BRPI0609485A2 - criação de aves domésticas e outros animais resistentes a doenças virais - Google Patents
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Abstract
CRIAçãO DE AVES DOMéSTICAS E OUTROS ANIMAIS RESISTENTES A DOENçAS VIRAIS. A invenção é direcionada a animais geneticamente modificados os quais são resistentes a infecções virais. Também fornecidos são métodos para criação de animais os quais são resistentes a infecções virais.
Description
CRIAÇÃO DE AVES DOMÉSTICAS E OUTROS ANIMAIS RESISTENTES ADOENÇAS VIRAIS
REFERÊNCIAS CRUZADAS A APLICAÇÕES RELACIONADAS
Esta referência reivindica prioridade para Aplicaçãode Patente Provisória E.U.A. 60/666,636, arquivada em 31 demarço de 2005, a qual está aqui incorporada por referênciapara todos os propósitos.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção se relaciona a utilização da tecnologia deRNA de interferência para criar animais que são resistentesa infecções virais.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
O Centro de Controle de Doenças (CDC) e a OrganizaçãoMundial de Saúde reportaram que a linhagem H5N1 altamenteletal do vírus influenza aviário foi reportado em mais de47 países espalhados por, pelo menos, 3 continentes. Veja,por exemplo,<HTTP: / /www. cdc . gov/f lu/avian/outbreaks/current. htm> .Influenza aviaria é uma infecção causada pelo vírusinfluenza (gripe). Estes vírus influenza ocorremnaturalmente entre aves. Aves selvagens de distribuiçãomundial carregam os vírus em seus intestinos e sãousualmente assintomáticos. Entretanto, influenza aviaria émuito contagiosa entre aves e pode deixar algumas avesdomésticas, incluindo galinhas, patos e perus, muitodoentes causando morte.
Aves infectadas possuem vírus influenza em sua saliva,secreções nasais e fezes. Aves susceptíveis se tornaminfectadas quando elas entram em contato com secreções ouexcreções contaminadas ou com superfícies que estãocontaminadas com secreções ou excreções de avescontaminadas. Aves domésticas podem se tornar infectadoscom o vírus influenza através de contato direto com aveaquática infectada ou outra ave doméstica infectada, ouatravés de contato direto com superfícies (tais comosujeira ou gaiolas) ou materiais (tais como água ou comida)que foram contaminados com o vírus.
Infecção por vírus influenza aviaria em avesdomésticas causa duas principais formas de doenças que sãodistinguidas por baixos e altos extremos de virulência. Aforma "pouco patogênica" pode seguir indetectada eusualmente causa apenas sintomas brandos (tais como plumasonduladas e uma queda na produção de ovos). Entretanto, aforma altamente patogênica se espalha mais rapidamenteatravés do bando de aves domésticas. Esta forma pode causardoença que afeta múltiplos órgãos internos e possui umataxa de mortalidade que pode alcançar 90-100%freqüentemente dentro de 4 8 horas. Desta maneira, opotencial para enorme perda econômica para fazendas de avesdomésticas pode ser dramaticamente reduzido se existiremmétodos de criar aves domésticas resistentes à gripeaviaria. Estas aves domésticas resistentes podem sercriadas para gerar uma nova espécie de aves domésticas quepassariam sua resistência viral de geração em geração.
O mercado global de aves domésticas é estimado paraproduzir mais de 50 bilhões de cabeças de aves domésticaspor ano. Desta maneira, ainda mais significante, ahabilidade de criar animais resistentes a vírus, tais comoaves domésticas, pode prevenir o espalhamento do terrívelvírus da "gripe aviaria" para humanos, então evitando umapandemia de gripe aviaria em humanos.
Outros tipos de doenças virais existem que são tambémproblemáticas para a indústria de aves domésticas. Doençade Marek, por exemplo, freqüentemente causa severa perdacom mortes de filhotes do bando e tem sido a maior causa decondenação no local de processamento do abate. Doença deMarek é uma doença linfoproliferativa causada pelo vírus MD(MDV) pertencente à família herpesvírus e tem sido oprincipal problema para a indústria de aves domésticasdurante os últimos 50 anos. Três sorotipos de linhagens MDVsão reconhecidos. Todas linhagens oncogênicas sãoclassificadas como sorotipo 1 (MDV) enquanto as linhagensnaturalmente não oncogênicas e herpesvírus de perus (HVT)pertencem aos sorotipos 2 (MDV-2) e 3, respectivamente. Asperdas econômicas anuais devido à doença de Marek pelomundo estão estimadas de estarem na faixa de bilhão dedólares americanos anualmente mesmo com as vastas campanhasde vacinação. Apesar das campanhas de vacinação, teremreduzido o número de bandos afetados pelo mundo há um altonúmero de epidemias da doença em diversas partes do mundo,as quais clamam por melhores métodos para controle dadoença.
Há números limitados de doenças virais que podem sertratadas com sucesso. Correntemente, vacinação é o únicométodo utilizado para combater doenças virais em animais.Em muitos casos, particularmente em doenças virais de gado,esta abordagem não é aplicável devido à inabilidade deproduzir vacinas altamente eficazes. Outra razão para aineficácia de algumas vacinas é a alta taxa de mutação,resultando na deriva antigênica ou perda da eficiência davacina. Uma vez que a vacina tenha perdido sua eficácia, adoença pode emergir e ser capaz de impor grandes perdaseconômicas no caso das doenças virais de aves domésticas egado.
Há duas formas clássicas de vacina; uma é vacina vivaatenuada, a qual é a mais potente porque induz tanto armashumorais e celulares do sistema imune. A desvantagem destetipo de vacina é o risco do reaparecimento de mutantes deescape altamente virulentos. Por esta razão, muitos paísessão relutantes em aprovar a utilização deste tipo devacina. O segundo tipo é vacina viral inativada, a qual é,em muitos casos, muito menos eficaz uma vez que apenasinduz o sistema imune humoral. Nos últimos poucos anos,diversos tipos de vacinas recombinantes tais como vacinasde subunidades e vacinas de DNA foram desenvolvidas.Infelizmente, a maioria delas não está em larga utilização.Uma das desvantagens da vacinação é o alto gasto econômicoanual como demonstrado no caso da Doença de Marek. Deacordo com a Organização para Saúde Animal (OIE), o númerototal de animais que foram vacinados contra a doença deMarek em 2002 foi 2,457 bilhões. Veja, por exemplo,<www.oie.com>.
Há duas maneiras conhecidas de vacinar. O primeirométodo é uma forma livre de célula (liofilizada) custandoaproximadamente U$3/1000 unidades. A segunda forma é umaforma associada à célula ("úmida") custando aproximadamenteU$8/1000 unidades. O dispêndio mundial estimado emvacinação para a doença de Marek em 2002 foiaproximadamente entre U$4,7 bilhões a U$19,7 bilhões.
Desde o início dos anos 70 a maioria das galinhas temsido vacinada contra MD utilizando linhagens do sorotipo 1atenuadas ou HVT. Iniciando em 1983 combinações bivalentese trivalentes vem sendo utilizadas para proteger contra asmais virulentas linhagens de campo. Apesar da vacinação sernotavelmente eficaz em proteger galinhas, MD continua emalta na lista de prioridades das doenças. A principal razãopara a alta prioridade é a evolução contínua das linhagensMDV para o aumento da virulência causando ruptura navacina.
Por conseguinte, há uma necessidade por um método deprevenção ou diminuição da transmissão de doenças virais emanimais, por exemplo, na influenza aviaria e doença deMarek em aves domésticas. Dada a corrente epidemia do vírusda influenza aviaria, existe uma forte necessidade pormétodos que posam criar animais modificados geneticamente,tais como aves domésticas, que sejam resistentes ainfecções virais, tais como influenza aviaria.
Na década passada, uma nova abordagem para inativaçãogênica via silenciamento gênico, chamada "RNA deinterferência" (RNAi) foi divulgada. Veja, por exemplo,Fire et al. , fature 391:806-811 (1998) e Patente E.U.A.6,506,559. RNA de interferência refere-se a um evento oqual ocorre quando um polinucleotídeo de RNA atua atravésde processos celulares endógenos para supressarespecificamente a expressão de um gene cuja seqüênciacorresponde àquela do RNA. O silenciamento do gene alvoocorre através da degradação do RNAm pelo RNA dupla fita(ds) pelo animal hospedeiro, as vezes através da digestãoEndonuclease RNAase III. A digestão resulta em moléculasque são aproximadamente 21 a 23 nucleotídeos (ou bases) emcomprimento (ou tamanhoO apesar do peso molecular poder sertão grande quanto 3 0 bases.
Estas espécies de RNA curto medeiam a degradação dasmensagens de RNA e transcritos correspondentes,possivelmente via um complexo de RNAi nuclease, chamado decomplexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), o qualauxilia os dsRNAs curtos a reconhecerem mRNAscomplementares através de interações com pares de bases.Seguindo a interação do siRNA com seu substrato, o mRNA setorna alvo para degradação, talvez por enzimas que estãopresentes no RISC. Este tipo de mecanismo parece ser maisútil para os organismos em inibir infecções virais,movimento do transposon e fenômenos similares e pararegular a expressão de genes endógenos. Atividade do RNAitambém foi documentada em plantas, insetos, nematódeos evertebrados entre outros organismos. Para informação geraldo fundamento, veja, por exemplo, Schutz et al. , Virology344 (1):151-7 (2006); Leonard et al. , Gene Ther. 13(6): 532-40 (2006); Colbere-Garapin et al. , Microbes Infect.7(4):767-75 (2005); Wall, Theriogenology 57(1):189-201(2002); El-Bashir, et al. , Nature 411: 494-498 (2001);Fire, A., et al. , Science 391:806-811 (1998); Gitlin etal., fature 418:430-434 (2002); Gitlin et al., J". Virol.79:1027-1035 (2005); Kahana, et al. , J. Gen. Virol. 85,3213-3217 (2004); Kronke et al. , J. Virol. 78:3436-3446(2004); Leonard et al. , J. Virol. 79:1645-1654 (2005) eYokota, et al. , EMBORep. 4:602-608 (2003).
Dado a globalidade do problema de diversas doençasvirais em animais, aves domésticas em particular, umaabordagem diferente para efetivamente controlar doençasvirais em aves domésticas e gado seria muito benéfica pararesolver este problema. Desta forma, a invenção divulgadaaqui fornece uma solução para este problema pelofornecimento de métodos para criação de vertebrados nãohumanos transgênicos, por exemplo, aves domésticas e gado,carregando e expressando moléculas alvo para bloquearfunções virais importantes que irão inibirsignificativamente replicação viral de vírus patogênicosassim como as aves domésticas e gado geneticamentemodificados por eles mesmos.
BREVE RESUMO DA INVENÇÃO
Esta invenção fornece células germinativas codificandopara siRNA que tem como alvo seqüências virais e métodospara obtenção do mesmo. A invenção também fornecevertebrados não humanos que são resistentes à infecçãoviral e métodos para obtenção dos mesmos.
Em um aspecto, a invenção é uma célula germinativa deum vertebrado não humano contendo uma construçãocompreendendo uma seqüência codificando um siRNA para umaregião conservada do genoma viral, onde a seqüência estáoperacionalmente ligada a um promotor. Em uma modalidade, aconstrução compreende seqüências codificando múltiplossiRNAs para o genoma viral. Em outra modalidade, a célulacontém múltiplas construções compreendendo uma seqüênciacompreendendo múltiplos siRNAs para regiões conservadas dogenoma viral, onde a seqüência está operacionalmente ligadaa um promotor. Em outra modalidade, o vertebrado é ummamífero não humano. Em outra modalidade, o vírus é umvírus da febre aftosa (FMDV). Em outra modalidade, aseqüência conservada é selecionada a partir do grupoconsistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.Em outra modalidade, o vertebrado é uma espécie aviaria. Emoutra modalidade, o vírus é um vírus influenza aviaria. Emoutra modalidade, a seqüência conservada é selecionada apartir do grupo consistindo das seqüências nas Figuras 1-16. Em outra modalidade, o vírus é um vírus da doença deMarek (MDV). Em outra modalidade, a célula germinativa éespermatozóide.
Em outro aspecto, a invenção fornece um vertebrado nãohumano que é resistente a uma doença viral, onde a maioriadas células no vertebrado compreende uma seqüênciacodificando um siRNA para uma região conservada de umgenoma de um vírus causador de uma doença, onde a seqüênciaestá operacionalmente ligada a um promotor. Em umamodalidade, a construção compreende seqüências codificandomúltiplos siRNAs para regiões conservadas do genoma viral.Em outra modalidade, a célula contém múltiplas construçõescompreendendo uma seqüência codificando múltiplos siRNApara regiões conservadas do genoma viral. Em outramodalidade, o vertebrado é um mamífero não humano. Em outramodalidade, a doença viral é FMDV. Em outra modalidade, aseqüência conservada é selecionada a partir do grupoconsistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.Em outra modalidade, o vertebrado é uma espécie aviaria. Emoutra modalidade, o vírus é vírus influenza aviaria. Emoutra modalidade, a seqüência conservada é selecionada apartir do grupo consistindo de seqüências das Figuras 1-16.Em outra modalidade, o vírus é MDV.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método degeração de célula germinativa de um vertebrado não humanocompreendendo incubação da célula germinativa com umaconstrução compreendendo uma seqüência codificando um siRNApara uma região conservada ou um genoma viral onde aseqüência esteja operacionalmente ligada a um promotor sobcondições que fazem com que a construção seja levada paradentro da célula. Em uma modalidade, a construção estáintegrada no genoma da célula hospedeira.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método parageração de um vertebrado não humano que é resistente adoença viral compreendendo (a) incubação da célulagerminativa com uma construção compreendendo uma seqüênciacodificando um siRNA para uma região conservada ou umgenoma viral onde a seqüência está operacionalmente ligadaa um promotor sob condições que formam uma célula diplóidee (b) incubação da célula diplóide (a) sob condições queesta forma um vertebrado não humano.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figuras 1-8 mostram as seqüências da influenza aviariaH5N1 que podem ser utilizadas para genoma 7 desta linhagemde influenza aviaria.
Figuras 9-12 mostram as seqüências da influenzaaviaria H5N1 que podem ser utilizadas para genoma 1 destalinhagem de influenza aviaria.
Figuras 13-16 mostram as seqüências da influenzaaviaria que podem ser utilizadas para genoma 5 destalinhagem de influenza aviaria.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece animais que sãoresistentes a infecções virais e métodos para criar estestipos de animais transgênicos. Os genes virais alvo serãosilenciados pela presença de moléculas silenciadoras, taiscomo moléculas siRNA divulgadas aqui e, desta maneira,serão capazes de realizar seu papel no ciclo de vida viral.O surgimento deste processo será um significante bloqueioda replicação viral levando a inabilidade da infecção ainduzir morbidade e/ou mortalidade nestes animais. Destamaneira, esta invenção terá um efeito econômico substancialpara os produtores assim como para a sociedade como um todogarantindo constante suprimento de carne e outros produtosdo gado.
A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado de outra forma, técnicas convencionais de biologiamolecular (incluindo técnicas recombinantes) ,microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia,as quais estão dentro da habilidade da arte. Tais técnicasestão explicadas inteiramente na literatura, tal como,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição(Sambrook et al. , 1989) Editora Cold Spring Harbor;Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed. , 1984); AnimalCell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Methods inEnzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of ExperimentalImmunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P.Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The PolymeraseChain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); CurrentProtocols in Immunology (J.E. Coligan et al. , eds., 1991) eShort Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons,1999) .
Todas as referências, patentes e aplicações depatentes citadas nesta aplicação de patente estão aquiincorporadas por referência, cada qual em sua respectivatotalidade para todos os propósitos.
Definições
Todos os termos científicos e técnicos utilizadosnesta aplicação possuem significados comumente utilizadosna arte a menos que especificado de outra forma. Comoutilizado nesta aplicação, as seguintes palavras ou frasespossuem os significados especificados.
Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico",utilizados intercambiavelmente aqui, referem-se a uma formapolimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, tantoribonucleotídeos ou deoxiribonucleotídeos. Estes termosincluem um DNA simples, dupla ou tripla fita, DNA genômico,cDNA, RN A, híbrido DNA-RNA ou um polímero compreendendobases purina e pirimidina ou outras bases nucleotídicasnaturais, quimicamente, bioquimicamente modificadas, nãonaturais ou derivadas.
Um "promotor" é uma seqüência controle que é umaregião de uma seqüência polinucleotídica cuja iniciação etaxa de transcrição são controladas. Esta pode conterelementos genéticos às quais proteínas e moléculasregulatórias podem se ligar tais como RNA polimerase eoutros fatores de transcrição. Promotores podem serconstitutivos, indutíveis, repressíveis ou tecido-específicos, por exemplo. As frases "operacionalmenteligado", "operacionalmente posicionado", "operativamenteligado", "sob controle" e "sob controle transcricional"significam que um promotor está em uma localização e/ouorientação funcional correta em relação a uma seqüência deácido nucleico para controlar iniciação transcricional e/ouexpressão desta seqüência. Um promotor pode ou não pode serutilizado em conjunto com um "acentuador", o qual se referea uma seqüência regulatória que atua em eis envolvida naativação transcricional de uma seqüência de ácido nucleico.Um promotor pode regular a expressão de um ou mais genes.
Alvos de RNAi
A invenção fornece métodos para silenciamento de genestais que animais resistentes a vírus podem ser produzidos.
Em uma modalidade, a invenção utiliza tecnologia desilenciamento de genes, tais como RNAi, associadas comlipofecção para criar aves domésticas e gado internamenteimune transgênicos. Em uma modalidade preferida, a invençãoutiliza Integração Mediada por Enzima de Restrição("REMI"), como divulgado, por exemplo, na WO 99/42569, paracriar animais resistentes a vírus. Os animais carregarão eexpressarão uma única ou múltiplas moléculas silenciadorasde genes com alvo de genes virais (por exemplo, genesvirais indispensáveis para replicação).
O RNA de interferência curta ("siRNA") fornecido pelapresente invenção permite a modulação e/ou a atenuação daexpressão do gene alvo quando tal gene está presente ecapaz de ser expresso dentro de uma célula. Modulação daexpressão pode ser parcial, mais preferencialmente umacompleta inibição, da função gênica ou mesmo a regulaçãopositiva de outro, genes alvos secundários ou o acentuadorda expressão de tais genes em resposta a inibição do genealvo primário.
Atenuação da expressão gênica pode incluir a supressãoou inibição completa ou parcial da função gênica,processamento do transcrito ou tradução do transcrito. Nocontexto do RNA de interferência, modulação da expressãogênica é acreditada de acontecer através de um complexo deproteínas e RNA, especificamente incluindo pequeno, dsDNAque pode atuar como um RNA "guia" . O siRNA, porconseguinte, é acreditado como sendo específico quando suaseqüência nucleotídica corresponde suficientemente a, pelomenos, parte da seqüência nucleotídica do gene alvo. Apesarda presente invenção não ser limitada por esta hipótese mecanista, é altamente preferido que a seqüência denucleotídeos no siRNA seja substancialmente idêntica a,pelo menos, uma porção da seqüência do gene alvo. Em umamodalidade, a identidade de seqüência entre o nucleotídeoviral alvo e o siRNA é 100%, ou seja, homologia exata. Emoutra modalidade, há um par de base (pb) de diferença. Emoutra modalidade, há 2 pares de base de diferença. Em outramodalidade, há uma diferença de 3 pares de base.
Um "gene alvo" ou "seqüência alvo" geralmentesignifica um polinucleotídeo compreendendo uma região que codifica um produto gênico, tal como um polipeptídeo ou umaregião polinucleotídica que regula replicação, transcriçãoou tradução ou outros processos importantes para aexpressão do polipeptídeo ou um polinucleotídeocompreendendo tanta uma região que codifica um polipeptídeoe uma região operacionalmente ligada nesta que regulaexpressão. A seqüência alvo não deve necessariamentecodificar para o produto gênico inteiro. No contexto dainvenção, "operacionalmente ligado" se refere ao promotorestando na localização e/ou orientação funcional correta em
relação a uma seqüência polinucleotídica para controlariniciação e/ou expressão desta seqüência.
Em um aspecto, os genes alvo para o siRNA são genesvirais. Em uma modalidade, os genes virais são aquelesenvolvidos na propagação das doenças virais aviárias (porexemplo, influenza aviaria e doença de Marek). Seqüênciasgênicas as quais estão compreendidas dentro do escopo destainvenção incluem aquelas mostradas nas Figuras 1-16.
O siRNA possui um comprimento suficiente para bloquearsignificativamente replicação viral mas não para causardestruição celular e está usualmente na faixa de entreaproximadamente 19 pares de base a aproximadamente 27 paresde base (pb) . Em uma modalidade, o siRNA tem 21 pb decomprimento. Em uma modalidade, o siRNA tem 22 pb decomprimento. Ainda em outras modalidades, os siRNA têm 19,20, 23, 24, 25, 26 ou 27 pb de comprimento. Ainda em outrasmodalidades, os siRNA têm 28,29 ou 30 pb de comprimento.Será aparente daquele habilitado na arte que o comprimentodo siRNA não pode ser muito longo porque este irádesencadear um tipo de mecanismo de auto-destruição para a célula na qual o siRNA reside. Por exemplo, Elbashir et al.ensina que um comprimento de 21 pb em comprimento é eficazem invadir os mecanismos antivirais da célula, tais comoresposta a interferon (veja Elbashir et al., Nature411:494-498 (201)).
Como mostrado nas Figuras 1-16, comprimentos variáveispodem ser utilizados como RNA de interferência. Umamodalidade preferida é 21 pb em comprimento. Alguém dehabilidade na arte pode utilizar as seqüênciasrepresentadas nas Figuras 1-16 e mover passo a passo para baixo da seqüência um par de base por vez para obter umsiRNA diferente de 21 pb.algumas das permutações estãomostradas nestas figuras. Entretanto, nem todas asseqüências possíveis de 21 pb do siRNA estão mostradasporque uma vez que a seqüências geral foi mostrada, comofeito nas Figuras 1-16, seria rotineiro para alguémhabilitado na arte para mover passo a passo ao longo daseqüência. Além disso, outros comprimentos além de 21 pbestão também compreendidos dentro desta invenção. Comodiscutido acima, em uma modalidade, o siRNA é aproximadamente 21 pb a aproximadamente 27 pb emcomprimento. Um artesão habilitado utilizaria as seqüênciasdivulgadas nas figuras 1-16 e utilizaria o comprimentodesejado e moveria ao longo da seqüência um PB por vez paragerar um quadro diferente. Por exemplo, se um siRNA de 23pb fosse para ser feito, então um artesão habilitadocomeçaria em uma extremidade da seqüência e utilizaria osprimeiros 23 pb como uma permutação de um siRNA. Então,ele/ela moveria um par abaixo da seqüência e os próximos 23pb seriam a próxima permutação e assim por diante.
Dados de seqüência, tanto determinadosexperimentalmente ou acessíveis a partir de banco de dadospúblicos podem ser varridos por ferramentas debioinformática. Análise de homologia é realizada pelautilização de programas disponíveis publicamente ou disponíveis comercialmente (por exemplo, programas PILEUP ePRETTY no pacote GCG) . Pesquisas de homologia sãoopcionalmente conduzidas com seqüências publicamentedisponíveis (por exemplo, Genebank) utilizando os programasPILEUP e PRETTY ou programa FASTA (Pearson et al. , PNAS 85:2444-2448 (1998)).Seqüências de genes virais, especialmente aquelas queafetam saúde e segurança dos animais, estão contempladascomo genes alvos nesta invenção. As seqüências viraisideais que servem como alvo são aquelas que são altamenteconservadas. O alto grau de conservação geralmente é umaindicação de pressão seletiva para não mudar para diferenteda seqüência conservada. Para muitos vírus, genes nãoestruturais tendem a ser altamente conservados entre osseus diversos sorotipos e, por conseguinte, são bons alvos para tecnologia de RNAi. Outros genes virais que também sãobons alvos são aqueles genes que são importantes ouessenciais para replicação viral e subseqüente propagação.Em um aspecto, o gene estrutural (S) do vírus Akabane éutilizado para criar siRNA.
Em outros aspectos, seqüências alvo são trechos curtosde seqüências que são conservadas entre diferenteslinhagens de influenza aviaria. Em uma modalidade, aseqüência utilizada para siRNA é do genoma 1 da linhagemH5N1 do vírus da influenza aviaria. Exemplos não limitantes disto estão mostrados nas Figuras 9-12. 0(s) nucleotídeo(s)em negrito indica(m) onde uma diferença no par de base foidetectada quando uma análise de homologia foi conduzida. Emoutra modalidade, a seqüência alvo utilizada para siRNA édo genoma 5 da linhagem H5N1 do vírus da influenza aviaria.
Exemplos não limitantes disto estão mostrados nas Figuras13-16. Em outra modalidade, a seqüência alvo utilizada parasiRNA é do genoma 7 da linhagem H5N1 do vírus da influenzaaviaria. Exemplos não limitantes disto estão mostrados nasFiguras 1-8. Em outras modalidades, as seqüências alvo são de outros tipos de genomas H5N1. Além disso, siRNA paracombater outras linhagens de influenza aviaria (porexemplo, H5N2, H5N3, etc.) estão também compreendidasdentro do escopo desta invenção e podem ser feitas por umartesão habilitado pelas seguintes instruções dadas aqui.
Em outro aspecto, trechos conservados do vírus dafebre aftosa (FMDV) são utilizados como seqüências alvopara construção de siRNA. Ainda em outros aspectos, listanão limitante dos vírus os quais causam as seguintesdoenças são utilizados como seqüências alvo para construção de siRNA: doença de Newcastle, febre do Oeste do Nilo,fowlpox, bronquite infecciosa aviaria, encefalomieliteaviaria, leucose aviaria, hepatite viral de pato, enteriteviral de pato, doença de pele grumosa, rinotraqueíteinfecciosa bovina, vírus da diarréia bovina, leucose bovina, febre do Vale Rift, peste da pele, língua azul,peste de pequenos ruminantes (PPR), pox de ovelha e pox decabra, dermatite pustular contagiosa (ectima), doença dafronteira, Maedi-visna, Gastro Enterite transmissível(TGE), influenza eqüina, doença de cavalo Africana,encefalomielite venezuelana eqüina e viremia primaveral dacarpa.
Construções Codificando siRNA
Construções codificando siRNA envolvem diversoscomponentes incluindo, mas não se limitando a, promotores e seqüências as quais irão "guiar" o siRNA para o alvocorreto na célula. Promotores os quais podem ser utilizadosincluem, mas não se limitam a, promotores da RNA polimeraseII e RNA polimerase III. Promotores da RNA pol IIItrabalham especialmente bem como promotores para a construção de siRNA. Exemplos não limitantes de promotores(tanto pol II e pol III) os quais podem ser utilizadosincluem: RNA 5S ribossomai (r) , U6 de rato, U6 humano, HIde rato, HI humano, promotor de citomegalovírus, ubiquitinaC de galinha, promotor de 7SK humano, promotor de U6bovino, promotor de U6 de galinha, gene da proteína 3 8 kdfosforilada (pp38) da doença de Marek, mRNA de 1,8-kb degalinha, humana, beta-actina bovina, promotor PRL degalinha, genes promotores de SPATA4 de galinha, promotor dePoli de galinha, promotor do gene US1 do vírus da doença deMarek, gene da subunidade pequena da ribonucleotídeoredutase do vírus da doença de Marek, vírus da leucemia esarcoma aviaria LTR, RSV-LTR, promotores sintéticos depoxvírus, promotor Pll do vírus vaccínia, vírus vaccíniaP174 e P190, promotor P.E/L inicial/tardio de fowlpox, promotor da timidina quinase do vírus fowlpox, promotorp7.5 de vaccínia e promotor PFL1 de fowlpox.
Utilizando técnicas padrão de biologia molecular,estes promotores estão operativãmente ligados às seqüênciasque terão como alvo genes virais e silenciarão as mesmas.
Um promotor pode regular a expressão de um ou maisseqüências alvos. 0(s) promotor(es) e a(s) seqüência(s)viral(is)estão clonados em vetores padrão de clonagem ouexpressão. Como utilizado aqui, "vetor" se refere amoléculas de ácido nucléico que são capazes de distribuiroutras seqüências de ácido nucléico para uma célula.Vetores podem ser derivados de plasmídeos, bacteriófagos,plantas ou outros vírus de animais.
As construções de siRNA são feitas tais que elas sejamcapazes de expressar o siRNA. O artesão habilitado entenderá que certos tipos de promotores regularão aexpressão de siRNA melhor em alguns vertebrados do que emoutros vertebrados, dependendo da fisiologia do vertebradoe deve seguir etapas para utilização do promotor que sejamais apropriado para o vertebrado. Um promotor pode tambémregular a expressão de um ou mais siRNA. Um vetor podeconter seqüências que codificam para um ou mais siRNAs.Acentuadores, marcadores seletivos e outras ferramentasmoleculares padrão podem também ser utilizadas parafacilitar manipulação molecular. Quando utilizar a técnica de REMI, o vetor deve ser construído tal que este facilitea utilização da técnica de REMI. Guia apropriado para essatécnica é encontrado na WO 99/42569.
Em um aspecto da invenção, um vetor pode ser utilizadocom diversos genes siRNA que correspondem a diferentesalvos no genoma viral. Este tipo de construção vetorassegura significante a completa inibição devido à clivagemsimultânea em diversos sítios. Além disso, este estaráainda ativo mesmo se uma das seqüências virais alvo mute oumude. Para o siRNA fita dupla, é possível ter a sobreposição de 2 pb padrão, assim como uma sobreposição de1 pb ou não haver sobreposição.Construção das Células Germinativas
Como utilizado aqui, uma "célula germinativa" édefinida como células espermatozóides e óvulos e seusprecursores. Células germinativas são haplóides e possuemapenas um conjunto de cromossomos enquanto outras célulasnão germinativas possuem dois conjuntos de cromossomos. Apresente invenção fornece construção de uma célulagerminativa de um vertebrado não humano contendo uma construção a qual compreende uma seqüência codificando umsiRNA para uma região conservada de um genoma viral, onde aseqüência está operacionalmente ligada a um promotor. Acélula germinativa pode conter uma construção quecompreende seqüências codificando múltiplos siRNAs para ogenoma viral. Exemplos de seqüências virais as quais podemser utilizadas estão descritas supra. Em uma modalidade, aseqüência do vírus é do vírus da febre aftosa (FDMV). Emoutra modalidade, a seqüência viral é vírus da influenzaaviaria.
A invenção fornece um método de geração uma célulagerminativa de um vertebrado não humano onde a célulagerminativa contém uma construção contendo uma seqüênciacodificando um siRNA para uma região conservada de umgenoma viral. Para praticar o método da invenção, alguémhabilitado na arte poderia incubar a célula germinativa comuma construção compreendendo seqüência codificando um siRNApara uma região conservada ou um genoma viral onde aseqüência está operacionalmente ligada a um promotor sobcondições que levam a construção a ser levada para dentro da célula. Em uma modalidade, a construção está integradadento do genoma da célula hospedeira utilizando atecnologia REMI.
Em um aspecto, a célula germinativa contém múltiplasconstruções compreendendo uma seqüências seqüênciacodificando múltiplos siRNAs para regiões conservadas dogenoma viral, onde a seqüência está operacionalmente ligadaa um promotor. Em outra modalidade, a célula germinativa deum vertebrado não humano é um não humano mamífero. Exemplosnão limitantes de vertebrados incluem galinha, pato, ganso, ave de capoeira, gado, vacas, porco, peixe, ovelha, cabrase cavalos. Em outra modalidade, o vertebrado é de umaespécie aviaria. Em outro aspecto, a célula germinativacontém um vetor contendo diversos genes sob o controle dediferentes promotores.
Em uma modalidade, a célula germinativa contém umaconstrução compreendendo uma seqüência codificando um siRNAo qual tem como alvo o Vírus da Febre aftosa (FMDV) .Exemplos de tais seqüências alvo são: i) 5'-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-3' (SEQ ID NO: 1) nos nt 4900-4922,localizada na região 3B; (ii) 5'-
GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3' (SEQ ID NO:2) no nt 6934-6992, localizada naregião 3D e (iii) 5'- GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-3 1 (SEQ IDNO: 3) no nt 6892-6917, localizada na região 3D. Todas asposições se referem ao FMDV sorotipo 01 (G) seqüência(GenBank acesso no. AF189157).
Em um aspecto, a célula germinativa contém umaconstrução compreendendo uma seqüência codificando um siRNAa qual tem como alvo influenza aviaria. Em modalidades deste aspecto, a célula germinativa contém uma construção
onde a seqüência conservada é selecionada a partir dequaisquer das seqüências descritas nas Figuras 1-16.
Em outro aspecto, a célula germinativa contém umaconstrução compreendendo uma seqüência codificando um siRNA o qual tem como alvo o vírus da doença de Marek (MDV) . Emquaisquer dos acima, a célula germinativa é espermatozóide.Construção de Animais Transgênicos
Construções como descritas acima são entãointroduzidas em células animais pela utilização de qualquer número de técnicas padrão, por exemplo, lipofecção.Entretanto, algumas das técnicas mais antigas, tais comolipofectina, produzem uma taxa de sucesso muito baixa. Osinventores encontraram que um caminho superior de gerarintrodução bem sucedida destas construções codificandosiRNA é utilizar integração mediada por enzimas derestrição ("REMI"), como ensinado na WO 99/42569. Porconseguinte, em uma modalidade, um polinucleotideocodificando siRNA é introduzido em células germinativasanimais (por exemplo, espermatozóides) utilizando REMI.
Estes animais transgênicos podem ser criados para gerar umestoque inteiro de animais resistentes a vírus. No caso deaves domésticas, os vírus que siRNA tem como alvo, incluemmas não se limitam a, doença de Marek, doença infecciosabursal e influenza aviaria.
O número de siRNA introduzido em uma célula animal(por exemplo, célula germinativa) pode variar. Em umamodalidade, uma construção de siRNA é introduzida. Em outramodalidade, um ou mais siRNA é introduzido. Um artesãohabilitado entenderá que diferentes combinações de siRNApodem ser introduzidas baseadas na doença viral a sertratada.
A invenção fornece a geração de um vertebrado nãohumano que é resistente a uma doença viral, onde a maioriadas células no vertebrado compreende uma seqüência codificando um siRNA para uma região conservada de umgenoma de um vírus causador da doença, onde a seqüênciasestá operacionalmente ligada a um promotor. Exemplos deseqüências virais estão discutidos supra. Em umamodalidade, a construção compreende seqüências codificando múltiplos siRNAs para regiões conservadas do genoma viral.Em outra modalidade, as células contendo múltiplasconstruções compreendendo uma seqüência codificandomúltiplos siRNAs para regiões conservadas do genoma viral.Em outra modalidade, o vertebrado não humano é umvertebrado não humano mamífero.
Em uma modalidade, a maioria das células no vertebradonão humano contém uma construção compreendendo umaseqüência codificando um siRNA o qual tem como algo o Vírusda Febre Aftosa (FMDV). Exemplos de tais seqüências alvosão: i) 5 1-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-3 ' (SEQ ID NO: 1) nos nt4900-4922, localizada na região 3B; (ii) 5'-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-31 (SEQ ID NO:2) no nt 6934-6992, localizada naregião 3D e (iii) 5'- GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-3 1 (SEQ IDNO:3) no nt 6892-6917, localizada na região 3D. Todas asposições se referem ao FMDV sorotipo 01 (G) seqüência(GenBank acesso no. AF189157).
Exemplos não limitantes de vertebrados não humanosincluem galinha, pato, ganso, ave de capoeira, gado, vacas, porco, peixe, ovelha, cabras e cavalos. Em outra
modalidade, o vertebrado é de uma espécie aviaria. Ainda emoutro aspecto, o vertebrado não humano possui célulascontendo uma construção codificando siRNA onde a seqüênciaconservada é selecionada a partir de quaisquer seqüênciasdescritas nas Figura 1-16. Ainda em outra modalidade, overtebrado não humano é resistente a MDV.
A invenção fornece método para geração de umvertebrado não humano que é resistente a doença viralcompreendendo as etapas de: (a) incubação da célula germinativa descrita supra sob condições que formam umacélula diplóide e (b) incubação da célula diplóide (a) sobcondições que esta forma um vertebrado não humano.
A invenção também contempla geração de um vertebradonão humano resistente a doenças virais por meios declonagem. Nestes casos, um ou mais siRNA seriam inseridosno genoma da célula a ser clonada. Diversos métodos destatecnologia estão disponíveis comercialmente, por exemplo,protocolos de transplante nuclear de Tecnologia CelularAvançada.
Aplicações
A invenção fornece aqui um método para criação de avesdomésticas que são resistentes a doenças virais. Estasdoenças incluem, mas não se limitam a, doença de Newcastle,febre do Oeste do Nilo, fowlpox, bronquite infecciosaaviaria, encefalomielite aviaria, leucose aviaria, hepatiteviral de pato e enterite viral de pato.
A invenção fornece aqui um método para criação de gadoque são resistentes a doenças virais. Estas doençasincluem, mas não se limitam a, doença de pele grumosa,rinotraqueíte infecciosa bovina, vírus da diarréia bovina,leucose bovina, febre do Vale Rift, peste da pele e línguaazul.
A invenção fornece aqui um método para criação deovelha e cabra que são resistentes a doenças virais. Estasdoenças incluem, mas não se limitam a, peste de pequenosruminantes (PPR), pox de ovelha e pox de cabra, dermatitepustular contagiosa (ectima), doença da fronteira, línguaazul, Maedi-visna e febre do Vale Rift.
A invenção fornece aqui um método para criação de cavalos que são resistentes a doenças virais. Estas doençasincluem, mas não se limitam a, influenza eqüina, doença decavalo Africana, encefalomielite venezuelana eqüina.
A invenção fornece aqui um método para criação depeixe que é resistente a doenças virais. Estas doençasincluem, mas não se limitam a, viremia primaveral da carpa.
A invenção pode ser aplicada a porcos para criarresistência contra doença da febre clássica de suínos,doença da febre suína africana, gastroenteritetransmissível (TGE) e febre aftosa. Em geral, as instruçõesaqui podem ser geralmente aplicadas para qualquer animalque esteja susceptível a doença viral.
No caso da ampla indústria de aves domésticas quesofre para sustentar grandes perdas econômicas devido àdoença, a solução prática consiste na implementação datecnologia siRNA para criar abatedouro e berçáriosresistentes à influenza aviaria e doença de Marek, doençainfecciosa da bursa e outros vírus aviários. A utilizaçãodesta invenção divulgada aqui fornece uma fonte segura deaves domésticas para consumidores e para população em geralcomo espalhamento de vírus aviários de aves para humanos écessado.
Os seguintes são fornecidos para ilustrar, mas nãopara limitar, a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Criação de Animais Resistentes a Febre Aftosa
Animais transgênicos susceptíveis a doença febreaftosa são gerados pela inserção de siRNA construído apartir de seqüências virais do vírus da doença febre aftosa(FMDV) em células germinativas dos animais. Geralmente, animais os quais são susceptíveis à FMDV são animais decasco dividido em dois.
Construção de siRNA para Febre Aftosa
Para construir o siRNA, a seqüência viral alvo éprimeiro identificada. De uma forma isto pode viracompanhado pela realização de análise de homologia localnas seqüências FMDV de diferentes linhagens ou sorotipos eidentificando trechos curtos de homologia de seqüência. Emuma modalidade, a homologia é 100%, ou seja, exatamente amesma seqüência pertence a todos os sorotipos. Em outra modalidade, a diferença em 1 ou 2 pares de base é vista.Análise de homologia é realizada pela utilização deprogramas disponíveis publicamente ou disponíveiscomercialmente (por exemplo, programas PILEUP e PRETTY nopacote GCG). Pesquisas de homologia são opcionalmenteconduzidas com seqüências publicamente disponíveis (porexemplo, Genebank) utilizando os programas PILEUP e PRETTYou programa FASTA (Pearson et al. , PNAS 85:2444-2448(1998)) .
Uma vez que trechos curtos de homologia são identificados, siRNA são sintetizados utilizando serviçosdisponíveis comercialmente. siRNA são sintetizados emdiversos comprimentos. Alguns siRNAs são 19 pb emcomprimento, enquanto outros são 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26ou 27 pb em comprimento. Cada um destes siRNAs são tanto 100% conservados entre os sorotipos ou possuem 1-2 pb dediferença em cada siRNA. Estas seqüências conservadas estãooperativamente ligadas a, pelo menos, um promotor em umvetor apropriado para distribuição a uma célulagerminativa. Outra alternativa é utilizar siRNA que já havia sido sintetizado, veja, por exemplo, o siRNAdivulgado em Kahana, et al. , J. Gen. Virol. 85, 3213-3217(2004).
Estas construções de siRNA são então inseridas emcélulas germinativas (por exemplo, espermatozóide ou ova)de animais com o casco dividido em dois utilizando atécnica REMI divulgada na WO 99/42569 para produzir umacélula germinativa com siRNA estavelmente integrado. Ascélulas germinativas são então utilizadas para produziranimais transgênicos por métodos conhecidos na arte (por exemplo, fertilização in vitro, inseminação artificial)para produzir um animal que é resistente à doença febreaftosa.
Exemplo 2 Geração de Espermatozóide Contendo siRNA paravírus Akabane
Uma linhagem espermática de um vertebrado não humano égerada pela incubação do espermatozóide com uma construçãocompreendendo uma seqüência codificando um siRNA para umaregião conservada do vírus Akabane onde a seqüência estáoperacionalmente ligada a um promotor sob condições quelevam o construto a ser levado para dentro da célula.Exemplos não limitantes incluem utilização de lipofectinaou um mecanismo similar, cloreto de cálcio ou protamina. Emuma alternativa, a construção é estavelmente integrada nogenoma da célula hospedeira utilizando tecnologia REMI. OssiRNAs são desenhados de acordo com dois critérios: regiõescompartilhando alta homologia entre os diferentes isoladose alta similaridade de atividade silenciadora comodeterminado pelos programas de encontro de alvos de siRNA.A utilização de moléculas de siRNA com alvo de seqüências conservadas deve garantir a habilidade destas moléculas declivar a maioria das não todos os vírus da mesma linhagem,considerando a sua origem, a segunda e mais importanterazão é que a conservação de uma seqüência indica uma fortepressão seletiva contra mudança, a pressão seletiva seriaesperada de manter estas regiões alvo não modificadas,mesmo se elas mudarem, elas devem supressar a atividadeantiviral das moléculas de siRNA.
Exemplo 3 Geração de Espermatozoide Contendo siRN A paravírus da Febre Aftosa
Uma linhagem espermática de um vertebrado não humano égerada pela incubação do espermatozoide com uma construçãocompreendendo uma seqüência codificando um siRNA para umaregião conservada do vírus da febre aftosa onde a seqüênciaestá operacionalmente ligada a um promotor sob condiçõesque levam o construto a ser levado para dentro da célula.Exemplos não limitantes incluem utilização de lipofectinaou um mecanismo similar, cloreto de cálcio ou protamina. Emuma alternativa, a construção é estavelmente integrada nogenoma da célula hospedeira utilizando tecnologia REMI.
Exemplo 4 Geração de Espermatozoide Contendo siRNA paravírus da Influenza Aviaria
Uma linhagem espermática de um vertebrado não humano é geradapela incubação do espermatozoide com uma construção compreendendouma seqüência codificando um siRNA para uma região conservada dovírus da influenza aviaria onde a seqüência está operacionalmenteligada a um promotor sob condições que levam o construto a serlevado para dentro da célula. Exemplos não limitantes incluemutilização de lipofectina ou um mecanismo similar, cloreto de cálcioou protamina. Em uma alternativa, a construção é estavelmente integrada no genoma da célula hospedeira utilizando tecnologia REMI.
Claims (24)
1. Célula germinativa de um vertebrado não humanocaracterizada pelo fato de conter uma construçãocompreendendo uma seqüência que codifica um siRNA para umaregião conservada de um genoma viral onde a seqüência estáoperativamente ligada a um promotor.
2. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato da construção compreenderseqüências codificando múltiplos siRNAs para o genomaviral.
3. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato da célula conter múltiplasconstruções que compreendem uma seqüência codificandomúltiplos siRNAs para regiões conservadas do genoma viral, onde a seqüência está operativamente ligada a um promotor.
4. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-1, 2 ou 3 caracterizada pelo fato do vertebrado ser ummamífero não humano.
5. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato do vírus ser Vírus da Febre Aftosa(FMDV).
6. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-5, caracterizada pelo fato da seqüência, conservada serselecionada do grupo consistindo das SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2 e SEQ ID NO.: 3.
7. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-1, 2 ou 3 caracterizada pelo fato do vertebrado ser de umaespécie aviaria.
8. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação- 7, caracterizada pelo fato de vírus ser um vírus dainfluenza aviaria.
9. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-8, caracterizada pelo fato da seqüência conservada serselecionada a partir do grupo consistindo das seqüências nas Figuras 1-16.
10. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação-7, caracterizada pelo fato do vírus ser vírus da doença deMarek (MDV).
11. Célula germinativa, de acordo com a reivindicação- 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizada pelo fato dacélula germinativa ser esperma.
12. Vertebrado não humano que é resistente a umadoença viral caracterizado pelo fato de que a maioria dascélulas no vertebrado compreendem uma seqüência codificando um siRNA para uma região conservada do genoma de um víruscausador de uma doença onde a seqüência está operativãmenteligada a um promotor.
13. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 12 caracterizado pelo fato da construçãocompreender seqüências codificando múltiplos siRNAs pararegiões conservadas do genoma viral.
14. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 12 caracterizado pelo fato da célula contermúltiplas construções que compreendem uma seqüênciacodificando múltiplos siRNAs para regiões conservadas dogenoma viral.
15. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 12, 13 ou 14 caracterizado pelo fato dovertebrado ser um mamífero não humano.
16. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato da doença viralser FMDV.
17. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 16, caracterizado pelo fato da seqüência conservada ser selecionada a partir do grupo consistindo deSEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2 e SEQ ID NO.: 3.
18. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 12, 13 ou 14 caracterizado pelo fato dovertebrado ser de uma espécie aviaria.
19. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 18, caracterizado pelo fato do vírus ser umvírus influenza aviário.
20. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 19, caracterizado pelo fato da seqüência conservada ser selecionada do grupo consistindo dasseqüências nas Figuras 1-16.
21. Vertebrado não humano, de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato do vírus ser MDV.
22. Método de geração de uma célula germinativa de um vertebrado não humano da reivindicação 1 caracterizado pelofato de compreender a incubação da célula germinativa comuma construção que compreende uma seqüência codificando umsiRNA para uma região conservada ou um genoma viral onde aseqüência está operativamente ligada a um promotor sobcondições que levam a construção a ser levada para dentroda célula.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22caracterizado pelo fato da construção ser integrada dentrodo genoma da célula hospedeira.
24. Método para geração de um vertebrado não humano,de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fatode(a) incubar a célula germinativa da reivindicação 1,-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 sob condições que formamuma célula diploide; e(b) incubar a célula diploide sob condições que formemum vertebrado não humano.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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