BRPI0609633A2

BRPI0609633A2 - espécies oxidáveis como uma referência interna em soluções de controle para biossensores

Info

Publication number: BRPI0609633A2
Application number: BRPI0609633-6A
Authority: BR
Inventors: Greg P Beer; Huan-Ping Wu
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2010-04-20
Also published as: JP2008536125A; TW200641352A; EP2267150B1; PL2267150T3; EP2267150A1; RU2007141387A; WO2006110504A1; RU2453843C2; HK1173214A1; US9244078B2; HK1205258A1; CN101180403B; US20140147872A1; MX2007012373A; BRPI0609633B1; US20160091454A1; CA2603542C; EP1869203A1; CN102778487B; CN102778487A

Abstract

ESPéCIES OXIDáVEIS COMO UMA REFERêNCIA INTERNA EM SOLUçõES DE CONTROLE PARA BIOSSENSORES. O teste do desempenho de um medidor eletroquímico, usado para medir a presença de um analito em uma amostra biológica, particularmente, glicose em sangue integral, inclui a introdução de uma solução de controle contendo uma proporção predeterminada do analito e uma proporção predeterminada de um composto de referência interna. O composto de referência interna é selecionado de modo que seja oxidado a um potencial superior do que aquele usado para oxidar o analito, possibilitando distinguir a solução de controle de uma amostra biológica.

Description

"ESPÉCIES OXIDAVEIS COMO UMA REFERÊNCIA INTERNA EMSOLUÇÕES DE CONTROLE PARA BIOSSENSORES"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é dirigida, de uma maneira geral, aocampo de dispositivos médicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Mais especificamente, esta invenção se refere abiossensores, que são usados para medir a proporção de ana-lisados em fluidos corpóreos. Os métodos ópticos são fre-qüentemente usados para fazer essas medidas, mas a presenteinvenção se refere a aperfeiçoamentos em biossensores ele-troquimicos. Ainda que o método descrito aqui possa ser a-pliçado à medida de outros analisados, incluindo colesterol,uréia, creatinina e creatina, a medida de glicose em sangueintegral é de particular interesse. Embora a descrição aquivá enfatizar a aplicação da invenção na medida de glicose,deve-se entender que a invenção tem aplicações mais amplas.

A invenção se refere a um instrumento eletroquimi-co no qual um potencial é aplicado a eletrodos em contatocom uma amostra biológica e reagentes. A corrente resultanteé medida, enquanto o analisado está reagindo com os, reagen-tes, e depois correlacionada com a proporção de um analisadona amostra. Esses instrumentos são referidos como amperome-tricos , em contraste com os instrumentos colorimétricos, quemedem a carga total em coulombs, produzidos da reação da a-mostra por integração da corrente por todo o tempo de medi-da. Os instrumentos amperometricos têm uma vantagem pelo fa-to de que eles são menos dependentes de volume e tempo. Nãoesperam que todo o volume do analisado seja reagido, mas a-penas fazem medidas no analisado por amostragem da taxa dereação a um tempo predeterminado.

Muitos projetos para esses biossensores foram des-critos na técnica, por exemplo, no pedido de patente U.S.2001/0042 683. Os eletrodos são descritos de uma maneira ge-ral como o eletrodo de trabalho e como o contra-eletrodo. Oseletrodos ficam em contato com uma camada sólida contendoreagentes, que oxidam o analisado na amostra, tal como gli-cose oxidase, e mediadores que reoxidam a enzima reduzida. Opróprio mediador reduzido é oxidado no eletrodo de trabalho,que produz uma corrente mensurável. Essa corrente é usadapara calcular a proporção de glicose na amostra sendo testa-da, uma vez que é uma medida Indireta da oxidação de glicosena amostra. as reações podem ser descritas pelas seguintesetapas:

<formula>formula see original document page 3</formula>

em que EOXid e Ered são as formas oxidada e reduzidado centro de. oxirredução da enzima e MedOXid e Medred são asformas oxidada e reduzida do mediador.

Para medir glicose, a enzima pode ser glicose oxi-dase e o mediador ferricianeto. A medida de outros analisa-dos vai empregar enzimas e mediadores adequados. As combina-ções típicas de enzima, mediador e analisado são listadas naTabela 1.TABELA 1 - Sistemas de substratos, enzimas e medi-adores

<table>table see original document page 4</column></row><table>

Para garantir medidas precisas, soluções de con-trole contendo proporções conhecidas de glicose são usadaspara verificar que o instrumento está funcionando adequada-mente . A composição das soluções de controle foi obj eto devárias patentes e publicações. São representativas as paten-tes U.S. 3.920.580, 4.572.899, 5.028.542 e 5.605.837, os pe-didos de patentes internacionais WO 93/21928, 95/13535 e95/13536. Ainda que as soluções de controle contendo sorode sangue tenham sido usadas, as patentes mais recentes sepreocuparam com a substituição das soluções de controle àbase de soro com soluções isentas de soro, uma vez que assoluções isentas de soro são mais consistentes e estáveis doque aquelas contendo soro. A solução de controle deve conter- uma concentração conhecida de glicose em uma matriz similara soro, para determinar a precisão de ambos o biossensor en-zimático e o medidor do potenciometro. Vai ser evidente quea composição deve ser estável por periodos mais longos dearmazenamento, antes de uso.As soluções de controle devem servir para a fina-lidade de checar o funcionamento do sistema de monitoramentode glicose, mas devem ser, ao mesmo tempo, identificadas eseparadas das leituras das amostras de sangue reais. Isso éporque as soluções de controle contêm proporções conhecidasde glicose e proporcionam leituras que não têm qualquer fimterapêutico. Se as soluções de controle não podem ser iden-tificadas e as suas respostas separadas daquelas das amos-tras de sangue pelo medidor de teste, as leituras de glicosedas soluções de controle vão ser incluídas na história dasmedidas de glicose, o que pode levar a uma interpretação er-rada de uma condição diabética de paciente. Ou, se uma solu-ção de controle for substituída por uma amostra de sangue,pode ser considerada erroneamente por um médico como indi-cando uma necessidade para mudança de tratamento. Além domais, uma vez que a resposta de temperatura das soluções decontrole é diferente daquela das amostras de sangue, a com-pensação de temperatura paras as medidas feitas em tempera-turas diferentes de 25°C vai ser menos precisa, se um medi-dor de teste não puder distinguir entre as amostras de san-gue e as soluções de controle. Portanto, é altamente desejá-vel que o sistema de monitoramento de glicose detecte e i-dentifique, automaticamente, as soluções de controle, paraseparar as leituras de glicose das soluções de controle da-quelas das amostras de sangue, e proporcione uma compensaçãode temperatura para ambas as amostras de sangue e as soluções de controle.Pode haver várias patentes descrevendo métodos deidentificação das soluções de controle por vários mecanis-mos . Na patente U.S. 5.723.284, a medida eletroquimica deglicose no sangue é discutida. A patente 1284 proposta paramodificar as soluções de controle, .alterando a razão dasleituras de momento, tomadas dos dois periodos de oxidaçãoseparados por um periodo de repouso. 0 medidor vai reconhe-cer que uma solução de controle estava sendo medida e tomara ação adequada, para impedir- que os resultados sejam inclu-ídos nos resultados das amostras de sangue. A patente '284também ensina que a solução de controle deve ser tamponadaem uma faixa de pH de 4,8 a 7,5, para que seja efetiva.

Outro método para determinar se uma solução decontrole ou uma amostra de sangue está sendo medida para oseu teor de glicose é descrito no pedido de patente U.S.2002/0139692A1 publicado. Um Índice é determinado que se re-fere à diminuição de corrente elétrica para a natureza daamostra sendo testada.

As patentes U.S. 5.620.579 e 5.653.863, foram pro-postas para começar o teste de uma amostra ao proporcionarum pulso de potencial positivo inicial por um curto período,para reoxidar qualquer mediador reduzido prematuramente. Es-se pulso inicial foi referido como um "período de queima".

Quando um potencial é aplicado pelos eletrodo detrabalho e contra-eletrodo e uma amostra. líquida é introdu-zida no sensor, os reagentes secos são reidratados pela a-mostra líquida e a corrente começa a escoar, aumentando, ti-picamente, a um pico e depois diminuindo pelo "período dequeima", usualmente de uma duração de cerca de dez segundos.Durante esse período, o mediador previamente reduzido é reo-xidado para reduzir a tendência para resultados altamenteincorretos. Se uma quantidade total de amostra não estiverpresente, um erro adicional pode ser introduzido, uma vezque todos os reagentes podem não ficar disponíveis para areação, ou os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo podemnão ficar em contato completo com a amostra, reduzindo, des-se modo, a corrente durante o período de "queima".

Após o per iodo de queima ter sido completado, umperíodo de repouso é proporcionado a um potencial mais baixoou sem potencial (circuito aberto). Durante esse periodo derepouso, a reação de oxidação de glicose continua a ocorrere o mediador é reduzido. Depois, um potencial constante éaplicado de novo entre os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo e a corrente é medida por um"curto periodo, tipica-mente em torno de dois a dez segundos. A corrente é inicial-mente alta, mas diminui rapidamente na medida em que a difu-são do mediador começa a controlar. A um momento predetermi-nado, a corrente medida é usada para determinar o teor de glicose da amostra.

A adição de um composto de referência interna éuma prática comum em quimica analítica para proporcionar umsinal de referência quantitativo. Esse principio operacionaltem sido usado em um pedido de patente recém-publicado WO2005/078118, no qual uma referência interna é adicionada aosistema reagente para obter alguma formulação fim.No pedido de patente internacional

W02004/040286A1, propõe-se que a solução de controle incluauma substância redutora selecionada de ácido úrico, bilirru-bina, ácido ascórbico, azul de metileno, bis(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano, ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminometano sulfônico, e acetamidofeno, vari-ando, desse modo, a razão das leituras de corrente tomadasde dois periodos de oxidação separados por um periodo de re-pouso e possibilitando a identificação da solução de controle.

Os presentes inventores buscaram um método de identificação aperfeiçoado para a distinção de soluções decontrole de amostras biológicas. Os seus métodos são descritos em detalhes abaixo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona um método para distin-guir uma solução de controle de uma amostra biológica, du-rante a operação de um medidor eletroquimico por um Índicequantitativo. Em uma modalidade, a invenção é uma solução decontrole, que inclui proporções conhecidas de glicose, umsistema tampão' com um valor de pH adequado, e um composto dereferência interna. 0 composto de referência interna é adi-cionado à solução de controle para identificar a solução decontrole pelo sistema de monitoramento de glicose. A inven-ção proporciona um método de detecção da presença do compos-to de referência interna, cálculo do indice quantitativo eidentificação de que a solução de controle está sendo testada.Em uma modalidade, o analisado na amostra biológi-ca é glicose em sangue integral e o mediador é ferricianetode potássio. 0 composto de referência interna é oxidável aum potencial mais alto do que o potencial necessário paraoxidar o mediador, que é usado para medir a oxidação do ana-lisado. A referência interna tem uma concentração predeter-minada na solução de controle, juntamente com uma concentra-ção predeterminada de glicose. 0 mediador relacionado comglicose e a referência interna são oxidados seletivamente noeletrodo por diferentes potenciais (baixos e altos). Quandoa glicose é o analisado, o composto de referência internadeve ser oxidável a um potencial de pelo menos 100 mV maisalto do que o potencial usado para reoxidar o mediador reduzido .

Os compostos de referência interna, úteis para me-dir glicose em soluções de controle, incluem quaisquer espé-cies oxidáveis no eletrodo a um potencial adequado, tais co-mo compostos organometálicos, compostos de coordenação ecompostos de aminas orgânicas. A proporção do composto dereferência interna usada é relacionada com a proporção deglicose na solução de controle. De preferência, a proporçãodo composto de referência interna é selecionada de modo quea solução de controle possa ser reconhecida, quando a glico-se na solução de controle for o máximo necessário para tes-tar o medidor de glicose eletroquimico. Alternativamente, aproporção do composto de referência interna pode ser variadaem relação à proporção de glicose.As medidas comparativas feita em potenciais baixose altos proporcionam um método para detectar o composto dereferência interna e, desse modo, a solução de controle.Quando o protocolo de medida emprega dois periodos separadospor um per iodo de repouso, as voltagens alta e baixa podemser aplicadas em qualquer um ou em ambos os periodos. Um po-tencial é aplicado a um sensor, que recebeu a solução decontrole. A corrente produzida a um potencial capaz de oxi-dar o composto de referência interna é comparada com a cor-rente produzida, quando de um potencial capaz de oxidar ape-nas o analisado (por exemplo, glicose), mas não o compostode referência interna. A razão entre as duas correntes medi-das , designada o índice Diferencial (Dl) , proporciona ummeio para distinguir a solução de controle de uma amostraliquida desprovida do composto de referência interna.

<formula>formula see original document page 10</formula>

em que iaita voit. e ibaixa voit. são as correntes medi-das em alta e baixa voltagens. Na voltagem mais alta, amboso composto de referência interna e o mediador reduzido sãooxidados, enquanto que na voltagem mais baixa apenas o medi-ador é oxidado.

Um valor de Dl de cerca de 1 indica que a amostraé desprovida do composto de referência interna e presume-seque seja uma amostra biológica, enquanto que um valor Dlsignificativamente superior a 1, de preferência, pelo menoscerca de 1,5, indica que a amostra é uma solução de controle.Em outra modalidade, a invenção é um composto dereferência interna, adequado para indicar a presença de umasolução de controle, que está sendo usada para testar a pre-cisão de um sistema biossensor eletroquimico / potenciôme-tro. Quando o analisado é glicose em sangue integral, o com-posto de referência interna pode ser um composto organometá-lico oxidável, um composto de coordenação ou uma amina orgâ-nica .

Uma conseqüência da presente invenção é o aperfei-çoamento da consistência da corrente medida e da precisão daanálise resultante. Se potenciais alto e baixo são aplicadosdurante o mesmo periodo de oxidação, tais como os periodosde queima e leitura usados na oxidação de glicose, é menosprovável que fatores externos, tais como o movimento da a-mostra ou a temperatura ambiental, afetem o índice Diferen-cial. As leituras múltiplas da corrente desenvolvida a vol-tagens alta e/ou baixa podem aperfeiçoar a precisão dos re-sultados . Também, quando a presença de uma solução de con-trole foi determinada, um algoritmo de correção de tempera-tura particular para a solução de controle pode ser aplica-do. Por uso de diferentes algoritmos de temperatura para asolução de controle e a amostra biológica (por exemplo, san-gue integral), os resultados clinicos podem ser aperfeiçoa-dos e valores de faixas de controle mais estreitas podem ser atribuídos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma vista detalhada de um biossensorde acordo com uma modalidade.A Figura 2 é uma vista montada do biossensor da Figura 1.

A Figura 3 é uma representação gráfica de potencial versus tempo para um periodo de queima.

A Figura 4 é uma representação gráfica de correnteversus tempo para o potencial aplicado como a Figura 3.

A Figura 5 é um curva corrente - potencial ciclicadescrita no Exemplo 1.

A Figura 6 é um curva corrente - potencial ciclicadescrita no Exemplo 2.

A Figura 7 é um curva corrente - potencial ciclicadescrita no Exemplo 3.

A Figura 8 é um curva corrente - potencial ciclicadescrita no Exemplo 4.

As Figuras 9A - E ilustram as seqüências de poten-ciais descritas no Exemplo 5.

As Figuras 10a - b são curvas corrente - potencialciclicas descritas no Exemplo 6.

A Figura 11 é uma representação gráfica de corren-te versus tempo obtida no Exemplo 7.

A Figura 12 é uma representação gráfica de corren-te versus tempo obtida no Exemplo 8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS

Descrição das modalidades preferidas

A invenção vai ser descrita abaixo como aplicada àmedida de teor de glicose de sangue integral, um método deinteresse comercial. No entanto, o método da invenção temoutras aplicações nas quais outros analisados, tais como co-lesterol, uréia, creatinina e creatina, são encontrados emfluidos biológicos, tais como urina, saliva e fluido inters-ticial, e quando soluções de controle são usadas para checara precisão de medidores eletroquimicos.

Biossensores eletroquimicos

A presente invenção não é limitada a um projeto debiossensor particular entre os muitos que foram descritos natécnica. Um exemplo de um biossensor, que pode ser usado, édescrito na patente U.S. 6.531.040, que é ilustrada nas Fi-guras 1 e 2.

O biossensor 10 é mostrado em uma vista detalhadana Figura 1. Compreende uma base isolante 12, na qual se im-prime em seqüência (tipicamente por técnicas de impressão emtela), um modelo de condutor elétrico 14, um modelo de ele-trodo (partes 16 e 18), um modelo isolante (dielétrico) 20 euma camada de reação 22, e completada por uma camada de co-bertura 28. O capilar 30, formado entre a camada de cobertu-ra 28 e a camada de reagente 22, proporciona um caminho deescoamento para a amostra de teste fluida. O biossensor émostrado na Figura 2, na qual todos os elementos na base sãomostrados no mesmo plano.

A função da camada de reação 22 é promover uma re-ação química com glicose, ou outro analisado na amostra deteste fluida, e produzir uma corrente elétrica, que é medidae correlacionada com a proporção do analisado presente. Acamada de reação 22 contém tipicamente uma enzima ou enzimase um aceptor de elétrons. A enzima reage com o analisado pa-ra produzir elétrons, que são transportados para a superfi-cie do eletrodo de trabalho por um aceptor de elétrons. 0aceptor de elétrons, também referido como um mediador, quetem sua resposta reduzida à reação entre o analisado e a en-zima . A enzima na camada de reação pode ser combinada com umpolímero hidrofilico, tal como poli (oxido de etileno). Umaenzima, que pode ser usada para reagir com glicose, é glico-se oxida se, e o mediador pode ser um sal de f erricianeto,usado com um tampão mantendo um pH de cerca de 5 - 7. Outraenzima, que pode ser usada, é glicose desidrogenase, junta-mente com um co-fator, tal como pirroloquinolina quinona(PQQ), usado com um tampão mantendo um pH de cerca, de 6 - 8.

As duas partes 16, 18 do modelo do eletrodo pro-porcionam os respectivos eletrodo de trabalho e contra-eletrodo, necessários para a determinação eletroquimica daconcentração do analisado. Um aspecto do projeto mostrado éque os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo são configura-dos de modo que a grande parte do contra-eletrodo seja loca-lizada a j usante (em termos da direção de escoamento defluido ao longo do caminho de escoamento), a partir da parteexposta do eletrodo de trabalho 16a.

0 sub-elemento contra-eletrodo 18a, no entanto, éposicionado a montante do elemento superior eletrodo de tra-balho 16a, de modo que, quando uma quantidade da amostra defluido de teste (por exemplo, uma amostra de sangue inte-gral), inadequada para cobrir completamente o eletrodo detrabalho, entra no espaço capilar, uma conexão elétrica seforma entre o sub-elemento contra-eletrodo 18a e a parte ex-posta do eletrodo de trabalho 16a, devido à condutividade daamostra de sangue integral. A área do contra-eletrodo, noentanto, que é disponível para contato pela amostra de san-gue integral, é tão pequena que apenas uma corrente muitofraca pode passar entre os eletrodos e, desse modo, pelo de-tector de corrente. Quando o sinal recebido estiver abaixode um certo nivel predeterminado, o dispositivo sensor in-forma ao usuário que sangue insuficiente entrou na cavidadedo sensor e que outro teste deve ser conduzido, ou que maissangue deve ser adicionado. Ainda que as dimensões particu-lares dos eletrodos não sejam criticas, a área do sub-elemento contra-eletrodo 18a é tipicamente menor do que cer-ca de 10% do que daquela do eletrodo operacional e, mais es-pecificamente, inferior a cerca de 6%.

Os eletrodo de trabalho e contra-eletrodo são ge-ralmente impressos usando tinta de eletrodo, que é de umaespessura de geralmente cerca de 14 u/m (0, 00055') e contém,tipicamente, carvão eletroquimicamente ativo. Os componentesda tinta condutora podem ser uma mistura de carvão e prata,que é selecionada para proporcionar um caminho de resistên-cia condutiva baixa entre os eletrodos e o medidor, com oqual estão em conexão operante, por contato com o modelocondutor em uma extremidade de rabo de peixe 26 do sensor. Ocontra-eletrodo pode ser compreendido de prata / cloreto deprata, embora carvão seja o preferido. Para melhorar a re-produtibilidade da leitura do medidor, o modelo dielétricoisola os eletrodos das amostra de teste de fluido, exceto emuma área definida próxima ao centro do modelo do eletrodo24. Com referência à Figura 2, uma área definida é importan-te nesse tipo de determinação eletroquimica, porque a cor-rente medida depende não apenas da concentração do analisadoe da área da camada de reação 22, mas também da área do ele-trodo de trabalho 16a, que é exposta à amostra de teste con-tendo analisado.

Uma camada dielétrica tipica 20 compreende um mo-nômero, oligômero ou polímero modificado com acrilato curadopor UV, e é de uma espessura de cerca de 10 (im (0, 0004')- Acamada dielétrica também pode ser curável por umidade ou cu-rável termicamente. Uma tampa ou cobertura 28 é adaptada pa-ra conformar-se com a base, para formar um espaço para rece-ber a amostra de teste de fluido, no qual os eletrodo detrabalho e contra-eletrodo estão situados. A tampa 2 8 pro-porciona um espaço côncavo 30, e é formada tipicamente porestampagem em relevo de uma folha plana de material deformá-vel. A tampa 28 é perfurada para proporcionar uma ventilaçãode ar 32 e unida à base 12 em uma operação de vedação. Atampa e a base podem ser unidas por soldagem sônica, na quala base 12 e a tampa 28 são primeiro alinhadas e depois com-primidas conjuntamente entre um elemento de vedação térmicavibratório ou corneta e um mordente estacionário. O contatoé feito apenas com as regiões não estampadas, planas da tam-pa. A energia ultra-sônica de um cristal ou outro transdutoré dissipada como calor na junta polimérica, propiciando aligação dos materiais termoplásticos. A tampa e a base es-tampadas também podem ser unidas por uso de um material ade-sivo no lado inferior da tampa. O método de união da tampa eda base é descrito mais detalhadamente na patente U.S.5.798.031.

Os materiais adequados para a base isolante 12 in-cluem policarbonato, poli (tereftalato de etileno), polime-ros acrílicos e de vinila dimensionalmente estáveis, e mis-turas poliméricas tal como policarbonato / poli (tereftalatode etileno), e estruturas de folhas metálicas (por exemplo,um laminado de náilon / alumínio / poli (cloreto de vinila).A também é tipicamente fabricada de um material de folha po-limérica deformável, tal como policarbonato, ou um grau es-tampável de poli (tereftalato de etileno) , poli (tereftalatode etileno) modificado com glicol, ou uma composição de fo-lha metálica (por exemplo, uma estrutura de folha de alumínio) .

Outros proj etos de sensores eletroquimicos podemser usados na presente invenção. Os exemplos de um sensoreletroquimico, que pode ser usado para medir concentraçõesde glicose, são aqueles usados nos sistemas HealthCare1s As-censia® DEX® e ELITE® da Bayer. Mais detalhes desses senso-res eletroquimicos podem ser encontrados nas patentes U.S.5.120.420 e 5.320.732. Outros sensores eletroquimicos, quepodem ser usados em um sistema de monitoramento amperométri-co, são descritos na patente U.S. 5.429.735.

Os sensores eletroquimicos podem ser localizadosem um instrumento de dispensação de sensor de glicose nosangue, portando uma pluralidade de sensores ou elementos deteste. Um exemplo de um grupo de sensores, colocado em uminstrumento de dispensação de sensor, é descrito na patenteU.S. 5.660.791.

Medida de glicose em sangue integralEm um bios sensor tipico para medida do teor deglicose de sangue integral, os eletrodo de trabalho e con-tra-eletrodo são revestidos com uma camada única de reagentepor co-impressão ou co-deposição. A camada de reagente vaiincluir tipicamente alguns polímeros e os ingredientes rea-tivos, isto é, uma enzima que oxida a glicose na amostra desangue, e um mediador, isto é, um composto de oxirreduçãoque reoxida a enzima, após ela ter sido reduzida por oxida-ção de glicose. 0 mediador reduzido conduz elétrons da rea-ção enzimática de oxidação de glicose para o eletrodo detrabalho e é reoxidado na superfície do eletrodo. 0 diferen-cial de voltagem aplicado entre os dois eletrodos resulta nomediador passando elétrons para o eletrodo de trabalho, cri-ando uma corrente mensurável que é proporcional à quantidadede glicose na amostra. O biossensor também pode compreendermúltiplas camadas de reagentes, ou pode compreender diferen-tes camadas de reagentes múltiplas em cada eletrodo, os ele-trodo de trabalho e contra-eletrodo.

Como descrito acima, os sensores amperométricosaplicam um potencial fixo pelos eletrodos e a corrente pro-duzida é medida por um periodo de tempo predeterminado, quepode ser muito curto, isto é, de 5 a 10 segundos, para cor-rigir a tendência que pode apresentar devido à redução pre-matura do mediador. Em um sistema preferido, um potencial éaplicado por dois periodos de tempo, separados por um perio-do de repouso. Uma representação gráfica representativa dopotencial versus tempo para o primeiro ou "período de quei-ma" é apresentada na Figura 3. A Figura 4 mostra uma repre-sentação gráfica representativa da corrente versus tempo queresulta. A corrente aumenta a um pico, enquanto que a amos-tra está reidratando a camada de reagente, permitindo que asreações de oxidação e redução ocorram, e depois diminui namedida em que a difusão começa controlar. Após esse breveperíodo, o potencial aplicado é removido ou pelo menos redu-zido, durante um periodo de repouso, enquanto que a oxidaçãode glicose e a redução do mediador continuam. Depois, o po-tencial é reapliçado por um segundo periodo e a corrente me-dida pelo periodo de "leitura" (por exemplo, dez segundos).Uma vez que o mediador reduzido está presente em conseqüên-cia da oxidação.concomitante da enzima, a corrente produzidainicialmente é alta, mas depois diminui rapidamente e se a-proxima de uma condição controlada por difusão em estadoconstante- A corrente registrada ao final do curto periodode "leitura" é usada para determinar o teor de glicose daamostra de sangue, por uma correlação obtida previamente en-tre a corrente ao final do periodo de leitura e a glicosecontida nas amostras de teste tendo concentrações conhecidas .

Soluções de controle

Como discutido acima, várias abordagens foram con-sideradas para garantir que uma solução de controle propor-cione leituras precisas e que possa ser distinguida de umaamostra biológica. A presente invenção emprega uma espécieoxidavel (isto é, uma referência interna), que é oxidavelapenas em voltagens mais altas do que aquelas usadas paramedidas de glicose (ou outro analisado). Isso significa quea um baixo potencial, adequado para oxidar inteiramente omediador relacionado com a glicose, mas não o composto dereferência interna, apenas a glicose vai ser medida. No en-tanto, quando o potencial é suficientemente alto para oxidaro composto de- referência interna adicionado, tanto a glicosequanto o composto de referência interna vão ser oxidados.Embora a glicose seja oxidada no potencial mais alto, a me-dida feita a uma voltagem mais baixa já é limitada por difu-são e não depende da quantidade total de glicose oxidada pe-la enzima. É viável, no entanto, adicionar essa espécie dereferência interna a uma solução de controle e usá-la paraidentificar a solução como um controle e não como uma amos-tra biológica.

A diferença entre as correntes medidas nas volta-gens alta e baixa pode ser comparada para indicar a presençada característica de referência interna da solução de con-trole . 0 índice Diferencial (Dl) seguindo os componentes decorrente relativos à glicose e ao composto de referência in-terna é:

<formula>formula see original document page 20</formula>

em que: iaita voit. é a corrente medida na voltagemmais alta e ibaixa voit. é a corrente medida na voltagem maisbaixa.Segue-se que se a referência interna não estiverpresente (tal como nas amostras de sangue) , iref ±nt deve serzero e a iaita voit. vai ser substancialmente igual à ibaixa voit.•Desse modo, o valor de Dl vai se aproximar de 1. Quando areferência interna estiver presente, o valor de Dl vai sermaior do que 1, dependendo da proporção do composto de refe-rência relativa à proporção de glicose. Se a proporção dereferência interna adicionada à solução de controle propor-cionar uma corrente similar àquela da oxidação do mediadorrelacionado com glicose, o valor de Dl pode ser cerca de 2.A referência interna pode ser incluida em uma proporção ade-quada para controlar as soluções correspondentes a uma altaconcentração de glicose. É tipico usar várias soluções decontrole correspondentes às concentrações baixa, normal ealta de glicose, para testar um medidor de glicose. Se, porexemplo, a proporção da referência interna for selecionadade modo que o valor de Dl seja igual ou superior a 1,75 paraa concentração de glicose mais alta na solução de controle,a corrente da referência interna vai ser relativamente gran-de, comparada com a corrente para a glicose na solução decontrole de menor teor de glicose. Então, a mesma proporçãoda referência interna usada com uma solução de controle ten-do uma baixa concentração de glicose vai proporcionar um va-lor de Dl ainda maior. Esses valores de Dl ainda maiores vãoproporcionar uma confiança mais alta na presença de uma so-lução de controle, em vez de uma amostra biológica, tal comosangue integral. Claramente, um indice quantitativo, tal co-mo o valor de Dl, tem uma vantagem em relação aos métodosmais qualitativos com base na forma da curva de correnteversus tempo nos períodos de queima ou leitura, como sugeri-do em outras patentes. A adição de uma referência internaoxidada a uma voltagem mais alta proporciona um resultadoque é independente da reação enzimática e da composição dasolução de controle.

Em uma modalidade, a proporção do composto de re-ferência interna adicionada à solução de controle é relacio-nada com a proporção de glicose presente. Isto é, a propor-ção da referência interna na solução de controle é propor-cional à concentração de glicose, para manter um valor Dlaproximadamente constante. Um processo é usar o suficienteda referência interna para proporcionar um Dl igual ou supe-rior a cerca de 1,5, quando a proporção máxima de glicose, acerca de 300 mg/dL, é usada. Então, a proporção da referên-cia interna é reduzida, de modo que as soluções de controlecontendo concentrações mais baixas de glicose mantêm um va-lor de Dl igual ou superior a 1,5.

A adição de uma referência interna para controlaras soluções possibilita distinguir facilmente entre as solu-ções de controle e as amostras biológicas e proporciona umaprecisão aperfeiçoada da análise. Os compostos de referênciainterna podem ser qualquer composto oxidavel eletroquimica-mente a um potencial desejável. É importante entender quenem todos os compostos oxidáveis quimicamente são oxidáveiseletroquimicamente a um potencial adequado, ou a qualquerpotencial oxidável. As espécies oxidáveis quimicamente (porexemplo, em uma solução homogênea) podem não ser oxidáveiseletroquimicamente a um potencial adequado, porque a barrei-ra de cinética de transferência de elétrons no eletrodo temque ser superada. Desse modo, um agente redutor por naturezaquimica pode não ser oxidável eletroquimicamente no eletro-do. Dependendo do potencial de oxirredução do mediador nosistema sensor de reagente, os compostos de referência in-terna com diferentes potenciais de oxirredução vão ser ne-cessários. Por exemplo, se o mediador no sistema reagentefor hexamina de rutênio (Ru (NH3) 6+3) / o composto de coordena-ção de ferrocianeto de potássio ou os compostos organometá-licos de ferroceno e os seus derivados podem ser usados comoa referência interna na solução de controle. Por outro lado,se o mediador for ferricianeto no sistema reagente, entãooutros compostos, tal como bis-tris ou 4-aminobenzonitrila,podem ser usados como a referência interna na solução decontrole. Em cada caso, o composto de referência interna vaiter um potencial de oxirredução que seja pelo menos 100 mVmais alto do que o potencial de oxirredução do mediador.

Os exemplos dos compostos de referência internaincluem, mas não são limitados a, aminas orgânicas, tais co-mo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico (MOPS), ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N1 - (2-etano sulfônico) (HEPES),ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hidroximetil) etilamino) etanosulfônico (TES), ácido 2-morfolinoetano sulfônico (MES), bis(2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris),4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico e 4-iodoanilina.Nos exemplos abaixo, Bis-Tris e vários outros compostos sãomostrados como sendo uma referência interna útil para uso emsoluções de controle contendo glicose.

Embora Bis-Tris possa ser usado como uma referên-cia interna, também pode servir como um tampão. 0 pH da so-lução de controle é um fator importante na reação na qual aglicose é oxidada por uma enzima, tal como glicose oxidase.Para a medida de glicose, um pH de cerca de 5 a 7 é preferi-do, quando glicose oxidase é usada, enquanto que um pH decerca de 6 - 8 é preferido quando se usa glicose desidroge-nase. Um tampão é usualmente proporcionado para garantir quea oxidação de glicose prossegue na taxa esperada. Uma vanta-gem da presente invenção é que o composto de referência e otampão podem ser separados, cada um servindo a uma funçãodiferente, propiciando, desse modo, a otimização de cadafunção (tampão e referência interna) separadamente. Os tam-pões podem ser selecionados daqueles compatíveis com o rea-gente enzimatico. Os exemplos incluem, mas não são limitadosa, tampão de citrato e tampão de fosfato.

Os materiais poliméricos usados para reproduzir aspropriedades fluidificantes do sangue podem incluir poli (ó-xido de etileno), poli (metacrilato de hidroxietila), poli-vinilpirrolidona (PVP), goma xantana, em proporções de 12 a20% em peso. A glicose está tipicamente presente nas solu-ções de controle nas proporções equivalentes a cerca de 30 a400 mg/dL, uma faixa que abrange o teor de glicose esperadodas amostras de sangue.Outros aditivos podem incluir sais, tampões, co-rantes, agentes antimicrobianos, polímeros, agentes espes-santes e tensoativos.

Modo de operação da solução de controleVai ser óbvio que a introdução de um material dereferência interna, oxidável a uma voltagem mais alta do quea usada para oxidar o mediador relacionado com glicose, viatornar necessária a aplicação da voltagem mais alta em algumponto, durante o protocolo de medida. Quando dois períodossão usados como descrito acima, isto é, os períodos de"queima" e "leitura", várias combinações de etapas potenci-ais dentro e por ambos os períodos de queima e leitura podemser usadas, para proporcionar tanto um valor de Dl identifi-cando a solução de controle e uma corrente, das quais o teorde glicose da solução de controle pode ser determinado. Nométodo mais simples, uma alta voltagem é aplicada durante operiodo de queima e uma baixa voltagem é aplicada durante operiodo de leitura. Desse modo, o índice Diferencial é:

Dl = (iqueima / ileitura)

Quando a referência interna está presente, a cor-rente medida durante o periodo de queima vai incluir a cor-rente resultante da oxidação da referência interna mais acorrente resultante do mediador relacionado com a glicose. Acorrente medida durante o periodo de leitura vai ser apenasaquela resultante da oxidação da glicose, uma vez que a vol-tagem vai ser muito baixa para oxidar a referência interna.Desse modo, a razão da corrente de queima para a corrente deleitura reflete o valor da corrente de referência internacontra a corrente da medida de glicose.

Alternativamente, ambas as voltagens alta e baixapodem ser aplicadas durante o período de queima, para detec-tar a presença da referência interna, enquanto que apenasuma baixa voltagem é usada durante o período de leitura. Es-sa combinação de etapas potenciais vai ainda manter o prin-cipio operacional de considerar a razão da corrente de umaalta voltagem para aquela de uma baixa voltagem. Uma varia-ção distinta na corrente vai ser observada, quando uma vari-ação é feita de uma baixa voltagem para uma alta voltagem,ou vice-versa. A "baixa" voltagem não precisa ser idênticaàquela usada no periodo de leitura, para medir a glicose. Avoltagem comparativa pode ser meramente mais baixa do que anecessária para oxidar a referência interna. Uma vez que operiodo de queima corresponde a um tempo no qual a amostraestá hidratando os reagentes, a corrente pode variar duranteo periodo de queima, como sugerido no diagrama genérico daFigura 4. Conseqüentemente, pode haver uma vantagem para sefazer mais de uma excursão entre as voltagens alta e baixa,para garantir que os valores de Dl não sejam afetados pelasvariações na disponibilidade de reagente, durante o periodode queima.

Em outro método alternativo, uma alta voltagem(isto é, uma que oxida a referência interna) é usada duranteuma parte do periodo de leitura. Desse modo, o Dl pode serdeterminado durante o periodo de leitura por medida das cor-rentes alta e baixa, apenas durante o periodo de leitura.Esse método pode proporcionar uma vantagem pelo fato de quequalquer variação na disponibilidade de reagente observadano periodo de queima seja evitada. De novo, o uso de mais deuma excursão entre as voltagens baixa e alta pode ser vanta-joso.

Em outra modalidade da invenção, a ciclização fre-qüente de potencial entre as voltagens alta e baixa é usadapara afetar a forma da corrente versus tempo, durante o pe-riodo de leitura, que é mostrada genericamente na Figura 4.A curva mostra tipicamente um rápido decaimento da correnteprovocada pela depleção do mediador reduzido na ou próximoda superfície do eletrodo. Desse modo, o teor de glicose to-tal é determinado por correlação com a corrente limitada pordifusão, em vez de medida da glicose total na solução decontrole. É evidente que o tempo selecionado como uma medidada glicose é importante, se medidas consistentes e precisasvão ser obtidas.

Em geral, as soluções de controle da invenção vãoconter um composto, que pode ser oxidado eletroquimicamentea um maior potencial do que aquele necessário para oxidarglicose. Uma vez que a oxidação do mediador relacionado coma glicose (por exemplo, ferricianeto de potássio) requer umpotencial de 200 mV relativo ao potencial no contra-eletrodode ferricianeto, o potencial de oxidação para o composto dereferência interna deve ser pelo menos 400 mV, relativo aomesmo contra-eletrodo. Por exemplo, usando-se Bis-Tris comoa referência, o potencial de oxidação é cerca de 600 mV, seo contra-eletrodo for suportado pela redução de ferriciane-to. Outros exemplos incluem 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico, 4-iodoanilina, que podem ser oxidados em umafaixa de potencial de + 400 a + 600 mV, relativa ao potenci-al no contra-eletrodo suportado pela redução do ferricianeto.

Um método de examinar o efeito da adição de umareferência interna às soluções de controle é o uso de volta-metria ciclica. Em vez de aplicar um potencial fixo, umavoltagem variável é usada/ varrendo de negativa à positivarelativa ao contra-eletrodo. Os exemplos apresentados a se-guir ilustram o conceito e a aplicação de referência internae o seu método de autodetecção de soluções de controle.

Exemplo 1

Uma solução aquosa contendo NaCl 50 mM foi compa-rada com outra solução contendo NaCl 50 mM e Bis-Tris 50 mM,como uma referência interna. Um segundo conjunto de amostrascontendo a mesma composição, mas incluindo 350 mg/dL de gli-cose , foi testado. Nenhuma enzima ou mediador foi incluido,de modo que a oxidação de glicose não ocorreu. A Figura 5mostra corrente versus potencial, na medida em que a dife-rença de potencial foi alternada entre - 400 mv e + 1.200 mVa 25 mV/s versus um eletrodo de referência de prata / clore-to de prata, usando a estação de trabalho eletroquimica daCH Instrument Co. Pode-se notar que a corrente não começou aescoar entre os eletrodos, até que fosse atingida uma dife-rença de potencial de + 600 mV. Para as amostras não conten-do Bis-Tris, a corrente de oxidação é substancialmente zeropor toda a faixa de potencial. Por outro lado, quando Bis-Tris estava presente, houve uma corrente significativa a +800 mV, começando a cerca de +600 mV. Pode-se concluir que aoxidação de biossensores é a mesma com e sem glicose presen-te, quando nenhuma enzima e mediador estão presentes. Quandoda comparação das correntes volumétricas a + 800 mV entre oscurvas corrente - potencial com e sem Bis-Tris na Figura 5,as soluções contendo Bis-Tris 50 mM foram claramente distinguidas.

Exemplo 2

Nesse exemplo, os testes do Exemplo 1 foram repe-tidos , como mostrado na Figura 6, exceto que o contra-eletrodo era de carbono com uma camada de ferricianeto depotássio, em vez do contra-eletrodo de Ag / AgCl2 usado noExemplo 1. A oxidação do Bis-Tris não é afetada pela presen-ça ou ausência de glicose, quando não estão incluídos enzimae mediadores - No entanto, a corrente de oxidação começa aaumentar após + 4 00 mV e atinge um valor significativo a +600 mV. Desse modo, comparadas com os aspectos voltamétricôsna Figura 5, as correntes de fundo se mantêm substancialmen-te iguais a zero, sem a referência interna. A única diferen-ça é o aumento da corrente de oxidação a um potencial maisbaixo. Essa diferença é inteiramente devido ao contra-eletrodo diferente. É significativo que não haja nenhumacorrente de oxidação abaixo de + 400 mV. Desse modo, o Bis-Tris pode ser observado como sendo claramente distinto daoxidação de glicose, que começa logo acima do potencial ze-ro, como vai ser observado no exemplo seguinte.

Exemplo 3Os Exemplos 1 e 2 apresentados nas Figuras 5 e 6mostram a presença da referência interna (Bis-Tris) em solu-ções com ou sem glicose, mas na ausência da glicose oxidasee do mediador necessários para detectar a presença de glico-se. No exemplo mostrado na Figura 7, as soluções dos Exem-plos 1 e 2 foram usadas, mas a glicose oxidase e o ferricia-neto de potássio (mediador) são incluídos, de modo que quan-do glicose está presente, é oxidada como é nos sensores ele-troquimicos de glicose. Comparando-se a Figura 7 com a Figu-ra 6, as características voltamétricas observadas nos curvascorrente - potencial ciclicos (modelos de corrente versuspotencial) diferem significativamente. Os picos na correntede oxidação ocorrendo em torno de zero volt indicam que aglicose está sendo oxidada. Quando nenhuma glicose estavapresente, apenas uma pequena corrente foi produzida acima de0 mV, devido a alguma atividade de fundo. Quando glicose, a350 mg/dL, e.stá presente, uma quantidade de corrente signi-ficativa é produzida com os picos característicos acima eabaixo de 0 mV. Uma condição de estado constante foi atingi-da a cerca de + 400 mV, que pode ser usado para correlacio-nar-se com a proporção de glicose presente. A ambos os ní-veis de glicose de 0 e 350 mg/dL, as correntes de oxidaçãoantes de 400 mV são iguais, com e sem a adição do compostode referência interna. Quando o potencial atinge + 600 mV, acorrente observada com as soluções contendo Bis-Tris é sem-pre mais alta do que aquela sem Bis-Tris, se a concentraçãode glicose foi igual a 0 ou 350 mg/dL. Desse modo, a soluçãode controle, que contém o composto de referência interna,pode ser identificada.

Exemplo 4

0 Bis-Tris foi usado como um composto de referên-cia nos Exemplos 1 - 3. Nesse exemplo, vários outros compos-tos de referência interna são apresentados. A Figura 8 mos-tra curvas corrente - potencial cíclicos de três compostosde referência interna adicionais, ácido 4-aminobenzóico, 4-aminobenzonitrila e 4-iodoanilina. Esses três curvas corren-te - potencial ciclicos foram obtidos de tiras de sensoresde glicose comerciais da Ascensia AUTODISC® (DEX). As trêsespécies de referência interna foram adicionadas individual-mente a uma solução equivalente à de controle de polimeroPVP a 20 - 24%, pH 5 - 5,5 em tampão de citrato, mas semglicose. As concentrações de ácido 4-aminobenzóico, 4-aminobenzonitrila e 4-iodoanilina foram de cada um deles de50 mM. Pode-se notar da Figura 8, que, enquanto que os pri-meiros picos de oxidação à direita depois do zero são subs-tancialmente idênticos, as correntes após + 0,3 volt dife-rem, dependendo do composto de referência interna incluído.Na Figura 8, o potencial entre 0,1 V e 0,3 V é consideradocomo baixo potencial, que é usado para medir glicose por o-xidação apenas do mediador. O potencial partindo de + 0,4volt a 0,8 volt é considerado o potencial alto, responsávelpor oxidação de ambos o mediador e a referência interna. Naregião de potenciais de + 0,3 a + 0,8, todas as correntessão mais altas quando uma referência interna estava presentedo que quando nenhuma referência interna tinha sido adicio-nada à solução de controle.

Exemplo 5

Há muitos modos de combinar os potenciais alto ebaixo para oxidar e medir a referência interna, para detec-tar a presença de uma solução de controle, enquanto aindamedindo a concentração de glicose. As Figuras 9A - E mostramalgumas das seqüências de potenciais (formas de onda) paracombinação dos potenciais alto e baixo. Em cada caso, um pe-riodo de queima é seguido por um periodo de espera, e depoispor um periodo de "leitura", como descrito acima. A Figura9A mostra uma seqüência de potenciais para a seqüência depotenciais Queima - Espera - Leitura simples. A Figura 9Bmostra uma seqüência de potenciais com a baixa voltagem naprimeira metade do periodo de Queima, seguido por uma altavoltagem no mesmo periodo de Queima. Na Figura 9C, uma se-qüência de potenciais, com a voltagem alta na primeira meta-de do periodo de Queima, é seguida por uma baixa voltagem nomesmo periodo de Queima. A Figura 9D mostra uma seqüência depotenciais, com a voltagem alta na primeira metade do perio-do de Leitura, seguida por uma baixa voltagem no mesmo peri-odo de Leitura. Na Figura 9E, uma seqüência de potenciaissimilar é mostrada com a baixa voltagem na primeira metadedo periodo de Leitura, seguida por uma alta voltagem no mes-mo periodo de Leitura.

Exemplo 6

As Figuras 10a - b ilustram o efeito do aumento daconcentração da referência interna, nesse caso o Bis-Tris.Na Figura 10a, a solução equivalente à de controle (isto é,sem glicose) contendo NaCl 50 mM mostra o efeito do aumentoda concentração de referência interna de 0 a 50 mM e a 100mM de Bis-Tris (com NaCl 100 mM) . A presença de Bis-Tris éclaramente visivel e o aumento na concentração aumenta aindamais a corrente a + 600 mV. Na Figura 10B, glicose a 350mg/dL está presente na solução de controle da mesma composi-ção, como indicado pelos fortes picos logo acima de 0 mV.Uma vez que a corrente de glicose é ainda notável em tornode + 600 mV, a detecção da presença de Bis-Tris requer umamaior quantidade do que quando nenhuma glicose está presen-te. Desse modo, a concentração da referência interna deveser tal que uma indicação clara da sua presença pode ser de-tectada, quando a solução de controle contém uma alta con-centração de glicose. Então, quando a solução de controlecontém uma concentração de glicose mais baixa, a presença dareferência interna vai ser ainda mais evidente.

Exemplo 7

Para esse exemplo, os testes foram conduzidos porcomparação das soluções de controle com e sem adição de Bis-Tris, como a referência interna, e uma amostra de sangue in-tegral. Em todos os três casos, as amostras foram tiras deteste comerciais Ascensia AUTODISC®. A seqüência do testefoi a de aplicar um potencial de + 4 00 mV por 4 segundos,depois + 600 mV por 4 segundos, repouso em circuito aberto(sem potencial aplicado ao eletrodo) por 5 segundos, e de-pois aplicação de + 200 mV por 5 segundos. Os perfis de cor-rente para os três tipos de amostras são apresentados na Fi-gura 11. O índice Diferencial (Dl) foi calculado para duascomparações. Caso I-a: a corrente medida a 8 segundos do pe-ríodo de queima é comparada com a corrente a 4 segundos doperiodo de queima. Caso I-b: a corrente medida a 8 segundosdo periodo de queima é comparada com a corrente a 2 segundosdo periodo de leitura. Nenhuma glicose foi adicionada à so-lução de teste de NaCl 100 mM e Bis-Tris 100 mM ou à amostrade sangue integral. O caso I-a é equivalente à seqüência daFigura 9B, enquanto que o caso I-b é equivalente à Figura9A. Os valores de Dl e as variações relativas dos valores deDl desses testes são apresentados na Tabela 2. Em ambos oscasos, o valor de Dl da solução de controle, com a referên-cia interna Bis-Tris, é da ordem de 500% dos valores de Dlencontrados quando a solução de controle e a amostra de san-gue integral não continham qualquer referência interna. Es-ses resultados indicam que a solução de controle com a refe-rência interna pode ser facilmente detectada, comparada comuma solução de controle ou sangue integral carente do com-posto de referência.

Tabela 2 - Valores de Dl e % de variação de valorde Dl a 0 de glicose.

<table>table see original document page 34</column></row><table>rência interna

<table>table see original document page 35</column></row><table> Exemplo 8

Os testes do Exemplo 7 foram repetidos, mas a so-lução de controle continha 350 mg/dL de glicose e a amostrade sangue integral 400 mg/dL de glicose. A mesma seqüênciade potenciais foi usada para esse teste. Os perfis de cor-rente tipicos para as três amostras são apresentados na Fi-gura 12 para altas concentrações de glicose. Os valores deDl e a variação relativa dos valores de Dl são registradosna Tabela 3. Os valores de Dl na Tabela 2, para os casos II-aell-b, são iguais àqueles do Exemplo 7 e são, desse modo,as variações relativas dos valores de Dl com a referênciainterna àquele sem a referência interna e as amostras desangue integral. Para a alta concentração de glicose de 350mg/dL, o valor de Dl para a solução de controle com a refe-rência interna é da ordem de 100% mais alto do que aqueledas amostras de sangue integral. A diferença de Dl garanteque a solução de controle com uma referência interna podeser distinguida de uma solução de controle carente da refe-rência interna e da amostra de sangue integral.

Tabela 3 - Valores de Dl e percentuais de variaçãode valores de Dl a um alto teor de glicose.<table>table see original document page 36</column></row><table>

Protocolos para teste da solução de controle

A comparação das correntes produzidas durante osperíodos de queima e leitura podem ser feitas de muitos mo-dos. Algumas seqüências de teste são ilustradas no Exemplo 5e na Figura 9. Na alternativa mais simples, uma medida éfeita no potencial necessário para oxidar o composto de re-ferência interna, e outra medida é feita no potencial maisbaixo usado para oxidar o analisado. Depois, o índice Dife-rencial é calculado e, com base nos resultados, o medidoreletroquimico registra que ou uma solução de controle ou queuma amostra biológica está sendo testada. De preferência, aprimeira medida é feita durante a parte posterior do periodode queima e a segunda durante o periodo de leitura, mas am-bas as medidas podem ser feitas durante o periodo de queimaou durante o período de leitura. O período de tempo necessá-rio para obter leituras de corrente pode ser variado, porexemplo, entre cerca de 1 e 10 segundos. No entanto, desdeque as leituras de corrente sejam suficientemente longas pa-ra representar adequadamente a presença do composto de refe-rência interna ou a glicose, qualquer periodo de tempo pode ser usado.

Para confiabilidade adicional nos resultados, maisde um periodo pode ser usado para ambos os potenciais alto ebaixo. Isto é, o potencial para oxidação da referência in-terna, isto é, + 600 mV para o Bis-Tris, e o potencial paraoxidação de glicose, isto é, + 200 - 400 mV, podem ser apli-cados mais de uma vez durante o periodo de queima ou o peri-odo de leitura.

É também viável aplicar potenciais que são maisaltos do que os que são necessários para a oxidação do ana-lisado ou da referência interna. Isto é, se o potencial deoxidação for para o mediador de glicose é + 200 mV, por e-xemplo, depois um potencial de + 200 mV e o mais alto podeser usado, com o limite sendo no potencial no qual a refe-rência interna é oxidada.

Em uma modalidade, variações múltiplas nos poten-ciais aplicados são usadas para proporcionar uma indicaçãomais consistente nos potenciais alto e baixo. Além do mais,a alternância dos potenciais tem a vantagem de uniformizaras curvas de corrente versus tempo e aperfeiçoar a precisão.Por exemplo, o potencial aplicado pode ser alternado entreos valores alto e baixo a cada 1 segundo, durante os perío-dos de queima e/ou leitura.

Processo alternativo A

Um método de distinguir uma solução de controle deuma amostra biológica, durante operação de um sensor eletro-quimico medindo a proporção de um analisado na dita soluçãode controle e na dita amostra biológica, o método compreen-dendo os atos de:

(a) adicionar à dita solução de controle um com-posto de referência interna, o dito composto sendo adaptadopara ser oxidado eletroquimicamente a um potencial mais altodo que o potencial necessário para medir a oxidação do ditoanalisado, o dito composto de referência interna sendo adi-cionado em uma proporção relativa a uma proporção predeter-minada de analisado na dita solução de controle, suficientepara indicar a presença do dito composto de referência in-terna na solução de controle;

(b) introduzir a dita solução de controle contendoo dito composto de referência interna e a dita proporçãopredeterminada do dito analisado a um sensor eletroquimico,o dito sensor tendo eletrodos de trabalho e de referência, euma camada de reação contendo os reagentes para oxidação dodito analisado;

(c) pelo menos por uma vez aplicação de um poten-ciai aos ditos eletrodos do dito sensor eletroquimico, sufi-ciente para oxidar o dito composto de referência interna e odito analisado e medir a corrente elétrica resultante;(d) pelo menos por uma vez aplicação de um poten-cial ao dito sensor eletroquímico mais baixo do que o poten-cial de (c) , o dito potencial sendo suficiente para medir aoxidação do dito analisado e não suficiente para oxidar odito composto de referência interna e medir a corrente elé-trica resultante;

(e) calcular um índice Diferencial (Dl) definidocomo Dl = (iaita voit. / ibaixa voit.) , em que: iaita voit. é a cor-rente medida em (c) e ibaixa voit. é a corrente medida em (d) ;

(f) determinar que uma solução de controle estápresente quando o índice Diferencial de (e) é suficientemen-te maior do que 1, para distinguir o composto de referênciainterna da proporção predeterminada de analisado; e

(g) determinar que uma amostra biológica está pre-sente quando o índice Diferencial de (e) é cerca de 1.

Processo alternativo B

0 método do processo alternativo A, em que o ditoíndice Diferencial determinado em (f) é igual ou superior a 1,5.

Processo alternativo C

0 método do processo alternativo A, no qual o ditocomposto de referência interna é adicionado em uma proporçãoproporcional à proporção do analisado na dita solução decontrole.

Processo alternativo D

0 método do processo alternativo C, no qual o ditocomposto de referência interna é adicionado em uma proporçãode modo que o índice Diferencial é igual ou superior a 1,5,quando a proporção do analisado é o máximo usado na dita so-lução de controle.

Processo alternativo E

0 método do processo alternativo A, no qual o po-tencial de (c) é aplicado antes do potencial de (d) ser aplicado.

Processo alternativo F

0 método do processo alternativo A, no qual o po-tencial de (d) é aplicado antes do potencial de (c).

Processo alternativo G

0 método do processo alternativo A, no qual os po-tenciais de (c) e (d) são aplicados mais de uma vez.

Processo alternativo H

0 método do processo alternativo A, no qual o ditoanalisado é medido por aplicação de um primeiro potencialsuficiente para oxidar o dito analisado, por um primeiro pe-ríodo de tempo predeterminado, seguida pela aplicação de umsegundo potencial insuficiente para oxidar o dito analisadoe inferior àquele do dito primeiro potencial, por um segundoperiodo de tempo predeterminado, e seguida por aplicação deum terceiro potencial mais alto do que o dito segundo poten-cial e suficiente para oxidar o dito analisado, por um ter-ceiro periodo de tempo predeterminado.

Processo alternativo 1

0 método do processo alternativo H, no qual o ditopotencial de (c) é aplicado durante o dito primeiro periodode tempo predeterminado, e o dito potencial de (d) é aplica-do durante o dito terceiro periodo de tempo predeterminado.Processo alternativo J

0 método do processo alternativo H, no qual amboso dito potencial de (c) e o dito potencial de (d) são apli-cados durante o dito primeiro periodo de tempo predeterminado.

Processo alternativo K

O método do processo alternativo H, no qual amboso dito potencial de (c) e o dito potencial de (d) são apli-cados durante o dito terceiro periodo de tempo.

Processo alternativo L

O método do processo alternativo H, no qual o ditopotencial de (d) é aplicado durante o dito primeiro periodode tempo predeterminado, e o dito potencial de (c) é aplica-do durante o dito terceiro periodo de tempo predeterminado.

Processo alternativo M

O método do processo alternativo H, no qual os di-tos potenciais de pelo menos um de (c) e (d) é aplicado maisde uma vez.

Processo alternativo.N

0 método do processo alternativo A, no qual o ditoanalisado é glicose e a dita amostra biológica é sangue in-tegral .

Processo alternativo O

O método do processo alternativo A, no qual o ditocomposto de referência interna é um composto organometálicooxidavel, um composto de coordenação ou um composto de aminaorgânica.

Processo alternativo PO método do processo alternativo 0, no qual o ditocomposto de referência interna é o dito composto de aminaorgânica, o dito composto de amina orgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico, ácido N-(2-hidroxietil) pi-perazina-N1 -(2-etano sulfônico), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis(hidroximetil) etilamino) etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris(hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

Processo alternativo Q

0 método do processo alternativo P, no qual o ditocomposto de referência interna é Bis-Tris.

Processo alternativo R

0 método do processo alternativo 0, no qual o -ditocomposto de referência interna é o dito composto organometá-lico oxidável, o dito composto organometálico oxidável sendoferroceno ou derivados de ferroceno.

Processo alternativo S

0 método do processo alternativo 0, no qual o ditocomposto de referência interna é o dito composto de coorde-nação, o dito composto de coordenação sendo ferrocianeto depotássio.

Processo alternativo T

0 método do processo alternativo N, no qual a gli-cose é oxidada por glicose oxidase, e no qual a dita soluçãode controle contém um tampão capaz de manter um pH entre 5 e 7.

Processo alternativo UO método do processo alternativo N, no qual a gli-cose é oxidada por glicose desidrogenase, e no qual a ditasolução de controle contém um tampão capaz de manter um pHentre 6 e 8.

Modalidade alternativa V

Uma solução de controle para uso em teste de umsistema eletroquimico para medir a proporção de um analisadoem uma amostra biológica, a solução de controle compreendendo :

(a) uma proporção predeterminada do dito analisado; e

(b) uma proporção predeterminada de um composto dereferência interna, o dito composto de referência internasendo adaptado para ser oxidado a um potencial mais alto doque o potencial requerido para oxidar o dito analisado, adita proporção predeterminada do dito composto de referênciainterna sendo proporcional à dita proporção predeterminadade analisado, de modo que a presença do dito composto de re-ferência interna é detectável.

Modalidade alternativa W

A solução de controle da modalidade alternativa V,na qual o dito analisado é glicose e a dita amostra biológi-ca é sangue integral.

Modalidade alternativa X

A solução de controle da modalidade alternativa W,na qual o dito composto de referência interna é um compostoorganometálico oxidável, um composto de coordenação ou umcomposto de amina orgânica.Modalidade alternativa Y

A solução de controle da modalidade alternativa X,na qual o dito composto de referência interna é o dito com-posto de referência interna é o dito composto de amina orgâ-nica, o dito composto de amina orgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico, ácido N-(2-hidroxietil) pipe-razina-N1 -(2-etano sulfônico), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hi-droximetil) etilamino) etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris(hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

Modalidade alternativa Z

A solução de controle da modalidade alternativa Y,na qual a dita referência interna é Bis-Tris.

Modalidade alternativa AA

A solução de controle da modalidade alternativa Y,na qual o dito composto de referência interna é o dito com-posto organometálico oxidável, o dito composto organometáli-co oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

Modalidade alternativa BB

A solução de controle da modalidade alternativa X,na qual o dito composto de referência interna é o dito com-posto de coordenação, o dito composto de coordenação sendoferrocianeto de potássio.

Modalidade alternativa CC

A solução de controle da modalidade alternativa W,na qual a glicose é oxidada por glicose oxidase, e um tampãoé incluido para manter o pH entre 5 e 7.Modalidade alternativa DD

A solução de controle da modalidade alternativa W,na qual a glicose é oxidada por glicose desidrogenase, e umtampão é incluído para manter o pH entre 6 e 8.

Modalidade alternativa EE

Um composto de referência interna para adição auma solução de controle, usada para testar um medidor ele-troquímico de glicose, a dita referência interna compreen-dendo um composto químico que é oxidavel a um potencial maisalto do que aquele necessário para medir a oxidação de gli-cose .

Modalidade alternativa FF

A referência interna da modalidade alternativa EE,em que a dita referência interna é oxida vel a um potencialpelo menos 100 mV maior do que o potencial necessário paramedir a oxidação de glicose.

Modalidade alternativa GG

A referência interna da modalidade alternativa EE,em que o dito composto de referência interna é um compostoorganometálico oxidavel, um composto de coordenação ou umcomposto de amina orgânica.

Modalidade alternativa HH

A referência interna da modalidade alternativa GG,na qual o dito composto de referência interna é ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico, ácido N- (2-hidroxietil) pipe-razina-N1 -(2-etano sulfônico), ácido 2- (hidróxi-1,1-bis (hi-droximetil) etilamino) etano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris(hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido4-aminobenzóico e 4-iodoanilina.

Modalidade alternativa II

A referência interna da modalidade alternativa HH,na qual o dito composto de referência interna é Bis-Tris.

Modalidade alternativa JJ

A referência interna da modalidade alternativa GG,na qual o dito composto de referência interna é o dito com-posto organometalico oxidável, o dito composto organometáli-co oxidável sendo ferroceno ou derivados de ferroceno.

Modalidade alternativa KK

A referência interna da modalidade alternativa GG,na qual o dito composto de referência interna é o dito com-posto de coordenação, o dito composto de coordenação sendoferrocianeto de potássio.

Ainda que a invenção seja suscetível a várias mo-dificações e formas alternativas, as modalidades especificassão mostradas por meio de exemplo nos desenhos e descritosem detalhes. Deve-se entender, no entanto, que não se temintenção de limitar a invenção às formas particulares des-critas, mas, ao contrário, a invenção é cobrir todas as mo-dificações, equivalentes e alternativas incluídas nos espi-rito e âmbito da invenção, como definido pelas reivindica-ções em anexo.

Claims

1. Método de distinguir uma solução de controle deuma amostra biológica, durante operação de um sensor eletro-quimico medindo a proporção de um analisado na dita soluçãode controle e na dita amostra biológica, CARACTERIZADO pelofato de que compreende os atos de:(a) adicionar à dita solução de controle um com-posto de referência interna, o dito composto sendo adaptadopara ser oxidado eletroquimicamente a um potencial mais altodo que o potencial necessário para medir a oxidaçâo do ditoanalisado, o dito composto de referência interna sendo adi-cionado em uma proporção relativa a uma proporção predeter-minada de analisado na dita solução de controle, suficientepara indicar a presença do dito composto de referência in-terna na solução de controle;(b) introduzir a dita solução de controle contendoo dito composto de referência interna e a dita proporçãopredeterminada do dito analisado a um sensor eletroquimico,o dito sensor tendo eletrodos de trabalho e de referência, euma camada de reação contendo os reagentes para oxidação dodito analisado;(c) pelo menos por uma vez aplicação de um poten-cial aos ditos eletrodos do dito sensor eletroquimico, sufi-ciente para oxidar o dito composto de referência interna e odito analisado e medir a corrente elétrica resultante;(d) pelo menos por uma vez aplicação de um poten-cial ao dito sensor eletroquimico mais baixo do que o poten-cial de (c) , o dito potencial sendo suficiente para medir aoxidação do dito analisado e não suficiente para oxidar odito composto de referência interna e medir a corrente elé-trica resultante;(e) calcular um índice Diferencial (Dl) definidocomo Dl = (iaita voit. / ibaixa voit.) r em que: iaita voit. é a cor-rente medida em (c) e ibaixa voit. é a corrente medida em (d) ;(f) determinar que uma solução de controle estápresente quando o índice Diferencial de (e) é suficientemen-te maior do que 1, para distinguir o composto de referênciainterna da proporção predeterminada de analisado; e(g) determinar que uma amostra biológica está pre-sente quando o índice Diferencial de (e) é cerca de 1.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito índice Diferencial de-terminado em (f) é igual ou superior a 1,5.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é adicionado em uma proporção proporcional à propor-ção do analisado presente na dita solução de controle.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é adicionado em uma proporção de modo que o índiceDiferencial é igual ou superior a 1,5, quando a proporção doanalisado é o máximo usado na dita solução de controle.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o potencial de (c) é aplicadoantes do potencial de (d) ser aplicado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o potencial de (d) é aplicadoantes do potencial de (c) .

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que os potenciais de (c) e (d)são aplicados mais de uma vez.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito analisado é medido poraplicação de um primeiro potencial suficiente para oxidar odito analisado, por um primeiro periodo de tempo predetermi-nado, seguida pela aplicação de um segundo potencial insufi-ciente para oxidar o dito analisado e inferior àquele do di-to primeiro potencial, por um segundo periodo de tempo pre-determinado, e seguida por aplicação de um terceiro potenci-al mais alto do que o dito segundo potencial e suficientepara oxidar o dito analisado, por um terceiro periodo detempo predeterminado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito potencial de (c) é a-plicado durante o dito primeiro periodo de tempo predetermi-nado, e o dito potencial de (d) é aplicado durante o ditoterceiro periodo de tempo predeterminado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que ambos o dito potencial de (c)e o dito potencial de (d) são aplicados durante o dito pri-meiro periodo de tempo predeterminado.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito potencial de (c) e odito potencial de (d) são aplicados durante o dito terceiroperiodo de tempo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito potencial de (d) é a-plicado durante o dito primeiro periodo de tempo predetermi-nado, e o dito potencial de (c) é aplicado durante o ditoterceiro periodo de tempo predeterminado.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos potenciais de pelomenos um de (c) e (d) é aplicado mais de uma vez.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito analisado é glicose ea dita amostra biológica é sangue integral.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é um composto organometálico oxidável, um compostode coordenação ou um composto de amina orgânica.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é o dito composto de amina orgânica, o dito compostode amina orgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfô-nico, ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N1 -(2-etano sulfô-nico), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hidroximetil) etilamino)et ano sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é Bis-Tris.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é o dito composto organometálico oxidável, o ditocomposto organometálico oxidável sendo ferroceno ou deriva-dos de ferroceno.

19. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto de referênciainterna é o dito composto de coordenação, o dito composto decoordenação sendo ferrocianeto de potássio.

20. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato de que a glicose é oxidada por gli-cose oxidase, e no qual a dita solução de controle contém umtampão capaz de manter um pH entre 5 e 7.

21. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato de que a glicose é oxidada por gli-cose desidrogenase, e no qual a dita solução de controlecontém um tampão capaz de manter um pH entre 6 e 8.

22. Solução de controle para uso em teste de umsistema eletroquimico para medir a proporção de um analisadoem uma amostra biológica, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende:(a) uma proporção predeterminada do dito analisado; e(b) uma proporção predeterminada de um composto dereferência interna, o dito composto de referência internasendo adaptado para ser oxidado a um potencial mais alto doque o potencial requerido para oxidar o dito analisado, adita proporção predeterminada do dito composto de referênciainterna sendo proporcional à dita proporção predeterminadade analisado, de modo que a presença do dito composto de re-ferência interna é detectável.

23. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito analisado églicose e a dita amostra biológica é sangue integral.

24. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é um composto organometálico oxidável, umcomposto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

25. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é o dito composto de referência interna éo dito composto de amina orgânica, o dito composto de aminaorgânica sendo ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico, áci-do N-(2-hidroxietil) piperazina-N1 -(2-etano sulfônico), áci-do 2-(hidróxi-1,1-bis (hidroximetil) etilamino) etano sulfô-nico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil)amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico ou 4-iodoanilina.

26. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita referênciainterna é Bis-Tris.

27. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é o dito composto organometálico oxidá-vel, o dito composto organometálico oxidavel sendo ferrocenoou derivados de ferroceno.

28. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é o dito composto de coordenação, o ditocomposto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.

29. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 23 , CARACTERIZADA pelo fato de que a glicose é oxida-da por glicose oxidase, e um tampão é incluido para manter opH entre 5 e 7.

30. Solução de controle, de acordo com a reivindi-cação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que a glicose é oxidadapor glicose desidrogenase, e um tampão é incluido para man-ter o pH entre 6 e 8.

31. Composto de referência interna para adição auma solução de controle, usada para testar um medidor ele-troquimico de glicose, a dita referência internaCARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto quími-co que é oxidável a um potencial mais alto do que aquele ne-cessário para medir a oxidação de glicose.

32. Referência interna de acordo com a reivindica-ção 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita referência in-terna é oxidável a um potencial pelo menos 100 mV maior doque o potencial necessário para medir a oxidação de glicose.

33. Referência interna de acordo com a reivindica-ção 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é um composto organometalico oxidavel, umcomposto de coordenação ou um composto de amina orgânica.

34. Referência interna de acordo com a reivindica-ção 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é ácido 3-(N-morfolino) propano sulfôni-co, ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etano sulfôni-co), ácido 2-(hidróxi-1,1-bis (hidroximetil) etilamino) eta-no sulfônico, ácido 2-morfolinoetano sulfônico, bis (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), 4-aminobenzonitrila, ácido 4-aminobenzóico e 4-iodoanilina.

35. Referência interna de acordo com a reivindica-ção 34, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é Bis-Tris.

36. Referência interna de acordo com a reivindica-ção 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é o dito composto organometalico oxidá-vel, o dito composto organometalico oxidavel sendo ferrocenoou derivados de ferroceno.

37. Referência interna de acordo com a reivindica-ção 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto dereferência interna é o dito composto de coordenação, o ditocomposto de coordenação sendo ferrocianeto de potássio.