BRPI0609614A2 - uso de ezetimiba na prevenção e tratamento de litìases de colesterol na árvore biliar - Google Patents

Abstract

USO DE EZETIMIBA NA PREVENçãO E TRATAMENTO DE LITìASES DE COLESTEROL NA áRVORE BILIAR. Essa invenção revela o uso de compostos da família da azetidinona na prevenção ou no tratamento de doença por litíase de colesterol da árvore biliar em mamíferos. Essa invenção está incluída no campo geral da doença por litíase de colesterol na árvore biliar e na vesícula biliar. Em particular, a invenção evidencia que o uso de fármacos que bloqueiam especificamente a absorção intestinal de colesterol inibe o surgimento de doença por litíase de colesterol na árvore biliar. Esses fármacos atuam diminuindo a secreção biliar de colesterol e, ao mesmo tempo, aumentando o fluxo biliar e a secreção hepática de compostos endógenos (por exemplo, sais biliares, fosfolipídeos) na bile. Por sua vez, esses compostos endógenos contribuem para inibir a precipitação de colesterol e a formação de litíases na árvore biliar.

Description

USO DE EZETIMIBA NA PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE LITÍASES DECOLESTEROL NA ÁRVORE BILIAR

DESCRIÇÃO GERAL E PRINCÍPIOSOBJETIVO DA INVENÇÃO

Essa invenção revela o uso de compostos da família daazetidinona na prevenção ou tratamento de doença porlitíase de colesterol da árvore biliar em mamíferos.Essa invenção está incluída no campo geral da doençalitiásica por litíases de colesterol na árvore biliar. Emparticular, a invenção evidencia que o uso de fármacos quebloqueiam especificamente a absorção intestinal decolesterol inibem o surgimento da doença por litíase decolesterol na árvore biliar. Esses fármacos atuamdiminuindo a secreção biliar de colesterol e, ao mesmotempo, aumentando o fluxo biliar e a secreção hepática decompostos endógenos (por exemplo, sais biliares,fosfolipídeos) na bile. Por sua vez, esses compostosendógenos contribuem para a inibição da precipitação decolesterol e a formação de litíases na árvore biliar.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A doença por litíase de colesterol na árvore biliar,especificamente na vesícula biliar (colelitíase), é umapatologia altamente prevalente na população adulta depaíses ocidentais desenvolvidos (10 a 15% da populaçãoacima de 18 anos de idade) . Essa doença alcança níveisepidêmicos nas populações hispânicas e indígena da maioriados países na área dos Andes, incluindo Chile, Peru,Bolívia e México, dentre outros (Carey e Paigen, 2002;Everhart e cols., 2002). No Chile, por exemplo,demonstramos que a ocorrência geral nos homens é de 17% ede 3 0% nas mulheres, alcançando incidências acima de 50% napopulação acima de 50 anos de idade (Miquel e cols.,1998a). Recentemente foi estimado que nos Estados Unidos,aproximadamente 2 0 milhões de pessoas foram afetadas ouestão atualmente afetadas por essa doença (Everhart ecols., 1999). Em países como o Chile, há mais de 2 milhõesde habitantes afetados por colelitíase. Esse cenárioepidemiológico torna a doença litiãsica da arvore biliar apatologia digestiva com o maior custo social em países comoos Estados Unidos, com um custo anual estimado de 8-10bilhões de dólares, em despesas diretas e indiretas, o quechega a 1,3-1,5% dos custos totais com assistência médica(Everhart, 1994). Por outro lado, em países emdesenvolvimento como o Chile, a colelitíase é a primeira causa de internações cirúrgicas, ultrapassada apenas porinternações obstétricas, com um alto custo social para osserviços de assistência médica do país (Csendes e cols.,1993; Medina, Pascual e Medina, 1983).

A secreção biliar tem funções fisiológicas importantes no nosso corpo; dentre outras funções ha a eliminação demoléculas de esteróide pela secreção de colesterol e saisbiliares (produtos catabólicos do colesterol) . Na verdade,a secreção biliar é a principal forma de eliminação demoléculas de esteróide do corpo tendo, portanto, um papelcentral na homeostasia do colesterol. Os mecanismospatogênicos da doença por litíase biliar de colesterol sãoconhecidos apenas parcialmente. É aceito como um dogma queo primeiro defeito metabólico necessário para a formação delitíases biliares é a geração de bile rica em colesterol, conhecida como "bile supersaturada de colesterol", pelofígado. A geração de bile supersaturada de colesterol é,portanto, um defeito nas funções fisiológicas dometabolismo lipidico hepãtico (Carey, 1993; Miquel e cols.,1998b). O principal defeito metabólico em pessoas quedesenvolvem litíases biliares de colesterol é o aumentoseletivo da secreção de colesterol na bile, em relação àsmoléculas que podem solubilizar o colesterol na bile (saisbiliares e fosfolipídeos). Portanto, é gerada uma soluçãobiliar termodinamicamente instável na qual o colesteroltende a se mover de uma fase solúvel para uma insolúvel,com precipitação de cristais de colesterol e crescimento delitíase biliar de colesterol, principalmente na vesículabiliar, onde as condições locais favorecem a estase e aretenção de cristais de colesterol (Apstein e Carey, 1996).

Presume-se que haja fatores genéticos, além de fatoresambientais, envolvidos na geração dessa doença metabólicacrônica. No entanto, esses fatores ainda não foramelucidados (Paigen, 2002) . Precisamos enfatizar que ocolesterol da bile é principalmente colesterol pré-formadoderivado de lipoproteínas plasmãticas, e não originado deneo-síntese hepãtica. Todavia, não esta clara aparticipação do colesterol da dieta (intestinal) e/ou docolesterol derivado de tecido periférico até o fígado(transporte reverso de colesterol endógeno) na geração debile supersaturada e, finalmente, de litíases biliares decolesterol (Paigen, 2002).

Após as litíases biliares serem formadas na vesículabiliar, elas são claramente visíveis por exames de imagemcomo, por exemplo, ultra-sons abdominais. As litíasesbiliares podem permanecer na vesícula biliar (ou no duetobiliar comum) sem causar sintomas durante toda a vida dapessoa (litiases biliares silenciosas), evoluir para formassintomáticas simples (dor do tipo eólica biliar) ou gerarcomplicações clínicas com prognóstico mais sério, comocolecistite aguda, empiema vesicular, colangite supurativaou pancreatite aguda, dentre outras (Jonston e Kaplan,1993). Ao mesmo tempo, a colelitíase é o principal fator derisco para o desenvolvimento de câncer da vesícula biliar,uma neoplasia digestiva com mau prognóstico e prevalênciaelevada em populações com alta incidência de doença porlitíase biliar, como as do Chile, Peru, México e aspopulações hispânicas e indígenas dos Estados Unidos(Nervi, 2001).

Os principais fatores de risco associados a uma maiorfreqüência de colelitíase nas diferente populaçõesestudadas são: sexo feminino, ascendência genéticaameríndia, colelitíase em parentes de primeiro grau,gravidez, obesidade ou sobrepeso em mulheres, perda de pesoabrupta no obeso mórbido, cirurgia bariátrica no obesomórbido, diabetes melito, puerpério, jejum prolongado,nutrição parenteral total, hipertrigliceridemia (Amigo ecols., 1999; Paigen, 2002; Wudel e cols., 2002).

Os modelos animais só desenvolvem colelitíase napresença de uma dieta rica em colesterol (aproximadamente100-1.000 vezes aquela da dieta ocidental humana).Recentemente, alguns modelos animais geneticamentemanipulados demonstraram o papel crucial da expressão degenes relevantes na absorção intestinal de colesterol(ACAT-2) e no transporte de colesterol da dieta para ofígado na forma de quilomícrons (Apolipoproteína E) , nageração de colelitíase experimental.

O fígado é um órgão central na regulação dahomeostasia do colesterol. Ele é o principal órgãoenvolvido na síntese e catabolismo de lipoproteínasplasmãticas, e o único órgão capaz de eliminar quantidadessignificativas de colesterol (e de outra moléculas deesteróide) do organismo, seja como colesterol livre(aproximadamente 1 g/dia) (Grundy, 1983) ou por meio de suaconversão ou catabolismo em sais biliares (Dietschy, Turlye Spady, 1993) . Defeitos no metabolismo hepãtico decolesterol produzem duas doenças altamente prevalentes:aterosclerose e colelitíase. As células hepãticas têmmecanismos moleculares complexos que ao final regulam ahomeostasia do colesterol intracelular. Evidênciasexperimentais em humanos e animais permitiram estimar que ocolesterol destinado à secreção biliar é principalmente(85-95%) colesterol pré-formado gerado pela captação delipoproteínas plasmãticas, e somente 5-15% são gerados porbiossíntese hepãtica (Vlahcevic, 1994). Estudos realizadosem pacientes com litíase e controles mostram resultadoscontraditórios em relação à atividade hepãtica de neo-síntese de colesterol e neo-síntese de sais biliares(revisão em Apstein e Carey, 1996; Carey, 1993). Noentanto, aceita-se que, em pacientes com litíase, ocolesterol destinado à secreção biliar em níveisanormalmente elevado é preferivelmente originado de umaconcentração pré-formada de origem lipoprotéica. O influxode colesterol de lipoproteína em direção ao fígado pode virde duas fontes: a) por transporte reverso de colesterol dostecidos periféricos para o fígado em HDL e/ou LDL (Fieldinge Fielding, 1995) e b) colesterol de origem exógena (dadieta) que é transportado do intestino até o fígadofundamentalmente como remanescentes de quilomicrons (rQM) elipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) (Wilson eRudel, 1994). É importante mencionar que o colesteroladsorvido no nível intestinal pode ser de origem exógena(da dieta) ou endógena (colesterol biliar). Na verdade, háevidências que mostram que o colesterol presente na bile esecretado no intestino é qualitativamente mais relevante(1.000 mg/dia) do que o colesterol presente na dietaocidental (200-4 00 mg/dia). Ao mesmo tempo, o colesterolpresente na bile parece ser absorvido mais eficientementedo que o colesterol da dieta. Outras evidências sugeremque, em humanos, o colesterol da dieta ou intestinalpoderia ser muito relevante na geração de bile litogênicaem pessoas geneticamente predispostas a desenvolver essadoença. A maioria do colesterol depositado em litíasesbiliares parece ter uma origem dietética (Holzbach, 1984).Além disso, outras evidências apoiam a idéia de que ocolesterol de origem intestinal destina-se preferivelmenteà secreção biliar, facilitando a formação de bilelitogênica (Cooper, 1991). Por exemplo, uma dietaenriquecida de colesterol em portadores de litíase biliaraumenta significativamente o teor de colesterol biliar nassemanas subseqüentes (Kern, 1994) . Há somente um relato quecomparou o efeito do colesterol da dieta em mulheres comlitíase biliar e controles, demonstrando que somentepacientes com litíase biliar aumentam a secreção biliar decolesterol quando expostos a uma sobrecarga exógena decolesterol na dieta (Kern, 1994). Esses dados sugerem que ocolesterol da dieta que pode ser destinado à secreçãobiliar é provavelmente regulado por genes ainda nãoidentificados, e seus mecanismos reguladores parecem estaralterados em pacientes que desenvolvem doença por litiasebiliar.

Em contraste com a quase completa absorção intestinalda maioria dos outros nutrientes, a absorção de colesterolé limitada a uma média de 40-60% do colesterol ingerido,com grande variabilidade entre espécies diferentes (Jolley,Dietschy e Turley, 1999) e entre as pessoas (Gylling eMiettinen, 2002b). A variabilidade na capacidade deabsorção de colesterol entre indivíduos pode ser de até 4-6vezes (em uma faixa de 30-80%) para uma quantidade similarde colesterol na dieta. Esse achado contrasta com asvariações intra-individuais observadas em momentosdiferentes sob a mesma dose de colesterol na dieta (<6%)(Bosner e cols., 1993) . Variações similares na habilidadede absorção do colesterol da dieta podem ser observadas emmodelos animais, especialmente entres espécies diferentesde camundongos (Jolley e cols., 1999). Nos últimos anos,essa variabilidade na capacidade para adsorver o colesterolda dieta obteve grande relevância, não apenas do ponto devista do estudo da fisiologia do metabolismo do colesterol,mas também da perspectiva de se projetar alternativasterapêuticas mais eficazes para o tratamento dedislipidemias e aterosclerose (Gylling e Miettinen, 2002a).Durantes os últimos anos, foi possível desvendar, pelomenos parcialmente, os mecanismos moleculares que controlame regulam a absorção intestinal de colesterol (Klett ePatel, 2004).O desenvolvimento de compostos que interferem com aabsorção de colesterol ganhou grande relevância durante osúltimos anos com o objetivo de desenvolver estratégias parao tratamento de hipercolesterolemias e aterosclerose. Oscompostos que foram avaliados podem ser classificados emtrês categorias, dependendo do seu local de ação: A)aqueles que interferem com a absorção intestinal no nívelintraluminal, tais como resinas como colestiramina esaponinas naturais e sintéticas, B) fármacos que interferemcom a entrada de colesterol no enterócito, tais como dotipo 2-azetidinonas (Ezetimiba) e C) fármacos queinterferem com a esterificação de colesterol incorporado noenterócito, especificamente inibindo a enzima ACAT-2.Apenas os compostos mencionados no ponto A e as 2-azetidinonas são usados atualmente na prática clínica parao tratamento de dislipidemias e na prevenção de doençascardiovasculares.

EZETIMIBA (SCH 58235, ( (-)-1-(4-fluorfenil)-(3R)- [3 -(4-fluorfenil) - (S) -hidroxipropil]- (4S) - (4-hidroxifenil) -2-azetidinona) ) é o primeiro fármaco em um grupo demedicamentos hipocolesterolêmicos, os inibidoresespecíficos da absorção de colesterol (Klett e Patel,2004), derivado da classe estrutural das 2-azetidinonas.Foi aprovado pelo FDA ("U.S. Food and Drug Administration"agência governamental americana que regula e fiscaliza afabricação de comestíveis, fármacos e cosméticos) emoutubro de 2002 sob a marca registrada Ezetrol®-MSD-Schering-Plough; e Zetia®, Merck/Schering Plough, NorthWales, Pennsylvania. Ezetimiba (SCH 58235) corresponde àsegunda geração de inibidores específicos da absorçãointestinal de colesterol, e foi gerada por modificaçãoestrutural de metabólitos de SCH 48461 e SCH 53695 (SCH53695 é o C-4 fenol de SCH 48461) . Ezetimiba é ummetabolito derivado das formas ativas de SCH 48461, com umaatividade inibidora na absorção de colesterol 400 vezesmaior do que seu análogo predecessor (SCH 48461) . Esseaumento da atividade inibidora da absorção de colesterolfoi atribuído à incorporação de anéis fenólicos em SCH48461 (Jeu e Cheng, 2003) . Ezetimiba demonstrou inibireficazmente a absorção intestinal de colesterol em modelosmamíferos (modelos murídeos) em dosagens que flutuam entre0,1-6 mg/kg do peso corporal por dia. Ezetimiba é indicadapara ser usada como monoterapia ou como terapia combinadacom inibidores da HMG-CoA-redutase (estatinas) notratamento de hipercolesterolemias primárias para a reduçãodo colesterol total, colesterol LDL e ApoB. Ela também éindicada como terapia combinada em pacientes comhipercolesterolemia familiar homozigota e como monoterapiaem pacientes com sitosterolemia familiar homozigota (Chenge Leiter, 2003; Davidson, 2003; Iglesias e Diez, 2003;Lipka, 2003) . A terapia combinada com 2-azetidinonasassociadas aos inibidores da HMG-CoA-redutase (estatinas)tais como pravastatina, sinvastatina, rosuvastatina,lovastatina, fluvastatina, atorvastatina e cerivastatina, se baseia na inibição seletiva da absorção intestinal decolesterol. Por isso, uma redução no teor hepático decolesterol desencadeia um efeito compensatório associado emhumanos, aumentando a neo-síntese de colesterol no nívelhepático. Portanto, quando as 2-azetidinonas são associadas a um inibidor seletivo (estatinas) da enzima crucial (HMG-CoA-redutase) na via da neo-síntese de colesterol, aredução no colesterol plasmãtico é aumentada, A terapiacombinada com 2-azetidinonas mais inibidores da HMG-CoA-redutase na patologia considerada nessa invenção(colelitíase) não foi avaliada e não ha relatos sobre elana literatura científica e médica.

O mecanismo de ação específico da Ezetimiba comoinibidor seletivo da absorção de colesterol ainda não éconhecido em detalhe. Existe a hipótese de que ela atuepela inibição da entrada de colesterol do lúmen para ointerior do enterócito, atuando no nível da membranaplasmãtica apical e por interação com algumas proteínasenvolvidas no transporte do colesterol (Klett e Patel,2004). Ezetimiba é incorporada no enterócito, églucuronizada em seu metabólito ativo nesse nível, e entrano circuito entero-hepãtico de lipídeos (Jeu e Cheng,2003) . Embora a Ezetimiba seja captada com alta afinidadepelo fígado e seja secretada ativamente em direção à árvorebiliar alcançando concentrações elevadas na bile, não sesabe se esse fármaco tem outras funções adicionais notransporte de moléculas de esteróide (por exemplo,colesterol) nos níveis hepático e da árvore biliar.

Hoje é universalmente aceito que a única terapiaeficaz para o tratamento de doença por litíase biliar é aressecção cirúrgica da vesícula biliar com suas litíasesbiliares (colecistectomia) (Gui e cols., 1998). No entanto,foram desenvolvidas algumas alternativas farmacológicaspara o tratamento (não cirúrgico). Esses tratamentosdemonstraram eficácia na dissolução de litíases biliares emsubgrupos específicos de pacientes com colelitíase(Hillebrant e cols., 2002; Stiehl e cols., 1984) e emalguns grupos específicos de pacientes em alto risco para odesenvolvimento de doença por litíase biliar (Mason eRenquist, 2002; Wudel e cols., 2002).

A alternativa médica é a dissolução de litíasesbiliares de colesterol por sais biliares, ácidoquenodesoxicólico e ursodesoxicólico (Sugata, 1993). O maisutilizado internacionalmente tem sido o ácidoursodesoxicólico, pois ele exibe taxas menores de efeitosadversos e eficácia similar. Esses fármacos atuam atravésdo aumento dos teores de sais biliares na bile e diminuiçãoda secreção hepática de colesterol gerando, dessa forma,bile não supersaturada com colesterol e permitindo asolubilização das litlases biliares de colesterol.

Demonstrou-se que é uma terapia eficaz em pacientes compequenas litlases biliares de colesterol. No entanto, exigelongos períodos de terapia (6-12 meses) e está associado aníveis de recorrência elevados (50% em 5 anos) quandosuspenso (Bilhartz, 1998; Stiehl e cols., 1984). Aassociação de ácido ursodesoxicólico com estatinas(inibidores da neo-síntese de colesterol) também foiexplorada para essa mesma finalidade, mas a eficácia daterapia não foi demonstrada (Hillebrant e cols., 2002 ;Miettinen e cols., 1998).

A possível utilidade de outros fármacoshipolipemiantes no tratamento de doença por litíase biliarde colesterol foi avaliada, sem nenhum efeito clínicodemonstrado. O uso de fibratos, niacina ou resinas quediminuem a absorção intestinal de colesterol e sais biliares (colestiramina, probocol) não demonstrou qualquereficácia terapêutica em pacientes com doença por litiasebiliar de colesterol. Além disso, o uso de terapiashipolipemiantes (que diminuem o colesterol plasmatico) comfibratos (especificamente clofibratos) em humanos mostra umnítido aumento no risco de desenvolvimento de colelitíase(Amigo e cols., 1999; Apstein e Carey, 1996). Por outrolado, o uso de inibidores da HMG-CoA-redutase (estatinas)mostrou resultados contraditórios em modelos pré-clínicos eclínicos. Em alguns modelos experimentais e em algunsestudos humanos, mas não em todos, essa terapia reduz oteor de colesterol biliar e o índice de litogenicidade; noentanto, não demonstrou ser útil na dissolução de litíasesbiliares de colesterol em estudos clínicos prospectivos(Chapman e cols., 1998; Hillebrant e cols., 2002; Porsch-Ozcurumez e cols., 2001).

O principal problema é que atualmente não há uma formade prevenção primária eficiente da doença por litiasebiliar na população geral ou em grupos de alto riscoespecíficos (mulheres, terceiro trimestre da gravidez,puerpério, mulheres com sobrepeso ou obesas, perda de pesoprogramada no obeso mórbido, gastroplastia e by-passintestinal no obeso mórbido, jejum prolongado, terapianutricional enteral prolongada), e nem há terapias médicaseficazes (por exemplo, dissolução de litíases biliares jáformadas).

Sabe-se que as 2-azetidinonas e suas respectivasfamílias farmacológicas são usada no tratamento decolesterol plasmatico elevado e são protegidas por diversaspatentes. Por exemplo, os documentos U.S. 5.631.365, WO2004 010948, WO 2004 081002, WO 2004 000803, WO 2004000804, WO 2004 000805 divulgam o uso de Ezetimiba para otratamento de distúrbios do colesterol, tais comohipercolesterolemia, aterosclerose ou tumores induzidospelo colesterol.

Embora a colelitiase seja uma doença do metabolismo docolesterol, não ha uma correlação nítida entre os níveisplasmãticos totais de colesterol, níveis plasmãticos decolesterol LDL ou aterosclerose com a presença de litíasesbiliares de colesterol ou com um risco maior dedesenvolvimento de colelitiase. Conseqüentemente, asdiferentes terapias desenvolvidas para o tratamento dehipercolesterolemia ou dislipidemias, os principais fatoresde risco da doença cardiovascular aterosclerótica, aindanão demonstraram ser eficazes no tratamento e/ou naprevenção da doença por litíase biliar de colesterol.Somente a hipertrigliceridemia e os níveis plasmãticosbaixos de colesterol HDL foram associados em alguns estudosa um risco maior de doença por litíase biliar, semdemonstrar um relacionamento causai entre essas variáveissorológicas e o desenvolvimento de colelitiase (Paigen,2002).

Em função dos argumentos apresentados acima a presenteinvenção ira solucionar um problema existente na técnica,uma vez que não é uma dedução óbvia que as técnicas atuaisdesenvolvidas para o tratamento de dislipidemiasplasmãticas e/ou aterosclerose sejam eficazes no tratamentoda doença por litíase biliar.

Um composto de 2-azetidinona em combinação com outrosfãrmacos e seu uso no tratamento de doença por litíasebiliar de colesterol ou colelitiase é mencionado nosdocumentos WO2004001002 e WO20030153541. Esses documentosdivulgam especificamente um composto farmacêutico queinclui um moderador de um receptor LXR e um agente deregulação lipídica como, por exemplo, Ezetimiba. O receptornuclear LXR órfão atua como um regulador da transcrição degenes envolvidos no metabolismo e transporte do colesterol.Quando ele se liga a ligantes endógenos (oxisteróis) ou aligantes sintéticos ele inibe a síntese de colesterol(especialmente no fígado) e, ao mesmo tempo, estimula ocatabolismo do colesterol em sais biliares e a saída decolesterol na bile em roedores (Yu e cols. , 2003) . Foidemonstrado em modelos experimentais animais (roedores) quea ativação desse receptor nuclear diminui os níveisplasmáticos de colesterol, particularmente sob dietasexperimentais ricas em colesterol que aumentam o teor decolesterol na bile de camundongos pela ativação específicade genes conhecidos como ABCG5 e ABCG8. Esses achados nãoainda foram demonstrados em humanos, uma vez que não háfármacos aprovados para uso humano. As evidênciasdisponíveis a partir de animais experimentais sugerem que ouso de fármacos que ativam LXR também poderia aumentar orisco de formação de litíase biliar de colesterol na árvorebiliar, já que a estimulação de LXR aumenta o teor decolesterol na bile (Yu e cols., 2003). Não há evidências naliteratura que mostrem que o uso de ligantes sintéticos deLXR (farmacológicos), isoladamente ou em combinação comEzetimiba, iniba a formação de litíases de colesterol daárvore biliar.

O documento WO200500217 divulga um composto quecombina um agente anti-obesidade e um agente anti-dislipidemiante, dentre os quais há um inibidor da absorçãode colesterol como Ezetimiba. Esse composto é indicado parauso em distúrbios relacionados à dislipidemia. O documentoWO2004078716 descreve derivados de piperazina e seu usocomo agonistas do receptor de melanocortina (MC-R),indicado para o tratamento de obesidade. Adicionalmente, odocumento WO2004030637 revela o uso de moduladores doreceptor 5 de glutamato metabotrópico (mGluR5) notratamento de distúrbios relacionados à obesidade. Nadescrição, eles mencionam que "agentes anti-obesidade aptosa serem usados em combinação com um modulador do mGluR5incluem, dentre outros agentes redutores de colesterol,inibidores da absorção de colesterol como 2-azetidinonas,por exemplo, Ezetimiba". O documento WO2004031175 descrevecompostos que atuam como agonistas de receptores de NPY,especificamente receptores de NPY Y5. Esses compostos sãoúteis para o tratamento de diversas patologias relacionadasa NPY, entre elas doença da vesicula biliar. Obesidade eproblemas médicos associados, por exemplo, doença porlitíase biliar, também podem ser tratadas. Ezetimiba émencionada como um exemplo de outros ingredientes ativosque podem ser administrados em combinação com o compostorelacionado à invenção.

O sobrepeso (índice de massa corporal, BMI, >25 kg/m2)e a obesidade (BMI >28) são fatores de risco estabelecidospara o desenvolvimento de colelitíase, principalmente emmulheres, sendo essa evidência mais nítida do que emhomens. O sobrepeso e a obesidade aumentam o risco decolelitíase 2-3 vezes em mulheres, mas não em homens. Poroutro lado, a perda de peso abrupta (>1,5 kg/semana) noobeso mórbido (BMI >35), tanto por tratamento dietéticohipocalórico (aproximadamente 1.000 kcal/dia) quantoatravés de cirurgia bariátrica, aumenta o risco dedesenvolvimento de colelitíase, e foi relatado que 20-40%desses pacientes podem desenvolver colelitíase nas semanasou meses subseqüentes. Não está claro por que algunsindivíduos com sobrepeso ou obesos desenvolvem colelitíase(20-30% de acordo com some estudos), e outros fatoresambientais e/ou genéticos que podem determinar essasuscetibilidade foram sugeridos (Paigen, 2002 e referênciasnele citadas).

Todavia, a maioria das pessoas que desenvolvemcolelitíase não tem sobrepeso ou é obesa e, portanto, essaassociação está longe de ser universal. É provável que otratamento da obesidade por si só com as técnicas atuaispoderia até mesmo aumentar o risco de desenvolvimento decolelitíase nesses indivíduos. Por outro lado, a prevençãodessa condição metabólica poderia diminuir, pelo menos emparte, a freqüência dessa doença em populações de altorisco (geneticamente suscetíveis).

Em função dos argumentos apresentados acima é que apresente invenção irá solucionar um problema existente natécnica, uma vez que não é óbvio deduzir que as técnicasatuais desenvolvidas para o tratamento de obesidade mórbidae/ou sobrepeso são eficazes no tratamento de doença porlitíases biliares.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGURA 1. A formação de cristais de colesterol e delitíases biliares de colesterol é inibida em camundongosC57BL/6 em dieta litogênica mais ezetimiba por 14 dias.FIGURA 2. (A) Perfil plasmático de lipoproteínas emcamundongos C57/BL6 após 14 dias em ração comercial, com esem Ezetimiba. VLDL, lipoproteínas de densidade muitobaixa; LDL, lipoproteínas de baixa densidade; IDL,lipoproteínas de densidade intermediária; HDL,lipoproteínas de alta densidade. (B) Perfil plasmático delipoproteínas em camundongos C57/BL6 após 14 dias em dietalitogênica, com e sem Ezetimiba. VLDL, lipoproteínas dedensidade muito baixa; LDL, lipoproteínas de baixadensidade; IDL, lipoproteínas de densidade intermediária;HDL, lipoproteínas de alta densidade.

FIGURA 3. (A) FLuxo de bile em camundongos C57BL/6 quereceberam ração comercial ou dieta litogênica, com ou semEzetimiba. (B) Concentração biliar de colesterol emcamundongos nas dietas mencionadas acima. (C) Secreçãobiliar de colesterol. (D) Concentração de ácidos biliaresna bile. (E) Secreção biliar de ácidos biliares. (F)Concentração de fosfolipídeo na bile. (G) Secreção biliarde fosfolipídeos. *, p<0,05 com relação ao seu grupo decontrole; e, p<0,05 com relação ao grupo em dietalitogênica, sem Ezetimiba.

FIGURA 4. Secreção biliar de glutationa em camundongosC57BL/6 em uma dieta litogênica, com e sem Ezetimiba. *,p<0,05 com relação a um grupo em uma dieta litogênica maiságua.

FIGURA 5. Ezetimiba inibe a formação de cristais decolesterol e de litíases biliares de colesterol emcamundongos C57BL/6 em uma dieta litogênica por 30 dias.

FIGURA 6. Níveis de expressão de proteína hepática dostransportadores críticos de sais biliares, Bsep (A) e Ntcp(B) em camundongos em dieta de controle e em dietalitogenica, com ou sem Ezetimiba. Bsep não exibe alteraçõessignificativas com Ezetimiba em ambas as dietas. Ntcpmostra um nível de expressão menor em uma dieta litogenica,mas essa diminuição é significativamente atenuada comEzetimiba. *, p<0,05 com relação a um controle com raçãocomercial (chow diet) ; e, p<0,05 com relação a uma dietalitogenica mais água.

FIGURA 7. Níveis de expressão de mRNA de MDR2, MRP eG-GCS no fígado de camundongos em uma dieta litogenica, comou sem Ezetimiba. Quantificação das faixas radioativasespecíficas da análise Northen mostradas como unidadesrelativas para 18S. Análise Northern demonstrando queapenas o transportador de fosfolipídeo MDR2 tem umadiminuição pequena, mas estatisticamente significativa.

FIGURA 8. Integridade do RNA isolado de camundongos emuma dieta litogenica, com e sem Ezetimiba.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Essa invenção demonstra que o uso de inibidoresespecíficos da absorção intestinal de colesterol quepertencem à classe da 2-AZETIDINONA, especificamenteEZETIMIBA (SCH 58235), inibe completamente odesenvolvimento de colelitíase em um modelo murídeo dadoença em uma dieta litogenica. Essa invenção, em um modelopré-clínico de doença por litíase biliar de colesterol,permite prever que a inibição seletiva da absorçãointestinal de colesterol em uma alternativa terapêuticaeficaz na prevenção primária e/ou no tratamento de doençapor litíase biliar de colesterol em humanos. Além disso,como foi discutido na seção "Fundamentos", é possívelprever que, em humanos, a combinação de Ezetimiba (SCH58235) com inibidores da neo-síntese hepática de colesterol(HMG-CoA redutase) seria mais eficiente do que Ezetimiba(SCH 58235) isoladamente na prevenção e/ou no tratamento dedoença por litíase biliar.

EXEMPLO DE APLICAÇÃO

MATERIAIS E MÉTODOS

Modelos de doenças de animais experimentais. A colelitíaseespontânea é extremamente rara em animais experimentais ouselvagens, provavelmente porque eles secretam níveis baixosde colesterol na bile e têm, portanto, bile não saturada emcolesterol. No entanto, diferentes modelos animais (coelho,hamster, marmota norte-americana, esquilo e camundongo)desenvolvem colelitíase similar à doença humana em dietasexperimentais ricas em colesterol mais sais biliares (ácidoeólico) e, algumas vezes, dietas experimentais ricas emtriglicerídeos. O camundongo é o modelo experimental maisbem caracterizado em que o desenvolvimento da doença édependente de uma dieta conhecida como "litogênica" (1,25%de colesterol, 0,5% de ácido eólico, 15% de gordura). Sobessas condições, a maioria das espécies de camundongosdisponíveis desenvolve colelitíase de colesterol emproporções e momentos variáveis (Paigen, 2002). Foiestabelecido que há espécies mais suscetíveis ou maisresistentes ao desenvolvimento de colelitíase, o que podeser determinado geneticamente. As espécies de camundongosC57L e C57BL/6 são particularmente suscetíveis aodesenvolvimento de colelitíase (80-100% dos animaisdesenvolvem a doença em 2-4 semanas em dieta litogênica)(Paigen, 2002; Bouchard e cols., dados não publicadoscomunicados em www.jax.org/pub-cgi/phenome). Estudosrealizados nesses modelos durante os últimos anos foramvitais para uma melhor compreensão da doença e para adescoberta de genes que são potencialmente relevantes nageração de suscetibilidade à doença (Paigen, 2002). Nessetrabalho pré-clínico inovador, utilizamos a cepa decamundongo C57BL/6.

Utilizamos camundongos C57BL/6J suscetíveis aodesenvolvimento de colelitíase obtidos originalmente deJackson Corp. (Bar Harbor, ME, EUA), e as colôniascresceram em nosso Laboratório de Gastrenterologia,Faculdade de Medicina, P. Universidade Católica do Chile.Os grupos experimentais receberam uma ração comercial decontrole baixa em colesterol (<0,02% de colesterol, ProlabRMH3000, PMI Feeds Inc., St. Louis, MO) ou uma dietalitogênica (1,25% de colesterol, 0,5% de ácido eólico, 15%de gordura, TD90221, Harlan Teklad, Madison, WI) (Amigo ecols. 2000) . Esses camundongos também foram tratados comEzetimiba (Zetia®, Merk/Schering Plough) ou placebo. Noprotocolo N° 1, comprimidos de Zetia® foram triturados emum pilão de porcelana e dissolvidos em água para seremadministrados aos camundongos em uma dose diária (08 horas)de 5 mg/Kg de peso corporal por engorda em um volume finalde 200 nl; os grupos de controle receberam o mesmo volumede água por engorda, sem o fármaco. No protocolo N° 2,comprimidos de Zetia® foram triturados da mesma formadescrita acima, dissolvidos em 200 cc de etanol 100%(Merck) e adicionados à dieta litogênica trituradapreviamente, e secos por 4 8 horas em temperatura ambiente.

Camundongos C57BL/6J receberam essa dieta litogênica maisZetia® em uma dose estimada de 5-6 mg/kg/dia durante 3 0dias (os camundongos consumem 4-5 g de dieta por dia) . Ogrupo de controle recebeu a mesma dieta litogenicatriturada, suplementada com etanol 100% (200 cc) e seca por48 horas. Durante o estudo, os camundongos foram mantidosem temperatura ambiente constante, com ciclos dia/noite de09:00-21:00h e 21:00-09:OOh, respectivamente, e livreacesso ao alimento e à água. Quatro grupos de camundongosmachos com 8-10 semanas de idade (5-10 por grupo) foramcolocados nas seguintes dietas experimentais:

Protocolo N° 1:

Grupo 1-A: Ração comercial de controle mais água porengorda (n=10).

Grupo 1-B: Ração comercial de controle mais Ezetimiba 5mg/kg/dia por engorda (n=10).

Grupo 2-A: Dieta litogenica mais água por engorda (n=10).

Grupo 2-B: Dieta litogenica mais Ezetimiba por engorda(n=10).

Protocolo N° 2:

Grupo 1: Dieta litogenica por 30 dias (n=5).

Grupo 2: Dieta litogenica mais Ezetimiba, 5-6 mg/kg/dia por30 dias (n=5).

Cirurgia e coleta de amostras. Os grupos foram mantidos por14 dias (protocolo N° 1) ou 30 dias (protocolo N° 2) nasdiferentes condições experimentais. Durante os últimos trêsdias dos protocolos, foram coletadas fezes de 24 horas dosdiferentes grupos {pool) para determinar a excreção fecalde esteróis neutros (colesterol) e esteróis ácidos (saisbiliares). Ao final do tempo estabelecido nos protocolos,os camundongos foram anestesiados (entre 08:00-10:00 horasda manhã) com uma injeção intraperitoneal de pentobarbitalem doses de 4,5 mg por 100 g de peso corporal (Amigo ecols., 2000), e submetidos à cirurgia. A cirurgiapadronizada consiste em uma laparoscopia aumentada e visualização dos órgãos abdominais, incluindo o fígado, aárvore biliar e a vesícula biliar. Primeiro, realizamos umaressecção da vesicula biliar (colecistectomia), com o duetocistico previamente ligado (Amigo e cols., 2002; Amigo ecols., 2000; Amigo e cols., 2003b). A vesícula biliar éremovida e inspecionada visualmente para determinar apresença de litíases biliares. A seguir, a bile da vesículabiliar é extraída para analisar a presença de cristais decolesterol nas amostras frescas sob o microscópio com luzpolarizada (2 0X). As alíquotas são estocadas a -20°C paraanálise química subseqüente. Depois, o dueto biliar comum ésondado (fístula biliar) com uma cânula de polietileno P-10para coleta da bile durante 15 minutos, determinação dofluxo de bile por gravimetria (1 g de bile = 1 ml; o fluxode bile é expresso como (al/min/g de fígado de camundongo) epara análise química posterior de lipídeos e glutationabiliares, como especificado posteriormente. A veia cavainferior é puncionada com uma seringa de tuberculinaheparinizada para extrair 500-800 ml de sangue. A seguir, ofígado é removido, pesado, congelado em nitrogênio líquidoe estocado a -80 para análises subseqüentes. O plasma éseparado por centrifugação a 1.500 rpm e estocado a -80°Cpara análise posterior. Os protocolos animais foramaprovados pelo Comitê de Ética de nossa instituição e osanimais foram tratados de acordo com regras internacionaisde cuidados com animais para animais experimentais.Determinação de litíase da vesícula biliar e de cristais decolesterol na bile da vesícula biliar. A presença ouausência de litíases biliares de colesterol na vesículabiliar dos camundongos é determinada por inspeção ópticasimples, uma vez que a vesícula biliar é translúcida epermite facilmente a detecção da presença de estruturasparticuladas em seu interior (litíases biliares ousedimentos particulados) . A fim de determinar a presença decristais típicos de monohidrato de colesterol, 10 [il debile da vesícula biliar são colocados em uma lâmina eanalisados por microscopia óptica sob luz polarizada comampliação de 10-20X. Os cristais de colesterol sãotipicamente observados como cristais birrefringentes com aaparência de vidro quebrado (Amigo e cols., 2000; Miquel ecols., 1998b; Moschetta, Bookout e Mangelsdorf, 2004).

Absorção intestinal de colesterol e de sais biliares. Acapacidade de Ezetimiba para inibir a absorção decolesterol e de sal biliar foi determinada indiretamentepor quantificação de esteróis neutros (colesterol) e deesteróis ácidos (ácidos biliares) presentes nas fezescoletadas no 12°, 13° e 14° dias do experimento (trêsdias) . A fim de determinar a excreção fecal de colesterol(esteróis neutros), as fezes foram secas a 50°C por trêsdias e depois pesadas para se obter uma média da excreçãofecal por dia (em gramas). As fezes foram homogeneizadas emum pilão, e 5 ml de 2 N NaOH:metanol 1:1 são adicionadospor alíquotas de 100 mg (peso seco) do homogeneizado. Aamostra é turbilhonada e incubada a 60°C por 1 hora parasaponif icação, e depois é resfriada, e 5 ml de éter depetróleo são acrescentados, seguidos por agitação vigorosapara se obter a separação das fases hidrofóbicas ehidrofílicas. As amostras são então centrifugadas a 1.000rpm por 10 minutos, e a fase hidrofóbica (camada superior)é recuperada. São realizadas uma segunda e terceiraextrações pela adição de 5 ml éter de petróleo à fasehidrofilica. As fases hidrofóbicas são secas sob nitrogêniogasoso, e os lipideos são ressuspensos em 1 ml declorofórmio. Alíquotas de 50 |il, em duplicata, são secas emtemperatura ambiente, e o colesterol total é quantificadode acordo com o método enzimãtico descrito acima. Osvalores obtidos são expressos como (imoles decolesterol/dia/100 g de camundongo (Miettinen e cols.,1965) . A fim de determinar a excreção fecal de ácidosbiliares, foram coletadas fezes dos camundongos durantetrês dias (12°-14° dias), secas a 50°C por uma semana epesadas. As fezes são então homogeneizadas em um pilão;ácido eólico (14C) , 200.000 cpm, é adicionado a 1 g dohomogeneizado para determinar o grau de recuperação. Asamostras são então misturadas com NaBr, NaOH e HC1,dissolvidas em etanol e incubadas a 120°C por 8 horas em umsistema de refluxo. As amostras fecais hidrolisadas sãoressuspensas em NaOH, e secas sob N2 gasoso. 0 péleteobtido é ressuspenso em etanol, e passado através decolunas Sep-Pak para eliminar todos os contaminantes desais biliares. Os sais biliares são eluídos com uma soluçãode metanol:água 85:15 e secos sob N2 gasoso. As amostrassão então ressuspensas em metanol, são coletadas alíquotasem duplicata e os sais biliares medidos com a utilização dehidroxiesteróide desidrogenase logo que são medidos nabile. O valor obtido é normalizado com a recuperação deácido eólico C (Mendez-Sanchez e cols., 1998).Determinação de colesterol plasmático, lipídeos biliares eglutationa biliar. O teor de colesterol plasmático e o teorde colesterol, sais biliares e fosfolipídeo na vesiculabiliar e na bile hepática são determinados por métodosenzimáticos. Concentração biliar de colesterol: 500 (j.1 detampão (Tris-HCl pH 7,6, fenol, clorofenol, Triton X-100,colato de sódio, aminoantipirina e as enzimas colesterolesterase, colesterol oxidase e peroxidase) são adicionadosa 5 fj,l de bile hepática ou 1 de bile da vesicula biliar.Essa mistura de reação é incubada por 10 minutos a 37°C, ea absorbância quantificada a 500 nm. Os valores obtidos sãointerpolados em uma curva-padrão de concentração decolesterol. O colesterol plasmático é quantificado da mesmaforma por 5 \i\ de plasma (Abell e cols., 1974). Aconcentração de sais biliares é determinada por adição de 1ml de tampão (fosfato de potássio, pH 8,0, hidrato dehidrazina, NAD e hidroxiesteróide desidrogenase) a 2 (j.1 debile hepática ou 1 /il de bile da vesicula biliar. Essamistura de reação é incubada a 30°C por 30 minutos, e aabsorbância quantificada a 34 0 nm. Os valores obtidos sãointerpolados em uma curva-padrão de concentração detaurocolato (Talalay, 1960) . A fosfatidileolina(fosfolipideos) na bile é determinada por adição de 1 ml detampão (Tris-HCl pH 7,6, fenol, aminoantipirina, Triton X-100, CaCl2, fofolipase D, colina oxidase e peroxidase) a 5ul de bile hepática ou 1 jal de bile da vesicula biliar. Amistura de reação é incubada a 37°C por 10 minutos, e aabsorbância medida a 500 nm. Os valores obtidos sãointerpolados em uma cura-padrão de concentração defosfatidilcolina (Gurantz e cols., 1981).

Determinação do débito de lipídeos biliares. Em todos oscasos apresentados acima, o valor da concentração em mM édado em termos de débito, que indica a quantidade de cadaclasse de lipídeo secretada na bile por unidade de tempo,em relação ao peso do fígado ou do camundongo. O cálculo dodébito é realizado multiplicando-se o valor da concentraçãode cada lipídeo pelo fluxo de bile.

Glutation biliar. O glutation biliar foi quantificado dabile obtida por sondagem do dueto biliar por um período de5 minutos com tubos contendo 5 \i\ de ácidosulfossalicílico. Foram coletadas amostras em duplicatadessas amostras, e diluídas a 1:60 em ácidosulfossalicílico. A reação enzimática para medida daglutationa foi feita por adição de tampão (fosfato desódio, EDTA, DNTB, NADPH) e da enzima GSH redutase. Amistura de reação foi incubada a 3 7°C, medida a 412 nm, e acurva enzimática cinética foi obtida usando diferentesconcentrações de GST como padrão. A atividade enzimáticafoi transformada em concentração de glutationa presente nabile. Após a determinação da concentração de glutationbiliar, obtivemos o débito de glutationa como descritoanteriormente para os lipídeos biliares (Anderson, 1985).Determinação do índice de saturação de colesterol na bile de amostras da vesícula biliar. Esse índice foi obtidousando a concentração biliar de cada lipídeo (colesterol,sais biliares e fosfatidilcolina) . A partir dessasconcentrações, estabelecemos a quantidade total delipídeos, a percentagem de fosfolipídeos/(fosfolipídeos dosal biliar) e a percentagem molar de colesterol. Com essesdados e uma tabela para calcular o índice de saturação,fomos capazes de determinar o índice de saturação decolesterol, como descrito previamente (Carey, 1978).Perfil de lipoproteínas plasmáticas. A fim de caracterizaro perfil da lipoproteína plasmática, coletamos 40 jil desoro de 5 camundongos em cada grupo (pool de 200 |j,l paracada grupo experimental). As amostras foram carregadas emuma coluna de sefarose 6B (Cromatografia Líquida de PressãoRápida, FPLC, Pharmacia), onde as lipoproteínas sãoseparadas de acordo com seu peso. A coluna é eluída e asfrações coletadas (37 frações, 300 jil cada) . Para cadafração, o teor de colesterol é calculado, o que nospermitiu estabelecer a distribuição das lipoproteínasgrandes (VLDL, IDL/LDL) e pequenas (HDL) da forma a seguir.

Para cada fração coletada, adicionamos 200 p.1 da mistura dereação para medida do colesterol total (sem diluir comágua). A reação enzimática foi feita exatamente comodescrito para o colesterol biliar. O valor obtido para cadafração é dado como ug de colesterol por fração.

Determinação do colesterol hepático. O teor hepático decolesterol é quantificado a partir de tecido hepático (50mg) que é homogeneizado em clorof órmio/metanol 2:1. 0homogeneizado é incubado a 50°C por 30 minutos, e depois éadicionada H20 destilada para separação das fases. Amistura é turbilhonada e incubada a 4°C por duas horas, ecentrifugada a 1.000 rpm por 20 minutos. A fase inferior(hidrofóbica-clorofórmio) é removida e seca sob nitrogêniogasoso. Os lipídeos na parede do tubo são ressuspensos emclorofórmio mais Triton X-100 0,5% v/v. Quatro alíquotassão coletadas e secas em temperatura ambiente. O teor totalde colesterol foi medido para metade dos tubos pelo métodoenzimático descrito anteriormente para o colesterol biliar.Para a outra metade, o colesterol livre foi medido emtampão (Tris-HCl pH 7,6, Triton X-100, fenol 0,2%,aminoantipirina) mais as enzimas colesterol oxidase eperoxidase. As amostras são incubadas e quantificadas damesma forma descrita para o colesterol total. O teor deéster de colesterol para cada amostra é calculado como adiferença entre o colesterol total e o colesterol livre. Os valores obtidos em cada case são dados como mg decolesterol/g de fígado (Folch e cols., 1957).Expressão de sais biliares específicos (Ntcp, Bsep),fosfolipídeo (MDR2) e ânions orgânicos ou glutationa(MRP2); e determinação da síntese de glutationa(glutamilcisteína-sintetase (GGCS)).

Análise Western Blot. Avaliamos os níveis de expressãoprotéica dos transportadores de sais biliares Ntcp (pólosinusoidal) e Bsep (pólo canicular) por Western blotting emmembranas hepáticas totais ou membranas hepáticas plasmáticas de camundongos tratados com as diferentesdietas. As membranas totais foram obtidas de fragmentos defígado homogeneizados em Tris-HCl pH 7,5, MgCl2 e sacarose.Os homogeneizados foram centrifugados a 1.000 g paraseparar os núcleos, e os sobrenadantes foram entãocentrifugados a 100.000 g. O pélete, contendo as membranastotais, foi ressuspenso no tampão descrito acima, e asproteínas foram quantificadas pelo método de Bradford.Alíquotas contendo 50 \ig de proteína foram separadas porSDS-PAGE e transferidas para nitrocelulose. As membranasforam incubadas em tampão TBS-T (Tris-HCl pH 7,5, NaCl eTween-20), leite 5% p/v, mais ao anticorpos para avaliar asdiferentes proteínas (Bsep, Ntcp). Os anticorpossecundários foram IgG anti-coelho ou anti-camundongoacoplados â peroxidase. Os sinais protéicos foramdetectados pelo método ECL. Como controle interno de cargausamos beta-actina, uma proteína com expressão constitutivaque não altera seus níveis de expressão com as dietas e osfármacos usados.

Análise Northern Blot.

Extração de RNA total. 8 0 mg de tecido hepático congelado a-70°C foram homogeneizados em 800 ul de solução D, seguindoo método descrito por Chomczynski e Sacchi, 1987. Aconcentração de RNA foi calculada medindo-se a densidadeóptica a 260 nm, e sua pureza pela proporção OD26o/OD280 . Asamostras foram estocadas a -20°C.

Eletroforese de RNA. 10 ug de RNA total são secos sob N2gasoso ou vácuo por 10 minutos. 10 ^1 de tampão de cargaforam adicionados, e as amostras aquecidas até 65 °C,carregadas em um gel desnaturante de agarose1%/formaldeído, e processados a 100 volts por 4 horas. Aintegridade do RNA foi determinada pela visualização nítidados RNAs ribossômicos 28 S e 18 S (Figura 8).Northern Blot e hibridização com sondas radioativas. O gelcom as amostras de RNA é lavado com H20 DEPC por 10 minutospara eliminar o formaldeído, e depois incubado por 20minutos com 50 mM NaOH para hidrólise parcial do RNA. Apósuma lavagem de 10 minutos com H20 DEPC para eliminar oNaOH, as amostras são transferidas do gel para membranas denáilon (Hybond-N, Amersham Pharmacia) de um dia para ooutro por um sistema capilar. Após a transferência, o RNA éfixado à membrana por aquecimento a 80°C por 2 horas.Rotulagem da sonda por "síntese de novo". Para a rotulagemradioativa de sondas específicas para MDR2, MRP2 e gama-glutamilcisteína-sintetase (G-GCS), utilizamos o sistema derotulagem "Prime-a-gene", Promega, baseado no métododesenvolvido por Feiberg e Vogelstein, 1983. Usamos umfragmento do gene de interesse (gerado por PCR), dCTP-a-P32, uma mistura de nucleotídeos não rotulados e umfragmento de Klenow para a rotulagem da sonda. Apercentagem de radioatividade incorporada na sonda foisempre acima de 6 0%.

Hibridização de membrana com a sonda rotulada. A sonda foidesnaturada a 100°C por 5 minutos e incubada com a membranapré-hibridizada a 65 °C de um dia para o outro. Após 2lavagens, a membrana foi submetida à auto-radiografia.

Análise estatística. Os resultados são apresentados comomédia ± desvio padrão. A significância estatística entre osgrupos tratados com Ezetimiba e os controles foideterminada pelo teste T de Student não pareado. Um valorde p<0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS DO PROTOCOLO N° 1

Litíase da vesícula biliar.

100% dos camundongos que receberam uma dietalitogênica e água por engorda por 14 dias desenvolveramlitíases biliares e apresentaram cristais de monohidrato decolesterol na bile da vesícula biliar. Em contraste, nenhumdos camundongos que receberam uma dieta litogênica maisEzetimiba por engorda por 14 dias desenvolveu litíasesbiliares ou cristais de colesterol na vesícula biliar(Figura 1) . Como era esperado, os camundongos em uma dietade controle baixa em colesterol, tanto com água quanto comEzetimiba, não desenvolveram colelitíase ou cristais decolesterol na bile. Esse é o resultado crítico que apoia apresente invenção, a inibição completa da geração decolelitíase em um modelo experimental pré-clínico atravésdo uso de Ezetimiba, um potente bloqueador seletivo daabsorção intestinal de colesterol que pertence à família de2-azetidinona.

Peso corporal e do fígado

Não foi encontrada uma diferença significativa nopeso, no peso do fígado e índice de peso do fígado/corporaldos animais entre os camundongos na dieta de controle, comou sem Ezetimiba. Na dieta litogênica, foi observado umaumento significativo no peso do fígado. Esse aumento dopeso do fígado não é significativamente diferente entrecamundongos que não foram tratados com Ezetimiba e aquelesque foram tratados (Tabela 1).

Colesterol e lipoproteínas plasmáticas

A concentração de colesterol total no plasma foisimilar entre o grupo de camundongos na dieta de controle,com ou sem Ezetimiba. A concentração de colesterolplasmático aumenta em uma dieta litogênica por 14 diassimilarmente nos grupos com ou sem Ezetimiba (Tabela 1) .Esse resultado contrasta com os achados de outrospesquisadores que observaram diferenças significativasentre camundongos em uma dieta rica em colesterol, com esem Ezetimiba. No entanto, os experimentos mencionadosforam realizados por períodos de tratamento mais longos(acima de dois meses), o que pode explicar nossosresultados. O perfil da lipoproteína plasmática entre osgrupos experimentais que receberam Ezetimiba e os controlesnão mostrou diferenças significativas (Figura 2).

TABELA 1

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*, p<0,05 comparados com seu respectivo grupo de controle;&, p<0,05 comparados com o grupo em dieta litogênica, semEzetimiba.

Excreção fecal de colesterol e teor hepático de colesterol

A fim de verificar o efeito inibidor de Ezetimibasobre a absorção de colesterol na dieta de controle e nasdietas litogênicas usadas, quantificamos o teor hepático decolesterol e a excreção fecal de colesterol (esteróisneutros) . A excreção fecal de esteróis neutros em 24 horasno 13°-14° dias de experimentação foi de 5,3 6 jamol por diapor 100 g de camundongo na dieta de controle sem Ezetimiba;e de 19,98 |amol por dia por 100 g de camundongo na dieta decontrole mais Ezetimiba (incremento de 37%) , de acordo comestudos prévios em dietas baixas em colesterol similares.Nas dietas litogênicas, a excreção fecal de esteróisneutros (colesterol) aumenta significativamente em ambos osgrupos (8 vezes), sendo 55% maior nos camundongos quereceberam Ezetimiba comparados com os que não formatratados com Ezetimiba (Tabela 2) .

TABELA 2

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O teor hepático de colesterol em camundongos na dietade controle foi similar entre aqueles que receberam água ouEzetimiba, sendo ainda menor (20%) nesses últimos. O teortotal de colesterol aumentou significativamente noscamundongos em dieta litogênica (360%), no entanto, esseincremento é significativamente menor nos camundongos emdieta litogênica mais Ezetimiba (38%) (Tabela 1). O aumentono colesterol hepático corresponde a um aumento tanto noéster de colesterol quanto no colesterol livre, sendo maisrelevante o aumento do colesterol esterificado noscamundongos sem Ezetimiba. Esses resultados confirmam que ocolesterol da dieta que se acumula no fígado em uma dietalitogênica é drasticamente reduzido por Ezetimiba.Ezetimiba não afeta significativamente a excreção fecal desais biliares (Tabela 2), tanto na dieta de controle quantonas dietas litogênicas, de acordo com estudos prévios quedemonstram a seletividade de Ezetimiba na inibição daabsorção intestinal de colesterol.

Teor lipídico e índice de saturação de colesterol na bileda vesícula biliar

Na dieta de controle, Ezetimiba não induziu alteraçõessignificativas no teor de colesterol, sais biliares ou lecitina na bile da vesícula biliar dos camundongos; oíndice de saturação de colesterol também foi similar emambos os grupos (Tabela 3).

TABELA 3

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Como já se sabe, a dieta litogênica por si sódesencadeia um aumento significativo no teor de colesterolna bile da vesícula biliar (4-5 vezes), sem causaralterações significativas nos sais biliares ou lecitina;portanto, o índice de saturação de colesterol também éaumentado significativamente (2-3 vezes). O tratamento comEzetimiba em uma dieta litogênica notoriamente diminui oteor de colesterol na bile da vesícula biliar (50-60%), comuma redução concomitante no índice de saturação decolesterol (50%). Na verdade, o índice de saturação decolesterol e os valores do teor de colesterol na bile davesícula biliar de camundongos em dieta litogênica maisEzetimiba foram similares àqueles obtidos por outrospesquisadores usando modelos murídeos com dietas com alto ebaixo teores de colesterol, com e sem Ezetimiba (mas naausência de ácido eólico e gordura) (Repa e cols.t 2002).Fluxo biliar e secreção hepãtica de lipídeos e glutationa

O fluxo biliar e a secreção hepãtica de lipídeostambém foram estabelecidos nos quatro grupos experimentais,representando observações originais adicionais que sãoparte de nossa invenção. Em dieta de controle com baixocolesterol, Ezetimiba produz um ligeiro aumento nãosignificativo no fluxo biliar (30-40%) (Figura 4). Como jáse sabe, uma dieta litogênica por si só aumentasignificativamente o fluxo biliar (200-300%) , além deaumentar a secreção biliar de lipídeos, sais biliares,lecitina e colesterol (Figura 3). Surpreendentemente, otratamento com Ezetimiba em dieta litogênica desencadeou umincremento ainda maior no fluxo biliar, significativamentemaior do que o do grupo em dieta litogênica sem Ezetimiba(50-60% maior). Percebemos que esse incremento maior dofluxo biliar estava associado a um aumento da secreção desais biliares e de fosfolipídeos (dependente da secreção desais biliares), mas não estava associado a uma secreçãomaior de colesterol biliar, comparado com o grupo que nãorecebeu Ezetimiba (Figura 3) . Como o fluxo biliar dependeprincipalmente da secreção hepãtica de sais biliares, mastambém da secreção biliar de outros solutos comoglutationa, quantificamos a secreção biliar de glutationanos camundongos em dieta litogênica, com e sem Ezetimiba.Observamos um aumento significativo da secreção deglutationa (200%) nos camundongos tratados com Ezetimibacomparados com aqueles que receberam apenas a dietalitogênica (Figura 4). Esses resultados sugerem que, em umadieta litogênica, Ezetimiba aumenta o fluxo biliar pormecanismos dependentes e independentes (glutationa) de saisbiliares, o que poderia ser relevante como mecanismosadicionais que favorecem a inibição de colelitíase nessemodelo pré-clínico.

Expressão hepática de proteínas ou seus mRNAs envolvidos notransporte de colesterol, sais biliares e xenobiõticosglucuronizados.

A fim de estabelecer se as diferenças observadas nofluxo biliar e na secreção de lipideos biliares e deglutationa entre o grupo de camundongos tratados com dietalitogênica e o grupo em dieta litogênica mais Ezetimiba por14 dias poderiam ser explicadas por alterações na expressãohepãtica de transportadores específicos para esses solutos(fosfolipídeos, sais biliares e ânions orgânicos) ,determinamos seus níveis de expressão por vestem blottinge/ou northern blotting. Não houve diferenças significativasentre os grupos na expressão hepãtica de SR-BI, Ntcp, Bsep,MRP2 e GGCS. Houve apenas uma ligeira, mas estatisticamentesignificativa, diminuição importante no transportador defosfolipídeo MDR2 no nível de mRNA. No entanto, não houvediminuição concomitante nos níveis de proteína mdr2 (dadosnão mostrados) ou uma maior secreção biliar defosfolipídeos em camundongos em dieta litogênica maisEzetimiba. Portanto, propusemos que o aumento do fluxobiliar e da secreção de sais biliares, fosfolipídeos eglutationa em camundongos em dieta litogênica maisEzetimiba comparados com aqueles em dieta litogênica semEzetimiba, não é causado por alterações da expressão detransportadores específicos. Essas alterações poderiam serexplicadas pelo efeito subtrativo de Ezetimiba no teorhepático de colesterol. Há a hipótese de que fígados commenor teor de colesterol (com remoção de colesterol) têmuma capacidade maior para transportar solutos como saisbiliares, lecitina e glutationa do que fígadossobrecarregados de colesterol. Esse é um ponto de vistainovador e permite sugerir que Ezetimiba poderia ter umefeito protetor contra xenobióticos endógenos (coléstase,ácidos graxos) ou exógenos (alguns ânions orgânicos).

RESULTADOS PROTOCOLO N° 2

Como a Ezetimiba inibiu a formação de litíasesbiliares no protocolo de 2 semanas (14 dias), queríamosestabelecer se seus efeitos eram mantidos por períodos dedieta mais longos. Portanto, fornecemos Ezetimibadiretamente na dieta litogênica (e não por engorda) duranteo dobro do período de tempo (30 dias) . Novamente, o uso deEzetimiba inibiu completamente a formação de litíasesbiliares de colesterol (Figura 5) . Como era esperado, 100%dos camundongos em dieta litogênica desenvolveramcolelitíase; em contraste, nenhum dos animais (0%) sob amesma dieta mais Ezetimiba desenvolveu litíases biliares oucristais de colesterol na vesícula biliar. Esse últimoresultado demonstra categoricamente o efeito protetorpotente e prolongado de Ezetimiba sobre o desenvolvimentode colelitíase em um modelo murídeo.

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Claims (7)

1. Uso de compostos da família de 2-azetidinona,caracterizado pelo fato de ser usado para a prevenção ou otratamento de doença por litíase biliar de colesterol, ouseja, colelitíase, em pacientes que sofrem dessa doença ouem risco de desenvolver tal condição; também para aumentarnesses pacientes o fluxo de bile e a secreção biliar decompostos que inibem a formação de litíases biliares decolesterol.

2. Uso de compostos da família de 2-azetidinona, deacordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato deser para o uso de uma dose terapeuticamente eficaz decompostos da família de 2-azetidinona que inibemseletivamente a absorção intestinal de colesterol.

3. Uso de compostos da família da azetidinona, deacordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato deser para o uso de uma dose terapeuticamente eficaz entre 0,1-6,0 mg/kg do peso corporal por dia.

4. Uso de compostos da família de 2-azetidinona, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3,caracterizado pelo fato de que os composto selecionadosusados para a prevenção ou o tratamento de litíase davesícula biliar são compostos que consistem essencialmenteem Ezetimiba (SCH 58235) ou qualquer um de seus metabólitosglucuronicos ativos ou seus análogos fenólicos.

5. Uso de compostos da família de 2-azetidinona, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4,caracterizado pelo fato de que os compostos selecionadosusados para a prevenção ou o tratamento de litíase davesícula biliar são compostos da família de 2-azetidinonaou seus análogos derivados, associados a pelo menos umagente regulador do metabolismo lipídico do grupo deinibidores da enzima HMG-CoA redutase.

6. Uso de compostos da família de 2-azetidinona, deacordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato deque os compostos selecionados usados para a prevenção ou otratamento de litíase da árvore biliar são compostos dafamília de 2-azetidinona ou seus análogos derivados,associados a pelo menos um agente regulador do metabolismolipídico do grupo de inibidores da enzima HMG-CoA redutase,por exemplo, pravastatina, sinvastatina, rosuvastatina,lovastatina, fluvastatina, atorvastatina e cerivastatina esuas apresentações farmacêuticas aceitas.

7. Uso de compostos da família de 2-azetidinona, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato deserem usados como uma composição farmacêutica para aprevenção ou o tratamento de doença litiásica que tem umcomposto da família de 2-azetidinona em uma doseterapeuticamente eficaz entre 0,1-6,0 mg/kg do pesocorporal por dia, e um segundo fármaco que corresponde a umagente regulador do metabolismo lipídico do grupo deinibidores da enzima HMG-CoA redutase, presente em doses de-10 mg até 80 mg por dia por dose.