BRPI0610503A2 - materiais e métodos para o controle de doença respiratória em caninos - Google Patents

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J. Gibbs Paul
J. Dubovi Edward
O. Donis Ruben
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I. Klimov Alexander
J. Cox Nancy
L. Castleman William
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Abstract

A presente invenção refere-se ao vírus influenza isolado que é capaz de infectar os canídeos e causar doença respiratória no canídeo. A presente invenção também refere-se às composições e aos métodos para induzir uma resposta imune contra um vírus influenza da presente invenção. A invenção também refere-se às composições e aos métodos para identificar um vírus da invenção e diagnosticar a infecção de um animal com um vírus da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MATERIAISE MÉTODOS PARA O CONTROLE DE DOENÇA RESPIRATÓRIA EMCANINOS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. H-de Série 60/673.443, depositado em 21 de abril de 2005, que é, pelopresente, incorporado por referência neste documento em sua totalidade,incluindo quaisquer figuras, tabelas, seqüências de ácidos nucléicos,seqüências de aminoácidos, e desenhos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A "tosse canina" ou traqueobronquite infecciosa (ITB) é umainfecção respiratória contagiosa, aguda, em cães, caracterizada principal-mente por tosse (Ford e outros, 1998). A ITB canina é considerada uma dasdoenças respiratórias infecciosas mais predominantes dos cães mundial-mente, e os surtos podem atingir proporções epidêmicas quando os cãesestiverem alojados em ambientes de populações de altas densidades, taiscomo os canis. A maior parte dos surtos é devido ao contato direto de cãocom cão ou à aerossolização das secreções respiratórias (Ford e outros,1998). Os sinais clínicos são causados por infecção com um ou umacombinação de agentes bacterianos e virais que colonizam o epitélio do tratorespiratório superior e inferior. O vírus parainfluenza canino (CPiV) e asbactérias Bordetella bronchiseptica são os organismos mais comunsisolados dos cães afetados, porém diversos outros vírus, tais como o vírusda cinomose canino (CDV) e os adenovírus-1 e -2 caninos (CAV-1, CAV-2),juntamente com bactérias, tais como Streptococcus sp., Pasteurella multico-da e Escherichia coli, podem influenciar o curso e o resultado clínicos (Forde outros, 1998). Embora os surtos ocorram de modo mais eficiente e rápidoem populações de altas densidades, com alta morbidade, as infecçõesrespiratórias complicadas e a morte são incomuns. Embora uma pneumoniabacteriana secundária, que pode causar morte, possa se desenvolver, amaioria dos casos de ITB é autolimitada e desaparece sem nenhumtratamento (Ford e outros, 1998).Em julho de 1992, uma infecção respiratória presumida ser a"tosse canina" tornou-se epidêmica em diversas pistas de corridas de galgosem New England, Flórida, Virgínia Ocidental, Wisconsin, Kansas, Colorado,Oklahoma e Arizona. De acordo com os veterinários, a maior parte dos cãesafetados teve uma tosse branda que desapareceu, porém mais do que umadúzia de galgos desenvolveu uma pneumonia hemorrágica aguda, seguidapor morte rápida (Greyhound Daily News, 1999).
No fim de 1998 até o início de 1999, diversos surtos de "tossecanina" ocorreram nos canis de galgos de corrida através do país,resultando em fechamento obrigatório das pistas de corridas e quarentenade todos os galgos de corrida nos U.S. por diversas semanas (GreyhoundDaily News, 1999). Em uma pista de corridas na Flórida (Palm Beach KennelClub), a tosse foi registrada em quase 40% da população de cães em umúnico dia (Comunicado particular do Dr. William Duggar). Similar ao surto em1992, a tosse desapareceu na maioria dos galgos, porém 10 cães na Flóridamorreram de uma síndrome de pneumonia hemorrágica não característicada "tosse canina" (Putnam, 1999).
Em março-abril de 2003, um outro surto de "tosse canina"ocorreu nas pistas de corridas de galgos nos U.S. do leste. O surto éacreditado ter se originado nos canis em quatro pistas na Flórida e causou asuspensão da corrida e a quarentena dos cães por quase três semanas.Quase 25% dos cães na pista de corridas em West Palm Beach foramafetados, enquanto que quase 50% dos 1400 cães em Derby Lane, em St.Petersburg, desenvolveram a tosse. Novamente, a maioria dos cães serecuperou, porém diversos cães morreram da infecção respiratória. Oimpacto econômico estimado do surto respiratório na pista de Derby Lane foi$2 milhões.
Não existe nenhum relatório publicado que documente aetiologia ou a clinicopatologia da epidemia de "tosse canina" nos canis degalgos de corrida em 1992, 1998-1999, ou 2003. A suposição tem sido queas infecções foram devido ao CPiV e/ou à B. bronchiseptica, as duas causasmais comuns de tosse canina. Comunicações não substanciadas, tais comoos endereços de páginas eletrônicas da rede, têm atribuído as pneumoniashemorrágicas fatais descritas em alguns dos cães com tosse à infecção comStreptococcus equi subespécie zooepidemicus p-hemolítico, e referem-se àsíndrome como "choque tóxico estreptocócico canino".
A transmissão do vírus de uma espécie hospedeira para outra éuma característica crucial da ecologia e da epidemiologia do vírus influenza(Webster, 1998). São possíveis dois mecanismos básicos de transmissãoentre espécies do vírus influenza (Webster e outros, 1992; Lipatov e outros,2004). Um é a transferência direta de um vírus essencialmente inalterado deuma espécie para outra. Os exemplos deste mecanismo incluem asinfecções humanas recentes com o subtipo H5N1 do vírus da influenzaaviaria (Subbbarao e outros, 1998; Peiris e outros, 2004; Guan e outros,2004) e possivelmente a pandemia de 1918, conhecida como gripe espa-nhola (Reid e outros, 2004). O segundo mecanismo é uma conseqüência danatureza segmentada do genoma de influenza. A co-infecção de um hospe-deiro com vírus de diferentes espécies pode resultar no reagrupamento dosgenes virais segmentados e na geração de um recombinante com acapacidade de infectar outras espécies. Por exemplo, os novos vírus gera-dos por reagrupamento de genes entre os vírus influenza aviários e huma-nos resultaram na pandemia de influenza humana em 1957 e 1968 (Webstere outros, 1992; Lipatov e outros, 2004; Kawaoka e outros, 1989).
A maioria das transmissões diretas de vírus influenza inalteradosa partir das espécies hospedeiras naturais para uma espécie diferente sãoocorrências terminais, porque a transmissão ininterrupta entre indivíduos danova espécie não consegue ocorrer. As interações múltiplas entre vírus-hospedeiro são necessárias para a replicação e a transmissão horizontal eproporcionam uma barreira formidável à perpetuação dos vírus influenza nonovo hospedeiro (Webby e outros, 2004). Portanto, o estabelecimento denovas linhagens de vírus influenza específicas para os hospedeiros éincomum e somente ocorreu em aves domésticas, porcos, cavalos, e sereshumanos (Webster e outros, 1992; Lipatov e outros, 2004).
Por causa da natureza séria da infecção por vírus influenza,permanece uma necessidade por métodos para diagnosticar, prevenir, etratar infecção por vírus influenza.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao vírus influenza isolado que écapaz de infectar os canídeos e causar doença respiratória no canídeo. Apresente invenção também refere-se às composições e aos métodos parainduzir uma resposta imune contra um vírus influenza da presente invenção.A presente invenção também refere-se às composições e aos métodos paraidentificar um vírus da invenção e diagnosticar a infecção de um animal comum vírus da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
O arquivo da patente ou do pedido contém pelo menos umdesenho executado em cor. As cópias dessa patente ou publicação depedido de patente com desenhos em cor serão proporcionadas pelo
Escritório de Patentes com o pedido e o pagamento da taxa necessária.
As figuras 1A-1B mostram as relações filogenéticas entre osgenes de hemaglutinina. A figura 1A mostra uma árvore de genes de HA apartir de isolados caninos, humanos, aviários, suínos, e eqüinosrepresentativos, incluindo o A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4) como grupohostil. A figura 1B mostra uma árvore dos genes de HA do vírus influenzacanino com genes de HA eqüinos contemporâneos e mais antigos, usandoA/Duck/Ukraine/63 (H3) como grupo hostil. As árvores filogenéticas foramdeduzidas de seqüências de nucleotídeos pelo método de união do próximoe os valores da análise de partida >90% são mostrados. A barra significa onúmero de alterações de nucleotídeos por comprimento de unidade dasramificações horizontais das árvores.
As figuras 2A-2B mostram a detecção imunoistoquímica doantígeno H3 de influenza nos pulmões. As secções dos tecidos dos pulmõesforam sondadas com um anticorpo monoclonal de camundongo para ahemaglutinina H3 e a ligação foi detectada por reação com a imunopero-xidase (precipitado marrom). A figura 2A mostra o epitélio bronquial de umgalgo com doença espontânea. O antígeno H3 viral foi detectado no citoplas-ma de células epiteliais bronquiais e nos macrófagos nos lúmens das viasaéreas e nos espaços alveolares. A figura 2B mostra o epitélio bronquial deum cão 5 dias após inoculação com A/canino/Florida/ 43/04 (H3N8). Oantígeno H3 viral foi detectado no citoplasma de células epiteliais bronquiais.Barra em escala, 66 u.m.
A figura 3 mostra as alterações histológicas características nosbrônquios de galgos que morreram de pneumonia hemorrágica associadacom a infecção pelo vírus influenza. Os tecidos estão tingidos com H&E.Painel superior: Brônquio normal com células epiteliais ciliadas, célulasmucosas, e células basais. Painel inferior: Brônquio de um galgo cominfluenza espontânea. Há necrose e erosão das células epiteliais ciliadasbronquiais. Barra em escala, 100 u.m.
As figuras 4A-4B mostram as relações filogenéticas entre osgenes de hemaglutinina H3. A Figura 4A mostra uma árvore dos genes deHA do vírus influenza canino com genes de HA eqüinos contemporâneos emais antigos. A figura 4B mostra uma árvore filogenética da proteína HA dovírus influenza canino com HA eqüina contemporânea e mais antiga. Asárvores filogenéticas foram deduzidas de seqüências genéticas ou deaminoácidos pelo método de união do próximo e os valores da análise departida >80% são mostrados. A barra significa o número de alterações deaminoácidos por comprimento de unidade das ramificações horizontais dasárvores.
A figura 5 mostra a proteína H3 do vírus influenza em célulasepiteliais de brônquios e glândulas bronquiais em pulmões de cães quemorreram de pneumonia associada com infecção por vírus influenza. Painéissuperiores: erosão das células epiteliais bronquiais ciliadas nos brônquios.Os tecidos foram tingidos com H&E. Painéis inferiores: proteína H3 do vírusinfluenza no citoplasma de células epiteliais bronquiais (esquerda) e dasglândulas bronquiais (direita). Os tecidos foram tingidos com um anticorpomonoclonal para H3 de influenza detectada por reação com imunopero-xidase (precipitado marrom) e contratingidos com hematoxilina.
As figuras 6A-6D mostram os gráficos de amplificação dosgenes de H3 e de Matriz (figura 6A e figura 6B) obtidos a partir daamplificação de padrões de RNA transcritos in vitro, diluídos em série 10vezes. Curvas-padrão dos genes de H3 e de Matriz (figura 6C e figura 6D)construídas por representação em gráfico do log das concentrações de RNAde partida contra o ciclo limiar (Ct) obtido a partir de cada diluição.
A figura 7 mostra a sensibilidade do Directigen Flu A que foitestado com linhagens de vírus diluídas em série 10 vezes, incluindoA/Wyoming/3/2003 e A/canino/FL/242/2003. O triângulo roxo indica resulta-do positivo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
A SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína PB2 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 2 é a seqüência de aminoácidos codificada pela SEQIDNO:1.
A SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína PB1 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 4 é a seqüência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 3.
A SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína PA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 6 é a seqüência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 5.
A SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína NS que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 8 é a seqüência de aminoácidos codificada pela SEQ ID NO: 7.
A SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína NP que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 10 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 9.
A SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína NA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 12 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 11.
A SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína MA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 14 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 13.
A SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Florida/43/04) codificando uma proteína HA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 16 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 15.
A SEQ ID NO: 17 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína PB2 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 18 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 17.
A SEQ ID NO: 19 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína PB1 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 20 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 19.
A SEQ ID NO: 21 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FU242/03) codificando uma proteína PA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 22 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQIDN0:21.
A SEQ ID NO: 23 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína NS que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 24 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 23.
A SEQ ID NO: 25 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína NP que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 26 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 25.
A SEQ ID NO: 27 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína NA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 28 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 27.
A SEQ ID NO: 29 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína MA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 30 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 29.
A SEQ ID NO: 31 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (FL/242/03) codificando uma proteína HA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 32 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 31.
A SEQ ID NO: 33 é a forma madura da proteína HA mostrada naSEQ ID NO: 16, em que a seqüência de sinal de 16 aminoácidos N terminalfoi removida.
A SEQ ID NO: 34 é a forma madura da proteína HA mostrada naSEQ ID NO: 32, em que a seqüência de sinal de 16 aminoácidos N terminalfoi removida.A SEQ ID NO: 35 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 36 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 37 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 38 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 39 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 40 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 41 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 42 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 43 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 44 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 45 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 46 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 47 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína PB2 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 48 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 47.
A SEQ ID NO: 49 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína PB1 que pode serusada de acordo com a presente invenção.A SEQ ID NO: 50 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 49.
A SEQ ID NO: 51 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína PA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 52 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 51.
A SEQ ID NO: 53 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína NS que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 54 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 53.
A SEQ ID NO: 55 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína NP que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 56 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 55.
A SEQ ID NO: 57 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína NA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 58 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 57.
A SEQ ID NO: 59 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína MA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 60 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 59.
A SEQ ID NO: 61 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Miami/2005) codificando uma proteína HA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 62 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 61.A SEQ ID NO: 63 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína PB2 que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 64 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 63.
A SEQ ID NO: 65 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína PB1 que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 66 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 65.
A SEQ ID NO: 67 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína PA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 68 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 67.
A SEQ ID NO: 69 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína NS que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 70 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 69.
A SEQ ID NO: 71 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína NP que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 72 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 71.
A SEQ ID NO: 73 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína NA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 74 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 73.
A SEQ ID NO: 75 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína MA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 76 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 75.
A SEQ ID NO: 77 é uma seqüência de nucleotídeos de um vírusinfluenza canino (Jacksonville/2005) codificando uma proteína HA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 78 é a seqüência de aminoácidos codificada pelaSEQ ID NO: 77.
A SEQ ID NO: 79 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 80 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 81 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 82 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 83 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 84 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 85 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 86 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 87 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
A SEQ ID NO: 88 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao vírus influenza isolado que écapaz de infectar canídeos e causar uma doença respiratória. Em umamodalidade, um vírus influenza da invenção compreende um polinucleotídeoque codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada emquaisquer das SEQ ID NQS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,
30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78,ou um seu fragmento ou variante funcional e/ou imunogênica. Em umamodalidade específica, o polinucleotídeo compreende a seqüência denucleotídeos mostrada em quaisquer das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67,69, 71, 73, 75, ou 77, ou um seu fragmento ou variante. Em uma modalidadeespecífica, um vírus influenza da presente invenção é um subtipo H3. Ovírus pode ser isolado de cães infectados e cultivado em células ou óvulos,de acordo com os métodos descritos nesse documento. Em uma modalidadeexemplificada, o vírus influenza é um vírus influenza A.
A presente invenção também refere-se aos polinucleotídeos quecompreendem todo ou parte de um gene ou genes ou um segmento genômi-co de um vírus influenza da presente invenção. Em uma modalidade, umpolinucleotídeo da invenção compreende um gene de hemaglutinina (HA) deinfluenza, gene de neuraminidase (NA), gene de nucleoproteína (NP), genede proteína de matriz (MA ou M), gene de proteína básica de polimerase(PB), gene de proteína ácida de polimerase (PA), gene de proteína não-estrutural (NS), ou um fragmento ou variante funcional de quaisquer dessesgenes. Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo da invençãocompreende o gene de hemaglutinina (HA), ou um seu fragmento ouvariante funcional. Em uma modalidade adicional, o gene de HA codificauma proteína hemaglutinina tendo uma ou mais das seguintes: uma serinana posição 83; uma leucina na posição 222; uma treonina na posição 328;e/ou uma treonina na posição 483, contra a seqüência de aminoácidos daseqüência de consenso de H3 eqüina. Em uma modalidade, o gene de HAcodifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada nasSEQ ID NOs: 16, 32, 62, ou 78, ou um seu fragmento ou variante funcionale/ou imunogênica. Em uma modalidade específica, o gene de HAcompreende uma seqüência de nucleotídeos mostrada nas SEQ ID NOs: 15,31, 61, ou 77.Em uma modalidade, um polinucleotídeo da invenção codificaum polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos mostrada em quaisquerdas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33,34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou umseu fragmento ou variante funcional e/ou imunogênica. Em uma modalidadeespecífica, o polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácidosmostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78compreende a seqüência de nucleotídeos mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou uma seqüênciacodificando um fragmento ou variante funcional e/ou imunogênica dequaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78.
Assim, a presente invenção refere-se às seqüências de polinucleotídeoscompreendendo a seqüência de nucleotídeos mostrada em quaisquer dasSEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49,51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ouvariante, incluindo uma variante degenerada, de quaisquer das SEQ ID NOs:1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57,59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77. Em uma modalidade específicaadicional, um polinucleotídeo da invenção pode compreender: osnucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 3; os nucleotídeos 1-2148 da SEQ IDNO:5; os nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 7; os nucleotídeos 1-1494 daSEQ ID NO: 9; os nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 11; os nucleotídeos1-756 da SEQ ID NO: 13; os nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 15; osnucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 19; os nucleotídeos 1-2148 da SEQ IDNO: 21; os nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 23; os nucleotídeos 1-1494da SEQ ID NO: 25; os nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 29; osnucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 31; os nucleotídeos 1-2277 da SEQ IDNO: 47; os nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 49; os nucleotídeos 1-2148da SEQ ID NO: 51; os nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 53; osnucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 55; os nucleotídeos 1-1410 da SEQ IDNO: 57; os nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 59; os nucleotídeos 1-1695da SEQ ID NO: 61; os nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 63; osnucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 65; os nucleotídeos 1-2148 da SEQ IDNO: 67; os nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 69; os nucleotídeos 1-1494da SEQ ID NO: 71; os nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 73; osnucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 75; e os nucleotídeos 1-1695 da SEQ IDNO: 77. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos das seqüênciasde polinucleotídeos e de polipeptídeos virais contempladas dentro do escopoda presente invenção foram também depositadas com o Banco de Genesnos N- de acesso DQ124147 até DQ124161 e DQ124190, cuja descrição éincorporada nesse documento por referência.
A presente invenção também refere-se aos polipeptídeoscodificados pelos polinucleotídeos de um vírus influenza da presenteinvenção. A presente invenção também refere-se aos fragmentos e àsvariantes funcionais e/ou imunogênicas dos polipeptídeos expostos. Ospolipeptídeos contemplados incluem a proteína HA, a proteína NA, aproteína NS, a nucleoproteína, a proteína básica de polimerase, a proteínaácida de polimerase, e a proteína de matriz de um vírus influenza dainvenção. Em uma modalidade exemplificada, um polipeptídeo da invençãotem uma seqüência de aminoácidos mostrada em quaisquer das SEQ IDNOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50,52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seu fragmentoou variante funcional e/ou imunogênica.
A presente invenção também refere-se às construções deexpressão de polinucleotídeos compreendendo uma seqüência depolinucleotídeos da presente invenção. Em uma modalidade, um constructode expressão da invenção compreende uma seqüência de polinucleotídeoscodificando um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácidos mostrada em quaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64,66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seu fragmento ou variante funcional e/ouimunogênica. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo que codificaa seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62,64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78 compreende a seqüência de nucleotídeosmostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77,respectivamente, ou uma seqüência codificando um fragmento ou variantefuncional e/ou imunogênica de quaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62,64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Assim, a presente invenção refere-se aosconstructos de expressão compreendendo uma seqüência de polinu-cleotídeos compreendendo a seqüência de nucleotídeos mostrada emquaisquer das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou umfragmento ou variante, incluindo uma variante degenerada, de quaisquer dasSEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49,51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77. Em uma modalidadepreferida, um constructo de expressão da presente invenção proporciona asuperexpressão de um polinucleotídeo operavelmente ligado da invenção.
Os constructos de expressão da invenção geralmente incluemelementos reguladores que são funcionais na célula hospedeira pretendida,na qual oconstructo de expressão é para ser expresso. Assim, uma pessoaversada na técnica pode selecionar os elementos reguladores para uso em,por exemplo, células hospedeiras humanas, células hospedeiras mamíferas,células hospedeiras de insetos, células hospedeiras de leveduras, célulashospedeiras bacterianas, e células hospedeiras de plantas. Em umamodalidade, os elementos reguladores são os que são funcionais em célulascaninas. Os elementos reguladores incluem os promotores, as seqüênciasde terminação de transcrição, as seqüências de terminação de tradução, asseqüências intensificadoras, e os elementos de poliadenilação. Conformeusado aqui, o termo "constructo de expressão" refere-se a uma combinaçãode seqüências de ácidos nucléicos que proporciona a transcrição de umaseqüência de ácidos nucléicos operavelmente ligada. Conforme usado aqui,o termo "operavelmente ligado(a)(s)" refere-se a uma justaposição doscomponentes descritos, onde os componentes estão em uma relação que ospermite funcionar em seu modo pretendido. Em geral, os componentesoperavelmente ligados estão em relação contígua.
Um constructo de expressão da invenção pode compreenderuma seqüência de promotores operavelmente ligada a uma seqüência depolinucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção. Os promotorespodem ser incorporados em um polinucleotídeo usando práticas-padrão,conhecidas na técnica. As cópias múltiplas de promotores ou promotoresmúltiplos podem ser usadas em um constructo de expressão da invenção.
Em uma modalidade preferida, um promotor pode estar posicionadoaproximadamente à mesma distância do sítio de iniciação de transcrição noconstructo de expressão que ele está do sítio de iniciação de transcrição emseu ambiente genético natural. Alguma variação nesta distância é permitidasem diminuição substancial na atividade de promotor. Um sítio de iniciaçãode transcrição é tipicamente incluído no constructo de expressão. Depreferência, o promotor associado com um constructo de expressão dainvenção proporciona a superexpressão de um polinucleotídeo operavel-mente ligado da invenção.
Os promotores para uso com um constructo de expressão dainvenção em células eucarióticas podem ser de origem viral ou celular. Ospromotores virais incluem, porém não estão limitados aos, promotores degenes de citomegalovírus (CMV), promotores iniciais ou tardios de SV40, oupromotores de genes do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Os promotoresde origem celular incluem, porém não estão limitados ao, promotor de genede desmina e promotor de gene de actina. Os promotores adequados parauso com um constructo de expressão da invenção em células de levedurasincluem, porém não estão limitados ao, promotor de 3-fosfoglicerato cinase,promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, promotor de metalotio-neína, promotor de álcool desidrogenase-2, e promotor de hexocinase.
Se o constructo de expressão for para ser proporcionado ouintroduzido em uma célula de planta, então os promotores virais de plantas,tais como, por exemplo, um promotor de vírus do mosaico da couve-flor(CaMV) 35S (incluindo o promotor do CaMV 35S reforçado (ver, por exemplo,a Patente U.S. N- 5.106.739 e An, 1997)), ou um de CaMV 19S, podem serusados. Os outros promotores que podem ser usados para os constructosde expressão em plantas incluem, por exemplo, o promotor de prolifera, opromotor de Ap3, os promotores do choque térmico, o 1'- ou 2'-promotor deT-DNA de A. tumefaciens, o promotor de poligalacturonase, o promotor decalcona sintase A (CHS-A) de petúnia, o promotor de PR-1a de tabaco, opromotor de ubiquitina, o promotor de actina, o promotor de gene de alcA, opromotor de pin2 (Xu e outros, 1993), o promotor de Wipl de milho, opromotor de gene de trpA de milho (Patente U.S. N- 5.625.136), o promotorde gene de CDPK de milho, e o promotor de RUBISCO SSU (Patente U.S.N2 5.034.322), que podem também ser usados. Os promotores específicospara raízes, tais como quaisquer das seqüências de promotores descritas naPatente U.S. N- 6.455.760 ou na Patente U.S. Ne 6.696.623, ou nos pedidosde patente U.S. publicados N— 20040078841; 20040067506; 20040019934;20030177536; 20030084486; ou 200401233349, podem ser usados com umconstructo de expressão da invenção. Os promotores constitutivos (taiscomo o promotor de CaMV, ubiquitina, actina, ou NOS), os promotoresregulados evolutivamente, e os promotores induzíveis (tais como aquelespromotores que podem ser induzidos por calor, luz, hormônios, ousubstâncias químicas) são também contemplados para uso com osconstructos de expressão de polinucleotídeos da invenção. Os promotoresespecíficos para tecidos, por exemplo, os promotores específicos para frutas,tais como o promotor de E8 de tomate (número de acesso: AF515784; Goode outros, (1994)) podem também ser usados. Os promotores específicospara sementes, tais como o promotor de um gene de p-faseolina (porexemplo, de feijão) ou um gene de glicinina (por exemplo, de soja), e outros,podem também ser usados.
Para a expressão em sistemas procarióticos, um constructo deexpressão da invenção pode compreender promotores tais como, porexemplo, o promotor de fosfatase alcalina, o promotor de triptofano (trp), opromotor de lambda P|_, o promotor de p-lactamase, o promotor de lactose, opromotor de phoA, o promotor de T3, o promotor de 17, ou o promotor de tac(de Bôer e outros, 1983).
Os constructos de expressão da invenção podem opcionalmenteconter uma seqüência de terminação de transcrição, uma seqüência determinação de tradução, uma seqüência codificando um peptídeo de sinal,e/ou elementos intensificadores. As regiões de terminação de transcriçãopodem tipicamente ser obtidas a partir da região não traduzida em 3' de umaseqüência de gene eucariótica ou viral. As seqüências de terminação detranscrição podem estar posicionadas a jusante de uma seqüência decodificação, para proporcionar uma terminação eficiente. Uma seqüência depeptídeos de sinal é uma seqüência de aminoácidos curta, tipicamentepresente na extremidade de amino de uma proteína que é responsável peloremanejamento de um polipeptídeo maduro operavelmente ligado para umafaixa ampla de destinações celulares pós-traducionais, variando de umcompartimento de organela específico até sítios de ação de proteína e oambiente extracelular. O alvejamento de produtos de genes para umadestinação celular e/ou extracelular pretendida, através do uso de umaseqüência de peptídeos de sinal operavelmente ligada, é contemplado parauso com os polipeptídeos da invenção. Os intensificadores clássicos sãoelementos de atuação eis que aumentam a transcrição de gene e podemtambém ser incluídos no construeto de expressão. Os elementosintensificadores clássicos são conhecidos na técnica, e incluem, porém nãoestão limitados ao, elemento intensificador de CaMV 35S, elementointensificador de promotor inicial de citomegalovírus (CMV), e ao elementointensificador de SV40. Os elementos intensificadores mediados por intron,que reforçam a expressão de gene, são também conhecidos na técnica.Estes elementos devem estar presentes dentro da região transcrita e sãodependentes de orientação.
As seqüências de DNA que orientam a poliadenilação do mRNAtranscrito do construeto de expressão podem também ser incluídas noconstructo de expressão, e incluem, porém não estão limitadas a, um sinalde octopina sintase ou nopalina sintase.
Os constructos de expressão podem também incluir um ou maisgenes marcadores selecionáveis dominantes, incluindo, por exemplo, osgenes codificando resistência a antibióticos e/ou resistência a herbicidaspara selecionar células transformadas. Os genes de resistência aantibióticos podem proporcionar resistência a um ou mais dos seguintesantibióticos; higromicina, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina,paromomicina, neomicina, e espectinomicina. A resistência à canamicinapode ser proporcionada pela neomicina fosfotransferase (NPT II). Os genesde resistência a herbicidas podem proporcionar resistência à fosfinotricinaacetiltransferase ou glifosato. Os outros marcadores usados para o examede transformação de células incluem, porém não estão limitados aos, genescodificando a p-glicuronidase (GUS), a (3-galactosidase, a luciferase, anopalina sintase, a cloranfenicol acetiltransferase (CAT), a proteína defluorescência verde (GFP), ou a GFP reforçada (Yang e outros, 1996).
A presente invenção também refere-se aos vetores depolinucleotídeos compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos dainvenção que codifica um polipeptídeo da invenção. Sítios de enzimas derestrição únicos podem ser incluídos nas extremidades 5' e 3' de umconstructo de expressão ou polinucleotídeo da invenção, para permitir ainserção em um vetor de polinucleotídeo. Conforme usado nesse documento,o termo "vetor" refere-se a qualquer elemento genético, incluindo, porexemplo, os plasmídios, os cosmídios, os cromossomos, o fago, o vírus, esimilares, que seja capaz de replicação quando associado com elementosde controle adequados e que possa transferir seqüências depolinucleotídeos entre as células. Os vetores contêm uma seqüência denucleotídeos que permite que o vetor replique em uma célula hospedeiraselecionada. Diversos vetores estão disponíveis para a expressão e/ou aclonagem, e incluem, porém não estão limitados ao, pBR322, série pUC,série M13, série pGEM, e vetores pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CAe Promega, Madison, Wl).A presente invenção também refere-se às sondas e aosiniciadores de oligonucleotídeos, tais como os iniciadores da reação emcadeia por polimerase (PCR), que podem hibridizar com uma seqüência decodificação ou de não-codificação de um polinucleotídeo da presenteinvenção. As sondas de oligonucleotídeos da invenção podem ser usadasem métodos para detectar as seqüências de ácidos nucléicos do vírusinfluenza. Os iniciadores de oligonucleotídeos da invenção podem serusados em métodos de PCR e em outros métodos que envolvam aamplificação de ácido nucléico. Em uma modalidade preferida, uma sondaou iniciador da invenção pode hibridizar com um polinucleotídeo da invenção,sob condições severas. As sondas e os iniciadores da invenção podemopcionalmente compreender uma molécula de marca ou repórter detectável,tal como as moléculas fluorescentes, as enzimas, a porção radioativa, esimilares. As sondas e os iniciadores da invenção podem ser de qualquercomprimento adequado para o método ou o ensaio no qual eles estão sendoempregados. Tipicamente, as sondas e os iniciadores da invenção serão 10a 500 ou mais nucleotídeos de comprimento. As sondas e os iniciadores quesão 10 a 20, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90, 91a 100, ou 101 ou mais nucleotídeos de comprimento são contempladosdentro do escopo da invenção. Em uma modalidade, as sondas e osiniciadores são quaisquer de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos de comprimento. Assondas e os iniciadores da invenção podem ter identidade de seqüência denucleotídeos completa (100%) com a seqüência de polinucleotídeos, ou aidentidade de seqüência pode ser menos do que 100%. Por exemplo, aidentidade de seqüência entre uma sonda ou iniciador e uma seqüênciapode ser 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% ouqualquer outra porcentagem de identidade de seqüência, desde que a sondaou o iniciador possa hibridizar sob condições severas com uma seqüênciade nucleotídeos de um polinucleotídeo da invenção. As sondas e osiniciadores exemplificados da invenção incluem aqueles tendo a seqüênciade nucleotídeos mostrada em quaisquer de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36,SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ IDNO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, eSEQ ID NO: 46, ou um fragmento ou variante funcional de quaisquer dasSEQ ID NOS: 35-46.
Conforme usados aqui, os termos "ácido nucléico", "polinucleotí-deo" e "oligonucleotídeo" referem-se a um desoxirribonucleotídeo, ribonu-cleotídeo, ou um polímero misto de desoxirribonucleotídeo e ribonucleotídeona forma de filamento simples ou duplo e, a não ser que de outro modolimitado, incluiriam os análogos conhecidos de nucleotídeos naturais quepodem funcionar em um modo similar aos nucleotídeos de ocorrência natural.
As seqüências de polinucleotídeos incluem a seqüência de filamento deDNA que pode ser transcrita em RNA e o filamento de RNA que pode sertraduzido na proteína. A seqüência complementar de qualquer ácido nucléi-co, polinucleotídeo, ou oligonucleotídeo da presente invenção é tambémcontemplada dentro do escopo da invenção. As seqüências de polinucleo-tídeos também incluem as seqüências de tamanhos naturais, bem como asseqüências mais curtas derivadas das seqüências de tamanhos naturais. Apresente invenção também inclui esses polinucleotídeos que são comple-mentares na seqüência aos polinucleotídeos descritos neste documento. Ospolinucleotídeos e os polipeptídeos da invenção podem ser proporcionadosna forma purificada ou isolada.
Por causa da degeneração do código genético, uma variedadede seqüências de polinucleotídeos diferentes pode codificar um polipeptídeoda presente invenção. Uma tabela mostrando todos os códons de tripletopossíveis (e em que U também significa T) e o aminoácido codificado porcada códon é descrito em Lewin (1985). Ademais, está bem dentro da habi-lidade de uma pessoa versada na técnica criar seqüências de polinucleotí-deos alternativas codificando polipeptídeos iguais, ou essencialmente iguais,da presente invenção. Essas seqüências de polinucleotídeos variantes ealternativas degeneradas estão dentro do escopo da presente invenção.
Conforme usadas aqui, as referências à seqüência "essencialmente igual"referem-se às seqüências que codificam substituições, remoções, adições,ou inserções de aminoácidos, que não alteram materialmente a atividadefuncional e/ou imunogenica do polipeptídeo codificado pelos polinucleotídeosda presente invenção.
A presente invenção também refere-se às variantes dospolinucleotídeos da presente invenção que codificam os polipeptídeos dainvenção. As seqüências variantes incluem aquelas seqüências em que umou mais nucleotídeos da seqüência foram substituídos, removidos, e/ouinseridos. Os nucleotídeos que podem substituir os nucleotídeos naturais deDNA têm uma porção de base que pode incluir, porém não está limitada à,inosina, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, hipoxantina, 1-metilguanina, 5-me-tilcitosina, e bases tritiladas. A porção de açúcar do nucleotídeo em umaseqüência pode também ser modificada e inclui, porém não está limitada à,arabinose, xilulose, e hexose. Ademais, as bases adenina, citosina, guanina,timina, e uracila dos nucleotídeos podem ser modificadas com grupos acetila,metila, e/ou tio. As seqüências contendo as substituições, as remoções, e/ouas inserções de nucleotídeos podem ser preparadas e testadas usandopráticas-padrão, conhecidas na técnica.
A substituição de aminoácidos, diferente daquelas especifica-mente exemplificadas ou naturalmente presentes em um polipeptídeo dainvenção, é também contemplada dentro do escopo da presente invenção.Por exemplo, os aminoácidos não naturais podem substituir os aminoácidosde um polipeptídeo, desde que o polipeptídeo tendo os aminoácidossubstituídos conserve substancialmente a mesma atividade funcional que opolipeptídeo no qual não foram substituídos aminoácidos. Os exemplos deaminoácidos não naturais incluem, porém não estão limitados à, ornitina,citrulina, hidroxipropila, homosserina, fenilglicina, taurina, iodotirosina, ácido2,4-diaminobutírico, ácido oc-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido2-amino butírico, ácido y-amino butírico, ácido e-amino hexanóico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico,norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cistéico, x-butilglicina,x-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, (3-alanina, flúor-aminoácidos,aminoácidos projetados, tais como os (3-metil aminoácidos, os C-metilaminoácidos, os N-metil aminoácidos, e os análogos de aminoácidos emgeral. Os aminoácidos não naturais também incluem os aminoácidos tendogrupos laterais derivados. Além disso, quaisquer dos aminoácidos naproteína podem ser da forma D (dextrorrotatório) ou forma L (levorrotatório).As variantes alélicas de uma seqüência protéica de um polipeptídeo dapresente invenção estão também incluídas dentro do escopo da invenção.
Os aminoácidos podem ser geralmente categorizados nasseguintes classes: apolares, polares não carregados, básicos, e ácidos. Assubstituições conservativas, pelas quais um polipeptídeo da presenteinvenção tendo um aminoácido de uma classe é substituído por um outroaminoácido da mesma classe, incidem no escopo da presente invenção,desde que o polipeptídeo tendo a substituição ainda conserve substancial-mente a mesma atividade funcional que o polipeptídeo que não tem asubstituição. Os polinucleotídeos codificando um polipeptídeo tendo uma oumais substituições de aminoácidos na seqüência são contemplados dentrodo escopo da presente invenção. A Tabela 11 abaixo proporciona umalistagem de exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe. Asabreviações de aminoácidos de uma única letra são definidas na Tabela 12.
Os fragmentos e as variantes dos polipeptídeos do vírusinfluenza da presente invenção podem ser gerados usando métodos-padrão,conhecidos na técnica, e testados quanto à presença de função ou imuno-genicidade usando práticas-padrão, conhecidas na técnica. Por exemplo,para testar os fragmentos e/ou as variantes de um polipeptídeo de neurami-nidase da invenção, a atividade enzimática pode ser analisada. Assim, umtécnico comumente versado pode prontamente preparar e testar osfragmentos e as variantes de um polipeptídeo da invenção e determinar se ofragmento ou a variante conserva atividade em relação ao polipeptídeo detamanho natural ou um não variante.
Os polinucleotídeos e os polipeptídeos contemplados dentro doescopo da presente invenção podem também ser definidos em termos defaixas mais particulares de identidade e/ou de similaridade com aquelasseqüências da invenção especificamente exemplificadas nesse documento.A identidade de seqüência tipicamente será maior do que 60%, preferivel-mente maior do que 75%, mais preferivelmente maior do que 80%, aindamais preferivelmente maior do que 90%, e pode ser maior do que 95%. Aidentidade e/ou a similaridade de uma seqüência pode ser 49, 50, 51, 52, 53,54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, ou 99%, em comparação com uma seqüênciaexemplificada nesse documento. A não ser que de outro modo especificado,conforme usado aqui, a porcentagem de identidade e/ou similaridade deseqüência de duas seqüências pode ser determinada usando o algoritmo deKarlin e Altschul (1990), modificado como em Karlin e Altschul (1993). Talalgoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul eoutros (1990). As buscas por BLAST podem ser efetuadas com o programaNBLAST, classificação = 100, comprimento de letra = 12, para obterseqüências com a porcentagem desejada de identidade de seqüência. Paraobter os alinhamentos com fendas para propósitos de comparação, oGapped BLAST pode ser usado como descrito em Altschul e outros (1997).Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetrospreestabelecidos dos respectivos programas (NBLAST e XBLAST) podemser usados. Ver o endereço de página eletrônica da rede de NCBI/NIH.
A presente invenção também contempla aquelas moléculas depolinucleotídeos tendo seqüências que são suficientemente homólogas comas seqüências de polinucleotídeos exemplificadas aqui, de modo a permitir ahibridação com aquela seqüência sob condições severas padrão e métodos-padrão (Maniatis e outros, 1982). Conforme usadas aqui, as condições"severas" para a hibridação referem-se às condições em que a hibridação étipicamente efetuada durante a noite, a 20-25 C abaixo da temperatura defusão (Tm) do híbrido de DNA, em 6x SSPE, 5x solução de Denhardt, 0,1%de SDS, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. A temperatura de fusão, Tm, édescrita pela seguinte fórmula (Beltz e outros, 1983):
Tm = 81,5 C +16,6 Log[Na+]+0,41(%G+C)-0,61(% de forma-mida)-600/comprimento do dúplex em pares de bases.As lavagens são tipicamente efetuadas como se segue:
(1) Duas vezes na temperatura ambiente por 15 minutos em1x SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de baixa severidade).
(2) Uma vez em Tm-20 C por 15 minutos em 0,2x SSPE,0,1% de SDS (lavagem de severidade moderada).
A presente invenção também refere-se às proteínas e aospeptídeos virais codificados pelos genes de um vírus influenza da presenteinvenção. Em uma modalidade, a proteína viral é uma proteína HA madura.
Em uma modalidade específica, a proteína HA madura compreende uma oumais das seguintes: uma serina na posição 82; uma leucina na posição 221;uma treonina na posição 327; e/ou uma treonina na posição 482. Em umamodalidade exemplificada, a proteína HA madura tem uma seqüência deaminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34, ou umfragmento ou variante funcional e/ou imunogênica de SEQ ID NO: 33 ouSEQ ID NO: 34. Em uma outra modalidade, a proteína viral é uma proteínaNA, proteína NS, proteína PB, proteína PA, ou proteína MA. As proteínas eos peptídeos virais da invenção podem ser usados para gerar anticorpos quese ligam especificamente à proteína ou ao peptídeo. As proteínas e ospeptídeos virais da presente invenção podem também ser usados comoimunógenos e em composições de vacina.
A presente invenção também refere-se às composições e aosmétodos para induzir uma resposta imune contra um vírus influenza que écapaz de infectar um animal hospedeiro suscetível e causar doençarespiratória. A invenção pode ser usada para induzir uma resposta imunecontra um vírus influenza de qualquer subtipo em um animal hospedeirosuscetível. Por exemplo, o vírus influenza pode ser um subtipo de HA de H1,H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, ou H16, eum subtipo de NA de N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, ou N9. Em umamodalidade, o subtipo de HA é H3 ou H5. Em uma modalidade adicional, osubtipo de NA é N7 ou N8. Em uma modalidade específica, uma respostaimune é induzida contra um vírus influenza do subtipo H3N8. Em umamodalidade, o animal hospedeiro é um canídeo. Os caninos incluem oscaninos selvagens, de zoológico, e domésticos, tais como os lobos, oscoiotes, e as raposas. Os caninos também incluem os cães, particularmenteos cães domésticos, tais como, por exemplo, os cães de companhia de raçapura e/ou mestiços, os cães para shows, os cães para trabalho, os cãespastores, os cães de caça, os cães-de-guarda, os cães-polícia, os cães decorrida, e/ou os cães de laboratório. Em uma modalidade específica, oanimal hospedeiro é um cão domesticado, tal como um galgo. Em umamodalidade, um animal é administrado com uma quantidade efetiva de umacomposição imunogênica da presente invenção, suficiente para induzir umaresposta imune contra um vírus influenza da invenção. A resposta imunepode ser uma resposta imune humoral e/ou celular. Em uma modalidadeespecífica, a resposta imune é uma resposta imune protetora que é capazde prevenir ou minimizar a infecção viral no animal hospedeiro imunizadopor algum período de tempo subseqüente à imunização. Assim, a presenteinvenção também refere-se às composições de vacinas e aos métodos quepodem prover o animal vacinado com uma resposta imune protetora a umvírus da presente invenção.
Conforme descrito nesse documento, as composições devacinas ou imunogênicas da presente invenção podem compreender vírusintegrais sem células, incluindo os vírus atenuados ou inativos, ou porçõesdos vírus, incluindo as partículas de subvírion (incluindo a "vacina separada",em que um vírion é tratado para remover alguns ou todos os lipídios virais),proteínas vitais (incluindo as proteínas individuais e os complexos macro-moleculares de proteínas múltiplas), polipeptídeos, e peptídeos, bem comoas linhagens de células infectadas com vírus, ou uma combinação dequaisquer desses. As composições de vacinas ou imunogênicas compreen-dendo linhagens de células infectadas com vírus podem compreenderlinhagens de células múltiplas, cada uma infectada com uma cepa viraldiferente.
As composições de vacinas ou imunogênicas da presenteinvenção também incluem os constructos à base de vetores virais recom-binantes que podem compreender, por exemplo, genes codificando aproteína HA, a proteína NA, a nucleoproteína, a proteína básica depolimerase, a proteína ácida de polimerase, e/ou a proteína de matriz de umvírus influenza da presente invenção. Qualquer vetor viral adequado quepossa ser usado para preparar um constructo de vetor recombinante/vírus écontemplado para uso com a presente invenção. Por exemplo, os vetoresvirais derivados de adenovírus, avipox, herpesvirus, vacínia, varíola doscanários, entomopox, varíola suína, vírus do Nilo Ocidental e outros conhe-cidos na técnica podem ser usados com as composições e os métodos dapresente invenção. Os vetores de polinucleotídeos recombinantes que codifi-cam e expressam componentes podem ser construídos usando práticas-padrão de engenharia genética, conhecidas na técnica. Além disso, asdiversas composições de vacinas descritas aqui podem ser usadas sepa-radamente e em combinação uma com a outra. Por exemplo, as imuniza-ções primárias de um animal podem usar constructos à base de vetoresrecombinantes, tendo componentes de cepas individuais ou múltiplas, segui-das por reforços secundários com composições de vacinas compreendendovírus inativado ou linhagens celulares infectadas com vírus inativado. Osoutros protocolos de imunização com as composições de vacinas dainvenção são aparentes para as pessoas versadas na técnica e sãocontemplados dentro do escopo da presente invenção.
A presente invenção também refere-se ao vírus reagrupadocompreendendo pelo menos um gene ou segmento genômico de um vírusinfluenza da presente invenção e o restante dos genes virais ou segmentosgenômicos a partir de um vírus influenza diferente da invenção ou a partir deum vírus influenza diferente de um vírus da presente invenção. O vírusreagrupado pode ser produzido por reagrupamento genético do ácidonucléico de um vírus influenza doador da presente invenção com o ácidonucléico de um vírus influenza receptor e então seleção do vírus reagrupadoque compreende o ácido nucléico do vírus doador. Os métodos paraproduzir e isolar o vírus reagrupado são bastante conhecidos na técnica(Fields e outros, 1996). Em uma modalidade, um vírus reagrupado dainvenção compreende genes ou segmentos genômicos de um vírusinfluenza humano, aviário, suíno, ou eqüino. Um vírus reagrupado dapresente invenção pode incluir qualquer combinação de ácido nucléico dovírus influenza doador e receptor, desde que o vírus reagrupado compre-enda pelo menos um gene ou segmento genômico de um vírus influenzadoador da presente invenção. Em uma modalidade, um vírus influenzareceptor pode ser um vírus influenza eqüino.
Os polipeptídeos naturais, recombinantes ou sintéticos deproteínas virais, e os seus fragmentos peptídicos, podem também serusados como composições de vacinas de acordo com os métodos expostos.
Em uma modalidade, os polipeptídeos virais derivados de cepas múltiplaspodem ser combinados em uma composição de vacina e são usados paravacinar um animal hospedeiro. Por exemplo, os polipeptídeos baseados naproteína HA viral a partir de pelo menos duas cepas diferentes do vírusinfluenza da invenção podem ser combinados na vacina. Os polipeptídeospodem ser homólogos a uma cepa ou podem compreender polipeptídeos"híbridos" ou "quiméricos", cuja seqüência de aminoácidos é derivada daunião ou da ligação dos polipeptídeos a partir de pelo menos duas cepasdistintas. Os procedimentos para preparar os polipeptídeos virais sãobastante conhecidos na técnica. Por exemplo, os polipeptídeos e os peptí-deos virais podem ser sintetizados usando métodos de síntese em fasesólida (Merrifield, 1963). Os polipeptídeos e os peptídeos virais podemtambém ser produzidos usando técnicas de DNA recombinante, em que umamolécula de polinucleotídeo codificando uma proteína ou peptídeo viral éexpressa em uma célula hospedeira, tal como bactérias, leveduras, oulinhagens celulares mamíferas, e a proteína expressa purificada usandopráticas-padrão da técnica.
As composições de vacinas da presente invenção tambémincluem as composições de ácidos nucléicos simples. Em uma modalidade,um ácido nucléico pode compreender uma seqüência de nucleotídeoscodificando uma proteína HA e/ou uma proteína NA proteína de um vírusinfluenza da presente invenção. Os métodos para a vacinação com ácidosnucléicos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nasPatentes U.S. N- 6.063.385 e 6.472.375. O ácido nucléico pode estar naforma de um plasmidio ou um cassete de expressão de gene. Em umamodalidade, o ácido nucléico é proporcionado encapsulado em umlipossomo, o qual é administrado a um animal.
As composições de vacinas e os imunógenos, tais como ospolipeptídeos e os ácidos nucléicos, que podem ser usados de acordo com apresente invenção podem ser proporcionados com um veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável. Os compostos e as composições úteis napresente invenção podem ser formulados de acordo com métodosconhecidos para a preparação de composições farmaceuticamente úteis. Asformulações são descritas em detalhe em diversas fontes, as quais sãobastante conhecidas e estão prontamente disponíveis para aquelesversados na técnica. Por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, porE.W. Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19â ed., 1995,descreve formulações que podem ser usadas em conexão com a presenteinvenção. Em geral, as composições da presente invenção serão formuladasde modo tal que uma quantidade efetiva de um imunógeno seja combinadacom um veículo adequado, para facilitar a administração efetiva da compo-sição. As composições usadas nos presentes métodos podem também estarem uma variedade de formas. Essas incluem, por exemplo, as formassólidas, semi-sólidas, e líquidas, tais como os comprimidos, as pílulas, ospós, as soluções ou as suspensões líquidas, os supositórios, as soluçõesinjetáveis e infusíveis, e os sprays. A forma preferida depende do modopretendido de administração e aplicação terapêutica. As composiçõestambém preferivelmente incluem os veículos e os diluentes farmaceuti-camente aceitáveis convencionais, os quais são conhecidos para aquelesversados na técnica. Os exemplos de veículos ou diluentes para uso com ospeptidomiméticos expostos incluem, porém não estão limitados à, água,solução salina, óleos, incluindo o óleo mineral, etanol, sulfóxido de dimetila,gelatina, ciclodextranos, estearato de magnésio, dextrose, celulose, açú-cares, carbonato de cálcio, glicerol, alumina, amido, e veículos e diluentesequivalentes, ou misturas de quaisquer desses. As formulações de umimunógeno da invenção podem também compreender agentes de suspen-são, protetores, lubrificantes, tampões, conservantes, e estabilizantes. Paraproporcionar a administração de tais dosagens para o tratamento terapêuticodesejado, as composições farmacêuticas da invenção vantajosamentecompreenderão entre cerca de 0,1% e 45%, e especialmente, 1 e 15% empeso do imunógeno ou dos imunogenos, com base no peso da composiçãototal, incluindo veículo ou diluente.
As composições de vacinas e imunogênicas da presenteinvenção podem ser preparadas por procedimentos bastante conhecidos natécnica. Por exemplo, a vacina ou os imunogenos são tipicamente prepa-rados como soluções ou suspensões injetáveis, por exemplo, líquidas. Avacina ou os imunogenos são administrados em um modo que sejacompatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade como seráterapeuticamente efetiva e imunogênica no receptor. As dosagens ótimas eos padrões de administração para uma formulação particular de vacina oude imunogenos podem ser prontamente determinados por uma pessoaversada na técnica.
Os peptídeos e/ou os polipeptídeos da presente invenção podemtambém ser proporcionados na forma de um constructo de peptídeoantigênico múltiplo (MAP). A preparação de constructos de MAP foi descritaem Tam (1988). Os constructos de MAP utilizam uma matriz de núcleo deresíduos de lisina, sobre a qual são sintetizadas múltiplas cópias de umimunógeno (Posnett e outros, 1988). Os constructos de MAP múltiplos, cadaum contendo imunogenos iguais ou diferentes, podem ser preparados eadministrados em uma composição de vacina de acordo com os métodos dapresente invenção. Em uma modalidade, um constructo de MAP é propor-cionado e/ou administrado com um ou mais adjuvantes. Os polipeptídeos deinfluenza da invenção podem também ser produzidos e administrados comoestruturas de proteínas macromoleculares compreendendo um ou mais poli-peptídeos. O Pedido de Patente U.S. publicado US2005/0009008 descrevemétodos para produzir partículas semelhantes a vírus como uma vacina parao vírus influenza.De acordo com os métodos da presente invenção, as compo-sições de vacina e imunogênicas descritas nesse documento são admi-nistradas a hospedeiros suscetíveis, tipicamente os canídeos, e maistipicamente os cães domesticados, em uma quantidade e maneira efetivaspara induzir uma imunidade protetora contra a provocação ou a infecçãosubseqüente do hospedeiro pelo vírus. Em uma modalidade, o animalhospedeiro é um canídeo. Os caninos incluem os caninos selvagens, dezoológico, e domésticos, tais como os lobos, os coiotes, e as raposas. Oscaninos também incluem os cães, particularmente os cães domésticos, taiscomo, por exemplo, os cães de companhia de raça pura e/ou mestiços, oscães para shows, os cães para trabalho, os cães pastores, os cães de caça,os cães-de-guarda, os cães-polícia, os cães de corrida, e/ou os cães delaboratório. Em uma modalidade específica, o animal hospedeiro é um cãodomesticado, tal como um galgo. As vacinas ou os imunógenos sãotipicamente administrados parenteralmente, por injeção, por exemplo, demodo subcutâneo, intraperitoneal, ou intramuscular. Os outros modosadequados de administração incluem a administração oral ou nasal.
Normalmente, as vacinas ou os imunógenos são administrados a um animalpelo menos duas vezes, com um intervalo de uma ou mais semanas entrecada administração. Entretanto, outros regimes para as administraçõesiniciais e de reforço da vacina ou dos imunógenos são contemplados, epodem depender do julgamento do profissional e do animal hospedeiroparticular que está sendo tratado.
O vírus e as células infectadas com vírus em uma formulação devacina podem ser inativados ou atenuados usando métodos conhecidos natécnica. Por exemplo, o vírus integral e as células infectadas podem serinativados ou atenuados por exposição ao paraformaldeído, formalina, fenol,luz UV, temperatura elevada e similar. A quantidade de vírus integral semcélulas em uma dose de vacina normalmente estará na faixa de cerca de 0,1mg a cerca de 5 mg, e mais usualmente sendo de cerca de 0,2 mg a cercade 2 mg. A dosagem para as formulações de vacinas compreendendolinhagens celulares infectadas com vírus normalmente contém de cerca de106 a cerca de 108 células por dose, e mais normalmente de cerca de 5 x 106a cerca de 7,5 x 107 células por dose. A quantidade de imunógeno deproteína ou peptídeo em uma dose para um animal pode variar de cerca de0,1 ug a 10000 ug, ou cerca de 1 ug a 5000 ug, ou cerca de 10 ug a 1000 ug,ou cerca de 25 ug a 750 ug, ou cerca de 50 ug a 500 ug, ou .100 ug a 250 ug,dependendo do tamanho, idade, etc, do animal que está recebendo a dose.
Uma composição imunogênica ou de vacina da invenção, talcomo vírus ou células infectadas com vírus ou proteínas ou peptídeos virais,pode ser combinada com um adjuvante, de modo típico exatamente antes daadministração. Os adjuvantes contemplados para uso nas formulações devacinas incluem o treonil muramil dipeptídeo (MDP) (Byars e outros, 1987), asaponina, o Corenebacterium parvum, os adjuvantes completos de Freund eincompletos de Freund, o alumínio, ou uma mistura de quaisquer desses.
Uma variedade de outros adjuvantes, adequados para uso com os métodose as vacinas da presente invenção, tais como o alúmen, é bastante conheci-da na técnica e é contemplada para uso com a presente invenção.
A presente invenção também refere-se aos anticorpos que seligam especificamente a uma proteína ou um peptídeo da presente invenção.
Os anticorpos da presente invenção incluem as composições de anticorposmonoclonais e policlonais. De preferência, os anticorpos da presenteinvenção são anticorpos monoclonais. Os anticorpos integrais e os seusfragmentos de ligação a antígenos são contemplados na presente invenção.
Assim, por exemplo, os fragmentos de ligação a antígenos adequadosincluem os fragmentos de anticorpos Fab2, Fab e Fv. Os anticorpos dainvenção podem ser marcados com uma porção detectável, tal como umamolécula fluorescente (por exemplo, fluoresceína ou uma enzima).
A presente invenção também refere-se aos métodos e àscomposições para a detecção e a identificação de um vírus influenza dainvenção e para a diagnose da infecção de um animal com um vírus influen-za da presente invenção. Os métodos da invenção incluem a detecção dapresença de influenza canina em uma amostra biológica de um animal. Adetecção de influenza canina em uma amostra é útil para diagnosticar ainfluenza canina em um animal. Por sua vez, esta informação podeproporcionar a capacidade de determinar o prognóstico de um animal combase na diferenciação dos níveis de influenza canina presente com o tempo,e pode auxiliar na seleção de agentes e tratamentos terapêuticos para oanimal, e auxiliar no monitoramento da terapia. O método também propor-ciona a capacidade de estabelecer a ausência de influenza canina em umanimal testado.
A capacidade de detectar a influenza canina em um animalpermite a avaliação de surtos de influenza canina em diferentes posiçõesgeográficas. Essa informação também permite a detecção inicial de modoque os animais infectados possam ser isolados, para limitar o espalhamentoda doença, e permite a intervenção inicial para as opções de tratamento.
Além disso, tendo essa informação disponível pode proporcionar orientaçãopara a equipe médica para a preparação, para tratar grandes números deanimais doentes, incluindo a montagem de suprimentos médicos, e, sedisponíveis, vacinas.
Em uma modalidade, um método da presente invenção envolvea coleta de uma amostra biológica a partir de um animal de teste, tal comoum canino. A amostra biológica pode ser qualquer material biológico,incluindo as células, o tecido, o cabelo, o sangue integral, o soro, o plasma,o aspirado do mamilo, a lavagem do pulmão, o fluido cerebroespinhal, asaliva, o suor e as lágrimas.
A amostra de teste do animal pode vir de um animal suspeito deter vírus influenza canino, quer o animal exiba sintomas da doença, quer nãoexiba. As amostras de controle podem também ser proporcionadas oucoletadas de animais sabidos estarem isentos de influenza canina. Podemser proporcionados controles adicionais, por exemplo para reduzir osresultados falso positivos e falso negativos, e verificar que os reagentes noensaio estão ativamente detectando o vírus influenza canino A.
Além de detectar a presença ou a ausência de influenza caninaem uma amostra biológica, os métodos de detecção usados na invençãopodem detectar mutações no vírus influenza canino, tais como alterações naseqüência de ácidos nucleicos, que podem resultar do ambiente, tratamentocom fármaco, manipulações ou mutações genéticas, lesão, mudança nadieta, envelhecimento, ou qualquer(quaisquer) outra(s) característica(s) deum animal. As mutações podem também fazer com que a influenza canina Atorne-se resistente a um fármaco que era inicialmente efetivo, ou capacite ovírus de infectar e propagar em uma espécie diferente de animal, ou serhumano. Por exemplo, o vírus influenza aviário A mostrou infectar outrosanimais e os seres humanos.
Em uma modalidade para detectar um vírus influenza em umanimal, a diagnose é facilitada pela coleta de espácimens de alta qualidade,pelo seu rápido transporte para uma instalação de teste, e pela armaze-nagem apropriada, antes do teste em laboratório. O vírus é mais bemdetectado em espécimens contendo células infectadas e secreções. Em umamodalidade, os espécimens para a detecção direta de antígenos virais e/oupara ácidos nucleicos e/ou isolamento de vírus em culturas de células sãoretirados durante os primeiros 3 dias após o início dos sintomas clínicos.Diversos tipos de espécimens são adequados para diagnosticar as infecçõespor vírus do trato respiratório superior, incluindo, porém não limitados ao,swab nasal, swab nasofaríngeo, aspirado nasofaríngeo, lavagem nasal eswabs da garganta. Além dos swabs, podem ser retiradas amostras detecido ou soro, e os procedimentos invasivos podem também ser efetuados.
Em uma modalidade, os espécimens respiratórios são coletadose transportados em 1-5 ml de meios de transporte de vírus. Diversos meiosque são satisfatórios para a recuperação de uma ampla variedade de vírusestão disponíveis comercialmente. Os espécimens clínicos são adicionadosao meio de transporte. Os swabs nasais ou nasofaríngeos podem tambémser transportados no meio de transporte de vírus. Um exemplo de um meiode transporte é 10 g de caldo de infusão de vitela e 2 g de fração de albu-mina bovina V, adicionados à água destilada estéril até 400 m. Os antibió-ticos, tais como 0,8 ml de solução de sulfato de gentamicina (50 mg/ml) e3,2 ml de anfotericina B (250 fig/ml), podem também ser adicionados. Omeio é preferivelmente esterilizado por filtração. As lavagens nasais, taiscomo a solução salina estéril (0,85% de NaCI), podem também ser usadaspara coletar os espécimens de vírus respiratórios.
Em uma modalidade, o soro é coletado em uma quantidade de1-5 ml de sangue integral a partir de um animal em fase aguda, logo após oinício dos sintomas clínicos, e preferivelmente não posterior a 7 dias. Umespécime de soro em fase convalescente pode também ser coletado, porexemplo, em torno de 14 dias após o início dos sintomas. Os espécimens desoro podem ser úteis para detectar os anticorpos contra os vírus respirató-rios em um teste de neutralização.
Em algumas situações, as amostras podem ser coletadas deanimais individuais, durante um período de tempo (por exemplo, uma vez aodia, uma vez por semana, uma vez por mês, bianualmente ou anualmente).A obtenção de diversas amostras de um animal individual, durante umperíodo de tempo, pode ser usada para verificar os resultados de detecçõesanteriores, e/ou para identificar a resposta ou a resistência a um tratamentoespecífico, por exemplo, um fármaco terapêutico selecionado.
Os métodos da presente invenção podem ser usados paradetectar a presença de um ou mais agentes patológicos em uma amostra deteste de um animal, e o nível de cada agente patológico. Qualquer métodopara detectar o agente patológico pode ser usado, incluindo, porém nãolimitado aos, ensaios de anticorpos, incluindo os ensaios de imunoabsorçãoenzimática (ELISAs), os testes de anticorpos fluorescentes indiretos (IFA),os ensaios de hemaglutinação, e inibição da hemaglutinação (Hl), e oWestern Blot. Os métodos de cultura de células conhecidos podem tambémser usados. As culturas positivas podem ser adicionalmente identificadasusando imunofluorescência de culturas de células ou ensaio de Hl do meiode cultura de células (sobrenadante).
Além disso, podem ser usados métodos para detectar o ácidonucléico (DNA ou RNA) ou a proteína. Tais métodos incluem, porém nãoestão limitados à reação em cadeia por polimerase (PCR), e a testes detranscriptase reversa (RT) PCR e a testes em tempo real, e a ensaios deproteção de nuclease quantitativos. Existem kits de teste à venda comercial-mente, disponíveis para efetuar esses ensaios. Por exemplo, a QIAGEN(Valencia, CA) vende um kit de RT-PCR de uma etapa, e o kit de extraçãode RNA viral.
Em uma modalidade, o método utiliza um anticorpo específicopara um vírus ou proteína viral da invenção. Em uma modalidade específica,um anticorpo específico para uma proteína HA de um vírus da invenção éutilizado. Em uma outra modalidade, um anticorpo específico para umaproteína NP de um vírus da invenção é utilizado. Uma amostra adequada, talcomo da região nasal ou nasofaríngea, é obtida de um animal e o vírus ou aproteína viral é isolada dele. Os componentes virais são então examinadosquanto à ligação de um anticorpo específico para uma proteína, tal como HAou NP, de um vírus da invenção. Em uma outra modalidade, uma amostrade soro (ou outra amostra contendo anticorpo) é obtida de um animal e osoro examinado quanto à presença de anticorpo que se liga a uma proteínade um vírus da invenção. Por exemplo, um ensaio ELISA pode ser efetuado,em que as paredes da placa têm proteína HA e/ou NP, ou um fragmento depeptídeo dela, ligado à parede. A parede da placa é então contatada com osoro ou o anticorpo de um animal de teste. A presença de anticorpo noanimal que se liga especificamente à proteína HA e/ou NP é indicativa que oanimal de teste está infectado ou foi infectado com um vírus influenza dapresente invenção.
Em uma modalidade, a presença de um agente patológico édetectada por determinação da presença ou da ausência de anticorposcontra o agente, em uma amostra biológica. Pode levar algum tempo (porexemplo, meses) após um animal ser infectado antes dos anticorpos pode-rem ser detectados em um teste de sangue. Assim que formados, os anticor-pos normalmente persistem por muitos anos, mesmo após o tratamentobem-sucedido da doença. Encontrar anticorpos para a influenza canina Apode não indicar se a infecção era recente, ou foi outrora no passado.
O teste dos anticorpos pode também ser feito em fluido(s). Osensaios de anticorpos incluem os ensaios imunológicos por ligação comenzimas (ELISAs), os ensaios de anticorpos fluorescentes indiretos (IFA), eo Western Blot. De preferência, o teste dos anticorpos é feito usandoensaios múltiplos, por exemplo, ELISA ou IFA seguido por Western Blot. Osensaios dos anticorpos podem ser feitos em um processo de duas etapas,usando um ensaio ELISA ou IFA, seguido por um ensaio de Western Blot. OELISA é considerado um ensaio mais confiável e preciso do que o IFA,porém o IFA pode ser usado se o ELISA não estiver disponível. O teste deWestern Blot (que é um teste mais específico) pode também ser feito emtodos os animais, particularmente aqueles que testaram positivos oupositivos duvidosos (equívocos) em um ensaio ELISA ou IFA.
Os outros testes à base de anticorpos que podem ser usadospara a detecção do vírus influenza incluem os ensaios de inibição dahemaglutinaçao. A atividade de hemaglutinaçao pode ser detectada em umaamostra biológica de um animal, usando as células sangüíneas vermelhasde galinhas ou perus, conforme descrito (Burleson e outros, 1992 e Kendal eoutros, 1982). Em uma modalidade, um influenza ou uma proteína oupeptídeo HA da invenção é contatado com uma amostra de teste contendosoro ou anticorpo. As células sangüíneas vermelhas (RBC) de um animal, talcomo uma ave, são então adicionadas. Se o anticorpo para HA estiverpresente, então as RBC não se aglutinarão. Se o anticorpo para HA nãoestiver presente, as RBC se aglutinarão na presença de HA. As variações eas modificações para os ensaios de inibição da hemaglutinaçao padrão sãoconhecidas na técnica e contempladas dentro do escopo da presenteinvenção.
A infecção de um animal pode também ser determinada porisolamento do vírus de uma amostra, tal como um swab nasal ou nasofa-ríngeo. O isolamento viral pode ser efetuado usando métodos-padrão,incluindo a inoculação de culturas de células e ovos.
Em uma modalidade adicional, um ensaio à base de ácidonucléico pode ser usado para a detecção de um vírus da presente invenção.Em uma modalidade, uma amostra de ácido nucléico é obtida de um animale o ácido nucléico submetido a PCR usando iniciadores que gerarão umproduto de amplificação, se o ácido nucléico contiver uma seqüência espe-cífica para um vírus influenza da presente invenção. Em uma modalidadeespecífica, a RT-PCR é usada em um ensaio para o vírus exposto. Em umamodalidade exemplificada, a RT-PCR em tempo real é usada para testar umvírus influenza da invenção. Os métodos de PCR, RT-PCR e PCR em temporeal são conhecidos na técnica e foram descritos nas Patentes U.S. N—4.683.202; 4.683.195; 4.800.159; 4.965.188; 5.994.056; 6.814.934; e emSaiki e outros (1985); Sambrook e outros (1989); Lee e outros (1993); eLivak e outros (1995). Em uma modalidade, o ensaio de PCR utilizaoligonucleotídeos específicos para um gene de matriz (MA) e/ou gene de HAde influenza. O produto de amplificação pode também ser seqüenciado paradeterminar se o produto tem uma seqüência de um vírus influenza dapresente invenção. Outros ensaios à base de ácidos nucléicos podem serusados para a detecção e a diagnose de infecção viral por um vírus dainvenção e tais ensaios são contemplados dentro do escopo da presenteinvenção. Em uma modalidade, uma amostra contendo um ácido nucléico ésubmetida a uma amplificação à base de PCR usando os iniciadores forwarde reverso, em que os iniciadores são específicos para uma seqüência depolinucleotídeos ou gene viral. Se o ácido nucléico na amostra for o RNA,então a RT-PCR pode ser efetuada. Para a PCR em tempo real, uma sondadetectável é utilizada com os iniciadores.
Os grupos de iniciadores específicos para o gene de hemaglu-tinina (HA) de muitos dos vírus influenza circulantes são conhecidos, e estãocontinuamente sendo desenvolvidos. O genoma do vírus influenza é umRNA de filamento simples, e a cópia de DNA (cDNA) deve ser feita usandouma polimerase transcritase reversa (RT). A amplificação do genoma deRNA, por exemplo, usando RT-PCR, requer um par de iniciadores deoligonucleotídeos, tipicamente projetado de acordo com a seqüência de HAconhecida dos subtipos de influenza A e de neuraminadase (NM)-1. Osiniciadores podem ser selecionados de modo tal que eles especificamenteamplificarão o RNA de somente um subtipo de vírus. Os DNAs gerados porutilização de iniciadores específicos para os subtipos podem seradicionalmente analisados por técnicas genéticas moleculares, tais como oseqüenciamento. O teste é preferivelmente efetuado com um controlepositivo, ou os produtos são confirmados por seqüenciamento e comparaçãocom seqüências conhecidas. A ausência de produtos-alvo de PCR (isto é,um resultado "negativo") pode não excluir a presença do vírus. Osresultados podem então ser tornados disponíveis dentro de algumas horas apartir de swabs clínicos ou culturas de células infectadas. Os testes PCR eRT-PCR para o vírus influenza A são descritos por Fouchier e col, 2000 eMaertzdorf e outros, 2004.
A presente invenção também refere-se aos métodos para atriagem por compostos ou farmacos que têm atividade antiviral contra umvírus da presente invenção. Em uma modalidade, as células infectadas comum vírus da invenção são contatadas com um composto ou fármaco de teste.A quantidade de vírus ou atividade viral após o contato é então determinada.Esses compostos ou farmacos que exibem atividade antiviral podem serselecionados para avaliação adicional.
A presente invenção também refere-se às células isoladas,infectadas com um vírus influenza da presente invenção. Em uma moda-lidade, a célula é uma célula canina, tal como as células epiteliais dos rinscaninos.
A presente invenção também refere-se às células transformadascom um polinucleotídeo da presente invenção que codifica um polipeptídeoda invenção. De preferência, a seqüência de polinucleotídeos é proporcio-nada em um constructo de expressão da invenção. Mais preferivelmente, oconstructo: de expressão proporciona a superexpressão na célula de umpolinucleotídeo operavelmente ligado da invenção. Em uma modalidade, acélula é transformada com uma seqüência de polinucleotídeos compre-endendo uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácidos mostradaem quaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76,ou 78, ou um fragmento ou variante funcional do mesmo. Em uma moda-lidade específica, a célula é transformada com um polinucleotídeocodificando a seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58,60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78 que compreende a seqüência denucleotídeos mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,ou 77, respectivamente, ou uma seqüência codificando um fragmento ouvariante funcional de quaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Assim, a presente invenção refere-se às célulastransformadas com uma seqüência de polinucleotídeos compreendendo aseqüência de nucleotídeos mostrada em quaisquer das SEQ ID NOs: 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante, incluindo umavariante degenerada, de quaisquer das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69,71, 73, 75, ou 77.
A célula transformada pode ser uma célula eucariótica, porexemplo, uma célula de planta, incluindo os protoplastos, ou a célulatransformada pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célulabacteriana, tal como E. coli ou B. subtilis. As células animais incluem ascélulas humanas, as células mamíferas, parcialmente as células caninas, ascélulas aviárias, e as células de insetos. As células de plantas incluem,porém não estão limitadas às, células dicotiledôneas, monocotiledôneas, ede coníferas.
A presente invenção também refere-se às plantas, incluindo asplantas transgênicas que expressam e produzem uma proteína oupolipeptídeo viral da presente invenção. As plantas, os tecidos de plantas, eas células de plantas, transformados com, ou gerados para conter, umpolinucleotídeo da invenção são contemplados pela presente invenção. Depreferência, o polinucleotídeo da invenção é superexpresso na planta, notecido da planta, ou na célula da planta. As plantas podem ser usadas paraproduzir as composições de vacinas de influenza da presente invenção e asvacinas podem ser administradas através do consumo da planta (ver, porexemplo, as Patentes U.S. N32 5.484.719 e 6.136.320).
A presente invenção também refere-se aos kits para detectar umvírus ou diagnosticar uma infecção por um vírus da presente invenção. Emuma modalidade, um kit compreende um anticorpo da invenção que se ligaespecificamente a um vírus influenza da presente invenção, ou a umaporção antigênica dele. Em uma outra modalidade, um kit compreende umou mais polipeptídeos ou peptídeos da presente invenção. Em umamodalidade específica, os polipeptídeos têm uma seqüência de aminoácidosmostrada em quaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento ou variante funcional e/ou imunogênicado mesmo. Em uma modalidade adicional, um kit compreende um ou maispolinucleotídeos ou oligonucleotídeos da presente invenção. Em umamodalidade específica, os polinucleotídeos têm uma seqüência de nucleo-tídeos mostrada em quaisquer das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71,
73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante do mesmo. Um kit podeopcionalmente compreender um ou mais anticorpo de controle, polipeptídeoou peptídeo de controle, e/ou polinucleotídeo ou oligonucleotídeo de controle.
O anticorpo, os polipeptídeos, os peptídeos, os polinucleotídeos, e/ou osoligonucleotídeos do kit podem ser proporcionados em um recipiente ouacondicionamento adequado.
O presente pedido também refere-se ao uso de cães mestiçoscomo um modelo para a infecção e a patogênese de vírus influenza. Emuma modalidade, um cão mestiço é inoculado com um vírus influenza, talcomo um vírus influenza canino da presente invenção. Opcionalmente, o cãopode ser administrado com agentes terapêuticos, subseqüente à inoculação.O cão pode também ter sido administrado com uma composição para geraruma resposta imune contra um vírus influenza, antes da inoculação com ovírus. As amostras de tecido, sangue, soro, e outras amostras biológicaspodem ser obtidas antes e/ou depois da inoculação e examinadas quanto àpresença de vírus e patogênese do tecido usando métodos conhecidos natécnica, incluindo, porém não limitados à, PCR, RT-PCR, seqüenciamentode ácido nucléico, e imunoistoquímica.
Qualquer elemento de qualquer modalidade descrita nessedocumento pode ser combinado com qualquer outro elemento ou modali-dade divulgada aqui e tais combinações são especificamente contempladasdentro do escopo da presente invenção.
Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos provisórios, epublicações referidos ou citados nesse documento são incorporados porreferência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medidaem que eles não estejam inconsistentes com os ensinamentos explícitosdeste relatório descritivo.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 1-6
Coleta de Swabs de Sangue e Nasais de Galgos.
As amostras agudas e convalescentes de sangue foram coleta-das por venopuntura jugular de galgos clinicamente doentes ou normais emcanis de corrida experimentando surtos de doença respiratória. As amostrasconvalescentes foram coletadas 4 a 12 semanas após a amostra aguda. Osoro foi coletado e armazenado a -80°C. Os swabs nasais foram coletados ecolocados em meio de transporte Amies com carvão vegetal (BectonDickinson Biosciences) aguardando o envio para o isolamento bacteriano.
Exame pós-morte de galgos.
Os exames completos pós-morte foram efetuados pelo AnatomicPathology Service na University of Florida College of Veterinary Medicine(UF CVM) em 5 dos 8 galgos que morreram no surto de janeiro de 2004 emuma pista da Flórida. O exame pós-morte de um outro cão foi efetuado emuma clínica veterinária particular, com o envio dos tecidos para a UF CVMpara a diagnose histopatológica. Os tecidos foram fixados em 10% deformalina tamponada neutra, incrustada em parafina, e as secções de 5 )imforam tingidas com hematoxilina e eosina para a diagnose histopatológica ouprocessadas para a imunoistoquímica, conforme descrito abaixo. Os tecidosnão fixados foram enviados para cultura bacteriana e também armazenadosa -80°C.Testes sorolóqicos para os patóqenos respiratórios virais caninos.
As amostras agudas e convalescentes de soro em pares foramsubmetidas ao Animal Health Diagnostic Laboratory (AHDL) na CornellUniversity College of Veterinary Medicine, para os ensaios de neutralizaçãodo soro contra o vírus da cinomose canino, o adenovírus tipo 2, e o vírusparainfluenza. Os títulos de anticorpos foram expressos como a últimadiluição do soro que inibiu a infecção viral das culturas de células. Asoroconversão, definida como um aumento > 4 vezes no título de anticorpoentre a amostra aguda e convalescente, indicou a infecção viral. Não foidetectada nenhuma soroconversão para esses patógenos virais.
Testes microbianos para patóqenos respiratórios bacterianos caninos.
Os swabs nasais e os tecidos pós-morte em pares foramenviados ao Diagnostic Clinicai Microbiology/Parasitology/Serology Servicena UF CVM para o isolamento e a identificação bacterianos. As amostrasforam cultivadas em meios não seletivos, bem como em meios seletivospara a espécie Bordetella (Regan-Lowe; Remei) e a espécie Mycoplasma(Remei). Todas as culturas foram conservadas por 21 dias antes do relatóriode nenhum crescimento. Os swabs nasais de alguns dos galgos foramtambém enviados ao Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology noKansas State University College of Veterinary Medicine para a culturabacteriana. Dos 70 cães clinicamente doentes, testados, a Bordetellabronchiseptica foi isolada da cavidade nasal de 1 cão, enquanto que asMycoplasma spp. foram recuperadas da cavidade nasal de 33 cães. APasteurella multocida foi comumente recuperada da cavidade nasal de cãescom secreções nasais purulentas. Dois dos cães que morreram no surto dejaneiro de 2004 tiveram crescimento reduzido de Escherichia coli nospulmões pós-morte, um cão teve crescimento reduzido de E. coli eStreptococcus canis, e um outro teve crescimento reduzido de Pseudo-monas aeruginosa e uma levedura. Nem Bordetella bronchiseptica, nemMycoplasma foi isolado das traquéias ou dos pulmões dos cães quemorreram.
Isolamento do vírus de tecidos pós-morte.Os tecidos congelados foram descongelados e homogeneizadosem 10 volumes de meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 0,5%de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos. Os fragmentos sólidosforam removidos por centrifugação e os sobrenadantes foram inoculadossobre células cultivadas ou em ovos de galinhas embrionados de 10 dias deidade. Os homogeneizados de tecido dos galgos que morreram foraminoculados em diversas culturas de células que suportaram a replicação deuma faixa ampla de patógenos virais. As culturas de células incluíram Vero(células epiteliais de rins de macacos verdes africanos, ATCC N2 CCL-81),A-72 (fibroblastos de tumores caninos, CRL-1542), HRT-18 (células epiteliaisretais humanas, CRL-11663), MDCK (células epiteliais de rins caninos, CCL-34), células primárias epiteliais de rins caninos (AHDL, Cornell University),células primárias epiteliais de pulmões caninos (AHDL), e células primáriastesticulares bovinas (AHDL). As células MDCK e HRT foram cultivadas emMEM suplementado com 2,5 ug/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma);as linhagens celulares restantes foram cultivadas em MEM suplementadocom 10% de soro de bezerro fetal e antibióticos. As células foram desenvol-vidas em frascos de 25 cm2, a 37°C, em uma atmosfera umidificada conten-do 5% de C02. Uma cultura de controle foi inoculada com o MEM suplemen-tado. As culturas foram observadas diariamente quanto a mudançasmorfológicas e coletadas em 5 dias após a inoculação. Os fluidos e ascélulas coletados foram clarificados por centrifugação e inoculados sobrecélulas novas, conforme descrito para a inoculação inicial; duas passagensàs cegas foram efetuadas. A atividade de hemaglutinação nos sobrena-dantes clarificados foi determinada usando as células vermelhas sangüíneasde galinhas ou perus, conforme descrito (Burleson e outros, 1992; Kendal eoutros, 1982). Para o isolamento do vírus em embriões de galinhas, 0,1 mLde homogeneizado de tecido foi inoculado no saco alantóico e incubado por48 horas, a 35°C. Após duas passagens às cegas, a atividade de hemaglu-tinação nos fluidos alantóicos foi determinada conforme descrito (Burleson eoutros, 1992; Kendal e outros, 1982).
RT-PCR, seqüenciamento de nucleotídeos, e análises filoaenéticas.O RNA total foi extraído do sobrenadante da cultura de tecido oudo fluido alantóico usando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), de acordocom as instruções do fabricante. O RNA total (10 ng) foi transcrito invertidopara cDNA usando o Kit de RT-PCR de uma etapa (Qiagen, Valencia, CA),de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação por PCR daregião de codificação dos 8 genes virais influenza no cDNA foi efetuadaconforme anteriormente descrito (Klimov e outros, 1992a), usando grupos deiniciadores específicos para genes universais. Os amplicons de DNAresultantes foram usados como moldes para o seqüenciamento automati-zado sobre um seqüenciador de DNA automatizado 3100 da AppliedBiosystems, usando a química de terminador de corante de seqüenciamentode ciclo (ABI). As seqüências de nucleotídeos foram analisadas usando oGCG Package®, Versão 10.0 (Accelyrs) (Womble, 2000). O PhylogenyInference Package® Versão 3.5 foi usado para estimar as filogêneses ecalcular os valores de partida a partir das seqüências de nucleotídeos(Felsenstein, 1989). As árvores filogenéticas foram comparadas àquelasgeradas por análise de união do próximo com o modelo de Tamura-Neigama implementado no programa MEGA® (Kumar e outros, 2004) econfirmadas pelo programa PAUP® 4.0 Beta (Sinauer Associates).
Inoculacão experimental dos cães.
Foram usados quatro beagles sem patógenos, de 6 meses deidade [(2 machos e 2 fêmeas (Liberty Research)). O exame físico e os testesde sangue de linha de base, incluindo a contagem completa de célulassangüíneas/diferencial, o painel de química do soro, e a urinálise,determinaram que os animais eram saudáveis. Eles foram alojados juntosem uma instalação duplamente reforçada BSL, autorizada pela Associationfor Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Astemperaturas retais de linha de base foram registradas duas vezesdiariamente, por 7 dias. Os cães foram anestesiados por injeção intravenosade propofol (Diprivan®, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg de peso docorpo até o efeito) por intubação com tubos endotraqueais. Cada cão foiinoculado com uma dose total de 106,6 doses infecciosas de cultura de tecidomédias (TCID50) de vírus A/Canino/Florida/43/2004 (Canino/FL/04) (H3N8),com metade da dose administrada na traquéia distai através do tuboendotraqueal e a outra metade administrada na passagem nasal profundaatravés de um cateter. Os exames físicos e os registros de temperaturasretais foram efetuados duas vezes ao dia, por 14 dias após a inoculação(p.i.)- As amostras de sangue (4 ml_) foram coletadas por venopunturajugular nos dias 0, 3, 5, 7, 10, e 14 p.i. Os espécimens nasais e orofaríngeosforam coletados com swabs de poliéster (Fisher Scientific) a partir de cadacão nos dias 0 a 5, 7, 10, e 14 p.i. Os swabs foram colocados em meio detransporte viral (Remei) e armazenados a -80°C. Dois cães (1 macho e 1fêmea) sofreram eutanásia por inoculação intravenosa de solução deBeuthanasia-D® (1 ml_/5 kg de peso do corpo; Schering-Plough AnimalHealth Corp) no dia 5 p.i. e os 2 cães restantes no dia 14 para exame pós-morte. Os tecidos para a análise histológica foram processados conformedescrito. Os tecidos para a cultura de vírus foram armazenados a -80°C.
Esse estudo foi aprovado pelo University of Florida Institutional Animal Careand Use Committee.
Disseminação do vírus a partir de cães experimentalmente inoculados.
As diluições em série de homogeneizados do pulmão e extratosdo swab, preparados por clarificação dos meios de transporte de swab porcentrifugação, foram preparadas em MEM suplementado com 0,5% de BSAe antibióticos. Os ensaios em placas foram efetuados conforme descrito(Burleson e outros, 1992) usando monocamadas de células MDCK emplacas de cultura de tecido de 6 cavidades. As monocamadas de célulasinoculadas foram cobertas com MEM suplementado contendo 0,8% deagarose e 1,5 ug/mL de tripsina com TPCK. As células foram cultivadas por72 horas, a 37°C, em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2,antes da fixação e do fingimento com violeta cristal. A concentração de vírusfoi expressa como unidades formadoras de placas (PFU) por grama detecido ou por swab.
Imunoistoquímica.
As secções de tecidos de pulmões de 5 um, desparafinizadas ereidratadas, dos galgos e beagles, foram montadas sobre lâminas Bond-Rite® (Richard-AIlan Scientific, Kalamazoo, Ml) e subseqüentemente tratadascom proteinase K (DakoCytomation, Carpenteria, CA), seguida por reagentede bloqueio de peroxidase (Kit de Peroxidase EnVision® da Dako®, DakoCorp.). As secções foram incubadas com diluições a 1:500 de anticorposmonoclonais para o vírus da cinomose canino (VMRD,Inc.), o adenovíruscanino tipo 2 (VMRD, Inc.), o vírus parainfluenza canino (VMRD, Inc.), ou oinfluenza A H3 (Chemicon International, Inc.) por 2 horas, na temperaturaambiente. Os controles incluíram a incubação das mesmas secções com IgGde camundongo (1 mg/mL, Serotec, Inc.), e a incubação dos anticorposmonoclonais com secções de pulmões caninos normais. Após o tratamentocom os anticorpos primários, as secções foram incubadas com os reagentesde substrato secundários de imunoperoxidase e peroxidase (Kit dePeroxidase EnVision® da Dako®, Dako Corp.), de acordo com as instruçõesdo fabricante. As secções foram contratingidas com hematoxilina, tratadascom Reagente Clarifier n2 2 e Bluing (Richard-AIlan Scientific, Kalamazoo,Ml), desidratadas, e as lamínulas aplicadas com Permount (ProSciTech).Ensaio de Inibição da hemaglutinacão (Hl).
As amostras de soro foram incubadas com a enzima destruidorade receptor (RDE, Denka) (1 parte de soro: 3 partes de RDE), por 16 horas,a 37°C, antes da inativação térmica por 60 minutos, a 56°C. O vírusinfluenza A/Canino/FL/04 (H3N8) foi desenvolvido em células MDCK por 36-48 h, a 37°C. Os sobrenadantes da cultura de vírus foram coletados,clarificados por centrifugação, e armazenados a -80°C. O ensaio de Hl foiefetuado conforme descrito anteriormente (Kendal e outros, 1982).
Resumidamente, 4 unidades de hemaglutinacão do vírus em 25 jil foramadicionadas a um volume igual de soro diluído em série, em cavidades demicrotítulo, e incubadas na temperatura ambiente por 30 minutos. Umvolume igual de 0,5% v/v de eritrócitos de peru foi adicionado e os títulos dehemaglutinacão foram estimados visualmente após 30 minutos. O título deHl de ponto final foi definido como a última diluição de soro que inibiucompletamente a hemaglutinacão. A soroconversão foi definida como umaumento > 4 vezes no título de Hl entre as amostras agudas econvalescentes em pares. A soropositividade de uma única amostra foidefinida como um título de Hl de anticorpo >1:32.
Ensaio de microneutralização (MN).
As respostas de anticorpos do soro de neutralização aoA/Canino/FL/04 (H3N8) foram detectadas por um ensaio de MN conformedescrito anteriormente (Rowe e outros, 1999), exceto que os soros caninosforam tratados com RDE, conforme descrito acima, antes do ensaio. O títulode ponto final foi definido como a mais alta diluição do soro que deu 50% deneutralização de 100 TCID50 do vírus. A soroconversão foi definida como umaumento de > 4 vezes no título de MN entre as amostras agudas econvalescentes em pares. A soropositividade de uma única amostra foidefinida como um título de MN >1:80.
Os que seguem são exemplos que ilustram os procedimentospara praticar a invenção. Esses exemplos não devem ser interpretadoscomo limitantes. Todas as porcentagens são em peso e todas as proporçõesde misturas de solventes são em volume, a não ser que de outro modoobservado.
EXEMPLO 1
Em janeiro de 2004, um surto de doença respiratória ocorreu em22 galgos de corrida alojados em 2 canis, em uma pista de corridas daFlórida e na fazenda local que fornecia os cães para estes canis. Haviaaproximadamente 60 cães em cada prédio do canil e 300 cães na fazenda.O surto ocorreu durante um período de 6 dias, após o que nenhum casonovo foi identificado. Quatorze dos 22 cães tiveram febre de 39,5 a 41,5°C,uma tosse leve que causava ânsia de vômito por 10 a 14 dias, recuperaçãofinal. Dos 8 cães restantes, 6 cães aparentemente saudáveis morreraminesperadamente com hemorragia da boca e do nariz. Dois outros cãessofreram eutanásia dentro de 24 horas do início da hemorragia da boca e donariz devido à rápida deterioração. Ambos esses cães tiveram febre de 41 °C.Quatro das 8 mortes ocorreram nos prédios dos canis e 4 ocorreram nafazenda. Cinqüenta por cento das mortes ocorreram no dia 3 do surto. Os 22cães variaram na idade de 17 meses a 4 anos, porém 73% eram 17 a 33meses de idade.
Duas síndromes clínicas eram evidentes: uma doença maisbranda, caracterizada por febre inicial e então tosse por 10-14 dias (14 cães),com recuperação subseqüente, ou uma morte peraguda associada comhemorragia no trato respiratório (8 cães para uma taxa de mortalidade de36%). Os exames pós-morte foram efetuados em 6 dos 8 casos fatais.
Todos os cães tiveram hemorragia extensa nos pulmões, mediastino, ecavidade pleural. O exame histológico do trato respiratório revelou que, alémda hemorragia pulmonar, todos os cães tiveram traqueíte, bronquite,bronquiolite, e broncopneumonia supurativa (figura 3). O revestimentoepitelial e os lúmens das vias aéreas nesses tecidos foram infiltrados porneutrófilos e macrófagos. Os homogeneizados dos pulmões preparados apartir desses cães foram inoculados em uma variedade de linhagenscelulares de macacos, humanas, bovinas, e caninas, para a cultura de vírus.
O homogeneizado do pulmão de um cão causou efeitos citopáticos nascélulas epiteliais de rins caninas de Madin-Darby (MDCK), cultivadas napresença de tripsina, e o sobrenadante da cultura de células aglutinou ascélulas sangüíneas vermelhas das galinhas. A evidência preliminar de umvírus influenza do tipo A foi proporcionada por um ELISA comercial para adetecção da nucleoproteína dos vírus influenza A e B, e através de análisepor PCR usando iniciadores específicos para o gene de matriz dos vírusinfluenza A. Ademais, a atividade de hemaglutinação foi inibida por anti-soros de referência para o subtipo de influenza A eqüino H3, porém não poranti-soros específicos para os subtipos de influenza A humanos H1-H11 eH13 (Tabela 3). Para caracterizar as propriedades moleculares do vírus,foram determinadas as seqüências de nucleotídeos dos 8 segmentos deRNA do genoma viral. As comparações de seqüências com os genes dovírus influenza conhecidos e as análises filogenéticas indicaram que os 8genes do isolado canino eram mais similares àqueles dos vírus influenza Aeqüinos contemporâneos (H3N8), com os quais eles compartilham >96-97%de identidade de seqüência (figura 1A, Tabela 4). Em contraste, os genesrepresentativos de isolados de influenza A aviários, suínos, e humanostiveram <94% de identidade com o isolado canino (Tabela 4). Esses dadosidentificaram o isolado canino A/Canino/Florida/43/04 (Canino/FL/04) comoum vírus influenza A H3N8 intimamente relacionado às linhagenscontemporâneas de vírus influenza eqüinos. Visto que todos os genes doisolado canino eram de origem de vírus influenza eqüino, foi concluído que ogenoma inteiro de um vírus influenza eqüino tinha sido transmitido para ocão.
EXEMPLO 2
Para investigar a função do vírus Canino/FL/04 nas observaçõesclínicas e patológicas nos galgos, foi efetuada coloração imunoistoquímica(IHC) nos tecidos dos pulmões, usando um anticorpo monoclonal parainfluenza A H3. O antígeno viral H3 foi consistentemente detectado no cito-plasma de células epiteliais bronquiais e bronquiolares, células epiteliais daglândula bronquial, e macrófagos nos lúmens das vias aéreas e nos espaçosalveolares (figura 2A). Esses dados suportam um diagnóstico de infecçãopulmonar com o vírus influenza do subtipo H3 em múltiplos cães.
EXEMPLO 3
Para determinar o envolvimento de um vírus similar ao Cani-no/FL/04 na etiologia do surto de doença respiratória, foram analisadossoros agudos e convalescentes em pares de 11 cães doentes e 16 contatosassintomáticos por inibição da hemaglutinação (Hl) e microneutralização(MN). A soroconversão, definida como uma elevação > 4 vezes no título deanticorpo para Canino/FL/04 a partir da fase aguda até a convalescente,ocorreu em 8 de 11 (73%) cães doentes em ambos os ensaios (Tabela 1). Asoroconversão ocorreu em 6 de 16 (38%) contatos assintomáticos no ensaiode Hl, enquanto 8 de 16 (50%) soroconverteram no ensaio de MN (Tabela 1).Os dados de soroconversão demonstraram a infecção dos cães com umvírus similar ao Canino/FL/04 que coincidiu temporariamente com o início dadoença respiratória na maioria dos animais.
As amostras de soro individuais foram coletadas 3 meses após osurto de uns 46 cães assintomáticos adicionais, alojados com os cãesdoentes. Desses, 43 (93%) eram soropositivos em ambos os ensaios. Para apopulação total de 73 cães testados, 93% eram soropositivos em ambos osensaios, incluindo 82% (9/11) dos cães doentes e 95% (59/62) dos contatossaudáveis. A alta soroprevalência nos cães sem nenhuma história dedoença respiratória indica que a maioria das infecções com o vírus influenzacanino era subclínica e sugere a disseminação eficiente do vírus entre oscães. Não se sabe se as infecções subclínicas contribuem para a disse-minação do vírus.
EXEMPLO 4
Para melhor entender a capacidade do vírus Canino/FL/04 deinfectar os cães, quatro beagles de 6 meses de idade, com o propósito decriação, foram, cada um, inoculados com 106,6 doses infecciosas de culturade tecido médias (TCID50) pelas rotas intratraqueal e intranasal. Todos oscães desenvolveram uma febre (temperatura retal >39°C) pelos primeiros 2dias após a inoculação (p.i.)., porém nenhum exibiu sintomas respiratórios,tais como tosse ou secreção nasal durante um período de observação de 14dias. A disseminação do vírus foi examinada por quantificação do vírus nosswabs nasais e orofaríngeos. Somente 2 dos 4 cães disseminaram quanti-dades detectáveis de vírus. Um cão disseminou o vírus nos dias 1 e 2 p.i.(1,0-2,5 logio PFU por swab), enquanto o outro cão disseminou o vírus por 4dias consecutivos após a inoculação (1,4-4,5 logio PFL) por swab). O examepós-morte de 2 cães no dia 5 p.i. revelou traqueíte necrotizante e hiperplá-sica, bronquite, e bronquiolite similares àquela verificada na doença espontâ-nea em galgos, porém não houve nenhuma hemorragia pulmonar oubroncopneumonia. O antígeno viral H3 foi detectado no citoplasma decélulas epiteliais dos brônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais por IHC(figura 2B). O vírus infeccioso foi recuperado do tecido do pulmão de um doscães. O exame pós-morte dos 2 cães restantes no dia 14 p.i. mostroualterações histológicas mínimas nos tecidos respiratórios, nenhum antígenoviral H3 por IHC, e nenhuma recuperação do vírus dos homogeneizados dopulmão. A soroconversão nestes 2 cães foi detectada em ensaios de MNpelo dia 7 p.i., com um aumento adicional de 2 a 3 vezes nos títulos deanticorpos pelo dia 14. Esses resultados estabeleceram a suscetibilidadedos cães à infecção com Canino/FL/04, conforme evidenciado pela respostafebril, presença de antígeno viral e vírus infeccioso no parênquima dopulmão, verificações histopatológicas típicas para a influenza, e sorocon-versão. O fracasso em reproduzir doença grave e morte nos beagles experi-mentalmente inoculados não é surpreendente, visto que uma grandeproporção dos galgos naturalmente infectados era assintomática.
EXEMPLO 5
Para investigar se um vírus influenza similar ao Canino/FL/04tinha circulado entre as populações de galgos na Flórida, antes do surto dejaneiro de 2004, os soros arquivados de 65 galgos de corrida foram testadosquanto à presença de anticorpos para Canino/FL/04, usando os ensaios deHl e MN. Não havia nenhum anticorpo detectável em 33 cães testados de1996 a 1999. Dos 32 cães testados entre 2000 e 2003, 9 eram soropositivosem ambos os ensaios - 1 em 2000, 2 em 2002, e 6 em 2003 (Tabela 5). Oscães soropositivos estavam localizados nas pistas de corrida da Flórida,envolvidas nos surtos de doença respiratória de etiologia desconhecida de1999 até 2003, sugerindo que um vírus similar ao Canino/FL/04 pode tersido o agente causador desses surtos. Para investigar essa possibilidadeadicionalmente, foram examinados os tecidos arquivados de galgos quemorreram de broncopneumonia hemorrágica em março de 2003. Oshomogeneizados do pulmão inoculados em células MDCK e embriões degalinhas a partir de um cão produziram o vírus influenza H3N8, chamadoA/Canino/Florida/242/2003 (Canino/FL/03). A análise de seqüência dogenoma completo do Canino/FL/03 revelou >99% de identidade com oCanino/FL/04 (Tabela 4), indicando que os vírus similares ao Canino/FL/04tinham infectado os galgos antes de 2004.
EXEMPLO 6
De junho a agosto de 2004, ocorreram surtos de doençarespiratória em milhares de galgos de corrida, em 14 pistas de corrida naFlórida, Texas, Alabama, Arkansas, West Virgínia, e Kansas.
Os dirigentes em algumas destas pistas estimaram que pelomenos 80% de sua população de cães teve doença clínica. A maioria doscães teve sinais clínicos de febre (>39°C) e tosse similares aos cães nosurto de janeiro de 2004, porém muitos cães também tiveram umacongestão nasal mucopurulenta. Foram descritas mortes múltiplas, porémuma taxa de mortalidade acurada não pôde ser determinada.
Foram coletados soros agudos e convalescentes em pares de94 cães localizados em 4 pistas da Flórida: 56% desses cães tiveramelevações >4 vezes nos títulos de anticorpos para Canino/FL/04, e 100%eram soropositivos (Tabela 6). Os soros convalescentes de 29 cães emWest Virgínia e Kansas também tinham anticorpos para Canino/FL/04. Foiisolados o vírus influenza A (H3N8) dos pulmões de um galgo que morreu debroncopneumonia hemorrágica em uma pista no Texas. A análise deseqüência do genoma inteiro desse isolado, chamado A/Canino/Texas/1/2004 (Canino/TX/04), revelou >99% de identidade com o Canino/FL/04(Tabela 4). O isolamento de três vírus influenza intimamente relacionados apartir de casos fatais caninos, durante um período de 13 meses, e dediferentes posições geográficas, juntamente com a evidência sorológicasubstancial de infecção espalhada entre os galgos de corrida, sugeriu acirculação continuada de um vírus similar ao Canino/FL/04 na população de cães.
A análise filogenética dos genes de HA de Canino/FL/03,Canino/FL/04, e Canino/TX/04 mostrou que eles constituem um grupomonofilético com suporte de partida sólido que era claramente distinto dosgenes de H3 contemporâneos dos vírus eqüinos isolados em 2002 e 2003(figura 1B). A análise filogenética e as comparações de seqüências denucleotídeos em pares dos outros 7 segmentos genômicos suportaram asegregação dos genes caninos como uma sublinhagem distinta, maisintimamente relacionada à linhagem de vírus eqüino (dados não mostrados,e Tabela 4). O agrupamento dos genes de influenza caninos como um grupomonofilético separado da influenza eqüina é também suportado pelapresença de 4 alterações de aminoácidos de assinatura na HA (Tabela 2).Juntamente com os resultados sorológicos de 2003 e 2004, esses dadosestão consistentes com um único evento de transmissão de vírus de cavalospara cães, com disseminação subseqüente horizontal do vírus na populaçãode galgos. Entretanto, as introduções repetidas dessa linhagem única devírus influenza a partir de uma espécie de reservatório não identificada nãopodem ser formalmente excluídas, improvável como ela possa ser.
A HA viral é um determinante crítico da especificidade do vírusinfluenza pela espécie hospedeira (Suzuki e outros, 2000). Para identificaros resíduos dentro da HA que possam estar associados com a adaptação aohospedeiro canino, foi comparada a seqüência de aminoácidos deduzida dasHAs caninas com aquelas dos vírus eqüinos contemporâneos. Quatroalterações de aminoácidos diferenciam as seqüências de aminoácidos deconsenso das HAs maduras eqüinas e caninas: N83S, W222L, I328T, eN483T (ver a Tabela 2). Os vírus caninos têm uma remoção de aminoácidoquando comparados às seqüências de Consenso Eqüinos. Portanto, aposição de aminoácido 7 na seqüência da HA eqüina é a posição 6 naseqüência da HA canina, a posição de aminoácido 29 na seqüência da HAeqüina é a posição 28 na seqüência da HA canina, a posição de aminoácido83 na seqüência da HA eqüina é a posição 82 na seqüência da HA canina,etc. Assim, os quatro aminoácidos substituídos estão na posição 82, 221,327, e 482 da seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 eSEQ ID NO: 34. A substituição de asparagina por serina na posição 83 daseqüência de consenso é uma alteração de significado funcional desco-nhecido, visto que diversos resíduos polares são encontrados nas moléculasde H3 a partir de outras espécies. A isoleucina estritamente conservada naposição 328 da seqüência de consenso, próxima ao sítio de clivagem da HAH3, foi substituída por treonina. A função principal da clivagem da HA porproteases hospedeiras na patogênese sugere que esta alteração mereceestudo adicional. A substituição de triptofano por leucina na posição 222 daseqüência de consenso é bem notável, porque ela representa uma alteraçãonão conservativa adjacente à bolsa de ligação de ácido siálico, que poderiamodular a função do receptor (Weis e outros, 1988). De modo interessante,a leucina na posição 222 não é única para a HA H3 canina, visto que ela étipicamente encontrada nos subtipos de HA H4, H8, H9, e H12 (Nobusawa eoutros, 1991; Kovacova e outros, 2002). A substituição da leucina pode sermais compatível com a especificidade do vírus por hospedeiros mamíferos,visto que foram descritas infecções do porco com os vírus do subtipo H4(Karasin e outros, 2002) e de seres humanos e do porco com os do subtipoH9 (Peiris e outros, 1999). A substituição de asparagina por treonina naposição 483 da seqüência de consenso resultou na perda de um sítio deglicosilação na subunidade HA2 que é conservada em todos os subtipos deHA (Wagner e outros, 2002). Embora a importância dessas alterações deaminoácidos na HA para a adaptação de um vírus eqüino aos cãespermaneça a ser determinada, foram observadas anteriormente alteraçõesde aminoácidos similares em associação à transferência entre espécies(Vines e outros, 1998; Matrosovich e outros, 2000). As diferenças de amino-ácidos entre outras proteínas virais de influenza da invenção e a seqüênciade Consenso Eqüino são mostradas nas Tabelas 19 a 25.
A fonte do vírus influenza eqüino que inicialmente infectou osgalgos de corrida permanece especulativa. Os canis nas pistas de corrida degalgos não estão localizados próximos a cavalos ou pistas de corrida decavalos, sugerindo que o contato entre os galgos e os cavalos quedisseminam não é uma explicação suficiente para os múltiplos surtos, emdiferentes estados, em 2004. Uma fonte potencial de exposição ao víruseqüino é a alimentação de carne de cavalo aos galgos, cuja dieta ésuplementada com carne crua fornecida por casas de embalagem queconvertem- em carcaças, incluindo os cavalos que poderiam carregar ainfluenza. Os precedentes para este modo de infecção incluem os relatóriosde transmissão entre espécies do vírus influenza aviário H5N1 para porcos efelinos de zoológicos, alimentados com carcaças de galinhas infectadas(Webster, 1998; Keawcharoen e outros, 2004; Kuiken e outros, 2004).Embora essa seja uma rota plausível para a introdução inicial de influenzaeqüino em cães, ela não explica os recentes surtos múltiplos de influenzaem milhares de cães, em diferentes estados. O presente estudo de inocu-lação experimental demonstrou a presença de vírus nas passagens nasais ena orofaringe de cães, embora em títulos modestos. Contudo, esses resul-tados indicam que a disseminação é possível, e que a transmissão do vírusde cão para cão por grandes aerossóis em gotículas, fomitos, ou contatomucoso direto poderia desempenhar uma função na epizootiologia dadoença.
A transferência entre espécies de um vírus influenza mamíferointegral para uma espécie mamífera não relacionada é um evento raro. Osestudos anteriores proporcionaram evidência sorológica ou virológicalimitada, porém não ambas, de infecção transiente de cães com os vírusinfluenza A humanos (H3N2) (Nikitin e outros, 1972, Kilbourne, e outros,1975; Chang e outros, 1976; Houser e outros, 1980). Entretanto, não havianenhuma evidência de circulação continuada no hospedeiro canino. Emboraa transferência direta dos vírus influenza suínos de porcos para pessoasesteja bem documentada (Dacso e outros, 1984; Kimura e outros, 1998;
Patriarca e outros, 1984; Top e outros, 1977), não há nenhuma evidênciaquanto à adaptação dos vírus suínos em hospedeiros humanos. Nesterelatório, foi proporcionada evidência virológica, sorológica, e molecular paraa transmissão entre espécies de um vírus influenza A eqüino (H3N8) inteiropara uma outra espécie mamífera, o cão. As substituições únicas deaminoácidos na HA de vírus canino, acopladas à confirmação sorológica deinfecção de cães em múltiplos estados nos U.S., sugerem a adaptação dovírus ao hospedeiro canino. Visto que os cães são os animais de companhiaprincipais para os seres humanos, essas descobertas têm implicações paraa saúde pública; os cães podem proporcionar uma nova fonte para atransmissão de novos vírus influenza A para os seres humanos.
Tabela 1. Resposta do anticorpo aoA/Canino/Florida/43/04 (H3N*).
<table>table see original document page 58</column></row><table>
a Número de cães com sinais clínicos da doença.
b Número de cães assintomáticos alojados em contato com cães clinicamentedoentes.c Ensaio de inibição da hemaglutinação (Hl) usando o vírus A/Canino/Florida/43/04.
d Ensaio de microneutralização (MN) usando o vírus A/Canino/Florida/43/04.
e Porcentagem de cães com pelo menos um aumento de 4 vezes no título deanticorpo em soros agudos e convalescentes em pares.
f Porcentagem de cães com um título de anticorpo positivo (título de Hl >32: títulode MN >80) nos soros convalescentes.
g Título de anticorpo médio geométrico para os soros convalescentes.
Tabela 2. Diferenças de aminoácidos entre as hemaglutininas H3 caninas e eqüinas. <table>table see original document page 59</column></row><table>
* Resíduo de aminoácido (código de letra única) e posição na HA H3 madura. Ocódigo do aminoácido é: A = alanina, D = ácido aspártico, G = glicina, I = isoleucina,
K = lisina, L = leucina, M = metionina, N = asparagina, R = arginina, S = serina, T =treonina, V = valina, W = triptofano.
f Significa nenhuma alteração das HAs H3 eqüinas de consenso.Tabela 3. Inibição da hemaglutinação de um isolado de vírus por anti-soros de referência para diferentes subtipos de HA <table>table see original document page 60</column></row><table>
a Título de inibição da hemaglutinação para isolado de vírus do cão n2 43.b Os anti-soros policlonais foram produzidos em furões, enquanto que todosos outros anti-soros foram produzidos em ovelhas ou cabras.
Tabela 4. Homologia de seqüência dos genes de A/Canino/Florida/43/04 (H3N8) com cepas eqüinas, avíárias, suínas, e humanas de influenza A. <table>table see original document page 60</column></row><table>Continuação
Tabela 4. Homologia de seqüência dos genes de A/Canino/Florida/43/04 (H3N8) com cepas eqüinas, aviárias, suínas, e humanas de influenza A.
<table>table see original document page 61</column></row><table>
a Porcentagem de identidade de seqüências de nucleotídeos e aminoácidos(em parênteses) dos genes de A/Canino/Florida/43/04 (H3N8) com o genemais homólogo de isolados de vírus influenza a partir de espécies, seguidapelos seus números de acesso de banco de dados de seqüência doGenbank.
b Não aplicável: a neuraminidase N8 nunca foi descrita em vírus humanos ousuínos.
Tabela 5. Títulos de anticorpos para A/canino/Florida/43/03 (H3N8) em soro degalgo coletado de 1996 até 2003._
<table>table see original document page 61</column></row><table>
a O ano da coleta da amostra de soro de galgos de corrida na Flórida.b Títulos de anticorpos do ensaio de microneutralização para cãessoropositivos, incluindo a faixa para os seis cães soropositivos de 2003.Tabela 6. Resposta do anticorpo ao A/canino/Florida/43/04 (H3N8) em galgos de corrida em 4 pistas de corrida da Flórida em junho de 2004. <table>table see original document page 62</column></row><table>
a Número de cães clinicamente doentes testados por Hl usandoA/canino/Florida/43/04 (H3N8).
b Porcentagem de cães com um aumento > 4 vezes no título de anticorpoentre soros agudos e convalescentes.
c Porcentagem de cães com um título de anticorpo positivo (título de Hl > 16)nos soros convalescentes.
d Título de anticorpo médio geométrico para os soros convalescentes.MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 7-11
Tecidos caninos
Os exames pós-morte foram efetuados pelo Anatomic PathologyService ("Serviço de Patologia Anatômica") na University of Florida Collegeof Veterinary Medicine em 6 cães de raça mista que morreram em abril/maiode 2005, durante um surto de influenza em uma instalação de abrigo nonordeste da Flórida, e em um cão de estimação Yorkshire Terrier quemorreu em maio de 2005, durante um surto de influenza em uma clínicaveterinária no sudeste da Flórida. Os tecidos foram fixados em 10% deformalina tamponada neutra, incrustada em parafina, e as secções de 5 fimforam tingidas com hematoxilina e eosina para a diagnose histopatológica.
Os tecidos não fixados foram armazenados a -80°C, aguardando análisesvirológicas.
Extração do RNA de amostras de tecidos caninos
Os tecidos dos pulmões congelados de cada um dos 7 cãesforam descongelados e homogeneizados em meio essencial mínimo (MEM)suplementado com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos(gentamicina e ciprofloxacina), usando um moedor de tecido descartável(Kendall, Lifeline Medicai Inc., Danbury, CT). O RNA total foi extraído usandoum kit comercial (Mini Kit RNeasy®, QIAGEN Inc., Valencia, CA), de acordocom as instruções do fabricante, e eluído em um volume final de 60 \iL detampão. O RNA total foi também extraído do tecido do pulmão coletado decães sem doença respiratória.
RT-PCR em tempo real
Uma RT-PCR em tempo real quantitativa, de uma única etapa,foi efetuada sobre o RNA total extraído das amostras de tecidos caninos,usando o Kit de RT-PCR de Sonda QuantiTect® contendo ROX como umcorante de referência passivo (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Resumidamente,2 grupos de iniciador-sonda foram usados para a detecção das seqüênciasde influenza A em cada amostra (Tabela 7). Um grupo de iniciador-sondaera seletivo para as seqüências de genes de hemaglutinina (H3) caninas. Ooutro grupo de iniciador-sonda visou uma região altamente conservada dogene de matriz (M) do vírus influenza do tipo A. Para cada reação de RT-PCR em tempo real, 5 (iL de RNA total extraído eram adicionados a umamistura de reação contendo 12,5 [d. de 2X Mistura Master de RT-PCR deSonda QuantiTech®, 0,25 |liL de Mistura de RT QuantiTech®, iniciadoresforward e reversos (reverse) (concentração final de 0,4 \M para cada um),sonda (concentração final de 0,1 nM) e água sem RNase em um volumefinal de 25 |iL. Os Reagentes de Controle de RNA Ribossômico TaqMan®(Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usados de acordo com asinstruções do fabricante para a detecção de rRNA 18S como um controleinterno endógeno quanto à presença de RNA extraído das amostras detecidos caninos.
A RT-PCR em tempo real quantitativa, de uma etapa, foi efetuadasobre as misturas de reação em um Sistema de QPCR Mx3000P® (Stratagene,La Jolla, CA). As condições de ciclização incluíram uma etapa de transcriçãoreversa a 50°C por 30 minutos, uma etapa de desnaturação inicial a 95°C por15 minutos para ativar a DNA polimerase HotStarTaq®, e a amplificação por 40ciclos. Cada ciclo de amplificação incluiu a desnaturação a 94°C por 15segundos, seguida por recozimento/extensão a 60°C por 1 minuto. Os sinaisfluorescentes FAM (comprimento de ondas de emissão de 518 nm) e VIC(comprimento de ondas de emissão de 554 nm) foram registrados no final decada ciclo. O ciclo limiar (Ct) foi determinado ajustando a fluorescencia limiar(dR) em 1000 em cada experimento individual. O programa de softwareMx3000P® versão 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA) foi usado para a aquisição dedados e análise. As amostras foram consideradas positivas para o vírusinfluenza A quando o ciclo limiar (Ct) para o gene de H3 ou M era 3 unidadesmenores do que o Ct para os tecidos do pulmão de cães sem doençarespiratória. O controle positivo consistia em amplificação de RNA extraído dovírus A/canino/FL/242/03 (H3N8).
Isolamento do vírus em células MDCK
Os tecidos dos pulmões congelados de cada um dos 7 cãesforam descongelados e homogeneizados em 10 volumes de Meio EagleModificado da Dulbecco (DMEM), suplementado com 0,5% de BSA eantibióticos (gentamicina e ciprofloxacina). Os fragmentos sólidos foramremovidos por centrifugação e os sobrenadantes foram inoculados sobrecélulas de rins caninas de Madin-Darby (MDCK), cultivadas em DMEMsuplementado com 1 |o,g/ml_ de tripsina tratada com TPCK (Sigma-AIdrichCorp., St. Louis, MO) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina). As célulasforam desenvolvidas em frascos de 25 cm2, a 37°C, em uma atmosferaumidificada contendo 5% de CO2. As culturas foram observadas diariamentequanto a alterações morfológicas e coletadas em 5 dias após a inoculação.As culturas coletadas foram clarificadas por centrifugação e os sobrena-dantes inoculados sobre células MDCK novas, conforme descrito para ainoculação inicial; duas passagens adicionais foram efetuadas para asamostras que não mostraram evidência de vírus influenza por hema-glutinação ou RT-PCR. A atividade de hemaglutinação nos sobrenadantesclarificados foi determinada usando 0,5% de células sangüíneas vermelhasde peru, como anteriormente descrito (Burleson, F. e outros, 1992; Kendal, P.e outros, 1982). A RT-PCR foi efetuada conforme descrito abaixo.Isolamento do vírus em ovos de galinhas embrionados
Os homogeneizados foram preparados a partir de tecidos dospulmões congelados, conforme descrito acima para a inoculação de célulasMDCK. Os homogeneizados (0,2 ml_) foram inoculados no saco alantóico deovos de galinhas embrionados de 10 dias de idade. Após 48 horas deincubação a 35°C, os ovos foram esfriados a 4°C durante a noite, antes decoletar o fluido alantoico. A atividade de hemaglutinaçao nos sobrenadantesclarificados foi determinada usando 0,5% de células sangüíneas vermelhas deperu, conforme anteriormente descrito (Burleson, F. e outros, 1992; Kendal, P.e outros, 1982). A RT-PCR foi efetuada conforme descrito abaixo. Foramefetuadas duas passagens adicionais nos ovos embrionados para asamostras que não mostraram evidência de vírus influenza após a inoculaçãoinicial.
RT-PCR, seqüenciamento de nucleotídeos, e análises filoqenéticas
O RNA viral foi extraído do sobrenadante de MDCK ou do fluidoalantoico usando o Mini Kit de RNA Viral QIAmp® (QIAGEN Inc., Valencia,CA), de acordo com as instruções do fabricante. O RNA viral foi transcritoinvertido para cDNA usando o Kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (QIAGENInc., Valencia, CA), de acordo com as instruções do fabricante. A amplifi-cação por PCR da região de codificação dos 8 genes virais influenza nocDNA foi efetuada conforme anteriormente descrito (Klimov. A. e outros,1992b), usando grupos de iniciadores específicos para genes universais(seqüências de iniciadores disponíveis mediante solicitação). Os ampliconsde DNA resultantes foram usados como moldes para o seqüenciamentoautomatizado no seqüenciador de DNA automatizado ABI PRISM® 3100,usando a química de terminador de corante de seqüenciamento de ciclo(Applied Biosystems, Foster City, CA). As seqüências de nucleotídeos foramanalisadas usando o Lasergene 6 Package® (DNASTAR, Inc., Madison, Wl).
O programa de software PHYLIP Versão 3.5® foi usado para estimar asfilogêneses e calcular os valores de partida a partir das seqüências denucleotídeos (Felsenstein, J., 1989). As árvores filogenéticas foram compa-radas àquelas geradas por análise de união do próximo com o modelo deTamura-Nei implementado no programa MEGA® (Kumar, S. e outros, 2004)e confirmadas pelo programa PAUP® 4.0 Beta (Sinauer Associates, Inc.,Sunderland, MA).
Ensaio de Inibição da hemaglutinaçao (Hl).As amostras de soro foram incubadas com a enzima destruidorade receptor (RDE, DENKA SEIKEN Co., Ltd., Tóquio, Japão) (1 parte desoro: 3 partes de RDE), por 16 horas, a 37°C, antes da inativação térmicapor 30 minutos, a 56°C. O vírus influenza A/Canino/Jacksonville/05 (H3N8)foi desenvolvido em células MDCK por 72 h, a 37°C, em 5% de C02. Ossobrenadantes da cultura de vírus foram coletados, clarificados porcentrifugação, e armazenados a -80°C. Todos os outros vírus usados noensaio de Hl foram desenvolvidos em ovos de galinhas embrionados de 10dias de idade, a partir dos quais o fluido alantóico foi coletado e armazenadoa -80°C. O ensaio de Hl foi efetuado conforme descrito anteriormente(Kendal, P. e outros, 1982). Resumidamente, 4 unidades de hemaglutinaçãodo vírus em 25 uJ foram adicionadas a um volume igual de soro diluído emsérie, em placas plásticas de 96 cavidades, e incubadas na temperaturaambiente por 30 minutos. Um volume igual de 0,5% de eritrócitos de peru foiadicionado e os títulos de hemaglutinação foram estimados visualmenteapós 30 minutos. O título de Hl de ponto final foi definido como a últimadiluição de soro que inibiu completamente a hemaglutinação.
EXEMPLO 7 - CASOS CLÍNICOS
Em abril e maio de 2005, ocorreu um surto de doençarespiratória anteriormente descrita (Crawford, P.C. e outros, 2005) em cãesalojados em uma instalação de abrigo no nordeste da Flórida. O surtoenvolveu pelo menos 58 cães variando na idade de 3 meses a 9 anos, eincluiu cães de raça pura, bem como raças mistas. Os sinais clínicos maiscomuns foram secreções nasais purulentas e uma tosse por 7 a 21 dias. Dos43 cães que tiveram doença clínica por >7 dias, 41 tiveram títulos deanticorpos de Hl para canino/FL/04 (H3N8) variando de 32 a >1024. Pelomenos 10 cães progrediram para pneumonia, dos quais 6 sofrerameutanásia. Estes 6 cães de raça mista incluíam 3 machos e 3 fêmeasvariando na idade de 4 meses a 3 anos. A duração dos sinais clínicos varioude 2 a 10 dias na hora da eutanásia. No exame pós-morte, estes cãestiveram congestão pulmonar e edema. O exame histológico do trato respira-tório revelou rinite, traqueíte, bronquite, bronquiolite, e broncopneumoniasupurativa. Havia necrose e erosão das células epiteliais na traquéia,brônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais. Os tecidos respiratóriosforam infiltrados por neutrófilos e macrófagos.
Em maio de 2005, um surto de doença respiratória ocorreu em40 cães de estimação em uma clínica veterinária no sudeste da Flórida. Ossinais clínicos mais comuns foram secreções nasais purulentas e uma tossepor 10 a 30 dias. Dos 40 cães, 17 eram soropositivos para canino/FL/04(H3N8), com títulos de anticorpos de Hl variando de 32 a >1024. Asoroconversão ocorreu em 10 cães, para os quais os soros agudos econvalescentes em pares estavam disponíveis. Três cães progrediram parapneumonia. Um desses cães, um Yorkshire Terrier macho de 9 anos deidade, morreu 3 dias depois do início dos sinais clínicos. Esse cão tevetraqueobronquite, edema e congestão pulmonar, e broncopneumonia grave.Similar aos 6 cães do abrigo, houve necrose e erosão das células epiteliaisdas vias aéreas e infiltrados de neutrófilos nos tecidos.
EXEMPLO 8 - RT-PCR EM TEMPO REAL E ISOLAMENTO VIRAL
Os tecidos dos pulmões dos 7 cães foram analisados porensaios de RT-PCR em tempo real, quantitativa, que detectam o gene de Mde influenza tipo A e o gene de H3 do vírus influenza A canino H3N8. Ospulmões de todos os 7 cães eram positivos tanto para o gene de M deinfluenza A quanto o gene de H3 de influenza canino (Tabela 8). Após 3passagens em células MDCK, o vírus influenza A subtipo H3N8 foi isoladodos pulmões de um cão do abrigo que morreu após 3 dias de pneumonia.
Este vírus foi chamado A/canino/Jacksonville/05 (H3N8) (canino/Jax/05).
Após 2 passagens em ovos de galinhas embrionados, o vírus influenza Asubtipo H3N8 foi recuperado dos pulmões do cão de estimação que tambémmorreu após 3 dias de pneumonia. Este vírus foi chamado A/canino/Miami/05 (H3N8) (canino/Miami/05).
EXEMPLO 9 - ANÁLISES GENÉTICAS DOS ISOLADOS DE INFLUENZA AH3N8 CANINOS
As análises de seqüências de canino/Jax/05 e canino/Miami/05revelaram que os seus genes de hemaglutinina (HA) eram 98% idênticosaos isolados de canino/FL/04, canino/TX/04, e canino/lowa/05, recuperadosdos pulmões de galgos de corrida que morreram de pneumonia durante ossurtos de influenza, nas pistas de corrida, em 2004 e 2005 (Crawford, P.C. eoutros, 2005; Yoon K-Y. e outros, 2005). Além disso, os genes de HA decanino/Jax/05 e canino/Miami/05 eram 98% idênticos aos vírus influenzaeqüinos contemporâneos, isolados após o ano de 2000. As comparaçõesfilogenéticas dos genes de HA mostraram que os vírus canino/Jax/05 ecanino/Miami/05 foram agrupados com os isolados de galgos canino/FL/04,canino/TX/04, e canino/lowa/05 e os isolados eqüinos contemporâneos,formando um grupo distinto a partir dos vírus eqüinos mais antigos, isoladosnos anos 90 (figura 4). Ademais, os isolados canino/Jax/05, canino/Miami/05,e canino/lowa/05 eram mais intimamente relacionados ao canino/Tx/04 doque ao canino/FL/04 ou ao canino/FL/03. Os isolados de 2005 formaram umsubgrupo que parece ramificar-se dos vírus caninos de 2003 e 2004 maisantigos, com diferenças em aproximadamente 10 sítios de parcimônia-informativos. Essas diferenças suportam a hipótese que o vírus influenzacanino está sendo transmitido horizontalmente de cão para cão, emoposição a ser reintroduzido periodicamente de uma fonte externa. Oacúmulo de mutações de 2003 a 2005 ilustra o processo permanente deadaptação que o vírus deve sofrer, após ser transmitido para um novohospedeiro, conforme é esperado ter acontecido para os vírus influenzacaninos.
EXEMPLO 10 - ANÁLISES DE AMINOÁCIDOS DOS ISOLADOS DEINFLUENZA A H3N8 CANINOS.
Houve substituições de aminoácidos conservadas em todos os 6isolados caninos que os diferenciaram dos vírus influenza eqüinoscontemporâneos (Tabela 9). Estas substituições conservadas eram I15M,N83S, W222L, I328T, e N483T. As comparações filogenéticas da proteínaHA madura mostraram que os vírus canino/Jax/05, canino/Miami/05, ecanino/lowa/05 formaram um subgrupo com o isolado canino/TX/04 (figura4). Houve 3 alterações de aminoácidos (L118V, K261N, e G479E) quediferenciaram este subgrupo dos outros vírus caninos (Tabela 9). Houve 2alterações de aminoácidos (F79L e G218E) que diferenciaram os isoladosde 2005 de sua origem canino/TX/04. Além disso, os isolados de 2005 decães que não eram galgos, canino/Jax/05 e canino/Miami/05, diferiram doisolado de galgo canino/lowa/05 por uma alteração de aminoácido, R492K.
Finalmente, o canino/Jax/05 diferenciou-se do canino/Miami/05 em um únicoaminoácido, S107P. Em todos os outros vírus H3N8 eqüinos e caninos, S éconservada na posição 107, exceto pelo A/Equine/Jilin/1/89, que tinha uma T(Guo Y. e outros, 1992).
EXEMPLO 11 - ANÁLISES ANTIGÊNICAS DOS ISOLADOS DEINFLUENZA A H3N8 CANINOS
Os testes de inibição da hemaglutinação (Hl) foram efetuadosusando um painel de antígenos de vírus influenza eqüinos mais antigos econtemporâneos e os vírus influenza caninos, e soro coletado em 2005 decavalos e cães que tinham sido infectados com o vírus influenza (Tabela 10).
O soro de furões imunizados contra canino/FL/04 foi também incluído nasanálises. Os títulos de anticorpos de Hl no soro eqüino eram 8 a 16 vezesmaiores quando testados com os vírus eqüinos contemporâneos, compa-rados aos isolados mais antigos, porém diminuíram em pelo menos 4 vezesquando testados com os vírus caninos. O soro canino era não reativo comos vírus eqüinos mais antigos, porém os títulos de anticorpos aumentaram 4vezes quando testados com os isolados eqüinos contemporâneos e osisolados caninos. Isso foi também observado para o soro dos furões imuni-zados contra o vírus influenza canino. Esses padrões de sororreatividadedemonstraram a similaridade antigênica entre os vírus influenza caninos e osvírus influenza eqüinos contemporâneos e estavam consistentes com asanálises filogenéticas. Os títulos de anticorpos nos soros eqüinos, caninos, ede furões para o isolado de canino/Miami/05 eram similares àqueles para osisolados caninos de 2003 e 2004. Entretanto, os títulos eram 2 a 4 vezesmenores para o isolado de canino/Jax/05. Isso sugere que o canino/Jax/05 éantigenicamente distinto dos outros isolados caninos, o que pode, em parte,estar relacionado à alteração única de aminoácido na posição 107 na HAmadura.Tabela 7
Iniciadores e sondas para a análise por RT-PCR em tempo real, quantitativa, para o gene de matriz de vírus influenza A e o gene de H3 de influenza A canina (H3N8) <table>table see original document page 70</column></row><table>
a A letra r sublinhada representa o nucleotídeo a ou g e a letra k sublinhada representa o nucleotídeo g ou t.b As letras maiúsculas representam os resíduos de ácidos nucléicos fixados.Tabela 8. RT-PCR durante os surtos cem tempo real, quantitativa, e isolamento viral efetuados em tecidos de pulmões de cães que morreram de pneumonia e doença respiratória em um abrigo e uma clínica veterinária na Flórida.
<table>table see original document page 71</column></row><table>Tabela 9. Comparação de aminoácidos da HA madura para os vírus influenza caninos e os vírus influenza eqüinos contemporâneos <table>table see original document page 72</column></row><table>Tabela 10. Títulos de anticorpo; influenza mais antigos e contem 3 em soro eqüino, canino, e de furão para os vírus porâneos e os vírus influenza caninos. <table>table see original document page 73</column></row><table>
a Os títulos de anticorpos foram determinados em um ensaio de inibição dahemaglutinação, efetuado com diluições em série de soro eqüino, canino, oude furão e os vírus listados na coluna de antígenos.
b Soro dos furões imunizados com vírus canino/FL/04.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 12-15
Inóculo de vírus influenza canino.
O inóculo de vírus foi preparado por inoculação das célulasepiteliais de rins caninos de Madin-Darby (MDCK) com um estoque deA/canino/FL/43/04 (H3N8) representando 3 passagens do isolado originalanteriormente descrito (Crawford e outros, 2005). As células MDCKinoculadas em Meio Essencial Mínimo da Dulbecco (DMEM), suplementadocom 1 u.g/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma-AIdrich Corp., St. Louis,MO) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina), foram desenvolvidas emfrascos de 250 cm2, a 37°C, em uma atmosfera umidificada contendo 5% deCO2. As culturas foram observadas diariamente quanto a alteraçõesmorfológicas e coletadas em 5 dias após a inoculação. As culturas coletadasforam clarificadas por centrifugação e os sobrenadantes foram armazenadosa -80°C aguardando a inoculação dos cães. Uma alíquota de sobrenadantefoi usada para a determinação do título de vírus pelo método de Reed eMuench. O título eram 107 doses infecciosas de cultura de tecido médias(TCID50) de A/canino/Florida/43/04 (canino/FL/04) por mL.Inóculo experimental.Oito cães mestiços criados em colônia, de 4 meses de idade(Marshall BioResources, North Rose, NY) (4 machos e 4 fêmeas), foramusados para o estudo de inoculação experimental aprovado pelo Universityof Florida Institutional Animal Care and Use Committee. Os pesos doscorpos dos cães variaram de 13 a 17 kg. Os cães eram saudáveis com baseem exames físicos, testes de sangue de linha de base, e registro dastemperaturas dos corpos por 2 semanas antes da inoculação. Todos os cãesestavam livres de exposição anterior ao vírus influenza canino com base emtestes de sorologia efetuados em amostras de soros em pares, coletadas nahora da chegada na instalação e 2 semanas mais tarde. Os cães foramanestesiados por injeção intravenosa de propofol (Diprivan®, ZenecaPharmaceuticals, 0,4 mg/kg de peso do corpo até o efeito) para a intubaçãocom tubos endotraqueais. Seis cães (3 machos e 3 fêmeas) foram, cada um,inoculados com 107 TCID50 de vírus canino/FL/04 em 5 ml_ de solução salinaestéril, administrada na traquéia distai através de um cateter de borracha dediâmetro pequeno inserido no tubo endotraqueal. Dois cães (1 macho e 1fêmea) foram inoculados falsamente com um volume igual de solução salinaestéril. Os cães de controle inoculados falsamente foram alojados em umaárea diferente dos cães inoculados com vírus e cuidados por uma equipediferente. Os exames físicos e os registros das temperaturas retais foramefetuados duas vezes diariamente, por 6 dias após a inoculação (p.i.).
Coleta de swab farínqeo e retal
Para monitorar a disseminação do vírus, os espécimensorofaríngeos foram coletados duas vezes, diariamente, de cada cão nos dias0 a 6 p.i., usando swabs de poliéster (Fisher Scientific International Inc.,Pittsburgh, PA). Os swabs foram colocados em 1 ml_ de solução salinatamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino(BSA). Os swabs retais foram coletados de cada cão, diariamente, a partirdos dias 0 até 6. Os extratos de swab foram preparados por clarificação domeio de transporte de swab por centrifugação. Uma alíquota de extrato deswab foi testada imediatamente quanto à nucleoproteína do vírus influenza Ausando o kit de imunoensaio comercial Directigen® (BD, Franklin Lakes, NJ),de acordo com as instruções do fabricante. O extrato restante foi armaze-nado a -80°C aguardando outros ensaios virológicos.
Exames pós-morte.
No dia 1 p.i., um cão inoculado falsamente e um cão inoculadocom vírus sofreram eutanasia por inoculaçao intravenosa de solução deBeuthanasia-D® (1 mL/5 kg de peso do corpo; Schering-Plough AnimalHealth Corp.). Um cão inoculado com vírus sofreu similarmente eutanasia acada dia a partir dos dias 2 até 5 p.i. No dia 6 p.i., o cão inoculado falsa-mente e inoculado com vírus restante sofreu eutanasia. Os exames pós-morte completos foram efetuados por um dos investigadores (WLC). Ostecidos foram fixados em 10% de formalina tamponada neutra, incrustadaem parafina, e as secções de 5 |im foram tingidas com hematoxilina eeosina para a diagnose histopatológica ou processadas para a imunoisto-química, conforme descrito abaixo. Os tecidos de pulmões não fixados foramenviados ao Diagnostic Clinicai Microbiology/Parasitology/ Serology Service("Serviço Diagnóstico de Microbiologia Clínica/Parasitologia/Sorologia") naUniversity of Florida College of Veterinary Medicine, para o isolamento e aidentificação bacterianos. As amostras foram cultivadas em meios nãoseletivos, bem como em meios seletivos para a espécie Bordetella (Regan-Lowe; Remei, Lenexa, KS) e a espécie Mycoplasma (Remei). Todas asculturas foram conservadas por 21 dias antes do relatório de nenhum cres-cimento. Os tecidos não fixados foram também armazenados a -80°C aguar-dando análises virológicas.
Imunoistoquímica.
As secções de tecidos da traquéia e do pulmão de 5 |imdesparafinizadas e reidratadas foram montadas sobre lâminas Bond-Rite®(Richard-AIlan Scientific, Kalamazoo, Ml) e subseqüentemente tratadas comproteinase K (DAKOCytomation Inc., Carpenteria, CA), seguida por reagentede bloqueio de peroxidase (Kit de Peroxidase EnVision® da DAKO®, DAKOCorp., Carpenteria, CA). As secções foram incubadas com uma diluição a1:500 de anticorpo monoclonal para influenza A H3 (Chemicon International,Inc., Ternecula, CA) por 2 horas, na temperatura ambiente. Os controlesincluíram a incubação das mesmas secções com IgG de camundongo (1mg/ml_, Serotec, Inc. Raleigh, NC), e a incubação do anticorpo monoclonalcom seções de pulmões caninos normais. Após o tratamento com oanticorpo primário, as secções foram incubadas com os reagentes desubstrato secundários de imunoperoxidase e peroxidase (Kit de PeroxidaseEnVision® da Dako®, Dako Corp.), de acordo com as instruções dofabricante. As secções foram contratingidas com hematoxilina, tratadas comReagente Clarifier n2 2 e Bluing (Richard-AIlan Scientific, Kalamazoo, Ml),desidratadas, e as lamínulas aplicadas com Permount (ProSciTech).
Extração do RNA dos swabs e dos tecidos.
Os tecidos do pulmão e traqueais de cada cão foramdescongelados e homogeneizados em meio essencial mínimo (MEM)suplementado com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos(gentamicina e ciprofloxacina), usando um moedor de tecido descartável(Kendall, Lifeline Medicai Inc., Danbury, CT). O RNA total foi extraído doshomogeneizados de tecidos, bem como dos extratos de swabs orofaríngeose retais, usando um kit comercial (Mini Kit RNeasy®, QIAGEN Inc., Valencia,CA), de acordo com as instruções do fabricante, e eluído em um volume finalde 60 |jL de tampão.
RT-PCR em tempo real
Uma RT-PCR em tempo real quantitativa, de uma única etapa,foi efetuada sobre o RNA total, usando o Kit de RT-PCR de SondaQuantiTect® contendo ROX como um corante de referência passivo(QIAGEN Inc., Valencia, CA) e um grupo de iniciador-sonda que alvejavauma região altamente conservada do gene de matriz (M) do vírus influenzado tipo A (Payungporn S. e outros, 2006a; Payungporn S. e outros, 2006b).
Para cada reação de RT-PCR em tempo real, 5 de RNA total extraídoeram adicionados a uma mistura de reação contendo 12,5 \iL de 2X MisturaMaster de RT-PCR de Sonda QuantiTech®, 0,25 fil_ de Mistura de RTQuantiTech®, iniciadores forward e reverse (concentração final de 0,4 \iMpara cada um), sonda (concentração final de 0,1 fiM) e água sem RNase emum volume final de 25 uL. Os Reagentes de Controle de GAPDH TaqMan®(Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usados de acordo com asinstruções do fabricante, para a detecção de GAPDH como um controleinterno endógeno quanto à presença de RNA extraído das amostras deswabs e de tecidos e como um controle de normalização.
A RT-PCR em tempo real quantitativa, de uma etapa, foiefetuada sobre as misturas de reação em um Sistema de QPCR Mx3000P®(Stratagene, La Jolla, CA). As condições de ciclização incluíram uma etapade transcrição reversa a 50°C por 30 minutos, uma etapa de desnaturaçãoinicial a 95°C por 15 minutos para ativar a DNA polimerase HotStarTaq®, e aamplificaçao por 40 ciclos. Cada ciclo de amplificaçao incluiu a desnaturaçãoa 94°C por 15 segundos, seguida por recozimento/extensão a 60°C por 1minuto. Os sinais fluorescentes FAM (comprimento de ondas de emissão de518 nm) e VIC (comprimento de ondas de emissão de 554 nm) foramregistrados no final de cada ciclo. O ciclo limiar (Ct) foi determinadoajustando a fluorescência limiar (dR) em 1000 em cada experimentoindividual. O programa de software Mx3000P® versão 2.0 (Stratagene, LaJolla, CA) foi usado para a aquisição de dados e análise. O controle positivoconsistia em amplificaçao de RNA extraído do vírus A/canino/FL/242/03(H3N8). Os resultados foram normalizados dividindo o valor de Ct de M pelovalor de Ct de GAPDH correspondente para cada amostra.
Isolamento novamente do vírus a partir dos tecidos
Os tecidos dos pulmões e das traquéias congelados dos cãesinoculados com vírus foram descongelados e homogeneizados em 10volumes de DMEM suplementado com 0,5% de BSA e antibióticos. Ofragmento sólido foi removido por centrifugação e os sobrenadantes foraminoculados sobre células MDCK, cultivadas em DMEM suplementado com 1ug/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma-AIdrich Corp., St. Louis, MO) eantibióticos, conforme acima descrito. As células foram desenvolvidas emfrascos de 25 cm2, a 37°C, em uma atmosfera umidificada contendo 5% deC02. As culturas foram observadas diariamente quanto a alteraçõesmorfológicas e coletadas em 5 dias após a inoculação. As culturas coletadasforam clarificadas por centrifugação e os sobrenadantes inoculados sobrecélulas MDCK novas, conforme descrito para a inoculação inicial; duaspassagens adicionais foram efetuadas para as amostras que não mostraramevidência de vírus influenza por hemaglutinação ou RT-PCR. A atividade dehemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foi determinada usando0,5% de células sangüíneas vermelhas de peru, como anteriormentedescrito (Crawford e outros, 2005). A RT-PCR foi efetuada conforme descritoabaixo.
RT-PCR, seqüenciamento de nucleotídeos, e análises filogenéticas
O RNA viral foi extraído do sobrenadante de MDCK usando oMini Kit de RNA Viral QIAmp® (QIAGEN Inc., Valencia, CA), de acordo comas instruções do fabricante. O RNA viral foi transcrito invertido para cDNAusando o Kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (QIAGEN Inc., Valencia, CA),de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação por PCR daregião de codificação dos 8 genes virais influenza no cDNA foi efetuadaconforme anteriormente descrito (Crawford e col, 2005), usando grupos deiniciadores específicos para genes universais (seqüências de iniciadoresdisponíveis mediante solicitação). Os amplicons de DNA resultantes foramusados como moldes para o seqüenciamento automatizado no seqüenciadorde DNA automatizado ABI PRISM® 3100, usando a química de terminadorde corante de seqüenciamento de ciclo (Applied Biosystems, Foster City,CA). As seqüências de nucleotídeos foram analisadas usando o Lasergene 6Package® (DNASTAR, Inc., Madison, Wl). As seqüências de nucleotídeospara os vírus recuperados de cães infectados foram comparadas com asseqüências dos vírus no inóculo, para determinar se quaisquer alteraçõestinham ocorrido durante a replicação no trato respiratório.
EXEMPLO 12 - DOENÇA CLÍNICA
Todos os 6 cães inoculados com vírus desenvolveram uma febretransiente (temperatura retal >39°C) durante os primeiros 2 dias p.i., porémnenhum exibiu sinais respiratórios, tais como tosse ou secreção nasal,durante o período de observação de 6 dias. Os cães inoculados falsamentepermaneceram clinicamente saudáveis.
EXEMPLO 13 - DISSEMINAÇÃO DO VÍRUSA nucleoproteína de influenza A foi detectada no swaborofaríngeo coletado de um dos cães inoculados com vírus em 24 horas p.i.Os swabs orofaríngeos coletados de um cão em 72, 84, e 120 horas p.i., ede um outro cão em 108, 120, e 132 horas p.i., eram positivos para vírus porRT-PCR em tempo real, quantitativa (Tabela 11). O número absoluto decópias de genes de M de influenza por fiL de extrato de swab aumentou como tempo de 3 a 6 dias p.i. Nenhum vírus foi detectado nos swabs retais.
EXEMPLO 14 - EXAMES PÓS-MQRTE
Em contraste com a infecção experimental anterior usandoBeagles sem patógenos específicos (Crawford e col, 2005), os cães mesti-ços inoculados com vírus tiveram pneumonia, como evidenciada poranálises gerais e histopatológicas dos pulmões a partir dos dias 1 até 6 p.i.
Além de pneumonia, os cães tiveram rinite, traqueíte, bronquite, e bronquio-lite similar àquela descrita em cães naturalmente infectados (Crawford eoutros, 2005). Houve necrose epitelial e erosão do revestimento das viasaéreas e das glândulas bronquiais, com infiltração por neutrófilos emacrófagos dos tecidos submucosos (figura 5, painéis superiores). Aimunoistoquímica detectou antígeno de H3 viral nas células epiteliais dosbrônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais (figura 5, painéis inferiores).
Nenhuma superinfecção bacteriana estava presente. Os tecidos respiratóriosdos 2 cães inoculados falsamente estavam normais.
EXEMPLO 15 - REPLICACÂO DE VÍRUS NA TRAQUÉIA E NOS PULMÕES
A traquéia e os pulmões eram positivos para o vírus por RT-PCRem tempo: real, quantitativa, em todos os cães de 1 até 6 dias p.i. (Tabela12). O número absoluto de cópias de gene de M de influenza por jllL dehomogeneizado de traquéia aumentou de 1 até 5 dias p.i., então diminuiu nodia 6. O número absoluto de cópias de gene de M por \lL de homogeneizadode pulmão diminuiu de 1 até 6 dias p.i. Em geral, a traquéia continha > umlogio mais vírus do que o pulmão em cada um dos 6 dias p.i.Tabela 11. Detecção da disseminação do vírus na orofaringe de cães mestiçosinoculados com o vírus influenza canino, por RT-PCR em tempo real, quantitativa.
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a Tempo que os swabs orofaríngeos foram coletados dos cães apósinoculação com o vírus A/canino/FL/43/04 (H3N8).
b As razões de normalização foram calculadas dividindo a M (Ct) peloGAPDH (Ct) para cada extrato de swab.
c O número absoluto de cópias de gene de matriz por uL de extrato de swab.
Tabela 12. Detecção da replicação do vírus na traquéia e no pulmão de cães mestiços inoculados com o vírus influenza canino, por RT-PCR em tempo real, quantitativa.
<table>table see original document page 80</column></row><table>
a Tempo que os tecidos foram coletados dos cães após inoculação com ovírus A/canino/FL/43/04 (H3N8).
b As razões de normalização foram calculadas dividindo a M (Ct) peloGAPDH (Ct) para cada homogeneizado de tecido.
c O número absoluto de cópias de gene de matriz por uL de homogeneizadode tecido.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA O EXEMPLO 16
Cepas de vírus
As cepas de vírus influenza caninos, bem como aquelas deorigem aviaria, eqüina e humana (listadas na Tabela 15) foram propagadasem ovos embrionados ou células MDCK e a sua capacidade de infectar foititulada por diluição de ponto final em embriões de galinhas, ou ensaio deplaca. A rápida quantificação do vírus foi efetuada por ensaio dehemaglutinação usando os eritrócitos de células sangüíneas vermelhas deperus.
Espécimens diagnosticas
Um total de 60 tecidos de pulmões caninos, coletados de casossuspeitos de doença respiratória viral durante o ano de 2005, foi testadoquanto à presença de vírus influenza canino.
Extração de RNA a partir de amostras de tecidos caninos
Os blocos de tecido de pulmão pesando entre 20 e 30 mg foramhomogeneizados em um moedor de tecido descartável (Kendal). O RNAtotal foi extraído usando um kit comercial (Mini Kit RNeasy, Qiagen, Valencia,CA) e eluído em um volume final de 60 |j.L, seguindo as recomendações dofabricante.
Projeto dos iniciadores e das sondas
Os alinhamentos de seqüências múltiplas dos genes de H3 e Ma partir de diversos subtipos e a partir de diversas espécies foram efetuadosusando o programa CLUSTAL X (Versão 1.8). Os iniciadores e a sonda dematriz (M) foram selecionados a partir das regiões conservadas de acimadas seqüências conhecidas correspondendo aos diferentes subtipos de vírusinfluenza A, enquanto que o grupo de iniciadores e sonda específico para ogene de hemaglutinina H3 foi selecionado para corresponder-se especifi-camente aos genes dos vírus influenza A eqüinos e caninos e unir-seinadequadamente aos genes aviários e humanos homólogos (Tabela 13). Osoftware de projeto do iniciador (OLIGOS Versão 9.1) e as ferramentas deanálise baseadas na web ("rede de alcance mundial") proporcionadas porEXIQON (http://lnatools.com) foram usados para o cálculo de Tm e aprevisão da estrutura secundária, bem como da auto-hibridação. Uma regiãoconservada de um gene de rRNA 18S foi usada como controle internoendógeno quanto à presença de RNA extraído de amostra de tecido canino.
Os Reagentes de Ensaio Pré-Desenvolvidos TaqMan® para o rRNA 18SEucariótico (VIC/TAMRA) (Applied Biosystems) foram usados para adetecção em tempo real de rRNA 18S nas amostras de tecido.Condição da RT-PCR em tempo real
Uma RT-PCR em tempo real, de uma única etapa, foi efetuadausando o Kit de RT-PCR de Sonda Quantitect contendo ROX como umcorante de referência passivo (Qiagen, Valencia, CA). Em cada reação deRT-PCR em tempo real, 5 ju.L de amostra de RNA foram usados como ummolde para combinar com uma mistura de reação contendo 10 [iL de 2XMistura Master de RT-PCR de Sonda QuantiTech, 0,2 jliL de Mistura de RTQuantiTech, iniciadores (cone. final de 0,4 \M para o gene de H3 ou cone.final de 0,6 u.M para o gene de M), sonda (cone. final de 0,1 |iM para o genede H3 ou cone. final de 0,2 jiM para o gene de M) e água sem RNase em umvolume final de 20 (iL. A RT-PCR em tempo real, de uma etapa, foi efetuadano Sistema de QPCR em Tempo Real Mx3005P (Stratagene). As condiçõesde ciclização incluíram uma etapa de transcrição reversa a 50°C por 30minutos. Após uma etapa de desnaturação inicial a 95°C por 15 minutos,para ativar a DNA polimerase HotStarTaq, a amplificação foi efetuadadurante 40 ciclos, incluindo a desnaturação (94°C por 15 segundos) e orecozimento/extensão (60°C por 30 segundos). Os sinais fluorescentes FAM(comprimento de ondas de emissão de 516 nm para a detecção de H3 e M)e VIC (comprimento de ondas de emissão de 555 nm para a detecção derRNA 18S) foram obtidos uma vez por ciclo no final da etapa de extensão. Aaquisição de dados e a análise do ensaio de PCR em tempo real foramefetuadas usando o software Mx3005P versão 2.02 (Stratagene).Especificidade do grupo de iniciadores/ sonda de H3 pelo influenza canino(H3N8) e universalidade do grupo de iniciadores/sonda de M para o vírusinfluenza tipo A
Para testar a especificidade de cada grupo de iniciadores/sonda,o RNA extraído de diversos subtipos conhecidos de vírus influenza A foiusado como um molde no ensaio de RT-PCR em tempo real (Tabela 15).
Padrão de RNA para a determinação do desempenho da RT-PCR em tempo real
Os genes de vírus influenza A canino (A/canino/Florida/242/2003(H3N8)) foram usados para gerar os amplicons de PCR para H3 (nt1 -487) e M (nt 1 -276) usando iniciadores ligados com o promotor T7 (Tabela13). Então os amplicons de PCR purificados dos genes de H3 e M foramusados como moldes para a transcrição in vitro usando o Sistema deTranscrição in vitro Riboprobe-T7 (Promega), seguindo as recomendaçõesdo fabricante. A concentração dos RNAs transcritos foi calculada medindo aabsorbância a 260 nm. Os RNAs foram então diluídos em série 10 vezes,variando de 108 a 10 cópias/ \iL, para efetuar os testes de sensibilidade.Além disso, uma curva padrão foi gerada representando em gráfico o log dasconcentrações iniciais de molde de RNA (cópias/ uL) contra o ciclo limiar(Ct) obtido a partir de cada diluição, para determinar o desempenho globalda RT-PCR em tempo real.
Testes comparativos de sensibilidade entre a RT-PCR em tempo real e o kitde teste Directigen Flu A
Os vírus de estoque de duas cepas virais que incluemA/Wyoming/3/2003 (H3N2) a 106'67 EID50/mL (HA = 64) e A/canino/Florida/242/2003(H3N8) a 107'17 EID50/mL (HA = 16) foram usados para o ensaiolimiar de detecção. A diluição logarítmica dos espécimens em solução salinatamponada com fosfato (PBS) (125 |liL) foi usada em um kit de detecção deantígeno de influenza A rápida, Directigen Flu A, (Becton, Dickinson eCompany), seguindo as instruções do fabricante. Cada dispositivo de testede Directigen Flu A tem um ponto de antígeno de influenza H1N1 no centroda membrana que se revela como um ponto roxo e indica a integridade doteste, o qual é baseado em um anticorpo monoclonal para a nucleoproteína(NP). O desenvolvimento de um triângulo roxo circundando o ponto éindicativo da presença de NP de influenza no espécime testado. Aintensidade do sinal roxo a partir do triângulo foi classificada como +(contorno do triângulo), ++ (triângulo ligeiramente colorido), +++ (triânguloroxo-escuro) e ++++ (triângulo roxo muito escuro). O RNA viral foi extraídode alíquotas de 125 de cada diluição de vírus usando o MiniKit de RNAViral QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) e eluindo em um volume final de 50 \xL.Um volume de 5 uL dos RNAs virais extraídos foi testado por RT-PCR emtempo real para o teste comparativo de sensibilidade com o kit Directigen Flu A.EXEMPLO 16
O ensaio de RT-PCR em tempo real para influenza canino vale-se da informação de três sondas moleculares que alvejam o rRNA 18S dacélula hospedeira, bem como M e H3 do genoma do vírus influenza A(Tabela 14). A amplificação do gene hospedeiro é um repórter da qualidadee da integridade do espécime. As amostras clínicas, de necropsia ou delaboratório contendo o vírus influenza canino (H3N8) são esperadasproduzirem sinal de amplificação com as três sondas. Os espécimens queproduzem sinal de amplificação com as sondas de M e rRNA 18S, porémnegativos para H3, seriam indicativos de um vírus influenza subtipo H3 deorigem humana, suína ou aviaria ou de subtipos que não de H3. Essescasos raros poderiam ser resolvidos por RT-PCR usando iniciadores de HAuniversais para gerar cDNA de amplicon que pode ser analisado porseqüenciamento. Os espécimens adequadamente coletados e manuseadosque não têm o vírus influenza A produzem sinal de amplificação de rRNA18S somente. As situações nas quais somente a sonda de rRNA 18S e assondas de H3 produzem sinal de amplificação são indicativas de técnicafalha, a não ser que de outro modo provado; um falso negativo com assondas de M ou falso positivo para H3 necessitam ser demonstrados.
Finalmente, os espécimens que não conseguem produzir sinais deamplificação com as três sondas são indicativos de coleta defeituosa deamostra, degradação, extração de RNA falha ou da presença de inibidoresdas polimerases usadas nas PCR.
Para testar a especificidade do grupo de iniciadores/sonda deH3 pelo vírus influenza A canino (H3N8) e a universalidade do grupo deiniciadores/sonda de M para o influenza tipo A, diversos subtipos de vírusinfluenza A foram testados por RT-PCR em tempo real. Os resultadosmostram que o grupo de iniciadores/sonda de H3 produziu um sinal deamplificação positivo somente com o influenza canino (H3N8). Nenhum falsopositivo significativo ou sinal de amplificação não específico foi observadonos outros subtipos ou cepas de H3 humanas. O grupo de iniciadores/sondade M produziu sinal de amplificação positivo com todas as cepas testadas(Tabela 15). Esses resultados indicaram que os iniciadores/sonda de H3especificamente detectam o vírus influenza A canino (H3N), enquanto queos iniciadores/sonda de M detectam múltiplos subtipos de vírus influenza tipo A.
O desempenho dos ensaios de RT-PCR em tempo real foiavaliado por diluição de ponto final dos RNAs transcritos in vitro de M e H3.Conforme esperado, o ciclo limiar (Ct) aumentou em correlação direta com adiluição dos padrões de RNA. Os sinais fluorescentes podem ser detectadosnas diluições de padrões de RNA de M e H3 como tão baixos quanto 103 e102 cópias/|LiL, respectivamente (figuras 6A e 6B). As curvas padrão dosgenes de M e H3 foram construídas representando graficamente o log dasconcentrações de RNA de partida contra o ciclo limiar (Ct) obtido de cadadiluição (figuras 6C e 6D). A inclinação da curva padrão é usada paradeterminar a eficiência da reação PCR, que é teoricamente exponencial;100% de eficiência de amplificação significariam a duplicação daconcentração de amplicon de cada ciclo. As curvas padrões com umainclinação entre aproximadamente -3,1 e -3,6 são tipicamente aceitáveispara a maioria das aplicações que requerem quantificação precisa (90-110%de eficiência de reação). Um valor de Rsq é a adequação de todos os dadosao gráfico da curva padrão. Se todos os dados situarem-se perfeitamentesobre a linha, o Rsq será 1,00. À medida que os dados incidem além dalinha, o Rsq diminui. Um valor de Rsq > 0,985 é aceitável para a maior partedos ensaios. A curva padrão de M revelou uma inclinação de -3,576(eficiência-= 90,4 %) e Rsq = 1,00, enquanto que a curva padrão de H3produziu uma inclinação de -3,423 (eficiência = 95,9%) e Rsq = 0,999).Esses valores indicam uma eficiência de amplificação e um desempenhoglobal satisfatórios dos ensaios de RT-PCR em tempo real. Atribui-se aeficiência e a sensibilidade menores do grupo de iniciadores/sonda de M, emcomparação com o grupo de iniciadores/sonda de H3, à degeneração de Nvezes das seqüências de iniciadores de M requerida para assegurar a amplacobertura da variabilidade das seqüências do gene de M através dos vírusde múltiplos subtipos, hospedeiros e linhagens.A sensibilidade do ensaio de RT-PCR em tempo real foi tambémcomparada com o ensaio comercial de detecção rápida de antígeno(Directigen Flu A). As diluições logarítmicas de AA/Vyoming/3/2003 (H3N2) eA/canino/Florida/242/2003(H3N8) foram analisadas com o Directigen Flu A epor RT-PCR em tempo real. Os resultados do Directigen Flu A mostraramque as sensibilidades contra ambas as cepas virais são aproximadamente100 vezes a diluição a partir dos vírus de estoque usados nesses experi-mentos (figura 7). Os sinais (cor roxa) gerados pelas amostras de víruscanino (A/canino/Florida/242/2003: 106x PFU/ml) eram muito mais fracos doque aqueles verificados no vírus humano (A/Wyoming/3/2003: 107x PFU/ml),em concordância com a menor concentração de vírus nessas amostras.Alternativamente, o sinal menor para o influenza canino poderia ser atribuídoà especificidade molecular dos anticorpos monoclonais contra a NP; isto é, aconservação insatisfatória dos aminoácidos dentro do epítopo de NP dosvírus influenza A caninos.
A RT-PCR em tempo real do gene de M produziu valores de Ctacima do limiar, com equivalentes de 10 e 30 PFL) de vírus por reação deA/canino/Florida/242/2003 e AAAtyoming/3/2003, respectivamente (Tabela16). As diferenças entre o valor de sensibilidade de 2 cepas virais por causadas diferenças nos títulos virais originais. A comparação da detecção dogene de H3 entre os vírus influenza caninos e humanos não foi efetuadaporque os iniciadores/sonda de H3 em nosso ensaio de RT-PCR em temporeal amplificam exclusivamente o vírus influenza A canino. A RT-PCR era105 vezes mais sensível do que o kit de detecção rápida de antígeno.
Para avaliar o desempenho do teste de RT-PCR nos espé-cimens de necrópsia a partir de cães com doença respiratória aguda,sessenta amostras de tecidos de pulmões caninos apresentadas durante oano de 2005 foram testadas quanto à presença de vírus influenza A caninopor RT-PCR em tempo real. Um total de 12 das 60 amostras (20%) erapositivo com os genes tanto de M quanto de H3, enquanto que as 48amostras restantes produziram resultado negativo tanto para o gene de Mquanto de H3. As tentativas de isolamento do vírus foram conduzidas porinoculação em ovo e célula MDCK, para avaliar a especificidade do ensaioem tempo real; 2 das 12 amostras que eram positivas para influenza caninopor RT-PCR produziram vírus influenza canino (dados não mostrados,manuscrito em preparação). Embora todos os tecidos fossem coletados decães com uma história de doença respiratória grave, a maioria das amostrasnão produziu nenhum vírus influenza canino por PCR em tempo real ouisolamento convencional, sugerindo uma alta incidência de outros patógenosrespiratórios, tais como Bordetella bronchiseptica, vírus da cinomose ouparainfluenza. O ensaio de RT-PCR em tempo real, de uma única etapa,aqui contido, proporciona uma abordagem rápida, sensível e de custo efetivopara a detecção do vírus influenza A canino (H3N8). O diagnóstico rápido delaboratório das infecções pelo vírus influenza A canino (H3N8) no estágioinicial da doença pode produzir informação relevante para o controle clínicodo paciente e das instalações.Tabela 13: Iniciadores e sondas usados para a detecção por RT-PCR e a transcrição in vitro <table>table see original document page 88</column></row><table> * = Observação: Letras maiúsculas = resíduos de LNA (Ácido Nucléico Travado), r = a ou g, k = g ou t, grifo = seqüência de promotor T6)Tabela 14. Interpretação do ensaio de RT-PCR em tempo real <table>table see original document page 89</column></row><table> Tabela 15. Teste de especificidade do grupo de iniciadores/sonda de H3 e teste deuniversalidade do grupo de iniciadores/sonda de M com diversos subtipos de vírusinfluenza A
<table>table see original document page 89</column></row><table>
* Observar que os subtipos das amostras clínicas foram confirmados porseqüenciamento de nucleotídeos.
Tabela 16. Testes comparativos de sensibilidade para a detecção do vírus influenza A entre a RT-PCR em tempo real e o Directigen Flu A <table>table see original document page 89</column></row><table>Tabela 17. <table>table see original document page 90</column></row><table>
Tabela 18. <table>table see original document page 90</column></row><table>
Tabela 19. Diferenças de aminoácidos entre as proteínas PB2 dos vírus influenza eqüinos e caninos H3N8 <table>table see original document page 90</column></row><table>
Tabela 20. Diferen eqüinos e caninos Hças de aminoácidos entre as proteínas PB1 dos vírus influenza 3N8 <table>table see original document page 90</column></row><table>Tabela 21. Diferen eqüinos e caninos H ças de aminoácidos entre as proteínas PA dos vírus influenza 3N8 <table>table see original document page 91</column></row><table>
* Com base nos genes disponíveis dos vírus isolados entre 1963 e 1998.
Tabela 22. Diferen eqüinos e caninos Hças de aminoácidos entre as proteínas NP dos vírus influenza 3N8
<table>table see original document page 91</column></row><table> Tabela 23. Diferen eqüinos e caninos Hças de aminoácidos entre as proteínas NA dos vírus influenza 3N8 <table>table see original document page 91</column></row><table>Tabela 24. Diferen eqüinos e caninos H ças de aminoácidos entre as proteínas M1 dos vírus influenza 3N8
<table>table see original document page 92</column></row><table>
* Com base nos genes disponíveis dos vírus isolados entre 1963 e 1998.
Tabela 25. Diferen eqüinos e caninos H ças de aminoácidos entre as proteínas NS1 dos vírus influenza 3N8
<table>table see original document page 92</column></row><table>
* Com base nos genes disponíveis dos vírus isolados entre 1963 e 1998.
Deve ser entendido que os exemplos e as modalidades descritosnesse documento são para propósitos ilustrativos somente e que diversasmodificações ou alterações levando-se em consideração isso serãosugeridas para as pessoas versadas na técnica e são para serem incluídasno espírito e no escopo deste pedido.
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<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1) .. (2277)
<400> atg gag Met Glu 1 1 aga Arg ata lie gaa Glu 5 gaa Glu ctg aga gat Leu Arg Asp ctg Leu 10 atg Met tta Leu caa Gln tcc Ser cgc Arg 15 acc Thr 48
cgc Arg gag Glu ata lie cta Leu 20 aca Thr aaa Lys act Thr act Thr gtg Vai 25 gac Asp cac His atg Met gcc Ala ata lie 30 ate lie aag Lys 96
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acg Thr aac Asn gat Asp gct Ala ggc Gly 85 tca Ser gac cgc Asp Arg gta Vai atg Met 90 gta Vai tca Ser cct Pro ctg Leu gca Ala 95 gtg Vai 288aca tgg tgg aat agg aat gga cca aca acg age aca att cat tat cca 33bThr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr lie His Tyr Pro100 105 110
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act ttt ggc cec gtt cat ttt agg aat caa gtc aag ata aga cga aga 432Thr Phe Gly Pro Vai His Phe Arg Asn Gln Vai Lys lie Arg Arg Arg130 135 140
gtt gat gta aac cet ggt cac gcg gac etc agt gcc aaa gaa gea caa 4 80
Vai Asp Vai Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln145 150 155 160
gat gtg ate atg gaa gtt gtt ttc cca aat gaa gtg gga gcc ata att 528Asp Vai lie Met Glu Vai Vai Phe Pro Asn Glu Vai Gly Ala lie lie165 170 175
cta aca tcg gaa tca caa-cta aca ata acc aaa gag aaa aag gaa gaa 57 6
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr lie Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu180 185 190
ctt cag gac tgc aaa att gct cec ttg atg gta gea tac atg cta gaa 624Leu Gln Asp Cys Lys lie Ala Pro Leu Met Vai Ala Tyr Met Leu Glu195 200 205
aga gag ttg gtc cga aaa aca agg ttc etc cca gta gea ggc gga aca 672Arg Glu Leu Vai Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Vai Ala Gly Gly Thr210 215 220
age agt gta tac att gaa gtg ttg cat ctg act cag gga aca tgc tgg 720Ser Ser Vai Tyr lie Glu Vai Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp225 230 235 240
gag caa atg tac acc cca gga gga gaa gtt aga aac gat gat att gat 7 68
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Vai Arg Asn Asp Asp lie Asp245 250 255
caa agt tta att att gea gcc cgg aac ata gtg aga aga gcg aca gta 816Gln Ser Leu lie lie Ala Ala Arg Asn lie Vai Arg Arg Ala Thr Vai260 265 270
tca gea gat cca cta gea tec cta ctg gaa atg tgc cac agt aca cag 864Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln275 280 285
att ggt gga ata agg atg gta gac ate ctt aag cag aat cca aca gag 912lie Gly Gly lie Arg Met Vai Asp lie Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu290 295 300
gaa caa gct gtg gat ata tgc aaa gea gea atg gga ttg aga att age 960Glu Gln Ala Vai Asp lie Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg lie Ser305 310 315 320tca tca ttc age ttt ggt gga ttc acc ttc aaa aga aca agt gga tca 1008Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser325 330 335
tca gtc aag aga gaa gaa gaa atg ctt acg ggc aac ctt caa aca ttg 1056Ser Vai Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu340 345 350
aaa ata aga gtg cat gag ggc tat gaa gaa ttc aca atg gtc gga aga 1104Lys lie Arg Vai His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Vai Gly Arg355 360 365
aga gea aca gcc att ate aaa aag gea acc aga aga ttg att caa ttg 1152Arg Ala Thr Ala lie lie Lys Lys Ala Thr Arg Arg Leu lie Gln Leu370 375 " 3S0
ata gta agt ggg aga gat gaa caa tca att gct gaa gea ata att gta 1200lie Vai Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser lie Ala Glu Ala lie lie Vai385 390 395 400
gcc atg gtg ttt tcg caa gaa gat tgc atg ata aaa gea gtt cga ggc 1248Ala Met Vai Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met lie Lys Ala Vai Arg Gly405 410 415
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caa etc ttg agg cat ttc caa aaa gat gea aaa gtg ctt ttc cac aat 1344Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Vai Leu Phe His Asn435 440 445
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cet gac atg acc cca age acc gag atg tca ttg aga gga gtg aga gtc 14 40
Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Vai Arg Vai465 470 475 480
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ctg tec cet gaa gaa gtc agt gaa aca caa gga acg gaa aag ctg aca 1584Leu Ser Pro Glu Glu Vai Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr515 520 525
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gtg ttg gtc aat act tat caa tgg ate ate agg aac tgg gaa att gta 1680
Vai Leu Vai Asn Thr Tyr Gln Trp lie lie Arg Asn Trp Glu lie Vai545 550 555 560
aaa att cag tgg tca cag gac cec aca atg tta tac aat aag ata gaa 1728
Lys lie Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys lie Glu
565 570 575
ttt gag cca ttc caa tec ctg gtc cet agg gcc acc aga age caa tac 177 6
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Vai Pro Arg Ala Thr Arg Ser Gln Tyr
580 585 590
age ggt ttc gta aga acc ctg ttt cag caa atg cga gat gta ctt gga 1824
Ser Gly Phe Vai Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Vai Leu Gly595 600 605
aca ttt gat act gct caa ata ata aaa etc etc cet ttt gcc gct gct 1872
Thr Phe Asp Thr Ala Gln lie lie Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala610 615 620
cet ceg gaa cag agt agg atg cag ttc tet tet ttg act gtt aat gta 1920
Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Vai Asn Vai625 630 635 640
aga ggt tcg gga atg agg ata ctt gtá aga ggc aat tec cca gtg ttc 1968
Arg Gly Ser Gly Met Arg lie Leu Vai Arg Gly Asn Ser Pro Vai Phe
645 650 655
aac tac aat aaa gcc act aaa agg etc aca gtc etc gga aag gat gea 2016
Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Vai Leu Gly Lys Asp Ala
660 665 670
ggt gcg ctt act gag gac cca gat gaa ggt acg gct gga gta gaa tet 2064
Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Vai Glu Ser675 680 685
gct gtt cta aga ggg ttt etc att tta ggt aaa gag aac aag aga tat 2112
Ala Vai Leu Arg Gly Phe Leu lie Leu Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr690 695 700
ggc cca gea cta age ate aat gaa cta age aaa ctt gea aaa ggg gag 2160
Gly Pro Ala Leu Ser lie Asn Glu Leu Ser Lys Leu Ala Lys Gly Glu705 710 715 720
aaa gcc aat gta cta att ggg caa ggg gac gta gtg ttg gta atg aaa 2208
Lys Ala Asn Vai Leu lie Gly Gln Gly Asp Vai Vai Leu Vai Met Lys
725 730 735
cgg aaa cgt gac tet age ata ctt act gac age cag aca gcg acc aaa 2256
Arg Lys Arg Asp Ser Ser lie Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys
740 745 750
agg att cgg atg gcc ate aat 2277
Arg He Arg Met Ala lie Asn755
<210> 2
<211> 759
<212> PRT
<213> Vírus Influenza<400> 2
Met Glu Arg lie Glu Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr15 10 15
Arg Glu lie Leu Thr Lys Thr Thr Vai Asp His Met Ala lie lie Lys20 25 30
Lys Tyr Thr Ser Glu Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys35 40 45
Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro lie Thr Ala Asp Lys Arg lie Met50 55 60
Glu Met lie Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys65 70 75 80
Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Vai Met Vai Ser Pro Leu Ala Vai85 90 95
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr lie His Tyr Pro100 105 110
Lys Vai Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Vai Glu Arg Leu Lys His Gly115 120 125
Thr Phe Gly Pro Vai His Phe Arg Asn Gln Vai Lys lie Arg Arg Arg130 135 140
Vai Asp Vai Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln145 150 155 160
Asp Vai lie Met Glu Vai Vai Phe Pro Asn Glu Vai Gly Ala lie lie165 170 175
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr lie Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190
Leu Gln Asp Cys Lys lie Ala Pro Leu Met Vai Ala Tyr Met Leu Glu195 200 205
Arg Glu Leu Vai Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Vai Ala Gly Gly Thr210 215 220
Ser Ser Vai Tyr lie Glu Vai Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp225 230 235 240
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Vai Arg Asn Asp Asp lie Asp245 250 255Gln Ser Leu lie lie Ala Ala Arg Asn lie Vai Arg Arg Ala Thr Vai260 265 270
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln275 280 285
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Glu Gln Ala Vai Asp lie Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg lie Ser305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser325 330 335
Ser Vai Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu340 345 350
Lys lie Arg Vai His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Vai Gly Arg355 360 365
Arg Ala Thr Ala lie lie Lys Lys Ala Thr Arg Arg Leu lie Gln Leu370 375 380
lie Vai Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser lie Ala Glu Ala lie lie Vai385 390 395 400
Ala Met Vai Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met lie Lys Ala Vai Arg Gly405 410 415
Asp Leu Asn Phe Vai Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His420 425 430
Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Vai Leu Phe His Asn435 440 445
Trp Gly lie Glu Pro lie Asp Asn Vai Met Gly Met lie Gly lie Leu450 455 460
Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Vai Arg Vai465 470 475 480
Ser Lys Met Gly Vai Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Vai Vai Vai485 490 495
Ser lie Asp Arg Phe Leu Arg Vai Arg Asp Gln Arg Gly Asn lie Leu500 505 510Leu Ser Pro Glu Glu Vai Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr515 520 525
lie lie Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu lie Asn Gly Pro Glu Ser530 535 540
Vai Leu Vai Asn Thr Tyr Gln Trp lie lie Arg Asn Trp Glu lie Vai545 550 555 560
Lys lie Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys lie Glu565 570 575
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Vai Pro Arg Ala Thr Arg Ser Gln Tyr580 585 590
Ser Gly Phe Vai Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Vai Leu Gly595 600 605
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Ala Vai Leu Arg Gly Phe Leu lie Leu Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr690 695 700
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Arg Lys Arg Asp Ser Ser lie Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys740 745 750
Arg lie Arg Met Ala lie Asn755
<210> 3<211> 2274<212> DNA<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CBS<222> (1).. (2274)
<400> 3
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<212> PRT
<213> Vírus Influenza
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<213> Vírus Influenza
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Arg lie Arg Met Ala lie Asn755
<210> 19
<211> 2274
<212> DNA
<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CBS
<222> (1).. (2274)
<400>
19atg gat gtc aat ccg act cta ctt ttc tta aag gtg cca gcg caa aat 48Met Asp Vai Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Vai Pro Ala Gln Asn15 10 15
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tet tgg ttc aac tec ttc etc aca cat gea ctg aag tag 2151Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys705 710 715<210> 52
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Ser lie Glu Glu Cys Leu lie Asn Asp Pro Trp Vai Leu Leu Asn Ala690 695 700
Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys705 710 715
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<210> 59
<211> 981
<212> DNA
<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CBS
<222> (1).. (756)
<400> 59
<210> 60
<211> 252
<212> PRT
<213> Vírus Influenza
<400>
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<210> 61<211> 1698<212> DNA
<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CBS<222> (1).. (1698)
<400> 61
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15 10 15
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<210> 62
<211> 565
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<213> Vírus Influenza
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Gly Pro Ala Leu Ser lie Asn Glu Leu Ser Lys Leu Ala Lys Gly Glu705 710 715 720
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<210> 65<211> 2274<212> DNA<213> Vírus Influenza
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<221> CBS
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Lys Thr Asn Leu Tyr Gly Phe lie "lie Lys Gly Arg Ser His Leu Arg500 505 510
Asn Asp Thr Asp Vai Vai Asn Phe Vai Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr515 520 525Asp Pro Arg Phe Glu Pro His Lys Trp Glu Lys Tyr Cys Vai Leu Glu530 535 540
lie Gly Asp Met Leu Leu Arg Thr Ala Vai Gly Gln Vai Ser Arg Pro545 550 555 560
Met Phe Leu Tyr Vai Arg Thr Asn Gly Thr Ser Lys lie Lys Met Lys565 570 575
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Glu Ser Met lie Glu Ala Glu Ser Ser Vai Lys Glu Lys Asp Met Thr595 600 605
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Ser lie Glu Glu Cys Leu lie Asn Asp Pro Trp Vai Leu Leu Asn Ala690 695 700
Ser Trp Phe Asn' Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys705 710 715
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<222> (1).. (690)
<400> 69atg gat tcc aac act gtg tca age ttt cag gta gac tgt ttt ctt tggMet Asp Ser Asn Thr Vai Ser Ser Phe Gln Vai Asp Cys Phe Leu Trp15 10 15
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<210> 70
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<212> PRT
<213> Vírus Influenza
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Asn Gly Arg Pro Ser Phe Pro Ser Lys Gln Lys Arg Lys Met Glu Arg210 215 220
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atg gcg tct caa ggc acc aaa cga tcc tat gaa cag atg gaa act gat 48Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp1 5 10 15
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<212> DNA
<213> Vírus Influenza
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<221> CBS<222> (1).. (756)
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ggc ctg gta tgc gcc aca tgt gaa cag att gct gat tec cag cat cga 480Gly Leu Vai Cys Ala Thr Cys Glu Gln lie Ala Asp Ser Gln His Arg145 150 155 160
tet cac agg cag atg gtg aca aca acc aac cca tta ate aga cat gaa 528Ser His Arg Gln Met Vai Thr Thr Thr Asn Pro Leu lie Arg His Glu165 170 175
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<210> 76
<211> 252
<212> PRT
<213> Vírus Influenza
<400> 76
Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Tyr Vai Leu Ser lie Vai Pro15 10 15
Ser Gly
Pro Leu Lys Ma Glu lie Ala Gln Arg Leu Glu Asp Vai Phe20 25 30Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr35 40 45
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Gln Asn Ala Leu Ser Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala85 90 95
Vai Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu lie Thr Phe His Gly Ala100 105 110
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Gly Leu lie Tyr Asn Arg Met Gly Thr Vai Thr Thr Glu Vai Ala Phe130 135 140
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<210> 77
<211> 1698
<212> DNA
<213> Vírus Influenza
<220><221> CBS<222> (1).. (1698)
<400> 77
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1680
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<210> 78
<211> 565
<212> PRT
<213> Vírus Influenza
<400>
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Gln Asn Pro lie Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His20 25 30
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<210> 79
<211> 20
<212> DNA
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<400> 79
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<210> 80
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<222> (18).. (18)
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<210> 84
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<212> DNA
<213> Vírus Influenza
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Claims (58)

1. Vírus influenza isolado que é capaz de infectar um animal canídeo.
2. Vírus influenza de acordo com a reivindicação 1, em que odito vírus influenza tem um sorotipo de HA de H3 ou H5.
3. Vírus influenza de acordo com a reivindicação 1, em que odito vírus influenza tem o sorotipo H3N8.
4. Vírus influenza de acordo com a reivindicação 1, em que odito vírus influenza compreende um polinucleotídeo que codifica um polipep-tídeo tendo a seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma dasSEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34,-48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seufragmento funcionai e/ou imunogênico, ou o dito polinucleotídeo codifica umpolinucleotídeo tendo identidade de seqüência de 99% ou mais com a se-qüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4,-6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56,-58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78.
5. Vírus influenza de acordo com a reivindicação 1, em que odito vírus influenza compreende um polinucleotídeo tendo a seqüência denucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,-13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou o dito polinucleotídeo tem identidade de se-qüência de 98% ou mais com a seqüência de nucleotídeos mostrada emqualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,-27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77.
6. Vírus influenza de acordo com a reivindicação 1, em que odito vírus influenza é o isolado viral designado como A/canino/Florida/43/04ou o isolado viral designado como A/canino/Florida/242/2003.
7. Vírus influenza de acordo com a reivindicação 1, em que odito vírus influenza é o isolado viral designado como canino/Jax/05 ou o iso-lado viral designado como canino/Miami/05.
8. Polinucleotídeo isolado que compreende todo ou parte de umsegmento genômico ou gene de um vírus influenza como definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 8, em que odito polinucleotídeo compreende todo ou parte de um gene de influenza se-lecionado a partir do grupo que consiste em um gene de neuraminidase, umgene de nucleoproteína, um gene de proteína de matriz, um gene de proteí-na básica de polimerase, um gene de proteína ácida de polimerase, um ge-ne de proteína não estrutural, e um gene de hemaglutinina.
10. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 8, em que odito vírus influenza compreende um polinucleotídeo que codifica um polipep-tídeo tendo a seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma dasSEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34,-48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seufragmento funcional e/ou imunogênico, ou o dito polinucleotídeo codifica umpolinucleotídeo tendo identidade de seqüência de 99% ou mais com a se-qüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4,-6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56,-58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78.
11. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 8, em que odito vírus influenza compreende um polinucleotídeo tendo a seqüência denucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,-13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou o dito polinucleotídeo tem identidade de se-qüência de 98% ou mais com a seqüência de nucleotídeos mostrada emqualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,-27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77.
12. Constructo de expressão de polinucleotídeo compreendendoum polinucleotídeo de quaisquer das reivindicações 8 a 11.
13. Oligonucleotídeo que pode hibridizar com uma seqüência decodificação ou uma de não-codificação de um polinucleotídeo como definidoem qualquer uma das reivindicações 8 a 11.
14. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, em queo dito oligonucleotídeo hibridiza com a dita seqüência sob condições de altaseveridade.
15. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, em queo dito oligonucleotídeo é 10 a 500 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeos, 21 a-30 nucleotídeos, 31 a 40 nucleotídeos, 41 a 50 nucleotídeos, 51 a 60 nucleo-tídeos, 61 a 70 nucleotídeos, 71 a 80 nucleotídeos, 81 a 90 nucleotídeos, ou-91 a 100 nucleotídeos de comprimento.
16. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, em queo dito oligonucleotídeo compreende uma marca detectável ou uma moléculade repórter.
17. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, em queo dito oligonucleotídeo tem de cerca de 90 por cento a 100 por cento de i-dentidade de seqüência de nucleotídeos com um polinucleotídeo como defi-nido na reivindicação 8.
18. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, em queo dito oligonucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos mostra-da em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,-45, 46, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, ou 88.
19. Polipeptídeo isolado codificado por um polinucleotídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11.
20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 19, em que odito polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em uma prote-ína hemaglutinina, uma proteína neuraminidase, uma nueleoproteína, umaproteína de matriz, uma proteína básica de polimerase, uma proteína ácidade polimerase, e uma proteína não estrutural.
21. Composição compreendendo um imunógeno de um vírusinfluenza como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em queo dito imunógeno é capaz de induzir uma resposta imune contra um vírusinfluenza que é capaz de infectar um animal canídeo.
22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que odito imunógeno compreende o vírus integral sem células, ou uma porçãodele; um polinucleotídeo viral; uma proteína viral; um polipeptídeo ou peptí-deo viral; uma célula infectada com vírus; um constructo à base de vetor viralrecombinante; um vírus recombinado; ou um ácido nucléico simples do ditovírus.
23. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que adita proteína, polipeptídeo, ou peptídeo viral compreende uma seqüência deaminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12,-14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62,-64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seu fragmento funcional e/ou imuno-gênico, ou o dito polinucleotídeo codifica um polinucleotídeo tendo identida-de de seqüência de 99% ou mais com a seqüência de aminoácidos mostra-da em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,-24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,-74, 76, ou 78.
24. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que odito polinucleotídeo viral codifica um polipeptídeo compreendendo uma se-qüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4,-6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56,-58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seu fragmento funcionale/ou imunogênico.
25. Método para induzir uma resposta imune em um animal con-tra um vírus influenza como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 7, o dito método compreendendo administrar ao dito animal uma quantida-de eficaz de uma composição de acordo com quaisquer das reivindicações 21, 22, 23, ou 24.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a ditacomposição compreende um proteína, polipeptídeo, ou peptídeo viral com-preendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em qualquer uma dasSEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34,-48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um seufragmento funcional e/ou imunogênico.
27. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a dita res-posta imune é uma resposta imune protetora que impede ou inibe a infecçãodo dito animal por um vírus influenza.
28. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o dito ví-rus influenza tem uma sorotipo de HA selecionado a partir de H3 e H5.
29. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o dito ví-rus influenza tem o sorotipo H3N8.
30. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a ditacomposição adicionalmente compreende um adjuvante.
31. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o dito a-nimal é um canídeo.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o dito a-nimal canídeo é um cão domesticado.
33. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a ditacomposição é administrada parenteralmente.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a ditacomposição é administrada de modo subcutâneo, intraperitoneal, ou intra-muscular.
35. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a ditacomposição é administrada de modo nasal ou oral.
36. Anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopode um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 19ou 20.
37. Anticorpo de acordocom a reivindicação 36, em que o ditoanticorpo é um anticorpo monoclonal.
38. Anticorpo de acordocom a reivindicação 36, em que o ditoanticorpo se liga a uma proteína hemaglutinina.
39. Anticorpo de acordocom a reivindicação 38, em que a ditaproteína hemaglutinina é uma proteína hemaglutinina H3 ou uma H5.
40. Anticorpo de acordocom a reivindicação 38, em que a ditaproteína hemaglutinina compreende uma seqüência de aminoácidos mostra-da em SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 62, ou SEQ ID NO: 78.
41. Célula compreendendo um vírus influenza como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou um polinucleotídeo da reivindica-ção 8.
42. Célula de acordo com a reivindicação 41, em que a dita célu-la é uma célula de animal canídeo.
43. Método para a detecção de um vírus influenza que é capazde infectar um animal canídeo, o dito método compreendendo obter umaamostra biológica de um animal e examinar a dita amostra quanto à presen-ça de um anticorpo ou um ligante que se liga a uma proteína, polipeptídeo,ou peptídeo de um vírus influenza como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 7.
44. Método para a detecção de um vírus influenza que é capazde infectar um animal canídeo, o dito método compreendendo obter umaamostra de ácido nucleico de um animal, e contatar a dita amostra de ácidonucleico com um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das rei-vindicações 13 a 18, e determinar se o dito oligonucleotídeo hibridiza sobcondições severas com o dito ácido nucleico.
45. Método para a triagem por um composto que possui ativida-de antiviral contra um vírus influenza que é capaz de infectar um animal ca-nídeo, o dito método compreendendo contatar uma célula infectada com, oucompreendendo, um vírus como definido em qualquer uma reivindicações 1a 7 com um composto de teste e determinar se o dito composto de teste ini-be a atividade do dito vírus na dita célula.
46. Vírus recombinado compreendendo pelo menos um gene,segmento genômico, ou um polinucleotídeo de um vírus influenza como de-finido na reivindicação 1.
47. Vírus isolado que compreende um ou mais polinucleotídeos,em que os ditos um ou mais polinucleotídeos codificam uma proteína de ví-rus influenza canino, selecionada a partir do grupo que consiste em HA, NA,NP, MA, PB1, PB2, PA, e NS, ou um seu fragmento funcional ou imunogênico.
48. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que os ditos umou mais polinucleotídeos compreendem uma seqüência de nucleotídeos se-lecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,-13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,-67, 69, 71, 73, 75, e 77.
49. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína HA tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 16, 32, 62, e 78.
50. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína NA tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 12, 28, 58, e 74.
51. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína NP tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 10, 26, 56, e 72.
52. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína MA tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 14, 30, 60, e 76.
53. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína PB1 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 4, 20, 50, e 66.
54. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína PB2 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 2, 18, 48, e 64.
55. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína PA tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 6, 22, 52, e 68.
56. Vírus de acordo com a reivindicação 47, em que a dita prote-ína NS tem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoque consiste nas SEQ ID NOs: 8, 24, 54, e 70.
57. Método para a detecção de um vírus influenza que é capazde infectar um animal canídeo, o dito método compreendendo obter umaamostra contendo ácido nucléico de um animal, e contatar a dita amostra deácido nucléico com um iniciador de oligonucleotídeo forward e reverse quese liga especificamente a uma seqüência de polinucleotídeo ou gene do ditovírus, sob condições suficientes para a geração de um produto de amplifica-ção, se o ácido nucléico contiver uma seqüência à qual os ditos iniciadoresse ligam; e detectar o dito produto de amplificação.
58. Método de acordo com a reivindicação 57, em que o dito ini-ciador de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo como definido em qualqueruma das reivindicações 13 a 18.
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