BRPI0609932A2

BRPI0609932A2 - métodos para preparar um produto imunogênico anti-tnfalfa e para preparar uma composição de vacina, produto imunogênico anti-tnfalfa, composição imunogênica, e, composição de vacina

Info

Publication number: BRPI0609932A2
Application number: BRPI0609932-7A
Authority: BR
Inventors: Daniel Zagury; Buanec Helene Le
Original assignee: Neovacs
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2011-10-11
Also published as: WO2007022813A2; CA2609572A1; ATE500848T1; CN101222941A; WO2007022813A3; ZA200710011B; AU2006284248A1; US20080193473A1; NZ563526A; JP5061099B2; EP1888122A2; CA2609572C; EP1888122B1; AU2006284248B2; JP2008542227A; ES2382229T3; DE602006020563D1; US7887811B2

Abstract

MéTODOS PARA PREPARAR UM PRODUTO IMIINOGêNICO ANTI-TNFALFA E PARA PREPARAR UMA COMPOSIçãO DE VACINA, PRODUTO IMUNOGêNICO ANTI-TNFALFA, COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, E, COMPOSIçãO DE VACINA. A presente invenção refere-se a um novo método para preparar um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFct e uma proteína veículo, cujas etapas do método são descritas no relatório.

Description

"MÉTODOS PARA PREPARAR UM PRODUTO IMUNOGÊNICO ANTI- TNFALFA E PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA, PRODUTO IMUNOGÊNICO ANTI-TNF ALF A, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, COMPOSIÇÃO DE VACINA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo, para obter uma resposta imune humoral em um mamífero, com produção de anticorpos que neutralizam a atividade biológica do TNFa, bem como a um método para prepará-lo.

O dito produto imunogênico estável pode também ser denominado um produto imunogênico anti-TNFa ou também um produto imunogênico para induzir anticorpos anti-TNFa.

Esta invenção refere-se ainda a composições de vacina, compreendendo dito produto imunogênico estável, consistindo de heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo, bem como a métodos para prepará-las.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Um método geral para preparar um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos, consistindo de uma ou mais proteínas antigênicas de interesse e pelo menos uma proteína veículo, foi descrito no pedido PCT publicado sob o no. WO 2004/024189 no nome de NEOVACs. Notavelmente, dito pedido PCT descreve um método para preparar tais heterocomplexos empregando TNFa como o antígeno de interesse e KLH como a proteína veículo. Dito método da técnica anterior geral, quando executado para preparar heterocomplexos compreendendo TNFa e KLH, compreende as seguintes etapas:

a) obtenção de uma mistura de KLH com TNFa;

b) adição a dita mistura de glutaraldeído em uma concentração final de 0,026 M;

c) remoção de glutaraldeído em excesso pela realização de diálise;

d) adição de formaldeído à solução dialisada e manutenção da presença de formaldeído durante um período de tempo de 48 horas;

e) adição de glicina à solução obtida no final da etapa d); e

f) realização de uma diálise com a solução obtida no final da etapa e).

Os exemplos do pedido PCT No. WO 2004/024189 mostraram que o produto imunogênico TNFa/KLH era estável e capazes de elevar a produção dos anticorpos que possuem uma boa atividade neutralizante contra TNFa nativo.

Entretanto, com o tempo, pareceu que heterocomplexos mais eficientes eram necessários, em vista de satisfazer o elevado nível de exigências das várias autoridades de saúde, incluindo nos Estados Unidos e Europa, para fins de manufaturar composições de vacina adequadas, contendo ditos heterocomplexos como o ingrediente ativo principal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O Requerente verificou que o método geral descrito no pedido PCT no. WO 2004/024189, quando aplicado a heterocomplexos compreendendo TNFa e uma proteína veículo, resultou em produtos imunogênicos finais em que tanto a inativação como a imunogenicidade do TNFa tinham que ser melhoradas, com vistas à manufaturação de composições de vacina anti-TNFa a serem aprovadas pelas várias autoridades de saúde por todo o mundo. O requerente também verificou que a estabilidade do inteiro produto imunogênico devia ser melhorada, notavelmente para aumentar sua estabilidade com o tempo de armazenagem.

O Requerente verificou agora um novo método para preparar um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo que permite alcançar os vários objetivos acima descritos.

Um objetivo da presente invenção consiste de um método para preparar um produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo, compreendendo as etapas de:

a) fornecer uma solução líquida contendo TNFa;

b) adicionar EDTA a dita solução líquida contendo TNFa da etapa a);

c) adicionar uma proteína veículo à solução líquida obtida no final da etapa b), a fim de obter uma mistura líquida de TNFa e dita proteína veículo;

d) adicionar glutaraldeído à mistura líquida obtida no final da etapa c), a fim de parcialmente conjugar covalentemente moléculas de TNFa a dita proteína veículo e obter heterocomplexos entre TNFa e dita proteína veículo;

e) remover glutaraldeído e moléculas livres de tanto TNFa e dita proteína veículo da solução obtida no final da etapa d), a fim de obter uma solução líquida contendo heterocomplexos purificados entre TNFa e dita proteína veículo;

f) adicionar formaldeído à solução líquida obtida no final da etapa e) e manter a presença de formaldeído por um período de tempo variando de 96 horas a 192 horas;

g) adicionar um reagente bloqueando a reação com formaldeído à solução líquida contendo heterocomplexos entre TNFa e dita proteína veículo, obtida no final da etapa f); e

h) remover formaldeído e reagente de bloqueio da solução líquida obtida no final da etapa h), a fim de obter uma solução líquida contendo dito produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos entre TNFa e dita proteína veículo; Executando-se o método descrito acima, os produtos imunogênicos estáveis são dotados com aumentada capacidade de induzir a produção de anticorpos que neutralizam o TNFa nativo, quando administrados a um mamífero em combinação com um ou mais compostos imunoadjuvantes.

Um "produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo", como aqui usada, consiste de um produto imunogênico que induz anticorpos que neutralizam a atividade biológica do TNFa, produto imunogênico este compreendendo associações de proteína entre (i) moléculas de TNFa e (ii) moléculas veículo, em que menos do que 40% das moléculas de TNFa são ligadas às moléculas veículo por ligações químicas covalentes.

O produto imunogênico estável, preparado pelo método acima, é "imunogênico" porque induz anticorpos contra TNFa nativo em um indivíduo, após sua administração a dito indivíduo e, mais especificamente, anticorpos que neutralizam a atividade biológica do TNFa nativo.

O produto imunogênico, preparado pelo método acima, é "estável", uma vez que dito produto imunogênico possui seu próprio ponto isoelétrico, que pode ser distinguido do ponto isoelétrico de pelo menos (i) TNFa ou (ii) da molécula veículo e uma vez que o dito produto imunogênico migra, em um ensaio isoeletrofocante, como uma faixa de proteína que é distinta de pelo menos uma das duas faixas de proteína correspondendo a (i) TNFa e (ii) à molécula veículo, respectivamente. Isto significa que um produto imunogênico de acordo com a presente invenção não compreende moléculas de TNFa não ligadas livres nem moléculas de proteína veículo não ligadas livres.

O produto imunogênico, preparado pelo método acima, compreende "heterocomplexos antigênicos" ou "heterocomplexos" de TNFa e uma proteína veículo, porque o dito produto imunogênico compreende (i) o TNFa antigênico e (ii) as moléculas de proteína veículo antigênicas, que são ligadas entre si (a) parcialmente por ligações covalentes (menos do que 40% de ligações covalentes) e (b) parcialmente por ligações não-covalentes fracas (mais do que 60% de ligações não-covalentes), abrangendo interações iônicas, ligações de hidrogênio, interações Van de Waals etc.

O produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo que é definida acima, que pode ser preparado de acordo com o método da invenção, pode também ser mais simplesmente denominado aqui como um produto imunogênico para indução ou que induz anticorpos anti-TNFa em um humano ou um animal, ou também como um produto imunogênico anti- TNFa.

Graças às etapas combinadas do método de acordo com a presente invenção, o produto imunogênico estável final é obtido com uma mais elevada reprodutibilidade do que os heterocomplexos compreendendo TNFa e uma proteína veículo obtidos de acordo com o método da técnica anterior descrito no pedido PCT No. WO 2004/024189, citado acima.

Notavelmente, verificou-se que a atividade imunogênica dos produtos imunogênicos estáveis, preparados realizando-se o método de acordo com a presente invenção, era muito reprodutível de uma batelada de preparação para outra.

Como mostrado nos exemplos aqui, os produtos imunogênicos estáveis, preparados executando-se o método de acordo com a presente invenção, são desprovidos de atividade biológica de TNFa detectável, tanto in vitro como in vivo, uma vez que a dose de ED50 é maior do que 50 ng/ml e mesmo maior do que 400 ng/ml, como expresso como concentração de TNFa final.

É também mostrado aqui que, além da indução dos elevados títulos anticorpo anti-TNFa, os produtos imunogênicos estáveis, preparados executando-se o método de acordo com a presente invenção, induzem a produção de anticorpos anti-TNFa altamente neutralizantes, tendo uma capacidade de neutralização NC5O de além de 1/1000.

Além disso, foi também mostrado que os produtos imunogênicos estáveis, preparados realizando-se o método de acordo com a presente invenção, podem ser seguramente administrados a mamíferos, uma vez que estes produtos não induzem qualquer efeito colateral adverso e, particularmente, nenhuma inflamação nem qualquer alteração em uma quantidade de 4000 vezes a dose terapêutica humana única (SHTD).

Adicionalmente, os produtos imunogênicos estáveis, preparados realizando-se o método de acordo com a presente invenção, induzem uma forte produção de anticorpos neutralizantes anti-TNFa, especificamente do Isótipo IgG, em macacos Rhesus, o que mostra que estes produtos imunogênicos estáveis são capazes de romper a tolerância imunológica para proteínas endogenamente produzidas e induzir uma vacinação eficaz, resultando em neutralização do TNFa, vacinação esta capaz de evitar efeitos deletérios de super-produção de TNFa em todas situações patológicas em que TNFa está envolvido.

Foi ainda mostrado que os produtos imunogênicos estáveis, preparados realizando-se o método de acordo com a presente invenção são capazes de eficazmente vacinar mamíferos contra artrite induzida por TNFa. Outrossim, foi mostrado que estes produtos imunogênicos estáveis são capazes de evitar e/ou tratar sinovite inflamatória de artrite induzida por TNFa e destruição articular, quando usados sozinhos, sem necessidade de complementar o tratamento preventivo ou curativo com qualquer ingrediente ativo anti-artrite adicional, como metotrexato.

Foi também mostrado que os produtos imunogênicos estáveis, preparados de acordo com o método da invenção, eram capazes de evitar e/ou tratar choque letal causado por superprodução de TNFa. Assim, os produtos imunogênicos estáveis, preparados de acordo com a presente invenção, induzem uma proteção auto-imune anti- TNFa contra patologias dependentes de TNFa agudas e crônicas, sem efeitos colaterais detectáveis.

Sem desejarmos ficar presos a qualquer teoria particular, o

Requerente acredita que a combinação específica das etapas a) a h) permite preservar a conformação espacial do produto de partida de TNFa, enquanto aumentando a exposição dos epítopos antigênicos principais do TNFa ao solvente, a fim de maximizar uma apresentação eficiente do antígeno de TNFa às células imunocompetentes, quando o produto imunogênico estável é administrado a um mamífero.

Sem desejarmos ficar presos a qualquer teoria particular, o Requerente também acredita que a combinação específica de etapas a) a h) permite tanto uma melhor estabilização estrutural como química do produto imunogênico final, quando TNFa e KLH são usados, do que o método descrito no pedido PCT No. WO 2004/024189. Tais aspectos específicos dos produtos imunogênicos estáveis resultantes, obtidos pelo método, devem permitir a preparação de composições de vacina que são também muito estáveis durante um longo período de tempo de armazenagem.

Além disso, verificou-se que o método da invenção permite a preparação de um produto imunogênico estável final que é dotado de atividade biológica residual do produto de partida de TNFa. Notavelmente, foi constatado que a ED50 do produto de partida de TNFa era de cerca de 10 pg/ml da invenção. O produto imunogênico estável final, obtido pelo método da invenção, tem um valor ED50 de mais do que 50 ng/ml e, mesmo na maioria dos casos, mais do que 400 ng/ml. Ao mesmo tempo, o produto imunogênico estável final é dotado de uma elevada imunogenicidade.

Além disso, foi mostrado que o produto imunogênico obtido pelo método de acordo com a presente invenção tem preservado a principal conformação do TNFa nativo, uma vez que o dito produto imunogênico ainda se liga aos receptores de TNFa Rl e R2, apesar de sua inativação biológica.

Na etapa a), o TNFa consiste de um TNFa nativo, selecionado do grupo consistindo de TNFa de camundongo, TNFa de rato, TNFa de coelho e TNFa humano. Preferivelmente, o TNFa consiste de TNFa humano.

Em certas formas de realização do método de acordo com a presente invenção, a etapa b) compreende as seguintes etapas:

bl) adição de EDTA a dita solução líquida contendo TNFa da etapa a); e

b2) adição de DMSO à solução líquida obtida no final da etapa

bl).

Foi verificado, de acordo com a presente invenção, que a adição de DMSO na etapa b2) aumentava a imunogenicidade do produto imunogênico estável final.

Em certas formas de realização do método, a etapa d) compreende as seguintes etapas:

dl) adicionar glutaraldeído à mistura líquida obtida no fim da etapa c), a fim de parcial e covalentemente conjugar moléculas de TNFa com dita proteína veículo e obter heterocomplexos entre TNFa e dita proteína veículo; e

d2) adicionar EDTA aos heterocomplexos entre TNFa e dita proteína veículo obtida no final da etapa dl).

Assim, no final da etapa dl), é obtida uma solução líquida, contendo um produto que compreende moléculas de TNFa, são ligadas às moléculas veículo (i) parcialmente por ligações covalentes e (ii) parcialmente por ligações não-covalentes.

O método de acordo com a presente invenção compreende a etapa h) para remover formaldeído e o reagente de bloqueio da solução obtida no final da etapa g), a fim de obter-se um produto imunogênico estável purificado, compreendendo heterocomplexos entre TNFa e dita proteína veículo.

No final da etapa h), o produto imunogênico estável é obtido sob a forma de uma solução líquida incolor translúcida, que é praticamente livre de quaisquer partículas visíveis.

Em certas formas de realização, dito método pode também compreender uma outra etapa i) de congelar a solução obtida no final da etapa h).

Em certas outras formas de realização, dito método pode também compreender uma outra etapa i) de liofilizar a solução obtida no fim da etapa h), a fim de obter-se um pó branco que pode ser armazenado por um longo período de tempo antes do uso.

Em formas de realização preferidas da etapa a), faixas de concentração de TNFa de 0,1 mg/ml a 50 mg/ml e, mesmo mais preferivelmente, faixas de 0,5 mg/ml a 10 mg/ml.

Em formas de realização preferidas da etapa b), faixas de concentração de 1 mM a 500 mM e, muitíssimo preferivelmente, de 1 mM a 10 mM.

Vantajosamente, EDTA é adicionado como uma solução tampão, tendo um pH variando de 7 a 8,5, mais preferivelmente de 7,5 a 8,1.

Em formas de realização preferidas da etapa b2), a concentração de DMSO final varia de 0,5% v/v a 20% v/v, muitíssimo preferivelmente de 5% v/v a 20% v/v.

Vantajosamente, a etapa b2) é realizada por um período de tempo variando de 10 min a 50 min, mais preferivelmente de 20 min a 40 min.

Nas formas de realização preferidas da etapa c), a relação molar de TNFa para dita proteína veículo varia de 5:1 a 100:1 e, mesmo mais preferivelmente varia de 20:1 a 80:1. Nas formas de realização mais preferidas da etapa c), a relação molar de TNFa para dita proteína veículo varia de 30:1 a 70:1 ou de 40:1 a 60:1.

Nas formas de realização da etapa d), faixas de concentração de glutaraldeído finais de 0,05% p/p a 0,5% p/p. Uma concentração final de glutaraldeído variando de 0,02 M a 0,03 M é adequada, com a concentração de glutaraldeído final mais preferida consistindo de 0,025 M.

Vantajosamente, a etapa d2) é realizada por um período de tempo variando de 30 min a 60 min, mais preferivelmente de 40 min a 50 min.

Em formas de realização preferidas da etapa d2), a concentração final de EDTA varia de 1 mM a 10 mM.

Em formas de realização preferidas da etapa e), o glutaraldeído é removido realizando-se uma diálise, por realização e ultrafiltragem com diafiltragem ou realizando-se filtragem de fluxo tangencial (TFF).

Quando diálise é realizada, uma membrana de diálise com um limiar de corte de 6 - 8 KDa é preferivelmente usada.

A etapa de diálise preferivelmente compreende três etapas, incluindo (i) as duas primeiras etapas realizadas com o tampão de trabalho (Fosfato 100 mM, NaCl 150 mM pH 7,8, EDTA 5 mM) e (ii) a última etapa realizada com PB S.

Usualmente, a etapa de diálise é realizada com uma solução tampão convencional, tal como uma solução salina tampão de fosfato (PBS), contra 200 a 400 vezes o volume da solução líquida contendo os heterocomplexos entre TNFa e a proteína veículo, em que as moléculas de TNFa são parcial e covalentemente conjugadas com a proteína veículo que é usada.

Quando ultrafiltragem com diafiltragem é realizada, uma membrana de filtragem com um limiar de corte de 10.000 KDa é preferivelmente usada, sendo entendido que os heterocomplexos entre TNFa e a proteína veículo são encontrados no retido de ultrafiltragem. Usualmente, o líquido usado para diafiltragem consiste de uma solução tampão, tal como uma solução salina de tampão de fosfato (PBS). Usualmente, a diafiltragem é realizada 3 vezes com um volume igual de tampão.

Em formas de realização preferidas da etapa f), a concentração final de formaldeído varia de 1% p/p a 10% p/p e, mesmo mais preferivelmente varia de 2% p/p a 5% p/p.

Na etapa f), a presença de formaldeído é mantida durante um período de tempo variando de 96 horas a 192 horas.

Verificou-se, de acordo com a presente invenção, que a manutenção da presença de formaldeído com os heterocomplexos por um período de tempo menor do que 96 horas resultou em um composto imunogênico que era significativamente menos estável com o tempo, quando comparado com um composto imunogênico estável, obtido de acordo com as formas de realização preferidas do método de acordo com a presente invenção.

Por outro lado, verificou-se de acordo com a presente invenção que, mantendo-se a presença de formaldeído com os heterocomplexos por um período de tempo de mais do que 192 horas, resultava em um composto imunogênico final que era altamente estável, mas com uma capacidade significativamente diminuída para induzir anticorpos tendo uma elevada atividade neutralizante contra TNFa nativo.

Mais preferivelmente, na etapa f), a presença de formaldeído é mantida durante um período de tempo variando de 120 horas a 168 horas.

Muitíssimo preferivelmente, na etapa f), a presença de formaldeído é mantida durante um período de tempo variando de 130 horas a 150 horas.

Vantajosamente, a etapa f) é realizada em uma temperatura variando de 30 °C a 42 °C, mais preferivelmente de 35 0C a 39 °C.

Na etapa g), o reagente que bloqueia a reação das moléculas de proteína com formaldeído pode consistir de qualquer composto adequado, compreendendo pelo menos um grupo amino e que parará a reação química das moléculas de proteína com formaldeído.

Em certas formas de realização preferidas, o dito reagente de bloqueio consiste de glicina.

Em formas de realização preferidas da etapa g), a concentração final de glicina varia de 0,01 M a 10 M e, mesmo mais preferivelmente, varia de 0,05 M a 2 M.

Em certas formas de realização preferidas da etapa g), o dito reagente de bloqueio consiste de lisina.

Em formas de realização preferidas da etapa g), a concentração final de lisina varia de 0,01 Ma 10 M, preferivelmente de 0,05 M a 2 M e, muitíssimo preferivelmente, de 0,05 M a 0,5 M.

Em formas de realização preferidas, as moléculas de proteína são trazidas em contato com a lisina durante um período de tempo de incubação de 1 hora a 10 dias e, muitíssimo preferivelmente, de 5 dias a 10 dias.

Um período de tempo de incubação com lisina de mais do que 3 dias e, muitíssimo preferivelmente, de pelo menos 5 dias, resulta em uma irreversibilidade ótima da estrutura química do produto final e contribui para suas boas imunogenicidade e estabilidade.

Vantajosamente, quando realizando a etapa h), o pH da solução líquida é ajustado a um pH variando de 6,8 a 7,8, mais preferivelmente de 7,0 a 7,6, por exemplo, utilizando-se uma base tal como NaOH.

Em formas de realização preferidas da etapa h), formaldeído e o reagente de bloqueio são removidos realizando-se uma diálise, realizando-se uma ultrafiltragem com diafiltragem ou realizando-se filtragem de fluxo tangencial TFF).

As condições para diálise, ultrafiltragem com diafiltragem ou filtragem de fluxo tangencial (TFF) que são usadas na etapa h) são usualmente as mesmas que aquelas anteriormente definidas para a etapa e) acima ou como descrito nos exemplos aqui.

As expressões "proteína veículo" ou "molécula de proteína veículo" são usadas aqui de acordo com seu significado convencional para uma pessoa hábil na técnica, isto é, uma proteína que, quando acoplada a uma molécula antigênica, incluindo uma molécula de hapteno, possibilita a indução de uma resposta imune em um organismo hospedeiro contra a dita molécula antígena, especificamente em mamíferos, incluindo humanos. Como aqui usada, a resposta imune abrange a produção de anticorpos dirigidos contra a dita molécula antigênica.

De acordo com o método da invenção, uma larga diversidade de proteínas veículo, conhecidas de uma pessoa hábil na técnica, pode ser usada na etapa c). A proteína veículo deve conter suficiente epítopos de célula-T auxiliar, a fim de ativar as células auxiliar-T e B e induzir estas células para liberar suficiente IL-1 e IL-2 para induzir a expansão dos clones de célula B que produzirão os anticorpos anti-TNFα neutralizantes.

Uma "molécula de proteína veículo", incluída no produto imunogênico estável da invenção, significa qualquer proteína ou peptídeo tendo o comprimento de pelo menos 15 amino ácidos, qualquer que seja sua seqüência amino ácida, e que, quando parcial e covalentemente associada com as moléculas de TNFα para formar heterocomplexos de proteína compondo o produto imunogênico da invenção, permite que um grande número de moléculas de TNFα seja apresentado aos linfócitos B.

De acordo com um primeiro aspecto, a molécula de proteína veículo consiste de uma proteína ou um peptídeo tendo o comprimento de pelo menos 15 amino ácidos ou também um oligômero de tal peptídeo, compreendendo um ou mais epítopos T auxiliares ("auxiliar") capaz de ativar os linfócitos T auxiliares ("auxiliar T") do organismo hospedeiro, para produzir citocinas, incluindo interleucina 2, tais citocinas, por sua vez, ativando e induzindo a proliferação dos linfócitos B que, após maturação, produzirão anticorpos criados contra TNFa.

A molécula de proteína veículo poderia também consistir de um homo-oligômero ou um homo-polímero da proteína nativa, de que é derivada, bem como um homo-oligômero ou um homo-polímero de um fragmento de peptídeo da proteína nativa, de que é derivada. A proteína antigênica de interesse poderia também consistir de um hetero-oligômero ou um hetero-polímero, compreendendo uma combinação de diversos fragmentos de peptídeo distintos, inicialmente incluídos na proteína nativa de que é derivada.

Exemplos de veículos de proteína que podem ser usados quando realizando o método de acordo com a presente invenção incluem os toxóides da difteria e tétano (DT, DT CRM197, outros mutantes DT, p.ex., posição Glu-148 etc. [vide, p. ex., Patente U.S. No. 4.709.017, WO 93/25210, WO 95/33481 etc.] e TT (e fragmento C de TT), respectivamente), hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), OMPC de N. meningitides e o derivado de proteína purificado da Tuberculina (PPD).

A função do veículo é fornecer ajuda da citocina a fim de aumentar a resposta imune contra TNFa. Uma lista não-exaustiva de veículos que podem ser usados na presente invenção inclui: hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH, albuminas de soro, tais como albumina de soro bovino (BSA), toxinas bacterianas inativadas, tais como toxinas do tétano ou difteria (TT e DT) ou seus fragmentos recombinantes (por exemplo, Domínio 1 do Fragmento C de TT ou o domínio de translocação de DT) ou o derivado de proteína purificado da tuberculina (PPD). Em uma forma de realização do método, o veículo é Proteína D da Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1). A proteína D é uma proteína de ligação IgD da Haemophilus influenzae e foi patenteada por Forsgren (WO 91/18926, EP O 594 610 Bl concedida). Em algumas circunstâncias, por exemplo, em sistemas de expressão de imunogene recombinante, pode ser desejável utilizarem-se fragmentos de proteína D, por exemplo, Proteína D l/3.sup.rd (compreendendo o terminal-N 100 - 110 amino ácidos da proteína D (WO 99/103375; WO 00/50077)).

Assim, nas formas de realização preferidas do método, dita proteína veículo é selecionada do grupo consistindo de toxóide de difteria (DT) e seus mutantes. O toxóide do tétano (TT), hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) e o derivado de proteína purificada da Tuberculina (PPD), OMPC de N. meningitidis, o derivado de proteína purificada da Tuberculina (PPD), albumina de soro bovino (BSA) e Proteína D da Haemophilus influenzae.

Muitíssimo preferivelmente, dita proteína veículo consiste de hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH).

A presente invenção também refere-se a um método para preparar uma composição de vacina compreendendo as etapas de:

a) preparar um produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa pela realização do método como definido acima; e

b) combinar dito produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa, preparados na etapa a) com um ou mais imunoadjuvantes.

Como mostrado nos exemplos aqui, o produto imunogênico estável, que pode também ser denominado aqui o produto imunogênico anti- TNFa, que consiste do produto final obtido pelo método de acordo com a presente invenção, possui propriedades físico-químicas e biológicas específicas.

Geralmente, o produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção possui um peso molecular variando de 50 kDa e 8000 kDa (8 MDa), com cerca de 30% da quantidade de proteína total tendo um pelo menos menor do que 1000 kDa (IMDa).

Além disso, o produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção exibe uma relação molar de TNFa para dita proteína veículo variando de 40:1 a 60:1.

Adicionalmente, um produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção, quando incubado sob condições desnaturantes em que ligações não-covalentes são removidas, como em um tampão contendo-SDS, gera mais do que uma produto de proteína, que ilustra as moléculas de TNFa e as moléculas de proteína veículo compreendidas nelas, são, pelo menos parcialmente, ligadas entre si por ligações não- covalentes, p. ex., ligações fracas abrangendo interações iônicas, ligações hidrogênio e ligações Van de Waals.

Outrossim, foi verificado que, em um produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção, as ligações covalentes entre as moléculas de TNFa e as moléculas de proteína veículo sempre representa menos do que 40$ das ligações totais entre estas moléculas, uma vez que sempre mais do que 60% do conteúdo de moléculas de TNFa do dito produto imunogênico anti-TNFa são liberados como moléculas não-ligadas à proteína veículo sob condições desnaturantes.

Como mostrado nos exemplos aqui, incluindo o Exemplo 8, um produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção compreende pelo menos as seguintes espécies de proteína:

moléculas TNFa covalentemente ligadas a moléculas de proteína veículo; e

moléculas que são ligadas por ligações não-covalentes, incluindo:

monômeros de moléculas de TNFα; dímeros de moléculas de TNFα; trímeros de moléculas de TNFα;

polímeros de dímeros e/ou trímeros de moléculas de TNFα;

monômeros de moléculas de proteína veículo; e polímeros de moléculas de proteína veículo. Importantemente, o produto imunogênico anti-TNFα de acordo com a presente invenção induz a produção de anticorpos anti-TNFα, tendo uma capacidade de neutralização de TNFα (NC50) além de 1/1000.

A capacidade de neutralização de TNFα consiste da diluição de soro que neutraliza 50% da atividade citotóxica do TNFα. Esta característica biológica de um produto imunogênico anti-TNFα de acordo com a presente invenção é fácil, direta e confiavelmente avaliada por uma pessoa hábil na técnica empregando as técnicas convencionais que são descritas nos exemplos e que são também detalhadas ainda no presente relatório.

O valor NC5O do produto imunogênico anti-TNFα da invenção é claramente distinto do valor NC5O encontrado para o produto imunogênico estável, preparado acordo com o método descrito no pedido PCT no. WO 2004/024189, anterior.

A comparação entre os valores NC50 de um produto imunogênico anti-TNFα, em que a proteína veículo consiste de KLH, é detalhada nos exemplos aqui, notavelmente na Tabela 3.

O produto imunogênico TNFα-KLH de acordo com a presente invenção consiste da batelada referida como "K7", enquanto que o correspondente produto imunogênico estável, preparado de acordo com o método descrito no pedido PCT anterior no. WO 2004/024189, consiste da batelada referida como "K10", como encontrado na Tabela 3.

Como mostrado na Tabela 3, o valor NC50, encontrado para o produto imunogênico estável, preparado acordo com o método descrito no pedido PCT No. WO 2004/024189 anterior, é de 1/700. O valor NC50 encontrado para o produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção é 1/1200, assim aproximadamente metade do valor NC50 encontrado para o produto da técnica anterior.

Esta melhor capacidade de neutralização de TNFa do produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção é fornecida ao produto final pela combinação específica de características do método de acordo com a presente invenção, incluindo o uso de EDTA na etapa b), e a manutenção da presença de formaldeído por um período de tempo variando de 96 horas a 192 horas na etapa f).

Particularmente, como mostrado na Tabela 3 aqui, a manutenção da presença de formaldeído por um período de tempo variando de 96 horas a 192 horas na etapa f) é determinante para obter-se um produto imunogênico anti-TNFa final, dotado dos melhores baixos valores de NC50-

Além disso, como mostrado na Tabela 3 aqui, mantendo-se a presença de formaldeído por um período de tempo variando de 96 horas a 192 horas na etapa f), permite-se também obter um produto imunogênico anti- TNFa final em que a atividade citotóxica de TNFa foi quase completamente bloqueada, com valores ED50 (Dose Eficaz50) de mais do que 50 ng/ml, preferivelmente de mais do que 400 ng/ml e, às vezes, pelo menos até 10 pg/ml.

A avaliação do valor da capacidade neutralizante NC50 de TNFa de um produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção é descrita em detalhe no Exemplo 3 e é resumidamente detalhada abaixo.

Um método típico direta e confiavelmente utilizável por uma pessoa hábil na técnica para medir o valor da capacidade de neutralização (NC50) de TNFa de um produto imunogênico anti-TNFa compreende as seguintes etapas:

a) administrar em camundongos uma combinação do produto imunogênico anti-TNFa a ser testada e adjuvante de Freund completo (CFA), via a rota intramuscular;

b) no dia 21 após a etapa a), administrar aos mesmos camundongos uma combinação do produto imunogênico anti-TNFa a ser testado em adjuvante de Freund incompleto (IFA), via a rota intramuscular;

c) no dia 28, após a etapa a), coletar amostras de sangue de cada camundongo tratado nas etapas a) e b) acima;

d) determinar que diluição dos soros originando-se das amostras de sangue coletadas na etapa c) inibe 50% da atividade citotóxica de uma quantidade padrão de TNFa.

Para executar o método de avaliação do valor NC5O acima, a atividade citotóxica de TNFa é medida de acordo com o teste de citotoxicidade convencional, empregando-se a linhagem de célula L929. Preferivelmente, a quantidade padrão de TNFa é de 20 ng/ml de concentração nas culturas de célula L929.

Como descrito nos exemplos aqui e especificamente na Tabela 3 aqui, o valor ED50 consiste da concentração final de um produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção, que induz 50% de citotoxicidade no teste de citotoxicidade de célula L929 convencional.

Foi verificado que outra característica que distingue um produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção do produto imunogênico estável descrito no pedido PCT No. WO 2004/024189 consiste de ED50, que é mais do que 50 ng/ml e mesmo mais do que 400 ng/ml e, às vezes, até 10 pg/ml, enquanto que uma ED50 de cerca de 15 ng/ml foi constatada para o produto da técnica anterior. Sem desejarmos ficar presos a qualquer teoria particular, o requerente acredita que as melhores propriedades biológicas, incluindo a falta de atividade TNF bem como elevada imunogenicidade, do produto imunogênico anti-TNFa, obtido pelo método de acordo com a presente invenção, ilustra que o produto imunogênico anti-TNFa de acordo com a presente invenção é estruturalmente distinto dos produtos imunogênicos estáveis descritos no pedido PCT No. WO 2004/024189, embora mudanças estruturais específicas não possam ser facilmente detectáveis.

Esta invenção também pertence a um produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo que tem uma ou mais das seguintes características técnicas:

(i) ela compreende (1) moléculas de TNFa e (2) moléculas de proteína veículo que são ligadas entre si (a) por menos do que 40% de ligações covalentes e (b) por mais do que 60% de ligações covalentes;

(ii) exibe uma relação molar de TNFa para dita proteína veículo variando de 40:1 a 60:1.

(iii)induz a produção de anticorpos anti-TNFa, tendo uma capacidade de neutralização de TNFa (NC5o) menor do que 1/1000; e

(iv) possui um valor ED50 de mais do que 50 ng/ml e mesmo mais do que 400 ng/ml, no teste de citotoxicidade de célula L929.

(v) possui um peso molecular variando de 50 kDa a 8000 kDa (8 MDa), com cerca de 30% da quantidade de proteína total tendo um peso molecular menor do que 1000 kDa (IMDa).

Notavelmente, a presente invenção refere-se a um produto imunogênico anti-TNFa tendo as características (i) a (iv) acima.

Em certas formas de realização, a proteína veículo consiste de KLH.

A percentagem das moléculas de proteína veículo e das proteínas TNFa de interesse ligadas entre si através de ligações covalentes em um produto imunogênico da invenção, pode ser facilmente verificada por uma pessoa da técnica.

Por exemplo, a determinação da percentagem de moléculas de TNFa ligadas às moléculas de proteína veículo através de uma ligação covalente de um produto imunogênico da invenção poderia ser feita utilizando-se as seguintes etapas de:

(i) submeter dito produto imunogênico em solução para desnaturar e reduzir as condições;

(ii) realizar uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho com o produto como obtido no final da etapa (ii), durante a qual os vários componentes de proteína com massa molecular decrescente são

sucessivamente eluídos do suporte de cromatografia de exclusão de tamanho;

(iii) medir a quantidade de moléculas de TNFa ligadas através de uma ligação covalente à molécula veículo na fração de eluído contendo os componentes protéicos com a mais elevada massa molecular;

(iv) comparar a quantidade de TNFa medida na etapa (iii) com a quantidade total de TNFa inicialmente incluído no produto imunogênico de partida.

Na etapa (i) do método para determinar a percentagem de ligação covalente acima descrita, a incubação de uma dada quantidade (em número de moles ou em peso) do produto imunogênico da invenção, sob condições desnaturantes e redutoras, resulta em uma disassociação das fracas ligações entre os vários componentes de proteína não ligados entre si através de uma ligação covalente.

Entre as condições desnaturantes preferidas há a presença de uréia, por exemplo, na concentração 8M final, ou a presença de SDS, por exemplo, na concentração final de 1% do peso total da solução contendo o produto imunogênico. Entre as condições redutoras preferidas há a presença de β-mercaptoetanol, por exemplo, na concentração final de 5% do volume total da solução contendo o produto imunogênico.

Na etapa (ii) do método para determinar a percentagem das moléculas de TNFa e moléculas de proteína veículo ligadas entre si através de ligações covalentes, o suporte de cromatografia de exclusão de tamanho é selecionado pela pessoa da técnica de acordo com seu conhecimento geral. Por exemplo, a pessoa da técnica poderia fazer uso de suportes cromatográficos como comercializados pela Pharmacia Corporation sob as marcas comerciais "Superdex 75™, Superdex 200™ e Superdex 400™".

Na etapa (ii), a fração molecular, correspondendo à molécula veículo covalentemente ligada às moléculas de TNFa, é eluída primeiro, antes das frações de eluído contendo o antígeno de interesse sob uma forma livre. A quantidade de TNFa sendo eluída sob uma forma livre corresponde à fração do antígeno de interesse, que não foi covalentemente ligado à molécula veículo, dentro do produto imunogênico de partida. E sobre a fração de proteína de elevada massa molecular que ocorre a medição da quantidade de TNFa covalentemente ligada à molécula de proteína veículo, por exemplo, em um teste de imuno-enzima, em um teste radioimunológico ou em um teste de imunofluorescência, direto ou indireto ("sanduíche"), empregando-se anticorpos específicos para TNFa e que não têm qualquer reação imunológica cruzada com a molécula de proteína veículo.

Na etapa (iii), a quantidade de TNFa covalentemente ligada com a molécula de proteína veículo, sendo medida como acima descrito, é comparada com a quantidade inicial de TNFa sendo incluída na dada quantidade (em número de moles ou em peso) do produto imunogênico de partida e a percentagem de TNFa é desse modo calculada, que é covalentemente ligada à molécula de proteína veículo, no produto imunogênico da invenção.

A percentagem de moléculas de proteína veículo e de TNFa ligado entre si através de ligações covalentes de um produto imunogênico da invenção, de um produto imunogênico da invenção, pode ser facilmente verificada pela pessoa da técnica, fazendo uso de um segundo método compreendendo as seguintes etapas de:

a) imobilizar em um suporte anticorpos especificamente cultivados em contato com a proteína veículo;

b) trazer em contato os anticorpos cultivados em contato com a proteína veículo, que foram imobilizados no suporte da etapa a), com uma quantidade conhecida de moléculas do produto imunogênico a ser testado, compreendendo dita proteína veículo e TNFa;

c) remover as moléculas do produto imunogênico que não

são ligadas aos anticorpos anti-proteína veículo imobilizados na etapa a), por meio de uma solução aquosa tamponante, compreendendo um ou mais agentes desnaturantes de proteína;

d) dl) trazer em contato (i) complexos imunogênicos formados na etapa c) entre os anticorpos anti-proteína veículo imobilizados e

as moléculas do produto imunogênico com (ii) anticorpos especificamente cultivados em contato com a proteína veículo;

d2) separadamente da etapa dl), trazer em contato os complexos imunogênicos formados na etapa c), entre os anticorpos anti- proteína veículo imobilizados e as moléculas do produto imunogênico, com (ii) anticorpos especificamente cultivados em contato com TNFa;

e) el) quantificar os anticorpos adicionados na etapa dl) tendo estado ligados à proteína veículo;

e2) quantificar os anticorpos adicionados na etapa d2) tendo estado ligados ao TNFa;

f) calcular a relação entre:

(i) a quantidade de anticorpos ligados a anti-proteína veículo, medida na etapa el: e

(ii) a quantidade de anticorpos ligados anti-TNFa, medidos na etapa e2),

dita relação consistindo da proporção de moléculas de proteína veículo e moléculas de TNFα sendo ligadas entre si através de ligações covalentes, dentro do produto imunogênico de partida.

Na etapa c) do método acima descrito, o uso de uma solução de lavagem aquosa, contendo um ou mais agentes desnaturantes de proteína resulta em uma desnaturação do produto imunogênico ligado aos anticorpos anti-proteína veículo, resultando na liberação, na solução de lavagem, de moléculas de TNFa que não são covalentemente ligadas às moléculas de proteína veículo. Portanto, na etapa d2) do método, somente as moléculas de TNFa sendo covalentemente ligadas as moléculas de proteína veículo são quantificadas.

Preferivelmente, a solução tampão desnaturante usada na etapa c) contém um tensoativo tal como Tween®20, em uma concentração final de 0,1% v/v.

Nas etapas dl) e d2), as quantidades de anticorpos ligados são preferivelmente medidas através da incubação de complexos antígeno- anticorpos formados no final de cada uma de ditas etapas com um novo anticorpo sendo rotulado através de uma molécula detectável, respectivamente:

(i) na etapa dl), um novo anticorpo dirigido contra um anticorpo anti-proteína veículo e rotulado com uma molécula detectável;

(ii) na etapa d2), um novo anticorpo dirigido contra um anticorpo anti-TNFα e rotulado com uma molécula detectável.

A molécula detectável é indiscriminadamente uma molécula radioativa, uma molécula fluorescente ou uma enzima. Como uma enzima, peroxidase poderia mais particularmente ser usada, sua presença sendo revelada através de colorimetria, após incubação com o substrato orto- fenilenodiamina (OPD). Um protocolo detalhado do método acima mencionado é descrito nos exemplos.

Por meio de ilustração, foi mostrado, de acordo com a invenção, utilizando-se o primeiro ou o segundo método de quantificação descritos acima, que: no produto imunogênico compreendendo heterocomplexos entre a molécula veículo KLH e moléculas de TNFa humanas, menos do que 40% das moléculas de TNFa são covalentemente ligadas à molécula de proteína veículo KLH.

Para preparar uma composição imunogênica ou uma composição de vacina da invenção, o produto imunogênico estável, obtido pelo método de acordo com a presente invenção, é ajustado a uma concentração apropriada, opcionalmente combinada com um adjuvante de vacina adequado, e embalado para uso.

Esta invenção também pertence a uma composição imunogênica compreendendo (i) um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo, preparada pelo método aqui descrito ou (ii) um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo descrita acima, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Esta invenção também refere-se a uma composição de vacina compreendendo (i) um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo preparada pelo método aqui descrito ou (ii) um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo descrita acima, em combinação com um ou mais imunoadjuvantes.

Como aqui usado, o termo "adjuvante" refere-se a seu sentido comum de qualquer substância que aumente a resposta imune a um antígeno com que seja misturada. Adjuvantes úteis na presente invenção incluem mas não são limitados a géis minerais de Freund, tais como hidróxido de alumínio e substâncias tensoativas, tais como lisolectina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina de lapa burato de fechadura e dinitrofenol. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são adjuvantes potencialmente úteis.

Qualquer adjuvante conhecido na técnica pode ser usado na composição de vacina acima, incluindo adjuvantes baseados em óleo, tais como adjuvante completo de Freund e adjuvante incompleto de Freund, adjuvantes baseados em micolato (p. ex., dimicolato de trealose), lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), peptidoglicanos (isto é, mureínas, mucopeptídeos ou glicoproteínas, tais como N-Opaca, muramil dipeptídeo [MDP] ou análogos MDP), proteoglicanos (p. ex., extrato de Klebsiella pneumoniae), preparações estreptococais (p. ex., LK432), Biostim.TM. (p. ex., 01K2), os "iscons" da EP 109 942, EP 180 564 e EP 231 039, hidróxido de alumínio, saponina, DEAE-dextrano, óleos neutros (tais como migliol), óleos vegetais (tais como óleo de amendoim), lipossomas, polióis Pluronic.RTM, o sistema adjuvante Ribi (vide, por exemplo, GB-A-2 189 141) ou as interleucinas, particularmente aquelas que estimulam a imunidade mediada por célula. Um adjuvante alternativo, consistindo de extratos de Amycolata, um gênero bacteriano da ordem Actinomycetales, foi descrito na Patente U.S. No. 4.877.612. Adicionalmente, misturas adjuvantes patenteadas são comercialmente disponíveis. O adjuvante usado dependerá, em parte, do organismo receptor. A quantidade de adjuvante para administrar dependerá do tipo e tamanho do animal. Dosagens ótimas podem ser prontamente determinadas por métodos de rotina.

Adjuvantes adequados incluem mas não são limitados a tensoativos, p. ex., hexadecilamina, octadecilamina, lisolectina, brometo de dimetildioctaecilamônio, N,N-dioctadecil-N'-N-bis(2-hidroxietil-propano diamina), metoxiexadecil-glicerol e polióis plurônicos; poliânions, p.ex., pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; peptídeos, p.ex., dipeptídeo de muramila, MPL, aimetilglicina, tuftsina, emulsões oleosas, alume, e suas misturas. Outros adjuvantes potenciais incluem as subunidades de peptídeo B da taxila instável ao calor E. coli ou do toxina de cólera. McGhee, J. R. et al., "On vaccine development", Sem. Hematol., 30:3- 15 (1993).

As propriedades adjuvantes da saponina é conhecida há muito, visto ter capacidade de aumentar títulos de anticorpo em imunogenes. Como aqui usado, o termo "saponina" refere-se a um grupo de glicosídeos tensoativos de origem vegetal, composto de uma região hidrofílica (usualmente diversas cadeias de açúcar) em associação com uma região hidrofóbica de estrutura esteróide ou triterpenóide. Embora a saponina seja disponível de numerosas diversas fontes, as saponinas com atividade adjuvante útil têm sido derivadas da South American tree Quillaja saponaria (Molina). A saponina desta fonte foi usada para isolar uma fração "homogênea" indicada "Quil A" (Dalsgaard, K., (1974), Arch. Gesamte Virusforsch. 44:243).

A reatividade do sítio de dose é um problema principal para uso tanto veterinário como humano de Quil A em preparações de vacina. Uma maneira de evitar esta toxicidade de Quil é o uso de um complexo imunoestimulante (conhecido como ISCOM.T., uma abreviação para complexo imunoestimulante). Isto é principalmente porque Quil A é menos reativo quando incorporado dentro de complexos imunoestimulantes, porque sua associação com colesterol no complexo reduz sua capacidade de ligar-se ao colesterol em membranas celulares e, daí, seus efeitos líticos celulares. Além disso, uma menor quantidade de Quil A é necessária para gerar um nível similar de efeito adjuvante.

As propriedades imunomoduladoras das saponinas Quil A e os benefícios adicionados a serem derivados destas saponinas, quando elas são incorporadas dentro de um complexo imunoestimulante, foram descritas em várias publicações, p. ex., Cox e Cox, J. C. e Coulter, A. R. Advances in Adjuvant Technology and Application em Animal Parasite Control Utilising Biotechnology, Capítulo 4, Editor Young, W. K. CRC Press (1992); Cox, J.

C. e Coulter, A. R. (1997) BioDrugas 12(6):439 - 453); Dalsgaard, (1974) supra; Morein et al. (1989) "Immunostimulating complex (ISCOM)", em "Vaccines: Recent Trends and Progress". G. Gregoriadis, A. C. Allison and G. Pôster (Eds). Plenum Press, New York, p. 153; Especificações de Patente Australiana Nos. 558258, 589915, 590904 e 632067.

Os ISCOMs clássicos são formados por combinação de colesterol, saponina, fosfolipídeo e imunogenes, tais como proteínas de envelope viral. As composições de matriz ad ISCOM (conhecidas como ISCOMATRIX.TM) são formadas identicamente, porém sem proteínas virais. Os ISCOMs parecem estimular respostas imunes tanto humorais como celulares. Os ISCOMs têm sido produzidos com proteínas de vários vírus, incluindo HSV-1, CMV, EBV, vírus da hepatite B (HBV), vírus da raiva e vírus influenza, vide, por exemplo, I. G. Barr et al., Adv. Drug Delivery Reviews, 32:247-271 (1998). Foi observado que onde DNA ou polipeptídeos nus de agentes infecciosos são fracamente imunogênicos quando dados sozinhos, a inclusão dentro de ISCOMs tem aumentado sua imunogenicidade. Várias proteínas formuladas com ISCOMs mostraram induzir CTL, principalmente em modelos de roedores. Berzofsky, (1991), Biotechnol. Ther. 2:123-135; Hsu et al., (1996), Vaccine 14:1159-1166; Lipford et al., (1994), Vaccine 12:73- 80; Mowat et al., (1991), Immunology 72:317-322; Osterhaus et al., (1998), Dev. Biol. Stand. 92:49-58; Rimmelzwaan et al., (1997), J. Gen. Virol. 78 (pt.4):757-765; Sambhara et al., (1998), J. Infect. Dis. 177:1266- 1274; Sambhara et al., (1997), Mech. Aging Dev. 96:157-169; Sjolander et al., (1997), Vaccine 15:1030-1038; Sjolander et al., (1998), J. Leukoc. Biol. 64:713-723; Takahashi et al., (1990), Nature 344:873-875; Tarpey et al., (1996), Vaccine 14:230-236; Trudel et al., (1987), Vaeeine 10:107- 112; Versehoor et al., (1999), J. Virol. 73:3292-3300; Villacres-Eriksson, (1995), Clin. Exp. Immunol. 102:46-52; Zugel et al., (1995), Eur. J. Immunoll. 25:451-458.

A associação entre um produto imunogênico estável, obtido pelo método da invenção, e um adjuvante, pensa-se ser importante para indução ótima das respostas imunes. Numerosos estudos foram realizados que confirmam esta hipótese, incluindo trabalho com virossomas e ISCOMs.TM. (Ennis, F. A., Crux, J., Jameson, J., Klein, M., Burt, D. e Thipphawong, J. 1999. Virology 259: 256-261., Zurbriggen, R., Novak- Hofer, I., Seelig, A. and Gluck, R. (2000), Progress in lipid Research 39: 3-18., Voeten, J. T. M., Nieuwkoop, N. J., Lovgren-Bengtsson, K., Osterhaus, D. Μ. E. and Rimmelzwaan, G. F. 2000. Euro J Imm (Submetido)). Tipicamente, a associação entre ISCOM.TM e antígeno foi conseguida por incorporação de antígenos anfipáticos dentro da estrutura de ISCOM.TM durante a formação (Morein, B., B. Sundquist, S. Hoglund, K. Dalsgaard, e A. Osterhaus. 1984. Nature 308:457). A incorporação foi por interações hidrofóbicas. Mais recentemente, métodos para associar antígenos com um complexo imunoestimulante livre de proteína pré-formada (ISCOMATRIZ.TM), utilizando interações quelantes e eletrostáticas, foram desviados (International Patent Applications Nos. PCT/AU98/OOO8O-WO 98/36772, e PCT/AUOO/OOllO).

Em certas formas de realização de uma composição de vacina de acordo com a presente invenção, dita composição de vacina compreende, como excipientes farmacêuticos, um ou mais veículos orgânicos carregados. Exemplos de veículos orgânicos carregados, que são adjuvantes adequados para uso na presente invenção, incluem mas não são limitados a saponina, complexos de saponina, qualquer um ou mais componentes do complexo de saponina imunoestimulante, colesterol e lipídeo conhecido como ISCOMATRIX.TM (por exemplo, o componente saponina e/ou o componente fosfolipídeo, lipossomas ou emulsões de óleo em água (a composição e preparação de ISCOMATRIZ.TM. é descrita em detalhes no Pedido de Patente Internacional No. PCT/SE86/00480, Patentes Australianas números 558258 e 632067 e Publicação de Patente Européia No. 0 180 564, cujas descrições são incorporadas aqui por referência). Outros exemplos de adjuvantes incluem mas não são limitados àqueles detalhados nas publicações de Cox e Coulter, 1992, 1997 e 1999. Deve ser entendido que o veículo orgânico do assunto pode ser naturalmente ocorrente ou pode ser sintética ou recombinantemente derivado.

As composições de vacina podem também incluir ainda adjuvantes para aumentar a eficácia da composição. Adjuvantes adequados incluem mas não são limitados a: (1) sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio etc.; (2) formulações de emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como peptídeos de muramila (vide abaixo) ou componentes de parede de célula bacteriana), tais como, por exemplo, (a) MF59 (Publ. PCT No. WO 90/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE (vide abaixo), embora não necessário) formulados em partículas submicrônicas, (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado por plurônico, e thr-MDP (vide abaixo) microfluidizado em uma emulsão submicrônica ou vortexado para gerar uma emulsão de grande tamanho de partícula e (c) sistema adjuvante Ribi. TM. (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) contendo 2% de Esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo consistindo de monofosforilipídeo A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox. TM.); (3) adjuvantes de saponina, tais como Stimulon. TM. (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.); (4) adjuvante de Freund completo (CFA) e adjuvante de Freund incompleto (IFA); (5) citocinas, tais como interleucinas (p. ex., IL-I, IL-2, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-12, etc), interferons (e.g. interferon gama), fator estimulante de colônia de macrófago (M-CSF) etc.; (6) mutantes desentoxicantes de uma toxina ribosilante-ADP bacteriana, tal como uma toxina da cólera (CT), uma toxina pertussis (PT) ou uma toxina instável (LT) ao calor de E. coli, particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; vide, p. ex., WO 93/13302 e WO 92/19265; (7) outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes, para aumentar a eficácia da composição; e (8) micropartículas com macromoléculas adsorvidas, como descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US99/17308. Alume e MF59 são preferidos.

Como mencionado acima, peptídeos de muramila adequados incluem mas não são limitados a N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normauramil-L-alanil-D-isoglutamina (nem MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-s-n- glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE) etc.

Outros adjuvantes para induzir uma resposta mucosa ou uma sistêmica contra um composto imunogênico de acordo com a presente invenção podem ser aqueles que são descritos no livre de Vogel et al. (Vogel F. R., Powell M. F. e Alving C. R., "A compendium of vaccine adjuvants and excipients"; 2a. Edição; Vogel F. R. e Powell MF, 1995, "A summary compendium of vaccine adjuvants and excipients. In: Powell MF, Newman MJ eds. "Vaccine design: the subunit and adjuvant approach". New York: Plenum publishing, 1995: 141-228).)

Geralmente, os adjuvantes que podem ser compreendidos em uma composição de vacina de acordo com a presente invenção abrangem, sem limitação:

(i) Adjuvantes tipo-gel, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (Glenny AT et al., 1926; J Pathol Bacteriol; Vol. 29: 38 - 45; Gupta RK and Siber GR, 1994; Biologicals; Vol. 22: 53-63);

(ii) Adjuvantes microbianos, tais como:

- DNA CpG motifs (Chu RS et al., 199; J Exp Med; Vol. 186: 1623 - 1631); Monophosphoryl lipid A (Schneerson R et al., 1991; J Immunol; Vol. 147: 2136 - 2140); Cholera toxin (Holmgren J et al., 1993; Vaccine; Vol. 11: 1179-1184; Okahashi N et al., 1996; Infect lmmun; Vol. 64: 1516-1525);

- Toxina instável no calor E. coli (Lycke N et al., 1992; Eur J Immunol; Vol. 22: 2277-2281; de Haan L et al., 1996; Vaccine; Vol. 14: 260 - 266; Chong C et al., 1998. Vaccine; Vol. 16: 732 - 740);

- Toxina pertussis (Roberts M et al., 1995; Infect lmmun; Vol. 63: 2100 - 2108; Mu HH and Sewell WA, 1994; Immunology; Vol. 83: 639 - 645);

- Dipeptídeo de muranila (Ellouz F et al.; 1974; Biochem Biophys Res Commun; Vol. 59: 1317 - 1325); Cohen LY et al., 1996; Cell Immunol; Vol. 169: 75 - 84);

(iii) Adjuvantes baseados em emulsão de óleo e emulsificador, tais como:

- Adjuvante incompleto de Freund (Dhiman N et al., 1997; Med Microbiol Immunol (Berlin); Vol. 186: 45 - 51; Putkonen P et al., 1994; J Med Primatol; Vol. 23: 89 - 94);

- MF59 (Dupuis M et al., 1998; Cell Immunol; Vol. 186: 18 - 27; Kahn JO et al., 1994; J infect Dis; Vol. 170: 1288 - 1291; Ott G et al., 1995; Vaccine. Vol. 13: 1557 - 1562);

- SAF (Allison AC; 1998; Dev Biol Stand; Vol. 92: 3-11; Gupta RK et al., 1993; Vaccine; Vol. 11: 293 - 306; Byars NE et al., 1994; Vacine; Vol. 12: 200 - 209);

(iv) Adjuvantes particulados, tais como: - Complexos Imunoestimulatórios (ISCOMs) (Putkonen P et al., 1994; J Med Primatol; Vol. 23: 89 - 94; Gupta RK et al., 1993; Vaccine; Vol. 11: 293 - 306; Sjolander A et al., 1997; Cell Immunol; Vol. 177: 69 - 76);

- lipossomas (Richards RL et al., 1998; Infect Immun; Vol. 66: 2859 - 2865; Fernandes I et al., 1997; Mol Immunol; Vol. 34: 569 - 576);

- microesferas biodegradáveis (Men Y et al., 1996; Vaccine; Vol. 14: 1442 - 1450; Shahin R et al., 1995; Infect lmmun; Vol. 63: 1195 - 1200;

- saponinas (QS - 21) (Newman MJ et al., 1992; J Immunol; Vol. 148: 2357 - 2362; Neuzil KM et al., 1997; Vaccine. Vol. 15: 525 - 532);

(v) Adjuvantes sintéticos, tais como:

copolímeros em bloco não-iônicos (Hunter RL et al., 1994; AIDS Res Hum Retroviruses; Vol. 10 (Supl 2); S95 - S98; Newman MJ et al., 1997; Mech Ageing dev; Vol. 93: 189 - 203);

- análogos de peptídeo de muramila (Cohen LY et al., 1996; Cell Immunol; Vol. 169: 75 - 84; Fast DJ and Vosika GJ, 1997; Vaccine; Vol. 15: 1748 - 1752; Bahr GM et al., 1995; Int J Immunopharmacol; Vol. 17: 117-131);

- polifosfazeno (Payne LG et al., 1998; Vaccine; Vol. 16: 92 - 98); - synthetic polynucleotides (Johnson AG, 1994; Clin Microbiol Rev; Vol. 7: 277 - 289; Harrington DG et al., 1979; Infect Immun; Vol. 24: 160 - 166); and

(vi) citocinas tais como:

- IFN-γ (Odean MJ et al., 1990; Infect Imun; Vol. 58: 427 - 432);

- Interleucina-2 (Nunberg J et al., 1989; Proc Natl Acad Sci USA; Vol. 86: 4240 - 4243);

- Interleucina-12 (Luis C et al., 1994; Science; Vol. 263: 235 - 237; Bliss J et al., 1996; J Immunol; Vol. 156: 887 - 894; Jankovic D et al., 1997, J Immunol; Vol. 159: 2409 - 2417).

Um outro aspecto da presente invenção, portanto, refere-se ao uso de um produto imunogênico estável ou de uma composição de vacina, como definido acima, para induzir uma resposta imune em um mamífero, incluindo uma resposta imune humoral, em que os anticorpos neutralizam as propriedades imunossupressivas, apoptóticas ou angiogênicas da citocina nativa.

Um outro objetivo da invenção consiste de um método para induzir a produção de anticorpos que neutralizam a atividade do TNFa nativo em um mamífero, compreendendo uma etapa de administrar a dito mamífero (i) uma composição de vacina como descrito acima ou (ii) um produto imunogênico estável, compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e uma proteína veículo como descrito acima junto com um ou mais imunoadjuvantes.

As composições de vacina opcionalmente podem incluir diluentes líquidos, semi-sólidos ou sólidos farmaceuticamente aceitável (isto é, estéril e não-tóxico) compatíveis com vacina, que servem como veículos, excipientes ou meios farmacêuticos. Qualquer diluente conhecido na técnica pode ser usado. Diluentes exemplificativos incluem mas não são limitados a monolaurato de polioxietileno sorbitano, estearato de magnésio, metil e propilidroxibenzoato, talco, alginatos, amidos, lactose, sacarose, dextrose, sorbitol, manitol, goma arábica, fosfato de cálcio, óleo mineral, manteiga de cacau e óleo de teobroma.

Uma composição de vacina de acordo com a presente invenção pode também compreender ainda um ou mais veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, tais veículos incluindo qualquer veículo que não induza ele próprio a produção de uma resposta nociva para o indivíduo recebendo a composição. Veículos adequados são tipicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicóligos, amino ácidos poliméricos, copolímeros de amino ácido, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas de vírus inativo. Tais veículos são bem conhecidos daqueles hábeis na técnica.

As composições de vacina de acordo com a presente invenção podem tipicamente também conter diluentes, tais como água, solução salina, glicerol, etanol etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tamponantes de pH e similares, podem estar presentes nas composições.

Preparações adequadas das vacinas da presente invenção incluem injetáveis, soluções líquidas ou suspensões. Formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em um veículo farmaceuticamente aceitável líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação de vacina pode ser emulsificada. Substâncias adicionais que podem ser incluídas em um produto para uso nos presentes métodos incluem mas não são limitadas a um ou mais preservativos, tais como sal dissódico ou tetrassódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), mertiolato e similares.

As composições de vacina opcionalmente podem incluir diluentes líquidos, semi-sólidos ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis compatíveis com vacina, que servem como veículos, excipientes ou meios farmacêuticos. Qualquer diluente conhecido na técnica pode ser usado. Diluentes exemplificativos incluem mas não são limitados a monolaurato de polioxietileno sorbitano, estearato de magnésio, metil e propilidroxibenzoato, talco, alginatos, amidos, lactose, sacarose, dextrose, sorbitol, manitol, goma arábica, fosfato de cálcio, óleo mineral, manteiga de cacau e óleo de teobroma.

As composições de vacina podem ser embaladas em formas convenientes para suprimento. As composições podem ser encerradas dentro de uma cápsula, tablete conformado em cápsula, sache, cápsula em forma de selo, gelatina, papel ou outro recipiente. Estas formas de suprimento são preferidas quando compatíveis com a entrada da composição imunogênica dentro do organismo receptor e, particularmente, quando a composição imunogênica está sendo suprida em forma de dose unitária. As unidades de dosagem podem ser embaladas, p. ex., em tabletes, cápsulas, supositórios ou cápsulas em forma de selo.

As formas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Elas devem ser estáveis sob as condições de manufatura e armazenagem e devem ser preservadas contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. A prevenção da ação dos microorganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes retardadores da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização por filtragem. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se os vários ingredientes ativos esterilizados dentro de um veículo estéril que contenha o meio de dispersão básico e os requeridos outros ingredientes daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são as técnicas de secagem por vácuo e de secagem por congelamento, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de sua solução previamente filtrada estéril.

Quando o composto imunogênico ativo de acordo com a presente invenção é adequadamente protegido, ele pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável ou pode ser encerrado em cápsula de gelatina de casca dura ou mole, comprimido dentro de tabletes ou incorporado diretamente com o alimento da dieta. Para administração terapêutica oral, o composto imunogênico ativo de acordo com a presente invenção pode ser incorporado com excipientes e usados na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e similares. Tais composições e preparações de vacina devem conter pelo menos 1% em peso de composto imunogênico ativo. A percentagem das composições e preparações pode, naturalmente, ser variada e pode convenientemente ser entre cerca de 5 a cerca de 80% do peso da unidade. A quantidade de composto imunogênico ativo em tais composições de vacina terapeuticamente úteis é de modo que uma dosagem adequada será obtida. Composições ou preparações de vacina preferidas de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que uma forma unitária de dosagem contenha entre cerca de 0,1 g e 2000 mg de composto imunogênico ativo.

Uma composição de vacina de acordo com a presente invenção, adequada para administração oral, pode também ser preparada sob a forma de uma solução líquida, incluindo uma formulação aerossol líquida.

As formulações aerossóis líquidas contêm o produto imunogênico e um agente dispersante em um diluente fisiologicamente aceitável. As formulações aerossóis em pó seco da presente invenção consistem de uma forma sólida finamente dividida do produto imunogênico e um agente dispersante. Com a formulação de aerossol líquida ou de pó seco, a formulação deve ser aerossolizada. Isto é, deve ser decomposta em líquido ou partículas sólidas, a fim de assegurar que a dose aerossolizada realmente alcance as membranas mucosas das passagens nasais ou do pulmão. A expressão "partícula aerossol" é usado aqui para descrever ou líquido ou partícula sólida adequada para administração nasal ou pulmonar, isto é, que alcance as membranas mucosas. Outras considerações, tais como construção do dispositivo de suprimento, componentes adicionais da formulação e características de partícula são importantes. Estes aspectos da administração pulmonar de um medicamento são bem conhecidos na técnica e a manipulação das formulações, meios de aerossolização e construção de um dispositivo de suprimento requerem no máximo experimentação de rotina por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Em uma forma de realização particular, o diâmetro dinâmico médio de massa será de 5 micrômetros ou menos, a fim de assegurar que as partículas de medicamento alcancem os alvéolos pulmonares [Wearley, L. L., Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8:333 (1991)].

Os sistemas de suprimento de aerossol, tais como o inalador de dose medida pressurizada e o inalador de pó seco são descritos em Newman, S. P., (Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. e Davia, D. editors, pp. 197 - 22) e podem ser usados com relação à presente invenção.

As composições de vacina de acordo com a presente invenção podem ser administradas ao indivíduo a ser imunizado por qualquer método convencional, incluindo, p. ex., por oral, injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal ou subcutânea; por suprimento oral, transdérmico, sublingual, intranasal, anal ou vaginal. O tratamento pode consistir de uma única dose ou uma pluralidade de doses durante um período de tempo.

A presente invenção é ainda ilustrada pelas figuras e exemplos abaixo. FIGURAS

A Figura 1 consiste de um esquema que ilustre o procedimento geral para manufatura de um produto imunogênico estável de acordo com a presente invenção.

A Figura 2 ilustra a resposta humoral em camundongos imunizados com (A) apenas KLH ou (B) um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no exemplo 1. Abscissa: indivíduos; Ordenada: títulos de anticorpo anti-TNFa IgG.

A Figura 3 ilustra a atividade neutralizante anti-TNFa dos anticorpos de soro produzidos por camundongos imunizados por (A) apenas KLH ou (B) um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1. Cada curva corresponde à forma de soro de um camundongo; Abscissa: neutralização percentual da atividade TNFa; Ordenada: diluição do soro.

A Figura 4 ilustra a resposta humoral dos macacos Rhesus imunizados com (A) apenas KLH, (B) 20 μg de um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1 e (C) 80 μg de um produto imunogênico estável manufaturado como descrito no Exemplo 1. Abscissa: Dias após primeira injeção; Ordenada: títulos de anticorpo anti- TNFaIgG.

A Figura 5 ilustra a atividade neutralizante anti-TNFa dos anticorpos de soro, produzidos por macacos Rhesus imunizados com (A) apenas KLH, (B) 20 μg de um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1 e (C) 80 μg de ) um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1. Abscissa: neutralização percentual da atividade TNFa; Ordenada: diluição de soro.

A Figura 6 ilustra a resposta humoral de camundongos huTNFa B6.SJL-Tg(77VF) N2 imunizados com (A) tampão PBS de controle, (B) apenas KLH, (C) de um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1 e (D) de um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1, combinado com metotrexato. Abscissa: indivíduos: Ordenada: títulos de anticorpo IgG anti-TNFα IgG.

A Figura 7 ilustra as classificações clínicas da artrite, determinadas em huTNFα B6.SJL-Tg(TNF) N2 transgênicos injetados com

- NaCl [♦];

- KLH apenas [ ■ ];

um produto imunogênico estável, manufaturado como descrito no Exemplo 1

[▲]; e

- - um produto imunogênico estável manufaturado como descrito no Exemplo 1, combinado com metotrexato [■]

Abscissa: Dias após primeira injeção; Ordenada: classificações clínicas da artrite.

A Figura 8 ilustra a caracterização de hTNFα-Quinóide.

Fig. 8-a) 1: marcadores RPN800 MW, 2: KLH (0,8 μg), 3: hTNFα (0,8 μg), 4: 3 μg de quinóide carregado em 12% SDS-PAGE. Revelação por tingimento de prata ou Western blotting.

Fig. 8-b) autorradiograma: 1: marcadores MW; 2: 1251- hTNFα 3: quinóide rotulado em hTNFα; 4: quinóide rotulado em KLH; 5: 125I-KLH.

Fig. 8-c) Quinóide (50 μg) filtrado em uma coluna de superose 6 (10 x 300). Eluição a 0,2 ml com DBPS. A coluna foi previamente calibrada pela aplicação de uma série de marcadores MW.

Fig. 8-d) Avaliação comparativa de atividade biológica de

TNFα (♦) e quinóide (◊) em células L929. e) Ligação comparativa de TNFα em receptor I(♦)e II(■)e quinóide em receptor I (◊) e II (□).

A Figura 9 ilustra a resposta anticorpo de camundongo TTg e Balb/c. A Figura 9-a) Título anti-TNFα Ab de soro em TNFα quinóide inativado (iTNFa) ou TTg imunizado KLH comparado com camundongos Balb/c.

Fig. 9-b) a 9-e): Avaliação de camundongos imunizados quinóide (0) e KLH (♦) de

Fig 9-b) capacidade de neutralização de acordo com diluição do soro,

Fig. 9-c) capacidade de neutralização de soro em função do tempo,

Fig. 9-d) inibição de ligação hTNFa de soro em receptor I,

Fig. 9-e) capacidade neutralizante IgG, Fig. 9-f) inibição IgG de ligação ao receptor TNFa I.

regime de imunização-1: 2 injeções i.m. de 10 μg 3 semanas separadas e reforço (5 μ§ a 6 semanas); 2: 2 injeções i.m. de 10 μg e um reforço de 5 μg.

A Figura 10 ilustra a imunidade mediada por célula de esplenócitos de camundongo a hTNFa.

Esplenócitos purificados de KLH (N = 3)(4)e camundongos imunizados quinóide (n = 2) (0). Camundongos Balb/c e TTg foram imunizados nos dias 1, 8, 29. Um reforço foi realizado no dia 90 e os baços foram colhidos no sacrifício (dia 120). Os esplenócitos foram estimulados in vitro por 96 h com a) hTNFa, b) TNFa de murino (muTNFa) e c) antígeno KLH. A proliferação de célula específica foi medida por incorporação de 3 H- timidina e expressa como índice de estimulação (Fig. 10A) ou produção de IL2 (Fig. 10-B) e IFN-γ (Fig. 10-C) no sobrenadante de cultura após 44 h e 72 h, respectivamente (vide seção de materiais e método).

A Figura 11 mostra que uma vacinação com quinóide hTNFa melhora a artrite clínica de camundongos transgênico hTNFa.

Camundongos com a idade de sete semanas foram imunizados nos dias 1, 7 e 28 com KLH-TNFa (círculos abertos) (n = 8) ou KLH (círculos fechados) (grupo de controle, η = 7). As diferenças entre os grupos foram estatisticamente significativas para qualquer parâmetro:

Fig. 11a): Evolução do ganho de peso a partir do início do experimento. P<0,05 (ANOVA);

Fig. 11-b): Número de membros afetados: P < 0,0001 (ANOVA);

Fig. 11-c): Classificações clínicas da artrite P < 0,0001 (ANOVA);

Fig. 11-d) Prevalência diária da artrite (percentagem) mostrando a regressão da doença em grupos vacinados (P < 0,01, ANOVA).

Este experimento foi repetido duas vezes com resultados similares.

EXEMPLOS

EXEMPLOS 1 A 7

EXEMPLO 1: Método de manufatura de um produto imunogênico estável de acordo com a presente invenção.

A. Materiais

Tabela 1: Produtos Químicos e Reagentes

<table>table see original document page 43</column></row><table> Tabela 2: Consumíveis

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Β. Descrição do método

O processo descrito neste exemplo ilustra uma forma de realização do método de acordo com a presente invenção, para manufaturar um produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos antigênicos de TNFa e KLH.

Além disso, o método que é detalhado abaixo é projetado para manufaturar uma batelada de 120 mg de produto imunogênico estável. Etapa a)

- Pegar 30,05 ml de TNFa (a 4,2 mg/ml) e permitir descongelar a 4 0C durante a noite (NB: 126,21 mg de TNFa requeridos). Etapa b) (ou etapa bl) em certas formas de realização do método)

- Adicionar 90,15 ml de "tampão de diluição" para obter a solução de "tampão de trabalho" e TNFa a 1 mg/ml (± 10%).

- Tampão de diluição = 130 mM fosfato hidrogenado dissódico, 133 mM NaCl, 6,6 mM EDTA, pH 7,8

- Tampão de trabalho = 100 mM de fosfato hidrogenado dissódico, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,8.

Etapa b2)

- Aos 120 ml restantes do TNFa a 1 mg/ml (± 10%) adicionar 1,2 ml de DMSO. Manter a mistura em RT por 30 minutos. Misturar por agitação cada 10 minutos e tentar evitar formação de espuma.

- Adicionar 61,34 ml de "tampão de trabalho" à mistura. Misturar suavemente invertendo o recipiente e tentar evitar formação de espuma.

Etapa c)

- Adicionar 51,6 mg de KLH. Nota: para uma solução de 9,81 mg/ml de KLH, adicionar 5,26 ml. Misturar suavemente invertendo o recipiente. O volume total neste ponto é de 187,8 ml.

Etapa d)

- Diluir o estoque de 25% de glutaraldeído a 2,5%, usando-se o "tampão de trabalho". Isto é feito imediatamente antes do uso.

- Adicionar 20,86 ml da solução diluída a 2,5% de glutaraldeído. Observar que o volume total nesta ponto seja 208,56 ml. Misturar suavemente invertendo o recipiente.

- Fechar o frasco e incubar por 45 min em RT. Virar suavemente o frasco durante cada 15 min.

Etapa e) Diafiltrar a solução usando filtragem de fluxo tangencial (TFF) em contato com o tampão de trabalho.

- dialisar três vezes contra 20 volume de tampão de fosfato a pH 7,6 10 mM, 150mMNaCl.

- Volume 1=2 horas

- Volume 2 = 2 horas

- Volume 3 = durante a noite

Etapa f)

- Diluir a solução estoque de formaldeído (a 37%) 10 vezes com "tampão de trabalho", para fornecer uma solução de 3,7%. Isto é feito imediatamente antes do uso.

- Adicionar formaldeído diluído 3,7% à solução de TNFa- KLH, para fornecer uma concentração final de 0,2%. Por exemplo, se o volume recuperado for 200 ml, então a quantidade de formaldeído 3,7% a ser adicionada será de 11,43 ml).

- Selar o frasco e incubar por 6 dias a 37 0C. O frasco é virado uma vez por dia. Etapa g)

- Após os 6 dias, adicionar glicina 2M (produzida em WFI) a uma concentração final de 0,1 M. Incubar por 1 h em RT durante o que o frasco é suavemente emborcado.

Etapa h)

- Verificar o pH de DPBS (Sigma) a ser usada para diafiltragem e ajustar se necessário a um pH final de 7,3 ± 0,2, usando-se NaOH 0,1M. Não é normalmente necessário ajuste de pH ser esperado.

- Diafiltrar a solução empregando-se filtragem de fluxo tangencial (TFF) contra DPB S. 2X5 kDa MWCO TFF membranas serão usadas

Um reservatório de 500 ml (acrílico) do sistema TFF de escala de laboratório será usado.

O material é recuperado da membrana por drenagem do concentrado (retido de ultrafiltragem) dentro de um frasco de polipropileno pré-pesado.

EXEMPLO 2: Procedimentos de teste para o produto imunogênico estável, obtido pelo método de acordo com a presente invenção

Os procedimentos de teste descritos no Exemplo 2 podem ser referidos por uma pessoa hábil na técnica. Entretanto, a pessoa hábil na técnica pode também realizar procedimentos de teste de acordo com qualquer um dos procedimentos de teste que são descritos nos vários exemplos aqui. 2.1 Determinação do TEOR DE PROTEÍNA TOTAL por Colorimetria: Exemplo do Teste de Bradford

O teor de proteína é determinado usando-se a técnica de Bradford (Bradford, Μ. Anal. Biochem. 1976.72, 248 - 254).

Resumidamente, uma curva de calibração é estabelecida com albumina de soro bovino (BSA) por pipetagem de uma série de tubos de teste 0, 10, 20, 30, 40 μl de uma solução de 0,2 mg/ml de BSA em PBS. Subseqüentemente, o volume de cada tubo é completado a 500 μl pela adição do correspondente volume de água DL Em cada tubo são então adicionados 500 μl de reagente de Bradford. Dois modelos são preparados com 200 μl PBS. Após 5 min de reação em temperatura ambiente, o teor de cada tubo é vortexado e lido a 595 nm.

Duzentos μl de uma diluição apropriada da solução de proteína de teste são reagidos com o reagente Bradford como descrito acima.

TEOR DE PROTEÍNA TNFa em KLH- TNFa: ELISA

Quatro amostras de KLH- TNFα, retiradas de 4 frascos, são diluídas em solução salina tamponada com fosfato pH 7,2 (PBS) A 5 μg/mi1. Estas diluições são usadas para revestir placas de microtitulagem (Costar 3590), 100 μl por poço. Após permitir que o revestimento ocorra durante a noite a 4 °C, as placas são lavadas com PBS contendo 0,1% Tween 20 e os poços são saturados com 2% de solução de Soro de Bezerro Fetal (FCS) em 100 μlPBS-Tween por 2 h a 37 °C. Após lavar as placas com PBS-Tween, 100 μl de diluições seriais de um soro anti-TNFa são pipetadas dentro de cada poço e as placas são incubadas por 2 h a 37 °C, após o que elas são totalmente lavadas e novamente incubadas por 2 h a 37 °C, após adicionar em cada poço 100 μl de um anti-soro anti-IgG rotulado HRP.

Em seguida à incubação, as placas são lavadas e 100 μl de solução de orto-fenilenodiamina (OPD) são adicionados em cada poço. Três minutos mais tarde, 100 μΐ de ácido sulfurico 2N são adicionados em cada poço e as placas são lidas a 490 nm em um fotomedidor de multivarredura.

2.2. GRAU DE PUREZA DE IMUNOGENE KLH- TNFa: IEF + WESTERN BLOT O grau de pureza do imunogene é avaliado por focalização isoelétrica (IEF), permitindo-se que o imunogene KLH- TNFa migre para um lado de KLH sozinho e TNFa sozinho em uma placa de 1% de agarose em um gradiente de 3 a 10 pH. Após aplicar uma diluição apropriada de cada amostra a 250 μg/ml, a migração é realizada utilizando-se um aparelho de sistema Phast (Amersham Pharmacia) sob as seguintes condições:

1a. etapa (pré-migração): 500 V, 2,5 mA, 2,5 W, 15 0C, 5 aVh

2a. etapa (aplicação): 200 V, 2,5 mA, 2,5 W, 15 0C, 5 aVh

3a. etapa (migração): 1500 V, 2,5 mA, 2,5 W, 15 0C, 450 aVh Em seguida à migração, as proteínas são transferidas por microcapilaridade para uma membrana PVDF e as proteínas são reveladas por Western Blot.

Detecção de Western Blot

A membrana de nitrocelulose é saturada por imersão durante a noite em 5% leite-TBS Tween 20 em temperatura ambiente, após o que é incubada por 1 h com o anticorpo primário policlonal anti- TNFα (hu) ou anti-KLH diluído em 10% leite-TBS Tween 20 em temperatura ambiente. Subseqüentemente, a membrana é lavada 4 vezes durante 5 min com TBS- Tween 20 antes de ser incubada por 1 h com o anticorpo secundário rotulado- HRP diluído com 10% leite-TBS Tween 20 em temperatura ambiente. Novamente a membrana é lavada 4 vezes com TBS-Tween 20 e as manchas são reveladas por quimio-luminescência usando-se um Kit ECL Plus (Amersham Pharmacia).

3. PERCENTAGEM DE LIGAÇÕES COVALENTES TNFa-KLH NO PRODUTO IMUNOGÊNICO ESTÁVEL

• 3.1. Método No. 1; cromatografia de exclusão de tamanho em condições desnaturantes e redutoras

A solução quinóide de teste é submetida a condições de desnaturação (uréia concentração final 8M) e redução (beta-mercaptoetanol 5% concentração final) que resultarão em uma dissociação de ligações não- covalentes. A solução resultante é eluída através de uma coluna de exclusão de tamanho guarnecida com Superdex 200™ (Pharmacia), escolhida por seu limite de fração de 600 kDa, muito abaixo do peso molecular das construções de KLH e KLH-TNFa covalente. Somente aquelas moléculas de citocina covalentemente ligadas a KLH estarão presentes no volume de exclusão. O último é ensaiado quanto a TNFa (antígenos TNFa específicos), usando-se uma técnica de sanduíche-ELISA com Abs anti-TNFa que não tem reação imune cruzada com KLH. O resultado é expresso como uma percentagem de título TNFa na solução de partida, que é medido pela mesma técnica ELISA. Esta percentagem é igual à% de ligações covalentes TNFa-KLH do quinóide TNFa.

• 3.2 Método No. 2: ELISA de duplo-sanduíche com lavagem Tween

Uma solução de 1 mg/ml de Abs policlonal anti-ILH em PBS (10 mM pH 7,3 NaCl 150 mM) é usada para revestir uma placa de microtítulo (Costar, alta-ligação), 100 μΐ por poço, por 2 h a 37°C. Após 3 ciclos de lavagem com PBST (PBS com Tween 20 0,1% v/v), os poços são saturados por 1 h:30 min com PBS contendo 2% FCS. Os poços são novamente lavados 3 vezes com PBST.

Duas idênticas séries de diluições do quinóide de teste (10, 5,

0,156 μg/ml) são então adicionadas nos poços e incubadas por 2 h. Os poços são lavados 3 vezes com PBST, cuja ação de dissociação (via Tween 20) elimina todas as moléculas não-covalentemente ligadas em KLH, o último KLH sendo fixado em Abs de captura revestido-suporte. A primeira série de diluições de teste é incubada com Abs anti-KLH, enquanto a segunda série é incubada com Abs anti- TNFa. Após incubação por lh30 a 37°C, os poços são lavados como descrito acima, em seguida incubados com Abs secundário acoplado por peroxidase específica.

A adição de OPD, o substrato de peroxidase, permite uma detecção colorimétrica quantitativa de Abs anti- TNFa fixado, para a primeira série, e Abs anti-KLH fixado, para a segunda série. A relação de Abs fixado entre as duas séries dá a percentagem de TNFa covalentemente ligado a KLH no quinóide.

4. ATIVIDADE IMUNOLÓGICA DO TESTE DE ANTIGENICIDADE DE QUINÓIDES KLH- TNFa

Este teste é destinado à medição da capacidade de um imunogene (um derivado de antígeno ou uma ligação de antígeno em uma proteína veículo) combinar-se com um anticorpo específico, com respeito àquela do antígeno nativo. Este teste essencialmente consiste de um ELISA inverso.

Uma série de diluições crescentes do imunogene sob teste é distribuída dentro dos poços de uma placa de microtitulação de poliestireno. Um anticorpo policlonal específico, direcionado à proteína a ser testada, é permitido reagir com o imunogene imobilizado dentro dos poços. Após remover o excesso de anticorpo não-reagido pela lavagem da placa, o Ab imobilizado pelo imunogene dentro dos poços é quantitativamente revelado tendo-o reagido com um Ab rotulado HRP dirigido ao primeiro Ab, a cor amarela que desenvolve pela adição de um apropriado substrato sendo diretamente proporcional à quantidade de proteína imobilizada. A densidade óptica (OD) de cada poço é medida com uma leitora de microplaca de absorvência. O teor de proteína da amostras de teste é determinado por uma curva de calibração.

5. IMUNOGENICIDADE DOS QUINÓIDES

A imunogenicidade de uma preparação imunogênica é:

-1- seu nível de capacidade de induzir a formação de Abs policlonal anti-TNFa específico (medido in vivo): e

-2- sua capacidade de neutralização. A última é medida in vitro quantificando-se a capacidade do anti-soro, amostrado de camundongos imunizados, de inibir a atividade biológica específica de TNFα

-1- Para este, grupos de 20 camundongos Balb/c com a idade de 7 semanas, 18 - 20 g de peso corporal, alojados em gaiolas separadas de 5 animais, alimentados com dieta padrão em pelotas com comida e água ad libitum, são imunizados no dia 0, 7, 14 e 21 por administração intramuscular de 0,1 ml (10 μg) do imunogene de teste em ISA 51 (1:1 v/v emulsão em ISA 51). Uma injeção de reforço de 5 μg do imunogene é dada como 0,1 ml de uma emulsão 1:1 em ISA 51 no dia 60. Uma amostra de sangue é tirada 2 dias antes de iniciar a imunização por perfuração retro-orbital e novamente 12 dias após a última injeção para determinação do nível de anticorpos por ELISA. Três camundongos de controle recebem uma emulsão v/v 1:1 de PBS em IFA.

Títulos de Ab de soro são expressos como o inverso da diluição que fornece um OD > 0,3. 6. IMUNOTOXICICIDADE - In Vitro

Teste de proliferação (por incorporação de 3H-timidina) de células T estimuladas por antígenos PPD/TT e tratadas com várias doses de quinóide. PBMCs são recentemente isoladas de doadores saudáveis por separação de sangue por centrifugação gradiente Ficoll. As células são introduzidas em placas de 96-poços de fundo redondo, 15000 células/poço em meio RMPIc com 10% FCS. O quinóide é adicionado em concentração de 1 μg/ml a 100 ng/ml, em seguida PPD ou TT a 0,16%. As placas são permitidas incubar a 37 0C 5% C02 por 6 dias. Timidina tritiada é adicionada 18 h antes do final da incubação, 0,5 μCi/poço. A proliferação celular é analisada com um contador de cintilação β. 7. CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE BIOENSAIO DE TNFα QUINÓIDES KLH-TNFα:

Citólise de células L929 de murino na presença de Actinomicina D

Materiais

- quinóide KLH-TNFα (murino ou humano) de linhagem de fibroblasto de camundongo L929 (ATCC Cat. No. CCL-1) em PBS (padrão), NEOVACS

- Meio de Cultura TNFa de murino recombinante Peprotech (315-01 A) ou TNFa humano Peprotech (300-01 A) (RPMI suplementado com 10% FCS (Soro Bezerro Fetal) 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina - estreptomicina)

- Meio de Ensaio (RPMI suplementado com 2% FCS 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina - estreptomicina)

- Meio pré-incubação: HLl suplementado com 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina - estreptomicina

- Placa de cultura de fundo chato de 96 poços (Costar, 3595)

- Actinomicina D, 1000 μg/ml armazenada a 4°C (protegida da luz)

- Solução MTT (Sigma, M5655) 5 mg/ml estoque em alíquota de estoque PBS mantida em menos - 20°C (protegida da luz)

- DMSO (SIGMA, 471267)

Duração do Experimento

Incubação de 24 h

preparação ensaio 1 hora

Método

1. Diluir KLH-TNFa quinóide murino ou humano e padronizar em uma série de diluições de 2 vezes no Meio de Ensaio em 50 μl/poço em placa de 96 poços da fileira 2 a 11, começando na fileira 1 de partida de diluição apropriada como modelo.

2. Preparar suspensão de célula L929 em uma densidade de 7,5 105 /ml em Meio de Ensaio suplementado com actinomicina Dal μg/ml (protegido da luz). Adicionar 50 μl/poço da suspensão de célula à mesma placa, da fileira 1 a 12.

3. Incubar a placa por 24 h a 37°C 5% C02 em um incubador umidificado.

4. Enxaguar 2 vezes com PBS sem Ca2+ Mg2+

5. Adicionar 50 μΐ/poço solução MTT a 40% em Meio de Ensaio e incubar por 4 horas a 37 0C 5% C02 em um incubador umidificado.

5 6. Esvaziar placas e adicionar 50 μΐ de DMSO em cada poço.

7. Ler a placa a 550 — 630 nm

8. Analisar dados.

EXEMPLO 3:

Estudo Comparativo das várias preparações de quinóides de KLH-TNFa (humanos)

Várias preparações de um quinóide TNFa humano consistindo de TNFa humano complexado com KLH de proteína veículo específica foram realizadas.

Mais precisamente, várias preparações de KLH-TNFa (humano) foram produzidas pelo mesmo processo geral que é descrito no exemplo 1, porém com variações (i) na percentagem de DMSO, (ii) concentração de glutaraldeído (2,5 ou 22,5 mM), bem como (iii) período de tempo de incubação do produto intermediário com formaldeído (de 0,2 a 6 dias de período de tempo de incubação).

Em seguida, a perda da atividade biológica do TNFa humano foi avaliada. Também a preservação dos epítopos-B conformacionais no produto quinóide final foi testada através (i) do ensaio de citotoxicidade de TNFa humano na linhagem de célula L929, bem como (ii) através dos ensaios de imunogenicidade descritos aqui neste exemplo.

A. MATERIAIS E MÉTODOS

A.l Ensaios quanto à ausência de atividade biológica TNFa nos quinóides KLH-TNFa (humano)

TNFa humano, na presença de actinomicina D, possui uma atividade citotóxica nas células de fibroblasto de murino da linhagem de célula L929, atividade citotóxica esta sendo avaliada pelo teste de viabilidade de célula usando-se brometo de MTT(3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil- tetrazólio. Este ensaio é baseado na redução MTT pela redutase NADPH mitocondrial das células vivas em relação ao produto reduzido formazano, que tem uma cor azul-púrpura.

Neste ensaio, a atividade metabólica das células permite a avaliação de sua viabilidade.

A avaliação da atividade biológica dos quinóides KLH TNFa consiste de incubar as células L929 na presença de quantidades decrescentes de dito produto quinóide (50 ng/ml a 0 ng/ml) em combinação com actinomicina D (1 μ§/ιη1) em poços de fundo chato de uma placa de microcultura.

A cultura celular é então realizada a 37 0C em uma atmosfera úmida contendo 5% CO2 durante um período de tempo de 24 horas.

Após um período de tempo de cultura de 24 horas, os sobrenadantes de cultura de célula são descartados e substituídos pela solução de ensaio MTT.

Após incubação de período de tempo de 4 horas a 37 0C com MTT, a solução de MTT é removida e DMSO é adicionado.

Após homogeneização, a densidade óptica do sobrenadante de cultura de célula é analisada com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 570 nm.

Os resultados são expressos como densidade óptica (O.D.) a 570 nm. Em paralelo, culturas de célula incubadas com uma faixa de TNFa de 0 a 10 ng/ml são realizadas como controle.

Os resultados finais são expressos como dose letal 50, também denominada LD50, que é a dose que induz a Iise de 50% das células L929 cultivadas.

A.2 Ensaio quanto à preservação dos epítopos-B conformacionais de TNFa humano nos quinóides finais de KLH-TNFa (humano), após os tratamentos químicos com glutaraldeído e formaldeído: ensaio de imunogenicidade.

O estudo da preservação dos epítopos B conformacionais do TNPa humano nos quinóides KLH-TNFa (humano) finais, após os tratamentos químicos, é realizado por um teste de atividade imunogênica em C57B1/6 pesando 18 - 20 g.

No dia 0, um grupo de três camundongos é injetado com 0,2 ml (50 μg) de uma emulsão em adjuvante de Freund completo (CFA) pela via intramuscular.

Uma segunda injeção de 25 μg do produto quinóide em adjuvante de Freund incompleto é administrada no Dia 21.

Amostragem de sangue retro-orbital é realizada em cada camundongo antes da primeira injeção e também no Dia 28. Soros de cada grupo de camundongos são reunidos.

A resposta humoral é medida através de detecção de anticorpos de Isótipo IgG direcionados contra TNFa-humano nos soros dos camundongos imunizados. A resposta humoral é determinada por um ensaio ELISA e é expressa em titulações de anticorpo (diluição"1 fornecendo uma densidade óptica maior do que 0,3).

A capacidade neutralizante dos soros dos camundongos imunizados com os quinóides KLH-TNFa (humano) foi medida através do ensaio de citotoxicidade de TNFa em células L929, como descrito a seguir.

As células L929 são tratadas com várias diluições de lagos de soros (diluições de 1/100 a 1/12800) que foram amostradas no Dia-2 e Dia 28 e então foram incubadas durante 40 minutos em temperatura ambiente e então 20 minutos a 4 0C com 20 ng/ml de TNFa humano.

A cultura de célula é prosseguida a 37 0C em atmosfera úmida, 5% CO2, durante 24 horas. Após um período de tempo de cultura de célula de 24 horas, os sobrenadantes de cultura de célula são removidos e substituídos por solução MTT.

Após uma incubação de 4 horas a 37 0C, MTT é removido e DMSO é adicionado.

Após homogeneização, a densidade óptica do sobrenadante de cultura de célula é analisada com um espectrofotômetro no comprimento de onda de 570 nm.

Os resultados são expressos como densidade óptica (O.D.) dos sobrenadantes de cultura de célula. Uma cultura de célula, incubada com uma faixa de TNFa de O a 10 ng/ml, é realizada em paralelo, como um controle.

Os soros que neutralizam a atividade citotóxica de TNFa evitam exercer sua atividade citotóxica nas células L929.

Os resultados são expressos como a capacidade de neutralização de 50%, ou NC5o, que corresponde à diluição de soros que neutraliza 50% da atividade citotóxica do TNFa humano.

B: RESULTADOS

A Tabela 3 abaixo descreve os resultados obtidos com os quinóides KLH TNFa (humano) finais, preparados de acordo com vários tratamentos químicos.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 3 acima, os melhores resultados são obtidos com um processo de manufaturar quinóide KLH TNFa (humano) envolvendo um tratamento químico (i) com DMSO na concentração de 1% e (ii) com glutaraldeído na concentração de 22,5 mM, em seguida (iii) com um tratamento químico com formaldeído durante o período de tempo de 6 dias. O produto KLH-TNFa (humano) final resultante é desprovido da atividade de citotoxicidade do TNFa humano e induz a produção de anticorpos policlonais que neutralizam a atividade biológica do TNFa humano nativo.

Assim, o processo de manufatura de acordo com a condição descrita em K7 da tabela 3 acima permite a inativação da citocina de TNFa humano contida ali, enquanto preservando os epítopos-B conformacionais.

O produto final de KLH-TNFa (humano), preparado de acordo com as condições denominadas "k7" da Tabela 3 acima, é o mesmo que é o que é manufaturado de acordo com o exemplo 1 acima.

Este melhor produto quinóide TNFa é o que foi estudado nos seguintes exemplos, notavelmente em um modelo de camundongo transgênico, em vista de estudar sua capacidade de induzir anticorpos policlonais que neutralizam TNFa nativo em um sistema autólogo. EXEMPLO 4: Estudo da toxicidade aguda do quinóide de KLH-TNFa (humano) em camundongos

O objetivo do estudo foi definir as propriedades características de uma composição de vacina compreendendo um quinóide de KLH-TNFa (humano) de acordo com a presente invenção, a ser usada como uma vacina terapêutica de largo espectro para uso no tratamento de caquexia cancerosa e/ou várias doenças auto-imunes (p. ex., artrite reumatóide, doença de Crohn e psoríase).

Particularmente, as propriedades da composição de vacina com respeito à tolerância e ausência de risco foram estudadas.

Conseqüentemente, um primeiro estudo de toxicidade foi realizado em camundongos SWISS. A. MATERIAL E MÉTODOS

Quarenta e seis (46) camundongos SWISS fêmeas foram distribuídos (i) um grupo de quatro animais não-tratados e (ii) três grupos de quatorze animais que receberam, respectivamente:

a) Grupo de controle (veículo adjuvante): n = 14

Uma injeção via intramuscular (IM), localizada na coxa de solução salina tampão de fosfato (PBS);

O grupo de controle foi usado para avaliar a reatividade local e sistêmica do uso do adjuvante da formulação.

b) Grupo tratado (primeira dose: 2000 vezes a dose humana terapêutica única, STHD°/N + 14

Uma injeção via intramuscular (IM), localizada na coxa de quinóide KLH-TNFa (humano) a 50 μg/camundongo em uma solução salina tampão de fosfato (PBSº);

c) Grupo tratado (segunda dose: 4000 vezes a dose humana terapêutica única, STHD): n = 14

Uma injeção via intramuscular (IM), localizada na coxa, do quinóide KLH-TNFa (humano) na dose de 100 μg/camundongo em uma solução salina tampão de fosfato (PBS).

d) Grupo de camundongos nativos, não-tratados, que foram incluídos neste estudo (n = 4).

A computação da dose refere-se à dose única para uso humano, que é 80 μg/injeção/indivíduo: 1 SHTD (dose humana terapêutica única), assim, 1,15 μg/kg

As injeções do quinóide KLH-TNFa (humano) foram realizadas no Dia 5 (D 5) da experimentação.

A resposta dos animais ao tratamento acima foi testada de acordo com os seguintes parâmetros:

a — O número eventual de período de curto tempo e período de longo tempo, imediato, de morte (período de observação de 10 dias após administração).

b - Reatividade local ou sistêmica ao tratamento, c — Curva mostrando o status geral e o peso dos animais até 10 dias em seguida à administração do quinóide KLH-ΤΝΡα (humano) (D 15).

Cinco (5) dias após o período de incubação (D20), os animais sobrevivendo foram sacrificados e os seguintes controles foram realizados.

d - Exame anatomo-patológico microscópico do músculo no local do sítio de injeção, para avaliação da tolerância local.

e - Determinação do peso dos pulmões, coração, fígado, baço, como um valor índice da resposta do órgão à administração das substâncias imunoestimulantes. B. RESULTADOS

Quando administradas a camundongos em doses altamente elevadas (cerca de 4000 vezes a dose terapêutica humana única em cada camundongo), o quinóide KLH-TNFa (humano) não resultou em qualquer efeito adverso, durante o inteiro período de observação de 10 dias e para cada um dos grupos testados, como é ilustrado por:

1) Nenhuma ocorrência de uma morte de termo imediato ou médio;

2) Nenhuma reação local no sítio da injeção, nem qualquer reação sistêmica;

3) Nenhum efeito sobre as curvas de crescimento do camundongo, em qualquer um dos grupos testados.

Além disso, o exame macroscópico dos órgãos dos animais sacrificados no final do teste (D20) não mostrou alteração de órgão, nem qualquer aumento no volume do baço e do fígado.

Outrossim, o peso do coração, pulmões, fígado e baço variou de uma maneira similar para os inteiros grupos de animais testados. EXEMPLO 5 - Estudo da imunogenicidade do quinóide KLH-TNFa (humano) em um modelo de camundongos transgênicos adequado para TNF humano.

A atividade imunogênica (humoral) da preparação de quinóide KLH-TNFa, em comparação com a atividade imunogênica de KLH, foi estudada em camundongos B6.SJL-Tg (TNF) N2 de 5 semanas (grupo de 10 camundongos). Estes camundongos foram fornecidos por Taconic Company (USA) e consistem de camundongos que são transgênicos para gene TNFa humano (hemizigoto).

A. MATERIAL E MÉTODOS

No Dia O e Dia 7, os camundongos (grupo de 10 camundongos) receberam uma injeção de 0,2 ml (30 μg) de uma emulsão em ISA51 pela via intramuscular. Uma segunda injeção de 25 μg em ISA51 foi dada no Dia 28. Em seguida, uma amostragem de sangue retro-orbital é realizada em cada camundongo no Dia 35.

B. RESULTADOS

1. Resposta humoral

A resposta humoral é medida pela presença no soro dos camundongos imunizados de anticorpos tipo IgG, direcionados contra TNFa humano; A resposta humoral é determinada por um ensaio ELISA e é expressa no título de anticorpo (diluição"1 fornecendo uma densidade óptica maior do que 0,3). A Figura 2 ilustra o título de anticorpo que foi obtido.

O soro do camundongo imunizado com produto de KLH- TNFa (humano) final, obtido de acordo com o exemplo 1, possui alto nível de títulos de anticorpo tipo IgG, enquanto que o soro de camundongos imunizados com KLH são destituídos destes anticorpos.

A atividade neutralizante destes anticorpos foi medida com o ensaio de citotoxicidade TNFa em células L929. Os resultados são apresentados na figura 3. Os anticorpos induzidos pela preparação de quinóide KLH- TNFa (humano) têm um alto nível de atividade neutralizante.

EXEMPLO 6 - Estudo da imunogenicidade do quinóide de KLH-TNFa (humano) no macaco rhesus

A atividade imunogênica humoral do quinóide KLH-TNFa (humano), em comparação com a atividade imunogênica de KLH apenas, foi estudada em maçado rhesus fornecido por MDS pharma (Lyon - França). Deve ser observado que o TNFa que é naturalmente produzido pelo macaco rhesus compartilha 98,1% de homologia de aminoácido com TNFa humano.

A. MATERIAL E MÉTODOS

No dia 0, Dia 21 e Dia 49, os macacos receberam uma injeção de 0,5 ml de uma emulsão do quinóide em ISA51 pela via intramuscular, contendo (i) 80 ou 20 μg da preparação de quinóide de KLH-TNFa (humano) ou (ii) apenas KLH. Uma amostragem de sangue foi realizada em cada animal no Dia 28, Dia 56 e Dia 68.

B. RESULTADOS

I-Resposta humoral:

A resposta humoral foi medida detectando-se a presença de anticorpos Isótipo IgG direcionados contra TNFa humano do soro dos macacos imunizados. A resposta humoral foi determinada com um ensaio ELISA e é expressa como títulos de anticorpo (diluição-1 fornecendo uma densidade óptica maior do que 0,3). Os resultados dos títulos de anticorpo obtidos são informados na figura 4.

O soro dos macacos imunizados com a preparação de quinóide KLH-TNFa (humano) tem títulos de anticorpo de isótipo IgG anti-TNFa, enquanto que o soro dos macacos imunizados com apenas KLH é desprovido destes anticorpos.

Os títulos de anticorpo anti-TNFa são mais importantes no soro dos macacos que receberam 80 μg do quinóide KLH-TNFa (humano). As atividades neutralizantes dos anticorpos foram medidas com o ensaio de citotoxicidade TNFa em células L929. Os resultados destes ensaios são informados na figura 5.

Os anticorpos induzidos pelo KLH-TNFa (humano) têm uma elevada atividade neutralizante.

EXEMPLO 7: avaliação da eficiência terapêutica da imunização ativa contra TNFa de camundongos transgênicos huTNFa

A avaliação da eficiência terapêutica da estratégia de imunização ativa contra TNFa empregando-se a preparação de quinóide KLH-TNFa (humano) como o ingrediente ativo foi realizada em camundongos transgênicos huTNFa B6.SJL-Tg (TNF) N2 de 5 semanas de idade, fornecidos por Taconic Company (USA). Estes camundongos transgênicos TNFa desenvolvem uma poliartrite espontânea na idade de 4 a 5 semanas.

A- MATERIAL E MÉTODOS

1 — Imunização

Camundongos receberam uma injeção de 0,2 ml de uma emulsão de ISA51 pela via intramuscular nos dias DO, D7 e D28. Quatro grupos de 10 camundongos foram tratados como detalhado abaixo:

- Grupo A: PBS: 200 μί PBS

- Grupo B: KLH: 200 μΐ KLH

- Grupo C: KLH-TNF: 200 μΐ KLH-TNF

- Grupo D: KLH-TNF+ MTX: 2000 μl KLHiTNF e metotrexato (1 mg/kg) três vezes por semana, começando da imunização No.

Ie até o sacrifício (injeção intraperitoneal de 200 μl por injeção).

Os camundongos receberam (i) no Dia 0 e Dia 7: 30 μg da preparação de quinóide KLH-TNFa (humano) e (ii) no Dia 28: 15 μg da mesma preparação.

Uma amostragem de sangue retro-orbital foi realizada em cada camundongo no Dia 35. No Dia 57, na ocasião em que os camundongos foram sacrificados, uma amostragem de sangue foi também realizada. 2 - Exame clínico e avaliação quantitativa da artrite:

Um exame clínico foi realizado, ainda no tempo de início do experimento e então duas vezes por semana.

As avaliações foram realizadas por um observador não tendo conhecimento do tratamento que foi aplicado. A severidade clínica da artrite em cada junta (dedos, tarso, tornozelo, carpo) foi quantificada por atribuição de uma classificação variando de O a 4, em que: O = normal; 1 = eritema; 2 = intumescimento; 3 = deformação e 4 = deformação maior ou necrose. A soma destas classificações tendo sido realizada a fim de obter-se uma classificação da artrite para cada animal, todo dia. Uma média para cada grupo foi calculada para todo dia de tratamento.

3 - Exame histológico e avaliação quantitativa da artrite

Os animais foram todos sacrificados 57 dias após o início do experimento. As patas posteriores foram removidas, fixadas em formol, descalcificadas, em seguida desidratadas e então incluídas em blocos de parafina. Em seguida, fatias histológicas com 5 μηι de espessura foram realizadas com um micrótomo. Pelo menos quatro seções seriais foram realizadas para cada pata, a fim de assegurar uma correta avaliação espacial das afecções das juntas. As preparações de lâminas foram então tingidas por hematoxilina e eosina e então observadas sob microscópio óptico. As lesões foram quantitativamente avaliadas em cada seção de acordo com uma escala de três pontos (0 = normal; 3 - severa). Esta classificação histológica pode ser dividida em dois parâmetros: destruição da cartilagem e do osso (espessura da cartilagem e do osso, irregularidades e presença de erosões) em uma das mãos e na outra mão inflamação (proliferação sinovial, infiltração inflamatória celular).

4 — Estatística Os valores dos resultados são dados como desvio médio e padrão da média (SDM). Um teste t de Student, bem como uma análise da variação (ANOVA ) foram realizados. B — Resultados: 1 — Resposta humoral

A resposta humoral é medida detectando-se a presença de anticorpos de isótipo IgG direcionados contra TNFa humano do soro de macacos imunizados. A resposta humoral é determinada por um ensaio ELISA e os resultados são expressos como o título de anticorpo (diluição"1 fornecendo uma densidade óptica maior do que 0,3).

Os resultados dos títulos de anticorpo que foram obtidos são informados na Figura 6.

2 — Exame clínico e avaliação quantitativa da artrite Evolução da classificação clínica com o tempo

A evolução da classificação clínica com o tempo é informada na Figura 7.

O tratamento dos macacos (i) com quinóide KLH-TNFa (humano) ou (ii) com quinóide KLH-TNFa (humano) combinado com MTX induz uma maior diminuição estatisticamente significativa das classificações de artrite, que foram avaliadas por exame clínico. Por comparação, as classificações de artrite, determinadas para controlar os animais tratados com KLH ou com tampão de PBS, foram muito mais baixas. Avaliação dos parâmetros de ocorrência da doença e ocorrência da severidade

A avaliação da ocorrência da doença e severidade da doença é informada na tabela 4 abaixo.

O dia da ocorrência da doença foi determinado, para cada animal, através de um exame clínico. Os animais que não tinham nunca desenvolvido a doença não foram considerados. A classificação "A MAX" corresponde à classificação máxima alcançada por cada animal durante o experimento. A classificação "A MAX" representa um parâmetro da severidade da doença.

A incidência significa o número de animais tendo desenvolvido artrite antes do final do experimento, sendo levado em consideração o número total de animais de cada grupo.

Tabela 4

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Os resultados mostram que o tratamento por KLH-TNFa e por KLH-TNFa + MTX induz, em uma maneira estatisticamente significativa:

um retardo na ocorrência da artrite, em comparação com os animais de controle tratados por KLH somente ou por PBS.

uma diminuição da severidade da artrite; e

- uma diminuição do número de animais doentes.

3 - Exame histológico e avaliação quantitativa da artrite

Os resultados são informados na tabela 5 abaixo. Tabela 5

<table>table see original document page 66</column></row><table>

* p < 0,01 vs KLH et vs PBS

**: ρ < 0,001 vs KLH et vs PBS (teste t de Student)

O tratamento com KLH-TNF e com KLH-TNF+MTX induz, de um modo estatisticamente significativo, uma diminuição das alterações histológicas (parâmetro de destruição e inflamação de junta).

C - CONCLUSÃO

A vacinação dos camundongos transgênicos huTNFa com preparação de quinóide KLH-TNFa (humano) de acordo com o exemplo 1 claramente protege os animais da inflamação e destruição das juntas, como é mostrado pelos resultados da análise clínica e histológica.

Os grupos de animais tratados com preparação de quinóide KLH-TNFa (humano), com referência à proteção das juntas, não podem ser distinguidos dos grupos de animais tratados com preparação de quinóide KLH-TNFa (humano) combinada com MTX; estes resultados podem ser explicados pelo fato de que a principal eficiência de quinóide KLH-TNFa (humano) sozinho mascara, nestas condições experimentais, o eventual efeito benéfico de MTX.

Os grupos de animais tratados por KLH não podem ser distinguidos dos grupos de animais tratados por tampão PBS.

Outros resultados relativos às propriedades biológicas do produto imunogênico estável de acordo com a presente invenção são descritos nos exemplos 8 a 12 abaixo.

EXEMPLOS 8 A 12

A. MATERIAIS E MÉTODOS DOS EXEMPLOS 8 a 12

A.l. Reagentes

KLH foi comprado da Intracel (San Diego, CA), hTNFa da Boehringer Ingelheim (Mannheim, Alemanha), TNFa de murino de Cytolabh (Rehovot, Israel), receptor hTNFa receptor RI e RII, hTNFa, kit de murino IL2 e murino IFNy ELISA da R&D System (Lille, França), adjuvante ISA51 da Seppic (Paris, França).

A.2. Animais

Camundongos transgênicos hTNF fêmeas e machos heterozigotos de 4 - 5 semanas de idade (1006-T) foram comprados de Taconic, camundongos C57B1/6 e Balb/c fêmeas de 6 - 8 semanas de idade de Charles River (L'Arbresles, França). Os camundongos foram mantidos sob condições livres de patógenos. Coelhos foram mantidos na procriação de Charles Rivers (L'Arbresles, França) e Macaca mulata em MDSPharma Inc. (St-Germain-sur-L'Arbresles, França).

A.3. Preparação de imunogene

O imunogene hTNFa-KLH foi preparado realizando-se o método descrito no Exemplo 1.

A.4. SDS/PAGE, tingimento de prata e imunoblotagem

Análise SDS-PAGE sob condições não redutoras foi realizada de acordo com Laemmli (Laemmli, U.K. (1970), Nature 227: 680-85). Em um SDS-PAGE 12%, as proteínas foram reveladas por tingimento de prata, autorradiografia (Lê Rou F., Biosbal C., Silhol M., Martinand C., Lebleu B. & Salehzada T. (2001). The Journal of Biological Chemistry, 276: 48473 - 482) ou análise de imunoblotagem, empregando-se anticorpos apropriados. Α.5. Cromatografia de filtragem-Gel

O heterocomplexo foi carregado em uma coluna de filtragem- gel Superose 6 10/300 GL (Amersham bioscience, Orsay, França), pré- equilibrado com DPBS e eluído com o mesmo tampão usado para o equilíbrio, a 0,2 ml/min. A.6. Culturas de célula

Linhagem de célula L929 de camundongo (ATCC, CCL 1) foi cultivada em meio RPMI-1640 contendo 10% FCS. Esplenócitos de murino purificados foram ressuspensos em meio RPMI contendo 5% FCS e 50 μΜ 2- β-mercaptoetanol e incubados em meio de cultura com ou sem KLH (30 μg/ml), hTNFa (3 μg/ml) e antígenos TNFa de murino (1 μg/ml). A.7. Ensaio de proliferação de células T

Esplenócitos ativados por antígeno foram cultivados por 4 dias e então pulsados por 18 h com 3H-Timidina. As células foram colhidas 18 h mais tarde em esteiras de filtro e a incorporação de timidina dentro do DNA foi quantificada utilizando-se um contador beta. O índice de estimulação foi expresso como: [(média de cpm de células estimuladas)-(média de cpm de células não-estimuladas)]/(média de cpm de células não estimuladas). Os valores SI maiores > 2 foram considerados positivos. A.8. Ensaios de TNFa e receptores

A.8.1. Ensaio Direto de Ligação de Receptor:

A ligação de heterocomplexo e hTNFa a seus receptores alvo foi medida usando-se placas pré-revestidas com 50 ng/poço de hTNFa RI ou RII. A diluição serial das amostras foram incubadas com seu receptor e hTNFa ligado foi detectado usando-se Ab anti-hTNFa policlonal de cabra biotinilado (R&D Systems). Para avaliar a capacidade do soro ou IgG inibir a ligação de hTNFa a seu receptor, hTNFa foi primeiro pré-tratado com diluição serial de soro ou IgG testado antes de ser transferido para a placa sobre a qual hTNFa RI foi imobilizado. O título de bloqueio foi expresso como o recíproco da diluição de soro neutralizar 50% da ligação hTNFa. A.8.2. Ensaio de Título Ab anti-hTNFa

O título Ab anti-hTNFa específico de soro de camundongos imunizados e de controle foi determinado por um ELISA direto. As placas de Elisa pré-revestidas com 50 ng/poço de hTNFa foram incubadas com diluições seriais de soro de camundongo imunizado e de controle. IgG específicos foram detectados usando-se peroxidase IgG anti-camundongo de Coelho (Zymed, CA). Os títulos de ponto final foram expressos como o recíproco da mais elevada diluição de amostra, fornecendo uma O.D. de 0,3. A. 8.3. Quantificação de citocina

hTNFa, IL-2 de murino e IFNy de murino foram determinados no soro e sobrenadante da cultura por ELISA. A.9. Bioensaio hTNFa.

A atividade hTNFa foi avaliada usando-se o ensaio de citotoxicidade L919 (Bloquei 2004). A diluição serial de hTNFa e heterocomplexo foram incubados por 18 h com células L929 na presença de actinomicina D (1 μg/ml) e o número de células sobrevivendo determinadas pelos ensaios MTT. A capacidade de soro hiperimune ou IgG neutralizar a atividade hTNFa foi similarmente determinada após incubar soro e IgG com hTNFa. O título de neutralização foi expresso como o recíproco da diluição de soro que neutraliza 50% da atividade de hTNFa. A. 10. Imunização.

Os animais foram imunizados por 3 ou 4 vezes por injeções i.m. de quinóide auxiliado por ISA51 (Seppic) ou preparação de controle (5 - 30 μg). Os soros foram coletados 8 a 12 dias após a 3a. ou 4a. imunização e no sacrifício.

A.ll. Purificação de anticorpo

Imunoglobulina (IgG) e anticorpos anti-hTNFa ou anti-KLH foram purificados de soros de camundongo imunizado ou de controle, utilizando-se um kit de purificação IgG de Proteína G (Pierce) ou cromatografia de afinidade em colunas de Sefarose 4B acopladas hTNF ou KLH (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). A avidez foi determinada usando- se tecnologia BIAcore 3000 (Lofas, S., Johnsson B. (1990) J. Chem. Soe. Chem. Commun. 21: 1526; Karlsson, R., FaIt A., (1997) J. Immunol. Methods 200:121).

A.12. Choque letal

Camundongos imunizados de controle e hTNFa-quinóides (C57B1/6 ou TTg) foram provocados imunologicamente IP com hTNFa na presença de 20 mg de D-galactosamina em PBS, 10 dias após a última injeção de imunização. Uma dose de lançamento letal de 80 - 90% de hTNFa foi administrada e a sobrevivência do Animal foi registrada 24 h pós-injeção (Lehmann V J Exp Med 1997 657). Nestes experimentos, uma análise microscópica do fígado foi realizada em um subgrupo de camundongos sacrificados 8 horas pós administração de TNFa.

A.13. Acompanhamento da artrite

Camundongos transgênicos TNFa humanos 1006-T desenvolvem uma artrite espontânea a partir da idade de 8a. semana, como cepa Tgl97 (Keffer, J., Probert, L., Cazlaris, H., Georgopoulos, S., Kaslaris, E., Kioussis, D. & Kollias, G. (1991) Embo J 10, 4025 - 31). Os camundongos foram monitorados quanto à evidência de artrite nas quatro patas, empregando-se um procedimento cego. Para cada membro, a severidade clínica foi classificada de 0 (normal) a 3 (inflamação severa com deformação (Williams, R. O., Feldmann, M. & Maini, R. N. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89, 9784 - 8; Thwin, M. M., Douni, E., Aidinis, V., Kollias, G., Kodama, K., Sato, K., Satish, R. L., Mahendran, R. & Gopalakrishnakone, P. (2004) Arthritis Res Ther 6, R282 - 94). A classificação média da artrite em cada observação clínica diária foi calculada em cada grupo de tratamento. Para análise histológica, as pernas foram dissecadas livres e processadas como descrito em outra parte (Bessis, N., Guery, L., Mantovani, A., Vecchi, A., Sims, J. E., Fradelizi, D. & Boissier, M. C. (2000) Eur J Immunol 30, 867 - 75). Seções extensas foram cortadas para cada pata e pelo menos quatro foram examinadas. As lesões foram cegamente avaliadas para cada junta do joelho, tornozelo e pé, como anteriormente descrito, usando-se uma escala de quatro pontos (0-3, onde 0 é normal e 3 severo) para sinovite (proliferação sinovial, infiltração de célula inflamatória) ou destruição de junta (espessura e irregularidade do osso e cartilagem e presença de erosões) (Saidenberg - Kermanac'h, N., Corrado, A., Lemeiter, D., deVernejoul, M. C., Boissier, M. C. & Cohen - Solai, Μ. E. (2004) Bone 35, 1200 - 7, Miellot, A., Zhu, R., Diem, S., Boissier, M. C., Herbelin, A. & Bessis, N. (2005) Eur J Immunol 35,3704- 13).

A. 14. Análise estatística. Toda estatística foi realizada usando-se o Software StatView, versão 5.0. ANOVA foi usado para analisar medidas repetidas, tais como classificações clínicas, número de membros afetados, ganho de peso, prevalência. Para comparação dos dados quantitativos, o teste de Mann Whitney não paramétrico foi usado. Qui- quadrado com correção Yates foi usado para comparar dados qualitativos.

B. RESULTADOS DOS EXEMPLOS 8 A 12

EXEMPLO 8: propriedades biológicas do produto imunogênico estável (quinóide hTNFa)

A. Caracterização Imuno-bioquímica

Quinóide TNFa humano é um heterocomplexo KLH-hTNFa que migrou em SDS-PAGE como 3 faixas exibindo pesos moleculares (MW) de cerca de 250, 105 e 40 kDa (Fig. 8-a). Uma proporção bastante grande do quinóide não migrou e é visualizada no nível do gel empilhante. Tanto hTNFa como KLH foram identificados com anticorpos específicos (Fig. 8-a).

Um diagrama similar de migração foi obtido com quinóide rotulado-125 1 em KLH ou hTNFa, como mostrado na Fig. 8-b. Quatro picos foram resolvidos em filtragem gel superose 6. Um pico eram no volume de exclusão, enquanto 3 outros eram de MWs 440, 158 e 13,7 kDa (Fig. 8-c). B. Ausência de bioatividade de TNFa

O quinóide era destituído de qualquer citotoxicidade induzida por TNFa, como avaliado pelo teste L929 padrão nas mais elevadas concentrações (Fig. 8-d).

Quinóide-TNFa humano, ligou-se tanto ao receptor I de hTNFa (p55) como receptor II (p75), apesar de sua desejável falta de bioatividade (Fig. 8-e).

EXEMPLO 9: Indução de anticorpos anti-TNFa em camundongos transgênicos para TNFa humano (camundongos TTg)

Em imunização de camundongos TTg com TNFa quinóide induziu elevados títulos de Abs anti-TNFa, enquanto que a imunização com TNFa inativado ou com KLH de controle deixou de eliciar qualquer Abs anti- TNFa detectável. Ao contrário, em camundongos Balb/c tanto imunização com quinóide ou com TNFa inativado eliciaram Abs anti-TNFa (Fig. 9-a). Em camundongos TTg e BalbC, KLH mas também imunizações de quinóide resultaram em geração de Abs anti-KLH (não mostrado). Como avaliado por testes de citotoxicidade L929 padrão, soros hiperimunes em alta diluição de camundongos TTg imunizados por quinóide, neutralizaram a bioatividade de TNFa mesmo em alta diluição, enquanto que não houve efeito dos soros dos camundongos imunizados KLH (Fig. 9-b). A atividade atingiu o pico 2-4 semanas pós reforço, declinou significativamente (> 50%) dentro de 3 meses (Fig. 9-c) e bloqueou a ligação dos receptores Rl e R2 de TNFa (Fig. 9-d). Abs anti-hTNFa pertencia principalmente a IgGl (52%) e IgG2a (48%). Houve quantidades desprezíveis de IgG3, IgM e IgE, conforme medido por kits Elisa de isotipagem. Finalmente, IgG purificado de soros hiperimunes exibiu alta afinidade para huTNFa com KD variando de 5 χ 10" a IO-10 M, como avaliado por tecnologia Biacore, e bloqueou a ligação de hTNFa a seus receptores I e II (Fig. 9-f). Estes resultados explicam por que o hTNFa circulante não foi detectado nos soros de camundongos imunizados, contrastando com sua presença em camundongos não imunizados a 9 pg/ml.

EXEMPLO 10: Segurança do produto imunogênico estável (hTNFa quinóide)

A administração de altas doses de quinóide TNFa (até 100 μg) não gerou efeitos colaterais clínicos regionais ou sistêmicos em diferentes cepas de camundongos (Balb/c; C57B16; Swiss), coelhos e macacos (Maccaca mulata). Também, enquanto que hTNFa nativo, administrado em camundongos C57B1/6 tratados com D-galactosamina, causou morte dentro de 24 horas (8 de 8 camundongos), não ouve efeito do quinóide hTNFa. Além disso, a imunização de quinóide não eliciou efeitos adversos incluindo resposta autoimune celular anti-hTNFa indesejável e deterioração de crescimento de longo termo e sobrevivência de camundongos TTg imunizados.

Cultura in vitro de esplenócitos de camundongos TTg imunizados por quinóide não acionou qualquer resposta imune mediada por célula para hTNFa, como testado por proliferação de células-T e por produção de citocina (II-2 e IFNy) em sobrenadantes de cultura (Fig. 10 (A, B, C)-a). Ao contrário, camundongos Balb/c imunizados por quinóide exibiram notável imunidade mediada por célula para hTNFa heterólogo, em comparação com animais não imunizados de controle (não mostrados). Nenhuma resposta celular a muTNFa pôde ser detectada em camundongos imunizados, em comparação com controles (Fig. 10 (A, B, C)-b). Finalmente, em camundongos TTg imunizados, uma comparável resposta de célula T positiva a antígeno KLh, igual àquela dos animais de controle recebendo KLH, foi observada, que não tinha efeitos clínicos detectáveis (Fig. 10 (A, B, C)-c).

O crescimento de camundongos imunizados por quinóide (n = 8), conforme medido pelo peso corporal, era comparável àquele dos animais não imunizados de controle (n = 7) até 50 dias pós-imunização, porém tornou- se significativamente melhor nos últimos estágios (Fig. 11-a). Os camundongos foram sacrificados no dia 120 pós-imunização para um estudo histológico comparativo de tecidos das juntas. Outros grupos de camundongos TTg foram acompanhados por mais tempo, a fim de observar-se a progressão clínica de sua artrite. Entre estes animais, os controles (n = 3) foram sacrificados no dia 150, por causa da severidade de sua artrite. Ao contrário, os 3 camundongos TTg imunizados hTNFa-quinóide permaneceram livres da artrite severa (agora acima de 210 dias).

EXEMPLO 11: Prevenção de choque letal de TNFα-galactosamina neutralizando-se anticorpos induzidos por vacinação com um produto imunogênico estável (hTNFa quinóide)

Administração intraperitoneal de TNFa pode acionar, na presença de galactosamina, um choque letal em camundongos. O efeito é dependente da dose. Como mostrado na Tabela 1, em camundongos C57B1/6, o choque letal ocorreu em uma dose de 11 μg e em camundongos TTg a morte foi registrada em uma dose tão baixa quanto 1 μg.

Todo o controle não-vacinado, exceto nenhum dos camundongos C57B1/6 imunizados hTNFa-quinóide, tratados com 11 μg de hTNFα, morreu (Tabela 6). Vale a pena observar que os animais imunizados não somente suportaram o choque letal como também permaneceram clinicamente saudáveis. Além disso, uma repetida administração de hTNFα- galactosamina em intervalos de um mês não teve nenhum efeito (não mostrado).

Importantemente, os camundongos TTg imunizados por quinóide, também resistiram ao choque letal dependente de hTNFα, enquanto que os camundongos TTg de controle morreram (Tabela 6). A administração de dosagens mais elevadas de hTNFα (2 μg) não teve efeito sobre os camundongos TTg imunizados por hTNFa quinóide (Tabela 6). Estes animais sobreviveram em seguida a um repetido choque de hTNFa após 2 semanas e permaneceram totalmente saudáveis até agora.

Em camundongos imunizados, a proteção contra o choque foi devida a Abs anti-TNFa neutralizante. Enquanto que os camundongos C57B1/6, recebendo IgG não específico (1 mg) uma hora em seguida à administração de TNFa (11 μg)-D-galactosamina, morreram dentro de 24 horas, os camundongos recebendo IgG policlonal purificado específico de soros hiperimunes sobreviveram (P<0,001 vs grupo de controle). Nestes experimentos, um subgrupo adicional de controle e camundongos imunizados foram sacrificados 8 h pós administração de hTNFa e análise macroscópica de órgão mostrou atrofia do fígado no controle, porém não em camundongos imunizados (P<0,02 vs controle) (Tabela 7).

EXEMPLO 12: Vacinação com um produto imunogênico estável (hTNFa quinóide) protege camundongos TTg de desenvolvimento de artrite

Camundongos TTg com a idade de sete semanas foram vacinados com KLH/TNFa quinóide e monitorados durante um período de 120 dias. Os grupos de controle consistiram de camundongos tratados-KLH e tratados com solução salina e nenhum teve a artrite afetada. Todos os camundongos de controle desenvolveram poliartrite com inflamação e deformações das juntas (fig. 11), enquanto que os camundongos vacinados com quinóide tiveram somente doença articular marginal (P < 0,0001) (fig. 4- c), com um retardo no início dos sinais clínicos (P.<0,05), uma baixa classificação de índice clínico máximo (p < 0,01 (Tabela 8)) e uma doença grosseiramente menos difusa e membros muito menos afetados (P < 0,0001) (Fig. 11-b). Embora todos os animais desenvolvessem artrite clínica, a doença reverteu somente no grupo imunizado quinóide TNFa (Fig. 11-d); no dia 120, todos os animais, exceto um, estavam protegidos no grupo tratado (Tabela 8), ao contrário do grupo de controle (P < 0,001). A avaliação histológica mostrou uma franca redução da inflamação e destruição das juntas nos animais tratados, que exibiram baixas classificações histológicas (P < 0,01 (Tabela 8); ao contrário, os camundongos de controle apresentaram evidência significativa de artrite, com sinovite proliferativa e infiltrado celular com células mononucleares e polimorfonucleares, associadas com erosões de cartilagem e osso. A incidência da sinovite ou destruição histológica foi significativamente reduzida em camundongos tratados TNFα-quinóide (Tabela 8). Tabela 6. Choque letal dependente TNFα:

<table>table see original document page 77</column></row><table> Tabela 7

<table>table see original document page 78</column></row><table> Tabela 8

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Claims

1. Método para preparar um produto imunogênico anti-TNFa, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) fornecer uma solução líquida contendo TNFa; b) adicionar EDTA a dita solução líquida contendo TNFa da etapa a); c) adicionar uma proteína veículo à solução líquida obtida no final da etapa b); d) adicionar glutaraldeído à mistura líquida obtida no final da etapa c); e) remover glutaraldeído e moléculas livres de tanto TNFa como de dita proteína veículo da solução obtida no final da etapa d); f) adicionar formaldeído à solução líquida obtida no final da etapa e) e manter a presença de formaldeído por um período de tempo variando de 96 horas a 192 horas; g) adicionar um reagente bloqueando a reação com formaldeído na solução líquida obtida no final da etapa f); e h) remover formaldeído e o reagente de bloqueio da solução líquida obtida no final da etapa h), a fim de obter-se uma solução líquida contendo dito produto imunogênico anti-TNFa.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa b) compreender as seguintes etapas: b1) adicionar EDTA a dita solução líquida contendo TNFa da etapa a); e b2) adicionar DMSO à solução líquida obtida no final da etapa b1).

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a etapa d) compreender as seguintes etapas: d1) adicionar glutaraldeído à mistura líquida obtida no final da etapa c); e d2) adicionar EDTA aos heterocomplexos entre TNFα e dita proteína veículo obtida no final da etapa d1);

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, caracterizado pelo fato de na etapa a) a concentração de TNFα variar de 0,1 mg/ml a 50 mg/ml.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, caracterizado pelo fato de na etapa a) a concentração de TNFα variar de 0,5 mg/ml a 10 mg/ml.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de na etapa b) a concentração de EDTA final variar de 1 mM a 500 mM.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de na etapa b2) a concentração de DMSO final variar de 0,5% v/v a 20% v/v.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, caracterizado pelo fato de na etapa c) a relação molar de TNFα para dita proteína veículo variar de 5:1 a 100:1.

9. Método dr acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -8, caracterizado pelo fato de na etapa d) a concentração final de glutaraldeído variar de 0,05% p/p a 0,5% p/p.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo fato de, na etapa d2), a concentração final de EDTA variar de 1 mM a 10 mM.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de, na etapa e), glutaraldeído ser removido realizando-se uma diálise, realizando-se uma ultrafiltragem com diafiltragem ou realizando-se Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF).

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de, na etapa f), a concentração final de formaldeído variar de 1% p/p a 10% p/p.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de, na etapa f), a concentração final de formaldeído variar de 2% p/p a 5% p/p.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de, na etapa f), a presença de formaldeído ser mantida durante um período de tempo variando de 120 horas a 168 horas.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de, na etapa g), o reagente de bloqueio consistir de glicina.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de, na etapa g), a concentração final de glicina variar de 0,01 Ma 10 M.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de, na etapa g), a concentração final de glicina variar de 0,05 M a 2 M.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de, na etapa g), o reagente de bloqueio consistir de lisina.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de, na etapa g), a concentração final de lisina variar de 0,01 Ma 10 M.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de, na etapa g), a concentração final de lisina variar de 0,05 M a 0,5 M.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de, na etapa h), o formaldeído e o reagente de bloqueio serem removidos realizando-se uma diálise, realizando-se uma ultrafiltragem com diafiltragem ou realizando-se Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF).

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de dita proteína veículo ser selecionada do grupo consistindo de toxóide da difteria (DT) e seus mutantes, toxóide do tétano (TT), hemocianina lapa buraco de fechadura (KLH) e o derivado de proteína purificado da Tuberculina (PPD), OMPC de N. meningitidis, proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD), albumina de soro bovina (BSA) e Proteína D de Haemopilus influenzae.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de dita proteína veículo consistir de Hemocianina de Lapa Buraco de Fechadura (KLH).

24. Método para preparar uma composição de vacina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) preparar um produto imunogênico anti-TNFa, pela realização do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23; e b) combinar dito produto imunogênico anti-TNFa, preparado na etapa a), com um ou mais imunoadjuvantes.

25. Produto imunogênico anti-TNFa, caracterizado pelo fato de ter uma ou mais das seguintes características técnicas: (i) compreender (1) moléculas TNFa e (2) moléculas de proteína veículo que são ligadas entre si (a) em menos do que 40% de ligações covalentes e (b) mais do que 60% de ligações não-covalentes; (ii) exibir uma relação molar de TNFa para dita proteína veículo variando de 40:1 a 60:1; (iii) induzir a produção de anticorpos anti-TNFa, tendo uma capacidade de neutralização TNFa (NC5o) menor do que 1/1000; e (iv) possuir um valor ED50 de mais do que 50 ng/ml e mesmo mais do que 400 ng/ml, no teste de citotoxicidade de célula L929.

26. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender (i) um produto imunogênico anti-TNFa, preparado pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou (ii) um produto imunogênico anti-TNFa como definido na reivindicação 25, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

27. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de compreender (i) um produto imunogênico anti-TNFa, preparado pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou (ii) um produto imunogênico anti-TNFa como definido na reivindicação 25, em combinação com um ou mais imunoadjuvantes.