BRPI0610196A2

BRPI0610196A2 - método de sìntese de peptìdeos

Info

Publication number: BRPI0610196A2
Application number: BRPI0610196-8A
Authority: BR
Inventors: Luis Javier Cruz; Ramos Yesica Garcia; Judit Tulla-Puche; Fernando Alberico
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2006-05-04
Publication date: 2010-06-01
Also published as: TW200716668A

Abstract

Um método para síntese de fase sólida de Timosina <244>1 é inventado.

Description

MÉTODO DE SÍNTESE DE PEPTÍDEOS

A presente invenção se relaciona a um método desíntese de fase sólida para um peptídeo que é usualmentedifícil de sintetizar e aos respectivos peptídeosconjugados de fase sólida.

O desafio da síntese peptídica de fase sólida é queapesar dos métodos rotineiros bem estabelecidos existirem,síntese bem sucedida e eficaz é altamente dependente daprópria seqüência peptídica a ser sintetizada.

Algumas seqüências peptídicas, desenhadas a partir desegmentos de peptídeos ou proteínas naturais, simplesmentefazem muito pior do que outras nos mesmos materiais deresina utilizados altamente bem sucedidos com muitos dospeptídeos "normais". Na literatura, freqüentemente sistemascuidadosos de solventes cinco-regulados foram propostos navisão de prevenir agregação inter-cadeia na resina pelomérito da formação de folhas beta. Ainda assim, engenhariade solvente utilizando diclorometano, N-metil-pirrolidonaou dimetilformamida, eventualmente suplementadas comsolventes polares particulares estabelecedores de estruturahelicoidal tais como trifluoro-etanol estão longe defornecer um remédio geral para peptídeos difíceis.

Timosina al (nome farmacêutico internacional não-proprietário: timalfasina) é um hormônio peptídico N-acetilado de 28-mer que ocorre na glândula timo humana e éutilizado como uma droga para tratar a hepetite B crônica.

Sua síntese de comprimento total de fase sólida foidescrita antes, mas sofria de produção pobre até agora.Infelizmente, a seqüência de aminoácido da Timosina al nãooferece uma glicina ou prolina a qual pode ser utilizadacomo um resíduo juncional em uma abordagem clássica dejunção de segmento em uma abordagem passo-a-passo parasíntese.

Echner et al. (Liebigs Ann. Chem. 1988, 1095-1097)descreve sintase linear em fase sólida em uma resina deWang-poliestireno. Enquanto eficiência de união é checadaposirivamente após cada unição com reagente BOP em DMFpelos meios do Teste Kaiser, apenas depois que cadacapeamento da junção de peptídeo não unido pelos meios deacetilação é feito. Clivagem do peptídeo protegidoacetilado terminalmente a partir da resina é realizada comácido trifluoro acético concentrado; assim a resina e faselíquida são separadas por filtração e o produto peptídico écoletado pela precipitação com dietiléter. O precipitadocoletado desta forma é quantificado e é designado "produtobruto", produção é calculada como uma quantidade de 76%. -Apenas depois disso, uma primeira purificaçãocromatográfica do produto bruto é realizada, seguida porHPLC de fase reversa. Nenhuma produção é indicada para oproduto puro então obtido.

Um problema com a abordagem de Echner é que junçãoincompleta da cadeia, levando a variantes de seqüênciaencurtadas indesejadas durante síntese, não é consideradano cálculo da produção. Quantidades de "produto bruto" paracada espécie peptídica obtida durante s síntese, incluindodesproteção incompleta/peptídeo alquilado. Entretanto,pureza peptídica obtida a partir da síntese linear éproblema quando lidamos com peptídeos difíceis;interessantemente, Echner não dá nenhuma indicação daprodução do produto purificado então obtido, assim comonenhum cromatograma de HPLC dado na publicação como érotineiramente feito na arte para provar a qualidade dasíntese. Nas nossas mãos, o esquema sintético de Echnerresulta em produções muito baixas de produto correto, umlargo arranjo de produto peptídeo impróprio compondo amaioria do produto bruto.

Outro problema com a abordagem de Echner o qual autoreleva ele mesmo (p. 1095, coluna da esquerda, 3° parágrafo)é carregando a resina Wang com o aminoácido C-terminal daTimosina al o qual é uma asparagina; o carregamento deEchner é 0,15 mmol/g, o qual é extremamente baixo.

Aminoácido Fmoc-Asn(4,4'-dimetoxidifenilmetil-)-OH deve serutilizado para carregamento da resina sem correr o risco dedegradar reações laterais.

É o objetivo desta invenção inventar uma síntese defase sólida melhorada para Timosina al. Este objetivo éresolvido pelo método da reivindicação 1.

De acordo com a presente invenção, um método desíntese de Timosina al em fase sólida ou uma versão C-terminalmente truncada compreendendo resíduos 1-27 ou umaversão N-terminalmente truncada compreendendo, pelo menos,resíduos 19-28 ou uma versão truncada compreendendo, pelomenos, os resíduos 19-27 da Timosina al madura é inventada,compreendendo as etapas de

a. Junção de um resíduo de FMOC-Glu ou FMOC-Asnapropriadamente protegido em uma resina PEG épreferencialmente selecionada a partir de um grupoconsistindo de resinas poliestireno-PEG misturadas, resinasPEG poliéter-poliéster misturadas ou resinas PEG poliêter-poliamida misturadas e resinas PEG essencialmente puras;b. Enlongamento da cadeia peptidica pela sínteseFMOC onde as cadeias laterais dos aminoácidos individuaispodem ser derivadas com os grupos protetores apropriados;

c. Opcionalmente acetilando o último resíduo N-terminal e

d. Clivando o peptídeo da resina.

O presente método permite a síntese do peptídeotimalfasina em pureza improcedente e, a partir daí,aumentar a produção em uma abordagem sintética linear defase sólida única. De acordo com a presente invenção, istopode ser, no entanto, plausível sintetizar apenas umfragmento C-terminal em uma fase sólida e constituirqualquer peptídeo de comprimento completo ou, pelo menos,uma versão mais comprida do peptídeo por junção desegmento, utilizando em uma modalidade preferida jucção deum fragmento N-terminal possuindo uma Ser ou Thr C-terminala qual é protegida da racemização pelo método do dipeptídeopseudoprolina (Wõhr et al., J. Am. Chem. Soe. 118, 9218).

Preferencialmente, o peptídeo para ser sintetizado éuma Timosina al (também referida como Timosina al matura,ativa como para distingui-la dos peptídeos precursores)possuindo a seqüência

<formula>formula see original document page 5</formula>

onde as cadeias de aminoácido individuais são desprotegidasou são apropriadamente protegidas, como pode ser necessáriopara um dado resíduo de aminoácido como é de conhecimentocomum na arte (veja Bodansky, infra, por exemplo) . Maispreferencialmente, tal peptídeo N-terminalmente acetiladoem uma etapa subseqüente a síntese linear, mas antes daclivagem da resina. Timalfasina natural a qual é tambémutilizada como um farmacêutico é acetilado N-terminalmente.

Notavelmente, os presentes inventores descobriram queé principalmente a metade C-terminal do peptídeotimalfasina, que tem aproximadamente 19-28 resíduos, queincorre a maioria das impurezas pelas deleções da cadeia egrandes perdas na produção do produto final gerado durantea fase linear da síntese. Esta parte do peptídeo foidescoberta como sendo de extrema dificuldade parasintetizar.

Vice-versa, durante síntese linear, é também factívelutilizar tais dipeptídeos oxazolidina, de acordo com Wõhret al. , supra. Um benefício de utilizar tal dipeptídeo aoinvés de individual protegido, preferencialmente Fmoc-,aminoácido pode ser inferido a partir da seqüênciatimalfasina em particular para o dipeptídeo Asp-Thr;utilização do dipeptídeo oxazolidina auxiliaria aqui paraevitar formação de aspartimida durante a síntese.

Similarmente, prevenção de formação glutarimida poderequerer utilização de grupos de proteção especiais.

Enquanto a presente invenção prefere fortementequímica Fmoc para realizar reações de junção, química Bocpode, da mesma maneira, ser utilizada em outra modalidadepara realizar a presente invenção.

Reagentes de junção para síntese de peptídeos são bemconhecidos na arte (veja Bodansky, M., Principies ofPeptide Synthesis, 2a Ed. Springer Verlag

Berlim/Heidelberg, 1993; também veja discussão da funçãodos aditivos ou auxiliares de junção nesta) . Reagentes dejunção podem ser anidridos misturados (por exemplo,T3P:anidrido ácido fosfônico propano) ou outros agentesacetilantes tais como derivados ésteres ou ácidoshalogenidos (por exemplo, ICBF, isobutil-cloroformiato) oueles podem ser carbodiimidas (por exemplo, l-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida), derivados benzotriazinaativados (DEPBT: 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2, 3-benzotriazina-4(3H)-um) ou sais urônio ou fosfônioderivados de benzotriazol.

Na visão da melhor produção, tempo curto de reação eproteção contra racemização durante elongamento da cadeia,mais preferido é que o reagente de junção seja selecionadodo grupo consistindo de sais urônios e sais fosfônios dobenzotriazol capaz de ativar uma função ácido carboxilicolivre ao longo da realização da reação na presença de umabase. Exemplos apropriados e, desta forma, preferidos detais sais urônio e fosfônio de junção são, por exemplo,HBTU (O-lH-benzotriazol-1 -il)-N,N,N1,N'-tetrametilurôniohexafluorofosfato), BOP (benzotriazol-l-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio hexafluorofosfato), PyBOP(Benzotriazol-1-il-oxi-tripirrolidinofosfôniohexafluorofosfato), PyAOP, HCTU (O-(lH-6-cloro-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurôniohexafluorofosfato), TCTU (0-lH-6-clorobenzotriazol-l-il) -1,1, 3 , 3-tetrametilurônio tetrafluoroborato), HATU (0-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurôniohexafluorofosfato), TATU (0-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1, 3 , 3-tetrametilurônio tetrafluoroborato), TOTU (0-[ciano(etoxicarbonil)metileneamino]-N,N,N', N"-tetrametilurônio tetrafluoroborato), HAPyU (0-(benzotriazol-l-il)oxibis-(pirrolidino)-urôniohexafluorofosfato.Preferencialmente, quando utilizar DEPBT ou o similar,reagentes de sal .urônio ou fosfônio, um reagente fracoadicional ou segundo é necessário para realizar a etapa dejunção. Isto é pareado pela base cujo conjugado ácidopossui um valor de pKa de pKa 7,5 a 15, maispreferencialmente de um pKa 7,5 a 10, com a exclusão de uma função a-amino de um peptídeo ou aminoácido ou derivadode aminoácido, e cuja base é preferencialmente uma aminaterciária, estericamente empatada. Exemplos de tais eadicionalmente preferidas são base Hünig (N,N-diisopropiletilamina), N,N'-dialquilanilina, 2,4,6-trialquilpiridina ou N-alquil-morfolina com o alquil sendoalquil C1-C4 linear ou ramificado, mais preferencialmenteeste é uma N-metilmorfolina ou colidina (2,4,6-trimetilpiridina), mais preferencialmente esta é colidina.

A utilização de aditivos de junção, em particular dosaditivos de junção do tipo benzotriazol, são tambémconhecidos (veja Bodansky, supra). Sua utilização éparticularmente preferida quando utilizando o altamenteativante, reagente de junção sal urônio ou forsfônioreferido acima. Desse ponto em diante é adicionalmentepreferido que o aditivo reagente de junção seja um compostohidroxi nucleofílico capaz de formar ésteres ativados, maispreferencialmetne possuindo uma função acídica,nucleofílica N-hidroxi onde N é imida ou é N-acil ou N-ariltriazeno substituto, mais preferencialmente o aditivo dejunção é um derivado N-hidroxi-benzotriazol (ou derivado 1-hidroxi-benzotriazol) ou é um derivado N-hidroxi-benzotriazina. Tais compostos N-hidroxi aditivos de junção foram descritos em amplo e vasto WO94/07910 e EP-410 182 eaqueles cujas respectivas divulgações estão incorporadaspor referências neste. Exemplos são, por exemplo, N-hidroxi-succinamida, N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-l,23-benzotriazina (HOOBt), l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) eN-hidroxi-benzotriazol (HOBt). Derivados N-hidroxi-benzotriazina, primeiro e principalmente HOOBt, sãoparticularmente preferidos.

Componentes sais amônio de aditivos de junção sãoconhecidos e sua utilização em química de junção foidescrita, por exemplo, na EUA4806641.

Em uma modalidade particularmente preferida, oreagente de junção sal de urônio ou fosfônio é um reagentesal de urônio, preferencialmente este é HCTU, TCTU ou HBTU,mais preferencialmente este é HCTU ou TCTU e maispreferencialmente este é utilizado na reação em combinaçãocom N-hidroxi-3,4-diidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina ou umsal deste.

No contexto da presente invenção, deve ser notado queHCTU e TCTU são definidos como sendo compreendidos pelotermo "reagente sal urônio" apesar destes compostos epossíveis análogos terrem se mostrado compreendendo ummotivo isonitroso ao invés de uma porção urônio pelos meiosda análise de estrutura criastalina (O. Marder, Y. Shvo eF. Albericio "HCTU and TCTU: New Coupling Reagents:Development and industrial Applications", PresentationGordon Conference Feb. 2002 & Chimica Oggi 2002, 20: 20:37-41), um substituinte N-amidino no núcleo heterocíclicodando crescimento a uma estrutura guanidina no lugar deste.No presente contexto, tal classe de compostos é chamada"subclasse tipo guanidina" de reagentes sal urônio, deacordo com a presente invenção.

Desproteção da base lábil Na pode ser realizada comorotineiramente feito na arte, por exemplo, com 20%piperidina em N-metil morfolina no cso da química Fmoc. 0último aminoácido a ser adicionado, por exemplo,tipicamente a Serina N-terminal da timalfasina madura,pode, é claro, carregar um grupo de proteção N-terminaloutro que não Fmoc, por exemplo, este pode carregar Boc ouprontamente um grupo acetil de proteção, embora que quantomais tarde convenientemente introduzido por acetilação pós-junção do aminoácido N-terminal desprotegido do peptídeousualmente. Preferencialmente, um pode utilizar um grupo deproteção ortogonal outro que não Fmoc para proteção doúltimo resíduo N-terminal. Exemplos são grupos de proteçãoAlloc (por exemplo, para proteger aminas primárias), ambassendo seletivamente removíveis do peptídeo portransacilação Pd(0) catalisadas (Gomez-Martinez, N°proteção temporária Alloc na síntese peptídica de fasesólida, utilização de complexos amina-borano como grupoalil removedor, J. Chem. Soe, Perkin Trans. J, 1999, 2871-2874), o grupo Dde (Bycroft et al. , A novel lysineprotecting procedure for SPPS of branched peptides, J.Chem. Soe. Chem. Commun. 1993, p. 778-779), um derivadodimedon que é removível pela hidrazinólise e seus homólogosfuncionais tais como, por exemplo, grupo Nde (N-l-(4-nitro-1,3-dioxoindan-2-ilideno)- grupo etil, Kellam et al.,Terahedron 54,1998, p. 6817-6832; N-l-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil, Chan 1995). Dde, seusderivados e homólogos são coletivamente endereçados comogrupos de proteção tipo-Dde compartilhando em seu estadolivre não reagido uma porção dioxoalquilideno funcional defórmula III

III (-CO-)2C=C(-R)(-OH)

Onde R é alquil substituto ou não substituto e ondepreferencialmente as duas funções carbonil estão formandouma estrutura cíclica conectada por um esqueleto -CH2-CR'R''-CH2-, -NR'-CO-NR' ' - ou -CR'=CR' ' - .

Preferencialmente, R' , R' ' são então alquil ou, juntos,aril.

É também prontamente plausível utilizar gruposprotetores modificados ou marcados ortogonais, os quaisabrigam o benefício adicional de permitir purificaçãosimples por subseqüente cromatografia de afinidade ou RPHPLC "padrão" de afinidade melhorada utilizando talmarcação de afinidade reversível. Neste caso, o peptídeosintetizado é clivado para fora da resina apropriadamentesob condição branda evitando desproteção global,purificação está tomando lugar, a sonda N-terminal éseletivamente removida permitindo subseqüente acetilação N-terminal e finalmente desproteção global do peptídeo. Umexemplo de tal são derivados Fmoc descritos em Bali et al. ,Int. J. peptide Protein Res. 1992, 40:370-379 e Bali etal., J. Chromatography 1994, 686:73-88.

Particularmente preferido por esta invenção é realizara remoção do grupo Fmoc com 20% de piperidina-DMF (v/v) ,por exemplo, (2x1 min, 2 x 10 min, 1x5 min) . Destamaneira preferida, junções de Fmoc-aa-OH (5 equiv) sãorealizadas com os reagentes de junção mencionados em DMF ousolvente similar por 60-120 min. para síntese otimizada eem particular tempos de junção para posições de seqüênciaindividual, após os testes de junção ninidrina foramrealizados e se este foi positivo, a junção era repetidasob as mesmas condições, por outro lado, o processo eracontinuado. Se após segunda junção do teste da ninidrinaera ainda positivo, uma etapa de acetilação era realizadacom Ac20 e DIEA ou método similar para capeamento dascadeias de peptídeo de deleção. Tal procedimento de junçãoe/ou capaeamento acentuado foi então aplicado para repetirsíntese sob as mesmas posições da posição de seqüênciafornecida. Notavelmente, escolha da resina foi descobertacomo influenciando fortemente nos problemas de junçãoespecífica de posições de seqüência como está exemplificadona seção experimental.

De acordo com a presente invenção, a fase sólidacompreende uma resina PEG. De acordo com as presentesinvenções, elas permitem a síntese de timalfasina ou adifícil secção do núcleo peptídico da timalfasina emprodução e pureza excepcionais. No presente contexto, adefinição de "fase sólida" compreende aparte da matriz deresina inerte a presença de um ligante integral no materialda matriz inerte, para ligação do peptídeo ou ligação em umadicional, ligante inserido ou carregador.

Tais resinas foram descritas, por exemplo, naEUA003078372 Al; em virtude do PEG incorporado na fasesólida, tais resinas ganham propriedades anfifílicas asquais as fazem diferentes dos materiais tradicionais deresina. É conhecido adotar um comportamento "similar a gel"em vez de comportamento similar ao sólido da tradicional,por exemplo, resina Merrifield após aumento. Estacaracterística particular é dita por oferecer benefícios detempos de ciclagem reduzidos na visão de mudançadifusão/líquida durante etapas de lavagem, junção,desproteção, etc. Notavelmente, de acordo com a presenteinvenção, tal resina PEG é também encontrada comoaumentando eficiência das difíceis, etapas para umpeptídeo, drasticamente e em uma inesperada, maneirasinérgica aumentando pureza e produção. O termo "resinaPEG" é para ser construído estritamente geralmente nopresente contexto como relacionado a uma resina poliméricacompreendendo um poliéter copolimérico ou parte docopolímero de bloqueio, pelo menos - um poliéter tipo PEGou resina PEG-poliéter para curto. O termo poliéter comoutilizado aqui se relaciona em sue sentido convencional apolímeros polioxialquenil tais como, por exemplo,polioxietileno ou polietilenoglicol (PEG) respectivamente,polioxipropileno, polioxibutileno ou polímeros destesmisturados. Diferentes modalidades de tal tipo de resinaexistem, polimerização de monômeros de carbono (incluindounidades monoméricas outras além de oxiran) não sendorestritas a química poliéster apenas. Conseqüentemente, amatriz da resina da fase sólida pode ser constituída, porexemplo, por uma resina poliestireno-PEG anfifílicomisturada (por exemplo, Tentagel, veja EUA4908405) ou PEG-poliamida ou resina misturada poliestireno-PEG, porexemplo, Kempe ET AL., J. Am Chem. Soe. 1996, 118, 7083;também cp. EUA5,910,554 A. Usualmente, carregamento daresina é usualmente menos eficiente e/ou estabilidadequímica em particular em meio ácido é freqüentemente nãocomparado a aquela de resinas tradicionais, por exemplo,Merrifield poliestireno-DVB clássico. Resinas poliestireno-PEG misturadas alcançam maiores carregamentos, mas menoranfifilicidade é obtida porque o conteúdo PEG é reduzido.

É também possível utilizar uma resina PEG que tenhasido obtida por inserção de uma matriz de resina não PEG auma camada de um material resina PEG apropriado, porexemplo, cp. Kates ET AL., High-oad polyethylene glycol-polystyrene (PEG-OS) graft suppots for solid-phasesynthesis, Biopolymers 1998, 47:365-380.

Em uma modalidade fortemente preferida de acordo aom ainvenção, a resina PEG é uma resina PEG-poliétersubstancialmente pura que é mais preferencialmentedestituída de qualquer, eventualmente adicionalmentesubstituída, poliestireno copolimérico ou parte do bloqueiocopolimérico e, mais uma vez mais pref erivelmente,adicionalmente não compreende quaisquer grupos funcionaiséster interno ou amida, mas apenas grupos uncionaispoliéter. Uma resina PEG-poliéter substancialmente purapode também ser chamada de resina PEG-poliésteressencialmente pura ou uma resina consistindo,essencialmente de parte da resina PEG-poliéter.Preferencialmente, o significado de "substancialmente puro"é que a definição estrutural acima das quantidades deresina PEG puras ou, pelo menos, 70% do peso seco domaterial de fase sólida, deixando uma menor parte deadições poliméricas de outro tipo. Tal material idealmentepuro de resina PEG oferece uma ótima estabilidade químicaem companhia da boa compatibilidade e facilidade demanuseio com solventes padrão durante síntese Fmoc normal.Notavelmente, na última definição as ligações terminaléster ou amida lança uma ponte diretamente na resina ou viao ligante integral/inserido para o peptídeo que não foicontado para, desde que a estrutura interna,características de reação cruzada e, conseqüentemente, nãoafete a definição de "puro PEG" neste sentido. Tais resinas"puras", PEG altamente anfifílicas são oferecidas pordiferentes companhias, Por exemplo, Matrix Innovations Inc.de Quebec, Canadá (marca "ChemMatrix") ou Versamatrix A. S.da Dinamarca e estão descritas, por exemplo, na WO02/40559. Elas podem oferecer capacidade de carregamento demais de 0,5 mmol/g, veja marca ChemMatrix de matrizdescrita na Wo 559 mencionada acima, por exemplo. Paraligação de peptídeos, tal resina pode possuir ligantesintegrais terminais tais como radicais hidroximetil ouderivados destes radicais "quase-nativos" amino-metil,carboxil ou bromometil ou iodometil por exemplo ou podemser derivados de ligantes ou alças inseridos conhecidospara ligação de fase sólida tais como, por exemplo, Wang,PAL, 4-alquoxi-benzaldeído ou ligantes amido Rink ouSieber.

Notavelmente, como um elemento adicional daspropriedades surpresas da resina PEG, de acordo com apresente invenção, junção de um segundo aminoácido N° 27,Glu, foi inesperadamente encontrada como favorecendo umaetapa criticamente difícil, em paricular quando utilizandoancoragem da cadeia lateral do resíduo terminal Asp/Asnquando comparada a resinas tradicionais (por exemplo, OS-DVB ou CTC-OS-DVB), enquanto a eficiência da junção deoutros resíduos críticos na extensão da seqüência 19-28 foidescoberta como sendo melhorada, não pensado como sendotrivial. Junção de grande extensão e/ou repetida do resíduoNo. 27 para a porção Asn ancorada na resina foi requeridaquando utilizando resina PEG e especificamente resina PEg-poliéter pura ou substancialmente pura. "Extendidas" serelaciona a utilização de mais equivalentes de umaminoácido Fmoc ou tempos de junção mais longos do que parao resíduo médio.

Objetivos adicionais da presente invenção são osdiversos peptídeos de fase sólida conjugados obtidos poresta maneira. As definições e explicações fornecidas aseguir se aplicam igualmente a estes objetivos.

Tal objeto é um peptídeo conjugado de fórmula I

<formula>formula see original document page 16</formula>

Onde cada resíduo de aminoácido pode serindividualmente protegido ou não protegido, R3 é uma resinaPEG de fase sólida a qual compreende um ligante integral ,R2 é um ligante inserido com x sendo 0 ou 1 e RI éhidrogênio, um grupo protetor ou um radical peptidil,preferencialmente um radical peptidil possuindo menos que50, preferencialmente menos de 25 resíduos de aminoácido eonde, se RI é um radical peptidil, os resíduos deaminoácido individuais são individualmente protegidos ounão protegidos e o N-terminal do referido radical peptidilé livre, é acetilado ou é protegido por um grupo protetorY.

Conseqüentemente, preferencialmente RI é um radicalpeptidil o qual é Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp- Leu-Lys-Glu- , Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu ouH-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu com Y possuindo o significadonomeado antes. Ac: Acetil.

Ligantes como definidos por Guillier, Orain e Bradley,Chem. Ver. 100, 2091-2157, 2000 são consideradossimplesmente como grupos protetores imobilizados e sãoclassificados em um ou mais tipos: (a) ligantes integraisnos quais parte do material do núcleo da fase sólida formaou é parte inseparável do ligante, ambos juntosconstituindo R3 e (b) Ligantes R2 não integrais ouinseridos nos quais o ligante R2 está adicionalmenteacoplado ao suporte sólido, no topo de um liganteintegral/fase sólida R3, por exemplo, para evitar maiscondições de clivagem branda. Exemplos típicos de ligantesde fases sólidas são p-metilbenzhidrilamina (MBHA), 2-clorotritil (CTC), amino-metil, etc... Ligantes integraissão obrigatórios enquanto ligantes R2 inseridos sãoopcionais. Exemplos típicos são 4-hidroximetilfenoxiacetil-ou ácido 4-hidroximetilbenzóico.

Convencionalmente, o peptídeo está conjugado atravésdo seu resíduo C-terminal via sua função ácido carboxílico1 à fase sólida ou ao ligante inserido, respectivamente.

Preferencialmente, de acordo com a presente invenção,a síntese de timalfasina ou seus fragmentos e variantes jámencionados é realizada pela ancoragem da cadeia lateral doúltimo segundo resíduo Glu ou do C-terminal Asp ou Asn."Último segundo Glu" pode significar, no presente contexto,um dipeptídeo Glu-Asn protegido que está ancorado a umafase sólida ou isto pode significar que síntese de umavariante de timalfasina que é distituída do Asn C-terminalda timalfasina natural inicia com referido resíduo Glu. -Inesperadamente, ancoragem de cadeia lateral foi descobertaresultando em síntese mais eficaz. Um resíduo terminal Aspque está ancorado via sua função beta-carboxílica à fasesólida ou um ligante inserido pode ser amidado após asíntese, após clivagem a partir da resina. Maispreferencialmente embora, um Fmoc-Asp o qual éapropriadamente protegido na sua função C carboxílica,preferencialmente por meios de um grupo protetortert.butil, é uma cadeia lateral ancorada a um ligantegerador de amida, preferencialmente um ligante gerador deamida inserido; considerando o produto final após clivagemda resina, tal conjugado pode ser considerado e nominado um"Asn cadeia lateral ancorado" assim como devido autilização de um ligante gerador de amida. Exemplos emodalidades fortemente preferidas de tais ligantesgeradores de amida são, por exemplo, "amida Rink" resina 4-(2' , 4 '-dimetoxibenzil-aminometil)-fenoxi, resina Sieber(Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110) ou similares resina9-amino-xantenil, resinas PAL (Albericio et al. , 1987, Int.J. Pep. Protein Research 30, 206-216). Outro exemplo menospreferido de ligadores geradores de amida são os derivadosespecificamente substituídos tritil-amina de acordo comMeisenbach et al. , 1997, Chem. Letters, p. 1265 f.). Estessão exemplos de grupos ligantes (compatíveis com químicaFmoc) a partir dos quais um Ca-carboxamido é gerado ouliberado após clivagem do peptídeo a partir da resina. Istoacontece sem dizer que tais ligantes amida são, é claro,dependentes de um tipo de síntese de fase sólida realizada,ou seja, se é tradicional Boc ou agora habitual, químicaprotetora Fmoc ortogonal que é utilizada para junção; umligante amida Boc-específico é PAM, por exemplo. Porconseguinte, fases sólidas compreendendo tais gruposligantes são chamadas "fases sólidas produtoras de amida"no presente contexto.

Incorporação de Fmoc-Asp-OtBu em uma fase sólida,contendo um ou dois ligantes, utilizando reagentes dejunção (Albericio, van Abel, Barany, Jnt. J. PeptideProtein Res., 35, 284-286, 1990), foi descrito e pode seraplicado no contexto da presente invenção. Usualmente,reagentes de junção tipo urônio são preferidos pararealizar isso.

Vantagens desta estratégia de ancoragem de cadeialateral são:

(i) Incorporação do primeiro aminoácido no suportesólido é realizada com muita produção quantitativa atravésde uma ligação amida e por conseguinte os mesmos reagentesutilizados para a formação de ligação peptídica podem serutilizados. Além disso, a incorporação de derivadosasparagina em uma resina do tipo Wang ocorre com baixasproduções, com risco de racemização e com formação de p-cianoalanina se cadeia lateral amida não está protegida(Katsoyannis et al. , 1958, Am. Chem. Soe. 80:2558).Adicionalmente, asparaginas de cadeia lateral não protegidapodem ser incorporadas a resinas de halogênio através deambas as funções carboxílica-1 e carboxamida, requerendoutilização de, por exemplo, aminoácidos Fmoc-Asn(Mbh)-0Hprotegidos, criando problemas adicionais na etapa dedesproteção do peptídeo finalmente.

(ii) Estratégia de ancoragem de cadeia lateral envolvegrupos protetores baseados em tBu ácido lábeis (tBu ésterespara o ácido aarboxílico-1 do primeiro resíduo e ácidoscarboxílicos-o dos resíduos Asp e Glu, éteres tBu paracadeia lateral Ser e Thr) e ácido Boc lábil para cadeialateral Lys irão facilitar a desproteção global final,porquede simples removedores tais como H20 podem serutilizados. Em contraste, se Asn está incorporado comgrupos protetores tritil, xantil ou 2,4,6-trimetoxibenzil,isto requerirá a presença de removedores adicionais.

(iii) O esqueleto da cadeia peptídica crescentepela estratégia de ancoragem da cadeia lateral terá maisflexibilidade do que a estratégia carboxílica-1, porque aancoragem é através da cadeia lateral.

Esquema 1 abaixo recapitula o modo mais preferido desíntese em uma resina PEG de acordo com a presente invençãopara timalfasina (Zadaxina), mais preferencialmente em umaresina PEG pura ou substancialmente pura, onde ligante 1 éum ligante gerador de amida e ligante 2 é um liganteintegral: Fmoc-^H—j—cooibu nh2

<formula>formula see original document page 20</formula>Esquema I

(i) Incorporação de Fmoc-Asp-OtBu em um suportesólido (SS), contendo um ou dois ligantes, utilizandoreagentes de junção (Albericio, van Abel, Barany, Int. J.Peptide Protein Res., 35, 284-286, 1990).

(ii) Elongamento da cadeia peptídica com o resto doaminoácido Fmoc-protegido (tBu para Asp, Glu, Ser e Thr eBoc para Lys).

(iii) Acetilação.

(iv) Clivagem do peptídeo do suporte sólido e remoçãodos grupos protetores, os quais podem ser realizados em uma(solução ácida de alta concentração) ou duas etapas(solução ácida de baixa concentração seguida de soluçãoácida de alta concentração).

EXEMPLOS

Procedimentos Gerais. Resina Fmoc-Sieber-OS era daNovaBiochem (Làufelfingen, Suiça), resina ChemMatrix daMatrix Innovation (Quebec, Canadá) , resina 2-Cl-TrtCl daCBL (Patras, Grécia), HCTU das Indústrias Luxemburgo Ltd.(Tel Aviv, Israel), derivados de aminoácido Fmoc Protegidoda IRIS Biotech (Marktredwitz, Alemanha).

Sínteses de fase sólida foram realizadas tanto emfunis de vidro com filtros ou seringas de propileno (50 mL)istaladas com um disco poroso de polietileno. Solventes ereagentes solúveis foram removidos por sucção. Remoção dogrupo Fmoc foi realizada com pirridina-DMF (2:8, v/v) (2 x1 min, 2 x 10 min, 1x5 min). Lavagens entre as etapas dedesproteção, junção e, novamente, desproteção foramrealizadas com DMF (5 x 0,5 min) e CH2C12 (5 x 0,5 min)utilizando em cada tempo 10 mL de solvente/g resina.Transformações e lavagens na síntese de peptídeo foramrealizadas a 25°C. Sínteses realizadas em fase sólida foramcontroladas por HPLC dos intermediários obtidos apósclivagem com TFA-H20 (95:5) por 1 h uma alíquota (aprox. 2mg) da resina peptidil. Colunas SymmetryTM C18 4,6 x 150mm, 5 pm (coluna A) de HPLC de fase reversa da Waters(Irlanda). HPLC analítico foi realizado em um instrumentoWaters compreendendo duas bombas de distribuição dosolvente (Waters 1525) e injetor automático (Waters 717autoamostrador), detector dual de comprimento de onda(Waters 2487) . Detecção de UV foi a 215 ou 220 nm egradientes lineares de CH3CN ( + 0,036% de TFA) em H20(+0,045% de TFA), de 30% a 100% em 15 min.

Análises MALDI-TOF e ES-MS de amostras peptídicasforam realizadas em um PerSptive Biosystems Voyager DE RP,utilizando matriz ACH.

Exemplo 1

Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu) -

Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc) -

Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc) -

Glu(OtBu) -Val-Val-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -

Asp (resina Rink,-ChemMatrix)-OtBu

Etapa 1

Ancoramento de cadeia lateral de Fmoc-Asp(resina Rink-ChemMatrix)-OtBu

Resina Fmoc-Rink-ChemMatrix (0,45 mmol/g) (5 g, 2,25mmol) foi colocada em um funil de vidro com um discoporoso. A resina foi submetida as seguinteslavagens/tratamentos com CH2C12 (3 x 0,5 min) e piperidinacomo indicado nos Procedimentos Gerais e DMF (5 x 0,5 min) .então, Fmoc-Asp-OtBu (4,11 g, 5 equiv. ) e DIEA 93,4 mL, 10equiv.) em DMF (9 mL) foram adicionados, seguido por HCTU

(3,96 g, 4,8 equiv.) em DMF (5 mL) . A mistura foi deixadapara agitar mecanicamente por 2 h e a resina foi lavada comDMF (3 x 0,5 min) e o teste da ninidrina foi negativo. Ac20

(0,5 mL x 5 mmol) e DIEA (1,7 mL, 5 mmol) em DMF (14 mL)foram adicionados e deixados para agitar mecanicamente por15 min e a resina foi filtrada e lavada com DMF (3 x 0,5min) .

Carregamento bem sucedido foi determinado como umaquantidade de 0,4 mmol/g.

Etapa 2

H-Ser(tBu) -Asp(OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu) -Ser(tBu)Ser(tBu)-Glu(OtBu) -Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu) -Lys(Boc) -Asp(OtBu) -Leu-Lys (Boc) -Glu(OtBu) -Lys (Boc) -Lys(Boc) -Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ala-Glu(OtBu) -Asp(resinaRink-ChemMatrix)-OtBu

O grupo Fmoc foi removido e Fmoc-aa-OH (5-10 equiv.)foram seqüencialmente adicionados a resina peptidil acima(etapa 1) junto com DIEA (3,4 mL, 10 equiv) em DMF (9 mL) ,por HCTU (3,96 g, 4,8 equiv.) em DMF (5 mL) . A mistura foideixada para agitar mecanicamente por 1-2 h, a resina foilavada com DMF (3 x 0,5 min) e o teste da ninidrina foifeito. Se o teste resultasse em positivo (azul), a junçãoera repetida, enquanto se o teste era ligeriramente(marrom), uma etapa de acetilação era realizada com Ac20(0,5 mL, 5 mmol) e DIEA (1.7 mL, 5 mmol) em DMF (14 mL) por15 min com agitação mecânica. Alíquotas das resinas foramobtidas após tratamentos com piperidina. Nas posições E27,K19, para cada posição uma dupla junção com, pelo menos, 35min. de tempo de reação por único e utilizando 10 eq. deaminoácidos Fmoc foi realizado.

Etapa 3

Ac-Ser(tBu) -Asp(OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu) -Ser(tBu)- Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc) -Asp(OtBu) -Leu-Lys (Boc) -Glu(OtBu) -Lys(Boc) -Lys(Boc) -Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ala-Glu(OtBu)- Asp(resina Rink-ChemMatrix)-OtBu

A acetilação final foi realizada com Ac20 (0,5 mL, 5 mmol) e DIEA (1,7 mL, 5 mmol) em DMF (14 mL) por 15 min comagitação mecânica, onde ninidrina foi negativa. A resinafoi seca e 16,5 g foram obtidos.

Etapa 4

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys- Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH(Zadaxina, timalfasina).

Clivagem em uma etapa a partir da resina e desproteçãoglobal foram realizadas. Porções de 5 g da resina da Etapa3 foram colocadas no funil de vidro acoplado a um discoporoso foram tratadas com TFA-H20 (95:5) (35 mL) gelado,então a solução foi filtrada e a resina é adicionalmentelavada com TFA-H20 (95:5) (10 mL) . A solução TFA combinadaé corrida em éter tbutil metil gelado (350 mL) e a misturaé centrifugada. O sólido é isolado por decantação.

MALDI-TOF-MS, cale. 3106,50. Encontrado: m/z 3107,36[M+H]+.

Análise RP-HPLC do peptídeo bruto mostrou que oproduto estava predominantemente puro, quantificando umaprodução de 90% (Fig. 1) . Dois picos contaminantes menores podem ser facilmente removidos por RP-HPLC em C18 Hypersilcom 10-30% acetonitrila/água por 45 min., resultando emproduto puro com quase recuperação completa do pico doproduto correto (Fig. 2).

Exemplo 2: Exemplo comparativo

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH(Zadaxina, timalfasina)

Procedimentos experimentais como descritos nosExemplos 1 e 2, exceto que resina Fmoc-Sieber-PS (0,59mmol/g) (3,33 g, 2 mmol) foi utilizado ao invés da resinaFmoc-Rink-ChemMatrix.

MALDI-TOF-MS, cale. 3106,50. Encontrado: m/z 3107,24[M+H]+. A pureza e produção da mistura do produto brutoanalisada por RP-HPLC como determinado pela área do picoquantificada a 40% da produção apenas (Fig. 3) , com umamplo espectro de impurezas.

Exemplo 3: Exemplo ComparativoAc-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -Ser(tBu) -Ser (tBu) -Glu(OtBu) -Ile-Thr (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Leu-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Glu(OtBu) -Vai-Vai-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-O-(2-Cl-Trt)-resina

Etapa 1

Ancoragem Ca-terminal na resina CTC, resultando na resinaFmoc-Asn(Trt)-0-TrtCl

Resina 2-Cl-TrtCl (0,2 g, 1,64 mmol/g; Ambersynth™CTC da Rohm & Haas, Paris, França com matriz feita depoliestireno - 1% divinilbenzeno) foi colocada emu maseringa de 10 mL de polipropileno acoplada a um discofiltro de polietileno. A resina foi então lavada com CH2C12(5 x 0,5 min) e uma solução de Fmoc-Asn(Trt)-0H (0,7 equiv)e DIEA (241 uL) em CH2C12 (2,5 mL) foi adicionada e amistura foi agitada por 15 min, quando DIEA extra (121 uL,total 7 equiv) e a mistura agitada por 45 min. a reação foiterminada pela adição de MeOH (16 0 uL) , após uma agitaçãode 10 min. A resina Fmoc-Asn(Trt)-0-TrtCl foi submetida aseguidas lavagens com CH2C12 (3 x 0,5 min) e DMF (3 x 0,5min) . O carregamento calculado por determinação Fmoc foi0,8 mmol/g.

Etapa 2

H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ala-Glu(OtBu) -Asn(Trt)- resina ClTrt-PS

O grupo Fmoc foi removido e Fmoc-aa-OH' (10 equiv)foram seqüencialmente adicionados a resina peptidil acima(etapa 1) junto com DIEA (20 equiv) em DMF (9 mL), por HCTU(9,6 equiv) em DMF um sintetizador automático ABI 433A com60 min de tempo de junção.

Etapa 3

Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-ThrftBu)Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys (Boc) -Asp(OtBu) -Leu-Lys (Boc) - Glu(OtBu) -Lys (Boc) -Lys (Boc)-Glu(OtBu) - Vai-Vai-Glu (OtBu ) -Glu(OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn(Trt)-resina ClTrt-PS

A acetilação final foi realizada com Ac20 (0,5 mmol) eDIEA (5 mmol) em DMF (2 mL) por 15 min com agitação manualesporádica, onde ninidrina foi negativa.

Etapa 4Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc) -Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Vai-Vai-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OH

O peptídeo protegido da etapa 3 acima foi clivado apartir da resina por TFA-Et3SiH-CH2Cl2 (1:1:98) (5 x 30sec). Filtrado foi coletado em H20 (4 mL) e a H20 foiparcialmente removida sob pressão reduzida. Acetonitrila(ACN) foi então adicionada para dissolver sólido queapareceu durante a remoção da H20 e a solução foiliofilizada.

Etapa 2

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-AspLeu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Vai-Vai-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH(Zadaxina,timalfasina)

0 peptídeo protegido da etapa 4 foi dissolvido em TFA-H20 (95:5, 5 mL) e a mistura foi deixada agitar por 1 h.então a mistura é filtrada e a resina é adicionalmentelavada com TFA-H20 (95:5) (1 mL). A solução TFA combinada écolocada no éter tbutil metil gelado (25 mL) e a mistura écentrifugada. O sólido é isolado por decantação. Então, H20(5 mL) foi adicionada e liofilizada.

MALDI-TOF-MS, cale. 3106,50. Encontrado: m/z [M+H]+ 3107,98.

A pureza e produção brutas, como determinado pela áreado pico de RP-HPLC, quantificadas em desapontantes 20% deproduto próprio com um forte fundo com manhas de variantescadeias impróprias (Fig. 4). - Repetição cuidadosa dasíntese de fase sólida de um fragmento encurtado (Lysl9 atéAsn28) com junção manual e testagem de ninidrina após cadaetapa mostrou que síntese de cadeia freqüentementeeficazmente termina após incorporação de V22; três junçõesconsecutivas E21, K20 e K19 provaram ser altamenteineficientes, requerendo capeamento de cadeias nãoreagidas. Junção dupla, tempos de junção alongados eutilização de mais eq. de aminoácido Fmoc não resolvemsatisfatoriamente o problema, não permitindo estabelecersíntese significantemente mais eficiente desta forma (Fig.5) .

Example 4: Exemplo Comparativo

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn (Zadaxina, timalfasina)

Procedimentos experimentais essencialmente comodescritos no Exemplo 2, exceto que alça Fmoc-Rink foiincorporada na resina MBHA (resina 4-metilbenzhidrilaminaLL em polistireno 1% base divinilbenzeno, Novabiochem™,Merck/Alemanha), Fmoc-Asp-OtBu foi ancorado pela cadeialateral como descrito na Etapa 1, Exemplo lem ligante Rinkaminometil inserido após remoção do grupo Fmoc da porçãoRink, carregamento foi determinado para quantidade de 0,66mmol/g. Junções foram realizadas com HCTU (10 eq.) por 35-min. com junções duplas nas posições D28 (ou seja, N28) ,E27, E21, K20, K19. Clivagem em uma etapa e desproteção foirealizada com TFA-H20 (95:5) após acetilação ser realizadacomo descrito acima. A pureza e produção bruta obtida, comodeterminada por RP-HPLC, foi 27% (Fig. 6).

Example 5

NH2-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (fragment19-28 de timalfasina)

Ancoramento de cadeia lateral e síntese foramrealizadas na resina Rink-ChemMatrix essencialmente comofoi descrito no exemplo 1, exceto que junção dupla não foirealizada nas posições das seqüências indicadas no exemplo1, mas um tempo uniforme e único de junção de 35 min. foiaplicado. Deleção do resíduo Glu No. 27 foi observada comoa único, mas dominante subproduto de terminação de cadeiano diagrama HPLC (Fig. 7). - Como determinado no exemplo 1,este subproduto pode ser suprimido com sucesso pelaextensão, junção repetida na E27.

Exemplo 6

NH2-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-An (fragmento 19-28da timalfasina)

Ancoramento de cadeia lateral e síntese foramrealizadas essencialmente como foi descrito no exemplo 1,exceto que uma resina PEG-MBHA da Millipore-Waters (resinaMeO[PEG]2000-CO-Om-MBHA-PS, similiarmente descrita em Kateset al., High-load PEG-polystyrene graft supports for solid-phase synthesis, supra) que foi inserida com um liganteRink aminometil foi empregada. O carregamento da resinaRink-PEG-MBHA foi determinado com 0,55 mmol/g.Especialmente, junções duplas foram realizadas nas posiçõesde seqüência E27, E21, K20, K19. A pureza e produção brutadeterminada por RP-HPLC quantificou 92% (Fig. 8).

Claims

1. Peptídeo conjugado de fórmula I<formula>formula see original document page 30</formula> caracterizado pelo fato de que cada resíduo de aminoácidoestá individualmente protegido ou desprotegido, R3 é umaresina de PEG da fase sólida a qual é compreendida de umligante integral, R2 é um ligante inserido com x sendo 0 oue RI é hidrogênio, um grupo protetor ou um radicalpeptidil, preferencialmente um radical peptidil possuindomenos de 50, preferencialmente menos de 25 resíduos deaminoácidos e onde, se RI é um radical peptidil, osresíduos de aminoácido individuais do referido radical sãoindividualmente protegidos ou desprotegidos e o N-terminaldo referido radical é livre, é acetilado ou é protegido comum grupo protetor Y.

2. Peptídeo conjugado, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor Y é umgrupo Fmoc, um grupo tipo Dde, um grupo Boc ou um derivadodos referidos grupos protetores, preferencialmente, umderivado de um grupo Fmoc ou tipo Dde, que compreende umgrupo que permite afinidade de ligação reversível do entãopeptídeo protegido para um material de matriz decromatografia sólida.

3. Peptídeo conjugado, de acordo com a reivindicação-3, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor Ypermite afinidade de ligação reversível a um material dematriz de cromatografia sólida de afinidade metalimobilizado.

4. Peptídeo conjugado, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fatode que RI é Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu, Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu ou H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Leu-Lys-Glu com Y possuindo o significadonomeado anteriormente.

5. Método de sintetizar Timosina al, uma versão C-terminalmente truncada da Timosina al compreendendoresíduos 1-27, uma versão terminalmente truncada N- daTimosina al compreendendo pelo menos resíduos 19-28 ou umaversão truncada compreendendo, pelo menos, resíduos 19-27da Timosina al madura em uma fase sólida caracterizado pelofato de compreender as etapas dea. Junção de um resíduo FMOC-Glu, FMOC-Asp ou FMOC-Asn apropriadamente protegido à uma resina PEG de fasesólida a qual resina PEG é preferencialmente selecionada apartir do grupo compreendendo resinas poliestireno-PEGmisturadas, resinas PEG poliéter-poliéster misturadas ouresinas PEG poliéter-poliamida misturadas e resinas PEGessencialmente puras.b. alongamento da cadeia peptídica pela síntese FMOConde as cadeias laterais dos aminoácidos individuais podemser derivadas de grupos protetores apropriadosc. Opcionalmente acetilando o último resíduo N-terminal ed. Clivando o peptídeo da resina.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o peptídeo sintetizado éTimosina al possuindo a seqüência<formula>formula see original document page 31</formula>onde as cadeias de aminoácidos individuais sãodesprotegidas ou são apropriadamente protegidas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a resina PEG é uma resinaanfifílica.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a capacidade de carregamentoda resina PEG é, pelo menos, 0,5 mmol/g e a qual resina PEGpreferencialmente é essencialmente desprovida da parte co-polimérica poliestireno.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a resina PEG com a exceçãodos ligantes integrais e/ou inseridos é uma resina PEGpoliéter essencialmente pura, preferencialmente que estaseja uma resina PEG poliéter pura.