BRPI0609713A2

BRPI0609713A2 - Método para modificação da composição de lignina de sabugos de milho, método para usar sabugos de milho com baixo teor de lignina em aplicações de conversão de biomassa, e método para aumentar o rendimento nutricional da ração de um animal

Info

Publication number: BRPI0609713A2
Application number: BRPI0609713-8A
Authority: BR
Inventors: Royston E Carter; John Steffens
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2005-03-28
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2010-04-20
Also published as: CN101501198A; WO2006104891A3; US20060260011A1; WO2006104891A2

Abstract

MéTODO PARA MODIFICAçãO DA COMPOSIçãO DE LIGNINA DE SABUGOS DE MILHO, MéTODO PARA USAR SABUGOS DE MILHO COM BAIXO TEOR DE LIGNINA EM APLICAçõES DE CONVERSãO DE BIOMASSA, E MéTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO NUTRICIONAL DA RAçãO DE UM ANIMAL. A presente invenção refere-se a métodos e constructos genéticos para o controle de expressão de enzimas envolvidas na biossíntese de lignina em plantas. O método envolve o uso de RNAI de filamento duplo para regular negativamente ou nocautear a expressão dos genes CAD e COMT. Em modalidades particulares, o método envolve o uso de promotores específicos para sabugo e preferidos para sabugo para regular negativamente a biossíntese de lignina nos sabugos de plantas de milho.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS ECONSTRUÇÕES GENÉTICAS PARA MODIFICAÇÃO DA COMPOSIÇÃODE LIGNINA DE SABUGOS DE MILHO".

Reivindicação de Prioridade

Este pedido reivindica a prioridade do pedido de Patente

US60/665.685, depositado em 28 de março de 2005, cuja exposição é aquiincorporada a título de referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia agrí-cola. Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao uso de tecno-logia de RNAi para modificar a expressão de genes envolvidos na biossínte-se de lignina no milho ("maize"), e mais especificamente em sabugos de mi-lho.

Antecedentes da Invenção

Lignina é um polímero aromático heterogêneo complexo quetorna as membranas impermeáveis e reforça as paredes de certas célulasdas plantas.

Lignina e formada por polimerização de radicais livres derivadosde monolignóis, tais como álcoois paracumarílicos, coniferílicos e sinapílicos(Higuchi, 1985, em Biosynthesis and degradation of wood components (T.Higuchi, ed.), Academic Press, Orlando, Fia. pp. 141-160). A lignina é for-mada por polimerização de pelo menos três monolignóis diferentes que sãosintetizados em uma via de multi-etapas, em que cada etapa na via é catali-sada por uma enzima diferente. Tem sido mostrado que a manipulação devárias cópias de genes que codificam certas enzimas, tais como álcool ci-namílico desidrogenase (CAD) e ácido caféico 3-O-metiltransferase (COMT)resulta na modificação da quantidade de lignina produzida; vide, por exem-plo, Patente US5.451.514 e Publicação de PCT WO 94/23044. Além disso,tem sido mostrado que a expressão anti-sentido de seqüências que codifi-cam CAD em choupo leva à produção de lignina tendo uma composiçãomodificada (Grand, C, et al., Planta (Berl.) 163:232-237 (1985)).

Ligninas têm uma ampla variação em seu conteúdo relativo demonolignóis, como função da espécie e dos vários tecidos dentro da mesmaplanta.

Essa variação é provavelmente causada e controlada por dife-rentes atividades e especificidades dos substratos, as enzimas necessáriaspara a biossíntese de monômeros de lignina (Higuchi, 1985, loc. cit).

Além de seu papel na estrutura das plantas, a lignina representaum componente principal da biomassa terrestre e assume uma grande signi-ficância econômica e ecológica (Brown, 1985, J. Appl. Biochem. 7, 371-387;Whetten e Sederoff, 1995, Forest Ecology and Management, 43, 301-316).

No nível de exploração da biomassa, é apropriado primeiro notarque a lignina é um fator limitativo da digestibilidade e rendimento nutricionalde plantas de forragem. De fato, está claramente demonstrado que a diges-tibilidade das plantas de forragem por ruminantes é inversamente proporcio-nal ao tratamento do teor de lignina nestas plantas, em que a natureza dasligninas é também um fator determinante neste fenômeno (Buxton e Rous-sel, 1988, Crop. Sei., 28. 553-558; Jung e Vogel, 1986, J. Anim., Sei., 62, 1703-1712).

Dentre as principais plantas para forragem nas quais seria deinteresse reduzir os teores de lignina podem ser mencionados luzerna, ca-pim-do-prado e forragem de milho usados para ensilagem.

Deve ser também observado que altos teores de lignina são, emparte, responsáveis pela limitada qualidade da torta de girassol destinada àalimentação de gado, e à redução das capacidades germinativas de certassementes no setor hortícola.

Pode ser enfatizado que a lignificação intensa que resulta duran-te a conservação dos componentes da planta depois da colheita rapidamen-te rende produtos tais como aspargo, inhame, cenouras, etc. inadequadospara consumo.

Além disso, é também apropriado notar que mais que 50 milhõesde toneladas de lignina são extraídos de materiais ligneos, cada ano, nocontexto da produção de polpa de papel na indústria de papel. Essa opera-ção de extração, que é necessária para obter celulose, é dispendiosa emenergia, e, em segundo lugar, causa poluição através dos compostos quími-cos usados para a extração, que são encontrados no ambiente (Dean e E-riksson, 1992, Holzforschung, 46, 135-147: Whetten e Sederoff, 1991, loc.cit).

Reduzir as proporções de ligninas (que perfazem até 20 a 30%da matéria seca, dependendo da espécie) para um pouco porcento (2 a 5%)representaria um aumento do rendimento e uma substancial economia (pro-dutos químicos) e contribuiria para melhorar o ambiente (redução da polui-ção). Dada à escala de uso de material lígneo, esses decréscimos teriamrepercussões extremamente significantes. Nesse caso, as espécies envolvi-das seriam choupo, eucalipto, Acácia magnium, o gênero Casuarina e todosangiospermas e gimnospermas usados na produção de polpa de papel.

Está claro que nos dois setores em consideração, a redução dosníveis de ligninas deve ser moderada para preservar as características derigidez e a arquitetura normal da planta (ou da árvore), já que as ligninas quereforçam as paredes celulares desempenham um significante papel na ma-nutenção do hábito ereto das plantas.

As variações naturais nos teores de lignina observados na natu-reza para as mesmas espécies (desvios que podem ser de até 6-8% da ma-teria secada entre os indivíduos) justificam as reduções sugeridas acima.

A resistência à degradação da lignina, como as dificuldades en-contradas no contexto de sua extração, é provavelmente devida à estruturacomplexa de seu polímero, que é feito de ligações de éter e ligações carbo-no-carbono entre os monômeros, bem como às numerosas ligações quími-cas que existem entre a lignina e os outros componentes da parede celular(Sarkanen e Ludwig, 1971, em Lignins: Occurrence, Formation, Structureand Reactions (K.V. Sarkanem e C. H. Kudwig ed.), Nova Iorque: Wiley—Interscience, pp. 1-18).

Uma abordagem para tentar reduzir o nível de ligninas em plan-tas por engenharia genética consistiria em inibir a síntese de uma das enzi-mas na cadeia da biossíntese dessas ligninas indicadas acima.

Uma técnica particularmente adequada no contexto de tal abor-dagem é usar mRNA anti-sentido, que é capaz de hibridizar o mRNA, quecodifica essas enzimas, e, conseqüentemente, previne, pelo menos em par-te, a produção destas enzimas de seu mRNA correspondente.

Tal estratégia de anti-sentido efetuada com a ajuda do gene quecodifica a CAD em tabaco foi o objeto do Pedido de Patente EP 584 117,que descreve o uso de mRNA anti-sentido que é capaz de inibir a produçãode ligninas em plantas por hibridização com o mRNA, que codifica a CADnessas plantas.

Os resultados nas plantas transformadas demonstram dessemodo uma redução da atividade da CAD, mas paradoxalmente os teores deligninas não mostraram alteração. Estudos complementares indicam que asligninas de plantas transformadas são diferentes das ligninas de controle, jáque os aldeídos cinamílicos são incorporados diretamente no polímero delignina.

Milho "Brown mid rib" (Bmr) tem sido usado como alternativapara aperfeiçoar a digestibilidade para híbridos de ensilagem, por décadas.O aperfeiçoamento nas ingestões e digestibilidade de ruminantes é derivadodo teor de lignina reduzido em híbridos mutados de Bmr. A mutação de Bm 1é relativamente branda e causa poucos efeitos pleiotróficos, mas proporcio-na menos aperfeiçoamento na digestibilidade que Bm3, tem sido menos es-tudado, e não tem sido comercialmente desenvolvido. A mutação de Bm3 éa característica de Bm mais bem estudada, ela proporciona característicassuperiores de digestibilidade, mas à custa de desempenho agronômico mo-deradamente pobre. Bm3 é a base da existência de produtos comerciais. Acaracterística de Bm1 é causada por atividade reduzida da enzima biossinté-tica, CAD, e a característica de Bm3 é causada por atividade reduzida deuma enzima biossintética, COMT.

As seguintes referências de base são aqui incorporadas a títulode referência: Patentes US 6.441.272; US 6.855.864; US 6.610.908; US5.451.514; US 5.866.791; US 5.959.178; US 6.066.780; US 6.211.432; US5.981.837; US 5.850.020; US 6.204.434; e US 6.610.521; Pedidos de Paten-te US20020081693 e US 20030159170; Pedidos PCT WO 2004080202; WO03054229; Pedido de Patente EP 1425401; e Piquemal et al., Plant Physio-logy 130:1675 - 1685 (2002); Vignols et al., The Plant Cell 7:407-416 (1995);Morrow et al., Molecular Breeding 3:351 - 357 (1997). Essas referências dis-cutem vários aspectos da biossíntese de lignina em plantas, e o controle de-les. Em especial, as Patentes US 5.451.514; US 5.959.178; e US 6.606.780são particularmente importantes com respeito ao ensinamento referente aopapel de expressão de CAD e de COMT na biossíntese de lignina em plan-tas.

Células e tecidos de plantas podem responder à lesão mecâni-ca, química ou induzida por patógeno por produção de vários compostosfenólicos incluindo precursores de lignina mono ou dimetoxilada derivadosde ácido cinâmico via uma séria complexa de reações bioquímicas. Essesprecursores de lignina são eventualmente usados pela planta para produzir opolímero de lignina que auxilia no reparo do ferimento por adição de hidrofo-bicidade, uma barreira física contra infecção por patógeno e resistência me-cânica ao tecido lesionado (Vance, C. P., et al., 1980, Annu Rev Phytopathol18:259-288). Biossíntese dos precursores de lignina mono ou dimetoxiladaocorrem, em parte, pela ação de duas enzimas, ácido caféico 3-0-metiltransferase (COMT), também conhecida como ácido caféico/5-hidroxiferúlico O-metiltransferase e cafeoil CoA 3-O-metiltransferase(CCOMT). Ambas as enzimas têm sido isoladas e purificadas a partir deuma ampla variedade de espécies de plantas.

Estudos mostraram que as atividades de COMT e CCOMT au-mentam antes da deposição de lignina (Inoue, K., et al., Plant Physiol117(3):761-770). A síntese de precursores de lignina envolve a metilação deácido caféico para produzir ácido ferúlico seguido por 5-hidroxilação do feru-lato, então uma segunda metilação para render sinapato. COMT está envol-vida na metilação tanto do ácido caféico como do ácido 5-hidroxiferúlico (I-noue, K., et al., 1998, Plant Physiol 117(3):761-770). Pesquisa indica quetranscritos de COMT estão presentes em altos níveis nos órgãos contendotecido vascular e um estudo sugere que a inibição de anti-sentido de COMTpode levar ao teor de lignina e composição modificados no xilem ou floemado tecido de planta transgênica (Dwivedi, U., et al., 1994, Plant Mol. Biol.26:61-71).

Uma tecnologia promissora para obtenção de silenciamento degene marcado é baseada em RNA de fita dupla (dsRNA) que induz repostaao chamado silenciamento de gene pós-transcricional ou de interferência deRNA (RNAi). RNA de fita dupla foi introduzido em várias espécies diferentes,incluindo nematódeos, moscas de frutas, Tripanossoma, fungos, plantas.Vide, por exemplo, W09932619. Algum sucesso limitado tem sido tambémdemonstrado em mamíferos, especificamente em ocitos e embriões de ca-mundongo. A introdução do dsRNA apropriado inibe a expressão de geneem uma modo dependente de seqüência, um efeito que tem sido usado ex-tensivamente em C. elegans e em D. melanogaster como uma ferramentagenética para estudar a função do gene. Por exemplo, 00/01846 descrevemétodos para caracterizar a função do gene usando inibição de dsRNA.

Contudo, a inibição de dsRNA tem sido aplicada com pouco sucesso emsistemas de mamíferos.

Por causa da importância das ligninas na arquitetura da paredecelular e digestibilidade, e por causa da agronomia desfavorável de milhoBmr, há considerável interesse nos prospectos para alterar a quantidade oua qualidade de lignina por engenharia genética. Assim, há um grande acordode interesse na identificação dos genes que codificam proteínas envolvidasna produção de lignina em plantas e na modificação da expressão de taisgenes, por exemplo, pelo uso de métodos de RNAi. Esses métodos podemser usados em células de planta para controlar a produção de lignina. Taismétodos teriam significante utilidade na produção de material de planta comaperfeiçoada digestibilidade, e se direcionados ao decréscimo do teor delignina dos sabugos de milho, poderiam evitar o aspecto inferior agronômicodo fenótipo de Bmr.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona métodos e construções de ex-pressão genética úteis no controle da biossíntese de lignina em plantas, eparticularmente em milho, e mais particularmente nos sabugos das plantasde milho. Em um exemplo específico, a tecnologia de RNAi de fita dupla éutilizada para diminuir a expressão de (ou para nocautear) tanto os genes deálcool cinamílico desidrogenase (CAD) do milho como os genes de ácidocaféico O-metil transferase (COMT) do milho. Modalidades preferidas envol-vem os genes nocaute CAD ou COMT especificamente no sabugo de milhopara reduzir o teor de lignina. Isso proporcionará digestibilidade aperfeiçoadade fibra não digerível no sabugo, que aperfeiçoaria a digestibilidade da plan-ta inteira por ruminantes. Limitando a expressão das características similaresa BM somente ao sabugo, o tecido mais altamente lignificado, proporcionariaainda aumento atrativo na digestibilidade da planta toda, mas mitigaria amaior parte do risco associada ao pobre desempenho agronômico, tais comodepósito aumentado e pobre rendimento de matéria seca, como ocorre commutações de Bmr, que está associado à sua expressão sistêmica. Portanto,os eventos de nocaute de CADA ou de COMT foram gerados usando tecno-logia de RNAi de fita dupla com OsMAD6, um promotor específico de sabu-go.

A presente invenção refere-se a um método para controlar a bi-ossíntese de lignina em uma planta, em que o método compreende infra-regular a expressão de uma enzima na planta, a enzima selecionada do gru-po que consiste em CAD e COMT, em que a infra-regulação é obtida usandoRNAi de fita dupla. O método refere-se também à infra-regulação de expres-são de ambas as enzimas; às construções de dsRNAi; e às construções es-pecíficas para sabugo/preferidas para sabugo. A presente invenção refere-se também ao uso dos sabugos, com baixo teor de lignina, produzidos utili-zando o método da invenção em aplicações de conversão de biomassa (porexemplo, na produção de etanol) e em aplicações de ração (por exemplo,em ração de animal para produção aumentada de leite, particularmente va-cas leiteiras).

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma representação do plasmídio pSyn12210.

A figura 2 é uma representação do plasmídio pSyn 12345.

A figura 3 é um gráfico mostrando que conforme o teor de ligninaaumenta, a digestibilidade de material de sabugo diminui.

Descrição Detalhada

Definições

Para clareza, certos termos usados no relatório descritivo sãodefinidos e apresentados como a seguir:

"Associado a/operativamente ligado" refere-se às duas seqüên-cias de ácido nucléico que estão relacionadas física ou funcionalmente. Porexemplo, um promotor ou seqüência de DNA reguladora é dito estar "asso-ciado a" uma seqüência de DNA que codifica um RNA ou a uma proteína seas duas seqüências estão operativamente ligadas, ou situadas de modo quea seqüência de DNA reguladora afetará o nível de expressão da codificaçãoou da seqüência de DNA estrutural.

Uma "construção quimérica" é uma seqüência de ácidos nucléi-cos recombinantes na qual um promotor ou seqüência de ácidos nucléicosreguladora é operativamente ligada ou associada a uma seqüência de áci-dos nucléicos que codifica mRNA ou que é expressa como uma proteína, demodo que a seqüência de ácidos nucléicos reguladora é capaz de regular atranscrição ou expressão da seqüência de ácido nucléicos associada. A se-qüência de ácidos nucléicos reguladora da construção quimérica é normal-mente operativamente ligada à seqüência de ácidos nucléicos associada,como encontrada na natureza.

Co-fator: reagente natural, tal como molécula orgânica ou íonmetal, requerido em uma reação catalisada por enzima. Um co-fator é, porexemplo, NAD(P), riboflavina (incluindo FAD e FMN), folato, molibdoproteí-na, tiamina, biotina, ácido lipóico, ácido pantotênico e coenzima A, S-adenosilmetionina, piridoxal fosfato, ubiquinose, menaquinona. Opcional-mente, um co-fator pode ser regenerado e re-usado.

Uma "seqüência de codificação" é uma seqüência de ácidos nu-cléicos que é transcrita em RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNAsentido ou RNA anti-sentido. Preferivelmente, o RNA é então traduzido emum organismo para produzir uma proteína.

Complementar: "complementar" refere-se a duas seqüências denucleotídeos que compreendem seqüências de nucleotídeos anti-paralelascapazes de emparelhamento, uma com a outra, mediante formação de pontede hidrogênio entre os resíduos de base complementares nas seqüências denucleotídeos anti-paralelas.

Atividade enzimática: significa aqui a capacidade de uma enzimaem catalisar a conversão de um substrato em um produto. Um substrato pa-ra a enzima compreende o substrato natural da enzima, mas também com-preende análogos do substrato natural, que podem ser também convertidospela enzima em um produto ou em um análogo de um produto. A atividadeda enzima é medida, por exemplo, por determinação da quantidade do pro-duto na reação depois de certo período de tempo, ou por determinação daquantidade de substrato que permanece na mistura reacional depois certoperíodo de tempo. A atividade da enzima é também medida por determina-ção da quantidade de um co-fator da reação, não usado, que permanece namistura reacional depois de certo período de tempo ou por determinação daquantidade de co-fator usado na mistura reacional depois de certo períodode tempo. A atividade da enzima é também medida por determinação daquantidade de um doador de energia livre ou molécula rica em energia (porexemplo, ATP, fosfoenolpiruvato, fosfato de acetila ou fosfocreatina) quepermanece na mistura reacional depois de certo período de tempo ou pordeterminação da quantidade de um doador usado de energia livre ou molé-cula rica em energia (por exemplo, ADP, piruvato, acetato ou creatina) namistura reacional depois de certo período de tempo.

Cassete de Expressão: "Cassete de expressão", como usadoaqui, significa uma molécula de ácido nucléico capaz de direcionar a expres-são de uma particular seqüência de nucleotídeos em uma célula hospedeiraapropriada, compreendendo um promotor operativamente ligado à seqüên-cia de interesse, que está operativamente ligada a sinais de terminação. Elatambém compreende, tipicamente, seqüências requeridas para traduçãoprópria da seqüência de nucleotídeo. A região de codificação codifica usu-almente uma proteína de interesse, mas pode também codificar um RNAfuncional de interesse, por exemplo, RNA anti-sentido ou RNA não traduzi-do, na direção sentido e anti-sentido. O cassete de expressão que compre-ende a seqüência de nucleotídeos de interesse por ser quimérico, significan-do que pelo menos um de seus componentes é heterólogo com respeito aopelo menos um de seus outros componentes. O cassete de expressão po-dem ser também um que ocorre naturalmente, mas que tenha sido obtidoem uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente,contudo, o cassete de expressão é heterólogo com respeito ao hospedeiro,isto é, a seqüência de DNA particular do cassete de expressão não ocorrenaturalmente na célula hospedeira e deve ter sido introduzida na célula hos-pedeira ou um ancestral da célula hospedeira por evento de transformação.A expressão da seqüência de nucleotídeos no cassete de expressão podeestar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzí-vel que inicia a transcrição somente quando a célula hospedeira é exposta aalgum estímulo externo. No caso de um organismo multicelular, tal comoplanta, o promotor pode ser também específico para um tecido particular ouórgão ou estágio de desenvolvimento.

Gene: o termo "gene" é usado amplamente com referência aqualquer segmento de DNA associado a uma função biológica. Assim, genesincluem seqüências de codificação e/ou seqüências reguladoras para suaexpressão. Os genes incluem também segmentos de DNA não expressosque, por exemplo, formam seqüências de reconhecimento para outras prote-ínas. Os genes podem ser obtidos de uma variedade de fontes, incluindoclonagem de uma fonte de interesse ou sintetização de uma informação deseqüência conhecida ou predita, e pode incluir seqüências desenhadas paraterem parâmetros desejados.

Heterólogo/exógeno: Os termos "heterólogos" e "exógenos",quando usados aqui, referem-se a uma seqüência de ácidos nucléicos (porexemplo, uma seqüência de DNA) ou um gene, referem-se a uma seqüênciaque se origina de uma fonte estranha à célula hospedeira particular ou, seda mesma fonte, é modificada de sua forma original. Assim, um gene heteró-logo em uma célula hospedeira inclui um gene que é endógeno à célulahospedeira particular, mas tem sido modificado através de, por exemplo, ouso de DNA shuffling. Os termos podem incluir também cópias múltiplas quenão ocorrem naturalmente de uma seqüência de DNA que ocorre natural-mente. Assim, os termos referem-se a um segmento de DNA que é estranhoou heterólogo à célula, ou homólogo às células, mas em uma posição dentrodo ácido nucléico da célula hospedeira e onde o elemento não é comumenteencontrado. Segmentos de DNA exógeno são expressos para produzir poli-peptídeos exógenos.

Uma seqüência de ácidos nucléicos "homóloga" (por exemplo,DNA) é uma seqüência de ácidos nucléicos (por exemplo, DNA) naturalmen-te associada a uma célula hospedeira na qual ele é introduzida.

Hibridização: A fase "hibridizar especificamente para" refere-se àligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula somente para umaseqüência de nucleotídeos particular sob condições severas quando essaseqüência está presente em um DNA ou RNA de mistura complexa (por e-xemplo, célula total). "Ligação(ções) substancialmente" refere-se à hibridiza-ção complementar entre um ácido nucléico de sonda e um ácido nucléicoalvo e engloba descorrespondências que podem ser acomodadas por redu-ção da severidade dos meios de hibridização para obter a detecção deseja-da da seqüência de ácidos nucléicos alvo.

Inibidor: uma substância química que inativa a atividade enzimá-tica de uma proteína tal como enzima biossintética, receptor, proteína detransdução de sinal, produto gênico estrutural, ou proteína de transporte. Otermo "herbicida" (ou "composto herbicida") é usado aqui para definir uminibidor aplicado a uma planta em qualquer estágio de desenvolvimento, pormeio de que a o herbicida inibe o crescimento da planta ou mata a planta.

Interação: qualidade ou estado de ação mútua de modo que aeficácia ou toxidez de uma proteína ou composto em uma outra proteína se-ja inibidora (antagonistas) ou intensificadora (agonistas).

Uma seqüência de ácidos nucléicos é "isocodificadora com" umaseqüência de ácidos nucléicos de referência quando a seqüência de ácidosnucléicos codifica um polipeptídeo tendo a mesma seqüência de aminoáci-dos que o polipeptídeo codificado pela seqüência de ácidos nucléicos dereferência.

Isogênico: plantas que são geneticamente idênticas, exceto pelofato de que elas podem diferir pela presença ou ausência de uma seqüênciade DNA heteróloga.

Isolado: no contexto da presente invenção, uma molécula deDNA isolada ou uma enzima isolada é uma molécula de DNA ou enzimaque, pela mão do homem, existe separada de seu ambiente nativo e não é,portanto, um produto da natureza. Uma molécula de DNA ou enzima isoladapode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente nãonativo, tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira transgênica.

Proteína madura: proteína da qual o peptídeo de trânsito, peptí-deo de sinal, e/ou porções de propeptídeo foram removidos.

Promotor mínimo da menor peça de um promotor, tal como umelemento TATA, que pode suportar qualquer transcrição. Um promotor mí-nimo tem tipicamente atividade de promotor, altamente reduzida, em ausên-cia de ativação a montante. Em presença de um fator de transcrição ade-quado, o promotor mínimo funciona para permitir transcrição.

Atividade de enzima modificada: atividade enzimática diferentedaquela que ocorre naturalmente em uma planta (isto é, atividade enzimáticaque ocorre naturalmente na ausência de manipulação direta ou indireta detal atividade pelo homem), que é tolerante a inibidores que inibem a ativida-de enzimática que ocorre naturalmente.

Nativo: refere-se a um gene presente no genoma de uma célulade planta não transformada.

Ocorrência natural: o termo "ocorrência natural" é usado paradescrever um objeto que pode ser encontrado na natureza como distinto deser artificialmente produzido pelo homem. Por exemplo, é de ocorrência na-tural uma proteína ou seqüência de nucleotídeos presente em um organismo(incluindo um vírus), que pode ser isolada de uma fonte na natureza e quefoi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório.

Ácido nucléico: o termo "ácido nucléico" refere-se a desorribonu-cleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes tanto na forma de fitasimples como de fita dupla. A menos que especificamente limita, o termoengloba ácidos nucléicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeosnaturais, que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucléico dereferência e são metabolizados de um modo similar aos nucleotídeos de o-corrência natural. A menos que de outro modo indicado, uma seqüência deácidos nucléicos, particular, também engloba implicitamente suas variantesmodificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códon dege-nerado) e seqüências complementares e bem como na seqüência explicita-mente indicada. Especificamente, substituições de códons degenerados po-dem ser obtidas por geração de seqüências, nas quais a terceira posição deum ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída com resíduos debases mistas e/ou de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol, Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al.,Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Os termos "ácido nucléico" ou "seqüên-cias de ácidos nucléicos" podem ser também usados intercambiavelmentecom gene, cDNA, e mRNA codificado por um gene.

"ORF" significa quadro aberto de leitura.Identidade percentual: as fases "porcentagem idêntica" ou "por-centagem idêntica" no contexto de duas seqüências de ácidos nucléicos ouproteínas, refere-se preferivelmente a duas ou mais seqüências ou subse-qüências que têm, por exemplo, 60%, preferivelmente, 70%, mais preferi-velmente 80%, ainda mais preferivelmente 90%, mesmo mais preferivelmen-te 95%, e de maior preferência pelo menos 99% de identidade de resíduosde nucleotídeos ou de aminoácidos, quando comparadas ou alinhadas paracorrespondência máxima, conforme medição usando um dos seguintes algo-ritmos de comparação de seqüência ou inspeção visual. Preferivelmente, aidentidade em porcentagem existe ao longo de uma região das seqüênciasque tem pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, mais preferivel-mente ao longo uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e maispreferivelmente a identidade em porcentagem existe ao longo de pelo menos150 resíduos. Em uma modalidade especialmente preferida, a presente iden-tidade existe ao longo de todo o comprimento das regiões de codificação.Para comparação de seqüências, tipicamente uma seqüênciaage como uma seqüência de referência com a qual seqüências de teste sãocomparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüências,as seqüências de teste e de referencia são inseridas em um computador, ascoordenadas de subseqüências são designadas se necessário, e os parâ-metros do programa de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmode comparação de seqüências calcula então a identidade de porcentagemde seqüência para a(s) seqüência(s) de teste com a seqüência de referên-cia, com base nos parâmetros de programa designados.

O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode serconduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Wa-terman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento dehomologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela buscapor método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei.E.U.A. 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algo-ritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software WisconsinGenetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, Wis.), ou porinspeção visual (vide genericamente, Ausubel et al., abaixo).

Exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar aidentidade de seqüências em porcentagem e similaridade de seqüências é oalgoritmo BLAST, que é descrito por Altschul et al, J. Mo. Biol. 215:403-410(1990). Software para realizar a análise de BLAST está publicamente dispo-nível no National Center for Biotechnology Information(htttp://www.ncbi.nlm.nih.go-v/). Esse algoritmo envolve os primeiros paresde seqüências de classificação alta de identificação (HSPs) por identificaçãode palavras curtas de comprimento W na seqüência de questões, que oucorrespondem ou satisfazem alguma classificação T de limite com valor po-sitivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em umaseqüência da base de dados. T é referido como o limite de classificação depalavras da vizinhança (Altschul et al., 1990). Esses acertos de palavras navizinhança iniciais agem como sementes para iniciar buscas para encontrarHSPs mais longas contendo estas. Os acertos de palavras são então esten-didos em ambas as direções ao longo de cada seqüência para a classifica-ção até a classificação de alinhamento cumulativo poder ser aumentada.Classificações cumulativas são calculadas usando, por exemplo, para se-qüências de nucleotídeos, os parâmetros M (classificação de recompensapara um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (classificação depenalidade para resíduos que descorrespondentes; sempre <0). Para se-qüências de aminoácidos, uma matriz de classificação é usada para calculara classificação cumulativa. Extensão dos acertos de palavras em cada dire-ção é interrompida, quando o alinhamento cumulativo cai da quantidade Xde seu valor máximo conseguido, a classificação cumulativa vai para zero ouabaixo devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos declassificação negativa, ou o final de qualquer das seqüências é atingido. Osparâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e ve-locidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleo-tídeos) usa padrões de comprimento de palavra (W) de 11, um expectativa(E) de 10, um corte de 100, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fi-tas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTOP usado comopadrões um comprimento palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e amatriz de classificação BLOSUM62 (vide Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. A-cad. Sei. E.U.A.: 10915 (1989)).

Além de calcular a identidade de seqüência em porcentagem, oalgoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade en-tre duas seqüências (vide, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl Acad.Sei. E.U.A. 90: 5873-5787 (1993)). Uma medição de similaridade fornecidapelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), queproporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondênciaentre duas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria poracaso. Por exemplo, uma seqüência de ácidos nucléicos de teste éconsiderada similar a uma seqüência de referência se a menor probabilidadede soma em um comparação da seqüência de ácidos nucléicos com aseqüência de ácidos nucléicos de referência for menor que cerca de 0,1,mais preferivelmente menor que cerca de 0,01, e de maior preferência me-nor que cerca de 0,001.0,001.

Pré-proteína: proteína que é normalmente marcada para umaorganela celular, tal como um cloroplasto, e ainda compreende seu peptídeode trânsito nativo.

Purificado: o termo "purificado", quando aplicado a um ácido nu-cleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou a proteína está essenci-almente isenta de outros componentes celulares com os quais ele(ela) é as-sociado(a) no estado natural. Está preferivelmente em um estado homogê-neo embora possa estar em uma solução seca ou aquosa. Pureza e homo-geneidades são tipicamente determinadas usando técnicas de química analí-tica tal como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia líquidade alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante em umapreparação está substancialmente purificada. O termo "purificado" denotaque um ácido nucleico ou proteína gera essencialmente uma banda em umgel eletroforético. Particularmente, isso significa que o ácido nucleico ou aproteína é pelo menos cerca de 50% pura, mais preferivelmente cerca depelo menos 85% pura, e de maior preferência pelo menos cerca de 99% pura.

Dois ácidos nucléicos são "recombinados" quando seqüênciasde cada unidos dois ácidos nucléicos são combinadas em um ácido nuclei-co progênie. Duas seqüências são "diretamente" recombinadas quando am-bos os ácidos nucléicos são substratos para recombinação. Duas seqüên-cias são "recombinadas indiretamente" quando as seqüências são recombi-nadas usando um intermediário tal como um oligonucletídeo de permuta.Para recombinação indireta, não mais que uma das seqüências é um subs-trato real para recombinação, e em alguns casos, nenhuma seqüência é umsubstrato para recombinação.

"Elementos reguladores" referem-se às seqüências envolvidasno controle da expressão de uma seqüência de nucleotídeos. Elementosreguladores compreendem um promotor operativamente ligado à seqüênciade nucleotídeos de interesse e sinais de terminação. Eles também englobamtipicamente seqüências requeridas para tradução da seqüência de nucleotí-deos.

Aumento significante: um aumento significante da atividade en-zimática que é maior que a margem de erro na técnica de medição, preferi-velmente um aumento de cerca de 2 vezes ou mais da atividade do tipo deenzima do tipo selvagem em presença do inibidor, mais preferivelmente umaumento de cerca de 5 vezes ou mais, e de maior preferência um aumentode cerca de 10 vezes ou mais.

Significantemente menor: significa que a quantidade de um pro-duto de uma reação enzimática é reduzida de maior que a margem de erroinerente à técnica de medição, preferivelmente um decréscimo de cerca de 2vezes ou mais da atividade da enzima do tipo selvagem em ausência do ini-bidor, mais preferivelmente um decréscimo de cerca de 5 vezes ou maior, ede maior preferência um decréscimo de cerca de 10 vezes ou maior.

Ligação específica/Reatividade Cruzada Imunológica: Uma indi-cação de que duas seqüências de ácidos nucléicos ou de proteínas sãosubstancialmente idênticas é que a proteína codificada pelo primeiro ácidonucléico apresenta reatividade imunologicamente cruzada com ou se ligaespecificamente à proteína codificada pelo segundo ácido nucléico. Assim,uma proteína é típica e substancialmente idêntica a uma segunda proteína,por exemplo, se a duas proteínas diferem somente por substituições conser-vadoras. A frase "especificamente (ou seletivamente) se liga a um anticor-po", ou "especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com", quandocom referência a uma proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de liga-ção que é determinante da presença da proteína em presença de uma popu-lação heterogênea de proteínas e outras substâncias biológicas. Assim, sobcondições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados se ligama uma proteína particular e não se ligam em uma quantidade significante àsoutras proteínas presentes na amostra. Ligação específica para um anticor-po sob tais condições pode requerer um anticorpo que é selecionado quantoa sua especificidade para uma particular proteína. Por exemplo, anticorposgerados para a proteína com a seqüência de aminoácidos codificada porquaisquer das seqüências de aminoácidos da invenção podem ser selecio-nados para obter anticorpos especificamente imunorreativos com aquelaproteína e não com outras proteínas exceto para variantes polimórficas. Umavariedade de formatos de imunoensaio pode ser usada para selecionar anti-corpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por e-xemplo, imunoensaios Elis em fase sólida, Western blots, ou imunoistoquí-mica são rotineiramente usados para selecionar anticorpos monoclonais es-pecificamente imunorreativos com uma proteína. Vide Harlow e Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova Ior-que ("Harlow and Lane"), para descrição de formatos de imunoensaios econdições que podem ser usadas para determinar imunorreatividade especí-fica. Tipicamente, uma reação específica ou seletiva é de pelo menos duasvezes o sinal de fundo ou de ruído e mais tipicamente acima de 10 a 100vezes de fundo.

"Condições de hibridização severas" e "condições de lavagemde hibridização severas" no contexto dos experimentos de hibridização deácidos nucléicos tais como hibridizações Southern and Northern são depen-dentes de seqüência, e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes.Seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas maisaltas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é dado porTijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bio-logy-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview ofprincipies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", El-sevier, Nova Iorque. Geralmente, condições de hibridização e de lavagemseveras são selecionadas para serem de 5°C inferiores ao ponto de fusãotérmico (Tm) para a seqüência específica em uma resistência iónica e pHdefinidos. Tipicamente, sob "condições severas" uma sonda hibridizirá parasua subseqüência alvo, mas não para outras seqüências.

A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) emcujos 50% da seqüência alvo hibridiza para um sonda perfeitamente corres-pondida. Condições muito severas são selecionadas para serem iguais à Tmpara uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridização seve-ras para hibridização de ácidos nucléicos complementares, que têm maisque 100 resíduos complementares em um filtro em um Southern ou Northernblor é 50% de formamida com 1 mg de heparina, a 42°C, com a hibridizaçãosendo efetuada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem al-tamente severas é NaCI 0,15M a 72°C, por cerca de 15 minutos. Um exem-pio de condições de lavagem severas é 0,2 vez SSC a 65°C, por 15 minutos(vide, Sambrook, abaixo, para uma descrição de tampão de SSC). Freqüen-temente, lavagem de alta severidade é precedida de uma lavagem de baixaseveridade para remover sinal de sonda de fundo. Um exemplo de lavagemde severidade média para um duplex de, por exemplo, mais que 100 nucleo-tídeos, 1 vez de SSC a 45°C, por 15 minutos. Um exemplo de lavagem debaixa severidade para um duplex de, por exemplo, mais que 100 nucleotí-deos, é de 4 a 6 vezes de SSC, a 40°C, por 15 minutos. Para sondas curtas(por exemplo, cerca de 10 a 50 nucleotídeos), condições severas envolvemtipicamente concentrações de sal de menos que cerca de íon Na 0,1 M, tipi-camente cerca de 0,01 a 1,0M de concentração de íon Na (ou outros sais),em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30°C.Condições severas podem ser também obtidas com a adição de agentesdesestabilizantes tal como formamida. Em geral, uma razão de sinal pararuído de 2 vezes (ou mais) que aquela observada para uma sonda não rela-cionada no ensaio de hibridização particular indica detecção de uma hibridi-zação específica. Ácidos nucléicos que não hibridizam para quaisquer outrascondições severas são ainda substancialmente idênticos se as proteínas queeles codificam forem substancialmente idênticas. Isso ocorre, por exemplo,quando uma cópia é criada usando a degenerescência máxima de códonpermitida pelo código genético.

Os seguintes são exemplos de condições de hibridiza-ção/lavagem que podem ser usadas para clonar seqüências de nucleotídeosque são homólogos das seqüências de nucleotídeos de referência da pre-sente invenção: uma seqüência de nucleotídeos de referência hibridiza pre-ferivelmente para a seqüência de nucleotídeos de referência em dodecil sul-fato de sódio a 7% (SDS), NaP04 0,5M, EDTA 1mM, a 50°C, com lavagemem 2 vezes de SSC, SDS a 0,1%, a 50°C, mais desejavelmente em dodecilsulfato de sódio a 7% (SDS), NaP04 0,5M, EDTA 1Mm, a 50°C, com lava-gem em 1 vez de SSC, SDS a 0,1%, a 50°C, mais desejavelmente em dode-cil sulfato de sódio a 7% (SDS), NaP04 0,5M, EDTA 1 mM, a 50°C, com la-vagem em 0,5 vez de SSC, SDS a 0,1%, a 50°C, preferivelmente em dodecilsulfato de sódio a 7% (SDS), NaP04 0,5M, EDTA 1mM, a 50°C, com lava-gem em 0,1 vez de SSC, SDS a 0,1%, a 50°C, mais preferivelmente em do-decil sulfato de sódio a 7% (DSD), NaP04 0,5M, EDTA 1mM, a 50°C, comlavagem em 0,1 vez de SSC, SDS a 0,1%, a 65°C.

"Subseqüência" refere-se a uma seqüência de ácidos nucléicosou de aminoácidos que compreende uma parte de uma seqüência mais lon-ga de ácidos nucléicos ou de aminoácidos (por exemplo, proteína), respecti-vamente.

Substrato: um substrato é a molécula que uma enzima reconhe-ce naturalmente e converte em um produto na via bioquímica na qual a en-zima efetua naturalmente a sua função, ou é uma versão modificada da mo-lécula, que é também reconhecida pela enzima e é convertida pela enzimaem um produto, em uma reação enzimática similar à reação que ocorre natu-ralmente.

Transformação: um processo para introduzir DNA heterólogo emuma célula de planta, um tecido de planta, ou planta. Células de planta, teci-do de planta ou plantas transformadas devem ser entendidas como englo-bando não somente o produto final de um processo de transformação, mastambém sua progênie transgênica.

"Transformado", "transgênico" e "recombinante" referem-se a umorganismo hospedeiro tal como bactéria ou planta onde uma molécula deácido nucléico heterólogo tenha sido introduzida. A molécula de ácido nu-cléico pode estar estavelmente integrada no genoma do hospedeiro ou amolécula de ácido nucléico pode estar também presente como uma molécu-la extracromossomial. Tal molécula extracromossomial pode ser auto-replicadora. Células, tecidos e plantas transformados devem ser entendidoscomo englobando não somente o produto final de um processo de transfor-mação, mas também a progênie deste. Um hospedeiro "não transformado","não transgênico", ou "não recombinante" refere-se a um organismo do tiposelvagem, por exemplo, uma bactéria ou planta, que não contém a moléculade ácido nucléico heterólogo.

Viabilidade: "viabilidade", com usada aqui, significa um parâme-tro de ajuste de uma planta. As plantas são ensaiadas para seu desempe-nho homozigoto do desenvolvimento da planta, indicando que as plantas sãoessenciais para o crescimento da planta.

Alteração da expressão de uma seqüência de nucleotídeos depresente invenção é também obtida por interferência de dsRNA conformedescrição no WO 99/32619, WO 99/53050 ou WO 99/61631, todos aqui in-corporados a título de referência em sua totalidade. Em uma outra modali-dade, a alteração da expressão de uma seqüência de nucleotídeos da pre-sente invenção, preferivelmente a redução de sua expressão, é obtida porinterferência de RNA de fita dupla (dsRNA). A totalidade ou, preferivelmente,uma porção de uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção estácompreendida em uma molécula de DNA. O tamanho da molécula de DNA épreferivelmente de 100 a 1.000 nucleotídeos ou mais; o tamanho ótimo a serdeterminado empiricamente. Duas cópias da molécula de DNA idênticas sãoligadas, separadas por uma molécula de DNA espaçador, de modo que aprimeira e a segunda cópias estejam em orientações opostas. Na modalida-de preferida, a primeira cópia de molécula de DNA está no complementoreverso (também conhecido como fita de não-codificação) e a segunda cópiaé a fita de codificação; na modalidade mais preferida, a primeira cópia é afita de codificação, e a segunda cópia é o complemento reverso. O tamanhoda molécula de DNA espaçador é preferivelmente de 200 a 10.000 nucleotí-deos, mais preferivelmente 400 a 5.000 nucleotídeos e de maior preferênciade 600 a 1.500 nucleotídeos de comprimento. O espaçador é preferivelmen-te uma peça aleatória de DNA, mais preferivelmente uma peça aleatória deDNA com homologia para o organismo alvo para a interferência de dsRNA, ede maior preferência uma intron funcional que é efetivamente unido pelo or-ganismo alvo. As duas cópias da molécula de DNA separadas pelo espaça-dor são operativamente ligadas a um promotor funcional em uma célula deplanta, e introduzidas em uma planta, onde a seqüência de nucleotídeos éexpressável. Em uma modalidade preferida, a molécula de DNA que com-preende a seqüência de nucleotídeos, ou uma porção desta, é estavelmenteintegrada ao genoma da célula de planta.

Em uma outra modalidade preferida, a molécula de DNA com-preendendo a seqüência de nucleotídeos, ou uma porção desta, está com-preendida em uma molécula de replicação extracromossomial. Várias publi-cações que descrevem essa abordagem são citadas para posterior ilustra-ção (Waterhouse et al. (1998) PNAS 95:13959-13964; Chuang e Meyerowitz(2000) PNAS 97:49854990; Smith et al. (2000) Nature 40:319-320). A altera-ção da expressão de uma seqüência de nucleotídeos por interferência dedsRNA está também descrita em, por exemplo, WO 99/32619, WO 99/53050ou WO 99/61631, todas estes aqui incorporadas a título de referência emsua totalidade.

Nas plantas transgênicas que contêm uma das moléculas deDNA descritas imediatamente acima, a expressão da seqüência de nucleotí-deos correspondente à seqüência de nucleotídeos compreendida na molécu-la de DNA é preferivelmente reduzida. Preferivelmente, a seqüência de nu-cleotídeos na molécula de DNA é pelo menos 70% idêntica à seqüência de nucleotídeos, cuja expressão é reduzida, mais preferivelmente ela é pelomenos 80% idêntica, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica,ainda de maior preferência pelo menos 95% idêntica, de ainda maior prefe-rência pelo menos 99% idêntica.

Controle de Expressão de Gene em Plantas Transgênicas

A invenção refere-se ainda às células transformadas que com-preendem as moléculas de ácido nucléico, plantas transformadas, sementes,e partes de plantas, e métodos para modificar as características fenotípicasde interesse por alteração da expressão dos genes da invenção.

A. Modificação das Seqüências de Codificação e Seqüências Adjacentes

A expressão transgênica em plantas de genes derivados de fon-tes heterologas pode envolver a modificação daqueles genes para obter eotimizar sua expressão em plantas. Em particular, ORFs bacterianos quecodificam enzimas separadas, mas que são codificados pelo mesmo trans-crito no micróbio nativo, são mais bem expressos em plantas em transcritosseparados. Para obtenção disto, cada ORF microbiano é isolado individual-mente e clonado dentro de um cassete que proporciona uma seqüência depromotores de planta na extremidade 5' do ORF e uma terminador transcri-cional de planta na extremidade 3' do ORF. A seqüência de ORFs isoladainclui preferivelmente o códon ATG iniciador e o códon STOP terminador,mas pode incluir seqüência adicional além do códon ATG iniciador e doSTOP. Além disso, o ORF pode estar truncado, mas ainda retém a atividaderequerida; para ORFs longos, versões truncadas que retêm atividade podemser preferíveis para expressão em organismos transgênicos. "Promotor deplanta" e "terminador transcricional de planta" significam promotores e termi-nadores transcricionais que operam dentro das células de planta. Isso incluipromotores e terminadores de transcrição que podem ser derivados de fon-tes não-plantas tais com vírus (um exemplo é o Vírus Mosaico da Couve-Flor).

Em alguns casos, a modificação das seqüências de codificaçãode ORF e da seqüência adjacente não é requerida. É suficiente isolar umfragmento contendo o ORF de interesse e inseri-lo a jusante de um promotorde planta. Por exemplo, Gaffney et al. (Science 261: 754-756 (1993)) ex-pressaram o gene nahG de Pseudomonas em plantas transgênicas sob ocontrole do promotor CaMV 35S e o terminador CaMV tml com sucesso semmodificação da seqüência de codificação e com nucleotídeos de gene dePseudomonas a montante do ATG ainda ligado, e nucleotídeo a jusante docódon STOP ainda ligado ao ORF de nahG. Preferivelmente, uma pequenaseqüência microbiana adjacente deve ser deixada a montante do ATG e ajusante do códon STOP. Na prática, tal construção pode depender da dispo-nibilidade de sítios de restrição.

Em outros casos, a expressão de genes derivados de fontes mi-crobianas pode proporcionar problemas na expressão. Esses problemas fo-ram bem caracterizados na técnica e são particularmente comuns com ge-nes derivados de certas fontes como Bacilos. Esses problemas podem seaplicar à seqüência de nucleotídeos desta invenção, e a modificação dessesgenes pode ser efetuada por técnicas agora bem conhecidas da arte. Osseguintes problemas podem ser encontrados:

1. Uso de Códon.

O uso de códon preferido em plantas difere do uso de códonpreferido em certos microrganismos. Comparação do uso de códons dentrode um ORF microbiano clonado com o uso em genes de plantas (e em parti-cular genes da planta alvo) possibilitará uma identificação dos códons dentrodo ORF, que seria preferivelmente alterado. Tipicamente, a evolução daplanta tende a uma forte preferência dos nucleotídeos C e G na terceira po-sição de base de monocotiledôneas, ao passo que as dicotiledôneas fre-qüentemente usam os nucleotídeos A ou T nesta posição. Com a modifica-ção de um gene para incorporar uso de códon preferido para uma espécietransgênica alvo particular, muitos dos problemas descritos abaixo relativosao teor de GC/AT e splice ilegítimo serão superados.

2. Teor de GC/AT

Genes de plantas têm tipicamente um teor de GC de mais que35%. As seqüências de ORFs que são ricas em nucleotídeos A e T podemcausar vários problemas nas plantas. Em primeiro lugar, acredita-se que mo-tivos de ATTTA provocam a desestabilização das mensagens e são encon-trados na extremidade 3' de muitos mRNAs de vida curta. Em segundo lu-gar, acredita-se que a ocorrência de sinais de poliadenilação tal como AA-TAAA em posições inapropriadas dentro da mensagem causa truncaçaoprematura de transcrição. Além disso, monocotiledôneas podem reconhecerseqüências ricas em AT em sítios de splice (vide abaixo).

3. Seqüências Adjacentes à Metionina de Iniciação

As plantas diferem dos microrganismos em que suas mensa-gens não possuem um sítio de ligação de ribossomo definido. Mais exata-mente, acredita-se que ribossomos se liguem à extremidade 5' da mensa-gem e faça uma varredura para o primeiro ATG disponível, no qual a trans-lação começa. Contudo, acredita-se que existe uma preferência por certosnucleotídeos adjacentes ao ATG e que a expressão de genes microbianospode ser intensificada pela inclusão de um iniciador de tradução de consen-so eucariótico no ATG. Clontech (catálogo de 1993/1994, página 210, aquiincorporado a título de referência) sugeriu uma seqüência como um iniciadorde trandução de consenso para a expressão do gene uidA da E. coli emplantas. Ainda, Joshi (N.A.R. 15: 6643-6653 (1987), incorporado aqui a títulode referência) comparou muitas seqüências de plantas com o ATG e sugereuma outra seqüência de consenso. Em situações onde dificuldades são en-contradas na expressão dos ORFs microbianos em plantas, a inclusão deuma dessas seqüências no ATG de iniciação podem aperfeiçoar a tradução.

Em tais casos, os últimos três nucleotídeos do consenso podem não ser a-propriados para inclusão na seqüência modificada devido à sua modificaçãodo segundo resíduo AA. Seqüências preferidas adjacentes à metionina deiniciação podem diferir entre espécies de plantas diferentes. Uma investiga-ção em 14 genes de milho localizados no banco de dados GenBank fornece-ram os resultados:

1 Posição Antes do ATG de Iniciação em 14 Genes de Milho:

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 C 3 8 4 6 2 5 6 0 10 T 3 0 3 4 3 2 1 1 1 0 A 2 3 14323723G6360654615

Essa análise pode ser efetuada para as espécies de plantas de-sejadas, nas quais a seqüência de nucleotídeos está sendo incorporada, e aseqüência adjacente ao ATG modificado para incorporar os nucleotídeospreferidos.

4. Remoção de Sítios Splice Ilegítimos

Genes clonados de fontes não-planta e não otimizados para ex-pressão em plantas podem conter também motivos que podem ser reconhe-cidos na plantas como sítios de splice 5' e 3', e ser clivados, gerando, assim,mensagens truncadas ou deletadas. Esses sítios podem ser removidos u-sando-se técnicas bem conhecidas da arte.

Técnicas para a modificação de seqüências de codificação eseqüências adjacentes são bem conhecidas da arte. Nos casos em que aexpressão inicial de um ORF microbiano é baixa e é considerada apropriadapara fazer alterações na seqüência conforme descrito acima, então a cons-trução de genes sintéticos pode ser obtida de acordo com os métodos bemconhecidos na técnica. Esses são, por exemplo, descritos nas descrições depatentes publicadas EP 0 385 962 (Monsanto), EP 0 359 472 (Lubrizol) eWO 93/07278 (Ciba-Geigy), todas as quais são aqui incorporadas a título dereferência. Na maioria dos casos, é preferível ensaiar a expressão de cons-truções de gene usando protocolos de ensaios transitórios (que são bemconhecidos da técnica) antes de sua transferência para as plantas transgê-nicas.

B. Construção de Cassetes de Expressão de Plantas

Seqüências de codificação destinadas à expressão em plantastransgênicas são inicialmente montadas em cassetes de expressão atrás deum promotor adequado expressável em plantas. O cassete de expressãopode compreender também quaisquer seqüências adicionais requeridas ouselecionadas para a expressão do transgene. Tais seqüências incluem, massem restrição, terminadores de transcrição, seqüências estranhas para in-tensificar a expressão tais como introns, seqüências vitais, e seqüênciasdestinadas para a marcação do produto gênico a organelas específicas ecompartimentos de células. Esses cassetes de expressão podem ser entãofacilmente transferidos para os vetores de transformação de plantas descri-tos abaixo. O seguinte é uma descrição de vários componentes de cassetesde expressão típicos.

1. Promotores

A seleção do promotor usado nos cassetes de expressão deter-minará o padrão de expressão espacial e temporal do transgene na plantatransgênica. Promotores selecionados expressarão transgenes em específi-cos tipos de células (tais como células epidérmicas de folha, células mesófi-las, células do córtex de raiz,) ou em tecidos ou órgãos específicos (raízes,folhas ou flores, por exemplo) e a seleção refletirá a localização desejada doacúmulo do produto gênico. Alternativamente, o promotor selecionado podeconduzir a expressão do gene sob várias condições indutoras. Os promoto-res variem em sua resistência, isto é, capacidade de promover transcrição.Dependendo do sistema de célula hospedeira utilizado, qualquer um de vá-rios promotores adequado pode ser usado, incluindo o promotor nativo degene. Os seguintes são exemplos não limitativos de promotores que podemser usados nos cassetes de expressão.a. Expressão Constitutiva, a Promotor de Ubiquitina:

A ubiquitina é um produto gênico conhecido por se acumular emvários tipos de células e seu promotor tem sido clonado de várias espéciespara uso em plantas transgênicas (por exemplo, girassol - Binet et al., PlantScience 79: 87-94 (1991); milho - Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989); e Arabidopsis - Callis et al., J. Biol. Chem. 265: 12486-12493 (1990) e Norris et al., Plant Mol. Biol. 21: 895-906 (1993)). O promotorde ubiquitina de milho tem sido desenvolvido em sistemas de monocotiledô-nea transgênica e sua seqüência e vetores construídos para transformaçãode monocotiledôneas são descritos na Patente EP 0 342 926 (Lubrizol), queé aqui incorporada a título de referência. Taylor et al. (Plant Cell Rep. 12:491495 (1993)) descrevem um vetor (pAHC25) que compreende um promo-tor de ubiquitina de milho e primeiro intron e sua alta atividade em suspen-sões de células de várias monocotiledôneas, quando introduzido via bom-bardeio de microprojéteis. O promotor de ubiquitina de Arabidopsis éideal para uso com as seqüências de nucleotídeos da presente invenção. Opromotor de ubiquitina é adequado para expressão de gene em plantastransgênicas, tanto monocotiledôneas como dicotiledôneas. Vetores ade-quados são derivados de pAHC25 ou quaisquer dos vetores de transforma-ção descritos neste pedido, modificados pela introdução do promotor de ubi-quitina apropriado e/ou seqüências de introns.

b. Expressão Constitutiva, o Promotor CaMV 35S:

Construção do plasmídio pCGN1761 é descrita no pedido depatente EP 0 392 225 (Exemplo 23), que é aqui incorporado a título de refe-rência. pCGNl761 contém o promotor CAMV 35 S "duplo" e o terminadortranscricional tml com um sítio EcoRI único entre o promotor e o terminadore tem a estrutura principal do tipo pUC. Um derivado de pCGN1761 é cons-truído tendo um poli-ligante modificado que inclui sítios Ntol e Xhol, além dosítio EcoRI, existente. Esse derivado é designado pCGN1761ENX.pCGN1761ENX é útil para clonar seqüências de cDNA ou seqüências decodificação (incluindo seqüências de ORFs microbianos) dentro de seu poli-ligante com a finalidade de sua expressão sob o controle do promotor 35Sem plantas transgênicas. O cassete de promotor 35S-seqüência de codifica-ção-terminador tml de tal construção pode ser excisado pelos sítios 5' Hindll-I, Sphl, Sall, e Xbal para o promotor e sítios 3' Xbal, BamHI e Bgll) para oterminador para transferência para vetores de transformação tais como a-queles descritos abaixo. Além disso, o fragmento de promotor 35S duplopode ser removido por excisão 5' com Hindlll, Sphl, Sall, Xbal, ou Pstl, e ex-cisão 3' com quaisquer sítios de restrição de poli-ligante (EcoRI, Notl ouXhol) para substituição com um outro promotor. Se desejado, modificaçõesem torno dos sítios de clonagem podem ser feitas pela introdução de se-qüências que podem intensificar a tradução. Isso é particularmente útilquando a super-expressão é desejada. Por exemplo, pCGN1761ENX podeser modificado por otimização do sítio de iniciação traducional como descritono Exemplo 37 da Patente US5.639.949, aqui incorporada a título de refe-rência.

c. Expressão Constitutiva, o Promotor de Actina:

Várias isoformas de actina são conhecidas por expressarem namaioria dos tipos de células e, conseqüentemente, o promotor de actina éuma boa escolha para um promotor constitutivo. Em particular, o promotorproveniente do gene Actl de arroz foi clonado e caracterizado (McEIroy et al.,Plant Cell 2: 163-171 (1990)). Verificou-se que um fragmento de 1,3 kb dopromotor continha todos os elementos reguladores requeridos para expres-são em protoplastos de arroz. Além disso, numerosos vetores de expressãode arroz com base no promotor Actl têm sido construídos especificamentepara uso em monocotiledôneas (McEIroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). Esses incorporam o Actl-intron 1, seqüências flanqueadora 5'de Adhl e Adhl-intron 1 (do gene de álcool de milho desidrogenase) e se-qüência do promotor CaMV 35S. Os vetores mostrando a maior expressãoforam as fusões de 35S e Actl intron ou a seqüência flanqueadora 5' de Actlintron e o Actl intron. Otimização das seqüências em torno do ATG iniciador(do gene repórter GUS) também intensificou a expressão. Os cassetes deexpressão de promotor descritos por McEIroy et al. (Mol.-Gen. Genet. 231:150-160 (1991)) podem ser facilmente modificados para expressão de genese são particularmente adequados para uso em hospedeiros de monocotile-dônea. Por exemplo, fragmentos contendo promotor são removidos dasconstruções de McEIroy e usados para repor o promotor 35s duplo empCGN1761ENX, que é então disponível para a inserção de seqüências degenes específicos. Os genes de fusão assim construídos podem ser entãotransferidos para vetores de transformação apropriados. Em um relatórioseparado, foi constatado que o promotor de Actl com seu primeiro intron di-reciona alta expressão em células de cevada cultivadas (Chibbar et al., PlantCell Rep. 12: 506-509 (1993)).

d. Expressão Induzível. Promotores PR-1:

O promotor 35S em pCGN1761ENX pode ser substituído comqualquer outro promotor de escolha que resultará em níveis de expressãoadequadamente altos. A título de exemplo, um dos promotores quimicamen-te reguláveis descritos na Patente US5.614.395, tal como o promotor PR-1de tabaco, pode substituir o promotor 35S duplo. Alternativamente, o promo-tor PR-1 de Arabidopsis descrito por Lebel et al., Plant J. 16: 223-233 (1998)pode ser usado. O promotor de escolha é preferivelmente excisado de suafonte por enzimas de restrição, mas pode ser alternativamente amplificadopor PCR usando iniciadores que contêm sítios de restrição terminal, apropri-ados. Se a amplificação de PCR for efetuada, então o promotor deve ser re-seqüenciado para checagem de erros de amplificação depois da clonagemdo promotor amplificado no vetor alvo. O promotor PR-1 a regulável quimi-camente ou por patógeno é clivado do plasmídio pCIB1004 (para constru-ção, vide Exemplo 21 da EP 0332 104, que é aqui incorporada a título dereferência) e transferido para o plasmídio pCGN1761ENX (Uknes et al.,Plant Cell 4: 645-656 (1992)). pCIB1004 é clivado com Ncol e o resultante 3'projetando-se do fragmento linearizado é tornado cego por tratamento comT4 DNA polimerase. O fragmento é então clivado com Hindlll e o fragmentocontendo o promotor PR-1 a, resultante, é purificado em gel e clonado parapCGN1761ENX, do qual o promotor 35S duplo foi removido. Isso é feito porclivagem com Xhol e tornado cego com T4 polimerase, seguido por clivagemcom Hindlll e isolamento do fragmento contendo terminador de vetor maiorno qual o fragmento de promotor pCIB1004 é clonado. Isso gera um deriva-do de pCGN1761ENX com o promotor PR-1a e o terminador tml e um poli-ligante intermédio com sítios únicos EcoRI e Notl. A seqüência de codifica-ção selecionada pode ser inserida nesse vetor, e os produtos de fusão (istoé, promotor-gene-terminador) podem ser subseqüentemente transferidospara qualquer vetor de transformação selecionado, inclusive aqueles descri-tos, abaixo. Vários reguladores químicos podem ser empregados para indu-zir a expressão da seqüência de codificação selecionada nas plantas trans-formadas de acordo com a presente invenção, incluindo o benzotiazol, ácidoisonicotínico, e compostos de ácido salicílico descritos nas Patentes US5.523.311 e US 5.614.395.

e. Expressão Induzível, um Promotor Induzível de Etanol:

Um promotor induzível por certos álcoois e cetonas, tal comoetanol, podem ser também usados para conferir expressão induzível de umaseqüência de codificação da presente invenção. Tal promotor é, por exem-plo, um promotor de gene alcA de Aspergillus nidulans (Caddick et al. (1998)Nat. Biotechnol 16:177-180). Em A. nidulans, o gene alcA codifica álcool de-sidrogenase 1, cuja expressão é regulada pelos fatores de transcrição empresença do indutor químico. Para os propósitos da presente invenção, asseqüências de codificação de CAT em plasmídio palcA:CAT compreendendouma seqüência de promotores de gene alcA fundida a um promotor 35a mí-nimo (Caddick et al. (1998) Nat. Biotechnol 16:177-180) são substituídas poruma seqüência de codificação da presente invenção para formar uma casse-te de expressão tendo a seqüência de codificação sob o controle do promo-tor de gene alcA. Isso é efetuado usando métodos bem conhecidos da técni-ca.

f. Expressão Induzível, um Promotor Induzível por Glicocorticóide:

A indução de expressão de uma seqüência de ácidos nucléicosda presente invenção usando sistemas com base em hormônios esteroidesé também contemplada. Por exemplo, um sistema de indução mediado porglicocorticóide é usado (Aoyama e Chua (1997) The Plant Journal 11: 605-612) e expressão de gene é induzida por aplicação de um glicocorticóide,por exemplo, um glicocorticóide sintético, preferivelmente dexametasona,preferivelmente em uma concentração que varia de 0,1 mM a 1 mM, mais pre-ferivelmente de 10mM a 100mM. Para os propósitos da presente invenção,as seqüências de genes de luciferase são substituídas por uma seqüênciade ácidos nucléicos da invenção para formar um cassete de expressão ten-do uma seqüência de ácidos nucléicos da invenção sob o controle de seiscópias de seqüências ativadoras a montante de GAL4 fundidas ao promotor35S mínimo. Isso é efetuado usando métodos bem conhecidos da técnica. Ofator de transação compreende o domínio de ligação de DNA GAL4 (Keeganet al. (1986) Science 231: 699-704) fundido ao domínio de trans-ativação daproteína viral de herpes VP16 (Triezenberg et al. (1988) Genes Devei. 2:718-729) fundido ao domínio de ligação do receptor de glicocorticóide derato (Picard et al. (1988) Cell 54: 1073-1080). A expressão da proteína defusão é controlada por qualquer promotor adequado para expressão emplantas conhecido da técnica ou descrito aqui. Esse cassete de expressão étambém compreendido na planta compreendendo uma seqüência de ácidosnucléicos da invenção fundida a 6 vezes GALI4/promotor mínimo. Assim,especificidade de tecido ou órgão da proteína de fusão é obtida levando àespecificidade de tecido ou órgão induzível da toxina inseticida.

q. Expressão Específica para Raiz

Um outro padrão de expressão de gene é a expressão de raiz.

Um promotor para raiz, adequado, é o promotor do gene similar à metalotio-neína do milho (MTL) descrito por de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991))e também na Patente US5.466.785, aqui incorporada a título de referência.Esse promotor "MTL" é transferido para um vetor adequado tal comopCGN1761ENX para a inserção de um gene selecionado e transferênciasubseqüente do inteiro cassete de promotor-gene-terminador para um vetorde transformação de interesse.

h. Promotores Induzíveis por Ferimento:Promotores induzíveis por ferimento podem ser também ade-quados para expressão de gene. Numerosos de tais promotores têm sidodescritos (por exemplo, Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Lo-gemann et al. Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec.Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al., Plant Molec. Biol: 129-142 (1993),Warner et al., Plant J. 3: 191-201 (1993)) e todos são adequados para usocom a presente invenção. Longeman et al. descrevem as seqüências a mon-tante 5' do gene wunl da batata dicotiledônea. Xu et al. mostram que umpromotor induzível de ferimento da batata de dicotiledônea (pin2) é ativa noarroz monocotiledôneo. Ainda, Rohrmeier & Lehle descrevem a clonagem docDNA Wipl de milho, que é um ferimento induzido e que pode ser usadopara isolar o promotor cognato usando técnicas padrão. Similarmente, Fireket al. e Warner et al. descreveram um gene induzido da Asparagus officinalismonocotiledônea, que é expressa no ferimento local e sítios de invasão depatógenos.

Usando técnicas de clonagem bem conhecidas da técnica, es-ses promotores podem ser transferidos para vetores adequados, fundidosaos genes pertencentes a esta invenção, e usados para expressar estes ge-nes nos sítios de ferimento da planta.

i. Expressão Preferida da Medula

Pedido de Patente WO 93/07278, que é aqui incorporado a títulode referência, descreve o isolamento do gene trpA do milho, que é preferen-cialmente expresso em células de medula. A seqüência de genes e o promo-tor se prolongando até -1726 bp do início da transcrição são apresentados.

Usando técnicas padrão de biologia molecular, esse promotor ou partes delepodem ser transferidos para um vetor tal como pCGN171, onde ele poderepor o promotor 35S e pode ser usado para conduzir a expressão de umgene estranho em um modo preferido para medula. De fato, fragmentos con-tendo o promotor preferido para medula ou partes dele podem ser transferi-dos para qualquer reator e modificados para utilidade em plantas transgêni-cas.

J. Expressão Específica para Folha:Um gene de milho que codifica fosfoenol carboxilase (PEPC) foidescrito por Hudspeth & Grula (Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)). Usan-do técnicas padrão de biologia molecular, o promotor para esse gene podeser usado para conduzir a expressão de qualquer gene em um modo especí-fico para folha em plantas transgênicas.

k. Expressão Específica para Pólen:

WO 93/07278 descreve o isolamento do gene de proteína quina-se depende de cálcio (CDPK) do milho, que é expresso em células de pólen.A seqüência de genes e promotor se estendendo até 1.400 bp do início datranscrição. Usando técnicas padrão de biologia molecular, esse promotorou partes dele foram transferidos para um vetor tal como pCGN1761, ondeele substitui o promotor 35S e pode ser usado para conduzir a expressão deuma seqüência de ácidos nucléicos da invenção em um modo específicopara pólen.

I. Expressão Específica para Sabuqo:

O promotor OsMADs6, isolado de arroz, é um promotor específi-co para sabugo de milho, tendo a seqüência:

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Esse promotor é um promotor preferido para uso na presenteinvenção.

2. Terminadores Transcricionais

Uma variedade de terminadores transcricionais está disponívelpara uso em cassetes de expressão. Esses são responsáveis pela termina-ção da transcrição além do transgene e correta poliadenilação de mRNA.Terminadores transcricionais apropriados são aqueles que são conhecidospor funcionarem em plantas e incluem o terminador CaMV 35S, o terminadortml, o terminador de nopalina sintase e o terminador rbcS E9 de ervilha. Es-ses podem ser usados tanto em monocotiledôneas como em dicotiledôneas.Além disso, um terminador de transcrição de gene nativo pode ser usado.

3. Seqüências para Intensificação ou Regulação de Expressão

Numerosas seqüências foram encontradas para intensificar aexpressão de gene de dentro da unidade transcricional e essas seqüênciaspodem ser usadas em conjunto com os genes desta invenção para aumentarsua expressão em plantas transgênicas.

Várias seqüências de introns têm sido mostradas para intensifi-car expressão, particularmente em células monocotiledôneas. Por exemplo,verificou-se que os introns do gene Adhl de milho intensificam significante-mente a expressão do gene do tipo selvagem sob seu promotor cognatoquando introduzido em células de milho. Verificou-se que intron 1 é de ex-pressão particularmente eficaz e intensificada em construções de fusão como gene cloranfenicol acetiltransferase (Callis et al., Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)). No mesmo sistema experimental, o intron do gene bronzel demilho tinha um efeito similar em intensificar expressão. Seqüências de in-trons têm sido rotineiramente incorporadas em vetores de transformação deplanta, tipicamente dentro do líder não traduzido.

Várias seqüências líder não traduzidas derivadas de vírus sãotambém conhecidas por intensificarem expressão, e estas são particular-mente eficazes em células dicotiledôneas. Especificamente, seqüências líderde vírus de Mosaico do Tabaco (TMV, a seqüência W"), Vírus de Mosquea-do Clorótico de Milho (MCMV), Vírus de Mosaico de Alfafa (AMV) mostraramser eficazes na intensificação de expressão (por exemplo, Gallie et al., Nucl.Acids. Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15:65079 (1990)). Outras seqüências líder conhecidas da técnica incluem, massem limitação: líderes picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região de não-codificação 5' da encefalomiocardite) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R., e Moss,TEV (Vírus "Etch" do Tabaco) (Allison et al., 1986); líder MDMV (Vírus doMosaico de Nanismo do Milho): Virologia 154:9-20); líder de proteína de li-gação de cadeia pesada da imunoglobulina (BiP), (Macejak, D.G., e Sarnow,P., Nature 353: 90-94 (1991); líder não traduzido do mRNA de proteína derevestimento do vírus de mosaico da alfafa (AMV RNA 4), (Jobling, S.A., eGehrke, L, Nature 325:622-625 (1987); líder do vírus do mosaico do tabaco(TMV), (Gallie, D.R. et al., Molecular Biology of RNA, páginas 237-256(1989); e Vírus de Mosqueado Clorótico do Milho (MCMV) (Lommel, S.A., etal., Virology 81:382-385 (1991). Vide também, Delia Cioppa et al., Plant Phy-siology 84:965-968 (1987).

Além de incorporar um ou mais dos elementos mencionados a-cima na região reguladora 5'de um cassete de expressão alvo da invenção,outros elementos peculiares ao cassete de expressão alvo podem ser tam-bém incorporados. Tais elementos incluem, mas sem limitação, um promotormínimo. Por promotor mínimo deve ser entendido que os elementos basaisdo promotor são inativos ou quase assim sem ativação a montante. Tal pro-motor tem baixa atividade residual em plantas quando não há transativadorpresente ou quando o intensificador ou sítios de ligação de elementos deresposta estão ausentes. Um promotor mínimo que é particularmente útilpara genes alvo em plantas é o promotor mínimo Bz1, que é obtido do genebronzel de milho. O promotor de núcleo Bz1 é obtido da construção de mu-tante Bz1 "myc"-luciferase pBz1LucR98 via clivagem no sítio Nhel localizadoem -53 a -58. Roth et al., Plant Cell 3: 317 (1991). O fragmento de promotorde núcleo Bz1 derivado se estende assim de -53 a +227 e inclui o Bz1 in-tron-1 na região não traduzida 5'. Também útil na presente invenção é umpromotor mínimo criado pelo uso de um elemento TATA sintético. O elemen-to TATA sintético possibilita o reconhecimento do promotor por fatores deRNA polimerase e rende um nível basal de expressão de gene na ausênciade ativação (vide genericamente, Mukumoto (1993) Plant Mol Biol 23: 995-1003; Green (2000) Trends Biochem Sei 25: 59-63).

4. Marcar Produto Gênico Dentro Da Célula

É conhecida a existência de vários mecanismos para marcar osprodutos gênicos, e as seqüências que controlam o funcionamento destesmecanismos têm sido caracterizadas em algum detalhe. Por exemplo, mar-car produtos gênicos para o cloroplasto é controlado por uma seqüência desinais encontrada na extremidade do amino-terminal de várias proteínas, aqual é clivada durante a importação de cloroplastos para produzir a proteínamadura (por exemplo, Cornai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109(1988)). Essas seqüências de sinais podem ser fundidas aos produtos gêni-cos heterólogos para efetuar a importação de produtos heterólogos no cloro-plasto (van den Broeck, et al. Nature 313: 358-363 (1985)). DNA que codificaseqüências de sinais apropriadas pode ser isolado da extremidade 5' doscDNAs que codificam a proteína RUBISCO, a proteína CAB, a enzima EPSPsintase, a proteína GS2 e muitas outras proteínas que são conhecidas porestarem localizadas em cloroplasto. Vide também, a seção intitulada "Ex-pression With Chloroplast Targeting", no Exemplo 37, da PatenteUS5.639.949.

Outros produtos gênicos estão localizados em outras organelastais como a mitocôndria e a peroxissoma (por exemplo, Unger et al. PlantMolec. Biol. 13: 41-418 (1989)). Os cDNAs que codificam esses produtospodem ser também manipulados para efetuar a marcação de produtos gêni-cos heterólogos para essas organelas. Exemplos de tais seqüências são aATPases codificadas nucleares e isoformas de aspartato amino transferaseespecíficas para mitocôndria. Marcação de corpos de proteínas celulares foidescrita por Rogers et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 82: 6512-6516(1985)).

Além disso, foram caracterizadas seqüências que causam amarcação de produtos gênicos para outros compartimentos das células. Se-qüências amino-terminal são responsáveis por marcar o ER, o apoplasto, esecreção extracelular de células aleurona (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Adicionalmente, seqüências amino-terminal em conjunto comseqüências carbóxi-terminal são responsáveis por marcação vacuolar deprodutos gênicos (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).

Através da fusão das seqüências de marcação apropriadas des-critas acima para seqüências de transgenes de interesse, é possível direcio-nar o produto de transgene para qualquer organela ou compârtimento dacélula. Para marcar cloroplastos, por exemplo, a seqüência de sinais de clo-roplasto de o gene RUBISCO, o gene CAB, o gene de EPSP sintase ou ogene GS2 é fundida, em estrutura, ao amino terminal ATG do transgene. Aseqüência de sinais selecionada deve incluir o sítio de clivagem conhecido, ea fusão construída deve levar em conta quaisquer aminoácidos depois dosítio de clivagem, que são requeridos para clivagem. Em alguns casos, essaexigência pode ser satisfeita pela adição de um pequeno número de amino-ácidos entre o sítio de clivagem e o ATG do transgene ou, alternativamente,substituição de alguns aminoácidos dentro da seqüência de transgenes. Fu-sões construídas para importação de cloroplastos podem ser testadas comrespeito à eficácia de captação de cloroplastos por tradução in vitro de cons-truções transcritas in vitro, seguida por captação de cloroplastos in vitro u-sando técnicas descritas por Bartlett et al., Edelmann et al. (Eds.) Methods inChloroplast Molecular Biology, Elsevier pp. 1081-1091 (1982) e Wasmann etal. Mol. Gen. Genet. 205: 466-453 (1986). Essas técnicas de construção sãobem conhecidas da arte e são igualmente aplicáveis às mitocôndrias e pero-xissomas.

Os mecanismos descritos acima para marcação celular podemser utilizados não somente em conjunto com seus promotores cognatos,mas também em conjunto com promotores heterólogos de modo a efetuaruma meta de marcação de células específicas sob a regulação transcricionalde um promotor que tem padrão de expressão diferente daquele do promo-tor do qual o sinal de marcação deriva.

C. Construção de Vetores de Transformação de Plantas

Numerosos vetores de transformação disponíveis para transfor-mação de plantas são conhecidos daqueles com conhecimento ordinário dastécnicas de transformação de plantas, e os genes pertinentes a esta inven-ção podem ser usados em conjuntos com tais vetores. A seleção de vetordependerá da técnica de transformação preferida e as espécies alvo para atransformação. Para certas espécies alvo, diferentes marcadores de seleçãode antibióticos e herbicidas podem ser preferidos. Marcadores de seleçãousados rotineiramente na transformação incluem o gene npll, que confereresistência à canamicina e antibióticos relacionados (Messing & Vierra. Gen19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), o gene bar,que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (White et al., Nucl. AcidsRes 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)),gene hph, que confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger &Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), e o gene dhfr, que confere resis-tência ao metatrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), ogene EPSPS, que confere resistência ao glifosato (Patente US4.940.935 ePatente US5.188.642), e o gene da manose-6-fosfato isomerase, que pro-porciona a capacidade de metabolizar manose (Patente US5.767.378 e Pa-tente US5.994.629).

1. Vetores Adequados para Transformação de Aqrobactéria

Muitos vetores estão disponíveis para transformação usandoAgrobacterium tumefaciens. Esses tipicamente portam pelo menos uma se-qüência da borda de T-DNA e incluem vetores tais como pBIN19 (Bevan,Nucl. Acids Res. (1984)). Abaixo, é descrita a construção de dois vetorestípicos adequados para transformação de Agrobactéria.

a. pCIB200e PCIB2001:

Os vetores binários pCIB200 e pCIB2001 são usados para aconstrução de vetores recombinantes para uso com Agrobactéria e sãoconstruídos do seguinte modo. pTJS75kan foi criado por digestão de Narl depTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)) permi-tindo a excisão do gene de resistência à tetraciclina, seguida pela inserçãode um fragmento Accl de pUC4K compreendendo NPTII (Messing & Vierra,Gene 19: 259-268 (1982): Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983): McBrideet al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Ligantes Xhol são liga-dos ao fragmento EcoRV de PCIB7 que contém as bordas de T-DNA da es-querda e da direita, um gene quimérico nos/nptll selecionável de planta e opoli-ligante pUC (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)) e o fragmentodigerido com Xhol são clonados em pTJS75kan digerido com S11 para criarpCIB200 (vide também EP 0 332 104, Exemplo 19). pCIB200 contém os se-guintes e únicos sítios de restrição de poli-ligante: EcoRI, Sstl, Kpnl, Bgmll,Xbal, e Sall. pCIB2001 é um derivado de pCIB200 criado por inserção nopoli-ligante de sítios de restrição adicionais. Sítios de restrição únicos no po-li-ligante de pCIB2001 são EcoRI, Sstl, Kpnl, Bglll, Xbal, Sall, Mlul, Bell, Avr-II, Apal, e Stul. PCIB2001, além de conter esses sítios de restrição únicos,contém também seleção de planta e canamicina bacteriana, bordas de T-DNA da esquerda e da direita para transformação mediada por Agrobactéria,a função trfA derivada de RK2 para mobilização entre E. coli e outros hospe-deiros, e as funções OriT e OriV também de RK2. O poli-ligante pCIB2001 éadequado para a clonagem de cassetes de expressão de planta contendoseus próprios sinais reguladores.

b. PCIB10 e Seus Derivados de Seleção de Higromicina

O vetor binário pCIB10 contém um gene que codifica resistênciaà canamicina para seleção em plantas de seqüências da borda direita e es-querda de T-DNA e incorpora seqüências do plasmídio pRK252 de amplafaixa hospedeira permitindo que ele replique tanto na E.coli como na Agro-bactéria. Sua construção é descrita por Rothstein et al. (Gene 53: 153-161(1987). Vários derivados de pCIB10 são construídos que incorporam o genepara higromicina B fosfotransferase descritos por Gritz et al. (Gene 25: 179-188 (1983)). Esses derivados permitem a seleção de células de plantastransgênicas somente em higromicina (pCIB743), ou higromicina e caramici-na (pCIB715, pCIB717).2. Vetores Adequados para Transformação de Não-Aqrobactéria

Transformação sem o uso de Agrobacterium tumefacies evita aexigência por seqüências de T-DNA no vetor de transformação escolhido e,conseqüentemente, vetores que carecem destas seqüências podem ser utili-zados além dos vetores tais como os descritos acima, que contêm seqüên-cias de T-DNA. Técnicas de transformação que não se baseiam em Agro-bactéria incluem transformação via bombardeio de partículas, captação deprotoplastos (por exemplo, PEG e eletroporação) e microinjeção. A escolhado vetor depende largamente da seleção preferida para as espécies que es-tão sendo transformadas. Abaixo, é descrita a construção de vetores típicosadequados para transformação de não-agrobactéria.

a. PCIB3064

pCIB3064 é um vetor derivado de pUC adequado para técnicasde transferências de genes direta em combinação com seleção pelo herbici-da basta (ou fosfinotricina). O plasmídio pCIB246 compreende o promotorCaMV 35S em fusão operacional ao gene GUS da E. coli e o terminadortranscricional CaMV 35S e está descrito no Pedido PCT WO 93/07278. Opromotor 35S desse vetor contém duas seqüências 5'de ATG do sítio de iní-cio. Esses sítios são mutados usando técnicas de PCR padrão de modo aremover os ATGs e gerar os sítios de restrição Sspl e Pvull. Os novos sítiosde restrição são de 96 e 37 pb de distância do sítio Sll único e 101 e 42 bpde distância do sítio de início real. O derivado resultante de pCIB246 é de-signado pCIB3025. O gene GUS é então excisado do pCIB3025 por digestãocom Sall e Saci, o terminais tornados cegos e religados para gerar o plasmí-dio pCIB3060. O plasmídio JIT82 é obtido do John Innes Centre, Noruega eo fragmento Smal de 400 bp contendo o gene bar de Streptomyces vifidoc-hromegenes é excisado e inserido no sítio Hpal de pCIB3060 (Thompson etal., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Isso gerou pCIB3064, que compreende ogene bar sob o controle do promotor CaMV 35S e o terminador para seleçãode herbicida, um gene para resistência à ampicilina (para seleção em E. coli)e um poli-ligante com os sítios únicos Sphl, Pstl, Hindlll, e BamHI. Esse ve-tor é adequado para a clonagem de cassetes de expressão de planta con-tendo seus próprios sinais reguladores.

b. pSOG19epSOG35:

pSOG35 é um vetor de transformação que utiliza o gene diidrof-talase redutase (DFR) da E. coli como um marcador selecionável que confe-re resistência ao metotrexato. PCR é usado para amplificar o promotor 35S(-800 bp), intron 6 do gene Adh1 do milho (-550 bp) e 18 bp da seqüêncialíder não traduzida de GUS de pSOglO. Um fragmento de 250 bp que codifi-ca o gene tipo II de diidroftalato redutase de E. coli é também amplificadopor PCR e estes dois fragmentos de PCR são montados com um fragmentosde Sacl-Pstl de pB1221 (Clontech) que compreende a estrutura principal dovetor pUC19 e o terminador de nopalina sintase. A montagem desses frag-mentos gera pSOG19 que contém o promotor 35S em fusão com a seqüên-cia de intron 6, o líder GUS, o gene DHFR e ò terminador de nopalina sinta-se. Substituição do líder GUS no pSOG19 com a seqüência líder do Vírus doMosqueado Clorótico de Milho (MCMV) gera o vetor pSOG35. pSOG19 epSOG35 transportam o gene pUC para resistência à ampicilina e têm sítiosHindlll, Sphl, Pstl e EcoRI disponíveis para a clonagem de substâncias es-tranhas.

3. Vetor Adequado para Transformação de Cloroplasto

Para expressão de uma seqüência de nucleotídeos da presenteinvenção em plastídios de plantas, o vetor de transformação de plastídiopPH143 (WO 97/32011, Exemplo 36) é usado. A seqüência de nucleotídeosé inserida no pPH143 repondo a seqüência de codificação de PROTOX. Es-se vetor é então usado para transformação de plastídio e seleção de trans-formantes para resistência à espectinomicina. Alternativamente, a seqüênciade nucleotídeos é inserida no pPH143 de modo que ela repõe o gene aadH.Nesse caso, os transformantes são selecionados para resistência aos inibi-dores PROTOX.

D. Transformação

Uma vez que a seqüência de ácidos nucléicos da invenção foiclonada em um sistema de expressão, ela é transformada em uma célula deplantas. O receptor e cassete de expressão alvo da presente invenção po-dem ser introduzidos na célula da planta de vários modos conhecidos datécnica. Métodos para regeneração de plantas são também bem conhecidosda técnica. Por exemplo, vetores de plasmídio Ti têm sido utilizados para adistribuição de DNA estranho, bem como captação direta de DNA, liposso-mas, eletroporação, microinjeção, e microprojéteis. Além disso, bactérias dogênero Agrobacteria podem ser utilizadas para transformar células de plan-tas. Abaixo, estão descrições de técnicas representativas para transformartanto as plantas dicotiledôneas como as monocotiledôneas, bem como umatécnica de transformação de plastídio representativo.

1. Transformação de Dicotiledôneas

As técnicas de transformação para dicotiledôneas são bem co-nhecidas da técnica e incluem técnicas com base em Agrobacteria e técni-cas que não requerem Agrobacteria. Técnicas de Não-Agrobactéria que en-volvem a captação de material genético exógeno diretamente por protoplas-tos ou células. Isso pode ser obtido por PEG ou captação mediada por ele-troporação, distribuição mediada por bombardeio de partículas, ou microinje-ção. Exemplos dessas técnicas são descritas por Paszkowvski et al., EMBOJ 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177(1985), Reich etal., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), e Klein etal., Nature327: 70-73 (1987). Em cada caso, as células transformadas são regenera-das para as plantas inteiras usando técnicas padrão conhecidas da técnica.

Transformação mediada por Agrobacteria é uma técnica preferi-da para transformação de dicotiledôneas devido a sua alta eficácia de trans-formação e usa ampla utilidade com muitas espécies diferentes. Transfor-mação de Agrobacteria envolve tipicamente a transferência do vetor bináriotransportando o DNA estranho de interesse (por exemplo, pCIB200 oupCIB2001) para uma linhagem de Agrobacteria apropriada que pode depen-der do complemento de genes vir pela linhagem Agrobacteria hospedeira,tanto em um plasmídio Ti co-residente ou cromossomicamente (por exem-plo, linhagem CIB542 para pCIB200 e pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5:159-169) (1993)). A transferência do vetor binário recombinante para Agro-bacteria é obtida por um procedimento de conjugação triparental usando E.coli transportando o vetor binário recombinante, uma linhagem de E. colihelper que transporta o vetor binário recombinante, que transporta um plas-mídio tal como pRK2013 e o qual é capaz de mobilizar o vetor binário re-combinante para a linhagem de Agrobactéria alvo. Alternativamente, o vetorbinário recombinante pode ser transferido para a Agrobactéria por transfor-mação de DNA (Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids. Res. 16: 9877 (1988)).

A transformação das espécies de plantas alvo por Agrobactériarecombinante envolve usualmente co-cultura da Agrobactéria com explantesda planta e segue os protocolos bem conhecidos da técnica. O tecido trans-formado é regenerado em meio selecionável compreendendo o marcador deresistência a antibiótico ou herbicida presente entre as bordas do T-DNA doplasmídio binário.

Uma outra abordagem para transformar células de plantas comum gene envolve propelir partículas inertes ou biologicamente ativas em te-cidos ou células de plantas. Essa técnica é descrita nas Patentes US4.945.050, US 5.036.006, e US 5.100.792, todas de Stanford et al. Geral-mente, esse procedimento envolve propelir partículas inertes ou biologica-mente ativas nas células sob condições eficazes para penetrar a superfícieexterna da célula e poder proporcionar incorporação dentro do interior desta.Quando partículas inertes são utilizadas, o vetor pode ser introduzido nascélulas por revestimento das partículas com o vetor que contém o gene de-sejado. Alternativamente, a célula alvo pode ser circundada pelo vetor demodo que o vetor é transportado para a célula pelo estímulo da partícula.Partículas biologicamente ativas (por exemplo, células de leveduras secas,bactérias secas ou um bacteriofago, cada um contendo DNA destinado a serintroduzido) podem ser também propelidas no tecido de célula da planta.

2. Transformação de Monocotiledôneas

A transformação da maioria das espécies de monocotiledôneastem também se tornado rotina. Técnicas preferidas incluem transferênciadireta de gene em protoplastos usando PEG ou técnicas de eletroporação, ebombardeio de partículas em tecido de calos. As transformações podem serefetuadas com uma espécie de DNA simples ou espécies de DNA múltiplos(isto é, co-transfomação) e ambas as técnicas são adequadas para uso comesta invenção. A co-transformação pode ter a vantagem de evitar a completaconstrução de vetor e de gerar plantas transgênicas com locais não ligadospara o gene de interesse e o marcador selecionável, permitindo a remoçãodo marcador selecionável em gerações subseqüentes, caso isso seja consi-derado desejável. Contudo, uma desvantagem do uso de co-transformaçãoé a freqüência menor que 100% com a qual as espécies de DNA separadassão integradas no genoma (Schocher et al., Biotechnology 4: 1093-1096(1986)).

Os Pedidos de Patente EP 0 292 435, EP 0 392 225 e WO93/07278 descrevem técnicas para a preparação de calo e protoplastos deuma linhagem endógama de elite de milho, transformação de protoplastosusando PEG ou eletroporação, e a regeneração de plantas de milho de pro-toplastos transformados. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603-618 (1990))e Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) publicaram técnicas paratransformação de linhagem de milho derivada de A188 usando bombardeiode partículas. Além disso, WO 93/07278 e Kozile et al. (Biotechnology 11:194-200 (1993)) descrevem técnicas para a transformação de linhagens en-dógamas de elite de milho por bombardeio de partículas. Essa técnica utilizaembriões imaturos de milho de comprimento de 1,5-2,5 mm excisados deuma orelha de milho de 14 a 15 depois da polinização e um Dispositivo Bio-lístico PDS 1000He para bombardeio.

Transformação de arroz pode ser efetuada por técnicas de trans-ferência direta de gene utilizando protoplastos ou bombardeio de partículas.

Transformação mediada por protoplastos foi descrita para tipos Japônica etipos indica (Zahng et al. Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimanoto et al.Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)).Ambos os tipos são também rotineiramente transformáveis usando bombar-deio de partículas (Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)). Alémdisso, WO 93/21335 descreve técnicas para a transformação de arroz viaeletroporação.

O Pedido de Patente EP 0 332 581 descreve técnicas para ageração, transformação e regeneração de protoplastos de Pooideae. Essastécnicas possibilitam a transformação de Dactylis e trigo. Além disso, atransformação de trigo foi descrita por Vasil et al. (Biotechnology 10: 667-674(1992)) usando bombardeio de partículas nas células de calos regeneráveisde longo prazo tipo C, e também por Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)) e Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)) usandobombardeio de partículas de embriões imaturos e calos derivados de embri-ões imaturos. Contudo, uma técnica preferida para transformação de trigoenvolve a transformação de trigo por bombardeio de partículas de embriõesimaturos e inclui tanto uma etapa de com alta sacarose ou com alta maltoseantes da distribuição de genes. Antes do bombardeio, qualquer número deembriões (0,75-1 mm de comprimento) é revestido em um meio MS com 3%de sacarose (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497(1962)) e 3 mg/L de 2,4-D para indução de embriões somáticos, o qual podeprosseguir no escuro. No dia escolhido para o bombardeio, os embriões sãoremovidos do meio de indução e colocados sobre o osmotico (isto é, meio deindução com sacarose ou maltose adicionada na concentração desejada,tipicamente 15%). Os embriões são deixados plasmolisar por 2 a 3 horas esão então bombardeados. Vinte embriões por placa alvo é típico, emboranão crítico. Um plasmídio transportando gene apropriado (tal comopCIB3064 ou pSG35) é precipitado sobre partículas de ouro de tamanho mi-crométrico, usando procedimento padrão. Cada placa de embriões é subme-tida a disparo com o dispositivo com hélio DuPont Biolistics.RTM., usandouma pressão explosiva de cerca de 6.895 MPa (1.000 psi) e usando umapeneira padrão de 80 mesh. Depois do bombardeio, os embriões são colo-cados de volta no escuro para recuperação por cerca de 24 horas (ainda noosmotico). Depois de 24 horas, os embriões são removidos do osmotico ecolocados de volta no meio de indução onde eles ficam por cerca de um mêsantes da regeneração. Aproximadamente um mês mais tarde, os explantesde embriões com calos embriogênicos em desenvolvimento são transferidospara o meio de regeneração (MS+1 mg/L de NAA, 5 mg/L de GA), contendoainda o agente de seleção apropriado (100 mg/l de basta no caso depCIB3064 e 2 mg/L de metotrexato no caso de pSOG35). Depois de aproxi-madamente um mês, os brotos desenvolvidos são transferidos para recipien-tes conhecidos como "GA7s", que contêm MS semi-resistente, 2% de saca-rose, e a mesma concentração de agente de seleção.

A transformação de monocotiledôneas usando Agrobactéria foitambém descrita. Vide, WO 94/00977 e a Patente US5.591.616, ambos sãoaqui incorporados a título de referência. Vide também Negrotto et al., PlantCell Reports 19: 798-803 (2000), aqui incorporada a título de referência.

Por exemplo, arroz (Oryza sativa) pode ser usado para gerarplantas transgênicas. Várias cultivares de arroz podem ser usadas (Hiei etal., 1994, Plant Journal 6:271-282); Dong et al., 1996, Molecular Breeding2:267-276; Hiei et al., 1997, Plant Molecular Biology, 35:205-218). Também,os vários constituintes dos meios descritos abaixo podem ter as quantidadesvariadas ou serem substituídos. Respostas embriogênicas são iniciadas e/ouas culturas são estabelecidas a partir de embriões maduros por cultivo nomeio MS-CIM (Sais basais do MS, 4,3 g/L; vitaminas B5 (200 vezes), 5ml/L;Sacarose, 30 g/L; prolina, 500 mg/L; glutamina, 500 mg/L; hidrolisado decaseína, 300 mg/L; 2,4-D (1 mg/ml), 2ml/L; ajustar o pH para 5,8 com KOH1N; Phytagel, 3 g/L). Tantos os embriões maduros nos estágios iniciais deresposta à cultura como as linhagens de culturas estabelecidas são inocula-dos e co-cultivados com a linhagem Agrobacterium tumefaciens LBA4404(Agrobactéria) contendo a construção de vetor desejada. A Agrobactéria écultivada de estoques de glicerol em meio de YPC sólido (100 mg/L de es-pectinomicina e qualquer outro antibiótico apropriado) por cerca de 2 dias a28°C. A Agrobactéria é re-suspensa em meio MS-CIM líquido. A cultura deAgrobactéria é diluída para uma OD600 de 0,2 a 0,3 e acetosiringona é adi-cionada para uma concentração final de 200 |iM. Acetosiringona é adiciona-da antes de misturar a solução com as culturas de arroz para induzir a Agro-bactéria para transferência de DNA para as células da planta. Para inocula-ção, as culturas de planta são imersas na suspensão bacteriana. A suspen-são bacteriana líquida é removida e as culturas inoculadas são colocadas nomeio de co-cultivo e incubadas a 22°C, por dois dias. As culturas são entãotransferidas para o meio MS-CIM com Ticarcilina (400 mg/L) para inibir ocrescimento da Agrobactéria. Para construções utilizando o gene de marca-dor selecionável PMI (Reed et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37:127-132),as culturas são transferidas para o meio de seleção contendo Manose comofonte de carboidrato (MS com 2% de Manose, 300 mg/L de Ticarcilina) de-pois de 7 dias, e cultivadas por 3 a 4 semanas, no escuro. Colônias resisten-tes são então transferidas para o meio de indução de regeneração (MS sem2,5-D, 0,5 mg/L de IAA, 1 mg/L de zeatina, 200 mg/L de timentina, 2% demanose e 3% de Sorbitol) e crescidas no escuro por 14 dias. Colônias emproliferação são então transferidas para um outro ciclo de meio de induçãode regeneração e movidas para a sala de crescimento, clara. Brotos regene-rados são transferidos para recipientes GA7 com médio GA7-1 (MS semhormônios e 2% de Sorbitol) por 2 semanas e então movidos para a estufaquando eles estão grandes o bastante e têm raízes adequadas. As plantassão transplantadas para o solo na estufa (Para geração) e crescidas paramaturidade e a semente T1 é colhida.

3. Transformações de Plastídios

Sementes de Nicotiana tabacum c.v. "Xanthienc" são germina-das, sete por placa, em uma disposição circular de 2,54 cm (1 polegada) nomeio de ágar T e bombardeadas durante 12 a 14 dias após implantas compartículas de tungstênio de 1 \im (M10, Biorad, Hercules, CA) revestidascom DNA dos plasmídios pPH143 e pPH145, essencialmente conforme des-crição (Svab, Z. e Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917). As semeadurasbombardeadas são incubadas em meio T por dois dias, depois do que asfolhas são cortadas e colocadas com o lado abaxial para cima em luz bri-lhante (350-500 umols de fótons/m2/s) em placas de meio RMOP (Svab, Z.,Hajdukiewicz, P. e Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) contendo 500.fig/ml de dicloridrato de espectinomicina (Sigma, St. Louis, Mo). Brotos resis-tentes surgindo embaixo das folhas alvejadas, três a oito semanas após obombardeio, são subclonados no mesmo meio seletivo, deixados formaremcalos, e os brotos secundários isolados e subclonados. Segregação comple-ta das cópias do genoma de plastídios transformados (homoplasmicidade)em subclones independentes é avaliada por técnicas padrão de Southernblotting (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). DNA total digerido comBamHI/EcoRI (Mettler, I.J. (1987) Plant Mol Biol Repórter 5, 346349) é sepa-rado em 1% de Tris-borato (TBE)-géis de agarose, transferido para mem-branas de náilon (Amersham) e sondados com seqüências de DNA sensibili-zada aleatoriamente e marcadas com 32P correspondendo a 0,7 kg de frag-mento de DNA BamHI/Hindlll de pC8 contendo uma porção da seqüência demarcação de plastídios rps {fração (7/12)}. Brotos homoplásmicos são enrai-zados assepticamente em meio de MS/IBA contendo espectomicina (McBri-de, K.E. et a., (1994) PNAS 91, 7301-7305) e transferidos para a estufa.

V. Cruzamento e Produção de Sementes

A. Cruzamento

As plantas obtidas via transformação com uma seqüência deácidos nucléicos da presente invenção podem ser qualquer uma de umaampla variedade de espécies de plantas, incluindo aquelas de monocotile-dôneas e dicotiledôneas; contudo, as plantas usadas no método da invençãosão preferivelmente selecionadas da lista de colheitas alvos agronomica-mente importantes, estabelecidas acima. A expressão de um gene da pre-sente invenção em combinação com outras características importantes paraa produção e qualidade pode ser incorporada em linhagens de plantas atra-vés de cruzamento. Abordagens e técnicas de cruzamento são conhecidasda técnica. Vide, por exemplo, Welsh J.R., Fundamentais of Plant Geneticsand Breeding, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1981); Crop Breeding, WoodD.R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1993); Mayo O.,The Theory of Plant Breeding, 2a Edição, Clarendon Press, Oxford (1987);Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, Nova Iorque (1986); e Wricke e Weber, Quantitative Genetics andSelection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlim (1986).

As propriedades genéticas engenheiradas nas sementes e plan-tas descritas acima são transmitidas por reprodução sexual ou crescimentovegetativo e podem ser assim mantidas e propagadas nas plantas progê-nies. Geralmente, a dita manutenção e propagação fazem uso de métodosagrícolas conhecidos desenvolvidas para adaptação de propósitos específi-cos tais como lavrar, semear ou colher. Processos especializados, tais comotecnologias de hidropônicos ou de estufa, podem ser aplicados. Como a co-lheita em crescimento é vulnerável ao ataque e danos provocados por inse-tos ou infecções, bem como à competição de ervas daninhas, medidas sãotomadas para controlar as ervas daninhas, doenças de plantas, insetos, ne-matódeos, e outras condições adversas para melhorar o rendimento. Essasincluem medições mecânicas tais como lavragem do solo ou remoção daservas daninhas e plantas infectadas, bem como a aplicação de defensivosagrícolas, tais como herbicidas, fungicidas, gametocidas, nematicidas, regu-ladores de crescimento, agentes de amadurecimento e inseticidas.

O uso das propriedades genéticas vantajosas das plantas trans-gênicas e sementes, de acordo com a invenção, pode ser feito ainda no cru-zamento da planta, que almeja o desenvolvimento de plantas com proprie-dades aperfeiçoadas tais como tolerância a pestes, herbicidas ou estresse,valor nutricional aperfeiçoado, rendimento aumentado, ou estrutura aperfei-çoada causando menor perda de instalação ou por destruição. As várias e-tapas de cruzamento são caracterizadas por intervenção humana bem defi-nida tal como seleção das linhagens a serem cruzadas, direcionamento dapolinização das linhagens parentais, ou seleção de plantas progênies apro-priadas. Dependendo das propriedades desejadas, medições de cruzamen-tos diferentes são tomadas. As técnicas relevantes são bem conhecidas naarte e incluem, mas sem limitação, hibridização, endogamia, cruzamentocom linhagens múltiplas, combinação de variedades, hibridização interespe-cífica, técnicas aneuplóides, etc. Técnicas de hibridização incluem também aesterilização das plantas para render plantas machos ou fêmeas por meiosmecânicos, químicos, ou bioquímicos. A polinização cruzada de uma plantaestéril macha com pólen de uma linhagem diferente assegura que o genomada planta macho estéril, mas fêmea fértil obterá uniformemente propriedadesde ambas as linhagens parentais. Assim, as sementes transgênicas e plan-tas de acordo com a invenção podem ser usadas para o cruzamento de li-nhagens de plantas aperfeiçoadas, que, por exemplo, aumentam a eficáciados métodos convencionais tal como tratamento com herbicida ou com pes-ticida ou permitem que se dispense com os ditos métodos devido às suaspropriedades genéticas modificadas. Alternativamente, novas colheitas comaperfeiçoada tolerância ao estresse podem ser obtidas, que, devido ao seu"equipamento" genético otimizado, rendem um produto colhido de melhorqualidade que os produtos que não foram capazes de tolerar condições dedesenvolvimento adversas, comparáveis.

B. Produção de Sementes

Na produção de sementes, a qualidade da germinação e a uni-formidade das sementes são características essenciais do produto. Como édifícil manter uma colheita livre de outra colheita e de sementes de ervasdaninhas, para controlar doenças contidas nas sementes, e para produzirsementes com boa germinação, práticas de produção de sementes razoa-velmente extensivas e bem definidas têm sido desenvolvidas por produtoresde sementes, que são experientes na técnica de crescimento, acondiciona-mento e comercialização de semente pura. Assim, é prática comum para ofazendeiro comprar semente certificada que satisfaz os padrões específicosde qualidade em vez de usar semente colhida de sua própria colheita. Mate-rial de propagação a ser usado como sementes é usualmente tratada comum revestimento protetor que compreende herbicidas, inseticidas, fungici-das, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, ou misturas destes. Costumei-ramente, os revestimentos protetores usados compreendem compostos taiscomo captano, carboxin, thiram (TMTD.TRM), metalaxil (Apron.RTM), e piri-mifos-metil (Actellic.RTM.). Se desejado, esses compostos são formuladosjuntamente com mais veículos, tensoativos ou adjuvantes promotores deaplicação costumeiramente empregados nas técnicas de formulação paraproporcionar proteção contra danos causados por pragas bacterianas, fúngi-cas ou animais. Os revestimentos protetores podem ser aplicados por im-pregnação do material de propagação com uma formulação líquida ou porrevestimento com uma formulação molhada ou secada, combinadas. Outrosmétodos de aplicação são também possíveis tal como tratamento direciona-do nos brotos ou na fruta.

Os seguintes exemplos são dados a título de ilustração e expla-nação, e não têm como objetivo limitar a invenção, em qualquer modo.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Transformação de Aqrobactéria do Milho - Embriões Imaturos

Preparação da Orelha

Colher orelhas quando os embriões imaturos nos grãos centraissão de aproximadamente 0,5 a 1,0 mm.

Debulhar e esterilizar as orelhas em uma solução de 20% deClorox e 3 gotas de Tween/litro de solução. Colocar em um agitador orbitalpor 20 minutos.

Enxaguar as orelhas, três vezes, com ddH20 estéril.

Em uma ambiente estéril, cortar os topos dos grãos. Colocar aorelha em uma placa de Petri e isolar os embriões imaturos.

Preparar a solução de inoculacão para transformação

• A 100ml de meio de LP-Lsinf., adicionar 50 |iL de solução deestoque de acetosiringona (AS) (40 mg/ml de estoque/ml) para uma concen-tração final de 100 uJvl de AS.

• Pipetar 4ml (2,5) do meio de infecção em 10ml de tubo descar-tável.

• Preparar tubos Eppendorf para coletar os embriões nessemomento e adicionar ~1,4ml do meio de infecção com AS a eles.

Preparação de suspensão de Aqrobactéria

• Tomar uma alça Agrobactéria e re-suspendê-la por turbilhona-mento em um tubo descartável de 10ml com 4ml (2,5ml) de meio de infec-ção.

• Medir a densidade óptica da suspensão de Agrobactéria. Ajus-tar a OD660 para aproximadamente 0,45 a 0,55.

Isolamento de Embriões Imaturos e Transformação

• Excisar os embriões e colocá-los no topo do meio de infecçãoem um tubo Eppendorf.Excisar os embriões por 30 a 35 minutos para obter um total de-150 embriões.

• Turbilhonar os embriões (agitar manualmente) por 5 segundos.

• Impingir termo-choque aos embriões em banho de água a45°C, por 5 minutos. Não deixar que a tampa do tubo Eppendorf entre emcontato com a água (possíveis problemas de contaminação).

• usar uma pipeta descartável para remover o meio de infecçãoe substituir com 1,5 de suspensão de Agrobactéria. Turbilhonar por 30 se-gundos.

• Deixe que o tubo assente por 5 minutos.

• Agitar o tubo para suspender os embriões e verter em umaplaca de Petri com meio AS 500 modificado com LS.

• Pipetar a suspensão de Agrobactéria e transferir os embriõespara uma área da placa que não tenha sido exposta à Agrobactéria.

Ter certeza absoluta que todos os embriões estão com o lado doescutelo para cima.Co-cultivo

• Co-cultivar embriões e a Agrobactéria, a 23°C, por 2 a 3 dias.Indução de calos nos embriões/somática

• Transferir o tecido (18 embriões/placa) para o meio de pré-seleção/indução de calos por 10 a 14 dias a 28°C, no escuro.

Seleção da Manose

• Transferir grupos de calos no Meio de Seleção. 9 grupos porplaca. Cultivar por aproximadamente 2 semanas a 28°C, no escuro.

• Checar as culturas quanto à contaminação e resposta de calose cultivar por mais 2 semanas a 28°C, no escuro.

Transferir 4 eventos por placa de tecido de crescimento para omeio de regeneração de MS (R1) e deixar no escuro por 10 a 14 dias.

Transferir tecido em crescimento/plantas de 4 eventos por pla-cas para a luz, por 14 dias, no claro.

Transferir os eventos para meios de formação de raízes em re-cipientes de cultura de tecido (2 eventos/recipiente Greiner).Milho transgênico foi crescido na estufa para o estágio TO ou T1,e amostras de sabugo ou de outros materiais foram selecionadas dos even-tos transgênicos produzidos. Os plasmídios mostrados na Figura 1 e Figura2 mostram os plasmídios (pSyn12210 contendo a construção CAD RNAi, epSyn 12345 contendo a construção COMT RNAi) usados no protocolo detransformação de milho dado acima.

Exemplo 2

Seleção de evento T1 CAD pSvn12210

As amostras de sabugo T1 de um total de 15 eventos (10 de có-pia baixa, 3 média e 2 alta) incluem 65 linhagens (28 linhagens de cópia bai-xa, 14 de cópia média, 5 de cópia alta e 18 nula para controle) foram envia-das para análise de MSU para NDF (fibra), ADL (lignina), IVNDFD (digestibi-lidade de NDF in vitro). 3 isolinhagens BM3 e 2 checagens de híbridos foramtambém incluídos. Comparamos a diferença entre as linhagens (transgêni-cas versus nulas) do mesmo evento, entre os eventos, ou entre os eventosde cópia baixa, média e alta com os controles positivos BM3 ou negativos echecagem de híbridos. Embora alguns destas tenham ficado nas 16 linha-gens de topo mencionadas abaixo, nenhumas destas mostrou redução con-sistente de lignina nos testes futuros. Os dados estão na Tabela 1 e os mé-todos usados para análise são dados abaixo.

Seleção de evento T1 COMT (PsYN 12345)

Análise do sabugo T1: 41 eventos totais (23 de cópia baixa, 13de média, e 5 de alta) incluem 131 linhagens (24 linhagens de cópia baixa,13 de média, 8 de alta e 20 de nulo para controle) foram enviados para MSUpara análises (ADL, NDF, IVNDFD), isolinhagens 3BM3, uma de controleJHAX707 e uma para checagem de híbridos foram também incluídas.

Análise de sabugo T1: As 7 linhagens de topo contendopSyn12210 ou pSynl 2345 foram selecionadas com base no teor de lignina edados de digestibilidade in vitro. Essas linhagens mostraram redução do teorde lignina e aperfeiçoada digestibilidade em comparação com o sabugo decontrole conforme mostrado na Tabela 1. Os dados referentes aos dois me-lhores eventos contendo plasmídio pSyn12345 estão apresentados na Tabe-Ia 2.Tabela 1

Características de ensilagem de eventos selecionados contendo nocautes de RNAi ou de CAD ou de COMT. Em 2 resíduos ge-néricos em comparação com linhagens nulas do mesmo evento. DM = matéria seca, NDF = Fibra Detergente Neutra, ADF =

<table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>Tabela 2

Dados mostrando redução consistente em % de lignina e aumento em % deIVNDFD para 2 eventos de topo

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Para metodologias gerais aplicáveis a essas análises, vide:

Goering, H.K., e P.J. Van Soest. 1970. Forage Fiber Analyses.Apparatus, Reagents, Procedures, and some applications. Agric. HandbookN° 379. ARS-USDA.

ADF - Fibra Detergente Ácida - (método Van Soest)

Realizada em capela química, com equipamento apropriado queinclui jaleco resistente a produtos químicos, capa para laboratório, luvas deborracha resistente a produtos químicos, óculos de segurança.

O método de ADF hidrolisa os componentes da parede celularque inclui pectinas e hemicelulose. A fração remanescente, chamada deADF contém celulose, lignina e cinzas. Ela é expressa como porcentagemda fração da parede celular total.

O resíduo de ADL é gerado a partir da fração de ADF, e repre-senta lignina + cinzas.

A etapa inicial é para recuperar a fração da parede celular de umtecido de planta particular. Em outras palavras ela eliminará compostos so-lúveis, tais como açúcares, proteínas, óleo e fibra solúvel. Se a amostra con-tém uma grande quantidade de óleo (tal como sementes de soja) então la-vagem com acetona é requerida (inicialmente triturar, então usar um tubo devidro, ou tempo de incubação em tubo de plástico curto). O tecido é secadoe triturado em partículas de não mais que 2 mm de tamanho. Tipicamente,cerca de 2 a 3 g de tecido são adicionados a um tubo cônico de 50ml. Então,40ml de etanol a 80% são adicionados, e misturados por 5 horas em um agi-tador giratório. Uma outra lavagem é requerida durante a noite. Então, 40mlde água são adicionados durante uma lavagem de 1 hora, repetindo a lava-gem em um total de 3 vezes. Algum tecido será perdido durante as trocas desolução. Uma lavagem preliminar deve ser feita para estimar a quantidadede tecido inicial para produzir cerca de 1 g de amostra de parede celular fi-nal.

No caso de tecido de sabugo, devido ao teor de parede celularser muito alto, não há necessidade de se fazer uma preparação da paredecelular. Assim, as análises de ADF e ADL serão calculadas com base nototal de matéria seca.

Solução de ADF

2% de CTAB em H2S04 1N

(para 1 litro de estoque, adicionar 20 g de CTAB para 900ml deágua deionizada (di), agitar por poucos minutos até redução do tamanho departícula. Então, adicionar 62,5ml de ácido sulfúrico 16N (Fisher A298-212,98%, densidade de 1,84 g/ml). Conforme o ácido é adicionado, a mistura deCTAB + água/ácido se torna solubilizada. Preencher para 1 L com água deionizada.

A solução de ADF pode ser também adquirida da ANKOM(www.ankom.com).

Registrar o peso da sacola da ANKOM.

Pesar 250 mg de uma amostra secada a ar (de com/ou sem in-cubação a 37°C de amostra seca).

Verter no saco de filtro (tipo F57)da ANKOM; registrar o peso.

Vedar com termo-vedador.

Adicionar a um béquer de vidro Pyrex de 2.000ml, tipicamente20 sacolas (24 max.) com 500ml da solução ADF. Cobrir com placa Pyrex deI.OOOml. Colocar em placa de vidro (Pyrex, diâmetro de 190 mm X 100 mmde altura), preenchida com água em ebulição. Adicionar, também, algumaspedras de PTFE em ebulição à placa. A água deve ser mantida em ebuliçãopor 1 hora. Agitar os sacos a cada 15 minutos.

Enxaguar no mínimo 4 vezes com H20 a 85-90°C. Todo o rejeitolíquido é descartado em uma pia com água corrente contínua. Mais dois mi-nutos de enxágüe com pequeno volume de acetona, que é então descartadaem recipiente com rejeito de solvente.

Secar a 70°C, em forno, durante a noite.

Pesar tecido residual = ADF.ADL - Liqnina Detergente Ácida

Ao resíduo de ADF seco (20-40 sacolas), adicionar 500ml deácido sulfúrico a 72%, cobrir todas as sacolas.

Usar um béquer de vidro Pyrex de 2.000ml, com 20 sacolas (24no máximo) e cobrir com uma placa Pyrex de 1 .OOOml.

NOTA: ácido sulfúrico a 72% pode ser preparado por adicção de750ml de ácido concentrado (95%) em 250ml de água. Cuidado: a mistura émuito quente e requer que o ácido seja vertido lentamente para evitar proje-ções. A garrafa é ainda colocada em um banho de água à temperatura am-biente (2 enxágües) para resfriamento rápido e uso. Pode-se também adqui-rir o H2S04 a 72% da Ankom.

Incubar na temperatura ambiente, por 3 horas, agitar várias ve-zes.

Excesso de ácido é descartado em rejeito de ácido líquido.

Então enxaguar, pelo menos cinco vezes com água quente (85 a90°C). As lavagens são realizadas na pia.

Enxágüe final em acetona por 2 minutos, descartar o solventeem um contêiner para lixo.

Secar em forno, a 70°C, durante a noite.

Pesar o tecido residual = ADL

Análise de Fibra Detergente Neutra

Preparar as amostras conforme recomendação do protocolo detrituração padrão, sem usar o Triturador Perten Hammer.

Colocar as amostras na balança seca para avaliar o teor de umi-dade da mistura.

Numerar as sacolas com marcador resistente a solvente.

Registrar o peso das sacolas de amostra seca, vazias, Ankom.

Tomar a amostra seca e pesar 0,5 g da amostra seca em sacolas de filtro Ankom.

Vedar as amostras com termo-vedador.

Dissolver 20 g de Sulfito de Sódio (0,5/50ml de solução de NDF)em 2.000ml de solução de NDF.

Ligar o aquecedor até atingir ebulição, uma vez em ebulição adi-cionar a amostra nas sacolas e cobrir soltamente.

Ajustar o cronômetro para 105 minutos.

Depois de decorrido esse tempo, verter as amostras em um e-quipamento para filtrar ("strainer") sobre recipiente de rejeito para NDF.

Enxaguar lentamente com 2 litros de água a 85-90°C.

Repetir o processo de enxágüe por um total de três enxágües.

Adicionar água gelada às amostras para auxiliar o resfriamento.

Drenar as sacolas e colocá-las em acetona por três minutos.

Espalhar a sacolas e deixar que sequem, no forno está ótimo,depois que a maior parte de acetona tenha saído.

Pesar as sacolas, coletar dados em uma Planilha designada NDF.

DETERMINAÇÃO DA DIGESTIBILIDADE REAL IN VITRO

1. Calibrar a balança e pesar 0,5 g (10,0 g para taxas de diges-tão) de amostra seca triturada (peneira de 1mm) em frascos Erlenmeyer de125ml. Preparar 6 amostras padrão para cada banho usado.

2. Preparar os meios por adição dos ingredientes na ordem abaixo:

Número dos frascos: 24 48 78 110 166

Água destilada 500ml 1,00L 1,75 L 2,25 L 3,50 L

Trypticase® Peptona 2,5 g 5,0 g 9,75 g 11,25 g 17,5 gSolução micromineral 0,125ml 0,25ml 0,438ml 0,563ml 0,880mlSolução de tampão Rúmen 250ml 500ml 975ml 1,125 L 1,75 LSolução macromineral 250ml 500ml 875ml 1,125 L 1,75 LResazurina 1,25ml 2,5ml 4,38ml 5,63ml 8,80ml1,00 L 2,00 L 3,50 L 14,50 I 7,00 L

Misturar e adicionar 40ml por frasco. Os meios devem ser adi-cionados aos frascos pelo menos 1 hora antes da inoculação, para hidrataras amostras. Aquecer os banhos de água durante a noite.

3. Preparar a solução redutora:

Adicionar cloridrato de cisteína, H20, e NaOH e dissolver. Adi-cionar Na2S.9H20 e dissolver novamente.

4. Enquanto a solução redutora está sendo misturada, colocar osfrascos em banho de água. Colocar os frascos com uma amostra padrão emcada fileira disposta diagonalmente através do banho de água. Adicionar 2mlda solução redutora a cada frasco com pipeta repetidora Eppendorf. Tamparcada frasco com um tubo de descarga de C02. Ligar o C02 e permitir que asamostras reduzam (a cor vermelha muda para transparente ou cor de chá),antes da adição do inóculo.

5. Preparar o inóculo:

Coletar fluido de rúmen e ingesta de animais fistulados 2 horasdepois da alimentação (vacas são alimentadas a 7,00 h, coletar às 9,15 h).Manter o fluído em um recipiente térmico, que foi pré-aquecido com águaquente da torneira. Verter água em balde e colocar o plugue de cânula nelepara mantê-lo flexível. Formar um túnel através da camada de rúmen parapermitir que uma xícara de plástico atinja o rúmen ventral. Colocar uma ca-mada de ingesta sobre o fluído e cobrir com uma tampa para eliminar qual-quer espaço com ar. Recolocar os plugues de cânula bem justos. Transpor-tar o fluído para o laboratório e colocá-lo sob C02. Aproximadamente 2 L defluido não processado são necessários para um conjunto de 166 amostras.

Combinar a mistura e ingesta em um misturador Waring de 3,78 litros, to-mando cuidado para que a descarga de Co2 continue. Revestir um funil deBuchner de plástico, grande, com uma camada de malha de náilon e passaro inóculo misturado através dela. Espremer bem.

Usar somente digesto pancreático de caseína Trypticase® Peptona (Becton Dickinson BBL #4311921).

Número dos frascos: 24 48 78 110 166

Água destilada 48ml 95ml 167ml 261 ml 356ml

L(+)Cisteína HCI.H20 313 mg 625 mg 1,094 g 1,719 g 2,344 g

NaOH 1N 2ml 4ml 7ml 11 ml 15ml

Na2S.9H20 313 mg 625 mg 1,094 g 1,719 g 2,344 g

50ml 10Oml 175ml 275ml 375ml

Passar inóculos através da lã de vidro em um béquer de plástico

grande para filtrar partículas pequenas.

O filtrado deve ser também mantido sob C02, o tempo todo,Transferir inóculos para uma garrafa que é anexada a um equipamento depipetar Brinkman de 50mL.

Usar um equipamento de pipetar Brinkman, inocular cada frascoremovendo primeiro a válvula de Bunsen, injetar 10ml de fluido, e repor aválvula. Esse procedimento descarregará C02 em cada frasco e expulsaráqualquer 02 presente. Girar a garrafa contendo fluido de rúmen durante ainoculação para manter as partículas suspensas.

6. Vedar os frascos, observar e corrigir quaisquer vazamentosde C02, e ajustar a pressão de C02 para produzir somente bolhas lentas nomanômetro. A temperatura do banho de água durante toda a fermentaçãodeve ser mantida em 40°C (100-102°F). Digerir as amostras por 30 h, a me-nos que especificado de outro modo. Para interromper a fermentação, remo-ver os frascos do banho e adicionar 20ml de solução de ND com o dispen-sador automático Unispense. Colocar uma rolha em cada frasco para impe-dir salpicos, e armazenar as amostras em refrigerador ou efetuar imediata-mente o procedimento NDF.

7. Lavar o conteúdo dos frascos com 80ml de detergente neutroem um béquer Berzelius de 600ml. Adicioanr 0,5 d de sulfito de sódio. Reflu-xar por 1 hora, cronometrada do início da ebulição. Adicionar aproximada-mente 1 colher de chá de areia do mar purificada com ácido (Seasand, FlukaChemika #84880) em cadinhos Gooch limpos. Lavar e enxaguar com águaquente até que a espuma desapareça, e duas vezes com acetona.

Deixar a acetona evaporar por completo, secar os cadinhos du-rante a noite, a 100°C, calibrar a balança e pesar a quente. Levar as amos-tras a cinzas a 500°C, por 6 horas, resfriar para 200°C, e transferir para se-cagem em forno e pesar a quente o cadinho mais a cinza.

8. Calcular a digestibilidade real in vitro da matéria seca:

IVTD = [1-(N - CA)] x 100, onde N = cadinho + peso de resíduode ND, CA = peso do cadinho vazio.10 S = peso da matéria seca da amostra

9. Calcular a digestibilidade de NDF in vitro:

IVCWD = [1 - ((N-CA)/(S x F/100))] x 100, onde N = cadinho +peso de resíduo de ND

CA = peso do cadinho vazioS = peso da matéria seca da amostraF = percentagem de NDF da amostra

10. Calcular as taxas de digestão, preparar um conjunto de 13amostras a serem incubadas de 0 a 120 horas. Colocar todos os frascos embanhos de água e remover com o tempo. Processar os resíduos como lista-do acima. Calcular NDF remanescente como percentagem de NDF originalpara cada amostra. Usar ou um método de regressão não linear (JMP ouSAS) ou um procedimento de transformada de log, como a seguir: subtrair oresíduo indigerível (-120 horas) de cada fração.

Calcular o log natural (In) de cada ponto e calcular a regressãolinear do gráfico.

Inclinação dessa linha é a taxa de digestão da fração em ques-tão.

Esse método é uma modificação do procedimento de digestibili-dade aparente in vitro. As etapas 1 a 5 são comuns em ambas as técnicas.

Da etapa 5, continuar abaixo com a etapa 6a para o método de Tilley-Terry.

6a. Depois de 48 horas de fermentação, adicionar, cuidadosa-mente, 2ml de HCI 6N a cada frasco para evitar excessiva formação de es-puma. Isso reduzirá o pH para abaixo de 2. Adicionar 0,5 g de pepsina, egirar para dissolver. Adicionar 1ml de tolueno, recolocar os frascos em ba-nho de água, e incubar por mais 48 horas.

7a. Remover os frascos do banho de água e filtrar em papelWhatman #4, 41 ou 54, previamente tarado, sem aplicação de vácuo. Enxa-guar o papel de filtro duas vezes por preenchimento com água quente e dei-xar drenar. Encher o filtro com acetona, deixar drenar e secar a ar. Dobrar ospapéis, secar a 100°C, e pesar. Usar um fator de matéria seca, calculado empapéis separados, para corrigir quanto à tara nos papéis usados para filtra-gem. Brancos separados, contendo inóculos e meios, mas sem amostra, eamostras de forragem padrão devem ser também analisadas.

8a. Calcular a digestibilidade aparente in vitro (Tilley-Terry):

IVDMD = [1-(R-F) - B] x 100, onde R = peso do papel de filtro e do resíduo

B = peso do branco de amostra

Referências:

Goering, H.K e P.J. Van Soest. 1970. Forage and Fiber Analysis.Agricultural Handbook N° 379. Departamento Norte-Americano de Agricultura.

Tilley, J.M.A. e R.A. Terry, 1963. A two-stage technique of the invitro digestion of forage crops. J. Br Grassl. Soe. 18:104-111.

2/4/00 M.S. Allen, Dairy Nutrition and Forage Analysis Lab,Michigan State University.

Exemplo 3

Nocautes Duplos de CAD/COMT

Co-expressão de construções de c/sRNA/ para CAD & COMTconduzidas pelo promotor OsMADs6 pode ser obtida em uma construçãosimples. Eventos de milho transgênico contendo tais construções são produ-zidos usando o protocolo de transformação estabelecido no Exemplo 1. Asseqüências do promotor OsMADs6 e as construções de RNAi são como a-presentadas, e as análises estabelecidas acima são usadas para determinaro teor de lignina, etc. Sabugos com teor reduzido de lignina produzidos u-sando este método pode ser usado do mesmo modo e para os mesmos pro-pósitos que aqueles produzidos usando os plasmídios da Figura 1 ou 2.

Exemplo 4

Uso de Material de Planta com Baixo Teor de Lignina em Con-versões de Biomassa

Uma das limitações de converter biomassa em etanol é a neces-sidade de um pré-tratamento químico severo para separar as fibras da plan-ta que estão "coladas" umas as outras por lignina. O propósito desta inven-ção é que quanto mais baixo o teor de lignina, mais facilmente as fibras po-dem ser separadas, pré-tratamento menos severo é usado, menos perda deglicose durante o pré-tratamento, menos enzima requerida para hidrolisar abiomassa e um maior rendimento de álcool. Um exemplo da tecnologia u-sando sabugo de milho é apresentado, contudo, é óbvio que esse resultadopode ser estendido para outras fontes de plantas. A produção de etanol debiomassa de celulose é discutida por Badger, P.C., Ethanol from cellulose: Ageneral review. pp. 17-21, J. Janick e A. Whipkey (eds.), Trends in newcrops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA., 2002.Pré-tratamento-sacarificacão-fermentacão padrão

Oito gramas de sabugo finamente triturados são suspensos com80ml de uma solução a 1% de hidróxido de sódio e aquecidos por 1 hora, a130°C. O pH é então ajustado para pH 5 e 100 mg de levedura seca mais 20unidades de papel de filtro (FPU) de celulose são adicionados e deixadosfermentar por 20 horas. A cerveja resultante seria analisada quanto ao eta-nol e a expectativa é de que seriam obtidos em torno de 3% v/v, como é u-sualmente obtido da biomassa de fermentação.

Pré-tratamento-sacarificacão-fermentacão de sabugo com baixo teor de lig-nina

Oito gramas de sabugo finamente triturados são suspensos com80ml de uma solução a 1% de hidróxido de sódio e aquecidos por 1 hora, a130°C. O pH é então ajustado para pH 5 e 100 mg de levedura seca mais 15FPU de celulose são adicionados e deixados fermentar por 20 horas. A cer-veja resultante seria analisada quanto ao etanol e a expectativa é que maisetanol seria produzido que os sabugos triturados padrão na faixa de cercade 3% v/v.

Exemplo 5

Análise composicional do sabugo e dados preliminares hidrolíticos.

Análise composicional de sabugos de milho

Esse exemplo descreve a análise composicional de sacarídeopara glicose, xilose, arabinose, e manose de sabugos de milho com baixoteor de lignina. A principal análise composicional de sacarídeo foi determina-da para três variedades de sabugo de milho: CPM913 (Controle de Isolinha-gem, genótipo A), CPM914 (mutante BM3, genótipo BM3), e CPM916 (mu-tante BM3, genótipo B). A composição foi determinada realizando-se hidróli-se com ácido forte (H2S04 a 72%), por uma hora, seguida por hidrólise comácido diluído aquecido (H2S04 a 4%, a 121°C, por 1 hora) e neutralizaçãocom carbonato de cálcio. As concentrações de monômeros individuais desacarídeo foram determinadas via índice de Retração - Cromatografia Líqui-da de Alto Desempenho (RI-HPLC). Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Análise composicional de amostras de sabugo em triplicata. Amostras desabugo não foram analisadas quanto ao teor de ferulato, lignina ou de cinzas.

<table>table see original document page 68</column></row><table>

Hidrólise Enzimática de Sabugos de Milhodo nos brotos ou na fruta.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Transformação de Agrobactéria do Milho - Embriões Imaturos

Preparação da Orelha

Enxaguar as orelhas, três vezes, com ddH20 estéril.

Preparar a solução de inoculacão para transformação

• A 100ml de meio de LP-Lsinf., adicionar 50 |iL de solução deestoque de acetosiringona (AS) (40 mg/ml de estoque/ml) para uma concen-tração final de 100 |iM de AS.

• Pipetar 4ml (2,5) do meio de infecção em 10ml de tubo descar-tável.

Preparação de suspensão de Agrobactéria

• Medir a densidade óptica da suspensão de Agrobactéria. Ajus-tar a OD66o para aproximadamente 0,45 a 0,55.

Isolamento de Embriões Imaturos e Transformação

• Turbilhonar os embriões (agitar manualmente) por 5 segundos.

• Impingir termo-choque aos embriões em banho de água a45°C, por 5 minutos. Não deixar que a tampa do tubo Eppendorí entre emcontato com a água (possíveis problemas de contaminação).

• Deixe que o tubo assente por 5 minutos.

Seleção da Manose

Transferir os eventos para meios de formação de raízes em re-cipientes de cultura de tecido (2 eventos/recipiente Greiner).Milho transgênico foi crescido na estufa para o estágio TO ou T1,e amostras de sabugo ou de outros materiais foram selecionadas dos even-tos transgênicos produzidos. Os plasmídios mostrados na Figura 1 e Figura2 mostram os plasmídios (pSyn12210 contendo a construção CAD RNAi, epSyn12345 contendo a construção COMT RNAi) usados no protocolo detransformação de milho dado acima.

Exemplo 2

Seleção de evento T1 CAD pSvn12210

As amostras de sabugo T1 de um total de 15 eventos (10 de có-pia baixa, 3 média e 2 alta) incluem 65 linhagens (28 linhagens de cópia bai-xa, 14 de cópia média, 5 de cópia alta e 18 nula para controle) foram envia-das para análise de MSU para NDF (fibra), ADL (lignina), IVNDFD (digestibi-lidade de NDF in vitrò). 3 isolinhagens BM3 e 2 checagens de híbridos foramtambém incluídos. Comparamos a diferença entre as linhagens (transgêni-cas versus nulas) do mesmo evento, entre os eventos, ou entre os eventosde cópia baixa, média e alta com os controles positivos BM3 ou negativos echecagem de híbridos. Embora alguns destas tenham ficado nas 16 linha-gens de topo mencionadas abaixo, nenhumas destas mostrou redução con-sistente de lignina nos testes futuros. Os dados estão na Tabela 1 e os mé-todos usados para análise são dados abaixo.

Seleção de evento T1 COMT (PsYN 12345)

Análise de sabugo T1: As 7 linhagens de topo contendopSyn12210 ou pSyn 12345 foram selecionadas com base no teor de lignina edados de digestibilidade in vitro. Essas linhagens mostraram redução do teorde lignina e aperfeiçoada digestibilidade em comparação com o sabugo decontrole conforme mostrado na Tabela 1. Os dados referentes aos dois me-lhores eventos contendo plasmídio pSyn12345 estão apresentados na Tabe-Ia 2.Tabela 1

Fibra Detergente Ácida, VTD = Digestibilidade rea in vitro, IVNDFD = Desaparecimento de NFD in vitro.

<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table>Tabela 2

<table>table see original document page 75</column></row><table>

Para metodologias gerais aplicáveis a essas análises, vide:

Goering, H.K., e P.J. Van Soest. 1970. Forage Fiber Analyses.

Apparatus, Reagents, Procedures, and some applications. Agric. HandbookN° 379. ARS-USDA.

ADF - Fibra Detergente Ácida - (método Van Soest)

Solução de ADF

2% de CTAB em H2S04 1N(para 1 litro de estoque, adicionar 20 g de CTAB para 900ml deágua deionizada (di), agitar por poucos minutos até redução do tamanho departícula. Então, adicionar 62,5ml de ácido sulfúrico 16N (Fisher A298-212,98%, densidade de 1,84 g/ml). Conforme o ácido é adicionado, a mistura deCTAB + água/ácido se torna solubilizada. Preencher para 1 L com água dei-onizada.

A solução de ADF pode ser também adquirida da ANKOM(www.ankom.com).

Registrar o peso da sacola da ANKOM.

Verter no saco de filtro (tipo F57)da ANKOM; registrar o peso.Vedar com termo-vedador.

Secar a 70°C, em forno, durante a noite.

Pesar tecido residual = ADF.

ADL - Liqnina Detergente Ácida

NOTA: ácido sulfúrico a 72% pode ser preparado por adicção de750ml de ácido concentrado (95%) em 250ml de água. Cuidado: a mistura émuito quente e requer que o ácido seja vertido lentamente para evitar proje-ções. A garrafa é ainda colocada em um banho de água à temperatura am-biente (2 enxágües) para resfriamento rápido e uso. Pode-se também adquirir o H2S04 a 72% da Ankom.

Incubar na temperatura ambiente, por 3 horas, agitar várias vezes.

Excesso de ácido é descartado em rejeito de ácido líquido.

Então enxaguar, pelo menos cinco vezes com água quente (85 a 90°C). As lavagens são realizadas na pia.

Secar em forno, a 70°C, durante a noite.

Pesar o tecido residual = ADL

Análise de Fibra Detergente Neutra

Numerar as sacolas com marcador resistente a solvente.

Registrar o peso das sacolas de amostra seca, vazias, Ankom.

Tomar a amostra seca e pesar 0,5 g da amostra seca em saco-las de filtro Ankom.

Vedar as amostras com termo-vedador.

Ajustar o cronômetro para 105 minutos.

Enxaguar lentamente com 2 litros de água a 85-90°C.

Repetir o processo de enxágüe por um total de três enxágües.

Adicionar água gelada às amostras para auxiliar o resfriamento.

Drenar as sacolas e colocá-las em acetona por três minutos.

Pesar as sacolas, coletar dados em uma Planilha designadaNDF.

DETERMINAÇÃO DA DIGESTIBILIDADE REAL IN VITRO

2. Preparar os meios por adição dos ingredientes na ordem a-baixo:

Número dos frascos: 24 48 78 110 166Água destilada 500ml 1,00L 1,75 L 2,25 L 3,50 LTrypticase® Peptona 2,5 g 5,0 g 9,75 g 11,25 g 17,5 gSolução micromineral 0,125ml 0,25ml 0,438ml 0,563ml 0,880mlSolução de tampão Rúmen 250ml 500ml 975ml 1,125 L 1,75 LSolução macromineral 250ml 500ml 875ml 1,125 L 1,75 LResazurina 1,25ml 2,5ml 4,38ml 5,63ml 8,80ml1,00 L 2,00 L 3,50 L 14,50 I 7,00 L

3. Preparar a solução redutora:

4. Enquanto a solução redutora está sendo misturada, colocar osfrascos em banho de água. Colocar os frascos com uma amostra padrão emcada fileira disposta diagonalmente através do banho de água. Adicionar 2mlda solução redutora a cada frasco com pipeta repetidora Eppendorf. Tamparcada frasco com um tubo de descarga de CO2. Ligar o CO2 e permitir que asamostras reduzam (a cor vermelha muda para transparente ou cor de chá),antes da adição do inóculo.

5. Preparar o inóculo:

Combinar a mistura e ingesta em um misturador Waring de 3,78 litros, to-mando cuidado para que a descarga de C02 continue. Revestir um funil deBuchner de plástico, grande, com uma camada de malha de náilon e passaro inóculo misturado através dela. Espremer bem.

Usar somente digesto pancreático de caseína Trypticase® Pep-tona (Becton Dickinson BBL #4311921).

Número dos frascos: 24 48 78 110 166

Água destilada 48ml 95ml 167ml 261 ml 356ml

L(+)Cisteína HCI.H20 313 mg 625 mg 1,094 g 1,719 g 2,344 g

NaOH 1N2ml4ml7ml 11 ml 15ml

Na2S.9H20 313 mg 625 mg 1,094 g 1,719 g 2,344 g

50ml 10Oml 175ml 275ml 375ml

Passar inóculos através da lã de vidro em um béquer de plásticogrande para filtrar partículas pequenas.

O filtrado deve ser também mantido sob C02) o tempo todo,Transferir inóculos para uma garrafa que é anexada a um equipamento depipetar Brinkman de 50mL.

8. Calcular a digestibilidade real in vitro da matéria seca:

IVTD = [1-(N - CA)] x 100, onde N = cadinho + peso de resíduode ND, CA = peso do cadinho vazio.

S = peso da matéria seca da amostra

9. Calcular a digestibilidade de NDF in vitro:

Inclinação dessa linha é a taxa de digestão da fração em ques-tão.

Da etapa 5, continuar abaixo com a etapa 6a para o método de Tilley-Terry.

8a. Calcular a digestibilidade aparente in vitro (Tilley-Terry):IVDMD = [1-(R-F) - B] x 100, onde R = peso do papel de filtro edo resíduo

B = peso do branco de amostra

Referências:

Exemplo 3

Nocautes Duplos de CAD/COMT

Co-expressão de construções de GfeRNA/ para CAD & COMTconduzidas pelo promotor OsMADs6 pode ser obtida em uma construçãosimples. Eventos de milho transgênico contendo tais construções são produ-zidos usando o protocolo de transformação estabelecido no Exemplo 1. Asseqüências do promotor OsMADs6 e as construções de RNAi são como a-presentadas, e as análises estabelecidas acima são usadas para determinaro teor de lignina, etc. Sabugos com teor reduzido de lignina produzidos u-sando este método pode ser usado do mesmo modo e para os mesmos pro-pósitos que aqueles produzidos usando os plasmídios da Figura 1 ou 2.

Exemplo 4

Uso de Material de Planta com Baixo Teor de Lignina em Con-versões de Biomassa

Pré-tratamento-sacarificação-fermentação de sabugo com baixo teor de lig-nina

Exemplo 5

Análise composicional do sabugo e dados preliminares hidrolíti-cos.

Análise composicional de sabugos de milho

Esse exemplo descreve a análise composicional de sacarídeopara glicose, xilose, arabinose, e manose de sabugos de milho com baixoteor de lignina. A principal análise composicional de sacarídeo foi determina-da para três variedades de sabugo de milho: CPM913 (Controle de Isolinha-gem, genótipo A), CPM914 (mutante BM3, genótipo BM3), e CPM916 (mu-tante BM3, genótipo B). A composição foi determinada realizando-se hidróli-se com ácido forte (H2S04 a 72%), por uma hora, seguida por hidrólise comácido diluído aquecido (H2S04 a 4%, a 1210C, por 1 hora) e neutralizaçãocom carbonato de cálcio. As concentrações de monômeros individuais desacarídeo foram determinadas via índice de Retração - Cromatografia Líqui-da de Alto Desempenho (RI-HPLC). Os resultados são apresentados na Ta-bela 3.

Tabela 3

Análise composicional de amostras de sabugo em triplicata. Amostras desabugo não foram analisadas quanto ao teor de ferulato, lignina ou de cin-zas.

<table>table see original document page 84</column></row><table>

Hidrólise Enzimática de Sabuaos de MilhoEsse experimento foi conduzido para determinar os sacarídeosproduzidos a partir de vários sabugos de milho mediante hidrólise enzimáti-ca.

Uma tela de primeira passagem foi iniciada usando altas con-centrações de sabugo de milho. CPM914 e CPM916 são reduzidos genóti-pos de lignina A e B, respectivamente. Reações amplas (100 mg de sabugode milho em pedaços) foram preferidas devido à natureza heterogênea e decurso do substrato - as reações, em geral, foram efetuadas em tubos Ep-pendorf, em vez de placas de microtitulação. Extratos de enzima de sobre-nadantes fúngicos e um coquetel otimizado em fibra de milho foram testadosquanto às atividades de hidrólise em três tipos de sabugo. A reações esta-vam em escala de 1ml contendo a) 100 mg de sabugo em pedaços, suple-mentados com b) 50 |ug de enzimas fúngicas de Cochliobolus heterotrophus("cokie") e 200 |a,g de enzimas de Aspergillus niger, d) um coquetel de xila-nase-esterase contendo 2 xilanases, uma a-arabinofuronosidase, uma (3-xilosidase, uma ácido ferúlico esterase e uma acetil xilano esterase. O co-quetel de xilanase continha: 25 |a,g de BD13509, 125 ng de BD2157, 62,5 u,gde BD13715 e BD13457. O coquetel de esterase continha: 100 |ig deBD14441 e BD14104.

Os resultados são apresentados na Tabela 4. Quando foi usadoo coquetel de enzimas definido, a hidrólise foi mais alta em ambas as varie-dades de sabugo com lignina reduzida em comparação ao sabugo de varie-dade regular. Embora o coquetel de xilanase-esterase não tenha sido otimi-zado para hidrólise de sabugo, o coquetel apresentou uma atividade surpre-endentemente alta em sabugo, com melhor atividade nos mutantes de ligni-na inferiores. Note que não existem enzimas de degradação de celulosepresentes no coquetel de enzimas: se essas enzimas são adicionadas, podeser possível aumentar ainda mais a hidrólise dos sabugos.Tabela 4

Hidrólise enzimática de três variedades de sabugo de milho em pedaços pa-ra monômero de açúcar, expresso em porcentagem de peso seco.

<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>

Hidrólise enzimática de sabuqos de milho incluindo também qlicanases, ce-lulases e qlicuronidase

A relação positiva entre os coquetéis de enzimas definidas eCPM913/CPM914 foi ainda explorada, desta vez adicionando outras glica-nases, celulases, e uma glicuronidase. A reações de hidrólise estavam emescala de 1 mml, 25 mg/ml de sabugo de milho em pedaços incubados por48 horas, a 37°C, em um agitador de tubo Eppendorf. O coquetel de xilana-se-esterase é o mesmo que o do Exemplo 2 (10ml de coquetel de xilanase:4ml de 13509, 20 ug de 2157, 10 ug de 13715 e 13457). Enzimas adicionaisforam adicionadas ao coquetel: 10 ug de a-Glicuronidase BD12669; 100 ugde coquetel de celulose de Trichoderma reesi; 10 ug de glicanase COM516;glicanase com coquetel de esterase (10ml de coquetel de esterase: 100 ugde BD14104 e 100 ug de BD14441); ou um coquetel contendo todas as aci-ma (exceto a a-Glicuronidase). Com coquetéis de enzimas definidos, o subs-trato de sabugo de milho de baixo teor de lignina é mais suscetível ao ata-que enzimático. A adição de um extrato de celulose aumenta a hidrólise glo-bal para 21,8%, ou 34% do total de açúcar disponível. Uma reação similarusando fibra de milho rende 5,4%, um substrato para o qual as enzimas fo-ram otimizadas.

A mesma tendência de melhor digestibilidade foi vista nas amos-tras de sabugo com baixo teor de lignina (Tabela 5). De particular interessefoi a habilidade de esterases e celulases em aumentar a quantidade de xilo-se hidrolisada no sabugo de baixo teor de lignina. Uma combinação de co-quetel de xilanase e celulases foram capazes de converter 34% da açúcardisponível em monômero no sabugo de baixo teor de lignina, em compara-ção a somente 25% no sabugo do tipo selvagem.

Tabela 5

É mostrada a hidrólise de dois tipos de sabugo em pedaços usando coque-téis de enzimas definidos - fibra de milho não tratada. Os números são ex-pressos como porcentagem de peso seco.

<table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table>

O benefício da digestibilidade aperfeiçoada de ensilagem de mi-lho na ingestão de matéria seca e produção de leite em vacas leiteiras foidemonstrado por Ballard et al., J. Dairy Sei. 84:442-452 (2001), e por Oba eAllen, J. Dairy Sei. 82:135-142 (1999). Experiências similares de alimentaçãosão estabelecidas para uso de sabugos de milho com baixo teor de ligninada presente invenção para demonstração de benefícios similares que resul-tam da digestibilidade aperfeiçoada demonstrada acima, e como mostradana Figura 3.

Certas seqüências são particularmente úteis na prática da pre-sente invenção. Essas seqüências são mostradas abaixo:

SEQ ID No: 1. Seqüência de Promotor: OsMADS 6

ctaggacgatggtgtgatgtgggaacacgaagaaaacatgaggaaaaaatattaaaatgaatttcccacttaaaatgcatcaaataaaaaaaataaagaaacgaccgggaatagacacagggtttgtgaactagctagggcaaacatcatatggtcccttgctgatgcacaagtacattgagatgtcatttcaattctgtgcatcatatgcatgtggtcccttgctgaatattactcttgaaatatctaccagtgccaatctattgcatgacttaattaattcacaggttttgttgattacattattagtaagcttgagagcacaagctcaatggatttttctataaatggggatcattttgcaattttctttgtcgtgcaaagttagccttctttattactacttctgtttttaaatatacgatcctattgacttttggtcatatatttaaccatgtatcttatttagatagtttgcgcaaatatatataccttcaatgataaaattagttacaatgaaacaaatgatatttacgcaattctttttactaaacaagtcacaagaagtacctgcagcaatatatgttggaaccgtgcagtagatcgagcctagctacgcaaaaaaacaaaaagagaaaaaaagggaaaggaaaaacattaatcatgcatgagcagtatgcccggcaactggaatttgtcaaagatatggggagaggagaataatacaagtactactactacctagctctaccatgcatatgcacccaaaggcaaactggattattggataaagcacagatgctggcaaaacaatccttaagcctcccctccctgcttctttatttttgggcagcctctaccggacggtgccgtggtccattggaccagtaggtggcgacatacatggtttgggttaagtctaggagagcagtgtgtgtgcgcgcgcaagagagagagactgtgagtctgggagtagccctctcccctcctttggccatcttcctcgtgtatatgcatatatgcatcatcgcaacggtgtatatttgtggtgtggcgggtgtggcattggattgcccccattttggctcgtgcttcccagttagggtaaaacctgtggtaaacttgctagccccacgccaaagttacccttctttattgttgaaagggagaggaggtgtgtgaattgtgatggagggagagagagagagatagaaagagagatgtgtgtcaaagcaagcaa

gaaaccagtttcacaaagagctactactagtactagtgtactactgtggtacagtgcccaatgtcctttctccggactcgactccacta

atattctcctcttctcgcgcggctcgttatattctcgtcatcattggaggctttagcaagcaagaagagaggcagtggtggtggtggtgg

aggaggagctagctagcctgtgcttgctgatcggtgctgagctgaggaatcgttcgatcgatcgggcgagtcgacgaggggaag

agttgagctgaggcgcatcgagaacaagatcaacaggcaggtcaccttctccaagcgccgcaacggcctcctcaagaaggcct

acgagctgtccgttctctgcgacgccgaggtcgcgctcatcatctlctccagccgcggcaagctctacgagttcggcagcgccggg

tataattaatacagacacaacaacacacacaaccaacaaaccagcatcaatttgaacctgcagatctgctgttttctctgatcaattg

cttcttttttWgttctttmgmctmatctgctgcaacggcgtcctgctcctctggggtttctcgttttctttttcatttatttttagcaggtgccaa

gtagccgagctactatacttacctggccatgttaattattttattccgtctgtctgtgtgtgtctgtgcatactactatagggacatggcgcg

gtgttcttataaaccgggaggccggatccctaactagcatgggaggatatcttttcagcggatctatacaaaccctactcctgctgac

ctctttcttccagtttctccgggtcttccttggattattattgcccatcttccgggttgtgcgtgtgtcagagacagctcgaacgataaatttct

caaaaccagtactagagagggtgtgttgtgtgtgagaactgagtggagagttagcatgaaggctgcaaactagaaaggaaggta

tgttGtttcctttttgatccatcaggggagccccttctggtattaagatctttccggcacattgattttcatactttgtgatgaccctggaaga

atcggcgtagcagcgtagcaccgctccattttggtcttaccctcacctccccatgctatgaactgatcaatttcattgttcttcatcaccct

tctcctagctttccacttccttcggatctcatgccatgtttctcagcatgaatcaaatttaattcgtgttttctacttccatatatactggaaga

aatttaattagatctatttttgctcgggaggtcttcatactttgagttctgatgccatcaccttatttcccccccccccttctcttgttctatcttctt

cctcatcttggcttgatcattttgatctgtcagttatagcatgatgcattctcaatttgactgtatgtaagttcaaccggaaatatgttgaatg

gattttctatatatcaacacttgatgtcaggcctgcatctgtttcgcttgtggtggtgtggccaaaattgtctatatttgatctttgctcttctttct

cctcatttcatgacgattcctactacggcttaaaccattctttattctttactaatcatggatgttgcttgactcctagttgtttcgtactagctc

aacttggagatcttttcattatttgcctagttggtgggtacgtttgtgacagatctaaaatggtgcacgaaaagttttacttattatgaaaa

aagggagcttaacagggtaatttctctatttattcgtgatgacattttttccttgataagggggattttttataatctgcactcacatgtttatat

SEQ ID NO: 2 Seqüência de RNAi de CAD K/O (PSyn 12210)CAD-Frente

giaaBfettitagclcttttPt^

atctttgattgtgaaaatcatacaatagggaaaatcaactgaagggttaattagatgctatatgcatatatatatatatgtgcgcgcgc

gcgcgcctgaatttaactatgtatgcatccaactgtttcattgaaaaagatttgatatttttcagtctattctttttcgagtatatatttaatatgt

ttcaatctgtütgaccattataagataaagcctatattcaccaggcatttgagatgatcttttcatgcatgaaaaagctgttgttatcactt

caactaaccagacgatctaacatgtatttgtataagaaacagacctígafttccítctgtaaaatcatgcaígtgttcgtfftgaallgga

gtcggcgcgcctgtgttttgaccgtcaggaaagtcttttttttccctgaatagtcaagggtctatacttcttgaagcaattgggacactaat

caattattgtttatacctcggaccatcttttccttcttcacaccactaatcagtttatgccttggaccattaattgtgttgttcacaagcttctígt

ttatggtttacaaagcattcgcctagatttgtgtgtgtctctacacatcgatcacttttaaatacttgtcgctttcagttattcttttaacgtttggt

tatttatcttatttaaaaaaattatcgtattattatttattttgtttgtgatttactttattatcaaaagtatttcaaatatgacttatctttttttataagt

gcactaatttttcaaataagatgaatggtcaaatgUacaagaaaaagttaaagcaaccactaattlagggcggaggtagtaaaac

ciagttaítgtaaccaataaítttatcaatciataaatgcaacacaaagtcacttcgtgatatctcacacaaagccacttcaacgatga

aagctgactgcatgttttatcaaaacacatgtgatcagUtgttggatgaaaaaaattatctatgtcataaatcaagagttataatataa

gcttctggctctacaagtaacatttctatgttttttttttacgttcttacatactatgttttgccaaaaaaaacatgatcattttgttggacgaaa

agaaatagtaaatatagagtgacctttgatatcattataatataagcttctgcctctataaataacatctatgcactttttacgtcgtagta

atttgatatatgagaaatttacatataacatttttgtgcagcataaccacc

SEQ ID NO: 3. Seqüência de RNAi de COMT/KO (pSyn 12345)COMT-Volta

5'atggggagcctggcgtccgagaggaaggtggtcgggtgggccgccagggacgccaccggacacctctccccctactcctacaccctcaggaacacaggccctgaagatgtggtggtgaaggtgctctactgcgggatctgccacacggacatccaccaggccaagaaccacctcggggcttcaaagtatcctatggtccctgggcacgaggtggtcggcgaggtggtggaggtcgggcccgaggtggccaagtacggcgtcggcgacgtggtaggcgtcggggtgatcgUgggtgctgccgcgagtgcagcx:cctgcaaggccaacgttgagcagtactgcaacaagaagatctggtcatacaacgacgtctacactgatggacggcccacgcagggtggattcgccctc 3'

Embora a invenção acima tenha sido descrita em alguns deta-lhes a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e entendi-mento, ficará claro para aqueles versados na técnica que certas alterações emodificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicaçõesapensas.

Claims

1. Método para controlar a biossíntese de lignina em uma plantatransformada, em que o método compreende infra-regular a expressão deuma enzima na planta, a enzima selecionada do grupo que consiste em CADe COMT, em que a infra-regulação é obtida usando RNAi de fita dupla.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a planta émilho.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a infra-regulação está localizada no sabugo da planta de milho.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a constru-ção de RNAi de fita dupla compreende a SEQ ID NO:2.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a constru-ção de RNAi de fita dupla compreende SEQ ID NO:3.

6. Método para controlar a biossíntese de lignina em uma plantatransformada, em que o método compreende infra-regular a expressão dosgenes de COD e COMT de uma planta usando RNAi de fita dupla.

7. Construção de RNAi selecionada do grupo que consiste em aseqüência SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3.

8. Método para controlar a biossíntese de lignina nos sabugosde uma planta de milho transformada, em que o método compreende infra-regular a expressão de o gene de CAD, o gene de COMT, ou ambos os ge-nes, nos sabugos da planta de milho usando uma ou mais construções deRNAi de fita dupla, cuja expressão está sob o controle de um promotor es-pecífico para sabugo ou preferido para sabugo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que o promotoré o promotor de SEQ ID NO:1.

10. Método para controlar a biossíntese de lignina nos sabugosde uma planta de milho transformada, em que o método compreende infra-regular a expressão de o gene CAD, o gene COMT, ou ambos os genes, nossabugos da planta de milho usando uma ou mais construções de RNAi defita dupla compreendendo SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, ou ambas, em queas construções são conduzidas pelo promotor de SEQ ID NO:1.

11. Método para a produção de etanol, em que o método com-preende o uso de biomassa compreendendo material de um sabugo de mi-lho de baixo teor de lignina produzido pelo processo conforme definido nareivindicação 8, em um processo de produção de etanol.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o sabugode milho com baixo teor de lignina é produzido pelo método conforme defini-do na reivindicação 10.

13. Método para aumentar a produção de leite em um animalpela alimentação do animal com uma ração que compreende material pro-veniente de sabugo de milho com baixo teor de lignina, produzido pelo mé-todo conforme definido na reivindicação 8.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o sabugocom baixo teor de lignina é produzido pelo método conforme definido na rei-vindicação 10.

15. Método para aumentar o rendimento nutricional da ração deum animal através da alimentação do animal com uma ração que compreen-de material proveniente de um sabugo de milho de baixo teor de lignina pro-duzido pelo método conforme definido na reivindicação 8.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o sabugode milho com baixo teor de lignina é produzido pelo método conforme defini-do na reivindicação 10.