BRPI0609216A2 - molÉcula de Ácido nucleÍco isolada, construÇço de dna vetor, mÉtodos para obtenÇço de planta transformada, para expressar uma sequÊncia nucleotÍdica em uma planta, em uma cÉlula vegetal, e preferencialmente em uma raiz vegetal e mÉtodo para expressar de maneira induzida uma sequÊncia de nucleotÍdeos em uma raiz vegetal - Google Patents

molÉcula de Ácido nucleÍco isolada, construÇço de dna vetor, mÉtodos para obtenÇço de planta transformada, para expressar uma sequÊncia nucleotÍdica em uma planta, em uma cÉlula vegetal, e preferencialmente em uma raiz vegetal e mÉtodo para expressar de maneira induzida uma sequÊncia de nucleotÍdeos em uma raiz vegetal Download PDF

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Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUÇçO DE DNA, VETOR, METODOS PARA OBTENÇçO DE PLANTA TRANSFORMADA, PARA EXPRESSAR UMA SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA EM UMA PLANTA, EM UNA CÉLULA VEGETAL E PREFERENCIALMENTE EM UMA RAIZ VEGETAL E MÉTODO PARA EXPRESSAR DE MANEIRA INDUZIDA UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS EM UMA RAIZ VEGETAL A presente invenção provê composições e métodos para regular a expressão de seqúencias heterólogas de nucleotídeos em plantas. As composições incluem uma nova seqiiencia de nucleotídeos para um promotor induzido e raiz-preferencial para o gene que codifica uma proteína dirigente e soja. É fornecido um método para expressar urna seqüência heteróloga de nucleotídeos em uma planta usando as seqüências promotoras aqui divulgadas, O método compreende incorporar, estavelmente em um genoma, uma seqüência nucleotídica operacionaímente ligada ao promotor raiz-preferencial da presente invenção e regenerar uma planta estavelmente transformada capaz de expressar a seqUência de nucleotídeos.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, CONSTRUÇÃO DE D NA,VETOR, CÉLULA VEGETAL, PLANTA, MÉTODOS PARA EXPRESSAR UMASEQÜÊNCIA NUCLEOTIDICA EM PLANTA E EM CÉLULA VEGETAL, MÉTODOPARA EXPRESSAR UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOSPREFERENCIALMENTE EM RAIZ VEGETAL, MÉTODO PARA EXPRESSAR DEMANEIRA INDUZIDA UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS EM RAIZVEGETAL
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção é relacionada ao campo da biologiamolecular, mais particularmente a regulação de expressãogênica em plantas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Avanços recentes em engenharia genética vegetalpermitiram a construção de plantas apresentandocaracterísticas ou traços melhorados, tais como resistênciaa doenças, resistência a insetos, resistência a herbicidas,estabilidade ou tempo de validade ampliados do produto finalao consumidor obtido a partir das plantas, e melhoria daqualidade nutricional das partes comestíveis da planta.
Logo, um ou mais genes de se j ados de uma fonte diferente doque a planta, mas construídos para conferir característicasou qualidades diferentes ou melhoradas, podem serincorporados ao genoma da planta. Novos genes podem serexpressos na célula vegetal para exibir o fenótipo desejadotal como uma nova qualidade ou característica.Os sinais regulatórios característicos devem estarpresentes e estar na posição adequada em relação ao gene, demodo a obter a expressão do gene recentemente inserido nacélula vegetal. Estes sinais regulatórios podem incluir umaregião promotora, uma seqüência líder 5' não traduzida e umaseqüência 3' de poliadenilação/terminação da transcrição.
Um promotor é uma seqüência de DNA que conduz amaquinaria celular de uma planta para produzir RNA a partirde uma seqüência codificante contígua a jusante (3') dopromotor. A região promotora influencia a taxa, o estágiode desenvolvimento e o tipo celular no qual o transcrito deRNA do gene é produzido. O transcrito de RNA é processadopara produzir o RNA mensageiro (mRNA) que serve como ummolde para a tradução da seqüência de RNA em uma seqüênciade aminoácidos do polipeptídeo codificado. A seqüêncialíder 5' não traduzida é uma região do mRNA a montante daregião codificante da proteína, que pode desempenhar umpapel na iniciação e na tradução do mRNA. O sinal 3' depoliadenilação/ terminação da transcrição é uma região nãotraduzida abaixo da região codificante da proteína, queproporciona em células vegetais a terminação do transcritode RNA e a adição de nucleotídeos poliadenilatos à ponta 3'do RNA.
A expressão de seqüências heterólogas de DNA em umaplanta hospedeira é dependente da presença de um promotorhospedeira. O tipo da seqüência promotora escolhida ébaseado em quando e aonde dentro do organismo a expressão deseqüência heteróloga é desejada. Onde a expressão emtecidos ou órgãos específicos é desejada, promotores tecido-preferenciais podem ser usados. Onde a expressão gênica emresposta a um estímulo é desejada, promotores induzíveis sãoos elementos regulatórios a escolher. Por outro lado, ondeé desejada a expressão contínua em todas as células de umaplanta, promotores constitutivos são utilizados.
Um promotor induzível é um promotor que é capaz deativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou maisseqüências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Naausência de um indutor, as seqüências de DNA ou genes nãoserão transcritos ou serão transcritos em um nível abaixo deum estado induzido. O indutor pode ser um agente químico,tal como um metabólito, regulador de crescimento, herbicidaou composto fenólico, ou um estresse fisiológico diretamenteimposto à planta como frio, calor, sal, seca, ou toxinas.No caso do combate a pragas em vegetais, também é desejávelter um promotor que é induzido por patógenos de plantas,incluindo pragas de insetos em plantas, nematódeos, ouagentes de doença como uma bactéria, vírus ou fungo. Ocontato com o patogeno vai induzir a ativação datranscrição, tal que uma proteína de combate a patogeno seráproduzida no momento em que será efetiva em defender aplanta. Um promotor induzido por patogeno pode também serusado para detectar a presença de um patogeno, por exemplo,pela expressão de um marcador detectável, de maneira que anecessidade de aplicação de pesticidas pode ser estimada.
Uma célula vegetal contendo um promotor induzível pode serexposta a um indutor ao aplicar-se externamente o indutor nacélula ou planta, por exemplo, pulverizando, regando,aquecendo, ou pela exposição do agente patogênico.
Um promotor constitutivo é um promotor de conduz a
expressão de um gene pelas variadas partes de uma planta econtinuamente por todo o desenvolvimento da planta.Exemplos - de alguns promotores constitutivos que sãoamplamente usados para induzir a expressão de genes heterólogos em plantas transgênicas incluem o promotor dogene da nopalina sintase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens(U.S. Patent No. 5.034.322), os promotores 35S e 19S dovírus do mosaico da couve-flor (CaMV), aqueles derivados dequalquer dos muitos genes de actina, que são conhecidos porserem expressos na maioria dos tipos celulares (U.S. PatentNo. 6.002.068), e o promotor da ubiquitina, que é um produtogênico conhecido por se acumular em muitos tipos celulares.
Seqüências regulatórias adicionais a montante e/ou a20 jusante da seqüência principal do promotor podem serincluídas em construções de expressão de vetores detransformação para ocasionar níveis variáveis de expressãode seqüências heterólogas de nucleotídeos em uma plantatransgênica. Alterar plantas geneticamente através do usode técnicas de engenharia genética para produzir plantas comcaracterísticas úteis requer, conseqüentemente, adisponibilidade de uma variedade de promotores.
Com o objetivo de maximizar a aplicação comercial datecnologia de plantas transgênicas, é importante conduzir aexpressão do DNA introduzido de uma maneira sítioespecífica. Por exemplo, é desejável produzir compostostóxicos de defesa em tecidos sujeitos ao ataque depatógenos, mas não em tecidos que servem para ser colhidosou comidos por consumidores. Através do direcionamentolocalizado da síntese ou estocagem de proteínas ou compostosdesejáveis, as plantas podem ser manipuladas como fábricas,ou sistemas de produção, para uma tremenda variedade decompostos com utilidade comercial. Promotores célula-específicos oferecem a habilidade de dirigir a síntese decompostos, espacialmente e temporalmente, para tecidos ouórgãos altamente especializados, tais como raízes, folhas,tecidos vasculares, embriões, sementes, ou flores.
Alternativamente, pode ser desejável inibir a expressãode uma seqüência de DNA nativa dentro de tecidos de umaplanta para conseguir o fenótipo desejado. Tal inibiçãopoderia ser atingida com a transformação da planta de formaa conter um promotor tecido-específico operacionalmenteligado a uma seqüência nucleotídica anti-senso, tal que aexpressão da seqüência anti-senso produza um transcrito deRNA que interfere com a tradução do mRNA da seqüência nativade DNA.
De particular interesse são promotores que sãoinduzidos por patógenos de plantas. Infecção por patógeno,como infecção por nematódeo, é um problema significativo nocultivo de plantas de importância na agricultura. Porexemplo, o nematódeo do cisto da soja (Heterodera glycines,aqui referido como "SCN") é uma praga comum que causadanos todos os anos a soja. Tal dano é o resultado daatrofia da planta de soja, causada pelo cisto donematódeo. As plantas atrofiadas apresentam sistemasradiculares menores, apresentam sintomas de deficiência deminerais em suas folhas, e definham facilmente. Acredita-se que o cisto do nematódeo de soja seja responsável porperdas estimadas superiores a 1 bilhão de dólares por anona produção de soja na América do Norte. Outrosnematõdeos patogênicos de importância na agriculturaincluem os cistos de nematódeo de batata Globoderarostochiensis e Globodera pallida, que são pragas-chave debatata, enquanto que o cisto de nematódeo de beterrabaHeterodera schachtii é o problema principal para osplantadores beterraba na Europa e nos Estados Unidos.
O método básico de controle de nematódeos tem sidoatravés da aplicação de compostos químicos altamentetóxicos. O uso comum de compostos químicos provoca muitosproblemas relacionados ao meio-ambiente por causa da nãoseletividade dos compostos e do desenvolvimento deresistência aos agentes químicos por parte dos insetos.Nematicidas como o Aldicarb ("chumbinho") e seus produtosderivados são conhecidos por serem altamente tóxicos aosmamíferos. Como resultado, restrições governamentais
foram impostas à utilização destes agentes químicos. 0nematicida mais amplamente utilizado, o brometo de metila,logo será retirado do mercado, e até o presente, não hácandidato promissor para substituir este tratamento.Assim, há uma grande necessidade por composições e métodosnão químicos, efetivos, para o controle de nematódeos.Varias abordagens para controle de praga foramtentadas incluindo o uso de organismos biológicos que são,tipicamente, "predadores naturais" das espécies alvo aserem controladas. Tais predadores podem incluir outrosinsetos, fungos, e bactérias tais como Bacillusthuringiensis. Em contra partida, grandes colônias depragas de insetos foram criadas em cativeiro, esterilizadase lançadas no ambiente na esperança de que o encontro entreinsetos esterilizados e insetos selvagens férteis reduziriaa população de insetos. Apesar de estas abordagens teremapresentado algum sucesso, elas implicam em uma despesaconsiderável e apresentam várias dificuldades importantes.Por exemplo, é difícil tanto aplicar organismos biológicosem grandes áreas quanto fazer com que tais organismos vivospermaneçam na área tratada ou nas espécies de plantastratadas por um tempo prolongado. Insetos predadores podemmigrar e fungos e bactérias podem ser lavados de uma plantaou removidos, pela chuva, de uma área tratada.Conseqüentemente, apesar de o uso de tais controlesbiológicos apresentarem características desej áveis e terematingido algum sucesso, estes métodos, na prática, nãoalcançaram o obj etivo de controlar o dano causado pornematódeos em plantas.
Avanços em biotecnologia têm apresentado novasoportunidades para o controle de pragas por meio daengenharia genética. Em particular, avanços em genética deplantas juntamente com a identificação de fatores decrescimento dos insetos e agentes ou compostos de defesavegetal naturalmente existentes oferecem a oportunidade decriar plantas cultiváveis transgênicas capazes de produzirtais agentes de defesa e, através estes, proteger asplantas contra o ataque de insetos e a doença vegetalresultante.
Obstáculos adicionais ao controle de pragas sãoimpostos por certas pragas. Por exemplo, é conhecido quecertos nematódeos, como o cisto de nematodeo de soja("SCN"), podem inibir alguma expressão gênica em plantas nosítio de alimentação do nematodeo (ver Gheysen and Fenoll(2002) Annu Rev Phytopathol 40:191-219). Logo, aoimplementar uma abordagem transgênica para o controle depragas, um fator importante é aumentar a expressão de genesdesejados em resposta ao ataque de patógeno.Conseqüentemente, há uma necessidade continuada para aexpressão controlada de genes deletérios para pragas emresposta ao dano na planta.
Um método promissor para o controle de nematódeos é aprodução de plantas transgênicas que são resistentes ainfecção de nematódeos e reprodução dos mesmos. Porexemplo, com o uso de promotores induzidos por nematódeos,plantas podem ser alteradas para expressar proteínasnematicidas em resposta a exposição a nematódeos. Ver porexemplo, U.S. Patent No. 6.252.138, aqui incorporado comoreferência. Por outro lado, alguns métodos usam umacombinação de ambos promotores nematodeo-induzidos enematodeo-reprimidos para obter resistência a nematódeos.
Logo, WO 92/21757, aqui incorporado por referência, discuteo uso de um sistema de dois promotores para romper locaisde alimentação de nematódeos, aonde um promotor induzidopor nematodeo conduz a expressão de um produto tóxico quemata as células vegetais no local de alimentação, enquantoque o outro promotor nematódeo-reprimido conduz a expressãode um produto gênico que inativa o produto tóxico doprimeiro promotor, sob circunstâncias nas quais osnematódeos não estão presentes, permitindo, assim, umcontrole mais fino dos efeitos deletérios do produto tóxicono tecido da planta. Similarmente, com o uso de proteínasapresentando efeito deletério em nematódeos, plantas podemser geneticamente alteradas para expressar tais proteínasdeletérias em resposta a ataque de nematodeo.
Um número de nematódeos parasitas de plantas, como oSCN, prefere infectar tecidos radiculares. Então,promotores raiz-específicos e raiz-preferenciais são muitoúteis para o desenvolvimento de plantas transgênicasresistentes a nematódeos. Os promotores raiz-específicos eraiz-preferenciais podem reduzir o impacto prejudicialpotencial dos genes nematicidas em outras característicasagronômicas.
Apesar de estes métodos terem potencial para otratamento de infecção e reprodução de nematodeo, aefetividade destes é altamente dependente dascaracterísticas dos promotores nematodeo-induzidos enematódeo-reprimidos acima discutidos, assim como aspropriedades deletérias das proteínas por estes expressas.Assim, tais fatores como, a força de tais promotoresresponsivos a nematódeos, o grau de indução ou repressão,especificidade de tecido, ou similares, podem todos alterara efetividade destes métodos de resistência a doença.Similarmente, o grau de toxicidade de um produto gênico anematódeos, a longevidade da proteína após o consumo pelonematódeo, ou semelhante podem alterar o grau no qual aproteína é útil em controlar nematódeos. Conseqüentemente,há uma necessidade continuada pela identificação depromotores nematódeo-responsivos, raiz-preferenciais, egenes de controle de nematódeos para uso em promover aresistência a nematódeo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Composições e métodos para regular a expressão gênica
em uma planta são providos. Composições compreendem novasseqüências de nucleotídeos para um promotor raiz-preferencial e induzido que inicia a transcrição emresposta a alimentação de pragas de nematódeos. Mais particularmente, é provida uma região de iniciaçãotranscricional isolada de soja. Avanços adicionais dainvenção compreendem seqüências nucleotídicas definidas emSEQ ID NOs:l-4, fragmentos das seqüências nucleotídicasdefinidas em SEQ ID NOs:l-4, e as seqüências promotorasvegetais depositadas no "American Type Culture Collection"(ATCC) em 11 de março de 2005, como o Patent Deposit No.PTA-6630. Os avanços da invenção ainda compreendemseqüências de nucleotídeos apresentando pelo menos 85% deidentidade de seqüência com as seqüências definidas em SEQID NOs:l-4, e que conduzem a expressão raiz preferencial enematódeo- induzida de uma seqüência nucleotidicaoperacionalmente ligada. Também estão incluídos fragmentosfuncionais das seqüências definidas como SEQ ID NOs:1-4 queconduzem a expressão preferencial em raiz ou induzida pornematódeo de uma seqüência nucleotidica operacionalmenteligada.
Os avanços da invenção também incluem construções deDNA compreendendo um promotor operacionalmente ligado a umaseqüência heteróloga de nucleotideos de interesse, onde oreferido promotor é capaz de conduzir a expressão dareferida seqüência nucleotidica de interesse em uma célulavegetal e o referido promotor compreende uma das seqüênciasnucleotidicas aqui divulgadas. Os avanços da invenção aindafornecem vetores de expressão, e plantas ou células vegetaistendo incorporado estavelmente em seus genomas umaconstrução de DNA acima mencionada. Adicionalmente, ascomposições incluem sementes transgênicas de tais plantas.
Os avanços de método compreendem um meio para expressarseletivamente uma seqüência nucleotidica em uma planta,compreendendo transformar uma célula vegetal com umaconstrução de DNA e regenerar uma planta transformada apartir da referida célula vegetal transformada, onde areferida construção de DNA compreendendo um promotor e umaseqüência heteróloga de nucleotideo, operacionalmente ligadaao referido promotor, na qual o promotor inicia atranscrição raiz-preferencial e induzida por nematódeo dareferida seqüência nucleotidica, em uma célula vegetal.Desta forma, as seqüências promotoras são úteis paracontrolar, de maneira raiz-preferencial ou induzida, aexpressão de seqüências codificantes operacionalmenteligadas.
À jusante e sob regulação da iniciação transcricionaldo promotor vai haver uma seqüência de interesse que vaiservir para a modificação do fenótipo da planta. Talmodificação inclui modular a ' produção de um' produtoendógeno, em quantidade, distribuição relativa, ousemelhante, ou produção de um produto de expressão exógenapara prover uma nova função ou produto em uma planta. Porexemplo, está abrangida uma seqüência nucleotidicaheteróloga que codifica um produto gênico que confereresistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno,nematódeo ou inseto.
Em um avanço adicional, um método para modular aexpressão de um gene em uma planta estavelmente transformadaé fornecido, compreendendo as etapas de (a) transformar umacélula vegetal com uma construção de DNA compreendendo opromotor dos avanços operacionalmente ligado a pelo menosuma seqüência nucleotidica; (b) crescer a célula vegetal sobcondições de crescimento vegetal e (c) regenerar uma plantaestavelmente transformada a partir de uma célula vegetalonde a expressão da seqüência nucleotidica altera o fenótipoda planta.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra a seqüência do promotor DGP de soja.As posições do TATA box e de outros motivos de interesse naseqüência promotora estão indicadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os avanços da invenção compreendem novas seqüênciasnúcleotidicas para promotores de plantas, particularmente umpromotor raiz-preferencial e induzido por nematódeo para umgene de proteína dirigente de soja (a partir daqui geneDGP), mais particularmente, o promotor DGP de soja. Emparticular, os avanços fornecem moléculas de ácido nucléicoisoladas compreendendo a seqüência de nucleotideos definidaem SEQ ID N0s:l-4, e a seqüência promotora de plantadepositada em hospedeiros bacterianos no Depósito de PatenteNo: PTA-6630, em 11 de março de 2 005, e fragmentos,variantes, e complementos desta.
Os plasmideos contendo as seqüências nucleotidicas
promotoras vegetais dos avanços foram depositados em 11 demarço de 2005 no "American Type Culture Collection" (ATCC),localizado no 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, ao qual foi atribuído o No. de Depósito de PatentePTA-663 0. Este depósito vai ser mantido sob os termos do
Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional doDepósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimentode Patente (International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure). Estedepósito foi feito meramente como uma conveniência paraespecialistas na matéria e não é uma admissão que umdepósito é exigido sob o artigo 35 do Código Norte Americano§112. O depósito estará, irrevogavelmente e sem restriçãoou condicão, disponível ao público em virtude da expediçãode uma patente. Entretanto, deveria ser entendido que adisponibilidade de um depósito não' constitui uma licençapara praticar o assunto da invenção em detrimento dosdireitos de patente outorgados por uma ação do governo.
As seqüências promotoras dos avanços são úteis paraexpressar seqüências núcleotidicas operacionalmente ligadasde uma maneira raiz-preferencial e induzida, particularmentede uma maneira induzida por nematódeo. As seqüências tambémencontram aplicação na construção de vetores de expressãopara subseqüente transformação de plantas de interesse, comosondas para o isolamento de outras seqüências promotoras dogene DGP, como marcadores moleculares, e os semelhantes.
0 promotor de DGP dos avanços foi isolado do DNAgenômico de soja. 0 método especifico usado para obter opromotor de DGP da presente invenção está descrito na seçãoexperimental deste pedido.
Os avanços abrangem composições de ácidos nucléicosisolados ou substancialmente purificados. Uma molécula deácido nucléico "isolada" ou "purificada", ou porçãobiologicamente ativa desta, é substancialmente livre deoutros materiais celulares, ou meio de cultura quandoproduzidas por técnicas recombinantes, ou substancialmentelivre de precursores químicos ou outros compostos químicosquando sintetizadas quimicamente. Um ácido nucléico
"isolado" é substancialmente livre de seqüências (incluindoseqüências codificando proteína) que naturalmente flanqueiamo ácido nucléico (por exemplo, seqüências localizadas nasextremidades 5' e 3' do ácido nucléico) no DNA genômico doorganismo do qual o ácido nucléico é derivado. Por exemplo,em vários avanços, a molécula de ácido nucléico pode contermenos do que 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, ou 0.1 kbde seqüências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente amolécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula da qualo ácido nucléico é derivado.O gene DGP de soja (SEQ ID NO: 5) é preferencialmenteexpresso em tecido de raiz de soja e sua expressão erainduzida por infecção por nematódeo como indicado por LynxMassively Parallel Signature Sequencing (MPSS) eexperimentos de Agilent microarray que estão melhordiscutidos no Exemplo 1. O polipeptídeo codificado pelogene de DGP de soja é apresentado como a SEQ ID NO: 6.Proteínas dirigentes são encontradas plantas terrestresvasculares e são uma classe de proteínas relativamenterecentemente descobertas (Davin et ai. , (1997) Science 275:362-366; Gang et al. , (1999) Chem. Biol. 6: 143-151; Davin &Lewis (2000) Plant Physiol. 123:453-461) e acredita-seestarem envolvidas no acoplamento de monolignol na produçãode ligninas e lignanas vegetais. Adicionalmente, acredita-se que as proteínas dirigentes desempenham um papel ligadoao acoplamento de outros radicais, mas a função exata destasainda está sendo determinada.
A seqüência promotora de DGP de soja conduz a expressãode seqüências operacionalmente ligadas, de maneira raiz-preferencial e induzida. Então, seqüências promotoras deDGP encontram uso na expressão raiz-preferencial e induzidade uma seqüência de nücleotideo' de interesseoperacionalmente ligada. Particularmente, o promotor dosavanços age para induzir a expressão após a penetração einfecção de nematódeos nas raízes.
As composições dos avanços incluem moléculas de ácidosnucléicos compreendendo a seqüência nucleotídica promotoradefinida em SEQ ID NOs: 1-4. O termo "promotor" significauma região regulatória de DNA usualmente compreendendo umTATA box capaz de direcionar a RNA polimerase II parainiciar a síntese de RNA no sítio apropriado de iniciação datranscrição para uma seqüência codificante em particular.
Um promotor pode adicionalmente compreender outrasseqüências de reconhecimento posicionadas, geralmente, acimaou a 5' do TATA box, referidas como elementos acima dopromotor, que influenciam a taxa de iniciação datranscrição. É reconhecido que uma vez tendo identificadoas seqüências de nucleotídeos para as regiões promotorasaqui divulgadas, está no estado da técnica isolar eidentificar elementos regulatórios adicionais na região 5'não traduzida acima das regiões promotoras em particularaqui identificadas. Logo, por exemplo, as regiõespromotoras aqui divulgadas podem ainda compreender elementosregulatórios a montante, tais como aqueles responsáveis porexpressão tecidual e temporal da seqüência codificante,amplificadores, e similares. Ver particularmente o pedidode patente australiano No. AU-A-77751/94 e os pedidos depatentes Norte-americanos Nos. 5,466,785 e 5,635,618. Damesma maneira, os elementos promotores que permitemexpressão raiz-preferencial e induzida podem seridentificados, isolados, e usados com outros promotoresnúcleo para conferir expressão induzida. Neste aspecto dosavanços, entende-se por um "promotor núcleo" um promotor semos elementos do promotor.
No contexto desta divulgação, o termo "elementoregulatório" também se refere a uma seqüência de DNA,usualmente, mas nem sempre, acima (5') da seqüênciacodificante de um gene estrutural, que inclui seqüências quecontrolam a expressão da região codificante ao prover oreconhecimento para a RNA polimerase e/ou outros fatoresrequeridos para iniciar a transcrição em um localparticular. Um exemplo de um elemento regulatório quepermite o reconhecimento por parte da RNA polimerase ououtros fatores de transcrição para assegurar a iniciação emum sítio em particular é um elemento promotor. Um elementopromotor compreende um elemento promotor núcleo, responsávelpela iniciação da transcrição, assim como outros elementosregulatórios (como discutido em alguma parte deste pedido)que modificam a expressão gênica. É para ser entendido queseqüências de nucleotídeos, localizadas no interior deintrons, ou 3' da região codificante da seqüência podemtambém contribuir para a regulação da expressão de umaregião codificante de interesse. Exemplos de intronsadequados incluem, mas não estão limitados a o intron IVS6de milho, ou o intron LSI INTR0N2 de batata (Vancanneyt, G. ,et al., (1990) Mol Gen Genet., 220, 245-250). Um elementoregulatorio também pode incluir aqueles elementoslocalizados a jusante (3') do sítio de iniciação datranscrição, ou dentro de regiões transcritas, ou em ambos.No contexto da presente divulgação, um elemento regulatoriopós transcricional pode incluir elementos que estão ativosapós o início da transcrição, por exemplo, intensificadoresde transcrição e de tradução, repressores de transcrição ede tradução, e determinantes de estabilidade de mRNA.
Os elementos regulatórios, ou fragmentos destes, dosavanços podem estar operativãmente associados com elementosregulatórios ou promotores, heterólogos, de maneira amodular a atividade do elemento regulatorio heterologo. Talmodulação inclui intensificar ou reprimir a atividadetranscricional do elemento regulatorio heterologo, modulandoeventos pós-transcricionais, ou tanto intensificando quantoreprimindo a atividade transcricional do elementoregulatorio heterologo e modulando eventos pós-transcricionais. Por exemplo, um ou mais elementosregulatórios, ou fragmentos destes, dos avanços podem estaroperativamente associados com promotores: constitutivos,induzidos, ou tecido-específicos; ou fragmentos destes, paramodular a atividade de tais promotores dentro de tecidosdesejados, dentro de células vegetais.A seqüência do promotor DGP de soja, quando montadadentro de uma construção de DNA, tal que o promotor éoperacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotideo deinteresse, permite a expressão da seqüência de nucleotideosnas células de uma planta estavelmente transformada com estaconstrução de DNA. O termo "operacionalmente ligado" tem oobjetivo de significar que a transcrição ou tradução daseqüência heteróloga de nucleotideos está sob a influênciada seqüência promotora. "Operacionalmente ligado" tambémtem o objetivo de significar a junção entre duas seqüênciasde nucleotideos tal que a seqüência codificante de cadafragmento de DNA permanece na fase de leitura adequada.Desta maneira, as seqüências de nucleotideos para ospromotores dos avanços são fornecidas em construções de DNAjuntamente com a seqüência de interesse, tipicamente umaseqüência heteróloga de nucleotideos, para a expressão naplanta de interesse. O termo "seqüência heteróloga denucleotideos" tem o intuito de significar uma seqüência quenão é naturalmente operacionalmente ligada com a seqüênciapromotora. Enquanto esta seqüência de nucleotideo éheteróloga a seqüência promotora, esta pode ser homóloga, ounativa, ou heteróloga, ou estrangeira, em relação à plantahospedeira.
É reconhecido que os promotores dos avanços podem serusados com as suas seqüências codificantes nativas paraaumentar ou reduzir a expressão, pelos quais resultando emuma mudança no fenótipo da planta transformada.Modificações das seqüências promotoras isoladas dosavanços podem fornecer uma variação de expressão daseqüência heterologa de nucleotideos. Assim, elas podem sermodificadas para serem promotores fracos ou promotoresfortes. Geralmente, um "promotor fraco" tem o intuito designificar um promotor que conduz a expressão de umaseqüência codificante em um baixo nível. Um "baixo nível"de expressão tem o propósito de significar expressão emníveis em torno de 1/10.000 transcritos até cerca de1/100.000 transcritos, até cerca de 1/500.000 transcritos.Reciprocamente, um promotor forte dirige a expressão de umaseqüência codificante em um nível elevado, ou em torno de1/10 transcritos até cerca de 1/100 transcritos, até cercade 1/1.000 transcritos.
Fragmentos e variantes das seqüências promotorasdivulgadas também estão englobados pelos avanços. Um"fragmento" tem a finalidade de significar uma porção daseqüência promotora. Fragmentos de uma seqüência promotorapodem manter a atividade biológica e, conseqüentemente,abranger fragmentos capazes de conduzir a expressão induzidade uma seqüência de nucleotideos operacionalmente ligada.Logo, por exemplo, menos do que a seqüência promotorainteira aqui divulgada pode ser utilizada para dirigir aexpressão de uma seqüência de nucleotideos de interesseoperacionalmente ligada, tal como uma seqüência denucleotideos codificando uma proteína heterologa. Logo, SEQID NOs: 2, 3 e 4 são fragmentos do promotor de SEQ ID NO: 1.Aqueles com conhecimento na arte são capazes de determinarse tais fragmentos reduzem os níveis de expressão ou alterama natureza da expressão, por exemplo, expressão constitutivaou induzida. Alternativamente, fragmentos de uma seqüêncianucleotídica promotora que são úteis como sondas parahibridização, tal qual descrito abaixo, podem não reter estaatividade regulatória. Assim, fragmentos de uma seqüênciade nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 20,cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou atéseqüências de nucleotídeos completas dos avanços.
Assim, um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos dopromotor DGP pode codificar uma porção biologicamente ativado promotor DGP ou este pode ser um fragmento que pode serusado como sonda para hibridização ou como oligo iniciadorpara PCR, usando métodos descritos abaixo. Uma porção biologicamente ativa de um promotor DGP pode ser preparadaao isolar uma porção da seqüência de nucleotídeos dopromotor DGP e avaliando a atividade desta porção dopromotor DGP. Moléculas de ácido nucléico que sãofragmentos de uma seqüência nucleotídica promotoracompreendem, pelo menos, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75,100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700,800, 900, 1000 ou até o número de nucleotídeos presente naseqüência nucleotídica, aqui divulgada, do promotorcompleto, por exemplo, 1108 nucleotídeos para SEQ ID NO: 1.
Os nucleotídeos de tais fragmentos, usualmente,compreenderão a seqüência TATA de reconhecimento daseqüência promotora particular. Tais fragmentos podem serobtidos através do uso de enzimas de restrição para clivar aseqüência nucleotídica promotora naturalmente existente,aqui divulgada; ou podem ser obtidos pelo uso da tecnologiade PCR. Ver particularmente, Mullis et al. (1987) MethodsEnzymol. 155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology(Stockton Press, New York). Variantes destes fragmentos depromotor, tais como aqueles resultantes de mutagênese sítiodirecionada e de um procedimento tal como o "embaralhamento"de DNA, também são abrangidos pelas composições dos avanços.
Um "análogo" dos elementos regulatórios dos avançosinclui qualquer substituição, deleção, ou adição à seqüênciade um elemento regulatório fornecido, que referido análogomantém, pelo menos, uma propriedade regulatória associadacom a atividade do elemento regulatório dos avanços. Taispropriedades incluem direcionar especificidade de órgão,especificidade de tecido, ou uma combinação destas, ouatividade temporal, ou atividade de acordo com odesenvolvimento, ou uma combinação destas.
O termo "variantes" tem a finalidade' de significarseqüências apresentando similaridade substancial com umaseqüência promotora aqui divulgada. Para seqüências denucleotídeos, variantes naturalmente existentes tais comoestas podem ser identificadas com o uso de técnicas bemconhecidas de biologia molecular, como, por exemplo, com areação da polimerase em cadeia (PCR) e técnicas dehibridização como apontadas abaixo. Seqüências variantes denucleotídeos também incluem seqüências nucleotídicassinteticamente derivadas, como aquelas geradas, por exemplo,pelo uso de mutagênese sítio-direcionada. Geralmente,variantes de uma seqüência de nucleotídeos particular dosavanços apresentarão, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, até 95%, 96%, 97%,98%, 99% ou maior identidade de seqüência com aquelaseqüência nucleotídica particular como determinado porprogramas de alinhamento de seqüência aqui descritos emalguma parte, usando parâmetros padrão. Variantesbiologicamente ativas também são abrangidas pelos avanços.Variantes "biologicamente ativas incluem, por exemplo, asseqüências promotoras nativas dos avanços tendo uma ou maissubstituições, deleções, ou inserções. A atividadepromotora pode ser medida pelo uso de técnicas tais comoanálise por Northern blot, medições de atividade repórterfeitas a partir de fusões transcricionais, e similares.Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York), daqui em diante"Sambrook", aqui incorporado por referência.
Alternativamente, níveis de um gene repórter tal qual o daproteína verde fluorescente (GFP) ou similar produzido sobcontrole de um fragmento ou variante de um promotor podemser mensurados. Ver, por exemplo, U.S. Patent No.6,072,050, aqui incorporado como referência.
Métodos para mutagênese e alterações de seqüência denucleotídeo são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo,Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkelet al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. PatentNo. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques inMolecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) eas referências citadas nestes.Seqüências de nucleotídeos promotoras variantes tambémenglobam seqüências derivadas a partir de um procedimentomutagênico e recombinogênico tal como embaralhamento de DNA.
Com tal procedimento, uma ou mais seqüências promotorasdiferentes podem ser manipuladas para criar um novo promotorpossuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira,bibliotecas de polinucleotideos recombinantes são geradas apartir de uma população de polinucleotideos de seqüênciarelacionados, compreendendo regiões de seqüência que têmidentidade de seqüência substancial e podem serhomologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Estratégiaspara tal embaralhamento de DNA são conhecidas na arte. Ver,por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameriet al. (1997) fature Eiotech. 15:436-438; Moore et al.(1997) J\ Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998)Nature 3 91:2 88-291; e U.S. Patent Nos. 5,605,793 and5,837,458 .
As seqüências de nucleotideos dos avanços podem serusadas para isolar seqüências correspondentes de outrosorganismos, tais como outras plantas, por exemplo, outrasmonocotiledôneas. Dessa maneira, . métodos tais como PCR,hibridização, e similares podem ser usados para identificartais seqüências com base em sua homologia de seqüência com aseqüência aqui relatada. Seqüências isoladas baseadas emsuas identidades de seqüência com a seqüência promotoracompleta de DGP aqui determinada ou a fragmentos dessa sãoenglobados pelos avanços. As regiões promotoras dos avançospodem ser isoladas de qualquer planta, incluindo, mas nãolimitado a milho (Zea mays), couve (Brassica napus, Brassicarapa. ssp. ), alfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) ,centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghumvulgare), girassol {Helianthus annuus), trigo (Triticumaestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum) ,batata {Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea) ,algodão (Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus) ,mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocosnucifera) , abacaxi (Arianas comosus) , árvores citricas{Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao) , chá (Camelliasinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana) ,figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga(Mangífera indica), oliveira (Olea europaea), aveias,cevada, cártamo, verduras, ornamentais, e coniferas.
Em uma abordagem por PCR, iniciadores deoligonucleotideos podem ser desenhados para uso em reaçõesde PCR para amplificar seqüências DNA correspondentes decDNA ou DNA genômico extraido de qualquer planta deinteresse. Métodos para desenhar tais iniciadores de PCR eclonagem por PCR são geralmente conhecidos na arte e estãodescritos em Sambrook, supra. Ver também Innis et ai., eds.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995)PCR Strategies (Academic Press, New York) ; e Innis andGelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, NewYork) . Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não selimitam a, métodos usando iniciadores pareados, iniciadoresaninhados, iniciadores únicos específicos, iniciadoresdegenerados, iniciadores gene-especificos, iniciadoresvetor-específicos, iniciadores parcialmente sem
correspondência, e similares,
Em técnicas de hibridização, toda ou parte de umaseqüência de nucleotideos conhecida ê usada como uma sondaque hibridiza seletivamente com outras seqüências denucleotideos correspondentes presentes em uma população defragmentos de DNA genômico ou fragmentos de cDNA clonados(por exemplo, bibliotecas de DNA genômico ou de cDNA) de umorganismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser
fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentosde RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadoscom um grupamento detectável tal como 32P, ou qualquer outromarcador detectável. Assim, por exemplo, sondas parahibridização podem ser feitas marcando oligonucleotídeossintéticos baseados na seqüência promotora de DGP. Métodospara preparação de sondas para hibridização e paraconstrução de bibliotecas genômicas e de cDNA são geralmenteconhecidos na arte e estão descritos em Sambrook, supra.
Por exemplo, a seqüência promotora completa de DGP aquidescrita, ou uma ou mais porções dessa, podem ser usadascomo uma sonda capaz de hibridizar especificamente comseqüências promotoras de DGP correspondentes. Para alcançarhibridização especifica sob uma variedade de condições, taissondas incluem seqüências que são únicas dentre asseqüências promotoras de DGP e são, geralmente, de pelomenos cerca de 10 nucleotideos em comprimento, incluindoseqüências de pelo menos cerca de 20 nucleotideos emcomprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar,por PCR, seqüências promotoras correspondentes a DGP de umaplanta escolhida. Essa técnica pode ser usada para isolarseqüências codificantes adicionais de uma planta desejada oucomo um teste diagnóstico para determinar a presença deseqüências codificantes em uma planta. Técnicas dehibridização incluem rastreamento por hibridização debibliotecas de DNA plaqueadas (tanto placas ou colônias;ver, por exemplo, Sambrook supra) .
A hibridização de tais seqüências pode ser conduzidasob condições estringentes. "Condições estringentes" ou"condições de hibridização estringentes" são condições sobas quais uma sonda hibridizará com a sua seqüência alvo a umgrau detectavelmente maior do que com outras seqüências (porexemplo, pelo menos 2 vezes sobre o ruido de fundo) .Condições estringentes são dependentes de seqüência e serãodiferentes em diferentes circunstâncias. Controlando aestringência das condições de hibridização e/ou lavagem,seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podemser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente,condições de estringência podem ser ajustadas para permitiralguma falta de correspondência em seqüências de forma quegraus menores de similaridade sejam detectados (sondagemheteróloga). Geralmente, uma sonda é menor que cerca de1000 nucleotideos em comprimento, incluindo aquelas de menosde 500 nucleotideos em comprimento.Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nasquais a concentração de sais é menor do que cerca de 1,5 Mde ions de Na, tipicamente na concentração de cerca de 0,01a 1,0 M de ions de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e atemperatura é de pelo menos 30°C para sondas curtas (porexemplo, 10 a 50 nucleotideos) e de pelo menos 60°C parasondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotideos).Condições estringentes podem ser alcançadas, também, com aadição de agentes desestabilizantes, tal como formamida.
Condições exemplares de baixa estringência incluemhibridização com uma solução tampão de 30 a 35% deformamida, 1 M NaCl, 1% SDS (sódio dodecil sulfato) a 37°C,e uma lavagem em SSC IX a 2X (SSC 20X = 3,0 M NaCl/0,3 Mtrissódio citrato) a 50 a 55°C. Condições exemplares deestringência moderada incluem hibridização em 40 a 45%formamida, 1,0 M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em SSC0,5X a IX entre 55 e 60°C. Condições exemplares deestringência elevada incluem hibridização em 50% formamida,1 M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem final em SSC 0,1X a60 a 65°C por pelo menos 30 minutos. A duração dehibridização é geralmente menor do que aproximadamente 24horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.
Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e atemperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado apartir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem.138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61(% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátionsmonovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotideos guanosinae citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida nasolução de hibridização, e L é o comprimento do hibrido empares de bases. Tm é a temperatura (sob definidas forçaiônica e pH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementarhibridizam com uma sonda perfeitamente correspondente. Tm éreduzida em cerca de 1 C para cada 1% de falta decorrespondência; assim, condições de Tm/ hibridização, e/oude lavagem podem ser ajustadas ' para hibridizar' comseqüências de identidade desejada. Por exemplo, seseqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm podeser diminuída em 10°C. Geralmente, condições estringentessão selecionadas para ser cerca de 5°C menos do que a Tm paraa seqüência especifica e seu complemento em uma força iônicae pH definidos. Contudo, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou4°C menor do que a Tm; condições moderadamente estringentespodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9,ou 10°C menor do que a Tm; condições de baixa estringênciapodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13,14, 15, ou 20°C menor do que a Tm. Usando a equação,composições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aquelescom ' habilidade comum entenderão que variações naestringência de soluções de hibridização e/ou lavagem sãoinerentemente descritas. Se o grau desejado de falta decorrespondência resulta em uma Tm de menos do que 45°C(solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), épreferível aumentar a concentração SSC de forma que umamaior temperatura possa ser usada. Um guia extensivo para ahibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I,Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al.t eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York), daquiem diante "Ausubel". Ver também Sambrook supra.
Logo, seqüências isoladas que apresentam atividadepromotora induzida e ' que hibridizam sob condiçõesestringentes com as seqüências promotoras de DGP aquidescritas, ou com fragmentos dessas, são englobadas pelosavanços.
Em geral, seqüências que tem atividade promotora ehibridizam com seqüências promotoras aqui descritas serãopelo menos de 40% a 50% homólogas, cerca de 60%, 70%, 80%,85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou mais com as seqüênciasdescritas. Isto é, a similaridade de seqüência entreseqüências pode variar, compartilhando pelo menos cerca de40% a 50%, cerca de 60% a 70%, e cerca de 80%, 85%, 90%, 95%a 98% similaridade de seqüência.
Os seguintes termos são usados para descrever osrelacionamentos de seqüência entre dois ou mais ácidosnucléicos ou polinucleotideos: (a) "seqüência referência",(b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüência",(d) "porcentagem de identidade de seqüência", e (e)"identidade substancial".
(a) Como aqui usado, "seqüência referência" é umaseqüência definida usada como base para comparação deseqüências. Uma seqüência referência pode ser um subgrupoou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo,como um segmento de um cDNA completo ou de uma seqüênciagênica completa, ou o cDNA ou seqüência gênica completos.
(b) Como aqui usado, "janela de comparação" faz
referência a um segmento contiguo e especifico de umaseqüência de polinucleotideos, caracterizado pelo fato deque a seqüência de polinucleotideos na janela de comparaçãopode compreender adições ou deleções (por exemplo,espaços("Gaps")) quando comparada à seqüência referência(que não compreende adições ou deleções) para alinhamentoideal das duas seqüências. Geralmente, a janela decomparação é de pelo menos 20 nucleotideos contíguos emcomprimento, e opcionalmente podem ser de 30, 40, 50, 100,ou mais longa. Aqueles especialistas na arte entendem quepara evitar uma alta similaridade para uma seqüênciareferência devido à inclusão de espaços (gaps) na seqüênciade polinucleotideos, uma penalidade por espaço é tipicamenteintroduzida e subtraída do número de correspondências.
Métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na arte. Assim, a determinação dopercentual de identidade de seqüência entre quaisquer duasseqüências pode ser alcançada usando um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes preferidos de taisalgoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller(1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de homologia local deSmith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo dealinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48:443-453; o algoritmo de Pearson e Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo deKarlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.
Implementações de computador desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação deseqüências para determinar a identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não são limitadas a: CLUSTAL noprograma PC/Gene (disponivei pela Intelligenetics, MountainView, Califórnia); o programa ALIGN (Version 2.0); oprograma ALIGN PLUS (Version 3.0, copyright 1997): e GAP,BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de softwareWisconsin Genetics Software Package of Genetics ComputerGroup, Version 10 (disponivei pela Accelrys, 9685 ScrantonRoad, San Diego, CA, 92121, USA) . A matriz de pontuaçãousada na versão 10 do pacote de software Wisconsin GeneticsSoftware Package é BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).
Alinhamentos usando esses programas podem serrealizados usando os parâmetros padrão. O programa CLUSTALé bem descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244(1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet etal. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al.(1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol.Biol. 24:307-331. Os programas ALIGN e ALIGN PLUS sãobaseados no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Umatabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade porcomprimento de espaço de 12, e uma penalidade por espaço de4 podem ser usadas com o programa ALIGN quando comparandoseqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschulet al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmode Karlin e Altschul (1990) supra. As buscas de
nucleotídeos no BLAST podem ser realizadas com o programaBLASTN, pontuação = 100, "wordlength" = 12, para obterseqüências de nucleotideos homólogas a uma seqüência denucleotideos codificando uma proteína dos avanços. Buscaspor proteína no BLAST podem ser efetuadas com o programaBLASTX, pontuação = 50, "wordlength" = 3, para obterseqüências de aminoácidos homólogas a uma proteína oupolipeptideo dos avanços. Para obter alinhamentos comespaços para propósitos de comparação, Gapped BLAST (noBLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Altschul etai. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente,PSI-BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado para efetuar umabusca iterada que detecta relações distantes entremoléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quandousando BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrãodos respectivos programas (por exemplo, BLASTN paraseqüências de nucleotideos, BLASTX para proteínas) podem serusados. Ver o site do National Center for BiotechnologyInformation na internet. O alinhamento também pode serefetuado manualmente por inspeção.
A menos que definido ao contrário, os valores deidentidade/similaridade de seqüência aqui providos referem-se ao valor obtido usando o programa GAP com parâmetrospadrão, ou qualquer programa equivalente. Por "programaequivalente", entende-se qualquer programa de comparação deseqüências que, para quaisquer duas seqüências em questão,gere um alinhamento tendo correspondência de nucleotideos oude resíduos de aminoácidos idênticos e um percentualidêntico de identidade de seqüência quando comparado aoalinhamento correspondente gerado pelo GAP.
O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch(1970) supra, para encontrar o alinhamento de duasseqüências completas, que maximiza o número decorrespondências e minimiza o número de espaços. GAPconsidera todas as posições de alinhamento e espaçospossíveis e cria o alinhamento com o maior número de basescom correspondência e com o menor de espaços. Isto leva emconsideração a provisão de uma penalidade de criação deespaços e uma penalidade de extensão de espaços em unidadesde bases com correspondência. GAP deve gerar um saldo denúmero de penalidades de criação de espaços decorrespondências para cada espaço que insere.
Se uma penalidade por extensão de espaço maior que zero éescolhida, GAP deve, adicionalmente, fazer um saldo paracada espaço inserido do comprimento do espaço vezes apenalidade por extensão de espaço. Valores padrão depenalidade de criação de espaços e valores de penalidade deextensão de espaços na Versão 10 do pacote de softwareWisconsin Genetics Software Package para seqüências deproteínas são 8 e 2, respectivamente. Para seqüências denucleotideos a penalidade padrão para criação de espaço é de50, enquanto a penalidade padrão por extensão de espaço é de3. As penalidades de criação e extensão de espaços podemser expressas como um número inteiro selecionado do grupo denúmeros inteiros consistindo de 0 a 200. Assim, porexemplo, as penalidades de criação e extensão de espaçospodem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.(c) Como aqui usado, "identidade de seqüência", ou"identidade" no contexto de duas seqüências de ácidosnucléicos ou polipeptideos, faz referência aos residuos nasduas seqüências que são os mesmos quando alinhadas paracorrespondência máxima sobre uma janela de comparaçãoespecífica. Quando a porcentagem de identidade de seqüênciaé usada em referência a proteínas, é reconhecido queposições de resíduos que não são idênticos, freqüentementediferem por substituições de aminoácidos conservadas, ondeos resíduos de aminoácidos são substituídos por outrosresíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares(por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, nãomudam as propriedades funcionais da molécula. Quandoseqüências diferem em substituições conservadas, opercentual de identidade de seqüência pode ser ajustado paracima para corrigir a natureza conservada da substituição.Seqüências que diferem por tais substituições conservadassão ditas tendo "similaridade de seqüência" ou"similaridade". Meios de fazer esse ajuste são bemconhecidos por especialistas na técnica. Tipicamente, issoenvolve pontuar uma substituição conservada como umaparcial, ao invés de uma falta de correspondência completa,aumentando, dessa forma, a porcentagem de identidade deseqüência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idênticorecebe uma pontuação de 1 e uma substituição não conservadarecebe uma pontuação de zero, uma substituição conservadarecebe uma pontuação entre zero e 1. A pontuação desubstituições conservadas é calculada, por exemplo, comoimplementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, MountainView, Califórnia).
(d) Como aqui usado, "porcentagem de identidade deseqüência" significa o valor determinado comparando-se duasseqüências otimamente alinhadas em uma janela de comparação,caracterizado pelo fato de que a parte da seqüência depolinucleotideos na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (ex: espaços), se comparada à seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) paraalinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem écalculada determinando-se o número de posições nas quais abase de ácido nucléico ou residuo de aminoácido idênticoocorre em ambas as seqüências para produzir o número deposições com correspondência, dividindo o número de posiçõescom correspondência pelo número total de posições na janelade comparação, e multiplicando o resultado por 100 paraproduzir a porcentagem de identidade de seqüência.
(e)(i) O termo "identidade substancial" de
seqüências de polinucleotideos significa que umpolinucleotideo compreende uma seqüência que tem pelo menos70% de identidade de seqüência, pelo menos 80%, pelo menos90%, ou pelo menos 95%, comparada a uma seqüência referênciausando um dos programas de alinhamento descritos, usandoparâmetros padrão. Um especialista na arte reconhecerá queesses valores podem ser ajustados apropriadamente paradeterminar identidade correspondente de proteínascodificadas por duas seqüências de nucleotideos, levando-se em conta degeneração de códon, similaridade de aminoácidos,posicionamento da fase de leitura, e similares. Identidadesubstancial de seqüências de aminoácidos para essespropósitos significa, normalmente, identidade de seqüênciade pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, e pelo menos 95%.
Outra indicação de que seqüências de nucleotideos sãosubstancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizamuma à outra sob condições estringentes. Geralmente,condições estringentes são selecionadas para ser cerca de5°C menos do que a Tm para a seqüência especifica em umaforça iônica e pH definidos. Contudo, condiçõesestringentes englobam temperaturas na faixa de cerca de 1°Ca cerca de 20 C menor do que a Tm, dependendo do grau deestringência desejado, como de outra forma aqui qualificado.
Ácidos nucléicos que não hibridizam um ao outro sobcondições estringentes são ainda substancialmente idênticosse os polipeptideos que codificam são substancialmenteidênticos. Isso pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópiade um ácido nucleico é criada usando a degeneração máxima decódon permitida pelo código genético. Uma indicação de queduas seqüências de ácidos nucléicos são substancialmenteidênticas é quando o polipeptideo codificado pelo primeiroácido nucleico é imunologicamente inter-reativo com opolipeptideo codificado pelo segundo ácido nucleico.
A seqüência promotora de DGP aqui descrita, assim comovariantes e fragmentos dessa,' são úteis para engenhariagenética de plantas, por exemplo, para a produção de umaplanta transformada ou planta transgênica, para expressar umfenótipo de interesse. Como aqui usado, os termos "plantatransformada" e "planta transgênica" referem-se a uma plantaque compreende em seu genoma um polinucleotideo heterólogo.Geralmente, o polinucleotideo heterólogo é estavelmenteintegrado no genoma de uma planta transgênica outransformada, de forma que o polinucleotideo é passado asucessivas gerações. 0 polinucleotideo heterólogo pode serintegrado no genoma sozinho ou como parte de uma construçãode DNA récombinante. Deve ser entendido que o termo"transgênico", como aqui usado, inclui qualquer célula,linhagem celular, calo, tecido, parte de planta, ou planta,cujo genótipo foi alterado pela presença de ácido nucléicoheterólogo, incluindo aqueles transgênicos alteradosinicialmente dessa forma, assim como aqueles criados porcruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir dotransgênico inicial. O termo "transgênico", como aquiusado, não engloba a alteração do genoma (cromossômico ouextra-cromossômico) por métodos convencionais demelhoramento de plantas ou por eventos naturalmenteocorrentes, tais como fertilização cruzada aleatória,infecção viral não récombinante, transformação bacteriananão récombinante, transposição não récombinante, ou mutaçãoespontânea.
Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vegetais com uma construção de DNA heterólogo,incluindo um cassete de expressão de ácido nucléico quecompreenda um transgene de interesse, a regeneração de umapopulação de plantas resultantes da inserção do transgene nogenoma da planta, e a seleção de uma planta em particular,caracterizada pela inserção em uma localidade do genoma emparticular. Um evento é caracterizado fenotipicamente pelaexpressão do transgene. No nivel genético, um evento éparte da constituição genética de uma planta. 0 termo"evento" também se refere à progênie produzida por umcruzamento sexuado entre a transformante e outra variedadeque inclui o DNA heterólogo.
Como aqui usado, o termo "planta" inclui referência aplantas inteiras, órgãos de plantas (e.g., folhas, caules,raizes, etc), sementes, células vegetais, e progênie dosmesmos.. Partes de plantas transgênicas devem serentendidas, no escopo dos avanços, por compreender, porexemplo, células vegetais, protoplastos, tecidos, calo,embriões, assim como flores, caules, frutos, óvulos, folhas,ou raizes, originando plantas transgênicas ou a progêniedestas, previamente transformada com uma molécula de DNA dosavanços, e, portanto, consistindo pelo menos em parte decélulas transgênicas.
Como aqui usado, o termo "célula vegetal" inclui, semlimitação, culturas de suspensão de sementes, embriões,regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raizes,brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micro-esporos. Aclasse de plantas que pode ser usada nos métodos aquidescritos é geralmente tão ampla quanto a classe de vegetaissuperiores receptivel a técnicas de transformação, incluindotanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas.
As seqüências promotoras e os métodos aqui descritossão úteis para regular a expressão de qualquer seqüênciaheteróloga de nucleotideos em uma planta hospedeira. Assim,a seqüência heteróloga de nucleotideos operacionalmenteligada aos promotores aqui descritos pode ser um geneestrutural codificando uma proteina de interesse. Genes deinteresse são reflexo dos mercados e interesses daquelesenvolvidos no desenvolvimento do cultivo. Cultivos emercados de interesse mudam, e à medida que nações emdesenvolvimento se abrem a mercados mundiais, novos cultivose tecnologias também emergirão. Além disso, à medida quenosso entendimento de traços e características agronômicas,tais como aumento de produção e de heterose, a escolha degenes para transformação conseqüentemente mudará de acordo.Categorias gerais de genes de interesse para os avançosincluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos eminformação, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos emcomunicação, tais como quinases, e aqueles envolvidos emmanutenção, tais como proteínas de choque de calor.Categorias mais especificas de transgenes, por exemplo,incluem genes codificando proteínas conferindo resistência aestresse abiótico, tal como seca, temperatura, salinidade, etoxinas, tais como pesticidas e herbicidas, ou a estressebiótico, tal como ataques por fungos, virus, bactérias,insetos, e nematódeos, e desenvolvimento de doençasassociadas a esses organismos. Várias mudanças em fenótiposão de interesse, incluindo modificar a expressão de um geneem uma planta, alterar o mecanismo de defesa de uma planta apatógeno ou inseto, aumentar a tolerância de planta aherbicidas, alterar o desenvolvimento vegetal para respondera estresse ambiental, e similares. Os resultados podem seratingidos ao se prover a expressão de produtos heterólogosou a expressão aumentada de produtos endógenos em plantas.Alternativamente, os resultados podem ser alcançadosprovendo-se uma redução de expressão de um ou mais produtosendógenos, particularmente enzimas, transportadores, ou co-fatores, ou afetando a absorção de nutrientes na planta.Essas mudanças resultam em uma mudança de fenótipo da plantatransformada.
É reconhecido que qualquer gene de interesse pode seroperacionalmente ligado às seqüências promotoras dos avançose expresso em uma planta.
Uma construção de DNA compreendendo um desses genes deinteresse pode ser usada com técnicas de transformação, taiscomo aquelas descritas abaixo, para criar resistência adoenças ou insetos em fenótipos vegetais susceptíveis oupara intensificar a resistência a doenças ou insetos emfenótipos vegetais resistentes. Conseqüentemente, osavanços englobam métodos que são direcionados para protegerplantas contra fungos patogênicos, bactérias, virus,nematódeos, insetos, e similares. Por "resistência adoenças" entende-se ' que as plantas evitam os sintomasnocivos que são o resultado das interações planta-patógeno.
Genes de resistência a doenças e de resistência ainsetos, tais como lisozimas, cecropinas, maganinas, outioninas para proteção anti-bacteriana, ou proteínasrelacionadas com a patogênese (PR), tais como glucanases equitinases para proteção anti-fúngica, ou endotoxinas de
Bacillus thuringiensis, inibidores de protease, colagenases,lectinas, e glicosidases para controlar nematódeos ouinsetos são todos exemplos de produtos gênicos úteis.
Genes codificando características de resistência adoenças incluem genes de desintoxicação, tais como contrafumonisina (U.S. Patent No. 5.792.931) avirulência (avr) egenes de resistência a doenças (R) (Jones et al. (1994)Science 266:189; Martin' et al. (1993) Science 262:1432;Mindrinos et al. (1994) Cell 75:1089); e similares.
Características de resistência a herbicidas podem serintroduzidas em plantas por genes codificando resistência aherbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactatosintase (ALS), em particular os herbicidas do tiposulfoniluréia (por exemplo, o gene de acetolactato sintase(ALS) contendo mutações levando a tal resistência, emparticular as mutações S4 e/ou Hra), genes codificandoresistência a herbicidas que atuam para inibir a ação deglutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (porexemplo, o gene bar), ou outros genes conhecidos na técnica.O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o genenptll codifica resistência aos antibióticos canamicina egeneticina, e o gene ALS codifica resistência ao herbicidaclorsulfuron.
A resistência ao glifosato é conferida pelo mutante na5-enol piruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) e genesaroA. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 4 . 940.835 paraShah et al., que descreve a seqüência de nucleotideos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato.U.S. Patent No. 5.627.061 para Barry et al. também descrevegenes codificando enzimas EPSPS. Ver, também, U.S. PatentNos. 6.248.876; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783;4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775;6.225.114; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061;5.633.448; 5.510.471; RE 36.449; RE 37.287; e 5.491.288; epublicações internacionais WO 97/04103; WO 97/04114; WO00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 e WO 00/66748, as quaissão aqui incorporadas por referência para esse propósito.
Resistência a glifosato também é conferida às plantas queexpressam um gene que codifica uma enzima glifosato óxido-redutase, como descrito mais completamente em U.S. PatentNos. 5.776.760 e 5.463.175, as quais são aqui incorporadaspor referência para esse propósito. Além disso, resistênciaa glifosato pode ser conferida a plantas pela super-expressão de genes codificando glifosato N-acetiltransferase. Ver, por exemplo, U.S. PatentApplication Serial Nos. 10/004.357; e 10/427.692.Genes de esterilidade também podem ser codificados emuma construção de DNA e fornecem uma alternativa à podafisica. Exemplos de genes usados em tais vias incluem genesmasculinos tecido-preferenciais e genes com fenótipos deesterilidade de machos, tais com QM, descrito em U.S. PatentNo. 5.583.210. Outros genes incluem quinases e aquelescodificando compostos tóxicos tanto para desenvolvimento degametófito masculino quanto para o feminino.
Características comerciais também podem ser codificadasem um gene ou genes que poderiam aumentar, por exemplo,amido para produção de etanol, ou prover expressão deproteínas. Outro importante uso comercial de plantastransformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, talcomo descrito em U.S. Patent No. 5.602.321. Genes, taiscomo (3-cetotiolase, PHBase (polihidroxibutirato sintase) , eacetoacetil-CoA redutase (ver Schubert et al. (1988) J.Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão depolihidroxialcanoatos (PHAs).
Características agronomicamente importantes, que afetama qualidade do grão, tal como niveis e tipos de óleos,saturados e insaturados, qualidade e quantidade deaminoácidos essenciais, niveis de celulose, amido, econteúdo de proteína podem ser geneticamente alteradosusando os métodos dos avanços. O promotor DGP também é útilem expressar genes envolvidos na utilização e assimilação denitrogênio em raizes, tal como nitrato redutase (ver, porexemplo, Kaiser, W. M. et ai. (2002) J. Exp. Bot. 53: 875-882) , nitrito redutase (ver, por exemplo, Takahashi, M. et al. (2001) Plant Physiol. 126 (2) : 731-41), glutaminasintetase (ver, por exemplo, Teixeira, J. et al. (2005) JExp Bot 56(412): 663-71), transportadores de nitrato (ver,por exemplo, Orsel, M. et al. (2002) Plant Physiol. 129(2):886-96) e outros, tal como sulfito oxidorredutase(ferredoxina) (Hirasawa, M. et al. (2004) Biochim. Biophys.Acta, 1608, 140-148) . O promotor DGP também pode ser útilem expressar seqüências de nucleotídeos anti-senso de genesque afetam negativamente o desenvolvimento de raiz sobcondições de plantio em alta densidade.Modificações para características de grãos incluem, masnão estão limitadas a, aumentar o conteúdo de ácido oléico,óleos saturados e insaturados, aumentar níveis de lisina eenxofre, prover aminoácidos essenciais, e modificar amido.Modificações da proteína hordotionina em milho são descritasem U.S. Patent Nos. 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e5.703.04 9; aqui incorporadas por referência. Outro exemploé a proteína de semente rica em lisina e/ou enxofrecodificada pela albumina 2S de soja descrita em U.S. PatentNo. 5.850.016, e o inibidor de quimotripsina de cevada,Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, asdescrições dos quais são aqui incorporadas por referência.
Produtos exógenos incluem enzimas e produtos vegetaisassim como aqueles de outras fontes incluindo procariotos eoutros eucariotos. Tais produtos incluem enzimas, co-fatores, hormônios, e similares.
Exemplos de outros genes aplicáveis e seus fenótiposassociados incluem o gene que codifica proteína de capsídeoviral e/ou RNA, ou outros genes virais ou vegetais queconferem resistência viral; genes que conferem resistência afungos; genes que conferem resistência a insetos; genes quepromovem aprimoramento da produção; e genes que conferemresistência a estresse, tal como a desidratação resultantede calor e salinidade, metal tóxico ou elementos traço, ousimilares.
Em outros avanços da presente invenção, as seqüênciasdo promotor DGP são operacionalmente ligadas a genes deinteresse que melhoram o crescimento de plantas ou aumentama produção de cultivos sob condições de alta densidade deplantas. Por exemplo, o promotor de DGP pode ser
operacionalmente ligado a seqüências de nucleotideosexpressando genes agronomicamente importantes que resultamem sistemas radiculares primários ou laterais melhorados.Tais genes incluem, mas não são limitados a, transportadoresde nutrientes/água e indutores de crescimento. Exemplos detais genes incluem, mas não são limitados a, H+-ATPase demembrana plasmática de milho (MHA2) (Frias et al. (1996)Plant Cell 8:1533-44); AKT1, um componente do aparato deabsorção de potássio em Arabidopsis (Spalding et al. (1999)J. Gen. Physiol. 113:909-18); genes RML, que ativam o ciclode divisão celular nas células apicais de raiz (Cheng et al.(1995) Plant Physiol. 108:881); genes de glutaminasintetase de milho (Sukanya et al. (1994) Plant Mol. Biol.26:1935-46); e hemoglobina (Duff et al. (1997) J. Biol.Chem. 27:16749-16752; Arredondo-Peter et al. (1997) PlantPhysiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter et al. (1997)Plant Physiol. 114:493-500 e referências ai citadas). Opromotor de DGP também pode ser útil expressando seqüênciasde nucleotideos anti-sênso de genes que afetam negativamenteo desenvolvimento de raiz sob condições de plantio em altadensidade.
A seqüência heteróloga de nucleotideos operacionalmente
ligada ao promotor de DGP e seus fragmentos ou variantesrelacionados biologicamente ativos aqui descritos podem seruma seqüência anti-senso para um gene alvo. A terminologia"seqüência de DNA de nucleotideos anti-senso" deve significar uma seqüência que está em orientação inversa àorientação 5'-3' normal daquela seqüência de nucleotideos.Quando entregue em uma célula vegetal, a expressão daseqüência de DNA anti-senso previne a expressão normal daseqüência de nucleotideos de DNA para o gene alvo. Aseqüência de nucleotideos anti-senso codifica um transcritode RNA que é complementar e capaz de hibridizar com o RNAmensageiro (mRNA) endógeno produzido pela transcrição daseqüência de nucleotideos de DNA do gene alvo. Neste caso,a produção da proteina nativa codificada pelo gene alvo éinibida para alcançar uma resposta fenotipica desejada.Modificações das seqüências anti-senso podem ser feitascontanto que as seqüências hibridizem e interfiram com aexpressão do mRNA correspondente. Dessa maneira,construções anti-senso tendo 70%, 80%, 85% de identidade deseqüência às seqüências anti-senso correspondentes podem serusadas. Adicionalmente, porções dos nucleotideos anti-sensopodem ser usadas para interromper a expressão do gene alvo.Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotideos, 100nucleotideos, 200 nucleotideos, ou maiores podem ser usadas.
Assim, as seqüências promotoras aqui descritas podem seroperacionalmente ligadas a seqüências de DNA anti-senso parareduzir ou inibir a expressão de uma proteina nativa naplanta.
"RNAi" refere-se a uma série de técnicas relacionadaspara reduzir a expressão de genes (Ver, por exemplo U.S.Patent No. 6.506.559). Técnicas mais antigas referidas poroutros nomes são, agora, consideradas por confiar no mesmomecanismo, mas são dados nomes diferentes na literatura.
Estas incluem "inibição anti-senso", a produção detranscritos de RNA anti-senso capazes de suprimir aexpressão da proteína alvo, a "co-supressão" ou "supressãosenso", que se referem à produção de transcritos de RNAsenso capazes de suprimir a expressão de genes estrangeirosidênticos ou substancialmente similares, ou genes endógenos(U.S. Patent No. 5.231.020, aqui incorporada porreferência) . Tais técnicas confiam no uso de construçõesresultando no acúmulo de RNA de dupla fita com uma fitacomplementar ao gene alvo a ser silenciado. A seqüênciapromotora de DGP dos avanços, e seus fragmentos ou variantesrelacionados biologicamente ativos aqui descritos, pode serusada para dirigir a expressão de construções que resultarãoem interferência com RNA, incluindo microRNAs e siRNAs.
Em um avanço da invenção, construções de DNA
compreenderão uma região de iniciação de transcriçãocompreendendo uma das seqüências de nucleotideos promotorasaqui descritas, ou variantes ou fragmentos dessas,operacionalmente ligadas a uma seqüência de nucleotideosheteróloga cuja expressão é para ser controlada pelopromotor dos avanços. Tal construção de DNA é provida comuma pluralidade de sitios de restrição para inserção daseqüência de nucleotideos de modo a ficar sob regulaçãotranscricional das regiões reguladoras. A construção de DNApode ainda conter genes marcadores de seleção.
A construção de DNA incluirá, na direção 5'-3' detranscrição, uma região de iniciação da transcrição (porexemplo, um promotor induzido dos avanços), região de iniciação da tradução, uma seqüência heteróloga denucleotideos de interesse, uma região de terminação datradução e, opcionalmente, uma região de terminaçãotranscricional funcional no organismo hospedeiro. Asregiões reguladoras (i.e., promotores, regiões reguladorasde transcrição, e regiões de terminação de tradução) e/ou ospolinucleotideos dos avanços podem ser nativos/análogos àcélula hospedeira ou um ao outro. Alternativamente, asregiões reguladoras e/ou o polinucleotideo dos avanços podemser heterólogos à célula hospedeira ou um ao outro. Comoaqui usado, "heterólogo" em referência a uma seqüência é umaseqüência que é de origem de uma espécie estrangeira, ou, seda mesma espécie, é substancialmente modificada de sua formanativa em composição e/ou locus genômico por intervençãohumana deliberada. Por exemplo, um promotoroperacionalmente ligado a um polinucleotideo heterólogo é deuma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotideofoi derivado, ou, se da mesma/análoga espécie, um ou ambossão substancialmente modificados de sua forma original e/oulocus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo para opolinucleotideo operacionalmente ligado.
A região de terminação opcionalmente incluida pode sernativa em relação a região de iniciação da transcrição, podeser nativa em relação ao polinucleotideo de interesse operacionalmente ligado, pode ser nativa em relação aohospedeiro vegetal, ou pode ser derivada de outra fonte(isto é, estrangeira ou heteróloga) para o promotor, opolinucleotideo de interesse, o hospedeiro, ou qualquercombinação destes. Regiões de terminação convenientes estãodisponíveis no plasmideo Ti de A. tumefaciens, tais como asregiões de terminação de octopina sintase e nopalinasintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen.Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674;
Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al.(1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res.
17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res.15:9627-9639. Em avanços particulares, o terminador do geneinibidor de protease de batata II (Pinll) é usado. Ver, porexemplo, Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; e An et al. (1989) Plant Cell 1:115-122, aquiincorporados por referência em sua integridade.
A construção de DNA compreendendo uma seqüênciapromotora dos avanços, operacionalmente ligada a umaseqüência heteróloga de nucleotideos, também pode conterpelo menos uma seqüência de nucleotideos adicional para umgene a ser co-transformado no organismo. Alternativamente,a(s) seqüência(s) adicional(is) pode ser provida em outraconstrução de DNA.
Onde for apropriado, a seqüência heteróloga denucleotideos cuja expressão é para estar sob o controle daseqüência promotora dos avanços e qualquer seqüência(s) denucleotideos adicional(is) , pode ser otimizada para aumentara expressão na planta transformada. Ou seja, essasseqüências de nucleotideos podem ser sintetizadas usandocódons preferenciais de plantas para expressão melhorada.Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizarseqüências de nucleotideos preferenciais de plantas. Ver,por exemplo, U.S. Patent Nos. 5.380.831 e 5.436.391, eMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aquiincorporadas por referência.
Modificações adicionais de seqüências são conhecidaspor intensificar a expressão gênica em um hospedeirocelular. Essas incluem a eliminação de seqüênciascodificando sinais artificiais de poliadenilação, sinais deprocessamento exon-intron, repetições do tipo transposons, eoutras, tais como seqüências bem caracterizadas que podemser deletérias à expressão gênica. 0 conteúdo de G-C daseqüência heteróloga de nucleotideos pode ser ajustado aniveis médios para um dado hospedeiro celular, comocalculado por referência para genes conhecidos expressos nacélula hospedeira. Quando possível, a seqüência émodificada para evitar estruturas secundárias em grampo(hairpin) de mRNA previstas.
As construções de DNA podem conter, adicionalmente,seqüências lider 5'. Tais seqüências lider podem atuar paraintensificar a tradução. Lideres de tradução são conhecidosna arte e incluem: lideres de picornavirus, por exemplo,lider EMCV (região não codificadora 5' do virus daencefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat.Acad. Sei. USA 86:6126-6130); lideres de potivirus, porexemplo, lider TEV (Virus Etch de Tabaco) (Allison et al.(1986) Virology 254:9-20); lider MDMV (Virus de Mosaico doMilho Anão); proteína ligante de imunoglobulina humana decadeia pesada (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); lider não traduzida do mRNA da proteína do capsideo devirus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al.(1987) Nature 325:622-625); lider de vírus de mosaico detabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology ofRNA, 237-256); e líder de vírus clorótico de milho (MCMV)(Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver, também,Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968.Outros métodos conhecidos por intensificar a tradução e/ouestabilidade de mRNA também podem ser utilizados, porexemplo, introns, tais como o intron de ubiquitina do milho(Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218;Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689) ou oíntron de Adhl do milho (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen.Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), e similares.
As construções de DNA dos avanços podem incluir,também, intensifícadores adicionais, tanto intensifícadoresde tradução como de transcrição, como pode ser requerido.Essas regiões intensificadoras são bem conhecidas deespecialistas na técnica, e podem incluir o códon deiniciação ATG e seqüências adjacentes. O códon de iniciaçãodeve estar na mesma fase de leitura que a seqüênciacodificadora para assegurar a tradução de toda a seqüência.Os sinais de controle de tradução e códons de iniciaçãopodem ser de uma variedade de origens, tanto natural comosintética. Regiões de iniciação de tradução podem serprovidas a partir da fonte da região de iniciaçãotranscricional, ou do gene estrutural. A seqüência tambémpode ser derivada do elemento regulador selecionado paraexpressar o gene, e pode ser especificamente modificada deforma a aumentar a tradução do mRNA. É reconhecido que,para aumentar os niveis de transcrição, intensificadorespodem ser utilizados em combinação com as regiões promotorasdos avanços. Intensificadores são conhecidos na técnica edestes fazem parte, a região intensificadora SV40, oelemento intensificador 35S, e similares.
Ao preparar a construção de DNA, os vários fragmentosde DNA podem ser manipulados, de forma a prover asseqüências de DNA na orientação correta e, como apropriado,na fase de leitura adequada. Nesse sentido, adaptadores ouligantes podem ser empregados para juntar os fragmentos deDNA ou outras manipulações podem ser envolvidas parafornecer sitios de restrição convenientes. Sítios derestrição podem ser adicionados ou removidos, DNA supérfluopode ser removido, ou outras modificações similares podemser feitas para as seqüências dos avanços. Com estepropósito, mutagênese ín vitro, reparo de oligo iniciador,restrição, anelamento, re-substituições, por exemplo,transições e transversões, podem estar envolvidas.
Genes repórter ou genes marcadores de seleção podem serincluídos nas construções de DNA. Exemplos de genesrepórter adequados conhecidos na arte podem ser encontradosem, por exemplo, Jefferson et al. (1991) in Plant MolecularBiology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer AcademicPublishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell.Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522;Kain et al. (1995) BioTechniques 29:650-655; e Chiu et al.1996) Current Biology 5:325-330.Genes marcadores de seleção para seleção de células outecidos transformados podem incluir genes que conferemresistência a antibióticos ou resistência a herbicidas.Exemplos de genes marcadores de seleção adequados incluem,mas não são limitados a, genes codificando resistência,cloramfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J.2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. ' (1983)Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol.26:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol.Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science105:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen.Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al.(1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al.(1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineauet al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinil(Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato(Shaw et al. (1986) Science 233:478-481); fosfinotricina(DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518) .
Outros genes que poderiam ter utilidade na recuperaçãode eventos transgênicos, mas podem não ser requeridos noproduto final, incluiriam, mas não estão limitados aexemplos tais como, GUS (b-glucuronidase; Jefferson (1987)Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteina verdefluorescente; Chalfie et al. (1994) Science 263:802),luciferase (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res.15(19):8115 e Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol.216:397-414), e os genes de milho codificando para produção de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).As moléculas de ácido nucléico dos avanços são úteis emmétodos direcionados para expressar uma seqüência denucleotideos em uma planta. Isso pode ser conseguido ao setransformar uma célula vegetal de interesse com umaconstrução de DNA compreendendo um promotor aquiidentificado, operacionalmente ligado a uma seqüênciaheteróioga de nucleotideos, e regenerando uma plantaestavelmente transformada a partir da referida célulavegetal. Os métodos dos avanços também são direcionadospara expressar de forma induzida uma seqüência denucleotideos em uma planta. Estes métodos compreendemtransformar uma célula vegetal com uma construção de DNAcompreendendo um promotor aqui identificado que inicia atranscrição em uma célula vegetal de maneira induzida,operacionalmente ligado a uma seqüência heteróioga denucleotideos, e regenerando uma planta transformada a partirda referida célula vegetal, e suj eitando a planta aoestimulo requerido para induzir a expressão.
A construção de DNA, compreendendo a seqüênciapromotora particular dos avanços, operacionalmente ligada auma seqüência de nucleotideos de interesse pode ser usadapara transformar qualquer planta. Neste sentido, podem serobtidas, por exemplo, células vegetais, plantas, tecidovegetal, semente, raiz e similares, geneticamentemodificados, isto é, transgênicos ou transformados.
Espécies vegetais adequadas para os avanços incluem,mas não estão limitadas a, (Zea mays) , Brassica sp. (e . g.,B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelasespécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente,alfafa (Medicago sativa) , arroz {Oryza sativa) , centeio(Secale cereale) , sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) ,milhete (e.g., milheto (Pennisetum glaucum), painço (Panicummiliaceum), painço português (Setaria itálica), capim(Eleusine coracana)), aveias (Avena spp.) , girassol{Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo{Triticum aestivum) , cevada (Hordeum spp.), soja (Glycinemax) , tabaco (Nicotiana tabacum) , batata (Solanum tuberosum) ,amendoins {Arachis hypogaea) , algodão (Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus) f mandioca(Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco {Cocos nucifera) ,abacaxi {Ananas comosus), árvores citricas (Citrus spp-),cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musaspp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba(Psidium guajava) , manga {Mangifera indica), oliveira (Oleaeuropaea), mamão-papaia {Carica papaya) , caju [Anacardiumoccidentale), macadâmia {Macadamia integrifolia) , amêndoa{Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris) , cana-de-açúcar(Saccharum spp.), cebola {Allium spp.), tâmaras (Phoenixspp.), verduras, plantas ornamentais, e coniferas.
Verduras incluem tomates {Lycopersicon esculentum),alface (e.g., Lactuca sativa), feijões (Phaseolus vulgaris ePhaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros dogênero Cucumis, tais como pepino (C. sativus) , cantaiupo (C.cantalupensis), e melão (C. melo). Ornamentais incluemazaléia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophyllahydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosaspp.)f tulipas {Tulipa spp.)/ narcisos {Narcissus spp.),petúnias (Petunia hybrida) , cravo {Dianthus caryophyllus) ,bico-de-papagaio (Euphorbia pulcherrima), e crisântemo.
Coniferas que podem ser empregadas na prática dos avançosincluem, por exemplo, pinheiros tais como pinheiro loblolly(Pinus taeda), pinheiro slash (Pínus elliotii) , pinheiroponderosa (Pinus ponderosa) , pinheiro' lodgepole (Pinuscontorta), e pinheiro de Monterey (Pinus radiata) ; Pseudotsuga(Pseudotsuga menziesii); cicuta do oeste (Tsuga canadensis);espruce Sitka (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens);abetos verdadeiros, tais como abeto prateado (Abies amabilis)e balsamo (Abies balsamea); e cedros, tais como cedro vermelho(Thuja plicata) e cedro-amarelo do Alasca (Chamaecyparisnootkatensis) .
Como aqui usado, "vetor" refere-se a uma molécula de DNA,tal como um plasmideo, cosmideo, ou fago de bactéria, paraintroduzir uma construção de nucleotideo, por exemplo, umcassete de expressão, em uma célula hospedeira. Vetores declonagem contêm, tipicamente, um ou um pequeno número desitios de reconhecimento de endonucleases de restrição, nosquais seqüências de DNA estrangeiras podem ser inseridas demaneira determinável, sem perda de função biológica essencialdo vetor, assim como um gene marcador que é adequado para usona identificação e seleção de células transformadas com ovetor de clonagem. Genes marcadores incluem, tipicamente,genes que conferem resistência à tetraciclina, resistência ahigromicina, ou resistência a ampicilina.Os métodos dos avanços envolvem introduzir uma construçãode nucleotideos em uma planta. Como aqui usado, "introduzir"deve significar apresentar à planta a construção denucleotideo de tal forma que a construção ganhe acesso aointerior de uma célula da planta. Os métodos dos avanços nãodependem de um método em particular para introduzir umaconstrução de nucleotideo a uma planta, apenas que aconstrução de nucleotideo ganhe acesso ao interior de pelomenos uma célula da planta. Métodos para introduzirconstruções de nucleotideo em plantas são conhecidos na arte,incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformaçãoestável, métodos de transformação transiente, e métodosmediados por virus.
Uma transformação estável é aquela cu j a construção denucleotideos introduzida em uma planta se integra no genomada planta e é capaz de ser herdada pela progênie desta."Transformação transiente" significa que uma construção denucleotideo introduzida em uma planta não se integra nogenoma da planta.
As construções de nucleotideos dos avanços podem serintroduzidas em plantas ao colocar plantas em contato com umvirus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodosenvolvem incorporar uma construção de nucleotideo dosavanços em uma molécula de DNA ou RNA viral. Métodos paraintroduzir construções de nucleotideo em plantas e expressaruma proteina nestas codificada, envolvendo moléculas de DNAou RNA virais, são conhecidos na arte. Ver, por exemplo,U.S. Patent Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785,5.589.367, e 5.316.931; aqui incorporadas como referência.
Protocolos de transformação, assim como protocolos paraintroduzir seqüências de nucleotideos em plantas podemvariar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, porexemplo, monocotiledônea ou dicotiledônea, visada paratransformação. ' Métodos adequados de introdução deseqüências nucleotidicas em células vegetais e a subseqüenteinserção destas no genoma de uma planta incluem microinjeção(Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334),eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium(U.S. Patent Nos. 5.981.840 e 5.563.055), transferência degene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J.3:2717-2722), e aceleração balística de partícula (ver, porexemplo, U.S. Patent Nos. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244;5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant CelI, Tissue, andOrgan Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips(Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988)Biotechnology 5:923-926). Ver também Weissinger et al.(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987)Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola);Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja);McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finerand McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182(soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324(soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz);Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309(milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563(milho); U.S. Patent Nos. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646;
Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Frommet al. (1990) Biotechnology 0:833-839 (milho); Hooykaas-VanSlogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S.Patent No. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al.(1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen);Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566(transformação mediada por fios de carboneto de silicio);D-Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505(eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413(arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens) ; todas as quaissão aqui incorporadas por referência.
As células que foram transformadas podem ser crescidasde acordo com maneiras convencionais. Ver, por exemplo,McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essasplantas podem ser' então, crescidas, e polinizadas com amesma linhagem transformada ou com diferentes linhagens, e ohíbrido resultante tendo expressão induzida dacaracterística fenotipica identificada desejada. Duas oumais gerações podem ser crescidas para assegurar que aexpressão induzida da característica fenotipica desejadaseja estavelmente mantida e herdada e, então, sementescolhidas para garantir que a expressão induzida dacaracterística fenotipica desejada foi atingida. Assim,como aqui usado, "sementes transformadas" refere-se asementes que contêm a construção de nucleotideo estavelmenteintegrada no genoma da planta.
Há uma variedade de métodos para a regeneração deplantas a partir de tecido vegetal. 0 método de regeneraçãoem particular dependerá do tecido vegetal inicial e aespécie vegetal em particular a ser regenerada. Aregeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partirde transformantes oriundos de um único protoplasto ou devários explantes transformados são bem conhecidos na técnica(Weissbach and Weissbach, (1988) In.: Methods for PlantMolecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego,CA). Esse processo de regeneração e crescimento inclui,tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas,o cultivo destas células individualizadas através deestágios usuais de desenvolvimento embrionário passando peloestágio de plântula com raiz. Embriões e sementes
transgênicas são similarmente regenerados. Os brotos
transgênicos enraizados resultantes são, por conseguinte,plantados e em um meio apropriado para crescimento vegetal,tal como solo. Preferencialmente, as plantas regeneradassão autopolinizadas para prover plantas transgênicashomozigotas. Por outro lado, o pólen obtido de plantasregeneradas é utilizado para cruzar com plantas oriundas desementes de linhagens de importância agronômica.Reciprocamente, pólen de plantas dessas linhagensimportantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Umaplanta transgênica dos avanços contendo um polipeptideodesejado é cultivada usando métodos bem conhecidos dequalquer especialista na arte.
Os avanços fornecem composições para rastrear compostosque modulam a expressão em plantas. Os vetores, células, eplantas podem ser usados para rastrear moléculas candidatasantagonistas e a favor do promotor de DGP. Por exemplo, umgene repórter pode ser operacionalmente ligado ao promotorde DGP e expresso como um transgene em uma planta.Compostos a serem testados são adicionados e a expressão dogene repórter é medida para determinar o efeito na atividadepromotora.
Os exemplos a seguir são apresentados como forma deilustração e não como uma forma de limitação.
EXPERIMENTAL
Os avanços são ainda definidos nos Exemplos a seguir,nos quais partes e porcentagens são expressas por peso, e atemperatura em graus Celsius, a menos que dito ao contrário.Técnicas em biologia molecular foram tipicamente realizadascomo descrito em Ausubel ou Sambrook, supra. Deveria serentendido que esses Exemplos, enquanto indicando avanços dainvenção, são dados por meio de ilustração apenas. A partirda discussão acima e desses Exemplos, um especialista naarte pode averiguar as características essenciais dosavanços e, sem deixar o espirito e escopo desses, pode fazervárias mudanças e modificações para adaptar-se a vários usose condições. Assim, várias modificações dos avanços, alémdaquelas aqui mostradas e descritas, serão aparentes àquelesespecialistas na arte a partir da precedente descrição.Pretende-se, também, que tais modificações caiam no escopodas reivindicações em anexo.
A descrição de cada referência aqui relatada é aquiincorporada por referência em sua integridade.
Exemplo 1: Identificação do gene DGP
O gene da proteína dirigente (DGP) foi identificadocomo um gene raiz-preferencial usando uma combinação datecnologia Agilent de microarray com a tecnologia LynxMassively Parallel Signature Sequencing (MPSS) (ver BrennerS, et al. (2000) Nature Biotechnology 18:630-634, Brenner Set al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97:1665-1670).
Análise por microarray Agilent
Os experimentos de microarray Agilent foram realizados
de acordo com os protocolos Agilent usando chips de genes de60-meros de soja.
A linhagem Pioneer YB17E e as sementes Bell foramplantadas em uma casa de vegetação (crescidas a 26°C, com umfoto-período de 16h luz/8h escuro), e as raízes dasplântulas com 10 dias, provenientes de sementes, foraminoculadas com 10000 ovos da raça 3 do Nematódeo do cisto dasoja (SCN) por 3 plantas. Tecidos foram coletados 10 dias após a inoculação (ver tabela 1) . Os tecidos foram limposusando água de torneira e foram imediatamente congelados emnitrogênio líquido, e estocados a -80°C. O RNA total foiisolado para as análises por microarray.
Tabela 1. Tecidos para as análises por Microarray Agilent
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Os dados do microarray Agilent permitiram a seleção degenes candidatos que mostraram expressão raiz preferencial epareceram ser induzidos pela infecção por SCN. Comomostrado na tabela 2, os dados de microarray indicaram queos níveis de expressão do gene DGP em raízes foram 32 vezese 15 vezes maiores do que em tecidos de folha e raiz emYB17E e Bell, respectivamente. Estes resultados indicaramclaramente o padrão de expressão preferencial em raiz. Aose comparar tecidos infectados com SCN com tecidos nãoinfectados, ficou claro que o SCN induziu a expressão em 30%nas raízes de YB17E e Bell. Em tecidos foliares, aexpressão de DGP foi induzida em YB17E, mas reprimida emBell.
Tabela 2. Análise da expressão do gene DGP por Microarray
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Análise Lynx MPSS
A tecnologia MPSS envolve a geração de marcas deassinatura de 17 bases a partir de amostras de mRNA queforam transcritas reversamente. As marcas sãosimultaneamente seqüenciadas e designadas a genes ou ESTs.A abundância dessas marcas recebe um valor numérico que énormalizado a partes por milhão (PPM) que, então, permite aexpressão de marca, ou abundância da marca, ser comparada emdiferentes tecidos. Assim, a plataforma MPSS pode ser usadapara determinar o padrão de expressão de um gene emparticular e seu nivel de expressão em diferentes tecidos.
A soja do genótipo Pioneer 93B82 foi usada para osexperimentos Lynx MPSS. Sementes da linhagem 93B82 daPioneer foram plantadas em vasos com terra em uma casa devegetação e crescidas a 26°C, com foto-pérlodo de 16h luz/8hescuro. Um total de 10 amostras foi coletado (ver tabela3) . Raiz principal, folha trifoliada, e caule que foramcoletados dos estágios V3 e V5 foram escolhidos pararepresentar estágios vegetativos do desenvolvimento. O pesofresco igual, do mesmo tipo de tecido, de dois estágiosescolhidos foram combinados e triturados em nitrogêniolíquido imediatamente após coletados e estocados a -80°C. Omesmo procedimento foi executado para tecidos coletadosdurante estágios reprodutivos. Raiz lateral, folha
trifoliada, caule e pecíolo foram coletados nos estágios RIe R3. O estágio RI captura a importante transição docrescimento vegetativo para o crescimento reprodutivo e o R3é importante porque as vagens estão começando a se formar, oque é particularmente significativo para pesquisa derendimento. Uma vez que R2 apresenta florescimento
completo, as flores foram coletadas neste estágio. Asvagens foram coletadas no estágio R3 que é quando se iniciao desenvolvimento de vagem. Amostras de semente foramcoletadas nos principais estágios de desenvolvimento desementes, R4 e R5.
Tabela 3: Descrição de amostras Lynx MPSS<table>table see original document page 68</column></row><table>
O experimento Linx foi executado como descrito porBrenner S, et al. (2000) Nature Biotechnology 18:630-634.
Como apresentado na tabela 4, o gene DGP de soja éexpresso apenas em raízes principal e lateral.Tabela 4. Padrão de Expressão do gene DGP segundo a análiseLynx MPSS
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O gene de DGP foi então procurado usando a base dedados proprietária de informação de EST para encontrar adistribuição nos tecidos. A pesquisa de distribuição nostecidos revelou que existe um total de 3 9 clones ESTs nabase de dados de EST de soja que codificam o gene de DGP.Trinta e sete dos 3 9 clones são provenientes de bibliotecasde cDNA de raiz. Estes dados também mostram que DGP tem umpadrão de expressão altamente preferencial de raiz. Oligosiniciadores foram desenhados para isolar o promotor de DGP.
Exemplo 2: Isolamento do Promotor do gene de DGPPlantas de soja (cultivar Jack) foram crescidas em casade vegetação a 26°C, com foto-periodo de 16h luz/8h escuro.Tecidos foliares da cultivar Jack foram usadas paraisolamento do gene e do promotor. Os tecidos foliares foramtriturados em nitrogênio líquido e o RNA total foi isoladopelo método Tri-pure (Boehringer) . O DNA genômico foi entãoisolado usando o kit DNeasy Plant mini (Qiagen) de acordocom as instruções do fabricante.
Regiões promotoras do gene DGP de soja foram isoladas apartir do DNA genômico de soja usando o kit Universal GenomeWalker (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante.Os DNAs genômicos digeridos com enzimas de restrição foramligados"com um adaptador para construir grupos de fragmentosde DNA para 'andar' no genoma por PCR usando um oligoespecífico para DGP (SEQ ID NO: 7) e um oligo adaptador(Clontech) . A PCR foi realizada em um volume total de 50 piLde: 10 mM Tris-HCL, pH 8.3; 1.5 mM MgCl2; 50 mM KC1; 0.1 mMdNTPs; e 0.2 5 piM de cada oligo, como apropriado, e 0,5unidades do mix Advantage Genomic PCR polymerase (Clontech)sob as condições descritas nas instruções da Clontech.
Análise dos produtos amplificados por PCR:
Os fragmentos amplificados por PCR com o tamanhoesperado foram extraídos individualmente do gel para umasegunda etapa de re-amplificação por PCR com as mesmascondições usadas na PCR inicial. Para a segunda etapa dePCR, um oligo adaptador aninhado (Clontech) e um segundooligo iniciador DGP-específico (SEQ ID NO 8) foram usados.Cada produto de segunda etapa de PCR apresentando uma únicabanda com o tamanho esperado foi clonado em um vetor TA(Invitrogen) de acordo com as instruções dos fornecedores.Clones positivos identificados foram selecionados paraseqüenciamento de DNA usando um seqüenciador automáticoApplied Biosystetns 373A (ABI) . A análise da seqüência deDNA foi realizada com Sequencer (3.0).
O promotor inteiro de DGP tem 1108 nucleotídeos decomprimento (SEQ ID NO 1) . Este contém um típico TATA Boxmostrado em negrito, maiúsculo na Figura 1 (posição 1025 a103 0) de SEQ ID NO: 1) , Um W-box responsivo à patógeno emnegrito, sublinhado na Figura 1 (posição 763-768 de SEQ IDNO: 1) e cinco elementos ATATT mostrados em negrito naFigura 1 (posições 4-8; 21-25; 210-214; 294-298; e 317-321de SEQ ID NO: 1) . O W-box é um elemento responsivo àpatógeno (Rushton PJ and Somssich IE. (1998) Current Opinionin Plant Biology 1: 311-315), e o elemento ATATT foianteriormente identificado como estando presente em outrospromotores com expressão específica em raiz (Elmayan &Tepfer M. (1995) Transgenic Res 4:388-396).
Exemplo 3: Atividade do Promotor de DGP Promoter e dosfragmentos deste
Para demonstrar que a seqüência de DNA isolada como opromotor de DGP funciona como um promotor, ensaios com sojatransgênica foram realizados. Estes ensaios forneceram umarápida avaliação se a seqüência de DNA testada é capaz dedirigir a expressão gênica.O promotor completo de 1108 pb (SEQ ID NO: 1) foiamplificado por PCR a partir de DNA genômico e clonado em umvetor de expressão na frente do gene que codifica a B-glucuronidase (GUS) para testar se o promotor poderiaconduzir a expressão do GUS. Três fragmentos do promotorcompleto de DGP (SEQ ID NO: 1) também foram preparados parateste com planta transgênica de modo a determinar o tamanhomínimo requerido do promotor para conduzir a transcrição em uma célula vegetal. O primeiro fragmento testado (SEQ IDNO: 2) apresentava 813 nucleotídeos de comprimento. Osegundo fragmento testado (SEQ ID NO:3) apresentava 518nucleotídeos de comprimento. O terceiro fragmento testado(SEQ ID NO: 4) apresentava 341 nucleotídeos de comprimento.
Estas três deleções também foram clonadas em vetores deexpressão na frente do gene GUS. Plantas transgênicas foramcriadas de acordo com os protocolos definidos no Exemplo 4.
As plantas transgênicas de soja foram testadas paraexpressão de GUS. Plantas TO ou TI foram imersas em tampãode ensaio GUS contendo 100 mM NaH2P04-H20 (pH 7.0), 10 mMEDTA, 0,5 mM K4Fe (CN) 6-3H20, 0,1% Triton X-100 e 2 mM 5-bromo-4-cloro-3-indol glucoronídeo. As plantas foramincubadas no escuro por 24 horas a 37°C. Substituir asolução de coloração GUS com etanol 10 0% bloqueou o ensaio ea clorofila foi removida com extração por etanol a 100% (3 x2 horas) à temperatura ambiente, e o material guardado emetanol 70%. A atividade de GUS foi visualizada efotografias foram feitas usando uma câmera digital.Análise do promotor completo (SE ID NO: 1)
Um total de 32 eventos TO PCR positivos foiidentificado, e três plantas por evento contendo aconstrução com o promotor DGP inteiro foram coradas com asolução GUS para análise histoquímica. Dois eventoscontrole (eventos PCR negativos) também foram testados. Dos32 eventos TO, 20 eventos foram positivos para coloração comGUS. Mais de 60% dos eventos positivos mostraram atividademuito alta em raízes, quando comparados com folhas. Aatividade do promotor completo em folhas é principalmentenas nervuras da folha, e há muito pouca atividade noscaules.
Doze dos 20 eventos GUS positivos foram avançados paraa geração TI e o padrão de expressão de GUS foi avaliado.Todos os 12 eventos apresentaram um padrão de expressãopreferencial em raiz. A atividade de GUS em raízes é emtorno de 3 0 vezes mais alta do que em folhas ou caules.
Este dado é consistente com o padrão de expressãoesperado do promotor DGP e confirma seu padrão de expressãopreferencial em raiz. Os eventos controle não apresentaramqualquer marcação GUS.
Análise de Fragmento do Promotor
Três fragmentos do promotor completo de DGP forampreparados para testes em plantas transgênicas de modo adeterminar o comprimento mínimo requerido do promotor paraconduzir a transcrição em uma célula vegetal. O primeirofragmento testado (SEQ ID No: 2) tinha 813 nucleotídeos decomprimento, compreendendo as posições 295-1108 de SEQ IDNO: 1. O segundo fragmento testado (SEQ ID NO: 3) tinha 518nucleotídeos de comprimento, compreendendo as posições 591-1108 de SEQ ID NO: 1. O terceiro fragmento testado (SEQ IDNO: 4) tinha 341 nucleotídeos, compreendendo as posições768-1108 de SEQ ID NO: 1.
Um total de 12 eventos TO PCR positivos transformadoscom o primeiro fragmento (SEQ ID NO: 2) foram identificados,e três plantas por evento foram coradas com a solução GUSpara análise histoquímica. Dois eventos controle (eventosPCR negativos) também foram testados. Sete dos 12 eventosforam GUS positivos. Todos os eventos GUS positivosapresentaram atividade muito elevada nas raízes quandocomparados com as folhas. A atividade nas raízes foi deaproximadamente 3 0 vezes mais alta do que em folhas. Aatividade em folha ocorreu essencialmente nas nervuras dafolha, como observado no caso do promotor completo, e houvemuito pouca atividade em caules. A atividade do fragmentode 813 PB foi muito similar a do promotor completo, emtermos de preferência por tecido e força. Os eventoscontrole não apresentaram qualquer marcação GUS.
Um total de 12 eventos TO PCR positivos transformadoscom o segundo fragmento (SEQ ID NO: 3) foram identificados,e três plantas por evento foram coradas com a solução GUSpara análise histoquímica. Seis dos 12 eventos foram GUSpositivos. Todos os eventos GUS positivos mostraramatividade fortemente raiz-preferencial. Não houve nenhumamarcação por GUS nos caules ou folhas destas plantas. Aatividade do fragmento de 518 pb foi mais específica pararaiz do que a do promotor completo, em termos de preferênciapor tecido, mas a força de marcação foi menor, indicando ummenor nível de atividade. Os eventos controle nãoapresentaram qualquer marcação GUS.
Um total de 12 eventos TO PCR positivos transformadoscom o terceiro fragmento (SEQ ID NO: 4) foram identificados,e três plantas por evento foram coradas com a solução GUSpara análise histoquímica. Apenas um entre os 12 eventosfoi GUS-positivo, e tal evento apresentou atividade GUSmuito fraca em folha e caule. Nenhum dos eventos apresentou qualquer marcação em raiz. A atividade do fragmento de 341pb foi muito similar a dos controles, que não apresentaramqualquer marcação.
O segundo fragmento de deleção apresentou maioratividade raiz específica, mas a força foisignificativamente reduzida quando comparada com a dopromotor inteiro. Este resultado indica que o fragmento deDNA das posições 295 a 591 de SEQ ID NO: 1 tem um impacto naforça de expressão de DGP nos tecidos. Este pode conter umelemento (ou mais) atuando em eis para atividadeconstitutiva. Então o terceiro fragmento de deleção (SEQ IDNO: 4) mostrou muito pouca atividade nas plantas. Esteresultado indica que o fragmento de DNA das posições 591 a768 de SEQ ID NO: 1 contém elemento (s) atuando em eis paraatividade específica em raiz.Exemplo 4: Preparação de Plantas transgenicas de Soja
As plantas transgenicas de soja do Exemplo 3 foramproduzidas de acordo com protocolos a seguir.
Culturas de soja embriogênica em suspensão foramtransformadas com vetores contendo o promotor completo deDGP e os 3 fragmentos diferentes através um dispositivo debombardeamento de partícula. A seguir, as soluções estoquee meios utilizados para transformação e regeneração deplantas de soja:
Soluções estoque
Sulfato 100 X Estoque: 37.0 g MgS04.7H20, 1.69 g MnS04.H20,0.86 g ZnS04.7H20, 0.0025 g CuS04. 5H20
Halide 100 X Estoque: 30.0 g CaCl2.2H20, 0.083 g Kl, 0.0025 gCoCl2. 6H20
P, B, Mo 100X Estoque: 18.5 g KH2P04, 0.62 g H3B03, 0.025 gNa2Mo04. 2H20
Fe EDTA 100X Estoque: 3.724 g Na2EDTA, 2.784 g FeS04. 7H202,4-D Estoque: 10 mg/mL
Vitamina B5 1000X Estoque: 10.0 g mio-inositol, 0.10 g ácidonicotínico, 0.10 g piridoxina HC1, 1 g tiamina.
Meios (por Litro)SB196: 10 mL de cada uma das soluções estoque acima, 1 mL deVitamina B5 estoque, 0.463 g (NH4)2 S04, 2.83 g KN03, 1 mL2,4-D estoque, 1 g asparagina, 10 g sacarose, pH 5.7.SB103: 1 pacote da mistura de sais Murashige & Skoog, 1 mLVitamina B5 estoque, 750 mg MgCl2 hexahidrato, 60 g maltose,2 g gelrite, pH 5.7.SB166: SB103 suplementado com 5 g de carvão ativado porlitro.SB71-4: Saia B5 de Gamborg (Gibco-BRL No. de catálogo 21153-028) , 1 mL vitamina B5 estoque, 3 0 g sacarose, 5 g agar TC,pH 5.7.
Culturas de soja embriogênica em suspensão (de Jack)foram mantidas em 35 mL de meio líquido (SB196) em umagitador rotacional (150 rpm) à 28 °C com luz fluorescentefornecendo um fotoperíodo de 16h de luz por 8 horas deescuro. As culturas foram subcultivadas a cada duas semanaso inocular 35 mg de tecido em 35 mL de meio líquido fresco.
Culturas de soja embriogênica em suspensão foramtransformadas através de dispositivo de bombardeamento departícula (ver Klein et al. (1987) Nature 327:70-73) usandoum instrumento DuPont Biolistic PDSIOOO/He.
O plasmídeo de DNA recombinante usado para expressarDGP: :GUS (e os plasmídeos expressando GUS com os fragmentosdo promotor de DGP) estava em um plasmídeo de DNArecombinante separado do gene marcador de seleção. Ambos osplasmídeos recombinantes de DNA foram precipitados em partículas de ouro como a seguir. Os DNAs em suspensãoforam adicionados a 50 /xL de uma suspensão de partícula de0,6 /xm de ouro de 20-60 mg/mL e então combinados com 50 fj.Lde CaCl2 (2.5 M) e 20 jzL espermidina (0.1 M) . A misturarecebeu um pulso no vortex por 5 vezes, rapidamentecentrifugada em uma microcentrífuga por 10 segundos, e osobrenadante foi removido. As partículas cobertas com DNAforam então lavadas uma vez com 150 fih de etanol 100%,receberam mais um pulso no vortex è foram novamentecentrifugadas, e foram ressuspensas em 85 /xL de etanolanidro. Cinco /zL de cada suspensão de partícula de ourocoberta com DNA foram então depositadas em cada discomicrocarreador.
Aproximadamente 150 a 250 mg de culturas em suspensãocom duas semanas de idade foram colocadas em uma placa depetri de 60 mm x 15 mm vazia e o líquido residual é removidodo tecido usando uma pipeta. O tecido foi colocado cerca de3,5 polegadas distante de uma tela de retenção e cada placade tecido foi bombardeada uma vez. A pressão de ruptura damembrana foi ajustada em 650 psi e a câmara foi submetida aum vácuo de -28 polegadas de Hg. Dezoito placas forambombardeadas, e, após o bombardeamento, o tecido de cadaplaca foi dividido em dois frascos, e cultivado comodescrito acima.
Sete dias após o bombardeamento, o meio líquido foitrocado por meio fresco SB196 suplementado com 50 mg/mL dehigromicina ou 100 ng/mL de clorsulfuron, dependendo do genemarcador de seleção usado na transformação. O meio seletivofoi renovado semanalmente ou a cada duas semanas. Setesemanas após o bombardeamento, tecido transformado, verde,foi observado crescendo a partir de agrupamentosembriogênicos necróticos não transformados. Tecidos verdesisolados foram removidos e inoculados em frascos individuaispara gerar novas, culturas embriogênicas em suspensãotransformadas, propagadas de maneira clonal.
Conseqüentemente, cada nova linhagem foi tratada como umevento independente de transformação. Estas suspensõesforam então mantidas como suspensões de embriões agrupadosem estágio imaturo de desenvolvimento através de subculturaou foram regeneradas em plantas inteiras por maturação egerminação de embriões somáticos individuais.
Os agrupamentos embriogênicos transformados foramremovidos da cultura liquida e colocados em meio sólido comagar (SB166) sem hormônios ou antibióticos por uma semana.Os embriões foram cultivados a 26 °C em um programa defotoperiodo de 16 horas de luz por 8 horas de escurocomposto com lâmpadas fluorescentes e incandescentes. Apósuma semana, as culturas foram então transferidas para meioSB103 e mantidas nas mesmas condições de crescimento durantetrês semanas adicionais. Antes de transferir da culturalíquida para o meio sólido, tecidos das linhagensselecionadas foram testados por PCR para a presença do genequimérico. Embriões somáticos tornaram-se úteis para
germinação após 4 semanas e foram então removidos do meio dematuração e secos em placas de petri por 1 a 5 dias. Osembriões secos foram então plantados em meio SB71-4 edeixados germinar sob as mesmas condições de luz egerminação descritas acima. Os embriões germinados foramtransferidos para solo estéril e crescidos até a maturidade.
Todas as publicações e pedidos de patentes mencionadosno relatório descritivo são indicativos do nível dosespecialistas aos quais esta invenção pertence. Todas aspublicações e pedidos de patentes são aqui incorporados porreferência à mesma medida como se cada publicação ou pedidode patente individual fosse especificamente eindividualmente indicado para ser incorporado porreferência.
Apesar de a presente invenção ser descrita em algumdetalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos declareza de entendimento, será óbvio que certas mudanças ealterações podem ser praticadas no escopo dasreivindicações.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
<120> Título: Molécula de ácido nucléico isolada, construção de
dna, vetor, célula vegetal, planta, métodos para expressar umaseqüência nucleotídica em planta e em célula vegetal, método paraexpressar uma seqüência de nucleotídeos preferencialmente em raizvegetal, método para expressar de maneira induzida uma seqüência denucleotídeos em raiz vegetal
<130> Referência do documento: 2000-PCT
<150> No. do pedido de prioridade: US 60/663.815
<151> Data de depósito do pedido de prioridade: 21.03.2005
<160> Quantidade de SEQ ID Nos,
<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> SEQ ID No 1<211> Comprimento: 1108<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Glycine max
<220> Características: <221> Nome/chave: Sinal TATA
<222> Localização: (1025) ... (1030)
<221> Nome/chave: ,misc_feature'
<222> Localização: 4-8, 21-25, 210-214, 294-298, 317-321 <223> Outras informações: Motivo de promotor de raiz ATATT
<formula>formula see original document page 81</formula>
<221> Nome/chave: <misc_feature'<222> Localização: (763) ... (768)
<223> Outras informações: Elemento W-Box de Resposta a Patógeno
<400> Seqüên
<table>table see original document page 81</column></row><table><210> SEQ ID No.: 2
<211> Comprimento: 813
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Glycine max
<220> Caracteristicas:
<221> Nome/chave: Variação
<222> Localização: (0)...( 0)
<223> Outras informações: Deleção
<400> Seqüência: 2
attataatta ggaataaaaa
attccataat tataagtaat
aataaataat ttatttatta
tttgaaatgg ggaaatgggg
tttcattttt gggtaggtga
atacccaaat cgaaaatgga
ttgactattt gggttacatt
actgcccaca tgcgtatgct
ggctgtttgg aaagtgttat
caactggatt aagcggaaga
tcaattttaa atccaaccta
gcacatgcat atacaataat
caactttctt ataaatagtg
actcactaat tggacaaccc
<210> SEQ ID No.: 3
<211> Comprimento: 518
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Glycine max
<220> Caracteristicas:
<221> Nome/chave: Variação
<222> Localização: (0)...( 0)
<223> Outras informações: Deleção 2
<400> Seqüência: 3
attttatacc caaatcgaaa atggaactca aacctttaag tagcccataa gccaaattag 60atgtgttgac tatttgggtt acattgcccc ttttcaaaga catgtgcttt aacgtttgac 120ctcaaactgc ccacatgcgt atgctgcagt aaataatatc caaaagttga atggtcaata 180attgtggctg tttggaaagt gttatctgtc aagaaaaata ataatagagg atcatctcag 240ccatgcaact ggattaagcg gaagataatc agtaaagcta tatcttggac tcacaattaa 300
ttaattcaat tttaaatcca acctacgcgg acgaacgtct aggaatcact tgttgctgtt 360ttttagcaca tgcatataca ataattaata tgaggttgtt tcaaacatca aagactttca 420aatctcaact ttcttataaa tagtgctcta tcttctcatg gagtagcatc actacctcag 480tatatactca ctaattggac aacccttctc ctacctcc 518
<210> SEQ ID No.: 4
<211> Comprimento: 341
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Glycine max
<220> Caracteristicas:<221> Nome/chave: Variação<222> Localização: (0)...( 0)<223> Outras informações: Deleção 3
aatatttatc tatttttcaagaattaatag agaataagaattatttttaa tatgtgtaaagagtatatgt tagatttgtagtccatttga aaataaaattactcaaacct ttaagtagccgccccttttc aaagacatgtgcagtaaata atatccaaaactgtcaagaa aaataataattaatcagtaa agctatatctcgcggacgaa cgtctaggaataatatgagg ttgtttcaaactctatcttc tcatggagtattctcctacc tcc
ccatcattaa tcattccgta 60tgttttaata aaattatttc 120aaatcttaaa tatcaatcat 180atcaattgtt aaattacaac 240atacttttaa ttatgatttt 300cataagccaa attagatgtg 360gctttaacgt ttgacctcaa 420gttgaatggt caataattgt 480agaggatcat ctcagccatg 540tggactcaca attaattaat 600tcacttgttg ctgtttttta 660catcaaagac tttcaaatct 720gcatcactac ctcagtatat 780
813<400> Seqüência: 4
ataattgtgg
cagccatgca
taattaattc
gttttttagc
tcaaatctca
cagtatatac
ctgtttggaa
actggattaa
aattttaaat
acatgcatat
actttcttat
tcactaattg
agtgttatct
gcggaagata
ccaacctacg
acaataatta
aaatagtgct
gacaaccctt
gtcaagaaaa
atcagtaaag
cggacgaacg
atatgaggtt
ctatcttctc
ctcctacctc
ataataatag
ctatatcttg
tctaggaatc
gtttcaaaca
atggagtagc
aggatcatct 60
gactcacaat 120
acttgttgct 180
tcaaagactt 240
atcactacct 300
341
<210> SEQ ID No.: 5
<211> Comprimento: 1209
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Glycine max
<220> Caracteristicas:
<221> Nome/chave: CDS
<222> Localização: (0)...( 0)
<400> Seqüência: 5
cacgaggaca ctcactaatt ggacaaccct tctcctacct cc atg gct aat ttcMet Ala Asn Phe 1 54
ata act ttc ttc att ccc cta gcc cta acc etc ctt ttc tec tec etclie Thr Phe Phe lie Pro Leu Ala Leu Thr Leu Leu Phe Ser Ser Leu5 10 15 20
102
gtc act gcc agt tac cat caa age ate tet cca age ctt cta cgt tetVai Thr Ala Ser Tyr His Gln Ser lie Ser Pro Ser Leu Leu Arg Ser25 30 35
150
cgt gag aag etc acg cac ctt cgc ttc tat ttc cat gaa att ttt actArg Glu Lys Leu Thr His Leu Arg Phe Tyr Phe His Glu lie Phe Thr40 45 50
198
age gac aaa ccc tet aat etc gtg ate gac ccc ccc aag gtg gta gccSer Asp Lys Pro Ser Asn Leu Vai lie Asp Pro Pro Lys Vai Vai Ala55 60 65
246
gac tet ccc ctt cca ttt ggg tec caa gtg gtg ate gag gac cca ttaAsp Ser Pro Leu Pro Phe Gly Ser Gln Vai Vai lie Glu Asp Pro Leu70 75 80
294
aca att ggg cet gat gtc gag tec aaa cag ata ggt aag gcc caa gggThr lie Gly Pro Asp Vai Glu Ser Lys Gln lie Gly Lys Ala Gln Gly85 90 95 100
342
ttt tac cta tec gea acc caa agg ccc ggt ttg gag ttg gag ata gtcPhe Tyr Leu Ser Ala Thr Gln Arg Pro Gly Leu Glu Leu Glu lie Vai105 110 115
390
atg ggg atg gcc ttg acc ttc tta gaa ggc gaa ttt aac ggt age agtMet Gly Met Ala Leu Thr Phe Leu Glu Gly Glu Phe Asn Gly Ser Ser120 125 130
438
tta agt gtg ttg ggg aga aac aaa ate ttc aat gag gtg agg gag ttgLeu Ser Vai Leu Gly Arg Asn Lys lie Phe Asn Glu Vai Arg Glu Leu135 140 145
486
cet att att ggt ggc acg ggt gag ttt cgc ttc gea cgt ggc tat atePro lie lie Gly Gly Thr Gly Glu Phe Arg Phe Ala Arg Gly Tyr lie150 155 160
534cta gct agg agt gtc aag gtc gat tac cat aaa ggg gat gct acc gtg 582
Leu Ala Arg Ser Vai Lys Vai Asp Tyr His Lys Gly Asp Ala Thr Vai
165 170 175 180
gaa tac aac gct tat gtg tat cat tat tct tcc act age tet tcg tet 630
Glu Tyr Asn Ala Tyr Vai Tyr His Tyr Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser
185 190 195
cac gag att ttt aac gat gga gtt cag ttc atg aca gac cet att ctt 678
JO His Glu lie Phe Asn Asp Gly Vai Gln Phe Met Thr Asp Pro lie Leu
200 205 210
age aag att tag atttttaact aatttatgtg ttggaggaag tttataaaaa 730Ser Lys lie *215
actttaggaa atttgtatct aaactaactc gatacaattt tctaagtttt actcacataa 7 90
ataagttcgg aaattagact gcggaaggtg ggggaataaa tccaaatacc aagttgctaa 850
tttactcctt tgaaaactat gcctcggttc agtactataa ataaatttgt tgtcttgtcg 910
tacacaaaat gtaagtcttt gttgtagtgc aagttgcgtg agctaaataa cgtgccagtc 970
ttaaaaattt aagtctttgt tgtagtacaa gttgcgtgag ctgaataatg tgccgcacct 1030
ttttttttgt tggagattta gaccgttgat tattatgtgt attctgcaat tgaatagata 1090
tagagaaaga gacccggggg ttgaaaactt gatatecatg acaatcatgt aatatatata 1150
tatatacaca cgaaaaataa tactacctcc tcgtttcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1209
<210> SEQ ID No.: 6
<211> Comprimento: 215
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 6Met Ala Asn Phe lie Thr Phe Phe lie Pro Leu Ala Leu Thr Leu Leu
15 10 15
Phe Ser Ser Leu Vai Thr Ala Ser Tyr His Gln Ser lie Ser Pro Ser35 20 25 30
Leu Leu Arg Ser Arg Glu Lys Leu Thr His Leu Arg Phe Tyr Phe His
35 40 45
Glu lie Phe Thr Ser Asp Lys Pro Ser Asn Leu Vai lie Asp Pro Pro
50 55 60
Lys Vai Vai Ala Asp Ser Pro Leu Pro Phe Gly Ser Gln Vai Vai lie65 70 75 80
Glu Asp Pro Leu Thr lie Gly Pro Asp Vai Glu Ser Lys Gln lie Gly85 90 95
Lys Ala Gln Gly Phe Tyr Leu Ser Ala Thr Gln Arg Pro Gly Leu Glu
100 105 110
Leu Glu lie Vai Met Gly Met Ala Leu Thr Phe Leu Glu Gly Glu Phe
115 120 125
Asn Gly Ser Ser Leu Ser Vai Leu Gly Arg Asn Lys lie Phe Asn Glu50 130 135 140
Vai Arg Glu Leu Pro lie lie Gly Gly Thr Gly Glu Phe Arg Phe Ala145 150 155 160
Arg Gly Tyr lie Leu Ala Arg Ser Vai Lys Vai Asp Tyr His Lys Gly165 170 175
Asp Ala Thr Vai Glu Tyr Asn Ala Tyr Vai Tyr His Tyr Ser Ser Thr
180 185 190
Ser Ser Ser Ser His Glu lie Phe Asn Asp Gly Vai Gln Phe Met Thr
195 200 205
Asp Pro lie Leu Ser Lys lie210 215<210> SEQ ID No.: 7<211> Comprimento: 25<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Caracteristicas:
<223> Outras informações: Oligonucleotideo iniciador
<400> Seqüência: 7 gagagatgct ttgatggtaa ctggc 25
<210> SEQ ID No.: 8
<211> Comprimento: 306
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<table>table see original document page 85</column></row><table>
<400> Seqüência: 8Met Ala Lys Ala Leu
1 5 10 15Ser Asn Vai Gln Ser20 25 30
Gln Leu Vai Pro Gln35 40 45
Vai Thr Thr Thr Pro50 55 60
Gly Pro Glu Pro lie65 70 75 80
Ser His Pro Ser Ala85 90 95
Vai Asn Gly lie Pro100 105 110
Asp Asn Ala Vai Pro115 120 125 Asn Pro Asn Thr Ala130 135 140
Asn Thr Vai lie Gln145 150 155 160
Ser Asn Asn Leu Pro165 170 175
Ala Leu Gln Gln Leu180 185 190
Leu Thr Glu Gly His195 200 205
Gly Phe Tyr Leu Ala210 215 220
Leu Thr Vai Leu Leu225 230 235 240
<table>table see original document page 85</column></row><table><210> SEQ ID No.: 9
<211> Comprimento: 25
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Oligonucleotideo iniciador
<400> Seqüência: 9
gccatggagg taggagaagg gttgt
<210> SEQ ID No.: 10
<211> Comprimento: 192
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Thuja plicata
<400> Seqüência: 10
Met Ala Met Lys Ala Ala Lys Phe Leu His Phe Leu Phe lie Trp Leu
1 5 10 15
Leu Vai Cys Thr 20 Vai Leu Leu Lys Ser 25 Ala Asp Cys His Arg 30 Trp Lys
Lys Lys lie 35 Pro Glu Pro Cys Lys 40 Asn Leu Vai Leu Tyr 45 Phe His Asp
lie Leu Tyr Asn Gly Ser Asn Lys His Asn Ala Thr Ser Ala lie Vai
50 55 60
Gly Ala Pro Lys Gly Ala Asn Leu Thr lie Leu Thr Gly Asn Asn His
65 70 75 80
Phe Gly Asp Vai Vai Vai Phe Asp Asp Pro lie Thr Leu Asp Asn Asn
85 90 95
Leu His Ser Thr 100 Pro Vai Gly Arg Ala 105 Gln Gly Phe Tyr Phe 110 Tyr Asp
Met Lys Asn 115 Thr Phe Asn Ser Trp 120 Leu Gly Phe Thr Phe 125 Vai Leu Asn
Ser Thr Asn Tyr Lys Gly Thr lie Thr Phe Asn Gly Ala Asp Pro lie
130 135 140
Leu Thr Lys Tyr Arg Asp lie Ser Vai Vai Gly Gly Thr Gly Asp Phe
145 150 155 160
Leu Met Ala Arg Gly lie Ala Thr lie Ser Thr Asp Ala Tyr Glu Gly
165 170 175
Asp Vai Tyr Phe 180 Arg Leu Arg Vai Asn 185 lie Thr Leu Tyr Glu 190 Cys Tyr

Claims (35)

1. Uma molécula de ácido nucléico isolada,caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotideoselecionada a partir do grupo consistindo de:a) uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4 ou um complementodesta;b) uma seqüência de nucleotideo compreendendo asseqüências promotoras vegetais dos plasmideos depositadoscom o Depósito de Patente No. PTA-6630, ou um complementodesta;c) uma seqüência de nucleotideo compreendendo umfragmento de pelo menos 200 nucleotideos contíguos daseqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4, onde a referidaseqüência inicia a transcrição em uma célula vegetal;d) uma seqüência de nucleotideos compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 85 % de identidade deseqüência com a seqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4; ondea referida seqüência inicia a transcrição na célulavegetal.
2. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de quecontém uma seqüência de nucleotideos como definida nareivindicação 1, operacionalmente ligada a uma seqüênciaheteróloga de nucleotideos de interesse.
3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende aconstrução de DNA como definida na reivindicação 2.
4. Célula vegetal, caracterizada pelo fato de que temincorporada, estavelmente em seu genoma, a construção deDNA como definida na reivindicação 2.
5. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a referida célula vegetal éde uma dicotiledônea.
6. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a referida dicotiledônea éso ja.
7. Planta, caracterizada pelo fato de ter incorporada,em seu genoma, a construção de DNA como definida nareivindicação 2.
8. Planta de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umadicotiledônea.
9. Planta de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja.
10. Semente transgênica da planta como definida nareivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a sementecontém a construção.
11. Planta de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a seqüência nucleotidicaheteróloga de interesse codifica um produto gênico queconfere resistência à: herbicida, sal, frio, seca,patógeno, ou inseto.
12. Planta de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a seqüência heteróloga de.nucleotideo codifica um produto gênico que intensifica aassimilação de nitrogênio na raiz.
13. Método para expressar uma seqüência nucleotidica emuma planta, caracterizado pelo fato de que o referidométodo consiste em introduzir em uma planta uma construçãode DNA, cuja construção de DNA compreende um promotor e umaseqüência heteróloga de nucleotideos de interesseoperacionalmente ligada ao referido promotor, onde oreferido promotor compreende uma seqüência de nucleotideosselecionada do grupo consistindo de:a) uma seqüência de nucleotideos compreendendo aseqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4;b) uma seqüência de nucleotideos compreendendo asseqüências promotoras vegetais dos plasmideos designados noDepósito de Patente No: PTA-6630;c) uma seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 200 nucleotideos contíguos da seqüência definida emSEQ ID NOs: 1-4; onde a referida seqüência inicia atranscrição na referida planta; ed) uma seqüência de nucleotídeos compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 85 % de identidade deseqüência com a seqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4, ondea referida seqüência nucleotidica inicia a transcrição emuma célula vegetal.
14. Método de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida planta é umadicotiledônea.
15. Método de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja.
16. Método de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotidicaheteróloga codifica um produto gênico que confereresistência à: herbicida, sal, frio, seca, nematódeo,patógeno, doença ou inseto.
17. Método de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a seqüência heteróloga denucleotideo codifica um produto gênico que intensifica aassimilação de nitrogênio na raiz.
18. Método de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotidicaheteróloga de interesse é preferencialmente expressa naraiz.
19. Método para expressar uma seqüência de nucleotídeosem uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que oreferido método consiste em introduzir em uma célulavegetal, uma construção de DNA contendo um promotoroperacionalmente ligado a uma seqüência heteróloga denucleotideos de interesse, onde o referido promotorcompreende uma seqüência núcleotidica selecionada do grupoconsistindo de:a) uma seqüência de nucleotideos compreendendo aseqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4;b) uma seqüência de nucleotideos compreendendo asseqüências promotoras vegetais dos plasmideos designados noDepósito de Patente No: PTA-6630;c) uma seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 200 nucleotideos contíguos da seqüência definida emSEQ ID NOs: 1-4; onde a referida seqüência inicia atranscrição na referida planta; ed) uma seqüência de nucleotideos compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 85 % de identidade deseqüência com a seqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4, ondea referida seqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.
20. Método de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal éde uma dicotiledônea.
21. Método de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja.
22. Método de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotidicaheteróloga codifica um produto gênico que confereresistência à: herbicida, sal, frio, seca, nematódeopatógeno, doença ou inseto.
23. Método de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotidicaheteróloga codifica um produto gênico que intensifica aassimilação de nitrogênio na raiz.
24 . Método para expressar uma seqüência de nucleotideospreferencialmente em uma raiz vegetal, caracterizado pelofato de que o referido método consiste em introduzir, emuma célula vegetal, uma construção de DNA, e regenerar umaplanta transformada a partir da referida célula vegetal,onde a referida construção de DNA contendo um promotor euma seqüência heteróloga de nucleotideos operacionalmenteligada ao referido promotor, na qual o referido promotorcompreende uma seqüência nucleotidica selecionada do grupoconsistindo de:a) uma seqüência de nucleotideos compreendendo aseqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4;b) uma seqüência de nucleotideos compreendendo asseqüências promotoras vegetais dos plasmideos designados noDepósito de Patente No: PTA-6630;c) uma seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 200 nucleotideos contíguos da seqüência definida emSEQ ID NOs: 1-4; onde a referida seqüência inicia atranscrição na referida planta;d) uma seqüência de nucleotideos. compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 85 % de identidade deseqüência com a seqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4, ondea referida seqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.e) uma seqüência de nucleotideos compreendendo aseqüência da posição 591 a 768 de SEQ ID NO: 1, onde areferida seqüência de nucleotideos inicia a transcrição emuma célula vegetal.
25. Método de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a expressão da referidaseqüência heteróloga de nucleotideos altera o fenótipo dareferida planta.
26. Método de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a planta é umadicotiledônea.
27. Método de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a dicotiledônea é soja.
28. Método de acordocaracterizado pelo fato denucleotideos codifica umresistência à: herbicida,patógeno, doença ou inseto.com a reivindicação 24,que a seqüência heteróloga deproduto gênico que conferesal, frio, seca, nematódeo,
29. Método de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a seqüência heteróloga denucleotideos codifica um produto gênico que intensifica aassimilação de nitrogênio na raiz.
30. Método para expressar de maneira induzida umaseqüência de nucleotideos em uma raiz vegetal,caracterizado pelo fato de que o referido método consisteem introduzir, em uma célula vegetal, uma construção deDNA, e regenerar uma planta transformada a partir dareferida célula vegetal, onde a referida construção de DNAcontendo um promotor e uma seqüência heteróloga denucleotideos operacionalmente ligada ao referido promotor,na qual o referido promotor compreende uma seqüêncianucleotidica selecionada do grupo consistindo de:a) uma seqüência de nucleotideos compreendendo aseqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4;b) uma seqüência de nucleotideos compreendendo asseqüências promotoras vegetais dos plasmideos designados noDepósito de Patente No: PTA-6630;c) uma seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 200 nucleotideos contíguos da seqüência definida emSEQ ID NOs: 1-4; onde a referida seqüência inicia atranscrição na referida planta; ed) uma' seqüência de nucleotideos compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 85 % de identidade deseqüência com a seqüência definida em SEQ ID NOs: 1-4, ondea referida seqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.
31. Método de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a expressão da referidaseqüência heteróloga de nucleotideos altera o fenótipo dareferida planta.
32. Método de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a planta é umadicotiledônea.
33. Método de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a dicotiledônea é soja.
34. Método de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato . de que a seqüência heteróloga denucleotideos codifica um produto gênico que confereresistência à: herbicida, sal, frio, seca, nematódeo,patógeno, doença ou inseto.
35. Método de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que a seqüência heteróloga denucleotideos codifica um produto gênico que intensifica aassimilação de nitrogênio na raiz.
BRPI0609216-0A 2005-03-21 2006-03-21 molÉcula de Ácido nucleÍco isolada, construÇço de dna vetor, mÉtodos para obtenÇço de planta transformada, para expressar uma sequÊncia nucleotÍdica em uma planta, em uma cÉlula vegetal, e preferencialmente em uma raiz vegetal e mÉtodo para expressar de maneira induzida uma sequÊncia de nucleotÍdeos em uma raiz vegetal BRPI0609216A2 (pt)

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