BRPI0609401A2 - método para tratar ou prevenir inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula bem como composição e combinação - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA TRATAR OU PREVENIR INFLAMAçãO SISTêMICA EM BEBêS ALIMENTADOS COM FóRMULA BEM COMO COMPOSIçãO E COMBINAçãO. A presente invenção refere-se a um novo método para tratar ou prevenir inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula. O método administrando ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR INFLAMAÇÃO SISTÊMICA EM BEBÊS ALIMENTADOS COM FÓRMULA".

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se de modo geral a um método para tratar ou prevenir inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um probiótico e no mínimo um ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa.

Descrição da Técnica Relacionada

A reação inflamatória é uma tentativa por parte do corpo para restaurar e manter a homeostase depois de invasão por um agente infeccioso, ataque de antígenos, ou lesão física, química ou traumática. A inflama-( ção localizada está contida em uma região específica e pode apresentar sintomas variáveis, inclusive vermelhidão, tumefação, calor e dor.

Apesar da reação inflamatória ser geralmente considerada uma reação saudável a lesão, o sistema imune pode apresentar uma reação fisiológica indesejável se não for adequadamente regulado. Nestas situações, o sistema imune normalmente protetor do corpo causa lesão para seu próprio tecido tratando tecido saudável como se estivesse infectado ou anormal de algum modo. Alternativamente, se houver uma lesão, a reação inflamatória pode ser fora de proporção com a ameaça com a qual está lidando. Esta reação inflamatória pode causar mais lesão ao corpo do que o próprio agente teria produzido.

Foi visto que a reação iinflamatória em parte consiste de umaumento da expressão tanto das citocinas pró-inflamatórias quanto antiin-flamatórias. Citocinas são proteínas biologicamente ativas e de baixo peso molecular envolvidas na coordenação de reações imunológicas e inflamató-rias e na comunicação entre populações de células imunes específicas. Uma série de tipos celulares semelhantes produzem citocinas, inclusive neutrófi-los, monócitos, e linfócitos como as principais fontes durante reações infla-matórias devido a seus grandes números no local da lesão.Existem múltiplos mecanismos pelos quais citocinas geradas nos sítios inflamatórios influenciam a resposta inflamatória. No entanto, se uma resposta pró-inflamatória não for neutralizada com sucesso por citocinas antiinflamatórias, pode ocorrer inflamação sistêmica descontrolada.

Em contraste com a inflamação localizada, a inflamação sistêmica é disseminada em todo o corpo. Este tipo de inflamação pode incluir inflamação localizada em sítios específicos, mas também pode estar associada com sintomas gerais "semelhantes à gripe" , inclusive febre, calafrios, fadiga ou perda de energia, cefaléias, perda de apetite, e ancilose muscular.

A inflamação sistêmica pode levar a degradação de proteínas, catabolismo e hipermetabolismo. Em conseqüência, a estrutura e a função de órgãos essenciais, tais como músculos, coração, sistema imune e fígado podem estar comprometidas e podem contribuir para falência múltipla dos órgãos e mortalidade. Jeschke, et ai, Insulin Attenuates the Systemic Inflammatory Response to Thermal Trauma, Mol. Med. 8(8):443-450 (2002). Embora tenha sido obtido enorme progresso no entendimento dos mecanismos da inflamação sistêmica, o índice de mortalidade devido a este distúrbio permanece inaceitavelmente elevado.

Freqüentemente, se a reação das citocinas é pró- ou antiinflamatória depende do equilíbrio de microorganismos individuais que colonizam a luz intestinal em qualquer momento em particular. É de conhecimento geral que a superfície da mucosa do trato intestinal é colonizada por uma coleção de microorganismos enormemente grande, complexa, e dinâmica. A composição da microflora intestinal varia ao longo do trato digestivo bem como em diferentes microhabitats, tais como a camada de muco epitelial, a camada de muco profunda das criptas, e a superfície das células epiteliais da mucosa. A colonização específica depende de fatores externos e internos, inclusive das moléculas disponíveis luminalmente, da qualidade do muco, e de interações hospedeiro-microbianas e microbianas-microbianas. Murch, S.H.,Toll of Allergy Reduced by Probiotics, Lancet, 357:1057-1059 (2001).

Estes microorganismos, os quais compõem a microflora intestinal, estão ativamente envolvidos com a resposta imune. Eles interagemcom o epitélio em condições de relações benéficas mútuas para ambos os parceiros (simbiose) ou em condições de benefício para um parceiro, sem ser prejudicial para o outro (comensalismos). Hooper, et ai, How Host-Microbial Interactions Shape the Nutrient Environment of the Mammalian In-5 testine, Annu. Rev. Nutr. 22:283-307 (2002). De fato, está surgindo considerável evidência a qual mostra uma forte interação ou "cross-talk" entre a mi-croflora intestinal e a população diversa de células na mucosa intestinal. Bourlioux, et ai, The Intestine and its Microflora are Partners for the Protec-tion ofthe Host: Reporton the Danone Symposium "The IntelligentIntestine," 10 realizado em Paris, junho de 14, 2002, Am. J. Clin. Nutr. 78:675 (2003); Hooper, L.V. & Gordon, J.I., Commensal Host-Bacterial Relationships in the Gut, Sei. 292:1115 (2001); Haller, et ai., Non-Pathogenic Bactéria Elicit a Differential Cytokine Response by Intestinal Epithelial Cell/Leucocyte Co-Cultures, GUT 47:79 (2000); Walker, W.A., Role of Nutrients and Bactéria! 15 Colonization in the Development of Intestinal Host Defense, J. Pediatr. Gas-troenterol. Nutr. 30:S2 (2000). Adicionalmente, foi demonstrado que a microflora intestinal provoca respostas imunes específicas tanto em um nível local quanto sistêmico em adultos. Isolauri, E., et ai, Probiotics: Effects on Immu-nity, Am. J. Clin. Nutr. 73:444S-50S (2001). 20 É de conhecimento geral que a microflora intestinal em bebês é

bem menos desenvolvida do que a de um adulto. Enquanto a microflora do adulto humano consiste em mais de 1013 microorganismos e quase 500 espécies, alguns sendo nocivos e alguns sendo benéficos, a microflora de um bebê contém somente uma fração destes microorganismos, tanto em núme-25 ro absoluto como também em diversidade de espécies. Os bebês nascem com um intestino estéril, mas adquirem flora intestinal do canal do parto, seu ambiente inicial, e o que ingerem. Como a população da microflora intestinal é muito instável na vida neonatal inicial, freqüentemente é difícil para o intestino do bebê manter o delicado equilíbrio entre bactérias nocivas e benéfi-30 cas, reduzindo deste modo a capacidade do sistema imune de funcionar normalmente.

É especialmente difícil para bebês alimentados com fórmulamanter este equilíbrio devido às diferenças entre as espécies bacterianas no intestino de um bebê alimentado com fórmula e alimentado com leite materno. As fezes de bebês alimentados com leite materno contêm predominantemente Bifidobacterium, com Streptococcus e Lactobacillus como contribuidores menos comuns. Em contraste, a microflora de bebês alimentados com fórmula é mais diversa, contendo Bifidobacterium e Bacteroides bem como as espécies mais patogênicas, Staphylococcus, Escherichia coli, e Clostridia. As espécies variadas de Bifidobacterium nas fezes de bebês alimentados com leite materno e alimentados com fórmula também diferem. Têm sido propostos uma variedade de fatores como a causa para a diferente flora fecal de bebês alimentados com leite materno e alimentados com fórmula, inclusive o menor teor e diferente composição de proteína no leite humano, um menor teor de fósforo no leite humano, a grande variedade de oligossa-carídeos no leite humano, e numerosos mediadores humorais e celulares da função imunológica no leite materno. Agostoni, et ai, Probiotic Bactéria in Dietetic Products for Infants: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-374 (Apr. 2004).

Como a microflora de bebês alimentados com fórmula é tão instável e a microflora intestinal participa grandemente na estimulação da imunidade intestinal, é mais provável que os bebês alimentados com fórmula desenvolvam doenças inflamatórias. Muitas das principais doenças que afetam os bebês, inclusive doença pulmonar crônica, leucomalacia periventricu-lar, meningite neonatal, hepatite neonatal, septicemia, e enterocolite necroti-zante são de natureza inflamatória. Dependendo da doença em particular, a inflamação acexa pode ocorrer em um órgão específico, tal como o pulmão, o cérebro, o fígado ou o intestino, ou a inflamação pode ser verdadeiramente de natureza sistêmica.

Por exemplo, a doença pulmonar crônica faz com que os tecidos dentro dos pulmões se tornem inflamados ao passo que a meningite neonatal envolve inflamação dos revestimentos do cérebro e da medula espinal. A leucomalacia periventricular é provocada por lesão inflamatória da área peri-ventricular no cérebro em desenvolvimento. A enterocolite necrotizante cau-sa inflamação no intestino que pode resultar em destruição de parte ou todo o intestino e a hepatite neonatal envolve uma inflamação do fígado que ocorre no início da infância. A septicemia, também conhecida como síndrome de reações infiamatórias sistêmicas, é uma grave doença provocada por uma infecção avassaladora da corrente sangüínea por bactérias produtoras de toxina, onde a presença de patógenos na corrente sangüínea provoca uma reação inflamatória através do corpo inteiro.

Os bebês prematuros e criticamente doentes também representam um grave desafio em termos de desenvolvimento da imunidade intestinal e prevenção de inflamação sistêmica. Bebês pré-termo ou crucialmente doentes são freqüentemente colocados imediatamente em incubadoras estéreis, onde permanecem não expostas às populações bacterianas às quais um bebê a termo saudável normalmente estaria exposto. Isto pode retardar ou prejudicar o processo de colonização natural. Estes bebês também são freqüentemente tratados com antibióticos de amplo espectro, os quais matam bactérias comensais que tentam colonizar o trato intestinal infantil. Adicionalmente, estes bebês são freqüentemente nutridos por meio de uma fórmula infantil, ao invés do leite materno. Cada um destes fatores pode fazer com que a microflora intestinal do bebê se desenvolva inadequadamente, deste modo provocando ou precipitando inflamação sistêmica que apresenta risco de vida.

Um modo de estimular a colonização intestinal com microorganismos benéficos em bebês alimentados com fórmula é através da administração de bactérias probióticas. Bactérias probióticas são microorganismos vivos que exercem efeitos benéficos sobre a saúde do hospedeiro. Lactoba-cillus spp. e Bifidobacterium spp., as quais são habitantes normais do intestino saudável, são espécies comuns de probióticos.

Infelizmente, há muito poucos estudos publicados sobre os efeitos clínicos da suplementação de bebês com probióticos. Agostoni, C, et al., Probiotic Bactéria in Dietetic Products for Infants: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-374 (2004). Ainda se sabe menos acerca da capacidade dos probióticos pararegular inflamação intestinal e alterar a propagação da resposta inflamatória a outros órgãos em bebês.

Resultados de estudos referentes aos efeitos de probióticos sobre os bebês são controversos. Por exemplo, um estudo de 1994 concluiu que a administração de fórmula infantil de rotina suplementada com Bifido-bacterium lactis e Streptococcus thermophilus reduziu a prevalência de diarréia nosocômica comparada com placebo. Saavedra, J., et ai, Feeding of Bifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilus to Infants in Hospital for Prevention of Diarrhea and Shedding of Rotavirus, Lancet 344:1049-49 (1994). Em contraste, no entanto, um estudo de 1999 não reportou efeito protetor de fórmula infantil suplementada com Bifidobacterium somente ou em combinação com S. thermophilus sobre episódios de diarréia. Phuapra-dit, P., et ai, Reduction of Rotavirus Infection in Children Receiving Bifido-bacteria-SuppIemented Formula, J. Med. Assoc. Thai. 82:S43-48 (1999).

O Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 20040208863 para Versalovic, et ai. se refere a um composto o qual tem atividade antiinflamatória e é secretado por bactérias de ácido láctico. O requerimento descreve o uso de GG de Lactobacillus rhamnosus (LGG) para inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias. A referência, no entanto, sefocaliza sobre modelos adultos e não revela ou sugere que a invenção seria benéfica para bebês. Conforme explicado acima, o intestino e o sistema imune de um bebê é muito diferente do de um adulto. Como as populações e espécies bacterianas variam tanto entre o intestino de um bebê e do adulto, e a grande diferença na maturidade do sistema imune nestas duas populações, não se pode presumir que o mesmo resultado seria obtido em um bebê.

O Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 20040147010 para Vidal, et al. se refere a um método para reduzir ou prevenir processos inflamatórios associados com doença mediada por bactérias no trato gastrointestinal, ossos, pele, olhos, ouvidos, pulmão e cavidade oral de um ser humano. O método compreende administrar uma quantidade eficaz de ácido lipoteicóico (LTA) de bactérias de ácido láctico e/ou administraralgumas bactérias de ácido láctico que produzem LTA. O requerimento também observa que estas composições podem modificar a colonização bacteriana e infecção durante o período neonatal.

As cepas bacterianas do requerimento de Vidal foram Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus johnsonii. Vidal não indicou o uso de LGG. De fato, Vidal revela que "LTAs de bactérias Gram-positivas apresentam grande diversidade de uma cepa bacteriana para outra." Vidal app., p. [0006]. Portanto, não se deve presumir que simplesmente porque L. acidophilus e L. johnsonii causaram um efeito antiinflamatório na linhagem celular colônica de adulto que foi testada, que todas as espécies de Lactobacillus teriam o mesmo efeito.

Vidal adicionalmente observa que LTA de algumas espécies de bactérias mediam um efeito pró-inflamatório ao invés de um efeito antiinflamatório sobre células imunes. Vidal app., p. [0005]. Portanto, como LTA pode ser pró-inflamatório ou antiinflamatório, dependendo da espécie bacteriana, a descoberta de Vidal está limitada às espécies especificamente descritas. Conforme Vidal reconheceu em um artigo publicado, "não pode ser prevista a atividade biológica de LTAs [de diferentes espécies bacterianas]." Vidal, et al., Lipoteichoic Acids from Lactobacillus johnsonii Strain La1 and Lactobacillus acidophilus Strain La 10 Antagonize the Responsiveness of Human Intestinal Epithelial HT29 Cells to Lipopolysaccharide and Gram-Negative Bactéria, Infect. Immun. 70:2057-2064 (2002).

Com base nas referências acima, o efeito de LGG sobre o sistema imune infantil ainda não foi revelado até o momento. Há diferenças grandes e fundamentais entre o intestino e o sistema imune infantis comparados com os de um adulto. Portanto, estudos que têm por foco indivíduos adultos ou linhagens celulares de adultos não são úteis na avaliação do efeito de LGG sobre os bebês. Não foi mostrado previamente que LGG apresenta um efeito imune sistêmico sobre bebês alimentados com fórmula. Além disso, não foi mostrado que a suplementação de LGG em bebês alimentados com fórmula previniria ou reduziria a inflamação sistêmica para um nível similar ao de um bebê alimentado com leite materno. Por conseguinte,seria benéfico proporcionar um método para reduzir ou prevenir inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula compreendendo a administração de LGG.

Sumário da Invenção

Em resumo, portanto, a presente invenção se refere a um novo método para tratar, prevenir ou reduzir inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa (LCPUFA).

A presente invenção também se refere a um método para reduzir ou prevenir inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula para um nível similar ao de um bebê alimentado com leite materno, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

Adicionalmenmte, a presente invenção se refere a um método para reduzir ou prevenir inflamação em um ou mais órgãos de um bebê alimentado com fórmula selecionados entre o grupo consistindo em trato gastrointestinal, fígado, plasma, pulmões, e cérebro, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para reduzir ou prevenir lesão física na mucosa intestinal de um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

A presente invenção também se refere a um método para reduzir ou prevenir a liberação sistêmica de uma ou mais citocinas ou quimocinas pró-inflamatórias em um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

A presente invenção adicionalmente se refere a um método para reduzir ou prevenir a liberação sistêmica de mieloperoxidase (MPO) em umbebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

Entre as várias vantagens encontradas a serem obtidas pela presente invenção, ela reduz ou previne inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula. Além disso, a presente invenção reduz ou previne inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula para um nível similar ao de um bebê alimentado com leite materno. A invenção pode reduzir inflamação no trato gastrointestinal, fígado, plasma, pulmões, e cérebro. Ainda outra vantagem da presente invenção é que previne ou reduz lesão física na mucosa intestinal de um bebê alimentado com fórmula. Adicionalmente, a invenção reduz ou previne a liberação de várias citocinas e quimocinas pró-inflamatórias em bebês alimentados com fórmula, inclusive os níveis de fator de necrose tumoral-a (TNF-a), interleucina-1p (IL-1P), IL-6, IL-18 e de oncogene relacionado com o crescimento (GRO/KC). Como a presente invenção pode ser usada para melhorar a condição inflamatória em um bebê, também pode prevenir o início de doenças ou infecções deletérias.

Breve Descrição dos Desenhos

Para um entendimento mais completo da presente invenção, agora é feita referência a seguintes descrições tomadas em combinação com os desenhos anexados.

A figura 1 ilustra o efeito de LGG sobre o crescimento de filhote de rato, expressado como peso corporal durante o curso de tempo do estudo.

figura 2 ilustra o efeito de LGG sobre a morfologia intestinaldos filhotes de rato, conforme representado por micrográficos do tecido intestinal sob condições de inflamação com ou sem a administração de LGG.

A figura 3 ilustra o efeito de LGG sobre a produção de peptídeo neutrófilo quimioatraente -1 induzido por citocina (CINC-1) do intestino (figura A), fígado (figura B), plasma (figura C) e pulmão (figura D) usando teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

A figura 4 ilustra o efeito de LGG sobre a produção de TNF-a doplasma (figura A) e do pulmão (figura B) usando ELISA.

A figura 5 ilustra o efeito de LGG sobre a atividade de MPO intestinal do intestino delgado distai (figura A) e do pulmão (figura B).

A figura 6 ilustra o efeito de LGG sobre abundâncias de citocina. A figura A mostra os níveis de citocina no pulmão, a figura B mostra os níveis de citocina no fígado, e a figura C mostra os níveis de citocina no plasma.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferenciais

Agora será feita referência em detalhes às modalidades da invenção, uma ou mais exemplos da qual são determinados abaixo. Cada exemplo é proporcionado a título de explanação da invenção, não uma limitação da invenção. De fato, será evidente para os versados na técnica que podem ser feitas vários modificações e variações na presente invenção sem se afastar do âmbito ou do espírito da invenção. Por exemplo, características ilustradas ou descritas como parte de uma modalidade, podem ser usadas em outra modalidade para produzir uma modalidade ainda adicional.

Portanto, pretende-se que a presente invenção cubra as modificações e variações referidas conforme estejam dentro do âmbito das reivindicações anexadas e seus equivalentes. Outros objetos, características e aspectos da presente invenção são revelados em ou são óbvios a partir da descrição detalhada seguinte. Deve ser entendido por uma pessoa versada na técnica que a presente discussão é somente uma descrição de modalidades típicas, e não se pretende que seja limitante para os aspectos mais amplos da presente invenção. Abreviações

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, são usadas as seguintes abreviações: LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; LCPUFA, ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa; LPS, lipopolissacarídeo; IL, inter-leucina; TNF, fator de necrose tumoral; CINC-1, neutrófilo quimoatraente-1 induzido por citocina; GRO/KC, oncogene relacionado com o crescimento; ELISA, teste imunossorvente ligado a enzima; RT-PCR, transcrição reversa-reação de cadeia polimerase; ANOVA, análise da variância; SD, desvio pa-drão; PAF, fator de ativação plaquetária; RMS, substituto do leite de rato; MPO, mieloperoxidase; TLRs, receptores semelhantes a Toll; EPA, ácido eicosapentaenóico; DHA, ácido docosahexaenóico; ARA, ácido araquidôni-co.

Definições

O termo "probiótico" significa um microorganismo que exerce efeitos benéficos sobre a saúde do hospedeiro.

O termo "prebiótico" significa um ingrediente alimentar não dige-rível que estimula o crescimento e/ou a atividade de probióticos.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "tratar" significa melhorar, recuperar ou remediar uma doença, distúrbio, ou sintoma de uma doença ou condição.

O termo "reduzir" significa diminuir em extensão, quantidade, ou

grau.

O termo "prevenir" significa parar ou impedir uma doença, distúrbio, ou sintoma de uma doença ou condição através de alguma ação.

O termo "sistêmico", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa se referindo a ou afetando o corpo inteiro.

Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" se referem a uma quantidade que resulta em uma melhora ou cura da doença, distúrbio, ou sintomas da doença ou condição.

O termo "pré-termo" significa um bebê nascido antes do fim da 37a semana de gestação.

O termo "bebê" significa um ser humano que tem menos de cerca de 1 ano de idade.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "fórmula infantil" significa uma composição que satisfaz as necessidades de nutrientes de um bebê por ser um substituto para o leite humano. Nos Estados Unidos, o conteúdo de uma fórmula infantil é ditado pelas regulamentações federais determinadas no 21 C.F.R. Seções 100, 106, e 107. Estas regulamentações definem níveis de macronutrientes, vitaminas, minerais, e outros ingredientes em um esforço para estimular as propriedades nutricio-nais e outras do leite materno humano.

De acordo com a presente invenção, foi descoberto um novo método para tratar ou prevenir inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula. O método compreende administrar uma quantidade terapeuti-camente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA a um bebê.

LGG é uma cepa probiótica isolada da flora intestinal humana saudável. Foi revelada na Patente dos Estados Unidos No. 5.032.399 para Gorbach, et ai., a qual é aqui, a este requerimento de patente, incorporada em sua totalidade, por meio de referência à mesma. LGG é resistente à maioria dos antibióticos, estável na presença de ácido e bile, e se fixa avidamente às células da mucosa do traro intestinal humano. Sobrevive por 1 a 3 dias na maioria dos indivíduos e até 7 dias em 30% dos sujeitos. Além de sua capacidade de colonização, LGG também afeta de modo benéfico as reações imunes da mucosa. LGG está depositado com a autoridade de depositário da American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 53103.

No método da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG pode corresponder a entre cerca de 1x104 e 1x1012 cfu/L/kg/dia para um bebê. Em outra modalidade, a presente invenção compreende a administração de entre cerca de 1x106 e 1x109 cfu/L/kg/dia de LGG a um bebê. Em ainda outra modalidade, a presente invenção compreende a administração de cerca de 1 x108 cfu/L/kg/dia de LGG a um bebê.

LCPUFAs adequados úteis na presente invenção podem incluir, mas não estão limitados a, ácido a-linoléico, ácido Y-linoléico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido eicosapentanóico (EPA), ARA e DHA. No método da presente invenção, uma quantidade eficaz de LCPUFA pode corresponder a entre cerca de 3 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 150 mg por kg de peso corporal por dia. Em uma modalidade da invenção, a quantidade é de a partir de cerca de 6 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por kg de peso corporal por dia. Em outra modalidade a quantidade é de a partir de cerca de 10 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de60 mg por kg de peso corporal por dia.

A forma de administração de LGG e LCPUFA no método da invenção não é crucial, na medida que seja administrada uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA. De modo ainda mais conveniente, o LGG e LCPUFA são suplementados na fórmula infantil a qual é em seguida alimentada a um bebê.

Em uma modalidade, a fórmula infantil para uso na presente invenção é nutricionalmente completa e contém tipos e quantidades adequados de lipídeo, carbóidrato, proteína, vitaminas e minerais. A quantidade de lipídeo ou gordura tipicamente pode variar a partir de cerca de 3 até cerca de 7 g/100 kcal. A quantidade de proteína tipicamente pode variar a partir de cerca de 1 até cerca de 5 g/100 kcal. A quantidade de carbóidrato tipicamente pode variar a partir de cerca de 8 até cerca de 12 g/100 kcal. As fontes de proteínas podem ser qualquer uma usada na técnica, por exemplo, leite sem gordura, proteína do soro, caseína, proteína de soja, proteína hi-drolisada, aminoácidos, e semelhantes. As fontes de carboidratos podem ser qualquer uma usada na técnica, por exemplo, lactose, glicose, sólidos do xarope de milho, maltodextrinas, sacarose, amido, sólidos do xarope de arroz, e semelhantes. As fontes de lipídeos podem ser qualquer uma usada na técnica, por exemplo, óleos vegetais tais como óleo de palma, óleo de soja, palmoleína, óleo de coco, óleo de triglicerídeo de cadeia média, óleo de girassol de alto teor oléico, óleo de açafrão de alto teor oléico, e semelhantes.

Convenientemente, pode ser usada fórmula infantil disponível comercialmente. Por exemplo, Enfamil®, Enfamil® Premature Formula, En-famil® with Iron, Lactofree®, Nutramigen®, Pregestimil®, e ProSobee® (disponíveis na Mead Johnson & Company, Evansville, IN, E.U.A.) podem ser suplementadas com níveis adequados de LGG e LCPUFA e usados na prática do método da invenção.

Em uma modalidade da invenção, LGG e LCPUFA podem ser combinados com um ou mais probióticos adicionais para tratar ou prevenir inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula. Qualquer probió-tico conhecido na técnica será aceitável nesta modalidade. Em uma modalidade particular, o probiótico é escolhido entre o grupo consistindo em Lac-tobacillus e Bifidobacterium.

Em outra modalidade da invenção, LGG e LCPUFA pode ser combinado com um ou mais prebióticos para tratar ou prevenir inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula. Qualquer prebiótico conhecido na técnica será aceitável nesta modalidade. Os prebióticos da presente invenção podem incluir lactulose, galacto-oligossacarídeo, fruto-oligossacarídeo, isomalto-oligossacarídeo, oligossacarídeos da soja, lactos-sacarose, xilo-oligossacarídeo, e gentio-oligossacarídeos.

Em uma modalidade, LGG é administrado em combinação com DHA. Em outra modalidade, LGG é administrado em combinação com ARA. Em ainda outra modalidade, LGG é administrado em combinação com tanto DHA quanto ARA. Fórmula infantil disponível comercialmente que contém DHA, ARA, ou uma combinação dos mesmos pode ser suplementada com LGG e usada na presente invenção. Por exemplo, Enfamil® LIPIL®, que contém níveis eficazes de DHA e ARA, está disponível comercialmente e pode ser suplementado com LGG e utilizado na presente invenção.

Em uma modalidade, tanto DHA quanto ARA são usados em combinação com LGG para tratar inflamação sistêmica em bebês. Nesta modalidade, a proporção em peso de ARA:DHA é tipicamente de a partir de cerca de 1:3 até cerca de 9:1. Em uma modalidade da presente invenção, esta proporção é de a partir de cerca de 1:2 até cerca de 4:1. Em ainda outra modalidade, a proporção é de a partir de cerca de 2:3 até cerca de 2:1. Em uma modalidade particular a proporção é de cerca de 2:1.

A quantidade eficaz de DHA em uma modalidade da presente invenção é tipicamente de a partir de cerca de 3 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 150 mg por kg de peso corporal por dia. Em uma modalidade da invenção, a quantidade é de a partir de cerca de 6 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 100 mg por kg de peso corporal por dia. Em outra modalidade a quantidade é de a partir de cerca de 10 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 60 mg por kg de peso corporal por dia.Em ainda outra modalidade a quantidade é de a partir de cerca de 15 mg porkg de peso corporal por dia até cerca de 30 mg por kg de peso corporal pordia.

A quantidade eficaz de ARA em uma modalidade da presenteinvenção é tipicamente de a partir de cerca de 5 mg por kg de peso corporalpor dia até cerca de 150 mg por kg de peso corporal por dia. Em uma moda-lidade desta invenção, a quantidade varia a partir de cerca de 10 mg por kgde peso corporal por dia até cerca de 120 mg por kg de peso corporal pordia. Em outra modalidade, a quantidade varia a partir de cerca de 15 mg porkg de peso corporal por dia até cerca de 90 mg por kg de peso corporal pordia. Em ainda outra modalidade, a quantidade varia a partir de cerca de 20mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 60 mg por kg de peso cor-poral por dia.

A quantidade de DHA em fórmulas infantis para uso com a pre-sente invenção tipicamente varia a partir de cerca de 5 mg/100 kcal até cer-ca de 80 mg/100 kcal. Em uma modalidade da presente invenção varia apartir de cerca de 10 mg/100 kcal até cerca de 50 mg/100 kcal; e em aindaoutra modalidade a partir de cerca de 15 mg/100 kcal até cerca de 20mg/100 kcal. Em uma modalidade particular da presente invenção, a quan-tidade de DHA é de cerca de 17 mg/100 kcal.

A quantidade de ARA em fórmulas infantis para uso com a pre-sente invenção tipicamente varia a partir de cerca de 10 mg/100 kcal atécerca de 100 mg/100 kcal. Em uma modalidade da presente invenção, aquantidade de ARA varia a partir de cerca de 15 mg/100 kcal até cerca de 70mg/100 kcal. Em outra modalidade a quantidade de ARA varia a partir decerca de 20 mg/100 kcal até cerca de 40 mg/100 kcal. Em uma modalidadeparticular da presente invenção, a quantidade de ARA é de cerca de 34mg/100 kcal.

A fórmula infantil suplementada com óleos contendo DHA e ARApara uso com a presente invenção pode ser feita usando técnicas de rotinaconhecidas na técnica. Por exemplo, podem ser adicionados à fórmula subs-tituindo uma quantidade equivalente de um óleo, tal como óleo de girassolde alto teor oléico, normalmente presente na fórmula. Como outro exemplo,os óleos contendo DHA e ARA podem ser adicionados à fórmula substituindo uma quantidade equivalente do resto da mistura de gorduras totais normalmente presentes na fórmula sem DHA e ARA.

A fonte de DHA e ARA pode ser qualquer fonte conhecida natécnica. Em uma modalidade da presente invenção, fontes de DHA e ARAsão óleos de células únicas conforme ensinado nas Patentes dos EstadosUnidos Nos. 5.374.567; 5.550.156; e 5.397.591, cujas revelações são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, em sua totalidade por meio dereferência. No entanto, a presente invenção não está limitada a somenteestes óleos. DHA e ARA podem estar em forma natural ou refinada.

Em uma modalidade, a fonte é substancialmente livre de EPA.Por exemplo, em uma modalidade da presente invenção a fórmula infantilcontém menos de cerca de 16 mg de EPA/100 kcal; em outra modalidademenos de cerca de 10 mg de EPA/100 kcal; e em ainda outra modalidademenos de cerca de 5 mg de EPA/100 kcal. Uma modalidade particular essencialmente não contém EPA. Outra modalidade é livre de EPA em quemesmo quantidades traço de EPA estão ausentes da fórmula.

Acredita-se que estipulação da combinação de LGG com DHAe/ou ARA proporciona efeitos complementares ou sinérgicos com respeito àspropriedades antiinflamatórias de formulações contendo estes agentes. Apesar de não desejar ser limitado a esta ou a qualquer outra teoria, imaginase que probióticos tais como LGG confiram efeitos antiinflamatórios em parteatravés de interação com receptores específicos, conhecidos como receptores semelhantes a Toll (TLRs) sobre a superfície de células imunes específicas. A interação direta ou indireta entre LGG e estes receptores inicia umacascata de transduçao de sinalização intracelular que resulta na alteração daexpressão genética nestas células alvo. É esta interação específica e a alteração resultante na expressão genética e outros efeitos celulares que se acredita que estejam envolvidas na modulação de inflamação.

Em contraste, imagina-se que ácidos graxos w-3 tais como DHAconfiram ação antiinflamatória através da alteração da produção de media-dores pró-inflamatórios, derivados de ácidos graxos, conhecidos amplamente como eicosanóides. Ácidos graxos co-6, tais como ARA, os quais estãolocalizados no grupo de fosfolipídeos das membranas celulares, são liberados durante a resposta inflamatória e liberam um grupo de ARA livres. Estegrupo de ARA então age sobre duas classes de enzimas, conhecidas comolipoxigenases e ciclooxigenases, as quais produzem um espectro específicode eicosanóides inclusive as 2-séries prostanóides, tais como prostaglandinas, tromboxanos, e leucotrienos. Sabe-se que estes eicosanóides têm umexcesso de ações pró-ínflamatórias em muitos tipos celulares e órgãos. Sabe-se que dietas ricas em ácidos graxos oj-3, tais como EPA e DHA, sãocompetidores para ácidos graxos u>-6 em várias etapas deste processo e,portanto, moderam os efeitos pró-inflamatórios de ARA. Por exemplo, ácidos graxos ca-3 modulam o alongamento dos ácidos graxos oj-6 em ARA, aincorporação de ARA no grupo de fosfolipídeos da membrana celular, e aprodução de eicosanóides pró-inflamatórios de ARA. A combinação de DHAe ARA, portanto, proporciona ações distintas, porém complementares, paramoderar a resposta inflamatória em múltiplos tecidos.

Como uma alternative a uma fórmula infantil, o LGG e LCPUFApodem ser administrados como um suplemento não integral para a alimentação da fórmula. Por exemplo, LGG pode ser ingerido sob a forma de umapílula, comprirmido, cápsula, cápsula, pó, líquido ou gel. Nesta modalidadedo método, um suplemento de LGG pode ser ingerido em combinação comoutros suplementos de nutrientes, tais como vitaminas, ou em combinaçãocom um suplemento de LCPUFA, tal como DHA ou ARA.

Em outra modalidade, o LGG e/ou LCPUFA são encapsuladosem uma matriz de açúcar, gordura, ou polissacarídeo para aumentar mais aprobabilidade de sobrevida bacteriana. As composições da presente invenção também podem ser providas em uma forma adequada para bebês selecionada entre o grupo consistindo em fórmula interruptas "follow-on", bebida,leite, iogurte, suco de fruta, bebida à base de fruta, comprimido mastigável,cookie, cracker, ou uma combinação dos mesmos.

No método da presente invenção, o bebê é alimentado com fór-mula. Em uma modalidade o bebê é alimentado com fórmula desde o nascimento. Em outra modalidade, o bebê é amamentado desde o nascimento até uma idade a qual é menor do que um ano, e é alimentado com fórmuladepois disso, ocasião na qual se inicia a suplementação de LGG e LCPUFA.

Em uma particular modalidade da presente invenção, o métodocompreende tratar ou prevenir inflamação sistêmica em um bebê pré-termoalimentado com fórmula. Neste método, LGG e LCPUFA podem ser administrados ao bebê pré-termo sob a forma de uma fórmula infantil ou qualqueroutra forma adequada. Em outra modalidade, LGG pode ser administradoao bebê pré-termo em combinação com DHA e/ou ARA para criar um efeitoantiinflamatório potencialmente sinérgico.

Em um método da presente invenção, a administração de LGG eLCPUFA reduz ou previne a liberação sistêmica de uma ou mais citocinas ouquimocinas pró-inflamatórias em um bebê alimentado com fórmula. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, citocinas ou quimocinas"pró-inflamatórias" incluem as conhecidas na técnica por estarem envolvidasna regulação para cima de reações inflamatórias. Exemplos incluem, masnão estão limitados a TNF-a, IL-1 p, IL-6, IL-18, e GRO/KC.

Quimocinas são um grupo de citocinas que permitem a migraçãode leucócitos do sangue para os tecidos no local da inflamação. Quandoproduzidas em quantidades em excesso, as quimocinas podem levar a lesãode tecido saudável. Oncogene relacionado com o crescimento (GRO/KC) éuma quimocina que recruta células imunes para o local da inflamação. É ocomplemento humano para quimioatraentes para neutrófilos induzidos porcitocina de rato (CINC-1), e está funcionalmente relacionada com a famíliadas interleucinas-8.

Em outra modalidade da presente invenção, LGG e LCPUFAreduzem ou previnem a liberação sistêmica de MPO em um bebê alimentadocom fórmula. MPO é uma proteína contendo ferro localizada nos grânulosazurofílicos de neutrófilos e nos lisossomas de monócitos. Usa peroxidasede hidrogênio para converter cloreto em ácido hipocloroso. O ácido hipocloroso produzido então reage com e destrói as bactérias. Durante a inflama-ção, os níveis de MPO chegam ao pico enquanto tenta destruir os patógenos. Portanto, a enzima é extremamente útil como um marcador de inflamação. Frode, T. & Medeiros, Y. Myloperoxidase and Adenosine-DeaminaseLeveis in the Pleural Fluid Leakage Induced by Carrageenan in the MouseModel of Pleurísy, Ml 10:4, 223-227 (2001).

Conforme será visto nos exemplos, foi demonstrado que LGGreduz inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula para umnível similar ao de bebês alimentados com leite materno. A lesão física namucosa intestinal de ratos bebês alimentados com fórmula foi reduzida paraum nível similar ao de ratos bebês alimentados com leite materno quandosuas dietas foram suplementadas com LGG. Adicionalmente, os níveis deCINC-1, MPO, e de várias citocinas nos ratos bebês alimentados com fórmula foram reduzidos para níveis similares aos de ratos bebês alimentados comleite materno quando suplementados com LGG.

Os exemplos seguintes descrevem várias modalidades da presente invenção. Outras modalidades dentro do âmbito das reivindicaçõesaqui, neste requerimento de patente, serão evidentes para uma pessoa versada na técnica a partir de consideração da especificação ou da prática dainvenção conforme revelado aqui, neste requerimento de patente. Pretendese que a especificação, junto com os exemplos, sejam considerados comosendo típicos somente, com o âmbito e o espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações que se seguem aos exemplos. Nos exemplos, todas as percentagens são dadas em uma base em peso a menos que indicado de outro modo.

Exemplo 1

Este exemplo descreve os materiais e métodos necessários paramostrar o efeito de LGG sobre filhotes neonatais de rato alimentados comfórmula. Em dois experimentos separados, dez ratos bebês Sprague-Dawley (Taconic, Germantown, NY) foram atribuídos aleatoriamente a doisgrupos de alimentação por gastrostomia com cinco ratos por grupo. A alimentação por gastrostomia, usando o modelo "filhote dentro do copo" debebê de rato, se iniciou no dia 7 de vida dos filhotes de rato. Os tubos dealimentação por gastrostomia foram construídos a partir de seções de 14 cmde tubulação de polietileno que foram inseridas no estômago dos filhotes.Este é um modelo usado comumente em estudos de nutrição desenvolvi-mental quando é importante manipular a composição nutricional na ausênciade alimentação materna. A colocação da gastrostomia foi feita sob aneste-sia com isoflurano. Bombas de seringa controlada por timer foram conecta-das aos tubos de alimentação e foram ajustadas para alimentar os ratos pe-los primeiros 20 minutos de cada hora em um índice de fluxo dependente dopeso. Cinco ratos da mesma idade criados pela mãe foram usados comocontroles de referência.

Durante um período de aclimatação de 2 dias, os filhotes de ratoalimentados por gastrostomia foram alimentados com substituto de leite derato (RMS). O componente de proteína do RMS foi entre 30 e 40 g/kg/dia, oqual é similar ao do leite materno e é requerido para o crescimento normal.A um dos grupos alimentados com RMS também foi administrado um su-plemento de 1x108 cfu/L/kg/dia de LGG. Ao outro grupo foi administradoRMS somente, sem suplementação de LGG. Todos os grupos alimentadospor gastrostomia receberam a mesma quantidade de gordura e carboidratos.

Lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli 0127:B8 (LPS;Sigma, St. Louis, MO) foi dissolvido em água por vórtice em uma concentra-ção de 2 mg/ml. Aos ratos alimentados por gastrostomia foi administradoentre 0,25 e 0,5 mg/kg/dia de LPS através do tubo de gastrostomia iniciando2 dias depois da iniciação da alimentação artificial. Foi administrada aosfilhotes suplementação de LPS por 6 dias. Foi determinado em estudos pilo-to que esta dose resulta em ocasionais calafrios, piloereção, e baixo ganhode peso mas não estava associada com um aumento significativo na morta-lidade durante um período de 6 dias.

Ao final do período de tratamento de 6 dias, os filhotes de ratoforam eutanizados com uma overdose de sódio pentobarbital. O intestinodelgado foi removido e separado em três partes: o íleo, jejuno, e duodeno,armazenados a -80°C para testes enzimáticos e ELISA, ou fixado em 10%de formalina tamponada neutra para morfologia intestinal. O pulmão, fígadoe plasma foram armazenados a -80°C para testes enzimáticos e ELISA.

Foi usado software estatístico Sigmastat (SPSS, Chicago, IL)para analisar o peso corporal, medições de vilus, e atividades enzimáticas,MPO, ELISA para CINC-1, e TNF-a e resultados de densitometria para RT-PCR. Todos os dados foram reportados como médias ± desvio padrão (SD).Uma análise da variância modelo "one-way" entre os grupos (ANOVA) foiusada para determinar se estava presente uma diferença significativa entretodos os grupos de tratamento.

Exemplo 2

Este exemplo ilustra o efeito de LGG sobre o crescimento dosfilhotes depois de alimentação por gastrostomia. Os filhotes de rato forampesados diariamente depois da alimentação por gastrostomia e comparadoscom animais de referência alimentados com leite materno. A figura 1 mostraque animais alimentados com leite materno crescem mais rapidamente doque os filhotes alimentados por gastrostomia, tratadas com LPS. Gráficosde linhas representam o aumento do índice de peso corporal dos filhotescom o aumento de tempo expressado desde o início do estudo. Prover LGGaos filhotes alimentados por gastrostomia, tratados com LPS não melhorou oganho de peso.

Exemplo 3

Este exemplo ilustra o efeito de LGG sobre a morfologia intestinal dos filhotes de rato. Os estudos de microscopia se focalizaram sobre oíleo porque esta é uma região que é mais altamente suscetível a algumaspatologias em bebês (por exemplo, enterocolite necrotizante e perfuraçõesrelacionadas com enterocolite não necrotizante). Amostras de íleo fixadascom formalina foram embutidas em parafina; seções de 6 pm foram cortadas usando um microtomo de parafina 2030 Reichert-Jung. As seções foram em seguida coradas com uma tintura de rotina de hematoxilina e eosina(H&E). A figura 2 mostra os resultados desta tintura.

Seções de íleo de filhotes de rato tratados com LPS (figuras 2G-21) apresentaram uma metaplasia ocorrendo no epitélio viloso, com aumentodo clareamento do citoplasma, comparadas com controles criados pela mãe(figuras 2A-2C). As figuras 2G-2F mostram que estas seções também ca-racterizaram expansão da lâmina própria por um infiltrado linfoplasmacítico,adelgaçamento da mucosa muscularis, e alterações regenerativas nas crip-tas inclusive aumento do número e ramificação das de criptas e aumento daatividade mitótica. Estas características estavam ausentes nos animais con-trole criados pela mãe, e atenuadas no grupo tratado com LPS mais LGG(figuras 2D-2F). A lesão física na mucosa intestinal do grupo LPS/LGG foireduzida para um nível similar ao de filhotes de rato alimentados com leitematerno. Nos últimos intestinos, a alteração metaplástica nos vilos foi inter-mediária entre a vista nos tecidos dos grupos controle e de LPS. Notavel-mente, isto parece ocorrer como um espectro, conforme ilustrado pela meta-plasia vista nos vilos, que se aproxima daquela do grupo tratado com LPS.

Exemplo 4

Este exemplo ilustra o efeito de LGG sobre CINC-1. Os níveisde CINC-1 no intestino delgado e no plasma foram determinados por kits deteste imunomético enzimático TiterZyme Enzyme Immunometric Assay paraoncogene relacionado com crescimento de rato/CINC-1 (Assay Designs, AnnArbor, Ml). A absorvência foi determinada a 450 nm, e a concentração foicalculada usando a equação derivada de uma curva padrão linear.

Para investigar adicionalmente os efeitos das dietas sobre peptí-deo CINC-1, a produção de CINC-1 foi avaliada por ELISA no intestino del-gado, no fígado, no pulmão e no plasma. Em um experimento inicial, a ad-ministração de LPS aos filhotes de rato causou uma elevação aproximadade 4 vezes em CINC-1 em relação aos filhotes alimentados por gastrostomianão tratados com LPS (dados não mostrados). Conforme mostrado na figu-ra 3A, ao comparar filhotes alimentados por gastrostomia tratados com LPScom ratos tratados com LPS/LGG e alimentados com leite materno, os níveisintestinais de CINC-1 nos filhotes não diferiram significativamente entre os 3grupos, mas sugeriram uma ligeira tendência para ser maior no grupo trata-do com LPS e sem LGG. No entanto, as concentrações de CINC-1 no fíga-do (figura 3B) e n no plasma (figura 3C), foram quase 2 vezes tão elevadasno grupo tratado com LPS que não recebeu LGG, mas isto foi significativa-mente atenuado com LGG. O pulmão (figura 3D), aqui usado para determinar se o efeito probiótico pode se estender a um órgão distai, também apresentou uma importante elevação (aproximadamente 4 vezes) de CINC-1com tratamento com LPS quando comparados com controles alimentadoscom leite materno, mas isto foi significativamente atenuado com LGG. Nofígado e no plasma, a suplementação com LGG reduziu os níveis de CINC-1para um nível o qual foi muito similar ao de filhotes de rato alimentados comleite materno. Estes resultados mostram que LGG tem a capacidade de reduzir a inflamação sistêmica em um bebê alimentado com fórmula para umnível o qual é similar ao de um bebê alimentado com leite materno.

Exemplo 5

Este exemplo ilustra o efeito de LGG sobre ós níveis de TNF-aem ratos bebês. Os níveis de TNF-a no intestino delgado e no plasma foramdeterminados por kits TiterZyme Enzyme Immunometric Assay para TNF-a(Assay Designs, Ann Arbor, Ml). A absorvência foi determinada a 450 nm, ea concentração foi calculada usando a equação derivada de uma curva padrão linear.

Para investigar adicionalmente os efeitos das dietas sobre TNF-a, a produção de TNF-a foi avaliada por ELISA no plasma e no pulmão. AFigura 4 ilustra o efeito de LGG sobre a produção de TNF-a do plasma (figura 4A) e do pulmão (figura 4B) usando ELISA. A Figura 4 indica que os níveis de TNF-a foram significativamente maiores em filhotes alimentados porgastrostomia, tratados com LPS do que em filhotes criados pela mãe e queLGG neutralizou significativamente a elevação de TNF-a, induzida por LPS,tanto no plasma quanto no pulmão.

Exemplo 6

Este exemplo ilustra o efeito de LGG sobre os níveis de MPO. Aatividade de MPO, uma medida do acúmulo de neutrófilos e um marcador dalesão tecidual, foi determinada por um procedimento enzimático de rotina.Amostras de intestino foram homogeneizadas sobre gelo em 0,01 M de tampão de KH2P04. Depois de centrifugação a 10.000 g por 20 minutos a 4°C,os péletes foram ressuspendidos por sonicaçao em tampão de brometo decetiltrimetilamônio (13,7 mM de CTAB, 50 mM de KH2P04, e 50 mM de ácidoacético, pH 6.0). O sobrenadante foi mantido por análise ELISA. A suspensão foi centrifugada de novo a 10.000 g por 15 minutos. O sobrenadante foiem seguida incubado em um banho de água a 60°C por 2 horas. A concentração de MPO do sobrenadante foi medida pela oxidação, H2O2-dependente, de tetrametilbenzidina. A absorvência foi determinada a 650nm e comparada com uma curva padrão linear. A proteína foi medida usando o teste de proteína BioRad Dc Protein Assay (BioRad).

A figura 5 ilustra o efeito de LGG sobre a atividade de MPO nointestino delgado distai (figura 5A) e pulmão (figura 5B). Os níveis de MPOforam significativamente maiores em filhotes alimentados por gastrostomia,tratados com LPS do que em filhotes criados pela mãe e LGG neutralizousignificativamente a elevação de MPO, induzida por LPS, tanto no intestinodelgado distai quanto no pulmão. Os níveis de MPO reduzidos nos ratostratados com LPS/LGG são muito similares aos de ratos alimentados pelasmães, mostrando que LGG reduz a inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula para um nível o qual é similar ao nível de bebês alimentados com leite materno.

Exemplo 7

Este exemplo ilustra o efeito de LGG sobre os níveis de váriascitocinas. Kits de contas múltiplas foram adquiridos da LINCO Research,Inc. (St. Charles, MO, EUA). Citocinas/quimocinas foram analisadas por umkit que incluiu: fator estimulante de colônia de macrófagos-granulócityos(GMCSF), A-interferon (IFN-A), interleucina-1a (IL-1a), IL-1a, IL-2, IL-4, IL-5,IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-18, Proteína Quimioatraente para Monócito-1 (MCP-1), GRO/KC (CINC-1 de rato), e fator de necrose tumoral-a (TNF-a). O testemúltiplo foi realizado de acordo com as especificações do fafricante. Curvaspadrão para cada citocina/ quimocina foram geradas usando as concentrações de referência fornecidas pelos fabricantes. Dados brutos (intensidadefluorescente média) foram analisados por Software MasterPlex Quantitation(MiraiBio, Inc., Alameda, CA, EUA) para obter os valores das concentrações.

Para investigar adicionalmente os efeitos de LPS e LGG sobrecitocinas, foram analisadas 14 citocinas / quimocinas do pulmão, fígado,plasma e intestino delgado distai. Estas incluíram: fator estimulante de colônia de macrófagos-granulócitos (GMCSF), A-interferon (IFN-A), interleucinala (IL-1 a), IL-1 (3, IL-2, IL-4, IL -5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-18, ProteínaQuimioatraente para Monócito-1(MCP-1), GRO/KC (CINC-1 de rato), e fatorde necrose tumoral-a (TNF- a).

A figura 6A ilustra que os níveis pulmonares de IL-1 (3, IL-6, IL-18,GRO/KC (CINC-1 de rato), e TNF-a foram significativamente maiores emfilhotes alimentados por gastrostomia, tratados com LPS do que em filhotescriados pela mãe e que LGG neutralizou significativamente a elevação induzida por LPS de IL-1 p, IL-6, IL-10, IL-18, GRO/KC (CINC-1 de rato), e TNF-a. A figura 6B mostra que os níveis hepáticos de IL-13, IL-6, IL-18, eGRO/KC (CINC-1 de rato) foram significativamente maiores em filhotes alimentados por gastrostomia, tratados com LPS do que em filhotes criadospela mãe e que LGG neutralizou significativamente a elevação induzida porLPS daquelas citocinas / quimocinas. A figura 6C também mostra um aumento significativo dos níveis de citocina / quimocina no plasma dos animaisque receberam LPS. Este efeito foi neutralizado nos animais recebendo oLGG.

Estes resultados mostram que a suplementação com LGG embebês alimentados com fórmula reduz inflamação sistêmica. Além disso, osresultados mostram que LGG reduz inflamação sistêmica em bebês alimentados com fórmula para um nível o qual é similar ao de bebês alimentadoscom leite materno. Isto é ilustrado nos resultados descritos aqui, neste requerimento de patente, através de comparação do grupo tratado com LGG edo grupo alimentado exclusivamente com leite materno. Em vários casos, aadministração de LGG resulta em uma resposta inflamatória particular nãosendo significativamente diferente entre o grupo tratado com LGG e o grupoalimentado com leite materno, indicando uma resposta inflamatória similar.

A invenção reduz a inflamação no trato gastrointestinal, fígado,plasma, pulmões, e cérebro e previne ou reduz lesão física na mucosa intestinal de um bebê alimentado com fórmula. Como a presente invenção podeser usada para melhorar a condição inflamatória em um bebê, também podeprevenir o início de doenças ou infecções deletérias.

Toda as referências citadas nesta especificação, inclusive semlimitação, todos os ensaios, publicações, patentes, requerimentos de patente, apresentações, textos, relatórios, manuscritos, brochuras, livros, postagens (postings) da internet, artigos de revistas, periódicos, e similares, sãopor este incorporadas por meio de referência em sua especificação em suastotalidades. Pretende-se que a discussão das referências aqui, neste requerimento de patente, simplesmente resuma as afirmações feitas por seus au-tores e não é feito reconhecimento de que qualquer referência constitua técnica anterior. Os requerentes se reservam o direito de testar a precisão e apertinência das referências citadas

Estas e outras modificações e variações da presente invençãopodem ser praticadas por aqueles versados técnica, sem se afastar do espírito e do âmbito da presente invenção, a qua é mais particularmente deterninada nas reivindicações anexadas. Além disso, deve ser entendido que aspectos das várias modalidades podem ser intercambiados tanto no todo ouem parte. Além disso, aqueles com conhecimento regular da técnica reconhecerão que a descrição precedente é a título de exemplo somente, e quenão se pretende que limite a invenção descrita adicionalmente portanto emsemelhantes reivindicações anexadas. Portanto, o espírito e o âmbito dasreivindicações anexadas não devem ser limitados à descrição das versõespreferenciais contidas nas mesmas.

Claims (26)

1. Método para tratar, prevenir ou reduzir inflamação sistêmicaem um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrarao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinaçãocom no mínimo um LCPUFA.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o LCPUFAcompreende DHA ou ARA.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o LCPUFAcompreende DHA em uma quantidade de entre cerca de 3 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 150 mg por kg de peso corporal por dia.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o LCPUFAcompreende ARA em uma quantidade de entre cerca de 5 mg por kg de peso corporal por dia até cerca de 150 mg por kg de peso corporal por dia.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o LCPUFAcompreende DHA e ARA.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a proporçãode ARA:DHA é de a partir de cerca de 1:3 até cerca de 9:1.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a proporçãode ARA:DHA é de a partir de cerca de 1:2 até cerca de 4:1.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a proporçãode ARA:DHA é de a partir de cerca de 2:3 até cerca de 2:1.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a inflamação sistêmica é tratada ou prevenida no trato gastrointestinal, no fígado, no plasma, nos pulmões, e no cérebro do bebê.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o LGG e oLCPUFA são incorporados em uma fórmula infantil e consumidos pelo bebê.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de LGG é de entre cerca de 1x104 e 1x1010 cfu/L/kg/dia.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de LGG é de cerca de 1x106 e 1x109 cfu/L/kg/dia.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de LGG é de cerca de 1x108 cfu/L/kg/dia.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o métodoadicionalmente compreende administrar ao bebê no mínimo um outro probiótico.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o métodoadicionalmente compreende administrar ao bebê no mínimo um prebiótico.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o bebê éum bebê pré-termo.

17. Método para reduzir ou prevenir inflamação sistêmica em umbebê alimentado com fórmula para um nível similar ao de um bebê alimentado com leite materno, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimoum LCPUFA.

18. Método para reduzir ou prevenir inflamação em um ou maisórgãos de um bebê alimentado com fórmula selecionados entre o grupoconsistindo em trato gastrointestinal, fígado, plasma, pulmões, e cérebro, ométodo compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

19. Método para reduzir ou prevenir lesão física na mucosa intestinal de um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a lesãofísica compreende um clareamento do citoplasma, expansão da lâmina própria por um infiltrado linfoplasmacítico, adelgaçamento da mucosa muscularis, aumento do número e ramificação de criptas, e/ou aumento da atividademitótica.

21. Método para reduzir ou prevenir a liberação sistêmica deuma ou mais citocinas ou quimocinas pró-inflamatórias em um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo umLCPUFA.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a citocinaou quimocina pró-inflamatória compreende uma ou mais selecionadas entreo grupo consistindo em TNF-a, IL-1p, IL-6, IL-18 e GRO/KC.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a liberação sistêmica de TNF-a, IL-1(3, IL-6 ou IL-18 é reduzida ou prevenida no pulmão, fígado, ou plasma do bebê.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a liberação sistêmica de GRO/KC é reduzida ou prevenida no intestino, fígado,plasma, ou pulmão do bebê.

25. Método para reduzir ou prevenir a liberação sistêmica deMPO em um bebê alimentado com fórmula, o método compreendendo administrar ao bebê uma quantidade terapeuticamente eficaz de LGG em combinação com no mínimo um LCPUFA.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a liberação sistêmica de MPO é reduzida ou prevenida no intestino ou pulmão do bebê.