BRPI0610330A2 - composições nutracêuticas. - Google Patents

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Jacobus Van Platerink Christianus
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Abstract

A presente invenção descreve o uso de MAP e<sym>ou ITP ou um sal destes como um nutracêutico, preferivelmente um medicamento.

Description

COMPOSIÇÕES NUTRACÊUTICAS
A presente invenção relaciona-se a nova composiçãonutracêutica. A presente invenção relaciona-se acomposições que compreendem o tripeptídeos metionina-alanina-prolina (Met-Ala-Pro, aqui: MAP) e/ou isoleucina-treonina-prolina (Ile-Thr-Pro, aqui: ITP) . Maisespecificamente, a presente invenção relaciona-se acomposições que compreendem MAP e/ou ITP usadas para amelhoria da saúde ou para a prevenção e/ou tratamento dedoenças. As composições são especialmente úteis para otratamento ou prevenção de pressão sangüínea alta (aqui:hipertensão) e insuficiência cardíaca, ou condiçõesassociadas como angina pectoris, infarto do miocárdio, AVC,doença obstrutiva arterial periférica, aterosclerose enefropatia. Em um outro aspecto, a presente invençãorelaciona-se ao uso de MAP e/ou ITP na manufatura de umacomposição nutracêutica para consumo concomitante notratamento ou prevenção de hipertensão e insuficiênciacardíaca. Ainda em um outro aspecto, a invenção relaciona-se a um método de tratamento ou prevenção de hipertensão einsuficiência cardíaca, ou condição associada como anginapectoris, infarto do miocárdio, AVC, doença obstrutivaarterial periférica, aterosclerose e nefropatia em que umaquantidade eficaz da composição que compreendem MAP e/ouITP é administrada a um indivíduo em necessidade de taltratamento.
É conhecido que a hipertensão é uma das causasevitáveis mais importantes de morte prematura por todo omundo. Além disso, até mesmo uma pressão arterial naextremidade superior da faixa normal pode aumentar o riscode morte prematura. A hipertensão é um fator de riscoprincipal para doença coronariana e o fator de risco maisimportante para AVC. Ela contribui para aproximadamentemetade de todas as doenças cardiovasculares, queresponderam por 16,7 milhões de mortes globais em 2002. Orisco de doença cardiovascular duplica para cada aumento de10 pontos na pressão diastólica ou a cada aumento de 2 0pontos na pressão sistólica. Na maioria dos países, até umterço dos adultos sofre de hipertensão. A prevalência dehipertensão é crescente com a idade e essa tendência peespecialmente proeminente em países em desenvolvimento.Além disso, estima-se que 4 0% dos indivíduos hipertensospermanecem não diagnosticados.
Atualmente, não há terapia de cura disponível paraindivíduos hipertensos e o objetivo principal do tratamentoé diminuir a pressão arterial a níveis seguros. Dieta emodificações de estilo de vida como mais exercício, consumoreduzido de sal e controle eficaz do estresse também podemrepresentar ferramentas para a prevenção de hipertensão.
Isso, por sua vez, pode diminuir as necessidades pormedicamentos, que são comumente associados com efeitoscolaterais que variam de tosse seca a perda de energia paraatividades da vida diária. Assim, há uma grande demandapela prevenção e tratamento de hipertensão por suplementosdietéticos que sejam seguros e não sejam associados com osefeitos colaterais de medicamentos atualmente usados para otratamento de hipertensão.
Atualmente, inibidores da ACE, antagonistas dereceptor II de angiotensina, bloqueadores do canal decálcio, diuréticos e beta bloqueadores são amplamenteusados para o tratamento de hipertensão. Inibidores da ACEreduzem os níveis de angiotensina II, um hormônio peptídicoconhecidos por aumentar a pressão arterial. Antagonistas dereceptor de angiotensina II bloqueiam a ligação deangiotensina II a seu receptor e dessa forma exerce efeitosde diminuição da pressão arterial. Bloqueadores do canal docálcio reduzem a entrada de cálcio nas células da parede dovaso sangüíneo e assim diminuem a contração dos vasossangüíneos, que por sua vez diminuem pressão arterial.
Diuréticos levam a excreção urinaria aumentada de sódio eágua, que leva a uma redução da pressão arterial. Betabloqueadores bloqueiam a ação de norepinefrina e epinefrinaem receptores beta adrenérgicos e dessa forma reduzem acontração dos vasos sangüíneos e diminuem a pressãoarterial.
A presente invenção relaciona-se a MAP e/ou ITP ou umsal de MAP e/ou um sal de ITP desse como um nutracêutico,preferivelmente um medicamento. A invenção tambémrelaciona-se ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ouum sal de ITP como um um nutracêutico, pref erivelmente ummedicamento, ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ouum sal de ITP para a manufatura de um nutracêuticopref erivelmente um medicamento, ao uso de MAP e/ou ITP ouum sal de MAP e/ou um sal de ITP para a melhoria da saúdeou a prevenção e/ou tratamento de doenças, ao uso de MAPe/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP para amanufatura de um nutracêutico preferivelmente ummedicamento para o tratamento de doenças cardiovascularescomo hipertensão e insuficiência cardíaca, ao uso de MAPe/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP para otratamento de pré-diabetes ou diabetes, ao uso de MAP e/ouITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP para o tratamentoou prevenção de obesidade, ao uso de MAP e/ou ITP ou um salde MAP e/ou um sal de ITP para aumentar a insulinaplasmática ou para aumentar a sensibilidade por insulinaplasmática, ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou umsal de ITP para aumentar a insulina plasmática ou paraaumentar a sensibilidade por insulina plasmática dediabetes tipo 2 ou pré-diabetes, ao uso de MAP e/ou ITP ouum sal de MAP e/ou um sal de ITP para diminuirconcentrações de glicose pós-prandial no sangue de diabetestipo 2 ou pré-diabetes, ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal deMAP e/ou um sal de ITP para aumentar a secreção de insulinapós-prandial no sangue de diabetes tipo 2 ou pré-diabetes,ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITPem que MAP e/ou ITP está na forma de um suplementodietético, ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou umsal de ITP para a manufatura de um produto sangüíneofuncional para o tratamento terapêutico dos efeitos deestresse, ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou umsal de ITP em aplicação tópica preferivelmente em aplicaçãode cuidados pessoais e ao uso de MAP e/ou ITP ou um sal deMAP e/ou um sal de ITP in ração e alimento para animais deestimação. MAP é o tripeptídeo preferido e é preferido nosusos da presente invenção.
Além disso, a presente invenção relaciona-se a ummétodo de tratamento de diabetes tipo 1 e 2, e para aprevenção de diabetes tipo 2 naqueles indivíduos com pré-diabetes, ou tolerância à glicose prejudicada (IGT) quecompreende a administração a um indivíduo em necessidade detal tratamento de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP e a um método de tratamento de pessoas que sofrem dehipertensão ou insuficiência cardíaca ou a prevenção dessesque compreende a administração ao indivíduo em necessidadede tal tratamento de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou umsal de ITP.
De acordo com um aspecto adicional da invenção, érevelado um método de síntese química de MAP e/ou ITP ou umsal de MAP e/ou um sal de ITP. Além disso, a presenteinvenção relaciona-se a um medicamento que compreendem MAPe/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP comoingrediente ativo, um suplemento dietético que compreendeMAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP comoingrediente ativo, uma ração que compreendem MAP e ou ITPou um sal de MAP e/ou um sal de ITP como ingrediente ativo,uma composição que compreendem MAP e/ou ITP ou um sal deMAP e/ou um sal de ITP como medicamento ou para benefíciosà saúde, uma composição em que o benefício à saúde é otratamento dos efeitos do estresse, preferivelmente acomposição é um alimento ou ração, uma composição quecompreendem MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal deITP para o uso como um agente tópico pref erivelmente parauso em cuidados pessoais e a uma composição que é umaloção, um gel ou uma emulsão.
De acordo com a presente invenção constatou-se, deforma surpreendente, que MAP e ITP inibem a enzima deconversão de angiotensina I (ACE) e, portanto, exibemefeitos de diminuição da pressão arterial. A inibição deACE resulta em vasoconstricção reduzida, vasodilataçãoaumentada, melhor excreção de sódio e água, que, por suavez, levam a uma resistência vascular periférica e pressãoarterial reduzidas e melhor fluxo sangüíneo local.Portanto, as presentes composições são particularmenteeficazes para a prevenção e tratamento de doenças que podemser influenciadas pela inibição da ACE, que incluem, semlimitação, hipertensão, insuficiência cardíaca, anginapectoris, infarto do miocárdio, AVC, doença obstrutivaarterial periférica, aterosclerose, nefropatia,insuficiência renal, disfunção erétil, disfunçãoendotelial, hipertrofia ventricular esquerda, vasculopatiadiabética, retenção de fluidos e hiperaldosteronismo. Ascomposições também podem ser úteis na prevenção etratamento de distúrbios gastrointestinais (diarréia,síndrome do cólon irritável), inflamação, diabete melito,obesidade, demência, epilepsia, confusão geriátrica edoença de Meniere. Além disso, as composições podemmelhorar a função cognitiva e memória (incluindo doença deAlzheimer), sensação de saciedade, limitar o dano isquêmicoe evitar a reoclusão de uma artéria após cirurgia de by-pass ou angioplastia.
Diabete melito é uma doença crônica disseminada queaté agora não tem cura. A incidência e prevalência deDiabete melito aumenta exponencialmente e está entre osdistúrbios metabólicos mais comuns em países desenvolvidose em desenvolvimento. Diabete melito é uma doença complexaderivada de múltiplos fatores causadores e caracterizadapor metabolismo prejudicado de carboidrato, proteína egordura associada a uma deficiência na secreção de insulinae/ou resistência à insulina. Isso resulta em concentraçõeselevadas de glicose sérica em jejum e pós-prandial que levaa complicações se deixada não tratada. Há duas categoriasprincipais da doença, Diabete melito insulino-dependente(IDDM, T1DM) e Diabete melito não insulino-dependente(NIDDM, T2DM) . T1DM = Diabete melito tipo 1. T2DM =diabetes melito tipo 2.
Diabetes T1DM e T2DM são associadas com hiperglicemia,hipercolesterolemia e hiperlipidemia. A deficiênciaabsoluta de insulina e insensibilidade a insulina em T1DM eT2DM, respectivamente, leva a uma aumento na utilização deglicose pelo fígado, músculo e tecido adiposo e a umaumento nos níveis sangüíneos da glicose. Hiperglicemiaincontrolada está associada com mortalidade aumentada e eprematura devido a um risco aumentado para doençasmicrovasculares e macrovasculares, incluindo nefropatia,neuropatia, retinopatia, hipertensão, AVC e doençacardíaca. Evidência recente mostrou que um controleglicêmico estrito é um fator principal na prevenção dessascomplicações em T1DM e T2DM. Portanto, um controleglicêmico ótimo por medicamentos ou regimes terapêuticos éuma abordagem importante para o tratamento de diabetes.
Terapia de T2DM inicialmente envolve mudanças na dietae estilo de vida, quando essas medidas falham em manter ocontrole glicêmico adequado os pacientes são tratados comagentes hipoglicêmicos orais e/ou insulina exógena. Osatuais agentes farmacológicos orais para o tratamento deT2DM incluem aqueles que potenciam a secreção de insulina(agentes de sulfoniluréia) , aqueles que melhoram a ação deinsulina no fígado (agentes de biguanida) , agentesinsulino-sensibilizantes (tiazolidinadionas) e agentes queagem inibindo a absorção de glicose (inibidores de a-glicosidase). No entanto, os agentes atualmente disponíveisgeralmente falham em manter controle glicemico adequado delonga duração devido à progressiva deterioração dahiperglicemia, resultante da progressiva perda de função dacélula pancreática. A proporção de pacientes capazes demanter níveis de glicemia alvo diminui marcadamente com otempo necessitando a administração de agentesfarmacológicos adicionais/alternativos. Além disso, osmedicamentos podem ter efeitos colaterais indesejados eestão associados a altas taxas de falência primária esecundária. Finalmente, o uso de medicamentoshipoglicêmicos pode ser eficaz no controle dos níveissangüíneos de glicose, mas pode não evitar todas ascomplicações da diabetes. Assim, métodos de tratamentoatuais para todos os tipos de diabete melito falham ematingir os ideais de normoglicemia e na prevenção decomplicações diabéticas.
Portanto, embora as terapias de escolha no tratamentode T1DM e T2DM sejam baseadas essencialmente naadministração de insulina e de medicamentos hipoglicêmicosorais, há uma necessidade por um suplemento nutricionalseguro e eficaz com mínimos efeitos colaterais para otratamento e prevenção de diabetes. Vários pacientes estãointeressados em terapias alternativas que possam minimizaros efeitos colaterais associados a alta dose de medicamentose que rendam benefícios clínicos adicionais. Os pacientescom diabete melito têm um especial interesse no tratamentoconsiderado como "natural" como leves efeitos anti-diabéticos e sem grandes efeitos colaterais, que possa serusado como um tratamento adjuvante. T2DM é uma doençaprogressiva e crônica, que comumente não é reconhecida atéque um dano significativo tenha ocorrido às célulaspancreaticas responsáveis pela produção de insulina (célulasP das ilhotas de Langerhans). Portanto, há um interessecrescente no desenvolvimento de um suplemento dietético quepossa ser usado para evitar o dano das células p e, dessaforma, a progressão para o T2DM visível em pessoas em risco,especialmente em idosos que estejam em risco de desenvolverT2DM. A proteção das células p pancreaticas pode ser obtidapela diminuição dos níveis sangüíneos de glicose e/ou delipídeos, uma vez que a glicose e os lipídeos exercemefeitos danosos sobre as células p. A redução dos níveisglicêmicos pode ser obtida por meio de diferentesmecanismos, por exemplo, por aumento da sensibilidade àinsulina e/ou por redução da produção hepática de glicose. Aredução dos níveis sangüíneos de lipídeos também pode serobtida por meio de diferentes mecanismos, por exemplo, poraumento da oxidação e/ou estocagem de lipídeos. Outraestratégia possível para proteger as células P pancreaticasseria a diminuição do estresse oxidativo. O estresseoxidativo também causa danos à célula p com subseqüenteperda de secreção de insulina e progressão ao T2DM franco.
Portanto, T2DM é uma doença complicada que resulta dedefeitos coexistentes em múltiplos locais orgânicos:resistência à ação da insulina nos tecidos musculares eadiposos, secreção pancreática de insulina deficiente,produção hepática descontrolada de glicose. Esses defeitosfreqüentemente estão associados a anormalidades lipídicas edisfunção endotelial. Considerando-se as múltiplas lesõesfisiopatológicas no T2DM, a terapia de combinação é umaabordagem atrativa para seu tratamento.
A presente invenção está relacionada a composiçõesnutracêuticas inéditas que compreendem MAP e/ou ITP. Ascomposições nutracêuticas que compreendem MAP e/ou ITPtambém podem compreender proteínas hidrolisadas, nãohidrolisadas e carboidratos como os ingredientes ativos parao tratamento ou a prevenção de diabetes melito, ou de outrascondições associadas à redução da tolerância à glicose, porexemplo, síndrome X. Em outro aspecto, a presente invençãorelaciona-se ao uso de tais composições como um suplementonutricional para o referido tratamento ou prevenção, porexemplo, como um aditivo a preparações multivitamínicas quecompreendem vitaminas e minerais que são essenciais para amanutenção da função metabólica normal, mas não sãosintetizados no corpo. Ainda em outro aspecto, a invençãoestá relacionada a um método para o tratamento de diabetesmelito tanto tipo 1 quanto tipo 2 e para a prevenção de T2DMnaqueles indivíduos com pré-diabetes, ou redução datolerância à glicose (IGT) ou obesidade, que compreende aadministração a um indivíduo que necessite de tal tratamentode MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínas ou proteínas nãohidrolisadas e/ou carboidratos.
As composições da presente invenção destinam-separticularmente ao tratamento tanto de T1DM quanto de T2DM epara a prevenção de T2DM naqueles indivíduos com pré-diabetes, ou redução da tolerância à glicose (IGT).
A presente invenção está relacionada a uma composiçãoque compreende MAP e/ou ITP e opcionalmente um hidrolisadode proteína. Além disso, essa composição compreende umaminoácido, preferivelmente o aminoácido é leucina. O MAPe/ou ITP, e opcionalmente hidrolisado de proteína évantajosamente usado para aumentar a insulina plasmática nosangue, preferivelmente para diabetes tipo 2 ou pré-diabetes.
Surpreendentemente, verificou-se que esse MAP e/ou ITPpode ser usado para diabetes tipo 2 ou pré-diabetes, depreferência para diminuir as concentrações pós-prandiais deglicose ou para aumentar a secreção pós-prandial de insulinano sangue.
As composições que compreendem uma combinação de MAPe/ou ITP e hidrolisados de proteínas ou proteínas nãohidrolisadas e/ou carboidratos estimulam de forma sinérgicaa secreção de insulina e aumenta a disponibilidade deglicose aos tecidos-alvos sensíveis à insulina como, porexemplo, tecido adiposo, músculo esquelético e fígado e,dessa forma, geram efeitos sinérgicos no tratamento dediabetes melito.
Também reconhece-se que as doenças relacionadas aestresse e os efeitos negativos do estresse sobre o corpo,têm um impacto significativo sobre várias pessoas. Nos anosrecentes os efeitos do estresse e sua contribuição para odesenvolvimento de várias doenças e condições, tem ganhomaior aceitação na comunidade médica e científica. Osconsumidores estão se tornando cada vez mais cientes dessesproblemas potenciais e estão se tornando cada vez maisinteressados na redução ou prevenção do possível impactonegativo do estresse sobre sua saúde.
É um assunto adicional da invenção o fornecimento deum produto alimentício, ou um ingrediente que pode serincorporado nele, que é adequado para auxiliar o corpo alidar com os efeitos do estresse.
É um assunto adicional o fornecimento de um produtoalimentício que tem uma alta concentração de um ingredienteque fornece um benefício à saúde, como auxiliar o corpo alidar com os efeitos negativos do estresse.
De acordo com um aspecto, a presente invenção forneceo uso do tripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP e/ou saisdesses para a manufatura de um produto alimentíciofuncional para o tratamento terapêutico dos efeitos doestresse.
Certos peptídeos são conhecidos por exibir efeitosanti-estresse. Os tripeptídeos MAP e ITP e/ou os saisdesses são, portanto, muito adequados para uso em fornecertal a benefício à saúde. A pessoa habilitada na técnicaestá ciente de como determinar tais propriedades para ummaterial.
O termo "nutracêutico", como aqui usado, denota autilidade no campo de aplicação tanto nutricional quantofarmacêutico. Dessa forma, as composições nutracêuticaspodem ter utilidade tanto como suplemento para alimentos ebebidas quanto como formulações farmacêuticas oumedicamentos para aplicações enterais ou parenterais, quepodem ser formulações sólidas, tais como as cápsulas oucomprimidos, ou formulações líquidas, tais como soluções oususpensões. Como ficará evidente a partir do disposto acima,o termo "composição nutracêutica" também compreendealimentos e bebidas contendo MAP e/ou ITP e hidrolisados deproteínas ou proteínas não hidrolisadas e/ou carboidratos,além de composições de suplementos, por exemplo, suplementosdietéticos, contendo os ingredientes ativos mencionadosanteriormente.
O termo suplemento dietetico como aqui usado denota umproduto ingerido pela boca que contém um "ingredientedietetico" para suplementar a dieta. Os "ingredientesdietéticos" nesses produtos podem incluir: vitaminas,minerais, ervas ou outros botânicos, aminoácidos esubstâncias como enzimas, tecidos de órgãos, glandulares emetabólitos. Suplementos dietéticos também podem serextratos ou concentrados e 'podem ser encontrados em váriasformas como comprimidos, cápsulas, géis, cápsulas de gel,líquidos, ou pós. Eles também podem estar em outras formas,como uma barra, se houver, haverá informação no rótulo dosuplemento dietetico que não representará o produto como umalimento convencional ou um item único de uma refeição oudieta.
MAP e/ou ITP podem ser feitos por hidrólise oufermentação de qualquer substrato adequado contendo osfragmentos MAP e/ou ITP. Vantajosamente, o substrato deproteína contém ambos fragmentos, de MAP e/ou ITP.
Preferivelmente o substrato de proteína é caseína ou leite.
Os tripeptídeos MAP (met-ala-pro) e ITP (ile-thr-pro)também podem ser feitos por síntese química usando técnicasconvencionais.
De acordo com a presente invenção verificou-se deforma surpreendente que composições que compreendem MAPe/ou ITP estimulam a secreção pancreática de insulina eaumentam a disponibilidade de glicose aos tecidos-alvossensíveis à insulina. Portanto, as composições quecompreendem MAP e/ou ITP podem ser usadas para evitar outratar T1DM e T2DM, e para a prevenção de T2DM naquelesindivíduos com pré-diabetes, intolerância à glicose (IGT).
O uso das combinações de MAP e/ou ITP e hidrolisados deproteínas ou proteínas não hidrolisadas e/ou carboidratos,que individualmente exercem diferentes mecanismos de ação,são eficazes na obtenção e manutenção de níveis sangüíneosde glicose em pacientes diabéticos.
As combinações dos ingredientes ativos identificadosacima foram concebidas por causa de suas diferentes ações,para se beneficiarem dos efeitos sinérgicos e em váriosórgãos. Em função dos distintos mecanismos de ação dosingredientes ativos individuais, as combinações não apenasmelhoram o controle glicêmico, mas também resultam em umamenor dosagem de fármacos em alguns quadros e minimizam osefeitos adversos. Por causa de seus mecanismos e local deação distintos, as combinações específicas de suplementosdietéticos discutidas acima também se beneficiam dos efeitossinérgicos para obter um grau de redução de glicose maior doque os agentes únicos conseguem obter. Dessa forma, emboraas terapias de escolha no tratamento terapêutico de T1DM eT2DM se baseiem essencialmente na administração de insulinae de fármacos hipoglicêmicos orais, uma terapia nutricionaladequada também é de grande importância para o tratamentobem sucedido de diabéticos.
Um suplemento multivitamínico e mineral pode seradicionado às composições nutraceuticas da presente invençãopara se obter uma quantidade adequada de um nutrienteessencial que falta em algumas dietas. O suplementomultivitamínico e mineral também pode ser útil paraprevenção da doença e proteção contra perdas e deficiênciasnutricionais causadas pelos padrões de estilo de vida epadrões dietéticos comuns inadequados algumas vezesobservados no diabetes. Além disso, o estresse oxidante foiimplicado no desenvolvimento de resistência à insulina.
Espécies reagentes ao oxigênio podem prejudicar a captaçãode glicose estimulada pela insulina ao romper a cascata desinalização do receptor de insulina. O controle do estresseoxidante com antioxidantes, por exemplo, a-tocoferol(vitamina E) , ácido ascórbico (vitamina C) , pode ser devalor no tratamento de diabetes. Portanto, a ingestão de umsuplemento multivitamínico pode ser adicionada àssubstâncias ativas mencionadas acima para manter umanutrição bem balanceada.
Além disso, a combinação de MAP e/ou ITP com mineraiscomo magnésio (Mg2+) , cálcio (Ca2+) e/ou potássio (K+) podeser usada para a melhoria da saúde e a prevenção e/outratamento de doenças que incluem sem limitação, doençascardiovasculares e diabetes.
Em um aspecto preferido da invenção, a composiçãonutracêutica da presente invenção contém MAP e/ou ITP ehidrolisados de proteínas. MAP e/ou ITP estão adequadamentepresentes na composição de acordo com a invenção em umaquantidade para fornecer uma dosagem diária de cerca de0,001 g por kg de peso corporal a cerca de 1 g por kg depeso corporal do indivíduo ao qual deve ser administrada.
Um alimento ou uma bebida contém adequadamente cerca de0,05 g por porção a cerca de 50 g por porção de MAP e/ouITP. Caso a composição nutracêutica seja uma formulaçãofarmacêutica, tal formulação pode conter MAP e/ou ITP emuma quantidade de cerca de 0,001 g a cerca de 1 g porunidade de dosagem, por exemplo, por cápsula ou comprimido,ou de cerca de 0,035 g por dose diária a cerca de 70 g pordose diária de uma formulação líquida. Hidrolisados deproteínas adequadamente estão presentes na composição deacordo com a invenção em uma quantidade para fornecer umadosagem diária de cerca de 0,01 g por kg de peso corporal acerca de 3 g por kg de peso corporal do indivíduo ao qualdeve ser administrada. Um alimento ou uma bebida contémadequadamente cerca de 0,1 g por porção a cerca de 100 gpor porção de hidrolisados de proteínas. Caso a composiçãonutracêutica seja uma formulação farmacêutica, talformulação pode conter hidrolisados de proteínas em umaquantidade de cerca de 0,01 g a cerca de 5 g por unidade dedosagem, por exemplo, por cápsula ou comprimido, ou decerca de 0,7 g por dose diária a cerca de 210 g por dosediária de uma formulação líquida.
Em outro aspecto preferido da invenção, a composiçãocontém MAP e/ou ITP da forma especificada acima e proteínasnão hidrolisadas. Proteínas não hidrolisadas estãoadequadamente presentes na composição de acordo com ainvenção em uma quantidade para fornecer uma dosagem diáriade cerca de 0,01 g por kg de peso corporal a cerca de 3 gpor kg de peso corporal do indivíduo ao qual devem seradministradas. Um alimento ou uma bebida contémadequadamente cerca de 0,1 g por porção a cerca de 100 g porporção de proteínas não hidrolisadas. Caso a composiçãonutracêutica seja uma formulação farmacêutica, talformulação pode conter proteínas não hidrolisadas em umaquantidade de cerca de 0,01 g a cerca de 5 g por unidade dedosagem, por exemplo, por cápsula ou comprimido, ou de cercade 0,7 g por dose diária a cerca de 210 g por dose diária deuma formulação líquida.
Ainda em outro aspecto preferido da invenção, acomposição contém MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínasou proteínas não hidrolisadas da forma especificada acima ecarboidratos. Carboidratos estão adequadamente presentes nacomposição de acordo com a invenção em uma quantidade parafornecer uma dosagem diária de cerca de 0,01 g por kg depeso corporal a cerca de 7 g por kg de peso corporal doindivíduo ao qual devem ser administrados. Um alimento ouuma bebida contém adequadamente cerca de 0,5 g por porção acerca de 200 g por porção de carboidratos. Caso a composiçãonutracêutica seja uma formulação farmacêutica, talformulação pode conter carboidratos em uma quantidade decerca de 0,05 g a cerca de 10 g por unidade de dosagem, porexemplo, por cápsula ou comprimido, ou de cerca de 0,7 g pordose diária a cerca de 4 90 g por dose diária de umaformulação líquida.
Composições nutracêuticas preferidas da presenteinvenção compreendem MAP e/ou ITP e hidrolisados deproteínas ou proteínas não hidrolisadas e/ou carboidratos,especialmente as combinações de:
MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínas;MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínas e carboidratos;MAP e/ou ITP e proteínas não hidrolisadas;MAP e/ou ITP e proteínas não hidrolisadas e carboidratos;
Prefere-se principalmente a combinação de MAP e/ou ITPe hidrolisados de proteínas.
Faixas de dosagem (para uma pessoa de 70 kg)MAP e/ou ITP:: 0,005-70 g/dia
Hidrolisados de proteínas: 0,07-210 g/diaProteínas não hidrolisadas: 0,07-210 g/dia
Carboidratos: 0,1-490 g/dia
Os tripeptídeos MAP (met-ala-pro) e ITP (ile-thr-pro)podem ser feitos por uma variedade de métodos que incluemsíntese química, hidrólise enzimática e fermentação desoluções que contêm proteína.
A identificação de peptídeos biologicamente ativos emmisturas complexas como hidrolisados de proteínas oulíquidos que resultam da fermentação é uma tarefadesafiadora. Fugindo da questão básica: estamos usando osubstrato de proteína correto, estamos usando a enzimacorreta, nós estamos usando a cultura microbiana correta.Vários peptídeos biologicamente ativos podem estarpresentes em amostras complexas que contêm milhares depeptídeos. As abordagens tradicionais de identificação queempregam ciclos repetidos de fracionamento cromatográficolíquido de alta performance (HPLC) e avaliação bioquímicasão geralmente longos e propensos a perdas dos peptídeosbiologicamente ativos presentes tornando a detecção debioatividade relevante extremamente difícil. No presentetrabalho equipamento muito sofisticado foi usado e váriosdiferentes hidrolisados de proteínas e caldos fermentaçãoforam rastreados finalmente nos levando à identificação dosdois novos peptídeos MAP e ITP que têm propriedadesinibidoras de ACE. Em nossa abordagem um ensaio bioquímicode fluxo contínuo foi ligado on-line a um sistema defracionamento de HPLC. O efluente de coluna de HPLC foidividido entre um bioensaio de ACE de fluxo contínuo e umatécnica de análise química (espectrometria de massa).Hidrolisados brutos e caldos de fermentação foram separadospor HPLC, depois do que a presença de compostosbiologicamente ativos foi detectada por meio do ensaiobioquímico on-line. Os espectros de massa foram registradoscontinuamente de modo que informação estrutural eraimediatamente disponível quando um peptídeo mostrava umsinal positivo no ensaio bioquímico.
Os tripeptídeos MAP e ITP como identificados pelaabordagem acima mencionada podem ser produzidos por váriosmétodos que incluem vias de produção economicamenteviáveis. A produção via síntese química é possível com ouso de técnicas convencionais, por exemplo, descritas em"Peptides: Chemistry and Biology" por N. Sewald e H.D.Jakubke, eds. Wiley-VCH Verlag GmbH, 2 002, capítulo 4.
Métodos particulares de custo compensador de síntesequímica de peptídeo adequados para produção em larga escalasão baseados no uso de alquilcloroformatos ou cloreto depivaloila para a ativação do grupo carboxílico combinadocom o uso de ésteres metílicos para proteção C-terminal ebenziloxicarbonil (Z) ou grupos terc-butiloxicarbonil paraN-proteção. Por exemplo, no caso de MAP, éster metílico deL-prolina pode ser ligado com Z-ala ativado comisobutilcloroformato; o dipeptídeo resultante pode ser Z-desprotegido através de hidrogenólise usando hidrogênio ePd em C e ligado novamente com Z-met ativado porisobutilcloroformato; do tripeptídeo resultante o éstermetílico é hidrolisado usando NaOH e depois Z-desproteçãopor hidrogenólise, o tripeptídeo met-ala-pro é obtido. Deforma similar, ile-thr-pro pode ser sintetizado mas duranteas reações de ligação a função hidroxi de thr requerproteção de benzil; na etapa final esse grupo é entãosimultaneamente removido durante a Z-desproteção.
MAP e/ou ITP também podem ser feitos por hidróliseenzimática ou por abordagens de fermentação com o uso dequalquer substrato de proteína que contenha a as seqüênciasde aminoácidos MAP e/ou ITP. Vantajosamente o substrato deprotexna contém tanto fragmentos MAP quanto ITP. Substratosde proteínas preferidos para tais abordagens enzimáticasou de fermentação são leite bovino ou a fração de caseínado leite bovino. Através da otimização da fermentação oudas condições de hidrólise, a produção das moléculasbiologicamente ativas MAP e/ou ITP pode ser maximizada. Apessoa habilitada que tenta maximizar a produção saberácomo ajustar os parâmetros do processo, como tempo dehidrólise/fermentação, temperatura de hidrólise/fermentação, tipo de enzima/microorganismo e concentraçãoetc.
MAP e/ou ITP ou composições que compreendem MAP e/ouITP são vantajosamente hidrolisadas e preferivelmentefeitas de acordo com um processo que envolve as seguintesetapas:
(a) hidrólise enzimática de um substrato adequado deproteína que compreendem MAP ou ITP em sua seqüência deaminoácidos que resulta em uma produto de proteínahidrolisada que compreende os tripeptídeos MAP e/ou ITP;
(b) separação do produto de proteína hidrolisada deuma fração rica em tripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP;e opcionalmente
(c) concentração e/ou secagem da fração da etapa b)para obter um líquido concentrado ou um sólido rico emtripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP.A etapa de hidrólise enzimática (a) pode ser qualquertratamento enzimático do substrato de proteína adequado queleva a hidrólise da proteína resultando na liberação detripeptídeos MAP e/ou ITP. Embora várias combinações deenzima possam ser usadas para liberar os tripeptídeosdesejados do substrato de proteína, a enzima preferidausada no presente processo é uma endoprotease específicapara prolina ou uma oligopeptidase específica para prolina.Um substrato de proteína adequado pode ser qualquersubstrato que englobe a seqüência de aminoácidos MAP e/ouITP. Substratos de proteínas conhecidos por englobar MAPsão, por exemplo, caseína, glúten de trigo, isolado deproteína de girassol, proteína de arroz, proteína de ovo.Substratos de proteínas adequados preferivelmente eenglobamas seqüências de aminoácidos aMAP ou pMAP como ocorre embeta-caseína bovina, a fração alfa-gliadina de glúten dotrigo e na fração 2S do isolado de proteína de girassol.
O substrato de caseína pode ser qualquer material quecontenha uma quantidade substancial de beta-caseína e alfa-S2-caseína. Exemplos de substratos adequados são leite bemcomo caseína, pó de caseína, concentrados de pó de caseína,isolados de pó de caseína, ou beta-caseína, ou alfa-S2-caseína. Pref erivelmente um substrato que tem um altoconteúdo de caseína, como isolado de proteína caseína(CPI).
A enzima pode ser qualquer enzima ou combinação deenzimas que seja capaz de hidrolisar proteína como beta-caseína e/ou alfa-S2-caseína resultando na liberação de umou mais dos tripeptídeos de MAP e/ou ITP.
A etapa de separação (b) pode ser executada dequalquer forma conhecida pela pessoa habilitada, porexemplo, por precipitação, filtração, centrifugação,extração ou cromatografia e combinações desses.
Preferivelmente a etapa de separação (b) é executada usandotécnicas de micro ou ultrafiltração. O tamanho de poro dasmembranas usadas na etapa de filtração, bem como a carga damembrana podem ser usados para controlar a separação dotripeptideo MAP e/ou do tripeptideo ITP. O fracionamentodos hidrolisados de proteínas caseína usando membranascarregada UF/NF é descrito em Y. Poilot e cols, Journal ofMembrane Science 158 (1999) 105-114.
A etapa de concentração (c) pode envolvernanofiltração ou evaporação da fração gerada pela etapa (b)para gerar um líquido altamente concentrado. Seadequadamente formulado, por exemplo, com uma baixaatividade em água (Aw) , um baixo pH e pref erivelmente umconservante como benzoato ou sorbato, tais composiçõeslíquidas concentradas formam uma via atrativa de estocagemdos tripeptídeos de acordo com a invenção. Opcionalmente aetapa de evaporação é seguida por uma etapa de secagem, porexemplo, por secagem por pulverização ou liofilização paragerar um sólido que contém uma alta concentração de MAPe/ou ITP.
O processo enzimático compreende preferivelmente umaúnica etapa de incubação de enzima. O processo enzimáticode acordo com a presente invenção também relaciona-se aouso de uma protease específica para prolina que épreferivelmente livre de atividades enzimáticascontaminantes. A protease específica de prolina preferida édefinida como uma protease que hidrolisa uma ligação depeptídeo no lado do terminal carboxi da prolina. A proteaseespecífica para prolina preferida é uma protease quehidrolisa a ligação do peptídeo em um lado do terminalcarboxi dos resíduos de prolina e alanina. A proteaseespecífica para prolina é preferivelmente capaz dehidrolisar grandes moléculas de proteína como polipeptídeosou a proteína em si. O processo de acordo com a invençãotem em geral um tempo de incubação de menos que 24 horas,preferivelmente o tempo de incubação é de menos que 10horas e mais preferivelmente menos que 4 horas. Atemperatura de incubação é em geral maior que 3 0°C,preferivelmente maior que 4 0°C e mais preferivelmente maiorque 50°C.
Um outro aspecto da presente invenção é a purificaçãoe/ou separação dos tripeptídeos MAP e ITP de uma proteínahidrolisada. A maior parte da proteína hidrolisada deacordo com a invenção é preferivelmente capaz de precipitarsob condições selecionadas de pH. Esse processo depurificação compreende a alteração do pH ao pH por onde amaioria da proteína hidrolisada e não hidrolisada precipitae separada das proteínas precipitadas dos tripeptídeos(bioativos) que permanecem em solução.
Para obter aos presentes tripeptídeos com um resíduode prolina em sua extremidade carboxiterminal, o uso daprotease que pode clivar no lado do carboxiterminal dosresíduos de prolina oferece uma opção preferida. Aschamadas prolil oligopeptidases (EC 3.4.21.26) têm apossibilidade única de clivar preferencialmente peptídeosno lado carboxil dos resíduos de prolina. Proliloligopeptidases também têm a possibilidade de clivarpeptídeos no lado carboxil dos resíduos de alanina, mas aúltima reação é menos eficiente que a clivagem de ligaçãode peptídeos que envolve resíduos de prolina. Em todas asproteases específicas para prolina adequadamentecaracterizadas isoladas de mamíferos bem como de fontesmicrobianas, foi identificado um domínio único de peptidaseque exclui grandes peptídeos do sítio ativo da enzima. Defato, essas enzimas são incapazes de degradar peptídeos quecontêm mais que cerca de 30 resíduos de aminoácidos de modoque essas enzimas são agora referidas como "proliloligopeptidases" (Fulop e cols.: Cell, vol. 94, 161-170, 24de julho de 1998). Como uma conseqüência, essas proliloligopeptidases requerem uma pré-hidrólise com outrasendoproteases antes que elas possam exercer sua açãohidrolítica. No entanto, como descrito em WO 02/45523,mesmo a combinação de uma prolil oligopeptidase com taloutra endoprotease resulta em hidrolisados caracterizadospor uma proporção significativamente aumentada de peptídeoscom um resíduo de prolina carboxiterminal. Por causa disso,tais hidrolisados formam um excelente ponto de iniciaçãopara a isolação dos tripeptídeos com efeitos inibidores daACE in vitro bem como uma melhor resistência à degradaçãoproteolítica gastrointestinal.
Um "peptídeo" ou "oligopeptídeo" é aqui definido comouma cadeia de pelo menos dois aminoácidos que são ligadosatravés de ligações de peptídeos. Os termos "peptídeo" e"oligopeptídeo" são considerados sinônimos (como écomumente reconhecido) e cada termo pode ser usado de formaintercambiável à media que o contexto necessitar. Um"polipeptídeo" é aqui definido como uma cadeia que contémmais que 30 resíduos de aminoácidos. Todos as fórmulas de(oligo)peptídeo e polipeptídeo ou seqüências nessa sãoescritas da esquerda para direita na direção do terminalamino para o terminal carboxi, de acordo com prática comum.
O código de uma letra de aminoácidos aqui usado é comumenteconhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, ecols. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Uma endoprotease é aqui definida como uma enzima quehidrolisa ligações de peptídeos em um polipeptídeo em umamodalidade endo (endo-fasion) e pertence ao grupo EC 3.4.
As endoproteases são divididas em sub-subclasses com baseno mecanismo catalítico. Há sub-subclasses de serinaendoproteases (EC 3.4.21), cisteína endoproteases (EC3.4.22), aspártico endoproteases (EC 3.4.23),metaloendoproteases (EC 3.4.24) e treonina endoproteases(EC 3.4.25). Exoproteases são aqui definidas como enzimasque hidrolisam ligações de peptídeos adjacentes a um grupoterminal a-araino ("aminopeptidases") , ou a ligação dopeptídeo entre o grupo terminal carboxil e o penúltimoaminoácido ("carboxipeptidases").
WO 02/45524 descreve uma protease específica paraprolina obtível a partir de Aspergillus niger. A enzimaderivada de A. niger cliva preferencialmente nocarboxiterminal da prolina, mas também pode clivar nocarboxi terminal da hidroxiprolina and, seja com uma menoreficiência, no carboxiterminal de alanina. WO 02/45524também ensina que não existe homologia clara entre essaenzima derivada de A. niger e as prolil oligopeptidasesconhecidas de outras fontes microbianas ou de mamífero. Emcontraste com prolil oligopeptidases conhecidas, a enzimade A. niger tem um pH ácido ótimo. Embora as proliloligopeptidases conhecidas bem como a enzima derivada de A.niger sejam chamadas serina proteases, a enzima de A. nigerpertence a uma subfamília completamente diferente. A enzimasecretada por A. niger parece ser um membro da família S28de serina peptidases em vez da família S9 na qual a maioriadas prolil oligopeptidases citosólicas foram agrupadas(RAwling,N.D. e Barrett, A.J.; Biochim. Biopys. Acta 1298(1996) 1-3). A preparação da enzima derivada de A. nigercomo usada no processo da presente invenção épreferivelmente essencialmente pura significando quenenhuma atividade endoproteolítica significativa outra quenão a atividade endoproteolítica inerente da endoproteaseespecífica para prolina pura é presente. Tambémdemonstramos que nossa preparação de enzima derivada de A.niger preferivelmente usada de acordo com a presenteinvenção não contém quaisquer atividades colateraisexoproteolíticas, mais especificamente aminopeptidolíticas.Preferivelmente a atividade exoproteolítica é ausente napreparação de enzima derivada de A. niger usada no processoda invenção. Prova experimental para a noção de que aatividade endoproteolítica específica para prolina éessencialmente ausente nas cepas de Aspergillus nãorecombinantes pode ser encontrada em WO 02/45524. Por causado processo da presente invenção ser possível por incubaçãodo substrato de caseína com apenas a endoproteaseespecífica para prolina, as condições ótimas de incubaçãocomo temperatura, pH etc. podem ser facilmenteselecionadas e não precisam ser fixadas em condiçõessubótimas como seria o caso se duas ou mais enzimas fossemaplicadas. Além disso, a formação de subprodutosindesejados como, por exemplo, peptideos não bioativosadicionais ou aminoácidos livres que levam a saboresdiferentes é evitada. Tendo maiores graus de liberdade naseleção das condições de reação torna a seleção mais fácilpor outros critérios possíveis. Por exemplo é muito maisfácil selecionar agora condições que são menos sensíveis ainfecções microbianas e para otimizar as condições de pHem relação a subseqüentes etapas de precipitação deproteína. A enzima de Aspergillus não é uma oligopeptidasemas uma endopeptidase verdadeira capaz de hidrolisarproteínas intactas, grandes peptideos bem como moléculas depeptideos menores sem a necessidade de uma endoproteaseauxiliar. Esse novo e surpreendente achado abre apossibilidade de uso da enzima de A.niger para a preparaçãode hidrolisados com altos conteúdos inédito de peptideoscom um resíduo de prolina carboxiterminal porque nenhumaendoprotease auxiliar é necessária. Tais novos hidrolisadospodem ser preparados a partir de diferentes materiais deiniciação proteináceos seja de origem vegetal ou animal.
Exemplos de tais materiais de iniciação são caseínas,gelatina, proteínas de peixe ou ovo, glúten de trigo,proteína de soja e ervilha bem como proteína de arroz eproteína de girassol. Uma vez que o sódio é conhecido porter um importante papel na hipertensão, substratospreferidos para a produção de peptideos inibidores da ACEsão cálcio e potássio em vez de sais de sódio dessasproteínas.O pH ótimo da prolil endoprotease derivada de A. nigeré por volta de 4,3. Por causa desse baixo pH ótimo, aincubação de caseinato de leite bovino com a prolilendoprotease derivada de A. niger não é auto-evidente.Caseinato de leite bovino precipitará se o pH cair abaixode 6,0 mas. em pH 6,0 a enzima de A. niger tem umaatividade limitada apenas. Mesmo sob essa condição bastantedesfavorável uma incubação com a prolil endoproteasederivada de A.niger pode produzir vários peptídeosinibidores da ACE conhecidos como IPP e LPP. De formasurpreendente, nenhum VPP é produzido sob essas condições.Caseina de leite bovino incorpora inúmeras diferentesproteínas que incluem beta-caseína e kapa-caseína. Deacordo com as seqüências de amino conhecidas, beta-caseínaengloba tripeptídeos inibidores de ACE IPP, VPP e LPP.Kapa-caseína engloba apenas IPP. O fato de que a enzimaderivada de A. niger não contém qualquer atividademensurável de aminopeptidase sugere fortemente que o IPPformado é liberado da seqüência -A107-I108-P109-P110-presente em kapa-caseínas. Presumivelmente, a ligação dopeptídeo carboxiterminal de IPP é clivada pela atividadeprincipal de uma prolil endoprotease derivada de A. nigerenquanto a clivagem da ligação anterior Ala-Ile é realizadapor sua atividade específica para ala. De modo similar. Aausência de VPP pode ser explicada com base na ausência deatividade laterla de aminopeptidase. VPP é contido em beta-caseína na seqüência -p81-v82-v83-v84-p85-p86-. Assim, aendoprotease específica para prolina retira a seqüênciaVWPP mas é incapaz de liberar VPP.
Esses resultados são obtidos com incubação docaseinato com a endoprotease derivada de A. niger em umprocesso de enzima simples de uma etapa. Soluções aquosascontendo proteína são altamente suscetíveis a infecçõesmicrobianas, especialmente se mantidas por várias horas emvalores de pH acima de 5,0 e em temperaturas de 50 graus Cou menos. Especialmente, toxinas microbianas que podem serproduzidas durante tais etapas de incubaçao prolongadas eprovavelmente sobrevivem a etapas subseqüentes deaquecimento e formam uma ameaça potencial a processos degrau alimentício. A presente invenção preferivelmente usauma temperatura de incubaçao acima de 50 graus C. Emcombinação com o processo de enzima de uma etapa em que aincubaçao da enzima é realizada por um período de menos que24 horas, preferivelmente menos que 8 horas, maispreferivelmente menos que 4 horas, o processo de acordo coma invenção oferece a vantagem de melhor estabilidademicrobiológica. O uso da presente proporção enzima-substrato em combinação com as condições de altatemperatura, a retirada de IPP e LPP é completada em umperíodo de incubaçao de 3 horas.
Porque os peptídeos inibidores da ACE IPP e LPP podemser retirados da caseína com o uso de uma única,endoprotease essencialmente pura, a presente invençãoresulta em um menor número de peptídeos hidrossolúveis quenos processos de técnica prévia. Entre esses peptídeoshidrossolúveis IPP e LPP estão presentes em maioresquantidades. Isso é especialmente importante no caso de umaalta concentração de tripeptídeos inibidores de ACE sernecessária sem qualquer outros compostos freqüentementemenos ativos.De acordo com o presente processo, preferivelmentepelo menos 20%, mais pref erivelmente pelo menos 30%, maispreferivelmente pelo menos 40% de qualquer seqüência —I-P-P- ou -L-P-P- presente em uma proteína é convertida notripeptídeo IPP ou LPP, respectivamente.
Nos exemplos, nós ilustramos o efeito da purificaçãode 5 vezes dos peptídeos bioativos por uma nova esurpreendente etapa de purificação. A base desse processode purificação é formada pelas propriedades únicas daendoprotease derivada de A. niger específica para prolina.
A incubação com essa enzima libera as partes mais bioativasda molécula do substrato na forma de tripeptídeoshidrossolúveis. As partes menos bioativas ou não bioativasda molécula do substrato permanecem em uma grande extensãoem não clivada e dessa forma partes muito maiores depeptídeo ou polipeptídeo das moléculas do substrato. Devidoàs solubilidades em água limitadas dessas partes maiores depeptídeo ou polipeptídeo sob condições selecionadas de pH,essas partes menos bioativas ou não bioativas da moléculado substrato são facilmente separadas dos tripeptídeosbioativos muito mais solúveis. Nesse processo o hidrolisadoinicial é formado durante o breve período de incubação daenzima a 55 graus c, pH 6,0 e é então opcionalmenteaquecido a uma temperatura acima de 80 graus C para matartodos os microorganismos contaminantes e para inativar aprolil endopeptidase derivada de A. niger.Subseqüentemente, o hidrolisado é acidifiçado para fazeruma queda de pH para 4,5 ou pelo menos abaixo de 5,0.
Nesse valor de pH, que não pode ser usado inativar a prolilendopeptidase derivada de A. niger porque ele representa acondição ótima para a enzima, todos os grandes peptideos docaseinato precipitam de modo que apenas os menorespeptideos permanecem em solução. Uma vez que os caseinatosprecipitados podem ser facilmente removidos por decantaçãoou uma etapa de filtração ou uma centrif ugação develocidade baixa (ou seja, abaixo de 5.000 rpm), a faseaquosa contém uma alta proporção de peptideos bioativosrelativos à quantidade de proteína presente. De acordo comdados de Kjeldahl 80 a 70% da proteína de caseinato éremovida pela etapa de centrifugação de baixa velocidadeque significa uma purificação de quatro a cinco vezes dospeptideos inibidores da ACE. Nós constatamos que esseprincípio de purificação pode ser vantajosamente aplicadopara obter peptideos biologicamente ativos obtidos dematerial proteináceo outro que não caseína também. Alémdisso, não apenas hidrolisados enzimaticamente produzidosmas também proteínas que são fermentadas pormicroorganismos adequados podem ser separados e purificadosde acordo com o presente processo. A incubação da enzima esubstrato em um valor de pH próximo ao que o substratoprecipitará e em que a enzima ainda é ativa, permitirá essaetapa de purificação. Devido ao baixo pH ótimo da prolilendoprotease derivada de A. niger, as precipitações desubstrato na faixa de pH entre 1,5 e 6,5 podem serconsideradas. Em vista de seu comportamento de precipitaçãoespecífico, as precipitações de glúten acima do pH 3,5,precipitações da proteína de girassol acima do pH 4,0 eabaixo de pH 6,0, precipitações de clara de ovo acima depH 3,5 e abaixo de pH 5,0 formam exemplos de condiçõesnas quais a proteína hidrolisada precipita e as proteínasprecipitadas podem ser separadas a partir da proteínahidrolisada ou peptídeos.
Depois da decantação, filtração ou centrifugação debaixa velocidade, os sobrenadantes que contêm os peptídeosbiologicamente ativos podem ser recuperados em um estadopurificado. Uma etapa subseqüente de evaporação e secagempor pulverização produzirá uma via econômica para obtençãode uma pasta de grau alimentício ou pó com uma altabioatividade. Após a digestão dos caseinatos de acordo como processo como descrito, um pó branco e inodoro com umaalta concentração de peptídeos inibidores da ACE, é obtido.
Alternativamente, a evaporação ou nanofiltração pode serusada para também concentrar os peptídeos bioativos. Aformulação adequada de tal concentrado por aumento daatividade em água (Aw) em combinação com um ajuste de pH ea adição de um conservante de grau alimentício comobenzoato ou um sorbato produzirão um concentrado líquidomicrobiologicamente estabilizado, de grau alimentício, dospeptídeos que diminuem a pressão arterial. Se adequadamentediluído à concentração de tripeptídeo correta, um materialde iniciação versátil é obtido adequado para favorecertodos os tipos de alimentos e bebidas com propriedadesinibidoras da ACE. Se necessário, o sobrenadante obtidoapós a decantação, filtração ou centrifugação de baixavelocidade pode ser também processado para melhorar apalatabilidade do produto final. Por exemplo, osobrenadante pode fazer contato com carvão ativado em póseguido por uma etapa de filtração para remover o carvão.
Para minimizar o amargor do produto final, o sobrenadanteobtido após a decantação, filtração ou centrifugação debaixa velocidade também pode ser submetido a uma incubaçãocom uma outra protease, como subtilisina, tripsina, umaprotease neutra ou uma endoprotease específica paraglutamato. Se necessário, a concentração dosbioingredientes ativos MAP e/ou ITP pode ser aumentadaainda mais por subseqüentes etapas de purificação nas quaisé feito uso do caráter específico hidrofílico/hidrofóbicodos tripeptídeos MAP e ITP. Métodos preferidos depurificação incluem nanofiltração (separação em tamanho),extração por exemplo com hexano ou butanol seguida porevaporação/precipitação ou contato do hidrolisadoacidificado como obtido com resinas cromatográficas dafaixa Amberlite XAD (Roehm). Também podem ser usadasresinas de butil-sefarose como suprido por Pharmacia.
Em um outro exemplo nos descrevemos a identificaçãodos novos peptídeos inibidores da ACE MAP e ITP em umhidrolisado de caseína preparado com o uso da endoproteasederivada de A. niger específica para prolina em combinaçãocom o novo processo de purificação de peptídeo. Apenas ouso dessa única (essencialmente pura) endoprotease emcombinação com a remoção de uma grande proporção dospeptídeos não bioativos e equipamentos de separação e deidentificação altamente sofisticados nos permitiu traçar eidentificar esses novos tripeptídeos inibidores de ACE. Nospeptídeos bioativos derivados de caseína (CDBAP) preparadosde acordo com os exemplos (após precipitação), ostripeptídeos MAP e ITP foram identificados em quantidadesque correspondem a 2,9 mg MAP/grama CDBAP (4,8 mg MAP/gramade proteína em CDBAP) e 0,9 mg ITP/ grama CDBAP (1,4 mgITP/ grama proteína em CDBAP). Uma característica adicionalpara CDBAP é seu conteúdo extraordinariamente alto deprolina de 24% em base molar. Os testes descritos noexemplo 7 ilustram os valores muito baixos de IC50 para osdois novos tripeptídeos no teste modificado de Matsui, ouseja, 0,5 micromol/1 para MAP e 10 micromol/1 para ITP.Esse achado é ainda mais surpreendente se nós percebermosque IPP, uma dos peptídeos inibidores da ACE naturais maiseficazes conhecidos, tem um valor de IC50 nesse testemodificado de Matsui de 2,0 micromol/1.
De acordo com o presente processo preferivelmente pelomenos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, maispreferivelmente pelo menos 40% de uma seqüência -M-A-P- ouuma -I-T-P- presente em uma proteína é convertido notripeptídeo MAP ou ITP, respectivamente.
A utilidade dos peptídeos inibidores da ACE recémidentificados MAP e ITP é também ilustradas nos exemplos.No último exemplo nós mostramos que ambos peptídeossobrevivem a condições de incubação que simulam ascondições digestivas tipicamente encontradas no tratogastrointestinal com base nesses dados, nós concluímos queos novos tripeptídeos provavelmente sobrevivem no tratogastrointestinal de mamífero (por exemplo, humano) queimplica em considerável potencial econômico se usados paratratar hipertensão.
Nos exemplos nós demonstramos que o superior peptídeoinibidor de ACE MAP não pode ser apenas produzido emexperimentos de hidrólise enzimática mas é tambémdetectável em preparações de leite fermentado com ummicroorganismo de grau alimentício adequado. No entanto,nós fomos incapazes de demonstrar a presença de peptídeoITP em tal produto fermentado.
Os peptídeos MAP e/ou ITP como obtidos antes ou depoisde um etapas adicionais de purificação (por exemplo,cromatográficas) podem ser usados para a incorporação emprodutos alimentícios que são amplamente consumidos em umabase regular. Exemplos de tais produtos são margarinas,cremes, vários produtos laticínios como manteiga ouiogurtes ou leite ou bebidas que contêm soro. Embora taiscomposições sejam tipicamente administradas a sereshumanos, elas também podem ser administradas a animais,preferivelmente mamíferos, para aliviar a hipertensão. Alémdisso, a alta concentração de inibidores da ACE nosprodutos como obtido torna esses produtos muito úteis paraa incorporação em suplementos dietéticos na forma depílulas, comprimidos ou soluções altamente concentradas oupastas ou pós. Suplementos dietéticos de liberação lentaque asseguram uma liberação contínua dos peptídeosinibidores da ACE são de particular interesse. Os peptídeosMAP e/ou ITP de acordo com a invenção podem ser formuladoscomo um pó seco, por exemplo, em uma pílula, um comprimido,um granulo, um sache ou uma cápsula. Alternativamente, asenzimas de acordo com a invenção podem ser formuladas comoum líquido, por exemplo, em um xarope ou uma cápsula. Ascomposições usadas nas várias formulações e que contêm asenzimas de acordo com a invenção também podem incorporarpelo menos um composto do grupo que consiste em um veículo,adjuvante, excipiente, estabilizante, tampão e diluentefisiologicamente aceitáveis cujos termos são usados nosentido comum para indicar substâncias que auxiliam naembalagem, liberação, absorção, estabilização, ou, no casode um adjuvante, melhoria do efeito fisiológico dasenzimas. O fundamento relevante nos vários compostos quepodem ser usados em combinação com as enzimas de acordo coma invenção em uma forma em pó pode ser encontrado em"Pharmaceutical dosage forms", segunda edição, volumes 1,2e 3, ISBN 0-8247-8044-2 Mareei Dekker, Inc. Embora ospeptideos inibidores da ACE de acordo com a invençãoformulados como um pó seco possam ser estocados porperíodos bastante longos, o contato com umidade ou ar úmidodeve ser evitado por escolha de embalagem adequada como,por exemplo, um blister de alumínio. Uma forma de aplicaçãooral relativamente nova é o uso de vários tipos de cápsulasde gelatina ou comprimidos baseados em gelatina.
Em vista da relevância de peptideos inibidores da ACEnaturais para combater a hipertensão as presentes viasnovas e de custo eficaz oferecem um ponto de inícioatrativo para produtos alimentares levemente hipotensoresou mesmo produtos veterinários. Pelo fato da presente viatambém incluir uma etapa de purificação surpreendentementesimples, as possibilidades para suplementos dietéticosconcentrados que diminuem a pressão arterial são tambémaumentadas.
Pela endoprotease específica para prolina de acordocom a invenção ou usada de acordo com a invenção entende-seo polipeptídeo como mencionado nas reivindicações 1-5, 11 e13 de WO 02/45524. Portanto, essa endoprotease específicapara prolina é um polipeptídeo que tem atividadeendoproteolítica específica para prolina, selecionado dogrupo que consiste em:
(a) um polipeptídeo que tem uma seqüência deaminoácidos que tem pelo menos 4 0% de identidade deseqüência de aminoácidos com aminoácidos 1 a 526 de Id. deSeq. No:2 ou um fragmento desse;
(b) um polipeptídeo que é codificado por umpolinucleotideo que hibridiza sob condições de baixo rigorcom (i) a seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq. N° : 1ou um fragmento desse que é pelo menos 80% ou 90% idênticosobre 60, preferivelmente sobre 100 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 90% idêntico sobre 200nucleotídeos, ou (ii) a seqüência de ácidos nucleicoscomplementar à seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq.N°:l. O Id. de Seq. N°:l e Id. de Seq. N°:2 como mostradoem WO 02/45524. Preferivelmente o polipeptídeo sta em formaisolada.
O polipeptídeo preferido usado de acordo com apresente invenção tem uma seqüência de aminoácidos que tempelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda maispreferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente pelomenos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de97% de identidade com aminoácidos 1 a 526 de Id. de Seq.N°: 2 ou que compreendem o seqüência de aminoácidos de Id.de Seq. N°:2.
Preferivelmente, o polipeptídeo é codificado por umpolinucleotideo que hibridiza sob condições de baixo rigor,mais preferivelmente condições de médio rigor, e maispreferivelmente condições de alto rigor, com (i) aseqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq. N°:l ou umfragmento desse, ou (ii) a seqüência de ácidos nucleicoscomplementar à seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq.N°:1.
O termo "capaz de hibridizar" significa que opolinucleotídeo alvo da invenção pode hibridizar ao ácidonucleico usado como um marcador (por exemplo, a seqüênciade nucleotideos apresentada no Id. de Seq. N°: 1, ou umfragmento desse, ou o complemento de Id. de Seq. N° : 1) emum nível significativamente acima do de base. A invençãotambém inclui os polinucleotídeos que codificam aendoprotease específica para prolina da invenção, bem comoseqüências de nucleotideos que são complementares a ela. Aseqüência de nucleotideos pode ser RNA ou DNA, incluindoDNA genômico, DNA sintético ou cDNA. Preferivelmente, aseqüência de nucleotideos é DNA e mais preferivelmente, umaseqüência de DNA genômico. Tipicamente, um polinucleotídeoda invenção compreende uma seqüência contígua denucleotideos que é capaz de hibridizar sob condiçõesseletivas à seqüência codificadora ou o complemento daseqüência codificadora de Id. de Seq. N° : 1. Taisnucleotideos podem ser sintetizados de acordo com métodosbem conhecidos na técnica.
Um polinucleotídeo da invenção pode hibridizar àseqüência codificadora ou o complemento da seqüênciacodificadora de Id. de Seq. N°:l em um nívelsignificativamente acima do de base. Hibridização de basepode ocorrer, por exemplo, por causa de outros cDNAspresentes em uma biblioteca de cDNA. O nível do sinalgerado pela interação entre um polinucleotídeo da invençãoe a seqüência codificadora ou complemento da seqüênciacodificadora de Id. de Seq. N°: 1 é tipicamente pelo menos10 vezes, preferivelmente pelo menos 20 vezes, maispreferivelmente pelo menos 50 vezes, e ainda maispreferivelmente pelo menos 100 vezes, tão intenso quanto asinterações entres outros polinucleotideos e a seqüênciacodificadora de Id. de Seq. N°: 1. A intensidade dainteração pode ser medida, por exemplo, por rotulagem domarcador, por exemplo, com 32P. A hibridização seletivapode tipicamente ser realizada pelo uso de condições debaixo rigor (0,3 M cloreto de sódio e 0,03 M citrato desódio em cerca de 40°C), de médio rigor (por exemplo, 0,3 Mcloreto de sódio e 0,03 M citrato de sódio em cerca de50°C) ou de alto rigor (por exemplo, 0,3 M cloreto de sódioe 0,03 M citrato de sódio em cerca de 60°C).
O pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode serusado para calcular a identidade (por exemplo, usado em seuajuste padrão).
Os algoritmos PILEUP e BLAST N também podem ser usadospara calcular a identidade de seqüência ou para alinharseqüências (como identificação de seqüências equivalentesou correspondentes, por exemplo, nos ajustes padrão).
O programa para realizar análises de BLAST épublicamente disponível através do "National center forbiotechnology informação" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Esse algoritmo envolve primeiramente a identificação de parde seqüência de alta pontuação (HSPs) por identificação depalavras curtas de comprimento W na seqüência em questãoque combina ou satisfaz alguma pontuação limiar T de valorpositivo quando alinhada como uma palavra do mesmocomprimento em uma seqüência de base de dados. T é referidocomo o limiar de pontuação de palavra vizinha. Essascombinações de palavra vizinha iniciais agem como sementespara iniciar pesquisas para encontrar HSPs que as contém.As combinações de palavra são estendidas em ambas direçõesjunto a cada seqüência por tanto quanto a pontuação dealinhamento cumulativo puder ser aumentada. As extensõespara as combinações de palavra em cada direção são detidasquando: a pontuação de alinhamento cumulativo diminui pelaquantidade X de seu valor máximo atingido; a pontuaçãocumulativa vai de zero ou menos, devido ao acúmulo de um oumais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou aextremidade de cada seqüência é atingida. Os parâmetros doalgoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade evelocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrãoum comprimento de palavra (W) de 11, os alinhamentos dematriz de pontuação BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de10, M=5, N=4 e uma comparação de ambos filamentos.
O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística dasimilaridade entres duas seqüências. Uma medida dasimilaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menorprobabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação daprobabilidade pela qual uma combinação entre doisnucleotídeos ou seqüências de aminoácidos pode ocorrer. Porexemplo, a seqüência é considerada similar a uma outraseqüência se a menor probabilidade de soma em comparação daprimeira seqüência para a segunda seqüência é de menos quecerca de 1, preferivelmente menos que cerca de 0,1, maispreferivelmente menos que cerca de 0,01 e ainda maispreferivelmente de menos que cerca de 0,001.
As cepas do gênero Aspergillus têm um status de graualimentício e enzimas derivadas desses microorganismos sãoconhecidas por serem de uma fonte de grau alimentício nãosuspeita. De acordo com uma outra modalidade preferida, aenzima é secretada por sua célula produtora ao invés de umachamada enzima citosólica não secretada. Dessa forma asenzimas podem ser recuperadas do caldo de células em umestado essencialmente puro sem etapas dispendiosas depurificação. Preferivelmente, a enzima tem uma altaafinidade para seu substrato sob o pH e condições detemperatura prevalecentes.
Os produtos nutracêuticos de acordo com a invençãopodem ser de qualquer tipo alimentar. Eles podemcompreender ingredientes alimentares comuns em adição aosproduto alimentares, como flavorizantes, açúcar, frutas,minerais, vitaminas, estabilizantes, espessantes etc. Emquantidades adequadas.
Preferivelmente, the produto nutracêutico compreende50-200 mmol/kg K+ e/ou 15-60 mmol/kg Ca2+ e/ou 6-25 mmol/kgMg2+ mais preferivelmente, 100-150 mmol/kg K+ e/ou 30-50mmol/kg Ca2+ e/ou 10-25 mmol/kg Mg2+ e mais preferivelmente110-135 mmol/kg K+ e/ou 35-45 mmol/kg Ca2+ e/ou 13-20mmol/kg Mg2+. Esses cátions têm um efeito benéfico detambém diminuir a pressão arterial quando incorporados nosthe produtos nutracêuticos de acordo com a invenção.
Vantajosamente, o produto nutracêutico compreende umaou mais vitaminas B.
A vitamina B ácido fólico é conhecida por participarno metabolismo de homocisteína, um aminoácido na dietahumana, por muitos anos, altos níveis de homocisteína têmsido correlacionados à alta incidência de doençacardiovascular. Acredita-se que diminuindo a homocisteínapode haver redução do risco de doença cardiovascular.
As vitaminas B6 e B12 são conhecidas por interferircom a biossíntese de purina e tiamina, por participar nasíntese do grupo metil no processo de metilação dahomocisteína para produzir metionina e em vários processosde crescimento. A vitamina B6 (cloridrato de piridoxina) éum suplemento vitamínico conhecido. A vitamina B12(cianobalamina) contribui para a saúde do sistema nervoso eé envolvida na produção de hemáceas. Ela também é conhecidacomo vitamina em suplementos alimentícios.
Por causa de seu efeito positivo combinado sobre aredução do risco de doença cardiovascular, é preferível queos produtos de acordo com a invenção compreendam vitaminaB6 e vitamina B12 e ácido fólico.
A quantidade das vitaminas B no produto nutracêuticopode ser calculada pela pessoa habilitada baseado emquantidades diárias dessas vitaminas B aqui apresentadas:ácido fólico: 200-800 ug/dia, preferivelmente 200-400ug/dia; vitamina B6: 0,2 - 2 mg/dia, preferivelmente 0,5-1mg/dia e vitamina B12: 0,5-4 ug/dia, preferivelmente 1 -2 ug/dia.
Preferivelmente, o produto nutracêutico compreende de3 a 25 % em peso de esterol, mais preferivelmente de 7 a 15% em peso de esterol. A vantagem da incorporação de esterolé que ele causará a redução no nível de colesterol LDL nosangue humano, que resultará na redução do riscocardiovascular.
Quando é feita referência a esterol isso inclui osestanóis saturados e derivados esterifiçados deesterol/estanol ou misturas de qualquer um desses.Nesse pedido quando é feita referência a esteroléster,essa também inclui seus derivados saturados, os ésteres deestanol e combinações de ésteres de esterol e estanol.
Esteróis ou fitosteróis, também conhecidos comoesteróis de plantas ou esteróis vegetais podem serclassificados em três grupos, 4-desmetilsteróis, 4-monometilsteróis e 4,41-dimetilsteróis. Em óleo, elesexistem principalmente, como esteróis livres e ésteres deesterol de ácidos graxos embora glicosídeos de esterol eglicosídeos de esterol acuados sejam também presentes. Hátrês fitosteróis principais, ou seja, beta-sitosterol,estigmasterol e campesterol. Desenhos esquemáticos doscomponentes são como apresentados em "Influence ofProcessing on Sterols of Edible Vegetable Oils", S.P.Kochhar; Prog. Lipid Res. 22: pp. 161-188.
Os respectivos derivados saturados 5-alfa comositostanol, campestanol e ergostanol e seus derivados sãoreferidos nessa especificação como estanóis.
Preferivelmente, o esterol ou estanol (opcionalmenteesterifiçado) é selecionado do grupo que compreendem ésterde ácido graxo de p-sitosterol, {3-sitostanol, campesterol,campestanol, estigmasterol, brassicasterol, brassicastanolou uma mistura desses.
Os esteróis ou estanóis são opcionalmente pelo menosparcialmente esterifiçados com um ácido graxo.Preferivelmente os esteróis ou estanóis são esterifiçadoscom um ou mais ácidos graxos C2-22- para os objetivos dainvenção o termo ácido graxo C2-22 refere-se a qualquermolécula que compreendem uma cadeia principal C2-22 e pelomenos um grupo ácido. Embora não preferível no presentecontexto a cadeia principal C2-22 pode ser parcialmentesubstituída ou cadeias laterais podem ser presentes.
Preferivelmente, no entanto, os ácidos graxos C2-22 sãomoléculas lineares que compreendem um ou dois grupo(s)ácidos como grupo(s) de extremidade. Mais preferível sãoácidos graxos C8-22 lineares uma vez que esses ocorrem emóleos naturais.
Exemplos adequados de tais ácidos graxos são ácidoacético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido capróico,ácido caprílico, ácido cáprico. Outros ácidos adequadossão, por exemplo, ácido cítrico, ácido lático, ácidooxálico e ácido maleico. Mais preferidos são ácidomirístico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico,ácido araquídico, ácido beênico, ácido oléico, ácidocetoléico, ácido erúcico, ácido elaídico, ácido linoleico eácido linolênico.
Quando desejada uma mistura de ácidos graxos pode serusada para esterificação dos esteróis ou estanóis. Porexemplo, é possível usar uma gordura de ocorrência naturalou óleo como uma fonte do ácido graxo e para realizar aesterificação via uma reação inter-esterificação.
Os ingredientes nutracêuticos acima descritos, quecontribuem para aumentar a saúde cardiovascular, K+, Ca2+ eMg2+, vitaminas B (ácido fólico, B6, B12) e esteróis sãoaqui coletivamente referidos como ingredientes da saúdecardíaca.
Os exemplos a seguir também ilustram a invenção.
A. Composições farmacêuticas podem ser preparadas porprocedimentos convencionais de formulação usando osingredientes abaixo especificados:Exemplo 1
Cápsula de gelatina macia
Cápsulas de gelatina macia são preparadas porprocedimentos convencionais que usam ingredientesespecificados abaixo:
ingredientes ativos: MAP e/ou ITP 0,1 g, hidrolisados deproteínas 0,3 g
outros ingredientes: glicerol, água, gelatina, óleo vegetal
Exemplo 2
Cápsula de gelatina dura
cápsulas de gelatina dura são preparadas porprocedimentos convencionais que usam ingredientesespecificados abaixo:
ingredientes ativos: MAP e/ou ITP 0,3 g, hidrolisados deproteínas 0,7 g
outros ingredientes:
agentes de preenchimento: lactose ou celulose ou derivadosde celulose q.s
lubrificante: estearato de magnésio se necessário (0,5%)
Exemplo 3
Comprimido
Comprimidos são preparados por procedimentosconvencionais que usam ingredientes especificados abaixo:ingredientes ativos: MAP e/ou ITP 0,4 g, proteína nãohidrolisada 0,4 g
outros ingredientes: celulose microcristalina, dióxido desilicone (Si02) , esterarato de magnésio, croscarmelosesódica.
B. itens alimentícios podem ser preparados porprocedimentos convencionais que usam ingredientesespecificados abaixo:
Exemplo 4
Refresco com 3 0% de sucoPorção típica: 240 mlingredientes ativos:
MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínas e maltodextrinacomo uma fonte de carboidrato são incorporados nesse itemalimentar:
MAP e/ou ITP: 0,5-5 g/ por porçãohidrolisados de proteínas: 1,5-15 g/ por porçãomaltodextrina: 3-30 g/ por porção
I. Um composto de refresco é preparado a partir dosseguintes ingredientes:
concentrados de suco e sabores solúveis em água1.1 Concentrado de laranja
60,3°brix, 5,15% de acidez 657,99concentrado de limão
43,5 °brix, 32,7% de acidez 95,96sabor de laranja, solúvel em água 13,43sabor de damasco, solúvel em água 6,71água 26.46
1.2 Cor
b-caroteno 10% cws
0,89
água
67, 65
25
1.3 Ácido e antioxidante
ácido ascórbico
4,11
ácido cítrico anidro
0,69
água
43,18
1.4 Estabilizantes
pectina
0,20benzoato de sódio 2,74
água 65,60
1.5 Sabores solúveis em óleo
sabor de laranja, solúvel em óleo 0,34
óleo de laranja destilado 0,34
1.6 Ingredientes ativos
Ingredientes ativos (isso significa o ingredienteativo acima mencionado: MAP e/ou ITP e hidrolisados deproteínas e maltodextrina nas concentrações acimamencionadas.
Concentrados de suco de fruta e sabores solúveis emágua são misturados sem incorporação de ar. A cor édissolvida em água deionizada. Ácido ascórbico e ácidocítricô são dissolvidos em água. Benzoato de sódio édissolvido em água. A pectina é adicionada sob agitação edissolvida com fervura. A solução é resfriada. Óleo delaranja e sabores solúveis em óleo são pré-misturados. Osingredientes ativos como mencionado em 1.6 são misturados aseco e então agitados preferivelmente na mistura deconcentrado de suco de fruta (1.1).
Para preparar o composto do refresco, todas as partes3.1.1 a 3.1.6 são misturadas antes da homogeneização usandoum Turrax e então um homogeneizador de alta pressão (pi =20MPa, p2 = 5 MPa).
II. Um xarope engarrafado é preparado a partir dosseguintes ingredientes:
Composto de refresco 74,50
Água 50,00
Xarope de açúcar 60° brix 150,00
Os ingredientes do xarope engarrafado são misturados.O xarope engarrafado é diluído com água para 1 L de bebidapronta.
Variações:
Em vez do uso de benzoato de sódio, a bebida pode serpasteurizada. A bebida também pode ser carbonizada.
Exemplo 5
Incubação de caseinato de potássio com a endoproteaseespecifica para prolina de A. niger rapidamente produz IPPe LPP mas não VPP.
Nesse experimento a endoprotease específica paraprolina superproduzida e essencialmente pura de A. nigerfoi incubada com caseinato de potássio para testar aliberação dos peptídeos inibidores da ACE IPP, VPP bem comoLPP. A endoprotease usada foi essencialmente purasignificando que nenhuma atividade endoproteolíticasignificativa outra que não a atividade endoproteolíticainerente à endoprotease específica para prolina pura (ouseja, clivagem carboxiterminal de prolina e alaninaresíduos) é presente.
Para limitar o consumo de sódio como o resultado daingestão de peptídeos inibidores da ACE as tanto quantopossível, caseinato de potássio foi usado como o substratonessa incubação.
O caseinato foi suspenso em água a 65 graus C em umaconcentração de 10% (p/p) de proteína depois do que o pHfoi ajustado a 6,0 utilizando ácido fosfórico. Então, asuspensão foi resfriada a 55 graus C e a endoproteasederivada de A. niger específica para prolina foi adicionadaem uma concentração de 4 unidades/grama de proteína (veja,a seção materiais e métodos para definição de unidade). Sobagitação contínua essa mistura foi incubada por 24 horas.Nenhum ajuste de pH adicional foi realizado durante esseperíodo. As amostras foram feitas depois de 1, 2, 3, 4, 8 e24 horas de incubação. De cada amostra, a atividade daenzima foi terminada por aquecimento imediato da amostra a90 graus C por 5 minutos. Após resfriamento, o pH de cadaamostra foi rapidamente diminuído a 4,5 usando ácidofosfórico depois do que a suspensão foi centrifugada por 5minutos a 3.000 rpm em uma centrífuga de topo de mesaHereaus. O sobrenadante completamente transparente foiusado para análise LC/MS/MS para quantificar os peptídeosVPP, IPP, LPP, WVPP e WVPPf no sobrenadante (seja a seçãomateriais & métodos).
Caseína de leite bovino incorpora inúmeras diferentesproteínas que incluem beta-caseína e kapa-caseína. Deacordo com as seqüências amino conhecidas, beta-caseínaengloba os tripeptídeos inibidores de ACE IPP, VPP e LPP.Em beta-caseína IPP é contido na seqüência -P71-Q72-N73-I74-P75-P76-/ VPP é contido na seqüência -P8i-V82-V83-V84-P85-P86- eLPP é contido na seqüência -P150-L151.-P152-P153-. Kapa-caseína,que é presente em preparações de caseinato precipitadas emácido em uma concentração molar de quase 50% daconcentração de beta-caseína, engloba apenas IPP. Em kapa-caseína IPP é contido na seqüência -A107-I108-P109-P110-• Osoutros constituintes da proteína de caseína não contêm IPP,VPP ou LPP.
As tabelas 2 e 3 mostram as concentrações dospeptídeos presentes nos sobrenadantes acidificados ecentrifugados como calculado por grama de caseinato depotássio adicionado à mistura de incubação. Como mostradona tabela 2, IPP atinge sua concentração máxima após 1 horade incubação. Além disso, a concentração de IPP não aumentamais. A formação do pentapeptideo VWPP mostra a mesmacinética que a geração de IPP. Como teoricamente esperado,o rendimento molar de VWPP é similar ao rendimento molardo peptídeo LPP. O rendimento de LPP e de VWPP atingemquase 60% daquilo que seria teoricamente possível. O fatode que a concentração máxima de LPP é atingida apenasdepois de 3 horas de incubação sugere que a clivagemdaquela e particular da molécula de beta-caseína é talvezmais difícil. Em contraste com VWPP, o hexapeptídeo WVPPFnão é formado completamente. Essa observação sugere que aendoprotease específica para prolina cliva de forma eficaza ligação -P-F- dessa forma gerando VWPP. O tripeptídeoIPP é formado imediatamente mas seu rendimento molar não émais que cerca de um terço do rendimento molar máximo deVWPP ou LPP. Uma vez que o tripeptídeo IPP está contido embeta-caseínas como em kapa-caseínas, esse resultado éinesperado. Uma explicação provável para essa observação éque a protease específica para prolina pode gerar IPP masda porção kapa-caseína dos caseinatos apenas. Em vista daseqüência de aminoácidos relevante de kapa-caseínas issosugere que a ligação do peptídeo -A107-Ii08- é clivada pelaatividade específica para alanina da enzima. Se verdadeiro,a quantidade de IPP liberada atinge aproximadamente 40% daquantidade que está presente em kapa-caseína, mas não maisque cerca de 10% do IPP que é teoricamente presente em betamais kapa caseína. Esse mecanismo de clivagem para aliberação de IPP também explica porque VPP não pode serformado a partir de sua molécula precursora VWPP: aatividade endoproteolítica necessária simplesmente não estápresente na preparação de enzima derivada de A. nigerusada.
Tabela 2
Conteúdo de peptídeo molar de sobrenadantes acidificadoscalculado por grama de proteína adicionada.
<table>table see original document page 52</column></row><table>
Exemplo 6
Incorporação de uma etapa de precipitação de caseínaácida resulta em uma concentração de 5-vezes dos peptídeosinibidores da ACEComo descrito no exemplo 5, caseinato de potássio emuma concentração de 10% (p/p) de proteína foi submetido auma incubação com a endoprotease derivada de A. nigerespecífica para prolina em pH 6,0. Após vários períodos deincubação as amostras foram aquecidas para interromperatividade adicional da enzima depois do que o pH foidiminuído para 4,5 para minimizar a solubilidade dacaseína. Moléculas não solúveis de caseína foram removidaspor uma centrifugação de baixa velocidade. Nas tabelas 2 e3 nós fornecemos concentrações de peptídeos inibidores daACE calculadas com base na concentração inicial de 10% deproteína. No entanto, como o resultado da acidificação e asubseqüente etapa de centrifugação, uma grande proporção daproteína adicionada foi removidos. Para levar emconsideração esses conteúdos reduzidos da proteína dossobrenadantes acidifiçados, análises de nitrogênio(Kjeldahl) foram realizadas. De acordo com os últimos dadosos vários sobrenadantes continham os níveis de proteínamostrados na Tabela 4.
Tabela 4
Conteúdo de Proteína de sobrenadantes acidificados
<table>table see original document page 53</column></row><table>
Levando esses dados em consideração, nós recalculamosa concentração dos peptídeos inibidores da ACE presentes emcada sobrenadante mas dessa vez usando seu conteúdo real deproteína. Esses dados recalculados data são mostrados naTabela 5.
Tabela 5
Concentrações de peptídeos em sobrenadantes acidificadoscalculadas por grama de de proteína presente.
<table>table see original document page 54</column></row><table>
A comparação dos dados apresentados nas Tabelas 3 e 5mostra claramente que a etapa simples de acidificação poruma etapa de decantação industrialmente, filtração oucentrifugação de baixa velocidade viáveis resulta em umaumento de 5 vezes na concentração dos peptídeos inibidoresda ACE específicos.
Exemplo 7
Identificação dos novos e potentes tripeptídeos inibidoresde ACE MAP e ITP em hidrolisados concentrados de caseína
Para facilitar uma análise mais completa dos peptídeosbioativos presentes, o hidrolisado de caseína obtido peladigestão com endoprotease derivada de A. niger específicapara prolina pura e purificado por precipitação de ácidofoi preparado em uma escala preparatória. Para esse fim3.000 gramas de caseinato de potássio foram suspensos em 25litros de água a 75°C. Depois de uma homogeneizaçãocompleta o pH foi lentamente ajustado para 6,0 usandoácido fosfórico diluído. Após resfriamento a 55 graus C, aendoprotease derivada de A. niger específica para prolinasfoi adicionada em uma concentração de 4 unidades deenzima/grama de caseinato (veja a seção materiais & métodospara definição de unidade) . Após uma incubação (comagitação) por 3 horas a 55 graus C, o pH foi diminuídopara 4,5 por lenta adição de ácido fosfórico concentrado.
Nessa preparação de maior escala etapa de tratamento porcalor para inativar a endoprotease específica para prolinanessa parte do processo foi omitida. Então a suspensão foirapidamente resfriada a 4 graus C e mantida de um dia parao outro (sem agitação) nessa temperatura. Na próxima manhãa camada superior transparente foi decantada e evaporadapara atingir um nível fr 40% de matéria seca. O últimolíquido concentrado foi submetido a um tratamento UHT de 4segundos a 140 graus C e então ultrafiltrado a 50 graus C.Após filtração de germe, o seco foi seco por pulverização.
Esse material é aqui referido como peptídeos bioativosderivados de caseína (CDBAP) . Com o uso de procedimentosLC/MS apontados na seção materiais & métodos, o conteúdo deIPP, LPP e VPP do produto em pó foi determinado. De acordocom seu conteúdo de nitrogênio, o produto em pó tem umconteúdo de proteína de cerca de 60% (usando um fator deconversão de 6,38) . Os conteúdos de IPP, LPP e VPP do pósão fornecidos na Tabela 6. A composição de aminoácidos doproduto CDBAP é fornecida na Tabela 7. É bastante notável oaumento do conteúdo molar de prolina do material seco porpulverização obtido após precipitação de ácido: de 12%inicial para aproximadamente 24%.
Tabela 6: conteúdo de IPP, LPP e VPP de CDBAP.
<table>table see original document page 56</column></row><table>
Tabela 7: Composição de aminoácidos do material deiniciação de caseinato de potássio e CDBAP (conteúdo deaminoácido após hidrólise ácida e mostrado comopercentagens do conteúdo de aminoácido molar).
<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>
A presença de novos peptídeos inibidores da ACE emCDBAP foi investigada pelo uso de separação cromatográficabidimensional combinada com um ensaio de inibição de ACE emlinha e espectrometria de massa para identificação. Naprimeira análise a mistura de peptídeos foi separada em umacoluna de cromatográfia líquida (LC) ODS3 e perfis deinibição de ACE foram gerados das várias frações obtidas.Em uma segunda análise as frações da primeira coluna quemostram uma alta inibição de ACE foram também separadas emuma coluna Biosuite LC usando um diferente perfil degradiente. As frações coletadas dessa segunda coluna foramdivididas em duas partes: uma parte foi usada para amedição da inibição de ACE em linha enquanto a outra partefoi submetida a análise MS e MS-MS para identificar ospeptídeos presentes.
Todas as análises foram realizadas em sistema Alliance2795 HPLC (Waters, Etten-Leur, Holanda) equipado com umadetector de UV de traço duplo. Para a identificação dospeptídeos o sistema de HPLC foi ligado a um espectrômetrode massa Q-TOF do mesmo fornecedor. Nos testes 20 pl de umasolução a 10% (p/v) de CDBAP em água Milli-Q foraminjetados em uma coluna 150 x 2,1 Inertsil 5 0DS3 com umtamanho de partícula de 5 um (Varian, Middelburg, Holanda).A fase A móvel consistia em uma solução a 0,1% de ácidotrifluoracético (TFA) em água Milli-Q. A fase móvel Bconsistia em uma solução a 0,1% de TFA em acetonitrila. Acomposição eluente inicial foi 100% A. O eluente foimantido em 100% de A por 5 minutos. Então um gradientelinear foi iniciado em 10 minutos a 5% de B, seguido por umgradiente linear em 10 minutos para 30% de B. A coluna foiestimulada elevando a concentração de B para 70% em 5minutos, e foi mantida a 70% de B por mais 5 minutos.
Depois disso o eluente foi trocado para 100% de A em 1minuto e equilibrado por 9 minutos. O tempo de passagemtotal foi de 50 minutos. O fluxo de efluente foi 0,2 mlmin"1 e a temperatura da coluna foi ajustada em 60°C. Umcromatograma de UV foi registrado a 215 nm. As frações doeluente foram coletadas em uma placa de 96 cavidades usandoum tempo de intervalo de 1 minuto que resulta em volumes defração de 200 ul. O efluente nas cavidades foi neutralizadopor adição de 8 0 ul de uma solução a 0,05% de hidróxido deamônio aquoso (25%). O solvente foi evaporado até secar sobnitrogênio a 50°C. Depois disso, o resíduo foireconstituído em 40 ul de água Milli-Q e misturado por 1minuto.
Para o ensaio de inibição de ACE em linha 27 ul de33,4 mU ml"1 ACE (enzima obtida de Sigma) em solução salinatamponada por fosfato (PBS) pH 7,4 com uma concentração decloreto de 26 0 mM foi adicionada e a mistura foi deixada emincubação por 5 minutos em um misturador de placa de 96cavidades a 700 rpm. Após o período de incubação, 13 ul deuma solução 0,35 mM ácido hipúrico-histidina-leucine (hhl)em tampão de PBS foi adicionada e misturada por 1 minuto a700 rpm. A mistura foi deixada em reação por 60 minutos a50°C em um forno GC. Depois da reação, a placa foiresfriada em gelo em derretimento.
A placa de 96 cavidades foi então analisada em umacoluna flash-HPLC. Da mistura de reação de cada cavidade,30 ul foram injetados em uma coluna de HPLC Chromlith FlashRP18e 25 x 4,6 mm (Merck, Darmstadt, Alemanha) equipada comuma coluna de guarda 10 x 4,6 mm RP18e do mesmo fornecedor.A fase móvel isocrática consistia em uma solução a 0,1% deTFA em água/acetonitrila 79/21. O fluxo de eluente foi 2 mlmin"1 e a temperatura da coluna foi de 25°C. As injeçõesforam realizadas com um tempo de intervalo de 1 minuto,ácido hipúrico (H) e HHL foram monitorados a 28 0 nm. Asalturas do pico de H e HHL foram medidas e a inibição deACE (ACEI) de cada fração foi calculada de acordo com aequação:
<formula>formula see original document page 59</formula>
ACEIa percentagem de inibição do analito
DCw grau de clivagem por ACE de HHL para H e HL em água
DCa grau de clivagem de HHL para H e HL para o analito
O grau de clivagem foi calculado por expressão daaltura do pico de H como uma fração da soma das alturas dospicos de H e HHL.
A maior inibição de ACE foi medida nas frações queeluem entre 18 e 26 minutos. Essa região foi coletada ereinjetada em uma coluna 150 x 2,1 mm Biosuite com umtamanho de partícula de 3 um (Waters, Etten-Leur, Holanda).A fase móvel A consistiu em uma solução a 0,1% de ácidofórmico (FA) em água Milli-Q. A fase móvel B consistiu emuma solução de FA a 0,1% em metanol. A composição eluenteinicial foi 100% A. O eluente foi mantido em 100% de A por5 minutos. Depois disso, um gradiente linear foi iniciadoem 15 minutos a 5% de B, seguido por um gradiente linear em30 minutos para 60% de B. O eluente foi mantido a 60% de Bpor mais 5 minutos. Finalmente o eluente foi reduzido para100% de fase móvel A em 1 minuto e equilibrado por 10minutos. O tempo de passagem total foi de 65 minutos. 0fluxo de efluente foi 0,2 ml min"1 e a temperatura dacoluna foi ajustada em 60°C. O traço de UV foi registrado a215 nm. As frações do eluente foram coletadas da colunaBiosuite em 10 segundos de tempo de intervalo. As fraçõesforam novamente divididas em duas partes, uma parte foiusada para medir a atividade usando o método de inibição deACE em linha anteriormente descrito, enquanto a outra partefoi usada para identificar os peptídeos ativos que usam MSe MS-MS.
Dois picos cromatográficos com íons moleculares de326,2080 Da e dois outros picos com íons moleculares de33 0,2029 Da e 318,1488 Da corresponderam com a inibição deACE aumentada medida na área entre 18 e 26 minutos. UsandoMS-MS, esses peptídeos foram identificados como os isômerosestruturais IPP e LPP (- 0,6 ppm) , ITP (-4,8 ppm) e MAP(+2,8 ppm) respectivamente. As fontes de proteína dospeptídeos são kapa-caseína Í108-110 (IPP), p-caseína fl51-153 (LPP), a-s2-caseína Í119-121 (ITP) e p-caseína Í102-104(MAP) . IPP e LPP foram relatados anteriormente comopeptídeos inibidores da ACE com valores de IC50 de 5 e 9,6um respectivamente (Y. Nakamura, M. Yamamoto., K. Sakai.,A. Okubo., S. Yamazaki, T. Takano, J. Dairy Sei. 78 (1995)777-783; Y. Aryoshi, Trends in Food Science and Technol. 4(1993) 139-144) . No entanto, os tripeptídeos ITP e MAPnunca foram antes relatados como potentes peptídeosinibidores da ACE.
MAP, ITP e IPP foram quimicamente sintetizados e aatividade de cada peptídeo foi medida usando um ensaiomodificado de Matsui aqui descrito.
A quantificação de MAP e ITP nas várias amostras foirealizada em um instrumento Micromass Quattro II MS operadono eletropulverização positivo, modo de monitoramento dereação múltiplo. O método de HPLC usado foi similar àqueledescrito acima. Os ajustes de MS (ESI+) foram como sesegue: voltagem de cone 37 V, voltagem capilar 4 kV,secagem de gás nitrogênio a 300 l/h. Temperatura da fonte enebulizador: 100°C e 250°C, respectivamente. Os peptídeossintetizados foram usados para preparar uma linha decalibragem usando o íon precursor 318,1 e os íons doproduto somado 227,2 e 347,2 para MAP e usando o íonprecursor 320,2 e os íons do produto somado 282,2 e 501,2para ITP. De acordo com essas análises os novostripeptídeos inibidores de ACE MAP e ITP estão presentes noproduto CDBAP em quantidades que correspondem com 2,9 mgMAP/grama de CDBAP ou 4,8 mg MAP/grama de proteína em CDBAPe 0,9 mg ITP/grama de CDBAP e 1,4 mg ITP/grama de proteínaem CDBAP.
Para determinar a atividade de inibição de ACE de MAPe ITP , os tripeptídeos quimicamente sintetizados foramanalisados de acordo com o método de Matsui e cols.(Matsui, T. e cols. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56:517-518) com algumas pequenas modificações. As váriasincubações são mostradas na Tabela 8.
Tabela 8: Procedimento para ensaio de inibição de ACE deMatsui. Os componentes foram adicionados em um tubo de 1,5ml com um volume final de 120 ul.
<table>table see original document page 62</column></row><table>
Cada uma das quatro amostras continha 75 ml 3 mmhipuril histidina leucina (hip-his-leu, sigma) dissolvidosem uma solução de 250 mm borato contendo 200 mM Nacl, pH8,3. ACE foi obtido de Sigma. As misturas foram incubadas a3 7°C e interrompidas depois de 3 0 minutos pela adição de125 ul 0,5 M HC1. Subseqüentemente, 225 pl de soluçãobicine/NaOH (1 M NaOH:0,25 m bicine (4:6)) foramadicionados, seguido por 25 ul 0,1 M TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico, Fluka, Suíça; em 0,1 M Na2HP04) .
Depois de incubação por 20 minutos a 37°C, 4 ml 4 mM Na2S03em 0,2 M NaH2P04 foi adicionado e a absorvência de luz a416 nm foi medica com espectrofotômetro UV/Vis (ShimadzuUV-1601 com um controlado CPS, Holanda).
A quantidade da atividade de inibição de ACE (ACEI)foi calculada como uma percentagem de inibição comparadacom a taxa de conversão de ACE na ausência de um inibidorde acordo com a seguinte fórmula:
ACEI (%) = ((controle 1 - controle 2)-(amostra 1- amostra2))/(controle 1- controle 2)) * 100 em quecontrole 1 = absorvência sem componente inibidor de ACE(=atividade max. de ACE) [AU].controle 2 = absorvencia sem componente inibidor de ACE esem ACE (valor de base) [AU].
Amostra 1 - absorvencia na presença de ACE e do componenteinibidor de ACE [AU].
Amostra 2 = absorvencia na presença do componente inibidorde ACE, mas sem ACE [AU].
As IC50 dos tripeptídeos MAP e ITP quimicamentesintetizados como obtido são mostradas na Tabela 9 juntocom valores de IC50 obtidos nas medições em linha usadas nafase de rastreamento do experimento. A medição de IPPquimicamente sintetizado foi incluída como uma referênciainterna para as várias medições.
Tabela 9: Inibição de ACE (valores de IC50) de MAP, ITP evalores de IPP determinado pelo ensaio de ACE em linha e oensaio modificado de Matsui.
<table>table see original document page 63</column></row><table>
Exemplo 8
Novos peptídeos inibidores da ACE MAP e ITP provavelmentesobrevivem no trato gastrointestinal humano
Após o consumo, as proteínas e peptídeos da dietahumana são expostos a vários processo enzimáticosdigestivos no trato gastrointestinal. Para avaliar aestabilidade dos peptídeos bioativos recém identificados notrato gastrointestinal humano, a preparação de CDBAP(preparada como descrito no exemplo 7) foi submetida a umtratamento gastrointestinal (GIT) que simula as condiçõesdigestivas tipicamente encontradas no corpo humano.Amostras obtidas após vários tempos de incubação no modelode sistema GIT foram analisadas usando o sistema em linhaHPLC-bioensaio-MS ou HRS-MS para quantificar quaisquerpeptideos residuais MAP e ITP. O procedimento GIT foirealizado em um dispositivo padrão de mistura que incorporaum frasco de 100 ml (suprido por Vankel, US). A temperaturado banho de água foi ajustada em 37,5°C e a velocidade foiescolhida de modo que a amostra fosse mantida em suspensão(100 rpm).
Cerca de 3,4 gramas de CDBAP (nível de proteína deaprox 60%) foi dissolvida/suspensa em 100 ml de água Milli-Q. Durante a simulação gástrica 5 M HC1 foram usados paradiminuir o pH. Ao final da simulação gástrica e durante afase duodenal 5 M NaOH foram usados para elevar o pH.
A suspensão de CDBAP foi pré-aquecida a 37,5°C e 5 mlda suspensão foram removidos para dissolver 0,31 g depepsina (Fluka order no. 77161) . Em t= 0 minutos os 5 mlcom a pepsina agora dissolvida foram adicionados de volta àsuspensão. Então o pH da suspensão de CDBAP foi ajustadoentamente por uso manual de um medidor de pH separado deacordo com o seguinte esquema:
<table>table see original document page 64</column></row><table>em t = 90 min 0,139 g de 8 vezes USP pancreatina (Sigmaorder no. p7545) foi cuidadosamente misturado em outros 5ml da suspensão de CDBAP e imediatamente adicionado devolta. A incubação continuou de acordo com o seguinteesquema:
t = 93 min pH a 5,5
t = 95 min pH a 6,3
t = 100 min pH a 7,1
O experimento foi interrompido em t = 125 minutos e opH foi checado (foi ainda pH 7).
Então as amostras foram transferidas para um bécher eforam colocadas em um microondas até ferver.
Subseqüentemente, as amostras foram transferidas para tubosde vidro e incubadas a 95°C por 60 minutos para inativartoda a atividade da protease. Após resfriamento as amostrasforam colocadas em tubos Falcon e centrifugadas por 10minutos a 3 000 x g. O sobrenadante foi liofilizado. Aconcentração total N do pó como obtido foi determinada econvertida ao nível de proteína usando o fator de Kjeldahlde caseína (6,38) . De acordo com esses dados o nível deproteína da preparação de CDBAP após o procedimento GIT foide 48,4%. Os níveis de MAP e ITP que sobrevivem aotratamento proteolítico de acordo com o procedimento GITforam determinados como descrito no exemplo 7 e os dadosobtidos são mostrados na Tabela 10.
De acordo com os resultados do experimento MAP e ITPexibem uma alta resistência contra digestão GIT. Emcombinação com os baixos valores de IC50 para essestripeptídeos (também como determinado no exemplo 7) , osdados sugerem considerável potencial para os dois novospeptídeos inibidores da ACE como peptídeos de diminuição dapressão arterial.
Tabela 10: Concentrações de MAP e ITP antes e depois dapassagem através de um trato gastrointestinal humanosimulado (procedimento GIT)
<table>table see original document page 66</column></row><table>
Exemplo 9
Digestão gastrointestinal simulada in-vitro de MAP e ITPsintéticos.
Para medir a estabilidade dos peptídeos no tratogastrointestinal (GI) micro-dissolução foi usada. Esseteste a seguir foi usado para testar a estabilidade no GIde MAP e ITP.
Componentes:
Para a dissolução as seguintes soluções foram usadas:
0,1 mol/1 HC1
1 mol/1 NaHCCb
Fluido gástrico simulado;
1,0 g cloreto de sódio en 3,5 ml 0,1 mol/1 HCl em 500 ml
água (desgaseifiçada em banho de sonificação, 10 minutos)condições das enzimas gástricas (quantidades necessárias em
1 ml de volume total):
2,9 mg pepsina en 0,45 mg Amano Lipase-FAP15 em 50 ul defluido gástrico simulado
Condições das enzimas intestinal (quantidades necessáriasem 1 ml de volume total):9 mg pancreatina (Sigma P8096) en 0,125 mg extrato de bileem 50 ul 1,0 mol/1 NaHC03
Procedimento:
Condições gástricas:
cada frasco foi preenchido com:
0,82 ml de fluido gástrico simulado + 70 ul MilliQ +
10 ug (10 x diluído) mistura 1,
pegar a amostra quando t = 37,5°C (t=0), adicionar 50pl de mistura pepsina/lipase (agitar).
- o pH é medido e ajustado a 3,5 com 0,1 mol/1 HC1incubação por 60 minutos, depois de 60' uma amostra éretirada.
Condições intestinais:
50 ul de mistura de pancreatina é adicionada, o pH é
medido e ajustado a 6,8 com HCl.
amostras são retiradas em 5', 30' en 60' após a adiçãode pancreatina (agitar).
todas as amostras são mantidas a 95°C por 60 minutospara interromper a enzima de ser ativa.
- após resfriamento as amostras foram estocadas a -20°Caté a análise.
as amostras foram centrifugada e analisadas com HPLC-MRM-MS.
Para as Tabelas 11 e 12 a concentração medida dospeptídeos é dada em ng/ml, calculada para a concentraçãorelativa de MAP.
Tabela 11 - Digestão gastrointestinal in-vitro simulada deMAP sintético - 1 micrograma/ml
<table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table>
Quando - é indicado, isso denota que as medições não foramfeitas.
Tabela 12 - Digestão gastrointestinal in-vitro simulada deMAP sintético - 10 micrograma/ml
<table>table see original document page 68</column></row><table>
Quando - é indicado, isso denota que as medições não foramfeitas.
Tabela 13 - Digestão gastrointestinal in-vitro simulada deITP sintético - 1 micrograma/ml<table>table see original document page 69</column></row><table>
Quando - é indicado, isso denota que as medições não foramfeitas.
Tabela 14 - Digestão gastrointestinal in-vitro simulada deITP sintético - 10 microgramas/ml
<table>table see original document page 69</column></row><table>
Quando - é indicado, isso denota que as medições não foramfeitas.
Os resultados acima demonstram que o tripeptídeo MAPexibe estabilidade razoavelmente boa sob condiçõesgastrointestinais especialmente após 1 hora sob condiçõesestomacais. Embora, MAP passe por degradação adicionalantes de atingir o fim do intestino, a maior parte dospeptídeos é absorvida logo depois do estômago, ou seja, noduodeno e parte proximal do jejuno. Entretanto, acredita-seque MAP seja protegido contra essa degradação na presençade outros peptídeos com o hidrolisado de caseína.
Os resultados também demonstram a excelenteestabilidade sob condições gastrointestinais de ITP. Essaexcelente estabilidade pode compensar a menor potência deITP como um inibidor da ACE.
Esses resultados demonstram que o tripeptídeo MAPexibe estabilidade razoavelmente boa sob condiçõesgastrointestinais especialmente após 1 hora sob condiçõesestomacais. No entanto, ele não passa por degradaçãoadicional antes de atingir o fim do intestino. Entretanto,acredita-se que MAP seja protegido contra essa degradaçãona presença de outros peptídeos no hidrolisado de caseína;isso explica as aparentes diferenças na estabilidade paraMAP mostradas nos exemplos 8 e 9.
Exemplo 10
Preparação de um leite fermentado que contém MAP.
Como descrito em exemplo 7 o tripeptídeo MAP inibidorde ACE altamente potente foi identificado em um hidrolisadode caseína preparado de acordo com o procedimentoenzimático descrito no exemplo 7. No entanto, nósquestionamos se o tripeptídeo MAP também pode ser obtidousando a abordagem mais comum de fermentação de leitedesnatado. Para testar isso, foi feito uso de uma cepa delactobacillus caracterizada por um API50CHL strip(disponível por Biomerieux SA, 69280 Marcy-11Etoile,França). A cepa usada foi capaz de fermentar d-glicose, d-frutose, d-manose, n-acetil glicosamine, maltose, lactose,sacarose e trealose. De acordo com o banco de dados APILABPlus (versão 5.0; também disponível por Biomerieux) a cepafoi caracterizada como um Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis 05-14. A cepa foi depositada no "Centraal Bureauvoor Schimmelculturen, Baarn, Holanda (CBS 109270).
Para preparar a pré-cultura para o real experimento defermentação, leite desnatado estéril (Yopper ex Campina,Holanda) foi inoculado com 2 a 4% de uma cultura da cepa doLactobacillus delbruecki e cresceu por 24 horas a 3 7 graus C.
No real experimento de fermentação, leitereconstituído de 4,2% MPC-80 (Campina, Holanda), 0,5%lactose e 0,3% lacprodan 80 (Campina, Holanda), foipasteurizado por 2 minutos a 80 graus. Após resfriamento oleite foi inoculado com 2% em peso da pré-cultura e foirealizada fermentação em jarros de 150 ml sob condiçõesestáticas e realizado sem controle de pH a 40°C.
Depois de 24 horas uma amostra foi retirada ecentrifugada por 10 minutos a 14.000 g. O pH da amostraobtida foi 5,3 e a concentração de MAP 18,3 mg/l. Noentanto, ITP não pode ser detectado no leite fermentado.

Claims (27)

1. MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITPcomo um nutracêutico, preferivelmente um medicamento.
2. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal deITP caracterizado pelo fato de ser como um nutracêutico,preferivelmente um medicamento.
3. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deum nutracêutico preferivelmente um medicamento.
4. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para a melhoria dasaúde ou a prevenção e/ou tratamento de doenças.
5. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deum nutracêutico preferivelmente um medicamento para otratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão einsuficiência cardíaca.
6. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para o tratamento depré-diabetes ou diabetes ou para o tratamento de obesidade.
7. Método de tratamento de diabetes tipos 1 e 2, epara a prevenção de diabetes tipo 2 naqueles indivíduos compré-diabetes, ou tolerância prejudicada à glicose (IGT)caracterizado pelo fato de compreender a administração deao indivíduo em necessidade de tal tratamento de MAP e/ouITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP.
8. Método de tratamento de pessoas que sofrem dehipertensão ou insuficiência cardíaca ou a prevenção destascaracterizado pelo fato de compreender a administração a umindivíduo em necessidade de tal tratamento de MAP e/ou ITPum sal de MAP e/ou um sal de ITP.
9. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para aumentar ainsulina plasmática ou a sensibilidade para insulinaplasmática.
10. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para aumentar ainsulina plasmática ou a sensibilidade para insulinaplasmática de diabetes tipo 2 ou pré-diabetes.
11. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para diminuir aconcentração de glicose pós-prandial no sangue de diabetestipo 2 ou pré-diabetes.
12. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para aumentar asecreção de insulina pós-prandial no sangue de diabetestipo 2 ou pré-diabetes.
13. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3,-4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 caracterizado pelo fato deque MAP e/ou ITP está na forma de um suplemento dietético.
14. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deum produto alimentício funcional para o tratamentoterapêutico dos efeitos de estresse.
15. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser para aplicação tópicapreferivelmente em aplicação de higiene pessoal.
16. Uso de MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um salde ITP caracterizado pelo fato de ser em alimentos ealimentos para animais de estimação.
17. Medicamento caracterizado pelo fato decompreender MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal deITP como ingrediente ativo.
18. Suplemento dietético caracterizado pelo fato decompreender MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal deITP como ingrediente ativo.
19. Alimento caracterizado pelo fato de compreenderMAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP comoingrediente ativo.
20. Composição caracterizada pelo fato de compreenderMAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP comomedicamento ou para benefício à saúde.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que o benefício à saúde é otratamento dos efeitos de estresse, preferivelmente acomposição é um alimento ou ração.
22. Composição caracterizada pelo fato de compreenderMAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP para o usocomo um agente tópico preferivelmente para uso em higienepessoal.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de ser uma loção, um gel ou umaemulsão.
24. Produção de ITP ou um sal de ITP caracterizadopelo fato de compreender a síntese química por ligação deisoleucina, treonina e prolina para formar ITP eopcionalmente conversão de ITP em seu sal.
25. Produção de MAP ou um sal de MAP caracterizadapelo fato de compreender a síntese química por ligação demetionina, alanina e prolina para formar MAP eopcionalmente conversão de MAP em um sal.
26. Produção de MAP e/ou ITP caracterizada pelo fatode compreender a fermentação de uma proteína adequada porum microorganismo adequado que é capaz de produzir MAP e/ouITP a partir da proteína.
27. Produção de MAP e/ou ITP caracterizada pelo fatode que a proteína é caseína e preferivelmente omicroorganismo é produtor de ácido lático.
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