg ggaagagata g 7401 <210> 2

<211> 2466 <212> PRT

<220>

<223> Seqüência amino nativa de proteína de fusão Tcpl

B/Classe C de Gibberella zeae PHl NRRL 31084. <400> 2

Met Ser Thr Leu Ser Ser Arg Pro Gly Asp Pro Arg Ala Leu His Ser

1 5 10 15

Gly Gln Asn Asn Gly Ala Pro Glu Thr Leu Thr Asn Ser Lys Ser Asn

20 25

Ala Thr Leu Ser Gly Asn Arg Thr Thr Ala Pro Ala Ser Ala Ser SerPhe Ala Pro Gln Vai Arg Thr Leu Gly Glu Gly lie Pro Gly Phe Arg

50 55 60

Thr Ser Phe Asn Vai Ala Gly Lys Gly Gly Gly Ala Phe Arg Ser lie 65 7.0 75 80

Ser Glu Asp Phe Glu Vai Ser Pro Ala Asn Gly Thr Met Ser Leu Ala

85 90 95

lie Pro Vai Arg Thr Ser Pro Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Asp Leu

100 105 110

Lys Leu Ser Tyr Asp Ser Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Gly Phe Gly

115 120 125

Trp Ser Met Ser Met Pro Ser lie His Arg Lys Thr Thr His Ala lie

130 135 140

Pro Arg Tyr Vai Asp Asp Glu Asp Asp Phe Leu Met Ser Gly Gly Asp 145 150 155 160

lie lie Lys Arg Leu Asn Ser Glu Gly lie Gln Glu Thr Arg Asn Glu

165 170 175

Ser Gly lie Cys Gly Lys Phe Leu Vai Thr Thr Tyr Arg Pro Arg Vai

180 185 190

Asp Ser Gly Asn lie Arg lie Glu Arg Trp Vai Arg Arg Glu Asp Leu

195 200 205

Glu Asp Vai His Trp Arg Thr lie Ser Ser Ser Asn Glu Thr Lys lie

210 215 220

Tyr Gly Asp Ser Asp Ser Ser Arg lie Phe Asp Ala Ser Gly Pro Ser 225 230 235 240

Lys Arg lie Phe Ser Trp Leu Leu Ser Arg Ser Tyr Asp Ala Ser Gly

245 250 255

Asn Ala lie Glu Tyr Vai Tyr Lys Glu Glu Asp Ser Leu Gly lie Ser

260 265 270

Asp Ala Thr Gly Ala Met Pro Vai Trp Glu Lys Asn Arg Glu Gln Asp

275 280 285

Ala Arg Tyr Arg Glu Arg Tyr lie Lys Arg Vai Lys Tyr Gly Asn Arg 290 295 300Lys Pro Asn Arg Asp Leu Thr Thr Trp Glu Vai Ser Asp Trp Pro Glu 305 310 315 320

Glu Trp Met Phe Glu Vai Vai Phe Asp Tyr Gly Glu His Asp Lys Gly

325 330 335

Ser Pro Ser Thr Glu Glu Ser His Ser Trp Pro Vai Arg Gln Asp Vai

340 345 350

Phe Ser Gln Ser Arg Pro Gly Phe Glu lie Arg Thr Tyr Arg Leu Cys

355 360 365

Arg Arg Vai Leu Met Phe His His Phe Pro Glu His Thr Gln Glu Ser

370 375 380

Glu Thr Phe Vai Phe Ser Thr Asp Leu Gln Tyr Asn Glu Ser Arg Gln 385 390 395 400

Arg Thr Vai Leu Ala Ser Leu Vai Ala Thr Gly Tyr Ser Ser Tyr Lys

405 410 415

Asp Asn Asn Asp Gly Lys Gln Arg Tyr Arg Ser Glu Ser Leu Pro Pro

420 425 430

Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Ser Pro Glu Ala Ser Glu lie Glu Leu

435 440 445

Met Glu Ala Lys Thr Phe Asn Leu Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Ala

450 455 460

Arg Vai Ser Glu Trp Leu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Met Pro Gly Leu 465 470 475 480

Leu Thr Arg Ser Vai Asp Gly Ala Leu Tyr Tyr Gln Arg Asn Leu Gly

485 490 495

Ser lie Ser Gly Asp Asp Asp Pro Gln Phe Cys Gly Pro Vai Leu Leu

500 505 510

Ala Gln Gln Pro Ser Met Thr Gly Gly Thr Phe Gln Asp Leu Asp Arg

515 520 525

Asn Gly Asn Leu Asn Tyr Vai Leu Arg Asn Glu His Gly His Leu Glu

530 535 540

Gly Tyr Tyr Glu Arg Gly Asn Ser Asp Thr Trp Lys Asn Tyr lie Glu 545 550 555 560Phe Pro Glu Thr

Asp Leu Thr Gly 580

Ser Gln Vai Leu 595

Ser Tyr Gln Arg 610

Leu lie Lys Asn 625

Ser Gly Met Ser

Trp Pro Asn Leu 660

Asn Pro Pro Ala 675

Arg Leu Met Asp 690

Leu Pro Thr Gly 705

Trp Ser Asn Met

Met Ser lie Phe 740

Cys Trp Ala Asp 755

lie Thr Gly Glu 770

Trp Gly Ala Thr 785

Ala Glu Asp Thr

Ser Asn Gly Asp 565

Asp Gly His Pro

lie Trp Gln Gln 600

Vai lie Cys Gly 615

Gln Asp Vai Gln 630

Asp Leu Vai Glu 645

Gly Tyr Gly Thr

Phe Ala Ala Lys 680

Thr Asp Gly Ser 695

Gly Ala Ala Leu 710

Vai Phe Leu Pro 725

Thr Leu Asp Leu

Thr Ser Thr Asp 760

Thr Lys Pro His 775

Thr Ser Vai Asp 790

Arg Asn Gly His 805

lie Trp Gln Ser 570

Asp Leu lie Cys 585

Asn Leu Gly Lys

His Asp Trp Glu 620

Thr Tyr Vai Gly 635

lie Ser Vai Ser 650

Phe Gly Ala Ala 665

Asp Tyr Phe Asp

Gly Thr Met Asp 700

Tyr Tyr Asn Leu 715

His Leu Pro Ala 730

lie Gly Lys Gly 745

Gly Asn Arg lie

Leu Leu Lys Ser 780

Tyr Ala Pro Ser 795

Pro Trp Ser Ser 810

Thr lie Asp lie 575

Ala Ala Asp Asp 590

Lys Gly Leu Ser 605

Ser Cys Pro Arg

Asp Met Thr Gly 640

Ser Vai Arg Tyr 655

Vai Asp Met Gly 670

His Ser Arg Vai 685

Leu Leu Tyr Ala

Ala Gly Asn Ser 720

lie lie Thr Pro 735

Ala Asp Cys Leu 750

Met Tyr Leu Asp 765

Tyr Ser Asn Gly

Thr Lys Phe Phe 800

Lys Leu Pro Phe 815Pro Vai Gln Cys Vai Ser Lys Vai Gln Vai Glu Asp Ala lie Thr Gly

820 825 830

Asn Arg Gln Ser Thr Glu Tyr lie Tyr His Asn Gly Cys Tyr Asn Pro

835 840 845

Thr Glu Lys Gln Phe Ser Gly Phe Glu Met Vai Glu Gln Phe Gln Ser

850 855 860

Glu Arg Vai lie Vai Gly Glu Asp Glu Thr Tyr Glu Pro Pro Vai Thr 865 870 875 880

His Thr Lys Ser Trp Phe Asn Vai Gly Leu Ser Leu Vai Vai Asp Glu

885 890 895

Ser Arg Phe Leu Thr Lys Pro Ala lie Leu Ser Ser Leu Gln Asp Tyr

900 905 910

His Thr Asp Pro Ala Glu Leu Vai Asn Ala Leu Lys Gly Leu Asn Vai

915 920 925

Arg Ser Glu lie Tyr Ser Gln Asp Gly Ser Pro Lys Ser His Leu Pro

930 935 940

Tyr Vai lie Lys Glu Vai Ser Tyr His Vai Lys lie Ser Gln Ala Arg 945 950 955 960

Asp Thr Asn Lys Tyr Ser Ala Vai Gln Vai Leu Pro Arg Glu Thr Phe

965 970 975

Ser Arg Ala Tyr Glu Arg Asp Met Ser Asp Pro Arg Vai Thr His Asp

980 985 990

Met Vai lie Lys Thr Asn Asp Phe Gly Asp Vai Glu Glu Ser Leu Ser

995 1000 1005

lie Vai Tyr Pro Arg Ala Gly Lys Thr Thr Phe Glu Asp Vai Asn

1010 1015 1020

Lys Asn Gln Lys Ala Gly Asn Met Ser Tyr Thr Gln Asn Trp Tyr

1025 1030 1035

Thr Lys Met Vai Ser Glu Pro Glu Gln Glu His Phe Arg Lys Pro

1040 1045 1050

Ala Ala Tyr Arg Gln Gln Glu His Glu lie Leu Ser Phe Pro Phe 1055 1060 1065Asn Gly Thr Leu Lys Phe Asp Asp Ala Leu Ala Phe Asn Phe Asn

1070 1075 1080

Gly Leu Pro Thr Thr Lys Cys Ser Lys Thr Trp Lys Ala Leu Arg

1085 1090 1095

Ser Glu Asn Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Gln Arg Arg

1100 1105 1110

Leu Asp Glu Gly Glu Leu Gln Thr Phe Ser Leu Leu Asp Gln Thr

1115 1120 1125

Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Pro Asp lie Leu Ala Lys Vai Glu lie

1130 1135 1140

Gly Leu Arg Asn Cys Asn Vai Pro Gly Ser Vai Glu Glu Leu Leu

1145 1150 1155

Thr Lys Gly Ser Tyr Vai Lys Leu Lys Asp Ser Asp Gly Trp Trp

1160 1165 1170

Ala Pro Ser Ser Gln Ser Phe Phe Cys Ser Ser Lys Thr Ala Ser

1175 1180 1185

Ala Ala Glu Glu Leu Lys Glu Ala Arg Lys Ser Phe Tyr Thr Pro

1190 1195 1200

Ser Arg Phe Vai Asp Leu Phe Gly Asn Ser Ser Arg Leu Asn Met

1205 1210 1215

Asp Lys Asp Phe Leu Leu Ala Thr Glu Vai Glu Asp Ala lie Gly

1220 1225 1230

Thr Ala Thr Ser Phe Lys Asn Ser Tyr Glu His Leu Gln Pro Vai

1235 1240 1245

Glu lie lie Asp Ala Asn Ser Asn Ser Vai Gln Vai Vai Leu Asp

1250 1255 1260

Pro Leu Gly Glu Ser lie Ala Vai Ala Ala Ser Thr Arg Arg Asp

1265 1270 1275

Gly Vai lie Glu Glu lie Asp Ser Leu Glu Asn Met Vai Leu Asp

1280 1285 1290

Ala Ser Pro Glu Asp Vai Asp Asp lie Leu Arg Asp Pro Thr Gly

1295 1300 1305Glu Vai Ser Thr Arg Leu Leu Gly Asn Ala Ala Ser Arg Thr lie

1310 1315 1320

His Tyr Arg Asp Arg Tyr Ala Gln Trp Lys Ser Arg Gln Asn Glu

1325 1330 1335

Thr Ser Thr Ser Vai Asp Pro Glu Pro Ala Leu Ser Leu Vai Leu

1340 1345 1350

Ser Arg Asp Leu Ser Phe Lys Glu Ser Ser Ser Pro Glu lie Arg

1355 1360 1365

Vai lie Vai Ser Tyr Met Asn Gly Leu Gly Ser Gln Tyr Gln Glu

1370 1375 1380

Gln His Leu Ser Asp Pro Thr Thr Leu Glu Lys Arg Trp Leu Vai

1385 1390 1395

Pro Gly Leu Ala lie Pro Asp Thr Gln Gly Gln Vai Vai Cys Thr

1400 1405 1410

Tyr Gln Pro Arg Phe Ala Thr Leu Ala Ala Pro lie Pro Ser Ser

1415 1420 1425

Leu Met Lys Thr Asn Ala Ala Phe Thr Phe Tyr Asp Ala Met Gly

1430 1435 1440

Arg Asn Vai Ala Ser Leu Ala Ala Asp Cys Thr Trp Ser Lys Thr

1445 1450 1455

Vai Tyr Thr Pro Trp Thr Thr Vai Glu His Gly Ala Gly Ser Met

1460 1465 1470

Vai Leu Gln Ser Asn Ala Arg Asp Asp Pro Asp Vai Gly His Phe

1475 1480 1485

Phe Ser Arg lie Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gln Ser Trp Tyr Asp

1490 1495 1500

Lys Arg Lys Leu Gly Thr Ala Gln Glu Lys Arg Ala Ala Glu Lys

1505 1510 1515

Ser Ala Vai Tyr Ser Asp Thr Pro Leu Thr Thr His Ser Gly Ser

1520 1525 1530

Cys Gly Leu Pro Vai Arg Thr lie Gln Gln Ala Gly Gly Lys Thr 1540 1545Tyr Thr Arg Ser Ser Met Tyr Asp Vai Ser Gly Asn Arg lie Arg

1550 1555 1560

Asp Vai Asp Ser Tyr Glu Arg Thr Vai Glu Lys Met Leu Tyr Asp

1565 1570 1575

Lys Leu Gly Arg Gln Leu Gln Thr Thr Gly Met Asp Cys Gly Glu

1580 1585 1590

Ser Trp Leu Leu Leu Asp Ala Gln Gly Gly Glu lie Leu Ser Trp

1595 1600 1605

Asn Cys Arg Gly Tyr Ser Phe lie Thr Arg Tyr Asp Pro Leu Arg

1610 1615 1620

Arg Glu Thr Glu Arg Leu Vai Ala Lys Ala Ala Glu Met Pro Lys

1625 1630 1635

Leu lie Ser Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Cys Gly Asp Ala lie

1640 1645 1650

Asn Leu Asn Leu Asn Gly Gln Vai Trp Lys Vai Glu Asp Gln Ala

1655 1660 1665

Gly Vai His lie Asn Thr His Tyr Asn lie Arg Gly His Cys Leu

1670 1675 1680

Gly Lys Thr Leu Gln Phe Thr Lys Glu Tyr Lys Gln Leu Vai Asp

1685 1690 1695

Trp Lys Leu Asp Gln Thr Leu Glu Thr Glu Vai Tyr Pro His Thr

1700 1705 1710

Tyr Phe Tyr Asp Asn Tyr Gly Gln Vai Leu Gln Glu Glu Asp Glu

1715 1720 1725

Gln Gly Asn Arg Thr Arg Arg Asn Tyr Ser Arg Gln Gly His Vai

1730 1735 1740

Vai Ser Vai Asp Phe Ser Ser lie Lys Gly Arg Asp Trp Lys Ser

1745 1750 1755

Tyr Leu Ser Gly Ala Thr Phe Ser Ala Asp Gly Leu Pro lie Thr

1760 1765 1770

lie Lys Tyr Gly Asn Gly Vai Vai Ser Asp Phe Phe Tyr Asp Asp

1775 1780 1785Glu Ser Arg Asn Leu lie Ser Gln Arg Thr Thr Arg Pro Cys Arg

1790 1795 1800

Gly Arg Arg Glu Leu Leu Gln Asp Arg Thr His Vai Tyr Asp Tyr

1805 1810 1815

Vai Gly Arg Arg lie Phe Thr Ser Asp Gly Ser Glu Gln Vai Lys

1820 1825 1830

Tyr Phe Gly Glu Ser Arg Vai Lys Pro Glu Trp Asp Tyr Thr Tyr

1835 1840 1845

Asn Ala Thr Gly Ala Leu Vai lie Ala Thr Gly Arg Ala Gln Leu

1850 1855 1860

Ser Gly Lys lie Gly Asn Gly Asn Gln Leu Thr Pro His Asn Ala

1865 1870 1875

Met Asn Gly Leu Asn Pro Ser Arg Gly Gly Gly Asp Gly Asn Leu

1880 1885 1890

Leu Tyr Gln Tyr Arg Glu Thr Tyr Asp Tyr Asp Arg Glu Gly Asn

1895 1900 1905

lie Leu Met Met Lys His Glu Ala Pro Asp lie Lys Gly Vai Thr

1910 1915 1920

Ser Trp Thr Arg Asn Tyr His Tyr Asp Glu Lys Ser Leu Leu Ser

1925 1930 1935

Asp Asp Pro Arg Vai Lys Ser Asn Arg Leu Ser Arg Thr Ser lie

1940 1945 . 1950

Gly Asp Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Met Tyr Glu Gly Ser Ala Gly

1955 1960 1965

Leu Ser Gly Cys lie Thr Thr Leu Pro Lys Phe Ser Glu Leu Asp

1970 1975 1980

Trp Asn Met Asn Asn Met Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Tyr Vai

1985 1990 1995

Asn Ala Gly Thr Pro Glu Arg Thr Tyr Tyr Vai Tyr Asp His Ala

2000 2005 2010

Gly Asn Arg Vai Arg Lys Vai Thr Glu Thr Ala Ala Lys Ser Gly

2015 2020 2025Glu Glu Pro Arg Lys Gln Arg Asp Thr Leu Phe Phe Gly Gly Vai

2030 2035 2040

Glu Leu Gln Thr Lys Ser Asn Gly Ser Leu Leu Trp Thr Thr Arg

2045 2050 2055

Vai Lys Gly Asp Gly lie Vai Ala Vai Vai Glu Vai Asn Arg Asn

2060 2065 2070

Gln Glu Thr Pro Leu Vai Arg Phe Gln Ala Gly Arg Asp Met Glu

2075 2080 2085

Phe Asp Asp Gln Ala Gln Leu lie Ser Tyr Glu Glu Tyr Ser Pro

2090 2095 2100

Phe Gly Ala Vai Vai Tyr Ala Ala Met Tyr Gly Asn lie Glu Ala

2105 2110 2115

Pro Arg Ala Tyr Arg Phe Ala Arg Tyr Glu His Asp Ser Glu Thr

2120 2125 2130

Gly Leu Tyr His Cys Gly Gln Arg Tyr Tyr Cys Pro Trp Leu Gly

2135 2140 2145

Arg Trp Thr Ser Pro Asp Pro Leu Gly Asp Vai Asp Gly Pro Asn

2150 2155 2160

Leu Phe Vai Tyr Vai Asn Asn Asp Pro Vai Asn Ser His Asp Pro

2165 2170 2175

Ser Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Lys Glu Gly Thr Arg Glu Met

2180 2185. 2190

Tyr Ala Ala Pro Asp Asp Gln Gly Lys Arg Arg Leu Vai Asp Glu

2195 2200 2205

Asn Lys Ala Vai Ala Asp Arg lie Ala Lys Tyr Glu Arg Lys Leu

2210 2215 2220

Gln Arg Gln Glu Arg Lys Gln Gln Arg Ala lie Ala Arg Met Ser

2225 2230 2235

Gly Thr Asp Pro lie Leu Gly Ser Arg Ala Arg Tyr Ala Vai Gly

2240 2245 2250

lie Ala Ala Met Gly Asn Ala Leu Gly Arg lie Ser Gly Ser Thr

2255 2260 2265Glu Leu His His Thr Tyr Pro Gln Glu Tyr Arg Glu Glu Phe Ser

2270 2275 2280

Asp lie Asp lie Asn Vai Asp Arg Thr Ser Vai Ser lie Ser Lys

2285 2290 2295

Glu Ala His Tyr lie Cys Thr Tyr Gly Ser lie Leu Asp Asn Leu

2300 2305 2310

Vai Ala Thr Asn Lys Arg Trp Lys Ser Glu Tyr Phe Asp Thr Pro

2315 2320 2325

Asp Thr Gly Tyr Tyr Glu Gln Met Glu Gln His Glu Trp Tyr Asp

2330 2335 2340

Asp Asp Pro Gly Met Gln Tyr Ala lie Arg Leu His Leu Ala Tyr

2345 2350 2355

Glu Ala Arg Thr Leu Asn Gly Lys lie Met Ala Asp Phe Gly lie

2360 2365 2370

Asn Pro Lys Gly Glu Asp Gly Arg Ser Met Phe Vai Asn Tyr Asp

2375 2380 2385

Ala Vai Thr Lys Met Arg Thr Ala Gly Gln Arg Arg Gly Vai Arg

2390 2395 2400

Asn Asp Asn Leu lie His His Glu Thr Trp Pro Gly Arg Pro Phe

2405 2410 2415

Asn Thr Gly Asn Ser Asp Thr Asp Asn Ala Gly Gly Pro Vai His

2420 2425 2430

Phe Gln Vai Ala Glu Glu Gln Tyr Asn Gly Leu Asp Ala Asp Ala

2435 2440 2445

Gln Ala Lys Phe Asp Asp Leu Arg Asn Gln Met Glu Ala Leu Leu

2450 2455 2460

Gly Lys Arg

2465 <210> 3 <211> 7320 <212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência hipotética nativa de cDNA codificando proteína de fu

são de Classe B/Classe C de Gibberella zeae PH1 NRRL 3 84 (in tron putativo removido)

<400> 3

atgtcaactc tttccagtcg tcctggagac cctcgcgccc tccactctgg acagaacaac 60

ggagcacccg aaaccctgac caactcaaaa agcaatgcca ctctatctgg aaaccgcacc 120

acggctccag cctcggcatc ttcatttgct ccacaagtcc gtacactggg tgaaggaatc 180

ccaggctttc gtacctcatt caacgtcgca ggtaaaggcg gcggagcgtt caggtccatc 240

agcgaggact tcgaagtgag ccctgccaat ggcaccatgt cacttgccat ccctgtgcgc 300

acgtcaccta cccgtggagg ctacggacca gatctgaagc tctcgtacga ctcgggttcg 360

ggaaatggac cgttcggatt tggctggagt atgtcaatgc cgtccattca tcgtaagaca 420

acacatgcta taccgcgata tgtggacgat gaggatgatt ttctcatgtc tggtggagac 480

atcattaaga ggttgaatag tgagggtata caagagacaa gaaatgaatc tggcatttgt 540

ggaaagtttc ttgttaccac atatcgtcca cgagtcgact ctgggaacat acgaatcgag 600

agatgggttc gcagagagga tctcgaagac gtgcactgga ggacaatctc gtccagcaac 660

gagactaaaa tctacggtga tagtgacagc agccgcatct ttgacgcttc tggcccatca 720

aagaggatct tctcttggct tttaagccga tcttatgatg catcaggcaa tgcaattgag 780

tatgtataca aagaagaaga ctcgttgggc atttctgatg ctactggagc catgcctgtg 840

tgggaaaaga atcgggaaca agacgcaaga taccgcgaga gatatatcaa acgagtcaag 900

tacggaaaca gaaagccaaa ccgtgatctt actacttggg aagtatcgga ttggcccgaa 960

gaatggatgt ttgaggtcgt ctttgactat ggagaacacg ataaaggcag tccaagcact 1020

gaagaatccc attcctggcc agttcgtcaa gatgtgtttt cacagagtcg ccctggattt 1080

gaaatccgta cctatcgtct ttgtcgccga gttctcatgt tccaccactt cçccgaacac 1140

acccaagagt cagagacttt cgtcttctcg acagatcttc agtacaacga gtctcgacaa 1200

aggactgttt tggccagctt ggtcgcaaca ggatactcgt cctacaaaga caacaatgat 1260

gggaaacaaa ggtacagatc agagtctctg ccgccatggt.catttgagta cacaagttcc 1320

cccgaggcca gcgagattga actcatggag gcaaagactt ttaacctact cgaacttcct 1380

acatctgatg cacgagtttc agagtggctg gatctcgacg gcgatggtat gccagggctg 1440

ttgacaaggt ctgtagatgg cgccctctat tatcaacgca atcttgggtc aatttctggt 1500

gacgatgacc cacagttctg tggtccagtc cttctcgcac aacagcccag tatgactggc 1560

gggactttcc aagaccttga tcgaaatgga aacctcaact acgttctccg taacgagcat 1620ggtcaccttg agggatacta tgaacgaggc tttccagaaa caagcaacgg ggatatatgg gacggtcatc ccgaccttat ctgtgcagca aacctcggaa agaaaggcct ctccagctat 5 tcttgtccac gcttgatcaa aaaccaagat agcggcatgt cggacctagt tgagatctca ggctatggaa catttggtgc tgcagtagat gactactttg atcacagtcg agttagactc ctcctctacg ctctgccaac agggggcgca tggagtaaca tggtattcct tccccatctc accttggatc taattggcaa gggggcggat gggaacagga ttatgtacct cgacatcacg tacagcaatg gttggggtgc aacaacgtca gcggaagata ccagaaatgg acacccgtgg gtctcaaagg tccaagtcga ggatgccatc taccacaacg gttgctacaa cccgaccgag cagtttcaga gcgaaagagt catcgttgga cacaccaagt cgtggttcaa cgttggtctg accaagccag ccattctctc tagtctacag aacgcactga aagggctcaa cgtgcgatcg tctcacttgc cctacgttat caaggaggtg gacacaaaca agtattccgc agtccaggta gagagggata tgagtgatcc acgtgtcaca ggagacgttg aggaaagcct gagtatcgtg gatgtgaaca agaatcaaaa ggctggaaac atggtgtcag aacctgaaca ggaacacttc cacgagatac tcagctttcc attcaatggg aacttcaatg gattgcccac cacaaaatgc aacaaggcgt tttacaaaga ctctctcttg acgttttcac tgcttgatca gacctatgcc gtcgaaatag gtttacggaa ttgcaatgtt gggtcatacg tgaagctgaa agacagtgac

aattctgata cctggaagaa ctacatcgaa 1680

cagagcacta tcgacatcga cttgacgggc 1740

gatgattccc aagtcttgat ttggcagcag 1800

caacgtgtca tatgcggaca tgattgggag 1860

gtccagacct atgttggaga tatgactggt 1920

gtatcgtcgg ttagatattg gccaaacctt 1980

atgggaaacc caccagcatt tgctgccaag 2040

atggacaccg atggtagtgg cactatggat 2100

gctttgtact acaaccttgc tggcaattca 2160

ccggctatta tcacgcctat gtcgatattt 2220

tgtctttgtt gggcagatac ttcaactgat 2280

ggagaaacaa aaccgcatct gttgaagtct 2340

gtggactacg ctccatcgac caagttcttc 2400

tcaagcaaat tgccattccc agttcaatgt 2460

actgggaatc gacagtctac cgaatacatc 2520

aagcaatttt ctggctttga gatggtagaa 2580

gaggatgaga catatgagcc tcctgttaca 2640

agccttgtag ttgatgagtc gcgctttttg 2700

gattaccaca cggatcccgc ggagcttgtg 2760

gagatatata gtcaggatgg aagccccaag 2820

tcgtaccatg tcaagatctc gcaagcacga 2880

ctcccgcgtg agacattctc gagagcgtac 2940

cacgatatgg tgatcaagac caacgacttt 3000

tatcctcgtg ctgggaagac cacattcgaa 3060

atgtcctaca cccagaattg gtatacaaag 3120

cgcaagcctg cagcgtacag gcaacaggaa 3180

accctcaagt tcgacgacgc tcttgcgttc 3240

tcgaaaacat ggaaggctct acgcagcgag 3300

cagagaagac ttgacgaagg cgagctgcag 3360

ctggccttta caccagacat cctagccaaa 3420

cccggctcag tcgaagagct tttgaccaaa 3480

ggttggtggg ctccatcgtc tcagtcattt 3540ttctgttcat ccaagactgc atcggcagct gaagagctca aagaggcacg caaatccttc 3600

tacacccctt cgcgcttcgt cgacctgttt ggcaactcgt cacggcttaa catggataag 3660

gacttcctat tagccacaga agttgaggat gctataggaa ctgcgacctc gttcaaaaac 3720

agctacgagc acttgcagcc tgtggagatc atcgatgcca atagtaattc cgtacaagtc 3780

5 gtgctggatc cactgggcga gtcgatcgcg gttgcagctt cgacaagacg cgacggggtt 3 840

atagaagaga tagacagcct ggagaatatg gtcttagatg ccagccctga agatgtagac 3 900

gacattcttc gcgatcctac gggcgaggtc tcgactcgtc ttttgggtaa tgctgcaagc 3960

aggactatcc attaccgcga tagatatgcc caatggaagt ctcgtcagaa tgagacatca 4020

acatcagtcg atccggaacc agcattgtca cttgttctat cacgggacct ttcattcaag 4080

10 gagtccagta gtcctgagat tcgagtcatc gtttcgtaca tgaatggact tgggtcgcag 4140

taccaggagc agcacctgag tgacccaact acgttggaaa aacgatggtt ggtacctggc 4200

cttgccattc cagacactca aggccaagtt gtgtgcacat accaacctcg gtttgcaact 4260

ttagcagcgc caattccatc cagtttgatg aagactaacg ctgcattcac cttttacgat 4320

gcaatgggtc gcaatgttgc gtcccttgct gccgattgca cttggtcgaa aacagtgtat 4380

15 accccatgga cgacagttga acatggagca ggaagcatgg tacttcagtc caacgcacga 4440

gatgatcctg atgttggcca tttcttctcc cgaatcgcat cctcccgata ctctcaaagt 4500

tggtacgaca agcgcaagct tggaacagca caagagaagc gagctgcaga gaaatcagct 4560

gtatactccg atactccact tactactcat tcgggtagct gcggacttcc tgttagaact 462 0

atccaacaag ccggtggcaa gacatacaca cggagctcca tgtatgatct tcagactaca 4680

20 ggcatggact gcggtgaatc atggctgctg ctagatgccc agggagggga gattctgtcc 4740

tggaattgtc gtggatactc tttcatcact cgttacgatc ccctacgtcg ggagactgag 4800

agattagttg cgaaagccgc agagatgccg aagctcatct cacgaatcac gtacggagag 4860

acctgtggcg atgccatcaa cctgaacttg aatggccaag tatggaaagt ggaagatcaa 4920

gctggtgttc atatcaatac ccattacaac atccgcggcc actgtctagg gaaaacatta 4980

25 cagttcacaa aagagtataa gcaactggtc gattggaaac ttgatcagac gcttgaaacg 5040

gaagtctacc cgcatacata cttctatgat aactatggtc aagtgttaca ggaagaggat 5100

gagcagggaa accgcacaag aagaaattat tcacgacaag ggcatgtcgt ttcggtcgat 5160

ttcagttcca taaagggtcg tgactggaag tcatatctct caggggcaac cttttcagct 5220

gatgggctgc ctataactat caagtatggg aatggagtcg tttctgactt tttctacgat 5280

30 gacgagtcca gaaacctcat ctcgcaaaga actacgcgcc catgccgggg tagaagagag 5340

ttgcttcaag acaggacaca cgtttatgac tacgtagggc gtcgaatatt tacctccgat 5400

ggctcagaac aagtcaagta ctttggtgaa agtcgcgtca agcccgagtg ggactacaca 5460tacaatgcga ccggtgccct ggtgattgcc ggaaatggca accagttgac accccacaac ggtggcgatg gcaatttact ttaccaatat aatatcttga tgatgaagca tgaggcgcct 5 aactatcatt acgatgagaa gagtttacta cttagtcgga cgtcaattgg agacacaaac ggtctctcag gctgcataac gacgctaccg aatatgctct ccttctcgtc aacgcagtac tatgtctacg accacgcggg caaccgtgtg

ggtgaggagc ctcgtaaaca aagggataca aaaagcaacg gatcactctt atggaccacg gtggaggtca atagaaatca agagacaccg gagttcgacg accaagcaca gctcatctca gtttacgcgg ctatgtacgg gaatatcgaa

gagcatgaca gcgagacggg cttgtaccac ggccgttgga cgtctccaga tcctcttggt gtgaataacg atcctgtaaa ctcgcacgat gagggcacca gagaaatgta cgcggcaccc gagaataagg cagtggccga ccgcatagcg cggaaacagc aacgagccat agctagaatg gcacggtacg cggttggcat agccgcaatg acagaactcc atcataccta tccacaagag aatgttgaca ggacttcggt gtctatttca agcattctgg acaaccttgt tgccaccaac

ccggacactg gttattatga gcagatggag atgcagtacg cgatacgtct gcatttggcc atggctgatt ttggcataaa ccccaaaggc gatgccgtga caaaaatgag gacggcaggg atacaccacg aaacatggcc tggtaggccg

gctggcggac ctgtgcattt ccaagtggct gcgcaggcga agtttgatga cttaaggaac <210> 4

acagggagag ctcaactctc tggaaagatt 5520

gcaatgaacg gactgaaccc atcgcgcggt 5580

cgcgagacat atgattatga tcgtgagggc 5640

gacatcaaag gggttacaag ctggacgaga 5700

agcgacgatc cccgcgttaa gagcaaccgt 5760

gagggcaagt acatgtatga aggcagtgcc 5820

aaattctccg agctcgattg gaacatgaac 5880

gtcaacgctg gcactccaga gagaacatac 5940

cgaaaggtga ccgagactgc agccaaatct 6000

ttgtttttcg gtggagtcga actgcaaaca 6060

cgtgtcaagg gtgatggtat cgtggctgtg 6120

ttggtgcgat tccaggcggg acgcgacatg 6180

tatgaagagt actcgccctt cggtgccgtg 6240

gcgcctcggg catatcgttt cgccaggtat 6300

tgtggacagc gctactattg cccatggctg 6360

gacgtagatg ggccgaacct ttttgtatat 6420

ccttcgggaa catctggcaa gaaaacgaaa 6480

gacgatcaag ggaagagacg tcttgtggat 6540

aagtatgaga ggaaattaca acgacaagaa 6600

tctggcacag atcccatcct aggttccagg 6660

ggcaatgcac tgggccgcat ttcaggaagt 6720

tacagggagg agttttccga catcgacatc 6780

aaggaggcac attatatctg cacttatggc 6840

aaacgatgga agagcgagta ttttgataca 6900

caacacgagt ggtatgacga tgaccctggt 6960

tatgaggctc gcaccctaaa cggtaaaatc 7020

gaagatggga ggagtatgtt tgtgaattac 7080

caaaggaggg gcgtgcggaa tgataatttg 7140

tttaatactg gtaacagcga tacggacaac 7200

gaggagcagt ataatggcct tgatgctgat 7260

cagatggaag ctcttttggg gaagagatag 7320<211> 2439 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência amino nativa de proteína de fusão Classe B/Classe C de

Gibberella zeae PH1 NRRL 31084. 2439 aminoácidos codificados na SEQ ID NO: 3 <400> 4

Met Ser Thr Leu Ser Ser Arg Pro Gly Asp Pro Arg Ala Leu His Ser 1 5 10 15

Gly Gln Asn Asn Gly Ala Pro Glu Thr Leu Thr Asn Ser Lys Ser Asn

20 25 30

Ala Thr Leu Ser Gly Asn Arg Thr Thr Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ser 35 40 45

Phe Ala Pro Gln Vai Arg Thr Leu Gly Glu Gly lie Pro Gly Phe Arg 50 55 60

Thr Ser Phe Asn Vai Ala Gly Lys Gly Gly Gly Ala Phe Arg Ser lie 65 70 75 80

Ser Glu Asp Phe Glu Vai Ser Pro Ala Asn Gly Thr Met Ser Leu Ala 20 85 90 95

lie Pro Vai Arg Thr Ser Pro Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Asp Leu

100 105 110

Lys Leu Ser Tyr Asp Ser Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Gly Phe Gly 115 120 125

Trp Ser Met Ser Met Pro Ser lie His Arg Lys Thr Thr His Ala lie 130 135 140

Pro Arg Tyr Vai Asp Asp Glu Asp Asp Phe Leu Met Ser Gly Gly Asp 145 150 155 160

lie lie Lys Arg Leu Asn Ser Glu Gly lie Gln Glu Thr Arg Asn Glu 30 165 170 175

Ser Gly lie Cys Gly Lys Phe Leu Vai Thr Thr Tyr Arg Pro Arg Vai 180 185 190Asp Ser Gly Asn 195

Glu Asp Vai His 210

Tyr Gly Asp Ser 225

Lys Arg lie Phe

Asn Ala lie Glu 260

Asp Ala Thr Gly 275

Ala Arg Tyr Arg 290

Lys Pro Asn Arg 305

Glu Trp Met Phe

Ser Pro Ser Thr 340

Phe Ser Gln Ser 355

Arg Arg Vai Leu 370

Glu Thr Phe Vai 385

Arg Thr Vai Leu

Asp Asn Asn Asp 420

Trp Ser Phe Glu 435

lie Arg lie Glu 200

Trp Arg Thr lie 215

Asp Ser Ser Arg 230

Ser Trp Leu Leu 245

Tyr Vai Tyr Lys

Ala Met Pro Vai 280

Glu Arg Tyr lie 295

Asp Leu Thr Thr 310

Glu Vai Vai Phe 325

Glu Glu Ser His

Arg Pro Gly Phe 360

Met Phe His His 375

Phe Ser Thr Asp 390

Ala Ser Leu Vai 405

Gly Lys Gln Arg

Tyr Thr Ser Ser 440

Arg Trp Vai Arg

Ser Ser Ser Asn 220

lie Phe Asp Ala 235

Ser Arg Ser Tyr 250

Glu Glu Asp Ser 265

Trp Glu Lys Asn

Lys Arg Vai Lys 300

Trp Glu Vai Ser 315

Asp Tyr Gly Glu 330

Ser Trp Pro Vai 345

Glu lie Arg Thr

Phe Pro Glu His 380

Leu Gln Tyr Asn 395

Ala Thr Gly Tyr 410

Tyr Arg Ser Glu 425

Pro Glu Ala Ser

Arg Glu Asp Leu 205

Glu Thr Lys lie

Ser Gly Pro Ser 240

Asp Ala Ser Gly 255

Leu Gly lie Ser 270

Arg Glu Gln Asp 285

Tyr Gly Asn Arg

Asp Trp Pro Glu 320

His Asp Lys Gly 335

Arg Gln Asp Vai 350

Tyr Arg Leu Cys 365

Thr Gln Glu Ser

Glu Ser Arg Gln 400

Ser Ser Tyr Lys 415

Ser Leu Pro Pro 430

Glu lie Glu Leu 445Met Glu Ala Lys 450

Arg Vai Ser Glu 465

Leu Thr Arg Ser

Ser lie Ser Gly 500

Ala Gln Gln Pro 515

Asn Gly Asn Leu 530

Gly Tyr Tyr Glu 545

Phe Pro Glu Thr

Asp Leu Thr Gly 580

Ser Gln Vai Leu 595

Ser Tyr Gln Arg 610

Leu lie Lys Asn 625

Ser Gly Met Ser

Trp Pro Asn Leu 660

Asn Pro Pro Ala 675

Arg Leu Met Asp 690

Thr Phe Asn Leu 455

Trp Leu Asp Leu 470

Vai Asp Gly Ala 485

Asp Asp Asp Pro

Ser Met Thr Gly 520

Asn Tyr Vai Leu 535

Arg Gly Asn Ser 550

Ser Asn Gly Asp 565

Asp Gly His Pro

lie Trp Gln Gln 600

Vai lie Cys Gly 615

Gln Asp Vai Gln 630

Asp Leu Vai Glu 645

Gly Tyr Gly Thr

Phe Ala Ala Lys 680

Thr Asp Gly Ser 695

Leu Glu Leu Pro 460

Asp Gly Asp Gly 475

Leu Tyr Tyr Gln 490

Gln Phe Cys Gly 505

Gly Thr Phe Gln

Arg Asn Glu His 540

Asp Thr Trp Lys 555

lie Trp Gln Ser 570

Asp Leu lie Cys 585

Asn Leu Gly Lys

His Asp Trp Glu 620

Thr Tyr Vai Gly 635

lie Ser Vai Ser 650

Phe Gly Ala Ala 665

Asp Tyr Phe Asp

Gly Thr Met Asp 700

Thr Ser Asp Ala

Met Pro Gly Leu 480

Arg Asn Leu Gly 495

Pro Vai Leu Leu 510

Asp Leu Asp Arg 525

Gly His Leu Glu

Asn Tyr lie Glu 560

Thr lie Asp lie 575

Ala Ala Asp Asp 590

Lys Gly Leu Ser 605

Ser Cys Pro Arg

Asp Met Thr Gly 640

Ser Vai Arg Tyr 655

Vai Asp Met Gly 670

His Ser Arg Vai 685

Leu Leu Tyr AlaLeu Pro Thr Gly 705

Trp Ser Asn Met

Met Ser lie Phe 740

Cys Trp Ala Asp 755

lie Thr Gly Glu 770

Trp Gly Ala Thr 785

Ala Glu Asp Thr

Pro Vai Gln Cys 820

Asn Arg Gln Ser 835

Thr Glu Lys Gln 850

Glu Arg Vai lie 865

His Thr Lys Ser

Ser Arg Phe Leu 900

His Thr Asp Pro 915

Arg Ser Glu lie 930

Tyr Vai lie Lys 945

Gly Ala Ala Leu 710

Vai Phe Leu Pro 725

Thr Leu Asp Leu

Thr Ser Thr Asp 760

Thr Lys Pro His 775

Thr Ser Vai Asp 790

Arg Asn Gly His 805

Vai Ser Lys Vai

Thr Glu Tyr lie 840

Phe Ser Gly Phe 855

Vai Gly Glu Asp 870

Trp Phe Asn Vai 885

Thr Lys Pro Ala

Ala Glu Leu Vai 920

Tyr Ser Gln Asp 935

Glu Vai Ser Tyr 950

Tyr Tyr Asn Leu 715

His Leu Pro Ala 730

lie Gly Lys Gly 745

Gly Asn Arg lie

Leu Leu Lys Ser 780

Tyr Ala Pro Ser 795

Pro Trp Ser Ser 810

Gln Vai Glu Asp 825

Tyr His Asn Gly

Glu Met Vai Glu 860

Glu Thr Tyr Glu 87 5

Gly Leu Ser Leu 890

lie Leu Ser Ser 905

Asn Ala Leu Lys

Gly Ser Pro Lys 940

His Vai Lys lie 955

Ala Gly Asn Ser 720

lie lie Thr Pro 735

Ala Asp Cys Leu 750

Met Tyr Leu Asp 765

Tyr Ser Asn Gly

Thr Lys Phe Phe 800

Lys Leu Pro Phe 815

Ala lie Thr Gly 830

Cys Tyr Asn Pro 845

Gln Phe Gln Ser

Pro Pro Vai Thr 880

Vai Vai Asp Glu 895

Leu Gln Asp Tyr 910

Gly Leu Asn Vai 925

Ser His Leu Pro

Ser Gln Ala Arg 960Asp Thr Asn Lys Tyr Ser Ala Vai Gln Vai Leu Pro Arg Glu Thr Phe

965 970 975

Ser Arg Ala Tyr Glu Arg Asp Met Ser Asp Pro Arg Vai Thr His Asp

980 985 990

Met Vai lie Lys Thr Asn Asp Phe Gly Asp Vai Glu Glu Ser Leu Ser

995 1000 1005

lie Vai Tyr Pro Arg Ala Gly Lys Thr Thr Phe Glu Asp Vai Asn

1010 1015 1020

Lys Asn Gln Lys Ala Gly Asn Met Ser Tyr Thr Gln Asn Trp Tyr

1025 1030 1035

Thr Lys Met Vai Ser Glu Pro Glu Gln Glu His Phe Arg Lys Pro

1040 1045 1050

Ala Ala Tyr Arg Gln Gln Glu His Glu lie Leu Ser Phe Pro Phe

1055 1060 1065

Asn Gly Thr Leu Lys Phe Asp Asp Ala Leu Ala Phe Asn Phe Asn

1070 1075 1080

Gly Leu Pro Thr Thr Lys Cys Ser Lys Thr Trp Lys Ala Leu Arg

1085 1090 1095

Ser Glu Asn Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Gln Arg Arg

1100 1105 1110

Leu Asp Glu Gly Glu Leu Gln Thr Phe Ser Leu Leu Asp Gln Thr

1115 1120 1125

Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Pro Asp lie Leu Ala Lys Vai Glu lie

1130 1135 1140

Gly Leu Arg Asn Cys Asn Vai Pro Gly Ser Vai Glu Glu Leu Leu

1145 1150 1155

Thr Lys Gly Ser Tyr Vai Lys Leu Lys Asp Ser Asp Gly Trp Trp

1160 1165 1170

Ala Pro Ser Ser Gln Ser Phe Phe Cys Ser Ser Lys Thr Ala Ser

1175 1180 1185

Ala Ala Glu Glu Leu Lys Glu Ala Arg Lys Ser Phe Tyr Thr Pro

1190 1195 1200Ser Arg Phe Vai Asp Leu Phe Gly Asn Ser Ser Arg Leu Asn Met

1205 1210 1215

Asp Lys Asp Phe Leu Leu Ala Thr Glu Vai Glu Asp Ala lie Gly

1220 1225 1230

Thr Ala Thr Ser Phe Lys Asn Ser Tyr Glu His Leu Gln Pro Vai

1235 1240 1245

Glu lie lie Asp Ala Asn Ser Asn Ser Vai Gln Vai Vai Leu Asp

1250 1255 1260

Pro Leu Gly Glu Ser lie Ala Vai Ala Ala Ser Thr Arg Arg Asp

1265 1270 1275

Gly Vai lie Glu Glu lie Asp Ser Leu Glu Asn Met Vai Leu Asp

1280 1285 1290

Ala Ser Pro Glu Asp Vai Asp Asp lie Leu Arg Asp Pro Thr Gly

1295 1300 1305

Glu Vai Ser Thr Arg Leu Leu Gly Asn Ala Ala Ser Arg Thr lie

1310 1315 1320

His Tyr Arg Asp Arg Tyr Ala Gln Trp Lys Ser Arg Gln Asn Glu

1325 1330 1335

Thr Ser Thr Ser Vai Asp Pro Glu Pro Ala Leu Ser Leu Vai Leu

1340 1345 1350

Ser Arg Asp Leu Ser Phe Lys Glu Ser Ser Ser Pro Glu lie Arg

1355 1360 1365

Vai lie Vai Ser Tyr Met Asn Gly Leu Gly Ser Gln Tyr Gln Glu

1370 1375 1380

Gln His Leu Ser Asp Pro Thr Thr Leu Glu Lys Arg Trp Leu Vai

1385 1390 1395

Pro Gly Leu Ala lie Pro Asp Thr Gln Gly Gln Vai Vai Cys Thr

1400 1405 1410

Tyr Gln Pro Arg Phe Ala Thr Leu Ala Ala Pro lie Pro Ser Ser

1415 1420 1425

Leu Met Lys Thr Asn Ala Ala Phe Thr Phe Tyr Asp Ala Met Gly

1430 1435 1440Arg Asn Vai Ala Ser Leu Ala Ala Asp Cys Thr Trp Ser Lys Thr

1445 1450 1455

Vai Tyr Thr Pro Trp Thr Thr Vai Glu His Gly Ala Gly Ser Met

1460 1465 1470

Vai Leu Gln Ser Asn Ala Arg Asp Asp Pro Asp Vai Gly His Phe

1475 1480 1485

Phe Ser Arg lie Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gln Ser Trp Tyr Asp

1490 1495 1500

Lys Arg Lys Leu Gly Thr Ala Gln Glu Lys Arg Ala Ala Glu Lys

1505 1510 1515

Ser Ala Vai Tyr Ser Asp Thr Pro Leu Thr Thr His Ser Gly Ser

1520 1525 1530

Cys Gly Leu Pro Vai Arg Thr lie Gln Gln Ala Gly Gly Lys Thr

1535 1540 1545

Tyr Thr Arg Ser Ser Met Tyr . Asp Leu Gln Thr Thr Gly Met Asp

1550 1555 1560

Cys Gly Glu Ser Trp Leu Leu Leu Asp Ala Gln Gly Gly Glu lie

1565 1570 1575

Leu Ser Trp Asn Cys Arg Gly Tyr Ser Phe lie Thr Arg Tyr Asp

1580 1585 1590

Pro Leu Arg Arg Glu Thr Glu Arg Leu Vai Ala Lys Ala Ala Glu

1595 1600 1605

Met Pro Lys Leu lie Ser Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Cys Gly

1610 1615 1620

Asp Ala lie Asn Leu Asn Leu Asn Gly Gln Vai Trp Lys Vai Glu

1625 1630 1635

Asp Gln Ala Gly Vai His lie Asn Thr His Tyr Asn lie Arg Gly

1640 1645 1650

His Cys Leu Gly Lys Thr Leu Gln Phe Thr Lys Glu Tyr Lys Gln

1655 1660 1665

Leu Vai Asp Trp Lys Leu Asp Gln Thr Leu Glu Thr Glu Vai Tyr

1670 1675 1680Pro His Thr Tyr Phe Tyr Asp Asn Tyr Gly Gln Vai Leu Gln Glu

1685 1690 1695

Glu Asp Glu Gln Gly Asn Arg Thr Arg Arg Asn Tyr Ser Arg Gln

1700 1705 1710

Gly His Vai Vai Ser Vai Asp Phe Ser Ser lie Lys Gly Arg Asp

1715 1720 1725

Trp Lys Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Thr Phe Ser Ala Asp Gly Leu

1730 1735 1740

Pro lie Thr lie Lys Tyr Gly Asn Gly Vai Vai Ser Asp Phe Phe

1745 1750 1755

Tyr Asp Asp Glu Ser Arg Asn Leu lie Ser Gln Arg Thr Thr Arg.

1760 1765 1770

Pro Cys Arg Gly Arg Arg Glu Leu Leu Gln Asp Arg Thr His Vai

1775 1780 1785

Tyr Asp Tyr Vai Gly Arg Arg lie Phe Thr Ser Asp Gly Ser Glu

1790 1795 1800

Gln Vai Lys Tyr Phe Gly Glu Ser Arg Vai Lys Pro Glu Trp Asp

1805 1810 1815

Tyr Thr Tyr Asn Ala Thr Gly Ala Leu Vai lie Ala Thr Gly Arg

1820 1825 1830

Ala Gln Leu Ser Gly Lys lie Gly Asn Gly Asn Gln Leu Thr Pro

1835 1840 1845

His Asn Ala Met Asn Gly Leu Asn Pro Ser Arg Gly Gly Gly Asp

1850 1855 1860

Gly Asn Leu Leu Tyr Gln Tyr Arg Glu Thr Tyr Asp Tyr Asp Arg

1865 1870 1875

Glu Gly Asn lie Leu Met Met Lys His Glu Ala Pro Asp lie Lys

1880 1885 1890

Gly Vai Thr Ser Trp Thr Arg Asn Tyr His Tyr Asp Glu Lys Ser

1895 1900 J.905

Leu Leu Ser Asp Asp Pro Arg Vai Lys Ser Asn Arg Leu Ser Arg

1910 1915 1920Thr Ser lie Gly Asp Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Met Tyr Glu Gly

1925 1930 1935

Ser Ala Gly Leu Ser Gly Cys lie Thr Thr Leu Pro Lys Phe Ser

1940 1945 1950

Glu Leu Asp Trp Asn Met Asn Asn Met Leu Ser Phe Ser Ser Thr

1955 1960 1965

Gln Tyr Vai Asn Ala Gly Thr Pro Glu Arg Thr Tyr Tyr Vai Tyr

1970 1975 1980

Asp His Ala Gly Asn Arg Vai Arg Lys Vai Thr Glu Thr Ala Ala

1985 1990 1995

Lys Ser Gly Glu Glu Pro Arg Lys Gln Arg Asp Thr Leu Phe Phe

2000 2005 2010

Gly Gly Vai Glu Leu Gln Thr Lys Ser Asn Gly Ser Leu Leu Trp

2015 2020 2025

Thr Thr Arg Vai Lys Gly Asp Gly lie Vai Ala Vai Vai Glu Vai

2030 2035 2040

Asn Arg Asn Gln Glu Thr Pro Leu Vai Arg Phe Gln Ala Gly Arg

2045 2050 2055

Asp Met Glu Phe Asp Asp Gln Ala Gln Leu lie Ser Tyr Glu Glu

2060 2065 2070

Tyr Ser Pro Phe Gly Ala Vai Vai Tyr Ala Ala Met Tyr Gly Asn

2075 2080 2085

lie Glu Ala Pro Arg Ala Tyr Arg Phe Ala Arg Tyr Glu His Asp

2090 2095 2100

Ser Glu Thr Gly Leu Tyr His Cys Gly Gln Arg Tyr Tyr Cys Pro

2105 2110 2115

Trp Leu Gly Arg Trp Thr Ser Pro Asp Pro Leu Gly Asp Vai Asp

2120 2125 2130

Gly Pro Asn Leu Phe Vai Tyr Vai Asn Asn Asp Pro Vai Asn Ser

2135 2140 2145

His Asp Pro Ser Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Lys Glu Gly Thr

2150 2155 2160Arg Glu Met Tyr Ala Ala Pro Asp Asp Gln Gly Lys Arg Arg Leu

2165 2170 2175

Vai Asp Glu Asn Lys Ala Vai Ala Asp Arg lie Ala Lys Tyr Glu

2180 2185 2190

Arg Lys Leu Gln Arg Gln Glu Arg Lys Gln Gln Arg Ala lie Ala

2195 2200 2205

Arg Met Ser Gly Thr Asp Pro lie Leu Gly Ser Arg Ala Arg Tyr

2210 2215 2220

Ala Vai Gly lie Ala Ala Met Gly Asn Ala Leu Gly Arg lie Ser

2225 2230 2235

Gly Ser Thr Glu Leu His His Thr Tyr Pro Gln Glu Tyr Arg Glu

2240 2245 2250

Glu Phe Ser Asp lie Asp lie Asn Vai Asp Arg Thr Ser Vai Ser

2255 2260 2265

lie Ser Lys Glu Ala His Tyr lie Cys Thr Tyr Gly Ser lie Leu

2270 2275 2280

Asp Asn Leu Vai Ala Thr Asn Lys Arg Trp Lys Ser Glu Tyr Phe

2285 2290 2295

Asp Thr Pro Asp Thr Gly Tyr Tyr Glu Gln Met Glu Gln His Glu

2300 2305 2310

Trp Tyr Asp Asp Asp Pro Gly Met Gln Tyr Ala lie Arg Leu His

2315 2320 2325

Leu Ala Tyr Glu Ala Arg Thr Leu Asn Gly Lys lie Met Ala Asp

2330 2335 2340

Phe Gly lie Asn Pro Lys Gly Glu Asp Gly Arg Ser Met Phe Vai

2345 2350 2355

Asn Tyr Asp Ala Vai Thr Lys Met Arg Thr Ala Gly Gln Arg Arg

2360 2365 2370

Gly Vai Arg Asn Asp Asn Leu lie His His Glu Thr Trp Pro Gly

2375 2380 2385

Arg Pro Phe Asn Thr Gly Asn Ser Asp Thr Asp Asn Ala Gly Gly

2390 2395 2400Pro Vai His Phe Gln Vai Ala Glu Glu Gln Tyr Asn Gly Leu Asp 2405 2410 2415

Ala Asp Ala Gln Ala Lys Phe Asp Asp Leu Arg Asn Gln Met Glu 2420 2425 2430

Ala Leu Leu Gly Lys Arg 2435

<210> 5

<211> 7440

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

são Classe B/Classe C de Gibberella zeae <400> 5

tctagaaaga aggagatata ccatgtctac cctgtcctct cgcccgggcg acccgcgtgc 60

gctccattcc ggccagaata acggtgcgcc agaaactctg accaacagca aatctaacgc 120

gaccctgtct ggtaaccgta ccactgcgcc ggcatctgct agctccttcg caccgcaggt 180

tcgtaccctg ggtgaaggta tcccaggctt ccgtacttct ttcaacgtag ctggtaaagg 240

tggcggtgcg tttcgctcta tttctgaaga cttcgaagtt tccccggcta acggcactat 300

gtctctggcg atcccggtac gcaccagccc gacccgtggt ggctatggtc cggacctgaa 360

actgagctac gatagcggtt ctggtaacgg cccgttcggc tttggttggt ccatgtctat 420

gccgtctatc caccgtaaaa ccactcatgc tattccgcgt tacgttgatg acgaagacga 480

tttcctgatg tctggtggcg acattatcaa acgtctgaac tccgaaggta ttcaggaaac 540

ccgcaacgag agcggcatct gcggtaaatt cctggtaacc acttatcgcc cgcgtgttga 600

ctccggtaac atccgcatcg aacgctgggt acgtcgcgaa gatctggaag atgtgcattg 660

gcgtactatc agctcctcta acgaaactaa aatctacggc gactccgatt cttcccgcat 720

cttcgatgct tccggtccgt ctaaacgtat cttttcctgg ctgctcagcc gctcttacga 780

cgcatccggc aacgcgattg aatacgtgta taaagaggaa gactccctgg gcatcagcga 840

cgcaaccggc gcgatgccag tatgggaaaa gaaccgtgaa caggacgctc gctaccgcga 900

acgttacatc aagcgtgtaa aatatggcaa ccgcaaaccg aaccgtgatc tgactacctg 960

ggaggtgtct gactggccgg aagagtggat gttcgaagtg gtattcgatt acggcgaaca 1020

tgataaaggt tctccgtcca ctgaggaatc ccactcttgg ccggttcgtc aggacgtttt 1080ctctcagtcc cgtccaggtt tcgaaatccg gttccaccat ttcccggaac acactcagga gcaatataac gaaagccgcc agcgtaccgt tagctacaaa gataacaacg atggtaagca gtcttttgaa tatacctcta gcccggaagc cttcaacctg ctcgaactgc cgacctccga tggtgacggc atgccgggcc ttctgacccg caacctgggt tctatctccg gtgacgatga tcagcaaccg tccatgaccg gcggtacttt ctacgtgctg cgtaacgaac acggtcacct cacctggaag aactatatcg aattcccgga tatcgatatt gacctgaccg gcgatggtca ccaggtgctg atttggcagc aaaacctggg aatttgcggc catgattggg agtcctgccc ctacgttggc gacatgaccg gcagcggcat cgtgcgctat tggccgaacc tgggttacgg cccgccagct ttcgcagcga aagattactt cgacggtagc ggcactatgg atctgctcta ctataacctg gctggcaaca gctggtctaa tatcaccccg atgagcatct tcaccctgga ttgggctgac acttccaccg atggtaaccg caaaccgcac ttgctgaaat cttatagcaa cgcgccgtcc accaaattct ttgcagaaga actgccgttt ccggtgcagt gcgtatctaa ccgtcagagc accgaataca tctatcataa ctctggtttc gaaatggtgg aacagttcca aacctacgaa ccgccagtta cccacaccaa agtggacgaa agccgtttcc tgactaaacc cactgacccg gcggaactgg tgaacgcact ctctcaagat ggctccccga aatctcacct cgttaagatt tcccaggcgc gtgacaccaa tgaaactttt agccgtgcgt acgaacgtga

tacttaccgt ctgtgtcgtc gcgttctgat 1140

gagcgaaacc tttgttttct ctaccgacct 1200

tctggcaagc ctggtggcga ctggttattc 1260

gcgttaccgc tctgaaagcc tgccaccgtg 1320

atctgagatc gaactgatgg aagctaaaac 1380

cgcacgtgtg tctgagtggç tggacctgga 1440

ttctgtggat ggcgcactgt actatcagcg 1500

cccgcagttc tgcggtccgg ttcttctggc 1560

ccaggatctg gatcgtaacg gcaacctgaa 1620

ggaaggttac tatgagcgtg gtaactctga 1680

aacctctaac ggtgatatct ggcagtctac 1740

tccggacctg atctgcgcgg cagacgatag 1800

taagaaaggc ctgtctagct accagcgtgt 1860

acgcctgatc aagaaccagg acgttcagac 1920

gtctgacctg gtagaaatca gcgtaagctc 1980

tactttcggc gcggcagtag acatgggtaa 2040

cgaccacagc cgtgtgcgcc tgatggacac 2100

cgcactgccg accggcggtg cagctctgta 2160

catggtgttc ctgccacacc tgccggcgat 2220

cctgattggc aaaggtgctg attgcctgtg 2280

tatcatgtat ctggacatca ccggcgaaac 2340

cggctggggt gctactacct ctgtggatta 2400

tacccgtaac ggccacccgt ggtctagcaa 2460

agttcaggtg gaagacgcta tcaccggcaa 2520

cggttgttac aacccgactg aaaagcagtt 2580

gtccgagcgt gttatcgtag gcgaagatga 2640

aagctggttc aacgttggtc tgagcctggt 2700

ggcgatcctg tcctctctgc aagattacca 2760

gaaaggtctg aacgtgcgtt ccgaaattta 2820

gccgtatgta atcaaggaag tttcttatca 2880

caaatattcc gcagttcagg ttctgccacg 2940

catgtccgac ccgcgtgtga ctcacgatat 3000ggttattaag accaacgact ttggtgacgt tgcaggcaaa accactttcg aagatgttaa cactcagaac tggtacacca aaatggtgag ggcagcgtat cgccaacagg aacacgagat gtttgatgac gcactggcgt ttaacttcaa ttggaaagct ctgcgcagcg aaaacaaggc tctggatgaa ggtgagctgc aaaccttctc taccccggac atcctggcta aagtggaaat tgtggaggaa ctgttgacta aaggtagcta

ggcaccgtct tcccagtctt tcttttgtag gaaagaagcg cgcaaatcct tttatacccc cagccgcctg aacatggata aagactttct caccgcaacc tctttcaaaa actcctatga gaactctaac agcgttcagg tagttctgga

ttccactcgt cgcgacggtg ttatcgagga tgcgtctccg gaagacgttg atgacatcct ccttctgggt aacgcggctt ctcgtaccat gtctcgccag aacgaaacct ctaccagcgt gtcccgtgac ctgtccttca aggaatcctc

catgaacggc ctgggtagcc agtatcaaga gaaacgttgg ctggttccgg gcctggcaat ctaccagccg cgtttcgcta ccctggctgc cgcggcattc accttctacg atgcgatggg tacctggtcc aaaaccgttt atactccgtg

ggttctgcaa tccaacgctc gtgatgaccc gtcttcccgc tactcccaga gctggtacga acgcgcagct gagaaatccg cggtttattc ttgcggcctg ccggttcgca ccatccagca tatgtatgat gtgtctggca accgtatccg

aaaaatgctg tacgacaaac tgggtcgtca atcctggctc ctgcttgacg cacagggtgg ctctttcatt actcgttacg acccgctgcg

tgaagagtct ctgtctattg tatatccgcg 3060

caagaaccag aaagcgggca acatgtccta 3120

cgaaccggaa caggagcact ttcgcaaacc 3180

cctgtccttt ccgttcaacg gcactctgaa 3240

cggtctgccg actaccaaat gttctaaaac 3300

gttctacaaa gatagccttc tgcaacgccg 3360

cctcctggac cagacttacg cactggcgtt 3420

tggcctgcgt aactgtaacg taccgggttc 3480

cgtaaagctg aaagacagcg acggctggtg 3 540

ctctaagacc gctagcgcag ctgaggaact 3 600

atcccgtttc gtggacctgt tcggcaactc 3660

cctggctact gaagttgagg acgcaatcgg 3720

acacctgcaa ccagtggaga ttatcgacgc 3780

cccactgggc gaatccattg cggtggcggc 3 840

aattgactcc ctggaaaaca tggtgctgga 3900

gcgtgatccg accggcgaag tgagcacccg 3960

tcattaccgt gatcgctacg ctcagtggaa 4020

tgatccggaa ccggctctgt ctctggttct 4080

tagcccggag atccgtgtta ttgtgagcta 4140

gcagcatctg tccgatccga ccactctgga 4200

cccagataca cagggccagg tggtatgcac 4260

gccgattcca tcctctctga tgaaaactaa 4320

ccgtaacgtg gcaagcttgg ctgcggattg 4380

gaccactgtt gaacacggtg ctggtagcat 4440

ggatgttggt cacttctttt cccgcatcgc 4500

taagcgtaaa ctgggtactg ctcaggaaaa 4560

cgatactccg ctgaccactc actccggttc 4620

agcaggcggt aaaacctaca cccgcagctc 4680

cgacgttgac tcctacgaac gtaccgttga 4740

gctgcagact accggtatgg attgtggcga 4800

cgagatcctg agctggaact gtcgcggtta 4860

tcgcgaaacc gaacgcctgg ttgcgaaagc 4920ggctgaaatg ccgaaactga tcagccgtat caacctgaac ctgaacggtc aggtatggaa cactcactat aacattcgtg gtcactgcct taaacagctg gttgattgga aactggatca 5 ctatttctac gataactatg gccaggttct ccgccgtaac tactcccgtc agggtcacgt ccgtgactgg aaatcttacc tgtctggtgc tatcaaatac ggcaacggtg tggtttccga gattagccaa cgcaccactc gtccgtgccg

10 ccatgtttac gactatgttg gtcgtcgcat atatttcggt gagagccgtg ttaagccgga actggtaatc gcaaccggcc gtgcgcagct gaccccgcat aacgctatga acggcctgaa gctgtatcag tatcgcgaaa cttacgacta

15 acacgaagcg ccggacatca aaggcgttac aaagagcctg ttatccgacg atccacgtgt cggcgatacc aacgaaggca aatacatgta caccactctg ccaaagttct ccgaactgga ttccactcag tacgtaaacg cgggcacccc

20 tggtaaccgc gttcgtaaag ttaccgagac acagcgtgat accctgttct ttggtggcgt tctgtggact acccgtgtta aaggtgatgg ccaggaaacc ccgctggtac gcttccaggc gcagctgatc agctacgagg aatattctcc

25 cggcaacatt gaggcaccac gcgcttaccg cggcctgtat cactgtggcc agcgttatta agatccgctg ggtgacgtgg atggtccaaa taactcccac gacccgtctg gtacttccgg gtacgcagcg ccagatgacc agggcaaacg

30 tgatcgcatc gcaaagtacg aacgcaaact gatcgcgcgt atgagcggca ccgacccgat cattgcggct atgggcaacg cgctgggtcg

cacttacggc gaaacctgcg gtgacgcaat 4980

agttgaggat caggcaggcg ttcacattaa 5040

gggtaagacc ctgcaattca ccaaagaata 5100

gaccctggaa actgaggttt atccgcatac 5160

gcaagaggaa gacgaacagg gcaaccgtac 5220

ggtttctgta gacttctcta gcattaaagg 5280

taccttctct gcggacggcc tgccgattac 5340

ctttttctac gatgacgaaa gccgtaacct 5400

tggtcgtcgc gaactgctcc aagatcgtac 5460

ttttacttcc gacggttccg aacaggtaaa 5520

atgggactac acttacaacg cgactggcgc 5580

gtctggcaaa atcggtaacg gcaaccagct 5640

cccgtctcgc ggtggcggtg acggtaactt 5700

cgatcgtgag ggtaacattc tgatgatgaa 5760

cagctggacc cgtaactacc actacgatga 5820

gaaatccaac cgtctgtctc gcacctccat 5880

cgaaggctct gctggcctgt ccggttgcat 5940

ttggaacatg aacaacatgc tgagcttttc 6000

ggaacgtacc tactatgtgt acgaccacgc 6060

tgcggctaaa tctggtgagg aaccgcgtaa 6120

ggaactgcaa accaaatcca acggctctct 6180

tatcgtggct gtagttgaag tgaaccgtaa 6240

tggtcgtgac atggaatttg acgatcaggc 6300

gttcggtgct gtggtttacg ctgcgatgta 6360

tttcgcacgt tacgaacacg attctgaaac 6420

ctgcccgtgg ctgggtcgtt ggacctcccc 6480

cctgttcgta tacgtgaaca acgatccagt 6540

caagaaaacc aaggaaggta ctcgcgaaat 6600

ccgtctggtt gacgagaaca aagctgttgc 6660

gcaacgtcag gaacgtaaac aacagcgtgc 6720

cctgggttct cgtgcacgtt atgcggtagg 6780

tatctctggt tccaccgaac tgcatcacac 6840ctacccgcag gaatatcgtg aagagttctc tgacatcgac attaacgttg accgtacctc 6900 tgtgagcatt tccaaagagg cgcactatat ctgcacttac ggtagcatcc tggacaacct 6960 ggtagcaacc aacaaacgct ggaaatctga atactttgac actccagaca ctggttatta 7020 cgaacagatg gagcagcatg agtggtacga cgatgaccca ggcatgcagt acgcgatccg 7080 tctgcacctg gcatacgaag cgcgtactct gaacggtaaa atcatggcgg atttcggcat 7140 caacccgaaa ggcgaagacg gtcgttccat gtttgttaac tatgatgcgg taaccaaaat 7200 gcgtaccgct ggtcagcgtc gcggcgtacg taacgacaac ctgatccatc acgaaacctg 7260 gccgggtcgt ccgtttaaca ccggcaacag cgataccgat aacgcgggtg gcccggttca 7320 cttccaggtt gcagaggaac agtacaacgg cctggatgct gacgcgcagg cgaaattcga 7380 tgacctgcgc aaccaaatgg aggcgctcct aggcaaacgc taataattaa tgctctcgag 7440 <210> 6 <211> 2528 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Exemplo de proteína de fusão gerada a partir de seqüências de

aminoácido de Tcac (GenBank Accession AAC38625.1) e TccCl (Gen-Bank Accession AAL18473.1) (ambas de cepa de Photorhabdus lumi-nescens W-14)

<400> 6

Met Gln Asp Ser Pro Glu Vai Ser lie Thr Thr Leu Ser Leu Pro Lys

15 10 15

Gly Gly Gly Ala lie Asn Gly Met Gly Glu Ala Leu Asn Ala Ala Gly

20 25 30

Pro Asp Gly Met Ala Ser Leu Ser Leu Pro Leu Pro Leu Ser Thr Gly

35 40 45

Arg Gly Thr Ala Pro Gly Leu Ser Leu lie Tyr Ser Asn Ser Ala Gly

50 55 60

Asn Gly Pro Phe Gly lie Gly Trp Gln Cys Gly Vai Met Ser lie Ser 65 70 75 80

Arg Arg Thr Gln His Gly lie Pro Gln Tyr Gly Asn Asp Asp Thr Phe 85 90 95Leu Ser Pro Gln 100

Gln Pro Asp lie 115

Pro lie Ser Tyr 130

Phe Ser Lys lie 145

Ala Phe Trp Leu

Lys Thr Ala Gln 180

Ala Gln Trp Leu 195

Ser Tyr Gln Tyr 210

Lys Thr Ala His 225

Asn Tyr Gly Asn

Ala Pro Pro Ala 260

Gly Glu Arg Asp 275

Thr Ala Gln Trp 290

Gly Phe Glu Vai 305

His Arg Thr Ala Glu Leu Vai Gly

Gly Glu Vai Met

Arg Gln Asp Vai 120

Thr Vai Thr Arg 135

Glu Tyr Trp Gln 150

lie Ser Ser Pro 165

Ala Cys Leu Ala

Leu Glu Glu Thr 200

Arg Ala Glu Asp 215

Pro Asn Vai Thr 230

lie Lys Pro Gln 245

Pro Glu Glu Trp

Thr Ser Leu His 280

Ser Vai Arg Pro 295

Arg Thr Arg Arg 310

Leu Met Ala Gly 325

Arg Leu lie Leu

Asn lie Ala Leu 105

Lys Thr Leu Gln

Tyr Gln Ala Arg 140

Pro Ala Ser Gly 155

Asp Gly Gln Leu 170

Asn Pro Gln Asn 185

Vai Thr Pro Ala

Glu Ala His Cys 220

Ala Gln Arg Tyr 235

Ala Ser Leu Phe 250

Leu Phe His Leu 265

Thr Vai Pro Thr

Asp lie Phe Ser 300

Leu Cys Gln Gln 315

Glu Ala Ser Thr 330

Glu Tyr Asp Lys

Asn Asp Gln Gly 110

Gly Vai Thr Leu 125

Gln lie Leu Asp

Gln Glu Gly Arg 160

His lie Leu Gly 175

Asp Gln Gln lie 190

Gly Glu His Vai 205

Asp Asp Asn Glu

Leu Vai Gln Vai 240

Vai Leu Asp Asn 255

Vai Phe Asp His 270

Trp Asp Ala Gly 285

Arg Tyr Glu Tyr

Vai Leu Met Phe 320

Asn Asp Ala Pro 335

Asn Ala Ser VaiThr Thr Leu lie 355

Pro Vai Thr Gln 370

Glu Lys Met Pro 385

Ser Gln Gln Arg

Gly Met Leu Tyr 420

Arg Gln Glu Asp 435

Pro Leu Pro Thr 450

lie Asn Gly Asp 465

Arg Gly Tyr His

Pro lie Asn Ala 500

Ala Asp Leu Thr 515

Lys Ser Vai Arg 530

Glu Asp Vai Pro 545

Asp Ala Arg Lys

Gln His Leu Vai 580

Leu Gly His Gly 595

Thr lie Arg Gln 360

Pro Pro Leu Glu 375

Thr Trp Gln Arg 390

Tyr Gln Leu Vai 405

Gln Asp Arg Gly

Gly Asp Ser Asn 440

Leu Pro Asn Leu 455

Gly Gln Leu Asp 470

Ser Gln Gln Pro 485

Leu Pro Vai Glu

Gly Ala Gly Leu 520

Leu Tyr Ala Asn 535

Gln Ser Thr Gly 550

Leu Vai Ala Phe 565

Glu lie Lys Ala

Arg Phe Gly Gln 600

165

Leu Ser His Glu

Leu Ala Trp Gln 380

Phe Asp Ala Leu 395

Asp Leu Arg Gly 410

Ala Trp Trp Tyr 425

Ala Vai Thr Tyr

Gln Asp Asn Ala 460

Trp Vai Vai Thr 475

Asp Gly Lys Trp 490

Tyr Phe His Pro 505

Ser Asp Leu Vai

Gln Arg Asn Gly 540

lie Thr Leu Pro 555

Ser Asp Met.Leu 570

Asn Arg Vai Thr 585

Pro Leu Thr Leu

Ser Asp Gly Ser 365

Arg Phe Asp Leu

Asp Asn Phe Asn 400

Glu Gly Leu Pro 415

Lys Ala Pro Gln 430

Asp Lys lie Ala 445

Ser Leu Met Asp

Ala Ser Gly lie 480

Thr His Phe Thr 495

Ser lie Gln Phe 510

Leu lie Gly Pro 525

Trp Arg Lys Gly

Vai Thr Gly Thr 560

Gly Ser Gly Gln 575

Cys Trp Pro Asn 590

Ser Gly Phe Ser 605Gln Pro Glu Asn 610

Asp Gly Ser Gly 625

Leu lie Tyr Leu

Leu Ala Leu Pro 660

Vai Ala Asp lie 675

Pro His lie Ala 690

Pro Trp Leu Leu 705

Leu His Tyr Arg

Leu Thr Lys Ala 740

His Leu Leu Trp 755

Leu Thr Ser Glu 770

Arg Glu Phe Arg 785

Phe Ser His Gly

Ser Trp Phe Ala 820

Glu Tyr Trp Gln 835

Tyr Thr Vai Trp 850

Ser Phe Asn Pro 615

Thr Thr Asp Leu 630

Asn Gln Ser Gly 645

Glu Gly Vai Gln

Gln Gly Leu Gly 680

Pro His His Trp 695

Asn Vai Met Asn 710

Ser Ser Ala Gln 725

Gly Lys Ser Pro

Tyr Thr Glu lie 760

Vai Asn Tyr Ser 775

Gly Phe Gly Cys 790

Thr Ala Pro Glu 805

Thr Gly Met Asp

Ala Asp Thr Gln 840

Asp His Thr Asn 855

166

Glu Arg Leu Phe 620

lie Tyr Ala Gln 635

Asn Gln Phe Asp 650

Phe Asp Asn Thr 665

lie Ala Ser Leu

Arg Cys Asp Leu 700

Asn Asn Arg Gly 715

Phe Trp Leu Asp 730

Ala Cys Tyr Leu 745

Gln Asp Glu lie

His Gly Vai Trp 780

lie Lys Gln Thr 795

Gln Ala Ala Pro 810

Glu Vai Asp Ser 825

Ala Tyr Ser Gly

Gln Thr Asp Gln 860

Leu Ala Asp lie

Ser Gly Ser Leu 640

Ala Pro Leu Thr 655

Cys Gln Leu Gln 670

lie Leu Thr Vai 685

Ser Leu Thr Lys

Ala His His Thr 720

Glu Lys Leu Gln 735

Pro Phe Pro Met 750

Ser Gly Asn Arg 765

Asp Gly Lys Glu

Asp Thr Thr Thr 800

Ser Leu Ser lie 815

Gln Leu Ala Thr 830

Phe Glu Thr Arg 845

Ala Phe Thr PrAsn Glu Thr Gln Arg Asn Trp Leu Thr Arg Ala Leu Lys Gly Gln Leu 865 870 875 880

Leu Arg Thr Glu Leu Tyr Gly Leu Asp Gly Thr Asp Lys Gln Thr Vai

885 890 895

Pro Tyr Thr Vai Ser Glu Ser Arg Tyr Gln Vai Arg Ser lie Pro Vai

900 905 910

Asn Lys Glu Thr Glu Leu Ser Ala Trp Vai Thr Ala lie Glu Asn Arg

915 920 925

Ser Tyr His Tyr Glu Arg lie lie Thr Asp Pro Gln Phe Ser Gln Ser

930 935 940

lie Lys Leu Gln His Asp lie Phe Gly Gln Ser Leu Gln Ser Vai Asp 945 950 955 960

lie Ala Trp Pro Arg Arg Glu Lys Pro Ala Vai Asn Pro Tyr Pro Pro

965 970 975

Thr Leu Pro Glu Thr Leu Phe Asp Ser Ser Tyr Asp Asp Gln Gln Gln

980 985 990

Leu Leu Arg Leu Vai Arg Gln Lys Asn Ser Trp His His Leu Thr Asp

995 1000 1005

Gly Glu Asn Trp Arg Leu Gly Leu Pro Asn Ala Gln Arg Arg Asp

1010 1015 1020

Vai Tyr Thr Tyr Asp Arg Ser Lys lie Pro Thr Glu Gly lie Ser

1025 1030 1035

Leu Glu lie Leu Leu Lys Asp Asp Gly Leu Leu Ala Asp Glu Lys

1040 1045 1050

Ala Ala Vai Tyr Leu Gly Gln Gln Gln Thr Phe Tyr Thr Ala Gly

1055 1060 1065

Gln Ala Glu Vai Thr Leu Glu Lys Pro Thr Leu Gln Ala Leu Vai

1070 1075 1080

Ala Phe Gln Glu Thr Ala Met Met Asp Asp Thr Ser Leu Gln Ala

1085 1090 1095

Tyr Glu Gly Vai lie Glu Glu Gln Glu Leu Asn Thr Ala Leu Thr

1100 1105 1110Gln Ala Gly Tyr Gln Gln Vai Ala Arg Leu Phe Asn Thr Arg Ser

1115 1120 1125

Glu Ser Pro Vai Trp Ala Ala Arg Gln Gly Tyr Thr Asp Tyr Gly

1130 1135 1140

Asp Ala Ala Gln Phe Trp Arg Pro Gln Ala Gln Arg Asn Ser Leu

1145 1150 1155

Leu Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Trp Asp Thr His His Cys Vai

1160 1165 1170

lie lie Gln Thr Gln Asp Ala Ala Gly Leu Thr Thr Gln Ala His

1175 1180 1185

Tyr Asp Tyr Arg Phe Leu Thr Pro Vai Gln Leu Thr Asp lie Asn

1190 1195 1200

Asp Asn Gln His lie Vai Thr Leu Asp Ala Leu Gly Arg Vai Thr

1205 1210 1215

Thr Ser Arg Phe Trp Gly Thr Glu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Tyr

1220 1225 1230

Ser Asn Gln Pro Phe Thr Pro Pro Asp Ser Vai Asp Lys Ala Leu

1235 1240 1245

Ala Leu Thr Gly Ala Leu Pro Vai Ala Gln Cys Leu Vai Tyr Ala

1250 1255 1260

Vai Asp Ser Trp Met Pro Ser Leu Ser Leu Ser Gln Leu Ser Gln

1265 1270 1275

Ser Gln Glu Glu Ala Glu Ala Leu Trp Ala Gln Leu Arg Ala Ala

1280 1285 1290

His Met lie Thr Glu Asp Gly Lys Vai Cys Ala Leu Ser Gly Lys

1295 1300 1305

Arg Gly Thr Ser His Gln Asn Leu Thr lie Gln Leu lie Ser Leu

1310 1315 1320

Leu Ala Ser lie Pro Arg Leu Pro Pro His Vai Leu Gly lie Thr

1325 1330 1335

Thr Asp Arg Tyr Asp Ser Asp Pro Gln Gln Gln His Gln Gln Thr

1340 1345 1350Vai Ser Phe Ser Asp Gly Phe Gly Arg Leu Leu Gln Ser Ser Ala

1355 1360 1365

Arg His Glu Ser Gly Asp Ala Trp Gln Arg Lys Glu Asp Gly Gly

1370 1375 1380

Leu Vai Vai Asp Ala Asn Gly Vai Leu Vai Ser Ala Pro Thr Asp

1385 1390 1395

Thr Arg Trp Ala Vai Ser Gly Arg Thr Glu Tyr Asp Asp Lys Gly

1400 1405 1410

Gln Pro Vai Arg Thr Tyr Gln Pro Tyr Phe Leu Asn Asp Trp Arg

1415 1420 1425

Tyr Vai Ser Asp Asp Ser Ala Arg Asp Asp Leu Phe Ala Asp Thr

1430 1435 1440

His Leu Tyr Asp Pro Leu Gly Arg Glu Tyr Lys Vai lie Thr Ala

1445 1450 1455

Lys Lys Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Tyr Thr Pro Trp Phe lie Vai

1460 1465 1470

Ser Glu Asp Glu Asn Asp Thr Ala Ser Arg Thr Pro Met Ser Pro

1475 1480 1485

Ser Glu Thr Thr Leu Tyr Thr Gln Thr Pro Thr Vai Ser Vai Leu

1490 1495 1500

Asp Asn Arg Gly Leu Ser lie Arg Asp lie Gly Phe His Arg lie

1505 1510 1515

Vai lie Gly Gly Asp Thr Asp Thr Arg Vai Thr Arg His Gln Tyr

1520 1525 1530

Asp Ala Arg Gly His Leu Asn Tyr Ser lie Asp Pro Arg Leu Tyr

1535 1540 1545

Asp Ala Lys Gln Ala Asp Asn Ser Vai Lys Pro Asn Phe Vai Trp

1550 1555 1560

Gln His Asp Leu Ala Gly His Ala Leu Arg Thr Glu Ser Vai Asp

1565 1570 1575

Ala Gly Arg Thr Vai Ala Leu Asn Asp lie Glu Gly Arg Ser Vai

1580 1585 1590Met Thr Met Asn Ala Thr Gly Vai Arg Gln Thr Arg Arg Tyr Glu

1595 1600 1605

Gly Asn Thr Leu Pro Gly Arg Leu Leu Ser Vai Ser Glu Gln Vai

1610 1615 1620

Phe Asn Gln Glu Ser Ala Lys Vai Thr Glu Arg Phe lie Trp Ala

1625 1630 1635

Gly Asn Thr Thr Ser Glu Lys Glu Tyr Asn Leu Ser Gly Leu Cys

1640 1645 1650

lie Arg His Tyr Asp Thr Ala Gly Vai Thr Arg Leu Met Ser Gln

1655 1660 1665

Ser Leu Ala Gly Ala Met Leu Ser Gln Ser His Gln Leu Leu Ala

1670 1675 1680

Glu Gly Gln Glu Ala Asn Trp Ser Gly Asp Asp Glu Thr Vai Trp

1685 1690 1695

Gln Gly Met Leu Ala Ser Glu Vai Tyr Thr Thr Gln Ser Thr Thr

1700 1705 1710

Asn Ala lie Gly Ala Leu Leu Thr Gln Thr Asp Ala Lys Gly Asn

1715 1720 1725

lie Gln Arg Leu Ala Tyr Asp lie Ala Gly Gln Leu Lys Gly Ser

1730 1735 1740

Trp Leu Thr Vai Lys Gly Gln Ser Glu Gln Vai lie Vai Lys Ser

1745 1750 1755

Leu Ser Trp Ser Ala Ala Gly His Lys Leu Arg Glu Glu His Gly

1760 1765 1770

Asn Gly Vai Vai Thr Glu Tyr Ser Tyr Glu Pro Glu Thr Gln Arg

1775 1780 1785

Leu lie Gly lie Thr Thr Arg Arg Ala Glu Gly Ser Gln Ser Gly

1790 1795 1800

Ala Arg Vai Leu Gln Asp Leu Arg Tyr Lys Tyr Asp Pro Vai Gly

1805 1810 1815

Asn Vai lie Ser lie His Asn Asp Ala Glu Ala Thr Arg Phe^ Trp

1820 1825 1830Arg Asn Gln Lys Vai Glu Pro Glu Asn Arg Tyr Vai Tyr Asp Ser

1835 1840 1845

Leu Tyr Gln Leu Met Ser Ala Thr Gly Arg Glu Met Ala Asn lie

1850 1855 1860

Gly Gln Gln Ser Asn Gln Leu Pro Ser Pro Vai lie Pro Vai Pro

1865 1870 1875

Thr Asp Asp Ser Thr Tyr Thr Asn Tyr Leu Arg Thr Tyr Thr Tyr

1880 1885 1890

Asp Arg Gly Gly Asn Leu Vai Gln lie Arg His Ser Ser Pro Ala

1895 1900 1905

Thr Gln Asn Ser Tyr Thr Thr Asp lie Thr Vai Ser Ser Arg Ser

1910 1915 1920

Asn Arg Ala Vai Leu Ser Thr Leu Thr Thr Asp Pro Thr Arg Vai

1925 1930 1935

Asp Ala Leu Phe Asp Ser Gly Gly His Gln Lys Met Leu"lie Pro

1940 1945 1950

Gly Gln Asn Leu Asp Trp Asn lie Arg Gly Glu Leu Gln Arg Vai

1955 1960 1965

Thr Pro Vai Ser Arg Glu Asn Ser Ser Asp Ser Glu Trp Tyr Arg

1970 1975 1980

Tyr Ser Ser Asp Gly Met Arg Leu Leu Lys Vai Ser Glu Gln Gln

1985 1990 1995

Thr Gly Asn Ser Thr Gln Vai Gln Arg Vai Thr Tyr Leu Pro Gly

2000 2005 2010

Leu Glu Leu Arg Thr Thr Gly Vai Ala Asp Lys Thr Thr Glu Asp

2015 2020 2025

Leu Gln Vai lie Thr Vai Gly Glu Ala Gly Arg Ala Gln Vai Arg

2030 2035 2040

Vai Leu His Trp Glu Ser Gly Lys Pro Thr Asp lie Asp Asn Asn

2045 2050 2055

Gln Vai Arg Tyr Ser Tyr Asp Asn Leu Leu Gly Ser Ser Gln Leu

2060 2065 2070Glu Leu Asp Ser Glu Gly Gln lie Leu Ser Gln Glu Glu Tyr Tyr

2075 2080 2085

Pro Tyr Gly Gly Thr Ala lie Trp Ala Ala Arg Asn Gln Thr Glu

2090 2095 2100

Ala Ser Tyr Lys Phe lie Arg Tyr Ser Gly Lys Glu Arg Asp Ala

2105 2110 2115

Thr Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Tyr Tyr Gln Pro Trp Vai

2120 2125 2130

Gly Arg Trp Leu Ser Ala Asp Pro Ala Gly Thr Vai Asp Gly Leu

2135 2140 2145

Asn Leu Tyr Arg Met Vai Arg Asn Asn Pro lie Thr Leu Thr Asp

2150 2155 2160

His Asp Gly Leu Ala Pro Ser Pro Asn Arg Asn Arg Asn Thr Phe

2165 2170 2175

Trp Phe Ala Ser Phe Leu Phe Arg Lys Pro Asp Glu Gly Met Ser

2180 2185 2190

Ala Ser Met Arg Arg Gly Gln Lys lie Gly Arg Ala lie Ala Gly

2195 2200 2205

Gly lie Ala lie Gly Gly Leu Ala Ala Thr lie Ala Ala Thr Ala

2210 2215 2220

Gly Ala Ala lie Pro Vai lie Leu Gly Vai Ala Ala Vai Gly Ala

2225 2230 2235

Gly lie Gly Ala Leu Met Gly Tyr Asn Vai Gly Ser Leu Leu Glu

2240 2245 2250

Lys Gly Gly Ala Leu Leu Ala Arg Leu Vai Gln Gly Lys Ser Thr

2255 2260 2265

Leu Vai Gln Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ser Ala

2270 2275 2280

Ala Ala Tyr Gly Ala Arg Ala Gln Gly Vai Gly Vai Ala Ser Ala

2285 2290 2295

Ala Gly Ala Vai Thr Gly Ala Vai Gly Ser Trp lie Asn Asn Ala

2300 2305 2310Asp Arg Gly lie Gly Gly Ala lie Gly Ala Gly Ser Ala Vai Gly

2315 2320 2325

Thr lie Asp Thr Met Leu Gly Thr Ala Ser Thr Leu Thr His Glu

2330 2335 2340

Vai Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Met lie Thr Gly

2345 2350 2355

Thr Gln Gly Ser Thr Arg Ala Gly lie His Ala Gly lie Gly Thr

2360 2365 2370

Tyr Tyr Gly Ser Trp lie Gly Phe Gly Leu Asp Vai Ala Ser Asn

2375 2380 2385

Pro Ala Gly His Leu Ala Asn Tyr Ala Vai Gly Tyr Ala Ala Gly

2390 2395 2400

Leu Gly Ala Glu Met Ala Vai Asn Arg lie Met Gly Gly Gly Phe

2405 2410 2415

Leu Ser Arg Leu Leu Gly Arg Vai Vai Ser Pro Tyr Ala Ala Gly

2420 2425 2430

Leu Ala Arg Gln Leu Vai His Phe Ser Vai Ala Arg Pro Vai Phe

2435 2440 2445

Glu Pro lie Phe Ser Vai Leu Gly Gly Leu Vai Gly Gly lie Gly

2450 2455 2460

Thr Gly Leu His Arg Vai Met Gly Arg Glu Ser Trp lie Ser Arg

2465 2470 2475Ala Leu Ser Ala Ala Gly Ser Gly lie Asp His Vai Ala Gly Met

2480 2485 2490lie Gly Asn Gln lie Arg Gly Arg Vai Leu Thr Thr Thr Gly lie

2495 2500 2505Ala Asn Ala lie Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Vai Gly Ala Ala Arg

2510 2515 2520Arg Vai Phe Ser Leu

2525<210> 7<211> 6654<212> DNA

<400> 7

atgtttttca tggtactaca ggttccgatc cataccagaa gactgctttc aatttttatg 60

attattgtat tgctcacacc gaatgtatat tgtcttgaaa acacagaggc aagccaggac 120

gtaaattccg agggttcaca agttgattcc gagtcatacg aggaaaataa taaaaacata 180

gtagaatctg aggaagaaac gagtgaaaca atttccgatc ttgatagtga aagtgtggac 240

gatgatacag aaactgtttc tgaagatact atgttaactg caactacagt ttccgaagat 300

gaggagcctt taagggatgc aaaagcgtat cttagtccta ccctggaaaa tgaaaacaat 360

tactttgaca caagcctgtt tacaggttct tttgtttatt cttatccgat tgaaacttta 420

aaaggaagaa ctggattaga gccggaggtt tctctaacct attccagtgc tacaggctca 480

aaaggaacat acggttcact ggggattggg tggtcattga atgagaactg cattatcagg 540

gataccagat atacccctga aaacacaaat gatgatagat ttattcttgt tttggacggc 600

tcaacatata aactcgtcta tgtggaaagt gacaactcat atcacaccga aactgaaagt 660

tttatgaaaa ttgaaaagag tgcaaccagt agcaattctt tcggggacta ctggaccctc 720

aacatgccgg acgggacaaa atatcgtttt ggttataata ttgattccga acaaagaaac 780

tccgttgaat caagaaatta tgtcagtaaa tggtggctcg atcttataga ggacgtcaat 840

ggcaacaaga ttaaatatac gtatcttgaa aatccggtaa gtggcgaggt cggaagcaca 900

tatcctgaca gcataaccta caacgacaat catgcagtta ttgattttga gttcacggaa 960

aaaccacgtg tattcactat ttatgaatat ggtaacaaaa ttatcgaaaa aaacttgatc 1020

tccagtatta ctgttcgtaa cgatgaaacc gttctctgga aatatgatct tgattatgaa 1080

acccaacagt taaaattaca tctgaaatcc attacaaaaa caggattaaa caatgaagag 1140

ttcccaccta ctgtttttga atatgactca ataaccgaag ggtggcagga aagtagttcc 1200

tggaccccac caacttccat gtcaggagac aagggaagaa gaattgcaga tgttaatggc 1260

gacggattag atgacatcct taaaggatat gtagatagtg acggggatgt ttattgctca 1320

acctggataa ataccggaga tgactgggaa ctgaacagtt cctggacaac accaacatat 1380

ttcaggcatt ataatcatga tgggggagct cgccttgcag atgtcaacgg ggacggatta 1440

gttgacatta tccagcacgg attttacatt tcctctgcct ggttgaatac cggtaccggt 1500

tgggaacaaa acaactcatg gatacctcca ctggattttg gctggtcaag tgattatggt 1560

gtaagagttt tagatgtcaa cggggacgga ttagttgaca taattaaggg ttacaaaaac 1620

gatcgtggaa ctatatacta tgatgcttat ctcaataccg gtgaaggctg gatacaggat 1680

aattcatgga acccgcctac ttacttctca tacgataata ttgatacagg cgtacgactc 1740acggacctta acggagacga cctggtcgataccggcagtg gatgggaaca ggataactcccagggtgtag tcttagtgga tgttaacggatataacgatg ccgggtacac ttacgatgcc gataactcat ggaatccgcc aacgttgatctttgctgatt tgaatggaga cggtttgacatgtgcctgga caaacacgaa cactgagagtaaaaaaatac agcactcaac cggtggaagcttcgataaca ccggggaaga cggcgtttcg

agtgtgacag gagataatgg tattacaggcacctataaaa acggaatgca gtacttcgacggtgaagtta ctgttgaaaa cgagtattcggtcctcaagg gcatcgaaca ccatactgaatcctcggaca cggaatatac tgctcaggaa

gactcggagt ccaaaacaag gttcgacgggtggtcatatc tcaccgaata taacgaatatgatcacggcg atgtgaacaa tgccggggatgcagaaaatc cgtggatcct cggaaaaaaagtaaagaaga gcgaatcatg gtactattat

aaagggcagc tcactaaaac agtattatggtacgattacg ataactatgg aaatataatcaacataggat atgatgaaaa ccatttatacaaagagtgtt atgaattcaa cgaccttggcatttctatag cgtatatcta tgatgacctg

gacacacttg attctccatc tattgagtataaaattttaa ccacaacaaa agaatgtggttctgtattca gcaattataa acgtatcacagattaccagg tgaagctgga tattaactatcttcgttttg ttgatgaaaa tggcattcta

tccagttatg caaaagtctg ggtaaaggttatcaaaatgt attatgataa ctcatatgttgaattctttg atgatttcga aagcggtgta

atctttaaac tacgctcttc atggttaaac 1800

tgggcgcccc caatatctct cgactcagat 1860

gacggtttga ctgacattct taagagttat 1920

tggataagca ctggcaatgg ctgggaaaac 1980

gcaagctacg gcaaagacca gggtgtacgg 2040

gacattatca aagcaggcta tagcgattac 2100

acagaaaatt acaaaactca gggcctgctc 2160

acgaccataa aatatgaacc ttctacgctc 2220

gatttgacca tgagtatgtg ggtcacaagc 2280

acgggaagcg tagtttcaac aacagattac 2340

ccaccggaag aaatcgaatt cagaggattt 2400

atagtaaagc actttttcca ccaggacaac 2460

f

gtctgggaca aaaacggaaa cctttacagt 2520

atataccctg atgtcaacct gattttgctg 2580

ctggtacaga acccgaccag ttcagccggc 2640

gacgattacg ggaacccgct ttccataaca 2700

gaaaaatatt accattttgg atatgccaat 2760

acacatgaat gggtggaaga ctccgatcat 2820

gacgaaacaa atgacaacag tgccattagc 2880

aacaatatgg gagataatcc caatgttctg 2940

cggattacaa atccggaagg ggcttcaaag 3000

cccgtttaca tcgaaaacgc ctttggtcaa 3060

aggataacga aaataacaga cagtaacgac 3120

cacagaataa caaaagtact gaaagtcaat 3180

acgtactatc aggatggagt agcgcctgaa 3240

agtgaagaga acaattacgt cattaatggt 3300

atttcaccat catcagacgg aaccctgact 3360

gaatcagaga tgcaatccga ttttgatgat 3420

cttccatatt ggatcgaaga aaaggttgat 3480

cctgtaatcg atggaattga tggtgctact 3 540

tcatcagcag agaatggcga tgatgttttt 3600

atagacaatg ctaaatggaa tgaagttggc 3660tcgccgacaa ttgttgatga caatggagacgtaaatacat ttaataagtt ttccggtacatcatcattcg gcgactacgg accacgcatgacgatacttg cgacatgtcg tatagaatcg5 tcaatacgat attatccggg ttcaggaagttggtctaccg gagtatggaa tagattttcaacaattaacg gccttgtcat ttctggcacaatacatacct gggacagtgg caatgacattgcatcgtctg agcccactgt tgtgcttgaa

10 actgactcat acgacggctt cggtcaattgtggattatcc agaacaccgc atataacgaacattattcgg accaaaccgg cttatccgtaacggttatca ccaatactga cagcactaccacgattacca accagaacgg cgttgacaaa

1 5 gtcaaggtat atgagttcaa cgaaggcgaactgaataatc tcatcgagat tacgccgggctatttcacct acgattccct cggcaggaaatggacctatg aatacgacct gaacggaaactcgacaatcc tcagttatga tgacctggac

20 gaggacatca gtttcaccta cgaccttgaaggacccgcat catcaagtta cgactacgacaccattgacg gtacacccta caccacgtccggaatcacct acccgaacgg cgaagccgtcgaaagcgttg acggcgtgat tgacgacctt

25 aaggaatatt ccaacggcgt aatcacaaccgacagaatct attccgcagg cctccaggacgtcctcgaga tcgcggacaa cacccaaaatgacaggctgg tcagcgcaga tatgtcggtcacctacgacc ggtatggcag tatcaggcag

30 tacggatact ctgcgacccc gtcccacgcatatgacgcaa acggaaacct tgtcgacgataaccagttaa gtgaagtccg ttactctgcc

aaagtgctga aggtgacacc aagcaacgag 3720

gagtacatcg ttggggggtt gatgaagttt 3780

acacttgatg tcagaaggca aaatgaccaa 3840

tatgcggatg ggacaggagg aacaggcacg 3900

ttcattacag ttgcacaagc tcggccatcg 3960

ttttcctcaa cgaatagtaç acagaaacta 4020

tgtgaaaaca atctttcagg ttcgataaat 4080

agactttctt atttatatgt ccgtaaattc 4140

gaaaaaaact atgtctctac tttcgactcc 4200

atccagaaaa agtatgaagg ggaaggcggc 42 60

ctgggccttg tagaaagtgc cgaaatcccg 4320

acctacgagt atgatgcagc cggacggcca 43 80

ctgacatacg attacaacct tgacgacacc 4440

acactaacaa gtgatgtttt cggaaatatt 4500

acttacgtta catcctacag ttacgatgcc 4560

ttcaatgacc ctcaggctcc gcccagtgtt 4620

gtggcaatgg acgactctga catgggcagc 4680

ctgataaacc agaccgattc acggggagtt 4740

agggttactg caatagatta ccctaacgat 4800

tttaacggta cgctttcccg ggtaacaaaa 4860

ctgcgctaca gggtagaaag cgaaacttta 4920

tacgattatg acagcatgga cagggtcacg 4980

agcctgacat acaatgcgca gacccttctt 5040

gactataacg caaggaacca gatcacaaga 5100

tacacctacg acagtcaaaa actgctgctg 5160

ctcaactacg atttcgataa cgtcggcaat 5220

tccgtaaaaa cctacggata cgacgacett 5280

aacagcgtcc cgacctacca gagagatttc 5340

gtggataaca acggcgccac agtctcctct 5400

cctgttacct acaacggaaa caccctcgac 5460

gaggatttca tctacgtcta caacgatgcc 5520

aataattccc ttgtagaaaa gtactggtac 5580gatgcaaacg gccagagaat caagaaacag aattccgatg gagaattcac ctattacatc 5640

aacaagttct acgaaatcga taacggcatc tctaccagct acttcttccg cgatgatgaa 5700

cgcgtagcca aagaaacatc cgaaagtatg gagtggtacc tctccgatca cataggcagc 5760

acttccctga tggttaacga gaatgggctt gaggtcgaac gcaccgattt cccatacgga 5820 caggttcggt caggcgggct ggagaaatac gggtttacag ggcaggaaaa tgatgccgat 5880

acagggctga tgtactacgg tgcgaggtat tactcgcctg agtacagggt tttcgttcag 5940

ccggatacaa tgcttcctga cccgtataat ccgcaggcgt tgaacaggta ttcttatgtg 6000

ctgaacaacc cggtgaagta tactgatccg agtgggcatg ttgtggacgt ccttgtggat 6060

ggcggatttc ttttgatgga tttagacgac atccgcaccg ggaatgctga taaatggaca 6120

tacatcggtc ttggtgttga ccttgtatgt gctttcgttc cgggtgtgac agggggaagg 6180

ctaggagttc aggctctgga ggaaacagtt actcatgcgg ataacgttga ggatttgttt 6240

aagctactgg ataaaacggt ggatgcagag aagaaagttg acgatgtgat agattctgga 6300

aaagttgcta aaaatagtaa ccaaatttac aacgttatca aaagagcgga cttgcctaat 6360

acaaaaatca caagttcgaa attacaacat gaatggaaac atgcaactga tttcggaata 6420 aaaggcaatt ggaataaagc taatggagat ctatatgaaa aagctattca gaatcatata 6480

aatactgcac ctgaagttta taaatcgact tatagacaaa atcaagatgt ttatgtttat 6540

ttgaataagg agacaggggt gggagtatac acagatcttt ctgggaatta tattggagct 6600

ggaaattcag tccggaacag attaagtatc atacaactaa tggacttaaa atag 6654<210> 8 <211> 2217<212> PRT

<400> 8

Met Phe Phe Met Vai Leu Gln Vai Pro lie His Thr Arg Arg Leu Leu

15 10 15

Ser lie Phe Met lie lie Vai Leu Leu Thr Pro Asn Vai Tyr Cys Leu

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Ala Ser Gln Asp Vai Asn Ser Glu Gly Ser Gln Vai

35 40 45

Asp Ser Glu Ser Tyr Glu Glu Asn Asn Lys Asn lie Vai Glu Ser Glu

50 55 60

Glu Glu Thr Ser Glu Thr lie Ser Asp Leu Asp Ser Glu Ser Vai Asp65

Asp Asp Thr Glu

Vai Ser Glu Asp100

Pro Thr Leu Glu115

Gly Ser Phe Vai130

Gly Leu Glu Pro145

Lys Gly Thr Tyr

Cys lie lie Arg180

Arg Phe lie Leu195

Glu Ser Asp Asn210

Glu Lys Ser Ala225

Asn Met Pro Asp

Glu Gln Arg Asn260

Leu Asp Leu lie275

Leu Glu Asn Pro290

lie Thr Tyr Asn305

Lys Pro Arg Vai

70

Thr Vai Ser Glu85

Glu Glu Pro Leu

Asn Glu Asn Asn120

Tyr Ser Tyr Pro135

Glu Vai Ser Leu150

Gly Ser Leu Gly165

Asp Thr Arg Tyr

Vai Leu Asp Gly200

Ser Tyr His Thr215

Thr Ser Ser Asn230

Gly Thr Lys Tyr245

Ser Vai Glu Ser

Glu Asp Vai Asn280

Vai Ser Gly Glu295

Asp Asn His Ala310

Phe Thr lie Tyr

75

Asp Thr Met Leu90

Arg Asp Ala Lys105

Tyr Phe Asp Thr

lie Glu Thr Leu140

Thr Tyr Ser Ser155

lie Gly Trp Ser170

Thr Pro Glu Asn185

Ser Thr Tyr Lys

Glu Thr Glu Ser220

Ser Phe Gly Asp235

Arg Phe Gly Tyr250

Arg Asn Tyr Vai265

Gly Asn Lys lie

Vai Gly Ser Thr300

Vai lie Asp Phe315

Glu Tyr Gly Asn

80

Thr Ala Thr Thr95

Ala Tyr Leu Ser110

Ser Leu Phe Thr125

Lys Gly Arg Thr

Ala Thr Gly Ser160

Leu Asn Glu Asn175

Thr Asn Asp Asp190

Leu Vai Tyr Vai205

Phe Met Lys lie

Tyr Trp Thr Leu240

Asn lie Asp Ser255

Ser Lys Trp Trp270

Lys Tyr Thr Tyr285

Tyr Pro Asp Ser

Glu Phe Thr Glu320

Lys lie lie GluLys Asn Leu lie340

Trp Lys Tyr Asp355

Lys Ser lie Thr370

Vai Phe Glu Tyr385

Trp Thr Pro Pro

Asp Vai Asn Gly420

Ser Asp Gly Asp435

Trp Glu Leu Asn450

Asn His Asp Gly465

Vai Asp lie lie

Thr Gly Thr Gly500

Phe Gly Trp Ser515

Asp Gly Leu Vai530

lie Tyr Tyr Asp545

Asn Ser Trp AsnGly Vai Arg Leu

325

Ser Ser lie Thr

Leu Asp Tyr Glu360

Lys Thr Gly Leu375

Asp Ser lie Thr390

Thr Ser Met Ser405

Asp Gly Leu Asp

Vai Tyr Cys Ser440

Ser Ser Trp Thr455

Gly Ala Arg Leu470

Gln His Gly Phe485

Trp Glu Gln Asn

Ser Asp Tyr Gly520

Asp lie lie Lys535

Ala Tyr Leu Asn550

Pro Pro Thr Tyr565

Thr Asp Leu Asn

330

Vai Arg Asn Asp345

Thr Gln Gln Leu

Asn Asn Glu Glu380

Glu Gly Trp Gln395

Gly Asp Lys Gly410

Asp lie Leu Lys425

Thr Trp lie Asn

Thr Pro Thr Tyr460

Ala Asp Vai Asn475

Tyr lie Ser Ser490

Asn Ser Trp lie505

Vai Arg Vai Leu

Gly Tyr Lys Asn540

Thr Gly Glu Gly555

Phe Ser Tyr Asp570

Gly Asp Asp Leu

335

Glu Thr Vai Leu350

Lys Leu His Leu365

Phe Pro Pro Thr

Glu Ser Ser Ser400

Arg Arg lie Ala415

Gly Tyr Vai Asp430

Thr Gly Asp Asp445

Phe Arg His Tyr

Gly Asp Gly Leu480

Ala Trp Leu Asn495

Pro Pro Leu Asp510

Asp Vai Asn Gly525

Asp Arg Gly Thr

Trp lie Gln Asp560

Asn lie Asp Thr575

Vai Asp lie PheLys Leu Arg Ser595

Asn Ser Trp Ala610

Leu Vai Asp Vai625

Tyr Asn Asp Ala

Gly Trp Glu Asn660

Tyr Gly Lys Asp675

Leu Thr Asp lie690

Asn Thr Asn Thr705

Lys Lys lie Gln

Pro Ser Thr Leu740

Thr Met Ser Met755

Thr Gly Thr Gly770

Gly Met Gln Tyr785

Gly Glu Vai Thr

His Gln Asp Asn820

Asp Lys Asn Gly

Ser Trp Leu Asn600

Pro Pro lie Ser615

Asn Gly Asp Gly630

Gly Tyr Thr Tyr645

Asp Asn Ser Trp

Gln Gly Vai Arg680

lie Lys Ala Gly695

Glu Ser Thr Glu710

His Ser Thr Gly725

Phe Asp Asn Thr

Trp Vai Thr Ser760

Ser Vai Vai Ser775

Phe Asp Pro Pro790

Vai Glu Asn Glu805

Vai Leu Lys GlyAsn Leu Tyr Ser

180

585

Thr Gly Ser Gly

Leu Asp Ser Asp620

Leu Thr Asp lie635

Asp Ala Trp lie650

Asn Pro Pro Thr665

Phe Ala Asp Leu

Tyr Ser Asp Tyr700

Asn Tyr Lys Thr715

Gly Ser Thr Thr730

Gly Glu Asp Gly745

Ser Vai Thr Gly

Thr Thr Asp Tyr780

Glu Glu lie Glu795

Tyr Ser lie Vai810

lie Glu His His825

Ser Ser Asp Thr

590

Trp Glu Gln Asp605

Gln Gly Vai Vai

Leu Lys Ser Tyr640

Ser Thr Gly Asn655

Leu lie Ala Ser670

Asn Gly Asp Gly685

Cys Ala Trp Thr

Gln Gly Leu Leu720

lie Lys Tyr Glu735

Vai Ser Asp Leu750

Asp Asn Gly lie765

Thr Tyr Lys Asn

Phe Arg Gly Phe800

Lys His Phe Phe815

Thr Glu Vai Trp830

Glu Tyr Thr Ala835 840 845

Gln Glu lie Tyr Pro Asp Vai Asn Leu lie Leu Leu Asp Ser Glu Ser

850 855 860

Lys Thr Arg Phe Asp Gly Leu Vai Gln Asn Pro Thr Ser Ser Ala Gly865 870 875 880

Trp Ser Tyr Leu Thr Glu Tyr Asn Glu Tyr Asp Asp Tyr Gly Asn Pro

885 890 895

Leu Ser lie Thr Asp His Gly Asp Vai Asn Asn Ala Gly Asp Glu Lys

900 905 910

Tyr Tyr His Phe Gly Tyr Ala Asn Ala Glu Asn Pro Trp lie Leu Gly

915 920 925

Lys Lys Thr His Glu Trp Vai Glu Asp Ser Asp His Vai Lys Lys Ser

930 935 940

Glu Ser Trp Tyr Tyr Tyr Asp Glu Thr Asn Asp Asn Ser Ala lie Ser945 950 955 960

Lys Gly Gln Leu Thr Lys Thr Vai Leu Trp Asn Asn Met Gly Asp Asn

965 970 975

Pro Asn Vai Leu Tyr Asp Tyr Asp Asn Tyr Gly Asn lie lie Arg lie

980 985 990

Thr Asn Pro Glu Gly Ala Ser Lys Asn lie Gly Tyr Asp Glu Asn His

995 1000 1005

Leu Tyr Pro Vai Tyr lie Glu Asn Ala Phe Gly Gln Lys Glu Cys

1010 1015 1020

Tyr Glu Phe Asn Asp Leu Gly Arg lie Thr Lys lie Thr Asp Ser

1025 1030 1035

Asn Asp lie Ser lie Ala Tyr lie Tyr Asp Asp Leu His Arg lie

1040 1045 1050

Thr Lys Vai Leu Lys Vai Asn Asp Thr Leu Asp Ser Pro Ser lie

1055 1060 1065'

Glu Tyr Thr Tyr Tyr Gln Asp Gly Vai Ala Pro Glu Lys lie Leu

1070 1075 1080

Thr Thr Thr Lys Glu Cys Gly Ser Glu Glu Asn Asn Tyr Vai lie1085 1090 1095

Asn Gly Ser Vai Phe Ser Asn Tyr Lys Arg lie Thr lie Ser Pro

1100 1105 1110

Ser Ser Asp Gly Thr Leu Thr Asp Tyr Gln Vai Lys Leu Asp lie

1115 1120 1125

Asn Tyr Glu Ser Glu Met Gln Ser Asp Phe Asp Asp Leu Arg Phe

1130 1135 1140

Vai Asp Glu Asn Gly lie Leu Leu Pro Tyr Trp lie Glu Glu Lys

1145 1150 1155

Vai Asp Ser Ser Tyr Ala Lys Vai Trp Vai Lys Vai Pro Vai lie

1160 1165 1170

Asp Gly lie Asp Gly Ala Thr lie Lys Met Tyr Tyr Asp Asn Ser

1175 1180 1185

Tyr Vai Ser Ser Ala Glu Asn Gly Asp Asp Vai Phe Glu Phe Phe

1190 1195 1200

Asp Asp Phe Glu Ser Gly Vai lie Asp Asn Ala Lys Trp Asn Glu

1205 1210 1215

Vai Gly Ser Pro Thr lie Vai Asp Asp Asn Gly Asp Lys Vai Leu

1220 1225 1230

Lys Vai Thr Pro Ser Asn Glu Vai Asn Thr Phe Asn Lys Phe Ser

1235 1240 1245

Gly Thr Glu Tyr lie Vai Gly Gly Leu Met Lys Phe Ser Ser Phe

1250 1255 1260

Gly Asp Tyr Gly Pro Arg Met Thr Leu Asp Vai Arg Arg Gln Asn

1265 1270 1275

Asp Gln Thr lie Leu Ala Thr Cys Arg lie Glu Ser Tyr Ala Asp

1280 1285 1290

Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ser lie Arg Tyr Tyr Pro Gly Ser

1295 1300 1305

Gly Ser Phe lie Thr Vai Ala Gln Ala Arg Pro Ser Trp Ser Thr

1310 1315 1320

Gly Vai Trp Asn Arg Phe Ser Phe Ser Ser Thr Asn Ser Thr Gln1325 1330 1335

Lys Leu Thr lie Asn Gly Leu Vai lie Ser Gly Thr Cys Glu Asn

1340 1345 1350

Asn Leu Ser Gly Ser lie Asn lie His Thr Trp Asp Ser Gly Asn

1355 1360 1365

Asp lie Arg Leu Ser Tyr Leu Tyr Vai Arg Lys Phe Ala Ser Ser

1370 1375 1380

Glu Pro Thr Vai Vai Leu Glu Glu Lys Asn Tyr Vai Ser Thr Phe

1385 1390 1395

Asp Ser Thr Asp Ser Tyr Asp Gly Phe Gly Gln Leu lie Gln Lys

1400 1405 1410

Lys Tyr Glu Gly Glu Gly Gly Trp lie lie Gln Asn Thr Ala Tyr

1415 1420 1425

Asn Glu Leu Gly Leu Vai Glu Ser Ala Glu lie Pro His Tyr Ser

1430 1435 ' 1440

Asp Gln Thr Gly Leu Ser Vai Thr Tyr Glu Tyr Asp Ala Ala Gly

1445 1450 1455

Arg Pro Thr Vai lie Thr Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Thr Tyr

1460 1465 1470

Asp Tyr Asn Leu Asp Asp Thr Thr- lie Thr Asn Gln Asn Gly Vai

1475 1480 1485

Asp Lys Thr Leu Thr Ser Asp Vai Phe Gly Asn lie Vai Lys Vai

1490 1495 1500

Tyr Glu Phe Asn Glu Gly Glu Thr Tyr Vai Thr Ser Tyr Ser Tyr

1505 1510 1515

Asp Ala Leu Asn Asn Leu lie Glu lie Thr Pro Gly Phe Asn Asp

1520 1525 1530

Pro Gln Ala Pro Pro Ser Vai Tyr Phe Thr Tyr Asp Ser Leu Gly

1535 1540 1545

Arg Lys Vai Ala Met Asp Asp Ser Asp Met Gly Ser Trp Thr Tyr

1550 1555 1560

Glu Tyr Asp Leu Asn Gly Asn Leu lie Asn Gln Thr Asp Ser Arg1565 1570 1575

Gly Vai Ser Thr lie Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Asp Arg Vai Thr

1580 1585 1590

Ala lie Asp Tyr Pro Asn Asp Glu Asp lie Ser Phe Thr Tyr Asp

1595 1600 1605

Leu Glu Phe Asn Gly Thr Leu Ser Arg Vai Thr Lys Gly Pro Ala

1610 1615 1620

Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Leu Arg Tyr Arg Vai Glu Ser Glu

1625 1630 1635

Thr Leu Thr lie Asp Gly Thr Pro Tyr Thr Thr Ser Tyr Asp Tyr

1640 1645 1650

Asp Ser Met Asp Arg Vai Thr Gly lie Thr Tyr Pro Asn Gly Glu

1655 1660 1665

Ala Vai Ser Leu Thr Tyr Asn Ala Gln Thr Leu Leu Glu Ser Vai

1670 1675 1680

Asp Gly Vai lie Asp Asp Leu Asp Tyr Asn Ala Arg Asn Gln lie

1685 1690 1695

Thr Arg Lys Glu Tyr Ser Asn Gly Vai lie Thr Thr Tyr Thr Tyr

1700 1705 1710

Asp Ser Gln Lys Leu Leu Leu Asp Arg lie Tyr Ser Ala Gly Leu

1715 1720 1725

Gln Asp Leu Asn Tyr Asp Phe Asp Asn Vai Gly Asn Vai Leu Glu

1730 1735 1740

lie Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ser Vai Lys Thr Tyr Gly Tyr Asp

1745 1750 1755

Asp Leu Asp Arg Leu Vai Ser Ala Asp Met Ser Vai Asn Ser Vai

1760 1765 1770

Pro Thr Tyr Gln Arg Asp Phe Thr Tyr Asp Arg Tyr Gly Ser lie

1775 1780 1785

Arg Gln Vai Asp Asn Asn Gly Ala Thr Vai Ser Ser Tyr Gly Tyr

1790 1795 1800

Ser Ala Thr Pro Ser His Ala Pro Vai Thr Tyr Asn Gly Asn Thr1805 1810 1815

Leu Asp Tyr Asp Ala Asn Gly Asn Leu Vai Asp Asp Glu Asp Phe

1820 1825 1830

lie Tyr Vai Tyr Asn Asp Ala Asn Gln Leu Ser Glu ■ Vai Arg Tyr

1835 1840 1845

Ser Ala Asn Asn Ser Leu Vai Glu Lys Tyr Trp Tyr Asp Ala Asn

1850 1855 1860

Gly Gln Arg lie Lys Lys Gln Asn Ser Asp Gly Glu Phe Thr Tyr

1865 1870 1875

Tyr lie Asn Lys Phe Tyr Glu lie Asp Asn Gly-lie Ser Thr Ser

1880 1885 1890

Tyr Phe Phe Arg Asp Asp Glu Arg Vai Ala Lys Glu Thr Ser Glu

1895 1900 1905

Ser Met Glu Trp Tyr Leu Ser Asp His lie Gly Ser Thr Ser Leu

1910 1915 1920

Met Vai Asn Glu Asn Gly Leu Glu Vai Glu Arg Thr Asp Phe Pro

1925 . 1930 1935

Tyr Gly Gln Vai Arg Ser Gly Gly Leu Glu Lys Tyr Gly Phe Thr

1940 1945 1950

Gly Gln Glu Asn Asp Ala Asp Thr Gly Leu Met Tyr Tyr Gly Ala

1955 1960 1965

Arg Tyr Tyr Ser Pro Glu Tyr Arg Vai Phe Vai Gln Pro Asp Thr

1970 1975 1980

Met Leu Pro Asp Pro Tyr Asn Pro Gln Ala Leu Asn Arg Tyr Ser

1985 1990 1995

Tyr Vai Leu Asn Asn Pro Vai Lys Tyr Thr Asp Pro Ser Gly His

2000 2005 2010

Vai Vai Asp Vai Leu Vai Asp Gly Gly Phe Leu Leu Met Asp Leu

2015 2020 2025

Asp Asp lie Arg Thr Gly Asn Ala Asp Lys Trp Thr Tyr lie Gly

2030 2035 2040

Leu Gly Vai Asp Leu Vai Cys Ala Phe Vai Pro Gly Vai Thr Gly2045 2050 2055

Gly Arg Leu Gly Vai Gln Ala Leu Glu Glu Thr Vai Thr His Ala

2060 2065 2070

Asp Asn Vai Glu Asp Leu Phe Lys Leu Leu Asp Lys Thr Vai Asp2075 2080 2085

Ala Glu Lys Lys Vai Asp Asp Vai lie Asp Ser Gly Lys Vai Ala

2090 2095 2100

Lys Asn Ser Asn Gln lie Tyr Asn Vai lie Lys Arg Ala Asp Leu

2105 2110 2115

Pro Asn Thr Lys lie Thr Ser Ser Lys Leu Gln His Glu Trp Lys

2120 2125 2130

His Ala Thr Asp Phe Gly lie Lys Gly Asn Trp Asn Lys Ala Asn

2135 2140 2145

Gly Asp Leu Tyr Glu Lys Ala lie Gln Asn His lie Asn Thr Ala2150 2155 2160

Pro Glu Vai Tyr Lys Ser Thr Tyr Arg Gln Asn Gln Asp Vai Tyr

2165 2170 2175

Vai Tyr Leu Asn Lys Glu Thr Gly Vai Gly Vai Tyr Thr Asp Leu

2180 2185 2190

Ser Gly Asn Tyr lie Gly Ala Gly Asn Ser Vai Arg Asn Arg Leu

2195 2200 2205

Ser lie lie Gln Leu Met Asp Leu Lys

2210 2215<210> 9 <211> 8961<212> DNA<213> Gibberella zeae

<400> 9

atggccaccg ttactgtaca agggcccttc ttcaaagatc tacccacgct atccgccaaa 60atcaacagtt tactggcaga agacggaacc acacttgcag cagctattga cagcgcgttg 120aagtctggtg gtctggattc tgttagtact cgccgtctgc ttttcttcca aggcctcact 180gcagacaacc aactgcttct gtatttgaca acaaactacg gtaatgtgga gccttcactt 240gctcggattg gtcttgaaaa ttacttcaataaggactttc ggtctcattt atgggagaaacgccagacta agctattgac cactgtttggctccaactgt gcgtggataa agaactttcg5 aaagaattgg atgtcacaag accgaagacagtcgttgttc ctggcttgcg tgatgcaattatcgatccga tgcatttgga agtgctactggccattctcc ctcgtggagt attcctttcacctatattca acatcgatga agaatctgca

10 gactgccgga accaagaaac gtgggtcaagatcgttgtac cacagtctcg tcccgaggatattgagaaac aagcaagaaa agacggtgccgcgcacaaaa actacaacat gtctaccatctgctgctcag ttacaggacc agccgcctac

15 agtccttgta ctggagctgg aagcaagtttcgtccagatt tgcaggactt ggaactatctatctccatcg tcaacgagac gctagagtctgatgacaaat atgttgctac tgtcctggcttcagggtcaa cacaggatac tcgattgaca

20 cctttgaatg tgtttccaca caaccaaggtttcggaatca cggggataga agtcttgaaagcggtgatag gagctttgcc cagtgacaaaggtgttatct tggatcgtgc aactgttgctgcagccattg tgggagagaa gatttacacg.25 cgacagaaac gaggaaagtc actc-ttgtcgtggggctatt cgagtactag tgacatgatctgcttcatca ggtctcagtt tatgccgcgtcttctcaaga gcctttattt tggtggccgtgcgtttactg gacagatttc cgagatgcgt

30 cçtaaagaga cggcagtcgg gcctttgactatcagactga agaatcgtct tggctggagtatcttccaga gccaggttgc ttcaggcgtt

187

agctttgatg gtttcaacaa agatgtcgtg 300

gaacctttgg ccgttctcct tgcatctttg 360

attgaactga agcctcaaat cgataccgtc 420

ctgtcttcac ctgaagttca cacccgtgtg 480

gaggtaaaga aagacgtcaa ggggaaatcg 540

cttgctatac agcgccttca ctgtcttgtc 600

agagaaggat ggcattccgc acatgatgtt 660

gtcatcgaaa aagcagccaa aaaccaggat 7 20

tcacgtatcc atgaccatgc cattaccatt 780

atacttgatg gtctcaaaag agactttacg 840

gaagctgaga agaaacggaa gcaagaggag 900

aacaaagacg ctcccagagt ggacgttctt 960

tttgacctac agacttccag ctgcgaagag 1020

tttgttgacc tactcaattt tctcaaagcg 1080

tccactttgt tccaggcttt gatgcatcga 1140

tgtgcaaact ccaagaacat ggtgccctac 1200

tttattgcat ctctcagcga acacgatgat 1260

gtcaatgaac aggaagcacc gggctcttat 1320

gccgccaagt ctctcgacgg ggtcatgtcc 1380

ctccagtcca tcaaaacata tcttcattcc 1440

acctttcgat ccgaggctag gctcttggaa 1500

ggcactcgtg caacacttct ctctgaagca 1560

gcatcactga atctactacc gctagattta 1620

ccacatgcaa tgaggagcat gatgggaatg 1680

gagctcgagg tcccaaaaac ttgccgtaac 1740

gacacggatg agcgggcaaa gactggtctc 1800

tcaggactgt cattcgaaga aatcctgcag 1860

cttgtcataa caaatgcaga caagacaaaa 1920

ctacaggccc tcaatacggc ggctactgca 1980

gatcaactct gtcacgagat tcaggccttt 2040

atcaaggagc ttgatggggc cttgtctgca 2100

atgcgcactc ctgatggtac ccgaggcatc 2160tcttttgggg tgttgcaaga tctttccatg gcgaagagcc tcgctgaatc tgtgaatatg 2220

ccgatagacg ctatacttat tctctgggca ccgcttaaca cagaaagccc tctcttcagt 2280

cgtgtctttg gtggcccacg caatatgtct tcggataaca tcttcaccac gctcagcaac 2340

cgtgtgtcat taatcaagaa ccãtcttcct gctgttatga ccgctctggg gcatagtcaa 2400

gatcaactga actgtctcat gcgagctgcc aatattgaca gcgcgaaaga caagctgacg 2460

atggacgtcc ttactaagtt gtatcgacac tcgactatga gccgaatact caaagccaca 2520

cctatggagt acttggaact tctctctctc cttcccgccg gacttgatgt actattagac 2580

ccgacaacga cgctgtcatt tgtcacgaaa tggcgtcagc ttgttgacag tcgctggtca 2640

ccacaagaga tcatcatggc aatacgtcca actcccgtaa ctagtatctc agacaactac 2700

accaatgtaa ctgatgctct cttcctatcg tcctctatta tcgacgaaat ggaagtaatg . 2760

cggttactct ggcaagatcc tgtccgcgat atggttgtac ggcacgagga tatcgttcag 2820

atttgtggag agctctatga cgcgaccgca gctgcttcaa ttgtagagtt catcgaggga 2 880

acccagtcaa ccgaagcaag aatccctttg tccaagcctc tcgccaccgc cctcatgacc 2940

atcaaagtat tgccatcaaa catgacgttg acagtcgagc ttgggtcgaa gacaaagccg 3000

ggtgtacttg ttctatccct cctgggcgtt ctctctggcg aaaaccgatt gatgatcgaa 3060

acgcttatca agaacaaaga cgccgggcta aaagcaccaa catccacact tggcacaggg 3120

cttcggaagg acctggatga gctatttgat gacttggatg tgcgctctag cggtgccagg 3180

aagacgttgg aagataggtt gctcaatact cttccagctg atcaacgtga agaacttggg 3240

ttaatgttcc agaatgatat tagagatgga accagcacga tgacactgga tgaagcattg 3300

attcaagctg agatggcagt caagaaacgc cggagtgctt tcatcttggc cgctctgcct 3360

gtattgcgcg cacaactggt agagagatca ttgattgggg caatcggcaa ggcagtccct 3420

ggccttgatc cgtcagtcct tgctatgctg ggaacacagg tttttaagca acatgacaag 3480

agtgcaacca aggttgtgga agatatttgc agtgattacg tgtctaacaa gggggcatcc 3540

gaagtctcta cggcgttctt ctgccctgca gcctcagata cttatcaatt tcatttcacg 3600

ccactgcaaa atgcggagca aaatggtcaa aacaactctt ctgtaccatt gttctcagtc 3660

aatggagtcg agatcccagt gctgaaggct ggcgatggaa acgggtggca gtcagttcca 3720

acactccttg cgactggcaa gccgtatctg ttgagttcat caacgagtct tggacatgct 3780

cagtggacga ccaaacaatc gactcagccc cagaaatttg tgaaatccac cttgatccct 3840

gctgatatca tcacatcggt ctccaacgag ctactaacag tcgttcactt tgcgcaactt 3900

atgaagaagc taaatctggg tcttgaagag ttcaagtatc tcagctctga ttccacctcc 3960

tctatgcaag tcgatctgaa caaactgacc attgatggtc tctgtcagct agagaagtat 4020

tgcacactca gagactcggt atctagtggt cccgactccc ttattggatt tttcgcctgg 4080ttaggtagtg ggcaatacga tggaaagacgagatgggatc agcttcagtt gaatactactaaggacatca ttgacagatt tgcgtcctctataacgctat ctggccatct gggcggcgccgttctgtaca aactcgctgt acctgcccctgcttcggcac ttgaactttg tctgggacctcgcgagacgc aacggacagc atatgtgcaattgggcgtaa cagatgcgga cgggctgtttgctcagctcg aaattacacg gatgaaggcg

cgçgtgctgc ttggtttaga ggcaccaagtaagtgggcgt ggatgcagcg ccacaatatcccagagaatt ggatagatcc aagcctacgagagtcagcca tcatgtccaa ggacctaagctatgtacaat cacttctagg aattgctgat cgacctgatg aggtcgaaat ttaccatttcttttactatc gagcgatgca gattgtcaagtcaccctgga ccaaggtggg ggtagaagccacacttgaca agggcggatg ctaccttgtttacctgccac agctcatggc caagcccgtg

atggccaaga aagtccctgt cacaactgggacagagtttg tagatggaca gtggacgcctaactggattc ccccgactac agaaaagcctaagtttgtct ttagtgccga aacgactgggggaaccatag atgggatgct tcattatatt gagactatca aagttactag ccagaccgatcacaagctca catgggaagc ggagccgaacctcaaagagc ctgacagctc gttgtactccttggcgatag gaaagcgtga ttataaacgtaagaccaata ataccaacaa gacagcaggt

gatggtacta ccttcttcat gtacccctatgtgccgcttg ctacaaacct catgtacgacgctgcacgag aaatgatgga ggcggtctgt

accttggcca cacgtctggc agccgccacc 4140

ctggagctca agtatcctgg tctgacggaa 4200

cttgacgaac tctgctccct gggcgatgtc 4260

tcgggacgac gagcggccca gccgttgttg 4320

cccaccgaaa ccgactggga catggaaacg 43 80

gaacaagctg cgcagtgcag atcagagtta 4440

tttctgctgc agcggaagta cttccaaaga 4500

gcacatttca tgctagatgt ccagatggga 4560

gccatctcga ctgtacagct gtttgtccag 4620

ggtgttctcg atgctcgtat cgacaaagac 4680

tggcaggcaa caagaaaggc attcctctac 4740

gatgacaaga ctccattgtt tgaggcctat 4800

tgggattcgt tttctcagtc aatgaaggac 4860

ctctcgattg aggcatacct acgggagcta 4920

tttggtagaa ctcgaagcgc gccttttgag 4980

tcgggatctg gcgaaggact tgtcttctgg 5040

cctacatacg acacagattg gaatggcaag 5100

cctgttgttc gaaacaagcg tcttttcctg 5160

gccccgacac ccaacatgac tatggaggat 5220

gcatacacct gggaagtacg catgggatgg 5280

aagcgggtgc tgcaaacacc tttggttgtc 5340

accgatatag agggcctacc ctctgtagac 5400

ccagatgtca aaatccaagt tgggtatcga 5460

ggcaggtttg acgttatcga tgaacgtatc 5520

aaactcggca aggcgctgga tacctccttt 5580

atcaaggaga ccatgggaca ggctggagag 5640

atgctgacca aggccgagga gacaccgctc 5700

aacctgacat ggacactatc ctacgcggac 5760

ctcgtggtag atgagcgtcg agggggtgct 5820

caaacgcctg aggataagaa gaagaagacg 5880

caatccagag aggaaatcgt tgaacactct 5940

cagactgacg gtctgaacat gctttttgac 6000acaatggata ccaacctcac caagaaccatatgagcaact atcatgagct tacgaccccacacgctgtcc tcctagccat cgatcgcttcaaggccgcca ggctcatctt tgaccccacc gaggcggcgg cagcttgctg gaggttcaggggtatggttg atgttttcaa gggctggcccgagcgccgaa gtaatccttc cacggtacacatgaagtggg ttatcatgaa gtacattgagcgacagggaa gtatggagac gctgcctttg

gtgcttggtc cagatccccc acgagtaccacgcgagatag gatcccccga gcacaaggttgagattgaaa gacgtggtag taagagagcactgtgcattc tcaccacgac ctacttcagccgagtcctag ttcaggatag gctctacaag

cctatcgttt attccatgtc cgagccctttgcacaaggtg gtgctggagc ggtcgggtcataccaacgat tctccttcct catcagcaaaatgggggagc aatttctttc cgtccgcgagaagaaccgcc aagattcaat gagacagaag

gaggagatcc tcaagaccat tgaatcactgctggagtact atctccgcct caccggtgatgatgagtggc aggacatccg gcaggacatcagcccttttg aaactatgga gcttgcttccgcagctggta tggatacact agccggcttc

gctcagccca tgggctgtgg tgtcaccgtcacgttgggtt tggcatcagc tacaaagacaatgtcagcgc gaatcggagg tctgaccaagatcaggggac gcgagatcaa gaatcttgatgatatcaatg ccaaggagat cctcgctcag

gaggtttggt atcgcagcaa atacacaaacgtccgttcta tacattacga cctttatggcagagcctttc gttttgagcg tggtcatcaa

gactacggta aagctgtggt ccggtccgac 6060

tacgccatct acaattggga gttgggtcta 6120

tacgccacgc agcagttcga gctcgcccta 6180

accaacccgc cgaccggctg ctcggcggac 6240

ccgttccggg acctggccga acacaagatt 6300

tcagacggga acctcgagat cgcagtgtcg 6360

tcgactgcac gcggacggcc ccaggcttac 6420

atattgatct ctgctggtga cgagtacttc 6480

gcaattcatc actatgttga agcagctcac 6540

cagttggcca agtctgtggt caagacattc 6600

gatctcgaac tcgcctttcc gttcctttgc 6660

gacggtgata gtcgccgtag atcaccactg 6720

ctgccgccaa acccaaagta cgcgagcttg 67 80

gctcggaaca atcttgacat caatggacgt 6840

attgatcctg gcgatgcgat gcgagcgttg 6900

ctcatgaatg atagtgacag tccaatgccg 6960

gctcttgaac tatgcaatga gctgaggagt 702 0

agacatgatg cggagtcttt ggcacaattg 7080

atgatacttg aagtcagact gtcacagacg 7140

caacagagtc gggcttctac tgtgtcacag 7200

tcactggatc ttattcccgg tgatgagaaa 7260

gcgactccaa tcagtgatga ccttcgaatg 7320

gcagctgtag cttccacgct gaatgttgca 7380

ctaaaagctt ttccaaacgt gacgacaaat 7440

aaggctgacg caagcaatgc ggctcaattg 7500

tatgctctta tcgcttcaga agctggatca 7560

caattacaag agcgtcgtat gcaagctaat 7620

aagcaaatcg agattcagcg taagaggcta 7680

agaagtgagg ttgagtatgc caatgagacc 7740

gccaaccttt actcatggct cgagggatca 7800

ctcgcatccg acatgtgccg tcgcgccgag 7860

gcatctgccg catttcttcg ttctggcggc 7920tactgggaca acagtcgaga cggtttgctc gcggctcagc aactagcctt ggacctgcga 7980

cgcatggagg cagcctatct tcacaaaccg ggtcatgact gggaattgtc caagaatatt 8040

tctctgcgca agactaaccc ccatgctctg ctcacgctac gagagaaagg tacgacaact 8100

ttcagcatcc cagaattgct gtttgatctg gattttcccg gacactacat gcgacgtctc 8160

5 aagtcagtgg cggtgacaat cccgtgcgtt atcggtcctt ataccactct agctgcgact 8220

ctgtcactca cgcgacacac ataccgtgta tctgcagctg cacaatctgg tgatgactat 8280

ctgctagcaa actcctcaga tggttcgttc agaaccgacc ccatccccat ctctgctgtc 8340

gccacatcgc atgccgtgca agatacaggc tcgttcgact ttggcttcaa ccagagcaac 8400

. attgcgaata ccgactacgg tccgttcgag ggtgccggtg ccatcagcaa ctggaaactc 8460

10 gaactaccac caaagacaac tcagccattt gattactcga ccatttcaga cgtggtactt 8520

catatcaagt atacttctat cgacggtgga ccgatcctta agcgttccgc ctccgatgcg 8580

gtgaaaaagc agtgcgcgcg tacagatagt ctgggtgttc acgacggtct ctggggcttc 8640

gtcgaggtac gcaatgaggc aacgaaccaa tggttcaagt ttagttccac gctctcccaa 8700

acggctttgg ctcgcaccgc aacacttgac cttggcccag caatcacgtc acgattaccc 8760

15 ttttggacaa agaatcggga tgtcaagatc gaaactttga cccttgcaat tacaggtgct 8820

gatgctggct tggccaaaga tttgtcaata cctgcattgg gatcaagtga ttgggattgt 8880

acaaccttgg gagacatagc actgctaagt atagctggtt taggagatat agtatctttg 8940

aagcaagagg aaggtcgcta a 8961<210> 10

20 <211> 2986<212> PRT

Met Ala Thr Vai Thr Vai Gln Gly Pro Phe Phe Lys Asp Leu Pro Thr

1 5 10 15

Leu Ser Ala Lys lie Asn Ser Leu Leu Ala Glu Asp Gly Thr Thr Leu

20 25 30

Ala Ala Ala lie Asp Ser Ala Leu Lys Ser Gly Gly Leu Asp Ser Vai

35 40 45

Ser Thr Arg Arg Leu Leu Phe Phe Gln Gly Leu Thr Ala Asp Asn Gln

50 55 60

Leu Leu Leu Tyr Leu Thr Thr Asn Tyr Gly Asn Vai Glu Pro Ser Leu65 70 75 80

Ala Arg lie Gly Leu Glu Asn Tyr Phe Asn Ser Phe Asp Gly Phe Asn

85 90 95

Lys Asp Vai Vai Lys Asp Phe Arg Ser His Leu Trp Glu Lys Glu Pro

100 105 110

Leu Ala Vai Leu Leu Ala Ser Leu Arg Gln Thr Lys Leu Leu Thr Thr

115 120 125

Vai Trp lie Glu Leu Lys Pro Gln lie Asp Thr Vai Leu Gln Leu Cys

130 135 140

Vai Asp Lys Glu Leu Ser Leu Ser Ser Pro Glu Vai His Thr Arg Vai145 150 155 160

Lys Glu Leu Asp Vai Thr Arg Pro Lys Thr Glu Vai Lys Lys Asp Vai

165 170 175

Lys Gly Lys Ser Vai Vai Vai Pro Gly Leu Arg Asp Ala lie Leu Ala

180 185 190

lie Gln Arg Leu His Cys Leu Vai lie Asp Pro Met His Leu Glu Vai

195 200 205

Leu Leu Arg Glu Gly Trp His Ser Ala His Asp Vai Ala lie Leu Pro

210 215 220

Arg Gly Vai Phe Leu Ser Vai lie Glu Lys Ala Ala Lys Asn Gln Asp225 230 235 240

Pro lie Phe Asn lie Asp Glu Glu Ser Ala Ser Arg lie His Asp His

245 250 .255

Ala lie Thr lie Asp Cys Arg Asn Gln Glu Thr Trp Vai Lys lie Leu

260 265 270

Asp Gly Leu Lys Arg Asp Phe Thr lie Vai Vai Pro Gln Ser Arg Pro

275 280 285

Glu Asp Glu Ala Glu Lys Lys Arg Lys Gln Glu Glu lie Glu Lys Gln

290 295 300

Ala Arg Lys Asp Gly Ala Asn Lys Asp Ala Pro Arg Vai Asp Vai Leu305 310 315 320

Ala His Lys Asn Tyr Asn Met Ser Thr lie Phe Asp Leu Gln Thr SerSer Cys Glu Glu340

Asp Leu Leu Asn355

Lys Phe Ser Thr370

Gln Asp Leu Glu385

lie Ser lie Vai

Glu His Asp Asp420

Glu Gln Glu Ala435

Leu Thr Ala Ala450

Phe Pro His Asn465

Phe Gly lie Thr

Arg Leu Leu Glu500

Arg Ala Thr Leu515

Vai Ala Ala Ser530

Gly Glu Lys lie545

Arg Gln Lys ArgThr Cys Arg Asn

325

Cys Cys Ser Vai

Phe Leu Lys Ala360

Leu Phe Gln Ala375

Leu Ser Cys Ala390

Asn Glu Thr Leu405

Asp Asp Lys Tyr

Pro Gly Ser Tyr440

Lys Ser Leu Asp455

Gln Gly Leu Gln470

Gly lie Glu Vai485

Ala Vai lie Gly

Leu Ser Glu Ala520

Leu Asn Leu Leu535

Tyr Thr Pro His550

Gly Lys Ser Leu565

Trp Gly Tyr Ser

330

Thr Gly Pro Ala345

Ser Pro Cys Thr

Leu Met His Arg380

Asn Ser Lys Asn395

Glu Ser Phe lie410

Vai Ala Thr Vai425

Ser Gly Ser Thr

Gly Vai Met Ser460

Ser lie Lys Thr475

Leu Lys Thr Phe490

Ala Leu Pro Ser505

Gly Vai lie Leu

Pro Leu Asp Leu540

Ala Met Arg Ser555

Leu Ser Glu Leu570

Ser Thr Ser Asp

335

Ala Tyr Phe Vai350

Gly Ala Gly Ser365

Arg Pro Asp Leu

Met Vai Pro Tyr400

Ala Ser Leu Ser415

Leu Ala Vai Asn430

Gln Asp Thr Arg445

Pro Leu Asn Vai

Tyr Leu His Ser480

Arg Ser Glu Ala495

Asp Lys Gly Thr510

Asp Arg Ala Thr525

Ala Ala lie Vai

Met Met Gly Met560

Glu Vai Pro Lys575

Met lie Asp Thr580 585 590

Asp Glu Arg Ala Lys Thr Gly Leu Cys Phe lie Arg Ser Gln Phe Met

595 600 605

Pro Arg Ser Gly Leu Ser Phe Glu Glu lie Leu Gln Leu Leu Lys Ser

610 615 620

Leu Tyr Phe Gly Gly Arg Leu Vai lie Thr Asn Ala Asp Lys Thr Lys625 630 635 640

Ala Phe Thr Gly Gln lie Ser Glu Met Arg Leu Gln Ala Leu Asn Thr

645 650 655

Ala Ala Thr Ala Pro. Lys Glu Thr Ala Vai Gly Pro Leu Thr Asp Gln

660 665 670

Leu Cys His Glu lie Gln Ala Phe lie Arg Leu Lys Asn Arg Leu Gly

675 680 685

Trp Ser lie Lys Glu Leu Asp Gly Ala Leu Ser Ala lie Phe Gln Ser

690 695 700

Gln Vai Ala Ser Gly Vai Met Arg Thr Pro Asp Gly Thr Arg Gly lie705 710 715 720

Ser Phe Gly Vai Leu Gln Asp Leu Ser Met Ala Lys Ser Leu Ala Glu

725 730 735

Ser Vai Asn Met Pro lie Asp Ala lie Leu lie Leu Trp Ala Pro Leu

740 745 750

Asn Thr Glu Ser Pro Leu Phe Ser Arg Vai Phe Gly Gly Pro Arg Asn

755 760 765

Met Ser Ser Asp Asn lie Phe Thr Thr Leu Ser Asn Arg Vai Ser Leu

770 775 780

lie Lys Asn His Leu Pro Ala Vai Met Thr Ala Leu Gly His Ser Gln785 790 795 800

Asp Gln Leu Asn Cys Leu Met Arg Ala Ala Asn lie Asp Ser Ala Lys

805 810 815

Asp Lys Leu Thr Met Asp Vai Leu Thr Lys Leu Tyr Arg His Ser Thr

820 825 830

Met Ser Arg lie Leu Lys Ala Thr Pro Met Glu Tyr Leu Glu Leu Leu835 840 845

Ser Leu Leu Pro Ala Gl-y Leu Asp Vai Leu Leu Asp Pro Thr Thr Thr

850 855 860

Leu Ser Phe Vai Thr Lys Trp Arg Gln Leu Vai Asp Ser Arg Trp Ser865 870 875 880

Pro Gln Glu lie lie Met Ala lie Arg Pro Thr Pro Vai Thr Ser lie

885 890 895

Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Vai Thr Asp Ala Leu Phe Leu Ser Ser Ser

900 905 910

lie lie Asp Glu Met Glu Vai Met Arg Leu Leu Trp Gln Asp Pro Vai

915 920 925

Arg Asp Met Vai Vai Arg His Glu Asp lie Vai Gln lie Cys Gly Glu

930 935 940

Leu Tyr Asp Ala Thr Ala Ala Ala Ser lie Vai Glu Phe lie Glu Gly945 950 955 960

Thr Gln Ser Thr Glu Ala Arg lie Pro Leu Ser Lys Pro Leu Ala Thr

965 970 975

Ala Leu Met Thr lie Lys Vai Leu Pro Ser Asn Met Thr Leu Thr Vai

980 985 990

Glu Leu Gly Ser Lys Thr Lys Pro Gly Vai Leu Vai Leu Ser Leu Leu

995 1000 1005

Gly Vai Leu Ser Gly Glu Asn Arg Leu Met lie Glu Thr Leu lie

1010 1015 1020

Lys Asn Lys Asp Ala Gly Leu Lys Ala Pro Thr Ser Thr Leu Gly

1025 1030 1035

Thr Gly Leu Arg Lys Asp Leu Asp Glu Leu Phe Asp Asp Leu Asp

1040 1045 1050

Vai Arg Ser Ser Gly Ala Arg Lys Thr Leu Glu Asp Arg Leu Leu

1055 1060 1065

Asn Thr Leu Pro Ala Asp Gln Arg Glu Glu Leu Gly Leu Met Phe

1070 1075 1080

Gln Asn Asp lie Arg Asp Gly Thr Ser Thr Met Thr Leu Asp Glu1085 1090 1095

Ala Leu lie Gln Ala Glu Met Ala Vai Lys Lys Arg Arg Ser Ala

1100 1105 1110

Phe lie Leu Ala Ala Leu Pro Vai Leu Arg Ala Gln Leu Vai Glu

1115 1120 1125

Arg Ser Leu lie Gly Ala lie Gly Lys Ala Vai Pro Gly Leu Asp

1130 1135 1140

Pro Ser Vai Leu Ala Met Leu Gly Thr Gln Vai Phe Lys Gln His

1145 1150 1155

Asp Lys Ser Ala Thr Lys Vai Vai Glu Asp lie Cys Ser Asp Tyr

1160 1165 1170

Vai Ser Asn Lys Gly Ala Ser Glu Vai Ser Thr Ala Phe Phe Cys

1175 1180 1185

Pro Ala Ala Ser Asp Thr Tyr Gln Phe His Phe Thr Pro Leu Gln

1190 1195 1200

Asn Ala Glu Gln Asn Gly Gln Asn Asn Ser Ser Vai Pro Leu Phe

1205 1210 1215

Ser Vai Asn Gly Vai Glu lie Pro Vai Leu Lys Ala Gly Asp Gly

1220 1225 1230

Asn Gly Trp Gln Ser Vai Pro Thr Leu Leu Ala Thr Gly Lys Pro

1235 1240 1245

Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu Gly His Ala Gln Trp Thr

1250 1255 1260

Thr Lys Gln Ser Thr Gln Pro Gln Lys Phe Vai Lys Ser Thr Leu

1265 1270 1275

lie Pro Ala Asp lie lie Thr Ser Vai Ser Asn Glu Leu Leu Thr

1280 1285 1290

Vai Vai His Phe Ala Gln Leu Met Lys Lys Leu Asn Leu Gly Leu

1295 1300 1305

Glu Glu Phe Lys Tyr Leu Ser Ser Asp Ser Thr Ser Ser Met Gln

1310 1315 1320

Vai Asp Leu Asn Lys Leu Thr lie Asp Gly Leu Cys Gln Leu Glu1325 1330 1335

Lys Tyr Cys Thr Leu Arg Asp Ser Vai Ser Ser Gly Pro Asp Ser

1340 1345 1350

Leu lie Gly Phe Phe Ala Trp Leu Gly Ser Gly Gln Tyr Asp Gly

1355 1360 1365

Lys Thr Thr Leu Ala Thr Arg Leu Ala Ala Ala Thr Arg Trp Asp

1370 1375 1380

Gln Leu Gln Leu Asn Thr Thr Leu Glu Leu Lys Tyr Pro Gly Leu

1385 1390 1395

Thr Glu Lys Asp lie lie Asp Arg Phe Ala Ser Ser Leu Asp Glu

1400 1405 1410

Leu Cys Ser Leu Gly Asp Vai lie Thr Leu Ser Gly His Leu Gly

1415 1420 1425

Gly Ala Ser Gly Arg Arg Ala Ala Gln Pro Leu Leu Vai Leu Tyr

1430 1435 1440

Lys Leu Ala Vai Pro Ala Pro Pro Thr Glu Thr Asp Trp Asp Met

1445. 1450 1455

Glu Thr Ala Ser Ala Leu Glu Leu Cys Leu Gly Pro Glu Gln Ala

1460 1465 1470

Ala Gln Cys Arg Ser Glu Leu Arg Glu Thr Gln Arg Thr Ala Tyr

1475 1480 1485

Vai Gln Phe Leu Leu Gln Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Leu Gly Vai

1490 1495 1500

Thr Asp Ala Asp Gly Leu Phe Ala His Phe Met Leu Asp Vai Gln

1505 1510 1515

Met Gly Ala Gln Leu Glu lie Thr Arg Met Lys Ala Ala lie Ser

1520 1525 1530

Thr Vai Gln Leu Phe Vai Gln Arg Vai Leu Leu Gly Leu Glu Ala

1535 1540 1545

Pro Ser Gly Vai Leu Asp Ala Arg lie Asp Lys Asp Lys Trp Ala

1550 1555 1560

Trp Met Gln Arg His Asn lie Trp Gln Ala Thr Arg Lys Ala Phe1565 1570 1575

Leu Tyr Pro Glu Asn Trp lie Asp Pro Ser Leu Arg Asp Asp Lys

1580 1585 1590

Thr Pro Leu Phe Glu Ala Tyr Glu Ser Ala lie Met Ser Lys Asp

1595 1600 1605

Leu Ser Trp Asp Ser Phe Ser Gln Ser Met Lys Asp Tyr Vai Gln

1610 1615 1620

Ser Leu Leu Gly lie Ala Asp Leu Ser lie Glu Ala Tyr Leu Arg

1625 1630 1635

Glu Leu Arg Pro Asp Glu Vai Glu lie Tyr His Phe Phe Gly Arg

1640 1645 1650

Thr Arg Ser Ala Pro Phe Glu Phe Tyr Tyr Arg Ala Met Gln lie

1655 1660 1665

Vai Lys Ser Gly Ser Gly Glu Gly Leu Vai Phe Trp Ser Pro Trp

1670 1675 1680

Thr Lys Vai Gly Vai Glu Ala Pro Thr Tyr Asp Thr Asp Trp Asn

1685 1690 1695

Gly Lys Thr Leu Asp Lys Gly Gly Cys Tyr Leu Vai . Pro Vai Vai

1700 1705 1710

Arg Asn Lys Arg Leu Phe Leu Tyr Leu Pro Gln Leu Met Ala Lys

1715 1720 1725

Pro Vai Ala Pro Thr Pro Asn Met Thr Met Glu Asp Met Ala Lys

1730 1735 1740

Lys Vai Pro Vai Thr Thr Gly Ala Tyr Thr Trp Glu Vai Arg Met

1745 1750 1755

Gly Trp . Thr Glu Phe Vai Asp Gly Gln Trp Thr Pro Lys Arg Vai

1760 1765 1770

Leu Gln Thr Pro Leu Vai Vai Asn Trp lie Pro Pro Thr Thr Glu

1775 1780 1785

Lys Pro Thr Asp lie Glu Gly Leu Pro Ser Vai Asp Lys Phe Vai

1790 1795 1800

Phe Ser Ala Glu Thr Thr Gly Pro Asp Vai Lys lie Gln Vai Gly1805 1810 1815

Tyr Arg Gly Thr lie Asp Gly Met Leu His Tyr lie Gly Arg Phe

1820 1825 1830

Asp Vai lie Asp Glu Arg lie Glu Thr lie Lys Vai Thr Ser Gln

1835 1840 1845

Thr Asp Lys Leu Gly Lys Ala Leu Asp Thr Ser Phe His Lys Leu

1850 .1855 1860

Thr Trp Glu Ala Glu Pro Asn lie Lys Glu Thr Met Gly Gln Ala

1865 1870 1875

Gly Glu Leu Lys Glu Pro Asp Ser Ser Leu Tyr Ser Met Leu Thr

1880 1885 1890

Lys Ala Glu Glu Thr Pro Leu Leu Ala lie Gly Lys Arg Asp Tyr

1895 19.00 1905

Lys Arg Asn Leu Thr Trp Thr Leu Ser Tyr Ala Asp Lys Thr Asn

1910 1915 1920

Asn Thr Asn Lys Thr Ala Gly Leu Vai Vai Asp Glu Arg Arg Gly

1925 1930 1935

Gly Ala Asp Gly Thr Thr Phe Phe Met Tyr Pro Tyr Gln Thr Pro

1940 1945 1950

Glu Asp Lys Lys Lys Lys Thr Vai Pro Leu Ala Thr Asn Leu Met

1955 1960 1965

Tyr Asp Gln Ser Arg Glu Glu lie Vai Glu His Ser Ala Ala Arg

1970 1975 1980

Glu Met Met Glu Ala Vai Cys Gln Thr Asp Gly Leu Asn Met Leu

1985 1990 1995

Phe Asp Thr Met Asp Thr Asn Leu Thr Lys Asn His Asp Tyr Gly

2000 2005 2010

Lys Ala Vai Vai Arg Ser Asp Met Ser Asn Tyr His Glu Leu Thr

2015 2020 2025

Thr Pro Tyr Ala lie Tyr Asn Trp Glu Leu Gly Leu His Ala Vai

2030 2035 2040

Leu Leu Ala lie Asp Arg Phe Tyr Ala Thr Gln Gln Phe Glu Leu2045 2050 2055Ala Leu Lys Ala Ala Arg Leu lie Phe Asp Pro Thr Thr Asn Pro

2060 2065 2070

Pro Thr Gly Cys Ser Ala Asp Glu Ala Ala Ala Ala Cys Trp Arg

2075 2080 2085

Phe Arg Pro Phe Arg Asp Leu Ala Glu His Lys lie Gly Met Vai

2090 2095 2100

Asp Vai Phe Lys Gly Trp Pro Ser Asp Gly Asn Leu Glu lie Ala

2105 2110 2115

Vai Ser Glu Arg Arg Ser Asn Pro Ser Thr Vai His Ser Thr: Ala

2120 2125 2130

Arg Gly Arg Pro Gln Ala Tyr Met Lys Trp Vai lie Met Lys Tyr

2135 2140 2145

lie Glu lie Leu lie Ser Ala Gly Asp Glu Tyr Phe Arg Gln Gly

2150 2155 2160

Ser Met Glu Thr Leu Pro Leu Ala lie His His Tyr Vai Glu Ala

2165 2170 2175

Ala His Vai Leu Gly Pro Asp Pro Pro Arg Vai Pro Gln Leu Ala

2180 2185 2190

Lys Ser Vai Vai Lys Thr Phe Arg Glu lie Gly Ser Pro Glu His

2195 2200 2205

Lys Vai. Asp Leu Glu Leu Ala Phe Piro Phe Leu Cys Glu lie Glu

2210 2215 2220

Arg Arg Gly Ser Lys Arg Ala Asp Gly Asp Ser Arg Arg Arg Ser

2225 2230 2235

Pro Leu Leu Cys lie Leu Thr Thr Thr Tyr Phe Ser Leu Pro Pro

2240 2245 2250

Asn Pro Lys Tyr Ala Ser Leu Arg Vai Leu Vai Gln Asp Arg Leu

2255 2260 2265

Tyr Lys Ala Arg Asn Asn Leu Asp lie Asn Gly Arg Pro lie Vai

2270 2275 2280

Tyr Ser Met Ser Glu Pro Phe lie Asp Pro Gly Asp Ala Met Arg2285 2290 2295

Ala Leu Ala Gln Gly Gly Ala Gly Ala Vai Gly Ser Leu Met Asn

2300 2305 2310

Asp Ser Asp Ser Pro Met Pro Tyr Gln Arg Phe Ser Phe Leu lie

2315 2320 2325

Ser Lys Ala Leu Glu Leu Cys Asn Glu Leu Arg Ser Met Gly Glu

2330 . 2335 2340

Gln Phe Leu Ser Vai Arg Glu Arg His Asp Ala Glu Ser Leu Ala

2345 2350 2355

Gln Leu Lys Asn Arg Gln Asp Ser Met Arg Gln.Lys Met lie Leu

2360 2365 2370

Glu Vai Arg Leu Ser Gln Thr Glu Glu lie Leu Lys Thr lie Glu

2375 2380 2385

Ser Leu Gln Gln Ser Arg Ala Ser Thr Vai Ser Gln Leu Glu Tyr

2390 2395 2400

Tyr Leu Arg Leu Thr Gly Asp Ser Leu Asp Leu lie Pro Gly Asp

2405 2410 2415

Glu Lys Asp Glu Trp Gln Asp lie Arg Gln Asp lie Ala Thr Pro

2420 2425 2430

lie Ser Asp Asp Leu Arg Met Ser Pro Phe Glu Thr Met Glu Leu

2435 2440 2445

Ala Ser Ala Ala Vai Ala Ser Thr Leu Asn Vai Ala Ala Ala Gly

2450 . 2455 2460

Met Asp Thr Leu Ala Gly Phe Leu Lys Ala Phe.Pro Asn Vai Thr

2465 2470 2475

Thr Asn Ala Gln Pro Met Gly Cys Gly Vai Thr Vai Lys Ala Asp

2480 2485 2490

Ala Ser Asn Ala Ala Gln Leu Thr Leu Gly Leu Ala Ser Ala Thr

2495 2500 2505

Lys Thr Tyr Ala Leu lie Ala Ser Glu Ala Gly Ser Met Ser Ala

2510 2515 2520

Arg lie Gly Gly Leu Thr Lys Gln Leu Gln Glu Arg Arg Met Gln2525 2530 2535

Ala Asn lie Arg Gly Arg Glu lie Lys Asn Leu Asp Lys Gln lie

2540 2545 2550

Glu lie Gln Arg Lys Arg Leu Asp lie Asn Ala Lys Glu lie Leu

2555 2560 2565

Ala Gln Arg Ser Glu Vai Glu Tyr Ala Asn Glu Thr Glu Vai Trp

2570 2575 2580

Tyr Arg Ser Lys Tyr Thr Asn Ala Asn Leu Tyr Ser Trp Leu Glu

2585 2590 2595

Gly Ser Vai Arg Ser lie His Tyr Asp Leu Tyr Gly Leu Ala Ser

2600 2605 2610

Asp Met Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ala Phe Arg Phe Glu Arg Gly

2615 2620 2625

His Gln Ala Ser Ala Ala Phe Leu Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Asp

2630 2635 2640

Asn Ser Arg Asp Gly Leu Leu Ala Ala Gln Gln Leu Ala Leu Asp

2645 2650 2655

Leu Arg Arg Met Glu Ala Ala Tyr Leu His Lys Pro Gly His Asp

2660 2665 2670

Trp Glu Leu Ser Lys Asn lie Ser Leu Arg Lys Thr Asn Pro His

2675 2680 2685

Ala Leu Leu Thr Leu Arg Glu Lys Gly Thr Thr Thr Phe Ser lie

2690 2695 2700

Pro Glu Leu Leu Phe Asp Leu Asp Phe Pro Gly His Tyr Met Arg

2705 2710 2715

Arg Leu Lys Ser Vai Ala Vai Thr lie Pro Cys Vai lie Gly Pro

2720 2725 2730

Tyr Thr Thr Leu Ala Ala Thr Leu Ser Leu Thr Arg His Thr Tyr

2735 2740 2745

Arg Vai Ser Ala Ala Ala Glh Ser Gly Asp Asp Tyr Leu Leu Ala

2750 2755 2760

Asn Ser Ser Asp Gly Ser Phe Arg Thr Asp Pro lie Pro lie Ser2765 2770 2775

Ala Vai Ala Thr Ser His Ala Vai Gln Asp Thr Gly Ser Phe Asp

2780 2785 2790

Phe Gly Phe Asn Gln Ser Asn lie Ala Asn Thr Asp Tyr Gly Pro

2795 2800 2805

Phe Glu Gly Ala Gly Ala lie Ser Asn Trp Lys Leu Glu Leu Pro

2810 ■ 2815 2820

Pro Lys Thr Thr Gln Pro Phe Asp Tyr Ser Thr lie Ser Asp Vai

2825 2830 2835

Vai Leu His lie Lys Tyr Thr Ser lie Asp Gly Gly Pro lie Leu

2840 2845 2850

Lys Arg Ser Ala Ser Asp Ala Vai Lys Lys Gln Cys Ala Arg Thr

2855 . 2860 2865

Asp Ser Leu Gly Vai His Asp Gly Leu Trp Gly Phe Vai Glu Vai

2870 2875 2880

Arg Asn Glu Ala Thr Asn Gln Trp Phe Lys Phe Ser Ser Thr Leu

2885 2890 2895

Ser Gln Thr Ala Leu Ala Arg Thr Ala Thr Leu Asp Leu Gly Pro

2900 2905 2910

Ala lie Thr Ser Arg Leu Pro Phe Trp Thr Lys Asn Arg Asp Vai

2915 2920 2925

Lys lie Glu Thr Leu Thr Leu Ala lie Thr Gly Ala Asp Ala Gly

2930 2935 2940

Leu Ala Lys Asp Leu Ser lie Pro Ala Leu Gly Ser Ser Asp Trp

2945 2950 2955

Asp Cys Thr Thr Leu Gly Asp lie Ala Leu Leu Ser lie Ala Gly

2960 2965 2970

Leu Gly Asp lie Vai Ser Leu Lys Gln Glu Glu Gly Arg

2975 2980 2985

<210> 11<211> 6084<212> DNA<213> Tannerella forsythensis (ATCC 43037)

<400> 11

atgagaataa taaatatatc catagagata atatgtacct gccttatcat tggagtgaca 60

ggctatgcac agaagacaaa tgtttatgcg gcagggaacg aggcttcttc ggacaattat 120

gatccatccg gatatcgtat atggggaaac tatcgcaatg agacaagtga tgccaatgag 180

ttagacgctc ggcaactacc ctccttctat tacaagatat taaaaaacag gttagaaaac 240

aactattcac cggaagagaa aagaaccttt gcacctgcac ccttgtcaag aggtatggct 300

gtcggttcaa cagccggtat ggctgaaatt actctcacgg gagccgctaa ttatagtgtt 3 60

ccgatcgaag ttccggaggg tattgccgga tttaagcctg aggtatccgt tcggtatagt 420

agtcaatcgg gggtcggttt attgggatac gggtggaatt tgtcggcatt ttccgtcata 480

tcacgcagtg gtaagacatt ctatcatgat gggatgtcaa aagctcctgc gttatcgtat 540

gaagataacg tgatgttgga cggacaaagg ctgatgttga tttccgggca gaatctgatg 600

aacggagcta aatacaggct ggaaaatgat ccgacgatag atattacgta taagatgatc 660

ggttcattcc agggatttac agtaagaagt aaggatggaa caataagaga attcggtgtt 720

acttcagatt caaacatcga aacttcggat ggtactgctt tgttttggct gttatctcga 780

gtgattgata aacaaggaaa tgtaatctct tatcaatatg aagaagtaat aaacaacgga 840

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acaagaaaag ataagcaaac aggatattat gcaggagcgg tattaaacag caacaaaatt 960

ctgaaaaata tatctaccta tatcggtcag atgcagttta agcaatatca gtttaattat 1020

aatacgtacg agaacggtct ttatacccag ctgacggaaa ttattgaaag cggacaaaat 1080

ggccagagat ataatccgac ccgcatatat tatggttatc cggatccata taaaaatgag 1140

gatattgtta ctttgtcgga acatcgaaaa ggaaataagc cgctgtttgc cgattttaac 1200

ggcgatggac gtatggattt tctgtcgtat ccggaagaat tatcggataa tccgaaagaa 1260

gatgtagcca ccttgttttt atcgcttcac ggacttggcg gaacgtattt tgccaagaaa 1320

tgtacgatcc cgatgcgtgc tttcggagaa tttcgatatt ttatgttggc agacgtgaac 1380

ggcgataaga agatggatgt cattcatgtt tccagagcgg ataatggaac ggaacgctat 1440

aactattatg tgtttgacgg agagaagctc gtgtatcaat ataagggttt taatacacat 1500

ggagacgaag catttgtcgg agattttgat ggggatggga ggcatgatat tttaattaaa 1560

aacaattcga aggtgtatga tggcgaagga cgtgagattg cctcgggagg cattaccgac 1620

tggggatcgg attatattaa gtattactat ccgaacagta gatatatatg tgatttgaat 1680

ggaaacggaa agtcggaatt attagtcatc gacaagcatg gagctaaagt ttatgagttg 1740

aatgaacggc agtttgtgga attgccggaa ttcaggacct ccctgataaa aaattactat 1800ttcccttatt tcggcgactt taacggagat ggtaaaacgg atgtcttgat acagcgatgg 1860

caccagggag attatgacga tgtaagtatc cttttttcaa ccgggaaagg atatgtaaaa 1920

caggatgttt taaatgcgga tattcgggct aàagtatttg tggcagattt taacaaagat 1980

gggaaatcgg atatttttca tatggagatc gtaaataatg ctgtcagaat gaaggtgggg 2040

atttttcacg gaaatggctt tcataccact tatcactcat cgaatttacg acttgaagat 2100

gtctatttat catataataa tatcgaatat gataattatc tgtttcaagt agctgatttt 2160

gatggggatg gcagttcgga gttctgttgt gcccgtcata tgaatgctta cattatcagg 2220

tctttttccg atcctcagaa tctgcttgtg gaaacaatct cggatggatt aggtgcatat 2280

acttcatttc aatatgcccc gataacaagt aattccgttt gtaccgtcac gggaaataac 2340

gaagcttttc ccgtaaccga cagtcgattc cctctatatg tagtcagcaa tatcacacag 2400

agtacgggag ggtattccga aacgacaaga tatcgatata aagaccctcg tagccatatg 2460

cagggaaaag gatttctggg attcggcgaa gtggaatcga tagatgataa taaagaccga 2520

aaagtaatta ctacatacgg atacgagaag gattattttt atccttttat taaggaacag 2580

aagatcatga cacgttccgg gatgaaaatt tctacttcgg tgtatgaaaa ttcatatgtc 2640

tataatggtt ccaaacgagt tgtcccctat gtgcggaaaa gtacaaccac cgatcatctg 2700

acaggagtag tgaagactgc tgaatgcact caaatcgata catgggctaa cccgttaagc 2760

attgttacac gccatggaaa tgatgtgact gaaacggtca ccgcatctta tattaaccgt 2820

gaagcagaga acctgtggat aatcggtctg cctcaatctg tagaaaagag agtaaccaag 2880

ggaacgggaa catggataga caagcaggta tttacgtata atgccggata tttgccccag 2940

aaaatagtca attttacagg ggatgggaac aaacagacat cagaagatgt ttttgattat 3000

gacagatacg gaaatatgat tacgcattcg acacgtgcct atgcatcgcc tcatgtattg 3060

acaaccagga cggaatactc gtccgacggt ctgtatatgc ttagaaccat cgacccgttg 3120

tcgagagtca cgactcatac ctacaattcg tcggggcagc ttgcttcaac aaaagatttt 3180

ctgaatacta cgactgcgta tgaatatgat ggtatgggaa gattggtaaa aaccgtctat 3240

ccggatcaaa cccagtcgtc ggttgtttat tcatgggaaa atgctgttgt aaacagcgtg 3300

tatggcatga cggagacgct cacgggaaaa ccggaacgaa aaatatattt cgatgccttc 3360

ggaagaaaag taagagagtg catccggcaa acggatggac aagacgtatg tacggatacg 3420

aaatatgaca atgccggccg tgtctcccag gaatcattgc cttttaaagg aggtgccgct 3480

tcaaaatgga atacttatgg atacgacggc tacggccgac tttcccaaca gacccatgct 3540

tccggaaaaa cgacgactta tacgtatgcc ggaaacagta ttacggaaac aaaaaacggg 3 600

atatctcata aaagtgtcta taatgcaatg ggtgaacagg tcagtgttac ggatcctgcc 3660

ggtaccatta cttatacgtt gcgtcccgat ggccagccgg taacgatcac agctccggga 3720aatgttaaaa caaccttttc ttatgacgctagcgccggta atcgcacctt cgcttacgatgccgacaatc gtgtcaagac gatgagttatttacccgagt ttactacttc gtatgcatat5 tcaaacaacg gaatatcatc cgtatacgaacgcaataatg tccccgacgg taaatggcttcttgcgtctg ttcgttacgc atcacagtcgtcgcatggcc atatgaacgg tatccgctgggaaaatccgt tcagccagcc tttgtcggtt

10 tacgatgtct atgggattcc gacgggccggttgaattcca cctatggttt tgatgcggcgcggaggaaca aacaggaaaa ctttacgtacggcatcgtta tggattatga cccgaaagggtttcattatc agacgccgta taagccgtac

15 aaagtaatcc ctccgagaga gcagacgataattaccgaaa acggctacga agcctcgtttatgacggtaa agaaaggggg taaaccgttcgaaacggacg ttatggggaa ttctcaaaagacggctccgg ccgtgtatat gaatacggga

20 gattatcttg gtaatatgac tcatcttgtaagttatgatg cgtggggacg tttgcgtaataacgagacgg aattaatgct tggtcgcggtgggttgatca atatgaacgc ccgtttatatgacccatacg tgcagatgcc ggacttcacc

25 aacaatccgc tggtgtatgt ggatcaagatgtgggggcag tgataggtgc ttatagtggacctgtaaaat gggattacaa ctcaggtaaagtaggcggta taagtggttc tctcggttggaacacagcgg gaataatatc tgcttcgttt

30 ggagggcaaa caccagtttc aatgagtttatcttttggtc atctcggcaa aaaaggcaacggggcaatgg cgaatttgag tgatatatta

tacgggcgac agacagccat acatgatccg 3780

gcttcaggca atcttcaacg cgaaacggat 3840

gacgtatatg ggaggcttac gtcgaaggtg 3900

aacggctatg gacaactgac gacggagact 3 960

tatgacagtt acggaagatt ggccaaagag 4020

gaaaaaacat atacgtatgc cgcagggaat 4080

ggggctatcg gtacggaagc atatacctac 4140

ggaagcagcc ctgtatggac actcaatgcg 4200

acgacagggc cggtaacgcg tacttatacg 42 60

accgctcaat cgacagccgg gggtacgttc 4320

agggggaatc tgacttatcg gaaagataac 4380

gacaatctga atcgtctgaa aacgtatgga 4440

aatattacga aaaaaggcga tgtgggtaca 4500

gccctctccg gtgcggatat aggcacaaat 4560

agatatactt catttgatcg accgtccgtc 4620

atatataatg cctcgggcga tcgccaaaag 4680

tatacgcgtt actaccttgg cggccgttac 4740

caccggcttt atatcggtgg ggacgcttat 4800

aacggttggg cgctttatta tatctgtcgc 4860

gcgagcaacg gtacggttgt tcaggagctg 4920

ccggagacgc atgccgtcta tcttcccgac 4980

tatacgggtc atgaacatct ttcgatgttc 5040

gatcccgttc tcggccgctt tcttagtccc 5100

caaagcttca accggtactc gtattgttta 5160

ggagaaatag cctggttcgt ccctgttatt 5220

ggggttattg ctaacgaagg tcaatataac 5280

acttggggct acatgcttgg tggtgctgtt 5340

gcagtctcaa tttcgggtat gccaatggca 5400

gtaaattctg ttggcacgca tatttacaca 5460

ggtgttgcct cttatgattt tacgaatggt 5520

aagtggtatg aaaacttggg atatggatta 5580

attggcttta aacctcaaaa agttgatttg 5640gttactgaaa attcagatgc gataggtcat tctgctattg tcaaacacga tacaagaaca 5700ggcatcaagg gcaaaacaga tataaatgga ttaatatcag tgggacctga tagagttagt 5760caaccagatg gttcgtggca ctggatgaaa ggaactaata aatggtcaac ttattcagca 5820aaagagaact caagatggat gcaatcactt gatgttaatt ataatacaat taatcgctat 5880tctaattggc ttaacaaaat ggaaaatacg ggtaaacttg tgtatagttt agaactaagt 5940agctgtgtga ctcacacgtc attagcactt aatgcgtcag gcgtttttaa tataggtata 6000cacccgtatt tacttcatgc tcaaatgtat ttatggggta acggaattag accttggtct 6060tttaatcatt tttttaatcg ttag 6084<210> 12 <211> 2027<212> PRT

<213> Tannerella forsythensis (ATCC 43037)

<400> 12

Met Arg lie lie Asn lie Ser lie Glu lie lie Cys Thr Cys Leu lie 1 5 10 15

lie Gly Vai Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Thr Asn Vai Tyr Ala Ala Gly

20 25 .30

Asn Glu Ala Ser Ser Asp Asn Tyr Asp Pro Ser Gly Tyr Arg lie Trp35 40 45

Gly Asn Tyr Arg Asn Glu Thr Ser Asp Ala Asn Glu Leu Asp Ala Arg50 55 60

Gln Leu Pro Ser Phe Tyr Tyr Lys lie Leu Lys Asn Arg Leu Glu Asn65 70 75 80

Asn Tyr Ser Pro Glu Glu Lys Arg Thr Phe Ala Pro Ala Pro Leu Ser'25 85 90 95

Arg Gly Met Ala Vai Gly Ser Thr Ala Gly Met Ala Glu lie Thr Leu

100 105 110

Thr Gly Ala Ala Asn Tyr Ser Vai Pro lie Glu Vai Pro Glu Gly lie115 120 125

30 Ala Gly Phe Lys Pro Glu Vai Ser Vai Arg Tyr Ser Ser Gln Ser Gly130 135 140

Vai Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Trp Asn Leu Ser Ala Phe Ser Vai lie145

Ser Arg Ser Gly

Ala Leu Ser Tyr180

Leu lie Ser Gly195

Asn Asp Pro Thr210

Gly Phe Thr Vai225

Thr Ser Asp Ser

Leu Leu Ser Arg260

Tyr Glu Glu Vai275

Tyr Ala Ser Gly290

Lys Gln Thr Gly305

Leu Lys Asn lie

Gln Phe Asn Tyr340

Glu lie lie Glu355

lie Tyr Tyr Gly370

Leu Ser Glu His385

Gly Asp Gly Arg

150

Lys Thr Phe Tyr165

Glu Asp Asn Vai

Gln Asn Leu Met200

lie Asp lie Thr215

Arg Ser Lys Asp230

Asn lie Glu Thr245

Vai lie Asp Lys

lie Asn Asn Gly280

Arg Ser lie Arg295

Tyr Tyr Ala Gly310

Ser Thr Tyr lie325

Asn Thr Tyr Glu

Ser Gly Gln Asn360

Tyr Pro Asp Pro375

Arg Lys Gly Asn390

Met Asp Phe Leu

155

His Asp Gly Met170

Met Leu Asp Gly185

Asn Gly Ala Lys

Tyr Lys Met lie220

Gly Thr lie Arg235

Ser Asp Gly Thr250

Gln Gly Asn Vai265

Glu Phe Tyr Leu

Phe Ser Tyr Glu300

Ala Vai Leu Asn315

Gly Gln Met Gln330

Asn Gly Leu Tyr345

Gly Gln Arg Tyr

Tyr Lys Asn Glu380

Lys Pro Leu Phe395

Ser Tyr Pro Glu

160

Ser Lys Ala Pro175

Gln Arg Leu Met190

Tyr Arg Leu Glu205

Gly Ser Phe Gln

Glu Phe Gly Vai240

Ala Leu Phe Trp255

lie Ser Tyr Gln270

Asn Arg lie Glu285

Thr Arg Lys Asp

Ser Asn Lys lie320

Phe Lys Gln Tyr335

Thr Gln Leu Thr350

Asn Pro Thr Arg365

Asp lie Vai Thr

Ala Asp Phe Asn400

Glu Leu Ser Asp405 410 415

Asn Pro Lys Glu Asp Vai Ala Thr Leu Phe Leu Ser Leu His Gly Leu

420 425 430

Gly Gly Thr Tyr Phe Ala Lys Lys Cys Thr lie Pro Met Arg Ala Phe

435 440 445

Gly Glu Phe Arg Tyr Phe Met Leu Ala Asp Vai Asn Gly Asp Lys Lys

450 455 460

Met Asp Vai lie His Vai Ser Arg Ala Asp Asn Gly Thr Glu Arg Tyr465 470 475 480

Asn Tyr Tyr Vai Phe Asp Gly Glu Lys Leu Vai Tyr Gln Tyr Lys Gly

485 490 495

Phe Asn Thr His Gly Asp Glu Ala Phe Vai Gly Asp Phe Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Arg His Asp lie Leu lie Lys Asn Asn Ser Lys Vai Tyr Asp Gly

515 520 525

Glu Gly Arg Glu lie Ala Ser Gly Gly lie Thr Asp Trp Gly Ser Asp

530 535 540

Tyr lie Lys Tyr Tyr Tyr Pro Asn Ser Arg Tyr lie Cys Asp Leu Asn545 550 555 560

Gly Asn Gly Lys Ser Glu Leu Leu Vai lie Asp Lys His Gly Ala Lys

565 570 575

Vai Tyr Glu Leu Asn Glu Arg Gln Phe Vai Glu Leu Pro Glu Phe Arg

580 585 590

Thr Ser Leu lie Lys Asn Tyr Tyr Phe Pro Tyr Phe Gly Asp Phe Asn

595 600 605

Gly Asp Gly Lys Thr Asp Vai Leu lie Gln Arg Trp His Gln Gly Asp

610 615 620

Tyr Asp Asp Vai Ser lie Leu Phe Ser Thr Gly Lys Gly Tyr Vai Lys625 630 635 640

Gln Asp Vai Leu Asn Ala Asp lie Arg Ala Lys Vai Phe Vai Ala Asp

645 650 655

Phe Asn Lys Asp Gly Lys Ser Asp lie Phe His Met Glu lie Vai Asn660

Asn Ala Vai Arg675

Thr Thr Tyr His690

Tyr Asn Asn lie705

Asp Gly Asp Gly

Tyr lie lie Arg740

lie Ser Asp Gly755

Thr Ser Asn Ser770

Vai Thr Asp Ser785

Ser Thr Gly Gly

Arg Ser His Met820

Ser lie Asp Asp835

Glu Lys Asp Tyr850

Arg Ser Gly Met865

Tyr Asn Gly Ser

Thr Asp His Leu900

Asp Thr Trp Ala

Met Lys Vai Gly680

Ser Ser Asn Leu695

Glu Tyr Asp Asn710

Ser Ser Glu Phe725

Ser Phe Ser Asp

Leu Gly Ala Tyr760

Vai Cys Thr Vai775

Arg Phe Pro Leu790

Tyr Ser Glu Thr805

Gln Gly Lys Gly

Asn Lys Asp Arg840

Phe Tyr Pro Phe855

Lys lie Ser Thr870

Lys Arg Vai Vai885

Thr Gly Vai VaiAsn Pro Leu Ser

665

lie Phe His Gly

Arg Leu Glu Asp700

Tyr Leu Phe Gln715

Cys Cys Ala Arg730

Pro Gln Asn Leu745

Thr Ser Phe Gln

Thr Gly Asn Asn780

Tyr Vai Vai Ser795

Thr Arg Tyr Arg810

Phe Leu Gly Phe825

Lys Vai lie Thr

lie Lys Glu Gln860

Ser Vai Tyr Glu875

Pro Tyr Vai Arg890

Lys Thr Ala Glu905

lie Vai Thr Arg

670

Asn Gly Phe His685

Vai Tyr Leu Ser

Vai Ala Asp Phe720

His Met Asn Ala735

Leu Vai Glu Thr750

Tyr Ala Pro lie765

Glu Ala Phe Pro

Asn lie Thr Gln800

Tyr Lys Asp Pro815

Gly Glu Vai Glu830

Thr Tyr Gly Tyr845

Lys lie Met Thr

Asn Ser Tyr Vai880

Lys Ser Thr Thr895

Cys Thr Gln lie910

His Gly Asn Asp915 920 925

Vai Thr Glu Thr Vai Thr Ala Ser Tyr lie Asn Arg Glu Ala Glu Asn

930 935 940

Leu Trp lie lie Gly Leu Pro Gln Ser Vai Glu Lys Arg Vai Thr Lys945 950 955 960

Gly Thr Gly Thr Trp lie Asp Lys Gln Vai Phe Thr Tyr Asn Ala Gly

965 970 975

Tyr Leu Pro Gln Lys lie Vai Asn Phe Thr Gly Asp Gly Asn Lys Gln

980 985 990

Thr Ser Glu Asp Vai Phe Asp Tyr Asp Arg Tyr Gly Asn Met lie Thr

995 1000 1005

His Ser Thr Arg Ala Tyr Ala Ser Pro His Vai Leu Thr Thr Arg

1010 1015 1020

Thr Glu Tyr Ser Ser Asp Gly Leu Tyr Met Leu Arg Thr lie Asp

1025 1030 1035

Pro Leu Ser Arg Vai Thr Thr His Thr Tyr Asn Ser Ser Gly Gln

1040. 1045 1050

Leu Ala Ser Thr Lys Asp Phe Leu Asn Thr Thr Thr Ala Tyr Glu

1055 1060 1065

Tyr Asp Gly Met Gly Arg Leu Vai Lys Thr Vai Tyr Pro Asp Gln

1070 1075 1080

Thr Gln Ser Ser Vai Vai Tyr Ser Trp Glu Asn Ala Vai Vai Asn

1085 1090 1095

Ser Vai Tyr Gly Met Thr Glu Thr Leu Thr Gly Lys Pro Glu Arg

1100 1105 1110

Lys lie Tyr Phe Asp Ala Phe Gly Arg Lys Vai Arg Glu Cys lie

1115 1120 1125

Arg Gln Thr Asp Gly Gln Asp Vai Cys Thr Asp Thr Lys Tyr Asp

1130 1135 1140

Asn Ala Gly Arg Vai Ser Gln Glu Ser Leu Pro Phe Lys Gly Gly

1145 1150 1155

Ala Ala Ser Lys Trp Asn Thr Tyr Gly Tyr Asp Gly Tyr Gly Arg1160 1165 1170

Leu Ser Gln Gln Thr His Ala Ser Gly Lys Thr Thr Thr Tyr Thr

1175 1180 1185

Tyr Ala Gly Asn Ser lie Thr Glu Thr Lys Asn Gly lie Ser His

1190 1195 1200

Lys Ser Vai Tyr Asn Ala Met Gly Glu Gln Vai Ser Vai Thr Asp

1205 1210 1215

Pro Ala Gly Thr lie Thr Tyr Thr Leu Arg Pro Asp Gly Gln Pro

1220 1225 1230

Vai Thr lie Thr Ala Pro Gly Asn Vai Lys Thr Thr Phe Ser Tyr

1235 1240 1245

Asp Ala Tyr Gly Arg Gln Thr Ala lie His Asp Pro Ser Ala Gly

1250 1255 1260

Asn Arg Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Ser Gly Asn Leu Gln Arg Glu

1265 1270 1275

Thr Asp Ala Asp Asn Arg Vai Lys Thr Met Ser Tyr . Asp Vai Tyr

1280 1285 1290

Gly Arg Leu Thr Ser Lys Vai Leu Pro Glu Phe Thr . Thr Ser Tyr

1295 1300 1305

Ala Tyr Asn Gly Tyr Gly Gln Leu Thr Thr Glu Thr Ser Asn Asn

1310 1315 1320

Gly lie Ser Ser Vai Tyr Glu Tyr Asp Ser Tyr Gly Arg Leu Ala

1325 1330 1335

Lys Glu Arg Asn Asn Vai Pro Asp Gly Lys Trp Leu Glu Lys Thr

1340 1345 1350

Tyr Thr Tyr Ala Ala Gly Asn Leu Ala Ser Vai Arg Tyr Ala Ser

1355 1360 1365

Gln Ser Gly Ala lie Gly Thr Glu Ala Tyr Thr Tyr Ser His Gly

1370 1375 1380

His Met Asn Gly lie Arg Trp Gly Ser Ser Pro Vai Trp Thr Leu

1385 1390 1395

Asn Ala Glu Asn Pro Phe Ser Gln Pro Leu Ser Vai Thr Thr Gly1400 1405 1410

Pro Vai Thr Arg Thr Tyr Thr Tyr Asp Vai Tyr Gly lie Pro Thr

1415 1420 1425

Gly Arg Thr Ala Gln Ser Thr Ala Gly Gly Thr Phe ■ Leu Asn Ser

1430 1435 1440

Thr Tyr Gly Phe Asp Ala Ala Arg Gly Asn Leu Thr Tyr Arg Lys

1445 1450 1455

Asp Asn Arg Arg Asn Lys Gln Glu Asn Phe Thr Tyr Asp Asn Leu

1460 1465 1470

Asn Arg Leu Lys Thr Tyr Gly Gly lie Vai Met Asp Tyr Asp Pro

1475 1480 1485

Lys Gly Asn lie Thr Lys Lys Gly Asp Vai Gly Thr Phe His Tyr

1490 . 1495 1500

Gln Thr Pro Tyr Lys Pro Tyr Ala Leu Ser Gly Ala Asp lie Gly

1505 1510 1515

Thr Asn Lys Vai lie Pro Pro Arg Glu Gln Thr lie Arg Tyr Thr

1520 1525 1530

Ser Phe Asp Arg Pro Ser Vai lie Thr Glu Asn Gly Tyr Glu Ala

1535 1540 1545

Ser Phe lie Tyr Asn Ala Ser Gly Asp Arg Gln Lys Met Thr Vai

1550 1555 1560

Lys Lys Gly Gly Lys Pro Phe Tyr Thr Arg Tyr Tyr Leu Gly Gly

1565 1570 1575

Arg Tyr Glu Thr Asp Vai Met Gly Asn Ser Gln Lys His Arg Leu

1580 1585 1590

Tyr lie Gly Gly Asp Ala Tyr Thr Ala Pro Ala Vai Tyr Met Asn

1595 1600 1605

Thr Gly Asn Gly Trp Ala Leu Tyr Tyr lie Cys Arg Asp Tyr Leu

1610 1615 1620

Gly Asn Met Thr His Leu Vai Ala Ser Asn Gly Thr Vai Vai Gln

1625 1630 1635

Glu Leu Ser Tyr Asp Ala Trp Gly Arg Leu Arg Asn Pro Glu Thr1640 1645 1650

His Ala Vai Tyr Leu Pro Asp Asn Glu Thr Glu Leu Met Leu Gly

1655 1660 1665

Arg Gly Tyr Thr Gly His Glu His Leu Ser Met Phe Gly Leu lie

1670 1675 1680

Asn Met Asn Ala Arg Leu Tyr Asp Pro Vai Leu Gly Arg Phe Leu

1685 . 1690 1695

Ser Pro Asp Pro Tyr Vai Gln Met Pro Asp Phe Thr Gln Ser Phe

1700 1705 1710

Asn Arg Tyr Ser Tyr Cys Leu Asn Asn Pro Leu Vai Tyr Vai Asp

1715 1720 1725

Gln Asp Gly Glu lie Ala Trp Phe Vai Pro Vai lie Vai Gly Ala

1730 1735 1740

Vai lie Gly Ala Tyr Ser Gly Gly Vai lie Ala Asn Glu Gly Gln

1745 1750 1755

Tyr Asn Pro Vai Lys Trp Asp Tyr Asn Ser Gly Lys Thr Trp Gly

1760 1765 1770

Tyr Met Leu Gly Gly Ala Vai Vai Gly Gly lie Ser . Gly Ser Leu

1775 1780 1785

Gly Trp Ala Vai Ser lie Ser Gly Met Pro Met Ala Asn Thr Ala

1790 1795 1800

Gly lie lie Ser Ala Ser Phe Vai Asn Ser Vai Gly Thr His lie

1805 1810 1815

Tyr Thr Gly Gly Gln Thr Pro Vai Ser Met Ser Leu Gly Vai Ala

1820 1825 1830

Ser Tyr Asp Phe Thr Asn Gly Ser Phe Gly His Leu Gly Lys Lys

1835 1840 1845

Gly Asn Lys Trp Tyr Glu Asn Leu Gly Tyr Gly Leu Gly Ala Met

1850 1855 1860

Ala Asn Leu Ser Asp lie Leu lie Gly Phe Lys Pro Gln Lys Vai

1865 1870 1875

Asp Leu Vai Thr Glu Asn Ser Asp Ala lie Gly His Ser Ala lie1880 1885 1890

Vai Lys His Asp Thr Arg Thr Gly lie Lys Gly Lys Thr Asp lie

1895 1900 1905

Asn Gly Leu lie Ser Vai Gly Pro Asp Arg Vai Ser Gln Pro Asp

1910 1915 1920

Gly Ser Trp His Trp Met Lys Gly Thr Asn Lys Trp Ser Thr Tyr

1925 1930 1935

Ser Ala Lys Glu Asn Ser Arg Trp Met Gln Ser Leu Asp Vai Asn

1940 1945 1950

Tyr Asn Thr lie Asn Arg Tyr Ser Asn Trp Leu ■ Asn Lys Met Glu

1955 1960 1965

Asn Thr Gly Lys Leu Vai Tyr Ser Leu Glu Leu Ser Ser Cys Vai

1970 1975 1980

Thr His Thr Ser Leu Ala Leu Asn Ala Ser Gly Vai Phe Asn lie

1985 1990 1995

Gly lie His Pro Tyr Leu Leu His Ala Gln Met Tyr Leu Trp Gly

2000 2005 2010 .

Asn Gly lie Arg Pro Trp Ser Phe Asn His Phe Phe Asn Arg

2015 2020 2025

<210> 13<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador PI

<400> 13

aggatcgtac gatggaacaa gagg

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Iniciador P2

<400> 14

cgactgtgat gcgtaacgaa caga

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador P3

<400> 15

gtccgacggt ctgtatatgc ttag

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador P4

<400> 16

ccgaagaaat caatgcctgc cgat

<210> 17

<211> 28

<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador P5

<400> 17

taatgtcccc gacggtaaat ggcttgaa

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Iniciador P6

<400> 18

gcgtctgttc gttacgcatc acagtcg 27<210> 19 <211> 7542<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Fusão 8884 (TcdB2/TcplGzC)

<400> 19

atgcaaaatt cacaagattt tagtattacg gaactgtcac tgcccaaagg ggggggcgct 60

atcacgggaa tgggtgaagc attaaccccc actggaccgg atggtatggc cgcgctatct 120

ctaccattgc ctatttctgc cgggcgcggt tatgctcccg cattcactct gaattacaac 180

agcggcgccg gtaacagtcc atttggtctg ggttgggatt gcaacgttat gactatccgc 240

cgccgcaccc attttggcgt cccccattat gacgaaaccg ataccttttt ggggccagaa 300

ggcgaagtgc tggtggtagc ggatcaacct cgcgacgaat ccacattaca gggtatcaat 360

ttaggcgcca cctttaccgt taccggctac cgttcccgtc tggaaagcca tttcagccga 420

ttggaatatt ggcaacccaa aacaacaggt aaaacagatt tttggttgat atatagccca 480

gatgggcagg tgcatctact gggtaaatca ccgcaagcgc ggatcagcaa cccatcccaa 540

acgacacaaa cagcacaatg gctgctggaa gcctctgtat catcacgtgg cgaacaaatt 600

tattatcaat atcgcgccga agatgacaca ggttgcgaag cagatgaaat tacgcaccat 660

ttacaggcta cagcgcaacg ttatttacac atcgtgtatt acggcaaccg tacagccagc 720

gaaacattac ccggtctgga tggcagcgcc ccatcacaag cagactggtt gttctatctg 780

gtatttgatt acggcgaacg cagtaacaac ctgaaaacgc caccagcatt ttcgactaca 840

ggtagctggc tttgccgtca ggaccgtttt tcccgttatg aatatggctt tgagattcgt 900

acccgccgct tatgccgtca ggtattgatg taccatcacc tgcaagcact ggatagtaag 960

ataacagaac acaacggacc aacgctggtt tcacgcctga tactcaatta cgacgaaagc 1020

gcgatagcca gcacgctagt attcgttcgc cgagtgggac acgagcaaga tggtaatgtc 1080

gtcaccctgc cgccattaga attggcatat caggattttt caccgcgaca tcacgctcac 1140

tggcaaccaa tggatgtact ggcaaacttc aatgccattc agcgctggca gctagtcgat 1200

ctaaaaggcg aaggattacc cggcctgtta tatcaggata aaggcgcttg gtggtaccgc 1260

tccgcacagc gtctgggcga aattggctca gatgccgtca cttgggaaaa gatgcaacct 1320ttatcggtta ttccttcttt gcaaagtaat gcctcgttgg tggatatcaa tggagacggc 1380

caacttgact gggttatcac cggaccggga ttacggggat atcatagtca acgcccggat 1440

ggcagttgga cacgttttac cccactcaac gctctgccgg tggaatacac ccatccacgc 1500

gcgcaactcg cagatttaat gggagccggg ctatccgatt tggtgctgat cggccctaag 1560 agcgtgcgtt tatatgccaa tacccgcgac ggctttgcca aaggaaaaga tgtggtgcaa 1620

tccggtgata tcacactgcc ggtgccgggc gccgatccac gtaagttggt ggcgtttagt 1680

gatgtattgg gttcaggtca agcccatctg gttgaagtaa gcgcgactaa agtcacctgc 1740

tggcctaatc tggggcgcgg acgttttggt caacccatta ccttaccggg attcagccag 1800

ccagcaaccg agtttaaccc ggctcaagtt tatctggccg atctggatgg cagcggtcca 1860

acggatctga tttatgttca tacaaaccgt ctggatatct tcctgaacaa aagtggcaat 1920

ggctttgctg aaccagtgac attacgcttc ccggaaggtc tgcgttttga tcatacctgt 1980

cagttacaaa tggccgatgt acaaggatta ggcgtcgcca gcctgatact gagcgtgccg 2040

catatgtctc cccatcactg gcgctgcgat ctgaccaaca tgaagccgtg gttactcaat 2100

gaaatgaaca acaatátggg ggtccatcac accttgcgtt accgcagttc ctcccaattc 2160

tggctggatg aaaaagccgc ggcgctgact accggacaaa caccggtttg ctatctcccc 2220

ttcccgatcc acaccctatg gcaaacggaa acagaagatg aaatcagcgg caacaaatta 2280

gtcacaacac ttcgttatgc tcgtggcgca tgggacggac gcgagcggga atttcgcgga 2340

tttggttatg tagagcagac agacagccat caactggctc aaggcaacgc gccagaacgt 2400

acgccaccgg cgctgaccaa aaactggtat gccaccggac tgccggtgat agataacgca 2460

ttatcàaccg agtattggcg tgatgatcag gcttttgccg gtttctcacc gcgctttacg 2520

acttggcaag ataacaaaga tgtcccgtta acaccggaag atgataacag tcgttactgg 2580

ttcaaccgcg cgttgaaagg tcaactgcta cgtagtgaac tgtacggatt ggacgatagt 2640

acaaataaac acgttcccta tactgtcact gaatttcgtt cacaggtacg tcgattacag 2700

cataccgaca gccgataccc tgtactttgg tcatctgtag ttgaaagccg caactatcac 2760

tacgaacgta tcgccagcga cccgcaatgc agtcaaaata ttacgctatc cagtgatcga 2820

tttggtcagc cgctaaaaca gctttcggta cagtacccgc gcçgccagca gccagcaatc 2880

aatctgtatc ctgatacatt gcctgataag ttgttagcca acagctatga tgaccaacaa 2940

cgccaattac ggctcaccta tcaacaatcc agttggcatc acctgaccaa caataccgtt 3000

cgagtattgg gattaccgga tagtacccgc agtgatatct ttacttatgg cgctgaaaat 3060

gtgcctgctg gtggtttaaa tctggaactt ctgagtgata aaaatagcct gatcgcggac 3120

gataaaccac gtgaatacct cggtcagcaa aaaaccgctt ataccgatgg acaaaataca 3180

acgccgttgc aaacaccaac acggcaagcc ctgattgcct ttaccgaaac aacggtattc 3240aaccagtcca cattatcagc gtttaacggactggagcaag ctggatatca gcaaacaaatgtttgggtag cccatcacgg ctataccgatcaaaaacaga gcaacaccca actcaccggt5 tgcgttgtgg tacaaacccg ggatgctgctcgttttctga ccccggtgca actcaccgatgatgcattgg gccgaccaat cacattgcgcggttattcct caccggaaaa agcatcatttgagttaaáaa aaccgctccc tgtagcacag

10 ccagtattaa gtcagaaaac cttcaatcgaaacgcccgaa tcatcaccga agatggacgtcaaagccaaa aggcaatccc tcaactcattcctcacagcc tgacattgac gacggatcgtcaacaggtgg tattcagtga tggctttggc

15 gcaggcatgg cccggcaacg caatgaagacgagaaccgtt gggcagtgac tggacgaacgacctatcagc cctatttcct caatgactgggaaaaagaag cttatgcaga tacccatgtcatcaccgcaa aaggttggtt ccgtcgaacc

20 gatgaaaatg acacagccgc tgaggtgaagggtcagacta tccgcactag gcctatgggcacctggtcca aaaccgttta tactccgtgggttctgcaat ccaacgctcg tgatgacccgtcttcccgct actcccagag ctggtacgat"25 cgcgcagctg agaaatccgc ggtttattcctgcggcctgc cggttcgcac catccagcaaatgtatgatg tgtctggcaa ccgtatccgcaaaatgctgt acgacaaact gggtcgtcagtcctggctcc tgcttgacgc acagggtggc

30 tctttcatta ctcgttacga cccgctgcgtgctgaaatgc cgaaactgat cagccgtatcaacctgaacc tgaacggtca ggtatggaaa

agcatcccgt ccgataaatt atcaacgacg 3300

tatctattcc ctcgcactgg agaagataaa 3360

tatggtacag cggcacagtt ctggcgcccg 3420

aaaatcaccc tcatctggga tgcaaactat 3480

ggactgacaa cctcagccaa atatgactgg 3 540

atcaatgaca atcagcacct tatcacactg 3 600

ttttggggaa ctgaaaacgg caagatgaca 3660

tctccaccat ccgatgttaa tgccgctatt 3720

tgtcaggtct acgcaccaga aagctggatg 3780

ctggcagaac aagattggca aaagttatat 3840

atctgcacac tggcttatcg ccgctgggta 3900

agcctgttaa acaacggacc ccgtttacct 3960

tatgatcacg atcctgagca acagatccgt 4020

cgcttgctgc aagccgctgc ccgacatgag 4080

ggctctttga ttataaatgt ccagcatact 4140

gaatatgaca ataaggggca accgatacgt 4200

cgatacgtca gcaatgatag tgcccggcag 4260

tatgatccca taggtcgaga aatcaaggtt 4320

ttgttcactc cctggtttac tgtcaatgaa 4380

aaggtaaaga tgccgggatc cgacaacaag 4440

cgtaacgtgg caagcttggc tgcggattgt 4500

accactgttg aacacggtgc tggtagcatg 4560

gatgttggtc acttcttttc ccgcatcgcg 4620

aagcgtaaac tgggtactgc tcaggaaaaa 4680

gatactccgc tgaccactca ctccggttct 4740

gcaggcggta aaacctacac ccgcagctct 4800

gacgttgact cctacgaacg taccgttgaa 4860

ctgcagacta ccggtatgga ttgtggcgaa 4920

gagatcctga gctggaactg tcgcggttac 4980

cgcgaaaccg aacgcctggt tgcgaaagcg 5040

acttacggcg aaacctgcgg tgacgcaatc 5100

gttgaggatc aggcaggcgt tcacattaac 5160actcactata acattcgtgg tcactgcctgaaacagctgg ttgattggaa actggatcagtatttctacg ataactatgg ccaggttctgcgccgtaact actcccgtca gggtcacgtg cgtgactgga aatcttacct gtctggtgctatcaaatacg gcaacggtgt ggtttccgacattagccaac gcaccactcg tccgtgccgtcatgtttacg actatgttgg tcgtcgcatttatttcggtg agagccgtgt taagccggaa

ctggtaatcg caaccggccg tgcgcagctgaccccgcata acgctatgaa cggcctgaacctgtatcagt atcgcgaaac ttacgactaccacgaagcgc cggacatcaa aggcgttaccaagagcctgt tatccgacga tccacgtgtg

ggcgatacca acgaaggcaa atacatgtacaccactctgc caaagttctc cgaactggattccactcagt acgtaaacgc gggcaccccgggtaaccgcg ttcgtaaagt taccgagactcagcgtgata ccctgttctt tggtggcgtg

ctgtggacta cccgtgttaa aggtgatggtcaggaaaccc cgctggtacg cttccaggctcagctgatca gctacgagga atattctccgggcaacattg aggcaccacg cgcttaccgtggcctgtatc actgtggcca gcgttattac

gatccgctgg gtgacgtgga tggtccaaacaactcccacg acccgtctgg tacttccggctacgcagcgc cagatgacca gggcaaacgcgatcgcatcg caaagtacga acgcaaactgatcgcgcgta tgagcggcac cgacccgatc

attgcggcta tgggcaacgc gctgggtcgttacccgcagg aatatcgtga agagttctctgtgagcattt ccaaagaggc gcactatatc

ggtaagaccc tgcaattcac caaagaatat 5220

accctggaaa ctgaggttta tccgcatacc 5280

caagaggaag acgaacaggg caaccgtacc 5340

gtttctgtag acttctctag cattaaaggc 5400

accttctctg cggacggcct gccgattact 5460

tttttctacg atgacgaaag ccgtaacctg 5520

ggtcgtcgcg aactgctcca agatcgtacc 5580

tttacttccg acggttccga acaggtaaaa 5640

tgggactaca cttacaacgc gactggcgca 5700

tctggcaaaa tcggtaacgg caaccagctg 5760

ccgtctcgcg gtggcggtga cggtaacttg 5820

gatcgtgagg gtaacattct gatgatgaaa 5880

agctggaccc gtaactacca ctacgatgaa 5940

aaatccaacc gtctgtctcg cacctccatc 6000

gaaggctctg ctggcctgtc cggttgcatc 6060

tggaacatga acaacatgct gagcttttct 6120

gaacgtacct actatgtgta cgaccacgct 6180

gcggctaaat ctggtgagga accgcgtaaa 6240

gaactgcaaa ccaaatccaa cggctctctt 6300

atcgtggctg tagttgaagt gaaccgtaac 6360

ggtcgtgaca tggaatttga cgatcaggcg 6420

ttcggtgctg tggtttacgc tgcgatgtac 6480

ttcgcacgtt acgaacacga ttctgaaacc 6540

tgcccgtggc tgggtcgttg gacctcccca 6600

ctgttcgtat acgtgaacaa cgatccagtt 6660

aagaaaacca aggaaggtac tcgcgaaatg 6720

cgtctggttg acgagaacaa agctgttgct 6780

caacgtcagg aacgtaaaca acagcgtgcg 6840

ctgggttctc gtgcacgtta tgcggtaggc 6900

atctctggtt ccaccgaact gcatcacacc 6960

gacatcgaca ttaacgttga ccgtacctct 7020

tgcacttacg gtagcatcct ggacaacctg 7080gtagcaacca acaaacgctg gaaatctgaa tactttgaca ctccagacac tggttattac 7140gaacagatgg agcagcatga gtggtacgac gatgacccag gcatgcagta cgcgatccgt 7200ctgcacctgg catacgaagc gcgtactctg aacggtaaaa tcatggcgga tttcggcatc 7260aacccgaaag gcgaagacgg tcgttccatg tttgttaact atgatgcggt aaccaaaatg 73205 cgtaccgctg gtcagcgtcg cggcgtacgt aacgacaacc tgatccatca cgaaacctgg 7380ccgggtcgtc cgtttaacac cggcaacagc gataccgata acgcgggtgg cccggttcac 7440ttccaggttg cagaggaaca gtacaacggc ctggatgctg acgcgcaggc gaaattcgat 7500gacctgcgca accaaatgga ggcgctccta ggcaaacgct aa 7542<210> 2010 <211> 2513<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Fusão de peptídeo 8884 TcdB2/TcplGzC

15 <400> 20

Met Gln Asn Ser Gln Asp Phe Ser lie Thr Glu Leu Ser Leu Pro Lys1.5 10 .15

Gly Gly Gly Ala lie Thr Gly Met Gly Glu Ala Leu Thr Pro Thr Gly20 25 30

20 Pro Asp Gly Met Ala Ala Leu Ser Leu Pro Leu Pro lie Ser Ala Gly35 40 45

Arg Gly Tyr Ala Pro Ala Phe Thr Leu Asn Tyr Asn Ser Gly Ala Gly

50 55 60

Asn Ser Pro Phe Gly Leu Gly Trp Asp Cys Asn Vai Met Thr lie Arg'25 65 70 75 80

Arg Arg Thr His Phe Gly Vai Pro His Tyr Asp Glu Thr Asp Thr Phe

85 90 95

Leu Gly Pro Glu Gly Glu Vai Leu Vai Vai Ala Asp Gln Pro Arg Asp100 105 110

30 Glu Ser Thr Leu Gln Gly lie Asn Leu Gly Ala Thr Phe Thr Vai Thr115 120 125

Gly Tyr Arg Ser Arg Leu Glu Ser His Phe Ser Arg Leu Glu Tyr TrpGln Pro Lys Thr 145

Asp Gly Gln Vai

Asn Pro Ser Gln 180

Vai Ser Ser Arg 195

Asp Thr Gly Cys 210

Ala Gln Arg Tyr 225

Glu Thr Leu Pro

Leu Phe Tyr Leu 260

Thr Pro Pro Ala 275

Arg Phe Ser Arg 290

Cys Arg Gln Vai 305

lie Thr Glu His

Tyr Asp Glu Ser 340

Gly His Glu Gln 355

Ala Tyr Gln Asp 370

Asp Vai Leu Ala

135

Thr Gly Lys Thr 150

His Leu Leu Gly 165

Thr Thr Gln Thr

Gly Glu Gln lie 200

Glu Ala Asp Glu 215

Leu His lie Vai 230

Gly Leu Asp Gly 245

Vai Phe Asp Tyr

Phe Ser Thr Thr 280

Tyr Glu Tyr Gly 295

Leu Met Tyr His 310

Asn Gly Pro Thr 325

Ala lie Ala Ser

Asp Gly Asn Vai 360

Phe Ser Pro Arg 375

Asn Phe Asn Ala

222

140

Asp Phe Trp Leu 155

Lys Ser Pro Gln 170

Ala Gln Trp Leu 185

Tyr Tyr Gln Tyr

lie Thr His His 220

Tyr Tyr Gly Asn 235

Ser- Ala Pro Ser 250

Gly Glu Arg Ser 265

Gly Ser Trp Leu

Phe Glu lie Arg 300

His Leu Gln Ala 315

Leu Vai Ser Arg 330

Thr Leu Vai Phe 345

Vai Thr Leu Pro

His His Ala His 380

lie Gln Arg Trp

lie Tyr Ser Pro 160

Ala Arg lie Ser 175

Leu Glu Ala Ser 190

Arg Ala Glu Asp 205

Leu Gln Ala Thr

Arg Thr Ala Ser 240

Gln Ala Asp Trp 255

Asn Asn Leu Lys 270

Cys Arg Gln Asp 285

Thr Arg Arg Leu

Leu Asp Ser Lys 320

Leu lie Leu Asn 335

Vai Arg Arg Vai 350

Pro Leu Glu Leu 365

Trp Gln Pro Met Gln Leu Vai Asp385

Leu Lys Gly Glu

Trp Trp Tyr Arg 420

Vai Thr Trp Glu 435

Ser Asn Ala Ser 450

Vai lie Thr Gly 465

Gly Ser Trp Thr

Thr His Pro Arg 500

Asp Leu Vai Leu 515

Arg Asp Gly Phe 530

Thr Leu Pro Vai 545

Asp Vai Leu Gly

Lys Vai Thr Cys 580

lie Thr Leu Pro 595

Gln Vai Tyr Leu 610

Tyr Vai His Thr 625

Gly Phe Ala Glu

390

Gly Leu Pro Gly 405

Ser Ala Gln Arg

Lys Met Gln Pro 440

Leu Vai Asp lie 455

Pro Gly Leu Arg 470

Arg Phe Thr Pro 485

Ala Gln Leu Ala

lie Gly Pro Lys 520

Ala Lys Gly Lys 535

Pro Gly Ala Asp 550

Ser Gly Gln Ala 565

Trp Pro Asn Leu

Gly Phe Ser Gln 600

Ala Asp Leu Asp 615

Asn Arg Leu Asp 630

Pro Vai Thr Leu

395

Leu Leu Tyr Gln 410

Leu Gly Glu lie 425

Leu Ser Vai lie

Asn Gly Asp Gly 460

Gly Tyr His Ser 475

Leu Asn Ala Leu 490

Asp Leu Met Gly 505

Ser Vai Arg Leu

Asp Vai Vai Gln 540

Pro Arg Lys Leu 555

His Leu Vai Glu 570

Gly Arg Gly Arg 585

Pro Ala Thr Glu

Gly Ser Gly Pro 620

lie Phe Leu Asn 635

Arg Phe Pro Glu

400

Asp Lys Gly Ala 415

Gly Ser Asp Ala 430

Pro Ser Leu Gln 445

Gln Leu Asp Trp

Gln Arg Pro Asp 480

Pro Vai Glu Tyr 495

Ala Gly Leu Ser 510

Tyr Ala Asn Thr 525

Ser Gly Asp Ilé

Vai Ala Phe Ser 560

Vai Ser Ala Thr 575

Phe Gly Gln Pro 590

Phe Asn Pro Ala 605

Thr Asp Leu lie

Lys Ser Gly Asn 640

Gly Leu Arg PheAsp His Thr Cys 660

Ala Ser Leu lie 675

Cys Asp Leu Thr 690

Asn Met Gly Vai 705

Trp Leu Asp Glu

Cys Tyr Leu Pro 740

Asp Glu lie Ser 755

Gly Ala Trp Asp 770

Glu Gln Thr Asp 785

Thr Pro Pro Ala

lie Asp Asn Ala 820

Ala Gly Phe Ser 835

Pro Leu Thr Pro 850

Leu Lys Gly Gln 865

Thr Asn Lys His Arg Arg Leu Gln

645

Gln Leu Gln Met

Leu Ser Vai Pro 680

Asn Met Lys Pro 695

His His Thr Leu 710

Lys Ala Ala Ala 725

Phe Pro lie His

Gly Asn Lys Leu 760

Gly Arg Glu Arg 775

Ser His Gln Leu 790

Leu Thr Lys Asn 805

Leu Ser Thr Glu

Pro Arg Phe Thr 840

Glu Asp Asp Asn 855

Leu Leu Arg Ser 870

Vai Pro Tyr Thr 885

His Thr Asp Ser

650

Ala Asp Vai Gln 665

His Met Ser Pro

Trp Leu Leu Asn 700

Arg Tyr Arg Ser

-715

Leu Thr Thr Gly 730

Thr Leu Trp Gln 745

Vai Thr Thr Leu

Glu Phe Arg Gly 780

Ala Gln Gly Asn 795

Trp Tyr Ala Thr 810

Tyr Trp Arg Asp 825

Thr Trp Gln Asp

Ser Arg Tyr Trp 860

Glu Leu Tyr Gly 875

Vai Thr Glu Phe 890

Arg Tyr Pro Vai

655

Gly Leu Gly Vai 670

His His Trp Arg 685

Glu Met. Asn Asn

Ser Ser Gln Phe 720

Gln Thr Pro Vai 735

Thr Glu Thr Glu 750

Arg Tyr Ala Arg 765

Phe Gly Tyr Vai

Ala Pro Glu Arg 800

Gly Leu Pro Vai 815

Asp Gln Ala Phe 830

Asn Lys Asp Vai 845

Phe Asn Arg Ala

Leu Asp Asp Ser 880

Arg Ser Gln Vai 895

Leu Trp Ser Ser900 905 910

Vai Vai Glu Ser Arg Asn Tyr His Tyr Glu Arg lie Ala Ser Asp Pro

915 920 925

Gln Cys Ser Gln Asn lie Thr Leu Ser Ser Asp Arg Phe Gly Gln Pro

930 935 940

Leu Lys Gln Leu Ser Vai Gln Tyr Pro Arg Arg Gln Gln Pro Ala lie 945 950. 955 960

Asn Leu Tyr.Pro Asp Thr Leu Pro Asp Lys Leu Leu Ala Asn Ser Tyr

965 970 975

Asp Asp Gln Gln Arg Gln Leu Arg Leu Thr Tyr Gln Gln Ser Ser Trp

980 985 990

His His Leu Thr Asn Asn Thr Vai Arg Vai Leu Gly Leu Pro Asp Ser

995 1000 1005

Thr Arg Ser Asp lie Phe Thr Tyr Gly Ala Glu Asn Vai Pro Ala

1010 1015 1020

Gly Gly Leu Asn Leu Glu Leu Leu Ser Asp Lys Asn Ser Leu lie

1025 1030 1035

Ala Asp Asp Lys Pro Arg Glu Tyr Leu Gly Gln Gln Lys Thr Ala

1040 1045 1050

Tyr Thr Asp Gly Gln Asn Thr Thr Pro Leu Gln Thr Pro Thr Arg

1055 1060 1065

Gln Ala Leu lie Ala Phe Thr Glu Thr Thr Vai Phe Asn Gln Ser

1070 1075 1080

Thr Leu Ser Ala Phe Asn Gly Ser lie Pro Ser Asp Lys Leu Ser

1085 1090 1095

Thr Thr Leu Glu Gln Ala Gly Tyr Gln Gln Thr Asn Tyr Leu Phe

1100 1105 1110

Pro Arg Thr Gly Glu Asp Lys Vai Trp Vai Ala His His Gly Tyr

1115 1120 1125

Thr Asp Tyr Gly Thr Ala Ala Gln Phe Trp Arg Pro Gln Lys Gln

1130 1135 1140

Ser Asn Thr Gln Leu Thr Gly Lys lie Thr Leu lie Trp Asp Ala1145 1150 1155

Asn Tyr Cys Vai Vai Vai Gln Thr Arg Asp Ala Ala Gly Leu Thr

1160 1165 1170

Thr Ser Ala Lys Tyr Asp Trp Arg Phe Leu Thr Pr o Vai Gln Leu

1175 1180 1185

Thr Asp lie Asn Asp Asn Gln His Leu lie Thr Leu Asp Ala Leu

1190 1195 1200

Gly Arg Pro lie Thr Leu Arg Phe Trp Gly Thr Glu Asn Gly Lys

1205 1210 1215

Met Thr Gly Tyr Ser Ser Pro Glu Lys Ala Ser Phe Ser Pro Pro

1220 1225 1230

Ser Asp Vai Asn Ala Ala lie Glu Leu Lys Lys Pro Leu Pro Vai

1235 1240 1245

Ala Gln Cys Gln Vai Tyr Ala Pro Glu Ser Trp Met Pro Vai Leu

1250 1255 1260

Ser Gln Lys Thr Phe Asn Arg Leu Ala Glu Gln Asp Trp Gln Lys

1265 1270 1275

Leu Tyr Asn Ala Arg lie lie Thr Glu Asp Gly Arg lie Cys Thr

1280 1285 1290

Leu Ala Tyr Arg Arg Trp Vai Gln Ser Gln Lys Ala lie Pro Gln

1295 1300 1305

Leu lie Ser Leu Leu Asn Asn Gly Pro Arg Leu Pro Pro His Ser

1310 1315 1320

Leu Thr Leu Thr Thr Asp Arg Tyr Asp His Asp Pro Glu Gln Gln

1325 1330 1335

lie Arg Gln Gln Vai Vai Phe Ser Asp Gly Phe Gly Arg Leu Leu

1340 1345 1350

Gln Ala Ala Ala Arg His Glu Ala Gly Met Ala Arg Gln Arg Asn

1355 1360 1365

Glu Asp Gly Ser Leu lie lie Asn Vai Gln His Thr Glu Asn Arg

1370 1375 1380

Trp Ala Vai Thr Gly Arg Thr Glu Tyr Asp Asn Lys Gly Gln Pro1385 1390 1395

lie Arg Thr Tyr Gln Pro Tyr Phe Leu Asn Asp Trp Arg Tyr Vai

1400 1405 1410

Ser Asn Asp Ser Ala Arg Gln Glu Lys Glu Ala Tyr Ala Asp Thr

1415 1420 1425

His Vai Tyr Asp Pro lie Gly Arg Glu lie Lys Vai lie Thr Ala

1430 1435 1440

Lys.Gly Trp Phe Arg Arg Thr Leu Phe Thr Pro Trp Phe Thr Vai

1445 1450 1455

Asn Glu Asp Glu Asn Asp Thr Ala Ala Glu Vai Lys Lys Vai Lys

1460 1465 1470

Met Pro Gly Ser Asp Asn Lys Gly Gln Thr lie Arg Thr Arg Pro

1475 1480 1485

Met Gly Arg Asn Vai Ala Ser Leu Ala Ala Asp Cys Thr Trp Ser

1490 1495 1500

Lys Thr Vai Tyr Thr Pro Trp Thr Thr Vai Glu His Gly Ala Gly

1505 1510 1515

Ser Met Vai Leu Gln Ser Asn Ala Arg Asp Asp Pro Asp Vai Gly

1520 1525 1530

His Phe Phe Ser Arg lie Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gln Ser Trp

1535 1540 1545

Tyr Asp Lys Arg Lys Leu Gly Thr Ala Gln Glu Lys Arg Ala Ala

1550 1555 1560

Glu Lys Ser Ala Vai Tyr Ser Asp Thr Pro Leu Thr Thr His Ser

1565 1570 1575

Gly Ser Cys Gly Leu Pro Vai Arg Thr lie Gln Gln Ala Gly Gly

1580 1585 1590

Lys Thr Tyr Thr Arg Ser Ser Met Tyr Asp Vai Ser Gly Asn Arg

1595 1600 1605

lie Arg Asp Vai Asp Ser Tyr Glu Arg Thr Vai Glu Lys Met Leu

1610 1615 1620

Tyr Asp Lys Leu Gly Arg Gln Leu Gln Thr Thr Gly Met Asp Cys1625 1630 1635

Gly Glu Ser Trp Leu Leu Leu Asp Ala Gln Gly Gly Glu lie Leu

1640 1645 1650

Ser Trp Asn Cys Arg Gly Tyr Ser Phe lie Thr Arg Tyr Asp Pro

1655 1660 1665

Leu Arg Arg Glu Thr Glu Arg Leu Vai Ala Lys Ala Ala Glu Met

1670 1675 1680

Pro Lys Leu lie Ser Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Cys Gly Asp

1685 1690 1695

Ala lie Asn Leu Asn Leu Asn Gly Gln Vai Trp Lys Vai Glu Asp

1700 1705 1710

Gln Ala Gly Vai His lie Asn Thr His Tyr Asn lie Arg Gly His

1715 1720 1725

Cys Leu Gly Lys Thr Leu Gln Phe Thr Lys Glu Tyr Lys Gln Leu

1730 1735 1740

Vai Asp Trp Lys Leu Asp Gln Thr Leu Glu Thr Glu Vai Tyr Pro

1745 1750 1755

His Thr Tyr Phe Tyr Asp Asn Tyr Gly Gln Vai Leu Gln Glu Glu

1760 1765 1770

Asp Glu Gln Gly Asn Arg Thr Arg Arg Asn Tyr Ser Arg Gln Gly

1775 1780 1785

His Vai Vai Ser Vai Asp Phe Ser Ser lie Lys Gly Arg Asp Trp

1790 1795 1800

Lys Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Thr Phe Ser Ala Asp Gly Leu Pro

1805 1810 1815

lie Thr lie Lys Tyr Gly Asn Gly Vai Vai Ser Asp Phe Phe Tyr

1820 1825 1830

Asp Asp Glu Ser Arg Asn Leu lie Ser Gln Arg Thr Thr Arg Pro

1835 1840 1845

Cys Arg Gly Arg Arg Glu Leu Leu Gln Asp Arg Thr His Vai Tyr

1850 1855 1860

Asp Tyr Vai Gly Arg Arg lie Phe Thr Ser Asp Gly Ser Glu Gln1870 1875 Vai Lys Tyr Phe Gly Glu Ser Arg Vai Lys Pro Glu Trp Asp Tyr 1880 1885 1890 Thr Tyr Asn Ala Thr Gly Ala Leu Vai lie Ala Thr Gly Arg Ala 1895 1900 1905 Gln Leu Ser Gly Lys lie Gly Asn Gly Asn Gln Leu Thr Pro His 1910 1915 1920 Asn. Ala Met Asn Gly Leu Asn Pro Ser Arg Gly Gly Gly Asp Gly 1925 1930 1935 Asn Leu Leu Tyr Gln Tyr Arg Glu Thr Tyr Asp Tyr Asp Arg Glu 1940 1945 1950 Gly Asn lie Leu Met Met Lys His Glu Ala Pro Asp lie Lys Gly 1955 1960 1965 Vai Thr Ser Trp Thr Arg Asn Tyr His Tyr Asp Glu Lys Ser Leu 1970 1975 1980 Leu Ser Asp Asp Pro Árg Vai Lys Ser Asn Arg Leu Ser Arg Thr 1985. 1990 1995 Ser lie Gly Asp Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Met Tyr Glu Gly Ser 2000 2005 2010 Ala Gly Leu Ser Gly Cys lie Thr Thr Leu Pro Lys Phe Ser Glu 2015 2020 2025 Leu Asp Trp Asn Met Asn Asn Met Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln 2030 2035 2040 Tyr Vai Asn Ala Gly Thr Pro Glu Arg Thr Tyr Tyr Vai Tyr Asp 2045 2050 2055 His Ala Gly Asn Arg Vai Arg Lys Vai Thr Glu Thr Ala Ala Lys 2060 2065 2070 Ser Gly Glu Glu Pro Arg Lys Gln Arg Asp Thr Leu Phe Phe Gly 2075 2080 2085 Gly Vai Glu Leu Gln Thr Lys Ser Asn Gly Ser Leu Leu Trp Thr 2090 2095 2100 Thr Arg Vai Lys Gly Asp Gly lie Vai Ala Vai Vai Glu Vai Asn2105 2110 2115

Arg Asn Gln Glu Thr Pro Leu Vai Arg Phe Gln Ala Gly Arg Asp

2120 2125 2130

Met Glu Phe Asp Asp Gln Ala Gln Leu lie Ser Tyr Glu Glu Tyr

2135 2140 2145

Ser Pro Phe Gly Ala Vai Vai Tyr Ala Ala Met Tyr Gly Asn lie

2150 2155 2160

Glu Ala Pro Arg Ala Tyr Arg Phe Ala Arg Tyr Glu His Asp Ser

2165 2170 2175

Glu Thr Gly Leu Tyr His Cys Gly Gln Arg Tyr Tyr Cys Pro Trp

2180 2185 2190

Leu Gly Arg Trp Thr Ser Pro Asp Pro Leu Gly Asp Vai Asp Gly

2195 2200 2205

Pro Asn Leu Phe Vai Tyr Vai Asn Asn Asp Pro.Vai Asn Ser His

2210 2215 2220

Asp Pro Ser Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Lys Glu Gly Thr Arg

2225 2230 2235

Glu Met Tyr Ala Ala Pro Asp Asp Gln Gly Lys Arg Arg Leu Vai

2240 2245 2250

Asp Glu Asn Lys Ala Vai Ala Asp Arg lie Ala Lys Tyr Glu Arg

2255 2260 2265

Lys Leu Gln Arg Gln Glu Arg Lys Gln Gln Arg Ala lie Ala Arg

2270 2275 2280

Met Ser Gly Thr Asp Pro lie Leu Gly Ser Arg Ala Arg Tyr Ala

2285 2290 2295

Vai Gly lie Ala Ala Met Gly Asn Ala Leu Gly Arg lie Ser Gly

2300 2305 2310

Ser Thr Glu Leu His His Thr Tyr Pro Gln Glu Tyr Arg Glu Glu

2315 2320 2325

Phe Ser Asp lie Asp lie Asn Vai Asp Arg Thr Ser Vai Ser lie

2330 2335 2340

Ser Lys Glu Ala His Tyr lie Cys Thr Tyr Gly Ser lie Leu Asp2345 2350 2355

Asn Leu Vai Ala Thr Asn Lys Arg Trp Lys Ser Glu Tyr Phe Asp

2360 2365 2370

Thr Pro Asp Thr Gly Tyr Tyr Glu Gln Met Glu Gln His Glu Trp

2375 2380 2385

Tyr Asp Asp Asp Pro Gly Met Gln Tyr Ala lie Arg Leu His Leu

2390 2395 2400

Ala Tyr Glu Ala Arg Thr Leu Asn Gly Lys lie Met Ala Asp Phe

2405 2410 2415

Gly lie Asn Pro Lys Gly Glu Asp Gly Arg Ser Met Phe Vai Asn

2420 2425 2430

Tyr Asp Ala Vai Thr Lys Met Arg Thr Ala Gly Gln Arg Arg Gly

2435 2440 2445

Vai Arg Asn Asp Asn Leu lie His His Glu Thr Trp Pro Gly Arg

2450 2455 2460

Pro Phe Asn Thr Gly Asn Ser Asp Thr Asp Asn Ala Gly Gly Pro

2465 2470 2475

Vai His Phe Gln Vai Ala Glu Glu Gln Tyr Asn Gly Leu Asp Ala

2480 2485 2490

Asp Ala Gln Ala Lys Phe Asp Asp Leu Arg Asn Gln Met Glu Ala

2495 2500 2505

Leu Leu Gly Lys Arg

2510 <210> 21 <211> 7458 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> fusão 8883 (tcplGzB/tccC3)

<400> 21

atgtctaccc tgtcctctcg cccgggcgac ccgcgtgcgc tccattccgg ccagaataac ggtgcgccag aaactctgac caacagcaaa tctaacgcga ccctgtctgg taaccgtaccactgcgccgg catctgctag ctccttcgca ccaggcttcc gtacttcttt caacgtagct tctgaagact tcgaagtttc cccggctaac accagcccga cccgtggtgg ctatggtccg ggtaacggcc cgttcggctt tggttggtcc actcatgcta ttccgcgtta cgttgatgac attatcaaac gtctgaactc cgaaggtatt ggtaaattcc tggtaaccac ttatcgcccg cgctgggtac gtcgcgaaga tctggaagat

gaaactaaaa tctacggcga ctccgattct aaacgtatct tttcctggct gctcagccgc tacgtgtata aagaggaaga ctccctgggc tgggaaaaga accgtgaaca ggacgctcgc tatggcaacc gcaaaccgaa ccgtgatctg

gagtggatgt tcgaagtggt attcgattac gaggaatccc actcttggcc ggttcgtcag gaaatccgta cttaccgtct gtgtcgtcgc actcaggaga gcgaaacctt tgttttctct cgtaccgttc tggcaagcct ggtggcgact ggtaagcagc gttaccgctc tgaaagcctg ccggaagcat ctgagafccga actgatggaa acctccgacg cacgtgtgtc tgagtggctg ctgacccgtt ctgtggatgg cgcactgtac gacgatgacc cgcagttctg cggtccggttggtactttcc aggatctgga tcgtaacggc ggtcacctgg aaggttacta tgagcgtggt ttcccggaaa cctctaacgg tgatatctgg gatggtcatc cggacctgat ctgcgcggca aacctgggta agaaaggcct gtctagctac

tcctgcccac gcctgatcaa gaaccaggac agcggcatgt ctgacctggt agaaatcagc ggttacggta ctttcggcgc ggcagtagac

ccgcaggttc gtaccctggg tgaaggtatc 180

ggtaaaggtg gcggtgcgtt tcgctctatt 240

ggcactatgt ctctggcgat cccggtacgc 300

gacctgaaac tgagctacga tagcggttct 360

atgtctatgc cgtctatcca ccgtaaaacc 420

gaagacgatt tcctgatgtc tggtggcgac 480

caggaaaccc gcaacgagag cggcatctgc 540

cgtgttgact ccggtaacat ccgcatcgaa 600

gtgcattggc gtactatcag ctcctctaac 660

tcccgcatct tcgatgcttc cggtccgtct 720

tcttacgacg catccggcaa cgcgattgaa 780

atcagcgacg caaccggcgc gatgccagta 840

taccgcgaac gttacatcaa gcgtgtaaaa 900

actacctggg aggtgtctga ctggccggaa 960

ggcgaacatg ataaaggttc tccgtccact 1020

gacgttttct ctcagtcccg tccaggtttc 1080

gttctgatgt tccaccattt cccggaacac 1140

accgacctgc aatataacga aagccgccag 1200

ggttattcta gctacaaaga taacaacgat 1260

ccaccgtggt cttttgaata tacctctagc 1320

gctaaaacct tcaacctgct cgaactgccg 1380

gacctggatg gtgacggcat gccgggcctt 1440

tatcagcgca acctgggttc tatctccggt 1500

cttctggctc agcaaccgtc catgaccggc 1560

aacctgaact acgtgctgcg taacgaacac 1620

aactctgaca cctggaagaa ctatatcgaa 1680

cagtctacta tcgatattga cctgaccggc 1740

gacgatagcc aggtgctgat ttggcagcaa 1800

cagcgtgtaa tttgcggcca tgattgggag 1860

gttcagacct acgttggcga catgaccggc 1920

gtaagctccg tgcgctattg gccgaacctg 1980

atgggtaacc cgccagcttt cgcagcgaaa 2040gattacttcg accacagccg tgtgcgcctg atggacaccg acggtagcgg cactatggat 2100

ctgctctacg cactgccgac cggcggtgca gctctgtact ataacctggc tggcaacagc 2160

tggtctaaca tggtgttcct gccacacctg ccggcgatta tcaccccgat gagcatcttc 2220

accctggacc tgattggcaa aggtgctgat tgcctgtgtt gggctgacac ttccaccgat 2280

ggtaaccgta tcatgtatct ggacatcacc ggcgaaacca aaccgcactt gctgaaatct 2340

tatagcaacg gctggggtgc tactacctct gtggattacg cgccgtccac caaattcttt 2400

gcagaagata cccgtaacgg ccacccgtgg tctagcaaac tgccgtttcc ggtgcagtgc 2460

gtatctaaag ttcaggtgga agacgctatc accggcaacc gtcagagcac cgaatacatc 2520

tatcataacg gttgttacaa cccgactgaa aagcagttct ctggtttcga aatggtggaa 2580

cagttccagt ccgagcgtgt tatcgtaggc gaagatgaaa cctacgaacc gccagttacc 2640

cacaccaaaa gctggttcaa cgttggtctg agcctggtag tggacgaaag ccgtttcctg 2700

actaaaccgg cgatcctgtc ctctctgcaa gattaccaca ctgacccggc ggaactggtg 2760

aacgcactga aaggtctgaa cgtgcgttcc gaaatttact ctcaagatgg ctccccgaaa 2820

tctcacctgc cgtatgtaat caaggaagtt tcttatcacg ttaagatttc ccaggcgcgt 2880

gacaccaaca aatattccgc agttcaggtt ctgccacgtg aaacttttag ccgtgcgtac 2940

gaacgtgaca tgtccgaccc gcgtgtgact cacgatatgg ttattaagac caacgacttt 3000

ggtgacgttg aagagtctct gtctattgta tatccgcgtg caggcaaaac cactttcgaa 3060

gatgttaaca agaaccagaa agcgggcaac atgtcctaca ctcagaactg gtacaccaaa 3120

atggtgagcg aaccggaaca ggagcacttt cgcaaaccgg cagcgtatcg ccaacaggaa 3180

cacgagatcc tgtcctttcc gttcaacggc actctgaagt ttgatgacgc actggcgttt 3240

aacttcaacg gtctgccgac taccaaatgt tctaaaactt ggaaagctct gcgcagcgaa 3300

aacaaggcgt tctacaaaga tagccttctg caacgccgtc tggatgaagg tgagctgcaa 3360

accttctccc tcctggacca gacttacgca ctggcgttta ccccggacat cctggctaaa 3420

gtggaaattg gcctgcgtaa ctgtaacgta ccgggttctg tggaggaact gttgactaaa 3480

,25 ggtagctacg taaagctgaa agacagcgac ggctggtggg caccgtcttc ccagtctttc 3540

ttttgtagct ctaagaccgc tagcgcagct gaggaactga aagaagcgcg caaatccttt 3600

tataccccat cccgtttcgt ggacctgttc ggcaactcca gccgcctgaa catggataaa 3660

gactttctcc tggctactga agttgaggac gcaatcggca ccgcaacctc tttcaaaaac 3720

tcctatgaac acctgcaacc agtggagatt atcgacgcga actctaacag cgttcaggta 3780

gttctggacc cactgggcga atccattgcg gtggcggctt ccactcgtcg cgacggtgtt 3840

atcgaggaaa ttgactccct ggaaáacatg gtgctggatg cgtctccgga agacgttgat 3900

gacatcctgc gtgatccgac cggcgaagtg agcacccgcc ttctgggtaa cgcggcttct 3960cgtaccattc attaccgtga tcgctacgct cagtggaagt ctcgccagaa cgaaacctct 4020

accagcgttg atccggaacc ggctctgtct ctggttctgt cccgtgacct gtccttcaag 4080

gaatcctcta gcccggagat ccgtgttatt gtgagctaca tgaacggcct gggtagccag 4140

tatcaagagc agcatctgtc cgatccgacc actctggaga aacgttggct ggttccgggc 4200

ctggcaatcc cagatacaca gggccaggtg gtatgcacct accagccgcg tttcgctacc 4260

ctggctgcgc cgattccatc ctctctgatg aaaactaacg cggcattcac cttctacgat 4320

gcgatgggcc gtaacgtggc aagcttggct gcggattgta cctggtccaa aaccgtttat 43 80

actccgtgga ccactgttga acacggtgct ggtagcatgg ttctgcaatc caacgctcgt 4440

gatgacccgg atgttggtca cttcttttcc cgcatcgcgt cttcccgcta ctcccagagc 4500

tggtacgata agcgtaaact gggtactgct caggaaggat ccgacaacaa gggtcagact 4560

atccgcacta ggcctatgaa aaacatcgat cccaaacttt atcaaaaaac ccctactgtc 4620

agcgtttacg ataaccgtgg tctgataatc cgtaacatcg attttcatcg tactaccgca 4680

aatggtgatc ccgatacccg tattacccgc catcaatacg atattcacgg acacctaaat 4740

caaagcatcg atccgcgcct atatgaagcc aagcaaacca acaatacgat caaacccaat 4800 tttctttggc agtatgattt gaccggtaat cccctatgta cagagagcat tgatgcaggt 4860

cgcactgtca ccttgaatga tattgaaggc cgtccgctac taacggtgac tgcaacaggg 4920

gttatacaaa ctcgacaata tgaaacttct tccctgcccg gtcgtctgtt atctgttgcc 4980

gaacaaacac ccgaggaaaa aacatcccgt atcaccgaac gcctgatttg ggctggcaat 5040

accgaagcag agaaagacca taaccttgcc ggccagtgcg tgcgtcacta tgacacggcg 5100

ggagttaccc ggttagagag tttatcactg accggtactg ttttatctca atccagccaa 5160

ctattgatcg acactcaaga ggcaaactgg acaggtgata acgaaaccgt ctggcaaaac 5220

atgctggctg atgacatcta cacaaccctg agcaccttcg atgccaccgg tgctttactg 5280

actcagaccg atgcgaaagg gaacattcag agactggctt atgatgtggc cgggcagcta 5340

aacgggagct ggctaacact caaaggccag acggaacaag tgattatcaa atccctgacc 5400 tactccgccg ccggacaaaa attacgtgag gaacacggca atgatgttat caccgaatac 5460

agttatgaac cggaaaccca acggctgatc ggtatcaaaa cccgccgtcc gtcagacact 5520

aaagtgctac aagacctgcg ctatgaatat gacccggtag gcaatgtcat cagcatccgt 5580

aatgacgcgg aagccacccg cttttggcac aatcagaaag tgatgccgga aaacacttat 5640

acctacgatt ccctgtatca gcttatcagc gccaccgggc gcgaaatggc gaatataggt 5700

caacaaagtc accaatttcc ctcacccgct ctaccttctg ataacaacac ctataccaac 5760

tatacccgta cttatactta tgaccgtggc ggcaatctga ccaaaatcca gcacagttca 5820

ccggcgacgc aaaacaacta caccaccaat atcacggttt caaatcgcag caaccgcgca 5880gtactcagca cattgaccga agatccggcg caagtagatg ctttgtttga tgcaggcgga 5940

catcagaaca ccttgatatc aggacaaaac ctgaactgga atactcgtgg tgaactgcaa 6000

caagtaacac tggttaaacg ggacaagggc gccaatgatg atcgggaatg gtatcgttat 6060

agcggtgacg gaagaaggat gttaaaaatc aatgaacagc aggccagcaa caacgctcaa 6120

5 acacaacgtg tgacttattt gccgaactta gaacttcgtc taacacaaaa cagcacggcc 6180

acaaccgaag atttgcaagt tatcaccgta ggcgaagcgg gccgggcaca ggtacgagta 6240

ttacattggg agagcggtaa accggaagat atcgacaata atcagttgcg ttatagttac 6300

gataatctta tcggttccag tcaacttgaa ttâgatagcg aaggacaaat tatcagtgaa 6360

gaagaatatt atccctatgg tggaacagca ttatgggccg ccaggaatca gacagaagcc 6420

10 agttataaaa ctatccgtta ttcaggcaaa gagcgggatg ccaccgggct atattactac 6480

ggctatcggt attaccaacc gtggatagga cggtggttaa gctccgatcc ggcaggaaca 6540

atcgatgggc tgaatttata tcggatggtg aggaataatc cagttaccct ccttgatcct 6600

gatggattaa tgccaacaat tgcagaacgc atagcagcac taaaaaaaaa taaagtaaca 6660

gactcagcgc cttcgccagc aaatgccaca aacgtagcga taaacatccg cccgcctgta 6720

15 gcaccaaaac ctagcttacc gaaagcatca acgagtagcc aaccaaccac acaccctatc 6780

ggagctgcaa acataaaacc aacgacgtct gggtcatcta ttgttgctcc attgagtcca 6840

gtaggaaata aatctacttc tgaaatctct ctgccagaaa gcgctcaaag cagttcttca 6900

agcactacct cgacaaatct acagaaaaaa tcatttactt tatatagagc agataacaga 6960

tcctttgaag aaatgcaaag taaattccct gaaggattta aagcctggac tcctctagac 7020

20 actaagatgg caaggcaatt tgctagtatc tttattggtc agaaagatac atctaattta 7080

cctaaagaaa cagtcaagaa cataagcaca tggggagcaa agccaaaact aaaagatctc 7140

tcaaattaca taaaatatac caaggacaaa tctacagtat gggtttctac tgcaattaat 7200

actgaágcag gtggacaaag ctcaggggct ccactccata aaattgatat ggatctctac 7260

gagtttgcca ttgatggaca aaaactaaat ccactaccgg agggtagaac taaaaacatg 7320

"25 gtaccttccc ttttactcga caccccacaa atagagacat catccatcat tgcacttaat 7380

catggaccgg taaatgatgc agaaatttca tttctgacaa caattccgct taaaaatgta 7440

aaacctcata agagataã 7458 <210> 22

30 <212> PRT <213> Seqi <220><223> 8883 proteína de fusão TcplGzB/TccC3

<400> 22

Met Ser Thr Leu Ser Ser Arg Pro Gly Asp Pro Arg Ala Leu His Ser

1 5 10 15

Gly Gln Asn Asn Gly Ala Pro Glu Thr Leu Thr Asn Ser Lys Ser Asn

20 25 30

Ala Thr Leu Ser Gly Asn Arg Thr Thr Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ser

35 40 45

Phe Ala Pro Gln Vai Arg Thr Leu Gly Glu Gly lie Pro Gly Phe Arg

50 55 60

Thr Ser Phe Asn Vai Ala Gly Lys Gly Gly Gly Ala Phe Arg Ser lie 65 70 75 80

Ser Glu Asp Phe Glu Vai Ser Pro Ala Asn Gly Thr Met Ser Leu Ala

85 90 95

lie Pro Vai Arg Thr Ser Pro Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Asp Leu

100 105 110

Lys Leu Ser Tyr Asp Ser Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Gly Phe Gly

115 120 125

Trp Ser Met Ser Met Pro Ser lie His Arg Lys Thr Thr His Ala lie

130 135 140

Pro Arg Tyr Vai Asp Asp Glu Asp Asp Phe Leu Met Ser Gly Gly Asp 145 150 155 160

lie lie Lys Arg Leu Asn Ser Glu Gly lie Gln Glu Thr Arg Asn Glu

165 170 175

Ser Gly lie Cys Gly Lys Phe Leu Vai Thr Thr Tyr Arg Pro Arg Vai

180 185 190

Asp Ser Gly Asn lie Arg lie Glu Arg Trp Vai Arg Arg Glu Asp Leu

195 200 205

Glu Asp Vai His Trp Arg Thr lie Ser Ser Ser Asn Glu Thr Lys lie

210 215 220

Tyr Gly Asp Ser Asp Ser Ser Arg lie Phe Asp Ala Ser Gly Pro Ser 225 230 235 240Lys Arg lie Phe

Asn Ala lie Glu 260

Asp Ala Thr Gly 275

Ala Arg Tyr Arg 290

Lys Pro Asn Arg

305-

Glu Trp Met Phe

Ser Pro Ser Thr 340

Phe Ser Gln Ser 355

Arg Arg Vai Leu 370

Glu Thr Phe Vai 385

Arg Thr Vai Leu

Asp Asn Asn Asp 420

Trp Ser Phe Glu 435

Met Glu Ala Lys 450

Arg Vai Ser Glu 465Leu Thr Arg Ser

Ser Trp Leu Leu 245

Tyr Vai Tyr Lys

Ala Met Pro Vai 280

Glu Arg Tyr lie 295

Asp Leu Thr Thr 310

Glu Vai Vai Phe 325

Glu Glu Ser His

Arg Pro Gly Phe 360

Met Phe His His 375

Phe Ser Thr Asp 390

Ala Ser Leu Vai 405

Gly Lys Gln Arg

Tyr Thr Ser Ser 440

Thr Phe Asn Leu 455

Trp Leu Asp Leu 470

Vai Asp Gly Ala 485

237

Ser Arg Ser Tyr 250

Glu Glu Asp Ser 265

Trp Glu Lys Asn

Lys Arg Vai Lys 300

Trp Glu Vai Ser 315

Asp Tyr Gly Glu 330

Ser Trp Pro Vai 345

Glu lie Arg Thr

Phe Pro Glu His 380

Leu Gln Tyr Asn 395

Ala Thr Gly Tyr 410

Tyr Arg Ser Glu 425

Pro Glu Ala Ser

Leu Glu Leu Pro 460

Asp Gly Asp Gly 475

Leu Tyr Tyr Gln 490

Asp Ala Ser Gly 255

Leu Gly lie Ser

■ 270 Arg Glu Gln Asp 285

Tyr Gly Asn Arg

Asp Trp Pro Glu 320

His Asp Lys Gly 335

Arg Gln Asp Vai 350

Tyr Arg Leu Cys 365

Thr Gln Glu Ser

Glu Ser Arg Gln 400

Ser Ser Tyr Lys 415

Ser Leu Pro Pro 430

Glu lie Glu Leu 445

Thr Ser Asp Ala

Met Pro Gly Leu 480

Arg Asn Leu Gly 495Ser Gly Asp Asp Asp Pro Gln Phe Cys Gly Pro Vai Leu Leu

500 505 510

Ala Gln Gln Pro Ser Met Thr Gly Gly Thr Phe Gln Asp Leu Asp Arg

515 520 525

Asn Gly Asn Leu Asn Tyr Vai Leu Arg Asn Glu His Gly His Leu Glu

530 535 540

Gly Tyr Tyr Glu Arg Gly Asn Ser Asp Thr Trp Lys Asn Tyr lie Glu 545 550 555 560

Phe Pro Glu Thr Ser Asn Gly Asp lie Trp Gln Ser Thr lie Asp lie

565 570 575

Asp Leu Thr Gly Asp Gly His Pro Asp Leu lie Cys Ala Ala Asp Asp

580 585 590

Ser Gln Vai Leu lie Trp Gln Gln Asn Leu Gly Lys Lys Gly Leu Ser

595 600 605

Ser Tyr Gln Arg Vai lie Cys Gly His Asp Trp Glu Ser Cys Pro Arg

610 615 620

Leu lie Lys Asn Gln Asp Vai Gln Thr Tyr Vai Gly Asp Met Thr Gly 625 630 635 640

Ser Gly Met Ser Asp Leu Vai Glu lie Ser Vai Ser Ser Vai Arg Tyr

645 650^ 655

Trp Pro Asn Leu Gly Tyr Gly Thr Phe Gly Ala Ala Vai Asp Met Gly

660 665 670

Asn Pro Pro Ala Phe Ala Ala Lys Asp Tyr Phe Asp His Ser Arg Vai

675 680 685

Arg Leu Met Asp Thr Asp Gly Ser Gly Thr Met Asp. Leu Leu Tyr Ala

690 .695 700

Leu Pro Thr Gly Gly Ala Ala Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala Gly Asn Ser 705 710 715 720

Trp Ser Asn Met Vai Phe Leu Pro His Leu Pro Ala lie lie Thr Pro

725 730 735

Met Ser lie Phe Thr Leu Asp Leu lie Gly Lys Gly Ala Asp Cys Leu 740 745 750Cys Trp Ala Asp Thr Ser Thr Asp Gly Asn Arg lie Met Tyr Leu Asp

755 760 765

lie Thr Gly Glu Thr Lys Pro His Leu Leu Lys Ser Tyr Ser Asn Gly

770 775 780

Trp Gly Ala Thr Thr Ser Vai Asp Tyr Ala Pro Ser Thr Lys Phe Phe . 785 790 795 . 800

Ala Glu Asp Thr Arg Asn Gly His Pro Trp Ser Ser Lys Leu Pro Phe

805 810 815

Pro Vai Gln Cys Vai Ser Lys Vai Gln Vai Glu Asp Ala lie Thr Gly

820 825 830

Asn Arg Gln Ser Thr Glu Tyr lie Tyr His Asn Gly Cys Tyr Asn Pro

835 840 845

Thr Glu Lys Gln Phe Ser Gly Phe Glu Met Vai Glu Gln Phe Gln Ser

850 855 860

Glu Arg Vai lie Vai Gly Glu Asp Glu Thr Tyr Glu Pro Pro Vai Thr 865 870 875 880

His Thr Lys Ser Trp Phe Asn Vai Gly Leu Ser Leu Vai Vai Asp Glu

885 890 895

Ser Arg Phe Leu Thr Lys Pro Ala lie Leu Ser Ser Leu Gln Asp Tyr

900 905 910

His Thr Asp Pro Ala Glu Leu Vai Asn Ala Leu Lys Gly Leu Asn Vai

915 920 925

Arg Ser Glu lie Tyr Ser Gln Asp Gly Ser Pro Lys Ser His Leu Pro

930 935 940

Tyr Vai lie Lys Glu Vai Ser Tyr His Vai Lys lie Ser Gln Ala Arg 945 950 955 960

Asp Thr Asn Lys Tyr Ser Ala Vai Gln Vai Leu Pro Arg Glu Thr Phe

965 970 975

Ser Arg Ala Tyr Glu Arg Asp Met Ser Asp Pro Arg Vai Thr His Asp

980 985 990

Met Vai lie Lys Thr Asn Asp Phe Gly Asp Vai Glu Glu Ser Leu Ser 995 1000 1005lie Vai Tyr Pro Arg Ala Gly Lys Thr Thr Phe Glu Asp Vai Asn

1010 1015 1020

Lys Asn Gln Lys Ala Gly Asn Met Ser Tyr Thr Gln Asn Trp Tyr

1025 1030 1035

Thr Lys Met Vai Ser Glu Pro Glu Gln Glu His Phe Arg Lys Pro

1040 1045 1050

Ala Ala Tyr Arg Gln Gln Glu His Glu lie Leu Ser Phe Pro Phe

1055 1060 1065

Asn Gly Thr Leu Lys Phe Asp Asp Ala Leu Ala Phe Asn Phe Asn

1070 1075 1080

Gly Leu Pro Thr Thr Lys Cys Ser Lys Thr Trp Lys Ala Leu Arg

1085 1090 1095

Ser Glu Asn Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Gln Arg Arg

1100 1105 1110

Leu Asp Glu Gly Glu Leu Gln Thr Phe Ser Leu Leu Asp Gln Thr

1115 1120 1125

Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Pro Asp lie Leu Ala Lys Vai Glu lie

1130 1135 1140

Gly Leu Arg Asn Cys Asn Vai Pro Gly Ser Vai Glu Glu Leu Leu

1145 1150 1155

Thr Lys Gly Ser Tyr Vai Lys Leu Lys Asp Ser Asp Gly Trp Trp

1160 1165 1170

Ala Pro Ser Ser Gln Ser Phe Phe Cys Ser Ser Lys Thr Ala Ser

1175 1180 1185

Ala Ala Glu Glu Leu Lys Glu Ala Arg Lys Ser Phe Tyr Thr Pro

1190 1195 1200

Ser Arg Phe Vai Asp Leu Phe Gly Asn Ser Ser Arg Leu Asn Met

1205 1210 1215

Asp Lys Asp Phe Leu Leu Ala Thr Glu Vai Glu Asp Ala lie Gly

1220 1225 1230

Thr Ala Thr Ser Phe Lys Asn Ser Tyr Glu His Leu Gln Pro Vai

1235 1240 1245Glu lie lie Asp Ala Asn Ser Asn Ser Vai Gln Vai Vai Leu Asp

1250 1255 1260

Pro Leu Gly Glu Ser lie Ala Vai Ala Ala Ser Thr Arg Arg Asp

1265 1270 1275

Gly Vai lie Glu Glu lie Asp Ser Leu Glu Asn Met Vai Leu Asp

1280 1285 1290

Ala Ser Pro Glu Asp Vai Asp Asp lie Leu Arg Asp Pro Thr Gly

1295 1300 1305

Glu Vai Ser Thr Arg Leu Leu Gly Asn Ala Ala Ser Arg Thr lie

1310 1315 1320

His Tyr Arg Asp Arg Tyr Ala Gln Trp Lys Ser Arg Gln Asn Glu

1325 1330 1335

Thr Ser Thr Ser Vai Asp Pro Glu Pro Ala Leu Ser Leu Vai Leu

1340 1345 1350

Ser Arg Asp Leu Ser Phe Lys Glu Ser Ser Ser Pro Glu lie Arg

1355 1360 1365

Vai lie Vai Ser Tyr Met Asn Gly Leu Gly Ser Gln Tyr Gln Glu

1370 1375 1380

Gln His Leu Ser Asp Pro Thr Thr Leu Glu Lys Arg Trp Leu Vai

1385 1390 1395

Pro Gly Leu Ala lie Pro Asp Thr Gln Gly Gln Vai Vai Cys Thr

1400 1405 1410

Tyr Gln Pro Arg Phe Ala Thr Leu Ala Ala Pro lie Pro Ser Ser

1415 1420 1425

Leu Met Lys Thr Asn Ala Ala Phe Thr Phe Tyr Asp Ala Met Gly

1430 1435 1440

Arg Asn Vai Ala Ser Leu Ala Ala Asp Cys Thr Trp Ser Lys Thr

1445 1450 1455

Vai Tyr Thr Pro Trp Thr Thr Vai Glu His Gly Ala Gly Ser Met

1460 1465 1470

Vai Leu Gln Ser Asn Ala Arg Asp Asp Pro Asp Vai Gly His Phe

1475 1480 1485Phe Ser Arg lie Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gln Ser Trp Tyr Asp

1490 1495 1500

Lys Arg Lys Leu Gly Thr Ala Gln Glu Gly Ser Asp Asn Lys Gly

1505 1510 1515

Gln Thr lie Arg Thr Arg Pro Met Lys Asn lie Asp Pro Lys Leu

1520 1525 1530

Tyr Gln Lys Thr Pro Thr Vai Ser Vai Tyr Asp Asn Arg Gly Leu

1535 1540 1545

lie lie Arg Asn lie Asp Phe His Arg Thr Thr Ala Asn Gly Asp

1550 1555 1560

Pro Asp Thr Arg lie Thr Arg His Gln Tyr Asp lie His Gly His

1565 1570 1575

Leu Asn Gln Ser lie Asp Pro Arg Leu Tyr Glu Ala Lys Gln Thr

1580 1585 1590

Asn Asn Thr lie Lys Pro Asn Phe Leu Trp Gln Tyr Asp Leu Thr

1595 1600 1605

Gly Asn Pro Leu Cys Thr Glu Ser lie Asp Ala Gly Arg Thr Vai

1610 1615 1620

Thr Leu Asn Asp lie Glu Gly Arg Pro Leu Leu Thr Vai Thr Ala

1625 1630 1635

Thr Gly Vai lie Gln Thr Arg Gln Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Pro

1640 1645 1650

Gly Arg Leu Leu Ser Vai Ala Glu Gln Thr Pro Glu Glu Lys Thr

1655 1660 1665

Ser Arg lie Thr Glu Arg Leu lie Trp Ala Gly Asn Thr Glu Ala

1670 1675 1680

Glu Lys Asp His Asn Leu Ala Gly Gln Cys Vai Arg His Tyr Asp

1685 1690 1695

Thr Ala Gly Vai Thr Arg Leu Glu Ser Leu Ser Leu Thr Gly Thr

1700 1705 1710

Vai Leu Ser Gln Ser Ser Gln Leu Leu lie Asp Thr Gln Glu Ala

1715 1720 1725Asn Trp Thr Gly Asp 1730

Asp Asp lie Tyr Thr 1745

Leu Leu Thr Gln Thr 1760

Tyr Asp Vai Ala Gly 1775

Gly Gln Thr Glu Gln 1790

Ala Gly Gln Lys Leu 1805

Glu Tyr Ser Tyr Glu 1820

Thr Arg Arg Pro Ser

1835 . Glu Tyr Asp Pro Vai

1850

Glu Ala Thr Arg Phe 1865

Thr Tyr Thr Tyr Asp 1880

Arg Glu Met Ala Asn 1895

Pro Ala Leu Pro Ser 1910

Thr Tyr Thr Tyr Asp 1925

Ser Ser Pro Ala Thr 1940

Ser Asn Arg Ser Asn 1955

243

Asn Glu Thr Vai Trp 1735

Thr Leu Ser Thr Phe 1750

Asp Ala Lys Gly Asn 1765

Gln Leu Asn Gly Ser 1780

Vai lie lie Lys Ser 1795

Arg Glu Glu His Gly 1810

Pro Glu Thr Gln Arg 1825

Asp Thr Lys Vai Leu 1840

Gly Asn Vai lie Ser 1855

Trp His Asn Gln Lys 1870

Ser Leu Tyr Gln Leu 1885

lie Gly Gln Gln Ser 1900

Asp Asn Asn Thr Tyr 1915

Arg Gly Gly Asn Leu 1930

Gln Asn Asn Tyr Thr 1945

Arg Ala Vai Leu Ser 1960

Gln Asn Met Leu Ala 1740

Asp Ala Thr Gly Ala 1755

lie Gln Arg Leu Ala 1770

Trp Leu Thr Leu Lys 1785

Leu Thr Tyr Ser Ala 1800

Asn Asp Vai lie Thr 1815

Leu lie Gly lie Lys 1830

Gln Asp Leu Arg Tyr 1845

lie Arg Asn Asp Ala 1860

Vai Met Pro Glu Asn 1875

lie Ser Ala Thr Gly 1890

His Gln Phe Pro Ser 1905

Thr Asn Tyr Thr Arg 1920

Thr Lys lie Gln His 1935

Thr Asn lie Thr Vai 1950

Thr Leu Thr Glu Asp 1965Pro Ala Gln Vai Asp Ala Leu Phe Asp Ala Gly Gly His Gln Asn

1970 1975 1980

Thr Leu lie Ser Gly Gln Asn Leu Asn Trp Asn Thr Arg Gly Glu

1985 1990 1995

Leu Gln Gln Vai Thr Leu Vai Lys Arg Asp Lys Gly Ala Asn Asp

2000 2005 2010

Asp Arg Glu Trp Tyr Arg Tyr Ser Gly Asp Gly Arg Arg Met Leu

2015 2020 2025

Lys lie Asn Glu Gln Gln Ala Ser Asn Asn Ala Gln Thr Gln Arg

2030 2035 2040

Vai Thr Tyr Leu Pro Asn Leu Glu Leu Arg Leu Thr Gln Asn Ser

2045 2050 2055

Thr Ala Thr Thr Glu Asp Leu Gln Vai lie Thr Vai Gly Glu Ala

2060 2065 2070

Gly Arg Ala Gln Vai Arg Vai Leu His Trp Glu Ser Gly Lys Pro

2075 2080 2085

Glu Asp lie .Asp Asn Asn Gln Leu Arg Tyr Ser Tyr Asp Asn Leu

2090 2095 2100

lie Gly Ser Ser Gln Leu Glu Leu Asp Ser Glu Gly Gln lie lie

2105 2110 2115

Ser Glu Glu Glu Tyr Tyr Pro Tyr Gly Gly Thr Ala Leu Trp Ala

2120 2125 2130

Ala Arg Asn Gln.Thr Glu Ala Ser Tyr Lys Thr lie Arg Tyr Ser

2135 2140 . 2145

Gly Lys Glu Arg Asp Ala Thr Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Arg

2150 2155 2160

Tyr Tyr Gln Pro Trp lie Gly Arg Trp Leu Ser Ser Asp Pro Ala

2165 2170 2175

Gly Thr lie Asp Gly Leu Asn Leu Tyr Arg Met Vai Arg Asn Asn

2180 2185 2190

Pro Vai Thr Leu Leu Asp Pro Asp Gly Leu Met Pro Thr lie Ala

2195 2200 2205Glu Arg lie Ala Ala Leu Lys Lys Asn Lys Vai Thr Asp Ser Ala

2210 2215 2220

Pro Ser Pro Ala Asn Ala Thr Asn Vai Ala lie Asn lie Arg Pro

2225 2230 2235

Pro Vai Ala Pro Lys Pro Ser Leu Pro Lys Ala Ser Thr Ser Ser

2240 2245 2250

Gln Pro Thr Thr His Pro lie Gly Ala Ala Asn lie Lys Pro Thr

2255 2260 2265

Thr Ser Gly Ser Ser lie Vai Ala Pro Leu Ser Pro Vai Gly Asn

2270 2275 2280

Lys Ser Thr Ser Glu lie Ser Leu Pro Glu Ser Ala Gln Ser Ser

2285 2290 2295

Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr Asn Leu Gln Lys Lys Ser Phe Thr

2300 2305 2310

Leu Tyr Arg Ala Asp Asn Arg Ser Phe Glu Glu Met Gln Ser Lys

2315 2320 2325

Phe Pro Glu Gly Phe Lys Ala Trp Thr Pro Leu Asp Thr Lys Met

2330 2335 2340

Ala Arg Gln Phe Ala Ser lie Phe lie Gly Gln Lys Asp Thr Ser

2345 2350 2355

Asn Leu Pro Lys Glu Thr Vai Lys Asn lie Ser Thr Trp Gly Ala

2360 2365 2370

Lys Pro Lys Leu Lys Asp Leu Ser Asn Tyr lie Lys Tyr Thr Lys

2375 2380 2385

Asp Lys Ser Thr Vai Trp Vai Ser Thr Ala lie Asn Thr Glu Ala

2390 2395 2400

Gly Gly Gln Ser Ser Gly Ala Pro Leu His Lys lie Asp Met Asp

2405 2410 2415

Leu Tyr Glu Phe Ala lie Asp Gly Gln Lys Leu Asn Pro Leu Pro

2420 2425 2430

Glu Gly Arg Thr Lys Asn Met Vai Pro Ser Leu Leu Leu Asp Thr

2435 2440 2445Pro Gln lie Glu Thr Ser Ser lie lie Ala Leu Asn His Gly Pro

2450 2455 2460

Vai Asn Asp Ala Glu lie Ser Phe Leu Thr Thr lie Pro Leu Lys

2465 2470 2475

Asn Vai Lys Pro His Lys Arg

2480 2485 <210> 23 <211> 7432 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de DNA de plantas otimizadas codificando vairação de

proteína de fusão Classe B/Classe C TcplGz de Gibberella zeae <400> 23

ccatggcttc aaccctctcc tctcgtcctg gtgacccaag ggcactccac tctggtcaga 60 acaatggtgc cccagagact ttgaccaact caaagtccaa tgcaaccctt tctggcaaca 120 gaacaactgc cccagcctct gcaagctcat ttgctcccca agtcagaaca ttgggtgaag 180 gcatccctgg gttccgcacc agcttcaatg ttgctggcaa aggtggaggt gctttccgca 240 gcatctctga ggactttgaa gtttccccag ccaatggcac catgagcttg gccatcccag 300 tgaggacctc tcccacccgt ggtggatatg gaccagacct caaactcagc tatgattctg 360 gctctggaaa tggccctttt ggctttggat ggagcatgtc catgcccagc atacacagaa 420 agacaactca tgccattccc agatatgttg acgatgagga tgacttcctc atgtctggtg 480 gagacattat caaaaggttg aactctgagg gtattcaaga gactcgcaat gagtctggaa 540 tctgtgggaa gttccttgtg acaacctaca gacctcgtgt ggactctggg aacattcgca 600 tagagcgctg ggtgagaagg gaggatcttg aagatgtcca ctggaggaca atcagctcat 660 ccaatgagac caaaatctat ggtgattctg attcctctcg catctttgac gcatctggtc 720 caagcaaacg catcttcagc tggctccttt caaggagcta tgacgcctct gggaatgcca 780 tagagtatgt ttacaaagag gaagatagcc tcgggatttc tgatgcaact ggagccatgc 840 cagtgtggga gaagaacaga gagcaagatg ctcgctaccg tgaacgttac atcaagaggg 900 tcaagtatgg aaaccgcaaa cccaaccgtg atctcaccac ttgggaggtc tcagattggc 960 ctgaagagtg gatgtttgag gtggtctttg actatggtga acatgacaag ggatcaccca 1020 gcacagaaga gagccactca tggcctgtga ggcaagatgt tttctcccag tcacgccctg 1080ggtttgagat tcgcacttac cgcctttgcc gcagagtgtt gatgttccat cacttcccag 1140

agcacaccca agagtctgaa acttttgtct tttctactga ccttcagtac aatgagtccc 1200

gtcaaaggac tgtcttggct tcccttgtgg ccactggcta cagctcatac aaggacaaca 1260

atgatggcaa gcagagatac cgctctgaga gcctccctcc ctggtccttt gagtacacct 1320

5 ccagcccaga ggcatctgag attgaattga tggaagccaa gaccttcaac ttgcttgagc 1380

ttcccacctc tgatgcaagg gtctcagagt ggcttgactt ggatggtgat gggatgcctg 1440

gcttgctcac cagatcagtg gatggagccc tttactatca gaggaacctt ggctccatct 1500

ctggtgatga cgatccacag ttctgtggac cagtgctctt ggctcagcag ccctccatga 1560

ctggtgggac cttccaagac ttggaccgca atggcaacct caactatgtc ttgaggaacg 1620

10 aacatgggca tcttgaaggt tactatgaac gtggaaactc agacacatgg aagaactaca 1680

ttgagttccc tgagacctcc aatggtgaca tctggcagtc caccatagac attgacctca 1740

ctggtgatgg ccatcccgat ctcatttgtg ccgcagatga cagccaagtg ctcatctggc 1800

aacagaacct tgggaagaaa ggtctcagct cctaccagag ggtgatctgc ggacatgact 1860

gggaatcctg cccaaggctc atcaagaacc aggatgtgca gacctatgtg ggagacatga 1920

15 caggttctgg aatgtctgac cttgttgaaa tctctgtcag ctctgtgcgt tactggccca 1980

accttggtta tgggacattt ggtgcagctg ttgacatggg gaaccctcca gcttttgctg 2040

ccaaggacta ctttgatcac tcaagagtcc gcctcatgga cactgatggg tctggcacaa 2100

tggacttgct ctatgctctc cccactggtg gagctgccct ctactacaac ttggctggca 2160

acagctggtc caacatggtg ttcctcccac acttgcctgc catcatcaca ccaatgtcca 2220

20 tcttcacctt ggatctcatt gggaaaggag ctgactgcct ttgctgggca gacacctcaa 2280

cagatgggaa ccgcataatg tacctcgaca tcactggtga gaccaagcca catcttctca 2340

agtcctacag caatggctgg ggtgccacca catctgtgga ctatgcccct tccaccaaat 2400

tctttgctga agatacaagg aatggtcatc cctggtcctc aaaactccca ttccctgtgc 2460

agtgtgtgtc caaggtccaa gttgaggacg ccatcactgg caacagacag tccaccgagt 2520

•25 acatctacca caatggctgc tacaacccca ctgaaaagca gttctctggc tttgaaatgg 2580

ttgagcagtt ccagtctgag agggtgattg tgggagaaga tgagacttac gagcctccag 2640

tcacacacac caaatcatgg ttcaatgttg gcctctcact tgtggttgat gagtccagat 2700

tcttgaccaa gccagccatc ttgtccagcc tccaagacta ccacactgac ccagctgagc 2760

ttgtcaatgc tctcaaagga ctcaacgtga ggtctgagat atactcccaa gatggcagcc 2820

30 ccaagagcca tctcccctat gtcatcaagg aggtctccta ccatgtcaag atttcccaag 2880

caagggacac aaacaaatac tccgctgttc aagttttgcc aagggagact ttctccagag 2940

cttacgaaag ggacatgtca gacccaaggg tgacccatga catggtgatc aagaccaatg 3000actttgggga tgttgaagag agcctttcaa ttgtctaccc acgtgctggc aagactacct 3060

ttgaggatgt caacaagaac cagaaagctg ggaacatgtc atacacacag aactggtaca 3120

caaagatggt ctcagagcca gaacaagagc acttccgcaa accagcagcc tacagacagc 3180

aagagcatga gattctcagc ttccccttca atgggacctt gaagtttgat gacgcacttg 3240

ccttcaactt caatgggttg ccaacaacta aatgctccaa gacctggaag gccctcagat 3300

cagagaacaa ggccttctac aaggactccc ttctccagag aaggttggat gaaggtgagt 3360

tgcagacctt ctcactcttg gaccagactt atgcccttgc tttcacccct gacattcttg 3420

ccaaagttga gattggattg aggaactgca atgtgcctgg ctcagtggaa gagcttctca 3480

caaagggaag ctacgtcaag ctcaaggatt cagatggatg gtgggcacct tcctctcagt 3540

cattcttctg tagctccaag acagcatccg cagctgagga actcaaggag gcaaggaaga 3600

gcttctacac tccctcaagg tttgttgact tgtttggaaa cagctcacgt ctcaacatgg 3660

acaaggactt cctcttggcc actgaggtgg aagatgcaat aggcactgca acatcattça 3720

agaactccta tgaacacctt cagccagttg agatcattga tgccaacagc aacagcgttc 3780

aagttgtcct tgacccactt ggtgagagca ttgctgttgc tgcatccacc agacgtgatg 3840

gagtcataga agagattgat tcacttgaga acatggtgtt ggatgccagc ccagaagatg 3900

ttgatgacat cctcagagac cccactggag aggtctccac aaggcttttg ggcaatgctg 3960

catcccgcac aatccactac agagaccgct atgctcagtg gaaatcacgt cagaatgaga 4020

catccacctc tgtggaccca gagcctgctc tcagccttgt gttgtcacgt gacttgagct 4080

tcaaggaatc ctcatcccca gaaatccgcg tcattgtttc ctacatgaat ggccttgggt 4140 cacagtacca agaacagcac ctctcagatc caaccacatt ggaaaagcgt tggttggtgc 4200 ctggccttgc catcccagac actcaaggac aagttgtctg cacataccag cctaggtttg 4260

ccaccttggc tgcacccatt ccttccagct tgatgaaaac caatgctgcc ttcacattct 4320

atgatgcaat gggacgcaat gtggccagcc ttgcagctga ctgcacttgg agcaagacag 4380

tctacactcc ttggacaact gtcgagcatg gcgctggttc tatggttctt cagtccaatg 4440

caagggatga cccagatgtg ggacactttt tctctcgcat agcatcatca cgctactccc 4500

agtcctggta tgacaagcgc aagttgggca ctgctcaaga gaaaagagcc gcggagaagt 4560

ctgctgttta ctctgacacc cccttgacca ctcactctgg aagctgtggt ctccctgtca 4620

gaaccatcca gcaagctggt ggcaaaactt acaccagatc atccatgtat gatgtttctg 4680

gcaacagaat cagagatgtg gactcttacg aaaggactgt tgagaagatg ttgtatgaca 4740

agttgggaag gcaattgcag actaccggta tggattgtgg agagtcatgg ttgctcttgg 4800

atgcacaagg tggagagatc ctttcatgga attgcagagg ctacagcttc atcacacgct 4860

atgatcctct cagaagggag actgaaaggc tcgttgccaa ggcagctgaa atgccaaagt 4920tgatttcaag gatcacctat ggggagactt gccaagtgtg gaaggttgag gatcaagctg gtggtcactg ccttggaaag acccttcagt ggaagttgga ccaaaccctt gagactgagg atggtcaagt tttgcaagaa gaggatgagc gacaaggaca cgtagtttct gtggatttct acttgtctgg agccacattc tcagcagatg gtgtggtctc agactttttc tacgacgatg caaggccttg cagaggtcgc agagaactcc

ttggaaggcg catattcact tctgatggtt gtgtcaaacc tgaatgggat tacacataca gtcgtgctca gctttctggc aagattggca tgaatggtct caaccccagc agaggtggag aaacttacga ttatgatcgt gagggcaaca

tcaaaggggt gacaagctgg acaaggaatt atgaccctcg tgtgaaatcc aatcgtttga ggaagtacat gtatgaaggt tcagctggac tctcagaact tgactggaac atgaacaaca atgctggcac tcccgaaaga acttactatg

aggtgactga gactgctgcc aagtctgggg tctttggtgg agttgagctt cagaccaaat tcaaggggga tggaatagtg gctgtggttg ttcgcttcca agctggcaga gacatggagt aggaatactc ccccttcgga gctgttgtgt

ccagagctta ccgttttgca cgttatgagc ggcagcgcta ctactgtcct tggcttggga ttgatgggcc aaacttgttt gtctatgtca ctggcacctc tggaaagaaa actaaggagg accaagggaa gaggcgtctt gttgatgaga

atgagaggaa actccagcgc caagagagga gaacagatcc cattcttggc tctcgtgccc atgcacttgg aagaatttct ggaagcacag

gtggggatgc catcaacctc aacctcaatg 4980

gggtccacat caacacacat tacaacatcc 5040

tcaccaaaga gtacaagcag ttggtggatt 5100

tttacccaca cacctacttc tacgacaact 5160

aaggcaacag aacccgtegc aactacagca 5220

ccagcatcaa gggaagggac tggaaatcct 5280

gtttgcccat caccatcaag tatggcaatg 5340

aatctaggaa cctcatttct cagagaacca 5400

ttcaagacag aacccatgtt tatgactacg 5460

cagagcaagt caaatacttt ggagagagcc 5520

acgccactgg tgctcttgtc attgccactg 5580

atggcaacca gctcactcct cacaatgcca 5640

gtgatggcaa ccttttgtac cagtacagag 5700

tattgatgat gaagcacgaa gctcctgaca 5760

accactacga cgaaaagtcc cttctctcag 5820

gcagaaccag cattggtgac accaatgagg 5880

tttctggttg catcaccact cttccaaagt 5940

tgctctcatt ctccagcact cagtatgtga 6000

tctatgacca tgctggcaat cgtgtgagaa 6060

aggaaccaag gaaacagagg gacacacttt 6120

caaatggcag ccttctctgg acaactcgtg 6180

aggtgaacag aaatcaagag acacccttgg 6240

ttgatgacca agcccagctc ataagctacg 6300

acgctgccat gtatggcaac attgaggctc 6360

atgacagcga aactggcttg taccactgtg 6420

ggtggacctc ccctgatcca cttggagatg 6480

acaatgatcc agtgaactca catgacccat 6540

gcacccgtga gatgtatgca gcccctgatg 6600

acaaagcagt tgctgatcgc attgccaagt 6660

aacagcaaag agccattgct cgcatgtctg 6720

gttatgcagt tggaatagct gcaatgggaa 6780

aacttcatca cacctaccct caagagtacc 6840gtgaagagtt ctctgacatt gacatcaatg ttgatcgcac atctgtcagc atttccaagg 6900 aagcccacta catctgcacc tatggctcaa tccttgacaa ccttgttgcc acaaacaaga 6960 ggtggaagtc agaatacttt gacaccccag acactggtta ctatgaacaa atggagcagc 7020 atgaatggta tgatgacgat cctggaatgc aatatgccat aaggctccac ttggcctatg 7080 aagcacgcac actcaatggc aaaatcatgg cagactttgg gattaaccca aagggagagg 7140 atggaaggtc aatgtttgtc aactatgatg cagtgacaaa gatgaggact gctggccaaa 7200 ggagaggtgt gaggaatgac aacctcatcc atcacgaaac ttggcctggg aggcctttca 7260 acactggcaa ctccgacact gacaatgctg gtggccctgt ccacttccaa gttgctgagg 7320 aacagtacaa tggccttgat gcagatgccc aagccaagtt tgatgacctt cgcaaccaga 7380

tggaagccct tttgggaaag agatgagtag ttagcttaat cacctagagc tc 7432 <210> 24 <211> 2467 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Variação de proteína de fusão Classe B/Classe C TcplGz codifica-

do por SEQ ID NO:17 <400> 24

Met Ala Ser Thr Leu Ser Ser Arg Pro Gly Asp Pro Arg Ala Leu His 20 1 5 10 15

Ser Gly Gln Asn Asn Gly Ala Pro Glu Thr Leu Thr Asn Ser Lys Ser25 30

Asn Ala Thr Leu Ser Gly Asn Arg Thr Thr Ala Pro Ala Ser Ala Ser 35 40 45

Ser Phe Ala Pro Gln Vai Arg Thr Leu Gly Glu Gly lie Pro Gly Phe 50 55 60

Arg Thr Ser Phe Asn Vai Ala Gly Lys Gly Gly Gly Ala Phe Arg Ser 65 70 75 80

lie Ser Glu Asp Phe Glu Vai Ser Pro Ala Asn Gly Thr Met Ser Leu 30 .85 90 95

Ala lie Pro Vai Arg Thr Ser Pro Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Pro Asp 100 105 HOLeu Lys Leu Ser 115

Gly Trp Ser Met 130

lie Pro Arg Tyr 145

Asp lie lie Lys

Glu Ser Gly lie 180

Vai Asp Ser Gly 195

Leu Glu Asp Vai 210

lie Tyr Gly Asp 225

Ser Lys Arg lie

Gly Asn Ala lie 260

Ser Asp Ala Thr 275

Asp Ala Arg Tyr 290

Arg Lys Pro Asn 305

Glu Glu Trp Met

Gly Ser Pro Ser 340

Vai Phe Ser Gln 355

Tyr Asp Ser Gly 120

Ser Met Pro Ser 135

Vai Asp Asp Glu 150

Arg Leu Asn Ser 165

Cys Gly Lys Phe

Asn lie Arg lie 200

His Trp Arg Thr 215

Ser Asp Ser Ser 230

Phe Ser Trp Leu 245

Glu Tyr Vai Tyr

Gly Ala Met Pro 280

Arg Glu Arg Tyr 295

Arg Asp Leu Thr 310

Phe Glu Vai Vai 325

Thr Glu Glu Ser

Ser Arg Pro Gly 360

Ser Gly Asn Gly

lie His Arg Lys 140

Asp Asp Phe Leu 155

Glu Gly lie Gln 170

Leu Vai Thr Thr 185

Glu Arg Trp Vai

lie Ser Ser Ser 220

Arg lie Phe Asp 235

Leu Ser Arg Ser 250

Lys Glu Glu Asp 265

Vai Trp Glu Lys

lie Lys Arg Vai 300

Thr Trp Glu Vai 315

Phe Asp Tyr Gly 330

His Ser Trp Pro 345

Phe Glu lie Arg

Pro Phe Gly Phe 125

Thr Thr His Ala

Met Ser Gly Gly 160

Glu Thr Arg Asn 175

Tyr Arg Pro Arg 190

Arg Arg Glu Asp 205

Asn Glu Thr Lys

Ala Ser Gly Pro 240

Tyr Asp Ala Ser 255

Ser Leu Gly lie 270

Asn Arg Glu Gln 285

Lys Tyr Gly Asn

Ser Asp Trp Pro 320

Glu His Asp Lys 335

Vai Arg Gln Asp 350

Thr Tyr Arg Leu 365Cys Arg Arg Vai Leu 370

Ser Glu Thr Phe Vai 385

Gln Arg Thr Vai Leu 405

Lys Asp Asn Asn Asp 420

Pro Trp Ser Phe Glu 435

Leu Met Glu Ala Lys 450

Ala Arg Vai Ser Glu 465

Leu Leu Thr Arg Ser 485

Gly Ser lie Ser Gly 500

Leu Ala Gln Gln Pro 515

Arg Asn Gly Asn Leu 530

Glu Gly Tyr Tyr Glu 545

Glu Phe Pro Glu Thr 565

lie Asp Leu Thr Gly 580

Asp. Ser Gln Vai Leu 595

Ser Ser Tyr Gln Arg 610

Met Phe His His Phe 375

Phe Ser Thr Asp Leu 390

Ala Ser Leu Vai Ala 410

Gly Lys Gln Arg Tyr 425

Tyr Thr Ser Ser Pro 440

Thr Phe Asn Leu Leu 455

Trp Leu Asp Leu Asp 470

Vai Asp Gly Ala Leu 490

Asp Asp Asp Pro Gln 505

Ser Met Thr Gly Gly 520

Asn Tyr Vai Leu Arg 535

Arg Gly Asn Ser Asp 550

Ser Asn Gly Asp lie 570

Asp Gly His Pro Asp 585

lie Trp Gln Gln Asn 600

Vai lie Cys Gly His 615

Pro Glu His Thr Gln Glu 380

Gln Tyr Asn Glu Ser Arg 395 400 Thr Gly Tyr Ser Ser Tyr 415

Arg Ser Glu Ser Leu Pro 430

Glu Ala Ser Glu lie Glu 445

Glu Leu Pro Thr Ser Asp 460

Gly Asp Gly Met Pro Gly 475 480 Tyr Tyr Gln Arg Asn Leu 495

Phe Cys Gly Pro Vai Leu 510

Thr Phe Gln Asp Leu Asp 525

Asn Glu His Gly His Leu 540

Thr Trp Lys Asn Tyr lie 555 560 Trp Gln Ser Thr lie Asp 575

Leu lie Cys Ala Ala Asp 590

Leu Gly Lys Lys Gly Leu 605

Asp Trp Glu Ser Cys Pro 620Arg Leu lie Lys 625

Gly Ser Gly Met

Tyr Trp Pro Asn 660

Gly Asn Pro Pro 675

Vai Arg Leu Met 690

Ala Leu Pro Thr 705

Ser Trp Ser Asn

Pro Met Ser lie 740

Leu Cys Trp Ala 755

Asp lie Thr Gly 770

Gly Trp Gly Ala 785

Phe Ala Glu Asp

Phe Pro Vai Gln 820

Gly Asn Arg Gln 835

Pro Thr Glu Lys 850

Ser Glu Arg Vai 865

Asn Gln Asp Vai 630

Ser Asp Leu Vai 645

Leu Gly Tyr Gly

Ala Phe Ala Ala 680

Asp Thr Asp Gly 695

Gly Gly Ala Ala 710

Met Vai Phe Leu 725

Phe Thr Leu Asp

Asp Thr Ser Thr 760

Glu Thr Lys Pro 775

Thr Thr Ser Vai 790

Thr Arg Asn Gly 805

Cys Vai Ser Lys

Ser Thr Glu Tyr 840

Gln Phe Ser Gly 855

lie Vai Gly Glu 870

Gln Thr Tyr Vai 635

Glu lie Ser Vai 650

Thr Phe Gly Ala 665

Lys Asp Tyr Phe

Ser Gly Thr Met 700

Leu Tyr Tyr Asn 715

Pro His Leu Pro 730

Leu lie Gly Lys 745

Asp Gly Asn Arg

His Leu Leu Lys 780

Asp Tyr Ala Pro 795

His Pro Trp Ser 810

Vai Gln Vai Glu 825

lie Tyr His Asn

Phe Glu Met Vai 860

Asp Glu Thr Tyr 875

Gly Asp Met Thr 640

Ser Ser Vai Arg 655

Ala Vai Asp Met 670

Asp His Ser Arg 685

Asp Leu Leu Tyr

Leu Ala Gly Asn 720

Ala lie lie Thr 735

Gly Ala Asp Cys 750

lie Met Tyr Leu 765

Ser Tyr Ser Asn

Ser Thr Lys Phe 800

Ser Lys Leu Pro 815

Asp Ala lie Thr 830

Gly Cys Tyr Asn 845

Glu Gln Phe Gln

Glu Pro Pro Vai 880Thr His Thr Lys Ser Trp Phe Asn Vai Gly Leu Ser Leu Vai Vai Asp

885 890 895

Glu Ser Arg Phe Leu Thr Lys Pro Ala lie Leu Ser Ser Leu Gln Asp

900 905 910

Tyr His Thr Asp Pro Ala Glu Leu Vai Asn Ala Leu Lys Gly Leu Asn

915 920 925

Vai Arg Ser Glu lie Tyr Ser Gln Asp Gly Ser Pro Lys Ser His Leu

930 935 940

Pro Tyr Vai lie Lys Glu Vai Ser Tyr His Vai Lys lie Ser Gln Ala 945 950 955 960

Arg Asp Thr Asn Lys Tyr Ser Ala Vai Gln Vai Leu Pro Arg Glu Thr

965 970 975

Phe Ser Arg Ala Tyr Glu Arg Asp Met Ser Asp Pro Arg Vai Thr His

980 985 990

Asp Met Vai lie Lys Thr Asn Asp Phe Gly Asp Vai Glu Glu Ser Leu

995 1000 1005

Ser lie Vai Tyr Pro Arg Ala Gly Lys Thr Thr Phe Glu Asp Vai

1010 1015 1020

Asn Lys Asn Gln Lys Ala Gly Asn Met Ser Tyr Thr Gln Asn Trp

1025 1030 1035

Tyr Thr Lys Met Vai Ser Glu Pro Glu Gln Glu His Phe Arg Lys

1040 1045 1050

Pro Ala Ala Tyr Arg Gln Gln Glu His Glu lie Leu Ser Phe Pro

1055 1060 1065

Phe Asn Gly Thr Leu Lys Phe Asp Asp Ala Leu Ala Phe Asn Phe

1070 1075 1080

Asn Gly Leu Pro Thr Thr Lys Cys Ser Lys Thr Trp Lys Ala Leu

1085 1090 1095

Arg Ser Glu Asn Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Gln Arg

1100 1105 1110

Arg Leu Asp Glu Gly Glu Leu Gln Thr Phe Ser Leu Leu Asp Gln

1115 1120 1125Thr Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Pr o Asp lie Leu Ala Lys Vai Glu

1130 1135 1140

lie Gly Leu Arg Asn Cys Asn Vai Pro Gly Ser Vai Glu Glu Leu

1145 1150 1155

Leu Thr Lys Gly Ser Tyr Vai Lys Leu Lys Asp Ser Asp Gly Trp

1160 1165 1170

Trp Ala Pro Ser Ser Gln Ser Phe Phe Cys Ser Ser Lys Thr Ala

1175 1180 1185

Ser Ala Ala Glu Glu Leu Lys Glu Ala Arg Lys Ser Phe Tyr Thr

1190 1195 1200

Pro Ser Arg Phe Vai Asp Leu Phe Gly Asn Ser Ser Arg Leu Asn

1205 1210 1215

Met Asp Lys Asp Phe Leu Leu Ala Thr Glu Vai Glu Asp Ala lie

1220 1225 1230

Gly Thr Ala Thr Ser Phe Lys Asn Ser Tyr Glu His Leu Gln Pro

1235 1240 1245

Vai Glu lie lie Asp Ala Asn Ser Asn Ser Vai Gln Vai Vai Leu

1250 1255 1260

Asp Pro Leu Gly Glu Ser lie Ala Vai Ala Ala Ser Thr Arg Arg

1265 1270 1275

Asp Gly Vai lie Glu Glu lie Asp Ser Leu Glu Asn Met Vai Leu

1280 1285 1290

Asp Ala Ser Pro Glu Asp Vai Asp Asp lie Leu Arg Asp Pro Thr

1295 1300 1305

Gly Glu Vai Ser Thr Arg Leu Leu Gly Asn Ala Ala Ser Arg Thr

1310 1315 1320

lie His Tyr Arg Asp Arg Tyr Ala Gln Trp Lys Ser Arg Gln Asn

1325 1330 1335

Glu Thr Ser Thr Ser Vai Asp Pro Glu Pro Ala Leu Ser Leu Vai

1340 1345 . 1350

Leu Ser Arg Asp Leu Ser Phe Lys Glu Ser Ser Ser Pro Glu lie

1355 1360 1365Arg Vai lie Vai Ser 1370

Glu Gln His Leu Ser 1385

Vai Pro Gly Leu Ala 1400

Thr Tyr Gln Pro Arg 1415

Ser Leu Met Lys Thr 1430`Gly Arg Asn Vai Ala 1445

Thr Vai Tyr Thr Pro 1460

Met Vai Leu Gln Ser 1475

Phe Phe Ser Arg lie 1490

Asp Lys Arg Lys Leu 1505

Lys Ser Ala Vai Tyr 1520

Ser Cys Gly Leu Pro 1535

Thr Tyr Thr Arg Ser 1550

Arg Asp Vai Asp Ser 1565

Asp Lys Leu Gly Arg 1580

Glu Ser Trp Leu Leu 1595

256

Tyr Met Asn Gly Leu 1375

Asp Pro Thr Thr Leu 1390

lie Pro Asp Thr Gln 1405

Phe Ala Thr Leu Ala 1420

Asn Ala Ala Phe Thr 1435

Ser Leu Ala Ala Asp 1450

Trp Thr Thr Vai Glu 1465

Asn Ala Arg Asp Asp 1480

Ala Ser Ser Arg Tyr 1495

Gly Thr Ala Gln Glu 1510

Ser Asp Thr Pro Leu 1525

Vai Arg Thr lie Gln 1540

Ser Met Tyr Asp Vai 1555

Tyr Glu Arg Thr Vai 1570

Gln Leu Gln Thr Thr 1585

Leu Asp Ala Gln Gly 1600

Gly Ser Gln Tyr Gln 1380

Glu Lys Arg Trp Leu 1395

Gly Gln Vai Vai Cys 1410

Ala Pro lie Pro Ser 1425

Phe Tyr Asp Ala Met 1440

Cys Thr Trp Ser Lys 1455

His Gly Ala Gly Ser 1470

Pro Asp Vai Gly His 1485

Ser Gln Ser Trp Tyr 1500

Lys Arg Ala Ala Glu 1515

Thr Thr His Ser Gly 1530

Gln Ala Gly Gly Lys 1545

Ser Gly Asn Arg lie 1560

Glu Lys Met Leu Tyr 1575

Gly Met Asp Cys Gly 1590

Gly Glu lie Leu Ser 1605Trp Asn Cys Arg Gly Tyr Ser Phe lie Thr Arg Tyr Asp Pro Leu

1610 1615 1620

Arg Arg Glu Thr Glu Arg Leu Vai Ala Lys Ala Ala Glu Met Pro

1625 1630 1635

Lys Leu lie Ser Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Cys Gly Asp Ala

1640 1645 1650

lie Asn Leu Asn Leu Asn Gly Gln Vai Trp Lys Vai Glu Asp Gln

1655 1660 1665

Ala Gly Vai His lie Asn Thr His Tyr Asn lie Arg Gly His Cys

1670 1675 1680

Leu Gly Lys Thr Leu Gln Phe Thr Lys Glu Tyr Lys Gln Leu Vai

1685 1690 1695

Asp Trp Lys Leu Asp Gln Thr Leu Glu Thr Glu Vai Tyr Pro His

1700 1705 1710

Thr Tyr Phe Tyr Asp Asn Tyr Gly Gln Vai Leu Gln Glu Glu Asp

1715 1720 1725

Glu Gln Gly Asn Arg Thr Arg Arg Asn Tyr Ser Arg Gln Gly His

1730 1735 1740

Vai Vai Ser Vai Asp Phe Ser Ser lie Lys Gly Arg Asp Trp Lys

1745 1750 1755

Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Thr Phe Ser Ala Asp Gly Leu Pro lie

1760 1765 1770

Thr lie Lys Tyr Gly Asn Gly Vai Vai Ser Asp Phe Phe Tyr Asp

1775 1780 1785

Asp Glu Ser Arg Asn Leu lie Ser Gln Arg Thr Thr Arg Pro Cys

1790 1795 1800

Arg Gly Arg Arg Glu Leu Leu Gln Asp Arg Thr His Vai Tyr Asp

1805 1810 1815

Tyr Vai Gly Arg Arg lie Phe Thr Ser Asp Gly Ser Glu Gln Vai

1820 1825 1830

Lys Tyr Phe Gly Glu Ser Arg Vai Lys Pro Glu Trp Asp Tyr Thr

1835 1840 1845Tyr Asn Ala Thr Gly Ala Leu Vai lie Ala Thr Gly Arg Ala Gln

1850 1855 1860

Leu Ser Gly Lys lie Gly Asn Gly Asn Gln Leu Thr Prp His Asn

1865 1870 1875

Ala Met Asn Gly Leu Asn Pro Ser Arg Gly Gly Gly Asp Gly Asn

1880 1885 1890

Leu Leu Tyr Gln Tyr Arg Glu Thr Tyr Asp Tyr Asp Arg Glu Gly

1895 1900 1905

Asn lie Leu Met Met Lys His Glu Ala Pro Asp lie Lys Gly Vai

1910 1915 1920

Thr Ser Trp Thr Arg Asn Tyr His Tyr Asp Glu Lys Ser Leu Leu

1925 1930 1935

Ser Asp Asp Pro Arg Vai Lys Ser Asn Arg Leu Ser Arg Thr Ser

1940 1945 1950

lie Gly Asp Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Met Tyr Glu Gly Ser Ala

1955 1960 1965

Gly Leu Ser Gly Cys lie Thr Thr Leu Pro Lys Phe Ser Glu Leu

1970 1975 1980

Asp Trp Asn Met Asn Asn Met Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Tyr

1985 1990 1995

Vai Asn Ala Gly Thr Pro Glu Arg Thr Tyr Tyr Vai Tyr Asp His

2000 2005 2010

Ala Gly Asn Arg Vai Arg Lys Vai Thr Glu Thr Ala Ala Lys Ser

2015 2020 2025

Gly Glu. Glu Pro Arg Lys Gln Arg Asp Thr Leu Phe Phe Gly Gly

2030 2035 2040

Vai Glu Leu Gln Thr Lys Ser Asn Gly Ser Leu Leu Trp Thr Thr

2045 2050 2055

Arg Vai Lys Gly Asp Gly lie Vai Ala Vai Vai Glu Vai Asn Arg

2060 2065 2070

Asn Gln Glu Thr Pro Leu Vai Arg Phe Gln Ala Gly Arg Asp Met

2075 2080 2085Glu Phe Asp Asp Gln Ala Gln Leu lie Ser Tyr Glu Glu Tyr Ser

2090 2095 2100

Pro Phe Gly Ala Vai Vai Tyr Ala Ala Met Tyr Gly Asn lie Glu

2105 2110 2115

Ala Pro Arg Ala Tyr Arg Phe Ala Arg Tyr Glu His Asp Ser Glu

2120 2125 2130

Thr Gly Leu Tyr His Cys Gly Gln Arg Tyr Tyr Cys Pro Trp Leu

2135 2140 2145

Gly Arg Trp Thr Ser Pro Asp Pro Leu Gly Asp Vai Asp Gly Pro

2150 2155 2160

Asn Leu Phe Vai Tyr Vai Asn Asn Asp Pro Vai Asn Ser His Asp

2165 2170 2175

Pro Ser Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Lys Glu Gly Thr Arg Glu

2180 2185 2190

Met Tyr Ala Ala Pro Asp Asp Gln Gly Lys Arg Arg Leu Vai Asp

2195 2200 2205

Glu Asn Lys Ala Vai Ala Asp Arg lie Ala Lys Tyr Glu Arg Lys

2210 2215 2220

Leu Gln Arg Gln Glu Arg Lys Gln Gln Arg Ala lie Ala Arg Met

2225 2230 2235

Ser Gly Thr Asp Pro lie Leu Gly Ser Arg Ala Arg Tyr Ala Vai

2240 2245 2250

Gly lie Ala Ala Met Gly Asn Ala Leu Gly Arg lie Ser Gly Ser

2255 2260 2265

Thr Glu Leu His His Thr Tyr Pro Gln Glu Tyr Arg Glu Glu Phe

2270 2275 2280

Ser Asp lie Asp lie Asn Vai Asp Arg Thr Ser Vai Ser lie Ser

2285 - 2290 2295

Lys Glu Ala His Tyr lie Cys Thr Tyr Gly Ser lie Leu Asp Asn

2300 2305 2310

Leu Vai Ala Thr Asn Lys Arg Trp Lys Ser Glu Tyr Phe Asp Thr

2315 2320 2325Pro Asp Thr Gly Tyr Tyr 2330

Asp Asp Asp Pro Gly Met 2345

Tyr Glu Ala Arg Thr Leu 2360

lie Asn Pro Lys Gly Glu 2375

Asp Ala Vai Thr Lys Met 2390

Arg Asn Asp Asn Leu lie 2405

Phe Asn Thr Gly Asn Ser 2420

His Phe Gln Vai Ala Glu 2435

Ala Gln Ala Lys Phe Asp 2450

Leu Gly Lys Arg

2465 <210> 25 <211> 9214 <212> DNA <213> Fusarium verticillioides

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> códon de Threonine que serve como o início da estrutura de lei-

tura aberta para a região codificada do primeiro segmento da proteína putativa deduzida Tc Classe A

<220>

<221> misc_feature

Glu Gln Met Glu Gln His Glu Trp Tyr

2335 2340

Gln Tyr Ala lie Arg Leu His Leu Ala

2350 2355

Asn Gly Lys lie Met Ala Asp Phe Gly

2365 2370

Asp Gly Arg Ser Met Phe Vai Asn Tyr

2380 2385

Arg Thr Ala Gly Gln Arg Arg Gly Vai

2395 2400

His His Glu Thr Trp Pro Gly Arg Pro

2410 2415

Asp Thr Asp Asn Ala Gly Gly Pro Vai

2425 2430

Glu Gln Tyr Asn Gly Leu Asp Ala Asp

2440 2445

Asp Leu Arg Asn Gln Met Glu Ala Leu

2455 2460<222> (3022)..(3024)

<223> códon AAA de lisina que serve como o inicio da estrutura de lei-

tua aberta para a segunda porção da proteína putativa deduzida Tc Classe A

<400> 25

tcgcgtctcg agcctcgtaa acgaacttgg aagagatttt gtgcagtgta tcactataca 60

atttcaccaa aacttccttt gccttcaatc agcaattgct cgctattgat tcagagcatt 120

cttttcacca actctattct atcaccatgg cgcaagtctc atctttggtt gctgccatgt 180

tccgtggaaa cgatgagcta gtgaccagag ttcaaactgc cattgagaca cgacatgatg 240

ttattgctgc cattgaagtc gttgttggtc agggaggttt aagcttagac aacatcaaat 300

cacttcaatg gatgcgggag atattccaag caacccaaga ggatgagaag cttgcctgtt 360

acctattaca gaacttccca ggcccgaata gcctcagcag ggttgcactc gagtactacc 420

gtaaagaaga cttgccctgc aacgacaaag aaaatgccgc gcgtctcaga tcgtatctga 480

tgcttaaaga accactggct gttctcctgg cttccgttag ggcgaaggat ttccagttta 540

aaccagaatt gaacagcact atcgagtttg cgttgaaatg ggctgttgag aacgacgtat 600

caatcacctc tgataggttt cgaaaacagg tcaactccaa aggcttcttc gactcaatca 660

aggacagccg gaaggtcgaa gtcgaagagg tcatcggcag aatcatgacg ctacagagat 720

tgcagtatct ggtcacagaa ccacagcata taaaacatct cctggacctc aaatttgaga 780

gtgcacagga tatcgcttct acaaacagaa aagagtttgt tcagagcatg aggaagcgtc 840

tgcaggagga gactgcactc aagatccacg accatgcggt tgtagttgct tgtcggagtc 900

aggaaacctg ggtgaatctg ctcaccatga ttaacgaaga cttcatgcca accagaaaag 960

cgatcgcaga tgttggggca gaagagatca gtcgaccatc ggtacccgac gaagatcctt 1020

ccacggcggt ccctgacgca agcactaaga aggacttcaa catgacaagt atctttgatc 1080

tacaagatac tccatgcgaa gagtgttgct ctgttgtcag cgcctcggca tattttgttg 1140

acctgctcaa gttcctagaa cacagccgct gctctacaac ggttaatgaa gccgacaatg 1200

tcctaaaagc attggctctt cgacgtccag atttgcaaaa actgcaactc tcgtgcgcga 1260

atagcaagaa aatggtgccc tatatcacaa tcgtcaatga gattatggct tcatacatcg 1320

caagtgaggg agggtccatc ggcgtcattg atgaacagga tacctcaaca tccgaagttc 1380

atgtcagtgc agaagaagat cttgtagcca ctgcatgcga gaacaaaatt gcggaagcta 1440

tgtttcctct gaaccgattc ccgtatagct tgggccaaga ctcggccaga gtctatcttt 1500

cttcgatggg tatcgagccg tcggacgtgc gtgaaaactt caagtcaact accttcatgc 1560

tgaaacagct tatgaacttc gttccaagtg actcaaagtc gaggaaagag ctggaaaggg 1620aggcagaggc tgtatggcac cgattcgacg ttgccgagac cttgcatatg ctccctcgcg 1680

accttgctgc tatttctaaa gaaaccatct ttacagacac ctttttagat cttcttgtcg 1740

gcctgtaccc agaggagctg gttcaagaga caatgctgcg agataggtcg atccccatgg 1800

tcaacgaatg ctggggctat gaaactattg acaagatgct tgacacctcc gagcagaatc 1860

tggcaggact ttgtttcata cgagatcagc ttcttccacg ctcggggcta tcgcttgagg 1920

aacttctgga gctttcgaac accactttct ttggtagaag acttgtaatç gtcaacaacc 1980

gaggctcaaa ggtgttcgac gggcagctgt cggaaatgcg acttcgactg cttgacaaca 2040

ccgcgagtgc cagtgggagg gatgcttctg aagaacctcc cattggtaat ctgacacaag 2100

agatttgçca cgaacttcaa agctttattc gactcagaaa taagctagga tggaccattg 2160

cagagcttga cgtcgtcatt tcaaccatca ctcagaatca cattgccaac agtgctactg 2220

catcagttga aggattcaga ggtattacgt tagcagtcct tgaagatgtc gctcacatcg 2280

taaagttgag taaactgaca gaggcaccag tggtctctct tctcccaatt tgggctccaa 2340

tçagcactca tggcgataag tccttatata gaaaggcgtt ccttgaacca atgagctatc 2400

tgagtaatga tccagtcttc aggccggact cttacggcgg atatctgagg gataaaggcg 2460

ccattgaagt ttacatggca cctctcacaa tgactttgaa gacgacttcg gaggatctga 2520

agattctttt ggctgttgct gggttgagcc cttcgtcacc gctcaacttg gatacgctgt 2580

ccaagatgta tcgtcatgcg ctgatgtgtc gacttcttgg agtacgtcca agagactatg 2640

atatggttct ttcagtcttc ccagacagga acatcttcat cgatccaaag acaactctcg 2700

ggaatatttc actctggagg cagttgactg atagtggctg gtcaattagc gacatcatgc 2760

tgcttgttgg caagagcgaa agtaccaaca ttccattatc tgaccatgcc cttcagttta 2820

cgtcgtctat tatggagaag gtcaatgcca acagcagtgt ctgggagcct cgcatacaaa 2880

acaatacggt tatatcgcga gatgttatgg atctgtgcgg ccagatattc gacgctgcaa 2940

cttccaagag cctgacgcag atagttgaag gttcgtcatc gagaccacca tgtctacacc 3000

accgtgctaa cgagactcta aaaaggtgat ttcgttctca acaagagcat taacatggag 3060

tctctggagt cgctgccttc cttcaacggc cttccttcaa aattgactat cgacatcaac 3120

agaagaaaca aaaagaccca ggcagctgtt gtaaccctca cgggggtcat gacagaggaa 3180

gaaaaagaga agagtataag tcaggtcgaa gaatttccaa ccctggccga cgcgatcaat 3240

gaacttgaca agttgacaaa gattccttat aatgccttgc tatccagatt ctcgggtaca 3300

gacaccactg agaagcagga tgttatcgac ttgatatgct ctgacgtggc tttgacaacc 3360

acagatcttg gaggccaatc cgacgactcg ctctgtacca gctcggagga agactcgagc 3420

gaggaagagg atagtgatgc agaatcctgt gagtcagatg agagtctggt cgacgagtcc 3480

gaagctatgg aatcgcctga agttgagaga gaaaagactt tacgtactag gcgattggaa 3540ttcgtcaagt tgatgttacc aatattgcga tcacagacct tggtcgacct cgcgaccagg 3600

agtattggtg agaagctgga aggtgttgaa cacactctta tccccatgct tctgaacaag 3660

gagatggcgt gggaaaacaa caagtcagct atcaatatcc tagacgagat tcggggttac 3720

tctgcagaga agcctgcaag gacgcaaggc tactttctac caacggccac aggagagtac 3780

acgttcactt tgcggtcatc acagcctcag gacataccgg atccátgtct tagcatcaat 3840

ggtgccaagg tcattatgaa aaaatccggc aaagagtggt attccgatcc catccttatg 3900

acaacagggc agacctactt gcttgtatcg tctgttcaac ccatgcatat tacatgggcc 3960

accaagcaga cggtgccagc aagcttcacc gatacaacgt tcattgtgga agacgatgtc 4020

cagaaggctg attcagtatt gaaagaggtt ggccgattgg cctcgttgtt ccgaaagctg 4080 gagctgagct tggaggaagt aaagtaccta accactccca acgggctgat gtccgttgat 4140

ttaaactccc tgagtatcag tgacattgcg aagctacaga gttatcgcca gctgagagac 4200

aatgttgcca aggataagga ctctttagtc acgttgtttt catggctgga aaaccctgac 4260

agttcttcaa cgttgacttc caaactcata gctgcgacaa catggcccga agcacagcta 4320

tcaaccttga tcaatgccaa atatgactat gatggggcga cgacagaaga tataatcagc 4380 tctgtatcca gtctcagtga cctcgtgtcc attcaaacta tcatggagat ctctggcaat 4440

ctgaagccca attcaagtca ggaaggcgag catccgatca ctaatctttt caaattcgcc 4500

gctcccacac ttcttagttc gtccaaggat ttggaggttg cgaacgagct gagactcatg 4560

ctaggtaaac gacaactcaa gacatgtacc tcacagctac aagagaccca gcggacagtt 4620

ttcatcgagt atttgctgca acagccatat atcaagaaag ccaagatctc ggacgcgggc 4680

ggcttgtttg atctgctgtt gattgacgtt cagatgggct cgcagtttga gatcacgcga 4740

atgaaacaag ccatctcgac cgttcagtta tacgtacaac ggtgtctcct cggcatggaa 4800

actgaagctg gtgtgcaacc aagcaacata gatcagacca agtgggcgtg gatgcataag 4860

cacaatactt ggacggctac açgcaaggca ttcctatacc cggagaattg gatcgatcca 4920

accttgcgtg acgataagac tgctttgttt cgtgactacg aaacaacgat catgcaaaag 4980

gacctcagct gggatacatt ctcacaagct atccggacgt acgtgaaggg tctgtcagag 5040

atcgctgatc tagacatcca agcatatcta cggcatcatc ccacggatgg cctcgagacg 5100

taccatttct ttggcaagac gcgcagcgca ccatatcgtt tctactaccg taacatgagg 5160

cttacacagc ccagtgacgt tgcgatatgg acaccgtgga ctttgatgga cattggatct 5220

gtgacgtacg aggcagattg ggatggctcg agtgtcacca atgccggggc ctacctgatt 5280

cccgttatgc gtggaaaccg tctcagcgtc tatgtcccag agataatggt caaaactact 5340

actcctgaga ccccagcggg gaaaacgacg accaccatga cgttttcaga ggccgcgggc 5400

gagtcattga acacgacaaa gtcgccgagt aactgggaga tacggatggc atggactgaa 5460ctacttaacg gggaatggac acccaagcga gtttcgcaac cggtactgaa tgtgaagtgg 5520

gataatgatt tcaacaaaga aaagctgcct tacatttcac gcttcacctt ttgggccaat 5580

acgaccgaac cggttgggga aacagtcact attaatgtgg gatgctggag aaaggaaaag 5640

aaaaccgaga ccacggcaac aaaaaccgac gtagccaacc actcatttct tggatctttt 5700

! 5 cagataagtg atgaccgcgc atctgtgaaa gaaaatgaga aacagtccga gtccacggca 5760

aaaacccttg agacggtgtt tcacaagtat acatggaagc aagactggga aacgagaaag 5820

acgtttgacg acgaccaggt cgagactcct gaacaacaag ttgcttcgtt tgggggagac 5880

caggtatctt ctcccttgct agctgttcct gttccaacct cttccagaac gcttgtttgg 5940

accatgtcgt atgatggaaa cgacaagctc ggcaaggcta caggctacgt cgtggacgtg 6000

10 caagtatcgg caccagatgg caagacaacc ttcatgtatc caaagcttgc ctacgcaaaa 6060

agcaacaaag tcaatcttgc atcgtcgaat cttgttcgga attcgatgac tgaagttatt 6120

gagcattctt catcaccaag tttcatgcag gatatcacga agacagacag cctgatacca 6180

ctctttgaga cgatgaacac aatgaacgag agagagtacg gaaaggctgt cgttgaagca 6240

aatatgtctc agtaccacga acaggcaact tcatatgctc tctacaactg ggaacttggt 6300

15 gcgcattgta ttcttctcgc tatggacagg ttcttagcaa cgcagcaata cgacctcgct 6360

cttcgcgttg caaggtttgt attcgacccg acagtagatg tccaagggca aactcgaaag 6420

caagcaaaga cggcatgctg gaggttccgt ccattcagag atattgcagc tgatccgact 6480

gagaaccaag acaagttcac tggctggcta gacgaatcta ccctcgacgt ggcagtgaca 6540

gaaaggagac gaaacccttc caacacgcat gcaacagcgc gaacacgacc gcgagcatac 6600

20 atgaaatgga tcgtcatgaa gtacatcgaa atcctcatag ctgctggcga tgagtacttc 6660

cgccagggta gcattgaatc tctccctatg gcgatccagc ggtacatcga ggcagcgcat 6720

gtcctcggcc cggagccacc caagatgccc aagcttggta aaactgcagt caagacctat 6780

gacactctga acaagaatgg cagaatgaga gtcgatctcg agctcacgtt tccttttctc 6840

tgtgatgttg agagacgagg gacaaatgcc tcgggcgatg acgcgcagga cagatatggc 6900

25 gtcttaggaa tcttaacaac gacatacttt tgcctgccag caaatccgaa gtatcagaca 6960

atgcggtcat tagtcaacga ccggctctac aaggctagga acaacttgga tatcaatgga 7020

cgaccacttg tgtatgccat gaacgagcag agtattgacc caggacaaat aggccgggcc 7080

ttgcaaggtg gtggaggggg agtgacttct ctgttgaatc agattgatgg tcccatgcca 7140

aatcagcgat tccaatacct aatctccaaa gcactggaga tatgtacgag ccttcaaggc 7200

30 atgggagagc agttcttaca aatcaaggaa aagaaggact cggaagctct ccagatcctc 7260

aaagcgaagc aagacacggc tcgacagcgg ctttccataa gtctcaaacg cctgcagagg 7320

gaggagatcg aaaggaacat cgagctttta gaaatgaaca gatcttctgc cgcatctcaa 7380ctgagctact accttcaact tatgggcgag ccattgaacc gcataccaag cgaaacggag 7440

aagtgggtgg acatcgagca tgcgatcgat gcaccgttca cggacgacct tcgtatgaat 7500

cgactggagc tccaggaaat gaagggaacg gatctggcca ataagctgaa catcgctgct 7560

tcatacatag acatctgggc gtttatgctc aaggctctac cccaggtgac gtcgaatgtt 7620 gagccaatgg gtgttggtgc gtcgctcaag atggatggct cgatcctgtc atcagctgtt 7680

caagcttcgg ccatgaccct caggacaggc tccatggcag ccagcatggt agcatccgat 7740

gcccaacgca caaatgcgct cacgaaacag ctacaagaga ggcgactcca agcaaacatg 7800

aagggccagg agattaagtc gcttgacaaa caagcagaga tccaaagaaa gcgattagag 7860

ctcaatgaga aggaaacatg catccagcaa gcagagattg acaatgcagt tgagatggag 7920 cagtggtatc agtccaagta cacaaacgag aagctctacg cttggatgga gaacacggtc 7980

cgtaatgtcc attacgatct gtatcagctc gcatcagacc ttgcacgtcg cgctcagaac 8040

tcgttccgct tcgagaaggg atcttcagtg cagggattct tgcgacctgg tggttattgg 8100

gatagcagtc atgatggtct cctcgcagcg cagcagctgc aagctgacct tcgacgcatg 8160

gaggccgcgt atctggagcg atcttcgtat gactatgaga tagtcaagaa tatctcactc 8220

aggcaactca aacctgaagc tctactgaat cttagagccg acggtactgc cacctttgac 8280

attcctgagg tgttgtatga ctttgacttc ccaggtcatt acatgcgtcg gatcaagtca 8340

gtctcattgt ctgttccgtg tgttgtcggt ccccatactg gtctgaatgc aacactgcgt 8400

cttcttcagc accgttaccg tgttagctct gtggcagcct caggagaaga ctacgctgaa 8460

gatgatatgg cctcgggaca tttccgcaca gacatcgtgc ctataacttc agttgccatc 8520

agctctggta tccaggactc tggtgtattc gagctcaact tcaaggacga ccgcttccag 8580

ccattcgaag gtgctggtgc aattggttca tggtcccttg agctccccac gattgtccgt 8640

tcttttgact actccactat ctcggacgtt attctgcatg ttcggtatac agcagtcgac 8700

ggagggcctt tgctccgcaa tgctgccaat caagctgtca agactttccg atctcgtgtt 8760

gaaggcttga gctcagaagg gcctggtctc ttcgccatgt ttgatctcaa aaacgacttt 8820

agtaacgcat ggtacgcgtt ccggtcaggc ctgttgggca aaactattgc cgagttggac 8880

ctatctggta tcaaagacag atttccatac tgggcgctag gaaaaaccat cattgttacc 8940

agtttaagtc ttgttgtttc tggcaaggtg aataagaaaa agctggacca gaaatcgttt 9000

tcgatcactg ctttggggac gggaaaaccg tgggattcag ttcctttggg aagtgcgacg 9060

atgctgacct tgtcaccatt gaacactgag ttaaaaaatt cgaaccttga gtggaaattg 9120 aaggtatcga atgaaggggg cgacttcacg gcgttggaga acgtggtagt tgtgttgcgg 9180

tatgccttag cttgagctca ctagcctgga gaaa 9214 <210> 26<211> 1002 <212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 26

Thr Asn Leu Glu Glu lie Leu Cys Ser Vai Ser Leu Tyr Asn Phe Thr

1 5 10 .15

Lys Thr Ser Phe Ala Phe Asn Gln Gln Leu Leu Ala lie Asp Ser Glu

20 25 30

His Ser Phe His Gln Leu Tyr Ser lie Thr Met Ala Gln Vai Ser Ser

35 40 45

Leu Vai Ala Ala Met Phe Arg Gly Asn Asp Glu Leu Vai Thr Arg Vai

50 55 60

Gln Thr Ala lie Glu Thr Arg His Asp Vai lie Ala Ala lie Glu Vai 65 70 75 80

Vai Vai Gly Gln Gly Gly Leu Ser Leu Asp Asn lie Lys Ser Leu Gln

85 90 95

Trp Met Arg Glu lie Phe Gln Ala Thr Gln Glu Asp Glu Lys Leu Ala

100 105 110

Cys Tyr Leu Leu Gln Asn Phe Pro Gly Pro Asn Ser Leu Ser Arg Vai

115 120 125

Ala Leu Glu Tyr Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Pro Cys Asn Asp Lys Glu

130 135 140

Asn Ala Ala Arg Leu Arg Ser Tyr Leu Met Leu Lys Glu Pro Leu Ala 145 150 155 160

Vai Leu Leu Ala Ser Vai Arg Ala Lys Asp Phe Gln Phe Lys Pro Glu

165 170 175

Leu Asn Ser Thr lie Glu Phe Ala Leu Lys Trp Ala Vai Glu Asn Asp

180 185 190

Vai Ser lie Thr Ser Asp Arg Phe Arg Lys Gln Vai Asn Ser Lys Gly

195 200 205

Phe Phe Asp Ser lie Lys Asp Ser Arg Lys Vai Glu Vai Glu Glu Vai 210 215 220lie Gly Arg lie Met Thr Leu Gln Arg Leu Gln Tyr Leu Vai Thr Glu 225 230 235 240

Pro Gln His lie Lys His Leu Leu Asp Leu Lys Phe Glu Ser Ala Gln

245 250 255

Asp-lie Ala Ser Thr Asn Arg Lys Glu Phe Vai Gln Ser Met Arg Lys

260 265 .270

Arg Leu Gln Glu Glu Thr Ala Leu Lys lie His Asp His Ala Vai Vai

275 280 285

Vai Ala Cys Arg Ser Gln Glu Thr Trp Vai Asn Leu Leu Thr Met lie

290 295 300

Asn Glu Asp Phe Met Pro Thr Arg Lys Ala lie Ala Asp Vai Gly Ala 305 310 315 320

Glu Glu lie Ser Arg Pro Ser Vai Pro Asp Glu Asp Pro Ser Thr Ala

325 330 335

Vai Pro Asp Ala Ser Thr Lys Lys Asp Phe Asn Met Thr Ser lie Phe

340 345 350

Asp Leu Gln Asp Thr Pro Cys Glu Glu Cys Cys Ser Vai Vai Ser Ala

355 360 365

Ser Ala Tyr Phe Vai Asp Leu Leu Lys Phe Leu Glu His Ser Arg Cys

370 375 380

Ser Thr Thr Vai Asn Glu Ala Asp Asn Vai Leu Lys Ala Leu Ala Leu 385 390 395 400

Arg Arg Pro Asp Leu Gln Lys Leu Gln Leu Ser Cys Ala Asn Ser Lys

405 410 415

Lys Met Vai Pro Tyr lie Thr lie Vai Asn Glu lie Met Ala Ser Tyr

420 425 430

lie Ala Ser Glu Gly Gly Ser lie Gly Vai lie Asp Glu Gln Asp Thr

435 440 445

Ser Thr Ser Glu Vai His Vai Ser Ala Glu Glu Asp Leu Vai Ala Thr

450 455 460

Ala Cys Glu Asn Lys lie Ala Glu Ala Met Phe Pro Leu Asn Arg Phe 465 470 475 480Pro Tyr Ser Leu

Gly lie Glu Pro 500

Met Leu Lys Gln 515

Lys Glu Leu Glu 530

Ala Glu Thr Leu 545

Glu Thr lie Phe

Pro Glu Glu Leu 580

Met Vai Asn Glu 595

Thr Ser Glu Gln 610

Leu Pro Arg Ser 625

Thr Thr Phe Phe

Lys Vai Phe Asp 660

Asn Thr Ala Ser 675

Gly Asn Leu Thr 690

Leu Arg Asn Lys 705

Ser Thr lie Thr

Gly Gln Asp Ser 485

Ser Asp Vai Arg

Leu Met Asn Phe 520

Arg Glu Ala Glu 535

His Met Leu Pro 550

Thr Asp Thr Phe 565

Vai Gln Glu Thr

Cys Trp Gly Tyr 600

Asn Leu Ala Gly 615

Gly Leu Ser Leu 630

Gly Arg Arg Leu 645

Gly Gln Leu Ser

Ala Ser Gly Arg 680

Gln Glu lie Cys 695

Leu Gly Trp Thr 710

Gln Asn His lie 725

Ala Arg Vai Tyr 490

Glu Asn Phe Lys 505

Vai Pro Ser Asp

Ala Vai Trp His 540

Arg Asp Leu Ala 555

Leu Asp Leu Leu 570

Met Leu Arg Asp 585

Glu Thr lie Asp

Leu Cys Phe lie 620

Glu Glu Leu Leu 635

Vai lie Vai Asn 650

Glu Met Arg Leu 665

Asp Ala Ser Glu

His Glu Leu Gln 700

lie Ala Glu Leu 715

Ala Asn Ser Ala 730

Leu Ser Ser Met .495

Ser Thr Thr Phe 510

Ser Lys Ser Arg 525

Arg Phe Asp Vai

Ala lie Ser Lys 560

Vai Gly Leu Tyr 575

Arg Ser lie Pro 590

Lys Met Leu Asp 605

Arg Asp Gln Leu

Glu Leu Ser Asn 640

Asn Arg Gly Ser 655

Arg Leu Leu Asp 670

Glu Pro Pro lie 685

Ser Phe lie Arg

Asp Vai Vai lie 720

Thr Ala Ser Vai 735Glu Gly Phe Arg Gly lie Thr Leu Ala Vai Leu Glu Asp Vai Ala His

740 745 750

lie Vai Lys Leu Ser Lys Leu Thr Glu Ala Pro Vai Vai Ser Leu Leu

755 760 765

Pro lie Trp Ala Pro lie Ser Thr His Gly Asp Lys Ser Leu Tyr Arg

770 775 780

Lys Ala Phe Leu Glu Pro Met Ser Tyr Leu Ser Asn Asp Pro Vai Phe 785 790 795 800

Arg Pro Asp Ser Tyr Gly Gly Tyr Leu Arg Asp Lys Gly Ala lie Glu

805 810 815

Vai Tyr Met Ala Pro Leu Thr Met Thr Leu Lys Thr Thr Ser Glu Asp

820 825 830

Leu Lys lie Leu Leu Ala Vai Ala Gly Leu Ser Pro Ser Ser Pro Leu

835 840 845

Asn Leu Asp Thr Leu Ser Lys Met Tyr Arg His Ala Leu Met Cys Arg

850 855 860

Leu Leu Gly Vai Arg Pro Arg Asp Tyr Asp Met Vai Leu Ser Vai Phe 865 870 875 880

Pro Asp Arg Asn lie Phe lie Asp Pro Lys Thr Thr Leu Gly Asn lie

885 890 895

Ser Leu Trp Arg Gln Leu Thr Asp Ser Gly Trp Ser lie Ser Asp lie

900 905 910

Met Leu Leu Vai Gly Lys Ser Glu Ser Thr Asn lie Pro Leu Ser Asp

915 920 925

His Ala Leu Gln Phe Thr Ser Ser lie Met Glu Lys Vai Asn Ala Asn

930 935 940

Ser Ser Vai Trp Glu Pro Arg lie Gln Asn Asn Thr Vai lie Ser Arg 945 950 955 960

Asp Vai Met Asp Leu Cys Gly Gln lie Phe Asp Ala Ala Thr Ser Lys

965 970 975

Ser Leu Thr Gln lie Vai Glu Gly Ser Ser Ser Arg Pro Pro Cys Leu 980 985 990His His Arg Ala Asn Glu Thr Leu Lys Arg

995 1000 <210> 27 <211> 2057 <212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 27

Lys Gly Asp Phe Vai Leu Asn Lys Ser lie Asn Met Glu Ser Leu Glu

1 5 10 15

Ser Leu Pro Ser Phe Asn Gly Leu Pro Ser Lys Leu Thr lie Asp lie

20 25 30

Asn Arg Arg Asn Lys Lys Thr Gln Ala Ala Vai Vai Thr Leu Thr Gly

35 40 45

Vai Met Thr Glu Glu Glu Lys Glu Lys Ser lie Ser Gln Vai Glu Glu

50 55 60

Phe Pro Thr Leu Ala Asp Ala lie Asn Glu Leu Asp Lys Leu Thr Lys 65 70 75 80

lie Pro Tyr Asn Ala Leu Leu Ser Arg Phe Ser Gly Thr Asp Thr Thr

85 90 95

Glu Lys Gln Asp Vai lie Asp Leu lie Cys Ser Asp Vai Ala Leu Thr

100 105 110

Thr Thr Asp Leu Gly Gly Gln Ser Asp Asp Ser Leu Cys Thr Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Ser Asp Ala Glu Ser Cys Glu

130 135 140

Ser Asp Glu Ser Leu Vai Asp Glu Ser Glu Ala Met Glu Ser Pro Glu 145 150 155 160

Vai Glu Arg Glu Lys Thr Leu Arg Thr Arg Arg Leu Glu Phe Vai Lys

165 170 175

Leu Met Leu Pro lie Leu Arg Ser Gln Thr Leu Vai Asp Leu Ala Thr

180 185 190

Arg Ser lie Gly Glu Lys Leu Glu Gly Vai Glu His Thr Leu lie ProMet Leu Leu Asn210

Asn lie Leu Asp225

Thr Gln Gly Tyr

Leu Arg Ser Ser260

Asn Gly Ala Lys275

Asp Pro lie Leu290

Vai Gln Pro Met305

Ser Phe Thr Asp

Asp Ser Vai Leu340

Leu Glu Leu Ser355

Leu Met Ser Vai370

Leu Gln Ser Tyr385

Ser Leu Vai Thr

Thr Leu Thr Ser420

Leu Ser Thr Leu435

Glu Asp lie lie

200

Lys Glu Met Ala215

Glu lie Arg Gly230

Phe Leu Pro Thr245

Gln Pro Gln Asp

Vai lie Met Lys280

Met Thr Thr Gly295

His lie Thr Trp310

Thr Thr Phe lie.325

Lys Glu Vai Gly

Leu Glu Glu Vai360

Asp Leu Asn Ser375

Arg Gln Leu Arg390

Leu Phe Ser Trp405

Lys Leu lie Ala

lie Asn Ala Lys440

Ser Ser Vai Ser

Trp Glu Asn Asn220

Tyr Ser Ala Glu235

Ala Thr Gly Glu250

lie Pro Asp Pro265

Lys Ser Gly Lys

Gln Thr Tyr Leu300

Ala Thr Lys Gln315

Vai Glu Asp Asp330

Arg Leu Ala Ser345

Lys Tyr Leu Thr

Leu Ser lie Ser380

Asp Asn Vai Ala395

Leu Glu Asn Pro410

Ala Thr Thr Trp425

Tyr Asp Tyr AspSer Leu Ser Asp

205

Lys Ser Ala lie

Lys Pro Ala Arg240

Tyr Thr Phe Thr255

Cys Leu Ser lie270

Glu Trp Tyr Ser285

Leu Vai Ser Ser

Thr Vai Pro Ala320

Vai Gln Lys Ala335

Leu Phe Arg Lys350

Thr Pro Asn Gly365

Asp lie Ala Lys

Lys Asp Lys Asp400

Asp Ser Ser Ser415

Pro Glu Ala Gln430

Gly Ala Thr Thr445

Leu Vai Ser lie450 455 460

Gln Thr lie Met Glu lie Ser Gly Asn Leu Lys Pro Asn Ser Ser Gln465 470 475 480

Glu Gly Glu His Pro lie Thr Asn Leu Phe Lys Phe Ala Ala Pro Thr

485 490 495

Leu Leu Ser Ser Ser Lys Asp Leu Glu Vai Ala Asn Glu Leu Arg Leu

500 505 510

Met Leu Gly Lys Arg Gln Leu Lys Thr Cys Thr Ser Gln Leu Gln Glu

515 520 525

Thr Gln Arg Thr Vai Phe lie Glu Tyr Leu Leu Gln Gln Pro Tyr lie

530 535 540

Lys Lys Ala Lys lie Ser Asp Ala Gly Gly Leu Phe Asp Leu Leu Leu545 550 555 560

lie Asp Vai Gln Met Gly Ser Gln Phe Glu lie Thr Arg Met Lys Gln

565 570 575

Ala lie Ser Thr Vai Gln Leu Tyr Vai Gln Arg Cys Leu Leu Gly Met

580 585 590

Glu Thr Glu Ala Gly Vai Gln Pro Ser Asn lie Asp Gln Thr Lys Trp

595 600 605

Ala Trp Met His Lys His Asn Thr Trp Thr Ala Thr Arg Lys Ala Phe

610 615 620

Leu Tyr Pro Glu Asn Trp lie Asp Pro Thr Leu Arg Asp Asp Lys Thr625 630 635 640

Ala Leu Phe Arg Asp Tyr Glu Thr Thr lie Met Gln Lys Asp Leu Ser

645 650 655

Trp Asp Thr Phe Ser Gln Ala lie Arg Thr Tyr Vai Lys Gly Leu Ser

660 665 670

Glu lie Ala Asp Leu Asp lie Gln Ala Tyr Leu Arg His His Pro Thr

675 680 685

Asp Gly Leu Glu Thr Tyr His Phe Phe Gly Lys Thr Arg Ser Ala Pro

690 695 700

Tyr Arg Phe Tyr Tyr Arg Asn Met Arg Leu Thr Gln Pro Ser Asp Vai705 710 715 720

Ala lie Trp Thr Pro Trp Thr Leu Met Asp lie Gly Ser Vai Thr Tyr

725 730 735

Glu Ala Asp Trp Asp Gly Ser Ser Vai Thr Asn Ala Gly Ala Tyr Leu

740 745 750

lie Pro Vai Met Arg Gly Asn Arg Leu Ser Vai Tyr Vai Pro Glu lie

755 760 765

Met Vai Lys Thr Thr Thr Pro Glu Thr Pro Ala Gly Lys Thr Thr Thr

770 775 780

Thr Met Thr Phe Ser Glu Ala Ala Gly Glu Ser Leu Asn Thr Thr Lys785 790 795 800

Ser Pro Ser Asn Trp Glu lie Arg Met Ala Trp Thr Glu Leu Leu Asn

805 810 815

Gly Glu Trp Thr Pro Lys Arg Vai Ser Gln Pro Vai Leu Asn Vai Lys

820 825 830

Trp Asp Asn Asp Phe Asn Lys Glu Lys Leu Pro Tyr lie Ser Arg Phe

835 840 845

Thr Phe Trp Ala Asn Thr Thr Glu Pro Vai Gly Glu Thr Vai Thr lie

850 855 860

Asn Vai Gly Cys Trp Arg Lys Glu Lys Lys Thr Glu Thr Thr Ala Thr865 870 875 880

Lys Thr Asp Vai Ala Asn His Ser Phe Leu Gly Ser Phe Gln lie Ser

885 890 895

Asp Asp Arg Ala Ser Vai Lys Glu Asn Glu Lys Gln Ser Glu Ser Thr

900 905 910

Ala Lys Thr Leu Glu Thr Vai Phe His Lys Tyr Thr Trp Lys Gln Asp

915 920 925

Trp Glu Thr Arg Lys Thr Phe Asp Asp Asp Gln Vai Glu Thr Pro Glu

930 935 940

Gln Gln Vai Ala Ser Phe Gly Gly Asp Gln Vai Ser Ser Pro Leu Leu945 950 955 960

Ala Vai Pro Vai Pro Thr Ser Ser Arg Thr Leu Vai Trp Thr Met Ser965 970 975

Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Leu Gly Lys Ala Thr Gly Tyr Vai Vai Asp

980 985 990

Vai Gln Vai Ser Ala Pro Asp Gly Lys Thr Thr Phe Met Tyr Pro Lys

995 1000 1005

Leu Ala Tyr Ala Lys Ser Asn Lys Vai Asn Leu Ala Ser Ser Asn

1010 1015 1020

Leu Vai Arg Asn Ser Met Thr Glu Vai lie Glu His Ser Ser Ser

1025 1030 1035

Pro Ser Phe Met Gln Asp lie Thr Lys Thr Asp Ser Leu lie Pro

1040 1045 1050

Leu Phe Glu Thr Met Asn Thr Met Asn Glu Arg Glu Tyr Gly Lys

1055 1060 1065

Ala Vai Vai Glu Ala Asn Met Ser Gln Tyr His Glu Gln Ala Thr

1070 1075 1080

Ser Tyr Ala Leu Tyr Asn Trp Glu Leu Gly Ala His Cys lie Leu

1085 1090 1095

Leu Ala Met Asp Arg Phe Leu Ala Thr Gln Gln Tyr Asp Leu Ala

1100 1105 1110

Leu Arg Vai Ala Arg Phe Vai Phe Asp Pro Thr Vai Asp Vai Gln

1115 1120 1125

Gly Gln Thr Arg Lys Gln Ala Lys Thr Ala Cys. Trp Arg Phe Arg

1130 1135 1140

Pro Phe Arg Asp lie Ala Ala Asp Pro Thr Glu Asn Gln Asp Lys

1145 1150 1155

Phe Thr Gly Trp Leu Asp Glu Ser Thr Leu Asp Vai Ala Vai Thr

1160 1165 1170

Glu Arg Arg Arg Asn Pro Ser Asn Thr His Ala Thr Ala Arg Thr

1175 1180 1185

Arg Pro Arg Ala Tyr Met Lys Trp lie Vai Met Lys Tyr lie Glu

1190 1195 1200

lie Leu lie Ala Ala Gly Asp Glu Tyr Phe Arg Gln Gly Ser lie1205 1210 1215

Glu Ser Leu Pro Met Ala lie Gln Arg Tyr lie Glu Ala Ala His

1220 1225 1230

Vai Leu Gly Pro Glu Pro Pro Lys Met Pro Lys Leu Gly Lys Thr

1235 1240 1245

Ala Vai Lys Thr Tyr Asp Thr Leu Asn Lys Asn Gly Arg Met Arg

1250 1255 1260

Vai Asp Leu Glü Leu Thr Phe Pro Phe Leu Cys Asp Vai Glu Arg

1265 1270 1275

Arg Gly Thr Asn Ala Ser Gly Asp Asp Ala Gln Asp Arg Tyr Gly

1280 1285 1290

Vai Leu Gly lie Leu Thr Thr Thr Tyr Phe Cys Leu Pro Ala Asn

1295 1300 1305

Pro Lys Tyr Gln Thr Met Arg Ser Leu Vai Asn Asp Arg Leu Tyr

1310 1315 1320

Lys Ala Arg Asn Asn Leu Asp lie Asn Gly Arg Pro Leu Vai Tyr

1325 1330 1335

Ala Met Asn Glu Gln Ser lie Asp Pro Gly Gln lie Gly Arg Ala

1340 1345 1350

Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Vai Thr Ser Leu Leu Asn Gln lie

1355 1360 1365

Asp Gly Pro Met Pro Asn Gln Arg Phe Gln Tyr Leu lie Ser Lys

1370 1375 1380

Ala Leu Glu lie Cys Thr Ser Leu Gln Gly Met Gly Glu Gln Phe

1385 1390 1395

Leu Gln lie Lys Glu Lys Lys Asp Ser Glu Ala Leu Gln lie Leu

1400 1405 1410

Lys Ala Lys Gln Asp Thr Ala Arg Gln Arg Leu Ser lie Ser Leu

1415 1420 1425

Lys Arg Leu Gln Arg Glu Glu lie Glu Arg Asn lie Glu Leu Leu

1430 1435 1440

Glu Met Asn Arg Ser Ser Ala Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Tyr Leu1445 1450 1455

Gln Leu Met Gly Glu Pro Leu Asn Arg lie Pro Ser Glu Thr Glu

1460 1465 1470

Lys Trp Vai Asp lie Glu His Ala lie Asp Ala Pro Phe Thr Asp

1475 1480 1485

Asp Leu Arg Met Asn Arg Leu Glu Leu Gln Glu Met Lys Gly Thr

1490 1495 1500

Asp Leu Ala Asn Lys Leu Asn lie Ala Ala Ser Tyr lie Asp lie

1505 1510 1515

Trp Ala Phe Met Leu Lys Ala Leu Pro Gln Vai Thr Ser Asn Vai

1520 1525 1530

Glu Pro Met Gly Vai Gly Ala Ser Leu Lys Met Asp Gly Ser lie

1535 1540 1545

Leu Ser Ser Ala Vai Gln Ala Ser Ala Met Thr Leu Arg Thr Gly

1550 1555 1560

Ser Met Ala Ala Ser Met Vai Ala Ser Asp Ala Gln Arg Thr Asn

1565 1570 1575

Ala Leu Thr Lys Gln Leu Gln Glu Arg Arg Leu Gln Ala Asn Met

1580 1585 1590

Lys Gly Gln Glu lie Lys Ser Leu Asp Lys Gln Ala Glu lie Gln

1595 1600 1605

Arg Lys Arg Leu Glu Leu Asn Glu Lys Glu Thr.Cys lie Gln Gln

1610 1615 1620

Ala Glu lie Asp Asn Ala Vai Glu Met Glu Gln Trp Tyr Gln Ser

1625 1630 1635

Lys Tyr Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Ala Trp Met Glu Asn Thr Vai

1640 1645 1650

Arg Asn Vai His Tyr Asp Leu Tyr Gln Leu Ala Ser Asp Leu Ala

1655 1660 1665

Arg Arg Ala Gln Asn Ser Phe Arg Phe Glu Lys Gly Ser Ser Vai

1670 1675 1680

Gln Gly Phe Leu Arg Pro Gly Gly Tyr Trp Asp Ser Ser His Asp1685 1690 1695

Gly Leu Leu Ala Ala Gln Gln Leu Gln Ala Asp Leu Arg Arg Met

1700 1705 1710

Glu Ala Ala Tyr Leu Glu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Glu lie Vai

1715 1720 1725

Lys Asn lie Ser Leu Arg Gln Leu Lys Pro Glu Ala Leu Leu Asn

1730 1735 1740

Leu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Thr Phe Asp lie Pro Glu Vai Leu

1745 1750 1755

Tyr Asp Phe Asp Phe Pro Gly His Tyr Met Arg Arg lie Lys Ser

1760 1765 1770

Vai Ser Leu Ser Vai Pro Cys Vai Vai Gly Pro His Thr Gly Leu

1775 1780 1785

Asn Ala Thr Leu Arg Leu Leu Gln His Arg Tyr Arg Vai Ser Ser

1790 1795 1800

Vai Ala Ala Ser Gly Glu Asp Tyr Ala Glu Asp Asp Met Ala Ser

1805 1810 1815

Gly His Phe Arg Thr Asp lie Vai Pro lie Thr Ser Vai Ala lie

1820 1825 1830

Ser Ser Gly lie Gln Asp Ser Gly Vai Phe Glu Leu Asn Phe Lys

1835 1840 1845

Asp Asp Arg Phe Gln Pro Phe Glu Gly Ala Gly Ala lie Gly Ser

1850 1855 1860

Trp Ser Leu Glu Leu Pro Thr lie Vai Arg Ser Phe Asp Tyr Ser

1865 1870 1875

Thr lie Ser Asp Vai lie Leu His Vai Arg Tyr Thr Ala Vai Asp

1880 1885 1890

Gly Gly Pro Leu Leu Arg Asn Ala Ala Asn Gln Ala Vai Lys Thr

1895 1900 1905

Phe Arg Ser Arg Vai Glu Gly Leu Ser Ser Glu Gly Pro Gly Leu

1910 1915 1920

Phe Ala Met Phe Asp Leu Lys Asn Asp Phe Ser Asn Ala Trp Tyr1925 1930 1935

Ala Phe Arg Ser Gly Leu Leu Gly Lys Thr lie Ala Glu Leu Asp

1940 1945 1950

Leu Ser Gly lie Lys Asp Arg Phe Pro Tyr Trp Ala Leu Gly Lys

1955 1960 1965

Thr lie lie Vai Thr Ser Leu Ser Leu Vai Vai Ser Gly Lys Vai

1970 1975 1980

Asn Lys Lys Lys Leu Asp Gln Lys Ser Phe Ser lie Thr Ala Leu

1985 1990 1995

Gly Thr Gly Lys Pro Trp Asp Ser Vai Pro Leu Gly Ser Ala Thr

2000 2005 2010

Met Leu Thr Leu Ser Pro Leu Asn Thr Glu Leu Lys Asn Ser Asn

2015 2020 2025

Leu Glu Trp Lys Leu Lys Vai Ser Asn Glu Gly Gly Asp Phe Thr

2030 2035 2040

Ala Leu Glu Asn Vai Vai Vai Vai Leu Arg Tyr Ala Leu Ala

2045 2050 2055

<210> 28<211> 9169<212> DNA

<213> Fusarium verticillioides

<220>

<221> misc_feature

<222> (20).. (22)

<223> Começo da região codificada correspondente a primeira Aspargini-

na da proteína putativa Tc Classe A codificada na SEQ ID NO:29

<220>

<221> misc_feature

<222> (3299)..(5396)

<223> n = a, g, c, out (grande lacuna na seqüência de DNA indicada

como seqüência de 2098 n's)<221> misc_feature

<222> (5451)..(5453)

tativa deduzida TC Classe A<400> 28

aggcaagcat gtcttctaga atgcgtgtga cctttccggc gagagtaaçc aggttgctat 60

gatcggcgcg gtcagcaagg actcgataaa acacgacttg gtattcccta agttgtttca 120

gtcaaagatg ataacagttc tgttgaagag gacagtacag atgatacagc tgcaataccg 180

agggccagaa gcctcggtcc aacgtcaccg tctcatggct cttagctcag cccccacaag 240

acaggtcgcg agctatacgg agatcattgg cgatattgtg atcggatctt gtgatgactg 300

taactcggtc accagtccag cggcatactt tgtcgacctc cttcgactgt tgaagaacac 360

tcctagtgat gctaaggcag gctcgcccag ccttctcgac aggattctcg tcaggcgccc 420

agatctgttg accttacagc tctcatatgt taacacaaac gtactgatcc cgtatattga 480

ccttgccaac gaagccatgg agtcattcat caagaatgtt gggactctcg ttccaccggc 540

tgccgtacca attcaagggt tcaacatgac ggatcaagat accagcgata tcagtctggc 600

tgagcccaag aacacggact acagtgtcta tcgtgatcaa atttccgccc agtatttccc 660

acttaccgta tttccttaca atcaggcact tgatttccaa cgccttttct tttccagtct 720

gaacacgtct ttttcagcgg tcattgactt atttggctcg gagtcacgtc ttcttcctca 780

agttggtagc aacatcgctc ctgatctggt caaactagcc aaggatgtag tagatgccgc 840

cagtgcagca gagtttcttg gtctctggcc tgcagactat gtagccatca ctggatcttc 900

tgtcttttca ttcgacttct tcaaggcggt ttacgatcag aatatacagc aggacgccta 960

caatcaaaag attggacgtc taggcactgg gcagtactgg ggctaccagg ctgctgatgg 1020

caagacagcc gagcaggtca tgttatctga agacaacgac cagggactgc cccttgtaaa 1080

ggcacaattg cttcgtcgta cagagctcac ctttgagcag ttgatagacc tcctcaaggc 1140

cagactgctc cagggccaac ttgtccttga gaacccggac aacacggcaa tcttttctgg 1200

aaagctggaa gagctcaggc tacgccatcc caccaaagag gtttctaacg cgccactgac 1260

ggagcgagac tgttggttat tgcagtctta catccgtctc tggcgtaaga cgggatggac 1320

tttgcaagac ctcgactgcg cggttgtctc gtttggtact ggcgacgcag ccagcggcct 1380

gaacatcact gcccagacca tcacttcaat ggcagctata cagcgcatct caaccctgac 1440

gggtcttgag atctatcaac taatgccttt ctgaggcatt attgatacta acggagacaa 1500

gtcactttat gcgaggctgt tcttgagagg caaggctggc cggaaggacc ctgttttcgg 1560

accagacgat caagggcgat accttcaggc tgatgcaagt ctccaagata acagagcgcc 1620attactctca agactcggac tcacggaaga aagctttacg gccatcttag cagctgccaa 1680

gatcaccaat gacaaacttg atttggctaa tgtcaccact atttatcgga taactatttt 1740

ctgtcagata cttggggtaa gcccaatcta ctttcagtcg ttccaagcac tgctggactc 1800

cgatgaagct gcttttgttg ccccgcaggc tacactgaac attattaagc agtttcaaga 1860

gtgcgcagat gccggtctca gctcggagca gatgattttc ttcacaaacc ácgacaaagt 1920

cttactctcg aagaacgtca actcgaggct ctcgattcag caaatcgcaa tagctgtatc 1980

agatatcatc aatagcctcc agagcagcta cgcggggccc ccgactatta acagcgacac 2040

aactacagct tctgcagccg atgtctccgc cgtttcaact aagatgtttg ctccggctac 2100

tgcgcagcaa gtgacggcgt ttcttcaaag tgagctccct acgcaagcaa cgagttgcta 2160

tcggtaacta acaatagtat ttagtgctcc ccggaacaga cctgacagat cagtcaaagg 2220

tgtacaataa tattctccgt ccattcttca gtgacacaca agcagcccac aaagtctttt 2280

ttgagcagcc agaaccaagc ggaacggagg aggagaaagc cattgccaaa gaaaataacc 2340

ttgattctcg acgcctgttt ttcttaaaag ctgttattaa accacttcaa gcccggattg 2400

ccagtgatac tgtcc-tgcag gtgctcactc ctctctacgt ggaatcagac cccactgttc 2460

ttggccacct actcgggacg gttgttggac aatctgaggg tgagcgacca gttgcgaaga 2520

tactaggtga tctcggggcc tctaatgagg cggcattaaa gaaaggctcg tcagatgtct 2580

tcttcatacc attgaatgta gacctatacc gcttcttctt tccggacaca agcttggaaa 2640

aggcccccac cgttactctg gatacgacag cccttgtgtt caacaaagac gtaggcgggt 2700

ggatttcgaa cgagatacgt ctatccaacg gacaagcgta taatttacgc cgctctaatg 2760

gtggattgac agagtgtttc tattctactc cgcgaaatcc tagacaatct tttccttcca 2820

acactctact tgcacacgat actatcaagt acgcccaaag ctccctgaaa ctgttgtcgc 2880

gagccgccgg tctgtgtacc agcttcaagt tgaatattga tgagctgcag ttcttccaga 2940

gtcaggagct aaacactgat cttgcaatcg acttggggaa cattgactgg aagactttgc 3000

agcttgtgca acggtacaga actctttcaa gaaggacaac agggactacg agccttctat 3060

ccttcctçaa atgggcctgt gtgtctcctc gggatggtac tctgatagca cagctcgtca 3120

ggctcacgaa tgtatcccaa acgcagatca aagattacac aactccaagg ttctcaagtc 3180

taactgagga tcagttggtt cagcgcttcc aagaaactgc ggagctcaga cacttacttg 3240

atagtgttgc cttcgtgcat cgcacaggtg tcccctggta tgacattcca actcttgtnn 3300

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3360

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3420

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3480

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3540nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3600

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3660

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3720

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3780

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3900

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3960

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4020

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4080

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4140

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4200

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4260

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4320

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4380

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4440

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4500

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4560

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4620

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4680

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4740

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4800

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4920

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4980

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5040

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5100

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5160

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5220

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5280

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5340

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnccgt 5400

atggaagatg ggacaccaaa gcaggtttct ccacaaaggc tactttctaa ggacatttag 5460agggaggccc attgagtacg gatttcccca tgcagcatgc aagttctact gcgcctggta 5520

atgcatggaa tgaggcggta aaattacctg acgtctcatc gttcaagttc tggattcggt 5580

ctaggaaaag cgactcaatg ccccctgctt ctttggtcgc tccggctcct cccgcaccta 5640

gcaaggctcc agttcctagt acaagtattc tagtcatcga tgtggagcgt tgggttgatg 5700

caggcaaagg ccagaaccct cgatatgtca actatcctct aggacgtttc gagatgcgtg 5760

gctcgcaggt tatcctggtc aacctcggaa cagctgatgt ttcacctgac cccttcaaga 5820

agccctggcg atcaactatc cctaccaagt tcgctaaaat gtggtggcac atggagaagg 5880

acaaagaccc ggccgttccc ggtatagcta tcggcagagg cacgggcgcc gacaaggagc 5940

cgctgttggg tgttgttacg aagctcatgg ataatattcc caagaaggat gttcactgga 6000

cgctatcatt caacgattca caagccaaga atgccactgg ctttgttcag gacattgtta 6060

ccaccgaaag caccatctcc tacatcacct atccacccat cgcgtcttca tcaacctttg 6120

cgtccgatgt cttccagcac actttggaca gagacctagt ttcgatgtca actatgtaca 6180

atgggctcga tcaagtctac gcctttcttg gaagtgtacc accgaatgac acatatcttg 6240

cctttggaaa acgcaatggt cctgtccacg aactctcaac cccatatgcc ctttacaact 6300

gggaattggg cgcccattcc atcatgttgc tcatggaaag gctacaggtg acacagcagt 6360

atgatctcgc tctccaagta gcgcatttcg tttttgatcc aaccattgat ggcaccagtc 6420

tcacccgttg ttgggtcttc ccaccgttta aagagctggc ggctggtaag attgactccg 6480

tggaagacat tttgaagctt cttgagccat ctagtggttc agaggaggac atgaagacca 6540

gtattcttga gtggcgtaag aacccattca atgctcatgt cgtggcgcga gggagacctt 6600

tagcttacat gaggcgcatc atcatgaagt atgtggagat tcttatcgct agcggcgatg 6660

tctattttcg acagaatacc cttgagactt taccattggc tattcagcgt tacgttgaag 6720

catctcatgt cttcgggtca aagcctgtac gcgtgcctaa gctagctaag cctgtgtata 6780

aatcttatgc agatctcgac cgggacttta acgacttttc caacgctgcc ttcgacatgg 6840

aattggactt ccctttcttc agcgatcctg cctcacgtgg aggagtgcct ggggccagtg 6900

gcacttttgg cctaactggt attctgaaga ccacgtactt ctgtgtccct tctaatccga 6960

agcttgttgg acttcgggat cttatagacg accgtctttt caagattcgc aactgccagg 7020

atatatatgg tgtcgtccga agtttagctc tcttcgagcc accactagac cctgggatgc 7080

tcgtccgagc gactgccggt ggcgttgaca tttcccagct ggtgagcagt atagcaggcc 7140

ccatgccaaa ttatcgcttc cagtacttgc tccaaaaagc tcaggagatg tgtgcggagg 7200

tcaagtcgat gggtaccttg atgctgtcta tcaaggagag gaaggatgtg gaagcactcg 7260

caagtcttcg agcgcggcag gataaggtca ttcagaatct tatgattgag atgaaagaaa 7320

ctgccaagaa agaagctgaa tcgagtattg atgccctctt ggagacgcgc caggctcagg 7380ttgcaagact ggagtactac cttgctctgaagaaggagga ttgggaagac atcgcacagtgtatgacgtc tcatgaaaag cttgagatgcaaaaggcgac tattctcgac attgcggctaaggcagctga gcctcttgga gttggtgtatagtccatgat gatcaattcg aatgtcatgcgtgctcgcgc gtcgcggact ggcgggctcaccaacatggc tggtcgtgac atcaaggaaagagtcgagat gtgcgagcgc aatattcaac acacagagga atggctgagg acgaagtacagtgtcgttcg gaatctgtac caccagacctcccagaaggc gttccagttt gaaaagggtgactgggatgc tggaagagat ggtttgttctggcttgaagg ggcatacatc gaacagcgca cgctacgtca ggttcggcct tgggctctgattgacttgcc agaggttctt ttcgactttgagtccgtcgg aatgactatc ccatgtattgtgacactcct cgaataccaa tatcgcatcacccaaaaagc gacagatgaa cggttccaaa

ttagccacgg gcagcaggac agtggtgtcttgccctttga aggcgcggga gcagttagtaagcaattcga ctacaaccct attagtgacaaaggctgtgc tgcctttcgc aaagctgcggatgaaggcat gtttgcagtg ttggatcttc

tagttatggc tgacaagacc caaccttcaattccattctt cacaaaaggc aagagtatcacgtcgggtat caatctggaa gaagacatcaaggccggaac tggcattggg tccttccaagctgttaaaga ttggcgtctg accttgtcat ttttgatttt atataggtat tttttagtat<210> 29<211> 484

cagggagtga tgacaagtct gcaccagatg 7440

caattgagaa gccgacaacc gatgatctac 7500

aaaaggctga cgccgcctcg gatctaaatc 7560

gtatcatcaa gatcatacca gacatcaacg 7620

ctattgactc catcaccaaa aacatctgcg 7680

gtgcccaggc tcaacacttt agtgatgaag 7740

ttaaacagct ccaagagcgg cgcttgcaag 7800

ctgacaagca aatcttgact gcgcgcatca 7860

tacagaagca acaggctgag tatgcacgcg 7920

gcagtgaaca gctctacgcc tggatggatg 7980

atatgattgc cgatgatctg gcgcagaaag 8040

atcaatttgt caacattatc agtccatgtt 8100

ccggggaaaa cctctttttg tctctaaagc 8160

tgcacgactt tgaaatagtg aaaaacattt 8220

ttaacttacg tgaaactggc gcggcagagt 8280

acttctccgg tcactattgt cgccgcatca 8340

tgggacccta caccagcgtc aatgccacgc 8400

agtcagacgc caagggcgcc caagactatc 8460

ctgaccaggt gccgatccca tccattgccg 8520

tgaatcttga cttcaaggac gagcgataca 8580

gatggagact ggaacttcca actaccatca 8640

ttgtcttgca catgaaatac açagctattc 8700

cagaatctgc ggctgctggc ctatcgctga 8760

ccaacgagtt tccttctgag tggcaccggc 8820

ctatgccgct tctatcttta caagatcgtc 8880

aggccggaag cgtgtctgtg catatcgagt 8940

ccttgactgc tgcgaatcgg ctgaacctca 9000

ttgctaccac atccacaaat atgagacaac 9060

caaaagctat gaatgcaagt atttctcgag 9120

aggccgtaat ccttttacc 9169<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 29

Asn Ala Cys Asp Leu Ser Gly Glu Ser Asn Gln Vai Ala Met lie Gly

1 5 10 15

Ala Vai Ser Lys Asp Ser lie Lys His Asp Leu Vai Phe Pro Lys Leu

20 25 30

Phe Gln Ser Lys Met lie Thr Vál Leu Leu Lys Arg Thr Vai Gln Met

35 40 45

lie Gln Leu Gln Tyr Arg Gly Pro Glu Ala Ser Vai Gln Arg His Arg

50 55 60

Leu Met Ala Leu Ser Ser Ala Pro Thr Arg Gln Vai Ala Ser Tyr Thr65 70 75 80

Glu lie lie Gly Asp lie Vai lie Gly Ser Cys Asp Asp Cys Asn Ser

85 90 95

Vai Thr Ser Pro Ala Ala Tyr Phe Vai Asp Leu Leu Arg Leu Leu Lys

100 105 110

Asn Thr Pro Ser Asp Ala Lys Ala Gly Ser Pro Ser Leu Leu Asp Arg

115 120 125

lie Leu Vai Arg Arg Pro Asp Leu Leu Thr Leu Gln Leu Ser Tyr Vai

130 135 140

Asn Thr Asn Vai Leu lie Pro Tyr lie Asp Leu Ala Asn Glu Ala Met145 """ 150 155 160

Glu Ser Phe lie Lys Asn Vai Gly Thr Leu Vai Pro Pro Ala Ala Vai

165 170 175

Pro lie Gln Gly Phe Asn Met Thr Asp Gln Asp Thr Ser Asp lie Ser

180 185 190

Leu Ala Glu Pro Lys Asn Thr Asp Tyr Ser Vai Tyr Arg Asp Gln lie

195 200 205

Ser Ala Gln Tyr Phe Pro Leu Thr Vai Phe Pro Tyr Asn Gln Ala Leu

210 215 220

Asp Phe Gln Arg Leu Phe Phe Ser Ser Leu Asn Thr Ser Phe Ser Ala225

Vai lie Asp Leu

Ser Asn lie Ala260

Ala Ala Ser Ala275

Ala lie Thr Gly290

Tyr Asp Gln Asn305

Leü Gly Thr Gly

Ala Glu Gln Vai340

Vai Lys Ala Gln355

lie Asp Leu Leu370

Asn Pro Asp Asn385

Leu Arg His Pro

Asp Cys Trp Leu420

Trp Thr Leu Gln435

Asp Ala Ala Ser450

Ala Ala lie Gln465

Leu Met Pro Phe

230

Phe Gly Ser Glu245

Pro Asp Leu Vai

Ala Glu Phe Leu280

Ser Ser Vai Phe295

lie Gln Gln Asp310

Gln Tyr Trp Gly325

Met Leu Ser Glu

Leu Leu Arg Arg360

Lys Ala Arg Leu375

Thr Ala lie Phe390

Thr Lys Glu Vai405

Leu Gln Ser Tyr

Asp Leu Asp Cys440

Gly Leu Asn lie455

Arg lie Ser Thr470

235

Ser Arg Leu Leu250

Lys Leu Ala Lys265

Gly Leu Trp Pro

Ser Phe Asp Phe300

Ala Tyr Asn Gln315

Tyr Gln Ala Ala330

Asp Asn Asp Gln345

Thr Glu Leu Thr

Leu Gln Gly Gln380

Ser Gly Lys Leu395

Ser Asn Ala Pro410

lie Arg Leu Trp425

Ala Vai Vai Ser

Thr Ala Gln Thr460

Leu Thr Gly Leu475

240

Pro Gln Vai Gly255

Asp Vai Vai Asp270

Ala Asp Tyr Vai285

Phe Lys Ala Vai

Lys lie Gly Arg320

Asp Gly Lys Thr335

Gly Leu Pro Leu350

Phe Glu Gln Leu365

Leu Vai Leu Glu

Glu Glu Leu Arg400

Leu Thr Glu Arg415

Arg Lys Thr Gly430

Phe Gly Thr Gly445

lie Thr Ser Met

Glu lie Tyr Gln480<210> 30<211> 230<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 30

Gly lie lie Asp Thr Asn Gly Asp Lys Ser Leu Tyr Ala Arg Leu Phe

1 5 10 15

Leu Arg Gly Lys Ala Gly Arg Lys Asp Pro Vai Phe Gly Pro Asp Asp

20 25 30

Gln Gly Arg Tyr Leu Gln Ala Asp Ala Ser Leu Gln Asp Asn Arg Ala

35 40 . 1 45

Pro Leu Leu Ser Arg Leu Gly Leu Thr Glu Glu Ser Phe Thr Ala lie

50 55 60

Leu Ala Ala Ala Lys lie Thr Asn Asp Lys Leu Asp Leu Ala Asn Vai65 70 75 80

Thr Thr lie Tyr Arg lie Thr lie Phe Cys Gln lie Leu Gly Vai Ser

85 90 95

Pro lie Tyr Phe Gln Ser Phe Gln Ala Leu Leu Asp Ser Asp Glu Ala

100 105 110

Ala Phe Vai Ala Pro Gln Ala Thr Leu Asn lie lie Lys Gln Phe Gln

115 120 125

Glu Cys Ala Asp Ala Gly Leu Ser Ser Glu Gln Met lie Phe Phe Thr

130 135 140

Asn His Asp Lys Vai Leu Leu Ser Lys Asn Vai Asn Ser Arg Leu Ser145 150 155 160

lie Gln Gln lie Ala lie Ala Vai Ser Asp lie lie Asn Ser Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Tyr Ala Gly Pro Pro Thr lie Asn Ser Asp Thr Thr Thr Ala

180 185 190

Ser Ala Ala Asp Vai Ser Ala Vai Ser Thr Lys Met Phe Ala Pro Ala195 200 205Thr Ala Gln Gln Vai Thr Ala Phe Leu Gln Ser Glu Leu Pro Thr Gln

210 215 220

Ala Thr Ser Cys Tyr Arg225 230<210> 31<211> 374<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 31

Tyr Leu Vai Leu Pro Gly Thr Asp Leu Thr Asp Gln Ser Lys Vai Tyr

15 10 15

Asn Asn lie Leu Arg Pro Phe Phe Ser Asp Thr Gln Ala Ala His Lys

20 25 30

Vai Phe Phe Glu Gln Pro Glu Pro Ser Gly Thr Glu Glu Glu Lys Ala

35 40 45

lie Ala Lys Glu Asn Asn Leu Asp Ser Arg Arg Leu Phe Phe Leu Lys

50 ■ 55 60

Ala Vai lie Lys Pro Leu Gln Ala Arg lie Ala Ser Asp Thr Vai Leu65 70 75 80

Gln Vai Leu Thr Pro Leu Tyr Vai Glu Ser Asp Pro Thr Vai Leu Gly

85 90 95

His Leu Leu Gly Thr Vai Vai Gly Gln Ser Glu Gly Glu Arg Pro Vai

100 105 110

Ala Lys lie Leu Gly Asp Leu Gly Ala Ser Asn Glu Ala Ala Leu Lys

115 120 125

Lys Gly Ser Ser Asp Vai Phe Phe lie Pro Leu Asn Vai Asp Leu Tyr

130 135 140

Arg Phe Phe Phe Pro Asp Thr Ser Leu Glu Lys Ala Pro Thr Vai Thr145 150 155 160

Leu Asp Thr Thr Ala Leu Vai Phe Asn Lys Asp Vai Gly Gly Trp lie

165 170 175

Ser Asn Glu lie Arg Leu Ser Asn Gly Gln Ala Tyr Asn Leu Arg Arg180 185 190

Ser Asn Gly Gly Leu Thr Glu Cys Phe Tyr Ser Thr Pro Arg Asn Pro

195 200 205

Arg Gln Ser Phe Pro Ser Asn Thr Leu Leu Ala His Asp Thr lie Lys

210 215 220

Tyr Ala Gln Ser Ser Leu Lys Leu Leu Ser Arg Ala Ala Gly Leu Cys225 230 235 240

Thr Ser Phe Lys Leu Asn lie Asp Glu Leu Gln Phe Phe Gln Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Asn Thr Asp Leu Ala lie Asp Leu Gly Asn lie Asp Trp Lys

260 265 270

Thr Leu Gln Leu Vai Gln Arg Tyr Arg Thr Leu Ser Arg Arg Thr Thr

275 280 285

Gly Thr Thr Ser Leu Leu Ser Phe Leu Lys Trp Ala Cys Vai Ser Pro

290 295 300

Arg Asp Gly Thr Leu lie Ala Gln Leu Vai Arg Leu Thr Asn Vai Ser305 310 315 320

Gln Thr Gln lie Lys Asp Tyr Thr Thr Pro Arg Phe Ser Ser Leu Thr

325 330 335

Glu Asp Gln Leu Vai Gln Arg Phe Gln Glu Thr Ala Glu Leu Arg His

340 345 350

Leu Leu Asp Ser Vai Ala Phe Vai His Arg Thr Gly Vai Pro Trp Tyr

355 360 365

Asp lie Pro Thr Leu Vai370

<210> 32<211> 1233<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 32

Gly His Leu Glu Gly Gly Pro Leu Ser Thr Asp Phe Pro Met Gln HisAla Ser Ser Thr20

Pro Asp Vai Ser35

Ser Met Pro Pro50

Lys Ala Pro Vai65

Trp Vai Asp Ala

Leu Gly Arg Phe100

Gly Thr Ala Asp115

Thr lie Pro Thr130

Lys Asp Pro Ala145

Asp Lys Glu Pro

Pro Lys Lys Asp180

Lys Asn Ala Thr195

lie Ser Tyr lie210

Ser Asp Vai Phe225

Thr Met Tyr Asn

Pro Pro Asn Asp260

Ala Pro Gly Asn

Ser Phe Lys Phe40

Ala Ser Leu Vai55

Pro Ser Thr Ser70

Gly Lys Gly Gln85

Glu Met Arg Gly

Vai Ser Pro Asp120

Lys Phe Ala Lys135

Vai Pro Gly lie150

Leu Leu Gly Vai165

Vai His Trp Thr

Gly Phe.Vai Gln200

Thr Tyr Pro Pro215

Gln His Thr Leu230

Gly Leu Asp Gln245

Thr Tyr Leu Ala

Ala Trp Asn Glu25

Trp lie Arg Ser

Ala Pro Ala Pro60

lie Leu Vai lie75

Asn Pro Arg Tyr90

Ser Gln Vai lie105

Pro Phe Lys Lys

Met Trp Trp His140

Ala lie Gly Arg155

Vai Thr Lys Leu170

Leu Ser Phe Asn185

Asp lie Vai Thr

lie Ala Ser Ser220

Asp Arg Asp Leu235

Vai Tyr Ala Phe250

Phe Gly Lys Arg265

Ala Vai Lys Leu30

Arg Lys Ser Asp45

Pro Ala Pro Ser

Asp Vai Glu Arg80

Vai Asn Tyr Pro95

Leu Vai Asn Leu110

Pro Trp Arg Ser125

Met Glu Lys Asp

Gly Thr Gly Ala160

Met Asp Asn lie175

Asp Ser Gln Ala190

Thr Glu Ser Thr205

Ser Thr Phe Ala

Vai Ser Met Ser240

Leu Gly Ser Vai255

Asn Gly Pro Vai270His Glu Leu Ser Thr Pro Tyr Ala Leu Tyr Asn Trp Glu Leu Gly Ala

275 280 285

His Ser lie Met Leu Leu Met Glu Arg Leu Gln Vai Thr Gln Gln Tyr

290 295 300

Asp Leu Ala Leu Gln Vai Ala His Phe Vai Phe Asp Pro Thr lie Asp305 310 315 320

Gly Thr Ser Leu Thr Arg Cys Trp Vai Phe Pro Pro Phe Lys Glu Leu

325 330 335

Ala Ala Gly Lys lie Asp Ser Vai Glu Asp lie Leu Lys Leu Leu Glu

340 345 350

Pro Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Met Lys Thr Ser lie Leu Glu Trp

355 360 365

Arg Lys Asn Pro Phe Asn Ala His Vai Vai Ala Arg Gly Arg Pro Leu

370 375 380

Ala Tyr Met Arg Arg lie lie Met Lys Tyr Vai Glu lie Leu lie Ala385 390 395 400

Ser Gly Asp Vai Tyr Phe Arg Gln Asn Thr Leu Glu Thr Leu Pro Leu

405 410 415

Ala lie Gln Arg Tyr Vai Glu Ala Ser His Vai Phe Gly Ser Lys Pro

420 425 430

Vai Arg Vai Pro Lys Leu Ala Lys Pro Vai Tyr Lys Ser Tyr Ala Asp

435 440 445

Leu Asp Arg Asp Phe Asn Asp Phe Ser Asn Ala Ala Phe Asp Met Glu

450 455 460

Leu Asp Phe Pro Phe Phe Ser Asp Pro Ala Ser Arg Gly Gly Vai Pro465 470 475 480

Gly Ala Ser Gly Thr Phe Gly Leu Thr Gly lie Leu Lys Thr Thr Tyr

485 490 495

Phe Cys Vai Pro Ser Asn Pro Lys Leu Vai Gly Leu Arg Asp Leu lie

500 505 510

Asp Asp Arg Leu Phe Lys lie Arg Asn Cys Gln Asp lie Tyr Gly Vai515 520 525Vai Arg Ser Leu530

Vai Arg Ala Thr545

lie Ala Gly Pro

Ala Gln Glu Met580

Ser lie Lys Glu595

Arg Gln Asp Lys610

Ala Lys Lys Glu625

Gln Ala Gln Vai

Asp Asp Lys Ser660

Gln Ser lie Glu675

Glu Lys Leu Glu690

Lys Ala Thr lie705

Asp lie Asn Glu

Ser lie Thr Lys740

Met Arg Ala Gln755

Arg Thr Gly Gly770

Ala Leu Phe Glu535

Ala Gly Gly Vai550

Met Pro Asn Tyr565

Cys Ala Glu Vai

Arg Lys Asp Vai600

Vai lie Gln Asn615

Ala Glu Ser Ser630

Ala Arg Leu Glu645

Ala Pro Asp Glu

Lys Pro Thr Thr680

Met Gln Lys Ala695

Leu Asp lie Ala710

Ala Ala Glu Pro725

Asn lie Cys Glu

Ala Gln His Phe760

Leu lie Lys Gln775

Pro Pro Leu Asp540

Asp lie Ser Gln555

Arg Phe Gln Tyr570

Lys Ser Met Gly585

Glu Ala Leu Ala

Leu Met lie Glu620

lie Asp Ala Leu635

Tyr Tyr Leu Ala650

Lys Glu Asp Trp665

Asp Asp Leu Arg

Asp Ala Ala Ser700

Ala Ser lie lie715

Leu Gly Vai Gly730

Ser Met Met lie745

Ser Asp Glu Gly

Leu Gln Glu Arg780

Pro Gly Met Leu

Leu Vai Ser Ser560

Leu Leu Gln Lys575

Thr Leu Met Leu590

Ser Leu Arg Ala605

Met Lys Glu Thr

Leu Glu Thr Arg640

Leu Thr Gly Ser655

Glu Asp lie Ala670

Met Thr Ser His685

Asp Leu Asn Gln

Lys lie lie Pro720

Vai Ser lie Asp735

Asn Ser Asn Vai750

Ala Arg Ala Ser765

Arg Leu Gln AlaAsn Met Ala Gly Arg Asp lie Lys Glu Thr Asp Lys Gln lie Leu Thr785 790 795 800

Ala Arg lie Arg Vai Glu Met Cys Glu Arg Asn lie Gln Leu Gln Lys

805 810 815

Gln Gln Ala Glu Tyr Ala Arg Asp Thr Glu Glu Trp Leu Arg Thr Lys

820 825 830

Tyr Ser Ser Glu Gln Leu Tyr Ala Trp Met Asp Gly Vai Vai Arg Asn

83 5 840 845

Leu Tyr His Gln Thr Tyr Met lie Ala Asp Asp Leu Ala Gln Lys Ala

850 855 860

Gln Lys Ala Phe Gln Phe Glu Lys Gly Asp Gln Phe Vai Asn lie lie865 870 875 880

Ser Pro Cys Tyr Trp Asp Ala Gly Arg Asp Gly Leu Phe Ser Gly Glu

885 890 895

Asn Leu Phe Leu Ser Leu Lys Arg Leu Glu Gly Ala Tyr lie Glu Gln

900 905 910

Arg Met His Asp Phe Glu lie Vai Lys Asn lie Ser Leu Arg Gln Vai

915 920 925

Arg Pro Trp Ala Leu lie Asn Leu Arg Glu Thr Gly Ala Ala Glu Phe

930 935 940

Asp Leu Pro Glu Vai Leu Phe Asp Phe Asp Phe Ser Gly His Tyr Cys945 950 955 960

Arg Arg lie Lys Ser Vai Gly Met Thr lie Pro Cys lie Vai Gly Pro

965 970 975

Tyr Thr. Ser Vai Asn Ala Thr Leu Thr Leu Leu Glu Tyr Gln Tyr Arg

980 985 990

lie Lys Ser Asp Ala Lys Gly Ala Gln Asp Tyr Pro Gln Lys Ala Thr

995 1000 1005

Asp Glu Arg Phe Gln Thr Asp Gln Vai Pro lie Pro Ser lie Ala

1010 1015 1020

Vai Ser His Gly Gln Gln Asp Ser Gly Vai Leu Asn Leu Asp Phe1025 1030 1035Lys Asp Glu Arg Tyr Met Pro Phe Glu Gly Ala Gly Ala Vai Ser

1040 1045 1050

Arg Trp Arg Leu Glu Leu Pro Thr Thr lie Lys Gln Phe Asp Tyr

1055 1060 1065

Asn Pro lie Ser Asp lie Vai Leu His Met Lys Tyr Thr Ala lie

1070 1075 1080

Gln Gly Cys Ala Ala Phe Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ser Ala Ala

1085 1090 1095

Ala Gly Leu Ser Leu Asn Glu Gly Met Phe Ala Vai Leu Asp Leu

1100 1105 1110

Pro Asn Glu Phe Pro Ser Glu Trp His Arg Leu Vai Met Ala Asp

1115 1120 1125

Lys Thr Gln Pro Ser Thr Met Pro Leu Leu Ser Leu Gln Asp Arg

1130 1135 1140

Leu Pro Phe Phe Thr Lys Gly Lys Ser lie Lys Ala Gly Ser Vai

1145 1150 1155

Ser Vai His lie Glu Ser Ser Gly lie Asn Leu Glu Glu Asp lie

1160 1165 1170

Thr Leu Thr Ala Ala Asn Arg Leu Asn Leu Lys Ala Gly Thr Gly

1175 1180 1185

lie Gly Ser Phe Gln Vai Ala Thr Thr Ser Thr Asn Met Arg Gln

1190 1195 1200

Pro Vai Lys Asp Trp Arg Leu Thr Leu Ser Ser Lys Ala Met Asn

1205 1210 1215

Ala Ser lie Ser Arg Vai Leu lie Leu Tyr Arg Tyr Phe Leu Vai

1220 1225 1230

<210> 33

<211> 7704

<212> DNA

<213> Fusarium verticillioides<220>

< 2 21> mi s c f eature<222> (22)..(24)

<223> início da região codificada correspondente à primeira alanina da

proteína putativa de fusão TC codificada na SEQ ID NO:35

<220>

<221> misc_feature

<222> (5483) .. (6141)

<223> n = a, g, c, ou t (grande lacuna na seqüência de DNA indicada

como seqüência de 659 n's)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6203) .. (6205)

<223> Códon (CAT) de estrutura interna de histidina que iniciam a se-

gunda porção da proteína puttiva de fusão TC classe B/Classe C<400> 33

gacagcaatt gcaggccttg agccatagtt atgtctggca agatgaatcg caaatccaga 60taccatccga gtgatgctgt agcacctaat accggcagct ccacgaaaag tccgccctcg 120cattcagcgt ccacaccggc aggcaaggcc tcgcaaggag gaggccaaca tgctgcacag 180acaggacaga gacttccagc tgtcatctcg accccaactc tacaaaaggg catcgccgga 240ggcagtcatc gaccaattga ccagaccttc aagatgaacc ccttgaacgg tacaatggct 300ttggccttac caatcccagt aactgagggc cgtggcgggt ttggtccgaa gttggaactc 360tcgtacaatt cgggctcggg aaatggttac ttcggacttg gctggcaact gaatttgagt 420tccatcaccc gtatgacctc caagcgtact cccatgtacg atgagaccga cactttcttg 480ctgagcggcg aggacgagtt ggtccgtatg ggtgaccctg aacgcattgg cgatgaattt 540tcggttcagt cgtatcaacc tcgagtcatg ggagatgctc tgaagatcga acaatggagt 600cgattgacag atccttccga tgtccactgg aggacgattt cgggctctaa tgtgacttgc 660atttatggcc agtcgagcca aacgcgaacc tcctgcaagg atcagtctgg ccgcacctat 720atcttctctt ggctactatg cagttcatac gatcccttcg ggaacttaat cacctatgaa 780tacaaggatg agaacacgca gggttttgac accttgtcgc ctgaagcgcg attgcaggaa 840cagaatcgag ccatggaaac agttggacgt gcaaagtact tgaaggcgat caagtacggc 900aatgcacttc ctaatcgaga tattagtagt tggaagccac tcgaacatga cgggcaatac 960cacttccaag tagttcttga ctacggagaa catgacatcg acaacccgga tgttcaggca 1020gaatcaccct gggtggtcag acaagacaga ttctcaacag cggcagccgg ctttgaagta 1080cgctggctac ggctgtgtcg ccgcattctc atgttccatt actttccgaa ggagctgtca 1140

gagaagcatt gtctcgtgcg ttctgtttcg atgcagtatc aagagtcatc cgtggcctct 1200

ttcttatctt cactaacaga acgggggcat tggttcaatc acgaaacgaa tgagatgcaa 1260

catcaagcgc taccgccata cactttccag tataacatgc cgatcgatgt gtccagcgcc 1320 aaagtcgagc acatgaatac cgataatctg ccgaatttac ccagcccagg tgggaatgag 1380

tggcaatggg tggatttgtt gggagaggga gcgcctgggc tacttgaaca acgtcccgac 1440

ggttcttgga acttccgtaa gaactacaat atcatagatg aatcatcagt tccgaagttc 1500

gattcatcta tgaccatacc tgcccgaccg aaccgaaacc tgggcaàatc ggcttacttt 1560

gaggacttga accaagatgg aaagctcgaa ctagtgtgtc tagacgacat aaacaggttg 1620 gaaggcttct accaccaata tgatgaggga tggattggtt acactacctt ctcgtcaact 1680

ccaaatcgag ataccaccgc agtcttcttc aagcagcttg atctcactgg aaatgggctt 1740

gcagatcttg tggcagttga tgccgtgaat agagagatta tgtggcaaga aaacttgggc 1800

gcagctggat ttgctccatt gagggaatgc gtcaacagta cgggtgttcc gcagctgatg 1860

tctgatgacc ctacggtaca ggtcactctt gctgatatga caggtgacgg tcggtcagat 1920 gtcgtacagg tctcttcagg ctatgtcaag tactggcaga atctatcata cggacaattc 1980

agtgacccgg tctgtatgta caatgcccca aagctggata gtgatatctc cattgccgaa 2040

agaatacgcc ttgttgatat caatggatcg ggtaccaacg atctgatcta catgcctgca 2100

ggtggtggtc tgcacgttta tttcaaccaa gcaggaaacg gctggagtga tccacagatt 2160

ctggagtcat tcccgtcggt tgaccagctg agtagcgtct ctacggtgga cctgtttggt 2220 aaagggacgg catgtttatg ttggagcggc aaggtacttg ggtcaaactc agcgcagact 2280

ctctactatg tcgaccttgc ccctggacca aagcccaact gcctagctac ataccaaaat 2340

gggaggggat cgcgagtaga agtctcgtat cggtcttcca actggtatta cctccaggat 2400

gagcgtgcag gagcaccatg ggctacaaaa atagggtttc ccgttcagtg tgtcagtcaa 2460

gtcaggttct tggacgatac aactggactt ttgaacacca agagtttcac ttatcatgat 2520

ggctactacg atgctcccga tagggagttt agaggctttg ggatggtcga acagcttgaa 2580

tcgactgttt tcaacgccga tacgtcatca gaataccgcc aaacagctac catcaccaaa 2640

acctggtttc atacaggggc aatgacacca actaagtgcc gtctagagcg agcaacctct 2700

ggagctcttt tcggttctta ctggtgcgta gagtcattca agctcgaaga tcggcgtgac 2760

tgctgccggg ccctcaaagg aatgcagctc cgagaagaaa ttattggcca cgttgggact 2820

gcacttacag aacatgccta tcaagtgaca gatactgctc accaagtggt ccagctctct 2880

cctaggaaag gcgtattgca gccaggcaca tatcgttgcg tgccacgcga aatactcaag 2940

actcacaatg atcggtcgcc ggaatcatta ccacgctaca gccacgaact catcctagag 3000acgaacagat tcaatgatag actgaagtca atggaaattt tctatgggca ctcaggcgga 3060

gaggccctgg attctgtcca gaaggaaagt gtcctgacgt acatagagaa cgaatattgt 3120

ctgcctgtcc tcgacaagga caatgggatc ttcgtaaagc caatgccgtc agtcactcgc 3180

aaatatcgta ttgttggtct ggactggtca agcaataaca tacaatcggc ctttaccaag 3240

' 5 tttactagtg gcagtttcca ggtattgcgg agtattcccg aagtcçcata cacagatcag 3300

attctacctc catgttcttc agaagcccga gtaaagatcg aagagagacg gacattatat 3360

cgcaaccagg acttctctca agtacagcca ttacctctgg ggcaatttca ggcttactcg 3420

gtgatccatg gtattcttga cctagctgga ggagacagat ggtttcaagc cctgctcaag 3480

gactatttac ctgataattc agacttggat agctttatga ctacatatgg gtatatcaaa 3540

10 acaacggagg aaaacggcac tactctttgg tggcgccttt cttcgcgtaa tctttttggt 3600

cctgacgcaa aaaatgaact cgccaaggcc agaaagtgct tttacacacc gacgatcacc 3660

caggatccct ttgacaaccg gagtacagtt cagatggatg actataacct actgccaagg 3720

ctttctactg atgcggttgg aaatgtcacc aatgtggata tggattacag atacatgtct 3780

ccatcgtgtg tcgttgatcc aaaccgcaat cgaaccacct atagctacga cctgttgggt 3840

15 agagtcgtgg caacagcccg atctgggaaa gagaaagaat cagttggtga caatctcaac 3900

acaacagtca agctaccctc acaagctgac aaggatgttt tctttgcatg tccgacgcaa 3960

gaggctgctt tcaagctttt aggtggtgcc actagttacc gcctgtacta cgatgctcaa 4020

gccaagcatc ccagagcgct tttggatacc agtcccactg cctttatcga catcagtcga 4080

acttcccacc atgcggatgg agccagtgct agtgatattt ccatatcgat cacttacctg 4140

20 gatggcaatc ttgctgagct gcaaacgatc agcttgactg gcacagtcga ggatggatat 4200

aagtggaaca ttggtgaatg gagtttacga aatagcagag gggacccggt tcgcacgttt 4260

cagccatgct ataccgattc gcatgggttc attcattctt ctgagagcca gtcgaaaatg 4320

accaccatga tctatgatcc cctgggcaga ctagtcggta cattctatcc tgaccacgca 4380

tactcgaaag tgagatatga gacttgggca actacaaact acgacagagg ggatacagtc 4440

25 ttgatggacc tcgccgagga caaagatctc agtatctata ccagcgttct cgcaaaggag 4500

aactatagtc ccagctggca cgctagcgcg tcgacccaag agctttcacg cagggctgta 4560

gcaaaggttt cggaggttta cagtgagaca cccgataaga cttatctgga tgcgcaagag 4620

cgtccaattc taagaatcag agattgcaaa acggccaaga taaagacgcg gagtagttac 4680

agtctagcag ggcatttggc ccaaacaaca gatggtagag gtcgtcttgc tgaaagcgta 4740

30 acctctgact tgctaggccg tgacatactc cgtcaaggta tggacactgg catggttttt 4800

accttccacg actgcatgga ccgcactgtg atactgatgg atggccgtaa ctggaggcaa 4860

cggtcggtat acgatgctgc aggtagaàag acccatctct ggctctggca acacggtgga 4920accgaattct tggcagaatt aattcgctat ggagaggctg ttgaaaacgc tgaggctttg 4980

aacctacgtg gaaaggtatg tgagatccgg gatcaatcag gaatccagaa gaacaaagtc 5040

tttgacttca aaggaaactt tgtcgagtca actacccagt tcacgactga atacaaaggc 5100

tcgatcaact ggggagctga gagcaacccc aagctggacc ccgaggttta cacggttcga 5160

5 aaggcttatg atgccatgga cagagtggtc gagtcatatg acgtcgaagg tgcagtcaca 5220

aggcatagtt atggcatctc tggacagctc aatcgggttt catacaagag cagagggcag 5280

aaggagtatc cctggaaaga ttacatgagc gacatcaggt atgcggctga tggacaaccg 5340

gagcaaatcc tgtacggaaa cggtgtcttg gcgacctttc agtatgactt agcgaccaga 5400

ctcatgaatc gaaagagact catccgccag aatgacaaga gagtcatgga agacacacaa 5460

10 tattcacacg atgttatgca tcnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5520

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5580

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5640

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5700

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5760

15 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5820

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5880

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 5940

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6000

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6060

20 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6120

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccagttacc ggcatagtgc agatagcagg gaaggagtcc 6180

caggtaggat gatggttgat agcattgctc aaaggggaaa acgccaccca ggcccaaaag 6240

gtcaaatgtg ggtgcggagc tatggcgtat gaggaaaaga gtcgggtcaa ggaaggcgag 6300

tctgaaaata ggctcagcta cacttcaaag agtggtcaaa cagaaaaatg gacgtacggc 6360

"25 gatgggagcc aacactggct ttgctggtag tgtcactgcc ggtggcggga tgcattccat 6420

gtactgggat cctttcaacc gtctcaagtc ttgctcaagg caagtcaaga agagtggtgt 6480

acçagaaact acatggtatg tgtacaacag tgaaggaaag agggtacgga aaataacgga 6540

gcgatcatcg tccgggtcgg atgatccaag aatgctgaaa gaaacaacct tcttttccaa 6600

tttgcacata taccagtgca agactgggga cggatctggc cacagcaagg ataaacgcta 6660

30 ccatctgatc catagtgccg aacagaaact cgtggccatt gctgaagagg acaaggctgt 6720

gtcttcagag tcttcccctc tagtcagata tcacatgtcc gacaagctag agttagatca 6780

ttcggggctt gtcataactt acgaggagta ttcacccttt ggatcaagct ccttttctct 6840tcgacgatcg gaacaagagg catcccgcaa gtacagattt gctggctacg agagagataa 6900agagaccggg ctctactact gcaacgcgcg gtactatgct ccgtggcttg ggcgatggat 6960gtcaccagac cctatcggaa ccaaggatgg gctaaacttg tactgctact gcggtaatga 7020cccggtgaac tacattgatç ctaccggaac tacgggtctg ttcaaggcca tgcgaatagc 70801 5 agcagtgcca ctagccaagg ccgcgatgag aatgaacgaa atcacaaaat cgggtgcagt 7140gtttgagccc taccagcgat cctggctctc ggagatttcc aagccgagtc gaggctgctc 7200ggcggctttc ctggatgatg ccggattctt gactgagaat gaaaagttga ggaacctgca 7260ggaatacaac gcgaagatgg aacagcaggt acaacgtccg ctgagtcata tgtctccgga 7320actcatgaag gaaatgggaa cgtacgacat taagcagtac ctcactgaat ttgggaagga 7380

10 aggtctaatt cagggaggca aggagctggc cttatttggt gctgccgcga tcggcacccg 7440gattccccta ctaagcatgt cctcgccttt aggatttgtg cccggtattg tttatggcgt 7500tgcctgcgat acggtcatag atgctgtagç ggagaagatt cgtgagggaa tggcgggtcc 7560aaatgagtac gcgcaggaag acgcacagag ccacgtagaa acgatgaaca agttacggca 7620gggtccgcgg gaattcgcac agggcttagc gcaggattgg ttcatgggcc atttccagga 7680

15 taaatgagat catcatttgc tttc 7704<210> 34<211> 1820<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

20 <400> 34

Ala lie Vai Met Ser Gly Lys Met Asn Arg Lys Ser Arg Tyr His Pro1 5 10 15

Ser Asp Ala Vai Ala Pro Asn Thr Gly Ser Ser Thr Lys Ser Pro Pro20 25 30

25 Ser His Ser Ala Ser Thr Pro Ala Gly Lys Ala Ser Gln Gly Gly Gly35 40 45

Gln His Ala Ala Gln Thr Gly Gln Arg Leu Pro Ala Vai lie Ser Thr

50 55 60

Pro Thr Leu Gln Lys Gly lie Ala Gly Gly Ser His Arg Pro lie Asp30 65 70 75 80

Gln Thr Phe Lys Met Asn Pro Leu Asn Gly Thr Met Ala Leu Ala Leu85 90 95Pro lie Pro Vai100

Leu Ser Tyr Asn115

Gln Leu Asn Leu130

Met Tyr Asp Glu145

Vai Arg Met Gly

Ser Tyr Gln Pro180

Ser Arg Leu Thr195

Ser Asn Vai Thr210

Cys Lys Asp Gln225

Ser Ser Tyr Asp

Glu Asn Thr Gln260

Glu Gln Asn Arg275

Ala lie Lys Tyr290

Lys Pro Leu Glu305

Tyr Gly Glu His

Trp Vai Vai Arg340

Thr Glu Gly Arg

Ser Gly Ser Gly120

Ser Ser lie Thr135

Thr Asp Thr Phe150

Asp Pro Glu Arg165

Arg Vai Met Gly

Asp Pro Ser Asp200

Cys lie Tyr Gly215

Ser Gly Arg Thr230

Pro Phe Gly Asn245

Gly Phe Asp Thr

Ala Met Glu Thr280

Gly Asn Ala Leu295

His Asp Gly Gln310

Asp lie Asp Asn325

Gln Asp Arg Phe

Gly Gly Phe Gly105

Asn Gly Tyr Phe

Arg Met Thr Ser140

Leu Leu Ser Gly155

lie Gly Asp Glu170

Asp Ala Leu Lys185

Vai His Trp Arg

Gln Ser Ser Gln220

Tyr lie Phe Ser235

Leu lie Thr Tyr250

Leu Ser Pro Glu265

Vai Gly Arg Ala

Pro Asn Arg Asp300

Tyr His Phe Gln315

Pro Asp Vai Gln330

Ser Thr Ala Ala345

Pro Lys Leu Glu110

Gly Leu Gly Trp125

Lys Arg Thr Pro

Glu Asp Glu Leu160

Phe Ser Vai Gln175

lie Glu Gln Trp190

Thr lie Ser Gly205

Thr Arg Thr Ser

Trp Leu Leu Cys240

Glu Tyr Lys Asp255

Ala Arg Leu Gln270

Lys Tyr Leu Lys285

lie Ser Ser Trp

Vai Vai Leu Asp320

Ala Glu Ser Pro335

Ala Gly Phe Glu350Vai Arg Trp Leu355

Pro Lys Glu Leu370

Gln Tyr Gln Glu`385

Arg Gly His Trp

Leu Pro Pro Tyr420

Ala Lys Vai Glu435

Pro Gly Gly Asn450

Pro Gly Leu Leu465

Asn Tyr Asn lie

Met Thr lie Pro500

Phe Glu Asp Leu515

Asp lie Asn Arg530

lie Gly. Tyr Thr545

Vai Phe Phe Lys

Vai Ala Vai Asp580

Gly Ala Ala Gly595

Arg Leu Cys Arg360

Ser Glu Lys His375

Ser Ser Vai Ala390

Phe Asn His Glu405

Thr Phe Gln Tyr

His Met Asn Thr440

Glu Trp Gln Trp455

Glu Gln Arg Pro470

lie Asp Glu Ser485

Ala Arg Pro Asn

Asn Gln Asp Gly520

Leu Glu Gly Phe535

Thr Phe Ser Ser550

Gln Leu Asp Leu565

Ala Vai Asn Arg

Phe Ala Pro Leu600

300

Arg lie Leu Met

Cys Leu Vai Arg380

Ser Phe Leu Ser395

Thr Asn Glu Met410

Asn Met Pro lie425

Asp Asn Leu Pro

Vai Asp Leu Leu460

Asp Gly Ser Trp475

Ser Vai Pro Lys490

Arg Asn Leu Gly505

Lys Leu Glu Leu

Tyr His Gln Tyr540

Thr Pro Asn Arg555

Thr Gly Asn Gly570

Glu lie Met Trp585

Arg Glu Cys Vai

Phe His Tyr Phe365

Ser Vai Ser Met

Ser Leu Thr Glu400

Gln His Gln Ala415

Asp Vai Ser Ser430

Asn Leu Pro Ser445

Gly Glu Gly Ala

Asn Phe Arg Lys480

Phe Asp Ser Ser495

Lys Ser Ala Tyr510

Vai Cys Leu Asp525

Asp Glu Gly Trp

Asp Thr Thr Ala560

Leu Ala Asp Leu575

Gln Glu Asn Leu590

Asn Ser Thr Gly605`Vai Pro Gln Leu610

Asp Met Thr Gly625

Tyr Vai Lys Tyr

Vai Cys Met Tyr660

Glu Arg lie Arg675

lie Tyr Met Pro690

Gly Asn Gly Trp705

Asp Gln Leu Ser

Ala Cys Leu Cys740

Thr Leu Tyr Tyr755

Ala Thr Tyr Gln770

Ser Ser Asn Trp785

Ala Thr Lys lie

Leu Asp Asp Thr820

Asp Gly Tyr Tyr835

Vai Glu Gln Leu850

Met Ser Asp Asp615

Asp Gly Arg Ser630

Trp Gln Asn Leu645

Asn Ala Pro Lys

Leu Vai Asp lie680

Ala Gly Gly Gly695

Ser Asp Pro Gln710

Ser Vai Ser Thr725

Trp Ser Gly Lys

Vai Asp Leu Ala760

Asn Gly Arg Gly775

Tyr Tyr Leu Gln790

Gly Phe Pro Vai805

Thr Gly Leu Leu

Asp Ala Pro Asp840

Glu Ser Thr Vai855

Pro Thr Vai Gln620

Asp Vai Vai Gln635

Ser Tyr Gly Gln650

Leu Asp Ser Asp665

Asn Gly Ser Gly

Leu His Vai Tyr700

lie Leu Glu Ser715

Vai Asp Leu Phe730

Vai Leu Gly Ser745

Pro Gly Pro Lys

Ser Arg Vai Glu780

Asp Glu Arg Ala795

Gln Cys Vai Ser810

Asn Thr Lys Ser825

Arg Glu Phe Arg

Phe Asn Ala Asp860

Vai Thr Leu Ala

Vai Ser Ser Gly640

Phe Ser Asp Pro655

lie Ser lie Ala670

Thr Asn Asp Leu685

Phe Asn Gln Ala

Phe Pro Ser Vai720

Gly Lys Gly Thr735

Asn Ser Ala Gln750

Pro Asn Cys Leu765

Vai Ser Tyr Arg

Gly Ala Pro Trp800

Gln Vai Arg Phe815

Phe Thr Tyr His830

Gly Phe Gly Met845

Thr Ser Ser GluTyr Arg Gln Thr Ala Thr lie Thr Lys Thr Trp Phe His Thr Gly Ala865 870 875 880

Met Thr Pro Thr Lys Cys Arg Leu Glu Arg Ala Thr Ser Gly Ala Leu

885 890 895

Phe Gly Ser Tyr Trp Cys Vai Glu Ser Phe Lys Leu Glu Asp Arg Arg

900 905 910

Asp Cys Cys Arg Ala Leu Lys Gly Met Gln Leu Arg Glu Glu lie lie

915 920 925

Gly His Vai Gly Thr Ala Leu Thr Glu His Ala Tyr Gln Vai Thr Asp

930 935 940

Thr Ala His Gln Vai Vai Gln Leu Ser Pro Arg Lys Gly Vai Leu Gln'945 950 955 960

Pro Gly Thr Tyr Arg Cys Vai Pro Arg Glu lie Leu Lys Thr His Asn

965 970 975

Asp Arg Ser Pro Glu Ser Leu Pro Arg Tyr Ser His Glu Leu lie Leu

980 985 990

Glu Thr Asn Arg Phe Asn Asp Arg Leu Lys Ser Met Glu lie Phe Tyr

995 1000 1005

Gly His Ser Gly Gly Glu Ala Leu Asp Ser Vai Gln Lys Glu Ser

1010 1015 1020

Vai Leu Thr Tyr lie Glu Asn Glu Tyr Cys Leu Pro Vai Leu Asp

1025 1030 1035

Lys Asp Asn Gly lie Phe Vai Lys Pro Met Pro Ser Vai Thr Arg

1040 1045 1050

Lys Tyr Arg lie Vai Gly Leu Asp Trp Ser Ser Asn Asn lie Gln

1055 1060 1065

Ser Ala Phe Thr Lys Phe Thr Ser Gly Ser Phe Gln Vai Leu Arg

1070 1075 1080

Ser lie Pro Glu Vai Pro Tyr Thr Asp Gln lie Leu Pro Pro Cys

1085 1090 1095

Ser Ser Glu Ala Arg Vai Lys lie Glu Glu Arg Arg Thr Leu Tyr

1100 1105 1110Arg Asn Gln Asp Phe Ser Gln Vai Gln Pro Leu Pro Leu Gly Gln

1115 1120 1125

Phe Gln Ala Tyr Ser Vai lie His Gly lie Leu Asp Leu Ala Gly

1130 1135 1140

Gly Asp Arg Trp Phe Gln Ala Leu Leu Lys Asp Tyr Leu Pro Asp

1145 1150 1155

Asn Ser Asp Leu Asp Ser Phe Met Thr Thr Tyr Gly Tyr lie Lys

1160 1165 1170

Thr Thr Glu Glu Asn Gly Thr Thr Leu Trp Trp Arg Leu Ser Ser

1175 1180 1185

Arg Asn Leu Phe Gly Pro Asp Ala Lys Asn Glu Leu Ala Lys Ala

1190 1195 1200

Arg Lys Cys Phe Tyr Thr Pro Thr lie Thr Gln Asp Pro Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Arg Ser Thr Vai Gln Met Asp Asp Tyr Asn Leu Leu Pro Arg

1220 1225 1230

Leu Ser Thr Asp Ala Vai Gly Asn Vai Thr Asn Vai Asp Met Asp

1235 1240 1245

Tyr Arg Tyr Met Ser Pro Ser Cys Vai Vai Asp Pro Asn Arg Asn

1250 1255 1260

Arg Thr Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu Leu Gly Arg Vai Vai Ala Thr

1265 1270 1275

Ala Arg Ser Gly Lys Glu Lys Glu Ser Vai Gly Asp Asn Leu Asn

1280 1285 1290

Thr Thr Vai Lys Leu Pro Ser Gln Ala Asp Lys Asp Vai Phe Phe

1295 1300 1305

Ala Cys Pro Thr Gln Glu Ala Ala Phe Lys Leu Leu Gly Gly Ala

1310 1315 1320

Thr Ser Tyr Arg Leu Tyr Tyr Asp Ala Gln Ala Lys His Pro Arg

1325 1330 1335

Ala Leu Leu Asp Thr Ser Pro Thr Ala Phe lie Asp lie Ser Arg

1340 1345 1350Thr Ser His His Ala Asp Gly Ala Ser Ala Ser Asp lie Ser lie

1355 1360 1365

Ser lie Thr Tyr Leu Asp Gly Asn Leu Ala Glu Leu Gln Thr lie

1370 1375 1380

Ser Leu Thr Gly Thr Vai Glu Asp Gly Tyr Lys Trp Asn lie Gly

1385 1390 1395

Glu Trp Ser Leu Arg Asn Ser Arg Gly Asp Pro Vai Arg Thr Phe

1400 1405 1410

Gln Pro Cys Tyr Thr Asp Ser His Gly Phe lie His Ser Ser Glu

1415 1420 1425

Ser Gln Ser Lys Met Thr Thr Met lie Tyr Asp Pro Leu Gly Arg

1430 1435 1440

Leu Vai Gly Thr Phe Tyr Pro Asp His Ala Tyr Ser Lys Vai Arg

1445 1450 1455

Tyr Glu Thr Trp Ala Thr Thr Asn Tyr Asp Arg Gly Asp Thr Vai

1460 1465 1470

Leu Met Asp Leu Ala Glu Asp Lys Asp Leu Ser lie Tyr Thr Ser

1475 1480 1485

Vai Leu Ala Lys Glu Asn Tyr Ser Pro Ser Trp His Ala Ser Ala

1490 1495 1500

Ser Thr Gln Glu Leu Ser Arg Arg Ala Vai Ala Lys Vai Ser Glu

1505 1510 1515

Vai Tyr Ser Glu Thr Pro Asp Lys Thr Tyr Leu Asp Ala Gln Glu

1520 1525 1530

Arg Pro lie Leu Arg lie Arg Asp Cys Lys Thr Ala Lys lie Lys

1535 1540 1545

Thr Arg Ser Ser Tyr Ser Leu Ala Gly His Leu Ala Gln Thr Thr

1550 1555 1560

Asp Gly Arg Gly Arg Leu Ala Glu Ser Vai Thr Ser Asp Leu Leu

1565 1570 1575

Gly Arg Asp lie Leu Arg Gln Gly Met Asp Thr Gly Met Vai Phe

1580 1585 1590Thr Phe His Asp Cys Met Asp Arg Thr Vai lie Leu Met Asp Gly

1595 1600 1605

Arg Asn Trp Arg Gln Arg Ser Vai Tyr Asp Ala Ala Gly Arg Lys

1610 1615 1620

Thr His Leu Trp Leu Trp Gln His Gly Gly Thr Glu Phe Leu Ala

1625 1630 1635

Glu Leu lie Arg Tyr Gly Glu Ala Vai Glu Asn Ala Glu Ala Leu

1640 1645 1650

Asn Leu Arg Gly Lys Vai Cys Glu lie Arg Asp Gln Ser Gly lie

1655 1660 1665

Gln Lys Asn Lys Vai Phe Asp Phe Lys Gly Asn Phe Vai Glu Ser

1670 1675 1680

Thr Thr Gln Phe Thr Thr Glu Tyr Lys Gly Ser lie Asn Trp Gly

1685 1690 1695

Ala Glu Ser Asn Pro Lys Leu Asp Pro Glu Vai Tyr Thr Vai Arg

1700 1705 1710

Lys Ala Tyr Asp Ala Met Asp Arg Vai Vai Glu Ser Tyr Asp Vai

1715 1720 1725

Glu Gly Ala Vai Thr Arg His Ser Tyr Gly lie Ser Gly Gln Leu

1730 1735 1740

Asn Arg Vai Ser Tyr Lys Ser Arg Gly Gln Lys Glu Tyr Pro Trp

1745 1750 1755

Lys Asp Tyr Met-Ser Asp lie Arg Tyr Ala Ala Asp Gly Gln Pro

1760 1765 1770

Glu Gln lie Leu Tyr Gly Asn Gly Vai Leu Ala Thr Phe Gln Tyr

1775 1780 1785

Asp Leu Ala Thr Arg Leu Met Asn Arg Lys Arg Leu lie Arg Gln

1790 1795 1800

Asn Asp Lys Arg Vai Met Glu Asp Thr Gln Tyr Ser His Asp Vai

1805 1810 1815Met His

1820<210> 35<211> 494<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 35

His Cys Ser Lys Gly Lys Thr Pro Pro Arg Pro Lys Arg Ser Asn Vai

15 10 15

Gly Ala Glu Leu Trp Arg Met Arg Lys Arg Vai Gly Ser Arg Lys Ala

20 25 30

Ser Leu Lys lie Gly Ser Ala Thr Leu Gln Arg Vai Vai Lys Gln Lys

35 40 45

Asn Gly Arg Thr Ala Met Gly Ala Asn Thr Gly Phe Ala Gly Ser Vai

50 55 60

Thr Ala Gly Gly Gly Met His Ser Met Tyr Trp Asp Pro Phe Asn Arg65 70 75 80

Leu Lys Ser Cys Ser Arg Gln Vai Lys Lys Ser Gly Vai Pro Glu Thr

85 90 95

Thr Trp Tyr Vai Tyr Asn Ser Glu Gly Lys Arg Vai Arg Lys lie Thr

100 105 110

Glu Arg Ser Ser Ser Gly Ser Asp Asp Pro Arg Met Leu Lys Glu Thr

115 120 125

Thr Phe Phe Ser Asn Leu His lie Tyr Gln Cys Lys Thr Gly Asp Gly

130 .135 140

Ser Gly His Ser Lys Asp Lys Arg Tyr His Leu lie His Ser Ala Glu145 150 155 160

Gln Lys Leu Vai Ala lie Ala Glu Glu Asp Lys Ala Vai Ser Ser Glu

165 170 175

Ser Ser Pro Leu Vai Arg Tyr His Met Ser Asp Lys Leu Glu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Leu Vai lie Thr Tyr Glu Glu Tyr Ser Pro Phe Gly Ser

195 200 205

Ser Ser Phe Ser Leu Arg Arg Ser Glu Gln Glu Ala Ser Arg Lys TyrArg Phe Ala Gly225

Asn Ala Arg Tyr

Pro lie Gly Thr260

Asp Pro Vai Asn275

Ala Met Arg lie290

Asn Glu lie Thr305

Trp Leu Ser Glu

Leu Asp Asp Ala340

Gln Glu Tyr Asn355

His Met Ser Pro370

Gln Tyr Leu Thr385

Glu Leu Ala Leu

Leu Ser Met Ser420

Vai Ala Cys Asp435

Gly Met Ala Gly450

Vai Glu Thr Met

215

Tyr Glu Arg Asp230

Tyr Ala Pro Trp245

Lys Asp Gly Leu

Tyr lie Asp Pro280

Ala Ala Vai Pro295

Lys Ser Gly Ala310

lie Ser Lys Pro325

Gly Phe Leu Thr

Ala Lys Met Glu360

Glu Leu Met Lys375

Glu Phe Gly Lys390

Phe Gly Ala Ala405

Ser Pro Leu Gly

Thr Vai lie Asp440

Pro Asn Glu Tyr455

Asn Lys Leu Arg

307

220

Lys Glu Thr Gly235

Leu Gly Arg Trp250

Asn Leu Tyr Cys265

Thr Gly Thr Thr

Leu Ala Lys Ala300

Vai Phe Glu Pro315

Ser Arg Gly Cys330

Glu Asn Glu Lys345

Gln Gln Vai Gln

Glu Met Gly Thr380

Glu Gly Leu lie395

Ala lie Gly Thr410

Phe Vai Pro Gly425

Ala Vai Ala Glu

Ala Gln Glu Asp460

Gln Gly Pro Arg

Leu Tyr Tyr Cys240

Met Ser Pro Asp255

Tyr Cys Gly Asn270

Gly Leu Phe Lys285

Ala Met Arg Met

Tyr Gln Arg Ser320

Ser Ala Ala Phe335

Leu Arg Asn Leu350

Arg Pro Leu Ser365

Tyr Asp lie Lys

Gln Gly Gly Lys400

Arg lie Pro Leu415

lie Vai Tyr Gly430

Lys lie Arg Glu445

Ala Gln Ser HisGlu Phe Ala Gln465 470 475 480

Gly Leu Ala Gln Asp Trp Phe Met Gly His Phe Gln Asp Lys485 490

<210> 36<211> 962<212> DNA

<213> Fusarium verticillioides

<220>

<221> misc_feature<222> (20) .. (22)

<223> início da região codificadora correspondente a primeira glutami-

na da proteína putativa de fusão TC deduzida classe B/Classe C

<220>

<221> misc_feature

<222> (619).. (621)

<223> Códon (GAT) de ácido aspártico que inicia a segunda porção da

proteína putativa de fusão TC Classe B/Classe C<400> 36

atacgccaca gagtattagc agatgctgga ctggggagca gaggtataca caacagagac 60attcttcaat gccctggggc agaatatccg tgttgttgcc ccgggaggtg actctctcaa 120acgatccttt gatctcgctg ggcgattggc gaaggttgaa gcctacgcgt ctgtcagtag 180tgttgttgcc acagcctcta tcgaccatgt cacatacgag cccgacgatc aagtgggctc 240ggttctctac ggcaacggag cattggtcaa aaatacctat ggtatatctg atcacagact 300actgaaaagt cgcaacacta gcactgagga gggtcgtgtg ctgcaggaca tctcatcctg 360gtacgactgc atgggccgac tagttcgaag ggaagataag gcacaacaga ctctcttctt 420tgacaattgt cgtatcagtc ttactgaaga ctttacctac gactctctcg gccagttggt 480tgagtccggg ggttgtgagt tgacaaatct cctgacggtc ctgggagaac cagtccacca 540gatcctcacc tacgtcgctc taccaatctt tcaggagacg ggaaacaaat ggcaccgttt 600gtagagaggt atacctaaga tgtttgtgga aacatattga ggatggggca tggacttcag 660tctgggagtg ggtggaccag aggatacaag tacgaagagc ctagccgcat tgatccaaat 720gttcacaaca accgtctaag cagctccact gttggtaatt cgacgactca ctacggctac 780aatggtattt caggaattgg tgggtgcatt gtgtccatgt ctggatactc agaccttcgc 840Tgggaccatc atgaccgtct ccgggcattt gccacgcaaa gggttacaga gggtgcaatg 900gcagcaatgg cgttcagcat ctttgtatac ttgttttata tatagttctg tcacgattca 960tt 962<210> 375 <211> 194<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 37

Gln Met Leu Asp Trp Gly Ala Glu Vai Tyr Thr Thr Glu Thr Phe Phe10 1 5 10 15

Asn Ala Leu Gly Gln Asn lie Arg Vai Vai Ala Pro Gly Gly Asp Ser

20 25 30

Leu Lys Arg Ser Phe Asp Leu Ala Gly Arg Leu Ala Lys Vai Glu Ala

35 40 45 t

15 Tyr Ala Ser Vai Ser Ser Vai Vai Ala Thr Ala Ser lie Asp His Vai50 55 60

Thr Tyr Glu Pro Asp Asp Gln Vai Gly Ser Vai Leu Tyr Gly Asn Gly65 70 75 80

Ala Leu Vai Lys Asn Thr Tyr Gly lie Ser Asp His Arg Leu Leu Lys20 85 90 95

Ser Arg Asn Thr Ser Thr Glu Glu Gly Arg Vai Leu Gln Asp lie Ser

100 105 110

Ser Trp Tyr Asp Cys Met Gly Arg Leu Vai Arg Arg Glu Asp Lys Ala115 120 125

25 Gln Gln Thr Leu Phe Phe Asp Asn Cys Arg lie Ser Leu Thr Glu Asp130 135 ■ 140

Phe Thr Tyr Asp Ser Leu Gly Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Cys Glu145 150 155 160

Leu Thr Asn Leu Leu Thr Vai Leu Gly Glu Pro Vai His Gln lie Leu30 165 170 175

Thr Tyr Vai Ala Leu Pro lie Phe Gln Glu Thr Gly Asn Lys Trp His180 185 190Arg Leu<210> 38<211> 109<212> PRT5 <213> Fusarium verticillioides

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (2)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

10 <400> 38

Xaa Xaa Asp Vai Cys Gly Asn lie Leu Arg Met Gly His Gly Leu Gln15 10 15

Ser Gly Ser Gly Trp Thr Arg Gly Tyr Lys Tyr Glu Glu Pro Ser Arg20 25 30

15 lie Asp Pro Asn Vai His Asn Asn Arg Leu Ser Ser -Ser Thr Vai Gly35 40 45

Asn Ser Thr Thr His Tyr Gly Tyr Asn Gly lie Ser Gly lie Gly Gly

50 55 60

Cys lie Vai Ser Met Ser Gly Tyr Ser Asp Leu Arg Trp Asp His His20 65 70 75 80

Asp Arg Leu Arg Ala Phe Ala Thr Gln Arg Vai Thr Glu Gly Ala Met

85 90 95

Ala Ala Met Ala Phe Ser lie Phe Vai Tyr Leu Phe Tyr100 105'25 <210> 39

<211> 8242<212> DNA

<213> Fusarium verticillioides

<220>

30 <221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> inicio da região codificada correspondete ao primeiro ácido glu-tâmico da primeira porção da proteína putativa de fusão TC de-duzida da Classe B/Classe C

<220>

<221> misc_feature

<222> (3424) .. (4432)

<223> n = a, g, c, ou t (grande lacuna na seqüência de DNA indicada

como seqüência de 1009 n's)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4435) .. (4437)

proteína deduzida de fusão TC da Classe B/Classe C<400> 39

tatactccaa gacggactga gagattttta tttcatcatg ctctgtaggc cctttaccat 60tttccatttt agtacagagt ccccagtcat ctgtcatgga tacaccgcaa gcagcaaaaa . 120

cgcaaatacc gtcacgtgac cgaagtggtc ccaagattga gcatcgcgat gccgttggca 180

catcatcttc gtcccaacag gccgctagca aaggctcaac cgcagccaaa ggcacaggaa 240

gctcttcgtc cctctccatc ccagtgctcg actctgctgc ctttgcaact ggcaaaggcg 300

ggggagcatt acgatccatc gatagtaatt tttccgtaaa ccccaacacc ggcaccttgt 360

ccttcagcgt gcccttgcct gtgtcaaaat cacgtggtgg cttccagcca tcactttctc 420

tcgagtatga ttcaggccgt ggaaatggtg cctttggcat tggttggcga cttggcggta 480

tttcaagcat tgctcgcaag atgtctcgtc gtattccgac atatggtcaa gatgacgatg 540

gagaagacct ggacactttc acgctcactg gcgctgatga tttagtccct cttagcgacg 600

agactgtcga tggcttcgtc gtgaggcagt acgcaccccg tgtacgtggc gatacagaaa 660

tgcgtgttga gcgctggatg caaggcagcc atgttatctt ctggaggaca atttcgtctg 720

aaaatgtgac aaatatttat gggcgtgacg attcctctcg tgagatggag aatccacatc 780

gagtgtttgc atggttgctc tgtgaaagct atgatgcgta.tggcaacgct atatctttca 840

catataagaa aggtgataat gaaggtatcg aagctttgcc tgcggacaga aaggcaactg 900

aaacgatgag agattctaaa gcactcacac gcgcgcgata tctcaagagc atccgatacg 960

gaaaccatac acccagtcga gatctcgaca gatggaagat tatccctgcc accgccaaca 1020

agacctatgg atggtgtttt agtattgtac tcgattacgg agaacatgac cttcagtgcc 1080

ctacaacgtt ggaatcttct cttccctggt ctgtccgaca ggatcctttc tcgacaggat 1140cccgggggtt tgaggtacgc agcctccgtctctctgagcc gggagaactc gggcgtgaagatcaagaaag tcccgccggg tctgtcattgacgcggctcg gggcgtgtat gccgcgcaga gcttgcctga cctcagaagt ttgccaattatgcccatttc ccggcctgac gccgtcactccgggcttgct tgtgcagcta gatggagcattagcctgtag tgatgatgat agcagctctaacgctagcag catcagcgac tctgagtcgg

ttggtcctat ccatgaattg agagccattctcgaagatgt tgatggaaac ggacatcaggcatctgggtt ctacgagcga atagctagtgaattatttcc gcaagtcgtc aacatggacgtgagacttga tatgactggc aatggacgac

gtagcggtct agcatggcat gaggcacttggccagatagc caacgatgct ccatcacccaatcgcacggc catttatcta gtggacatgttcaccaataa cctgataagt tattggcccatatctatgag actgccatgt cctataagcg

tgcacctgct agacgtggat ggtagcggtagaggagccaa cgtctttttc aatcacagtgcccagttccc aagcatcagc cgactcacctgtaccagctg tctctgctgg gttggtccgctcaactacct cgaccttgca gctggaggga

■ gaaagggctc tgagacgcga attaattatcaagccggagg ccagccctgg aaaacccgtccagtcagaca agaccatgtg tcacagaccagcttttttga tccgcatgat agagagtttcaagagcaaat gcgactcgca ccatctgtgt

30 ttagacatat aaagacttgg ttccacacgggtactttcga acctcatcgt atgcagactgctgctcatgt aagacgggag gcattccgag

tctgccggcg agttctcatg tttcatcatt 1200

attatctggt cgcctcgatg gagattaatt 1260

aacagatcac ctccaatggc catgtattcg 1320

gcatggcgcc tctcaaacta cgctatagcg 1380

ctaccgtctg cccgaccgca ttgcaaaatt 1440

gctgggtaga cctggatggc gaaggctcac 1500

ggtacttcca gcgcaatgaa agtcccttga 1560

tcactagttc tggggtggac acagaatcag 1620

ataagatgca ccttttaccc aaggacggct 1680

cgggcctgaa agactttact cgcagcacct 1740

acgtggttgt tgtggatgaa caaggtcgcg 1800

acgacggaga tgacggctgg actccattgc 1860

ttcaaacagc cgaggcaaaa acccattcga 1920

cagacatact gctcgaggta gctggtggag 1980

gcaaaagagg catggatgct ctaagggaat 2040

cagccccgcc actgaatctc acaggagatg 2100

ctggcgacgg tcttcaggat atcgtgcgta 2160

atttgggata cggaagcttt ggccatgaaa 2220

aggatgacgc aagcttcaac gttctacgac 2280

ctacagatat catatacctt ccaccagaag 2340

gcaatgcctt cagtgcgcca ttatctctac 2400

cagtgtttgc cctggacttg ctgggaaaag 2460

gggctggcag cggtactgat gaatttgtca 2520

aaccccatct tctgtgccat ctcgacgatg 2580

gtccatccac ggccttctac ctgagcgata 2640

tgccgtttcc tgtacacgtt gtgcgcaagg 2700

agctgacaac aacctacgcc tatcgcgatg 2760

gcggctttgg aacggtgcac atttgggagc 2820

catcctcgtc cacaacgtat aagctgcctg 2880

gtgctacaga gtcatcttgg ctcccaacag 2940

ttttaccaga caacgctggc ccatctgctg 3000

ccctcaaggg attgcagatg cgttctgaag 3060tgtatcagaa agggaggtcg agctccagta acacacctat ctcaatttca gagacggcat 3120

tcgacatcca gcttctccag atgcctgtcg acagtcatat gaatgaaagg gccaagttca 3180

agcacgaaaa acctgggatc tcccgcgtgc ttccgcgcga gcagctgatg gagatctgtg 3240

agcggcagaa aggagaaaat gctcgtttgc agcacgaaat gatacttgaa cgaaacgagt 3300

5 acggctctgt ccgacgaaag ctgaccgtgt cgtatggttg tacaccggga tctcaagtat 3360

cctttgcatc catagttgag gctttgaaga atgggaaaca ggatgcagcg tctgctctcg 3420

agannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3480

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3540

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3600

10 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3660

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3720

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 37 80

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3 900

15 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3960

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4020

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4080

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4140

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4200

20 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4260

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 432 0

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4380

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntcttgacc 4440

gaggctggtt tcgttcaact acccaaagac gatcgatggt ggaagccttc gagccgacag 4500

25 tctttttctg cgccctgcca tgctgctggc tccgagcttg tgagtgcccg caaaagtttc 4560

ttcacaccca ccatggaagc cgatgttttc cagaacacca ccagtgtgaa gatggacagc 4620

tacatgttgc tccccgaggt ctataccaac gctgcgggtc accagactaa agcagaaaat 4680

gactaccgca ccttaacagc ccgtgtcatg acggattgta acatgaatcg cactgcagct 4740

gaaggagatg cccttggtaa cacgcacgct gtatcacgca tgggcaaaga agaagagaaa 4800

30 ttgggcgatg accatgccgt ggagaaccta gtttcacaag ggctcataga cgacttcctc 4860

tttaatccgg ccgaggacaa ggcaattggt atgttgggtg gccgcgggtc tttgtcactg 4920

tactcgcatc gactcaatgg agacactcca ccttatcgga tcgatatcac tcgcgatact 4980cacgcccatc cagatggaga cgatgaaaggactttcttcg acccacaagg ccggacggtccagcgttggg acattactgg ctgtactgcgcaccatgctt tcaccagctc gactccggcc gctacggtgc agtttgtaga tgctaccggtacatggagca aagtgcactt cacgccttggttgggcattg aagatccagc ggaggacccgagaggtgcat actccccttc atggcttgaggctactggac agaaggccat ggacgcctac

ggtcgtggca atgggctgtc taagattcaaattgccgttc actatgaata tgacgctttgggccgtacgg tgcagactac ccagtacaatatggacaagt gcgaggagat atctctaagtgacctgggtc cgggctcacg acgtcgaatg

acctgggttc gcgcgagctc acacgaacgcagcaccaaca caagtgagtc caggtccatcgaccaggccg gaacacgcaa gtttgacaagactcgggtgt tttctgagga atacaagactaagatgcaaa accacatgac ctaccactct

atcttcgaag aaaatgctca tggccgccaagtcgttcacc tgcaatctaa agcacatcagtcaaccttca cctcagatct actacccgtgcagcatgagt acgaccaata caccagacttagtagcctgg ttgaagacat tacccatata ttggacgcag cacaagagac agtcttctactactggtacg atttccatga tcgcctggtcggacagaaac agcaacaagg tccctttttcttgacatgct atacggagac gtacagataccacgatatat cagatacgac catgccaaac

agtcgtattg agcctgacaa gatgagcaatgaaagcaaac aatttgagta caatgccaattacgttggat gggaccctat ggattctctc

cctttgaagc gcaacttccc agtcaaagta 5040

caagagtcgc accttgcgtc atgggacaaa 5100

tttgatgcta agggccacgc gatacaaaca 5160

tttgtgccag tttcaaagag aaacagccct 5220

cgccaggttg ggcagctcga cccgggccat 5280

gcacaatggg tgtttgacaa aggtgctact 5340

gatgttggag tctacatgtc tgcgcttgga 5400

atgcatcgaa gtgcaggtgg gattctacaa 5460

gccaatcatg cgatggtgct cctgtatgat 5520

ggtgtgcgtc aagatagggc aacacaacca 5580

ggccatcttg cgcgtgaggt agatgctctt 5640

cgccttggac aacaaatgat caagaagagc 5700

gacattaatg gccaaccagt ctacctttgg 5760

gtctataaca atctgcgcca gcaaacagag 5820

gaaattcttt ggactcgaac ggtgtataac 5880

aacatgctgg ggcaagtcat gaggatcgaa 5940

tatgacttca aaggcacagc cattgcggaa 6000

ggactagact ggtcggctgt ccctgttcca 6060

agccttcgac tcgatgcagc cggcaggcca 6120

acacgacggt gctacgatgt tcgcggtaat 6180

caagacagtt ggactgtaca tctccaagat 6240

aatgtcactc gcggtaatgg caccaagacc 6300

ctaaccaaca gaagaaccag gcgctctgat 6360

tacgactgca tgggccgcac ttcgcgaact 6420

cgcaaccagc gaatagaacc tgttaacgag 6480

aaggctacag gaagagagat ggtttcactg 6540

agacagcaca taaacggcga tgccaagcaa 6600

gatgacgccg gcaacatact cgagcaccgg 6660

tggactcgga ttcaccgata caatcaaacc 6720

cgactgacat cggtgtcaat atctggcgta 6780

ggtgccacgg tatcactgcc agggttctcc 6840

cattgcgtat caactcagat tgtcaatcca 6900ggagatgaaa cagcgattcc cgaaacaacg ttcttcgtct acgacaagga cggtacacgt 6960

gtcagaaaag tcacagaatc atcacgatca tgttgcaaga tgaaggagac attgtatctc 7020

ggccctgcag ctgaacactc cctgacctat tctggtgagg gcgtgactcc agactcggag 7080

gtgactacgt gccacctctt tcccgcgaca tcggaccctg gtaccaccgc ggtcgtaact 7140

5 atagagcact atgttaaagc agctaatcct aagctcggaa acaagactct acaacgctac 7200

aacctcagca acaatctcga agtggacgag gacggacaca ccatctccta tgaagagtat 7260

acgccgtttg ggactccaac atatgtaatc cgccagtctg gtattgacgc tcccagtgcg 7320

tttcgttttg ctgcataccg acgagatcga gagactggtg ggatgtacta ctgtaatgca 7380

agatattatg tgccgtggct cggtcgttgg atgtcgcccg atccactaga taccgttgat 7440

10 ggccctaacg tatacgcata ctgcggcaac aatcttgtca actgggcgga tccaaagggc 7500

acccttaagt ggaacatgca agatgtcaag aacgctattg tcccagctct caaatccgcc 7560

gcagttactg tccccagcgc tatagttagc ataggtacag cagcagtggc caacacgatc 7620

ctcacataca gggtcagttc aacccagtct gctctcacca atatggcatg gtcagctgca 7680

gcttacggct tgcaaaccgt cgctgcatct ttgccggtca tggtcaatgc cttcgcgggg 7740

15 tctgtgctgg cagagaggga taagcgagag gccgcaacca aggcagagat cattgataaa 7800

aagattaaat cactcgaaga taagaataaa acactcgaag agaagaacga atcactcgaa 7860

aaacagaata aagagttaaa agagcaggtt agatggctga aggagcacgg agaaaacctg 7920

gaaagggctg ttgtgtcact aagtgcggcg gtggggtttg tgctaccaga atttcaagac 7980

aagccatatc ccgaggacag tgaagaccaa cttcaagccg aattggagga ggaagataat 8040

20 ggcggatttg aggatgaaag cgatcttccg ggattattca taaatcaggt gatgagcgca 8100

cagaatcttg aagaagacaa cggagtgtct gaagtgagaa ggacaggagc agacgtaaac 8160

cagtcatctg ttgttaatcg gagggtcaac gcatctacaa atagagccat acacacagag 8220

ccttagattc aatcgaattg at 8242<210> 40

25 <211> 1134<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<400> 40

Glu lie Phe lie Ser Ser Cys Ser Vai Gly Pro Leu Pro Phe Ser lie30 1 5 10 15

Leu Vai Gln Ser Pro Gln Ser Ser Vai Met Asp Thr Pro Gln Ala Ala20 25 30Lys Thr Gln lie35

Arg Asp Ala Vai50

Gly Ser Thr Ala65

Pro Vai Leu Asp

Leu Arg Ser lie100

Leu Ser Phe Ser115

Gln Pro Ser Leu130

Phe Gly lie Gly145

Met Ser Arg Arg

Leu Asp Thr Phe180

Asp Glu Thr Vai195

Arg Gly Asp Thr210

Vai lie Phe Trp225

Gly Arg Asp Asp

Ala Trp Leu Leu260

Phe Thr Tyr Lys275

Pro Ser Arg Asp40

Gly Thr Ser Ser55

Ala Lys Gly Thr70

Ser Ala Ala Phe85

Asp Ser Asn Phe

Vai Pro Leu Pro120

Ser Leu Glu Tyr135

Trp Arg Leu Gly150

lie Pro Thr Tyr165

Thr Leu Thr Gly

Asp Gly Phe Vai200

Glu Met Arg Vai215

Arg Thr lie Ser230

Ser Ser Arg Glu245

Cys Glu Ser Tyr

Lys Gly Asp Asn280

Arg Ser Gly Pro

Ser Ser Gln Gln60

Gly Ser Ser Ser75

Ala Thr Gly Lys90

Ser Vai Asn Pro105

Vai Ser Lys Ser

Asp Ser Gly Arg140

Gly lie Ser Ser155

Gly Gln Asp Asp170

Ala Asp Asp Leu185

Vai Arg Gln Tyr

Glu Arg Trp Met220

Ser Glu Asn Vai235

Met Glu Asn Pro250

Asp Ala Tyr Gly265

Glu Gly lie Glu

Lys lie Glu His45

Ala Ala Ser Lys

Ser Leu Ser lie80

Gly Gly Gly Ala95

Asn Thr Gly Thr110

Arg Gly Gly Phe125

Gly Asn Gly Ala

lie Ala Arg Lys160

Asp Gly Glu Asp175

Vai Pro Leu Ser190

Ala Pro Arg Vai205

Gln Gly Ser His

Thr Asn lie Tyr240

His Arg Vai Phe255

Asn Ala lie Ser270

Ala Leu Pro Ala285Asp Arg Lys Ala Thr Glu Thr Met Arg Asp Ser Lys Ala Leu Thr Arg

290 295 300

Ala Arg Tyr Leu Lys Ser lie Arg Tyr Gly Asn His Thr Pro Ser Arg305 310 315 320

Asp Leu Asp Arg Trp Lys lie lie Pro Ala Thr Ala Asn Lys Thr Tyr

325 330 335

Gly Trp Cys Phe Ser lie Vai Leu Asp Tyr Gly Glu His Asp Leu Gln

340 345 350

Cys Pro Thr Thr Leu Glu Ser Ser Leu Pro Trp Ser Vai Arg Gln Asp

355 360 365

Pro Phe Ser Thr Gly Ser Arg Gly Phe Glu Vai Arg Ser Leu Arg Leu

370 375 380

Cys Arg Arg Vai Leu Met Phe His His Phe Ser Glu Pro Gly Glu Leu385 390 395 400

Gly Arg Glu Asp Tyr Leu Vai Ala Ser Met Glu lie Asn Tyr Gln Glu

405 410 415

Ser Pro Ala Gly Ser Vai lie Glu Gln lie Thr Ser Asn Gly His Vai

420 425 430

Phe Asp Ala Ala Arg Gly Vai Tyr Ala Ala Gln Ser Met Ala Pro Leu

435 440 445

Lys Leu Arg Tyr Ser Gly Leu Pro Asp Leu Arg Ser Leu Pro lie Thr

450 455 460

Thr Vai Cys Pro Thr Ala Leu Gln Asn Leu Pro lie Ser Arg Pro Asp465 470 475 480

Ala Vai Thr Arg Trp Vai Asp Leu Asp Gly Glu Gly Ser Pro Gly Leu

485 490 495

Leu Vai Gln Leu Asp Gly Ala Trp Tyr Phe Gln Arg Asn Glu Ser Pro

500 505 510

Leu lie Ala Cys Ser Asp Asp Asp Ser Ser Ser lie Thr Ser Ser Gly

515 520 525

Vai Asp Thr Glu Ser Asp Ala Ser Ser lie Ser Asp Ser Glu Ser Asp530 535 540Lys Met His Leu545

Arg Ala lie Pro

Vai Asp Gly Asn580

Arg Ala Ser Gly595

Gly Trp Thr Pro610

Gln Thr Ala Glu625

Asn Gly Arg Pro

Leu Ala Trp His660

Glu Cys Gln lie675

Asn Leu Thr Gly690

Gly Asp Gly Leu705

Tyr Trp Pro Asn

Arg Leu Pro Cys740

Arg Leu His Leu755

Tyr Leu Pro Pro770

Asn Ala Phe Ser785

Leu Pro Lys Asp550

Gly Leu Lys Asp565

Gly His Gln Asp

Phe Tyr Glu Arg600

Leu Gln Leu Phe615

Ala Lys Thr His630

Asp lie Leu Leu645

Glu Ala Leu Gly

Ala Asn Asp Ala680

Asp Asp Arg Thr695

Gln Asp lie Vai710

Leu Gly Tyr Gly725

Pro lie Ser Glu

Leu Asp Vai Asp760

Glu Gly Gly Ala775

Ala Pro Leu Ser790

Gly Phe Gly Pro555

Phe Thr Arg Ser570

Vai Vai Vai Vai585

lie Ala Ser Asp

Pro Gln Vai Vai620

Ser Met Arg Leu635

Glu Vai Ala Gly650

Lys Arg Gly Met665

Pro Ser Pro Thr

Ala lie Tyr Leu700

Arg lie Thr Asn715

Ser Phe Gly His730

Asp Asp Ala Ser745

Gly Ser Gly Thr

Asn Vai Phe Phe780

Leu Pro Gln Phe795

lie His Glu Leu560

Thr Phe Glu Asp575

Asp Glu Gln Gly590

Asp Gly Asp Asp605

Asn Met Asp Vai

Asp Met Thr Gly640

Gly Gly Ser Gly655

Asp Ala Leu Arg670

Ala Pro Pro Leu685

Vai Asp Met Ser

Asn Leu lie Ser720

Glu lie Ser Met735

Phe Asn Vai Leu750

Thr Asp lie lie765

Asn His Ser Gly

Pro Ser lie Ser800Arg Leu Thr Ser Vai Phe Ala Leu Asp Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser

805 810 815

Cys Leu Cys Trp Vai Gly Pro Arg Ala Gly Ser Gly Thr Asp Glu Phe

820 825 830

Vai lie Asn Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Gly Gly Lys Pro His Leu Leu

835 840 845

Cys His Leu Asp Asp Gly Lys Gly Ser Glu Thr Arg lie Asn Tyr Arg

850 855 860

Pro Ser Thr Ala Phe Tyr Leu Ser Asp Lys Ala Gly Gly Gln Pro Trp865 870 875 880

Lys Thr Arg Leu Pro Phe Pro Vai His Vai Vai Arg Lys Ala Vai Arg

885 890 895

Gln Asp His Vai Ser Gln Thr Lys Leu Thr Thr Thr Tyr Ala Tyr Arg

900 905 910

Asp Gly Phe Phe Asp Pro His Asp Arg Glu Phe Arg Gly Phe Gly Thr

915 920 925

Vai His lie Trp Glu Gln Glu Gln Met Arg Leu Ala Pro Ser Vai Ser

930 935 940

Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Lys Leu Pro Vai Arg His lie Lys Thr Trp945 950 955 960

Phe His Thr Gly Ala Thr Glu Ser Ser Trp Leu Pro Thr Gly Thr Phe

965 970 975

Glu Pro His Arg Met Gln Thr Vai Leu Pro Asp Asn Ala Gly Pro Ser

980 985 990

Ala Ala Ala His Vai Arg Arg Glu Ala Phe Arg Ala Leu Lys Gly Leu

995 1000 1005

Gln Met Arg Ser Glu Vai Tyr Gln Lys Gly Arg Ser Ser Ser Ser

1010 1015 1020

Asn Thr Pro lie Ser lie Ser Glu Thr Ala Phe Asp lie Gln Leu

1025 1030 1035

Leu Gln Met Pro Vai Asp Ser His Met Asn Glu Arg Ala Lys Phe1040 1045 1050Lys His Glu Lys Pro Gly lie Ser Arg Vai Leu Pro Arg Glu Gln

1055 1060 1065

Leu Met Glu lie Cys Glu Arg Gln Lys Gly Glu Asn Ala Arg Leu

1070 1075 1080

Gln His Glu Met lie Leu Glu Arg Asn Glu Tyr Gly Ser Vai Arg

1085 1090 1095

Arg Lys Leu Thr Vai Ser Tyr Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gln Vai

1100 1105 1110

Ser Phe Ala Ser lie Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Lys Gln Asp

1115 1120 1125

Ala Ala Ser Ala Leu Glu

1130<210> 41<211> 1267<212> PRT

<213> Fusarium verticillioides

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 41

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Thr Glu Ala Gly Phe Vai Gln Leu Pro Lys Asp

1 5 10 15

Asp Arg Trp Trp Lys Pro Ser Ser Arg Gln Ser Phe Ser Ala Pro Cys

20 25 30

His Ala Ala Gly Ser Glu Leu Vai Ser Ala Arg Lys Ser Phe Phe Thr

35 40 45

Pro Thr Met Glu Ala Asp Vai Phe Gln Asn Thr Thr Ser Vai Lys Met

50 55 60

Asp Ser Tyr Met Leu Leu Pro Glu Vai Tyr Thr Asn Ala Ala Gly His65 70 75 80

Gln Thr Lys Ala Glu Asn Asp Tyr Arg Thr Leu Thr Ala Arg Vai MetThr Asp Cys Asn100

Asn Thr His Ala115

Asp Asp His Ala130

Phe Leu Phe Asn145

Arg Gly Ser Leu

Pro Tyr Arg lie180

Asp Asp Glu Arg195

Phe Asp Pro Gln210

Asp Lys Gln Arg225

Gly His Ala lie

Phe Vai Pro Vai260

Asp Ala Thr Gly275

Ser Lys Vai His290

Ala Thr Leu Gly305

Tyr Met Ser AlaMet His Arg Ser

85

Met Asn Arg Thr

Vai Ser Arg Met120

Vai Glu Asn Leu135

Pro Ala Glu Asp150

Ser Leu Tyr Ser165

Asp lie Thr Arg

Pro Leu Lys Arg200

Gly Arg Thr Vai215

Trp Asp lie Thr230

Gln Thr His His245

Ser Lys Arg Asn

Arg Gln Vai Gly280

Phe Thr Pro Trp295

lie Glu Asp Pro310

Leu Gly Arg Gly325

Ala Gly Gly lie

90

Ala Ala Glu Gly105

Gly Lys Glu Glu

Vai Ser Gln Gly140

Lys Ala lie Gly155

His Arg Leu Asn170

Asp Thr His Ala185

Asn Phe Pro Vai

Gln Glu Ser His220

Gly Cys Thr Ala235

Ala Phe Thr Ser250

Ser Pro Ala Thr265

Gln Leu Asp Pro

Ala Gln Trp Vai300

Ala Glu Asp Pro315

Ala Tyr Ser Pro330

Leu Gln Ala Thr

95

Asp Ala Leu Gly110

Glu Lys Leu Gly125

Leu lie Asp Asp

Met Leu Gly Gly160

Gly Asp Thr Pro175

His Pro Asp Gly190

Lys Vai Thr Phe205

Leu Ala Ser Trp

Phe Asp Ala Lys240

Ser Thr Pro Ala255

Vai Gln Phe Vai270

Gly His Thr Trp285

Phe Asp Lys Gly

Asp Vai Gly Vai320

Ser Trp Leu Glu335

Gly Gln Lys Ala340

Met Asp Ala Tyr355

Gly Asn Gly Leu370

Gln Pro lie Ala385

Arg Glu Vai Asp

Arg Leu Gly Gln420

lie Ser Leu Ser435

Gly Pro Gly Ser450

Thr Glu Thr Trp465

Thr Arg Thr Vai

Asn Met Leu Gly500

Lys Phe Asp Lys515

Vai Phe Ser Glu530

Vai Pro Lys Met

545.

Asp Ala Ala Gly

Thr Arg Arg Cys580

Lys Ala His Gln

Ala Asn His Ala360

Ser Lys lie Gln375

Vai His Tyr Glu390

Ala Leu Gly Arg405

Gln Met lie Lys

Asp lie Asn Gly440

Arg Arg Arg Met455

Vai Arg Ala Ser470

Tyr Asn Ser Thr485

Gln Vai Met Arg

Tyr Asp Phe Lys520

Glu Tyr Lys Thr535

Gln Asn His Met550

Arg Pro lie Phe565

Tyr Asp Vai ArgGln Asp Ser Trp

345

Met Vai Leu Leu

Gly Vai Arg Gln380

Tyr Asp Ala Leu395

Thr Vai Gln Thr410

Lys Ser Met Asp425

Gln Pro Vai Tyr

Vàl Tyr Asn Asn460

Ser His Glu Arg475

Asn Thr Ser Glu490

lie Glu Asp Gln505

Gly Thr Ala lie

Gly Leu Asp Trp540

Thr Tyr His Ser555

Glu Glu Asn Ala570

Gly Asn Vai Vai585

Thr Vai His Leu

350

Tyr Asp Gly Arg365

Asp Arg Ala Thr

Gly His Leu Ala400

Thr Gln Tyr Asn415

Lys Cys Glu Glu430

Leu Trp Asp Leu445

Leu Arg Gln Gln

Glu lie Leu Trp480

Ser Arg Ser lie495

Ala Gly Thr Arg510

Ala Glu Thr Arg525

Ser Ala Vai Pro

Ser Leu Arg Leu560

His Gly Arg Gln575

His Leu Gln Ser590

Gln Asp Ser ThrPhe Thr Ser Asp610

Lys Thr Gln His625

Arg Thr Arg Arg

Tyr Asp Cys Met660

Thr Vai Phe Tyr675

Tyr Asp Phe His690

Ser Leu Gly Gln705

Asn Gly Asp Ala

Asp Asp Ala Gly740

Thr Met Pro Asn755

lie Glu Pro Asp770

Gly Vai Glu Ser785

Ser Leu Pro Gly

His Cys Vai Ser820

Pro Glu Thr Thr835

Lys Vai Thr Glu

600

Leu Leu Pro Vai615

Glu Tyr Asp Gln630

Ser Asp Ser Ser645

Gly Arg Thr Ser

Arg Asn Gln Arg680

Asp Arg Leu Vai695

Lys Gln Gln Gln710

Lys Gln Leu Thr725

Asn lie Leu Glu

Trp Thr Arg lie760

Lys Met Ser Asn775

Lys Gln Phe Glu790

Phe Ser Tyr Vai805

Thr Gln lie Vai

Phe Phe Vai Tyr840

Ser Ser Arg Ser

Asn Vai Thr Arg620

Tyr Thr Arg Leu635

Leu Vai Glu Asp650

Arg Thr Leu Asp665

lie Glu Pro Vai

Lys Ala Thr Gly700

Gly Pro Phe Phe715

Cys Tyr Thr Glu730

His Arg His Asp745

His Arg Tyr Asn

Arg Leu Thr Ser780

Tyr Asn Ala Asn795

Gly Trp Asp Pro810

Asn Pro Gly Asp825

Asp Lys Asp GlyCys Cys Lys Met

605

Gly Asn Gly Thr

Leu Thr Asn Arg640

lie Thr His lie655

Ala Ala Gln Glu670

Asn Glu Tyr Trp685

Arg Glu Met Vai

Arg Gln His lie720

Thr Tyr Arg Tyr735

lie Ser Asp Thr750

Gln Thr Ser Arg765

Vai Ser lie Ser

Gly Ala Thr Vai800

Met Asp Ser Leu815

Glu Thr Ala lie830

Thr Arg Vai Arg845

Lys Glu Thr Leu850 855 860

Tyr Leu Gly Pro Ala Ala Glu His Ser Leu Thr Tyr Ser Gly Glu Gly865 870 875 880

Vai Thr Pro Asp Ser Glu Vai Thr Thr Cys His Leu Phe Pro Ala Thr

885 890 895

Ser Asp Pro Gly Thr Thr Ala Vai Vai Thr lie Glu His Tyr Vai Lys

900 905 910

Ala Ala Asn Pro Lys Leu Gly Asn Lys Thr Leu Gln Arg Tyr Asn Leu

915 920 925

Ser Asn Asn Leu Glu Vai Asp Glu Asp Gly His Thr lie Ser Tyr Glu

930 935 940

Glu Tyr Thr Pro Phe Gly Thr Pro Thr Tyr Vai lie Arg Gln Ser Gly945 950 955 960

lie Asp Ala Pro Ser Ala Phe Arg Phe Ala Ala Tyr Arg Arg Asp Arg

965 970 975

Glu Thr Gly Gly Met Tyr Tyr Cys Asn Ala Arg Tyr Tyr Vai Pro Trp

980 985 990

Leu Gly Arg Trp Met Ser Pro Asp Pro Leu Asp Thr Vai Asp Gly Pro

995 1000 1005

Asn Vai Tyr Ala Tyr Cys Gly Asn Asn Leu Vai Asn Trp Ala Asp

1010 1015 1020

Pro Lys Gly Thr Leu Lys Trp Asn Met Gln Asp Vai Lys Asn Ala

1025 1030 1035

lie Vai Pro Ala Leu Lys Ser Ala Ala Vai Thr Vai Pro Ser Ala

1040 1045 1050

lie Vai Ser lie Gly Thr Ala Ala Vai Ala Asn Thr lie Leu Thr

1055 1060 1065

Tyr Arg Vai Ser Ser Thr Gln Ser Ala Leu Thr Asn Met Ala Trp

1070 1075 1080

Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Leu Gln Thr Vai Ala Ala Ser Leu Pro

1085 1090 1095

Vai Met Vai Asn Ala Phe Ala Gly Ser Vai Leu Ala Glu Arg Asp1100 1105 1110

Lys Arg Glu Ala Ala Thr Lys Ala Glu lie lie Asp Lys Lys lie

1115 1120 1125

Lys Ser Leu Glu Asp.Lys Asn Lys Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu

1130 1135 1140

Ser Leu Glu Lys Gln Asn Lys Glu Leu Lys Glu Gln Vai Arg Trp

1145 1150 1155

Leu Lys Glu His Gly Glu Asn Leu Glu Arg Ala Vai Vai Ser Leu

1160 1165 1170

Ser Ala Ala Vai Gly Phe Vai Leu Pro Glu Phe Gln Asp Lys Pro

1175 1180 1185

Tyr Pro Glu Asp Ser Glu Asp Gln Leu Gln Ala Glu Leu Glu Glu

1190 1195 1200

Glu Asp Asn Gly Gly Phe Glu Asp Glu Ser Asp Leu Pro Gly Leu

1205 1210 1215

Phe lie Asn Gln Vai Met Ser Ala Gln Asn Leu Glu Glu Asp Asn

1220 1225 1230

Gly Vai Ser Glu Vai Arg Arg Thr Gly Ala Asp Vai Asn Gln Ser

1235 1240 1245

Ser Vai Vai Asn Arg Arg Vai Asn Ala Ser Thr Asn Arg Ala lie

1250 1255 1260His Thr Glu Pro

1265

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína ocorrendo naturalmente, isolada, que potencializa aatividade inseticida de uma toxina complexo de toxina Classe A, a dita prote-ína compreendendo, em ordem amino-para-carboxila, um segmento B e um segmento C, em que o dito segmento B compreende, em ordem amino-paracarboxila, um domínio spvB Pfam característico de um polipeptídeo comple-xo toxina Classe B, e uma pluralidade de domínios FG-GAP Pfam caracterís-ticos de um polipeptídeo complexo toxina Classe B, e em que o dito domínioC compreende, em ordem amino-para-carboxila, uma pluralidade de domí- nios RHS Pfam característicos de um polipeptídeo complexo toxina ClasseC, e um domínio hiper - variável característico de um polipeptídeo complexode toxina Classe C.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína é uma proteína eucariótica.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína é uma proteína de fungo.

4. Proteína de acordo com a reivindicação 3, em que a dita pro-teína de fungo é selecionada de uma proteína Gibberella e uma proteínaFusarium.

5. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína tem um peso molecular de aproximadamente 200-300 kDa.

6. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína tem aproximadamente 2000-2600 aminoácidos de comprimento.

7. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que o dito do- mínio B é de aproximadamente 1500 aminoácidos de comprimento.

8. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que o dito do-mínio C é de aproximadamente 1000 aminoácidos de comprimento.

9. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína compreende uma região semelhante a intron.

10. Proteína isolada que potencializa a atividade inseticida deuma toxina complexo toxina Classe A, a dita proteína compreendendo, emordem amino-para-carboxila, um segmento B e um segmento C, em que odito segmento B compreende, em ordem amino-para-carboxila, um domíniospvB Pfam característico de um polipeptídeo complexo toxina Classe B, euma pluralidade de domínios FG-GAP característicos de um polipeptídeocomplexo toxina Classe B, e em que o dito domínio C compreende, em or- dem amino-para-carboxila, uma pluralidade de domínios RHS Pfam caracte-rísticos de um polipeptídeo complexo toxina Classe C, e um domínio hiper-variável característico de um polipeptídeo complexo toxina Classe C, em queum polinucleotídeo que codifica a dita proteína hibridiza sob condições rigo-rosas com o inteiro complemento de uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, uma seqüência codificando SEQID NO: 34, uma seqüência codificando SEQ ID NO:35, uma seqüência codi-ficando SEQ ID NO:37, uma seqüência codificando SEQ ID NO:38, uma se-qüência codificando SEQ ID NO: 40, e uma seqüência codificando SEQ IDNO:41.

11. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOs: 2, 4, 34, 35, 37, 38, 40 e 41.

12. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pro-teína é uma proteína de bactéria.

13. Proteína de acordo com a reivindicação 12, em que a ditaproteína é obtenível de uma bactéria ocorrendo naturalmente de um gêneroselecionado de Methanosarcina, Treponema, Leptospira, Microbulbifer, Tan-nerella, Burkholderia, e Nitrosospora.

14. Proteína de acordo com a reivindicação 13, em que um poli- nucleotídeo que codifica a dita proteína hibridiza sob condições rigorosascom o complemento inteiro de uma seqüência selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NOs: 7 e 11.

15. Proteína de acordo com a reivindicação 13, em que a ditaproteína compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:8 e 12.

16. Proteína de toxina complexo toxina Classe A eucariótica,isolada, tendo atividade inseticida em que a dita atividade é potencializadapor uma proteína de complexo de toxina Classe B e uma proteína complexotoxina Classe C.

17. Proteína de acordo com a reivindicação 16, em que a ditaproteína é uma proteína de fungo.

18. Proteína de acordo com a reivindicação 17, em que a ditaproteína de fungo é selecionada de uma proteína Gibberella, uma proteínaFusarium, e uma proteína Aspergillus.

19. Proteína de acordo com a reivindicação 16, em que um poli-nucleotídeo que codifica a dita proteína hibridiza sob condições rigorosas com o complemento inteiro de uma seqüência selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NO: 9, uma seqüência que codifica SEQ ID NO:26, umaseqüência que codifica SEQ ID NO:27, uma seqüência que codifica SEQ IDNO:29, uma seqüência que codifica SEQ ID NO:30, uma seqüência que co-difica SEQ ID NO: 31, e uma seqüência que codifica SEQ ID NO:32.

20. Proteína de acordo com a reivindicação 16, em que a ditaproteína compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 27, 29, 30, 31 e 32.

21. Proteína isolada compreendendo um segmento B de umaproteína de acordo com a reivindicação 1.

22. Proteína isolada compreendendo um segmento C de umaproteína de acordo com a reivindicação 1.

23. Proteína de acordo com a reivindicação 21, em que a ditaproteína compreende SEQ ID NO: 22.

24. Proteína de acordo com a reivindicação 22 em que a ditaproteína compreende SEQ ID NO: 20.

25. Proteína toxina complexo de toxina Classe A de Burkholderi-a, isolada, tendo uma atividade inseticida em que a dita atividade é potencia-lizada por uma proteína complexo toxina Classe B e uma proteína complexotoxina Classe C.

26. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de acordocom a reivindicação 25.

27. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína como defi-nido na reivindicação 1.

28. Polincleotídeo de acordo com a reivindicação 27, tendo umacomposição de códon otimizada para expressão em uma planta.

29. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 28, em que o dito polinucleotídeo compreende SEQ ID NO: 23.

30. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 27, em que odito polinucleotídeo compreende uma seqüência intron não-heteróloga.

31. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 27, em que odito polinucleotídeo foi modificado para remoção de uma seqüência intron não-heteróloga.

32. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína como defi-nida na reivindicação 16.

33. Célula transgênica compreendendo um polinucleotídeo comodefinida na reivindicação 27.

34. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 33, aindacompreendendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma toxinaClasse A.

35. Célula de acordo com a reivindicação 33, em que a dita célu-la é uma célula de planta.

36. Célula transgênica compreendendo um polinucleotídeo comodefinido na reivindicação 32.

37. Processo de seleção de seqüências de polinucleotídeos paraum polinucleotídeo que codifica uma proteína como definido na reivindicação1, em que o dito processo compreende provimento de uma seqüência refe- rência, comparação da dita seqüência referência a uma base de dados deseqüências usando um algoritmo, assinalação de um escore para uma se-qüência na dita base de dados, seleção de um valor mínimo, identificação dodito polinucleotídeo na dita base de dados que tem o dito escore acima dodito valor mínimo, produção de uma proteína que é codificada pelo dito poli- nucleotídeo, e avaliação da dita proteína para habilidade para potencializar aatividade de uma proteína complexo toxina Classe A.

38. Processo de controle de um inseto em que o dito processocompreende a etapa de contato do dito inseto com uma proteína como defi-nida na reivindicação 1 e uma toxina proteína complexo toxina Classe A.

39. Processo de potencialização de atividade de toxina de umatoxina proteína complexo toxina Classe A em que o dito processo compre- ende provimento de uma proteína como definida na reivindicação 1 e umatoxina proteína complexo de toxina Classe A para ingestão por um inseto.

40. Processo de seleção de um organismo ocorrendo natural-mente para uma proteína como definida na reivindicação 1.

41. Processo de seleção de um organismo eucariótico para uma proteína como definida na reivindicação 16.