BRPI0610051A2 - métodos e composições para melhorar a reprodução de plantas - Google Patents

Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES PARA MELHORAR A REPRODUçãO DE PLANTAS. A presente invenção refere-se a métodos de reprodução e composições para melhora do germoplasma de uma planta. Os métodos descrevem a identificação e acúmulo de transgenes e regiões genómicas de haplátipo, favoráveis no germoplasma de uma população de reprodução de plantas de colheita.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS ECOMPOSIÇÕES PARA MELHORAR A REPRODUÇÃO DE PLANTAS".

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Esse pedido de Patente reivindica o benefício do Pedido de Pa-tente Provisório US número 60/685.584, depositado em 27 de maio de 2005,todo o texto do mesmo sendo especificamente incorporado aqui como referência.

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de reprodução e bio-tecnologia das plantas, especificamente a um transgene inserido em umaligação genética com uma região genômica de uma planta e ao uso dotransgene/região genômica para melhorar o germoplasma e acumular outrasregiões genômicas favoráveis às populações de reprodução.

2. Descrição da Técnica Relacionada

A reprodução avançou da seleção para traços economicamenteimportantes nas plantas e animais, com base nos registros de fenótipos doindivíduo e seus parentes para o uso de genética molecular de modo a iden-tificar regiões genômicas que contêm os traços genéticos valiosos. Informa-ções no nível do DNA conduziram ao acúmulo genético mais rápido de tra-ços valiosos dentro do germoplasma que o que poderia ser obtido com baseapenas nos dados fenotípicos. O desenvolvimento de colheitas transgênicasadicionalmente revolucionou a reprodução e produção de colheitas na agri-cultura. O sucesso ressaltado das colheitas criadas geneticamente é eviden-te do fato de que a área de terra das fazendas destinada às colheitas trans-gênicas cresceu de extensão em acres insignificante dez anos atrás parametade da extensão em acres para colheitas principais em países agricola-mente importantes, tais como, Estados Unidos, Canadá, Brasil e Argentina.Além do desenvolvimento dos traços de entrada, a biotecnologia das plantastambém mantém um grande compromisso para o desenvolvimento futuro detraços de saída que beneficiarão diretamente os consumidores, como ali-mentos nutricionalmente superiores, tais como, arroz enriquecido com vita-mina A, óleos insaturados e produtos agrícolas para uso medicinal, para de-nominar alguns. O potencial para o sucesso comercial de um transgene co-dificando um traço de entrada novo ou aperfeiçoado ou traço de saída é umgrande incentivo para o desenvolvimento de novos transgenes e sua distri-buição através da colheita desses gene dentro de germoplasma de elite.

Durante o desenvolvimento de plantas de colheita transgênicas,muito esforço se encontra na otimização da inserção e expressão do trans-gene, e então introgressão do transgene através de toda a população dereprodução por métodos clássicos de reprodução. O sítio de inserção de umtransgene dentro do genoma hospedeiro vem sendo uma questão por pelomenos duas razões; (i) a região onde ele é inserido pode modular o nível deexpressão do transgene e (ii) a inserção do transgene pode interromper afunção normal ou expressão de um transgene próximo ou onde ele foi inse-rido. A seleção das localizações genômicas que são benéficas para integra-ção do gene prove os níveis apropriados de expressão estável de um geneintroduzido ou genes e geralmente não afeta seletivamente outras caracte-rísticas agronômicas da planta de colheita.

A região genômica na qual o transgene foi inserido também pro-ve fenótipos agronômicos para a planta de colheita. Esses fenótipos possu-em seu próprio valor no programa de reprodução e essas regiões seriamconsideradas quando da seleção entre múltiplos eventos de inserção detransgene. Os eventos de inserção de transgene nas regiões genômicas queestão associados ao desempenho aperfeiçoado com relação a um traço a-gronômico ou índice de traços múltiplos resultam em um fenótipo aperfeiço-ado na planta de colheita e progênie derivada da planta de colheita, que con-tém o transgene e um fenótipo associado aperfeiçoado. A seleção para oevento transgênico resulta necessariamente na seleção de um segmento dogenoma hospedeiro que circunda o mesmo, e o efeito fenotípico aperfeiçoa-do. Aperfeiçoamentos adicionais envolvem a identificação de marcadoresmoleculares para o rastreamento e manutenção do segmento genômico como transgene associado. Essa é uma área que não foi adequadamente endere-çada a reprodução de plantas corrente com eventos de inserção de transgene.

Existe a necessidade, na técnica de reprodução de plantas, deidentificar as regiões genômicas associadas ao desempenho com relação aum traço agronômico ou índice de traços múltiplos que estão ligados a umevento de inserção de transgene e então selecionar essas regiões de trans-gene-genômicas para dispersão na população de reprodução da colheita. Apresente invenção prove consideração para estimar o valor da região genô-mica e o evento de transgene. Esse valor pode então ser usado como umcritério para seleção entre múltiplos eventos transgênicos. Um benefício adi-cional é que o arrasto de ligação ao redor de um transgene é minimizado eregiões genômicas valiosas são selecionadas, as quais contém o transgenepara reprodução dentro do germoplasma de uma colheita.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção prove um método para reprodução complantas transgênicas. Em um aspecto, esse método compreende provisão deuma base de dados identificando um valor de um traço agronômico para pe-Io menos dois haplótipos distintos do genoma para um conjunto de germo-plasma. O método compreende, adicionalmente, transformação de umaplanta de origem com DNA recombinante para produzir, pelo menos, doiseventos transgênicos, onde o DNA recombinante é inserido dentro da liga-ção com pelo menos dois haplótipos distintos do genoma da planta de ori-gem. A base de dados pode então ser referida para estimar o valor do traçoagronômico para os eventos ligados aos haplótipos distintos e evento trans-gênico possuindo valor de reprodução referido maior pode então ser sele-cionado para reprodução em um germoplasma.

A presente invenção prove um método para aperfeiçoar o ger-moplasma da planta por acúmulo de um ou mais haplótipos em um germo-plasma. O método compreende inserção de um transgene em um genomade uma primeira planta e determinando a localização do mapa do transgeneno genoma. A localização do mapa pode ser correlata a um haplótipo ligado,onde o transgene e o haplótipo compreendem região genômica do tipo T. Aprimeira planta pode então ser cruzada com uma segunda planta. A segundaplanta pode conter, pelo menos, uma região genômica do tipo T ou haplótipoque é diferente da primeira região genômica do tipo T. Pelo menos umaplanta de progênie pode então ser selecionada, a planta de progênie possu-indo expressão detectável do transgene ou seu fenótipo e compreendendoem seu genoma, a região genômica do tipo T da primeira planta e pelo me-nos um haplótipo o genômico do tipo T da segunda planta. A planta de pro-gênie pode ser usada nas atividades relacionadas ao aperfeiçoamento dogermoplasma, que pode ser selecionado do uso da planta para fabricaçãode cruzamentos de reprodução, teste adicional da planta, avanço da plantaatravés da autofertilização, uso da planta ou partes da mesma para trans-formação, uso da planta ou partes da mesma para mutagenese, e uso daplanta ou partes da mesma para CULTIVO ou qualquer combinação desses.

A presente invenção inclui um método para reprodução de umaplanta de colheita, especificamente soja ou milho com traços agronômicos etransgênicos melhorados compreendendo uma região genômica do tipo Tpreferida. Um transgene da região genômica do tipo T é adicionalmente de-finido como conferindo uma propriedade preferida como tolerância ao herbi-cida, resistência a doenças, resistência aos insetos ou pragas, ácido graxoalterado, metabolismo da proteína ou carboidrato, rendimento do grão au-mentado, teor de óleo aumentado, teor nutricional aumentado, taxas decrescimento aumentadas, tolerância ao estresse aumentada ou característi-cas morfológicas alteradas ou qualquer combinação dessas.

A presente invenção prove um novo processo para mapeamentode pelo menos uma região genômica de inserção de um transgene. Essemétodo envolve mapeamento indireto e não requer o estabelecimento desegregação de uma população de novo para um transgene. O método com-preende primeira identificação de pelo menos um primeiro polimorfismo en-tre as linhagens de origem de uma população de mapeamento na regiãogenômica correspondente a um evento de inserção transgênico em umaplanta ou linhagem transformada, então ensaiando as plantas de progênieda população de mapeamento quanto ao polimorfismo. Análises de ligaçãopodem ser realizadas para determinar uma posição do mapa de polimorfis-mo e pelo que um local de mapeamento do evento de inserção transgênico.

A localização do mapa na população de mapeamento pode então ser corre-lacionada ao haplótipo da planta transformada e sua progênie.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES ILUSTRATIVAS

As definições e métodos fornecidos definem a presente invençãoe guiam os versados na técnica na prática da presente invenção. A menosque de outra forma observado, os termos devem ser entendidos de acordocom o emprego convencional pelos versados na técnica relevante. As defini-ções de termos comuns na biologia molecular podem também ser encontra-das em Rieger e outros (1991); e Lewin (1994). A nomenclatura para basesde DNA é empregada conforme estabelecido na 37 CFR § 1.822.

Conforme usado aqui, o termo "milho" significa Zea mays ou mi-lho e inclui todas variedades da planta que podem ser reproduzidas com omilho, incluindo espécies de milho selvagem.

Conforme usado aqui, o termo "soja" significa Glycine max e in-clui todas as variedades a planta que podem ser reproduzidas com soja, in-cluindo espécies de soja selvagem.

Conforme usado aqui, o termo "compreendendo" significa "inclu-indo porém não limitado".

Um "evento" transgênico é produzido por formação de uma célu-la de planta com DNA heterólogo, isto é, um constructo de ácido nucléicoque inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população deplantas resultando da inserção do transgene no genoma da planta, e seleçãode uma planta específica caracterizada por inserção em um local de genomaespecífico. O termo "evento" refere-se ao transformante original e progêniedo transformante que incluem o DNA heterólogo. O termo "evento" tambémrefere-se à progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transfor-mante e outra variedade que inclui o DNA heterólogo.

A presente invenção supera as deficiências dos métodos de re-produção de transgene correntes pela descrição de uma região genômica dotipo T, definida por um transgene e a região genômica de haplótipo ligada,através da qual o gene ligado geneticamente e o haplótipo são selecionadose então sofre introgressão no germoplasma através da reprodução. A sele-ção da região genômica do tipo T baseia-se na estimativa de um valor T quea região genômica do tipo T prove ao germoplasma da planta de colheita. Abase da avaliação distingue e seleciona regiões genômicas do tipo T aper-feiçoadas para uso em um método de reprodução e seleciona e avançaplantas compreendendo as regiões genômicas do tipo T aperfeiçoadas. Aslocalizações genômicas para a integração do gene são favoráveis com basena provisão de níveis apropriados de expressão estável de um gene introdu-zido ou genes e para identificação de associações de transgene com regiõesde haplótipo favoráveis que também fornecem características agronômicasbenéficas ao germoplasma. Considerando-se os aspectos benéficos de am-bos o transgene e a região genômica a qual ele é geneticamente ligado, va-lor adicional pode ser obtido em um evento transgênico e seu uso para de-senvolvimento de germoplasma superior. Em um resultado esperado de ex-periências extensivas na reprodução com plantas transgênicas, os invento-res idealizaram que a consideração adicional seria dada à região genômicaque é ligada à inserção do transgene. Como o transgene é difundido por mé-todos de reprodução no germoplasma da planta, uma porção da região ge-nética ligada ao transgene é também difundida. Considerando-se especial-mente a região genética ligada a um transgene, é possível implementar es-tratégias biotecnológicas e de reprodução para aumentar o valor total dotransgene e a região genética a qual ele é ligado para melhorar o aperfeiço-amento do germoplasma e minimizar o risco de avanço de regiões genéticasmenos favoráveis, freqüentemente referidas como arrasto de ligação.

Por exemplo, em um aspecto da presente invenção, as regiõesgenômicas do tipo T dos novos eventos de soja tolerante a glifosato foramidentificadas, compreendendo um transgene de tolerância ao glifosato comníveis apropriados na ligação com um haplótipo. O tipo T de rendimentomais alto foi identificado como evento 19788 (também referido comoMON89788) e provido para substituição da região genômica do tipo T doevento 40-3-2 com um haplótipo na mesma região genômica com rendimen-to aperfeiçoado, conforme determinado em uma comparação lado a lado.

Essa verificação terá impacto significativo na melhora do germoplasma dasoja tolerante ao glifosato. Uma porção significativa da reprodução da sojarecente utiliza linhagens contendo o traço Roundup Ready® no evento 40-3-2 (Padgette e outros, 1995), com possivelmente tanto quanto 80-95% dogermoplasma de soja oferecido para venda nos Estados Unidos atualmente,contendo esse evento transgênico. A fim de continuar a melhorar o germo-plasma da soja, é desejável ser capaz de identificar eventos de tolerância aoglifosato que também possuem regiões genômicas de haplótipo favoráveis esubstituem a região genômica do tipo T 40-3-2 no germoplasma, portantoprovendo traços agronômicos de elite da linhagem de origem para a progênie.

Em outro aspecto da presente invenção, as regiões genômicasdo tipo T dos eventos de soja tolerantes a inseto são identificadas, as quaiscompreendem um transgene resistente a inseto com níveis apropriados deexpressão na linhagem com um haplótipo. O evento GM_19459 foi selecio-nado de uma população de eventos de soja transgênica. Esses eventos con-têm um transgene inserido no genoma da soja que expressa uma proteínatóxica as pragas de insetos Lepidópteros da soja. As várias regiões genômi-cas de haplótipo foram mapeadas para ajudar na seleção de um evento coma região genômica do tipo T mais favorável.

Em outro aspecto da presente invenção, as regiões genômicasdo tipo T dos eventos de milho tolerantes a inseto são identificadas, as quaiscompreendem um transgene resistente a inseto com níveis apropriados deexpressão na ligação com um haplótipo. O evento de milho tolerante a insetoé selecionado da população de eventos de milho transgênicos. Esses even-tos contêm um transgene inserido no genoma do milho que expressa umaproteína tóxica às pragas de inseto Lepidópteros do milho. As várias regiõesgenômicas haplóticas são mapeadas para ajudarem na seleção de um even-to com a região genômica do tipo T mais favorável.

Qualquer transgene inserido no genoma de uma planta de milhoque possa ser mapeado para uma localização genômica pode então sercomparado ao marcador de haplótipo desenvolvido naquele local para de-terminar se a localização compreende um haplótipo com valor de reproduçãomelhorado.

Em uma concretização, a presente invenção prove marcadoresgenéticos e métodos para a identificação e reprodução de regiões genomi-cas do tipo T na soja. A invenção portanto permite, pela primeira vez, a cria-ção das plantas de soja que combinam com o valor do transgene e um ha-plótipo agronomicamente de elite ou favorável. Os haplótipos favoráveis sãopelo menos identificados como aqueles que vêm sendo hereditariamentemais freqüentes que o esperado em uma população de planta. Usando osmétodos da presente invenção, os locais compreendendo uma região genô-mica do tipo T podem ser introduzidos potencialmente em qualquer planta desoja desejada. Marcadores moleculares são providos os quais quando usa-dos em um programa de reprodução auxiliado com marcador fornecem ummeio para identificar e manter a associação do haplótipo favorável e o trans-gene para prover a região genômica do tipo T valiosa. A presente invençãoprove exemplos de transgenes que fornecem fenótipos resistentes a herbici-da e insetos para as plantas de soja, outros transgenes que fornecem tole-rância ao estresse, tolerância a doença, proteína melhorada, óleo, aminoáci-do outra qualidade de alimentação, traços de nutrição ou processamento sãotambém contemplados como aspectos da presente invenção e germoplasmacompreendendo esses tipos T seriam cruzados para prover um produto detraço empilhado com regiões genomicas do tipo T preferidas.

Em outra concretização, a presente invenção prove marcadoresgenéticos e métodos para identificação e reprodução das regiões genomicasdo tipo T no milho. A invenção, portanto, permite pela primeira vez a criaçãode plantas de milho que combinam o valor do transgene e um haplótipo a-gronomicamente de elite ou favorável. Usando os métodos da presente in-venção, os locais compreendendo uma região genômica do tipo T podem seintroduzidos potencialmente em qualquer planta de milho desejada. Os mar-cadores moleculares são providos, os quais quando usados em um progra-ma de reprodução auxiliada por marcador fornecem um meio para identificare manter a associação dos haplótipos favoráveis e o transgene para prover aregião genômica do tipo T valiosa. A presente invenção prove exemplos detransgenes que fornecem um fenótipo resistente a inseto à planta de milho,outros transgenes que fornecem tolerância ao estresse, tolerância ao herbi-cida, proteína melhorada, óleo, aminoácido ou outra qualidade de alimenta-ção, traços de nutrição e processamento são também contemplados comoaspectos da presente invenção e germoplasma compreendendo esse tipo Tseriam cruzados para prover um produto de traço empilhado com regiõesgenômicas do tipo T preferidas.

Região qenômica do Tipo T e conceito de valor do tipo T

Uma região genômica do tipo T é uma nova composição genéti-ca compreendendo pelo menos um transgene, com níveis apropriados deexpressão, na ligação genética com um haplotipo. Em uma concretizaçãopreferida, a ligação de um transgene com um haplotipo não teria efeito pre-judicial observável na integridade funcional do haplotipo devido à inserçãolocal do transgene. Adicionalmente, um haplotipo de uma região genômicado tipo T seria funcionalmente melhorado, como resultado da integraçãodentro da ligação genética de um transgene. A composição da região genô-mica do tipo T possui o benefício do transgene e o haplotipo com o qual estáligada. A região genômica do tipo T é a composição genética através da qualo transgene é difundido para o germoplasma pela reprodução.

Em uma concretização preferida da presente invenção, um ha-plotipo de uma região genômica do tipo T compreende pelo menos doismarcadores bialélicos separados aproximadamente em 10 cm, ou pelo me-nos um local plurialélico dentro de 5 cM do transgene e com teor alto de in-formações polimórficas. Alterações em um haplotipo, realizadas por recom-binação, por exemplo, podem resultar na modificação de um haplotipo, demodo que ele apenas compreende uma porção do haplotipo original (de ori-gem) fisicamente ligado ao transgene. Qualquer tal alteração em um haploti-po estaria incluída em nossa definição do que constitui uma região genômicado tipo T, à medida que a integridade funcional da região genômica do tipo Tnão seja modificada ou melhorada. A ligação do transgene ao haplotipo ouporção funcional do mesmo que prove o fenótipo desejado está preferivel-mente dentro de cerca de 5 cm, ou dentro de 2 cM ou dentro de cerca de 1cM da região de haplotipo. A integridade funcional de um haplotipo é consi-derada como sendo inalterada se seu valor não for negativo com relação aorendimento ou não for positivo com relação à maturidade ou se nulo comrelação à maturidade ou entre os melhores 50% com relação a um traço a-gronômico ou um índice de traços múltiplos quando comparado a qualqueroutro haplotipo no mesmo segmento de cromossoma em um conjunto degermoplasma (germoplasma de reprodução, população de produção, cole-ção de linhagens de congênito de elite, população de indivíduos de combi-nação aleatória, cruzamento biparental) ou entre os melhores 50% com rela-ção ao traço agronômico ou um índice de traços múltiplos, quando compara-do a qualquer outro haplotipo através de todo o genoma em um conjunto degermoplasma ou o haplotipo estando presente com uma freqüência de 50%ou mais em uma população de reprodução ou um conjunto de germoplasmapode ser tomado como evidência de seu alto valor ou qualquer combinaçãodesses.

O benefício ou valor da planta compreendendo em seu genomauma região genômica do tipo T é estimado por um valor T, que depende dovalor do traço de transgene e o valor do haplotipo ao qual o transgene estáligado. O valor de um transgene de uma região genômica do tipo T pode serestimado do valor do traço que o transgene codifica. Esse valor depende dotraço do transgene (por exemplo, incluindo, porém não limitado a: tolerânciaao herbicida, resistência aos insetos, resistência a doenças, nutrição aper-feiçoada, rendimento melhorado, traço de processamento aperfeiçoado outolerância a tensão) e seria estimado da saída da planta de colheita aumen-tada ou diminuição das entradas necessárias para cultivo da colheita ouqualquer combinação dessas. O traço do transgene também possui valorcomo marcador selecionável ou classificável. Isso é valioso nas aplicaçõesde reprodução para um versado na técnica, em razão da capacidade de se-lecionar ou classificar os resultados de traço de transgene na seleção simul-tânea do haplotipo ligado. Por exemplo, no caso de um cruzamento fabrica-do com uma planta compreendendo um tipo T, onde o transgene codificauma tolerância ao herbicida, aspersão da progênie daquele cruzamento como herbicida teria uma alta probabilidade de seleção para o transgene é o ha-plotipo recombinante ou de origem ligado de forma apertada. Os marcadoresde DNA que são desenvolvidos para definirem o haplótipo podem ser usa-dos para confirmar a integridade do tipo T na progênie do cruzamento.

Um transgene compreendendo um constructo recombinante po-de compreender, adicionalmente, um marcador selecionavel ou marcadorclassificável. A seqüência de ácido nucléico servindo como marcador sele-cionavel ou classificável funciona para produzir um fenótipo nas células, quefacilita sua identificação em relação às células não contendo o marcador.

Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, porém não es-tão limitados ao gene neo ou nptll (Potrykus e outros, 1991), que codificaresistência a canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina,G418, etc.,; gene barqve codifica resistência ao bialafos; EPS sintase resis-tente ao glifosato, EPSP sintase mutante resistente ao glifosato (Hinchee eoutros, 1988) que codifica resistência ao glifosato, enzimas de inativação deglifosato; um gene nitrilase que codifica resistência à bromoxinila (Stalker eoutros, 1988); um gene acetolactato sintase mutante (ALS) que confere re-sistência à imidazolinona ou sulfoniluréia (Pedido de Patente Europeu número0154204); e um gene DHFE resistente a metotrexato (Thillet e outros, 1988).

Outros marcadores exemplares classificáveis incluem: um geneB-glucuronidase ou gene uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qualsão conhecidos vários substratos cromogênicos (Jefferson, 1987; Jeffersone outros, 1987); um gene R-locus, que codifica um produto que regula a pro-dução dos pigmentos de antocianina (de cor vermelha) nos tecidos da planta(Dellaporta e outros, 1988); um gene B-lactamase (Sutcliffe e outros, 1978),que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cro-mogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um ge-ne luciferase (Ow e outros, 1986); um gene xylE (Zukowsky e outros, 1983)que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogê-nicos; um gene B-amilase (Ikatu e outros, 1990); um gene tirosinase (Katz eoutros, 1983), que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPAdopaquinona (que por sua vez condensa em melanina); e uma B-galactosi-dase, que se converterá em um substrato p-galactose cromogênico.

Incluídos nos termos "marcadores selecionáveis ou classifica-veis) estão os genes que codificam um marcador secretavel, cuja secreçãopode ser detectada como um meio de identificar ou selecionar as célulastransformadas. Exemplos incluem os marcadores que codificam um antígenosecretavel que pode ser identificado por interação de anticorpos ou mesmoenzimas secretáveis que podem ser detectadas cataliticamente. As proteí-nas de marcação secretadas selecionáveis se encontram em várias classes,incluindo proteínas pequenas, difundíveis, que são detectáveis, (por exem-plo, por ELISA), pequenas enzimas ativas que são detectáveis na soluçãoextracelular (por exemplo, (3-amilase, p-lactamase, fosfinotricina transferase)ou proteínas que são inseridas ou aprisionadas na parede da célula (taiscomo, proteínas que incluem uma seqüência líder, tal como aquela encon-trada na unidade de expressão de extensão ou tabaco PR-S). Outros genesmarcadores selecionáveis possíveis ficarão claros aos versados na técnica.

Um marcador é preferivelmente GUS, proteína fluorescente ver-de (GFP), {nptll), luciferase (LUX), uma seqüência de codificação de genede resistência ao antibiótico ou uma seqüência de codificação de gene deresistência ao herbicida. O agente selecionável pode ser um antibiótico, porexemplo incluindo, porém não limitado a canamicina, higromicina ou um her-bicida, por exemplo, incluindo, porém não limitado ao glifosato, glifosinato,2,4-D e dicamba.

A região genômica do tipo T possui um valor na seleção associ-ado ao marcador e aplicações de reprodução auxiliadas por marcador. Aseleção para um transgene e haplótipo favorável no caso onde eles compre-endem uma região genômica do tipo T requer apenas um marcador, consi-derando-se que pelo menos dois marcadores seriam necessários, se otransgene e o haplótipo favorável não estivem ligados. Esse valor em poten-cial aumentaria quanto mais regiões genômicas do tipo T estiverem acumu-ladas ou empilhadas em conjunto em um germoplasma.

O valor T pode se alterado ou modificado por alteração da ex-pressão do transgene, onde uma alteração é realizada no nível da expres-são de transgene ou na época da expressão do transgene ou na localizaçãoda expressão de transgene ou qualquer combinação dessas. É antecipadopor essa invenção que a alteração no valor de T realizada por uma alteraçãoem qualquer um dos componentes da expressão de transgene seria efetua-da através de fatores da ação eis (local) ou ação trans (pode atuar a umadistância não simplesmente na molécula de DNA na qual ocorrem), umacombinação desses.

Adicionalmente, o valor de T pode ser alterado ou modificadopor alteração no haplótipo còm o qual o transgene é ligado apertadamente.Uma concretização preferida da presente invenção é o aperfeiçoamento dovalor T por seleção ou direcionamento do transgene de um genômico do tipoT existente em ligação apertada com um haplótipo receptor diferente, onde ohaplótipo diferente é associado ao valor adicional e aperfeiçoado com rela-ção a um traço agronômico ou um índice de traços múltiplos, conforme de-terminado em uma comparação lado a lado ou cabeça a cabeça. Uma alte-ração no haplótipo também seria efetuada por geração ou seleção de pelomenos um haplótipo do tipo T recombinante, que é aperfeiçoado com rela-ção a um traço agronômico ou um índice de traços múltiplos sem relação aohaplótipo do tipo T existente, conforme determinado em uma comparaçãolado a lado replicada ou cabeça a cabeça.

Outra concretização preferida da presente invenção é acrescen-tar um valor adicional a um novo evento de transgene por seleção ou dire-cionamento do transgene para a ligação com um haplótipo receptor, quepossui um valor de reprodução que não é negativo com relação ao rendi-mento ou não é positivo com relação à maturidade, ou é nulo com relação àmaturidade ou entre os 50% melhores com relação a um traço agronômicoou um índice de traços múltiplos em comparação a qualquer outro haplótipono mesmo segmento de cromossoma em um conjunto de germoplasma, ouentre os 50% melhores com relação a um traço agronômico ou um índice detraços múltiplos quando comparado a qualquer outro haplótipo através detodo o genoma em um conjunto de germoplasma, ou alelos conferindo ade-quação agronômica a uma planta de colheita ou haplótipo estando freqüentecom uma freqüência de 50% ou mais em uma população de reprodução ouum conjunto de germoplasma podem ser tomados como evidência de seualto valor ou qualquer combinação desses.

Outra concretização da presente invenção é a seleção de umaplanta ou linhagem para transformação com pelo menos um primeiro trans-gene, onde a seleção da planta ou linhagem se baseia nela compreender emseu genoma uma proporção alta de haplótipos receptores que possuem umvalor de reprodução que não é negativo com relação ao rendimento, nem épositivo com relação à maturidade, ou é nulo com relação à maturidade ouentre os 50% melhores com relação a um traço agronômico ou um índice detraços múltiplos quando comparado a qualquer outro haplotipo no mesmosegmento de cromossoma em um conjunto de germoplasma ou entre os50% melhores com relação ao traço agronômico ou um índice de traços múl-tiplos quando comparado as qualquer outro haplotipo, através de todo o ge-noma em um conjunto de germoplasma, ou alelos conferindo adequaçãoagronômica a uma planta de colheita ou haplotipo estando freqüente comuma freqüência de 50% ou mais em uma população de reprodução ou umconjunto de germoplasma podem ser tomados como evidência de seu altovalor ou qualquer combinação desses.

Essa invenção antecipa um acúmulo ou empilhamento das regi-ões genômicas do tipo T nas plantas ou linhagens, por adição de transgenespor transformação ou por cruzamento de plantas de origem ou linhagenscontendo regiões genômicas do tipo T diferentes, ou qualquer combinaçãodessas. O valor das regiões genômicas do tipo T acumuladas ou empilhadaspode ser estimado pelo valor T composto, que depende da combinação dovalor dos traços de transgene e do valor do(s) haplótipo(s) ao(s) qual(is) ostransgenes estão ligados. A presente invenção adicionalmente antecipa queo valor T composto pode ser melhorado por modificação dos componentesde expressão de um ou cada um dos transgenes empilhados. Adicionalmen-te, a presente invenção antecipa que o valor adicional pode ser acrescido aovalor T do compósito por seleção de pelo menos um haplotipo receptor comum valor de reprodução favorável ao qual um ou qualquer um dos transge-nes está ligado ou por seleção de plantas ou linhagens para empilhamentode transgenes por transformação ou por reprodução ou por qualquer combi-nação dessas.

As colheitas transgênicas as quais um método da presente in-venção pode ser aplicado incluem, porém não são limitadas às colheitas to-lerantes a herbicidas, por exemplo, Roundup Ready® algodão 1445 e88913; Roundup Ready® milho GA21, nk603, MON802, MON809; RoundupReady® beterraba GTSB77 e H7-1; Roundup Ready® Canola RT73 eGT200; semente de colza ZSR500, Roundup Ready® soja 40-3-2, soja con-tendo MON89788, Roundup Ready® agróstea ASR368, HCN10, HCN28 eHCN92 canola, MS1 e RF1 canola, OXY-235 canola, PHY14, PHY35 ePHY36 canola, RM3-3, RM3-4 e RM3-6 chicória, A2704-12, A2704-21,A5547-35, A5547-127 soja, GU262 soja, W62 e W98 soja, 19-51A algodão,31807 e 31808 algodão, BXN algodão, FP967 linho, LLRICE06 e LLRICE62arroz, MON71800 trigo, 676 e 678 e 680 milho, B16 milho, Bt11 milho, CBH-351 milho, DAS-06275-8 milho, DBT418 milho, MS3 e MS6 milho, T14 e T25milho, H177 milho e TC1507 milho. Os herbicidas aos quais as plantastransgênicas demonstraram tolerância foram demonstrados e o método dapresente invenção pode ser aplicado, incluindo porém não limitado a: glifosa-to, glifosinato, sulfoniluréias, imidazolinonas, bromoxinila, dalapon, dicamba,2,4-D, ciclohexanodiona, inibidores de protoporfirinogênio oxidase, e herbici-das isoxaflutol. Moléculas de polinucleotídeo codificando proteínas envolvi-das na tolerância ao herbicida são conhecidas na técnica e incluem, porémnão estão limitadas a uma molécula de polinucleotídeo codificando 5-enolpiruvilchiquimate-3- Patente US número 5.633.435, Patente US número6.040.497 e na Patente US número 5.094.945 para tolerância ao glifosato,todas os quais são incorporadas aqui como referência; polinucleotídeos codi-ficando um glifosato oxidoreductase, glifosato-N-acetil transferase ou glifosa-to descarboxilase (GOX, Patente US número 5.463.175; GAT, Publicaçõesde Patente US número 20030083480 e 20050246798; glifosato descarboxi-lase, Publicações de Patente US número 20060021093; 20060021094;20040177399, incorporadas aqui como referência em sua totalidade); umamolécula de polinucleotídeo codificando bromoxinil nitrilase (Bxn) descrita naPatente US número 4.810.648 para tolerância a bromoxinila, que é incorpo-rada aqui como referência; uma molécula de polinucleotídeo codificando fi-toeno desaturase {crtf) descrita em Misawa e outros, (1993) e Misawa e ou-tros, (1994) para tolerância a norflurazon; uma molécula de polinucleotídeocodificando acetohidróxi ácido (AHAS, aka ALS) descrita em Sathasiivan eoutros (1990) para tolerância aos herbicidas sulfoniluréia; e o gene bar des-crito em DeBlock e outros (1987) para tolerância a glifosinato e bialafos; hi-droxifenil piruvato desidrogenase resistente (HPPD, Patente US número6.768.044). Um promotor de um transgene da presente invenção pode ex-pressar genes que codificam fosfinotricina acetiltransferase, EPSPS resis-tente a glifosato, aminoglicosídeo fosfotransferase, hidroxifenil piruvato desi-drogenase, higromicina fosfotransferase, neomicina fosfotransferase, dala-pon desalogenase, nitrilase resistente a bromoxinila, dicamba monooxigena-se, antranilato sintase, glifosato oxidoreductase, glifosato-N-acetil transfera-se ou glifosato descarboxilase.

Colheitas transgênicas, as quais o método da presente invençãopode ser aplicado incluem, porém não estão limitadas as colheitas resisten-tes aos insetos, por exemplo, eventos de milho, tais como, MON15985, 281-24-236, 3006-210-23, MON531, MON757, MON1076, e COT102; ou eventosde milho, tais como, MIR604, BT176, BT11, CBH-351, DAS-06275-8,DBT418, MON80100, MON810, MON863, TC1507, MIR152V, 3210M e3243M. Colheitas transgênicas resistentes aos insetos podem prover tole-rância aos danos causados pela alimentação das pragas de insetos e mos-traram ser eficazes contra determinadas pragas de insetos lepidópteros ecoleópteros, e outras colheitas transgênicas que podem também prover re-sistência as pragas de plantas, tais como, determinados elementos dos He-mípteros, Homópteros, Ortópteros, Tisanópteros e nematóides parasitas deplantas. Colheitas transgênicas resistentes as doenças, por exemplo, papaiaresistente ao vírus 55-1/63-1 e abóbora resistente ao vírus CZW-3 e ZW20.

Colheitas transgênicas de esterilidade masculina, por exemplo, canolaPHY14, PHY35 e PHY36 e eventos de milho 676, 678, 680, MS3 e MS6.Plantas de colheita transgênicas adicionais podem também prover resistên-cia aos organismos de fungos e bactérias que causam doença as plantas.A presente invenção contempla as colheitas transgênicas lista-das acima e germoplasma compreendendo as regiões genômicas do tipo Tpara uso na reprodução e empilhamento de regiões genômicas do tipo T, ouhaplótipos identificados por um método de mapeamento indireto ou qualquercombinação desses para aumentar o valor do tipo T ou a qualidade do ger-moplasma total, conforme descrito nos métodos da presente invenção.Haplótipos

Um "haplótipo" é um segmento de DNA no genoma de um orga-nismo que presume-se seja idêntico por descendência de indivíduos diferen-tes quando o conhecimento da identidade por estado em um ou mais locaisé o mesmo nos indivíduos diferentes, e que a quantidade regional de dese-quilíbrio de ligação nas vizinhanças daquele segmento do mapa físico ougenético é alta. Um haplótipo pode ser rastreado através de populações esua associação estatística com um dado traço pode ser analisada. Assim,um estudo de associação de haplótipo permite que se defina a freqüência etipo de haplótipo veículo ancestral. Um "estudo de associação" é um experi-mento genético onde se testa o nível de falha da aleatoriedade entre a se-gregação de alelos em um ou mais locais de marcadores e o valor do fenóti-po individual para um ou mais traços. Estudos de associação podem se fei-tos nos traços quantitativos ou categóricos, contabilizando ou não a estruturade população e/ou estratificação.

Uma análise de haplótipo é importante, pelo que aumenta a for-ça estatística de uma análise envolvendo marcadores bialélicos individuais.Em um primeiro estágio de uma análise de freqüência de haplótipo, é deter-minada a freqüência dos haplótipos possíveis com base nas inúmeras com-binações de marcadores bialélicos identificados da invenção. Uma freqüên-cia de haplótipo é então comparada às populações distintas e população demapeamento. De modo geral, como resultado do aperfeiçoamento do ger-moplasma anterior, quanto maior a freqüência de haplótipo em uma popula-ção do conjunto de germoplasma, maior seu valor deve ser para o germo-plasma, descrito como os alelos associados a adequação agronômica deuma planta de colheita (Patente US número 5.437.697, incorporada aquicomo referência em sua totalidade. Um haplótipo favorável pode ser selecio-nado com base em sua freqüência em um conjunto de germoplasma, geral-mente uma freqüência de 50% ou mais indicaria que o haplótipo possui umvalor no germoplasma. Um haplótipo que ocorre em uma freqüência maiorseria favorável para alvejar um transgene ou seleção de um tipo T, onde ohaplótipo possui uma freqüência alta no germoplasma seria considerado fa-vorável. Um haplótipo ocorrendo em qualquer freqüência no germoplasmapode ser correlacionado a um traço e o haplótipo pode receber um valor combase em um traço simples ou uma combinação de traços. Um haplótipo fa-vorável fornecerá um ou mais traços favoráveis ao germoplasma. Em geral,qualquer método conhecido na técnica para testar se um traço e um genóti-po mostram uma correlação estatisticamente significativa pode ser empre-gado. Métodos para determinar o significado estatístico de uma correlaçãoentre o fenótipo e um genótipo, nesse caso um haplótipo, podem ser deter-minados por qualquer teste estatístico conhecido na técnica e com qualquerlimite aceito de significado estatístico sendo necessário. A aplicação dos mé-todos específicos e limites de significado são do conhecimento de um versa-do na técnica.

Nas populações de reprodução de planta, o desequilíbrio de li-gação (LD) que é o nível de falha da associação aleatória entre dois ou maislocais em uma população, freqüentemente persiste nos segmentos cromos-sômicos grandes. Embora seja possível que se esteja envolvido no efeitoindividual de cada gene no segmento, para uma finalidade de reprodução deplanta prática, a questão geralmente é o impacto médio da região para o(s)traço(s) de interesse quando presente(s) em uma linhagem, híbrido ou vari-edade. A quantidade de paridade de LD (usando a estatística r2) foi colocadaem gráfico contra a distância de centiMorgans (cM, um centésimo de umMorgan, em média uma recombinação por meiose, recombinação é ao resul-tado da troca recíproca do segmento cromatídico entre cromossoma homó-logo emparelhado em meiose e é geralmente observada através da associa-ção dos alelos nos locais ligados de avós diferentes na progênie) entre osmarcadores para um conjunto de germoplasma de referência, por exemplo,um conjunto de linhagens US elite de soja 791 e locais SNP 1211 com umafreqüência de alelo rara superior a 5%. Uma curva média de movimento de200 pontos de dados era um indicador da presença de LD, mesmo para lo-cais 10 cM separados. Assim, quando se prevê o efeito médio dos segmen-tos de cromossoma, pode-se considerar segmentos com alguns centiMor-gans de comprimento e isso é a acepção fornecida a uma região de haplóti-po, que é um segmento de cromossoma que possui alguns centiMorgans decomprimento que persiste em reação às múltiplas gerações de reprodução eque é transportado por uma ou mais linhagens de reprodução. Esse seg-mento pode ser identificado com os múltiplos locais de marcador ligado quecontém, e a identidade do haplótipo comum nesses locais em duas linha-gens fornece um alto grau de confiabilidade à identidade por descendênciade todo o segmento de cromossoma subjacente transportado por essas li-nhagens.

Será especificado quais são os haplótipos favoráveis e qual é asua freqüência no germoplasma. Assim, pode-se obter ou gerar um examedo marcador molecular do germoplasma considerando-se a reprodução e/oupropagação de um evento de transformação. Esse exame marcador geraráuma impressão digital de cada linhagem. Presume-se que esses marcadorestenham sua posição aproximada conhecida no mapa genômico. Para simpli-ficar as análises a jusante, a garantia de qualidade e etapas de estimativa dedados faltantes, podem precisar ser implementadas nesse estágio para pro-duzir uma matriz de dados completa e acurada (genótipo de marcador porlinhagem). As detecções de erro e estimativas de dados faltantes podemrequerer o uso de testes de descendência de origem, LD entre locais demarcador, mapeamento de intervalo, regenotipagem, etc.

Os marcadores são então agrupados com base em sua proximi-dade. Esse agrupamento pode ser arbitrário (por exemplo, "começar de umaextremidade do cromossoma e incluir todos os marcadores que estão dentrode 10 cM do primeiro marcador incluído no segmento, antes de iniciar o pró-ximo segmento") ou com base em algumas análises estatísticas (por exem-plo, "define os pontos de rompimento do segmento, com base nos parceirosLD entre locais adjacentes").

Quando um grande conjunto de linhagens for considerado, emúltiplas linhagens tiverem o mesmo alelo em um local de marcador, seránecessário determinar se a identidade por estado (IBS) no local do marcadoré uma boa previsora da identidade por descendente (IBD) na região cromos-sômica circundando o local do marcador. "Identidade por descendente" (IBD)caracteriza dois locais/segmento de DNA que são transportados por dois oumais indivíduos e são todos derivados do mesmo ancestral. "Identidade porestado" (IBS) caracteriza dois locais/segmentos de DNA que são transporta-dos por dois ou mais indivíduos e possuem os mesmos alelos nos locais ob-serváveis. Uma boa indicação que o número de locais de marcador em umsegmento é suficiente para caracterizar IBD para o segmento é que eles po-dem predizer os alelos presentes em outros locais de marcador dentro dosegmento.

Para estimar a freqüência de um haplótipo, o germoplasma dereferência de base precisa ser definido (coleta de linhagens de congênitosde elite, população de indivíduos de combinação aleatória, etc.) e uma a-mostra representativa (ou a população total) precisa ser genotipada. A fre-qüência do haplótipo pode então ser determinada por contagem simples,caso considerando um conjunto de indivíduos congênitos de reprodução. Osmétodos de estimativa que empregam técnicas de computação semelhantesao algoritmo Expectativa/Maximização serão necessários se os indivíduosgenotipados forem heterozigotos na maior parte dos locais no segmento efase de ligação for desconhecida (Excoffier e Slatkin, 1995). Preferivelmente,é usado um método com base em um algoritmo de expectativa-maximização(EM) (Delpster e outros, 1977) conduzindo a estimativas de probabilidademáxima de freqüência de haplótipos de acordo com a presunção das pro-porções de Hardy-Weinberg (combinação aleatória) (Excoffier e Slatkin,1995). Com as estimativas do haplótipo, e a identidade de cada segmentode cromossoma para cada linhagem de hospedeiro candidato, é adicional-mente possível classificar as linhagens de acordo com sua probabilidade desurgimento de eventos localizados em haplótipos de valor alto. Várias distri-buições de probabilidade de um evento a ser localizado em um segmento decromossomo poderiam ser usadas, de acordo com o grau de conhecimentoadquirido no tamanho físico de cada segmento e o modo seguindo um pa-drão ou aleatório de inserção de um transgene no genoma. Abordagens al-ternativas podem ser empregadas para realizar os estudos de associação:estudos de associação ampla ao genoma, estudos de associação de regiãocandidata e estudos de associação de gene candidato. Os marcadores bialé-licos da presente invenção podem ser incorporados em qualquer mapa dosmarcadores genéticos de um genoma de planta, a fim de realizar os estudosde associação ampla de genoma.

A presente invenção compreende métodos para detectar umaassociação entre um haplótipo e uma propriedade favorável ou um índice detraços múltiplos. Um índice de traços múltiplos (MTI) é uma entidade numé-rica que é calculada através da combinação de valores de traço simples emuma fórmula. Mais freqüentemente calculado como uma combinação linearde traços ou desvios normalizados de traços, pode ser o resultado de cálcu-los mais sofisticados (por exemplo, uso de razões entre os traços). Esse MTIpode então ser usado em análise genética como se fosse um traço. Um ha-plótipo favorável prove uma propriedade favorável a uma planta de origem eà progênie de origem quando selecionada por um meio marcador ou meiofenotípico. O método da presente invenção prove seleção de haplótipos fa-voráveis e o acúmulo de haplótipos favoráveis em uma população de repro-dução, por exemplo, um ou mais dos haplótipos identificados na presenteinvenção. Em uma concretização específica da presente invenção, umtransgene está associado ao haplótipo favorável para criar um tipo T que éacumulado com outros haplótipos favoráveis para melhora um germoplasma.Acúmulo de regiões genômicas do tipo T e haplótipos favoráveis

Outra concretização dessa invenção é um método para melhoraro acúmulo de um ou mais haplótipos em um germoplasma. A transformaçãode uma célula de planta com um transgene significa que o DNA do transge-ne foi inserido na região de DNA genômica da planta. As regiões genômicasdefinidas como regiões de haplótipo incluem informação genética e fome-cem traços fenotípicos à planta. As variações nas informações genéticasresultam na variação do traço fenotípico e o valor do fenótipo pode ser me-dido. O mapeamento genético das regiões de haplotipo e o mapeamentogenético de um evento de inserção de transgene permitem a determinaçãoda ligação de uma inserção de transgene com um haplotipo. Qualquer trans-gene que tenha uma seqüência de DNA que seja nova no genoma de umaplanta transformada pode servir propriamente como um marcador genéticodo transgene e da região genômica na qual foi inserido. Por exemplo, napresente invenção, um transgene que foi inserido no genoma de uma plantade soja prove a expressão de uma 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintaseresistente ao glifosato que possui uma seqüência de codificação de DNAcompreendida dentro da SEQ ID NO:28, descrita na Patente US número6.660.911 e SEQ ID NO:9 descrita na Patente US número 5.633.435, ambasincorporadas aqui como referência, a partir da qual um iniciador de DNA oumolécula de sonda pode ser selecionada para funcionar como marcador ge-nético para o transgene no genoma.

Adicionalmente, um transgene pode prover um dispositivo paraselecionar plantas que possuem a inserção e a região de haplotipo ligada. Aseleção pode ser devida à tolerância a uma substância química fitotóxicaaplicada, tal como um herbicida ou antibiótico. A seleção pode ser devida àdeterminação de um produto de um transgene, por exemplo, um mRNA ouproduto de proteína. A seleção pode ser conduzida por detecção do DNA detransgene inserido dentro do genoma da planta. Um transgene pode tambémprover um dispositivo de seleção fenotípico, tal como, um fenótipo morfológi-co que é fácil de ser observado, podendo ter a cor da semente, característi-cas de germinação da semente, características de crescimento da semente,aparência da folha, arquitetura da planta, altura da planta e morfologia da flore fruto, ou seleção com base no fenótipo agronômico, tal como, rendimento,tolerância aos herbicidas, tolerância as doenças, tolerância aos insetos, qua-lidade de alimento melhorada, tolerância à estiagem, tolerância ao frio ouqualquer outro traço agronômico provido por um transgene.

Durante o desenvolvimento de plantas de colheita aperfeiçoadaspor inserção de genes transgênicos freqüentemente centenas de plantas sãoproduzidas com localizações de inserção de transgene diferentes. Esseseventos de inserção ocorrem através de todo genoma da planta e são incor-porados em ligações apertadas com muitas regiões de haplótipo diferentes.

A presente invenção prove a classificação dos eventos transgênicos quepossuem uma inserção de transgene em ligação apertada com regiões dehaplótipo favoráveis e seleção desses eventos para uso em um programa dereprodução para melhorar o acúmulo de regiões de haplótipo favoráveis. Ométodo inclui: a) inserção de um transgene em um genoma de uma célulade planta e regeneração da célula de planta em uma planta transformadaintacta usando métodos de transformação e regeneração de planta anteri-ormente descritos e conhecidos na técnica da biotecnologia da planta; e b)determinação de uma localização do mapa do transgene no genoma daplanta transformada usando marcadores de DNA do transgene e regiõesgenômicas listadas; e c) correlação da localização no mapa com um haplóti-po ligado apertadamente, onde o transgene e o haplótipo compreendemuma região genômica do tipo T na planta transformada; e d) cruzamento daplanta transformada com uma segunda planta que pode também ser trans-formada para conter pelo menos uma região genômica do tipo T que é dife-rente da primeira região genômica do tipo T de planta transformada ou a se-gunda planta pode conter uma região de haplótipo favorável identificada pormarcadores genéticos que seja diferente da primeira planta transformada; ee) seleção de pelo menos uma planta de progênie por detecção da expres-são do transgene da primeira planta ou seleção pela presença de um mar-cador associado ao transgene, onde a planta de progênie compreende emseu genoma pelo menos uma porção da região genômica do tipo T da pri-meira planta e pelo menos uma região genômica do tipo T ou haplótipo favo-rável da segunda planta; e f) usando a planta de progênie em atividades re-lacionadas germoplasma, aperfeiçoamento das atividades selecionadas dogrupo consistindo no emprego da planta para obtenção de cruzamentos dereprodução, teste adicional da planta, avanço da planta através da autoferti-lização, uso da planta ou partes da mesma para transformação, uso da plan-ta ou partes da mesma para mutagênese e uso da planta ou partes da mes-ma para CULTIVO (por exemplo, McCalIum e outros, 2000).

Utilizando esse método, a presente invenção contempla que re-giões genômicas do tipo T preferidas são selecionadas de uma grande popu-lação de regiões genômicas do tipo T e as regiões genômicas do tipo T pre-feridas possuem um valor T melhorado no germoplasma de uma planta decolheita. Adicionalmente, a região genômica do tipo T preferida pode ser u-sada no método de reprodução descrito para acumular outras regiões ge-nômicas do tipo T benéficas e regiões de haplótipo favoráveis e manter asmesmas em uma população de reprodução para melhorar o germoplasmatotal da planta de colheita. As plantas de colheita consideradas para uso nométodo incluem, porém não estão limitadas ao milho, soja, algodão, trigo,arroz, semente de colza, beterraba, sorgo, painço, alfafa, colheitas de vege-tais, árvores de floresta e colheitas de frutas.

Mapeamento do qenoma de uma região genômica do tipo T

Outra concretização dessa invenção é um método para mapea-mento indireto de pelo menos uma região genômica do tipo T. O mapeamen-to da região genômica do tipo T no genoma de uma planta prove a seleçãode regiões de haplótipo favoráveis que compreendem a região genômica dotipo T. A presente invenção prove um método para mapeamento do eventode inserção de transgene e sua associação á região genômica e localizaçãono mapa genômico da planta. O método pode incluir as seguintes etapas:

(a) obtenção da seqüência de DNA do genoma flanqueando oevento de inserção de transgene;

(b) comparação do cromatograma da seqüência de DNA paraeliminar seqüências parálogas quando duas ou mais seqüências de alta ho-mologia são obtidas;

(c) busca pela seqüência de DNA em uma base de dados deseqüência para verificar se o evento de inserção interrompeu um gene en-dógeno;

(d) projetando um ou vários pares de moléculas iniciadoras deDNA em uma ou ambas as regiões genômicas 5' e 3' flanqueando a inserçãodo transgene. Quando múltiplos pares de iniciadores são projetados, issopode ser feito de modo a ser obter sobreposição de produtos da PCR decada região de flanqueamento genômico para garantir cobertura substancialdo DNA genômico associado;

(e) uso das linhagens de origem de população(ões) de mapea-mento como modelo para PCR;

(f) seqüenciamento dos produtos da PCR obtidos dessas combi-nações de iniciadores/linhagem;

(g) identificação de SNPs ou outro aspecto polimórfico, tal como,indels ou SSRs, entre as origens de pelo menos uma das populações demapeamento;

(h) repetição das etapas (d) a (g) em uma seqüência de flanque-amento adicional, saída do sítio de inserção nas direções 5' e 3', até os sítiospolimórficos serem encontrados ou obtenção de outros adicionais;

(i) projeto de um ensaio para classificar as plantas de progênieda(s) população(ões) de mapeamento;

(j) realização de uma análise de ligação para determinar a posi-ção do mapa desses polimorfismos e conseqüentemente do local do evento;

(k) correlacionar a posição do mapa com a localização de umaregião de haplótipo.

O genomâ flanqueando o evento de inserção de transgene podecompreender um segmento de DNA de algumas centenas a dezenas de mi-lhares de pares de base de nucleotídeo ou um comprimento suficiente paraidentificar um polimorfismo. A região de flanqueamento genômico pode serda extremidade 5' ou 3' da localização de inserção do transgene, estenden-do-se para o genoma a partir do sítio de inserção. A "reação da cadeia dapolimerase" (PCR) é um processo de ampliação geométrica in vitro de umsegmento de DNA alvo através do uso de uma DNA polimerase resistenteao calor e variação cíclica de temperatura para permitir a desnaturação repe-titiva, recombinação do iniciador e ampliação ou modelamento do DNA. "Se-qüências parálogas" são duas seqüências de DNA com um alto grau de si-milaridade, porém, pertencendo a locais diferentes no genoma. Uma "popu-lação de mapeamento" refere-se a um conjunto de indivíduos onde os alelosnos locais de marcador e possivelmente em um ou mais dos Locais de TraçoQuantitativos (QTL) são segregacionais, em um modo que a presença dedesequilíbrio de ligação pode ser tomada como evidência de proximidade nocromossoma e existindo correlações positivas entre a proximidade e o dese-quilíbrio. A população de mapeamento é a mesma em espécies de planta ouuma espécie de planta demostrando sitenia ou colinearidade. Essas popula-ções podem ser empregadas para estimar as posições relativas dos locaisde marcador entre as mesmas ou entre aquelas e QTLs. As populações demapeamento em geral são populações segregacionais. O método pode seraplicado a qualquer espécie de colheita, espécies de colheita importante eespecíficas são, por exemplo, milho, soja, algodão, trigo, arroz, canola, óleode colza, beterraba, sorgo, painço, alfafa, colheitas de vegetais, árvores dafloresta e colheitas de frutos. Existem mapas disponíveis ao versado na téc-nica para uma ou mais dessas colheitas, por exemplo, os mapas genéticoscom referência ao milho (Lee e outros, 2002), soja (Ferreira e outros, 2000),algodão (Lacape e outros, 2003), e canola (Cheung e outros, 1997). Popula-ções de mapeamento de novo podem também ser geradas para qualquercolheita de interesse e um mapa genético criado sendo útil na presente inven-ção para mapear as regiões de haplótipo nas quais é inserido um transgene.

A identificação das regiões de DNA genômicq clonadas por e-xemplo, aquelas contidas em uma biblioteca Bac pode ser sondada commarcadores e DNA desenvolvidos para identificar o haplótipo ligado a umainserção transgênica. Marcadores de DNA adicionais podem ser desenvolvi-dos por seqüenciamento dos clones Bac e inspeção quanto aos polimorfis-mos na seqüência. Os genes de interesse podem ser isolados dos clonesBac que podem ser usados como transgenes para melhorar o desempenhodas mesmas espécies de colheita ou espécies de colheita diferentes.

Vetores e Transgenes Recombinantes

Os meios para preparação de vetores recombinantes são bem-conhecidos na técnica. Os métodos para fabricação de vetores recombinan-tes especificamente apropriados para transformação de planta incluem, semlimitação, aqueles descritos nas Patentes US número Números 4.971.908,4.940.835, 4.769.061 e 4.757.011. Esses tipos de vetores também foramrevistos (Rodriguez e outros, 1988; Glick e outros, 1993).

Vetores típicos úteis para expressão de ácidos nucléicos emplantas maiores são bem-conhecidos na técnica e incluem vetores derivadosde plasmídeo de indução de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Ro-gers e outros, 1987). Outros vetores recombinantes úteis para transformaçãode planta incluindo o vetor de controle de transferência de pCaMVCN, tam-bém foram descritos (Fromm e outros, 1985). Muitas espécies de colheitasforam transformadas para conter um ou mais transgenes de importância a-gronômica que propriamente fornecem uma propriedade favorável à planta.

Um exemplo é um transgene que confere tolerância aos herbicidas à plantade colheita. Os transgenes que codificam proteínas de tolerância ao herbici-da que foram transformados e expressos nas plantas incluem, por exemplo,proteína 5-enolpiruvilchiquimate-3-fosfato sintase (EPSPS) conferindo resis-tência ao glifosato e proteínas conferindo resistência a outros herbicidas, taiscomo, glifosinato ou bromoxinila (Cornai e outros, 1985; Gordon-Kamm eoutros, 1990; Stalker e outros, 1988; Eichholtz e outros, 1987; Shah e outros,1986; Charest e outros, 1990). Exemplos adicionais incluem a expressão deenzimas, tais como, dihidrofolato reductase e acetolactato sintase, mutanteALS e enzimas AHAS que conferem resistência aos herbicidas imidazolino-na ou sulfoniluréia (Lee e outros, 1988 e Miki e outros, 1990), uma fosfinotri-cin-acetil-transferase conferindo resistência à fosfinotricina (Pedido Europeunúmero 0 242 246), proteínas conferindo resistência aos ácidos fenóxi propi-ônico e ciclohexonas, tais como, setoxidima e haloxifop (Marshall e outros,1992); e proteínas conferindo resistência à trizina (genes psbA e gs+) e ben-zonitrila (genes codificando nitrilase, Przibila e outros (1991).

Uma planta da presente invenção pode também compreenderum transgene que confere resistência ao ataque de insetos, pragas, vírus oubactérias. Por exemplo, um transgene conferindo resistência a uma praga,tal como, nematódio cyst de soja foi descrita no Pedido de Patente PCTWO96/30517 e no Pedido de Patente PCT W093/19181. Jones e outros(1994) descreve a clonagem do gene Cf-9 para resistência ao Cladosporiumfulvum); Martin e outros (1993) descreve um gene Pto do tomate resistenteao Pseudomonas syringae pv. e Mindrinos e outros (1994) descreve um ge-ne Arabidopsis RSP2 para resistência ao Pseudomonas syringae. Endotoxi-nas Bacillus thuringiensis podem também ser usadas para resistência aosinsetos, por exemplo, Geiser e outros (1986).

A expressão de proteínas de revestimento viral ou transgenesnas células de plantas transformadas é conhecida por fornecer resistência àinfecção viral e/ou desenvolvimento de doenças afetadas pelos vírus do qualo gene de proteína de revestimento é derivado, bem como por vírus correla-tos (Beachy e outros, 1990).

Os transgenes podem também ser usados para conferir valornutricional melhorado ou outros traços de adição de valor. Um exemplo é ometabolismo do ácido graxo modificado, por exemplo, por transformação daplanta com um gene de anti-sentido de estearoil-ACP desaturase para au-mentar o teor de ácido estérico da planta (Knutzon e outros, 1992). Um genede sentido de desaturase pode também ser introduzido para alterar o teor deácido graxo. O teor de ftato pode ser modificado por introdução de um genede codificação de fitase para melhorar o rompimento do ftato, adicionandomais fosfato livre à planta transformada. Composição de carboidrato modifi-cado pode também ser afetada, por exemplo, por transformação das plantascom um gene codificando uma enzima que altera o padrão de ramificação doamido (Shiroza e outros, 1988, seqüência de nucleotídeo de Streptococcusmutants do gene fructosiltransferase); Steinmetz e outros (1985) (seqüênciade nucleotídeo de Bacillus subtilis do gene levansucrase); Pen e outros(1992), produção de plantas transgênicas que expressam Bacillus licheni-fonnis de a-amilase); Elliot e outros (1993), seqüências de nucleotídeo dosgenes tomate invertase); Sogaard e outros (1993), mutagêneses direcionadaao sítio do gene de cevada de a-amilase; e Fisher e outros (1993), enzimado tipo II ramificando amido de endosperma do milho.

Os transgenes podem também ser usados para alterar o meta-bolismo da proteína. Por exemplo, a Patente US número 5.545.545 descrevesintase do ácido diidrodipicolínico de milho insensível à lisina (DHPS) que ésubstancialmente resistente às concentrações de L-lisina que de outra formainibem a atividade de DHPS nativo. De modo semelhante, a EP 0640141descreve seqüências codificando aspartocinase insensível à lisina (AK) ca-pazes de causar uma produção maior que a normal de treonina, bem comoum subfragmento codificando lisina de anti-sentido cetogluratato reductasepara aumento de lisina.

Pode ser empregado um transgene que altera o metabolismo docarboidrato da planta. Por exemplo, os genes frutocinase são conhecidospara uso na transformação metabólica da expressão do gene de frutocinaseem plantas transgênicas e seus frutos (Patente US número 6.031.154). E-xemplos adicionais de transgenes que podem se usados são genes que alte-ram o rendimento do grão. Por exemplo, a Patente US número 6.486.383descreve modificação do teor de amido nas plantas com proteínas de subu-nidade de adenosina difosfoglicose pirofosforilase ("ADPG PPase"). NaEP0797673, são discutidas as plantas transgênicas, onde a introdução eexpressão das moléculas de DNA específicas resultam na formação de po-ols de fosfato facilmente mobilizados fora do vacúolo e uma produção debiomassa melhorada e/ou comportamento de florescimento alterado. Aindaadicionalmente conhecidos são os genes para alterar a maturidade da plan-ta. A Patente US 6.774.284 descreve DNA codificando uma lipase de plantae métodos para uso da mesma para controle de senescência das plantas. APatente US 6.140.085 prove genes FCA para alterar as características defloração, especificamente época de floração. A Patente US 5.637.785 des-creve plantas geneticamente modificadas possuindo desenvolvimento de flormodulado, tal como, possuindo desenvolvimento de meristema floral precocee compreendendo um gene estrutural codificando a proteína LEAFY em seugenoma.

Os genes para alterar as características morfológicas da plantasão também conhecidos e podem ser usados de acordo com a invenção. APatente US 6.184.440 descreve plantas transformadas geneticamente quedescrevem estrutura ou morfologia alterada, como resultado da pressão deum transgene de modulação de parede da célula. Exemplos de transgenesde modulação de parede de célula incluem um domínio de ligação de celulo-se, uma proteína de ligação de celulose ou uma proteína de modificação deparede de celulose ou enzima, tal como, endoxiloglicano transferase, xilogli-cano endotransglicosilase, uma expansina, celulose sintase ou uma novaendo-1,4-p-glucanase isolada.

Um transgene que prove uma propriedade favorável pode estarassociado à morfologia da planta, fisiologia, crescimento e desenvolvimento,rendimento, melhoramento nutricional, resistência à doença ou praga, outolerância ambiental ou química. Um transgene que prove um traço agronô-mico benéfico às plantas de colheita pode incluir, porém não está limitadoaos exemplos que se seguem de elementos genéticos resistentes aos herbi-cidas (Patente US número 5.633.435 e Patente US número 5.463.175), ren-dimento aumentado (Patente US número 5.716.837), controle de insetos(Patente US número 6.063.597; Patente US número 6.063.756; Patente USnúmero 6.093.695; Patente US número 5.942.664; e Patente US número6.110.464), resistência a doença por fungos (Patente US número 5.516.671;Patente US número 5.773.696; Patente US número 6.121.436; Patente USnúmero 6.316.407 e Patente US número 6.506.962), resistência aos vírus(Patente US número 5.304.730 e Patente US número 6.013.864), resistênciaaos nematóides (Patente US número 6.228.992), resistência as doençasbacterianas (Patente US número 5.516.671), produção de amido (PatenteUS número 5.750.876 e Patente US número 6.476.295), produção de óleosmodificados (Patente US número 6.444.876), produção de óleo superior (Pa-tente US número 5.608.149 e Patente US número 6.476.295), teor de ácidograxo modificado (Patente US número 6.537.750), alta produção de proteína(Patente US número 6.380.466), amadurecimento dos frutos (Patente USnúmero 5.512.466), nutrição animal e humana melhoradas (Patente US nú-mero 5.985.605 e Patente US número 6.171.640), biopolímeros (Patente USnúmero 5.958.745 e Publicação de Patente US número US20030028917),resistência ao estresse ambiental (Patente US número 6.072.103), peptídeosfarmacêuticos (Patente US número 6.080.560), traços de processamentomelhorados (Patente US número 6.476.295), capacidade de digestão melho-rada (Patente US número 6.531.648) baixo teor de rafinose (Patente USnúmero 6.166.292), produção industrial de enzima (Patente US número5.543.576), sabor aperfeiçoado (Patente US número 6.011.199), fixação denitrogênio (Patente US número 5.229.114), produção de semente híbrida(Patente US número 5.689.041) e produção de biocombustível (Patente USnúmero 5.998.700), os elementos genéticos, métodos e transgenes descritosnas patentes listadas acima são incorporados aqui como referência.

Alternativamente, uma molécula de polinucleotídeo que pode sertranscrita pode afetar as características da planta mencionada acima ou fe-nótipo por codificação de uma molécula de RNA que causa inibição alvejadada expressão de um gene endógeno, por exemplo, através de anti-sentido,RNA inibidor (RNAi) ou mecanismos mediados por co-supressão. O RNApoderia ser também uma molécula de RNA catalítica (isto é, uma ribozima)transformada para clivar um produto de RNAm endógeno desejado. Deter-minadas moléculas de RNA podem também ser expressas nas células dasplantas que inibem os alvos nos organismos diferentes de plantas, por e-xemplo, insetos que se alimentam das células da planta e ingerem o RNAinibidor, ou nematóides que se alimentam das células da planta e ingerem oRNA inibidor. Assim, qualquer molécula de polinucleotídeo que pode sertranscrita que codifica uma molécula de RNA transcrita que afeta uma alte-ração de fenótipo ou morfológica de interesse pode ser útil para a prática dapresente invenção.

Reprodução e Marcadores

As técnicas de reprodução tiram vantagem do método de polini-zação das plantas. Existem dois métodos gerais de polinização: a autopolini-zação, que ocorre se o pólen de uma flor for transferido para a mesma ououtra flor da mesma planta e a polinização cruzada, que ocorre se o pólenvem de uma flor em uma planta diferente. As plantas que são autopoliniza-das e selecionadas por tipo por muitas gerações se tornam homozigotas namaior parte dos locais de gene e produzem uma população uniforme da ver-dadeira progênie de reprodução, plantas homozigotas.No desenvolvimento de variedades apropriadas, a reproduçãocom pedigree pode ser usada. O método de reprodução com pedigree paratraços específicos envolve cruzamento de dois genotipos. Cada genótipopode ter uma ou mais características desejáveis; ou cada genótipo podecomplementar o outro. Se dois genotipos de origem não fornecerem todasas características desejadas, outros genotipos podem ser incluídos na popu-lação de reprodução. Plantas superiores que são os produtos desses cru-zamentos tem existência própria e são novamente avançadas em cada ge-ração sucessiva. Cada geração que se sucede se torna mais homogêneacomo resultado da autopolinização e seleção. Tipicamente, esse método dereprodução envolve cinco ou mais gerações de existência própria e seleção:S-i->S2; S2->S3; S3->S4; S4->S5,etc. Uma geração própria (S) pode ser con-siderada como sendo um tipo de geração filial (F) e pode ser denominada Fcomo tal. Após pelo menos cinco gerações, a planta reproduzida é conside-rada geneticamente pura.

Cada programa de reprodução incluiria uma avaliação periódica,objetiva da eficiência do procedimento de reprodução. Os critérios de avalia-ção variam dependendo dos objetivos. As linhagens geradas por endogamiacom a promessa de avanço são completamente testadas e comparadas aospadrões apropriados nos ambientes representativos da(s) área(s) alvo co-mercial(is) geralmente por três ou mais anos. A identificação dos indivíduosque são geneticamente superiores em razão do valor genotípico podem sermascarados por traços de plantas que causam confusão ou fatores ambien-tais. Um método para identificar uma planta superior é observar seu desem-penho em relação a outras plantas experimentais e a uma ou mais varieda-des padrão de crescimento mais difundido. Observações simples podem serconclusivas, enquanto observações replicadas fornecem uma estimativa me-lhor do valor genético.

Seleções de massa e recorrência podem ser usadas para aper-feiçoar as populações de colheitas de polinização própria ou cruzada. Umapopulação geneticamente variável de indivíduos heterozigotos é tanto identi-ficada quanto criada por intercruzamento de várias origens diferentes. Asmelhores plantas são selecionadas com base em superioridade individual,progênie ou excelente capacidade de combinação. As plantas selecionadassão intercruzadas para produzir uma nova população na qual ciclos adicio-nais de seleção são contínuos. As descrições de outros métodos de repro-dução que são geralmente usados para traços diferentes e colheitas podemser encontradas em um dos vários livros de referência (Allard, 1960; Sim-monds, 1979; Sneep and Hendriksen, 1979; Fehr, 1987; Fehr, 1987).

A eficácia da seleção para genótipos com traços de interessemelhorados (por exemplo, uma propriedade favorável, tal como, rendimentode um produto de planta colhido, por exemplo, rendimento de um grão, se-mente, fruto, fibra, forragem ou um traço agronômico, por exemplo, resisten-te às pragas, tais como, resistência a doenças, resistência aos isentos, resis-tência aos nematóides, ou razão de crescimento aperfeiçoada, e tolerânciaao estresse; ou um produto processado aperfeiçoado da planta, por exem-pio, rendimento do ácido graxo, rendimento do aminoácido, teor nutricional,qualidade da fibra) em um programa de reprodução dependerão: 1) da ex-tensão na qual a variedade nos traços de interesse das plantas individuaisem uma população é o resultado de fatores genéticos e é assim transmitidapara as progênies dos genótipos selecionados e 2) quanto a capacidade devariação dos traços de interesse entre as plantas se deve ao ambiente noqual genótipos diferentes estão crescendo. A hereditariedade dos traços va-ria do controle por um gene principal cuja expressão não é influenciada peloambiente (isto é, caracteres qualitativos) para controle por muitos genes cu-jos efeitos são muito influenciados pelo ambiente (isto é, caracteres quantita-tivos). A reprodução para traços quantitativos tais como, rendimento, é adi-cionalmente caracterizada pelo fato de que: 1) as diferenças resultando doefeito de cada gene são pequenas, tornado difícil ou impossível identificar asmesmas individualmente; 2) o número de genes contribuindo para um cará-ter é grande, de modo que, razões de segregação distintas são raras, sesempre obtidas; e 3) os efeitos dos genes podem ser expressos de modosdiferentes com base na variação ambiental. Portanto, a identificação acerta-da dos segregados transgredidos ou genótipos superiores com os traços deinteresse é extremamente difícil e seu sucesso depende da capacidade re-produtora da planta para minimizar a variação ambiental afetando a expres-são do caráter quantitativo na população.

A probabilidade de identificar um segregador transgressivo émuito reduzida, quando o número de traços combinados em um genótipo éaumentado. Conseqüentemente, todo reprodutor pode geralmente esperarobter uma classificação favorável de genes para o primeiro caráter complexocombinado com uma classificação favorável de genes para o segundo cará-ter em um genótipo além de um gene selecionado.

A introgressão de uma região genômica específica em um con-junto de regiões genomicas que contém um transgene ou transgenes em umgermoplasma de planta é definida como o resultado do processo da conver-são de retrocruzamento. Um germoplasma de planta onde uma nova se-qüência de DNA foi introgredida pode ser referida como um genótipo, linha-gem, congênito ou híbrido convertido em retrocruzamento. Adicionalmente,uma introgressão de uma região genômica específica ou transgene pode serconduzida por um processo de reprodução a frente. Similarmente, um genó-tipo de planta que não possui a seqüência de DNA desejada pode ser referi-do como um genótipo, linhagem, congênito ou híbrido não convertido. Du-rante a reprodução, os marcadores genéticos ligados à região genômica dotipo T podem ser usados para auxiliar na reprodução com o fim de produzirsoja com rendimento aumentado e um traço transgênico. O retrocruzamentoe a seleção auxiliada por marcador ou reprodução a frente e seleção auxilia-da por marcador, especificamente, podem ser usados com a presente inven-ção para introduzir a região genômica do tipo T em qualquer variedade porconversão daquela variedade.

Em outra concretização dessa invenção, as seqüências marca-doras são providas, sendo geneticamente ligadas e podendo se usadas paraseguir a seleção de haplótipos de soja ou milho. As bibliotecas genomicasde múltiplas linhagens de milho ou soja são constituídas por isolamento doDNA genômico de diferentes linhagens de milho ou soja pelo "Plant DNAzolReagent" da Life Technologies agora Invitrogen (Invitrogen Life Technologi-es, Carlsbad, CA). Os DNA genômicos são digeridos com enzima de restri-ção Pst endonuclease, fracionada em tamanho para 1% de gel agarose eligada no vetor de plasmídio para seqüenciamento pelas técnicas de biologiamolecular padrão, conforme descrito em Sambrook e outros. Essas bibliote-cas são seqüenciadas por procedimentos padrão no Sequenciador de DNAABI Prism®377 usando reagentes disponíveis comercialmente (Applied Bi-osystems, Foster City, CA). Todas seqüências são montadas para identificarseqüências não redundantes por Pangea Clustering and Alignment Tools,que se encontra disponível na DoubleTwist Inc., Oakland, CA. A seqüênciade múltiplas linhagens de milho ou soja são montada nos locais possuindoum ou mais polimorfismos, tais como, SNPs e/ou Indels. Os polimorfismoscandidatos são qualificados pelos parâmetros que se seguem:

(a) O comprimento mínimo de um mapa físico de um cromosso-ma ou feto que se desenvolve sozinho para um alinhamento de consenso éde 200 bases;

(b) A porcentagem de identidade das bases observadas em umaregião de 15 base em cada lado de um SNP candidato é de pelo menos 75%.

(c) A qualidade Phred mínima em cada mapa físico de um cro-mossoma em um sítio de polimorfismo é 35.

(d) A qualidade Phred mínima em uma região de 15 bases emcada lado do sítio de polimorfismo é de 20.

Os dados lidos dos seqüenciadores automatizados variam signi-ficativamente em qualidade devido à natureza dos nucleotídeos em uma mo-lécula de polinucleotídeo e número de outra razões (Ewing e outros, 1998).

Muitos algoritmos foram desenvolvidos para resolver a questão de chamadade par de base acurada (Giddings e outros, 1993; Berno, 1996; Lawrenceand Solovyev, 1994). O algoritmo mais amplamente usado calcula a quali-dade da seqüência como "q" na equação q = - 10 X Iog10(p), onde p é aprobabilidade de erro estimada daquela chamada de base (Ewing and Gre-en, 1998). Assim, uma chamada de base possuindo uma probabilidade de1/1000 de ser incorreta em uma seqüência específica recebe uma classifica-ção de qualidade de 30. As classificações de qualidade são também referi-das como "Phred Scores".

Seleção de Plantas usando Seleção Auxiliada por Marcador

Uma motivação primária para desenvolvimento dos marcadoresmoleculares nas espécies de colheita é o potencial para eficiência melhora-da na reprodução de plantas através da seleção auxiliada por marcador(MAS). Alelos marcadores genéticos (um "alelo" é uma seqüência alternativaem um local) são usados para identificar plantas que contém um genótipodesejado em locais múltiplos e que se espera transfiram o genótipo deseja-do, juntamente com um fenótipo desejado para sua progênie. Os alelos mar-cadores genéticos podem ser usados para identificar plantas que contêm ogenótipo desejado em um local de marcador, vários locais ou um haplótipo eque se espera transfiram o genótipo desejado, juntamente com o fenótipodesejado à sua progênie.

A seleção auxiliada por marcador compreende o mapeamentodos traços fenotípicos e se fia na capacidade de detectar diferentes genéti-cas entre os indivíduos. Um "mapa genético" é a representação da posiçãorelativa dos locais caracterizados (marcadores de DNA ou quaisquer outroslocais para os quais o alelo pode ser identificado) ao longo dos cromosso-mas. A medição da distância é relativa à freqüência dos eventos de cruza-mentos entre cromatides irmãs na meiose. As diferenças genéticas ou "mar-cadores genéticos" são então correlatos às variações fenotípicas usandométodos estatísticos. Em um caso preferido, um gene simples codificandouma proteína responsável por um traço fenotípico é detectável diretamentepor uma mutação que resulta na variação do fenótipo. De modo geral, múlti-pios locais genéticos contribuem para o fenótipo observado.

A presença e/ou ausência de um alelo marcador genético espe-cífico no genoma de uma planta exibindo traço fenotípico favorável é possí-vel por qualquer método listado acima usando marcadores, por exemplo,marcadores de DNA são Polimorfismos de Comprimento de Fragmento deRestrição (RFLP), Polimorfismos de Comprimento de Fragmento Ampliado(AFLP), Repetições de Seqüência Simples (SSR), Polimorfismos de Nucleo-tídeo Simples (SNP), Polimorfismos de Inserção/Deleção (Indels), Repeti-ções em Tandem de Número Variável (VNTR) e DNA Polimórfico AmpliadoAleatório (RAPD) e outros conhecidos na técnica. Se os ácidos nucléicos daplanta forem positivos para um marcador genético desejado, a planta podepropriamente criar uma linhagem de reprodução verdadeira com o mesmogenótipo ou pode ser cruzada com uma planta com o mesmo marcador oucom outras características desejadas, para criar uma geração híbrida cruza-da sexualmente. São providos os métodos de seleção auxiliada por marca-dor (MAS) usando uma variedade de marcadores genéticos. São providasplantas selecionadas por MAS usando os métodos.

A introgressão auxiliada por marcador envolve a transferência deuma região cromossômica definida por um ou mais marcadores de um ger-moplasma para um segundo germoplasma. A etapa inicial naquele processoé a localização da região genômica ou de transgene por mapeamento dogene, que é o processo de determinação da posição de um gene ou regiãogenômica em relação a outros genes e marcadores genéticos através daanálise de ligação. O princípio básico para mapeamento de ligação é que osdois genes mais próximos estão em um cromossoma, então quanto maiseles se parecem para serem herdados em conjunto. Em resumo, um cruza-mento é geralmente realizado entre duas origens geneticamente compatí-veis, porém divergentes em relação aos traços em estudo. Os marcadoresgenéticos podem então ser usados para seguir a segregação dos traços emestudo na progênie a partir do cruzamento, freqüentemente um retrocruza-mento (BC1), F2, ou população endogâmica recombinante.

A seleção de uma origem recorrente apropriada é uma etapaimportante para um procedimento de retrocruzamento de sucesso. O objeti-vo de um protocolo de retrocruzamento é alterar ou substituir um traço oucaracterística no congênito original. Para realizar isso, um ou mais locais docongênito recorrente são modificados ou substituídos com o gene desejadoda origem não recorrente (doador), enquanto retendo essencialmente todo orestante da genética desejada, e portanto, a constituição fisiológica e morfo-lógica do congênito original. A escolha da origem doadora específica depen-derá da finalidade do retrocruzamento. O protocolo de retrocruzamento exa-to dependerá das características ou traços sendo alterados para determinarum protocolo de teste apropriado. Pode ser necessário introduzir um teste daprogênie para determinar se a característica desejada foi transferida comsucesso. No caso da presente invenção, pode-se testar as linhagens de pro-gênie geradas durante o programa de retrocruzamento, bem como usar osistema marcador descrito aqui para selecionar as linhagens com base nosmarcadores ao invés dos traços visuais, os marcadores são indicativos daregião genômica do tipo T ou uma região genômica compreendendo um ha-plótipo favorável.

Plantas Transformadas e Células de Planta

Conforme usado aqui, o termo "transformada" refere-se à umacélula, tecido, órgão ou organismo no qual foi introduzida uma molécula depolinucleotídeo estranha, tal como um constructo. A molécula de polinucleo-tídeo introduzida pode ser integrada ao DNA genômico da célula, tecido, ór-gão ou organismo receptor, tal que, a molécula de polinucleotídeo introduzi-da é herdada pela progênie subseqüente. Uma célula "transgênica" ou"transformada" ou organismo também inclui progênie da célula ou organismoe a progênie produzida de um programa de reprodução empregando talplanta transgênica como uma origem em um cruzamento e exibindo um fe-nótipo alterado resultando da presença de uma molécula de polinucleotídeoestranha. Um constructo de transformação de planta contendo uma moléculade polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzido nas plantaspor qualquer método de transformação de planta. Os métodos e materiaispara transformação das plantas por introdução de um constructo de expres-são de planta em um genoma de planta, na prática dessa invenção, podemincluir qualquer um dos métodos bem-conhecidos e demonstrados incluindoeletroporação conforme ilustrado na Patente US número 5.384.253; bom-bardeamento de microprojéteis conforme ilustrado na Patente US número5.015.580; Patente US número 5.550.318; Patente US número 5.538.880;

Patente US número 6.160.208; Patente US número 6.399.861; e Patente USnúmero 6.403.865; transformação mediada por Agrobacterium conforme ilus-trada na Patente US número 5.824.877; Patente US número 5.591.616; Pa-tente US número 5.981.840; e Patente US número 6.384.301; e transforma-ção de protoplasma conforme ilustrada na Patente US número 5.508.184todas sendo incorporadas aqui como referência.

Os métodos para transformar especificamente dicotos são bem-conhecidos pelos versados na técnica. A transformação e regeneração deplanta usando esses métodos foi descrita para várias colheitas incluindo,porém não limitado ao algodão {Gossypium hirsutum), soja (Glycine max),amendoim (Arachis hypogaea), alfalfa {Medicago sativa), e membros do gê-nero Brassica.

Os métodos para transformação de monocotos são bem-conhe-cidos dos versados na técnica. A transformação e regeneração da plantausando esses métodos foi descrita para várias colheitas incluindo, porémnão limitado à cevada {Hordeum vulgarae); milho {Zea mays); aveias {Avenasativa); grama de pomar (Dactylis glomerata); arroz (Oryza sativa, incluindovariedades indica e japonica); sorgo (Sorghum bicolor); cana de açúcar(Saccharum sp); erva carneira {Festuca arundinaceá); espécies de grama deturfe (por exemplo as espécies: Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenota-phrum secundatum); e trigo {Triticum aestivum). Fica claro aos versados natécnica que várias metodologias de transformação podem ser usadas e mo-dificadas para produção de plantas transgênicas estáveis de qualquer núme-ro de colheitas alvo de interesse. Os métodos para introdução de um trans-gene são bem-conhecidos na técnica e incluem protocolos de transformaçãode planta biológicos e físicos. Vide, por exemplo, Miki e outros (1993). Umavez que um transgene é introduzido em uma variedade ele pode ser transfe-rido por cruzamento. Por emprego de retrocruzamento, essencialmente to-das as características morfológicas e fisiológicas desejadas de uma varieda-de são recuperadas em adição ao local transferido na variedade através datécnica de retrocruzamento. O retrocruzamento e métodos de reprodução afrente podem ser usados com a presente invenção para aperfeiçoar ou intro-duzir uma característica a uma planta (Poehlman and Sleper, 1995; Fehr,1987a, b; Sprague and Dudley, 1988).

Integração específica de sítio dos transqenesVários métodos mediados por recombinação específica de sítioforam desenvolvidos para incorporar transgene aos genomas de plantas,bem como para apagar os elementos genéticos indesejados das células deplantas e animais. Por exemplo, o sistema de recombinação cre-lox do bac-teriofago P1, descrito por Abremski e outros (1983); Sternberg e outros(1981) e outros, foi usado para promover a recombinação em uma variedadede tipos de células. O sistema cre-lox utiliza a cre recombinase isolada dobacteriofago P1, em conjunto com as seqüências de DNA (denominadossítios lox) que reconhece. Esse sistema de recombinação pode ser eficazpara obter recombinação nas células de plantas (Patente US número5.658.772), células de animais (Patente US número 4.959.317 e Patente USnúmero 5.801.030), e vetores viróticos (Hardy e outros, 1997). O alvejamen-to e controle da inserção ou remoção de seqüências de transgene em umgenoma de planta pode ser obtido por uso de um método de recombinaçãomolecular (Patente US número 6.573.425). Uma molécula de polinucleotídeointroduzida compreendendo um sítio de recombinação heterólogo incorpora-do a uma região de haplótipo está dentro do escopo da presente invenção.

Wahl e outros (Patente US número 5.654.182) usou o sistemade recombinase FLP específico de sítio de Saccharomyces cerevisiae paradeletar as seqüências de DNA nas células eucarióticas. As deleções foramdesignadas para realizar cada inativação de um gene ou ativação de um ge-ne colocando os fragmentos de DNA desejados em associação um com ooutro. Atividade de FLP recombinase nas plantas foi demonstrada (Lyznik eoutros, 1996; Luo e outros, 2000).

Outros utilizaram transposons ou elementos genéticos móveisque transpuseram quando um gene de transposase está presente no mesmogenoma, para separar genes alvo de seqüências auxiliares. Yoder e outros(Patente US número 5.482.852 e Patente US número 5.792.924, ambassendo incorporadas aqui como referência) usaram constructos contendo aseqüência da enzima transposase e as seqüências de reconhecimento detransposase para prover um método para alterar geneticamente as plantasque contém um gene desejado, isento de vetor e/ou seqüenciais marcado-ras. Outros métodos que usam seqüência de DNA dirigida a bacteriofagorecombinase ou transposases para regiões específicas alvo são descritos naUS 20020132350 e EP 1308516 (ambas incorporadas aqui como referên-cia). Endolases de dedo de zinco podem ser especificamente designadaspara reconhecer uma seqüência de DNA e podem alvejar seqüências deDNA específicas em um genoma para criar um sítio de recombinação útilpara a inserção de um transgene (Wright e outros, 2005; Patente US número7.030.215; US 20050208489; US 20050064474, incorporadas aqui comoreferência, em sua totalidade), por exemplo, alvejadas para um haplótipocompreendendo seqüências de DNA listadas na listagem de seqüência dapresente invenção e contidas no genoma do milho ou soja sendo contem-plado pelos inventores.

Um transgene que contém sítios de recombinação adicionaisvê uma oportunidade para acrescentar transgenes adicionais à região ge-nômica do tipo T, pelo que, aumentando o valor da região em um germo-plasma. A presente invenção contempla que a região genômica do tipo T étambém um sítio para atividades de recombinação específicas de modo aremover ou adicionar novo material genético à região genômica.

Os exemplos que se seguem são incluídos par demonstrar mo-dalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos versados natécnica que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representamtécnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da inven-ção e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferidospara a sua prática. Contudo, os versados na técnica apreciarão, em virtudeda presente descrição, que muitas alterações podem ser feitas às concreti-zações específicas que são descritas e ainda obtendo um resultado seme-lhante ou parecido, sem com isto fugir do espírito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Identificação dos haplótipos

Esse exemplo ilustra a identificação de haplótipos de soja úteisnas bases de dados para praticar os métodos dessa invenção. Os cromos-somas da soja foram divididos em haplótipos por seguir a hereditariedade deum grande conjunto de marcadores. As formas alélicas dos haplótipos foramidentificadas para um conjunto de 4 haplótipos que são ilustrados na Tabela1. Com referência à Tabela 1, um haplótipo mapeado para uma localizaçãogenômica é identificado por referência, por exemplo, C8W6H5 refere-se aoscromossoma 8, a janela 6 naquele cromossoma e haplótipo 5 naquela janela(região genômica); SEQJD prove referência à listagem de seqüências e onúmero ID do marcador é uma denominação de identificação arbitrária paraum amplicon de DNA associado ao local do marcador; START_POS refere-se à posição de partida do marcador no amplicon de DNA; o alelo HAP refe-re-se ao nucleotídeo de um marcador SNP/Indel como a posição de partidaonde * indica uma deleção de um Indel; ".outros estados de marcador" iden-tifica outro alelo de nucleotídeo de marcadores na janela.

Tabela 1. Informação resumida dos locais de marcador empregados paracaracterizar quatro haplótipos de soja associados aos eventos de soja tole-rante ao glifosato, incluindo a identificação de seqüência (SEQ ID e númerode ID do marcador) e a posição do polimorfismo (START POS) sendo usadapara caracterizar alelos (ALELO HAP) nessas seqüências.

<table>table see original document page 43</column></row><table>EXEMPLO 2

Preparação de uma base de dados com traços agronômicos e haplotipos

Esse exemplo ilustra a preparação de uma base de dados útilem um método dessa invenção. Com referência à tabela 2, a base de dadoscompreende valores computados de traços agronômicos, por exemplo, ren-dimento, maturidade, altura de planta e envergamento para os haplotipos desoja alelos específicos e a freqüência de haplótipo em um conjunto de linha-gens de reprodução. Outros traços podem ser medidos, por exemplo, rendi-mento de um grão, semente, fruto, fibra, forragem, óleo; ou um traço agro-nômico, por exemplo, resistência a pragas, tais como, resistência a doença,resistência aos insetos, resistência aos nematóides, ou razão de crescimen-to aperfeiçoada, e tolerância ao estresse; ou um produto processado aper-feiçoado da planta, por exemplo, perfil do ácido graxo, perfil do aminoácido,teor nutricional, qualidade da fibra e uma base de dados compilada para osvalores de cada haplótipo desses outros traços. Os valores de traço agro-nômicos desses haplotipos representam a alteração de população previstaem valor médio para o traço listado, se o haplótipo for fixado no germoplas-ma, tudo o mais permanecendo o mesmo. Os valores para "rendimento" es-tão em bushels de soja por acre. Os valores para "maturidade" estão emdias (a maturidade de uma linhagem de soja é o tempo de floração relativodaquela linhagem, em comparação a um conjunto de averiguações padrãode maturidade definida). Os valores para "altura da planta" são em cm daaltura medida da superfície do solo à ponta do tecido de planta mais alto namaturidade. Os valores de "envergamento" estão em porcentagem de plan-tas comparado a um conjunto de averiguações padrão (o envergamento éum fenômeno no qual a haste principal das plantas de colheita se move davertical em um ângulo grande, algumas vezes ao ponto das plantas se deita-rem no solo).

Os valores de reprodução para cada um dos haplotipos são u-sados para selecionar o haplótipo que, em combinação com um transgene,será o mais benéfico para o aperfeiçoamento do germoplasma da colheita. Ovalor de reprodução é uma combinação de traços medidos e a estimativa decomo esses traços afetarão o aperfeiçoamento do idioplama. Os haplotiposde soja associados aos eventos transgênicos para tolerância a glifosato fo-ram medidos e os resultados são mostrados na Tabela 2. O HaplótipoC8W6H5 seria um haplótipo favorável por seu efeito no rendimento e o ha-plótipo C18W3H8 seria um haplótipo favorável por sua freqüência muito altano germoplasma (94%), indicando que a pouca variabilidade está presenteno germoplasma de soja alvo para esse segmento de cromossoma, tornan-do o processo de difusão de um evento transgênico neutro. O haplótipoC19W3H6 é geralmente neutro com relação ao rendimento.

Tabela 2. Valores de reprodução calculados dos quatro haplotipos descritospara rendimento, maturidade, altura da planta e envergamento. A freqüênciado haplótipo no germoplasma de soja foi estimada de uma amostra de 365linhagens de soja.

<table>table see original document page 45</column></row><table>

As regiões de haplótipo foram determinadas para cada um dosquatro novos eventos de soja tolerante ao glifosato. 17194 é ligado ao hapló-tipo G16W8H43, 17426 é ligado ao haplótipo C18W3H8, 19703 é ligado aohaplótipo C19W3H6, e 19788 é ligado ao haplótipo C8W6H5. O efeito relati-vo desses haplotipos foi medido conforme ilustrado na Tabela 2, Isso repre-senta a alteração de população prevista em valor médio para o traço listadose o haplótipo for fixado no germoplasma, tudo o mais permanecendo igual.O tipo T de 19788 e o haplótipo C8W6H5 associado é o mais favorável dosquatro tipos T que foram medidos. Esse resultado demonstra que é impor-tante em um processo aperfeiçoar o desempenho da colheita através de mé-todos transgênicos, que ambos, os eventos transgênicos e as regiões dehaplótipo ligadas são avaliadas para continuar a melhora da produtividadeda colheita.

Os novos eventos tolerantes a glifosato foram comparados emexperimentos de campo replicados em relação a uma conversão de retro-cruzamento de 40-3-2 no germoplasma A3244. Isso foi demonstrado em ex-perimentos de campo replicados incluindo dados de rendimento coletadosde dezessete localizações nos Estados Unidos. O A3244 (Patente US núme-ro 5.659.114, ATCC número 97549) é um germoplasma de soja de elite daAsgrow (Monsanto, St. Lois, MO) que foi usado como a linhagem de origempara transformação para gerar os novos eventos de soja tolerantes ao glifo-sato 17194, 17426, 19703 e 19788. Os resultados do estudo de rendimentomostraram que retrocruzamentos de 40-3-2 A3244 renderam uma média de60,7 bu/acre, 19788 uma média de 65,6 bu/acre, 19703 uma média de 65,7bu/acre, 17426 uma média de 65,3 bu/acre e 17194 uma média de 65,8bu/acre. As quatro novas linhas tiveram uma vantagem de rendimento apro-ximada de 5 bu/acre em relação ao mesmo genótipo com a região genômicado tipo 40-3-2-T introgredida. Quando o haplótipo de cada um é consideradoentão o evento mais favorável é 19788.

Essas análises demonstram o valor de determinação do tipo Tpara cada evento transgênico que está sendo desenvolvido como um produ-to comercial. A não consideração dos efeitos agronômicos na região de ha-plótipo onde o transgene introgrediu pode resultar na introdução de ume-vento de desempenho fraco no germoplasma de uma colheita.

EXEMPLO 3

Uso de valores de reprodução

As regiões de haplótipo e valores de reprodução de cada umaforam determinados para quatro regiões de haplótipo onde um gene toleran-te a inseto foi inserido no genoma da soja. O valor de reprodução relativopara cada uma das regiões de haplótipo é mostrado na Tabela 3, as defini-ções das medições são as mesmas conforme descrito no Exemplo 2. A tabe-la é uma base de dados para determinar o haplótipo e seu valor de reprodu-ção onde um gene tolerante a inseto foi inserido (do tipo T). Um eventotransgênico compreendendo o tipo T é selecionado usando as informaçõesde base de dados. Um evento específico, GM_19459, contém o tipo T dogene tolerante a inseto associado com o haplótipo C6W4H1 que é um hapló-tipo para maturidade.

Tabela 3. Valores de reprodução calculados para rendimento, maturidade,altura da planta e encurvamento de quatro haplótipos para os eventos desoja tolerante a inseto. A freqüência do haplótipo no germoplasma foi esti-mada de 2.589 linhagens de soja.

<table>table see original document page 47</column></row><table>

As formas alélicas dos haplótipos foram identificadas para umconjunto de 4 haplótipos associados às sojas transgênicas resistentes a in-setos conforme listado na Tabela 4. Com referência à Tabela 4, um haplótipomapeado para um local genômico é identificado como referência, por exem-plo, C1W1H2 refere-se ao cromossoma 1, a janela 1 naquele cromossoma ehaplótipo 2 naquela janela (região genômica); a SEQJD prove referência àlistagem de seqüência e o número ID do marcador é uma denominação deidentificação arbitrária para um amplicon de DNA associado ao local do mar-cador; START_POS refere-se à posição de partida do marcador no ampliconde DNA; o alelo HAP refere-se ao nucleotídeo de um marcador SNP/Indelcomo a posição de partida onde * indica uma deleção de um Indel; "outrosestados de marcador" identifica outro alelo de nucleotídeo de marcadores najanela, "NA" indicou que outro alelo marcador não estava presente.

Tabela 4. Informação resumida dos locais de marcador empregados paracaracterizar quatro haplótipos de soja associados aos eventos de soja tole-rante aos insetos, incluindo a identificação de seqüência (SEQ ID e númerode ID do marcador) e a posição do polimorfismo (START POS) sendo usadapara caracterizar alelos (ALELO HAP) nessas seqüências.<table>table see original document page 48</column></row><table>

EXEMPLO 4

Aplicação à reprodução do milho

Esse exemplo ilustra as regiões de haplotipo e reprodução queforam determinadas para quatro regiões de haplotipo onde um gene toleran-te aos insetos foi inserido no genoma do milho (LH172). O valor de reprodu-ção relativo para cada uma das regiões de haplotipo é mostrado na Tabela5, as definições das medições são as mesmas conforme descrito no Exem-plo 2. A tabela é uma base de dados para determinar o haplotipo e seu valorde reprodução onde um gene tolerante ao inseto foi inserido (tipo T). Umevento transgênico compreendendo o tipo T é selecionado usando a infor-mação de base de dados. Um evento específico contém o tipo T do genetolerante ao inseto associado ao haplotipo C1W36H2.Tabela 5. Valor de reprodução calculado para rendimento de quatro haplóti-pos par eventos de milho tolerante ao inseto. A freqüência do haplótipo nogermoplasma foi estimada de 6.335 linhagens de milho.

<table>table see original document page 49</column></row><table>

As formas alélicas dos haplótipos foram identificadas para umconjunto de 4 haplótipos para o milho transgênico resistente aos insetos,conforme listado na Tabela 6. Com referência à Tabela 6, um haplótipo ma-peado para um local genômico é identificado como referência, por exemplo,C1W19HÍ4 refere-se ao cromossoma 1, a janela 19 naquele cromossoma ehaplótipo 14 naquela janela (região genômica); SEQJD prove referência àlistagem de seqüência e o número ID do marcador é uma denominação deidentificação arbitrária para um amplicon de DNA associado ao local do mar-cador; START_POS refere-se à posição de partida do marcador no ampliconde DNA; o alelo HAP refere-se ao nucleotídeo de um marcador SNP/Indelcomo a posição de partida onde * indica uma deleção de um Indel; "outrosestados de marcador" identifica outro alelo de nucleotídeo de marcadores najanela.

Tabela 6. Informação resumida dos locais de marcador empregados paracaracterizar quatro haplótipos de milho associados aos eventos de milhotolerante aos insetos, incluindo a identificação de seqüência (SEQ ID e nú-mero de ID do marcador) e a posição do polimorfismo (START POS) sendousada para caracterizar alelos (ALELO HAP) nessas seqüências.

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

EXEMPLO 5

Mapeamento Indireto de uma região genômica do tipo T

Os marcadores de DNA são identificados na região genômicaflanqueando uma inserção de transgene para prover um meio de identificar alocalização genômica do transgene por comparação dos marcadores deDNA com a população de mapeamento. Os marcadores de DNA podem serdesenvolvidos para qualquer evento transgênico por isolamento da regiãogenômica, seqüenciamento da região, isolamento da mesma região em umapopulação de mapeamento da planta de colheita, e determinação da locali-zação com relação aos marcadores conhecidos na população de mapea-mento. A associação do transgene com os fenótipos mapeados, locais detraço quantitativos compreendendo uma região genômica de haplótipo podeser determinada.

Por exemplo, para MON89788 um par de iniciador foi seleciona-do de uma seqüência de DNA que se estende no genoma 5' para o sítio deinserção de transgene (SEQ ID NO:55 e 56) e para a região genômica 3' emrelação ao sítio de inserção de transgene (SEQ ID NO:57-58). Um métodode ampliação de DNA foi usado para produzir produtos de DNA que com-preendem uma porção do genoma de soja das regiões 5' e 3' do sítio de in-serção de transgene. Esses produtos de DNA foram sequenciados. Osmesmos pares de iniciador foram usados para ampliar o DNA das sete li-nhagens de soja (507354, Minsoy, Noir, HS1, PIC, 88788, A3244) que sãoorigens de quatro das populações de mapeamento. Um polimorfismo de nu-cleotídeo simples (SNP) foi identificado na posição 119 (SNP119, SEQ IDNO:59) a partir das seqüências de flanqueamento 3' quando comparado àsseqüências através das diferentes linhagens. A tabela 7 mostra a composi-ção alélica nessa posição em outros linhagens testadas.

Tabela 7. Polimorfismo nas seqüências de flanqueamento em linhagens desoja diferentes compreendendo MON89788.

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Um ensaio de ponto final Taquman® (PE Applied Biosystems,Foster City, CA) foi desenvolvido com SNP 119 de acordo com as instruçõesprovidas pelo fabricante. Seqüências de sonda e iniciador são fornecidas naTabela 8. Para mapear o polimorfismo SNP119, foi usada uma população F1derivada de um cruzamento entre HS1 x PI407305 (PIC), consistindo em140 indivíduos. A posição no mapa de SNP119 foi determinada por coloca-ção de classificações alélicas contra o conjunto de dados alélicos existentesusando o MapMaker (Lincoln and Lander, 1990). SNP119 foi encontrado nogrupo de ligação D1a+Q (Song, Q. J., e outros, 2004). Assim, MON89788 foiindiretamente mapeado para essa mesma posição.Tabela 8. Moléculas de iniciador e sonda para ensaio Taqman de mapeamento de haplótipo.

<table>table see original document page 52</column></row><table> A Monsanto Technology LLC realizou um depósito de sementesde soja compreendendo o evento MON89788 descrito acima e citado nasreivindicações, o mesmo tendo sido realizado de acordo com o Tratado deBudapeste com o American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Univer-sity Boulevard, Manassas, Va. 20110. O número de acesso ATCC é o PTA-6708 depositado em 11 de maio de 2005. O depósito será mantido no depo-sitador por um período de 30 anos, ou 5 anos após a última solicitação oupela vida útil da patente, qualquer um que seja mais longo e será substituídoconforme necessário, durante o período. As moléculas de DNA da presenteinvenção podem ser isoladas do genoma do material depositado e a se-qüência corrigida, caso necessário, moléculas de DNA adicionais para usocomo sondas ou iniciadores para as regiões de haplótipo descritas aqui po-dem ser isoladas do material depositado.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são incor-porados aqui como referência como se cada publicação individual ou pedidode patente tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incor-porado como referência.

Todas as composições e métodos descritos aqui e reivindicadospodem ser fabricados e executados sem experimentação indevida à luz dapresente descrição. Embora as composições e métodos da invenção tenhamsido descritos em termos de concretizações preferidas, ficará claro aos ver-sados na técnica que variações podem ser aplicadas aos métodos e nasetapas ou na seqüência das etapas do método descrito aqui, sem com istofugir do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, fica-rá claro que determinados agentes que são ambos química e fisiologicamen-te correlatas podem ser substituídos por agentes descritos aqui, embora osmesmos resultados ou similares possam ser obtidos. Todos tais substitui-ções similares e modificações ficam claras aos versados na técnica comoestando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme defini-do pelas reivindicações apensas.

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

As referências que se seguem, à medida que fornecem proce-dimentos exemplares ou outros detalhes suplementares aos já estabelecidosaqui, são especificamente incorporadas como referência.

<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>Patente US número 6.166.292

Patente US número 6.171.640

Patente US número 6.184.440

Patente US número 6.228.992

Patente US número 6.316.407

Patente US número 6.380.466

Patente US número 6.384.301

Patente US número 6.399.861

Patente US número 6.403.865

Patente US número 6.444.876

Patente US número 6.476.295

Patente US número 6.476.295

Patente US número 6.476.295

Patente US número 6.486.383

Patente US número 6.506.962

Patente US número 6.531.648

Patente US número 6.537.750

Patente US número 6.660.911

Patente US número 6.768.044

Patente US número 6.774.284

Patente US número 7.030.215

Publicação US número 20020132350

Publicação US número 20030083480

Publicação US número 20040177399

Publicação US número 20050064474

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Butruille, DavidEathington, Samuel REdwards, Marlin DGupta, AnjuJohnson, RichardKennard, WayneRinehart, JenniferWu, Kun6heng

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MELHORAR A REPRODUÇÃO DE PLANTAS

<130> M0NS:115US

<140> Desconhecido

<141> 2006-05-26

<l50> 60/685,584

<151> 2005-05-27

<160> 63

<170> 3.3

<210> 1

<211> 664

<212> DNA

<213> Slycine max

<400> 1

attcagaagg ctgttaaaac cccctcaggt cacoaccact aaacaagaca acaagacaat 60

aacagataaa agcctagttt gtcttgcatg cacttacatg cacctttcat ttttttttct 120

tgcatgcatc atggtcccct actaatacca tttatcttca actattcccc cctctcccaa 180

aatcattcct tgcccttcaa cttttcataa ttgtcttaat taaatgtttg gattaaagtc 240

tataaaagta tcacaaggct taotttttca aaactggata tctaggtaaa attttactct 300

caaacatagt tttgggagta accaaacatt accctaaact gattttaatt tcaaacatat 360

acttttaaac cctcccactg gaaatccgaa cacatcctaa gatgacttat tatatttgca 420

tctatctaat aataataata aaagtaaatg atttttatat tgatacttaa ttatgagttg 480

ttttatgata tgtttattga cttttatagt gattagtatc tactttaaaa atcatatcta 540

ttttggacta gotgagagtg tttatattga caatacatag aaattaaatt ttaagaataa 600

gaaaatgata atcatatttt aggatattgg ttaagaataa aataaaaagt tttattgaaa 660aaat

664

<210><211><212><213> 21156DNA

Glycine raax

<400>

2

aaagccaatc agatgctact gagtaaaatc agaaaaaatg tgaactaaga gcaatgacaa 60

gagtcaagaa tgctatacct gctgctcagt catttgaaga aaagcaatag tatagtacac 120

caattctctg atattagcca caaccaccta tagaaatgca aaccatagat caaagtaatg 180

atacaattga acacaatcag cagaaaaata agatttcaag aatgttctga accaaacctt 240

tcccagtctt ggattaccca caatggtcaa catgagttca aacagctgta aataacaact 300

tagataaaaa tgataattca aaaattatta caagaaatga aggaaacaca aacaaaaaac 360

catgcaaacc tgatttacgc aagttttaga cagatctcag ccagtttatt atttaaaatc 420

ctataattat aattttttat catttccata caataatcca gcaaaactat acgacactaa 480

taaaaggtat agatcaaaca aagaggttcc tttcaatagt aagctgatga agccatcatt 540

gcagfcgacta cagtatcccc tgtgaattcc agtttgacta atttgaaatt taggactgtc 600

ttccttgcca aataacaagt taaaggatat cattctagca gctgattcag tttgacactt 660

catagtgacc tttctctctc tggaatactg acaactatgt acagtttaaa ttaaacaatc 720

aagttaacag cagttttctt tggggcagta tgcagatgat acggtttcct ttgggacagc 780

aacattggca aatgtaagag caatcaaggt gatgttgagg agctttgagt tggtatcggg 840

attaaagata aactttgcca acatctgttt ttgggcaatt gggatgactg agcaatggat 900

gaacagtgct gtcagataag ttgcagaatg atgtcagtac tcttttctta tttgggtatc 960

tctattgggg caaactcaag acgtagtgag atttgggatc taatagtcaa gaaatgtgag 1020

agaaaattgt caaaatgaaa acaaaaatat ctttctttcg gggaagggtg actttgatta 1080

agtcagtcct aaactcgatc cctaaaattt ttttcttttt tcaaggctcc aaagaatgtg 1140

gtggataggt aggtga 1156

<210> 3

<211> 657

<212> DNA

<213> Glycine max<400> 3

atagttcact aggtttgtac tcatgccata atatgccaat ctttcacagc attcatttcc 60

tgacataatg tttttagcac cttagtgcga ttttaatact gaaatatgca taaaagatgg 120

tatcgaaatg aaagaagaaa aaaaatccaa taccaagtat gaagcggcat gctttccaat 1B0

ttccagtttt tttcttgatg gcaggctttt tgtaaatatc aactgtccca tcttctgtgt 240

ataaactatc ttctcccaca tcatgtgatt ttttgacatc tcccatggtt tcacagcaga 300

tttcctattt gctgcttctt gttctctttg atatctacta caaatgtctg tttgcagggt 360

gctggaaatg agtaaacaaa ataatcggca aaaggtacac gaaaattaaa cagattgcta 420

tcatgaattt catattataa atacttgatt tgagggtgtt tatgaagtag gaatagcaaa 480

gagaggttca gcaaagcaat gaatatgtta gctcatgaag ctccaatcac aatccttcgc 540

aaacacattt gatggcaaca ttgtgatttg ggattattag tggtacaaag tgatagttat 600

aatcacaaag aattaatgta gaactgcagg tgacttagga ggtccgggtt cgacccg 657

<210> <2ll> <212> <213> 4 659 DNA Glycine max

<400> 4

atttgggcgg cctacacttt tttgaaaatt aaaatatact tttgtgtagc taatttccgt 60

tttgcatgtg tgtgtgtgtg taatggagag agagatagag agaaagagtt agtttggttc 120

ctagtggcac tgaaattact accaaatctc caaaagtagc tatggagtta tttaggatgt 180

ctaatgagtt gagtttatgg tcttatttat atgtggaaat aatgatttat taatccagag 240

cagatgagtt aaaagtttct ctagagaatg gtagtttcta aatgaataaa taggatagaa 300

tctctagcac tcaaagaatg aaagaatgtt tgcattttat tatcacctga gccaatttca 360

gatatctcga ttatttcctc ttaatatccc atggcaaoat tcattgcgtt aagccaacat 420

ttfcaaatgaa agtatctgtg atctccaagt ctttgatatt catttgtcta ttccaaattt 480

tggttccaac tggcttcgaa agctttgatc ctcctccctg ctttcagcat gatttcctca 540

ctcttcttga actttccata ctgaggaagt ctgagacaca atggtaaaac tatcatggtt 600

atggaatcca tgaaacaaac atcattattt tctattaagc tctgaattgt agaaataca 659

<210><211>

5

372<212> DNA

<213> Glycine max

<400> S

cattcatcag aagtgctcaa agcatttaat ttcagtgcca aagcactgca acttttcagc 60

tcagacaaaa caaacttgct agcttccttg gtaactgtgg aggatttgat agacttgaaa 120

accttctcaa cagattcttg agcacatctg cgtacctaaa aagcaaacaa accacaacac 180

aatttaaaca aacaaaaaat ccataagctc agagtaatga aatgattaat aggcatggac 240

caatgtctcg aaatcaaagg tcatatcata accaaatgct gattgcattg taaggtaaaa 300

ccatcaccaa atctatacat aattggatat aaacaaggtt taaaactaaa gttgcagaca 360

cattagcagc ac 372

<210> <211> <212> <213> 6 1448 DNA Glycine max

<400> 6

aacagaactc tatggccgca agacaagata gaccaaagag gaaggacocg gcatattaaa 60

agcagtgaca aagtaggaaa attgcactca tttacgatca acccaggttc ttgtagatct 120

agagtactag taaggttctc taatcactta tggctcttaa tgttgaatag ccagaagtga 180

taaaatcaaa tcaaataacc ccctagggtc ggcctagtga cggggttttt ggtagcatgc 240

acaaagtctt agattgtaat cttgttgagt cattgtacac caaataaata aataaataaa 300

attaaaatta atgtaaaata tgataaatgc aagtggaatt tatttccaac taatttatgc 360

tcgttctcaa cataaaaaat caagagattt gttgtgcata actctttctt aagccatata 420

tcatgactct tacctgctta gctgtcgcaa aattcagtag cgcttcacat tcatcaagca 480

tggctttttc cctagctgat acaacagcaa cttcagacat taaactattc atgccctcca 540

cctattccag acacacacac aaaaaaaaaa aatggtgtca gccttaaggc tttagggatt 600

taccattgaa tcaaaaagga aaatcattag gaagaaaaaa catacagtta gtagaagaaa 660

aaaagtttga tactaaatgt gtaggcctag aaaatagcaa atgctagtgt gatattgtga 720

gtcaaaccag tagaactcct aaaaaagtaa cacaccccgt gacagcaaag ggcagatagc 780

agatcccatt gcttgcatgg catcaacagc tgaatagata gcatgcttca aatgttcaat 840

atctgcctga aaaagtgtaa acacagtaat gatgttagtg tctctttgca cgcatcgaac 900caaaagaaca gaaaccacca tacatacctt

acttgcctcc aagtcttcta cagccccgga

agcccagtca tcaaggtagg ccatctgtgt aagtatcaaa aaaaagttga atcatttaaa

tcatatccac cattaataat atgagttatg

aattaaacat aacttttcaa tgtgcagggc

tataaacttc acaataaata tctctagtta

aaaaagaaag aaagaaaaag taattgtaat

tgataaatat ttcaggcaag agagaagtat cagctcaa

<210> 7

<211> 922

<212> DNA

<213> Glycine max <400> 7

agtttgctag gaagtgggtg ccattctgca

agatgtactt cagtgagaaa attgattacc

aggatcgtcg agctatgaag gtctgtatca

gagtttaaaa gttagtttaa agcttattca

tgaagagttt aaggttagga tcaatgcact

aggatggatt atgcaggatg ggacaccatg

tatgattcaa gtctttcttg gtcacagtgg

tcgtcttgtt tatgtttccc gagagaaaag

tgctatgaat gctttggtag atttttttga

cacctttata tgagacacaa ttccttgaca

gggtttccgc tgtgctcaca aatgctcctt

tcaataacag caaggctgct cgagaggcca

agaaggtctg ctatgtccaa tttcctcaaa

atgctaatag aaacacggtt ttctttgatg

tagcatggcc ttttctttga agcatttgac

tgcccctcca gttagaggaa gacgaagagt 960

taaggcatca atatgatcac tttcaagtac 1020

cattaattgt aaaaggacta caatttaaaa 1080

taagaaaatg gtttcatata tgacttgtaa 1140

aataccatgt tatgacagac tagcataaac 1200

caacatcttg ctgagtatat tttcctcatt 1260

aattaccaaa aatgaaaatc gggaaaaaaa 1320

gtatcatcaa caataatatc gcacatagaa 1380

tacttgatca ttcaaaatag aattcagctt 1440

1448

agaaattttc tatagaacct agagcaccag 60

tcaaggacaa ggtgcagccc acctttgtta 12 0

tatctatcag actagtactt gaacacatgg 180

gtgttaattg ggtgtttgac agagagaata 240

tgtggcaaaa gctcagaagg ttcctcaagg 300

gcctggaaat aatactaagg atcatcctgg 360

aggtcatgat actgaaggaa acgagcttcc 420

gcctggattc caacaccaca agaaagctgg 480

gcagtttttg ttgttcctat gatgtccatt 540

cttccaatta ttgctgtgat ttgcagattc 600

tcatgctgaa cttggattgt gatcattatg 660

tgtgcttttt aatggacccc caaactggga 720

gatttgatgg cattgatagg catgatcgtt 780

taagtcactg caagaaacac agcatcagca 840

tatttttttt tggtagtgta agctaatact 900aactatttct tcttctttgt ct 922

<210> <2ll> <212> <213> a 730 DNA Glycine max

<400> 8

tccctattat tcactgaagt aatgaataag tcgttgaaga aagttgggca tgtcattatg 60

tcaaaatgct tctgacttct gagggtcaaa agtttacacc tcttttctat tttcgtaaaa 120

ttcctgagga acatttttct tctgacatgt aaagtgaaat tttatagctc attgctgtac 180

tgccgtttaa tatctgacaa tcattgaagt taattaaact atctcataaa agttgttggt 240

gatgaatgtc tggaggtgta agcgcaaaat ttgcgaccag ttaatgaatg tcttatcaac 300

gaaaatacgt gtactactaa tcaaccaaca tatgtggctt aaacaatcct agtttgccag 360

tagtataaat gctggggtta cattatcagt agatgttttt attagagaac caggtcatga 420

tcttcagttg aatattgcca caagtatgac atgtgttatg cttgtttttt ccatcagaat 480

agagtagtgg aaaaaaatgc taatctgtga caaatttagg ttgtgtaagt tgaagtagtt 540

gcatggaatg cgcttcatca tgatccttgt gtcagtttct aattttcaat gttattttgg SOO

cgtaaacagg ttgaggaata tagccttcgg acgcatctca tgcagatcaa gcaaataagt 660

aaccaatctc ggaaattcaa acacgcatga ccctgacctg cttctacgct aacaagaagt 720

cttttgcagc 730

<210> <211> <212> <213> 9 717 DNA Glycine max

<400> 9

tcttatttga tttctccaat gatatgcata tagtggtgtt taaccatgtt tcttgacatt 60

tatttgtgtt ctatttgatt atgtgactgc tccagaatag agtatttatg caatatcttg 120

gtaatggaaa ctaacaaagt ggaattaatt aactcattgg agccattcat tatgattgtt 180

tctttcaaat tgtctattga gttcaatcat ttgttgcttc tattgatttt atttaatatt 240

ttagtaggca tgatcggtcc aggggctgta gaaatatagt gaaggatttg aaagtctttg 300

acacattcaa tacttggttg cattatgaat atgttgaaga caaattatag aagataaatc 360taaggagcaa ttttatatat caacaagcag

acataggttt ggagctgtca tgagcttaat

caaaagcaaa acatagaata aaaggaatat

ggctagacta gatacgtttt cctggtccaa

agttagtaat atgctgaagg aggaagctac ccttatgtat aggttgtttt ctattgttta

<210> <211> <212> <213> 10 807 DNA Glycine max <400> 10

tgcataatca accaactgat atgacatttt

gatgttaatc agtagatcat ttgccatctg

tttcattgcc tagtattgag aataaaacag

aatgaattgt ttattagcat tgtctacttc

tgtcgaaatc tataataact aataatcact

ttttgtcatg ggtgtcttta atgcaagttt

tacaaaatag tagatgaagt tcattaagat

catgataata tttggtgttc tgtctacctc

ttgctctctc tgttttattt tactctcaat

tactgtctct agaaggtcct attactttat

ccaaccttgt gatttgtgtg cattacactc

aatctaatta gttgttctat gcaaactttg

tttaacttgc cttgcttact gttctccttc

gctcagcctt ggatccataa taatctg

<210> <211> <212> <213> 11 839 DNA Glycine max <400a. 11

caagggaata tgttcgaaca gatggtgggc 420

tcatttgagg atgacccata ttttaaccgt 480

tgattctgtt tgcattttgt ttggggtact 540

tggaaacctt tggatcgttg gttgatttga 600

aagagaagtt tgcatttcac gatcattttt 660

ctcacatttt cagctgcagg catgcaa 717

ctgtggaatg gacagaaccg ttattatcat 60

gcttccagat gttaatctct tagtagaatt 120

atttgagact taaggttctg tatgcaatac 180

ttgatactga tggttgtcat tacagtaata 240

taagcaacaa gttaaattct gtttttggta 300

atatctttga tgcttttttg gttttatttt 360

gtttttcctt attgattgtg aaatggaatg 420

tcctgaatta gaccagtcag tttaattctg 480

ctttgtgagt ttttcggttc acttgagttg 540

tggtcaagaa aaatatagaa ggatattaat 600

atacacattt tatgttcata tagtcatctc 660

ttgtggaatt gaactgcttc ctgctgtgca 720

tgtgtgtctc aggttagaaa ttctttgaat 780

807

caaacttgca tgcctgcaga ctatatggca ccgcccctat agtgcccctt ccaacgatta

60cctagaattt aatttgatct tctgaaggta

aaacagtaag tacatgccag tacgtaataa

tccaatgctg caaaagacct agttagactt

tcaagattaa ctaaataata cacagacaaa

gatcagcata tgtgaaagtc tcagagagca

tgattttatt atctatatgg gaatcaaata

ttggatacac ataattccaa cctccaccaa

ctattgtgcc cccgggtagc ttaactcttg

cacaccctcg taattcgaag caacaagagg

atcagtactt tgtccacaac ttgaagaagc

catttcctcc ccatagaaga actccaacga

agcagaaacc atttccccaa ctgtagtggt

agcacggtac tcattgctct gaccaaactg

<210> 12

<211> 751

<212> DNA

<213> Glycine max <400> 12

aaacactggc fctcggattta tcacttgtaa ctctttattt tcaggttttg ttctgatatc

aattgtaata agtctacatc tcaagcgtct

agaaatggtg tttttggtag accactttgt

ggtccagctt tttattctct ggagactagt

tcccgtgttg cagaagaaaa agttggtgtg

ttgagtgacg tgcaaccttt tctgtttaat

tttgtgcttt ttctactgtt gatttttctt agtacatgtt catatgattt gtatgctaat

cgtcttccaa ggttgtttcg gtttctccag cgggctccta aatccaagga agggtatgct

gatgaataaa taaataaacg tgtgaaaata 12 0

tgtgaactag tttgtataca tgaatttagg 180

ggaacataaa aggatatatt taaatgactc 240

tcagataatt aaactgcacg gccactaagg 300

gacatgtcgc tagttatata taaatcaagc 360

caagcttaat tctcttttgc tagcttcaat 420

ttgataacaa atactagtaa tgtacacatg 480

aaaaacacat tctcgtggca tctcttgacg 540

aggataaatc agagaactgg tttcacccca 600

acaagcacca cccattatct tatcggtaat 660

cccacctaat aacctttgag aataatcatt 720

agtgaaactg ctttgtcctt gcaccaactc 780

tacttggttg ttgccaatag agttcatgc 839

gtagagtttg ctaactaaaa tgctttgtca 60

caaaatcctg gctatgttga ttgocattca 120

ttgtttttgt gttccgactc caacagtaga 180

gtgaacccct ctggcaggag aaacctagtt 240

gcttatgacg tggctgcttt agaatctcct 300

ctgcttctca atctaggagg accagagaca 360

ctttttgcag atcctgtatg ttagtttgta 420

tttcctgttt atgtaaattc cattagcatt 480

gtgtttcttg tattgacata ggatatcatt 540

cgacoattgg caaaattgat ttctgtactt 600

gctattggtg gtggctctcc tttacgaaaa 660attacagatg accaggtgga gtttaaattt tttggttttc ccattatctg ctttgtggag 720

cttttatctt tctgcaacat gaatcttttt t 751

<210> <211> <212> <213> 13 663 DNA Glycine max

<400> 13

aatatgaaga agtacctgct ttaccattca acttagtgac tgtaagtatt caatactaga 60

gccaagttca cttttctatt tagctacata ctaggggggg ttctcttggt aaaaagaaac 120

tatctatact tatatgttat ggaattacat gactttcatg atacaaatcá catgaatatc 180

aatagttgca agtagttctt taatgattta tatttcttag gaacatgact tgtgcataac 240

ttctttgagg tcaatccacg gcttagagta attctgggaa cccgtttgca tcattgtaaa 300

caggcatttc acactttcga atgcatcaaa tgaagcaaca tttttttata attggcattc 360

aatgtccatt tggatggttt gaactgataa ccatttggat ggtttttaca attggcatct 420

gtgtcttcag gaaggggact tgagcaggac agcttccttt gcagatgatg gagaggtttt 480

agatggaata attactcgaa gccggggtga ggttagacgt gtttgcagtc caaaggtgat 540

gaaatccact ccaaacctat cccaagagtt aacaagtcca aggctcacag ataaagtata 600

cagccctcgg ataagccatc tcagaggaaa tcaaagccct cgaggtgttg ggagaggatc 660

att 663

<210> <211> <212> <213> 14 713 DNA Glycine max

<400> 14

cttaagtctg aaaacaattt gtctacttgt acataatctt tatcatggac aaagtatcaa 60

gaacagaaaa tattttatat attgtctact cttgcctcat tcttacacat ctttatttta 120

tttattttgt ttcaagttat ttgttattga aaaagataaa agtgttaact gtttttttaa 180

taatattcta atttaaataa attcaaacct atatttgagc tcttttttta atgaggataa 240

tttaatattt tttatgttat aacttgtgta attaatattt ttttgagaga actcagcaaa 300

aaataaataa atttttgaga gaaaaataat atttttttta aagaagtgtg tattatttta 360

aaaaataaat aatatgagat ggaggcaaca tgtgatttta acaatgactt gtaacatcta 420taagctcaaa atttttgaaa aatgaactgg cgtaggataa aattaaacta cctggataaa 480

gcaaaggttc ttcccaattg gttatttaaa gcaatcttct ttgtataatg gataccataa 540

cttcaatctc ttaactacca tgatttgatt gaagcgatcg atctcacaaa gatgttcctt 600

tcaatattct taaactcaag tacaattttc cctcaaggac ccactatgtc tatattccat 660

tggattacat agtaaaagca aaccaataat ttctctacct ttagctgcat ttt 713

<210> <211> <212> <213> 15 534 DNA Glycine max

<400> 15

cttgcatgcc tgcaggagac tttgagaaag cacacttcag ttgtttaccc gatataggag 60

agatacaagt taaagggtta atggtaagta ctttactttc tgtttagtat ctatgcatcc 120

ttttatgaat ttctgcacca atgagttttt gctcaagtta ctgcacattc tcctaggtga 180

agcgaaaatc atgcttctac tacctgcctg attcgttccc tatacagtat gctttccctg 240

caatcagagg aacatggttt cttcatgtgg aagtgaagca tttaaagcgt ttgcgcattc 300

cgtgtccacc tggtgatgca gctgttcttt caaaacataa ggacttaaag acctgcaatg 360

gtgaggataa ggcaaaatgc aacagtgagg aaaataaaat ggaagggttc caaccccgtt 420

catgttttgc agaagagcat gaaactacta atcatgtttc aaagaagctg aacaaaaaga 480

gaatttctaa tgaaaaccac acgcagaatg aagccactgg aatgccagaa agat 534

<210> <211> <212> <213> 16 433 DNA Glycine max

<400> 16

ttgccaatgc agctgctggc ttgagtgcag ccatggcagc tcagcttgtg tggacccctg 60

ttgatgtcgt gagccagagg ctgatggttc aaggtgtttg tgattcggga aatcctaagg 120

cttcagctct tcggtacatc aacgggattg atgccttcag gaagatcttg agcagtgatg 180

gtcttagggg cttgtatagg ggttttggga tatcaatttt gacctatgcc ccttcaaatg 240

cagtttggtg ggcttcatat tctgttgcac aaaggatggt ttggggtgga gttgggtact 300

acttgtgcaa gggaaatgat agtgcactga agcctgatac aaagactgtg atggcagttc 360agggagtcag tgcagcagtg gctggtggca tgtctgcttt gatcaccatg ccactggata 420

ccatcaagac aag 433

<210> <2ll> <212> <213> 17 554 DtJA Glycine max

<400> 17

aaaaaaaagg acaatcatta aacacgtatc taaaatgcat ttcatcaaaa tgaaaaatta 60

tgcaatactg aaaatccatg cgtgttataa aggcaaacaa aatgaacttg gagagcaatg 120

caacaaagta ctttttacag tcaatgtgca ctttaaaaaa tagtatattt catacttaca 180

taaaagagct gaatgagtgc aagacgtacg aaagaataaa atttcaaagt gccacctaag 240

tcacagagtt tatgagaaac aaactgtgag ctttggtcag gtaatatcca ccacaatgca 300

gggatgacaa ccgagtttag gacgaatata ctgcacaaaa atttaaaaga tgttgaaatc 360

attaaacacg tagattttag attcatgatt tgttcaggac aatcaatcca tggatgacaa 420

aaatatgtac aatcagattc cttcgagtca ttatgtcaaa agtatacata atccaatttc 480

tttgccacaa aatttcattc actgtgttga aataaattga agctagtttc acttctcctt 540

ctgcaggtcg actt 554

<210> <211> <212> <213> 18 810 DNA Glycine max

<400> 18

tgagtttaat catgtatctt ctttttcaat gcttttggtt ggacattaaa gccatatttg 60

tttggatttt gtgccatata ctatcaatcc aattttatta agaactaaga cctactagtt 120

tttcaaacaa ggtcagcaat actcaaaaat aaattgccaa gttggaccct gtagttttgt 180

aaatgtatcc caacaattat aattaaaaag tagttgtact gtataatatc tagcaaattc 240

aaaattctaa agbcaatttt ttactgtcta atccaaatgg acgctaagat actagactat 300

tgatactcac agaacattat ctgtagttaa catgaaaaat gtagtttgtg gttttgatgc 360

ttçctttttt attttattta agtgacttag tttgtagatt ttactttgca gggagactat 420

catgttgaca gtgaattttg tggtacggac agrtgtacagc tgaaaggatc tgagattact 480

gctgaactta agtatctctt aaacttgttg acattgtgtt ggcacttttc gaagaagccc 540tttcccttgt ttttagaaga aactggctac

aaagcaggag taagtcttgt ttgaatttta

ctgtgttgac taagtcattg atagttatta

ggctgaaagc acaagagatg ttgttttatt

atgatagatg ccttcttttt gcttcacttt

<210> 19

<211> 1222

<212> DNA

<213> Glycine max <400> 19

aggtgcagct gcccttttgt actcacattg

gacgaagatg gtgaagaaaa tgggagtgat

cgtgtttctc atcggttaat ccaagcccct

tcagagactc tcaggttcac gtattcggag

gcgtttggca tcagctttct tctaaagcgg

tttattgttg ccctgatttg aagcaactga

ctatctgtaa ctttggacaç atttaagtag

ggaagccagg tgcatatttt tcaggtagaa

ctgcacttaa tgtgcaactc acataattca

gaatgaaaga gagagaaata tagagaaagt

agttaggtga actttttcat gtgtaaataa

aatttaatgc tttccatctc aataaaaaaa

ttggagagca gttataattt atattaactc

tttttcatgg gtgttgtttt tgttttgctt

ttgggatcat gacttgcaat atttgaactt

gaagttgaca tattagatta ttcttggatt

tactttctag gagagtaaba tggctaaggt

tgaatcctca caagattgtt cacatgacct

aatcatatat taagcatttt ttaaggtaga

agtgaagaaa acgttctcct tcgagaagcc 600

ggaaaaaatg ataataattc aatatctgta 660

acacacattc tcttttgagg aaggatggaa 720

tagactgata aaatatggga taaaaaattg 780

810

aatcggaaat tgcagactca cgatgcaatc 60

acgçccactg atacgccatt aggtattggc 120

gcaacatggt tggagacaat ttcaacattg 180

acacttggga aatggccaat tggggatttg 240

caggtaatga caacgagtag attttggttc 300

aaatgccgga aagctgtgtc gtttttttat 360

taagtagaat atagaatcag tatttagtgt 420

ctataattga tctgaaatgg tagttgcaac 480

cctaaaggat tgcccgtcac tgacattgat 540

aaaatggaca atggtcatgg aagttatgcg 600

aattgttgat gattaaatgg ttggaagacc 660

attatggtcg ttaaagaaat aatcccacat 720

ttaagtgttc cttacatgtg ataggatctt 780

tttaagcctt ctcaacatca cagcagtggt 840

cttttgttac ttgttaatca tgatcacttt 900

ttatgattta catgatatga tttctgttta 960

agcttagaaa tcagactatt ctctacaaaa 1020

gtgctacttt atatatttga ttttgattta 1080

tcagtttcat gacatcctgg actacttaat 1140ttcttcatct cagctcaaca taaatagatg agaagttgct ctgtaatatt ggttttgtgc 1200

cagtttaatt tgttcatatt aa 1222

<210> <211> <212> <213> 20 682 DNA Glycine max

<400> 20

gcaacaaatg gatgtacaca gtccgagccc tgcataattg gagcaaattg catattccaa 60

cccttaatga gaatacagaa atcaaaactt gataaataaa atacttcaaa tttgcccaca 120

ttggttgcta atagctattg cagagtatac acaattattc cagtaataca aacttgcata 180

ttaccacaga actcttaatc ataccaacat taaaatagtc tctgtagcca ggctttgagg 240

gcacaagaaa gtgcaacaaa tagttgaaaa aacactgtat gttgtggttc actaatctct 300

tatgaaacag gttatgtaga aaggcttcag ttgtcaccta ctaacatcag ttcaccttac 360

acttgtaatc gtagctacat cttgcttccg gaaacaaagc tatgtatcta atcactaata 420

atgacatcaa agtatgaagt aagatatacc ttttcttcag aggtactctt gacgaaacac 480

aggaatgcct ctgagaactg agagccactg gaaccggttc gcaagtcagc aacgcaaggg 540

cattcaaggg ctttctgagt catttcctcc acagactgaa aaatccaaaa tttccaattg 600

ttttcattcg ttcaacctgc caagttgaaa gcaaaagatc aaagcaattc aattcaaacc 660

tcagtgttct gatttccata tt 682

<210> <211> <212> <213> 21 681 DNA Glycine max

<400> 21

actgaaacat tcgaaattcc ttacataatt tattcttatt aaaaataaca gtaatctttt 60

gacttgaatt ggtacagaag tacaattatt ggttgaggct tttatttcac gcataccaca 120

atgaaacaca tttcaatttt tcttacccct ggttaattta atgtaccgaa tttatacatc 180

aaagagaaga taactttcga agtaaaaatg attatcctaa acaccgtatg ataaagtgta 240

taagattgtt caccattact taggtttttg gaaatgtcaa accttagcac tatggtaagt 300

ttgttgcctt gtaacttgga ggtcatgggt tcaaatcctg caaacagcct ctccttaggt 360

aggaacctca tgcattggac tgccattttt gttgctttgg tgtgagcata gatactgctg 420aattctttga gatgccactt ctcacttatc

ttgtaactac gttcctgaag gcctagaaat gatggatgtt ttgcagacct tcatgctggg

gattggatçc accaggcata agagttaggc

ttgctgcagg tcgactctag a

<210> <211> <212> <213> 22 1002 DNA Glycine max <400> 22

tgagagcttc cattcagaac tactatcaag

taataaacag aataatcgct taaatgaaat

cacagtgctt tagatgtaat caattcaggg

attttaaaag ttgaacatcc tcagcttgct

tgagaaaaaa tgagatttaa gattttatag

gagagttgta actctgaaat ttcaactcac

gactccatgt aggttattaa ctgagttcag

ataatgatgt tgatatttat gtttttatgt

acaaacaatt acaatgaaac aagtaattat

acaaatacct gctttctcca tctgaaaatg

actgcttagc atgatcttta gaaccagagc

ataactctga gtgattctgt gcatgaaagt

aacgtaatta ctttatcagg aaggaggaag

ttctgcttat gttgctttgg acacaattta

ctgaactaac ttcaaaaaca gaatgagact

gttcatgaaa atatcatcag ttcatcactt

ggtaatattt taccaatact atcagcacaa

ccatttttaa cttgcaatct taacttatgc 480

ggtgggataa ggatttatgt gttgtttctt 540

tggatcacat gtcactggac aatgaaacag 600

ctgtctctgg acttgtagct gctgattact 660

681

tactgacagt tagcttcaat acttcattta 60

tggtttagtt tcattcacat taatttcagg 120

agctgagaaa gaaattccac aaaccctcag 180

gcatcaatta acagtaaaaa agaaaggaaa 240

caatttcatg tgagatatta gagcagatat 300

tatccaattt tcttccacag tattatcatt 360

ctgaatcctg tcagttggat ttgagaatga 420

tccaaaaggc cacctttggg caaagggaat 480

atacagaaaa ctgagaaaag aaaaaaatca 540

agcaactcag ggcagggagt tcagatgata 600

gacataaatc cacaccagaa cttgactgag 660

aaattaaata ttaagctgaa tttaggaaat 720

gagaaagcaa aagcatggat aaaaaggaac 780

taaattttgt aatatgttta gatgttaaag 840

caacatttag cacactttca agcaaaaatt 900

ttgaagttaa tcaaatgttg cctgcttact 960

gtagttttat cc 1002

<210><211><212>

23

785

DNA<213> Glycine max

<400> 23

cgacttcgta gcctgcagca agcaaaggcc caactccgtc cagggacggt ccagtacggt 60

ccaagatgat caagctcacc actatgcaca tttctttcgc ctcccaaacc tgaacttgct 120

gcaacagttt taaaagaata ttaatattaa tattaatatt aaagtttcct acagtaagtt 180

attatttaga ataaacataa aaaaaattta tatgaatatt tatttttaat aaataaatag 240

tattcataaa aatgctaaaa tcaagcaagt aattttccta caattttaaa atttgcaaga 300

aaattacata caaatttaaa atccacaaga aagataaact gtgtatttta aattcctgaa 360

aaattaaata caaatttaaa ttccgaagga aaattactag caaatttaaa ttctaccaga 420

aaattatttg caattcaccg aaaaattact tgcaaataaa ttatctgtga aatttctagc 480

agattctttt agtaaaactt tatttataga cacaccactt tttatgtaaa acattttgcc 540

gcagaaattg ttgtatttgt tctagaaaaa ttagcaagaa attttctatg agtttcaaaa 600

ttttcaaaaa attaattatc tactaaggta ttatttagga acccaagtat tggaaattca 660

caggtaatta gtaataagaa aaattctata agatatcgta aaaatataga tcacaataaa 720

gcaagataaa cgtacgggga aaaaaaaatg taaaagggaa tctatcttcg tataaactaa 780

cgtat 785

<210> <211> <212> <213> 24 805 DNA Glycine max

<400> 24

tattaggtca gccattatga caacatcgga tatattcgac aatactaagg aactcatcaa 60

ggacattgct gatgattaca aaccagcctc tcctttagcc ttgggatctg gtcatgtcaa 120

ccccaacaaa gcccttgacc ctggacttgt ttacgatgta ggagttcaag attatgtcaa 180

tcttctctgt gcaatgagct ccactcaaca gaacatctca atcatcacta gatcgtctac 240

taataattgc tccaatcctt ccttggatct caactaccct tctttcattg gtttcttcag 300

tagcaatggt tcttctaatg aatcaagggt agcttgggca tttcagagaa cagtgaccaa 360

tgttggggag aaacaaacaa tctattctgc taacgttaca cccatcaaag ggtttaatgt 420

tagtgttgtt ccaagcaagt tggtgttcaa. ggagaagaac gagaagctaa gttataagtt 480

aaggatagaa ggtccaatgg tcgaaggctt tgggtatctg acttggacgg acatgaagca 540tgcggtgagg agccctattg tggtcaccaa tcaggcaccc tcaaattcaa tttccatata 600

gatcaatttt gtgatggata aatgtttttc atatgtttga agttaaaaat atatattaat 660

agaggaaatg ttcgtacatg aatgattatc atttctgata ataataataa ttttttttgg 720

aaaagtttta acaccaattt taattttttt tttcttatca cgcacaccaa ttttaattgt 780

tacgtactga aataatacgt tagtt 805

<210> <211> <212> <213> 25 1222 DNA Glycine max

<400> 25

tagatctgca ctcgtgaatg ataacattgt tgaattaagg attttgatgc ttgatgcttg 60

atgcttgact atgagagaga atactattga aaattgaagt gaatacttag aagaagttca 120

tggccttgga atggaatgat catgtgaacc tcattacctg ccgacttggc actgcatata 180

tggatctaat tcaagtcctt ttcatcctcc taaatgcctg tcccttcttc tttagttctg 240

atcctcaact tatccacatt agctttcttt ttctagtatt tacaaggatt gctaaaatta 300

attttatttg taataataaa aatgtttatt attgttgtct ataattatta ataaatacaa 360

ttactcgttt tagtgtacat atttcttatt tctatatacc ctttaatata ttaattattt 420

tcttcataaa ccttcaagat gtaactgttc taattttttt ctaaaaaaac tgttatcaat 480

actttcttta attgtttccc ttttttaaaa taaagataga agcatgaagt gtctcatttt 540

caattattta aataaacaat actttagtta gacacaagtt cgaactataa gtttcccata 600

attttgotcc attatatcct acaatttttg tgaaatatat atattcttac aagataatat 660

tacgcacaac ttttcatcaa aatgttacaa acaactcgag cattttagga catttttttt 720

caagtaaatc ccaggccgaa taatcatcaa cctatgttac attcaccccc aacataaaaa 780

ctaacggggg aagatatcta ttgttagtct gtacatttgt tagtgcctga tctctctcgc 840

ctacacagtc gcttgttctt ttaaaaaaaa ccagttagtc accgtttatt ggtcttctcc 900

ttgcctgcaa acaagtttgc cttgtgtcag aattaagcat tactatagag aagcataatt 960

ttcttaaata agattactca ccaaatatag ttgattttaa aggaaatcga attgatgaac 1020

ccttaaatct cagctcccga ttatgcttgt ttctattttg tttctcaata gcactggaac 1080

tattgctagt ttctccggtc agaaagtttg ccactttact taccttttca tggtacacag 1140caggtggggc aagcttcaat ggaggcaagt tttctatttg cataaatctc tgattcttct 1200

gcaagctgcb caagatctgg aa 1222

<210> <211> <212> <213> 26 1177 DNA Glycine max

<400> 26

agtatttttt aaagtacagt gagaaaatgt aaaataaata aataaataaa taaattatct 60

tagctatcat attattgccg abaaaaaaaa atgtcttggc tatcaaagct cttaaagctt 120

accatttagt acggatcctt ccgtggcatc tttatacgcc catttacatg catctatggt 1B0

actttcagat gcgtatctaa aaaaaaaatt acccaagtta agtatgtata tatgctttga 240

ataataatca gagacaacta aagaagctgg tttctttcat aaaaaaaaaa gaagctggtt 300

tctgttgttt ttctagttat gggtttttgg gatttaaata aagaactcat ttttaagcat 360

gtgataggat ggatatgcca ctattttcaa catcagagaa ggatattata tttttatatt 420

ctaaaggatt attttaatac tattatatgt attgtattta aattatttat aataaaaatc 480

ttaccaagaa aattgaaaga tataaacgtg aaactcgcaa aagaaacatt atagaaataa 540

ttggatttgg gtaaatgata tattaattat abtattaata ataatgggac atacgtagct 600

gggcatggaa ggtcattatc accgcagttc tcccattctt ctatctgatc ggcccatact 660

ttctgtttat ttagabaaaa ataaataaaa aattgaagat atacaacctc aaacttcaca 720

acccaaatcc ttatttagat tgatgattaa aacaaaattg catacaatac cgtaatattc 7B0

tgttgaagtg catcgatgaa ttcgttcatg tcagagtcat aaaaattgtc gacttctgtc 84 0

tgaaggatgg tactatccca aacctgtatg tatatgaagg taaaattaaa catatcatat 900

tgtcgtatat atagtatgtg aagacaagaa atggcaagtt ttaatgcatt ccttcatcca 960

gtttctaatt taaggactca tatttttatc tcaafcacatc agattttaaa atgcacacat 1020

tcgagattta aaccatctga tcttcaccta acggtgtcga tctatgaatc catgaagaaa 1080

aaattgactt acatggtgaa gattttgctt ccttttatac cagcgaacag taattgcatt 1140

gcccccatgt ctgagagaaa gccacaatgt agaggct 1177

<210> 27

<211> 685

<212> DNA

<213> Glycine max<400> 27

agtttgcatg cctgcagcca agctctcgtg

cataatttta tattaaattc ttatgtttct

tgggcataac agacacccac cattgcctgt

cagctgatgc cgtgggctgt tgtagctctg

ccccagtgtc ataaggctct tcactatgcg

cttgtccttg ctgatgcaag gaggttgctt

gcacaacttt actgttattc caggactcgc

agtctctagc taaatgaatt gtgtcaatgg

agtccatcag agacaaaaga gtttacacac

gctattatgg atatacaagt tgttccccat

gtaaagctgg tacggctgga aaataacttg

tgagatcctt tgggttgatg acaaa

<210> <211> <212> <213> 28 1343 DNA Glycine max <400> 28

cttgcatgcc tgcagaaaat tataaaattc

attgatttgc tatatatcct atacacttgg

actttaagga cacaatatta tgaaaaatat

caatgcatct caatattttt ttgaaaggtg

cttggctaat gagtgttttc cctggttaat

tatatttttt ttcattaaat actaatgttg

gtatatgact gttattgata aggtatttgt

gaaagaaact aaaaggttaa ctacatgatt

aaaagtcatc catgatttgt atatttggtg

tcaaaatcta gtaacagatt acttaaccat

tttttttaga aggaaaaaat tgggtctgtg

gatttggtgg tgttgttcgg gtaaattttt 60

tgatgtgttt tgcaccaaat tcacctattt 120

tcctgctgtc tgtgaaagtc agctgcttta 180

tcaaactcat ggcctcttaa aaaaaacata 240

aaagtatggg agagggtcat tgtatgtagc 300

ccgaattcaa acccatgacc aactggttag 360

cctctagcca aaatgacctt aacaaaaaat 420

tgttatttta aaggttaaac aaatgtgtat 480

taaaactgat agcataaatt gtcacaggct 540

ggttttctta catgcggtgg ggatggaatt 600

cttggccatg gaattgagtt atgatacttc 660 685

ataaaacgct tctacagaaa attcaaaaag 60

acattttagt cgaaacctct atggatagag 120

tcagctcaaa tattataaaa tgttaaaaaa 180

tacttttaac atgtttatga attgtacttt 240

gttatggatt gtactttgta ggtgtactga 300

attattcaat tttagaacag tgtacgcata 360

tatcgataag gtgcagttaa tataagcaga 420

aagcttaagt gatgaaatgg ataatccctt 480

ctttgcaaaa acaatcattt aagttcgtct 540

tcttttagat cactacaaat atagtatttg 600

gcatcttaat ttttgtgatc acatttttgg 660ttctagtgat actaacttct tagttcttac aatgtatgta tattttttct ttttacaaat 720

gtcactcttc tcagctggat tcatggtttg aaaactcttt cctcataatg tcaacaggtg 780

gctccctata atacatttta ctcccaattg gaaaagcata tgaatgaagt tggaattgtg 640

cccacagtta accgatggga tgagcctcta gcattgggca tggttgatcc ccafcgattca 900

ttatctcatc cagcaggtgt ctctgatgtt caagctgagt ctgctacacg ggtggaccct 960

gatcagttca ctgattttgt ggtatgaatg tttctttaac attgacttgt aaggaaagta 1020

aaatagtgga tatatgtgtg cacacatgtg tatgcgccag tagatggtat ctttaacatt 1080

catatatgct ttttctctgt ctgtatfcgtt gtcatgcaga ttccaaactg gtttggagga 1140

gagtccactg gggctacaaa aggcaaccca ttcacgttac cagatgccta tatggtatct 1200

cagcataaaa atgtatgtgt ggtattaatt gatttgtata ttaattaacg attggatttc 1260

caaatctttt ggtgatcaaa ttttcaaaaa actttatttt aagcgaaata tgttttaact 1320

acaatgaaat tgtatcttct tct 1343

<210> <211> <212> <213> 29 1062 DNA Glycine max

<400> 29

aacttgtgat tcttaatagc cttctcacgc tttttgttgt caaaggttaa ttgatgcagc 60

tttccatata gcagataagc actatataat tacgtatttc aaactacaca ttagtaatta 120

tgtcaggact tttgattatt tctgttggtc aàatttagaa tatggtacta agttaatcta 180

tagtaaatta aactaaccct ttttgagatt agatataact ctctactttt ttttaatatt 240

acattgacat ccttatacag ttatatatat atatatatat atatttaaaa taattaagga 300

agatttatat gtataaaggt gtcaatgtaa actatatatt tttaaatata acaaaaaaga 360

atagtgtagg ggtatataat aagaaaaagg taacgggtaa atttgatgaa atttcaaggg 420

gttaatataa tttaatggca ttcaactggg aaagcaatga gggatgatat tgattggtgc 480

gttgttggct tctaatgtgt ccaaagatgt gttacggaaa attgagcacc aaaagtaccc 540

atagtggttt agagaagtta ctgaaaatga aagcatgtgg tccactctgt ttgatcgatc 600

tccatttctt taaagaattg aatcaaactc tattattaac atactttctg gttccagaat 660

gaatagatat aactagactt gttttatctg acaacaaata ttattccatt tgataaggac 720

gaaacttatg ttcaaattct actttgttag ttaatgbaag aattttattg atagacgatt 780tgaatgtatt tgagtacgaa ttttttgaat tgagactcaa attaaaatat gtctaacctg 840

atcagtgaat tafctgagatc taatttacct atatattttt ttataaaaaa agaattattt 900

tatctaaacc ttttgaaaaa ttaactactt atacatactt tttcaacaac tactcctacc 960

ttagtattct gacctagggc ggctcaattt tccttttttt atttatcagt atgacatatt 1020

aacaaactcg gctgcaggac atgcaaggct ggcggtaaag ga 1062

<210> <211> <212> <213> 30 1095 DNA Glycine max

<400> 30

aaaagttagt agaatttcgc cttaggtggt ttgggaatgc atgaagaaga cctaaagaag 60

cctcgataag aagagcagat catatggagg gcaatctatt tccttgtatc tctgtattgt 120

atagagaggt gcagtattca actcactctc tcaagttagt agttggcata ctgtgtcagt 180

ttgtaaagtt agttattgac agttgtcata actaactaac tgtttcctaa ctatctaact 240

tcataactct ataaatagag tgttgtaact caggattcat taacctccat aatattttct 300

cattccattt atcttotttc ttttctcctt tttctatgat ctaaacagag ttctaatgtg 360

atctattagt tttctattat ggtatctaga gcttggtgag atcttcaatg gctgcgaaca 420

gcaccacatt cctttccgct tcttcttttt cccaattcca tatcacataa acttgatgat 480

tcaagctttc ttctatgtcg tcaacaattt gagcctgcta tcaaaccaca caaacttaac 540

gattcgttgc taatcctcag attccacttc gatttctctc tgaagaagat caagaagttg 600

gacgtgaaaa tccagcttac gaagcatggg aaaagcaaga tcaggtgtta ttagcctgac 660

acaaatcaag gcacttgctg atgctcttgc ttcagtagga agccctataa tgattcaaga 720

gcacattgat tcaattgttg aaggtctttc tccagattat cacccgataa tcgagataat 780

ttagagtaag tttgaaaccg ttccaatcac gcaagttaaa gcacttcttc tagctcatga 840

gtcttgtctg aataacttca acgattaatt acactcatgc acaacacaga gcgaattcgc 900

attcctaaaa ttacactttg ccaaaaaagt caagttctca atcggatcct gaaagttttt 960

tctggttttc gcggtggttc tgcgtgcggt agctataata ggggtggcag cagcggcggt 1020

agtggtggcc attgtcacac tggtgcaggt caatttgcct atttccaatg ccaagtctgc 1080

tttaaatttg gtcat 1095<210> <211> <212> <213> 31 508 DKA Glycine max <400> 31

ttgctcaaca tacaaaacct accacgcatt

tatcttgtag gcccatccat gtttgtccaa gtttggcact aactgtgatg gatcaagggg ctgtttaaga agttgaatta ttgcacactg

gaaggtgaaa catgcaaatc aggttacctt

atatgtaagt ccacttggag tgattacagg

gcacaaataa tctggcacct gtagactcaa

aatttccagg gcaccactga aaaaagattt

gtacacacct cagtaggtgt gtcagctt

<210> <211> <212> <213> 32 580 DNA Glycine max <400> 32

gcgtgcctgc aggtaaaaat ttatgctatt

tgttattcag acatatcatg caaaatataa

ggcatgaata atatttccgt ttaactggtt

ttagaccaca accaacacat gtggccagaa

aaaattttta accatgttca gtgtggcaaa

taactatgct accaaagttt catgcattgg

ttattttaag gagatacaaa taagagatct

tgagcattta ctttttttga gctctccact

tacactttct ggtgcttgtc aaaattgaat

taaaaacatg tcatatttgt ttttttatta

<210> <211> 33 B15

gttaatttgc aacttaatct ttcgttattc 60

gaatgcctcg accgcttcct taatggccaa 120

ttcccgtgtg attgggtcga atttacccac 180

acttcattga agtggaaagc attcaacaga 240

ctgaagatgc tcaagaatca ctgctctctc 300

atcatggaaa atgtcgagtg taattctaca 360

caágacaatt tgtgtaatta ataagatggt 420

gatgaatata gaattaacaa aacaagccat 480

508

aacgaagaag atgttaatgg caggtacgtt 60

cttgcttagc agcttcacag aacccaatag 120

accttaccag cagacgcaaa aaacctcatg 180

tcaataagca tagtaatttt actaacagag 240

tatatgctta tggggtacag taaataatga 300

gggaggataa atgaagggaa ttgtttgaga 360

ctagttaaca taacaaaatc cttcâattaa 420

tcggagtatt ttgtaagcta aattacttta 480

tttaacattt attagaagag cagaaattta 540

aatcctttat 580<212> <213> DNA Zea mays

<400> 33

agccccctga aacattgagc tattaaaaat

gattctaaat ctaaatatga aacctcttgg

tacaagtaat ttgatgacaa tgagctatgc

tgagaaaata tcaggagacc tagcattagg

attcatgcat gacttaccta gtgcaatcta

aattaagcct gctacaattc acaactgggg

aagtgtgtat tagagtcaat ccatctacaa

catttcaatt aatcagacaa acagtagtta

tctagcattt tgctgagata ggacccccgc

gatggagtag catagcatta ttctagcata

tcatactcat ccggaagttg tgtttcgtca

gacagaacta agtagtgaaa aagaagcaca

actaccaagt agcaagaacc atgtttcatc

acatagaact aattattagt ataaaagaag

<210> <211> <212> <213> 34 763 DNA Zea mays

<400> 34

tgtaagttat ctacttattt gttccctatt

ccaaagtatt gttagtgtaa tgttttttct

gcttcatgtc tcaggagggg ctcttggggg

tgcaggttcc atattttaaa ctttctttga

cgtaaaacaa ttctgtggta ttcaatagca

gatttcacta tctcagtttc tttggaggtt

atatatttta ctgaggttct caacgttgtg

ctgctatagt tgattagtaa atatagcagt

tagaaaacga cacaccttca gatactttct .60

tccttacttg caagtaaaag ctacatatta 120

agtcagcatg gaaatgtcaa aacctatctg 180

attcttttgt tttatttttc tactgattga 240

gatgaaaagg tctaacattt tccccatctt 300

agatagaaac tcaaactatg gcagaggcat 360

tgaaaagtat gctatattca taggtattgg 420

ctgcacgata aaacaactga acatcaacbt 480

agggtacata ttacaagaca ggatatgaag 540

attatattaa cataacatga ttaggtcagg 600

ccatagtaac tttggcagca aaacaaacta 660

gatcgcagag agcagttcac atattttact 720

accaccctac ctttggtagc aaaacaatct 780

ttgaa 815

ttcatttatt tatttaaagt tgagatttat 60

tctgccacat taggtttttg tcaatgcacg 120

tggtcgcatg gtagaagact cctcaagcgt 180

tgatcacatt tttgtagtat tcttttttta 240

aattatacac ttcttacaag tcaacatata 300

actagcagaa aagtaattta gaaatgatta 360

tttttcggtt gctggtaaat tgctcatttg 420

atttatgtca ttactggtta cttgtaatgc 480aaaccttttt cattgaagta catgttctgt

cattggtcac taacttttat gttttatgcg

tacttagttt ccatgccatg ccgccttttc

tgataccaaa tcagtagtta caactccaag

tggtgatgct tctgtagagc ttacacggcg

<210> <211> <212> <213> 35 750 DNA Zea mays

<400> 35

tgaggcaatc agtgctactt tagctgctgt

gcattcacct gacagggaac aatctccaga

ccttataaaa ccagatcctg ctcttatgaa

gcaccataga gcagtgagtt gaaaaaatag

ttattctatt cttatttaga cattcagtct

aaaaatgctc ttatttgttt tgatgccagt

cagcagaaac tggaggtgcc ttaggtggca

agaatgaagg tagaagggtc atttatggca

tgctggatcg acaaatgtct attaatagcg

tattgtaaga ttactgacaa aagcaacaca

atggcttctg ctaaaaaaac aagcacttca

tctatattga tttgttataa ttataatctg

gctgaaacct cgtggttgga gccccctgtg

<210> <211> <212> <2Í3> 36 607 DNA Zea mays

<400> 36

cagtcactac tgtgcttttg actggaactt

atggtagcag gccatctcgt gccatggcca

gtggaagtat gaataccaat agcagcataa

aaaatactag aacatggtca gtactttcag 540

agtaataata tttctatttc catgtttatc 600

agtattggac actgctgctg gagtttggtg 660

gacaggaagg tatagtgcag atgcagcagg 720

gtgcaggcac gca 763

aaaggctagg caagttaacg gtgagatgga 60

tgctgcacca agtgccaagc aaaattcaag 120

caattcaaca ccaccacctg gggttcggtt 150

ttcattttgc tgcttgttgt ttaaatttag 240

gtttaactta gaagtcatca catttacatg 300

tacatatttt ggccttgtag gttgtggtag 360

tggttagaca gctctcgatt gaccagtttg 420

cccctgagaa tgcaactgcg gcaaggaaat 480

tgcccaaaaa ggtaatctac atttttctac 540

tgctagaaaa ctgaaagagt tattatcata 600

tatgatgaca ttttctctaa gatgtagatt 660

tggcccaata attcaggtaa ttgcttctct 720

750

gtgtcgtctt atggacatca gagaagaatg 60tcaatattct tggctgaagg aagtatcaaa 120actgaagttg tgcaatgcat atgcttgttg 180cgagaacaga taaagcagaa aactgatgat

agatgttact cattttaaaa ccatgcccac

tgaatcacag aagaaatttg atgatacatt

tagaccccat caaggttgag cagagagcaa

aacaagataa gcacatgaaa acaatctcag

aatgagaaga agtccttaca ttgcccagtg

aggggtgtct gggtccatag caaagtatgg

catgtac

<210> <211> <212> <213> 37 607 DNA Zea tnays

<400> 37

cagtcactac tgtgcttttg actggaactt

atggtagcag gccatctcgt gccatggcca

gtggaagtat gaataccaat agcagcataa

cgagaacaga taaagcagaa aactgatgat

agatgttact cattttaaaa ccatgcccac

tgaatcacag aagaaatttg atgatacatt

tagaccccat caaggttgag cagagagcaa

aacaagataa gcacatgaaa acaatctcag

aatgagaaga agtccttaca ttgcccagtg

aggggtgtct gggtccatag caaagtatgg

catgtac

<210> <211> <212> <213> 38 1025 DNA Zea mays

<400> 38

atatatccag attatatgcc agtattcttc 240

ttggctgatg actcatattt tccatcaatt 300

ggttaagata tgcttatacc tgtggcaata 360

gaacagcacc agttgttaca agatacctaa 420

tcagacgcac accagatcat ccatgaaaaa 480

catcccatgt ttggcaaagg cagatgaaat 540

taccagacca acaataacaa ctgaaaccaa 600

607

gtgtcgtctt atggacatca gagaagaatg 60

tcaatattct tggctgaagg aagtatcaaa 120

actgaagttg tgcaatgcat atgcttgttg 180

atatatccag attatatgcc agtattcttc 240

ttggctgatg actcatattt tccatcaatt 300

ggttaagata tgcttatacc tgtggcaata 360

gaacagcacc agttgttaca agatacctaa 420

tcagacgcac accagatcat ccatgaaaaa 480

catcccatgt ttggcaaagg cagatgaaat 540

taccagacca acaataacaa ctgaaaccaa 600

607

ctctagagga tccccctggt ggttgagagg tactaccagc aagtgacgat gtactgaggc 60cagtagattg ggctggggag ctgaacccaa

atgaaggggt tgaagcagac tgtaaacctg

cagatattcc agcagcatca cttgaaggtg

cgggggaact tgaaaagctt gcaatacttg

atgccttgct gcttgcatct ggtgcaacag

caaatgataa ggtgctagtg ccatcagatt

gagcactgga agaaaaacta aatcccgtaa

tactggatac ggcaaatatg gaagtggaaa

ccactcttgt cctcgacctt gattctgaca

aacttgaatc tgtactttct ggattgaatg

ctgctgagtc ctacaagtat gttatttatg

tcctcctaga cccttttgtg atgacatcat

acatctctga gcagtgtgac tgcttatggt

gggcttgtca cgagtgctgg tttccctgct

ggacgcaaca tctgggctga tgatcttgct

gctgttgttg ggaagggtaa tcatgcttgc

ttaca

<210> 39

<211> 450

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 39

tgaaacgata gctttattta tatcactatt

caatcctaag taaccgaccc cttacatatt

acaagctacc tatagtgcac cggcagagcc

taacggcggc agatgtcttg cgtcgtgaca

aatcgtccgt ggtggcttct tttgcgtcgg

tccccctaga cggctcaccg gacgcgggcg

gcacgccgga gcagcagttc ccgatgttcc

tgtgcaagcc gtgcgcccca ggttccagca

aaaggttgtt tccagagctc ggaaatgtaa 120

gtgcagtgga agtactagat ggtgcagcca 180

caactgcggt gaaagtaggc gtagatgtgg 240

atgacacagg tgaaataaaa agttccgatg 300

atttcacttc agcttttgta ccccctatac 360

tagctgatgt taccaatgac aatccaaccg 420

atgcaggaga cgatgaaata gctggactgc 480

caggggcttc atggattcag tttgatgagc 540

aattggctgc attctctgct gcatacgcag 600

tgcttgttga gacttacttt gctgatgttc 660

ttgctagctc acccttttct cagccattgc 720

acttgctgtt cttttgaatg caggacccta 780

tttgatcttg tccgtggaac ccaaactctt 840

ggaaagtacc tctttgctgg tgttgtggat 900

acatctcCca gcactctcca gtctcttgag 960

acttattgtc tgccataaaa ttggatttag 1020

1025

ggtacagtta gatagaaaag tttcaggcct 60

tcgaacttct atttacaggc ctaggcaaca 120

catgctcgcc gttgcaeggg ctgccgtccc 180

cctcccgcat ccggcgccgc ttcgcctcac 240

ccccggcccc ggcgccggca gccaccataa 300

cgctggacta caccgtgaac gtcggctatg 360

tggacaccat cttcggcgtg tccctggtct 420

450<210> 40

<211> 373

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 40

tcacaaattc atctttaaat tggccctaca

atatcatatt ctaaatgact aaaagatttc

tttccaacaa cctcaaacgt ccattgtttc

tttggcatgg aggcccagtg tgtatcacca

gatgaaacct tctaattaag tgggtaagca

gttctagcag gaatctccaa aatctcttca

tcactttgtg ctt

<210> 41

<211> 1106

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 41

gcggctccac ggccaggcac aacaagcccg

ccgttctccc gcgtcccagc gcaccagccc

aggatctcct cgtctatcct gtccagcacc

ggcgcgtcgc tggcgaccat gcggtccagg

ttcggagggt tgtcccacga gatgtagtgc

tcctccgcgt tgcacacaac ggtgtggaag

tagtacatga gcactgtgcg aggtaggttg

ggcctggaca gtgccatcca ggcagaacct

tatctgaatc agtaactgac atatatagat

tagagtagtg tttatatcta agctgtagtg

cctgcctaca cagagaagtg caaacctcct

gatgtagaac ctgaacacca tatttatatt

ttcattgaca cggtttcatt aatatataaa

tatgatataa ctcacactga gtaactgttg 60

agttattagc atattatgat atcacacacc 120

aaccggaagg ccactgcgtt tagatgatta 180

tttaaactct gaaaaggtta gactttccct 240

aagcactatt cagtaattgt atcacctcct 300

ccaggccaaa ctccgtgggg aacgtgttac 360

373

gtgtctccga ccaccgagca agggtcgctc 60

ccgggagtcg gcacgtccgc gccgcggccc 120

gggtcgtcct cgtggaactt gcgggcgaac 180

tcctccgccg tcaagtagtg cgggtgctgc 240

aggtcgtggt tcaccgtcgt gttcttgaac 300

tatccttccg gcgacgagat gaagtttgag 360

tcccagcccc atatgcagta ttccacaaag 420

gcgatgtcat aggctcatca ggtgcttcta 480

gcctggttat ctatatgagc tgtctggacc 540

tctgtttaag aaattggaat caattaattt 600

ttggggggag atggctaagc atggataatg 660

aatgaaaaaa cctgattttt gtgggaaaag 720

ttagtaactg acacataaaa caaggatagc 780ctttcaaaaa ttaatggcag ctaacataaa tggatcaggg gagtaatcga gccaggaatg 840

ccttggttgg tttccagaac aggaggtcat ttttacatgc aaataaatgt gttgccatac 900

aaatgttctc tactaoaggc aacaaacaaa tagaatcaca aatgtttgtt ccagcaataa 960

gatcaaacaa aataagatta tacagatgga aaggtaattt tttttaccaa ggagaatttc 1020

aggcagcgat atactacact gtacaaaaaa aaaagttaaa aaaataccac agotgtatgc 1080

actattttga agaagaccta aggtaa 1106

<210> <21l> <212> <213> 42 958 DNA Zea mays •

<400> 42

catcttgcat gcctgcagtt tctttggtag acataggtgg gcatgaaggt ggttagttct 60

ttaagattta agatgctaat ctttatgttg agttatactg tgattaaaat gaagataaac 120

atatagtagt gtggtctgtg gtgtcaggat ttgttttcat aaaaattctt tctgcatgct 180

taggtctgtt tgttaaggta tatgctagtg taaaagatgg tgctctcaga catatccatg 240

attcaaaatt aaattagtgg ttgtgacgaa gaattttgag ctgggaaggc agtgtccaca 300

ggcaattgct tagagccctg ccctgctgtg tatccttaaa attgacatga atttaggacc 360

cttgtgattt atacatctat gccaaattgc caagtgctac ttttctctat gtggaaggag 420

atacatgcat ggaaagtttt gcgcgagcct tgagtgtatc acagactatc acagctgaga 480

gggatatctg aaggatatat catgattcat gattaagtta atgtgaagat ctgactaaaa 540

ttgtgcttgc agtaaacaaa acagttctgg ttgggaacca cagatctctt aggaacattg 600

tattctgatc tgactaaaat tgtgcttgaa atgaacaaaa cagttattgg caacctcaga 660

tgcttagata tattaggaac aaatgtattc cgatctgact aaaaccgtgc ttgcagtgag 720

caaaacagtt cttgttggga acctcagatc tcttaggaac aaatgtgatc tgatctgact 780

aatattgtgc ttgtagtgat aaaaaagctc ttgttgggaa catcagatat cttaattttt 840

ttgaaaaacg caggagagct gcgcatattt atagataaga tagaagaaag ggtcttacaa 900

gagaggtaca ggttagggac acctgcaccc acacacacgc actatcaact gaaacaaa 958

<210> 43

<211=» 683

<212> DNA

<213> Zea mays<400> 43

tggtatgctc tctgaacttt tgctctgtaa

aaggaatagg tcccgttgac cgagctcttc

gtagctgtat acgcggactg ggggttcact

ggtgtggtgt ggctctacaa cctcgtcttc

atccgatacg ctctgagtgg caaagcgtgg

ataaactgct cgttttgtca tgcacagcaa

ccatgcacgc gcggtcggtg tgtcgctaat

gaagaaggac ttcgggaagg aggagagggc

ccacgggctg cagccaccgg atgccaagct

gatggccgaa gaggccaaac ggagggccga

agatggtatc gcttgagggg aaagaaaggg

catatgcttt gggatatcta taa

<210> <211> <212> <213> 44 772 DNA Zea mays

<400> 44

cacccctacc aaatcgagca cagctcagaa

caaaagtcac ctcgacactg gacgtgatac

catgcatcag acagttctga gaacttattc

cttcctcgtt ccaccatcct ttttggcatc

caaaagaagc aagcataaat cacatcagta

acatcattcc taaacttcca aatggcccag

ttcctcgtgg ttttcttata aatgttcatc

ggacatctct tcacatccag ggcaacctga

caattgagaa aaaggtgatt ggtggattcc

ccaggccaat tccttttttc aggttttctt

cacaggaaaa cttaaatttt tgaggcattc

ctgtgaccct caataaaaaa aattcagtta 60

gattctctct gaatgcagat agctacactg 120

tcgatcgaag gcattggatg gggctgggct 180

tacttcccgc tcgacctcct caagttcctc 240

gatcttgtca ttgagcaaag ggtgatcaat 300

agcacagcac agcacctgtt tgagtgaatt 360

cgccggggtt ttgcagattg cgtttacaag 420

gctcaagtgg gcacacgcgc agaggacgct 480

gttccctgac agggtgaacg agctgaatca 540

gattgcaagg taagatgttg aagtccgtgg 600

caccgatgtc agcgtttccc atgatctctc 660

683

gaggcagggg aggatcactc tcctaccaac 60

aagagacaca aaacatgggc cagaagacac 120

aacagcaaaa gtcatcttcg gatttgttgg 180

ttttcctgta gaacagacca cgaatccaac 240

gggtcataaa agaccttgtt gttaaagcac 300

agaatggctc ctatgcctag aacaatcaaa 360

cagtcctcaa aaagagaatc caggttttga 420

agaactctcc acacaaaagt ggocactggg 480

aaaacaccac agaaacaaca atcagtcaac 540

tggagataat ttttaatctt cagaacaagc 600

ttattttcca aagaaactta ggaactttag 660tatgacgtca aatagatata cttggctaat aattttgaag aatttaatga ttattatttg 720

gtatcataaa tgctattatt tgattatata aaaattggtc aaacttatga tg 772

<210> <211> <212> <213> 45 544 DHA Zea mays

<400> 45

atacaatgag atggttggca tgcaaagtat tgtgttgaaa ctgataaaac attatcttat 60

atctcaaagt tctcaattgt ttacaagaag gtaaagccct gtataatttt atggcagata 120

actgcaactc ccatagaaaa tccaatgccg gaggttccca catgagtagg gtctgggaag 160

agaaaaacca aggcaagcct tcccccgcag atgaggggag gctacaaatc tcatcaacag 240

acaaaactca tccatcggcg ttggtagcgc ccagatgcca catctgggtc tggcactgga 300

cgcagcatcc accatccatt "tgtcctatcc tttgatccac agttcattta atttagtcca 360

caaggaataa catatctact tctaattaat ccaagtgaaa tgggactatc ttcgtgcatt 420

cctttacctc cacatctgcc tacctcttgc accatcgcta tttctctcgt gcggaattcc 480

aaggctgggt taaaaaaaac acggaacacc cctcacccct gtcggcctgt tcttccactg 540

acgc 544

<210> <21i> <212> <213> 46 452 DNA Zea mayB

<400> 46

cttccatcca cgaactcccg ttctccafcbt ccagccatgg cggtgtcgat cgagctca.cc 60

aaggagtacg gctacgtcgt gctggtgctg gtggcctatg tcttcctcaa cctttggatg 120

ggcttccagg tcggcaaggc ccgcagaaag taagctctcc gaaatctgaa tcgctcgtcg 180

ccattgttgt cttcgtttgt ctccgcccaa cttatttcat caacggacat aataatatga i 240

tggtttcogc tgtgattctt ctttaggtac aaggtgttct accccaccat gtacgccatc 300

gagtcggaga acaaggacgc caagctcttc aactgcgtgc aggtgcgccc aagattctga 360

catcctctcc cctcccccgt gattaattaa ttgctcttgt gaggggttgg gactttggga 420

ggcatctaaa tttccgctgg ttcttgtggt tg 452<210> <211> <212> <213> 47 1064 DNA Zea mays

<400> 47

tagctttaga gcatgtggaa atttcagctt ctggacaggc tactaacttc cctacttgca 60

cgcaagcata aggtatggtt ttaatgaaca tgttacccaa gtttgtgttt ttttagtatt 120

tcttaactaa ctttagatca actgatatat gtttgtaggt tctaatattc tcacaatgga 180

caaaagtttt ggacattctt gagtattacc tagattcaaa aggccttggg gtttgcagaa 240

ttgatggtag tgttaatttg gaagagaggc ggcgacaggt aacatgctag cctgtgccaa 300

tatattactc ctttcattcc aaattataaa atattgactt ttctagatac attacttttg 360

ctatgtatct agatatacac tcatgtggga gcctccaaca ctggatctgc cctagataca 420

cactaagtct atatgcataa caaaaagtga tgtatctaga aaagccaaaa cgtcttgtaa 480

tttgggacgt gtactatttt tctaaagaac atctaaactc tgaggatttg cactgtagtt 540

agatatttgg gtacatgtat aaatttattt cacaaaaaaa atcttttgtt actgttttct 600

catgcagata gcagagttga atgatttgaa tagcagtctg aatgtcttta ttctgagcac 660

acgggctggc ggacttggta tcaaccttac ttctgctgat acatgtatcc tttatgacag 720

tgactgggta attctctgtc aagactacta tactcatcag aaaaatgttt acaagaaagc 780

cttttttttt gctggctact ttctttggct gctgattgac ttattatgct agttctaata 840

tggtgctcgt ttactcgaac ctccagaatc ctcagatgga tcagcaggcc atggatcgat 900

gccaccggat tggtcaaaca cgcccagtac atgtatatag gctggctacc tcatattctg 960

ttgaggtatg cttcagtgat ccgtgttttc agacttgtca ctttggctat tgtctcaggt 1020

ttactcagct tttcaccttt gcaggaacgg atcatcaaga aagc 1064

<210> <211> <212> <213> 48 1588 DNA Zea mays

<400> 48

gggcgccggc gggtgagatc ggcaggggca tgccgccgtt ggccccggcg gcggtagaga 60

atcctgatga tgctgcagag tggtgcaacg gcacgtgagg ggagccctgc gcttgccatg 120

cccatgaggg gaatggctgg gcgcccagct caggccttcg ctccaccggc ctttcctgga 180cctgcacgat atcgcagcag cacgagcatg

aacgtttcca cctttaagtc gttcacagga

atcggcgagc atgattaatc tttcatgatt

atgtgcagca caatgaagac ttgatgctag

tcaggactac agctgcagca cgtgatccct

tatgtcaaga aactgcgacc caacaaccgc

cagaacggcc tggtcgaaac accaaccagt

taaggagtac cattgccccc cacccccccc

tatttttcca aggagcaaga cgtttcataa

ttggtaggga atcaatctac aagtaaatgt

gacatgtcgc acatatatat tcggcttgtt

ggtcatgttc agctaaccat cctggattct

tagtaacaga catttgcatg tgtaagtgta

cggaaagaag ccatgacaag ctgacgagta

gttttggtga tacccgggcc aaggggatga

aaaggagcaa acactgtgag atcaataata

gatctccccc aaccatatgc caatcaaata

ctagtaggaa ctagtatcag aggtccaaga

ttccatctta agattttaat tttttttcta

ctatatactg gaaaattgaa cgggtggttt

aggggaatca catgttggct gga.ggcca.gc

attaggctgt gaaatccgca aatccaaatc

cgtagagaga accatgagat acacctcaga

acaaggccga gtgtaatacc ctcggttt

<210> <211> <212> <213> 49 784 DNA Zea mays t

<400> 49

agctttgttt gtcaggtttt gaccacagtg 240aacagagcga acaaacaacc aagattggat 300ctgttttaat taattgattg attttaacgt 360ctctatttcc cgtaaaaatt cagagaatcc 420gatcagcgta ctaaaagata catcccatgt 480gactgcggtg tttcaaaaga tggaaagtgg 540ccacacacca aacagtacct gccattatag 600aaaaaaaaca gaaaaagaag tgctgtatag 660gaaatttcta aacaagctaa cagtaacagg 720ctatctagct gctctcagtc aaaaaggtta 780tctttcccat tatttccttt ttggaacaca 840acgatagttt ggaataactg atggagtatg 900acaaagggat cttggcgata cctggtggtt 960caagcgctga tggtgagatg acactgctgg 1020tgagctcatt ggctacagca gcagcaggtg 1080gttgtaggac ctggaccacg aattaatatc 1140gtcctatgaa tctttgtagg ctaggagtta 1200ttctacaaag acaattcaac cgacagttgc 1260gatacctctt taggcaccat aagtaaaaag 1320tacctgagaa gccatcgtat ttgaagattc 1380taaggtattg tcccttttgg ggtcttgcac 1440aatggcatca ccatcatcaa ttgctgacaa 1500tactatatat attaaaaaaa agaacggatg 1560

1588aacataattt catgtactgt tcgtacagag attatcttta gagagaatag taagtactac 60

cttcgttctt gaatatttat catctgctag tttaatttta aactaaaacg tgataaataa 120

aaaaaacgaa gagggtatct tctatcttgt aataccaacc acgtgaagac cttcactcca 180

cggttgtttt gcotttttag attatattaa aactttgccc atacaaaaca gtttcttagg 240

gaaatttcca gatttatctc actcgcaatt accaactggc catcgttatt ttttagaacg 300

atatcttgca atcttctaag ctgactctgt aaatcttcac gtagccatct cctaaaaatg 360

aggctctagt ttttatattt catggcttca actgaacaat cacggtcctc gtttttttta 420

aaaaaaatga gaaaagtgtg tctttaaagt aacctatagc cacaccatct agtatgccaa 480

aaaaatggtg gatttttcat tggccgacac cgtagacctg ctgcttaagt aaatatatct 540

ggtttggggt taafctagaag tatgccactc caaatttaaa gagttataaa gtagtttatt 600

ttcatgtcgc tcaatgacat caaaatgaat tacctatcta attttataaa aacagggtga 660

caagtatgta attaatcttt tttttcttag ctaggtttag tgatcttagt ccatctaatc 720

aaatgatatt tccctcttcc aaaaaaaacg ctttctagca ctatccatct ttccaataga 780

tgtc 784

<210> <211> <212> <213> 50 802 DHA Zea mays

<400> 50

tgetgcgtcg tcgtgttgtt acgatcgtcc tttttttttt gaaaatttat tgaaggcccg 60

tgcttcttct tctcttcttc ttttccttct ccactgtttt cctcgcatgc tacatgacag 120

tctctctctc tcgttaactc tgttggtgtt cttattattt gatccggatg caagtaatac 180

tatacaaaca ggaatcggga atgcacgctc ccaatttttg acgcctccat gcatgtagtg 240

gcggagttcc gtaaaattaa cgtccgagat gtactattct atcttttgat tttttttttc 300

gtgttttatt taaaaataaa cagcggatga taaatattta ataacggaga gtaacattta 360

aaacaatcca gttaaactat gacaagtagg gaaagtggat tagatattcg ggaacaatta 420

cttacaatag aggagaatca cgagcacatg gcagcagaca gtcaacactc aggacacaac 480

gttogccgct caggtggccg ttgttcattg gccaaggagg cactctgcac tcgcctatga 540

ataacaaaaa aagataatca agttgagaaa gttatatagc ttggaagaag atgtaatgac 600

aggggtggat ttgggcggtg gcatggcgcc agcccccgcg cgcgacactg ctatagggtc 660gcagggaggc tggaggcgga tggtggaggc cgatgccaga ctggcggtgg tggatgcccc 720

gagtcaagcc cgccccgacc gcctcggagg gttgctggfct tgttcctcat fcgccgaatfcc 780

cccggaagcc cttaaggctt tt 802

<210> <211> <212> <213> 51 793 DNA Zea mays

<220> <221> <222> <223> inseguro (1)..(793) n=a,g,c,or t

<400> 51

aaagtaagca aaactaagct gaaatctgca agaagcagta ttgagattac caaaccaaca 60

agatcctgca gttaagttca acagaaccaa gatcagcatt cagcacaaaa tgaactgatt 120

cataatcact ctgtggacag taacagtggc agagaaagac ctgatgccca actggtttcg 180

aattgtgcaa gatatgagaa aatgggtaaa acaaatctct cctgtctttt agtgtcctta 240

agctattact attgagaact ccaccagtga tccttttgcg cattagagca tccttaatcc 300

tggactgact tagttgagta tcagcgagca tgttctgtgt gctgcatagt ataataataa 360

gccatcataa ataataatga tgataaacga aatcaataac ataaaacaca taataactca 420

cgtgttctgt gtgctgcgta gtataataat aagccatcat aaataataat gatgataaac 480

gaaatcaata acataaaaca cataataact cacggtgtgt gttgctctat ttttactcta 540

gggcttccat caggttcggt aagtgcagct tctccttcaa cagcataaac aagaagacca 600

agttggcagt accctaatgc tgtagcttgg aaccaggcaa gatcaacacg gataccattc 660

tcagctaaag agggatttgc atgagattca agccagttga tgaccggaag aaacgttact 720

ttcagatttc caccacggac caaacgcagg gggatnctnt agagtcgaac ctgcaggmic 780

agcaagtcat agg 793

<210> <211> <212> <213> 52 748 DNA Zea raays

<400> 52

atcatttttc aaccaagtaa tggagatcgc tttttatttt tagtatgtcg catcgttggc 60tagagctttg atctaccttc atggcaagca

tcttttagtt ggagttcagg tacttgcatt

ggtctgctct gcctcatctg gaagactgga

ttccttggaa cagggcgaga tcaaaattgc

cagaagacgg actatgtgcg gaactctgga

agccatttac ctccagttat gaactagttc

ctagctgctt tccttggctc tgaaacctgt

tgattaccat gttgatatat ggagccttgg

cccacctttc gaagctaagg agcactcaga

gatcttagta tgtcgtccct aacttgccga

ttgacttttg agctatgctc tgataactgt

agtgtagcaa agagagagca ctatattg

<210> <211> <212> <213> 53 610 DNA Zea raays

<400> 53

atattcaaaa gggaaacgaa gatggcttgt

tgtgggcttt aattatggat gctggcactg

attactttct tcacaaggta agcaatcaat

ttcccctttt ttcttcttaa tataatgata

aaccttcaaa gatatgtaag ggttcttcct

cttcttctta atataatgat acacaatttc

aaaaaccttc aaaaatttac tgttctttgt

atacatcctc aatgatgtct cattgtcatt

atggaacagt gggagagaaa tttctatatc

tctttggtga ttatgtcaag aggtaattaa

caggcatgca

<210> 54

tgttatccat cgggacatta aaccagagaa 120

gtgttctttt ttggtatccc tctggcaccg 180

actatatgct tgctttacat cgtcgtctgt 240

cgactttggc tggtctgtgo acaccttcaa 300

ttacctgcca cctgaaatgg gtactttgct 360

aatgggtttt gagaattccc acagcagtac 420

tgtggtttat ccagtggaga aggcagaaca 4B0

tgttctgtgc tatgagttcc tttacggggt 540

aacctacaga aggtaactcc acaactctgg 600

tatcttgccc tagattattt cctgtggctt 660

gaggaaactt ttgaagttgc atatagtgct 720

748

ttattagttc agttgcctct agctcaaatc 60

gctttacatc tcaagtatac gaactttcta 120

tctgttgact tcaaagatct gtaagggtcc 180

ttcagctctc ctgcttattt gagagaaaaa 240

ctttgtaata gggtctttac ccttcctttt 300

tcctgcttat tcgagaaaaa aattgagaga 360

ttatgattgt acgccaacac ttcactgatt 420

cgcatgcttg tactgtgtta ggaatggata 480

actgcactgg ctggggcgaa taatggaagc 540

tgtaaatgtt tgagcttgat gcttagactg 600 610<211> 883

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 54

atttgaatag gatacatatg aaaaaagaga aattaaaggc ctgtttggtt cactacctca 60

gttgccacaa tttgcctaac ttttctgcct gaggttagtt attcaattcg aacgactaac 120

cttaggcaaa gtgtggcaca tttagccaca aaccaaacag gccctaagtg tttgctcagc 180

caaacatcgt gtatcagctt gaaatccaaa atatgtttgg caaaacatag cacatttatc 240

aagaaatcat agaaggcaaa atgcaatatg ctaatggaaa aggctcacag gtgactacga 300

tatctctcaa caggatatac aatgcttgag atggagttcg ccatactcag aaatttgttt 360

gacatgtgtc attttataat tttattttag aagctaggat tcagacttca actggagtag 420

atcaagtcaa tacataaaca gtattctttc atactaagaa atatcacctt gtaagattcc 480

tcaagcctgt ccttgtattt ttcaaccaac agctctttac tcaatgccag atctctttcc 540

actactgcct ctgtctcaaa ctattaagag acaagagaac acattactct atctattcaa 600

aacaattcct gtaatcaagt gataatataa ctataaccaa ctaaacatca tgaaaaaatt 660

gcagtgcaat acctgaataa caatgtgagg atacaatgtt tgtcctttac ggattggtgg 720

atcaagagtg ataacaacaa atgtatgagg attgtttgac tgcaaaggtc aaccatgcaa 780

tgagtttagt tacatgtcac aatgtaatac tatgtacaat aataaagcac aagcctcaac 840

catatgatac caaggaacag aaaccttttg gcaaaaagga aag 883

<210> <211> <212> <213> 55 24 DNA Glycine max

<400> 55

tgcttgcttt ggacctacac aaaa 24

<210> <211> <212> <213> 56 24 DNA Glycine max

<400> 56

aaaagcccaa aaggaagagt ggag 24<210> 57

<211> 24

<212=. DNA

<213> Glycine max

<400> 57

gcgatgacct tgtatggggt agac 24

<210> <211> <212> <213> 58 24 DNA Glycine max

<400> 58

ccatgccctg attcattcat cata 24

<210> <211> <212> <213> 59 1249 DNA Glycine max

<400> 59

cagactctag tgactaccac cttcactctc ctcaagcatt tcagcctctt ccccgctcag 60

actccttagc tttgggagcc aaattatccc ttacgttctc gacttcaacc atatgtgata 120

gctgcctatg ataccatggc tacttcccgt tagttcttta tctttccttt ccgctttatt 180

ccatgoctta ccgatcctct gaagtgtctt tgcattagct tcattgaaac ctcacgcgat 240

gaaaggtgtg atggtctcct ccgatggcgc acttctcata gggtaaccta attgtcttac 300

gaccaacata ggattataat taatacaacc cctcgtccct ataaaaggga catttggaaa 360

tccttcacat aagcataaca ctcctacccc tctttctttc cactgtggga accaactaat 420

ggacgctcct atcatgcctg ccaagagttc ttcccaattt gcctcgtcct ttcctgagca 480

catgcgatga ccttgtatgg ggtagacaga tctactttca tgattgaaga cgtgggatac 540

caaccacaca taaagagcag gcgcacaaca gaaaatcctc gtagtgctct tcttgcatct 600

taagtcaaat gtatcataca cttatgctaa aacaacaatg atcgggcttt ccttgctatg 660

gtgataagca agaaaagcat cgattgctac tagatccacc aactcgtcta cattcgaaaa 720

tagtactatc ccaaacacta gcagtgctaa tacgtcgatg aatgatgccc actctccttg 780

gctggccaga gtttccgcct tctcctccaa tcacttcctt ggtattcccc ctaccctatt 840

cctactttgc ttcactcagt ctaattctca tttcgagatc ttgacaactc ctgctattct 900cgccatagaa ggatagtacc cagaaaaaag gtatggcttc cttcctccta tcgggcatcc 960taagatccct tcgaactcct ctatggttgg tgctaactga aagtccccaa aagtgaagca 1020tctgagtgat tggtcatagt attgggtgag agatgcgatg gcttcaacga acacttctat 1080catcaccaga tcccaaatct tcccatatac cttgttgaag gactgacgtt gagctcgatc 114ocatccgatgc cccagttttc gcaagatgac tacttctaga ttcttgagtt cgacacgata 1200gaaccfctttc ttaaaagaca gtgcttgtct gaccccatct catcagact 1249

<210> 60

<211> 25

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 60

cgttctcgac ttcaaccata tgtga 25

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 61

gcatggaata aagcggaaag gaaag 2 5

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 62

ccatggtatc ataggca 17

<210> 63

<211> 17

<212> UNA

<213> Glycine max

<400> 63

ccatggtatc gtaggca

17

Claims (37)

1. Método para reprodução de uma planta transgênica compre-endendo as etapas de:(a) provisão de uma base de dados identificando um valor depelo menos um traço agronômico para pelo menos dois haplótipos distintosdo genoma para um conjunto de germoplasma;(b) transformação de uma planta de origem com um DNA re-combinante para produzir pelo menos dois eventos transgenicos, em que oDNA recombinante é inserido dentro da ligação com pelo menos dois hapló-tipos distintos do genoma da planta de origem;(c) identificação da base de dados quanto ao valor do dito traçoagronômico para os eventos ligados aos haplótipos distintos; e(d) seleção de uma planta para reprodução, a dita planta com-preendendo o evento transgenico possuindo um valor haplótipo identificadomais alto.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o DNA re-combinante é selecionado do grupo consistindo em DNA codificando ummarcador selecionável, DNA codificando um marcador classificável, um sítiode recombinação de DNA, DNA codificando uma proteína provendo um a-perfeiçoamento agronômico e DNA para supressão gênica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que existe pelomenos o dito traço agronômico ou um índice de traços múltiplos.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito even-to transgenico selecionado para reprodução possui o DNA recombinanteligado a um haplótipo em que o haplótipo é selecionado do grupo consistindoem não-negativo com relação ao rendimento, não positivo com relação àmaturidade, nulo com relação à maturidade, entre os 50% favoráveis comrelação a um traço agronômico ou um índice de traço múltiplo quando com-parado a qualquer outro haplótipo no mesmo segmento de cromossoma,entre os 50% favoráveis com relação a um traço agronômico ou um índicede traço múltiplo quando comparado a qualquer outro haplótipo através detodo genoma.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma plantade progênie da planta selecionada para reprodução é selecionada por sele-ção auxiliada por marcador.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma plantade progênie da planta selecionada para reprodução é selecionada por de-tecção da expressão do transgene ou expressão do traço agronômico dotransgene.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a planta éuma planta de colheita selecionada do grupo consistindo em uma colheita deforragem, colheita de sementes oleaginosas, colheita de grãos, colheita defrutas, colheita de vegetais, colheita de fibras, colheita de temperos, colheitade nozes, colheita de turfa, colheita de açúcar, colheita de plantas usadasem bebidas e colheita de plantas florestais.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a oleagino-sa é selecionada do grupo consistindo em soja, canola, semente de colzaóleo de palma, girassol, azeitona, milho, semente de algodão, amendoim,semente de linho, açafrão e coco.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a soja pos-sui em seu genoma, pelo menos um marcador genético que é ligado geneti-camente a um haplótipo selecionado do grupo consistindo em C8W6H5,C18W3H8, C19W3H6, C16W8H43, C1W1H2, C1W2H1, C14W7H2, eC6W4H1; e o dito haplótipo compreende adicionalmente um transgene ligado.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o marcadorgenético é um marcador de DNA selecionado do grupo consistindo nas SEQIDNOs:1-32.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendoadicionalmente a etapa de cruzamento da planta de progênie com uma ter-ceira planta, a soja, para produzir plantas de progênies adicionais.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a dita co-lheita de grãos é a do milho e possui em seu genoma, pelo menos um mar-cador genético que é ligado geneticamente a um haplótipo selecionado dogrupo consistindo em C1W19H14, C1W30H4, C1W36H2 e C8W4H5; e odito haplótipo compreende adicionalmente um transgene ligado.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o ditomarcador genético é um marcador de DNA selecionado do grupo consistindonas SEQ ID NOs: 33-54.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o DNA re-combinante e o haplótipo são ligados a uma distância genética de 0 a cercadelOcM.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o DNA re-combinante e o haplótipo são ligados a uma distância de 0 a cerca de 5 cM.

16. Método de acordo com a reivindicação 4, em que um alelode haplótipo está associado à adequação agronômica ou ocorre a uma fre-qüência de 50% ou mais em uma população de reprodução ou um conjuntode germoplasma.

17. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o aperfei-çoamento agronômico é selecionado do grupo consistindo em, tolerância aoherbicida, resistência à doença, resistência aos insetos ou pragas, ácidograxo alterado, metabolismo da proteína ou carboidrato, rendimento degrãos aumentado, maior produção de óleo, maturidade da planta alterada,tolerância ao estresse melhorada e características morfológicas alteradas.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a tolerân-cia ao herbicida é selecionada do grupo consistindo em glifosato, glifosinato,sulfoniluréias, imidazolinonas, bromoxinila, dalapon, dicamba, 2,4-D, ciclohe-xanodiona, inibidores de protoporfirinogeno oxidase e tolerância ao isoxaflutol.

19. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a planta deprogênie contém pelo menos uma porção do haplótipo da planta selecionadapara reprodução, em que a porção é selecionada do grupo consistindo empelo menos 10 cM, pelo menos 5 cM e pelo menos 1 cM.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o uso daplanta de progênie em atividades relacionadas ao aperfeiçoamento do ger-moplasma, as atividades selecionadas do grupo consistindo no emprego daplanta para obtenção de cruzamentos de reprodução, teste adicional daplanta, melhoramento da planta através da autofertilização, uso da planta oupartes da mesma para transformação, uso da planta ou partes da mesmapara mutagênese, e uso da planta ou partes da mesma para CULTIVO.

21. Método para inserção de um transgene em um haplotipo deplanta compreendendo:(a) incorporação de um sítio alvo compreendendo pelo menosum primeiro sítio de recombinação à ligação genética com um haplotipo; e(b) introdução em uma célula de planta de um cassete de ex-pressão de transgene compreendendo pelo menos um primeiro sítio de re-combinação, em que o primeiro sítio de recombinação do cassete de ex-pressão flanqueia um polinucleotídeo compreendendo um transgene de inte-resse; e(c) provisão de uma recombinase que reconhece e implementarecombinação do cassete de expressão no primeiro sítio de recombinação,pelo que, criando uma região genômica do tipo T preferida, em que a regiãogenômica do tipo T preferida possui um valor do tipo T estimado,em que os meios preferidos selecionados para um haplotipo que anterior-mente não continha um transgene ou é preferido em relação a um haplotipoque anteriormente continha um transgene, em que o haplotipo é selecionadodo grupo consistindo em não-negativo com relação ao rendimento, não épositivo com relação à maturidade, nulo com relação à maturidade, entre osmelhores 50% com relação a um traço agronômico ou um índice de traçomúltiplo quando comparado a qualquer outro haplotipo no mesmo segmentode cromossoma, entre os melhores 50% com relação a um traço agronômicoou um índice de traço múltiplo quando comparado a qualquer outro haplotipoatravés de todo o genoma.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o sítio derecombinação é selecionado do grupo consistindo em FRT, FRT mutante,LOX, sítios LOX mutantes, e sítio modificado de nuclease de dedo zinco.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que um alelode haplotipo está associado à adequação agronômica ou ocorre em umafreqüência de 50% ou mais em uma população de reprodução ou um conjun-to de germoplasma.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a recom-binase é cre ou flp.

25. Método para mapeamento de pelo menos um evento detransgene do tipo T, compreendendo:(a) identificação da seqüência de flanqueamento circundandopelo menos um primeiro evento transgênico em uma planta transformada oulinhagem pelo menos um primeiro polimorfismo entre as linhagens de origemde uma população de mapeamento, em que a planta transformada ou linha-gem pode ser diferente das linhagens de origem da população de mapea-mento; e(b) ensaio das plantas de progênie da população de mapeamen-to quanto ao polimorfismo,(c) realização de uma análise de ligação para determinar a posi-ção no mapa do polimorfismo e pelo que uma localização no mapa do even-to transgênico; e(d) correlação da localização no mapa em relação a um haploti-po da planta transformada.

26. Método para melhorar o acúmulo de um ou mais regiões ge-nômicas do tipo T em um germoplasma compreendendo:(a) inserção de um transgene dentro do genoma de uma primei-ra planta; e(b) determinação da localização no mapa do transgene no ge-noma; e(c) correlação da localização no mapa em relação ao haplotipo, emque o transgene e o haplotipo compreendem a região genômica do tipo T; e(d) cruzamento da primeira planta com uma segunda planta quecontém pelo menos uma região genômica do tipo T ou haplotipo que sejadiferente da região genômica do tipo T da primeira planta;(e) seleção de pelo menos uma planta de progênie por detecçãoda expressão do transgene da primeira planta, em que a planta de progêniecompreende em seu genoma, pelo menos uma porção da região genômicado tipo T da primeira planta e pelo menos uma região genômica do tipo T ouhaplótipo da segunda planta;(f) empregando a planta de progênie em atividades relacionadasao aperfeiçoamento do germoplasma, as atividades selecionadas do grupoconsistindo no emprego da planta para obtenção de cruzamentos de repro-dução, teste adicional da planta, melhoramento da planta através da autofer-tilização, uso da planta ou partes da mesma para transformação, uso daplanta ou partes da mesma para mutagênese, e uso da planta ou partes damesma para CULTIVO.

27. Planta de cultivo compreendendo uma região genômica dotipo T preferida, em que um transgene da região genômica do tipo T é adi-cionalmente definido como conferindo um traço selecionado do grupo con-sistindo em tolerante ao herbicida, resistente à doença, resistência ao insetoou praga, ácido graxo alterado, metabolismo da proteína ou carboidrato,rendimento de grãos aumentado, maior produção de óleo, maturidade daplanta alterada, tolerância ao estresse melhorada e características morfoló-gicas alteradas; e o haplótipo da região genômica do tipo T é selecionado dogrupo consistindo em não-negativo com relação ao rendimento, não positivocom relação à maturidade, nulo com relação à maturidade, entre os melho-res 50% com relação a um traço agronômico ou um índice de traço múltiploquando comparado a qualquer outro haplótipo no mesmo segmento de cro-mossoma, entre os 50 melhores com relação a um traço agronômico ou umíndice de múltiplos traços quando comparado a qualquer outro haplótipo a-través de todo o genoma.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que um hapló-tipo possui um valor alto se estiver presente com uma freqüência de 50% oumais em uma população de reprodução ou um conjunto de germoplasma.

29. Planta de cultivo de acordo com a 27, em que a região ge-nômica do tipo T preferida compreende um transgene e um haplótipo quesão geneticamente ligados dentro de uma distância de 0 a cerca de 10 cM.

30. Planta de cultivo de acordo com a reivindicação 27, em quea região genômica do tipo T preferida compreende um transgene e um ha-plótipo que são geneticamente ligados dentro de uma distância de 0 a cercade 5 cM.

31. Planta de cultivo de acordo com a reivindicação 27, em quea planta de colheita é a soja tolerante a herbicida, transgênica, e em que otransgene é geneticamente ligado a um haplotipo identificado como C8W6H5.

32. Planta de soja, de acordo com a reivindicação 31, em que omarcador genético é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1,-2, 3 e 59.

33. Planta de cultivo de acordo com a reivindicação 27, em quea planta de colheita é soja tolerante a inseto, transgênica, e em que o trans-gene é geneticamente ligado a um haplotipo identificado como C6W4H1.

34. Planta de soja de acordo com a reivindicação 33, em que omarcador genético é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 29-32.

35. Planta de cultivo de acordo com a reivindicação 27, em quea planta de colheita é o milho tolerante a inseto, transgênico, e em que otransgene é geneticamente ligado a um haplotipo identificado comoC1W36H2.

36. Planta de milho de acordo com a reivindicação 35, em que omarcador genético é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 48-50.

37. Método para melhorar o acúmulo de um ou mais haplótiposem um germoplasma compreendendo:(a) determinação da localização no mapa de um trasngene nogenoma; e(b) correlação da localização no mapa com relação a um haplo-tipo, em que o transgene e o haplotipo compreendem uma região genomicado tipo T; e(c) cruzamento da primeira planta com uma segunda planta quecontém pelo menos uma região genomica do tipo T ou haplotipo que sejadiferente da região genomica do tipo T da primeira planta;(d) seleção de pelo menos uma planta de progênie por detecçãoda expressão do transgene da primeira planta, em que a planta de progêniecompreende em seu genoma, pelo menos uma porção da região genomicado tipo T da primeira planta e pelo menos uma região genomica do tipo T ouhaplótipo da segunda planta;(e) uso de uma planta de progênie em atividades relacionadasao aperfeiçoamento do germoplasma as atividades selecionadas do grupoconsistindo no emprego da planta para obtenção de cruzamentos de repro-dução, teste adicional da planta, melhoramento da planta através da autofer-tilização, uso da planta ou partes da mesma para transformação, uso daplanta ou partes da mesma para mutagênese, e uso da planta ou partes damesma para CULTIVO.