BRPI0610112A2 - método para avaliar a eficácia de um regime de tratamento - Google Patents

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BRPI0610112A2
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Abstract

A presente invenção fornece materiais e métodos para avaliar a eficácia de um tratamento. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de avaliação da eficácia de um tratamento para doença celiaca medindo-se o nível de zonulin de soro de um indivíduo que tenha recebido o tratamento.

Description

"MÉTODO PARA AVALIAR A EFICÁCIA DE UM REGIME DETRATAMENTO"
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOSEste pedido reivindica prioridade ao pedido de pa-tente provisional dos Estados Unidos No. de Série60/680.868, depositado em 13 de maio de 2005, os teores dosquais estão especificamente aqui incorporados por referência .
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo de diagnós-ticos e avaliação de modalidades terapêuticas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os epitélios de mamífero contêm estruturas referi-das como zonula occludens (ZO) também referidos como junçõesestreitas (TJs). Estas estruturas regulam a passagem de ma-'teriais através de epitélios controlando-se o acesso para oespaço entre as células epiteliais (a via paracelular). Pa-ra atender aos muitos desafios fisiológicos e patológicosdiversos aos quais os epitélios são submetidos, as junçõesestreitas ou zonula occludens devem ser capazes de respostasrápidas, fisiológicas, reversíveis, transitórias, dependen-tes de energia, e coordenadas que requerem a presença de umsistema regulador complexo. Os exemplos de epitélios quecontêm junções estreitas incluem, porém não estão limitados,aos intestinos (particularmente o intestino delgado), e abarreira hematoencefálica.
Na ausência de estímulos, as junções estreitas sãofechadas restringindo o acesso à via paracelular. Na pre-sença de estímulos, as junções estreitas são reversivelmenteabertas. Nas Patentes U.S. Nos. 5.945.510 e 5.948.629, no-vas proteínas de mamífero que funcionam como o modulador fi-siológico de junções estreitas de mamífero, foram identifi-cadas e purificadas. Estas proteínas de mamífero, referidascomo "zonulina", funcionam como o efetor fisiológico de jun-ções estreitas de mamífero. Certas bactérias Foram mostra-das ter toxinas que estimulam a abertura de junções estrei-tas. Vibrio Cholerae produz uma toxina (toxina de zonulaoccludens, ZOT) que foi mostrada causar a abertura de jun-ções estreitas. Foi mostrado que 6 His-AG, uma deleção N-terminal de ZOT na qual os primeiros 2 64 aminoácidos foramdeletados e substituídos com um rótulo de purificação deseis histidinas, retém a capacidade de abrir as junções es-treitas.
A disfunção da junção estreita intestinal ocorreem doenças auto-imunes e em uma variedade de condições cli-nicas que afetam o trato gastrointestinal, inclusive alergi-as de alimento, infecções entéricas, sindromes de má absor-ção tal como doença celiaca, e doenças de intestino inflama-tórias. Mucosa de intestino madura saudável, com sua junçãoestreita intacta serve como a barreira principal à passagemde macromoléculas. Durante o estado saudável, as quantida-des pequenas de proteínas imunologicamente ativas cruzam abarreira de hospedeiro de intestino. Quando a integridade dosistema de junção estreita é comprometida, como com prematu-ridade ou após exposição a radiação, quimioterapia, e/ou to-xinas, uma resposta danosa aos antigenos ambientais (inclu-indo doenças autoimunes e alergias à alimentos) pode ocor-rer .
A doença celiaca (CD) é uma condição na qual a in-gestão de glúten (uma proteína encontrada no trigo, centeio,e cevada) resulta em um aumento anormal na permeabilidade dajunção estreita intestinal. Sabe-se bem que a doença celia-ca pode ser associada com outras doenças autoimunes (AD) .
Entretanto ainda não está claro se o risco associado à CD deoutra AD está relacionado com a ingestão de glúten continuaou simplesmente depende de base genética comum. Atualmente,o único tratamento disponível para doença celiaca é uma die-ta sem glúten (GFD).
Para avaliar a eficácia de um agente terapêuticono tratamento de doenças associadas com a permeabilidade e-pitelial anormal, seria útil ter um marcador que altere coma progressão da doença. Zonulin, que é responsável pela mo-dulação da permeabilidade intestinal, é para regulado em CDe outra AD, tal como diabete Tipo 1. A presente invençãodemonstra que zonulin pode servir como marcador com o qualse avalia a eficácia de um agente terapêutico no tratamentode doenças associadas com permeabilidade epitelial anormal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece materiais e métodospara avaliar a eficácia de um tratamento. Desse modo, emuma modalidade, a presente invenção fornece um método paraavaliar a eficácia de um tratamento de uma condição em umindivíduo em necessidade de tal tratamento. Tais métodostipicamente compreendem obter uma amostra do indivíduo e de-terminar a concentração de zonulin na amostra. As amostraspodem ser de qualquer tipo conhecido por aqueles versados natécnica. Em uma modalidade, uma amostra pode ser uma amos-tra de sangue. As amostras podem ser processadas por méto-dos bem conhecidos por aqueles de experiência na técnica.Em uma modalidade, os métodos da invenção podem compreenderisolar soro da amostra e determinar a concentração de zonulin no soro.
A presente invenção pode ser empregada para avali-ar o tratamento de uma ampla variedade de condições. Tipica-mente, a presente invenção pode ser empregada para avaliar otratamento de uma condição caracterizada por permeabilidadede junção estreita anormal. Desse modo, a presente invençãopode ser empregada para avaliar a eficácia de um tratamentopara condições associadas com um aumento na permeabilidadeepitelial. Os tratamentos para condições que podem ser ava-liados incluem, porém não é limitado aos tratamentos paradoenças autoimunes, tratamentos para doença.celiaca, e tra-tamentos para doenças celiacas associadas.
Em uma modalidade, os métodos da invenção podemcompreender determinar a concentração de zonulin em uma a-mostra por métodos que envolvem o uso de um ou mais anticor-pos, por exemplo, ELISAs. Em uma modalidade, os métodos dainvenção podem compreender contatar a amostra com um primei-ro anticorpo que se liga a zonulin sob condições de ligação,contatando a amostra ligada com um segundo anticorpo que li-ga zonulin sob condições de ligação; e detectar a presençade segundo anticorpo ligado. Em tais métodos, o primeiroanticorpo pode ser fixado a um suporte sólido, por exemplo,uma conta ou uma cavidade em uma placa de microtitulo. Emalgumas modalidades, pelo menos um anticorpo pode ser eleva-do contra uma proteina que compreende um fragmento de toxinade zonula occludens, por exemplo, o primeiro anticorpo podeser elevado contra uma proteina que compreende um fragmentode toxina de zonula occludens. Uma proteina que compreendequalquer fragmento adequado de toxina de zonula occludenspode ser empregada, por exemplo, uma proteina que compreendefragmento de AG de toxina de zonula occludens. Em uma moda-lidade, uma proteina que compreende um fragmento adequado detoxina de zonula occludens pode ser uma proteina onde ofragmento de AG compreende um rótulo de seis histidinas N-terminais. Em alguns métodos da invenção, pelo menos um an-ticorpo pode ser elevado contra uma proteina que compreendetoxina de zonula occludens, por exemplo, o segundo anticorpopode ser elevado contra uma proteina que compreende toxinade zonula occludens. O segundo anticorpo pode compreenderuma ou mais frações detectáveis. Em uma modalidade, o se-gundo anticorpo pode incluir biotina.
Em uma modalidade especifica, a presente invençãofornece um método para avaliar a eficácia de um tratamentopara doença celiaca em um indivíduo em necessidade de taltratamento. Tal método pode compreende obter uma amostra doindivíduo; e determinar a concentração de zonulin na amos-tra. Em algumas modalidades,, a amostra pode ser uma amostrade sangue. Tal método pode também compreender isolar o soroda amostra; e determinar a concentração de zonulin no soro.Em algumas modalidades, a determinação da concentração dezonulin pode compreender anexar um primeiro anticorpo a umsuporte sólido, contatando o primeiro anticorpo com amostrasob condições que fazem com que o zonulin na amostra se li-gue ao primeiro anticorpo, contatando o zonulin ligado comum segundo anticorpo sob condições que fazem com que o se-gundo anticorpo ligue o zonulin ligado ao primeiro anticor-po, e detectar o segundo anticorpo ligado. Em algumas moda-lidades, o segundo anticorpo pode compreender uma fração de-tectável. Uma fração detectavel pode ser diretamente detec-tavel, por exemplo, quando a fração for um grupo fluorescen-te. Em algumas modalidades da invenção, uma fração detecta-vel pode ser contatada com um reagente que se liga à fraçãodetectavel. Por exemplo, uma fração detectavel pode ser bi-otina e um reagente que se liga à biotina (por exemplo, avi-dina ou estreptavidina conjugados para uma enzima tal comoalcalino fosfatase) pode ser adicionado. Quando um reagenteque se liga à fração detectavel compreende uma enzima, osmétodos da invenção tipicamente incluirão adicionar um subs-trato para a enzima ao reagente ligado e detectar a conver-são do substrato no produto ou detectando-se o produto oudetectando-se a diminuição no substrato.
A presente invenção também contempla kits para a-valiar a eficácia de um tratamento para uma condição, porexemplo, tratamento de doença celiaca. Tais kits tipicamen-te compreendem meios para detectar zonulin. Os meios paradetectar zonulin podem compreender um ou mais dos anticorposanti-AG, anticorpos anti-AG biotinilados, anticorpos anti-ZOT, e anticorpos anti-ZOT biotinilados, desse modo os kitsda invenção podem compreender um ou mais recipientes quecontêm um ou mais de anticorpos anti-AG, anticorpos anti-AGbiotinilados, anticorpos anti-ZOT, e anticorpos anti-ZOT bi-otinilados. Em algumas modalidades, um kit da invenção podecompreender um recipiente que contém um anticorpo. Tais an-ticorpos podem ser anticorpos anti-IgG, anti-IgA, anticorposanti-IgM, e/ou anticorpos anti-IgE. Os anticorpos para usonos kits da invenção podem compreender uma ou mais fraçõesdetectáveis. Em algumas modalidades, um kit da invenção po-de compreender um recipiente que contém zonulin e/ou um re-cipiente que contém AG. Os kits da invenção podem compreen-der um ou mais pares de ligação de proteina de auto-anticorpos. Por exemplo, os kits da invenção podem compre-ender um ou mais recipientes que contêm um ou mais de trans-glutaminase humano (tTG), endomisial (EMA), fosfato de tiro-sina (IA - 2), tiróide peroxidase (TPO), tiroglobulina (TG),células ilhotas ou proteínas destes, insulina, ou ácido glu-tâmico decarboxilase (GAD).
A presente invenção também contempla kits para a-valiar a eficácia de um tratamento para doença celiaca.Tais kits tipicamente incluem meios para detectar zonulin.Os meios para detectar zonulin podem compreender um ou maisdos anticorpos anti-AG, anticorpos anti-AG biotinilados, an-ticorpos anti-ZOT, e anticorpos anti-ZOT biotinilados, dessemodo os kits da invenção podem compreender um ou mais reci-pientes que contêm um ou mais dos anticorpos anti-AG, anti-corpos anti-AG biotinilados, anticorpos anti-ZOT, e anticor-pos anti-ZOT biotinilados. Em algumas modalidades, um kitda invenção pode compreender um recipiente que contém um an-ticorpo. Tais anticorpos podem ser anticorpos anti-IgG, an-ti-IgA, anticorpos anti-IgM, e/ou anticorpos anti-IgE. Osanticorpos para uso nos kits da invenção podem compreenderuma ou mais frações detectáveis. Em algumas modalidades, umkit da invenção pode compreender um recipiente que contémzonulin e/ou um recipiente que contém AG. Os kits da inven-ção podem compreender um ou mais pares de ligação de protei-na de auto-anticorpos. Por exemplo, os kits da invenção po-dem compreender um ou mais recipientes que contêm um ou maisde transglutaminase humano (tTG), endomisial (EMA), fosfatosde tirosina (IA-2), tiróide peroxidase (TPO), tiroglobulina(TG), células ilhotas ou proteínas destes, insulina, ou áci-do glutâmico decarboxilase (GAD).
BREVES DESCRIÇÕES DOS DESENHOS
A Figura 1 é um gráfico de barra que mostra os re-sultados de um ensaio para biomarcadores de doença celiacade pacientes com doença celiaca que obedeceram a dieta deGFD.
A Figura 2 é um gráfico de barra que mostra os re-sultados de um ensaio para auto-anticorpos de pacientes comdoença celiaca que obedeceram a dieta de GFD.
A Figura 3 é um gráfico de barra que mostra os re-sultados de um ensaio para biomarcadores de doença celiacade pacientes com doença celiaca que não obedeceram a dietade GFD.
A Figura 4 é um gráfico de barra que mostra os re-sultados de um ensaio para auto-anticorpos de pacientes comdoença celiaca que não obedeceram a dieta de GFD.
A Figura 5 é um gráfico de barra que mostra os re-sultados de um ensaio para auto-anticorpos de indivíduos quetêm uma condição de AI associada mostrando a prevalência deauto-anticorpos em relação às condições autoimunes preexis-tentes (AI) (Tipo uma diabete, a doença de Graves ou artritereumatóide).
A Figura 6 é um gráfico de barra que mostra os re-sultados de um ensaio para auto-anticorpos de indivíduos quenão têm uma condição de AI associada mostrando a prevalênciade auto-anticorpos em relação às condições autoimunes pree-xistentes (AI) (Tipo uma diabete, a doença de Graves ou ar-trite reumatóide).
A Figura 7 é um gráfico em linha que mostra os re-sultados de um ensaio para auto-anticorpos contra tireopero-xidase (TPO) em indivíduos que responderam ao GFD.
A Figura 8 é um gráfico em linha que mostra os re-sultados de um ensaio para zonulin em indivíduos que respon-deram ao GFD e inicialmente tiveram auto-anticorpos de TPO.
A Figura 9 é um gráfico em linha que mostra os re-sultados de um ensaio para autoanticorpos contra tireopero-xidase (TG) em indivíduos que responderam ao GFD.
A Figura 10 é um gráfico em linha que mostra osresultados de um ensaio para niveis de zonulin de soro emindivíduos que responderam ao GFD e inicialmente tiveram au-to-anticorpos de TG.
A Figura 11 é um gráfico em linha que mostra osresultados de um ensaio para auto-anticorpos contra célulasilhotas (ICA) em indivíduos que responderam ao GFD.
A Figura 12 é um gráfico em linha que mostra osresultados de um ensaio para niveis de zonulin de soro emindivíduos que responderam ao GFD e inicialmente tiveram au-to-anticorpos de ICA.
A Figura 13 é um gráfico em linha que mostra osresultados de um ensaio para auto-anticorpos contra ácidoglutâmico decarboxilase (GAD) em indivíduos que responderamao GFD.
A Figura 14 é um gráfico em linha que mostra osresultados de um ensaio para niveis de zonulin de soro emindivíduos que responderam ao GFD e inicialmente tiveram osauto-anticorpos de GAD.
A Figura 15 é um gráfico em setores que mostra aporcentagem de indivíduos que testaram positivo para auto-anticorpos em relação ao tipo de HLA.
A Figura 16 é um gráfico de barra que mostra aprevalência de auto-anticorpos em relação a idade dos indi-viduos.
A Figura 17 mostra os resultados dos ensaios donivel de zonulin de soro em soro obtido de pacientes com asdoenças autoimunes indicadas HC (controle saudável), CD (do-ença celiaca), AIH (hepatite autoimune), PBC (cirrose biliarprimária), DM (mielopatia degenerativa), APS-I (sindrome po-liglandular autoimune tipo 1), MS (esclerose múltipla).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Como empregado aqui um indivíduo é qualquer ani-mal, por exemplo, mamífero que recebe um tratamento. Os in-divíduos incluem, porém não estão limitados aos humanos.
Aqueles de experiência na técnica observarão que apresente invenção pode ser empregada para avaliar a eficáciade tratamento de qualquer doença caracterizada por um nivelde zonulin de soro elevado. Em particular, a presente in-venção pode ser empregada para avaliar a eficácia do trata-mento de doenças autoimunes associadas com um aumento no ni-vel de zonulin de soro, por exemplo, doença celiaca, cirrosebiliar primária, e mielopatia degenerativa.
Os materiais e métodos da invenção podem ser em-pregados para avaliar a eficácia de um tratamento de doençaceliaca. Por exemplo, um nivel de zonulin de soro pode serdeterminado para um indivíduo em necessidade de um tratamen-to para doença celiaca antes de ou concomitante com o começode um regime de tratamento. Em tempos apropriados durantee/ou após o curso de tratamento, um ou mais niveis de zonu-lin de soro adicionais podem ser determinados e comparadosao nivel de zonulin de soro obtido no começo do tratamento.
Desse modo, em algumas modalidades da invenção, os métodosda invenção podem requerer aquisição repetida de amostras deindivíduos recebendo ou que tenham recebido os tratamentos edeterminando os niveis de zonulin nas amostras. Os métodosda invenção podem requerer também comparar os niveis de zo-nulin nas amostras com aqueles de uma amostra de referênciaque pode ser do mesmo indivíduo (por exemplo, de uma amostratomada no começo do tratamento) ou de uma fonte diferente.Uma diminuição nos niveis de zonulin de soro é indicativa deuma melhora da condição e indica que o tratamento é eficaz.
Os materiais e métodos da invenção podem ser em-pregados para avaliar a eficácia de um tratamento de uma do-ença associada com a doença celiaca. Aqueles de experiênciana técnica estão cientes que numerosas doenças estão associ-adas com a doença celiaca (veja, por exemplo, Tabela 1 emLee and Green, Current Opínion in Rheumatology 2006, 18:101-107 na página 104) e os materiais e métodos da invenção po-dem ser empregados para avaliar a eficácia do tratamento dedoenças celiacas associadas. As doenças associadas com adoença celiaca podem incluir: doenças neurológicas tal comoneuropatia periférica, ataxia cerebelar, epilepsia, e enxa-quecas; doenças endócrinas tal como diabete melito Tipo 1,distúrbios de tiróide autoimunes, doença de Addison, e area-ta de alopecia; doenças cardíacas tal como cardiomiopatiaidiopática dilatada e miocardite autoimune; doenças hepáti-cas tal como cirrose biliar primária, hepatite autoimune, ecolangite autoimune; doenças reumatológicas tal como artriteoligoarticular, artrite juvenil, lúpus sistêmico eritemato-so, e a sindrome de Sjogren; e outras doenças tal como ane-mia, osteoporose ou osteopenia, sindrome de Turner, sindromede Down, defeitos de esmalte dental, sarcoidose, intolerân-cia a lactose, herpetiforme de dermatite (uma queimadura,coceira, erupção cutânea devastadora), e outros distúrbiosda pele, infertilidade inexplicada, falha, e pancreatite a-guda recorrente.
Os materiais e métodos da invenção podem ser em-pregados para avaliar a eficácia do tratamento para uma va-riedade de condições incluindo, porém não limitado às doen-ças autoimunes. Os exemplos de doenças autoimunes incluem,porém não estão limitados a nefropatia de IgA, a granuloma-tose de Wegener, esclerose múltipla, escleroderma, esclerosesistêmica, artrite reumática, a doença de Crohn, lúpus eri-tematoso, tiroidite de Hashimoto (tiróide sub-ativa), a do-ença de Graves (tiróide super ativa), doença de orelha in-terna autoimune, penfigóide bolhoso, sindrome de Devic, sin-drome de Goodpasture, sindrome miastênica de Lambert-Eaton(LEMS), sindrome linfoproliferativos autoimunes (ALPES),sindromes paraneoplásicos, e sindromes autoimunes poliglan-dulares (PGA).
Os materiais e métodos da invenção podem ser em-pregados para avaliar a eficácia de um tratamento de infla-mação gastrointestinal que dá origem a permeabilidade intes-tinal aumentada. Desse modo, a presente invenção é útil,por exemplo, na avaliação de tratamento de condições intes-tinais que causam enteropatia de perda de proteina. A ente-ropatia de perda de proteina pode surgir devido a:infecção, por exemplo, infecção de Clostridiumdifficile, enterocolite, shigellosis, gastroenterite viróti-ca, infestação de parasita, super-proliferação bacteriana,doença de Whipple;
doenças com erosão mucosal ou ulcerações, por e-xemplo, gastrites, câncer gástrico, coutes colagenosas, do-ença de intestino inflamatória; e
doenças mucosais sem ulceração, por exemplo, doen-ça de Menetrier, doença celiaca, gastroenterite eosinofili-ca.
A presente invenção também compreende kits paraavaliar a eficácia de um tratamento bem como kits para de-terminar a concentração de zonulin, por exemplo, de soro.
Os kits da invenção tipicamente incluirão um ou mais recipi-entes que contêm um ou mais reagentes úteis na prática dainvenção. Os reagentes úteis na prática da invenção inclu-em, porém não estão limitados aos tampões, sais de tampona-mento, ions de metal, compostos cromogênicos, anticorpos,enzimas, combinações fluorescentes e outros. Os kits da in-venção podem incluir um ou mais recipientes que contêm zonu-lin, AG, ou outros compostos que podem ser empregados comoum padrão de referência. Os kits da invenção podem compre-ender recipientes que contêm um ou mais anticorpos onde osanticorpos são conjugados a uma fração detectável. As fra-ções detectáveis podem ser qualquer conhecida por aquelesversados na técnica, por exemplo, enzimas (por exemplo, pe-roxidase, luciferase), outras proteínas (por exemplo, prote-ína fluorescente verde), compostos opticamente detectáveis(por exemplo, fluoroforos, cromoforos), membros de um par deligação (por exemplo, biotina/estreptavidina, digoxigeni-na/anti-digoxigenina), ou qualquer outra fração detectávelconhecida por aqueles versados na técnica. Quando um kit dainvenção inclui uma enzima, tal kit pode compreender um oumais recipientes que contêm substratos para a enzima.
Os seguintes exemplos são fornecidos para propósi-tos ilustrativos, e são de modo algum pretendidos limitar oescopo da presente invenção.EXEMPLO 1
Pacientes e Métodos:
54 pacientes foram diagnosticados com CD (20 M e34 F; idade média: 39y; provado por biópsia-: 42/54). ADassociada foi constatada em 8 indivíduos (2diabetes Tipo 1,1 doença de Grave, 5 artrites reumáticas).
As amostras de soro foram coletadas em diagnoses eapós um período médio de 17 meses de GFD (faixa de 10-49) .Todas as amostras de soro foram medidas para auto-anticorposrelacionados com CD (anti-transglutaminase-tTG, anti-endomisial-EMA), diabetes tipo 1 (IA-2: fosfatos de tirosi-na, IAA: anticorpos anti-insulina, GAD: ácido glutâmico de-carboxilase), tiroidite (TPO: anticorpos de tireoperoxidase,TG: anticorpos de tireoglobulina), e niveis de zonulin.
Medição de zonulin de soro por ensaio imunossor-vente ligado à enzima de sanduíche. O ensaio imunossorventeligado a enzima de sanduíche de zonulin (ELISA) foi realiza-do como descrito em El Azmar e outros. Gastroenterology123:1607-1615, 2002 com pequenas modificações.
Brevemente, as placas de microtitulo plásticas(Costar, Cambridge, MA) foram revestidas com anticorpos IgGAG derivados de toxina anti-zonula occludens (Zot) de reti-culação de zonulin de coelho derivado (10 mug/ml em 0,1mol/1 de tampão de carbonato de sódio, pH 9,0). Estes anti-corpos foram preparados imunizando-se um coelho com AG em-pregando os protocolos padrões.
Após a incubação durante a noite a 4°C, as placasforam lavados quatro vezes em salina Tris tamponada de 0,05%Tween 20 (TBS-T) e bloqueadas por incubação durante lha37°C com TBS-T. Após quatro lavagem de TBS-T, cinco padrõesseriais AG (50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, e 0 ng/ml) e amostra desoros de paciente (1:101 diluição em TBS-T) foram adiciona-dos e incubados durante a noite a 4°C. Após quatro lavagenscom salino Tris tamponada 0,2% de tampão Tween 20, as placasforam incubadas com anticorpos IgG anti-Zot biotinailado(Patente U.S. No. 5.945.510) durante 4 h a 4°C e contatadascom alcalino fosfatase conjugada para estreptavidina. Umareação de cor foi desenvolvida empregando um kit comercial{kit ELISA de amplificação; Invitrogen). A absorvência a4 95 nm foi medida com um auto-leitor de microplaca (Molecu-lar Devices Thermomax Microplate Reader).
Os anticorpos autos foram detectados empregandokits comercialmente disponíveis: ensaio imunossorvente liga-do a enzima anti-(humano)-transglutaminase (anti-tTG)(ELISA), Scimedx Corporation, NJ; ) ensaio de anticorpo deimunofluorescência indireto (IFA) anti-endomisial (anti-EMA) , empregando tecido de esôfago de macaco, Scimedx Corpo-ration, NJ; radioimunoensaio (RIA) de fosfato de anti-tirosina (anti IA-2), Kronus Boise Research Center, Idaho,imunoensaio enzimático (EIA) de anticorpos de anti-tiróideperoxidase de (anti-TPO), Scimedx Corporation, NJ; EIA anti-tiroglobulina (anti-TG), Scimedx Corporation, NJ; IFA de an-ticorpos anti- célula ilhota (anti-ICA), empregando tecidosdo pâncreas de macaco, Scimedx Corporation, NJ, RIA de anti-corpos anti-insulina (IAA), Kronus Boise Research Center,Idaho; e RIA de anti-ácido glutâmico de decarboxilase (anti-Gad), Kronus Boise Research Center, Idaho.
Os pacientes tendo uma diagnose de CD mostram zo-nulin de soro aumentado em 76% e os auto-anticorpos foramdetectados em 39% (TPO: 21,7%, TG 19,6%, GAD 6,5%, ICA 4,4%e IA2- 2,5%) . Após GFD, EMA e zonulin permaneceram altera-dos em 13% dos pacientes, e tTG em 35% dos indivíduos. Al-guns auto-anticorpos diminuíram (TPO: 10,9%, GAD 4,4%), aomesmo tempo em que outros permaneceram inalterados (TG23,9%, ICA 4,4%, e IA2- 2,2%). Sete dos 53 pacientes nãocomeçaram GFD. Estes indivíduos tiveram zonulin, EMA, e tTGalterados e 14% deles foram auto-anticorpos positivos. Nes-tes indivíduos, tanto os niveis de zonulin quanto os auto-anticorpos de soro não alteraram na avaliação seguinte.
Conclusões: CD não tratado tipicamente mostra su-pra-regulação de zonulin e prevalência aumentada de auto-anticorpos de soro. Após o tratamento com GFD, os niveis dezonulin de soro tendem a normalizar, uma situação que estáassociada com uma prevalência diminuída de alguns auto-anticorpos (especialmente TPO) . Estes resultados indireta-mente sugerem que a recuperação da função de barreira intes-tinal pode diminuir o risco de fenômenos autoimunes associa-dos. Estes resultados também sugerem se o GFD é implementa-do precocemente (menos 30 anos de idade) os auto-anticorposseroconverterão, sugerindo um possível rolo protetor contraco-morbidade autoimune, se CD é diagnosticado precocemente einiciado em um GFD.
Exemplo 2
A Figura 17 mostra os resultados de ensaios de ni-veis zonulin de soro em soros obtidos de pacientes com asdoenças autoimune indicadas HC (controle saudável), CD (do-ença celiaca), AIH (hepatite autoimune), PBC (cirrose biliarprimária), DM (mielopatia degenerativa), APS-1 (sindrome po-liglandular autoimune tipo 1), MS (esclerose múltipla). Adoença celiaca, hepatite autoimune, cirrose biliar primáriae mielopatia degenerativa estão todas associadas com os ní-veis de zonulin de soro elevados.
Ao mesmo tempo em que a invenção foi descrita emdetalhes, e com referência as modalidades especificas des-tas, será evidente para um alguém de experiência ordináriana técnica que varias alterações e modificações podem serfeitas aqui sem afastar-se do espirito e escopo desta e taisalterações e modificações podem ser praticadas dentro o es-copo das reivindicações anexas. Todas as Patentes e publi-cações aqui são incorporadas por referência na mesma exten-são como se cada publicação individual foi especificamente eindividualmente indicada ser incorporada por referência emsua totalidade.

Claims (54)

1. Método de avaliação da eficácia de um tratamen-to de uma condição em um indivíduo em necessidade de taltratamento, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:obter uma amostra do indivíduo; edeterminar concentração de zonulin na amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é uma amostra desangue.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende:isolar soro da amostra; edeterminar concentração de zonulin no soro.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição está associada comum aumento na permeabilidade epitelial.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento na atividade epite-lial está associado com um aumento na permeabilidade de jun-ção estrita.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma doença auto-imune associada com um nivel de zonulin de soro elevado.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é doença celiaca.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma doença asso-ciada com doença celiaca.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a doença associada com doençaceliaca é selecionada de um grupo consistindo em neuropatiaperiférico, ataxia cerebelar, epilepsia, enxaquecas, diabetemelito tipo 1, doença de tiróide autoimunes, doença de Addi-son, areata alopecia, cardiomiopatia dilatada de idiopatia,miocardite autoimune, cirrose biliar primária, hepatite au-toimune, colangite autoimune, artrite oligoarticular, artri-te juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, sindrome de Sjo-gren, anemia, osteoporose, osteopenia, sindrome de Turner,sindrome de Down, defeitos de esmalte dental, sarcoidose,intolerância a lactose, herpetiformes de dermatite, inferti-lidade não explicada, abortamento, e pancreatite aguda re-corrente .
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a determinação da concentra-ção de zonulin compreende:contatar a amostra com um primeiro anticorpo quese liga ao zonulin sob condições de ligação;contatar a amostra ligada com um segundo anticorpoque liga zonulin sob condições de ligação; edetectar a presença do segundo anticorpo ligado.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteina compreendendo um fragmento detoxina de zonula occludens.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que em o primeiro anticorpo foielevado contra uma proteína compreendendo um fragmento detoxina de zonula occludens.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo fragmento de AG detoxina de zonula occludens.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de AG compreendeum rotulo de seis histidinas N-terminais.
15. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteína compreendendo toxina de zonulaoccludens.
16. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo toxina de zonula oc-cludens .
17. Método, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo compreen-de uma fração detectável.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração detectável é bioti-na.
19. Método para avaliar a eficácia de um tratamen-to para doença celíaca, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende :obter uma amostra do indivíduo; edeterminar a concentração de zonulin na amostra.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é uma amostra desangue.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende:isolar o soro da amostra; edeterminar a concentração de zonulin no soro.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que a determinação da concentra-ção de zonulin compreende:contatar a amostra com um primeiro anticorpo quede liga ao zonulin sob condições de ligação;contatar a amostra de ligada com um segundo anti-corpo que liga zonulin sob condições de ligação; edetectar a presença do segundo anticorpo de ligado .
23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteina compreendendo um fragmento detoxina de zonula occludens.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que em o primeiro anticorpo foielevado contra uma proteina compreendendo um fragmento detoxina de zonula occludens.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro anticorpo foi ele-vado contra uma proteina compreendendo fragmento de AG detoxina de zonula occludens.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de AG compreendeum rotulo de seis histidinas N-terminais.
27. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteina compreendendo toxina de zonulaoccludens.
28. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo foi ele-vado contra uma proteina compreendendo toxina de zonula oc-cludens .
29. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo compreen-de uma fração detectável.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração detectável é bioti-na.
31. Kit para a avaliação da eficácia de um trata-mento, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:meios para detectar zonulin.
32. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que os meios para detectar zonu-lin compreendem:um recipiente contendo um primeiro anticorpo e umrecipiente contendo um segundo anticorpo.
33. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende umrecipiente contendo fragmento de AG de toxina de zonula oc-cludens.
34. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteína compreendendo um fragmento detoxina de zonula occludens.
35. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo um fragmento de toxi-na de zonula occludens.
36. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo fragmento de ÁG detoxina de zonula occludens.
37. Kit, de acordo com a reivindicação 36,CARACTERIZADO pelo fato de que fragmento ÁG compreende umrotulo de seis histidinas N-terminais.
38. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteína compreendendo toxina de zonulaoccludens.
39. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo toxina de zonula oc-cludens .
40. Kit, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo compreen-de uma fração de detectável.
41. Kit, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração de detectável é bio-tina.
42. Kit, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende umrecipiente contendo zonulin.
43. Kit para avaliação da eficácia de um tratamen-to para doença celiaca, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende :meios para detectar zonulin.
44. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que os meios para detectar zonu-lin compreendem:um recipiente contendo um primeiro anticorpo e umrecipiente contendo um segundo anticorpo.
45. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreendendoum recipiente contendo fragmento de AG de toxina de zonulaoccludens.
46. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteína compreendendo um fragmento detoxina de zonula occludens.
47. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo um fragmento de toxi-na de zonula occludens.
48. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo fragmento de AG detoxina de zonula occludens.
49. Kit, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de AG compreendeum rotulo de seis histidinas N-terminais.
50. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um anticorpo foielevado contra uma proteína compreendendo toxina de zonulaoccludens.
51. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARCTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo foi ele-vado contra uma proteína compreendendo toxina de zonula oc-cludens .
52. Kit, de acordo com a reivindicação 51,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo anticorpo compreen-de uma fração detectável.
53. Kit, de acordo com a reivindicação 52,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração detectável é bioti-na.
54. Kit, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreendendoum recipiente contendo zonulin.
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