BRPI0610212A2 - elevação de óleo em plantas monocotiledÈneas - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para preparar plantas de safras tendo maiores níveis de óleo em suas sementes aumentando o fluxo glicolítico através de superexpressão de ácidos nucléicos codificando fosfofrutoquinase. A invenção pode compreender adicionalmente a superexpressão de ácidos nucléicos codificando uma piruvato quinase para alterar o teor de óleo em sementes de plantas, e plantas e células monocotiledóneas transformadas com fosfofrutoquinase, ou transgenes de fosfofrutoquinase e piruvato quinase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ELEVAÇÃODE ÓLEO EM PLANTAS MONOCOTILEDÔNEAS".
Antecedentes da Invenção
Este pedido de patente reivindica prioridade segundo 35 U.S.C.119(e) do pedido de patente Provisório dos Estados Unidos Serial N260/684.809, depositado em 26 de maio de 2005, cujo pedido de patente éincorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.
1. Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a aumentar os níveis de óleo nassementes de plantas de safras por superexpressão de fosfofrutoquinase.
2. Técnica Relacionada
A conversão de frutose-6-fosfato (F-6-P) para frutose-1,6-bis-fosfato (F-1,6-BP) é catalisada pela enzima fosfofrutoquinase (PFK). PFKATP-dependente catalisa esta etapa na maioria dos organismos e tecidos eesta enzima tem sido implicada por muito tempo na regulação do fluxo glico-lítico. Na verdade em muitos sistemas, inclusive plantas, acresdita-se que aregulação combinada das enzimas alostéricas ATP-PFK e piruvato quinase(PK) seja essencialmente responsável para regular a glicólise. Em plantas,ATP-PFK está localizada nos plastídeos e no citosol. Freqüentemente asenzimas encontradas nestas diferentes localizações celulares têm diferentespropriedades cinéticas. Além das enzimas ATP-PFK, há duas outras enzi-mas que estão envolvidas na interconversão destes dois metabólitos: PFKpirofosfato-dependente (PPI-PFK), o qual catalisa a interconversão reversí-vel, pirofosfato inorgânico-dependente, de F-6-P e F-1.6-BP, e frutose-1,6-bisfosfatase, que catalisa a reação reversa para gliconeogênese.
Doehlert et aí. (1988) descobriram que a fosfofrutoquinase foimais abundante em embriões (tecido de alto teor de óleo) do que no endos-perma (tecido de baixo teor de óleo) de milho. Em um estudo da distribuição daabundância de enzimas envolvidas no metabolismo dos carboidratos dentro dediferentes partes do núcleo, estes pesquisadores descobriram a atividade daPFK correlacionada com estas áreas do núcleo que depositou a maior partedo óleo. Há um grande corpo de evidência corroborando á importância dePFK na regulação do fluxo glicolítico {por exemplo, Plaxton, 1996). Emboratenham sido produzidas algumas plantas transgênicas compreendendo umgene de fosfofrutoquinase heterólogo (por exemplo, Patente dos EstadosUnidos N2 7.012.171; Burrell et ai, 1994; Thomas et aí., 1997; publicação depatente internacional N2 WO 99/67392; Wood et ai, 1999; Wood et ai,2002), não foi reportado o uso de PFK para aumentar o teor de óleo emplantas monocotiledôneas e sementes.
De modo a produzir maiores níveis de óleo no desenvolvimentode sementes de monocotiledôneas, estes tecidos precisam converter maisdo carbono entrante (predominantemente sacarose) em triacilgliceróis (TAG)ao invés de amido. Isto sugere que mais das hexoses precisam ser decom-postas por glicólise de modo a gerar piruvato e acetil-CoA como substratospara síntese de ácidos graxos.Sumário da Invenção
Esta invenção envolve a superexpressão de um gene pfk com oefeito pretendido de aumentar o fluxo glicolítico e deste modo aumentar osuprimento de substrato, resultando em maiores níveis de óleo em tecidostais como as sementes de plantas monocotiledôneas. Mais especificamenteenvolve a superexpressão do gene pfk ATP-dependente das bactérias Lac-tobacillus delbreuckii subespécie bulgaricus nas sementes de monocotiledô-neas.
Esta invenção proporciona um método para preparar uma plantamonocotiledônea tendo óleo aumentado em sua semente, compreendendo aetapa de cultivar uma planta monocotiledônea transformada compreendendouma seqüência de ácido nucléico codificando uma fosfofrutoquinase, enca-deada operavelmente a um promotor de reforço de semente o qual tambémé opcionalmente encadeado operavelmente a uma seqüência de ácido nu-cléico codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo exceto quando o re-ferido promotor de reforço de semente é um promotor de reforço de embrião,para produzir semente, por meio do qual o teor de óleo da semente é au-mentado comparado com uma semente de uma planta isogênica carecendoda seqüência de ácido nucléico.Esta invenção proporciona um método para preparar uma plantamonocotiledônea tendo óleo aumentado em suas sementes, compreenden-do a etapa de cultivar uma planta monocotiledônea transformada compreen-dendo uma seqüência de ácido nucléico codificando uma fosfofrutoquinasediferente da SEQ ID NO: 9 ou 13, encadeada operavelmente a um promotorde reforço de semente o qual também é opcionalmente encadeado opera-velmente a uma seqüência de ácido nucléico codificando um peptídeo detrânsito de plastídeo exceto quando o referido promotor de reforço de se-mente é um promotor de reforço de embrião, para produzir semente, pormeio do qual o teor de óleo da semente é aumentado comparado com umasemente de uma planta isogênica carecendo da seqüência de ácido nucléico.
Em uma modalidade, o método compreende produzir uma plantamonocotiledônea em que a seqüência de ácido nucléico codificando umafosfofrutoquinase é selecionada entre o grupo consistindo em:
a) seqüências de ácido nucléico compreendendo SEQ ID NO: 1 ou 11 e
b) seqüências de ácido nucléico codificando SEQ ID NO: 2 ou 12.
Em outra modalidade, a planta compreende adicionalmente umasegunda seqüência de ácido nucléico codificando uma piruvato quinase, en-cadeada operavelmente a um promotor de reforço de semente. Em uma ver-são desta modalidade, a segunda seqüência de ácido nucléico codificandouma piruvato quinase é selecionada entre o grupo consistindo em:
a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo SEQ ID NO: 3 a
b) uma seqüência de ácido nucléico codificando SEQ ID NO: 4.
Em várias modalidades, a planta monocotiledônea é selecionadaentre o grupo consistindo em milho (Zea mays), arroz {Oryza sativa), cevada(Hordeum vulgaré), painço {Panicum miliaceum), centeio {Secale cereale),trigo (Triticum aestivum), e sorgo (Sorghum bicoloi).
Em várias modalidades, o promotor é selecionado entre o grupoconsistindo em promotores de reforço de embrião, promotores de reforço deendosperma e promotores de reforço de embrião e de endosperma.
A invenção também proporciona células de plantas transforma-das, plantas transformadas e progênie, semente, óleo e refeição. Adicional-mente, a invenção proporciona composições de ração animal e alimentohumano e métodos para produzir óleo.
Breve Descrição das Seqüências
A SEQ ID NO: 1 determina uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma fosfofrutoquinase de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.
A SEQ ID NO: 2 determina uma seqüência de polipeptídeo deuma fosfofrutoquinase de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.
A SEQ ID NO: 3 determina uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma piruvato quinase de Lactobacillus delbreuckiissp. bulgaricus.
A SEQ ID NO: 4 determina uma seqüência de polipeptídeo deuma piruvato quinase de Lactobacillus delbreuckii ssp. bulgaricus.
As SEQ ID NOS: 5 a 8 determinam iniciadores de ácidos nucléi-cos.
A SEQ ID NO: 9 determina uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma fosfofrutoquinase de Schizosaccharomyces pombe.
A SEQ ID NO: 10 determina uma seqüência de polipeptídeo deuma fosfofrutoquinase de Schizosaccharomyces pombe.
A SEQ ID NO: 11 determina uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma fosfofrutoquinase de Propionibacterium freudenreichii.
A SEQ ID NO: 12 determina uma seqüência de polipeptídeo deuma fosfofrutoquinase de Propionibacterium freudenreichii.
A SEQ ID NO: 13 determina uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma fosfofrutoquinase de Escherichia coli.
A SEQ ID NO: 14 determina uma seqüência de polipeptídeo deuma fosfofrutoquinase de Escherichia coli.
Breve Descrição dos Desenhos
Os desenhos seguinte formam parte do presente relatório descri-tivo e são incluídos para demonstrar adicionalmente alguns aspectos da pre-sente invenção. A invenção pode ser melhor entendido por meio de referên-cia a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição deta-lhada de específicas modalidades apresentadas aqui, neste pedido de pa-tente.
A figura 1 mostra um alinhamento da seqüência codificante dogene pfk (SEQ ID NO: 1) isolado de Lactobacillus delbreuckii subspécie bul-garicus ATCC cepa 11842 com a seqüência genética pfk publicada (EMBLns de acesso X71403).
A figura 2 representa o plasmídeo pMON72008.
A figura 3 representa o plasmídeo pMON79823.
A figura 4 representa o plasmídeo pMON79824.
A figura 5 representa o plasmídeo pMON79827.
A figura 6 representa o plasmídeo pMON72028.
A figura 7 representa o plasmídeo pMON79832.
A figura 8 representa o plasmídeo pMON81470.
A figura 9 representa o plasmídeo pMON72029.
A figura 10 representa o plasmídeo pMON83715.
Descrição de Modalidades Ilustrativas
As seguintes definições são proporcionadas como um auxíliopara entender esta invenção. As expressões "seqüência de DNA", "seqüên-cia de ácido nucléico", "molécula de ácido nucléico", e "segmento de ácidonucléico" se referem a uma estrutura física compreendendo uma disposiçãoordenada de nucleotídeos. O segmento de DNA, seqüência, ou seqüênciade nucleotídeos podem estar contidos dentro de uma molécula de nucleotí-deo maior, vetor, ou similares. Além disso, a disposição ordenada de ácidosnucléicos nestas seqüências pode ser representada sob a forma de umalistagem de seqüência, figura, tabela, meio eletrônico, ou similares.
As expressões "seqüência codificante", "região codificante", "se-qüência estrutural", e "seqüência de ácido nucléico estrutural" se referem atoda ou um segmento de uma seqüência de DNA, seqüência de ácido nu-cléico, molécula de ácido nucléico na qual os nucleotídeos estão dispostosem uma série de triplets que formam cada um códon. Cada códon codificaum aminoácido específico. Deste modo, a seqüência codificante, região co-dificante, seqüência estrutural, e seqüência estrutural de ácido nucleico codi-ficam uma série de aminoácidos formando uma seqüência de proteína, poli-peptídeo, ou peptídeo. A seqüência codificante, região codificante, seqüên-cia estrutural, e seqüência estrutural de ácido nucleico pode estar contidadentro de uma molécula de ácido nucleico maior, vetor, ou similares. Alémdisso, a disposição dos nucleotídeos nestas seqüências pode ser represen-tada sob a forma de uma listagem de seqüências, figura, tabela, meio eletrô-nico, ou similares.
O termo "cDNA" se refere a um DNA de filamento duplo que écomplementar a e derivado de mRNA.
"Expressão" se refere ao processo pelo qual a informação codifi-cada por um gene é convertida em estruturas presentes e operantes na célu-la. Genes expressados incluem aqueles que são transcritos em RNA e emseguida traduzidos em proteína e os que são transcritos em RNA mas nãotraduzidos em proteína (por exemplo, RNA de transferência e RNA ribossô-mico).
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "gene" se referea um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica,inclusive seqüências regulatórias precedendo (seqüências não codificantes5') e seguindo (seqüências não codificantes 3') a seqüência codificante."Gene nativo" se refere a um gene conforme encontrado na natureza comsuas próprias seqüências regulatórias. "Gene quimérico" se refere a qual-quer gene que não é um gene nativo, compreendendo seqüências regulató-rias e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Por conse-guinte, um gene quimérico pode compreender seqüências regulatórias e se-qüências codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou seqüênciasregulatórias e seqüências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dis-postas em uma maneira diferente da encontrada na natureza. "Gene endó-geno" se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma deum organismo. Um gene "exógeno" ou "transgene" se referem a um geneque foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. Umtransgene inclui DNA genômico introduzido por um procedimento de trans-formação (por exemplo, um DNA genômico encadeado a seu promotor ati-vo).
"Heteróloga" se refere à relação entre duas ou mais seqüênciasde ácido nucléico ou proteína que são derivadas de diferentes fontes. Porexemplo, um promotor é heterólogo com respeito a uma seqüência codifi-cante se uma combinação semelhante não for encontrada normalmente nanatureza. Além disso, uma seqüência de ácido nucléico em particular podeser "heteróloga" com respeito a uma célula ou organismo no qual é inseridose não ocorrer naturalmente nesta célula ou organismo em particular.
"Homologia de seqüência" se refere ao nível de similaridade en-tre 2 ou mais seqüências de ácido nucléico ou aminoácido em termos depercentagem de identidade posicionai. O termo homologi também é usadopara se referir ao conceito de propriedades funcionais similares entre dife-rentes ácidos nucléicos ou proteínas.
"Hibridização" se refere à capacidade de um primeiro filamentode ácido nucléico para unir com um segundo filamento através de parea-mento de base de ligação de hidrogênio quando os dois filamentos de ácidonucléico têm complementaridade de seqüência suficiente. Conforme usadoaqui, neste pedido de patente, diz-se que uma molécula de ácido nucléico éo "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se apresentar com-plementaridade completa. Conforme usado aqui, neste pedido de patente,diz-se que as moléculas apresentam "complementaridade completa" quandocada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeoda outra. Portanto diz-se que dois filamentos de ácido nucléico têm suficien-te complementaridade quando podem hibridizar um ao outro com suficienteestabilidade para permitir que os mesmos permaneçam anelados um aooutro sob condições apropriadas.
Condições de estringência apropriadas as quais promovem hi-bridização de DNA são, por exemplo, 6,0 X cloreto de sódio / citrato de sódio(SSC) a cerca de 45°C, seguida por uma lavagem de 2,0 X SSC a 20-25°C,e são de conhecimento daqueles versados na técnica. Por exemplo, a con-centração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada entre uma baixaestringência de cerca de 2,0 X SSC a 50°C até uma elevada estringência decerca de 0,2 X SSC a 65°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagempode ser aumentada de condições de baixa estringência em temperaturaambiente, cerca de 22°C, até condições de alta estringência a cerca de65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou quer a tem-peratura ou a concentração de sal podem ser mantidos constantes de talmodo que um ácido nucléico especificamente hibridizará a uma ou mais dasmoléculas de polinucleotídeo proporcionadas aqui, neste pedido de patente,por exemplo, conforme estipulado em : SEQ ID NOs 1, 3, ou 11, e comple-mentos das mesmas, sob condições moderadamente estringentes, por e-xemplo a cerca de 2,0 X SSC e cerca de 65°C.
A expressão "isolado" significa tendo sido removido de seu am-biente natural, independente de sua disposição eventual. Por exemplo, umaseqüência de ácido nucléico "isolado" de arroz, tal como por clonagem deuma célula de arroz, permanece "isolado" quando é inserido no genoma deuma célula de milho.
A expressão "encadeada operavelmente" se refere à disposiçãoespacial de duas ou mais regiões de ácido nucléico ou seqüências de ácidonucléico de modo que exerçam seus efeitos apropriados com respeito uma àoutra. Por exemplo, uma região de promotor pode ser posicionado em rela-ção a uma seqüência de ácido nucléico de tal modo que a transcrição daseqüência de ácido nucléico é dirigida pela região de promotor. A região depromotor e a seqüência de ácido nucléico são "encadeadas operavelmente".
O termo "fosfofrutoquinase" se refere a uma enzima capaz deconverter frutose-6-fosfato (F-6-P) para frutose-1,6-bis-fosfato (F-1,6-BP).Isto inclui enzimas da International Union of Biochemistry and Molecular Bio-logy Enzyme Nomenclature classes EC 2.7.1.11 e EC 2.7.1.90 .
O termo "piruvato quinase" se refere a uma enzima capaz deconverter fosfoenol piruvato para piruvato. Isto inclui enzimas da Internatio-nal Union of Biochemistry and Molecular Biology Enzyme NomenclatureclassEC 2.7.1.40.
O termo "plastídeo" se refere a uma organela citoplasmática au-to-replicante de células de alga e vegetais, tal como um cloroplasto ou cro-moplasto. Um "peptídeo de trânsito" se refere a uma seqüência de aminoá-cidos no N-término de uma proteína que orienta o polipeptídeo para o plastí-deo a partir de sua síntese no citosol e facilita sua translocação através damembrana de plastídeo. Depois do polipeptídeo penetrar no plastídeo, opeptídeo de trânsito é clivado do polipeptídeo.
"A montante" e "a jusante" são termos posicionais usados comreferência à localização de uma seqüência de nucleotídeo e a direção detranscrição ou translação de seqüências codificantes, as quais normalmenteprosseguem na direção 5' a 3'.
Os termos "promotor" ou "região do promotor" se referem a umaseqüência de ácido nucléico, geralmente encontrada a montante (5') a umaseqüência codificante, que é capaz de dirigir a transcrição de uma seqüênciade ácido nucléico em uma molécula de RNA. O promotor ou região do pro-motor tipicamente proporciona um sítio de reconhecimento para RNA poli-merase e os outros fatores necessários para iniciação de transcrição apro-priada. Conforme contemplado aqui, neste pedido de patente, um promotorou região do promotor inclui variações de promotores derivados inserindo oueliminando regiões regulatórias, submetendo o promotor a mutagênese alea-tória ou sítio-dirigida, e similares. A atividade ou potência de um promotorpode ser medida em termos das quantidades de RNA que produz, ou daquantidade de acúmulo de proteína em uma célula ou tecido, em relação aum segundo promotor que é medido similarmente.
A expressão "seqüências não codificantes 3"' se refere a se-qüências de nucleotídeo localizadas a jusante de uma seqüência codificantee incluem seqüências de reconhecimento de poliadenilação e outras se-qüências codificando sinais regulatórios capazes de afetar o processamentode mRNA ou a expressão genética. Estas são comumente referidas comoregiões não traduzidas 3' ou 3'-UTRs. O sinal de poliadenilação é geralmen-te caracterizado por afetar a adição de conjuntos de ácido poliadenílico àextremidade 3' do precursor de mRNA. O uso de diferentes seqüências nãocodificantes 3' é exemplificado por Ingelbrecht et aí. (1989)."Seqüência líder de translação" ou "região não traduzida 5"' ou"5'-UTR" todas se referem a uma seqüência de nucleotídeo localizada entrea seqüência promotora de um gene e a seqüência codificante. A 5'-UTR estápresente no mRNA totalmente processado a montante da seqüência de ini-ciação de translação. A 5'-UTR pode afetar o processamento do transcriptoprimário para mRNA, estabilidade de mRNA ou eficiência de translação. Fo-ram descritos exemplos de seqüências líder de translação (Turner and Fos-ter, 1995).
"Transcripto de RNA" se refere ao produto resultante de transcri-ção catalisada por RNA polimerase, de uma seqüência de DNA. Quando otranscripto de RNA é uma cópia complementar perfeita de uma seqüência deDNA, é referido como o transcripto primário. Uma seqüência de RNA deriva-da de processamento pós-transcripcional do transcripto primário é referidacomo o RNA maduro. "RNA mensageiro" (mRNA) se refere ao RNA que estásem íntrons e que pode ser traduzido em polipeptídeo pela célula.
"Vetor recombinante" se refere a qualquer agente pelo qual ouno qual um ácido nucléico de interesse é amplificado, expressado, ou arma-zenado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, seqüência autonomamen-te replicante, fago, ou seqüência de nucleotídeo de DNA ou RNA linear defilamento único, circular de filamento único, linear de filamento duplo, ou cir-cular de filamento duplo. O vetor recombinante pode ser sintetizado ou deri-vado de qualquer fonte e é capaz de integração genômica ou replicação au-tônoma.
"Seqüência regulatória" se refere a uma seqüência de nucleotí-deo localizada a montante (5'), dentro, ou a jusante (3') com respeito a umaseqüência codificante, ou um íntron, cuja presença ou ausência afeta atranscrição e expressão da seqüência codificante
"Substancialmente homóloga" se refere a duas seqüências quesão no mínimo cerca de 90% idênticas em seqüência, conforme medido peloalgoritmo CLUSTAL W em, por exemplo, DNAStar (Madison, Wl).
"Substancialmente purificada" se refere a uma molécula separa-da de substancialmente todas as outras moléculas normalmente associadascom esta em seu estado nativo. Mais preferencialmente, uma moléculasubstancialmente purificada é a espécie predominante presente em umapreparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais doque cerca de 60% livre, preferencialmente cerca de 75% livre, mais prefe-rencialmente cerca de 90% livre, e ainda mais preferencialmente cerca de95% livre das outras moléculas (exclusive de solvente) presentes na misturanatural. A expressão "substancialmente purificada" não pretende englobarmoléculas presentes em seu estado nativo. Preferencialmente, as moléculasde ácido nucléico e polipeptídeos desta invenção são substancialmente puri-ficados.
O termo "transformação" se refere à introdução de ácido nucléi-co em um hospedeiro receptor. O termo "hospedeiro" se refere a células debactérias, fungos, animais ou células de animais, plantas ou sementes, ouquaisquer partes ou tecidos de plantas inclusive células de plantas, proto-plastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, mudas, embri-ões, e pólen.
Conforme usado aqui, neste pedido de patente, uma "plantatransgênica" é uma planta tendo estavelmente introduzido em seu genoma,por exemplo, os genomas nucleares ou de plastídeo, um ácido nucléico exó-geno.
O termo "isogênico" como um termo comparativo entre plantasou linhagens de plantas tendo ou carecendo de um transgene significa plan-tas ou linhagens tendo os mesmos fundos genéticos ou similares, com a ex-ceção do transgene em questão. Por exemplo, as denominadas linhagensirmãs representando seleções fenotipicamente similares ou idênticas damesma população F2 matriz são consideradas como sendo "isogênicas".Quando a progênie de uma planta mutante estável são cruzadas e retrocru-zadas com as plantas da linhagem matriz não transformada por 3 a 6 gene-rações (ou mais) usando a planta matriz não transformado como a matrizrecorrente ao selecionar por tipo (genótipo por análise de marcador molecu-lar, fenótipo por observação de campo, ou ambos) e pelo transgene, a linha-gem transgênica resultante é considerada como sendo altamente "isogênica"a sua linhagem matriz não transformada.
Os termos "sementes" "núcleos" e "grão" são entendidos comosendo de signbificado equivalente. O termo núcleo é freqüentemente usadoao descrever a semente de uma planta de milho ou arroz. Em todas as plan-tas a semente é o óvulo maduro consistindo em um revestimento da semen-te, embrião, aleurona, e um endosperma.
Ácidos Nucléicos Codificando Fosfofrutoquinase e Piruvato Quinase
Esta invenção proporciona, entre outras coisas, um método parausar moléculas de ácido nucléico codificando fosfofrutoquinase (Internatio-nal Union of Biochemistry and Molecular Biology Enzyme Nomenclatureclasses EC 2.7.1.11 e EC 2.7.1.90; mais especificamente SEQ ID NOs: 1 e11) e piruvato quinase (EC 2.7.1.40; mais especificamente SEQ ID NO: 3).
Em uma modalidade, estas moléculas de ácido nucléico são u-sadas no contexto desta invenção para alterar o teor de óleo de uma semen-te em uma planta monocotiledônea.
As moléculas de ácido nucléico referidas podem ser amplifica-das usando cDNA, mRNA ou DNA genômico como um modelo e iniciadoresde oligonucleotídeos apropriados de acordo com técnicas de amplificaçãoPCR® de rotina. Alternativamente, podem ser sintetizadas usando técnicassintéticas de rotina, tais como um sintetizador de DNA automatizado.
Caso desejado, as seqüências de ácidos nucléicos que codifi-cam para fosfofrutoquinase ou piruvato quinase podem ser modificadas semalterar a seqüência de aminoácidos resultante da proteína expressada demodo que as seqüências são mais suscetíveis a expressão em hospedeirosvegetais. Uma seqüência codificante pode ser um DNA artificial. Um DNAartificial, conforme usado aqui, neste pedido de patente, significa uma molé-cula de polinucleotídeo de DNA que é não natural. Moléculas de DNA artifi-ciais podem ser designadas por uma variedade de métodos, tais como, mé-todos conhecidos na técnica que são à base de substituição do um ou maiscódons de um primeiro polinucleotídeo para criar um equivalente, ou mesmoum polinucleotídeo artificial aprimorado, de segunda geração, onde este no-vo polinucleotídeo artificial é útil para reforçar a expressão em plantas trans-gênicas. O aspecto do design freqüentemente emprega uma tabela de usode códon, a tabela é produzida compilando a freqüência de ocorrência decódons em uma coleção de seqüências codificantes isoladas de uma planta,tipo de planta, família ou gênero. Outros aspectos do design incluem reduzira ocorrência de sinais de poliadenilação, sítios de junção de íntrons, ou tre-chos longos de seqüência AT ou GC (Patente dos Estados Unidos Ne5.500.365). Seqüências codificantes de exntensão total ou fragmentos dasmesmas podem ser fabricadas de DNA artificial usando métodos de conhe-cimento daqueles versados na técnica.
Vetores e Cassetes de Expressão
Um vetor de expressão vegetal pode compreender um promotornativo ou não nativo encadeado operavelmente a uma molécula de ácidonucléico descrita acima. A seleção de promotores, por exemplo, promotoresque podem ser descritos como expressados fortemente, expressados fraca-mente, expressados indutivelmente, expressados tecido-reforçado (isto é,expressados especificamente ou preferencialmente em um tecido), expres-sados órgão-reforçado (isto é, expressados especificamente ou preferenci-almente em um órgão) e expressados desenvolvimentalmente-reforçados(isto é, expressados especificamente ou preferencialmente durante um oumais estágios de desenvolvimento em particular), está dentro do conheci-mento da técnica. Similarmente, a combinação de uma molécula de ácidonucléico conforme descrito acima com um promotor também está dentro doconhecimento da técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al., 1989).
Em uma modalidade desta invenção, uma molécula de ácidonucléico descrita acima é encadeada operavelmente a um promotor de re-forço de semente causando expressão suficiente para aumentar óleo na se-mente de uma planta monocotiledônea. Promotores da presente invençãogeralmente incluem, mas não estão limitados a, promotores que funcionamem bactérias, bacteriófagos, ou células de plantas. Promotores úteis paraexpressão bacteriana são os promotores lacZ, Sp6, T7, T5 ou E. coli glgC.Promotores úteis para células de plantas incluem o promotor de globulina(vide, por exemplo Belanger e Kriz (1991), promotor de gama zeína Z27 (vi-de, por exemplo, Lopes era/. (1995), promotor de L3 oleosina (Patente dosEstados Unidos N2 6.433.252), promotor PER1 da cevada (Stacey et ai(1996), promotor CaMV 35S (Odell et aí. (1985)), o promotor CaMV 19S(Lawton etal., 1987), nos (Ebert etal., 1987), Adh (Walker etal., 1987), sa-carose sintase (Yang et ai, 1990), actina (Wang et ai, 1992), cab (Suílivanet ai, 1989), promotor PEPCase (Hudspeth era/., 1989), ou os promotoresassociados com o complexo genético R (Chandler et ai, 1989). O promotordo Vírus do Mosaico da Escrofulária (FMV) (Richins et ai, 1987), arcelina,E8 do tomate, patatina, ubiquitina, manopina sintase (mas) e promotores detubulina são outros exemplos de promotores úteis.
Promotores expressados em milho incluem promotores de genescodificando zeínas, os quais são um grupo de proteínas de armazenamentoencontradas no endosperma do milho. Foram isolados clones genômicospara genes zeína (Pedersen etal., 1982) e Russell etal., 1997) e podem serusados os promotores destes clones, inclusive os genes de 15 kD, 16 kD, 19kD, 22 kD, e 27 kD. Outros promotores de expressão reforçada de sementeque se sebe que funcionam no milho e em outras plantas incluem os promo-tores para os seguintes genes: Waxy (amido sintase ligada a grânulo), Brittleand Shrunken 2 (ADP glicose pirofosforilase), Shrunken 1 (sacarose sinta-se), enzimas de ramificação I e II, amido sintases, enzimas de desramifica-ção, oleosinas, glutelinas, e BetH (camada de transferência de endospermabasal). Outros promotores úteis na prática da invenção que são de conheci-mento de uma pessoa versada na técnica também são contemplados pela invenção.
Além disso, reforçadores da transcrição ou duplicações de refor-çadores podem ser usados para aumetar a expressão de um promotor emparticular. Exemplos de similares reforçadores incluem, mas não estão limi-tados a, o Adh íntronl (Callis et ai, 1987), um íntron da actina do arroz(McEIroy et ai, 1991; Patente dos Estados Unidos N2 5.641.876), íntron dasacarose sintase (Vasil et ai, 1989), um íntron HSP70 do milho (tambémreferido como Zm.DnaK) (Patente dos Estados Unidos N2 5.424.412 Brown,et ai)) um elemento ômega TMV (Gallie et ai, 1999), o reforçador CaMV35S (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.359.142 e 5.196.525, McPhersonet ai) ou um reforçador da octopina sintase (Patente dos Estados Unidos Ne5.290.924, Last et ai). Toda a seqüência de DNA entre o sítio de iniciaçãode transcrição e o início da seqüência codificante, isto é, a seqüência lídernão traduzida, podem influenciar a expressão genética, também se podedesejar empregar uma seqüência líder particular. Pode ser empregada qual-quer seqüência líder disponível para uma pessoa versada na técnica. Se-qüências líder preferenciais dirigem níveis ótimos de expressão do gene fi-xado, por exemplo, aumentando ou mantendo a estabilidade do mRNA e/ouprevenindo iniciação inadequada de translação (Joshi, 1987). A escolha desimilares seqüências é a critério daqueles versados na técnica. São contem-pladas seqüências que são derivadas de genes que são altamente expres-sados em milho, arroz e monocotiledôneas em particular.
Cassetes de expressão desta invenção também incluirão umaseqüência próxima à extremidade 3' do cassete que age como um sinal paraterminar a transcrição de um ácido nucléico heterólogo e que dirige a polia-denilação do mRNA resultante. Estes são comumente referidos como regi-ões não traduzidas 3' ou 3' UTRs. Alguns elementos 3' que podem agir co-mo sinais de terminação de transcrição incluem os do gene nopalina sintasede Agrobacterium tumefaciens (Bevan et ai, 1983), uma região não traduzi-da 3' de napina (Kridl et ai, 1991), uma região não traduzida 3' de globulina(Belanger e Kriz, 1991) ou uma de um gene de zeína, tal como Z27 (Lopeset ai, 1995). Outros elementos 3' regulatórios conhecidos na técnica tam-bém podem ser usados nos vetores da invenção.
Vetores de expressão desta invenção também podem incluiruma seqüência codificando para um peptídeo de trânsito fundido à seqüên-cia de ácido nucléico heteróloga. Peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTPs)são fabricados para serem fundido ao N-término de uma proteína para dirigira proteína para dentro do cloroplasto da planta. Muitras proteínas localiza-das no cloroplasto são expressadas a partir de genes nucleares como pre-cursores e são orientadas para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito decloroplasto que é removido durante o processo de introdução. Exemplos deoutras proteínas de cloroplasto semelhantes incluem a pequena subunidade(SSU) de Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxi-dorredutase, a proteína I e proteína II do complexo de light harvesting, e tio-redoxina F. Em particular, pode ser usado o CTP do peptídeo de trânsito decoroplasto de pequena subunidade ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase deNicotiana tabacum (SSU-CTP) (Mazur, era/., 1985). Foi demonstrado in vivoe in vitro que proteínas não cloroplasto podem ser orientadas para o cloro-plasto por uso de fusões de proteína com um CTP e que uma seqüência deCTP é suficiente para orientar uma proteína para o cloroplasto. Foi demons-trado que a incorporação de um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequa-do, tal como, o EPSPS CTP de Arabidopsis thaliana (Klee et al., 1987), e oEPSPS CTP de Petunia hybrida (della-Cioppa et al., 1986) orienta seqüên-cias de proteínas EPSPS heterólogas para cloroplastos em plantas transgê-nicas.
Esta invenção adicionalmente proporciona um vetor compreen-dendo uma descrita acima molécula de ácido nucléico. Uma molécula deácido nucléico conforme descrito acima pode ser clonada em qualquer vetoradequado e pode ser usada para transformar ou transfectar qualquer hospe-deiro adequado. A seleção de vetores e métodos para construir as mesmassão conhecidas comumente na técnica e são descritas em referências datécnica geral (vide, em geral, "Recombinant DNA Part D" (1987)). O vetorpreferencialmente compreenderá seqüências regulatórias, tais como códonsde iniciação e terminação de translação e transcrição, os quais são específi-cos para o tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo, ou planta) noqual o vetor deve ser introduzido, conforme apropriado e levando em contase o vetor é DNA ou RNA.
Constructos de vetores que são circulares ou lineares podem serpreparadso para conter uma seqüência de ácido nucléico inteira conformedescrito acima ou uma porção da mesma ligada a um sistema de replicaçãofuncional em uma célula hospedeira procariótica or eucariótica. Sistemas dereplicação podem ser derivados de ColE1, 2 mu. plasmídeo, X fago, f1 fagofilamentoso, espécie Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens e A. rhizo-genes), e similares.
Além do sistema de replicação e da seqüência de ácido nucléicoinserida, o constructo pode incluir um ou mais genes marcadores que permi-tem seleção de hospedeiros transformados ou transfectados. Genes marca-dores incluem resistência a biocida, tal como resistência a antibióticos, me-tais pesados, herbicidas, e etc, complementação em um hospedeiro auxo-trófico para proporcionar prototrofia, e similares.
Esta invenção proporciona uma célula hospedeira compreen-dendo uma molécula de ácido nucléico descrita acima, opcionalmente sob aforma de um vetor. Hospedeiros adequados incluem células de plantas, bac-terianas e de levedura, inclusive Escherichia coli, Bacillus subtilis, Agrobac-terium tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae, e Neurospora crassa. Hos-pedeiros de E. coli incluem TB-1, TG-2, DH5oc, XL-Blue MRF' (Stratagene,La Jolla, CA), SA2821, Y1090 e TG02. Células de plantas incluem células demonocotiledôneas, inclusive, mas não limitadas a milho, trigo, cevada, aveia,centeio, painço, sorgo, e arroz.
Polipeptídeos
Esta invenção proporciona fosfofrutoquinases e, em alguns ca-sos, uma piruvato quinase codificada por uma molécula de ácido nucléicodescrita acima. O polipeptídeo preferencialmente compreende uma extremi-dade amino e uma extremidade carboxila. O polipeptídeo pode compreenderD-aminoácidos, L-aminoácidos ou uma mistura de D- e L-aminoácidos.
Alterações da seqüência de aminoácido nativa para produzir po-lipeptídeos variantes podem ser feitas por uma variedade de meios conheci-dos daqueles ordinariamente versados na técnica. Por exemplo, substitui-ções de aminoácidos podem ser introduzidas convenientemente nos polipep-tídeos alterando a seqüência da molécula de ácido nucléico na ocaisão dasíntese. Mutações sítio-específicas também podem ser introduzidas ligandoem um vetor de expressão um oligonucleotídeo sintetizado compreendendoa seqüência modificada. Alternativamente, podem ser usados procedimentosde mutagênese oligonucleotídeo-dirigidos, sítio-específicos, tal como descri-to em Walder et al. (1986); Bauer et ai (1985); e nas Patentes dos EstadosUnidos N2S 4.518.584 e 4.737.462.
Está dentro do conhecimento do técnico versado como selecio-nar aminoácidos sintéticos e naturais que realizam substituições conservati-vas ou neutras para quaisquer aminoácidos naturais particulares. O técnicoordinariamente versado desejavelmente considerará o contexto no qual éfeita qualquer substituição de aminoácido em particular, além de considerara hidrofobicidade ou polaridade da cadeia lateral, o tamanho geral da cadeialateral e o valor de pK de cadeias laterais com caráter acidífero ou básicosob condições fisiológicas. Por exemplo, lisina, arginina, e histidina são fre-qüentemente substituídas convenientemente uma pela outra, e mais fre-qüentemente arginina e histidina. Conforme é de conhecimento na técnica,isto porque todos os três aminoácidos têm cadeias laterais básicas, ao pas-so que o valor pK para as cadeias laterais de lisina e arginina estão muitomais próximas uma da outra (cerca de 10 e 12) do que para histidina (cercade 6). Similarmente, glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina são fre-qüentemente substituídas convenientemente uma pela outra, com a condi-ção de que glicina freqüentemente é não substituída convenientemente pe-los outros membros do grupo. Isto porque cada um destes aminoácidos érelativamente hidrofóbico quando incorporado em um polipeptídeo, mas afalta de glicinea de um carbono a possibilita os ângulos de rotação phi e psi(em torno do carbono a) portanto mais liberdade conformacional que resí-duos glicinila podem dar origem a mudanças na conformação ou estruturasecundária que não ocorrem freqüentemente quando os outros aminoácidossão substituídos uns pelos outros. Outros grupos de aminoácidos freqüen-temente substituídos convenientemente uns pelos outros incluem, mas nãoestão limitados a, o grupo consistindo em ácidos glutâmico e aspártico; ogrupo consistindo em fenilalanina, tirosina e triptofano; e o grupo consistindoem serina, treonina e, opcionalmente, tirosina. Adicionalmente, o técnico or-dinariamente versado pode prontamente agrupar aminoácidos sintéticos comaminoácidos que ocorrem naturalmente.
Caso desejado, os polipeptídeos podem ser modificados, porexemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação, ou fosforilação, ou pelacriação de sais de adição de ácido, amidas, ésteres, em particular ésteres deC-terminal, e derivados N-acila dos polipeptídeos da invenção. Os polipeptí-deos também podem ser modificados para criar derivados de proteína for-mando complexos covalentes ou não covalentes com outras porções de a-cordo com métodos de conhecimento na técnica. Complexos ligados de mo-do covalente podem ser preparados encadeando as porções químicas agrupos funcionais osbre as cadeias laterais de aminoácidos compreendendoos polipeptídeos, ou no N- ou C-término. Desejavelmente, as modificações econjugações referidas não afetam adversamente a atividade dos polipeptí-deos (e variantes dos mesmos). Enquanto semelhantes modificações e con-jugações podem ter maior ou menor atividade, a atividade desejavelmentenão é negada e é característica do polipeptídeo inalterado.
Os polipeptídeos (e fragmentos, variantes e proteínas de fusão)podem ser preparados por quaisquer de uma série de técnicas convencio-nais. O polipeptídeo pode ser isolado ou substancialmente purificado a partirde uma fonte natural ou a partir de uma fonte recombinante. Por exemplo, nocaso de proteínas recombinantes, um fragmento de DNA codificando umaproteína desejada pode ser subclonado em um vetor apropriado usando téc-nicas genéticas moleculares (vide, por exemplo, Maniatis et al., 1989) e ou-tras referências citadas aqui, neste pedido de patente, sob "EXEMPLOS"). Ofragmento pode ser transcrito e a proteína subseqüentemente traduzida invitro. Kits disponíveis comercialmente também podem ser empregados (porexemplo, tais como fabricados por Clontech, Amersham Life Sciences, Inc.,Arlington Heights, IL; Invitrogen, e similares). A reação de cadeia polimeraseopcionalmente pode ser empregada na manipulação de ácidos nucléicos.
Os polipeptídeos referidos também podem ser sintetizados u-sando um sintetizador de peptídeos automatizado de acordo com métodosde conhecimento na técnica. Alternativamente, o polipeptídeo (e fragmentos,variantes, e proteínas de fusão) podem ser sintetizados usando técnicas desintetização de peptídeos de rotina de conhecimento geral daqueles de co-nhecimento regular da técnica (por exemplo, conforme resumido em Bo-danszky, 1984)). Em particular, o polipeptídeo pode ser sintetizado usando oprocedimento de síntese de fase sólida (vide, por exemplo, Merrifield, 1963;Barany et al., 1987; e a Patente dos Estados Unidos Ns 5.424.398). Casodesejado, isto pode ser feito usando um sintetizador de peptídeos automati-zado. A remoção dos grupos de bloqueio de aminoacido t-butiloxicarbonila(t-BOC) ou 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc) e separação da proteína daresina podem ser realizados, por exemplo, por tratamento ácido em tempe-ratura reduzida. A mistura contendo polipeptídeo pode ser então extraída,por exemplo, com éter dietílico, para remover compostos orgânicos não pep-tídicos, e a proteína sintetizada pode ser extraída do pó de resina (por e-xemplo, com cerca de 25% em peso/ volume de ácido acético). Depois dasíntese do polipeptídeo, purificação adicional (por exemplo, usando HPLC)opcionalmente pode ser feita de modo a eliminar quaisquer proteínas incom-pletos, polipeptídeos, peptídeos ou aminoácidos livres. Análise de aminoáci-dos e/ou HPLC podem ser realizadas sobre o polipeptídeo sintetizado paravalidar sua identidade. Para outras aplicações de acordo com a invenção,pode ser preferencial produzir o polipeptídeo como parte de uma proteína defusão maior, quer por conjugação química, ou através de meios genéticosconhecidos na técnica. A este respeito, esta invenção também proporcionauma proteína de fusão compreendendo o polipeptídeo (ou fragmento domesmo) ou variante do mesmo e um ou mais polipeptídeos / uma ou maisproteínas diferentes tendo quaisquer propriedades desejadas ou funções efetoras.
Testes para produção e identificação de proteínas específicas sebaseiam em várias propriedades físico-químicas, estruturais, funcionais, ououtras das proteínas. Propriedades físico-químicas únicas ou estrutural per-mitem que as proteínas sejam separadas e identificadas por procedimentoseletroforéticos, tais como eletroforese por gel desnaturante ou nativo ou fo-calizador isoelétrico, ou por técnicas cromatográficas tais como cromatogra-fia de permuta iônica ou de exclusão de gel. As únicas estruturas de proteí-nas individuais oferecem oportunidades para uso de anticorpos específicospara detectar sua presença em formatos tais como um ensaio ELISA. Com-binações de abordagens podem ser usadas para obter ainda maior especifi-cidade tais como western blotting nas quais anticorpos são usados para lo-calizar produtos genéticos individuais que foram separados por técnicas ele-troforéticas. Técnicas adicionais podem ser usadas para confirmar absolu-tamente a identidade do produto de interesse tais como avaliação por se-qüenciamento de aminoácido depois de purificação. Embora estas estejamentre as mais comuns, outors procedimentos também podem ser usados.
Procedimentos de teste podem identificar a expressão de proteí-nas por sua funcionalidade, particularmente onde a proteína expressada éuma enzima capaz de catalisar reações químicas envolvendo substratos eprodutos específicos. Por exemplo, em extratos vegetais estas reações po-dem ser medidas proporcionando quantificando a perda de substratos ou aprodução de produtos das reações por procedimentos físicos e/ou químicos.
A atividade de fosfofrutoquinase ou piruvato quinase pode sermedida in vitro usando um teste similar. Exemplos de similares testes inclu-em LeBras et ai (1991) e LeBras etal. (1993). Estudos de radiotraçador me-tabólico podem medir a produção de diferentes grupos de produtos in vivo.Em semelhantes estudos, precursores radioativamente marcados são pro-porcionados para tecidos intactos e o destino da etiqueta radioativa é moni-torado à medida que o precursor é metabolizado.
Em muitos casos, a expressão de um produto genético é deter-minada avaliando os resultados fenotípicos de sua expressão. As avaliaçõesreferidas podem ser simplesmente como observações visuais, ou podemenvolver testes. Os testes refeirods podem tomar muitas formas, tais comoanalisar mudanças na composição química, morfologia, ou propriedades fisi-ológicas da planta. A composição química pode ser alterada por expressãode genes codificando enzimas ou proteínas de armazenamento que mudama composição de aminoácidos e estas mudanças podem ser detectadas poranálise de aminoácidos, ou por enzimas que mudam a quantidade de amido,que pode ser analisado por espectrometria de reflectância de infravermelhopróximo. Mudanças morfológicas podem incluir maior estatura ou caulesmais grossos.
As moléculas de ácido nucléico, vetores e polipeptídeos destainvenção podem ser usado em métodos agrícolas e vários testes de triagem.Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico pode ser usada para expres-sar fosfofrutoquinase através de um vetor em uma célula hospedeira, paradetectar mRNA codificando fosfofrutoquinase em uma amostra biológica,para detectar uma alteração genética em um gene codificando fosfofrutoqui-nase através de um Southern blot, para suprimir a fosfofrutoquinase, ou pararegular para cima a fosfofrutoquinase. Os polipeptídeos podem ser usadospara compensar deficiências na fosfofrutoquinase ou para a presença deuma fosfofrutoquinase mutada tendo atividade reduzida ou nenhuma ativida-de em uma planta, ou para tratar níveis excessivos de substratos, quer dire-tos ou indiretos, para fosfofrutoquinase em uma planta. Alternativamente, ospolipeptídeos podem ser usados para triar agentes para a capacidade paramodular sua atividade. Os anticorpos podem ser usados para detectar e iso-lar os polipeptídeos respectivos bem como reduzir a disponibilidade de simi-lares polipeptídeos in vivo.Métodos
Esta invenção proporciona um método para aumentar o óleo emuma semente de uma monocotiledônea comparada com uma semente deuma planta não transformada tendo um fundo genético similar. Em uma mo-dalidade, o método para aumentar o óleo compreende a etapa de cultivaruma planta monocotiledônea transformada com uma seqüência de ácidonucléico codificando uma fosfofrutoquinase diferente da SEQ ID NO: 9 ou 13encadeada operavelmente a um promotor de reforço de semente o qual éopcionalmente encadeado operavelmente a uma seqüência de ácido nucléi-co codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo exceto quando o promo-tor de reforço de semente é um promotor de reforço de embrião, para produ-zir semente.
Em outra modalidade, o método para aumentar o óleo compre-ende a etapa de introduzir em células da monocotiledônea uma seqüênciade ácido nucléico codificando uma fosfofrutoquinase selecionada entre ogrupo consistindo em:
a) seqüências de ácido nucléico compreendendo SEQ ID NO: 1ou 11 e
b) seqüências de ácido nucléico codificando SEQ ID NO: 2 ou 12.
Em outra modalidade, o método para aumentar o óleo compre-ende a etapa adicional de transformar a planta com uma segunda seqüênciade ácido nucléico codificando uma piruvato quinase, encadeada operavel-mente a um promotor de reforço de semente. Em ainda outra modalidade, ométodo para aumentar o óleo compreende a etapa adicional de introduzir emuma planta uma segunda seqüência de ácido nucléico codificando uma piru-vato quinase, selecionada entre o grupo consistindo em:
a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo SEQ IDNO:3e
b) uma seqüência de ácido nucléico codificando SEQ ID NO: 4.
Em várias modalidades, a planta monocotiledônea é selecionadaentre o grupo consistindo em milho {Zea mays), arroz (Oryza sativa), cevada(Hordeum vulgare), painço (Panicum miliaceum), centeio {Secale cereale),trigo (Triticum aestivum), e sorgo (Sorghum bicoloi).
Em várias modalidades, o promotor é selecionado entre o grupoconsistindo em promotores de reforço de embrião, promotores de reforço deendosperma e promotores de reforço de embrião e de endosperma.
Transformação de Plantas
Em uma modalidade da invenção, uma planta transgênica ex-pressando a proteína ou proteínas desejadas produzidas. Vários métodospara a introdução de uma seqüência de polinucleotídeo desejada codifican-do a proteína desejada em células de plantas são conhecidos na técnica,inclusive: (1) métodos físicos tais como microinjeção, eletroporação, e libe-ração mediada por micropartículas (biolística ou tecnologia de pistola de ge-nes); (2) liberação mediada por vírus; e (3) transformação mediada por A-grobacterium.
Os métodos mais comumente usados para transformação decélulas de plantas são o processo de transferência de DNA mediado porAgrobacterium e a biolística ou processo mediado por bombardeamento demicropartículas de microprojéteis. Tipicamente, é desejada transformaçãonuclear mas onde é desejável especificamente transformar plastídeos, taiscomo cloroplastos ou amiloplastos, plastídeos vegetais podem ser transfor-mados utilizando uma liberação mediada por micropartículas do polinucleotí-deo desejado.
Transformação mediada por Agrobacterium é obtida através douso de uma bactéria do solo produzida por engenharia genética pertencenteao gênero Agrobacterium. Uma série de cepas selvagens e desarmadas deAgrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes carregando plasmí-deos Ti ou Ri podem ser usadas para transferência genética em plantas.Transferência genética é feita através da transferência de um DNA específi-co conhecido como "T-DNA" que pode ser produzido por engenharia genéti-ca para carregar qualquer pedaço de DNA desejada em muitas espéciesvegetais, conforme elaborado adicionalmente, por exemplo, na Patente dosEstados Unidos N2 6.265.638 para Bidney et ai, cujas descrições são poreste incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.
Transformação genética de plantas, mediada por Agrobacterium,envolve várias etapas. A primeira etapa, na qual o Agrobacterium virulento ecélulas de plantas são primeiro trazidas em contacto umas com as outras, égeralmente denominado "inoculação". Inoculação é preferencialmente a-companhada por algum método para causar dano a parte de algumas célu-las vegetais, a qual libera constituintes celulares de plantas, tais como álcoolcumarílico, sinapinato (o qual é reduzido para acetossiringona), álcool sina-pílico, e álcool coniferílico, que ativam fatores de virulência no Agrobacteri-um. Depois da inoculação, deixa-se o Agrobacterium e células / tecidos deplantas crescerem juntos por um período de várias horas até vários dias oumais sob condições adequadas para crescimento e transferência de T-DNA.Esta etapa é denominada "co-cultura". Depois de co-cultura e liberação deT-DNA, as células de plantas são tratadas com agentes bactericidas ou bac-teriostáticos para matar o Agrobacterium remanescente em contato com oexplante e/ou no vaso contendo o explante. Se isto for feito na ausência dequaisquer agentes seletivos para promover crescimento preferencial de célu-las de plantas transgênicas versus não transgênicas, então isto é tipicamen-te referido como a etapa de "atraso". Se feito na presença de pressão seleti-va favorecendo células de plantas transgênicas, então é referido como umaetapa de "seleção". Quando se usa um "atraso", tipicamente é seguido poruma ou mais etapas de "seleção".
Com respeito a bombardeamento de micropartículas (Patentedos Estados Unidos N- 5.550.318 (Adams et aí.); Patente dos Estados Uni-dos N2 5.538.880 (Lundquist et. ai), Patente dos Estados Unidos N25.610.042 (Chang et ai.); e Publicação de Patente Internacional PCT N2 WO95/06128 (Adams et ai); cada uma das quais é especificamente incorporadaaqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade),partículas microscópicas são revestidas com ácidos nucleicos e liberadasnas células por uma força propelente. Partículas típicas incluem as que con-sistem de tungstênio, platina, e preferencialmente, ouro.
Uma modalidade ilustrativa de um método para liberar DNA emcélulas de plantas por aceleração é o sistema de liberação de partículas bio-lístico (Biolistics Particle Delivery System, BioRad, Hercules, CA), o qual po-de ser usado para impulsionar partículas revestidas com DNA ou célulasatravés de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou Nytex, para so-bre uma superfície de filtro coberta com células de plantas monocotiledô-neas cultivadas em suspensão.
Técnicas de bombardeamento de micropartículas são ampla-mente aplicáveis, e podem ser usadas para transformar virtualmente qual-quer espécie vegetal. Exemplos de espécies que foram transformadas porbombardeamento de micropartículas incluem espécies monocotiledôneastais como milho (Publicação de Patente Internacional N2 WO 95/06128 (A-dams et ai)), cevada, trigo (Patente dos Estados Unidos N2 5.563.055(Townsend et ai) incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio dereferência em sua totalidade), arroz, aveia, centeio, cana-de-açúcar, e sor-go; bem como uma série de dicotiledôneas inclusive tabaco, soja (Patentedos Estados Unidos N2 5.322.783 (Tomes et ai), incorporada aqui, a estepedido de patente, por meio de referência em sua totalidade), girassol, a-mendoim, algodão, tomate, e legumes em geral (Patente dos Estados Uni-dos N- 5.563.055 (Townsend et ai) incorporada aqui, a este pedido de pa-tente, por meio de referência em sua totalidade).
Para selecionar ou classificar para células de plantas transfor-madas independente da metodologia de transformação, o DNA introduzidona célula contém um gene que funciona em um tecido de planta regenerávelpara produzir um composto que confere ao tecido da planta resistência a umcomposto tóxico de modo diverso. Genes de interesse para uso como ummarcador selecionável, triável, ou classificável incluiriam mas não estão limi-tados a beta-glucuronidase (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), lucife-rase (LUX), genes de tolerância a antibiótico ou herbicida. Exemplos de ge-nes de resistência a antibiótico incluem as penicilinas, canamicina (e neomi-cina, G418, bleomicina); metotrexato (e trimetoprim); cloranfenicol; canami-cina e tetraciclina. Moléculas de polinucleotídeo codificando proteínas envol-vidas em tolerância a herbicida são de conhecimento na técnica, e incluem,mas não estão limitadas a, uma molécula de polinucleotídeo codificando 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) descrita na Patente dos Es-tados Unidos N2 5.627.061 (Barry, et ai), na Patente dos Estados Unidos N25.633.435 (Barry, et ai), e na Patente dos Estados Unidos N2 6.040.497(Spencer, et ai) e aroA descrita na Patente dos Estados Unidos N25.094.945 (Cornai) para tolerância a glifosato; uma molécula de polinucleotí-deo codificando bromoxinil nitrilase (Bxn) descrita na Patente dos EstadosUnidos N2 4.810.648 (Duerrschnabel, et ai) para tolerância a Bromoxinila;uma molécula de polinucleotídeo codificando fitoeno dessaturase (crtl) des-crita em Misawa et ai (1993) e Misawa et ai (1994) para tolerância a norflu-razon; uma molécula de polinucleotídeo codificando acetoidroxiácido sintase(AHAS, aka ALS) descrita em Sathasiivan et ai (1990) tolerância a herbici-das de sulfoniluréia; e tanto o gene PAT descrito em Wohlleben et ai (1988)quanto o gene bar descrito em DeBlock et ai (1987) cada um dos quais pro-porciona tolerância a glufosinato e bialafos.
A regeração, desenvolvimento, e cultivo de plantas de váriosexplantes transformados estão bem-documentados na técnica. Este proces-so de regeração e crescimento tipicamente inclui as etapas de selecionarcélulas transformadas e cultivar estas células individualizadas através dosestágios usuais de desenvolvimento embrionário através do estágio de plan-tinha com raízes. Embriões transgênicos e sementes são regenerados demodo semelhante. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depoisdisso plantados em um meio de crescimento de planta apropriado tal comosolo. Células que sobrevivem à exposição do agente seletivo, ou células queforam classificadas positivas em uma prova de triagem, podem ser cultiva-das em meio que suporta regeração de plantas. Plantinhas em desenvolvi-mento são transferidas para solo menos mistura de crescimento de planta, eamolecidas, antes de transferência para uma estufa ou câmara de cresci-mento para maturação.
Esta invenção podem ser usada com qualquer célula ou tecidotransformável. Por transformável conforme usado aqui, neste pedido de pa-tente, se indica uma célula ou tecido que é capaz de propagação adicionalpara dar origem a uma planta. Os versados na técnica reconhecem que umasérie de células ou tecidos de plantas são transformaveis nos quais depoisde inserção de DNA exógenos e condições de cultura apropriadas as célulasou tecidos da planta podem formar em uma planta diferenciada. Tecido ade-quado para estes fins pode incluir mas não está limitado a embriões imatu-ros, tecido escutelar, culturas celulares em suspensão, inflorescência imatu-ra, meristema do broto, explantes nodais, tecido de calo, tecido hipocotil,cotilédones, raízes, e folhas. A patente de Tomes et al. '783, citada acima,descreve um método para tratamento com uma citocinina seguido por incu-bação por um período suficiente para permitir que células indiferenciadas emtecido de nó cotiledonar diferenciem em células meristemáticas e para per-mitir que as células entrem nas fases entre as fases G1 e de divisão de de-senvolvimento, a qual foi determinado que melhora a suscetibilidade paratransformação.
Pode ser usado qualquer meio de cultura vegetal adequado.Meios adequados incluem mas não estão limitados a meios à base de MS(Murashige and Skoog, 1962) ou meios à base de N6 (Chu et al., 1975) su-plementado com reguladores de crescimento de plantas adicionais incluindomas não estão limitados a auxinas, citocininas, ABA, e giberelinas. Os ver-sados na técnica são familiarizados com a variedade de meios de cultura detecido, os quais, quando suplementados adequadamente, suportam o cres-cimento e o desenvolvimento de tecido de plantas e são adequados paratransformação e regeração de plantas. Estes meios de cultura de tecido po-dem ou ser adquiridos como uma preparação comercial, ou preparados porencomenda e modificados. Os versados na técnica estão cientes de quemeios e suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores do cres-cimento para uso em transformação e regeração e outras condições de cul-tura tais como intensidade da luz durante a incubação, pH, e temperaturasde incubação que podem ser otimizadas para a variedade de interesse emparticular.
Depois de um cassete de expressão ser estavelmente incorpo-rado em plantas transgênicas e confirmado que é operável, pode ser intro-duzido em outras plantas da mesma espécie ou em outra espécie sexual-mente compatível por cruzamento sexual. Pode ser usada qualquer uma deuma série de técnicas de reprodução de rotina, dependendo da espécie aser cruzada.
Sementes, Farinha, Óleo e Produtos Compreendendo Sementes, Farinha eÓleo
Esta invenção também proporciona um recipiente de mais decerca de 1000, mais preferencialmente cerca de 20.000, e ainda mais prefe-rencialmente cerca de 40.000 sementes onde mais de cerca de 10%, maispreferencialmente cerca de 25%, mais preferencialmente cerca de 50%, eainda mais preferencialmente cerca de 75% ou mais preferencialmente cer-ca de 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta desta in-venção.
Esta invenção também proporciona um recipiente de mais decerca de 10 kg, mais preferencialmente cerca de 25 kg, e ainda mais prefe-rencialmente cerca de 50 kg sementes onde mais de cerca de 10%, maispreferencialmente cerca de 25%, mais preferencialmente cerca de 50%, eainda mais preferencialmente cerca de 75% or mais preferencialmente cercade 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta desta inven-ção.
Quaisquer das plantas ou partes das mesmas desta invençãopodem ser colhidas e, opcionalmente, processadas para produzir uma pre-paração de ração, farinha, ou óleo. Uma parte de planta particularmente pre-ferencial para este fim é grão colhido, mas outras partes de plantas podemser colhidas e usadas para forragem ou silagem. Em uma modalidade a pre-paração de ração, farinha, ou óleo é formulada para animais ruminantes. Emsemelhantes formulações, o teor de óleo aumentado em grão e farinha per-mitido por esta invenção proporciona "bypass fat" que é especialmente útilpara proporconar aumento da ingestão calórica para vacas da indústria lei-teira depois de partos com menor risco de acidose. Métodos para produzirpreparações de ração, farinha, e óleo são conhecidos na técnica. Vide, porexemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.957.748; 5.100.679;5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227. O grão ou farinhadesta invenção podem ser combinados com outros grãos ou farinhas. Emuma modalidade, a farinha produzida a partir de grão colhido desta invençãoou produzida por um método para esta invenção constitui mais de cerca de0,5%, cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 25%, cerca de50%, cerca de 75%, ou cerca de 90% por volume ou peso do componentede farinha de qualquer produto. Em outra modalidade, a preparação de fari-nha pode ser combinada e pode constituir mais de cerca de 10%, cerca de25%, cerca de 35%, cerca de 50%, ou cerca de 75% da combinação por vo-lume.
O óleo de milho e/ou farinha de milho produzidos de acordo comesta invenção podem ser combinados com uma variedade de outros ingredi-entes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto serão determi-nados de acordo com o principal uso do produto. Produtos típicos incluemração animal, matéria-prima para modificação química, plástico biodegradá-vel, produto alimentar combinado, óleo comestível, óleo de cozinha, lubrifi-cante, biodiesel, lanche, cosméticos, e matéria-prima de processo de fer-mentação. Produtos incorporando a farinha descritos aqui, neste pedido depatente, também incluem rações completas ou parcialmente completas parasuíno, aves domésticas, e gado vacuum, alimentos para animais de estima-ção, e produtos de alimentos humanos tais como lanches extrusados, pães,como um agente ligante alimentar, rações para aquacultura, misturas fer-mentáveis, suplementos alimentares, bebidas desportivas, barras de alimen-tos nutricionais, suplementos multivitaminas, bebidas de dieta, e alimentosde cereais.
A farinha de milho é opcionalmente submetida a métodos con-vencionais de separação dos componentes de amido e proteína. Os méto-dos referidos incluem, por exemplo, processos de moagem a seco, de moa-gem a úmido, de bombeamento de alta pressão, ou criogênicos. Estes e ou-tros processos adequados são descritos em Watson (1987), cuja descrição épor este incorporada por meio de referência.
Outros grãos de monocotilefôneas desta invenção, inclusive tri-go, cevada, sorgo e arroz podem ser similarmente processados ou moídospara produzir rações, polvilhos, amidos, farinhas, xaropes, produtos de cere-ais e bebidas fermentadas de conhecimento geral na técnica.
Esta invenção é descrito adicionalmente no contexto dos exem-plos seguintes. Estes exemplos servem para ilustrar adicionalmente estainvenção e não se pretende que limitem o âmbito da invenção.
Exemplos
Os versados na técnica reconhecerão que muitas vantagens dosmétodos e composições proporcionados pela presente invenção. Os exem-plos seguintes são incluídos para demonstrar modalidades da invenção. De-ve ser reconhecido por aqueles versados na técnica que as técnicas descri-tas nos exemplos que se seguem representam técnicas descrições pelosinventores para funcionarem bem na prática da invenção. No entanto, osversados na arte, à luz da presente descrição, reconhecerão que muitas al-terações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas eainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e do âm-bito da invenção. Todas as referências citadas aqui, neste pedido de paten-te, são incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referênciana medida que suplementam, explicam, proporcionam um pano de fundopara, ou ensinam metodologia, técnicas, ou composições empregadas aqui,neste pedido de patente.
Exemplo 1
Clonagem dos Genes pfk e pyk de Lactobacillus Delbreuckii SubespéciesBulgaricus
Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus (ATCC cepa 11842)foi obtido da ATCC (Manassas, VA) e foi cultivado em caldo ATCC 416. Ogene de L. delbreuckii subsp. bulgaricus pfk foi amplificado por PCR® comoum produto de 967 bp a partir de uma al/quota de cultura Visada usando uminiciador 5' (Oligo. n2 17166) (SEQ ID NO: 5) para introduz/r um sítio de clo-nagem Asei a montante da fase de leitura aberta pfk (ORF) e um iniciador3'(Oligo. n- 17167) (SEQ ID NO: 6) para introduzir um sítio de clonagem Sbfllogo a jusante da ORF. Similarmente, o gene pyk foi amplificado por PCR®como um produto de 1777 bp a partir de uma alíquota da cultura lisada u-sando um iniciador 5' (Oligo. n2 17168) (SEQ ID NO: 7) para introduzir umsítio de clonagem Asei logo a montante da ORF pyk e um iniciador 3' (Oligo.n2 17169) (SEQ ID NO: 8) para introduzir um sítio de clonagem Sbfl a jusan-te da ORF. Os produtos de PCR pfk e pyk foram cada clonados em pCR2.1por clonagem Topo TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os clones foram triadospara o inserto apropriado por PCR® usando os oligos previamente descritos.Clones que foram PCR-positivos para os genes pfk ou pyk foram verificadospor análise de restrição para confirmar a presença dos sítios de clonagemWanqueantes introduzidos por PCR® e em seguida por seqüenclamento. Afigura 1 mostra um alinhamento da seqüência codificante do gene pfk (SEQID NO: 1) isolado de Lactobacillus delbreuckii subespécie bulgaricus ATCCcepa 11842 com a seqüência do gene pfk publicada (EMBL n2 de acessoX71403). Houve uma diferença entre a seqüência obtida acima e a seqüên-cia publicada; a seqüência publicada tem uma A no resítuo codificante 261enquanto o gene isolado conforme descrito acima tem uma G nesta posição.O alinhamento das seqüências de proteína PFK prewsías (por exemplo,SEQ ID NO: 2) revelou que eram Idênticas. A seqüência de DNA do Lacto-bacillus delbreuckii subespéc/e bulgaricus gene pyk (SEQ ID NO: 3) tambémfoi obtida e foi idêntica à seqüência publicada (EMBL nfi de acesso X71403 ).Portanto a seqüência de proteína prevista (SEQ ID NO: 4) foi idêntica à se-qüência de proteína PYK prevista publicada.
Tabela 1
Oligo. ^17166 5' AGGCGCGCCACCATGAAACGGATTGGT 3' (SEQ ID NO: 5)Oligo. rf 17167 5' CGCCTGCAGGCTATCTTGATAAATCTG 3' (SEQ ID NO: 6)Oligo. rf 17168 5' AGGCGCGCCACCATGAAAAAAACAAAG 3' (SEQ ID NO: 7)Oligo. rf 17169 5' CGCCTGCAGGTTACAGGTTTGAAAC 3' (SEQ ID NO: 8)
Exemplo 2
Construção de Vetores de Transformação Orientados por EmbriãoPMON72008
O gene de 967 bp Asc\/Sbft pfk descrito no Exemplo 1 foi clona-do nos sítios /4scl/Sse8387l a jusante das seqüências de promotor de L3oleosina do milho (P-Zm.L3) e íntron de actina do arroz (l-Os.Act) no vetorde transformação binaria de E. coli/Agrobacterium tumefaciens pMON71055para formar pMON72004. Similarmente, o de gene 1777 bp Asci/Sbfi pykdescrito no Exemplo 1 foi clonado nos sítios >Asd/Sse8387l a jusante dasseqüências P-Zm.L3 e l-Os.Act no vetor de transformação binaria de E. coli/A.tumefaciens pMON71055 para formar pMON72005. O constructo genéticoduplo pfk/pyk (pMON72008) foi preparado isolando um fragmento PmeMXbaide 7165 bp de pMON72004 contendo o cassete pfk, cegando o fragmentousando Pfu polimerase, e em seguida clonando o fragmento de extremidadecega no sítio Pme\ de pMON72005. O constructo final, pMON72008 (figura2) foi confirmado por análise de restrição e seqüenciamento de DNA.
PMON79823
O Pme\IXba\ de 3616 bp de pMON72004 foi usado para substi-tuir o fragmento Pme\IXba\ de 2145 bp do vetor de expressão do germepMON71273 para fabricar pMON79823 (figura 3), contendo o gene pfk orien-tado por P-Zm.L3 com o l-Os.Act.PMON79824
O Pmel/Xbal de 4426 bp de pMON72005 foi usado para substi-tuir o fragmento Pme\/Xba\ de 2145 bp do vetor de expressão do germepMON71273 para fabricar pMON79824 (figura 4), contendo o gene pyk ori-entado por P-Zm.L3 com o l-Os.Act.
PMON79827
O fragmento Pme\IKsp\ de 6809 bp de pMON79824 foi usadopara substituir o fragmento Sma\IKsp\ de 2358 bp de pMON79823 para fa-bricar pMON79827 (figura 5) contendo os genes pfk e pyk, cada um orienta-do por P-Zm.L3 com o l-Os.Act.
Exemplo 3
Construção de vetores orientados por endospermaPMON72028
O gene AscUSbfl pfkàe 967 bp descrito no Exemplo 1 acima foiclonado nos sítios /4sd/Sse8387l a jusante das seqüências de promotor deZea mays Z27 (P-Zm.Z27) e do íntron de Z. mays Hsp70 (l-Zm.DnaK) empMON68203 para fabricar pMON72012. Similarmente, o gene Asd/Sbfi pykàeMil bp descrito no Exemplo 1 acima foi clonado nos sítios /\scl/Sse8387l ajusante das seqüências P-Zm.Z27 e l-Zm.DnaK em pMON68203 para fabri-car pMON72013. O vetor para co-expressão dos genes pfke py/cfoi prepa-rado isolando o fragmento Pme\IEcdR\ de 3256 bp contendo o cassete deexpressão pfk de pMON72012, cegando a extremidade do fragmento comPfu polimerase, e clonando o mesmo no sítio Pmel de pMON72013 (figura 5)para dar pMON72015. Para melhorar a estabilidade do vetor pfk/pyk durantetransformação de A. tumefaciens, o número de elementos repetitivos foi re-duzido substituindo o fragmento da espinha dorsal do vetor Pme\/EcoR\ de7318 bp de pMON72015 com o fragmento da espinha dorsal do vetorPmeUEcoR\ de 5496 bp de pMON72021 para gerar o vetor de transformaçãode duplo gene final pMON72028 (figura 6).
PMON79832:
O gene A/o/l/Sse8387í pfk de 973 bp descrito no Exemplo 1 aci-ma foi clonado nos sítios Ssp120l/Sse8387l a jusante das seqüências P-Zm.Z27 e 1-Zm.DnaK em pMON71274 para fabricar pMON79832 (figura 7),contendo o gene pfk orientado por P-Zm.Z27 com o l-Zm.DnaK.
PMON81470:
O gene A/ofl/Sse8387l pyk de 1783 bp descrito no Exemplo 1acima foi clonado nos sítios /Vo/l/Sse8387l de pMON71274 a jusante dasseqüências P-Zm.Z27 e l-Zm.DnaK. O cassete do gene pyk do vetor resul-tante foi em seguida cortado com AscVSrfl e ligado nos sítios Mlu\ISrí\ depMON79832 descritos acima para fabricar pMON81470 (figura 8), contendoos genes pfke pyk, cada um orientado por P-Zm.Z27 com o I- Zm.DnaK.
PMON72029
O fragmento de DNA >4scl/Sse8387l de 1199 bp contendo o pep-tídeo de trânsito de coroplasto de pequena subunidade de Nicotiana taba-cum (SSU-CTP) fundido ao gene pfk de pMON72006 foi clonado nos sítios>4scl/Sse8387l de pMON68203 para formar pMON72017. Similarmente, ofragmento /4sd/Sse8387l de 2041 bp contendo o SSU-CTP de N. tabacumfundido ao gene pyk de pMON72007 foi clonado nos sítios >4scl/Sse8387l depMON68203 para formar pMON72019. O vetor para co-expressão dos genespfk e pyk foi preparado isolando o fragmento de DNA Pme\/EcoR\ de 3204 bpcontendo o cassete de expressão pfkúe pMON72017, cegando a extremidadedo fragmento com Pfu polimerase, e clonando o mesmo no sítio Pme\ depMON72019 para dar pMON72020. Para melhorar a estabilidade deste vetorde duplo gene pfk/pyk durante transformação de Agrobacterium tumefaciens, onúmero de elementos repetitivos foi reduzido substituindo o fragmento daespinha dorsal do vetor Pme\/EcoR\ de 7135 bp de pMON72020 com o fragmen-to da espinha dorsal do vetor Pme\/EcoR\ de 5496 bp de pMON72021 para ge-rar o vetor de transformação de duplo gene final pMON72029 (figura 9).
PMON83715
O fragmento de DNA A/oíl/Sse8387l de 1,2 kb de pMON72017contendo o peptídeo de trânsito de coroplasto de pequena subunidade deNicotiana tabacum (SSU-CTP) fundido ao gene pfk foi clonado nos sítiosA/o/l/Sse8387l do plasmídeo de seleção de glifosato pMON93102 a jusantedo promotor de Zea mays Z27 (P-Zm.Z27) e íntron de Z. mays Hsp70 (I-Zm.DnaK) para fabricar pMON83715 (figura 10).
Exemplo 4
Transformação de Milho
Linhagens de milho de elite (Corn States Hybrid Serv., LLC, DesMoines, IA) são usadas para transformação em conformidade com esta in-venção. Estas incluem LH59 (transformada com pMON72008, pMON72028,pMON72029), LH172 (transformada com pMON72008, pMON72028), e LH244(transformada com pMON79823, pMON79824, pMON79827, pMON79832,pMON81470). Explantes transformados são obtidos através de transforma-ção mediada por Agrobacterium tumefaciens para todos os constructos ex-ceto por pMON72029, o qual é obtido através de bombardeamento de mi-cropartículas. As plantas são regeneradas de tecido transformado. As plan-tas cultivadas em estufa são em seguida analisadas por níveis de expressãode gene de interesse bem como níveis de óleo e proteína.
Exemplo 5
Análise de Constructos PFK e PK Orientados por Citosol Expressados porEndosperma
PMON72028
O constructo pMON72028 foi designado para produzir expressãoorientada pelo citosol de ambos os genes pfk e pyk no endosperma. Núcleosmaduros da primeira geração foram analisados por PCR® para os transge-nes pfk e pyk. Sessenta e sete eventos foram analisados por RMN de núcleoúnico e PCR®. 64 eventos foram PCR-positivos para o transgene pyk e 7destes também foram positivos para o transgene pfk. Dois eventos contendoambos os genes demonstraram núcleos PCR-positivos que foram estatisti-camente maiores nos níveis de óleo do núcleo inteiro por comparação comos núcleos PCR-negativos (aumento máximo de 0,73%, P = 0,05).
Os 7 eventos que foram positivos para ambos os transgenesforam plantados no campo. Análise do óleo por NIT (transmitância próximaao infravermelho) revelou que para 3 eventos houve uma diferença significa-tiva na percentagem média de óleo do núcleo inteiro para os núcleos reuni-dos das espigas segregantes canamicina-positivas e -negativas. Estes even-tos, 62221, 71907 e 73131, tiveram aumentos estatisticamente significativosnos níveis de óleo nas espigas positivas (1,2%, 0,8%, 0,5%, P = 0,05) res-pectivamente. Os níveis de óleo estavam elevados nos 4 eventos restantesque se sabia que continham ambos os transgenes, mas a elevação não foisignificativa em P = 0,05.
Cinco eventos do construct pMON72028 contendo ambos ostransgenes pfk e pyk e seus segregantes negativos foram cruzados paradois verificadores diferentes. O primeiro verificador foi uma procriação porendogamia de caule firme convencional e o segundo foi um verificador decaule firme com um feótipo de alto teor de óleo (7,5% de óleo per se). Assementes híbridas F1 foram plantadas em 6 localizações em um design queresultou em separação de linhagens portando o transgene das linhagenssem um transgene para uma faixa de híbridos estéreis machos. Os registrosforam randomizados diferentemente em cada localização. Seis espigas fo-ram colhidas manualmente do centro de cada lote, foram debulhadas, e osnúcleos foram analisados para óleo, proteína e amido por transmitância in-fravermelho próximo (NIT). A percentagem de óleo estava aumentada emtodos os 5 eventos de +0,5% a +1,1% com ambos os verificadores(p<0,005).
PMON79832, F1
Análise do óleo por RMN sobre núcleos F1 de 26 eventos depMON79832 em LH244 revelou que os núcleos PCR-positivos pfk de 9 dos26 eventos testados foram significativamente (P = 0,05) maiores na percen-tagem de óleo do núcleo inteiro, com um aumento máximo de 0,95%. Consi-derando todos os eventos juntos, teste T de students revelou que a percen-tagem média de óleo do núcleo para os núcleos PCR-positivos (3,85%) foisignificativamente maior (0,19%) (P<0,0001) do que a média para os nú-cleos PCR-negativos (3,66%). Análise do tecido de endosperma dissecadorevelou que os núcleos PCR-positivos de 8 dos eventos tiveram significati-vamente (P = 0,05) maior percentagem de óleo no endosperma do que osnúcleos negativos (aumento máximo de 0,48%) e 7 eventos tiveram óleo noendosperma total significativamente (P = 0,05) maior em uma base de mg/núcleo (aumento máximo de 0,48 mg/ núcleo) apesar do fato de que o pesoa seco do endosperma total foi significativamente (P = 0,05) reduzido (redu-ção média de 8 mg/ núcleo, redução máxima de 41 mg/ núcleo).
PMON81470. F1
Análise do óleo por RMN sobre núcleos F1 de 20 eventos depMON79832 em LH244 revelou que os núcleos PCR-positivos pfk de 9 dos20 eventos eram significativamente (P = 0,05) maiores em percentagem deóleo do núcleo inteiro, com um aumento máximo de 1,1%. Considerandotodos os eventos juntos, teste T de students revelou que a percentagem mé-dia de óleo do núcleo para os núcleos PCR-positivos (4,47%) foi significati-vamente maior (0,4%, P<0,0001) do que a média para os núcleos negativos(4,07%). Análise do tecido do endosperma dissecado revelou que os núcleosPCR-positivos de 9 dos eventos tiveram percentagem de óleo do endosper-ma significativamente (P = 0,05) maior do que os núcleos negativos (aumen-to médio de 0,3%, aumento máximo de 0,62%) e 6 eventos tiveram óleo doendosperma total significativamente maior em uma base de mg/ núcleo (au-mento médio, 0,28 mg/ núcleo; aumento máximo, 0,48 mg/ núcleo) (P =0,05) apesar do fato de que o peso a seco do endosperma total foi significa-tivamente reduzido (redução média 30 mg/ núcleo) (P = 0,05). Comparandoestes dados com os dados do constructo pfk separado (pMON79832) pareceque a magnitude da diferença do óleo é maior com o constructo de duplogene pMON81470 e que há uma maior freqüência de eventos com um au-mento nos níveis de óleo.
Exemplo 6
Análise de constructo Orientado por Plastídeo Expressado por Endosperma
O constructo pMON72029 foi designado para produzir expressãoorientada por plastídeo de ambos os genes pfk e pyk no endosperma de mi-lho. Cruzamentos recíprocos foram realizados entre as plantas transgênicascontendo pMON72029 e LH59 não transgênico e núcleos maturos foramcolhidos de 62 eventos separados.
Análise de núcleo único revelou que a concentração média deóleo do endosperma estava significativamente aumentada em 9 dos 13 e-ventos que se viu que continham ambos os transgenes por PCFr (aumentomédio de 0,94%, aumento máximo de 1,7%, P = 0,05). Nenhum dos 3 even-tos que continha somente o gene pyk tinha percentagem elevada de óleo noendosperma. Em termos de percentagem de óleo do núcleo inteiro, 10 dos13 eventos que continham ambos os transgenes tinham percentagem deóleo do núcleo inteiro significantivamente (P = 0,05) aumentada (aumentomédio de 1,75%, aumento máximo de 2,9%). Em termos da quantidade ab-soluta de óleo / núcleo, 4 dos 13 eventos com ambos os genes tinha mili-gramas de óleo / núcleo significativamente (P = 0,05) aumentado (aumentomédio de 1,5 mg/ núcleo, aumento máximo de 2,5 mg/ núcleo).
Exemplo 7
Análise de Constructos PFK e PK Orientados por Citosol e Germe-ExpressadosPMON79823, F1
Análise por RMN dos níveis de óleo nos núcleos F1 PCR-positivose -negativos de gene pfk dissecados para 20 eventos de pMON79823 revelouque 7 dos 20 eventos analisados tinha percentagem de óleo do germe signi-ficativamente (P = 0,05) maior nos núcleos positivos (aumento médio de1,7%, aumento máximo de 5,8%). Além disso, 7 eventos tinham percenta-gem de óleo do endosperma significativamente maior (P = 0,05) nos núcleospositivos (aumento médio de 0,14%, aumento máximo de 0,34%), 4 dosquais eram os mesmos eventos que tiveram a percentagem de aumento doóleo do germe.
PMON79824, F1
Análise do óleo por RMN dos núcleos F1 PCR-positivos e -negativos de gene pyk para 24 eventos de pMON79824 revelou que a per-centagem de óleo do germe foi inalterada em todos exceto 1 dos eventos e,similarmente, a percentagem de óleo do núcleo inteiro foi inalterada em to-dos exceto 1 evento diferente. Uma freqüência de 1/24 para eventos comníveis de óleo alterado foi não mais do que pode ser esperada por variaçãoaleatória. Portanto, pareceu que o transgene pyk sozinho sob estas condi-ções não afetou os níveis de óleo.PMON79827, F1
Os eventos pfk/pyk foram primeiro triados para o transgene pfk.Análise do óleo por RMN dos núcleos F1 PCR-positivos e negativos do genepfk para 24 eventos de pMON79827 revelaram que 10 dos 20 eventos ti-nham percentagem de óleo do germe significativamente aumentado (P =0,05) (aumento médio de 2,23%, aumento máximo de 5,39%). Além disso,apesar do promotor ser germe-reforçado, a percentagem de óleo do endos-perma estava aumentada em 5 eventos dos 20.
PMON72008
O constructo pMON72008 foi transformado na variedade de eliteLH172. Comparação do teste T de Student da percentagem média de óleodo germe determinada por análise RMN de tecido de germe maduro disse-cado de 32 eventos revelou que a média de todos os núcleos PCR-positivosdo gene pfk através de todos os eventos foi maior do que a média para osnúcleos negativos por um valor absoluto de 2,59 % e esta diferença foi esta-tisticamente significativa (p = 0,05). O aumento máximo visto foi de 3,5%. Amédia da percentagem de % óleo do núcleo total para os núcleos PCR-positivos do gene pfk através de todos os eventos (2,89%) foi ligeiramentemenor do que a média para os núcleos negativos (3,01%) embora esta dife-rença não fosse significativa em P = 0,05.
Embora a expressão dos transgenes fosse orientada pelo pro-motor de L3 oleosina, o qual é expressado no tecido germe preferencialmen-te, houve um aumento pequeno mas estatisticamente significativo na per-centagem média de óleo do endosperma através de todos os eventos paraos núcleos PCR-positivos do gene pfk comparados com os núcleos negati-vos (aumento médio de 0,07%, aumento máximo de 0,24%).
Análise da expressão de transgene adicional para os genes pfke pyk nos núcleos em desenvolvimento de eventos pMON72008 foi conduzi-da tanto por análise Western blotting para testar para expressão de proteínaquanto por testes enzimáticos. A análise Western blotting revelou que todosos 30 dos eventos PCR-positivos do gene pfk\o\ considerado expressando aproteína PK, enquanto foi visto que 29 dos 30 expressam a proteína PFK. Aproteína PK foi sempre expressada em um maior nível do que a proteínaPFK. Os resultados da atividade enzimática estão bem de acordo com osresultados da expressão protéica da análise western blot. A elevação na ati-vidade de PK foi maior do que a elevação na atividade de PFK, de acordocom os resultados da expressão protéica.
Exemplo 8
Construção de Vetores de Transformação Expressando Fosfofrutoquinasede Propionibacterium Freudenreichii
São gerados constructos semente-específicos adicionais expres-sando a fosfofrutoquinase de Propionibacterium freudenreichii. Para expres-são citosólica no endosperma, o gene pfk de P. freudenreichii (Genbank n-de acesso M67447) (SEQ ID NO: 11) é amplificado e é clonado a jusante dopromotor Z27 da zeína do milho opcionalmente seguido pelo íntron DnaK domilho como um reforçador em um vetor designado para transformação domilho. Para expressão plastidial no endosperma, o gene pffcde P. freudenre-ichii (SEQ ID NO: 11) é amplificado e é clonado a jusante do promotor Z27da zeína do milho seguido pelo SSU CTP do N. tabacum fundido ao genepfk em um vetor designado para transformação do milho. Para expressãocitosólica no germe, o gene pfk de P. freudenreichii (SEQ ID NO: 11) é am-plificado e é clonado a jusante do promotor PER1 da cevada opcionalmenteseguido pelo íntron DnaK do milho como um reforçador em um vetor desig-nado para transformação do milho. Explantes mutantes são obtidos atravésde transformação para todos os constructos. As plantas são regeneradas apartir de tecido transformado. As plantas cultivadas em estufa são em segui-da analisadas para níveis de expressão de genes de interesse bem comoníveis de óleo e proteína.
Todas as composições e métodos descritos e reivindicados aqui,neste pedido de patente, podem ser preparados e executados sem indevidaexperimentação à luz da presente descrição. Apesar das composições e mé-todos desta invenção terem sido descritos em termos das modalidades ilus-trativas precedentes, será evidente para os versados na téncica que varia-ções, mudanças, modificações, e alterações podem ser aplicadas à compo-sição, aos métodos, e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodosdescritos aqui, neste pedido de patente, sem se afastar do verdadeiro con-ceito, espírito, e âmbito da invenção. Mais especificamente, será evidenteque alguns agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamenterelacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, nestepedido de patente, enquanto os mesmos resultados ou similares seriam ob-tidos. Todos os referidos substitutos similares e modificações evidentes paraos versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito,âmbito, e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações ane-xadas.Listagem de Referências
As seguintes referências, na medida que proporcionam detalhesde procedimentos típicos ou outros suplementares aos estipulados aqui,neste pedido de patente, são especificamente incorporadas aqui, a este pe-dido de patente, por meio de referência.
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<210> 1<211> 960<212> DNA
<213> Lactobacillus delbrueckii<400> 1
atgaaacgga ttggtatttt gactagcggc ggtgacgccc ctggtatgaa tgcagccgta 60
agagccgtaa ccagagtcgc gatcgcgaac ggtttggaag ttttcggtat cagatacggt 120
tttgcaggtt tggttgcggg cgacattttc ccattggaaa gtgaagacgt agcccacttg 180
atcaatgttt ccggtacctt cctctactct gcgcgttatc ctgaatttgc agaagaagaa 240
ggacagctgg ctggtattga acaattgaag aagcacggca tcgatgctgt tgtcgttatt 300
ggtggggatg gttcctacca tggcgccctg cagctgaccc gccacggctt caactcaatt 3 60
ggcctgccag gcacgatcga caacgatatc ccttacacgg atgccacgat cggctatgac 420
acggcctgca tgacggcaat ggacgcgatc gacaagatcc gtgacactgc ttctagccac 480
caccgcgtct tcattgtcaa cgtaatgggc cgcaactgtg gtgacatcgc tatgcgcgtc 540
ggcgtagcct gcggggcgga cgcgatcgtc attcctgaaa gaccatatga tgtcgaagaa 600
atcgccaacc ggctcaagca agcccaggaa agcggcaagg accacggttt ggtagttgtt 660
gctgaaggcg taatgaccgc tgaccaattc atggctgaac tgaagaagta tggtgacttc 720gacgtccggg ccaatgtttt gggtcacatg cagcggggcg gcacgccaac tgtttctgac 780
cgggtgctgg cttccaagct gggcagcgaa gccgttcacc ttcttttgga aggcaagggc 840
ggcctggctg tcggcattga aaacggcaag gttacttcac acgacatcct tgatttattt 900
gatgagtctc acaggggtga ctatgacttg ttaaagctca acgcagattt atcaagatag 960
<210> 2<211> 319<212> PRT
<213> Lactobacillus delbrueckii<400> 2
Met Lys Arg lie Gly lie Leu Thr Ser Gly Gly Asp Ala Pro Gly Met1 5 10 15
Asn Ala Ala Vai Arg Ala Vai Thr Arg Vai Ala lie Ala Asn Gly Leu20 25 30
Glu Vai Phe Gly lie Arg Tyr Gly Phe Ala Gly Leu Vai Ala Gly Asp35 40 45
lie Phe Pro Leu Glu Ser Glu Asp Vai Ala His Leu lie Asn Vai Ser50 55 60
Gly Thr Phe Leu Tyr Ser Ala Arg Tyr Pro Glu Phe Ala Glu Glu Glu65 70 75 80
Gly Gln Leu Ala Gly lie Glu Gln Leu Lys Lys His Gly lie Asp Ala85 90 95
Vai Vai Vai lie Gly Gly Asp Gly Ser Tyr His Gly Ala Leu Gln Leu100 105 110
Thr Arg His Gly Phe Asn Ser lie Gly Leu Pro Gly Thr lie Asp Asn115 120 125
Asp lie Pro Tyr Thr Asp Ala Thr lie Gly Tyr Asp Thr Ala Cys Met130 135 140Thr Ala Met Asp Ala lie Asp Lys lie Arg- Asp Thr Ala Ser Ser His145 150 155 160
His Arg Vai Phe lie Vai Asn Vai Met Gly Arg Asn Cys Gly Asp lie165 170 175
Ala Met Arg Vai Gly Vai Ala Cys Gly Ala Asp Ala lie Vai lie Pro180 185 190
Glu Arg Pro Tyr Asp Vai Glu Glu lie Ala Asn Arg Leu Lys Gln Ala195 200 205
Gln Glu Ser Gly Lys Asp His Gly Leu Vai Vai Vai Ala Glu Gly Vai210 215 220
Met Thr Ala Asp Gln Phe Met Ala Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Asp Phe225 230 235 240
Asp Vai Arg Ala Asn Vai Leu Gly His Met Gln Arg Gly Gly Thr Pro245 250 255
Thr Vai Ser Asp Arg Vai Leu Ala Ser Lys Leu Gly Ser Glu Ala Vai260 265 270
His Leu Leu Leu Glu Gly Lys Gly Gly Leu Ala Vai Gly lie Glu Asn275 . 280 285
Gly Lys Vai Thr Ser His Asp lie Leu Asp Leu Phe Asp Glu Ser His290 295 300
Arg Gly Asp Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ala Asp Leu Ser Arg305 310 315
<210> 3<211> 1770<212> DNA
<213> Lactobacillus delbrueckii<400> 3
atgaaaaaaa caaagattgt tagtactttaaccaagttag ccgaagcagg cgcaaacgtagaagaacact tggcaagaat gaacatggttttgggcatcg ctttggacac caagggtgctaagttcacta tcaacactgg tgacgaaatcaacaaggaca tgatccacgt tacctacccaactgtattga tcgacgacgg tgctgttggtcgcgaattgg tttgtgaagc tcaaaacactgctccaggtg ttgaaatccg cctcccagggtttggtttga agcacggtat taacttcatcgttcttgaca ttcgcgcact ttgcgaagaaaagattgaat cacaagaagg tattgacaacttgatggttg cccgtggtga catgggtgttcaaaagactt tgatcaagaa gtgcaacgctatgctggact caatgcaaga aaacccacgtaacgccgttc ttgacggtac tgacgcaacttacccagtac aatcagttca agctatgcacgacacccgga acactctggc tctgcaacgcgaagctatcg gtgaatcagt tgtccgcactgctgctacta gctccggcta cacagctcgtatcgttgcct tgactttcga cgaaaagatcgaaccagttt tggcaaagaa accttcaaacgtagctaagg aacacggttt cgttaaggatccattcggcc aatcaggtac tactaacttggctcaaggtt tgggcgtagg cactggctcagctgaagaag ccaacgctaa ggttcacgaaaaggactaca tgccagctat caagaaggccaccagccacg cagctgttgt cggcgtatcagacgcaactt caaagatcgc tgacggctcaatttaccaag gtgaagtttc aaacctgtaa<210> 4
gggccagctt cagacgatat tgaaactatt 60ttccgtttca acttctcaca cggtaaccac 120cgtgaagttg aaaagaagac tggcaagctt 180gaaatcagaa ccactgacca agaaggcggc 240cgcgtgtcaa tggacgcaac caaggccggc 300ggtctgttcg acgacactca cgtaggcggc 360ttgactatca aggccaagga cgaagaaaag 42 0ggtgtcatcg gctcaaagaa gggtgttaac 480attactgaaa aggacactga cgacatccgc 540tttgcttcat ttgtacgtaa ggctcaagac 600gctaacgcat catacgttaa gatcttccca 660atcgacgaaa tcttgcaagt ttcagatggt 72 0gaaatcccat tcatcaacgt gccatttgtt 780ttgggcaagc cagttatcac tgctactcaa 840ccaacccgtg ccgaagtaac tgacgttgct 900atgctgtcag gtgaatcagc aaacggtttg 960gacatcgatg ttcggactga aaaggaattg 1020tttgaagaat acaagggctc aaacgttact 1080gctcaagaac tgggcgttaa gactatcatc 1140atgatctcca agtaccgtcc agacgcaacc 1200caacactcat tgggtatcgt ttggggcgtt 1260actgacgaaa tgttcgaaga agctgcccgc 1320ggcgacctgg taatcatcgt tgccggcgta 1380atgaagctgc aaatcatcgg caaccaactt 1440gttatcggca aggctgttgt tgcgaacagc 1500ggcgacatcc tggtagctaa gactactgac 1560agcggtatga tcgttgaagc ttccggcttg 1620ctcggcattc cagttgttgt cggtgttgct 1680actttgactg ttgacgcacg tcgcggcgca 1740
1770<211> 589<212> PRT
<213> Lactobacillus delbrueckii<400> 4
Met Lys Lys Thr Lys lie Vai Ser Thr Leu Gly Pro Ala Ser Asp Asp1 .5 10 15
lie Glu Thr lie Thr Lys Leu Ala Glu Ala Gly Ala Asn Vai Phe Arg20 25 30
Phe Asn Phe Ser His Gly Asn His Glu Glu His Leu Ala Arg Met Asn35 40 45
Met Vai Arg Glu Vai Glu Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu Gly lie Ala50 55 60
Leu Asp Thr Lys Gly Ala Glu lie Arg Thr Thr Asp Gln Glu Gly Gly65 70 75 80
Lys Phe Thr lie Asn Thr Gly Asp Glu lie Arg Vai Ser Met Asp Ala85 90 95
Thr Lys Ala Gly Asn Lys Asp Met lie His Vai Thr Tyr Pro Gly Leu100 105 110
Phe Asp Asp Thr His Vai Gly Gly Thr Vai Leu lie Asp Asp Gly Ala115 120 125
Vai Gly Leu Thr lie Lys Ala Lys Asp Glu Glu Lys Arg Glu Leu Vai130 135 140
Cys Glu Ala Gln Asn Thr Gly Vai lie Gly Ser Lys Lys Gly Vai Asn145 150 155 160
Ala Pro Gly Vai Glu lie Arg Leu Pro Gly lie Thr Glu Lys Asp Thr165 170 175Asp Asp lie Arg Phe Gly Leu Lys His Gly lie Asn Phe lie Phe Ala180 185 190
Ser Phe Vai Arg Lys Ala Gln Asp Vai Leu Asp lie Arg Ala Leu Cys195 200 205
Glu Glu Ala Asn Ala Ser Tyr Vai Lys lie Phe Pro Lys lie Glu Ser210 215 220
Gln Glu Gly lie Asp Asn lie Asp Glu lie Leu Gln Vai Ser Asp Gly225 230 235 240
Leu Met Vai Ala Arg Gly Asp Met Gly Vai Glu lie Pro Phe lie Asn245 250 255
Vai Pro Phe Vai Gln Lys Thr Leu lie Lys Lys Cys Asn Ala Leu Gly260 265 270
Lys Pro Vai lie Thr Ala Thr Gln Met Leu Asp Ser Met Gln Glu Asn275 280 285
Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Vai Thr Asp Vai Ala Asn Ala Vai Leu290 295 300
Asp Gly Thr Asp Ala Thr Met Leu Ser Gly Glu Ser Ala Asn Gly Leu305 310 315 320
Tyr Pro Vai Gln Ser Vai Gln Ala Met His Asp lie Asp Vai Arg Thr325 330 335
Glu Lys Glu Leu Asp Thr Arg Asn Thr Leu Ala Leu Gln Arg Phe Glu340 345 350
Glu Tyr Lys Gly Ser Asn Vai Thr Glu Ala lie Gly Glu Ser Vai Vai355 360 365
Arg Thr Ala Gln Glu Leu Gly Vai Lys Thr lie lie Ala Ala Thr Ser370 375 380Ser Gly Tyr Thr Ala Arg Met lie Ser Lys Tyr Arg Pro Asp Ala Thr385 390 395 400
lie Vai Ala Leu Thr Phe Asp Glu Lys lie Gln His Ser Leu Gly lie405 410 415
Vai Trp Gly Vai Glu Pro Vai Leu Ala Lys Lys Pro Ser Asn Thr Asp420 425 430
Glu Met Phe Glu Glu Ala Ala Arg Vai Ala Lys Glu His Gly Phe Vai435 440 445
Lys Asp Gly Asp Leu Vai lie lie Vai Ala Gly Vai Pro Phe Gly Gln450 455 460
Ser Gly Thr Thr Asn Leu Met Lys Leu Gln lie lie Gly Asn Gln Leu465 470 475 480
Ala Gln Gly Leu Gly Vai Gly Thr Gly Ser Vai lie Gly Lys Ala Vai485 490 495
Vai Ala Asn Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ala Lys Vai His Glu Gly Asp500 505 510
lie Leu Vai Ala Lys Thr Thr Asp Lys Asp Tyr Met Pro Ala lie Lys515 520 525
Lys Ala Ser Gly Met lie Vai Glu Ala Ser Gly Leu Thr Ser His Ala530 535 540
Ala Vai Vai Gly Vai Ser Leu Gly lie Pro Vai Vai Vai Gly Vai Ala545 550 555 560
Asp Ala Thr Ser Lys lie Ala Asp Gly Ser Thr Leu Thr Vai Asp Ala565 570 575
Arg Arg Gly Ala lie Tyr Gln Gly Glu Vai Ser Asn Leu580 585<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial
<400> 5
aggcgcgcca ccatgaaacg gattggt
<210> 6<211> 27<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial<400> 6
cgcctgcagg ctatcttgat aaatctg
<210> 7<211> 27<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial<400> 7
aggcgcgcca ccatgaaaaa aacaaag
<210> 8<211> 25<212> DNA
Iniciador Sintético
27
Iniciador Sintético
27
Iniciador Sintético<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial: Iniciador Sintético<400> 8
cgcctgcagg ttacaggttt gaaac 25
<210> 9<211> 2829<212> DNA
<213> Schizosaccharomyces pombe<400> 9
atgagtggag aaaccgtgca tggaatttcg tgctactctg ttgttgcaaa cactgaggac 60acatataatc agactctcga cttctaccaa aagcttggct tcaagaaggt tgccagcttc 120ggtaccagcg attctgacaa tgcccgtgtt tgcaacgagt ctctccgtga ggactggatg 180catgtcgctg gaaacaactc tgctgaaagc gtcaccatca agttccgttt agtccccggt 240gaattgagcc tttcccccgc tgccgaagat tctgaatggc gcggacaaaa gagttctctt 300gttttttact atcccaactt gcttgacttg cttaagcaac tcagtgccga tgccattaaa 360taccaagctt tccccaacga gaagaagcct gatgaggttt atgtcgagga tcccttgggt 42 0aatttgattg gcttctccga ccgttacaat cctttcgccc atgctaacct taagaagagc 480gaggagtctg gtgctgcttc taacctcgag agcggtttgg ctactcccgt cgttgagact 540ctcaagaaag ctaccacttc tgacaagcct gcaggtgtca agaagaagat tgcagttatg 600accagtggtg gtgactcccc tggtatgaac gctgttgttc gtgccgtcgc tcgtattgcc 660attcaccgtg gttgtgatgc tttcgctatt tatgaaggtt atgaaggtct tgttcaaggt 720ggtgatatga tcaagcaatt gcaatggggt gatgtccgtg gttggcttgc tgagggtggt 7 80actcttattg gtaccgctcg ttgtatggct ttccgtgagc gtcctggtcg tcttcgtgct 840gccaagaacc ttatttccgc tggtattgat tccattattg tttgcggtgg tgatggttct 900ttgaccggtg ctgatatctt ccgttctgac tggcccggtt tggttaaaga gttggaggac 960accaaggcta ttactcccga gcaagccaag ctctaccgcc atcttaccat tgtcggtttg 1020gtcggttcaa tcgataacga tatgtcttca actgacgtta ctatcggtgc cttctcttct 1080cttcaccgta tttgcgaagc cgtcgactcc atttcttcta ctgctatttc ccattctcgt 1140gctttcatcg ttgaagtcat gggtcgtcat tgcggttggt tggctgtttt agctgcattg 1200gctaccggtg ctgatttcgt ctttatccctgacgaattgt gcaattcttt gagctctgtcattgttgcag agggtgctat tgactccgagaacttgttag ttgagcgcct tcacttggàccgtggtggta ttccttgtgc ttatgaccgtgttgatgctg ttcttgcctc tacccctgataacaagatta accgcaagcc tttgatggaggctattgaga agaagcagtt cgctcatgcttacttacaca cttgggaagg tactacctttgacgagagaa tgcgtgtcgc eatcatccatgctactcgtg ctgccgttcg atattgtttgaatggtttct ctggcttctt gcgccatgatgatgagtggt gcattcgtgg tggtagtgaagacatgggct tcactgcctt caagttccaaggtggtttcg aggctttcac cgccctttcttcattccgca ttcccatggc tatcatccctgaattctctt tgggttgcga tacttgtcttaagcaaagtg ctagtgctag ccgtcgtcgttctggttata tcgctactgt cggtggtctcgaggatggta tctccttgga tatgttgcgtgccttagaag ctggtcgtaa ccgtgctggtaaggtttaca ccaccgaagt tattggaaactccgctcgta ccgctgttcc cggtcacgttcgtgctcgtg ctgctcgtct ggctatgcgtaacgacttgg gtaatgaccc cagctctgcctctttcagct ctgttgctga tgttgagaacaagaacgctt ggtggcgtga tatgcacaacgctgattaa
<210> 10<211> 942<212> PRT
<213> Schizosaccharomyces pombe
gagagacctg ctgaagtcgg caaatggcaa 1260cgtaagttgg gcaagagaaa gtcaattgtt 1320cttaaccaca tttctcccga agacatcaag 1380actcgtgtca ccactctcgg tcacgttcaa 1440atgcttgcta cccttcaagg tgttgatgcc 1500actccatctc ccatgattgc tatcaatggt 1560gctgttaagt tgactcatga ggttgctgat 1620atggagctcc gtgaccccga atttgctgat 1680attgaagacg agtcacactt cgttcccaag 1740gttggtgctc ccgctggtgg tatgaactct 1800aaccgtggtc acactcctct tgccattgac 1860tctattcatg aactttcatg gattgatgtt 1920atcggtacca accgtgatac ccctgatctc 1980caacataaga ttgatgcttt gattattatt 2040caacttgaga gtgcacgtgt taactaccct 2100gccaccattt ccaacaacgt tcccggtacc 2160aatgccgtta tggaatactg tgataccatt 2220gtcttcgttt gtgaagttca aggtggccgc 22 80attactggtg cctccgccat ttacaccccc 2340aaggatattg atcaccttaa ggctacattc 2400caacttatcc ttcgtaacga atgtgcttct 2460atcatcagtg aagaagctca taagcgcttc 2520caacaaggtg gtaaccccac tcctatggac 2 580gccattcgtt tcttcgaaac ttgccgtgcc 2 640gttgtcatcg gtatccgtgg tactggtgtc 2700aacgaaaccg aaattgagat gcgtcgtcct 2760ttggttaaca tcttggccgg caagaccttt 2820
2829<400> 10Met Ser Gly Glu1
Asn Thr Glu Asp20
Gly Phe Lys Lys35
Arg Vai Cys Asn50
Asn Asn Ser Ala
Glu Leu Ser Leu
Lys Ser Ser Leu100
Gln Leu Ser Ala115
Lys Pro Asp Glu130
Phe Ser Asp Arg145
Glu Glu Ser Gly
Vai Vai Glu Thr180
Thr Vai His Gly5
Thr Tyr Asn Gln
Vai Ala Ser Phe40
Glu Ser Leu Arg55
Glu Ser Vai Thr70
Ser Pro Ala Ala85
Vai Phe Tyr Tyr
Asp Ala lie Lys120
Vai Tyr Vai Glu135
Tyr Asn Pro Phe150
Ala Ala Ser Asn165
Leu Lys Lys Ala
lie Ser Cys Tyr10
Thr Leu Asp Phe25
Gly Thr Ser Asp
Glu Asp Trp Met60
lie Lys Phe Arg75
Glu Asp Ser Glu90
Pro Asn Leu Leu105
Tyr Gln Ala Phe
Asp Pro Leu Gly140
Ala His Ala Asn155
Leu Glu Ser Gly170
Thr Thr Ser Asp185
Ser Vai Vai Ala15
Tyr Gln Lys Leu30
Ser Asp Asn Ala45
His Vai Ala Gly
Leu Vai Pro Gly80
Trp Arg Gly Gln95
Asp Leu Leu Lys110
Pro Asn Glu Lys125
Asn Leu lie Gly
Leu Lys Lys Ser160
Leu Ala Thr Pro175
Lys Pro Ala Gly190Vai Lys Lys Lys lie195
Met Asn Ala Vai Vai210
Cys Asp Ala Phe Ala225
Gly Asp Met lie Lys245
Ala Glu Gly Gly Thr260
Glu Arg Pro Gly Arg275
lie Asp Ser lie lie290
Asp lie Phe Arg Ser305
Thr Lys Ala lie Thr325
lie Vai Gly Leu Vai340
Vai Thr lie Gly Ala355
Asp Ser lie Ser Ser370
Glu Vai Met Gly Arg385
Ala Vai Met Thr Ser Gly200
Arg Ala Vai Ala Arg lie215
lie Tyr Glu Gly Tyr Glu
230 235
Gln Leu Gln Trp. Gly Asp250
Leu lie Gly Thr Ala Arg265
Leu Arg Ala Ala Lys Asn280
Vai Cys Gly Gly Asp Gly295
Asp Trp Pro Gly Leu Vai310 315
Pro Glu Gln Ala Lys Leu
330 .
Gly Ser lie Asp Asn Asp345
Phe Ser Ser Leu His Arg360
Thr Ala lie Ser His Ser375
His Cys Gly Trp Leu Ala390 395
Gly Asp Ser Pro Gly205
Ala lie His Arg Gly220
Gly Leu Vai Gln Gly240
Vai Arg Gly Trp Leu255
Cys Met Ala Phe Arg270
Leu lie Ser Ala Gly285
Ser Leu Thr Gly Ala300
Lys Glu Leu Glu Asp320
Tyr Arg His Leu Thr335
Met Ser Ser Thr Asp350
lie Cys Glu Ala Vai365
Arg Ala Phe lie Vai380
Vai Leu Ala Ala Leu400Ala Thr Gly Ala
Gly Lys Trp Gln420
Leu Gly Lys Arg435
Ser Glu Leu Asn450
Glu Arg Leu His465
Arg Gly Gly lie
Gly Vai Asp Ala500
Ser Pro Met lie
515 .
Met Glu Ala Vai530
Lys Gln Phe Ala545
Tyr Leu His Thr
Phe Vai Pro Lys580
Ala Pro Ala Gly595
Asp Phe Vai Phe405
Asp Glu Leu Cys
Lys Ser lie Vai440
His lie Ser Pro455
Leu Asp Thr Arg470
Pro Cys Ala Tyr485
Vai Asp Ala Vai
Ala lie Asn Gly520
Lys Leu Thr His535
His Ala Met Glu550
Trp Glu Gly Thr565
Asp Glu Arg Met
Gly Met Asn Ser600
lie Pro Glu Arg410
Asn Ser Leu Ser425
lie Vai Ala Glu
Glu Asp lie Lys460
Vai Thr Thr Leu475
Asp Arg Met Leu490
Leu Ala Ser Thr505
Asn Lys lie Asn
Glu Vai Ala Asp540
Leu Arg Asp Pro555
Thr Phe lie Glu570
Arg Vai Ala lie585
Ala Thr Arg Ala
Pro Ala Glu Vai415
Ser Vai Arg Lys430
Gly Ala lie Asp445
Asn Leu Leu Vai
Gly His Vai Gln480
Ala Thr Leu Gln495
Pro Asp Thr Pro510
Arg Lys Pro Leu525
Ala lie Glu Lys
Glu Phe Ala Asp560
Asp Glu Ser His575
lie His Vai Gly590
Ala Vai Arg Tyr605Cys Leu Asn Arg Gly His Thr Pro Leu Ala lie Asp Asn Gly Phe Ser610 615 620
Gly Phe Leu Arg His Asp Ser lie His Glu Leu Ser Trp lie Asp Vai625 630 635 640
Asp Glu Trp Cys lie Arg Gly Gly Ser Glu lie Gly Thr Asn Arg Asp645 650 655
Thr Pro Asp Leu Asp Met Gly Phe Thr Ala Phe Lys Phe Gln Gln His660 665 670
Lys lie Asp Ala Leu lie lie lie Gly Gly Phe Glu Ala Phe Thr Ala675 680 685
Leu Ser Gln Leu Glu Ser Ala Arg Vai Asn Tyr Pro Ser Phe Arg lie690 695 700
Pro Met Ala lie lie Pro Ala Thr lie Ser Asn Asn Vai Pro Gly Thr705 710 715 720
Glu Phe Ser Leu Gly Cys Asp Thr Cys Leu Asn Ala Vai Met Glu Tyr725 730 735
Cys Asp Thr lie Lys Gln Ser Ala Ser Ala Ser Arg Arg Arg Vai Phe740 745 750
Vai Cys Glu Vai Gln Gly Gly Arg Ser Gly Tyr lie Ala Thr Vai Gly755 760 765
Gly Leu lie Thr Gly Ala Ser Ala lie Tyr Thr Pro Glu Asp Gly lie770 775 780
Ser Leu Asp Met Leu Arg Lys Asp lie Asp His Leu Lys Ala Thr Phe785 790 795 800
Ala Leu Glu Ala Gly Arg Asn Arg Ala Gly Gln Leu lie Leu Arg Asn805 810 815Glu Cys Ala Ser Lys Vai Tyr Thr Thr Glu Vai lie Gly Asn lie lie820 825 830
Ser Glu Glu Ala His Lys Arg Phe Ser Ala Arg Thr Ala Vai Pro Gly835 840 845
His Vai Gln Gln Gly Gly Asn Pro Thr Pro Met Asp Arg Ala Arg Ala850 855 860
Ala Arg Leu Ala Met Arg Ala lie Arg Phe Phe Glu Thr Cys Arg Ala865 870 875 880
Asn Asp Leu Gly Asn Asp Pro Ser Ser Ala Vai Vai lie Gly lie Arg885 890 895
Gly Thr Gly Vai Ser Phe Ser Ser Vai Ala Asp Vai Glu Asn Asn Glu900 905 910
Thr Glu lie Glu Met Arg Arg Pro Lys Asn Ala Trp Trp Arg Asp Met915 920 925
His Asn Leu Vai Asn lie Leu Ala Gly Lys Thr Phe Ala Asp930 935 940
<210> 11<211> 1215<212> DNA
<213> Propionibacterium freudenreichii<400> 11
atggtgaaaa aggtcgctct gctgaccgct ggtggcttcg ccccctgtct ttcctcggcc 60atcgctgagc tcatcaagcg ctataccgag gtatcacccg aaacgaccct catcggctat 120cgctatggct atgagggcct gctcaagggc gattccctcg agttctcccc tgccgtgcgc 180gcacactacg accggctctt cagcttcggc gggtcaccga tcgggaactc ccgggtcaag 240ctcaccaatg tgaaggacct ggttgcgcgg ggcctggttg cttccggcga tgatcccctc 300aaggttgccg ccgatcagct gattgccgac ggggtcgacg tgctgcacac gatcgggggc 360gacgacacca acaccacggc cgccgacctg gccgcctacc tggcacagca tgactacccg 420ctgacggttg tggggctgcc caagacgatc gacaacgaca tcgtgcccat ccgccagtcg 480ctgggtgcct ggacggccgc cgacgagggg gcccgcttcg cggcgaatgt gatcgccgag 540cacaatgctg ctccgcgcga actcatcatc cacgagatca tgggccgcaa ctgcggctat 600ctggcggccg agacctcgcg gcgttacgtg gcctggctcg acgcgcagca gtggctcccg 660gaggccggtc tcgaccgacg tggctgggat atccacgccc tgtacgtgcc ggaggccacg 720atcgacctgg acgccgaggc cgagcgcctg cgcaccgtga tggacgaggt gggaagcgtc 780aatatcttca tctcggaggg agccggcgtt cccgatatcg tcgcccagat gcaggccacg 840ggccaggagg tgcccactga cgccttcggc cacgtgcagc tcgacaagat caatcccggg 900gcgtggttcg ccaagcagtt cgccgagcgc atcggtgcgg gcaagaccat ggtgcagaag 960tccggttact tcagccgctc cgccaagtcg aatgcccagg acctggagct catcgccgcc 1020accgccacga tggcggttga tgcggcgctg gccggcaccc ccggcgtggt cggtcaggac 1080gaggaggcag gcgacaagct gagcgtgatc gacttcaagc ggatcgcggg ccacaagccc 1140ttcgacatca cccttgattg gtacacccag ctgctggccc gaatcggtca gccggcaccc 1200atcgccgccg cgtaa 1215
<210> 12
<211> 404 .
<212> PRT
<213> Propionibacterium freudenreichii
<400> 12
Met Vai Lys Lys Vai Ala Leu Leu Thr Ala Gly Gly Phe Ala Pro Cys1 5 10 15
Leu Ser Ser Ala lie Ala Glu Leu lie Lys Arg Tyr Thr Glu Vai Ser20 25 30
Pro Glu Thr Thr Leu lie Gly Tyr Arg Tyr Gly Tyr Glu Gly Leu Leu35 40 45
Lys Gly Asp Ser Leu Glu Phe Ser Pro Ala Vai Arg Ala His Tyr Asp
50 55 60
Arg Leu Phe Ser Phe Gly Gly Ser Pro lie Gly Asn Ser Arg Vai Lys
65 70 75 80Leu Thr Asn Vai Lys Asp Leu Vai Ala Arg Gly Leu Vai Ala Ser Gly85 90 95
Asp Asp Pro Leu Lys Vai Ala Ala Asp Gln Leu lie Ala Asp Gly Vai100 105 110
Asp Vai Leu His Thr lie Gly Gly Asp Asp Thr Asn Thr Thr Ala Ala115 120 125
Asp Leu Ala Ala Tyr Leu Ala Gln His Asp Tyr Pro Leu Thr Vai Vai130 135 140
Gly Leu Pro Lys Thr lie Asp Asn Asp lie Vai Pro lie Arg Gln Ser145 150 155 160
Leu Gly Ala Trp Thr Ala Ala Asp Glu Gly Ala Arg Phe Ala Ala Asn165 170 175
Vai lie Ala Glu His Asn Ala Ala Pro Arg Glu Leu lie lie His Glu180 185 190
lie Met Gly Arg Asn Cys Gly Tyr Leu Ala Ala Glu Thr Ser Arg Arg195 200 205
Tyr Vai Ala Trp Leu Asp Ala Gln Gln Trp Leu Pro Glu Ala Gly Leu210 215 220
Asp Arg Arg Gly Trp Asp lie His Ala Leu Tyr Vai Pro Glu Ala Thr225 230 235 240
lie Asp Leu Asp Ala Glu Ala Glu Arg Leu Arg Thr Vai Met Asp Glu245 250 255
Vai Gly Ser Vai Asn lie Phe lie Ser Glu Gly Ala Gly Vai Pro Asp
260 265 270
lie Vai Ala Gln Met Gln Ala Thr Gly Gln Glu Vai Pro Thr Asp Ala275 280 285Phe Gly His Vai Gln Leu Asp Lys lie Asn Pro Gly Ala Trp Phe Ala290 295 300
Lys Gln Phe Ala Glu Arg lie Gly Ala Gly Lys Thr Met Vai Gln Lys305 310 315 320
Ser Gly Tyr Phe Ser Arg Ser Ala Lys Ser Asn Ala Gln Asp Leu Glu325 330 335
Leu lie Ala Ala Thr Ala Thr Met Ala Vai Asp Ala Ala Leu Ala Gly340 345 350
Thr Pro Gly Vai Vai Gly Gln Asp Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Ser355 360 365
Vai lie Asp Phe Lys Arg lie Ala Gly His Lys Pro Phe Asp lie Thr370 375 380
Leu Asp Trp Tyr Thr Gln Leu Leu Ala Arg lie Gly Gln Pro Ala Pro385 390 395 400
lie Ala Ala Ala
<210> 13<211> 927<212> DNA
<213> Escherichia coli<400> 13
atggtacgta tctatacgtt gacacttgcg ccctctctcg atagcgcaac aattaccccg 60
caaatttatc ccgaggaaaa ctgcgctgta ccgcaccggt gttcgaaccc gggcggcggc 120
atcaacgtcg cccgcgccat tgcccatctt ggaggcagtg ccacagcgat cttcccggcg 180
ggtggcgcga ccggcgaaca cctggtttca ctgttggcgg atgaaaatgt ccccgtcgct 240
actgtagaag ccaaagactg gacccggcag aatttacacg tacatgtgga agcaagcggt 300
gagcagtatc gttttgttat gccaggcgcg gcattaaatg aagatgagtt tcgccagctt 360
gaagagcaag ttctggaaat tgaatccggg gccatcctgg tcataagcgg aagcctgccg 420
ccaggtgtga agctggaaaa attaacccaa ctgatttcgc tgcgcaaaaa caagggatcc 480gctgcatcgt cgacagttct tggacagggc ttaagtgcag cactggcaat tggtaacatc 540
gagttggtta agcctaacca aaaagaactc agtgcgctgg tgaatcgcga actcacccag 600
ccggacgatg tccgcaaagc cgcgcaggaa atcgttaata gcggcaaggc caaacgggtt 660
gtcgtttccc tgggtccaca aggagcgctg ggtgttgata gtgaaaactg tattcaggtg 720
gtgccaccag cgttgaaaag ccagagtacc gttggcgctg gtgacagact ggtcggcgcg 780
atgacactga aactggcaga aaatgcctct cttgaagaga tggttcgttt tggcgtagct 840
gcggggagtg cagccacact caatcaggga acacgtctgt gctcccatga cgatacgcaa 900
aaaatttacg cttacctttc ccgctaa 927
<210> 14
<211> 308<212> PRT
<213> Escherichia coli<400> 14
Met Vai Arg lie Tyr Thr Leu Thr Leu Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ala1 5 10 15
Thr lie Thr Pro Gln lie Tyr Pro Glu Glu Asn Cys Ala Vai Pro His20 25 30
Arg Cys Ser Asn Pro Gly Gly Gly lie Asn Vai Ala Arg Ala lie Ala35 40 45
His Leu Gly Gly Ser Ala Thr Ala50 55
Gly Glu His Leu Vai Ser Leu Leu65 70
Thr Vai Glu Ala Lys Asp Trp Thr85
Glu Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Arg100
lie Phe Pro Ala Gly Gly Ala Thr60
Ala Asp Glu Asn Vai Pro Vai Ala75 80
Arg Gln Asn Leu His Vai His Vai90 95
Phe Vai Met Pro Gly Ala Ala Leu105 110
Asn Glu Asp Glu Phe Arg Gln Leu Glu Glu Gln Vai Leu Glu lie Glu115 120 125
Ser Gly Ala lie Leu Vai lie Ser Gly Ser Leu Pro Pro Gly Vai Lys130 135 140
Leu Glu Lys Leu Thr Gln Leu lie Ser Leu Arg Lys Asn Lys Gly Ser145 150 155 160
Ala Ala Ser Ser Thr Vai Leu Gly Gln Gly Leu Ser Ala Ala Leu Ala165 170 175
lie Gly Asn lie Glu Leu Vai Lys Pro Asn Gln Lys Glu Leu Ser Ala180 185 190
Leu Vai Asn Arg Glu Leu Thr Gln Pro Asp Asp Vai Arg Lys Ala Ala195 200 205
Gln Glu lie Vai Asn Ser Gly Lys Ala Lys Arg Vai Vai Vai Ser Leu210 215 220
Gly Pro Gln Gly Ala Leu Gly Vai Asp Ser Glu Asn Cys lie Gln Vai225 230 235 240
Vai Pro Pro Ala Leu Lys Ser Gln Ser Thr Vai Gly Ala Gly Asp Arg245 250 255
Leu Vai Gly Ala Met Thr Leu Lys Leu Ala Glu Asn Ala Ser Leu Glu260 265 270
Glu Met Vai Arg Phe Gly Vai Ala Ala Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn275 280 285
Gln Gly Thr Arg Leu Cys Ser His Asp Asp Thr Gln Lys lie Tyr Ala290 295 300
Tyr Leu Ser Arg305

Claims (22)

1. Método para produzir uma planta monocotiledônea tendo óleoaumentado em sua semente, compreendendo introduzir na referida plantaum polinucleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase, encadeada opera-velmente a um promotor de reforço de semente por meio do qual o teor deóleo da semente é aumentado comparado com uma semente de uma plantaisogênica carecendo da seqüência de ácido nucleico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinu-cleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase compreende uma seqüênciadiferente da SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:13.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinu-cleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase é encadeado operavelmente aum polinucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo excetoquando o referido promotor de reforço de semente é um promotor de reforçode embrião.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinu-cleotídeo compreende uma seqüência de ácido nucleico selecionada entre ogrupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 ou SEQIDNO:11;e(b) uma seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüênciade polipeptídeo de SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:12.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o polinu-cleotídeo compreende uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza à se-qüência de (a) ou (b) ou um complemento da mesma sob condições de altaestringência de cerca de 0,2 x SSC e 65°C.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a plantacompreende adicionalmente um polinucleotídeo codificando uma piruvatoquinase encadeado operavelmente a um promotor de reforço de semente.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o polinu-cleotídeo codificando uma piruvato quinase compreende uma seqüência deácido nucleico selecionada entre o grupo consistindo em:(a) uma seqüência de ácido nucléico compreendendo a seqüên-cia de SEQ ID NO:3; e(b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüênciade polipeptídeo de SEQ ID NO:4.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o polinu-cleotídeo compreende uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza à se-qüência de (a) ou (b) ou um complemento da mesma sob condições de altaestringência de cerca de 0,2 x SSC e 65°C.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a planta éuma monocotiledônea selecionada entre o grupo consistindo em milho (Zeamays), arroz (Oryza sativá), cevada {Hordeum vulgaré), painço (Panicummiliaceum), centeio (Secale cerealé), trigo {Triticum aestivum), e sorgo (Sor-ghum bicolor).
10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o promotoré selecionado entre o grupo consistindo em promotores de reforço de embri-ão, promotores de reforço de endosperma e promotores de reforço de em-brião e de endosperma.
11. Planta monocotiledônea compreendendo um polinucleotídeocodificando uma fosfofrutoquinase, encadeada operavelmente a um promo-tor de reforço de semente.
12. Planta de acordo com a reivindicação 11, em que o polinu-cleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase compreende uma seqüênciadiferente da SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:13.
13. Planta de acordo com a reivindicação 11, em que o polinu-cleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase é encadeado a um polinucleotí-deo codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo exceto quando o refe-rido promotor de reforço de semente é um promotor de reforço de embrião.
14. Célula de planta monocotiledônea compreendendo um poli-nucleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase, encadeada operavelmente aum promotor de reforço de semente.
15. Semente produzida a partir da planta como definida na rei-vindicação 11, compreendendo um polinucleotídeo codificando uma fosfofru-toquinase de acordo com a reivindicação 7.
16. Refeição produzida a partir da semente como definida nareivindicação 15, compreendendo um polinucleotídeo codificando uma fosfo-frutoquinase de acordo com a reivindicação 11.
17. Composição de ração animal produzida a partir da sementecomo definida na reivindicação 15, compreendendo um polinucleotídeo codi-ficando uma fosfofrutoquinase de acordo com a reivindicação 11.
18. Composição de alimento humano produzido a partir da se-mente como definida na reivindicação 15, compreendendo um polinucleotí-deo codificando uma fosfofrutoquinase de acordo com a reivindicação 11.
19. Composição de ração animal compreendendo a refeiçãocomo definida na reivindicação 16, compreendendo um polinucleotídeo codi-ficando uma fosfofrutoquinase de acordo com a reivindicação 11.
20. Método para preparar uma óleo de planta monocotiledôneacompreendendo as etapas de:a) cultivar uma planta monocotiledônea transformada compreen-dendo um polinucleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase encadeada ope-ravelmente a um promotor de reforço de semente, para produzir semente; eb) processar a semente para obter o óleo.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o polinu-cleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase compreende uma seqüênciadiferente da SEQ IDNO:9 ou SEQ IDNO:13.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o polinu-cleotídeo codificando uma fosfofrutoquinase é encadeado a um polinucleotí-deo codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo exceto quando o refe-rido promotor de reforço de semente é um promotor de reforço de embrião.
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