BRPI0610609A2 - métodos e composições para modular a adesão e toleráncia ao estresse em bactérias - Google Patents

Abstract

São fornecidos métodos e composições que melhoram a adesão de um bactéria a substratos alvo e/ou melhoram a tolerância ao estresse da bactéria. Métodos compreendem a exposição da bactéria a condições adaptáveis de adesão e dessa forma aumentam a atividade de adesão e/ou tolerância ao estresse da bactéria. Além disso, são fornecidas bactérias que têm uma produção modulada de "auto-indutor-2". Composições incluem bactérias recombinantes que expressam moléculas de ácido nucleico envolvidas na via de produção de "auto-indutor-2". Além disso, são fornecidas proteínas de fusão relacionadas a "auto-indutor-2", peptideos antigênicos, anticorpos e vetores. Métodos de rastreamento de compostos ou de condições ambientais que estimulam a produção de "auto-indutor-2" e/ou produzem uma resposta adaptável de adesão são também fornecidos, assim como vários métodos de uso para as bactérias que têm adesão aumentada e/ou tolerância ao estresse.

Description

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MODULAR A ADESÃO E TOLERÂNCIA AOESTRESSE EM BACTÉRIAS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se às bactérias,particularmente bactérias probióticas e de ácido lático, emétodos e construções para o controle da sinalizaçãocelular nas mesmas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

No intestino delgado, os lactobacilos representam umcomponente principal e importante da microflora comensal.

Várias espécies de Lactobacillus têm sido usadas comoculturas probióticas selecionadas para uso em alimentos oucomplementos dietéticos com base nos benefícios específicosexigidos do organismo e nas características dobioprocessamento desejadas pelo fabricante. Nem todas asculturas probióticas exibem as mesmas características,tornando fundamental a seleção dessas cepas e oesclarecimento de seus benefícios. Bactérias de ácidolático, e lactobacilos, especificamente, constituem umgênero comum incluído em produtos alimentícios para umaampla gama de potenciais fatores promotores de saúde.

Bactérias de ácido lático (LAB) são encontradasnaturalmente em diversos nichos ambientais onde existemcomo membros de comunidades microbianas complexas. Asobrevida em cada nicho depende da habilidade do organismopara perceber e responder às condições variáveis, tais comotemperatura, pH, disponibilidade de nutrientes e densidadecelular populacional. Um nicho importante que as LABfreqüentemente ocupam é aquele do trato gastrintestinal demamíferos (GIT). Provavelmente várias vias de transdução desinal controlam a expressão de fatores de adesão, genes deresposta ao estresse e outros determinantes genéticos quepromovem a sobrevida e a competição de LAB dentro dosvários compartimentos do GIT.

Alguns lactobacilos intestinais, juntamente combactérias patogênicas gram-positivas e gram-negativas, têma habilidade de se associar ao epitélio intestinal e suascamadas mucosas. Acredita-se que essa associação sejaimportante para a realização de certas propriedadesprobióticas, incluindo exclusão competitiva, imunomodulaçãoe a liberação de bioterapêuticos, dentre outras. Embora osmecanismos moleculares envolvidos com essa associação nãosejam compreendidos, é evidente que o processo é complexo,envolvendo fatores específicos do hospedeiro, específicosdas bactérias e ambientais.

Alguns lactobacilos intestinais, juntamente combactérias patogênicas gram-positivas e gram-negativas, têma habilidade de se associar com o epitélio intestinal esuas camadas mucosas. A habilidade de colonizar essassuperfícies pode fornecer para os probióticos uma nítidavantagem em relação à outra microflora local e patogênica.É especialmente importante o mecanismo através do qualessas bactérias sobrevivem e potencialmente colonizam oambiente cinético do trato intestinal. Foram estudadoscertos fatores ambientais que influenciam a adesão,incluindo pH, fase de crescimento e a presença de outrosmicroorganismos.

Os lactobacilos devem reter um equilíbrio entre obterseus próprios requisitos de crescimento e sobreviver àscondições hostis, incluindo choque gástrico ácido,apresentado pelas defesas do hospedeiro e pela microfloraconcorrente (Tannock (2005) Appl. Environ. Microbial. 71:8.419-8.425). No entanto, pouco se sabe sobre como essesfatores estressantes influenciam a habilidade doslactobacilos para se associarem a substratos variados noambiente intestinal.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São fornecidos métodos e composições que melhoram aadesão de uma bactéria a substratos-alvo e/ou melhoram atolerância ao estresse de uma bactéria. Os métodoscompreendem a exposição das bactérias às condiçõesadaptáveis de adesão e, dessa forma, o aumento da adesãoe/ou tolerância ao estresse das bactérias. Ainda sãofornecidas bactérias que possuem um nível modulado de auto-indutor-2 (AI-2). As composições incluem bactériasrecombinantes que expressam moléculas de ácido nucléicoenvolvidas na via de produção de auto-indutor-2. Ainda sãofornecidas proteínas de fusão relacionadas ao auto-indutor-2, peptídeos antigênicos, anticorpos e vetores. São aindafornecidos métodos para o rastreamento de compostos oucondições ambientais que estimularão a produção de auto-indutor-2 e/ou produzirão uma resposta adaptável de adesão,bem como vários métodos de uso para as bactérias quepossuem adesão e/ou tolerância ao estresse aumentadas.

A presente invenção é explicada com mais detalhes nosdesenhos aqui apresentados e na especificação apresentadaabaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 demonstra a adesão de L. acidophilus NCFM acélulas Caco-2 in vitro, como observada microscopicamente.As células bacterianas foram (a) incubadas por uma hora a37°C em condição não concentrada (1 x IO8 UFC/ml) ou (b)peletizadas e incubadas em uma condição concentrada 10 X (1x IO9 UFC/ml) (condições AAR) por 1 hora a 37°C.

A Figura 2 exibe o protocolo de adesão.

A Figura 3 demonstra, as propriedades de adesão decepas mutantes e cepa de controle NCFM::lacL às célulasCaco-2 em condições padronizadas de incubação (barrassólidas) e condições adaptáveis de adesão (barraslistradas). As contagens são expressas como aderência médiade bactérias por campo microscópico e as barras de errosrepresentam um desvio padrão da média.

A Figura 4 mostra a via para a produção de AI-2 apartir de metionina em L. acidophilus NCFM. Intermediáriosessenciais para a produção de AI-2 são representados emnegrito, e ORFs que codificam cada enzima estão listadossob o nome da enzima. A metiltransferase dependente de SAMé abreviada SAM-MT. A etapa final envolve a circularizaçãonão enzimática de 4,5-diidroxi-2,3-pentanodiona em AI-2.

A Figura 5 mostra a habilidade de adesão de uma cepamutante de L. acidophilus NCFM LuxS" às células Caco-2,comparada com a cepa de controle NCFM::2acL.

A Figura 6 mostra AI-2 produzido durante a fase decrescimento de L. acidophilus NCFM, detectado dosobrenadante estéril neutralizado (barras listradas) eexpresso como luminescência média da cepaparente/luminescência média da cepa mutante LuxS". 0crescimento de L. acidophilus NCFM, representado por OD60o(linha sólida com círculos) e a queda do pH (linhapontilhada com triângulos), coincide com a produção rápidade AI-2 durante a fase de crescimento logarítmico. Cadavalor representa a média de experimentos em triplicata e asbarras de erro são um desvio padrão da média.

A Figura 7 demonstra as propriedades de adesão da cepade controle e cepas mutantes selecionadas de L. acidophilusNCFM, com e sem exposição às condições adaptáveis deadesão.

A Figura 8 apresenta a classificação COG de ORFstotais superexpressos na cepa do tipo selvagem (Painel A)ou mutante LuxS" (Painel B) . Os grupos COG (Painel C) sãolistados nos gráficos de setores com o número de ORFssuperexpressos naquele grupo (COG, # de ORFs).

A Figura 9 mostra o número de ORFs cuja expressãoaumentou (sem listras) ou diminuiu (listras) a partir (A)da fase log inicial a médio ou (B) da fase log médio atardio. O tipo selvagem é representado por barras brancas ea cepa mutante LuxS" representada por barras cinzas.

A Figura 10 demonstra tolerância à bile de L.acidophilus NCFM (sem listras) e da cepa mutante LuxS"(listras) colhidas na fase log inicial (OD60o 0,2), logmédio (OD600 0, 7) e log tardio (ODSOo 1,2) de crescimento.Populações bacterianas foram diluídas e plaqueadas em MRSsuplementado com Oxgall 0,75% (barras brancas), 1,0%(barras cinza) ou 2,0% (barras pretas). O percentual desobrevida foi calculado por comparação com UFC/ml crescidoem MRS não suplementado. Diferenças significativasdetectadas pelo teste t de Student (P < 0,05) sãorepresentadas por um asterisco (*) . As barras de errorepresentam um desvio padrão da média.

A Figura 11 demonstra a sobrevida de populações dotipo selvagem (círculos abertos) e LuxS" (círculosfechados) após estresse por calor a 55°C, quando colhidasna fase log inicial de crescimento (Painel A), OD6oo 0,2,log médio (Painel B) , ODeoo 0,7, ou log tardio (Painel C) ,OD6oo 1,2. Um asterisco (*) indica que uma diferençaestatisticamente significativa (P < 0,05) foi detectadapara aquele ponto do tempo. As barras de erro representamum desvio padrão da média.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As presentes invenções serão descritas com maisdetalhes daqui por diante com referência aos desenhos queas acompanham, nos quais algumas modalidades das invenções,mas nem todas, são mostradas. Na verdade, essas invençõespodem ser expressas de várias formas diferentes e não devemser consideradas como limitadas às modalidades aquiapresentadas; em vez disso, essas modalidades sãofornecidas de tal forma que essa especificação satisfaça asexigências legais aplicáveis. Números semelhantes referem-se a elementos semelhantes por toda a especificação.

Muitas modificações e outras modalidades das invençõesaqui apresentadas ocorrerão para aqueles habilitados natécnica à qual essas invenções pertencem, beneficiando-sedos ensinamentos apresentado das descrições precedentes edos desenhos a elas associados. Portanto, deve-se entenderque as invenções não se limitam às modalidades específicasapresentadas, e que modificações e outras modalidades visama estar incluídas dentro do escopo das reivindicações emanexo. Embora sejam empregados nesta especificação termosespecíficos, eles são usados somente em um sentido genéricoe descritivo, e não com a finalidade de limitá-la.Como aqui usados, "um/uma" e "o/a" podem ser no pluralou singular, como usados ao longo de toda a especificação enas reivindicações. Por exemplo, "uma" célula podesignificar uma única célula ou uma multiplicidade decélulas.

Também como aqui usado, "e/ou" refere-se e englobaqualquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dositens associados listados, bem como a ausência decombinações, quando interpretado na alternativa ("ou").

I. Visão geral

São fornecidos métodos e composições da invenção quemelhoram a adesão de uma bactéria a substratos-alvo e/oumelhoram a tolerância ao estresse de uma bactéria. A adesãoaumentada de um organismo comensal, por exemplo, umprobiótico, às células do trato gastrintestinal ou do tratourogenital encontra utilidade na redução do risco deinfecção do intestino, do trato urogenital e de locais deferidas. Da mesma forma, a melhora da tolerância aoestresse de um organismo probiótico como, por exemplo, ataxa de sobrevida do probiótico é aumentada no ambientehostil do trato intestinal, irá auxiliar ainda mais naredução do risco de infecção do intestino, do tratourogenital e de locais de feridas.

Em uma modalidade, a presente invenção identificou"condições adaptáveis de adesão". Como aqui usado, o termo"condições adaptáveis de adesão" compreende qualquercondição física, química, biológica ou similar que melhoraa adesão de bactérias a um substrato. A presente invençãodemonstrou que o pré-condicionamento de células bacterianasa essas condições adaptáveis de adesão resulta em umaumento da adesão e/ou a um aumento da tolerância aoestresse. Como aqui usadas, as propriedades de adesãoaprimoradas das bactérias são denominadas "respostaadaptável de adesão" ou "AAR". Polipeptídeos epolinucleotídeos cujos níveis e/ou atividade são moduladossob condições adaptáveis de adesão são aqui citados como"relacionados à resposta adaptável de adesão" oupolipeptídeos ou polinucleotídeos "relacionados à AAR" .Vários polinucleotídeo e polipeptídeos relacionados à AARsão aqui revelados. Veja as Tabelas 8 e 9 abaixo.Polinucleotídeos relacionados a AAR adicionais, e seuspolipeptídeos codificados, são apresentados no Id. de Seq.N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37 e 38.

São ainda fornecidos métodos e composições que modulama via de auto-indutor-2 de uma bactéria e, portanto,modulam a adesão e/ou a tolerância ao estresse da bactéria.Mais especificamente, são fornecidos polinucleotídeos epolipeptídeos da via de produção de auto-indutor-2 (AI-2)em bactérias. Células bacterianas freqüentemente secomunicam por meio de mecanismos de sensoriamentopopulacional (guorun? sensing) , que envolvem oreconhecimento dependente da densidade de um auto-indutor,seguido por alterações na expressão gênica. Um sistema desensoriamento populacional importante que pode ser usadopara a comunicação em uma mesma espécie e entre espécies sebaseia em um diéster de borato furanosil denominado auto-indutor-2 (AI-2), produzido em quatro etapas enzimáticas apartir de metionina. AI-2 regula a expressão de váriosfenótipos, incluindo fatores de virulência, processamentode DNA, morfologia celular, tnotilidade, formação debiopelícula, produção de toxina, produção de luz e divisãocelular em numerosas espécies (Xavier e cols. (2003) Curr.Opin. Microbiol. 6: 191-197). Conseqüentemente, sãofornecidos métodos e composições que permitem a modulaçãodo nível e/ou da atividade dos polipeptídeos na via AI-2 e,portanto, é fornecida a habilidade para modular váriosfenótipos bacterianos. O polinucleotídeo e as seqüênciaspolipeptídicas da via AI-2 são apresentados no Id. de Seq.N° : 1, 2, 3, 4, 13, 14, 15, 16, 21 ou 22. Essas seqüênciassão aqui denominadas "seqüências relacionadas ao AI-2".

II. Polipeptídeos e Polinucleotídeos relacionados ao AI-2 erelacionados à AAR

São fornecidas composições que empregam os váriospolinucleotídeos e polipeptídeos relacionados à AAR erelacionados ao AI-2 da invenção. A invenção ainda fornecefragmentos e variantes dessas seqüências relacionadas aoAI-2 ou relacionadas à AAR, que também podem ser usadospara a prática dos métodos da presente invenção. Como aquiusado, os termos "gene" e "gene recombinante" referem-se àsmoléculas de ácido nucléico que compreendem um quadroaberto de leitura (ORF), particularmente aqueles quecodificam proteínas envolvidas na produção de AI-2 ou naAAR. Moléculas de ácido nucléico isolado da presenteinvenção compreendem seqüências de ácidos nucléicos quecodificam proteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadas àAAR apresentada nos Ids. de Seq. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 34, 36 ou 38, as seqüências de ácidosnucléicos apresentadas nos Ids. de Seq. Nos: 1, 3, 5, 7, 9,11, 13, 15, 17, 19, 21, 33, 35 ou 37, e variantes efragmentos destas. A presente invenção também englobamoléculas de ácido nucléico anti-senso, como descritasabaixo.

Polipeptídeos e proteínas isoladas envolvidos naprodução de AI-2 ou na AAR, e variantes e fragmentosdestes, são englobados, bem como métodos para a produçãodaqueles polipeptídeos. Para as finalidades da presenteinvenção, os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usadosde forma intercambiável. Polipeptídeos relacionados ao AI-2exemplares incluem os Ids. de Seq. Nos: 2, 4, 14, 16, 22.Polipeptídeos relacionados ã AAR exemplares incluem o Id.de Seq. N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 34, 36e 38.

A "produção de AI-2" ou a "resposta adaptável deadesão (AAR)" refere-se a uma atividade biológica oufuncional, como determinada in vivo ou ín vitro de acordocom técnicas padronizadas de ensaio. Por exemplo, aprodução de AI-2 pode ser medida utilizando-se uma ceparepórter Vibrio harveyi e um bioensaio de auto-indutor (DeKeersmaecker e cols. (2003) Microbiology 149: 1.953-6).Ensaios adicionais envolvem, por exemplo, a medida dasobrevida ou do crescimento bacteriano sob as condiçõesadaptáveis de adesão aqui descritas em outra seção.

As bactérias e os métodos da invenção são úteis parafermentações bacterianas, por exemplo, quando se desejarestimular a produção de AI-2, ou promover a adesão ouformação de biopelícula das bactérias em um substrato paraa realização do processo fermentativo.

As bactérias da invenção são úteis como bactériasprobióticas, por exemplo, quando se desejar estimular aprodução de AI-2, ou promover a adesão ou formação debiopelícula das bactérias no intestino ou na paredeintestinal para dele excluir competitivamente outrasbactérias menos desejadas.

Métodos de indução de sinalização celular ou umaresposta adaptável de adesão em bactérias são úteis naestimulação da produção de AI-2, ou na promoção da adesãoou formação de biopelícula de bactérias, incluindobactérias tanto recombinantes quanto não recombinantes dotipo selvagem, para estimular a produção de AI-2, ou parapromover a adesão ou formação de biopelícula por bactériasprobióticas.

As composições de ácido nucléico e polipeptídeoenglobadas pela presente invenção são isoladas ousubstancialmente purificadas. O termo "isolado" ou"substancialmente purificado" significa que as moléculas deácido nucléico ou polipeptídeo, ou fragmentos ou variantesbiologicamente ativos, são substancial ou essencialmentelivres de componentes normalmente encontrados em associaçãocom a molécula de ácido nucléico ou proteína em seu estadonatural. Tais componentes incluem outro material celular,meios de cultura da produção recombinante, e váriassubstâncias químicas usadas na síntese química dasproteínas ou dos ácidos nucléicos. De preferência, um ácidonucléico "isolado" da presente invenção é livre deseqüências de ácidos nucléicos que flanqueiam o ácidonucléico de interesse no DNA genômico do organismo do qualo ácido nucléico foi derivado (tais como as seqüências decodificação presentes nas extremidades 5' ou 3'). Noentanto, a molécula pode incluir algumas bases ou porçõesadicionais que não afetam negativamente as característicasbásicas da composição. Por exemplo, em várias modalidades,a molécula de ácido nucléico isolado contém menos de 5 kb,4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüência deácidos nucléicos normalmente associados ao DNA genômico nascélulas das quais foi derivada. Da mesma forma, umaproteína substancialmente purificada tem menos de cerca de30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) de proteínacontaminante, ou proteína não relacionada ao AI-2 ou nãorelacionada à AAR. Quando a proteína é produzida de formarecombinante, preferivelmente o meio de cultura representamenos de 30%, 20%, 10% ou 5% do volume da preparação deproteína, e quando a proteína é produzida quimicamente,preferivelmente as preparações têm menos de cerca de 3 0%,20%, 10% ou 5% (por peso seco) de precursores químicos, ousubstâncias químicas não relacionadas à produção de AI-2 ouàs condições adaptáveis de adesão,

i. Fragmentos e variantes

A invenção fornece moléculas de ácido nucléico isoladoque compreendem seqüências de nucleotídeos que codificamproteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR, alémdas proteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AARpor elas codificadas. Também são fornecidos fragmentos evariantes dessas seqüências de nucleotídeos e proteínascodificadas. "Fragmento" de uma seqüência de nucleotídeosou proteína significa uma porção da seqüência denucleotídeos ou de aminoácidos.

Fragmentos das moléculas de ácido nucléico aquirevelados podem ser usados como sondas de hibridização paraidentificar ácidos nucléicos que codificam a proteínarelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR, ou podem serusados como iniciadores em amplificação por PCR ou mutaçãode moléculas de ácido nucléico relacionadas ao AI-2 ourelacionadas à AAR. Fragmentos de ácidos nucléicos tambémpodem ser ligados a um substrato físico para compreenderemo que pode ser considerado um macro- ou microarranjo (porexemplo, Patente U.S. N° 5.837.832; Patente U.S. N°5.861.242). Tais arranjos de ácidos nucléicos podem serusados para estudar a expressão gênica ou para identificarmoléculas de ácido nucléico com identidade suficiente paraas seqüências-alvos.

A presente invenção ainda fornece um arranjo ou chipde ácidos nucléicos, ou seja, vários ácidos nucléicos (porexemplo, DNA) como sondas moleculares organizadas ouarranjadas precisamente em um suporte sólido, que permite oseqüenciamento de genes, o estudo de mutações nelescontidas e/ou a análise da expressão de genes, uma vez queesses arranjos e chips são atualmente de interesse emfunção de seu tamanho muito pequeno e de sua altacapacidade em termos de número de análises.

A função desses arranjos/chips de ácidos nucléicos sebaseia em sondas moleculares, principalmenteoligonucleotídeos, que são anexadas e um veículo que possuium tamanho geralmente de poucos centímetros quadrados oumais, como desejado. Para uma análise, o veículo, porexemplo, um arranjo/chip de DNA, é coberto com sondas deDNA (por exemplo, oligonucleotídeos) que são arranjadas emuma localização ou posição predeterminada no veículo. Umaamostra contendo um ácido nucléico-alvo e/ou fragmentosdeste a serem analisados, por exemplo, DNA ou RNA ou cDNA,que foi marcada previamente, é colocada em contato com oarranjo/chip de DNA, levando à formação, através dehibridização, de um duplex. Apôs uma etapa de lavagem, aanálise da superfície do chip permite que quaisquerhibridizações sejam localizadas por meio dos sinaisemitidos pelo alvo marcado. Como resultado, forma-se uma"impressão digital" da hibridização, a qual, porprocessamento computacional, permite a obtenção deinformações como a expressão de genes, a presença defragmentos específicos na amostra, a determinação deseqüências e/ou a identificação de mutações.

Em uma modalidade desta invenção, a hibridização entreácidos nucléicos-alvo e ácidos nucléicos da invenção,usados na forma de sondas e depositados ou sintetizados insi tu em um chip/arranjo de DNA, pode ser determinada pormeio de fluorescência, radioatividade, detecção eletrônica,ou semelhantes, como são conhecidos na técnica.

Em outra modalidade, as seqüências de nucleotídeos dainvenção podem ser usadas na forma de um arranjo/chip deDNA para a realização de análises da expressão de genesenvolvidos na produção de AI-2 ou na AAR. Essa análise sebaseia no arranjo/chips de DNA nos quais sondas, escolhidaspor sua especificidade para caracterizar certo gene ouseqüência de nucleotídeos, estão presentes. As seqüências-alvos a serem analisadas são marcadas antes de seremhibridizadas sobre o chip. Após lavagem, os complexosmarcados são detectados e quantificados, com ashibridizações sendo realizadas pelo menos em duplicata.

Análises comparativas das intensidades dos sinais obtidoscom relação à mesma sonda para amostras diferentes e/oupara sondas diferentes com a mesma amostra, permitem, porexemplo, uma transcrição diferencial de RNA derivado daamostra.

Ainda em outra modalidade, os arranjos/chips contendoseqüências de nucleotídeos da invenção podem compreenderseqüências de nucleotídeos específicas para outrosmicroorganismos, o que permite o teste serial e a rápidaidentificação da presença de um microorganismo em umaamostra.

Em uma modalidade adicional, o princípio doarranjo/chip de DNA também pode ser usado para produzirarranjos/chips de proteína sobre os quais o suporte foicoberto com um polipeptídeo e/ou um anticorpo destainvenção, ou arranjos destes, no lugar do ácido nucléico.

Esses arranjos/chips de proteína tornam possível, porexemplo, analisar as interações biomoleculares induzidaspela afinidade de captura de alvos sobre um suportecoberto, por exemplo, com proteínas, por ressonância deplasma de superfície (SPR). Os polipeptídeos ou anticorposdesta invenção, capazes de se ligarem especificamente aosanticorpos ou polipeptídeos derivados da amostra a seranalisada, podem ser usados em arranjos/chips de proteínapara a detecção e/ou identificação de proteínas e/oupeptídeos em uma amostra.

Dessa forma, a presente invenção fornece ummicroarranjo ou microchip que compreende vários ácidosnucléicos desta invenção em qualquer combinação, incluindorepetições, além de um microarranjo que compreende váriospolipeptídeos desta invenção em qualquer combinação,incluindo repetições. Também é fornecido um microarranjoque compreende um ou mais anticorpos que reagemespecificamente com vários polipeptídeos desta invenção, emqualquer combinação, incluindo repetições.

O termo "molécula de ácido nucléico" significamoléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) emoléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ouRNA gerado com a utilização de análogos de nucleotídeos. Amolécula de ácido nucléico pode ser de fita simples ou defita dupla, mas preferivelmente é DNA de fita dupla. Umfragmento de uma molécula de ácido nucléico que codificauma proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR podecodificar um fragmento de proteína que é biologicamenteativo, ou ele pode ser usado como uma sonda de hibridizaçãoou iniciador de PCR como descrito abaixo. Um fragmentobiologicamente ativo de um polipeptídeo aqui revelado podeser preparado isolando-se uma porção de uma das seqüênciasde nucleotídeos da invenção, expressando-se a porçãocodificada da proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR (por exemplo, por expressão recombinante in vitro), eavaliando-se a atividade da porção codificada da proteínarelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR. Fragmentos demoléculas de ácido nucléico que codificam proteínasrelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR compreendem pelomenos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600nucleotídeos ou até o número total de nucleotídeospresentes em uma seqüência de comprimento total relacionadaao AI-2 ou relacionada à AAR de nucleotídeos, como aquirevelada (por exemplo, 693 para o Id. de Seq. N° : 1, 942para o Id. de Seq. N°: 3, 1.116 para o Id. de Seq. N°: 13,471 para o Id. de Seq. N° : 15 etc).

Fragmentos de seqüências de aminoácidos incluemfragmentos polipeptídicos adequados para uso comoimunógenos para o desenvolvimento de anticorpos contrapolipeptídeos envolvidos na produção de AI-2 ou na AAR.Fragmentos incluem peptídeos que compreendem seqüências deaminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas daseqüência de aminoácidos de uma proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR, ou proteína de comprimento parcial,da invenção, e que exibem pelo menos uma atividade de umaproteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR, mas queincluem menos aminoácidos do que as proteínas relacionadasao AI-2 ou relacionadas à AAR de comprimento total aquireveladas. Em uma modalidade, os fragmentos podem incluirpolipeptídeos que sejam biologicamente ativos. Uma porçãobiologicamente ativa de um polipeptídeo é aquela que exibepelo menos uma atividade (por exemplo, uma atividadeassociada à produção de AI-2 ou à AAR) da proteína decomprimento total da invenção. Uma porção biologicamenteativa de uma proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR pode ser um polipeptídeo que tenha comprimento de, porexemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidospresentes em uma proteína de comprimento total relacionadaao AI-2 ou relacionada à AAR da presente invenção (porexemplo, 231 para o Id. de Seq. N° : 2, 314 para o Id. deSeq. N° : 4, 372 para o Id. de Seq. N° : 14, 157 para o Id.de Seq. N°: 16 etc). Essas porções biologicamente ativaspodem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadasquanto a uma ou mais das atividades funcionais de umaproteína nativa relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR.Como aqui usado, um fragmento compreende pelo menos 5aminoácidos contíguos dos Ids. de Seq. pares Nos: 2-22, 36,ou 38. No entanto, a invenção engloba outros fragmentos,por exemplo, qualquer fragmento na proteína acima de 6, 7,8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 ou acima de 500aminoácidos.

Seqüências da invenção relacionadas à AAR compreendemos Ids. de Seq. N°s: 19 e 20 que codificam uma proteína deligação de fibronectina; Ids. de Seq. NoS: 33, 34, 35 e 36que codificam proteínas envolvidas na produção deexopolissacarídeos; e Ids. de Seq. N°s: 3 7 e 3 8 quecodificam uma proteína envolvida na esterificação de D-alanina de ácido lipoteicóico e ácido teicóico da parede.Em modalidades específicas, uma variante ou um fragmentobiologicamente ativo do Id. de Seq. N°: 19 ou 20 continuaráa ter atividade de ligação à mucosa intestinal, incluindoligação à fibronectina, mucina ou moléculas da matrizextracelular. São conhecidos métodos para testar essaatividade. Por exemplo, a atividade de ligação àfibronectina da variante pode ser testada com o uso demicroesferas fluorescentes cobertas com FN-120, que é umfragmento quimiotríptico de ligação celular de fibronectinaplasmática. Veja, por exemplo, Schultz e Armant (1995) J.Biol. Chem. 270 (19): 11.522-31. Uma variante ou umfragmento biologicamente ativo do Id. de Seq. N° : 33, 34,ou 3 6 continuará a estar envolvido na produção deexopolissacarídeos. A produção de exopolissacarídeo podeser estimada pelo método quantitativo de fenol/ácidosulfúrico descrito em Mozi, e cols. (2001) J. Appl.Microbiol. 91 (1) :160-167. Uma variante ou um fragmentobiologicamente ativo do Id. de Seq. N°: 37 ou 38 continuaráa estar envolvido na inserção de D-alanina no ácidolipotecóico em bactérias. A captação de D-alanina pode sermedida de acordo com os métodos descritos por 0'Brien, ecols. (1995) Micróbios 83 (335) : 119-137.

Outras seqüências da invenção relacionadas à AARcompreendem enzimas envolvidas na produção de AI-2,incluindo os Ids. de Seq. Nos: 1 e 2, que codificam umanucleosídeo fosforilase (pfs) ; Ids. de Seq. Nos: 3 e 4, quecodificam uma metil transferase dependente de SAM (SAM-MT);Ids. de Seq. Nos: 13 e 14, que codificam uma metioninaadenosiltransferase (metE); Ids. de Seq. Nos: 15 e 16, quecodificam uma S-ribosil-homocisteinase (luxS); e os Ids. deSeq. Nos: 21 e 22, que codificam uma metioninaadenosiltransferase (metK). Em modalidades específicas, umavariante ou um fragmento biologicamente ativo dos Ids. deSeq. Nos: 1, 2, 3, 4, 13, 14, 15, 16, 21 ou 22 continuará ater a atividade enzimática citada acima, respectivamente.São conhecidos métodos para avaliar a atividade para cadauma dessas enzimas. Por exemplo, a atividade de metK podeser medida quantificando-se a produção de S-adenosiltransferase com o uso de cromatografia líquida dealto eficiência de acordo com os métodos descritos emPosnick e Samson (1999) J. Bacteriol. 181(21): 6.756-6.762.A atividade de doação de metil de SAM-MT pode ser testadade acordo com os métodos de Borchardt e cols. (1974) J\Med. Chem. 19(9): 1.104-1.110. A atividade de MTA/SAHnucleosídeo pode ser medida seguindo a conversão de 14C-metiltioadenosina em C-metiltioribose, como descrito porDella-Ragione e cols. (1995) Biochem. J. 232: 335-341 eCornell e cols. (1996) Biochem. J. 317: 285-290. Aatividade de MetE pode ser medida de acordo com o ensaiodescrito por Hondorp e Matthews (2004) PLoS Biol. 2(11):e336. A atividade de LuxS pode ser medida com o uso doensaio de repórter de Vibrio harveyi, como descrito emoutra seção nesta especificação.

Variantes das seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos estão englobadas pela presente invenção. Otermo "variante" significa uma seqüência suficientementeidêntica. Conseqüentemente, a invenção engloba moléculas deácido nucléico isolado que são suficientemente idênticas àsseqüências de nucleotídeos que codificam proteínasrelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR nos Ids. de Seq.pares Nos: 2-22, 34, 36 ou 38, ou moléculas de ácidonucléico que hibridizam para uma molécula de ácido nucléicodos Ids. de Seq. ímpares Nos: 1-21, 33, 35 ou 37, ou umcomplemento destes, sob condições altamente controladas.

Variantes também incluem polipeptídeos variantescodificados pelas seqüências de nucleotídeos da presenteinvenção. Além disso, polipeptídeos da presente invençãopossuem uma seqüência de aminoácidos que é suficientementeidêntica a uma seqüência de aminoácidos apresentada nosIds. de Seq. pares Nos: 2-22, 34, 36 ou 38. 0 termo"suficientemente idêntica" significa que uma seqüência deaminoácidos ou uma seqüência de nucleotídeos contém umnúmero suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ounucleotídeos equivalente ou idêntico, comparada com umasegunda seqüência de aminoácidos ou seqüência denucleotídeos, fornecendo, desse modo, um domínio estruturalcomum e/ou indicando uma atividade funcional comum.Variantes conservadoras incluem aquelas seqüências denucleotídeos que diferem em função da degeneração do códigogenético.

Em geral, seqüências de aminoácidos ou seqüências denucleotídeos que possuem pelo menos cerca de 45%, 55% ou65% de identidade, pelo menos cerca de 70% ou 75% deidentidade, pelo menos cerca de 80%, 85% ou 95%, pelo menoscerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou99,5% de identidade de seqüência para qualquer uma dasseqüências de aminoácidos dos Ids. de Seq. pares Nos: 2-22,34, 36 ou 38, ou qualquer uma das seqüências denucleotídeos dos Ids. de Seq. ímpares Nos: 1—21, 33, 35 ou37, respectivamente, são aqui definidas comosuficientemente idênticas. Proteínas variantes englobadaspela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja,retêm a atividade biológica desejada da proteína nativa.

Uma variante biologicamente ativa de uma proteína dainvenção pode diferir daquela proteína por apenas 1-15resíduos de aminoácidos, apenas 1-10, por exemplo, 6-10,apenas 5, apenas 4, 3, 2, ou até mesmo 1 resíduo deaminoácido.

Variantes de ocorrência natural podem existir dentrode uma população (por exemplo, a população de bactérias deácido lático). Tais variantes podem ser identificadas pelautilização de técnicas conhecidas de biologia molecularcomo, por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR), ehibridização, como descrita abaixo. Seqüênciasnucleotídicas derivadas sinteticamente, por exemplo,seqüências geradas por mutagenese sítio-dirigida oumutagenese mediada por PCR que ainda codificam uma proteínarelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR também estãoincluídas como variantes. Uma ou mais substituições,adições, ou eliminações de nucleotídeos ou aminoácidospodem ser introduzidas em uma seqüência de nucleotídeos oude aminoácidos aqui revelada, de tal forma que assubstituições, adições, ou eliminações são introduzidas naproteína codificada. As adições (inserções) ou eliminações(truncamentos) podem ser feitas na extremidade N-terminalou C-terminal da proteína nativa, ou em um ou mais sítiosna proteína nativa. Da mesma forma, uma substituição de umou mais nucleotídeos ou aminoácidos pode ser feita em um oumais sítios na proteína nativa.

Por exemplo, podem ser feitas substituiçõesconservadoras de aminoácidos em um ou mais resíduos deaminoácidos previstos, preferivelmente não essenciais. Umresíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que podeser alterado da seqüência do tipo selvagem de uma proteína,sem alterar a atividade biológica, enquanto um aminoácido"essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma"substituição conservadora de aminoácidos" é aquela em queo resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo deaminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias deresíduos de aminoácidos que possuem cadeias lateraissimilares são conhecidas na técnica. Essas famílias incluemaminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo,lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (porexemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico) , cadeiaslaterais polares sem carga (por exemplo, glicina,asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano) , cadeias laterais comramificações beta (por exemplo, treonina, valina,isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo,tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Taissubstituições não seriam feitas para resíduos deaminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidosque residem dentro de um motivo conservado, onde taisresíduos são essenciais para a atividade da proteína.

Alternativamente, podem ser feitas mutaçõesaleatoriamente ao longo de todo ou parte do comprimento daseqüência codificadora relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR, por exemplo, por mutagênese por saturação. Os mutantespodem ser expressos de forma recombinante, e rastreadosquanto àqueles que retêm a atividade biológica testando-sea atividade protetora relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR com o uso de técnicas de ensaio padronizadas. Métodospara mutagênese e alterações de seqüência de nucleotídeossão conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-4 92; Kunkel e cols.(1987) Methods in Enzymol. Molecular Biology (MacMillanPublishing Company, Nova York) e as referências nelescitadas. As mutações feitas no DNA que codifica a variantenão devem romper o quadro de leitura e, preferivelmente,não criarão regiões complementares que poderiam produzirestrutura de mRNA secundário. Veja a Publicação do Pedidode Patente EP N° 75.444. Diretrizes sobre substituições deaminoácidos apropriadas que não afetam a atividadebiológica da proteína de interesse podem ser encontradas nomodelo de Dayhoff e cols. (1978) Atlas of Protein Sequenceand Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,D.C.), aqui incorporado por referência.

Não se espera que as eliminações, inserções esubstituições das seqüências de proteína aqui englobadasproduzam mudanças radicais nas características da proteína.No entanto, quando for difícil prever o efeito exato dasubstituição, eliminação ou inserção antes de fazê-la,aqueles habilitados na técnica observarão que o efeito seráavaliado por ensaios de rastreamento rotineiros. Ou seja, aatividade pode ser avaliada comparando-se a atividade daseqüência modificada com a atividade da seqüência original.Por exemplo, a atividade de variantes e fragmentos depolipeptídeos envolvidos na produção de AI-2 ou na AAR podeser medida testando-se a produção de AI-2 com a utilizaçãode métodos aqui revelados em outra seção.

Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos variantesda presente invenção também englobam seqüências derivadasde procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, tais comoembaralhamento de DNA (DNA shuffling). Com um procedimentocomo esse, uma ou mais regiões codificadoras diferentes deproteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR podem serusadas para criar uma nova proteína relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR que possua as propriedades desejadas.Dessa forma, são geradas bibliotecas de polinucleotídeosrecombinantes a partir de uma população de polinucleotídeosrelacionados à seqüência que compreendem regiões daseqüência que possuem identidade de seqüência substancial epodem ser recombinados de forma homóloga in vifcro ou invivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, motivos daseqüência que codificam um domínio de interesse podem serembaralhados entre o gene relacionado ao AI-2 ourelacionado à AAR da invenção e outros genes conhecidosrelacionados ao AI-2 ou relacionados à AAR para se obter umnovo gene que codifica uma proteína com uma propriedade deinteresse aprimorada como, por exemplo, um Km aumentado, nocaso de uma enzima. Estratégias para esse embaralhamento deDNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10.747-10.751;Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri e cols. (1997)Nature Biotech. 15: 436-438; Moore e cols. (1997) J. Mol.Biol. 272: 336-347; Zhang e cols. (1991) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 94: 4.504-4.509; Crameri e cols. (1998) Nature391: 288-291; e Patentes U.S. Nos 5.605.793 e 5.837.458.

Variantes de uma proteína da invenção relacionada aoAI-2 ou relacionada à AAR podem ser identificadasrastreando-se bibliotecas combinatórias de mutantes, porexemplo, mutantes por truncamento, de uma proteínarelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR. Em umamodalidade, é gerada uma biblioteca diversificada devariantes relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR pormutagenese combinatória no nível do ácido nucléico, e ela écodificada por uma biblioteca gênica diversificada. Umabiblioteca diversificada de variantes relacionadas ao AI-2ou relacionadas à AAR pode ser produzida, por exemplo,ligando-se enzimaticamente uma mistura de oligonucleotídeossintéticos em seqüências gênicas de tal forma que umconjunto degenerado de potenciais seqüências relacionadasao AI-2 ou relacionadas à AAR seja expressível comopolipeptídeos individuais ou, alternativamente, como umconjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, paraexibição de fago) contendo o conjunto de seqüênciasrelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR. Há váriosmétodos que podem ser usados para produzir bibliotecas depotenciais variantes relacionadas ao AI-2- ou relacionadasà AAR a partir de uma seqüência degenerada deoligonucleotídeos. A síntese química de uma seqüênciagênica degenerada pode ser realizada em um sintetizadorautomático de DNA, e o gene sintético então ligado em umvetor de expressão apropriado. O uso de um conjunto degenes degenerados permite o fornecimento, em uma mistura,de todas as seqüências que codificam o conjunto desejado depotenciais seqüências relacionadas ao AI-2 ou relacionadasà AAR. Métodos para a síntese de oligonucleotídeosdegenerados são conhecidos na técnica (veja, por exemplo,Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura e cols. (1984)Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura e cols. (1984) Science198: 1.056; Ike e cols. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).

Além disso, bibliotecas de fragmentos de uma seqüênciacodificadora de uma proteína relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR podem ser usadas para gerar uma populaçãodiversificada de fragmentos relacionados ao AI-2 ourelacionados à AAR para o rastreamento e subseqüenteseleção de variantes de uma proteína relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR. Em uma modalidade, pode ser gerada umabiblioteca de fragmentos da seqüência codificadoratratando-se um fragmento de PCR de fita dupla de umaseqüência codificadora relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR com uma nuclease sob condições nas quais ocorrarompimento (nicking) apenas cerca de uma vez por molécula,desnaturando-se o DNA de fita dupla, renaturando-se o DNApara formar DNA de fita dupla que possa incluir paressenso/anti-senso de diferentes produtos rompidos,removendo-se porções de fita simples dos duplexos re-formados por tratamento com SI nuclease, e ligando-se abiblioteca de fragmentos resultante em um vetor deexpressão. Por esse método, pode-se derivar uma bibliotecade expressão que codifique fragmentos do N-terminal einternos de vários tamanhos da proteína relacionada ao AI-2ou relacionada à AAR.

São conhecidas várias metodologias na técnica para orastreamento de produtos gênicos de bibliotecascombinatórias feitos por mutações ou truncamento em ponto epara o rastreamento de bibliotecas de cDNA para produtosgênicos que possuem uma propriedade selecionada. Taistécnicas são adaptáveis para um rastreamento rápido dasbibliotecas gênicas geradas pela mutagenese combinatória deproteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR. Astécnicas usadas mais amplamente, que são passíveis de umaanálise de alto rendimento, para o rastreamento de grandesbibliotecas gênicas tipicamente incluem a clonagem dabiblioteca gênica em vetores de expressão replicáveis,transformação das células apropriadas com a biblioteca devetores resultante, e a expressão dos genes combinatóriossob condições nas quais a detecção de uma atividadedesejada facilita o isolamento do vetor que codifica o genecujo produto foi detectado. A mutagenese de montagemrecursiva (REM), uma técnica que aumenta a freqüência demutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada emcombinação com os ensaios de rastreamento para identificarvariantes relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR (Arkine Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 7.811-7.815; Delgrave e cols. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

ii. Identidade de seqüências

As seqüências relacionadas ao AI-2 ou relacionadas àAAR são membros de uma família de moléculas comcaracterísticas funcionais conservadas. 0 termo "família"significa duas ou mais proteínas ou moléculas de ácidonucléico que possuem identidade de seqüências denucleotídeos ou de seqüências de aminoácidos suficiente.

Uma família que contém grupos profundamente divergentespode ser dividida em subfamílias. Um clã é um grupo defamílias que provavelmente possuem uma ancestralidadecomum. Membros de um clã têm uma estrutura terciáriasimilar. O termo "identidade de seqüência" significa que osresíduos de nucleotídeos ou de aminoácidos são os mesmosquando se alinham duas seqüências para uma correspondênciamáxima sobre pelo menos uma janela de comparaçãoespecificada. "Janela de comparação" significa um segmentocontíguo das duas seqüências de nucleotídeos ou seqüênciasde aminoácidos para um alinhamento ótimo, em que a segundaseqüência pode conter adições ou eliminações (ou seja,lacunas - gaps), quando comparada com a primeira seqüência.

Geralmente, para alinhamentos de ácidos nucléicos, a janelade comparação tem comprimento de pelo menos 2 0 nucleotídeoscontíguos e, opcionalmente, pode ter 30, 40, 50, 100 oumais. Para alinhamentos de seqüências de aminoácidos, ajanela de comparação tem comprimento de pelo menos 6aminoácidos contíguos e, opcionalmente, pode ter 10, 15,20, 30 ou mais. Aqueles habilitados na técnica sabem que,para evitar uma similaridade elevada em conseqüência dainclusão de lacunas, uma penalidade de lacuna é tipicamenteintroduzida e é subtraída do o número de combinações.

Os membros da família podem ser da mesma espécie ou deespécies diferentes, e podem incluir homólogos, além deproteínas distintas. Freqüentemente, membros de uma famíliaexibem características funcionais comuns. Homólogos podemser isolados com base em sua identidade em relação àsseqüências de ácidos nucléicos relacionadas ao AI-2 ourelacionadas ã AAR aqui reveladas com a utilização do cDNA,ou uma porção deste, como sonda de hibridização, de acordocom técnicas de hibridização padronizadas, sob condições dehibridização altamente controladas, como revelado abaixo.

Para determinar o percentual de identidade de duasseqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos, é realizadoum alinhamento. O percentual de identidade das duasseqüências é uma função do número de resíduos idênticoscompartilhados pelas duas seqüências na janela decomparação (ou seja, percentual de identidade = número deresíduos idênticos/número total de resíduos x 100). Em umamodalidade, as seqüências têm o mesmo comprimento. Métodossimilares àqueles mencionados abaixo podem ser usados paradeterminar o percentual de identidade entre duasseqüências. Os métodos podem ser usados com ou sem apermissão de lacunas. O alinhamento também pode serrealizado manualmente por inspeção.

Quando seqüências de aminoácidos diferem emsubstituições conservadoras, o percentual de identidadepode ser ajustado para cima para corrigir a naturezaconservadora da substituição. Meios para a realização desseajuste são conhecidos na técnica. Tipicamente, asubstituição conservadora é classificada como nãocombinação parcial, em vez de não combinação total,aumentando, dessa forma, a percentagem da identidade deseqüência.

Podem ser usados algoritmos matemáticos paradeterminar o percentual de identidade de duas seqüências.

Exemplos não limitantes de algoritmos matemáticos são oalgoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 87: 2.264, modificado em Karlin e Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5.873-5.877; o algoritmo deMyers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; o algoritmo dealinhamento local de Smith e cols. (1981) Adv. Appl. Math.2: 482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman eWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; e o método depesquisa de alinhamento local de Pearson e Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2.444-2.448.

Foram projetadas várias implementações por computadorbaseadas nesses algoritmos matemáticos para permitir adeterminação da identidade de seqüências. Os programasBLAST de Altschul e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 sebaseiam no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra.

Pesquisas para a obtenção de seqüências de nucleotídeos quesejam homólogas às seqüências de nucleotídeos da presenteinvenção podem ser realizadas com o programa BLASTN,pontuação = 100, comprimento (wordlength) = 12. Para aobtenção de seqüências de aminoácidos homólogas àsseqüências que codificam uma proteína ou polipeptídeo dapresente invenção, o programa BLASTX pode ser usado,pontuação = 50, comprimento (wordlength) = 3. Alinhamentoscom lacunas podem ser obtidos com o uso de Gapped BLAST (emBLAST 2.0), como descrito em Altschul e cols. (1997)Nucleic Acids Res. 25: 3.389. Para se detectarrelacionamentos distantes entre moléculas, pode serutilizado PSI-BLAST. Veja Altschul e cols. (1997) supra.Para todos os programas BLAST, os parâmetros-padrão dosrespectivos programas podem ser usados. Vejawww.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser feitomanualmente por inspeção.

Outro programa que pode ser utilizado para determinaro percentual de identidade de seqüências é o programa ALIGN(versão 2.0), que usa o algoritmo matemático de Myers eMiller (1988) supra. Uma tabela de peso de resíduo PAM120,uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e umapenalidade de lacuna de 4 podem ser usadas com esseprograma quando se comparam seqüências de aminoácidos.

Além dos programas ALIGN e BLAST, os programasBESTFIT, GAP, FASTA e TFASTA são parte do pacote deprogramas "GCG Wisconsin Genetics Software Package", Versão10 (disponível por Accelrys Inc., 9685 Scranton Rd. , SanDiego, Califórnia, EUA), e podem ser usados para arealização de alinhamentos de seqüências. O programapreferido é GAP, versão 10, que utiliza o algoritmo deNeedleman e Wunsch (1970) supra. A menos que estabelecidode forma diferente, os valores de similaridade deidentidade de seqüência aqui apresentados referem-se aovalor obtido com a utilização de GAP Versão 10 com osseguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridadepara uma seqüência de nucleotídeos com o uso de Peso de GAPde 50 e Peso do Comprimento de 3 e a matriz de pontuaçãonwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para umaseqüência de aminoácidos com o uso de Peso de GAP de 8 ePeso de Comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62;ou qualquer programa equivalente. "Programa equivalente"significa qualquer programa de comparação de seqüênciasque, para quaisquer duas seqüências em questão, gera umalinhamento que possui combinações idênticas de resíduos de

10 nucleotídeos ou de aminoácidos, e um percentual deidentidade de seqüência idêntico, quando comparado com oalinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

O alinhamento de uma seqüência em uma base de dados emrelação a uma seqüência investigada produzida peloalgoritmo BLASTN, FASTA, BLASTP ou semelhante é normalmentedescrito como um "hit". Hits para uma ou mais seqüências dabase de dados por uma seqüência investigada produzida peloalgoritmo de BLASTN, FASTA, BLASTP ou um algoritmo similaralinham e identificam porções similares de uma seqüência.

Um hit para uma seqüência da base de dados geralmenterepresenta uma superposição em relação a uma fração docomprimento da seqüência da seqüência investigada, ou seja,uma porção ou fragmento da seqüência investigada. Noentanto, a superposição pode representar todo o comprimentoda seqüência investigada. Os hits em um alinhamento emrelação a uma seqüência investigada produzida poralgoritmos de BLASTN, FASTA ou BLASTP em relação àsseqüências em uma base de dados são comumente dispostos emordem do grau de similaridade e do comprimento dasuperposição de seqüência.Hits de polinucleotldeos e polipeptídeos alinhadospelos algoritmos de BLASTN, FASTA ou BLASTP em relação auma seqüência investigada produzem valores "Previstos". Ovalor Previsto (valor E) indica o número de hits que sepode "prever" em relação a certo número de seqüênciascontíguas aleatoriamente quando se pesquisa uma base dedados de determinado tamanho. O valor Previsto é usado comoum limiar de significância para se determinar se o hit parauma base de dados, por exemplo, a base de dados GENBANK® ouEMBL, indica a similaridade real. Por exemplo, um valor Ede 0,1 atribuído a um hit de polinucleotídeo é interpretadocomo significando que, em uma base de dados do tamanho dabase de dados GENBANK®, pode-se prever 0,1 de combinaçõessobre a porção alinhada da seqüência com uma pontuaçãosimilar, aleatoriamente. Por esse critério, as porçõesalinhadas e combinadas das seqüências de polinucleotídeostêm uma probabilidade de 95% de serem as mesmas. Paraseqüências que possuem um valor E de 0,01 ou menos sobreporções alinhadas e combinadas, a probabilidade de seencontrar uma combinação aleatoriamente na base de dadosGENBANK® é de 1% ou menos, usando o algoritmo de BLASTN ouFASTA.

De acordo com uma modalidade desta invenção,polinucleotídeos e polipeptídeos "variantes" desta invençãocompreendem seqüências que produzem um valor E de cerca de0,01 ou menos, quando comparadas com as seqüências depolinucleotídeos ou de polipeptídeos da presente invenção.Ou seja, um polinucleotídeo variante ou polipeptídeo équalquer seqüência que tenha pelo menos uma probabilidadede 99% de ser a mesma que o polinucleotídeo ou polipeptídeoda presente invenção, medida como tendo um valor E de 0,01ou menos, usando os Algoritmos de BLASTN, FASTA ou BLASTPajustados com os parâmetros aqui descritos. Em outrasmodalidades, um polinucleotídeo variante é uma seqüênciaque possui o mesmo número, ou menos ácidos nucléicos, doque um polinucleotídeo da presente invenção que tenha umaprobabilidade de pelo menos 99% de ser a mesma que opolinucleotídeo da presente invenção, medida como tendo umvalor E de 0,01 ou menos, usando os algoritmos de BLASTN ouFASTA ajustados com os parâmetros aqui descritos. Da mesmaforma, um polipeptídeo variante é uma seqüência que possuio mesmo número, ou menos, de aminoácidos do que umpolipeptídeo da presente invenção que tenha umaprobabilidade de pelo menos a 99% de ser o mesmo que umpolipeptídeo da presente invenção, medido como tendo umvalor E de 0,01 ou menos, usando o algoritmo de BLASTPajustado com os parâmetros aqui descritos.

Como observado anteriormente, o percentual deidentidade é determinado alinhando-se seqüências com o usode um dos algoritmos de BLASTN, FASTA ou BLASTP, ajustadoscom os parâmetros aqui descritos, e identificando-se onúmero de ácidos nucléicos ou aminoácidos idênticos sobreas porções alinhadas; dividindo-se o número de ácidosnucléicos ou aminoácidos idênticos pelo número total deácidos nucléicos ou aminoácidos do polinucleotídeo ou daseqüência polipeptídica da presente invenção; e, a seguirmultiplicando-se por 100 para determinar o percentual deidentidade. Por exemplo, um polinucleotídeo da presenteinvenção que possui 220 ácidos nucléicos tem um hit parauma seqüência de polinucleotídeos na base de dados GENBANK®que possui 520 ácidos nucléicos sobre um trecho de 23nucleotídeos no alinhamento produzido pelo algoritmo deBLASTN usando os parâmetros aqui descritos. O hit de 23nucleotídeos inclui 21 nucleotídeos idênticos, uma lacuna eum nucleotídeo diferente. O percentual de identidade dopolinucleotídeo da presente invenção para o hit nabiblioteca GENBANK® é, portanto, 21/220 vezes 100, ou seja,9,5%. A seqüência de polinucleotídeos na base de dadosGENBANK® não é, portanto, uma variante de umpolinucleotídeo da presente invenção.

iii. Identificação e isolamento de seqüências homólogas

As seqüências de nucleotídeos relacionadas ao AI-2 ourelacionadas à AAR identificadas com base na sua identidadede seqüência para as seqüências de nucleotídeosrelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR aquiapresentadas, ou para fragmentos e variantes destas, sãoenglobadas pela presente invenção. Métodos, tais como PCRou hibridização, podem ser usados para identificarseqüências a partir de uma biblioteca de cDNA ou genômica,por exemplo, que sejam substancialmente idênticas a umaseqüência desta invenção. Veja, por exemplo, Sambrook ecols. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2a ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,Nova York) e Innis, e cols. (1990) PCR Protocols: A Guideto Methods and Applications (Academic Press, Nova York).

Métodos para a construção dessas bibliotecas de cDNA egenomicas são geralmente conhecidos na técnica e também sãorevelados na referência acima.

Em técnicas de hibridização, as sondas de hibridizaçãopodem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA,fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podemconsistir em toda seqüência de nucleotídeos conhecida aquirevelada, ou parte dela. Além disso, elas podem sermarcadas com um grupo detectável, por exemplo, 32P, ouqualquer outro marcador detectável, por exemplo, outrosradioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou umco-fator de enzima. Sondas para hibridização podem serfeitas por marcação de oligonucleotídeos sintéticos, combase nas seqüências de nucleotídeos relacionadas ao AI-2 ourelacionadas à AAR conhecidas aqui reveladas. Iniciadoresdegenerados projetados com base em nucleotídeos ou resíduosde aminoácidos conservados em uma seqüência de nucleotídeosrelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR conhecida, ou naseqüência de aminoácidos codificada, podem adicionalmenteser usados. A sonda de hibridização tipicamente compreendeuma região da seqüência de nucleotídeos que hibridiza sobcondições altamente controladas para pelo menos cerca de10, preferivelmente cerca de 20, mais preferivelmente cercade 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ou 400nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeosrelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR da invenção, ou umfragmento ou variante desta. Para se obter hibridizaçãoespecífica com diversas condições, tais sondas incluemseqüências que são únicas entre seqüências de proteínas25 relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR. Métodos para apreparação de sondas para hibridização são geralmenteconhecidos na técnica, e são revelados em Sambrook e cols.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NovaYork), aqui incorporado por referência.Em uma modalidade, toda a seqüência de nucleotídeosque codifica uma proteína relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR é usada como sonda para identificarseqüências relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR eRNAs mensageiros inéditos. Em outra modalidade, a sonda éum fragmento de uma seqüência de nucleotídeos aquirevelada. Em algumas modalidades, a seqüência denucleotídeos que hibridiza sob condições altamentecontroladas para a sonda pode ter comprimento de pelo menoscerca de 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600,650, 700, 800, 900, 1000, 1500 ou mais nucleotídeos.

Conseqüentemente, além das seqüências de nucleotídeosrelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR aqui reveladas,e fragmentos e variantes destas, as moléculas de ácidonucléico isolado da presente invenção também englobamseqüências de DNA homólogas identificadas e isoladas deoutros organismos ou células por hibridização comseqüências inteiras ou parciais obtidas das seqüências denucleotídeos relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AARaqui reveladas, ou variantes e fragmentos destas.

Seqüências substancialmente idênticas hibridizarãoentre elas sob condições altamente controladas. "Condiçõesaltamente controladas" significam condições sob as quaisuma sonda hibridizará para sua seqüência-alvo em um graudetectavelmente maior do que para outras seqüências (porexemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao nível de fundo).Geralmente, condições altamente controladas englobamaquelas condições para hibridização e lavagem sob as quaisnucleotídeos que possuem pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%,ou pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüênciatipicamente permanecem hibridizados entre eles. Condiçõesaltamente rigorosas são conhecidas na técnica e podem serencontradas em Ausubel e cols., eds. (1989) CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NovaYork). A hibridização tipicamente ocorre por menos de cercade 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

Condições altamente rigorosas dependem da seqüência ediferirão em diferentes circunstâncias. Seqüências deácidos nucleicos de comprimento total ou parciais podem seraqui usadas para a obtenção de homólogos e ortólogosenglobados pela presente invenção. "Ortólogos" significamgenes derivados de um gene ancestral comum e que sãoencontrados em diferentes espécies como resultado deespeciação. Genes encontrados em diferentes espécies sãoconsiderados ortólogos quando suas seqüências denucleotídeos e/ou suas seqüências codificadas de proteínacompartilham identidade substancial, como aqui definido emoutra seção. As funções de ortólogos são freqüentementealtamente conservadas entre espécies.

Quando se utilizam sondas, condições altamentecontroladas serão aquelas nas quais a concentração de sal émenos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente umaconcentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou deoutros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelomenos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondaslongas (por exemplo, acima de 50 nucleotídeos).

As lavagens pós-hibridização são instrumentais nocontrole de especificidade. Os dois fatores críticos sãoforça iônica e temperatura da solução de lavagem final.Para a detecção de seqüências que hibridizam para umaseqüência-alvo de comprimento total ou aproximadamente decomprimento total, a temperatura sob condições altamentecontroladas é selecionada para ser cerca de 5°C abaixo doponto térmico de fusão (Tm) para a seqüência específica emuma força iônica e um pH definidos. No entanto, condiçõesaltamente controladas englobariam temperaturas na faixa de1°C a 20 °C abaixo do Tm, dependendo do grau de controledesejado, como aqui definido em outra seção. Para híbridosDNA-DNA, o Tm pode ser determinado usando-se a equação deMeinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm =81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% de forma) -500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GCé a percentagem de nucleotídeos guanosina e citosina noDNA, % de forma é a percentagem de formamida na solução dehibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares debase. O Tm é a temperatura (sob força iônica e pHdefinidos) na qual 50% de uma seqüência-alvo complementarhibridiza para uma sonda que combina perfeitamente.

A habilidade para detectar seqüências com grausvariáveis de homologia pode ser obtida variando-se o rigordas condições de hibridização e/ou lavagem. Paraseqüências-alvos que são 100% idênticas (sondagemhomóloga), devem ser obtidas condições de rigor que nãopermitam a não combinação. Ao se permitir a ocorrência denão combinação de resíduos de nucleotídeos, seqüências comum grau menor de similaridade podem ser detectadas(sondagem heteróloga). Para cada 1% de não combinação, o Tmé reduzido cerca de 1°C; portanto, as condições dehibridização e/ou lavagem podem ser manipuladas parapermitirem hibridização de seqüências de um percentual deidentidade-alvo. Por exemplo, caso sejam preferidasseqüências com > 95% de identidade de seqüência, o Tm podeser diminuído em 10°C. Duas seqüências de nucleotídeospoderiam ser substancialmente idênticas, mas não conseguemhibridizar entre elas sob condições altamente controladas,se os polipeptídeos que codificam forem substancialmenteidênticos. Essa situação ocorreria, por exemplo, se amáxima degeneração de códon do código genético fosse usadapara criar uma cópia de um ácido nucléico.

Condições de baixo rigor exemplares incluemhibridização com uma solução-tampão de formamida 30-35%, 1M de NaCl, SDS 1% (sódio dodecil sulfato) a 37°C, e umalavagem em SSC IX a 2X (SSC 20X = 3,0 de M NaCl/0,3 M decitrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições de rigormoderado exemplares incluem hibridização em formamida 4 0 a45%, 1,0 M de NaCl, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,5Xa IX a 55 a 60°C. Condições de alto rigor exemplaresincluem hibridização em formamida 50%, 1 M de NaCl, SDS 1%a 37 °C e uma lavagem em SSC 0, IX a 60 a 65 °C.Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cercade 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização égeralmente menos de cerca de 24 horas, normalmente cerca de4 a cerca de 12 horas. Um guia detalhado para ahibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology — Hybridization with Nucleic Acids Probes, Parte I,Capítulo 2 (Elsevier, Nova York); e Ausubel e cols., eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2(Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova York). VejaSambrook e cols. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2 a ed. ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, Nova York).

Em uma abordagem de PCR, iniciadores deoligonucleotídeos podem ser projetados para uso em reaçõesde PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes apartir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquerorganismo de interesse. Iniciadores de PCR têmpreferivelmente comprimento de pelo menos cerca de 10nucleotídeos e, principalmente, comprimento de pelo menoscerca de 20 nucleotídeos. Métodos para o projeto deiniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmenteconhecidos na técnica e são discutidos em Sambrook e cols.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. , ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NovaYork). Veja também Innis e cols., eds. (1990) PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, Nova York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCRStrategies (Academic Press, Nova York); e Innis e Gelfand,eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova York).Métodos de PCR conhecidos incluem, sem limitação, métodosque utilizam iniciadores pareados, iniciadores abrigados,iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados,iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadores parcialmente-não combinados, esemelhantes.

iv. Seqüências de nucleotídeos anti-senso

A presente invenção também engloba moléculas de ácidonucléico anti-senso, ou seja, moléculas que sãocomplementares a um ácido nucléico senso que codifica umaproteína, por exemplo, complementares à fita codificadorade uma molécula de cDNA de fita dupla, ou complementares auma seqüência de mRNA. Conseqüentemente, um ácido nucleicoanti-senso pode se ligar por hidrogênio a um ácido nucleicosenso. O ácido nucleico anti-senso pode ser complementar atoda uma fita codificadora relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR, ou a apenas uma porção desta, porexemplo, toda ou parte da região codificadora de proteína(ou quadro aberto de leitura). Uma molécula de ácidonucleico anti-senso pode ser anti-senso para uma região nãocodificadora da fita codificadora de uma seqüência denucleotídeos que codifica uma proteína relacionada ao AI-2ou relacionada à AAR. As regiões não codificadoras são asseqüências 51 e 3' que flanqueiam a região codificadora enão são traduzidas em aminoácidos. Seqüências denucleotídeos anti-senso são úteis na interrupção daexpressão do gene-alvo. Podem ser usadas construções anti-senso que possuem 70%, 80%, ou 85% de identidade deseqüência para a seqüência correspondente.

Considerando a seqüência da fita codificadora quecodifica uma proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR aqui revelada (por exemplo, Ids. de Seq. ímpares Nos:1-21, 33, 35, ou 37), podem ser projetados ácidos nucléicosanti-senso da invenção de acordo com as regras depareamento de bases de Watson e Crick. A molécula de ácidonucleico anti-senso pode ser complementar a toda a regiãocodificadora do mRNA relacionado ao AI-2 ou relacionado àAAR, mas, mais preferivelmente, é um oligonucleotídeo quesó é anti-senso para uma porção da região codificadora ounão codificadora do mRNA relacionado ao AI-2 ou relacionadoà AAR. Um oligonucleotídeo anti-senso pode ter, porexemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50nucleotídeos de comprimento, ou ele pode ter 100, 200 oumais nucleotídeos de comprimento. Um ácido nucleico anti-senso da invenção pode ser construído com a utilização deprocedimentos de síntese química e ligação enzimáticaconhecidos na técnica.

Uma molécula de ácido nucleico anti-senso da invençãopode ser uma molécula a-anomérica de ácido nucleico(Gaultier e cols. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6.625-6.641) . A molécula de ácido nucleico anti-senso também podecompreender um 21-o-metilribonucleotídeo (Inoue e cols.(1987) Nucleic Acids Res. 15: 6.131-6.148) ou um análogoquimérico de RNA-DNA (Inoue e cols. (1987) FEBS Lett. 215:327-330). A invenção também engloba ribozimas, que sãomoléculas catalíticas de RNA com atividade de ribonucleaseque são capazes de clivar um ácido nucleico de fita simplescomo, por exemplo, um mRNA, para as quais possuem umaregião complementar. A invenção também engloba moléculas deácido nucleico que formam estruturas helicoidais triplas.Veja geralmente Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sei. 660: 27; e Maher(1992) Bioassays 14(12): 807.

Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleicoda invenção podem ser modificadas na porção de base, porçãode açúcar ou na estrutura central de fosfato para melhorar,por exemplo, a estabilidade, hibridização ou solubilidadeda molécula. Como aqui usados, os termos "ácidos nucléicospeptídicos" ou "PNAs" referem-se aos miméticos de ácidonucleico, por exemplo, miméticos de DNA, nos quais aestrutura central de desoxirribose fosfato é substituídapor uma estrutura central pseudopeptídica, e só são retidasquatro nucleobases naturais. Demonstrou-se que a estruturacentral neutra de PNAs permite a hibridização específicapara DNA e RNA sob condições de baixa força iônica. Asíntese de oligômeros de PNA pode ser realizada com autilização de protocolos padronizados de síntese peptídicade fase sólida, como descrito, por exemplo, em Hyrup ecols. (1996) supra; Perry-0'Keefe e cols. (1996) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 93: 14.670.

Em outra modalidade, PNAs de uma molécula relacionadaao AI-2 ou relacionada à AAR podem ser modificados, porexemplo, para aumentar sua estabilidade, especificidade oucaptação celular, anexando-se grupos lipofílicos ou outrosgrupos auxiliares ao PNA, pela formação de quimeras PNA-DNA, ou com o uso de lipossomos ou outras metodologias deliberação de fármacos conhecidas na técnica. A síntese dequimeras PNA-DNA pode ser efetuada como descrito em Hyrup(1996) supra; Finn e cols. (1996) Nucleic Acids Res.24(17): 3.357-63; Mag e cols. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5.973; e Peterson e cols. (1975) Bioorganic Med. Chem.Lett. 5: 1.119.

v. Proteínas de fusão

A invenção também inclui proteínas quiméricas ou defusão relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR. Uma"proteína quimérica" ou "proteína de fusão" relacionada aoAI-2 ou relacionada à AAR compreende um polipeptídeorelacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR ligadooperacionalmente a um polipeptídeo não relacionado ao AI-2ou não relacionado à AAR. Um polipeptídeo "relacionado aoAI-2" ou "relacionado à AAR" refere-se a um polipeptídeoque possui uma seqüência de aminoácidos que corresponde aum polipeptídeo'que esteja envolvido na produção de AI-2 ouna AAR, enquanto um polipeptídeo "não relacionado ao AI-2"ou "não relacionado à AAR" refere-se a um polipeptídeo quepossui uma seqüência de aminoácidos que corresponde a umaproteína que não seja substancialmente idêntica a umpolipeptídeo que esteja envolvido na produção de AI-2 ou naAAR, e que seja derivado do mesmo organismo ou de umorganismo diferente. Dentro de uma proteína de fusãorelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR, o polipeptídeorelacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR pode correspondera toda ou a uma porção de uma proteína relacionada ao AI-2ou relacionada à AAR, incluindo preferivelmente pelo menosuma porção biologicamente ativa de uma proteína relacionadaao AI-2 ou relacionada à AAR. Dentro da proteína de fusão,o termo "ligado operacionalmente" visa a indicar que opolipeptídeo relacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR e opolipeptídeo não relacionado ao AI-2 ou não relacionado àAAR estão fundidos estruturalmente entre si. O polipeptídeonão relacionado ao AI-2 ou não relacionado à AAR pode serfundido ao N-terminal ou C-terminal do polipeptídeorelacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR.

A expressão das seqüências de codificação ligadasresulta em duas seqüências de aminoácidos heterólogasligadas que formam a proteína de fusão. A seqüênciatransportadora (o polipeptídeo não relacionado ao AI-2 ounão relacionado à AAR) pode codificar um polipeptídeotransportador que potencializa ou aumenta a expressão daproteína de fusão no hospedeiro bacteriano. A porção daproteína de fusão codificada pela seqüência transportadora,ou seja, o polipeptídeo transportador, pode ser umfragmento de proteína, uma porção funcional inteira ou umaseqüência de proteína inteira. A região ou o polipeptídeotransportador pode adicionalmente ser projetado para serusado na purificação da proteína de fusão, tanto comanticorpos quanto com purificação por afinidade específicapara aquele polipeptídeo transportador. Da mesma forma, aspropriedades físicas do polipeptídeo transportador podemser exploradas para permitir a purificação seletiva daproteína de fusão.

Polipeptídeos transportadores específicos de interesseincluem superóxido dismutase (SOD), proteína de ligação demaltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), um fcagr dehistidina N-terminal (His), e semelhantes. Essa lista nãotem a intenção de ser limitante, uma vez que qualquerpolipeptídeo transportador que potencialize a expressão daproteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR como umaproteína de fusão pode ser usado nos métodos da invenção.

Em uma modalidade, a proteína de fusão é uma proteínade fusão de GST relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR naqual as seqüências relacionadas ao AI-2 ou relacionadas àAAR estão fundidas ao C-terminal das seqüências de GST. Emoutra modalidade, a proteína de fusão é uma proteína defusão de imunoglobulina relacionada ao AI-2 ou relacionadaà AAR na qual toda ou parte de uma proteína relacionada aoAI-2 ou relacionada à AAR está fundida a seqüênciasderivadas de um membro da família da proteína deimunoglobulina. As proteínas de fusão de imunoglobulinarelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR da invençãopodem ser usadas como imunogenos para produzirem anticorposanti-proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR emum indivíduo, para purificar ligantes relacionados ao AI-2ou relacionados à AAR, e em ensaios de rastreamento para aidentificação de moléculas que inibem a interação de umaproteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR com umligante relacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que opolipeptídeo transportador específico é escolhido tendo emmente o esquema de purificação. Por exemplo, marcadoresHis, GST, e proteína de ligação de maltose representampolipeptídeos transportadores que possuem colunas deafinidade facilmente disponíveis às quais podem ser ligadose eluídos. Dessa forma, quando o polipeptídeo transportadorfor um marcador His N-terminal, por exemplo, hexahistidina(marcador His6) , a proteína de fusão relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR poderá ser purificada usando uma matrizque compreende uma resina quelante de metal, por exemplo,ácido níquel nitrilotriacético (Ni-NTA), ácido níqueliminodiacético (Ni-IDA) e resina contendo cobalto (Co-resina). Veja, por exemplo, Steinert e cols. (1997) QIAGENNews 4: 11-15, aqui incorporado por referência em suatotalidade. Quando o polipeptídeo transportador for GST, aproteína de fusão relacionada ao AI-2 ou relacionada ã AARpoderá ser purificada usando uma matriz que compreendeglóbulos de glutationa-agarose (Sigma ou PharmaciaBiotech); quando o polipeptídeo transportador for umaproteína de ligação de maltose (MBP), a proteína de fusãorelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR poderá serpurificada usando uma matriz que compreende uma resina deagarose derivatizada com amilose.

De preferência, uma proteína quimérica ou de fusão dainvenção é produzida por técnicas padronizadas de DNArecombinante. Por exemplo, fragmentos de DNA que codificamas diferentes seqüências polipeptídicas podem ser ligadosjuntos estruturalmente, ou o gene de fusão pode sersintetizado, por exemplo, com sintetizadores automatizadosde DNA. Alternativamente, a amplificação por PCR dosfragmentos gênicos pode ser realizada com o uso deiniciadores de ancoragem que dão origem a protuberânciascomplementares entre dois fragmentos gênicos consecutivos,os quais podem subseqüentemente ser endurecidos e re-amplificados para gerar uma seqüência gênica quimérica(veja, por exemplo, Ausubel e cols., eds. (1995) CurrentProtocols in Molecular Biology (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova York). Além disso, um ácido nucléico quecodifica uma proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada àAAR pode ser clonado em um vetor de expressão disponívelcomercialmente de forma a ser ligado estruturalmente a umaporção de fusão existente.

O vetor de expressão da proteína de fusão étipicamente projetado para facilitar a remoção dopolipeptídeo transportador, permitindo que a proteínarelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR retenha aatividade biológica nativa a ela associada. Métodos para aclivagem de proteínas de fusão são conhecidos na técnica.Veja, por exemplo, Ausubel e cols., eds. (1998) CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.). Aclivagem química da proteína de fusão pode ser obtida comreagentes como brometo de cianogênios, 2-(2-nitrofenilsulfenil)-3-metil-31-bromoindolenina,hidroxilamina, ou pH baixo. A clivagem química éfreqüentemente obtida sob condições desnaturantes paraclivar proteínas de fusão de outra forma insoluveis.

Quando for desejada a separação do polipeptídeorelacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR do polipeptídeotransportador e um sítio de clivagem na junção entre essespolipeptídeos fundidos não for de ocorrência natural, aconstrução de fusão poderá ser projetada para conter umsítio de clivagem de protease específico para facilitar aclivagem enzimática e a remoção do polipeptídeotransportador. Dessa forma, uma seqüência ligadora quecompreende uma seqüência codificadora para um peptídeo quetenha um sítio de clivagem específico para uma enzima deinteresse pode ser fundida estruturalmente entre aseqüência codificadora para o polipeptídeo transportador(por exemplo, MBP, GST, SOD ou um marcador His N-terminal)e a seqüência codificadora para o polipeptídeo relacionadoao AI-2 ou relacionado à AAR. Enzimas adequadas que possuemespecificidade para sítios de clivagem incluem, semlimitação, fator Xa, trombina, enteroquinase, remina,colagenase e protease do vírus efcch do tabaco (TEV). Sítiosde clivagem para essas enzimas são bem conhecidos natécnica. Dessa forma, por exemplo, quando fator Xa forutilizado para clivar o polipeptídeo transportador dopolipeptídeo relacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR, aconstrução de fusão poderá ser projetada para compreenderuma seqüência ligadora que codifica um sítio de clivagemsensível ao fator Xa, por exemplo, a seqüência IEGR (veja,por exemplo, Nagai e Thogersen (1984) Nature 309: 810-812,Nagai e Thogersen (1987) Meth. Enzymol. 153: 461-481 ePryor e Leiting (1997) Protein Expr. Purif. 10(3): 309-319, aqui incorporados por referência). Quando trombina forusada para clivar o polipeptídeo transportador dopolipeptídeo relacionado ao AI-2 ou relacionado à AAR, aconstrução de fusão poderá ser projetada para compreenderuma seqüência ligadora que codifica um sítio de clivagemsensível à trombina, por exemplo, a seqüência LVPRGS ouVIAGR (veja, por exemplo, Pryor e Leiting (1997) ProteinExpr. Purif. 10 (3): 309-319, e Hong e cols. (1997) Chin.Med. Sei. J: 12(3): 143-147, respectivamente, aquiincorporados por referência). Sítios de clivagem para TEVprotease são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, ossítios de clivagem descritos na Patente U.S. N° 5.532.142,aqui incorporada por referência em sua totalidade. Vejatambém a discussão em Ausubel e cols., eds. (1998) CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.),Capítulo 16.

vi. Anticorpos

Um polipeptídeo isolado da presente invenção pode serusado como um imunogeno para a geração de anticorpos que seligam especificamente às proteínas relacionadas ao AI-2 ourelacionadas à AAR, ou estimular a produção de anticorposcontra polipeptídeos relacionados ao AI-2 ou relacionados àAAR in vivo. A proteína de comprimento total relacionada aoAI-2 ou relacionada à AAR pode ser usada como um imunogenoou, alternativamente, fragmentos peptídicos antigênicos deproteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR, comoaqui descritas, podem ser usados. O peptídeo antigênico deuma proteína relacionada ao AI-2 ou relacionada à AARcompreende pelo menos 8, preferivelmente 10, 15, 20 ou 30resíduos de aminoácidos da seqüência de aminoácidosmostrada nos Ids. de Seq. pares Nos: 2-22, 34, 36 ou 38, eengloba um epitopo de uma proteína relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR, de tal forma que um anticorpodesenvolvido contra o peptídeo forme um complexo imuneespecífico com a proteína relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR. Epitopos preferidos englobados pelopeptídeo antigênico são regiões de uma proteína relacionadaao AI-2 ou relacionada à AAR que estão localizadas nasuperfície da proteína, por exemplo, regiões hidrofílicas.

vii. Ensaios

São revelados ensaios diagnósticos para detectar aexpressão das moléculas de polipeptídeos e/ou de ácidonucléico reveladas, além de sua atividade apresentada emuma amostra. Um método exemplar para detecção da presençaou ausência de um ácido nucléico ou proteína revelada quecompreende o polipeptídeo revelado em uma amostra envolve aobtenção de uma amostra de um produtoalimentício/laticínio/de ração, cultura de partida (mãe, deorigem, massa/conjunto, concentrada, seca, liofilizada,congelada), produto alimentício/laticínio/de raçãocultivado, suplemento dietético, fermentado debioprocessamento ou de um indivíduo que tenha ingerido ummaterial probiótico, e contato da amostra com um compostoou um agente capaz de detectar os polipeptídeos ou ácidosnucléicos revelados (por exemplo, um mRNA ou DNA genômicoque compreende o ácido nucléico revelado ou fragmentodeste), de tal forma que a presença da seqüência reveladaseja detectada na amostra. Os resultados obtidos com umaamostra do alimento, suplemento, cultura, produto ouindivíduo podem ser comparados com os resultados obtidoscom uma amostra de uma cultura, produto ou indivíduo decontrole.

Um agente para a detecção do mRNA ou DNA genomico quecompreende uma seqüência de nucleotídeos revelada é umasonda marcada de ácido nucléico capaz de hibridizar para aseqüência de nucleotídeos revelada do mRNA ou DNA genomico.A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, umamolécula de ácido nucléico revelada, por exemplo, o ácidonucléico dos Ids. de Seq. ímpares Nos: 1-21, 33, 35, 37, ouuma porção deste, por exemplo, uma molécula de ácidonucléico com comprimento de pelo menos 15, 30, 50, 100,200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500 oumais nucleotídeos, e suficiente para hibridizarespecificamente sob condições altamente controladas para omRNA ou DNA genomico que compreende a seqüência de ácidosnucléicos revelada. São aqui descritas outras sondasadequadas para uso nos ensaios diagnósticos da invenção.

Um agente para a detecção de uma proteína quecompreende uma seqüência polipeptídica revelada é umanticorpo capaz de se ligar ao polipeptídeo revelado,preferivelmente um anticorpo com um marcador detectável.Anticorpos podem ser policlonais ou, mais preferivelmente,monoclonais. Pode ser usado um anticorpo intacto ou umfragmento deste (por exemplo, Fab ou F(abN)2). O termo"marcado", com relação à sonda ou anticorpo, visa aenglobar a marcação direta da sonda ou do anticorpo poracoplamento (ou seja, ligação física) de uma substânciadetectável à sonda ou anticorpo, além da marcação indiretada sonda ou do anticorpo por reatividade com outro reagenteque seja marcado diretamente. Exemplos de marcação indiretaincluem a detecção de um anticorpo primário com o uso de umanticorpo secundário marcado e marcação terminal de umasonda de DNA com biotina, de forma que ela possa serdetectada com estreptavidina marcada por fluorescência.

O termo "amostra" visa a incluir tecidos, células elíquidos biológicos presentes ou isolados de um indivíduo,além de células de culturas de partida ou produtosalimentícios que possuem tais culturas, ou derivados do usode tais culturas. Ou seja, o método de detecção da invençãopode ser usado para detectar mRNA, proteína ou DNA genômicoque compreende uma seqüência revelada em uma amostra, tantoin vitro quanto in vivo. Técnicas in vitro para detecção demRNA que compreendem uma seqüência revelada incluemhibridizações Northern e hibridizações in situ. Técnicas invitro para detecção de uma proteína que compreendem umpolipeptídeo revelado incluem ensaios imunoabsorventesligados à enzima (ELISAs), Western blots,imunoprecipitações e imunofluorescência. Técnicas in vitropara detecção de DNA genômico que compreendem as seqüênciasde nucleotídeos reveladas incluem hibridizações Southern.

Além disso, técnicas in vivo para detecção de uma proteínaque compreendem um polipeptídeo revelado incluem aintrodução em um indivíduo de um anticorpo marcado contra opolipeptídeo revelado. Por exemplo, o anticorpo pode sermarcado com um marcador radioativo cuja presença elocalização em um indivíduo pode ser detectada portécnicas-padrão de imagem.

Em uma modalidade, a amostra contém proteína moléculasde um indivíduo de teste que consumiu um materialprobiotico. Alternativamente, a amostra pode conter mRNA ouDNA genômico de uma cultura de partida.

A invenção também engloba kits para a detecção dapresença de ácidos nucléicos ou proteínas reveladas quecompreendem polipeptídeos revelados em uma amostra. Taiskits podem ser usados para determinar se um micróbio queexpressa um polipeptídeo da invenção específico estápresente em um produto alimentício ou cultura de partida,ou em um indivíduo que consumiu um material probiotico. Porexemplo, o kit pode compreender um composto ou agentemarcado capaz de detectar um polipeptídeo ou mRNA reveladoem uma amostra, e meios para a determinação da quantidadedo polipeptídeo revelado na amostra (por exemplo, umanticorpo que reconhece o polipeptídeo revelado ou umasonda de oligonucleotídeo que se liga ao DNA que codificaum polipeptídeo revelado, por exemplo, Ids. de Seq. ímparesNos: 1-21, 33, 35, ou 37). Os kits também podem incluirinstruções que detalham o uso de tais compostos.

Para kits baseados em anticorpos, o kit podecompreender, por exemplo: (1) um primeiro anticorpo (porexemplo, anexado a um suporte sólido) que se liga a umpolipeptídeo revelado; e, opcionalmente, (2) um segundoanticorpo diferente que se liga ao polipeptídeo revelado ouao primeiro anticorpo, e está conjugado a um agentedetectável. Para kits baseados em oligonucleotídeos, o kitpode compreender, por exemplo: (1) um oligonucleotídeo, porexemplo, um oligonucleotídeo marcado de forma detectável,que hibridiza para uma seqüência de ácidos nucléicosrevelada ou (2) um par de iniciadores úteis na amplificaçãode uma molécula de ácido nucléico revelada.

O kit também pode compreender, por exemplo, um agentede tamponamento, um conservante ou um agente estabilizantede proteínas. O kit também pode compreender componentesnecessários para a detecção do agente detectável (porexemplo, uma enzima ou um substrato) . O kit também podeconter uma amostra de controle ou uma série de amostras decontrole que podem ser testadas e comparadas com a amostrade teste contida. Cada componente do kit está normalmenteembalado em um recipiente individual e todos os váriosrecipientes estão dentro de uma única embalagem, juntamentecom instruções para uso.

Em uma modalidade, o kit compreende diversas sondas emformato de arranjo, tais como aquelas descritas, porexemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.412.087 e 5.545.531, ePublicação Internacional N° WO 95/0053 0, aqui incorporadaspor referência. Sondas para uso no arranjo podem sersintetizadas diretamente sobre a superfície do arranjo,como revelado na Publicação Internacional N° WO 95/00530,ou antes da imobilização sobre a superfície do arranjo(Gait, ed. (1984), Oligonucleotide Synthesis: a PracticalApproach IRL Press Oxford, Inglaterra). As sondas podem serimobilizadas sobre a superfície com a utilização detécnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica,tais como aquelas descritas na Patente U.S. N° 5.412.087.As sondas podem ser uma seqüência de ácido nucléico ou depeptídeos, preferivelmente purificados, ou um anticorpo.

Os arranjos podem ser usados para rastrear organismos,amostras ou produtos em busca de diferenças em seu teorgenômico, de cDNA, polipeptídico ou de anticorpo, incluindoa presença ou ausência de seqüências ou proteínasespecíficas, bem como a concentração desses materiais. Aligação a uma sonda de captura é detectada, por exemplo,pelo sinal gerado por um marcador anexado à molécula deácido nucléico que compreende a seqüência de ácidosnucléicos revelada, um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácidos revelada ou um anticorpo. O métodopode incluir o contato da molécula que compreende o ácidonucléico, polipeptídeo ou anticorpo revelado com umprimeiro arranjo que possui várias sondas de captura e umsegundo arranjo que possui um conjunto diferente de sondasde captura. Os resultados de cada hibridização podem sercomparados para analisar as diferenças na expressão entreuma primeira e uma segunda amostras. O primeiro conjunto desondas de captura pode ser de uma amostra de controle, porexemplo, uma bactéria de ácido lático do tipo selvagem, ouindivíduo de controle, por exemplo, um alimento, suplementodietético, amostra de cultura de partida ou um líquidobiológico. O segundo conjunto de sondas de captura pode serde uma amostra experimental, por exemplo, uma bactéria deácido lático do tipo mutante, ou de um indivíduo que tenhaconsumido um material probiótico, por exemplo, uma amostrade cultura de partida, ou um fluido biológico.

Esses ensaios podem ser especialmente úteis emprocedimentos de seleção microbiana e de controle dequalidade nos quais a detecção de materiais indesejados éessencial. A detecção de seqüências de nucleotídeos oupolipeptídeos específicos também pode ser útil nadeterminação da composição genética de alimentos, produtosde fermentação ou micróbios industriais, ou micróbiospresentes no sistema digestivo de animais ou seres humanosque tenham consumido probióticos.

Ensaios para detectar a expressão das moléculasreveladas de polipeptideos e/ou ácidos nucléicos tambémpodem incluir a detecção e/ou quantificação de AI-2.Métodos para a detecção de AI-2 são aqui descritos em outraseção. Ensaios para medir aderência, por exemplo, emresposta às condições adaptáveis de adesão, também podemser usados para avaliar a expressão dos polipeptideos dapresente invenção. Tais métodos também são aqui descritosem outra seção.

III. Vetores de expressão recombinante e célulashospedeiras

As moléculas de ácido nucléico da presente invençãopodem ser incluídas em vetores, preferivelmente vetores deexpressão. "Vetor" refere-se a uma molécula de ácidonucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qualfoi ligada. Vetores de expressão incluem uma ou maisseqüências reguladoras, e dirigem a expressão de genes aosquais estão ligadas operacionalmente. O termo "ligadaoperacionalmente" significa que a seqüência de nucleotídeosde interesse está ligada à(s) seqüência(s) reguladora(s) detal forma que a expressão da seqüência de nucleotídeos sejapermitida (por exemplo, em um sistema in vitro detranscrição/tradução ou em uma célula hospedeira quando ovetor é introduzido na célula hospedeira) . O termo"seqüência reguladora" visa a incluir promotorescontroláveis da transcrição, operadores, intensificadores,finalizadores de transcrição e outros elementos de controleda expressão, tais como seqüências de controle da tradução(por exemplo, seqüência de consenso Shine-Dalgarno, códonsde iniciação e terminação). Essas seqüências reguladorasdiferirão, por exemplo, dependendo da célula hospedeira queestiver sendo utilizada.

Os vetores podem ser replicados autonomamente em umacélula hospedeira (vetores epissomais), ou podem serintegrados no genoma de uma célula hospedeira, e replicadosjuntos com o genoma do hospedeiro (vetores mamíferos nãoepissomais). Vetores de integração tipicamente contêm pelomenos uma seqüência homóloga ao cromossomo bacteriano quepermite a ocorrência de recombinação entre o DNA homólogono vetor e o cromossomo bacteriano. Vetores de integraçãotambém podem compreender seqüências de bacteriófago ou detransposon. Vetores epissomais, ou plasmídeos, são alçascirculares de DNA de fita dupla nas quais segmentos de DNAadicionais podem ser ligados. Plasmídeos capazes demanutenção estável em um hospedeiro são geralmente a formapreferida de vetores de expressão quando se utilizamtécnicas de DNA recombinante.

As construções ou os vetores de expressão englobadosna presente invenção compreendem uma construção de ácidonucléico da invenção em uma forma adequada para expressãodo ácido nucléico em uma célula hospedeira. A expressão emcélulas hospedeiras procarióticas é englobada na presenteinvenção. Será observado por aqueles habilitados na técnicaque o projeto do vetor de expressão pode depender defatores como a escolha da célula hospedeira a sertransformada, do nível de expressão de proteína desejadoetc. Os vetores de expressão da invenção podem serintroduzidos em células hospedeiras para, desse modo,produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas oupeptídeos de fusão, codificados por ácidos nucléicos, comoaqui descritos (por exemplo, proteínas relacionadas ao AI-2ou relacionadas à AAR, formas mutantes de proteínasrelacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AAR, proteínas defusão etc.).

Seqüências reguladoras incluem aquelas que dirigem aexpressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos,bem como aquelas que dirigem a expressão indutível daseqüência de nucleotídeos somente sob certas condiçõesambientais. Um promotor bacteriano é qualquer seqüência deDNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciara transcrição abaixo (31) de uma seqüência codificadora(por exemplo, gene estrutural) em mRNA. Um promotor teráuma região de iniciação de transcrição, que é normalmentecolocada proximal à extremidade 5' da seqüênciacodificadora. Essa região de iniciação de transcriçãotipicamente inclui um sítio de ligação de RNA polimerase eum sítio de iniciação de transcrição. Um promotorbacteriano também pode ter um segundo domínio chamado umoperador, que pode se sobrepor a um sítio de ligação de RNApolimerase adjacente no qual começa a síntese de RNA. Ooperador permite a transcrição regulada negativa(indutível) , uma vez que uma proteína do gene repressorpode se ligar ao operador e, dessa forma, inibir atranscrição de um gene específico. A expressão constitutivapode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativoscomo, por exemplo, o operador. Além disso, a regulaçãopositiva pode ser obtida por uma seqüência de ligação daproteína ativadora de genes, a qual, se presente, énormalmente proximal (51) à seqüência de ligação de RNApolimerase.

Um exemplo de uma proteína ativadora de genes é aproteína ativadora de catabólito (CAP), que ajuda a iniciara transcrição do operon lac em Escherichia coli (Raibaud ecols. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173). A expressãoregulada pode, portanto, ser tanto positiva quanto negativae, assim, aumentar ou reduzir a transcrição. Outrosexemplos de elementos reguladores positivos e negativos sãobom conhecidos na técnica. Vários promotores que podem serincluídos no sistema de expressão de proteínas incluem, semlimitação, um promotor híbrido T7/lac0, um promotor trp, umpromotor T7, um promotor lac e um promotor bacteriófagolambda. Qualquer promotor adequado pode ser usado para aprática da presente invenção, incluindo o promotor nativoou um promotor heterólogo. Promotores heterólogos podem serconstitutivamente ativos ou indutíveis. Um exemplo nãolimitante de um promotor heterólogo é apresentado naPatente U.S. N° 6.242.194 para Kullen e Klaenhammer.

Seqüências que codificam enzimas da via metabólicafornecem seqüências promotoras particularmente úteis.Exemplos incluem seqüências promotoras derivadas de enzimasque metabolizam açúcar, como galactose, lactose (lac)(Chang e cols. (1987) Nature 198: 1.056) e maltose.

Exemplos adicionais incluem seqüências promotoras derivadasde enzimas biossintéticas, por exemplo, triptofano (trp)(Goeddel e cols. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4.057;Yelverton e cols. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 731; PatenteU.S. N° 4.738.921; Publicações EPO Nos 36.776 e 121.775). Osistema promotor beta-lactamase (bla) (Weissmann, (1981)"The Cloning of Interferon and Other Mistakes", emInterferon 3 (ed. I. Gresser); PL bacteriófago lambda(Shimatake e cols. (1981) Nature 292: 128); o promotorarabinose-indutível araB (Patente U.S. N° 5.028.530); esistemas promotores T5 (Petente U.S. N° 4.689.406) tambémfornecem seqüências promotoras úteis. Veja também Balbas(2001) Mol. Biotech. 19: 251-267, em que são discutidossistemas de expressão de E. coli.

Além disso, promotores sintéticos que não ocorrem nanatureza também funcionam como promotores bacterianos. Porexemplo, seqüências de ativação da transcrição de umpromotor bacteriano ou de bacteriófago podem ser unidas comas seqüências de operon de outro promotor bacteriano ou debacteriófago, criando um promotor híbrido sintético(Patente U.S. N° 4.551.433). Por exemplo, os promotores tac(Amann e cols. (1983) Gene 25: 167; de Bôer e cols. (1983)Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 21) e tre (Brosius e cols.(1985) J. Biol. Chem. 260: 3.539-3.541) são promotoreshíbridos trp-lac compostos tanto pelo promotor trp quantopor seqüências operon de lac que são regulados pelorepressor lac. O promotor tac tem a característicaadicional de ser uma seqüência reguladora indutível. Dessaforma, por exemplo, a expressão de uma seqüênciacodificadora ligada operacionalmente ao promotor tac podeser induzida em uma cultura de células por adição deisopropil-1-tio-p-D-galactosida (IPTG). Além disso, umpromotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrêncianatural de origem não bacteriana que possuem a habilidadede se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar atranscrição. Um promotor de ocorrência natural de origemnão bacteriana também pode ser acoplado a uma RNApolimerase compatível para produzir níveis elevados deexpressão de alguns genes em procariotas. O sistemabacteriófago de T7 RNA polimerase/promotor é um exemplo deum sistema de promotor acoplado (Studier e cols. (1986) J.Mol. Biol. 189: 113; Tabor e cols. (1985) Proc. Natl. Acad.Sei. 82: 1.074). Além disso, um promotor híbrido pode sercomposto por um promotor de bacteriófago e uma regiãooperadora de E. coli (Publicação EPO N° 267,851).

O vetor pode adicionalmente conter um gene quecodifica o repressor (ou indutor) para aquele promotor. Porexemplo, um vetor indutível da presente invenção poderegular a transcrição do operador Lac (LacO) por expressãodo gene que codifica a proteína repressora Lacl. Outrosexemplos incluem o uso do gene lexA para regular aexpressão de pRecA, e o uso de trpO para regular ptrp.Alelos de tais genes que aumentam a extensão da repressão(por exemplo, laclq) ou que modificam a forma de indução(por exemplo, lambda CI857, que torna lambda pLtermicamente indutível ou lambda CI+, que torna lambda pLquimicamente indutível) podem ser empregados.

Além de uma seqüência promotora funcional, um sítio deligação de ribossomo eficiente também é útil para aexpressão da construção de fusão. Em procariotas, o sítiode ligação de ribossomo é denominado seqüência Shine-Dalgarno (SD), e inclui um códon de iniciação (ATG) e umaseqüência com comprimento de 3-9 nucleotídeos localizada 3-11 nucleotídeos acima do códon de iniciação (Shine e cols.(1975) Wature 254: 34). Acredita-se que a seqüência SDpromova a ligação de mRNA ao ribossomo pelo pareamento debases entre a seqüência SD e a extremidade 3' de 16S rRNAbacteriana (Steitz e cols. (1979) "Genetic Signals andNucleotide Sequences in Messenger RNA", em BiologicalRegulation and Development: Gene Expression (ed. R. F.Goldberger, Plenum Press, NY)).

Proteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadas à AARtambém podem ser secretadas pela célula criando-semoléculas quiméricas de DNA que codificam uma proteína quecompreende um fragmento de uma seqüência peptídicasinalizadora que permite a secreção dos polipeptídeosrelacionados ao AI-2 ou relacionados à AAR em bactérias(Patente U.S. N° 4.336.336). O fragmento de seqüênciasinalizadora tipicamente codifica um peptídeo sinalizadorcomposto por aminoácidos hidrofõbicos que dirigem asecreção da proteína pela célula. A proteína é secretadanos meios de crescimento (bactérias gram-positivas) ou noespaço periplásmico, localizada entre a membrana interna eexterna da célula (bactérias gram-negativas) . Depreferência, há sítios de processamento, que podem serclivados tanto in vivo quanto in vitro, codificados entre ofragmento do peptídeo sinalizador e a proteína relacionadaao AI-2 ou relacionada à AAR.

O DNA que codifica seqüências sinalizadoras adequadaspode ser derivado de genes para proteínas bacterianassecretadas, tais como o gene da proteína da membranaexterna de E. coli (ompA) (Masui e cols. (1983) FEBS Lett.151(1): 159-164; Ghrayeb e cols. (1984) EMBO J. 3: 2.437-2.442) e a seqüência sinalizadora de fosfatase alcalina deE. coli (phoA) (Oka e cols. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei.82: 7.212). Outros sinais procarióticos incluem, porexemplo, a seqüência sinalizadora de penicilinase, Ipp, oulíderes de enterotoxina II termoestável.

Bactérias como L. acidophilus geralmente utilizam ocódon de partida ATG, que especifica o aminoácido metionina(que é modificado para N-formilmetionina em organismosprocarióticos). Bactérias também reconhecem códons departida alternativos, tais como os códons GTG e TTG, quecodificam valina e leucina, respectivamente. Quando elessão usados como o códon de iniciação, no entanto, essescódons dirigem a incorporação de metionina em vez doaminoácido que eles normalmente codificam. Lactobacillusacidophilus NCFM reconhece esses sítios de partidaalternativos e incorpora metionina como o primeiroaminoácido.

Tipicamente, seqüências de terminação da transcriçãoreconhecidas por bactérias são regiões reguladoraslocalizadas 3* em relação ao códon de parada de tradução e,dessa forma, junto com o promotor, flanqueiam a seqüênciacodificadora. Essas seqüências dirigem a transcrição de ummRNA que pode ser traduzido no polipeptídeo codificado pelo

DNA. Seqüências de terminação da transcrição freqüentementeincluem seqüências de DNA (de cerca de 50 nucleotídeos) quesão capazes de formar estruturas em grampo (stem loop) queajudam na terminação da transcrição. Exemplos incluemseqüências de terminação da transcrição derivadas de genescom promotores fortes como, por exemplo, o gene trp em E.coli, além de outros genes biossintéticos.

Os vetores de expressão terão diversos sítios derestrição para inserção da seqüência relacionada ao AI-2 ourelacionada à AAR de forma que ela esteja sob regulação detranscrição pelas regiões reguladoras. Genes de marcadorselecionável que asseguram a manutenção do vetor na célulatambém podem ser incluídos no vetor de expressão.Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles queconferem resistência a fármacos, tais como ampicilina,cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina) etetraciclina (Davies e cols. (1978) Annu. Rev. Microbiol.32: 469) . Marcadores selecionáveis também podem permitirque uma célula cresça em meio mínimo, ou na presença demetabólitos tóxicos, e podem incluir genes biossintéticos,tais como aqueles nas vias biossintéticas de histidina,triptofano e leucina.

Como aqui usado, o termo "heterólogo", em relação auma seqüência, é uma seqüência que se origina de umaespécie estranha ou, se da mesma espécie, ésubstancialmente modificada em relação à sua forma nativaem composição e/ou lócus genômico por intervenção humanadeliberada. Por exemplo, um promotor ligadooperacionalmente a um polinucleotídeo heterólogo é de umaespécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foiderivado ou, se da mesma espécie ou de uma espéciehomóloga, um ou ambos são substancialmente modificados emrelação à sua forma original e/ou lócus genômico, ou opromotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeoligado operacionalmente.

As regiões reguladoras podem ser nativas (homólogas) ,ou podem ser estranhas (heterólogas) à célula hospedeirae/ou à seqüência de nucleotídeos da invenção. As regiõesreguladoras também podem ser naturais ou sintéticas. Quandoa região for "estranha" ou "heteróloga" à célulahospedeira, isso significará que a região não é encontradana célula nativa na qual a região é introduzida. Quando aregião for "estranha" ou "heteróloga" à seqüência denucleotídeos relacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR dainvenção, isso significará a região não é a região nativaou de ocorrência natural para a seqüência de nucleotídeosrelacionada ao AI-2 ou relacionada à AAR ligadaoperacionalmente da invenção. Por exemplo, a região podeser derivada de fago. Embora seja preferível expressar asseqüências com a utilização de regiões reguladorasheterólogas, regiões nativas podem ser usadas. Espera-seque tais construções, em alguns casos, alterem os níveis deexpressão de proteínas relacionadas ao AI-2 ou relacionadasà AAR na célula hospedeira. Dessa forma, o fenótipo dacélula hospedeira poderia ser alterado.

Na preparação do cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados de forma a fazercom que as seqüências de DNA fiquem na orientação adequadae, como apropriado, no quadro de leitura adequado. Paraessa finalidade, podem ser empregados adaptadores ouvinculadores para unir os fragmentos de DNA, ou outrasmanipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios derestrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoçãode sítios de restrição, ou semelhantes. Para essafinalidade, mutagênese in vitro, reparo de iniciador,restrição, endurecimento, re-substituições, por exemplo,transições e transversões, podem estar envolvidos.

A invenção ainda fornece um vetor de expressãorecombinante que compreende uma molécula de DNA da invençãoclonado no vetor de expressão em uma orientação anti-senso.Ou seja, a molécula de DNA está ligada operacionalmente auma seqüência reguladora de tal forma a permitir aexpressão (por transcrição da molécula de DNA) de umamolécula de RNA que seja anti-senso ao mRNA relacionado aoAI-2 ou relacionado à AAR. Podem ser escolhidas seqüênciasreguladoras ligadas operacionalmente a um ácido nucléicoclonado na orientação anti-senso para dirigir a expressãocontínua ou indutível da molécula de RNA anti-senso. Ovetor de expressão anti-senso pode estar na forma de umplasmídeo recombinante ou fagemídeo no qual são produzidosácidos nucléicos anti-senso sob o controle de uma regiãoreguladora de alta eficiência, cuja atividade pode serdeterminada pelo tipo de célula na qual o vetor éintroduzido. Para uma discussão da regulação da expressãogênica com o uso de genes anti-senso, veja Weintraub ecols. (1986) Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1).

Alternativamente, alguns dos componentes descritosacima podem ser reunidos em vetores de transformação.Vetores de transformação são tipicamente compostos por ummarcador selecionável que seja mantido em um replicon ouseja desenvolvido em um vetor de integração, como descrito acima.

IV. Células hospedeiras microbianas ou bacterianas

Qualquer bactéria de interesse pode ser usada nosmétodos e nas composições da invenção. Em modalidadesespecíficas da invenção, a bactéria empregada nos métodos éuma bactéria probiótica. O termo "probiótica" significa ummicroorganismo vivo que sobrevive à passagem através dotrato gastrintestinal e tem um efeito benéfico sobre oindivíduo. Como aqui usadas, "propriedades probióticas"compreendem função intestinal e estabilidade aprimoradas;proteção aumentada contra doenças infecciosas e nãoinfecciosas; modulação do sistema imunológico; alívio daintolerância à lactose; melhora da digestão e da absorçãode nutrientes; colesterol sangüíneo reduzido; riscoreduzido à alergia; e risco reduzido de infecções do tratourinário. Em algumas modalidades, um aumento da adesão, datolerância ao estresse ou da produção de AI-2 em umabactéria resulta na melhora de pelo menos uma propriedadeprobiótica da bactéria.

Em outras modalidades da invenção, a bactéria é umabactéria de ácido lático. Como aqui usado, o termo"bactéria de ácido lático" significa bactérias de um gêneroselecionado dos seguintes: Aerococcus, Carnobacterium,Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Melissococcus,Alloiococcus, Dolosigranulum, Lactosphaera,Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella (Holzapfel e cols.(2001) Am. J. Clin. Nutr. 73: 365S-373S; Sneath, ed. (1986)Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol 2,Lippincott, Williams e Wilkins, Hagerstown, MD).

Ainda em outras modalidades, é usado Lactobacillus."Lactobacillus" significa qualquer bactéria do gêneroLactobacillus, incluindo, sem limitação, L. casei, L.rhamnosus, L. johnsonni, L. gasseri, L. acidophilus, L.plantarum, L. fermentum, L. salivarius, L. bulgaricus evárias outras espécies definidas por Wood e cols.(Holzapfel e Wood, eds. (1995) The Genera of Lactic AcidBactéria, Vol. 2., Springer, Nova York).

A produção de bactérias contendo genes heterologos, apreparação de culturas de partida de tais bactérias emétodos de substratos de fermentação, particularmentesubstratos alimentícios, como leite, podem ser realizadosde acordo com técnicas conhecidas, incluindo, semlimitação, aquelas descritas em Mâyrá-Mákinen e Bigret(1993) Lactic Acid Bactéria, Salminen e von Wright eds.Mareei Dekker, Inc. Nova York. 65-96.; Sandine (1996) DairyStarter Cultures, Cogan and Accolas eds. VCH Publishers,Nova York. 191-206; Gilliland (1985) Bacterial StarterCultures for Food, CRC Press, Boca Raton, Flórida.

O termo "fermentação" significa a quebra metabólicageradora de energia de compostos orgânicos pormicroorganismos que geralmente evolui sob condiçõesanaeróbicas e com a evolução de gás.

Moléculas de ácido nucleico ou seqüências deaminoácidos da invenção podem ser introduzidas em célulashospedeiras por métodos conhecidos na técnica. O termo"introdução" significa a introdução em célulasprocarióticas através de técnicas convencionais detransformação ou transfecção, ou por infecção mediada porfago. Como aqui usados, os termos "transformação","transdução", "conjugação" e "fusão de protoplasto"referem-se a diversas metodologias reconhecidas na técnicapara a introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo,DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitaçãocom fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecçãomediada por DEAE-dextrana, lipofecção ou eletroporação.

Métodos adequados para a transformação ou transfecção decélulas hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook ecols. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, Nova York) e em outros manuais de laboratório.

Células bacterianas usadas para produzir ospolipeptídeos relacionados ao AI-2 ou relacionados à AARdesta invenção são cultivadas em meios adequados, comodescrito de forma geral em Sambrook e cols. (198 9)Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York).

Cepas bacterianas englobadas pela presente invençãoincluem aquelas que são culturas biologicamente puras deuma bactéria que compreendem pelo menos uma seqüência denucleotideos ou de aminoácidos da presente invenção. Essascepas podem incluir, sem limitação: Lactobacillusacidophilus, L. gasseri, L. johnsonii ou L. plantarum.

Uma seqüência ou um promotor de controle de expressãoheteróloga pode ser associado operacionalmente a umaseqüência de nucleotideos desejada de acordo com técnicasconhecidas como, por exemplo, por inserção direcionada ou"ativação gênica" por recombinação homóloga. Veja, porexemplo, Patentes U.S. Nos 6.391.633 e 6.569.681.

Uma "bactéria ou célula em questão" é aquela na qualuma alteração genética, por exemplo, transformação, foiefetuada para um gene de interesse, uma célula que descendede uma célula assim alterada e que compreende a alteração,ou é uma bactéria que foi submetida às condições adaptáveisde adesão. Um "controle" ou uma "célula de controle" ou uma"bactéria de controle" fornece um ponto de referência paramedida das alterações no fenótipo da bactéria em questão.

Uma bactéria de controle pode compreender, porexemplo: (a) uma bactéria do tipo selvagem, ou seja, domesmo genótipo que o material de partida para a alteraçãogenética que resultou na bactéria em questão; (b) umabactéria do mesmo genótipo que o material de partida, masque foi transformada com uma construção nula (ou seja, comuma construção que não tem nenhum efeito sobre o traço deinteresse, por exemplo, uma construção que compreende umgene marcador); (c) bactérias geneticamente idênticas àbactéria em questão, mas que não são expostas às condiçõesadaptáveis de adesão ou a condições ou estímulos quemodulariam a produção de AI-2; ou (d) a própria bactéria emquestão, sob condições nas quais gene de interesse não éexpresso.

V. Métodos

i. Modulação da resposta adaptável de adesão

Em uma modalidade, a presente invenção identificou"condições adaptáveis de adesão". Como aqui usado, o termo"condições adaptáveis de adesão" compreende qualquercondição física, química, biológica ou similar que melhorea adesão de bactérias a um substrato. A adesão pode sermodulada, por exemplo, por cultivo de uma bactéria até umadensidade celular desejada, e depois incubação da bactériasob condições que aumentarão a resposta de adesão dabactéria. Para as finalidades da presente invenção, o termo"cultivo" ou uma "cultura de células" visa a descrevercélulas que crescem em um ambiente sintético. As condiçõesde cultura (por exemplo, meios de crescimento, pH,temperatura) variam amplamente para cada tipo de célula, ea variação de condições para um tipo de célula emparticular pode resultar na expressão de diferentesfenótipos. As células são tipicamente cultivadas emcondições favoráveis para promover crescimento celular. Ascélulas podem ser cultivadas em meios mínimos (contendo osnutrientes exatos, incluindo quaisquer fatores decrescimento, necessários para o crescimento da bactéria) oumeios complexos (contendo normalmente toda a gama defatores de crescimento que podem ser necessários para ocrescimento da bactéria). Pode-se também ajustar ascondições físicas de um meio de cultura, tais como pH etemperatura, para evitar o crescimento de alguns organismosenquanto aumenta o crescimento de outros.

Em modalidades específicas, as condições de culturabacteriana compreendem o cultivo anaeróbico a 37°C ou 42 °Cem meio de Mann-Rogosa-Sharpe (MRS) . O meio pode sermodificado para substituir glicose por galactose ou outroscarboidratos adequados como a fonte de açúcar no meio. Ascélulas podem ser coletadas na fase log inicial decrescimento (definida como tendo uma densidade óptica a 600nm (OD60o) de até 0,4), fase log médio de crescimento (OD600de cerca de 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9) ou fase logtardio de crescimento (OD60o acima de 0,9), antes daexposição às condições adaptáveis de adesão. Em modalidadesespecíficas, as células são coletadas em uma OD600 de cercade 0,6. As células bacterianas são coletadas, por exemplo,por sedimentação em uma centrífuga ou em outro dispositivoapropriado, e ressuspensas em meios adequados.

As células bacterianas coletadas podem então ser pré-condicionadas por incubação sob condições adaptáveis deadesão (ou seja, por incubação das células bacterianas sobcondições adaptáveis de adesão) que resulta em um aumentoda adesão a um substrato-alvo. O termo "incubação" refere-se à manutenção de uma população de bactérias sob condiçõesespecíficas (ou seja, condições adaptáveis de adesão) a fimde promover uma reação em particular (por exemplo, umaresposta adaptável de adesão). As condições adaptáveis deadesão podem incluir, por exemplo, incubação de bactériaspor um tempo suficiente para aumentar a adesão da bactéria.

Em algumas modalidades, as bactérias da presente invençãosão incubadas por pelo menos cerca de 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100 ou 120 minutos. Emoutras modalidades, as bactérias são incubadas sobcondições nas quais as células foram concentradas até umadensidade de cerca de 1,5 x IO8 a cerca de 1 x 1010 unidadesformadoras de colônias por mililitro (ufc/ml) de diluente(por exemplo, meio MRS), incluindo cerca de 2,0 x IO8, 3,0x 10a, 4,0 x IO8, 5,0 X IO8, 6,0 x IO8, 7,0 X IO8, 8,0 x IO8,9,0 x 108, 1,0 x IO9 ou mais ufc/ml. Em modalidadesespecíficas, a concentração é acima de 1,0 x 108 ufc/ml.

Modalidades adicionais incluem incubação em um meio que foiajustado até um pH de menos de 5, incluindo 4,5, 4,0, 3,5 e3,0. Em modalidades específicas, permite-se que o pH caianaturalmente em um intervalo de cerca de 7,0 a cerca de4,5. A incubação de células bacterianas sob essas ou outrascondições adequadas, antes do contato das bactérias com umsubstrato-alvo ("pré-condicionamento"), pode tanto aumentarquanto diminuir, dependendo das condições de incubação, aadesão das bactérias pré-condicionadas ao substrato-alvo.

Qualquer substrato de interesse pode ser empregado,incluindo, por exemplo, uma célula do trato gastrintestinalou do trato urogenital.

Um aumento da adesão compreende qualquer aumentoestatisticamente significativo da adesão a um substrato-alvo, quando comparado a um controle apropriado (porexemplo, bactérias que não foram expostas às condiçõesadaptáveis de adesão). Em modalidades específicas, oaumento pode compreender, sem limitação, pelo menos emtorno de 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250% oumaior. Um aumento da adesão pode ser testado in vítro, porexemplo, por contato da bactéria pré-condicionada a um alvoadequado (ou seja, células epiteliais ou mucosas) econtagem do número de bactérias que aderem ao substrato-alvo. Um aumento da adesão pode ser testado in vivo pormonitoramento da resposta do hospedeiro à exposição àbactéria pré-condicionada. Por exemplo, a adesão de umabactéria probiótica que foi pré-condicionada sob condiçõesadaptáveis de adesão pode ser avaliada pelo monitoramentoda melhora das propriedades probióticas, por exemplo,função intestinal e estabilidade aumentadas; proteçãoaumentada contra doenças infecciosas e não infecciosas;modulação do sistema imunológico; alívio da intolerância àlactose; melhora da digestão e da absorção de nutrientes;

colesterol sangüíneo reduzido; risco reduzido à alergia; erisco reduzido de infecções do trato urinário. Métodosadicionais para a medida da adesão bacteriana in vivo sãodescritos em Leffler, e cols. (1995) Methods Enzymol. 253:206-220.

Em algumas modalidades, um aumento da adesãocompreende a modulação da expressão de pelo menos um dosIds. de Seq. NoS: 19, 20, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38, ouvariantes e fragmentos destes. Modalidades adicionaiscompreendem a modulação da expressão de 2, 3, 4 ou maisdessas seqüências. Uma modulação da adesão pode ser medidacomparando-se a expressão dos polinucleotídeos da invençãoem uma bactéria na qual os polinucleotídeos foramintroduzidos com a expressão do mesmo polinucleotídeo(s) emuma bactéria de controle, como definido em outra seçãodesta especificação. Métodos para a medida da expressãodessas seqüências são conhecidos na técnica e sãodiscutidos em outra seção desta especificação.

ii. Modulação da produção de AI-2

As composições e os métodos da presente invenção podemser usados para modular a produção de AI-2 em bactérias.

"Modular", "alterar" ou "modificar" significa a supra- ouinfra-regulação de uma atividade biológica-alvo,particularmente a supra-regulação da atividade. Moléculasde ácido nucléico e polipeptídeos da invenção são úteis namodificação das atividades biológicas de bactérias de ácidolático, especialmente bactérias de ácido lático que sãousadas para a fermentação de alimentos com característicasnutricionais ou que promovem a saúde. É englobada a supra-ou infra-regulação da expressão por um polinucleotídeo dapresente invenção. A supra-regulação pode ser obtidafornecendo-se múltiplas cópias gênicas, modulando-se aexpressão por modificação de elementos reguladores,promovendo-se mecanismos de transcrição ou tradução, ou poroutros meios. A infra-regulação pode ser obtida com autilização de técnicas conhecidas anti-senso e desilenciamento gênico.

Em modalidades específicas, a invenção fornece umabactéria que compreende pelo menos uma molécula de ácidonucléico heterólogo relacionada ao AI-2 (ou seja, Id. deSeq. N° : 1, 3, 13, 15 ou 21), ou variantes biologicamenteativas ou fragmentos destas. Modalidades adicionais incluemuma bactéria que compreende pelo menos duas, pelo menostrês, pelo menos quatro ou pelo menos cinco moléculas deácido nucléico relacionadas ao AI-2, como descrito acima. Aexpressão dessas seqüências heterólogas na bactéria produzum nível aumentado de auto-indutor-2, quando comparada comuma bactéria de controle adequada. Como aqui usado, umaumento em auto-indutor-2 compreende qualquer aumentosignificativo em AI-2 em relação ao controle. Emmodalidades específicas, o aumento pode compreender, semlimitação, um aumento de pelo menos cerca de 90%, 100%,120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250% ou mais na produção deAI-2, quando comparado a um controle apropriado. Métodospara testar esse aumento na produção de AI-2 são discutidosdetalhadamente em outra seção desta especificação.

As bactérias da invenção que possuem o aumento daprodução de AI-2 podem exibir adesão aumentada a umsubstrato-alvo e/ou também exibir tolerância aumentada aoestresse.

Micróbios que expressam o polipeptídeos da presenteinvenção são úteis como aditivos no processamento delaticínios e de fermentação. As seqüências depolinucleotídeos, polipeptídeos codificados emicroorganismos que os expressam são úteis na fabricação deprodutos derivados do leite, tais como queijos, iogurte,produtos fermentados do leite, coalhadas e soro do leite.Microorganismos que expressam polipeptídeos da invençãopodem ser organismos probióticos, uma bactéria de ácidolático ou qualquer outro hospedeiro bacteriano deinteresse.

iii. Melhora da tolerância ao estresse e/ou da adesão

Como discutido anteriormente, a presente invençãofornece bactérias que possuem maior tolerância ao estressee/ou atividade de adesão. Como aqui usado, uma melhora daadesão a um substrato-alvo compreende qualquer aumentosignificativo da adesão ao substrato-alvo, incluindo, semlimitação, um aumento de 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%,200%, 250% ou mais da adesão, quando comparado a umcontrole apropriado. Qualquer substrato de interesse podeser empregado, incluindo, por exemplo, uma célula do tratogastrintestinal ou do trato urogenital. Em modalidadesespecíficas, a célula compreende uma célula epitelial ouuma célula mucosa. Reconhece-se ainda que a célula pode sercolocada em contato com a bactéria tanto in vitro quanto invivo.

Como aqui usado, uma maior tolerância ao estresse deuma bactéria compreende qualquer aumento significativo nasobrevida da bactéria sob condições de estresse, incluindo,sem limitação, um aumento de aproximadamente 90%, 100%,120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250% ou mais na sobrevida,quando comparado a um controle apropriado.

Uma bactéria probiótica da invenção que possui adesãoaumentada e/ou tolerância ao estresse aumentada é útil napromoção da saúde de um indivíduo. Embora sem se prender aum mecanismo de ação específico, bactérias probióticas quepossuem essas características aprimoradas medianteadministração a um indivíduo podem bloquear a adesão ecompetir com patógenos; estimular defesas imunológicas dacélula hospedeira; e/ou desencadear eventos de sinalizaçãocelular que "silenciam" a produção de fatores de virulênciapelos patógenos. Dessa forma, o aumento da tolerância aoestresse e/ou a atividade de adesão de um organismoprobiótico irá ainda auxiliar na redução do risco deinfecção do intestino, trato urogenital e locais deferidas.

As bactérias probióticas que possuem a tolerância aoestresse aumentada e/ou adesão aumentada podem seradministradas a qualquer indivíduo que delas necessite. Porexemplo, o indivíduo pode compreender um mamífero, um serhumano, um animal doméstico ou um animal agrícola. Aadministração pode ser nasal, oral, vaginal ou anal. Noscontextos em que a administração mucosa não é preferida, abactéria pode ser administrada por outro meio adequado,dentro da capacidade daqueles habilitados na técnica, ouseja, vias parentais (endovenosa, intraperitoneal,subcutânea, intramuscular).

Reconhece-se que as bactérias da invenção que possuema tolerância ao estresse aumentada e/ou adesão aumentadapodem ainda expressar pelo menos um polinucleotídeo e/oupolipeptídeo que tenha atividade terapêutica. O termo"atividade terapêutica" significa que o efeito biológico,quando o polipeptídeo é liberado a um indivíduo, é benéficopara aquele indivíduo. A administração é preferivelmente emuma "quantidade terapeuticamente eficaz", que é suficientepara mostrar benefício ao indivíduo. Tal benefício pode serpelo menos a melhora de pelo menos um sintoma. Em umcontexto profilático, a quantidade pode ser suficiente parareduzir o efeito deletério sobre o indivíduo de um ataquepatogênico subseqüente, por exemplo, pela intensificação daresposta imune. A quantidade efetiva administrada, a taxa ea duração da administração dependerão do objetivo daadministração, por exemplo, do efeito biológico buscado àluz da natureza e gravidade do ataque, e é objeto deotimização de rotina. A prescrição do tratamento, incluindovacinação profilática, por exemplo, decisões sobre adosagem etc, está dentro da responsabilidade dos médicos ede outros profissionais da área médica.

Polinucleotídeos e/ou polipeptídeos que têm atividadeterapêutica e podem ser expressos nas bactérias probióticasque possuem atividade de adesão aumentada ou tolerância aoestresse aumentada podem incluir, por exemplo, insulina,hormônio do crescimento, prolactina, calcitonina, hormônioluteinizante, hormônio da paratireóide, somatostatina,hormônio estimulante da tireóide, polipeptídeo intestinalvasoativo, uma citocina estrutural do grupo 1 que adota umaestrutura em feixe helicoidal antiparalela 4 alfa como, porexemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10,IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-y, EPO, G-CSF,LIF, OSM, CNTF, GH, PRL ou IFN-a/p, a família de citocinasTNF, por exemplo, TNFct, TNFp, CD40, CD27 ou ligantes FAS, afamília de citocinas IL-1, a família de fator decrescimento de fibroblastos, os fatores de crescimentoderivados de plaquetas, fator de transformação docrescimento beta e fatores de crescimento de nervos, umacitocina estrutural do grupo 3 que compreende moléculas a/Pde cadeia curta, que são produzidas como grandes moléculasprecursoras transmembrana em que cada uma contém pelo menosum domínio EGF na região extracelular, por exemplo, afamília de citocinas do fator de crescimento epidérmico, asquimiocinas caracterizadas por possuírem seqüências deaminoácidos agrupadas em torno de resíduos conservados decisteína (os subgrupos de quimiocina C--C ou C--X--C) ou ascitocinas relacionadas à insulina, uma citocina estruturaldo grupo 4 que exibe estruturas em mosaico, tais como asheregulinas ou neuregulinas compostas por domíniosdiferentes, por exemplo, EGF, domínios imunoglobulina-li&ee kringle. Alternativamente, o polipeptídeo biologicamenteativo pode ser um receptor ou antagonista parapolipeptídeos biologicamente ativos, como definidos acima.

Em modalidades específicas, o polipeptídeo que possuiatividade terapêutica compreende um antígeno. Parapolipeptídeos terapêuticos adicionais que podem serexpressos em bactérias não patogênicas, veja, por exemplo,Pedido U.S. 20030202991; Vandenbroucke e cols. (2004)Gastroenterology 127: 667-8;. Huyghebaert e cols. (2005)Eur. J. Pharm. Biopharm. 59: 9-15; Steidler e cols. (2000)Science 289: 1.352-1.355; Steidler e cols. (2001) TheScientific World 1: 215-217; Pedido U.S. N° 20020019043;cada um deles aqui incorporado por referência em suatotalidade. Reconhece-se que, em aplicações específicas, opolipeptídeo terapêutico pode ser projetado para sersecretado pelas bactérias probióticas.

iv. Método de raatreamento

São fornecidos métodos de rastreamento parasubstâncias químicas ou condições ambientais que aumentem aadesão de uma bactéria a um substrato. O método compreendesubmeter a bactéria a uma condição ambiental suspeita deaumentar a adesão e/ou suspeita de aumentar a produção deAI-2; e o contato da referida bactéria com o substrato. Umaumento da adesão da bactéria submetida à condiçãoambiental ao substrato, comparada com a adesão da mesmabactéria que não foi submetida às condições ambientais,indica que a condição ambiental é eficaz no aumento daadesão da bactéria.

Diversos candidatos a substâncias químicas oucondições ambientais podem ser empregados nesse método derastreamento. Tais condições podem incluir, sem limitação,indutores/supressores de AI-2 ou de qualquer gene envolvidona produção de AI-2, agentes microbiológicos (por exemplo,organismos procarióticos e eucarióticos), temperatura,concentração, tempo de incubação em condições adaptáveis deadesão, composição dos meios de incubação (por exemplo,presença, abundância e/ou tipo de fatores de crescimento,carboidratos, aminoácidos, sal, minerais e semelhantes) ,densidade celular ou pH. Um agente candidato pode ser umcomposto químico, uma mistura de compostos químicos ou umamacromolécula biológica. Tais agentes candidatos podemestar contidos em vários agentes bancos incluindo, porexemplo, bibliotecas de compostos, bibliotecas de peptídeose semelhantes.

As condições ou os compostos identificados por esseprocesso estimularão bactérias, incluindo bactérias tantorecombinantes quanto não recombinantes do tipo selvagem,para produzir AI-2, ou para promover a adesão ou formaçãode biopelícula para uso em fermentação ou bactériasprobióticas, ou em qualquer outro método aqui descrito.

A presente invenção é explicada com mais detalhes nosexemplos apresentados abaixo.

EXPERIMENTALExemplo 1

Análise "Gapped BlastP" de seqüências de aminoácidos

As seqüências da invenção foram alinhadas usando ométodo de alinhamento "Gapped BlastP" e parâmetros aquiapresentados. A Tabela 1 resume os resultados de "TopBlast" para essas seqüências.

Um alinhamento "Gapped BlastP" da seqüência deaminoácidos mostrou que o Id. de Seq. N° : 14 (372aminoácidos, ORF LBA1080) tem cerca de 55% de identidadedos aminoácidos 11-371 com uma proteína de Leuconostocmesenteroides subsp. mesenteroides, que é uma proteína demetionina sintase II (cobalamina-independente) (N° deAcesso ZP_00064070.1), cerca de 47% de identidade dosaminoácidos 5-372 com uma proteína de Lactobacillusgasseri, que é uma proteína de metionina sintase II(cobalamina-independente) (N° de Acesso ZP_00046311.1) ,cerca de 46% de identidade dos aminoácidos 7-372 com umaproteína hipotética de Chlamydophila pneumoniae (N° deAcesso NP_224351.1), 44% de identidade dos aminoácidos 4-372 com uma proteína hipotética de Lactobacillus johnsonii(N° de Acesso NP_965623.1) e 45% de identidade dosaminoácidos 9-372 com uma proteína de Oenococcus oeni, queé uma proteína de metionina sintase II (cobalamina-independente) (N° de Acesso ZP_00069898.1).

Um alinhamento "Gapped BlastP" da seqüência deaminoácidos mostrou que o Id. de Seq. N°: 16 (157aminoácidos ORF LBA1081) tem cerca de 87% de identidade dosaminoácidos 1-157 com uma proteína de Lactobacillusjohnsonii, que é uma proteína de produção de auto-indutor-2LuxS (N° de Acesso NP 965624.1), cerca de 87% de identidadedos aminoácidos 1-157 com uma proteína de Lactobacillusgasseri, que é uma proteína LuxS envolvida na síntese deauto-indutor AI2 (N° de Acesso ZP_00046310.1), cerca de 76%de identidade dos aminoácidos 4-157 com uma proteína deStreptococcus bovis, que é uma sintase LuxS de auto-indutor2(N° de Acesso dbj|BAD06876.1), 77% de identidade dosaminoácidos 1-157 com uma proteína de Lactobacillusplantarum, que é uma proteína de produção de auto-indutor(N° de Acesso NP_784522.1) e 73% de identidade dosaminoácidos 4-157 com uma proteína de Streptococcuspyogenes, que é uma proteína de produção de auto-indutor-2(N° de Acesso NP_269689.1).

Um alinhamento "Gapped BlastP" da seqüência deaminoácidos mostrou que o Id. de Seq. N° : 18 (444aminoácidos, ORF LBA16 9) tem cerca de 95% de identidade dosaminoácidos 49-444 com uma proteína de Lactobacillusacidophilus, que é um precursor da proteína "S-layer" (N°de Acesso sp|P3 582 9|SLAP_LACAC), cerca de 67% de identidadedos aminoácidos 49-443 com uma proteína de Lactobacillushelveticus, que é uma proteína da camada de superfície (N°de Acesso emb | CAA62606.1) , cerca de 67% de identidade dosaminoácidos 49-443 com uma proteína de Lactobacillushelveticus, que é uma proteína da camada de superfície (Nosde Acesso emb|CAB46984.1; AJ388558) , 66% de identidade dosaminoácidos 49-443 com uma proteína de Lactobacillushelveticus, que é uma proteína da camada de superfície (N°de Acesso emb|CAB46985.1) e 66% de identidade dosaminoácidos 49-443 com uma proteína de Lactobacillushelveticus, que é uma proteína da camada de superfície (N°de Acesso emb|CAB46986.1).Um alinhamento "Gapped BlastP" da seqüência deaminoácidos mostrou que o Id. de Seq. N°: 20 (566aminoácidos, ORF LBA1148) tem cerca de 69% de identidadedos aminoácidos 4-564 com uma proteína hipotética deLactobacillus johnsonii (N° de Acesso NP_965038.1), cercade 66% de identidade dos aminoácidos 4-564 com uma proteínade Lactobacillus gasseri, que é uma proteína de ligação deRNA prevista homóloga a um snRNP eucariótico (N° de AcessoZP_00045959.1), cerca de 41% de identidade dos aminoácidos4-566 com uma proteína de Enterococcus faecium, que é umaproteína de ligação de RNA prevista homóloga a um snRNPeucariótico (N° de Acesso ZP_00037499.1), cerca de 41% deidentidade dos aminoácidos 4-566 com uma proteína deEnterococcus faecalis, que é homóloga a uma proteína deligação de fibronectina/fibrinogênio (N° de AcessoNP_814975.1) e cerca de 41% de identidade dos aminoácidos4-557 com uma proteína de Lactobacillus plantarum, que éuma proteína de aderência (N° de Acesso NP_785358.1).Tabela 1. Resultados de "Top Blast" para seqüências de proteína da invenção

<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>Análise PFAM de seqüências de aminoácidos

O Id. de Seq. N° : 2 (231 arainoácidos, ORF LBA820)contém um domínio PNP_UDP_1 previsto em torno dosaminoácidos 2 a 222, e é um membro da família de 5'-metiladenosina fosforilase (MTA fosforilase) (Acesso PFAMPF01048).

O Id. de Seq. N°: 4 (314 aminoácidos, ORF LBA931)contém um domínio PrmA em torno dos aminoácidos 6 a 312, eé um membro da família da proteína ribossômica Lllmetiltransferase (PrmA) (Acesso PFAM PF06325).

O Id. de Seq. N° : 14 (372 aminoácidos, ORF LBA1080)contém um domínio Methionine_synt previsto em torno dosaminoácidos 11 a 369, e é um membro da família da proteínametionina sintase independente de vitamina B12 (Acesso PFAMPF01717).

O Id. de Seq. N° : 16 (157 aminoácidos ORF LBA1081)contém um domínio LuxS previsto localizado em torno dosaminoácidos 2 a 155, e é um membro da família da proteínaLuxS (LuxS) (Acesso PFAM PF02664).

O Id. de Seq. N° : 20 (566 aminoácidos, ORF LBA1148)contém um domínio FbpA previsto em torno dos aminoácidos 1a 425, e é um membro da família da proteína de ligação defibronectina A (FbpA) (Acesso PFAM PF05833).

O Id. de Seq. N° : 22 (399 aminoácidos, ORF LBA1622)contém um domínio N-terminal S-adenosilmetionina sintaseprevisto em torno dos aminoácidos 2-102 (Acesso PFAM00438), um domínio central S-adenosilmetionina sintase emtorno dos aminoácidos 124-243 (Acesso PFAM 02772) e umdomínio C-terminal S-adenosilmetionina sintase em torno dosaminoácidos 245-384 (Acesso PFAM 02773).Cepas bacterianas e condições de crescimento

Cepas de Lactobacillus foram cultivadas de formaanaeróbica a 37°C ou 42°C em caldo MRS (Difco LaboratoriesInc., Detroit, MI) ou, quando apropriado, em MRSsuplementado com ágar 1,5%. Escherichia coli foi propagadade forma aeróbica em meio de Luria-Bertani (LB, Difco) ouem meio LB suplementado com ágar 1,5% a 37°C. Meio deinfusão de coração-cérebro (BHI, Difco) suplementado comágar 1,5% e 150 ug/ml de eritromicina (Em) foi usado paraseleção de transformantes de E. coli. Meio de Bioensaio deAuto-Indutor (AB) (Bassler e cols. (1993) Mol. Microbiol.9: 773-786) foi usado para a propagação de todas as cepasde Vibrio harveyi. Quando apropriado, cloranfenicol (Cm,5,0 ug/ml) e Em (5,0 ^g/ml ou 150 (Kj/ml) foram usados paraseleção. As Unidades de Formação de Colônias (UFC) por mlforam determinadas com diluições apropriadas usando um"Whitley Automatic Spiral Plater" (Don Whitley ScientificLimited, West Yorkshire, Inglaterra).

Tabela 2. Cepas bacterianas e plasmideos usados

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>

Cultura de tecido

As células Caco-2 (ATCC HTB-37, Rockville, MD) foramusadas apenas entre a 40* e a 50° passagens. Todos osreagentes usados na manutenção de células Caco-2 foramobtidos de Gibco (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Ascélulas cresceram rotineiramente em atmosfera de 95% de ar-5% de C02 em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado comsoro fetal bovino 20% (v/v) inativado (56°C, 30 minutos)(FBS), 0,10 mM de aminoácidos não essenciais e 1,0 mM depiruvato de sódio. As monocamadas foram submetidas àtripsina por 10 minutos, contadas usando um hemocitômetro,e semeadas a 1,3 x IO5 células/poço em 2,0 ml de meio decultura de células. As células cresceram em lamínulasplásticas de 15 mm "Thermanox" (Nalge Nunc International,Rochester, NY) em placas de cultura tratadas de 12 poços"Costar" (Corning Inc., Acton, MA). O meio foi substituídoa cada dois dias e todos os ensaios de aderência foramrealizados após 14 dias de incubação.

Ensaio de aderência

A adesão de cepas de Lactobacillus às células Caco-2foi examinada de acordo com o método descrito previamente(Buck e cols. (2005) Appl. Environ. Microbiol. 71: 8.344-8.351J. Resumidamente, células bacterianas em fase logmédio (OD600 0, 6) foram preparadas em 10 ml de MRS com 3,0Hg/ml de Em para manter pressão seletiva sobre osintegrantes. As células foram removidas por centrifugaçãopor 10 minutos a 4.000 x g, e lavadas duas vezes com sorofisiológico tamponado com fosfato (PBS). Os péletesbacterianos foram ressuspensos em 5 ml de MRS fresco, antesda aderência. Para condições adaptáveis de adesão, péletescelulares de culturas em fase log médio foram ressuspensasem 1 ml de MRS fresco a -1,0 x IO9 ufc/ml e incubadas por 1hora a 37°C. As células foram centrifugadas novamente, eressuspensas em 5 ml de MRS fresco, antes da adição àsmonocamadas. Monocamadas de Caco-2 com quinze dias foramlavadas duas vezes com PBS, e tratadas com uma suspensãobacteriana em uma concentração de 4 x IO8 UFC/ml. Asbactérias foram incubadas na monocamada por 1,5 hora a 37°Cem uma mistura (1:2 v/v) de MRS e meio de cultura delinhagem celular. Após incubação, as monocamadas foramlavadas cinco vezes com PBS, fixadas em metanol e coradaspor Gram. As células bacterianas aderentes foram entãoenumeradas microscopicamente. As lamínulas em duplicataforam contadas para cada experimento. Os dados finaisapresentados coletivamente representam pelo menos 3experimentos independentes em duplicata. As contagenstotais para cada lamínula foram usadas, e a adesão foiexpressa como percentual (%) da cepa de controle NCK1398(Russell e Klaenhammer (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:4.361-4.3 64) que carrega uma inserção no gene lacL (0-galactosidase). Usando esse controle, todas as culturasmutantes e o controle parente puderam ser preparados com Empara manter pressão seletiva sobre o integrante LuxS". Oprotocolo de adesão é apresentado na Figura 2.

Resposta adaptável à adesão

Dez ml de células em fase log (OD600 0 , 7) foramcoletados por centrifugação e ressuspensos em 1 ou 10 ml demeio de crescimento Mann-Rogosa Sharpe (MRS) fresco eincubados por 1 hora a 37°C. Aquelas ressuspensas em 10 mlsão representadas como "condições de controle" (Figura IA),enquanto aquelas ressuspensas em 1 ml são as "condiçõesadaptáveis de adesão" (Figura 1B) . Para as finalidades dapresente invenção, tanto as condições de incubação quanto aressuspensão no volume menor (mais concentrado) de meio(por exemplo, 1 ml de MRS para o grupo de AAR ver sus 10 mlMRS para o grupo de controle) são consideradas condiçõesadaptáveis de adesão. As células concentradas e incubadasexibiram um aumento significativo na adesão (Figura 1) . Onível de aderência para as células concentradas e incubadasfoi pelo menos 20 vezes maior do que das células decontrole não concentradas e incubadas, embora o mesmonúmero de células bacterianas tenha sido adicionadoinicialmente a cada poço. Em cada experimento, as célulasforam ressuspensas em 5 ml de MRS fresco, e enumeradas paradeterminar a concentração absoluta de células adicionada àmonocamada Caco-2. Apenas os dados de aderência resultantesda adição de 3,8 x 108-4,2 x IO8 UFC/ml foram registrados.

Aumentos similares na aderência bacteriana não foramobtidos pela concentração de 10 X sem incubação, ouincubação (37°C, 1 hora) sem concentração das células mid-log, antes da aderência, ou por incubação (37°C, 1 hora)sem concentração em MRS ajustado até o pH 4,5 com ácidolático (dados não mostrados). Após a incubação de uma hora,o pH das células não concentradas era de 5,5, enquanto ascélulas concentradas reduziram o pH a 4,5. Portanto, acombinação de concentração celular e pH diminuído resultouem uma adaptação das células de L. acidophilus a um estadosignificativamente mais receptivo à aderência. Designamosesse fenômeno uma Resposta Adaptável à Adesão (AAR).

A Figura 3 mostra as propriedades de adesão da cepa decontrole e cepas mutantes selecionadas de L. acidophilusNCFM, com e sem exposição às condições adaptáveis deadesão. Os dados são registrados como contagem total decélulas em 17 campos em uma única lamínula. Cada ponto dosdados representa pelo menos dois experimentos em duplicata.L. acidophilus NCFM contendo uma integração no gene de p—galactosidase atua como o "controle" a fim de manter aseleção de Em durante crescimento de todos os mutantes.

Análise de microarranjos

Uma única cultura de 20 ml de L. acidophilus cresceuem MRS até OD60o de 0,6, dividida em duas alíquotas de 10ml, e coletada por centrifugação por 8 minutos a 3.150 x g.

Uma alíquota foi ressuspensa em 10 ml de MRS fresco, e aoutra foi ressuspensa em 1 ml de MRS fresco. Ambas asculturas foram então incubadas por 1 hora a 37°C. Apósincubação, as células foram coletadas por centrifugação econgeladas imediatamente em um banho de gelo seco-etanol. Oisolamento de RNA foi efetuado usando TRIzol (LifeTechnologies, Rockville, MD) de acordo com o protocolodescrito previamente (Azcarate-Peril e cols. (2005) Appl.Environ. Microbiol. 71: 5.794-5.804). A pureza e aconcentração do RNA foram determinadas por eletroforese emgéis de agarose e medidas padronizadas doespectrofotômetro.

Quantidades idênticas (25 (ig) de RNA total forammarcadas com aminoalil por transcrição reversa comhexâmeros aleatórios na presença de amino-alil dUTP (SigmaChemical Co., St. Louis, MO), usando transcriptase reversaSuperscript II (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View,CA) a 42°C de um dia para o outro, seguido por marcação porfluorescência de cDNA com aminoalil com ésteres de Cy3 ouCy5 ativados por N-hidroxisuccinimida (Amersham PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ) . Sondas de cDNA marcadas forampurificadas com o uso do Kit de Purificação por PCR(Qiagen, Valencia, CA) . O acoplamento dos corantes Cy3 eCy5 ao cDNA marcado com AA-dUTP e a hibridização dasamostras aos microarranjos foram realizados usandoprotocolos padronizados. Informações adicionais sobre essesprotocolos podem ser encontradas na página da Internet doTIGR em www.tigr.org/tdb/microarray/protocolsTIGR.shtml. Asintensidades de fluorescência foram adquiridas usando umscanner de microarranjo "Packard Bioscience ScanArray 4000"(Global Medicai Instruments, Inc, Ramsey, MN) e processadascomo imagens TIFF. As intensidades dos sinais foramquantificadas com a utilização da suíte de programas "GSILuminomics QuantArray 3.0" (PerkinElmer Life and AnalyticalSciences, Inc., Boston, MA) . Duas lâminas (cada umacontendo arranjos em triplicata) foram hibridizadasreciprocamente para sondas marcadas com Cy3 e Cy5 porexperimento (swap de corante). Os spots foram analisadospor quantificação adaptiva (Azcarate-Peril e cols., 2005,supra). O nível de fundo local foi subseqüentementesubtraído das intensidades registradas do spot. Os dadosforam normalizados para a mediana. A mediana das seisproporções por gene foi registrada. A proporção entre osvalores médios absolutos de pixels para os spots replicadosde cada gene, com e sem tratamento, representava o aumento(em número de vezes) na expressão gênica. Também foramcalculados os intervalos de confiança e os valores P paraos aumentos com o uso de um teste t de duas amostras.Valores P de 0,05 ou menos foram consideradossignificativos (Tabela 3).Tabela 3. ORFs selecionados expressos diferencialmente sob condições adaptáveis de adesãoa

<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>

a ORFs mostrados em negrito na tabela 2 exibem um padrão de expressão similar a umaanálise de microarranjo prévia de L. acidophilus NCFM exposto a MRS acidificado até pH 4,5 (3) .A análise de microarranjo de L. acidophilus NCFMexposto às condições adaptáveis de adesão (Tabela 3) sugereuma produção aumentada de um sinal interespécies, auto-indutor-2 (AI-2). Os genes iniciais (metK) e finais (luxS)na via para a produção de AI-2 a partir de metionina (vejaa Figura 4) são significativamente induzidos.

Adicionalmente, foi induzido um agrupamento transportadorABC supostamente envolvido com a exportação de AI-2.

Via biossintética de auto-indutor-2

A análise adicional do genoma de L. acidophilus NCFMrevelou quatro ORFs (LBA1622, LBA0931, LBA0820, LBA1081)que exibem homologia para cada gene na via biossintéticapara a produção de AI-2 a partir de metionina (Figura 4) .

MetK converte metionina em S-adenosilmetionina (SAM) e ésupostamente codificado por LBA1622 (Id. de Seq. N° : 21).Um grupo metil é removido de SAM por uma metiltransferase

dependente de SAM (codificada por LBA931, Id. de Seq. N° :3), formando S-adenosilhomocisteína (SAH), que ésubseqüentemente detoxificada por uma MTA/SAH nucleosidase,Pfs (codificada por LBA820, Id. de Seq. N° : 1), formandoS-ribosilhomocisteína (SRH) e adenina. LuxS (codificado porLBA1081, Id. de Seq. N° : 15) converte SRH em homocisteína e4 , 5-diidroxi-2,3-pentanodiona, que circulariza,incorporando boro, para formar AI-2 (Winzer e cols. (2002)Microbiology 148: 909-922). Homocisteína é finalmentemetilada de volta à metionina por MetE (codificado porLBA1080, Id. de Seq. N° : 13) localizado diretamente acimado homólogo de luxS, LBA1081. Um terminador entre os doisORFs com uma energia livre de -16,2 kcal sugere que LBA1080e LBA1081 são expressos separadamente.A Tabela 4 lista outros lactobacilos, para os quais hádisponibilidade de dados de seqüências, com a via completapara a produção de AI-2 a partir de metionina.

Tabela 4 <table>table see original document page 103</column></row><table>

Os números de ORFs previstos que codificam proteínasque exibem similaridade para cada enzima na via para asíntese de AI-2 a partir de metionina são listados para L.acidophilus NCFM (Altermann e cols. (2005) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 102: 3.906- 3.912), Lactobacillus gasseri,Lactobacillus johnsonii NCC533 (Pridmore e cols. (2004)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101: 2.512-2.517) eLactobacillus plantarum WCFS 1 (Kleerebezum e cols. (2003)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 1.990-1.995). Prevê-se queL. acidophilus NCFM abrigue duas cópias de luxS, mas um dosORFs não contém sinais de expressão como, por exemplo,regiões promotoras ou de ligação ribossômica.

Produção de AI-2

A detecção de auto-indutor-2 do sobrenadante de cepasbacterianas selecionadas foi realizada como descritopreviamente (De Keersmaecker e Vanderleyden, 2003, supra),com as seguintes modificações. A detecção de AI-2 produzidopor bactéria de ácido lático pode ser problemática, emfunção do pH diminuído dos sobrenadantes de cultura gastos,e a repressão de catabólitos por glicose do operon lux nacepa repórter de V. harveyi BB17 0 (DeKeersmaecker eVanderleyden, 2003, supra). Conseqüentemente, todas aspopulações de Lactobacillus usadas para detecção de auto-indutor-2 cresceram em MRS modificado (mMRS) contendogalactose 1% em vez de glicose. Em pontos do tempoespecificados, foram coletadas alíquotas de 4 ml, a OD60ofoi medida e sobrenadantes livres de células foram isoladospor centrif ugação a 4.000 x g por 10 minutos. O pH dosobrenadante foi neutralizado até o pH 6,5 com 2 N de NaOHe ele foi filtrado através de uma membrana de 0,2 \m\m. Ossobrenadantes preparados foram estocados a 4°C até o finalda duração dos experimentos, e todas as amostras de cadacultura foram testadas em conjunto em placas demicrotitulação de 96 poços separadas. A cepa repórter de V.harveyi BB170 (Azcarate-Peril, 2005, supra) cresceu de umdia para o outro em meio de bioensaio de auto-indutor (AB) ,foi lavada com e ressuspensa em AB fresco até OD600 de 0,5.Dez \il de sobrenadante estéril foram misturados com 90 \xlde uma diluição 1/1.000 da cepa repórter BB170 em cada poçode uma placa de 96 poços. A luminescência foi medida a 30°Ca cada 10 minutos por 6 horas em uma leitora fluorescentede placa de microtitulação (FLOUStar Optima, BMGTechnologies, Durham, NC) . O aumento da indução foicalculado obtendo-se a média de pelo menos 6 pontos dotempo padronizados e dividindo-se o valor médio obtido dotipo selvagem pelo valor médio obtido pelo mutante LuxS".Cada amostra foi medida em pelo menos 3 poçosindependentes, e cada ponto dos dados representa 3 amostrasindependentes.A fim de determinar quando AI-2 foi produzido durantea fase de crescimento de L. acidophilus NCFM, foramcoletados sobrenadantes aO, 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24 36, e48 horas de culturas em triplicata. A produção de AI-2durante o crescimento de L. acidophilus é mostrada naFigura 5. Coincidindo com uma queda rápida no pH, ocorre umaumento notável na produção de AI-2 por toda a faselogarítmica de crescimento. Com a entrada na faseestacionaria, a atividade de AI-2 no sobrenadante mantém umnível constante por até 4 8 horas (Figura 5).

Inativação da inserção do gene luxS

Usando DNA cromossômico de L. acidophilus NCFM comomodelo, um fragmento interno de 471 bp de LBA1081 (luxS)foi amplificado usando PCR com iniciadores 1081-IF (51-GATCA GATCT AAGTT AAGGC ACCTT ACG - 3', Id. de Seq. N° : 23)e 1081-IR. (5'-GATCT CTAGA TTTCG AATGG GTCAT CAC - 3', Id.de Seq. N° : 24) . O fragmento interno foi clonado no vetorintegrativo pORI28 (Law, e cols. (1995) J. Bacteriol. 177:7.011-7.018) e subseqüentemente transformado poreletroporação em L. acidophilus NCFM contendo o plasmideoauxiliar sensível à temperatura pTRK669 (Russell eKlaenhammer, 2001, supra). Foram então realizadas etapas deacordo com Russell e Klaenhammer, 2 001, supra para seleçãode integrantes. A integração bem sucedida do plasmideo foiconfirmada por PCR e análise de hibridização Southern defragmentos de junção usando protocolos padronizados.

A cepa mutante LuxS", NCK 1765, foi testada quanto àhabilidade para se aderir às células Caco-2 usando célulasbacterianas da fase de crescimento de log médio e célulasexpostas às condições AAR. Quando as células de fase logmédio foram adicionadas diretamente às células Caco-2 dafase log médio, foi observada uma diminuição de 58% naadesão (teste t de Student, P < 0,001) para a cepa mutanteLuxS- (Figura 6), comparada com o controle. Um derivado deL. acidophilus NCFM (NCK1398) que abriga uma integração emP—galactosidase foi usado como controle, de forma que apressão antibiótica pudesse ser mantida sobre o mutante e ocontrole.

Conclusões

L. acidophilus NCFM responde às condições ambientaisde um modo que aumenta dramaticamente a habilidade doorganismo para aderir às células epiteliais intestinais, invitro. A análise de microarranjo de transcrição de umapopulação exposta a essas condições adaptáveis de adesãosugere que a produção de uma molécula de sinalização, AI-2,está aumentada. A análise do genoma de L. acidophilus NCFMidentificou todos os genes necessários para a produção deAI-2 a partir de metionina. A produção de AI-2 por L.acidophilus NCFM foi confirmada com o uso de uma ceparepórter de V. harveyi. Com a inativação do gene final navia, luxS, foi observada uma diminuição na adesão emcélulas em fase log, mas não foi observada nenhumadiferença na resposta adaptável de adesão da cepa mutanteLuxS", comparada com o controle. Esses dados sugerem que aadesão de lactobacilos ao epitélio intestinal pode envolveruma interação íntima de vários fatores. Embora asinalização mediada por AI-2 contribua para a habilidade deadesão de L. acidophilus NCFM, ela não é o único meio decomunicação dentro da população responsável pela respostaadaptável de adesão. Esses dados sugerem que a adesão delactobacilos ao epitélio intestinal pode envolver umainteração íntima de vários fatores.

Exemplo 2

A análise de microarranjo da expressão gênica afetadapor LuxS e AI-2 foi realizada em várias espéciesmicrobianas diferentes a fim de determinar a função de LuxSsobre processos celulares. A influência de AI-2 sobre E.coli K-12 crescida na presença e ausência de glicoserevelou expressão gênica alterada de genes relacionados aooperon lsr, ao metabolismo de metionina e à utilização decarbono (12, 32). Outro estudo ligou a produção de LuxS comgenes envolvidos no crescimento e divisão celular ao uso demicroarranjos de E. coli (9) . A análise de microarranjo datranscrição de um mutante LuxS" de Porphyromonas gingivalise seu tipo selvagem relacionou a participação de LuxS àresposta ao estresse daquele organismo (36). Além de cepasbacterianas patogênicas, várias cepas não patogênicasdemonstraram um fenótipo associado à produção de AI-2. Porexemplo, o desempenho ecológico de Lactobacillus reuteri notrato gastrintestinal murídeo estava alterado em um mutanteLuxS" (28) . Esse estudo utilizou um microarranjo de genomainteiro para identificar a expressão gênica influenciadapor LuxS em L. acidophilus NCFM. Vários genes envolvidoscom a resposta ao estresse, crescimento e metabolismo foramexpressos diferencialmente em uma cepa mutante LuxS". Aanálise fenotlpica de uma cepa mutante LuxS" examinou ainfluência de uma mutação luxS sobre a tolerância ao calore à bile de L. acidophilus NCFM.

Cepas bacterianas e condições de crescimento

Cepas de Lactobacillus foram cultivadas de formaanaeróbica a 37°C ou 42°C em caldo MRS (Difco LaboratoriesInc., Detroit MI) ou, quando apropriado, em MRSsuplementado com ágar 1,5%. Para detecção de AI-2, oslactobacilos cresceram em MRS modificado, seguindo osingredientes para MRS, exceto com a substituição degalactose 1% p/v no lugar de glicose. E. coli cresceu deforma aeróbica em meio de Luria-Bertani (LB, Difco) ou emmeio LB suplementado com ágar 1,5% a 37°C. Meio de InfusãoCérebro Coração (BHI, Difco) suplementado com ágar 1,5% e150 ug/ml de eritromicina (Em) foi usado para seleção detransf ormantes de E. coli. Meio de Bioensaio de auto-indutor (AB) (5) foi usado para a propagação de todas ascepas de Vibrio harveyi. Quando apropriado, cloranfenicol(Cm, 5,0 ug/ml) e Em (50 ug/ml ou 150 ug/ml) foram usadospara seleção. Foram determinadas unidades formadoras decolônias (UFC) por ml com diluições adequadas em caldo MRS10% usando um "Whitley Automatic Spiral Plater" (DonWhitley Scientific Limited, West Yorkshire, England).

Tabela 5. Cepas bacterianas e plasmídeos usados

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Técnicas de manipulação de DNA

DNA genômico total de Lactobacillus foi isolado deacordo com o método de Walker e Klaenhammer (31) . Foramutilizados protocolos padronizados para restrição porendonuclease, ligação, modificação e transformação de DNA(23). As preparações de plasmídeos com a finalidade derastrear transformantes de E. coli seguiram o método deZhou e cols. (37) . Preparações de plasmídeos em largaescala foram realizadas com o kit "QIAprep Spin" de acordocom as instruções do fabricante (QIAGEN Inc., Valencia,CA). As PCRs foram efetuadas de acordo com as recomendaçõesdo fabricante usando um sistema de PCR de Taq DNApolimerase (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) . Osiniciadores de PCR foram sintetizados por "Integrated DNATechnologies" (Coralville, IA) e, quando apropriado, foramprojetados sítios de restrição na extremidade 5' dosiniciadores para facilitar futuras etapas de clonagem.Foram extraídos fragmentos de DNA de géis de agarose 1,0%usando o kit de recuperação "Zymoclean Gel DNA Recoverykit" (Zymo Research, Orange, CA) . Foram preparadas célulasde Lactobacillus eletro-competentes como descrito porWalker e cols. (30) . A hibridização Southern de DNAgenômico foi realizada usando protocolos padronizados.

Tabela 6. Iniciadores usados neste estudo

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a Sítios de enzima de restrição usados para clonagem estãosublinhados.

Inativação de LuxS sem marcador

Uma cepa mutante LuxS" de L. acidophilus NCFM foiconstruída por eliminação de 97 bp dentro de luxS (LBA1081)de acordo com os protocolos descritos previamente (2, 6).Resumidamente, um fragmento de 1,243 bp contendo luxS foiamplificado usando iniciadores LuxS-EF e LuxS-ER (Tabela6). Cada fragmento foi subseqüentemente ligado a pORI28,nos sítios Xbal e BglII. Os transf ormantes foramselecionados em E. coli EC1000 e pORI::LuxSbig foi isolado.Foi realizada PCR Inversa ("Expand High Fidelity PCRsystem", Roche Applied Science, Indianapolis, IN) naqueleplasmídeo usando iniciadores LuxS-delF e LuxS-delR (Tabela6), cada um contendo sítios de reconhecimento de enzimaEcoRI na extremidade 5' . O produto de PCR de 2,7 kbpresultante foi limpo usando o kit de purificação de PCRQiagen, e digerido por 18 horas a 37°C com EcoRI. Apóspurificação em gel com o kit de recuperação "Zymoclean GelDNA Recovery Kit" (Zymogen) , o produto foi ligado a elepróprio por 16 horas a 16°C. O plasmídeo resultante,pTRK884, foi então transformado em E. coli EC1000, e aconstrução do plasmídeo foi confirmada com amplificação porPCR. L. acidophilus NCFM contendo o plasmídeo auxiliarsensível à temperatura, pTRK669, foi então eletro-transformado com pTRK884 e integrantes selecionados deacordo com o método descrito previamente por Russell eKlaenhammer (22) . Os integrantes selecionados forampassados seis vezes em meios não seletivos para permitir aocorrência do segundo evento de entrecruzamento, e depoisplaqueados em MRS desprovido de antibióticos. As colôniasforam rastreadas quanto à sensibilidade a Em, e a PCR dacolônia realizada com a utilização de iniciadores LuxS-delNF e LuxS-delNR, flanqueando a região eliminada. Aamplificação por PCR da região eliminada e ensaios dehibridização Southern usando um fragmento interno de luxScomo sonda confirmaram a eliminação por meio desubstituição de gene em NCK1818.

Até recentemente, a inativação gênica sítio-específicaem lactobacilos era realizada com o uso de estratégias deintegração de plasmídeos. A manutenção da integração deplasmídeo exige crescimento em meios seletivos. No entanto,tanto a integração de plasmídeo quanto o crescimentoseletivo podem influenciar os resultados da expressãogênica obtidos por análise de microarranjo. Dessa forma,foi usada uma estratégia sem marcador para inativar luxS(LBA1081) em L. acidophilus NCFM usando uma abordagem derecombinação homóloga com entrecruzamento duplo. O geneluxS da cepa mutante resultante, NCK1818, era desprovido deuma região interna de 97 bp, e continha um sítio derestrição EcoRI adicional. A região de eliminação foiselecionada para romper o quadro de leitura e resulta em umproduto gênico não funcional. A substituição gênica foiconfirmada por análise por PCR da região eliminada ehibridização Southern usando um fragmento interno de luxScomo sonda. NCK1818 era sensível a Em e não produziu AI-2,como determinado pelo ensaio de repórter de V. harveyi (5) .Previamente, o padrão de expressão de AI-2 por L.acidophilus NCFM foi determinado com a utilização de ummutante de integração luxS como controle negativo (8) . 0mesmo padrão de produção de AI-2 durante o crescimento deL. acidophilus NCFM foi observado com o uso de NCK1818 comocontrole negativo.

Detecção de AI-2

A detecção de auto-indutor-2 do sobrenadante de cepasbacterianas selecionadas foi realizada como descritopreviamente (8) . Resumidamente, os sobrenadantes depopulações bacterianas coletadas em cada ponto do tempoespecificado foram ajustados até o pH 6,5 com 2 N de NaOH,e filtrados através de uma membrana de 0,2 jam. A ceparepórter de Vibrio harveyi BB170 (3) cresceu de um dia parao outro em meio de bioensaio de auto-indutor (AB) , foilavada e ressuspensa em AB fresco até ODSOo 0,5. Dez j^l desobrenadante estéril da cultura de teste foram misturadoscom 90 ^1 de uma diluição 1/1.000 da cepa repórter BB170 emcada poço de uma placa de 96 poços. A luminescência foimedida a 3 0°C a cada 10 minutos por 6 horas em uma leitorade placa de microtitulação fluorescente (FLOUStar Optima,BMG Technologies, Durham, NC) . 0 aumento da indução foicalculado obtendo-se a média de pelo menos 6 pontos dotempo padronizados pela curva de luminescência de V.harveyi e dividindo-se o valor médio obtido pelo tiposelvagem pelo valor médio obtido pelo mutante LuxS". Ospontos do tempo foram selecionados quando a luminescênciaestava em um nível constante, antes de a cepa repórter terrespondido à produção de seu próprio AI-2. Cada amostra foimedida em pelo menos 3 poços independentes, e cada pontodos dados representa 2 experimentos independentes (Tabela 7) .Isolamento de RNA

Tanto L. acidophilus NCFM quanto NCK1818 foramtransferidos duas vezes de culturas de estoque congeladasem meio semidefinido usando galactose como fonte primáriade carbono para evitar a repressão de catabólito porglicose do operon lux na cepa repórter de V. harveyi. Umacultura de 400 ml de ambas as cepas foi inoculada a 1% deuma fase cultura de estacionaria (16 horas) e permitiu-se ocrescimento a 3 7°C. Em OD60o 0,2, uma amostra de 5 ml foiobtida para determinação de UFC e medida do pH. Seisamostras de 10 ml de cada cepa foram então resfriadasrapidamente em gelo seco, e os péletes celulares coletadosa 4°C por centrif ugação por 10 minutos a 3.150 x g. Osobrenadante de cada cepa após centrif ugação em cada pontodo tempo foi retido para detecção de AI-2. Nos dois pontosde amostragem finais (OD600 0 , 7 e OD6oo 1,2), foramrecolhidas amostras de 5 ml de cada cultura paraplaqueamento e determinação do pH; duas amostras de 10 mlforam então coletadas de cada cultura, e tratadas comodescrito acima. O isolamento de RNA de péletes celularesfoi realizado como descrito previamente (3) usando TRIzol(Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD) . A pureza e aconcentração de RNA foram determinadas por eletroforese emgéis de agarose 1,0% e medidas padronizadas comespectrofotômetro. O RNA foi isolado de duas réplicasbiológicas de ambas as cepas.

Tabela 7 Condições de cultura de populações celularescoletadas para análise de microarranjo3

<table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table>

a Todos os valores representam a média e um desviopadrão calculados a partir de dados combinados obtidos deL. acidophilus NCFM e NCK1818 em três experimentosindependentes.

Produção de cDNA e hibridização de microarranjo

A análise da expressão gênica da cepa mutante LuxS" eda cepa do tipo selvagem em cada um dos três pontos deamostragem selecionados foi realizada com a utilização deum microarranjo de DNA de todo o genoma (3) . Os produtos dePCR de 1.889 ORFs previstos do genoma de L. acidophilusNCFM (1) foram spotted em triplicata em lâminas de vidro"ULTRA GAPS" (Corning Inc., Acton, MA). A síntese e amarcação do cDNA da primeira fita foram efetuadas com osistema de marcação "SuperScript Indirect cDNA LabelingSystem" (Invitrogen). Resumidamente, quantidades iguais (20(ag) de RNA foram marcadas com aminoalil por transcriçãoreversa com hexâmeros aleatórios na presença denucleotídeos modificados com amino, usando transcriptasereversa SuperScript III a 42 °C por 3 horas. O cDNA daprimeira fita foi purificado com colunas S.N.A.P.,precipitado, marcado com ésteres de Cy3 ou Cy5 ativados porN-hidroxisuccinimida (GE Healthcare Life Sciences,Piscataway, NJ) , e purificado novamente com colunasS.N.A.P. O cDNA marcado resultante foi hibridizado sobrelâminas de microarranjo de acordo com os protocolosapresentados por TIGR (www.tigr.org/tdb/microarray/protocolsTIGR.shtml) . Ashibridizações foram realizadas de acordo com um padrãoúnico round-robin, de forma que todas as comparaçõespossíveis de pareamento direto fossem feitas em um designnão equilibrado. Foi feito um total de quinze hibridizaçõesdiferentes em três pontos de amostragem diferentes (OD60o0,2, 0,7 e 1,2) e duas cepas diferentes (L. acidophilusNCFM e NCK1818).

Análise dos dados de microarranjo

As intensidades de fluorescência foram adquiridas como uso de um scanner de microarranjo "General ScanningScanArray 4000" (Packard Biochip BioScience, BiochipTechnologies LLC, Mass.) e processadas como imagens TIFF.As intensidades dos sinais foram quantificadas, incluindo asaturação de fundo, e foram obtidas médias dos spotsreplicados com o uso da suíte de programas "QuantArray 3.0"(Packard BioScience). Os dados brutos de intensidaderesultantes foram importados em SAS (SAS Institute, Cary,NC) , transformados para log2 e ajustados para análise devariancia de modelo misto de normalização (ANOVA) e fim decentralizar os dados para a intensidade média. Um ANOVA demodelo misto gene-específico foi então realizado nos dadosnormalizados em que o corante, a cepa e o tempo foramconsiderados efeitos fixos, e o efeito do arranjo foiconsiderado um efeito aleatório (34) . A diferençaresultante entre as estimativas do quadrado mínimo paradois tratamentos diferentes é análoga à proporçãotransformada para log2 da expressão gênica entre aquelesdois tratamentos. Foram calculadas diferenças para efeitodo corante, efeito da cepa, efeito do tempo e para o efeitocombinado de cepa e tempo, cepa*tempo. Foi realizado umteste t usando essas diferenças e seus erros-padrão, com P< 0,05 considerado significativo. Foram construídosgráficos Volcano para cada comparação usando a estimativa e-Log10 (valor P) com JMP 5.0 (SAS Institute) a fim devisualizar o contraste entre tratamentos e significânciaestatística dos resultados.

A fim de estudar os genes expressos diferencialmenteem resposta à produção de LuxS, foi desenvolvido um designde microarranjo que examinasse as diferenças na expressãoentre o tipo selvagem e LuxS" mutante na fase decrescimento inicial, média ou tardia - exponencial. Aprodução de AI-2 durante o crescimento foi determinadapreviamente para L. acidophilus NCFM (8). A partir dessesdados, foram selecionados três pontos de crescimento paraisolamento de RNA: OD600 0 , 2 , antes de o AI-2 ter seacumulado; OD6oo 0,7, durante a produção rápida de AI-2; eOD60o 1/2, quando a produção de AI-2 fica lenta e o nível deAI-2 no sobrenadante permanece elevado, mas constante. ORNA foi isolado por ambas as cepas em cada ponto do tempo,em duplicata, e a atividade de AI-2 determinada usando oensaio de repórter de V. harveyi. No total, foramcomparados seis pontos entre eles em todos os pares decomparações possíveis (15 hibridizações) . A análise dosdados de expressão foi realizada usando um ANOVA de modelomisto em dois estágios e as proporções da média do quadradomínimo foram consideradas significativas com um aumento de1,8 vezes e P < 0,05 (Tabela 9).

Cada ORF expresso diferencialmente nos primeiros doispontos do tempo foi agrupado de acordo com suaclassificação COG (Fig. 8) . As duas classificações COG como maior número de genes superexpressos em NCFM, totalizando42% do total, foram da estrutura e biogênese ribossômica detradução (J) e de replicação, recombinação e reparo (L). Emcontraste, 4 0% dos genes superexpressos no mutante LuxS"foram categorizados como função desconhecida (S) . Aexpressão aumentada de genes relacionados ao crescimento emetabolismo normais em NCFM, comparado com o mutante LuxS,sugere que LuxS influencia positivamente a expressão demuitos desses genes direta ou indiretamente. A partirdesses dados, não está clara a função dos genes cujaexpressão foi influenciada negativamente por LuxS. Nãohouve genes significativamente expressos diferencialmentesob as condições testadas em NCFM ou no mutante LuxS" emfase log tardio (OD60o 1/2), quando o nível de AI-2 no meionão está mais crescendo.

Um design de microarranjo round-robin combinado comanálise de modelo misto foi usado para comparar o efeito dacepa, tempo e o efeito combinado tanto da cepa quanto detempo (cepa*tempo) sobre a expressão gênica de L.acidophilus NCFM. Uma comparação cepa a cepa revelou que,antes de AI-2 começar a se acumular apreciavelmente no meio(ODe0o 0,2), 84 ORFs foram significativamente superexpressosem NCFM (Tabela 8a) , enquanto somente 13 ORFs foramsignificativamente superexpressos no mutante LuxS" (Tabela8b) . Os genes mais altamente induzidos em NCFM, comparadocom o mutante em fase log inicial (OD6oo 0,2), foram relA(3,14 vezes), supostamente relacionado à transdução desinal, e IF-2 (3,14 vezes), um suposto fator de iniciaçãoda tradução. Na fase log médio (OD60o 0,7), à medida que AI-2 se acumulava rapidamente, apenas 3 ORFs foramsignificativamente superexpressos em NCFM (LBA1497,LBA1796, LBA1798) e 4 ORFs (LBA0026, LBA0089, LBA0568, eLBA1596) superexpressos no mutante LuxS". Curiosamente, oúnico ORF que era significativamente expressodiferencialmente nos dois primeiros pontos do tempo foilabT (LBA1796), um transportador ABC previamente implicadona exportação de bacteriocina (10). Na fase log inicial,labT foi superexpresso em NCFM 2,53 vezes, e, em fase logmédio, ele foi superexpresso 2,10 vezes, comparado com omutante LuxS". Um regulador da resposta (LBA1798), de umistema regulador vizinho de dois componentes, também foisuperexpresso em NCFM, comparado com o mutante em fase logmédio. Em relação a esse fato, a cepa LuxS" foi analisadaquanto à produção de bacteriocina, e constatou-se que eladesencadeia o mesmo nível de produção de bacteriocina que otipo selvagem. Adicionalmente, uma cepa mutante isogênicalabT foi testada quanto à produção de AI-2, e verificou-seque ela produz AI-2 no mesmo nível que o tipo selvagem.

Tabela 8a. Classificação COG de genes expressosdiferencialmente

<table>table see original document page 119</column></row><table>Controle do ciclo celular, divisão celular, divisão cromossômica

<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table><table>table see original document page 123</column></row><table>

Suposta identificação por anotação manual paraaquele gene ou ORF

b Proporção de médias de quadrados mínimos deestimativas log2 entre L. acidophilus NCFM do tipo selvageme a cepa mutante LuxS". A proporção de corte para adiferença do aumento foi de 1,8 e P < 0,05.

Tabela 8b. Classificação COG de genes expressosferencialmente

<table>table see original document page 124</column></row><table><table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table>

a Suposta identificação por anotação manual paraaquele gene ou ORF

b Proporção de médias de quadrados mínimos deestimativas log2 entre L. acidophilus NCFM do tipo selvageme a cepa mutante LuxS". A proporção de corte para adiferença do aumento foi de 1,8 e P < 0,05.

Tabela 9. Resultados do microarranjo

<table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 128</column></row><table><table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table><table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table>

A trealose hidrolase, treC (LBA1014), foisuperexpressa 2,56 vezes em NCFM, comparada com a cepamutante LuxS" em fase log inicial. Pesquisa prévia relatoucrescimento deficiente em trealose de um mutante de L.acidophilus TreC" (11) . Portanto, foi medida a taxa decrescimento máximo de L. acidophilus NCFM e do mutanteLuxS" em meio mMRS contendo vários açúcares a fim dedeterminar a possível influência de uma mutação luxS sobrea utilização de açúcar (Tabela 10) . O crescimento não foiafetado pela mutação luxS quando as cepas cresciam em MRSou mMRS contendo glicose ou trealose. No entanto, o mutanteLuxS" exibiu uma menor taxa de crescimento máximo,comparada com NCFM tanto em lactose quanto em sacarose.

Tabela 10. Taxa de crescimento máximo específico (p. h"1) emvárias fontes de carboidratos

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* Identifica taxas de crescimento significativamentediferentes, como determinado pelo teste t de Student (P <0, 01)

a Composição do meio descrita acima

O perfil de transcrição de cada cepa da fase loginicial a tardio também foi examinado (Fig. 9). Um númerosimilar de genes, 27 em NCFM e 41 no mutante LuxS",aumentou em expressão da fase log inicial a médio em ambasas cepas. A expressão de 12 genes aumentou em ambas ascepas, e incluiu genes do metabolismo de açúcar (LBA0874,LBA1012, LBA1812, e LBA1974), e um suposto antígeno queapresenta reação cruzada com miosina (LBA555). Apenas 24genes na cepa do tipo selvagem, comparados com 97 genes nacepa mutante, diminuíram em expressão da fase log inicial amédio. Novamente, da fase log médio a tardio, a expressãode um número similar de genes aumentou em ambas as cepas,mas 45 genes diminuíram em expressão durante essa fase decrescimento no tipo selvagem, e somente 15 no mutante LuxS"

Esses resultados sugerem que AI-2 poderia ser responsávelpelo aumento ou manutenção da expressão de genes durante osestágios iniciais de crescimento. Quando AI-2 estádeficiente no meio, a expressão de um número significativode genes parece estar diminuída durante a fase log inicial.

Experimentos de estresse

L. acidophilus NCFM e NCK1818 cresceram em caldo MRS a37°C, até que a população alcançasse OD600 0, 2, 0,7 e 1,2, enesse ponto as células foram coletadas para experimentos detolerância ao estresse.

Tolerância à bile. Nos pontos de amostragempredeterminados, cada cultura foi diluída e plaqueada emduplicata em ágar MRS suplementado com 0,75, 1,0, ou 2,0%p/p de Oxgall (BD Biosciences, San Jose, CA) . As placasforam incubadas de forma anaeróbica por 4 8 horas, e foramcalculados a UFC/ml e o percentual de sobrevida. Cadaensaio foi realizado em triplicata.

Tolerância ao calor. Cada cepa cresceu em 250 ml decaldo MRS e, em cada ponto de amostragem, foram coletados10 ml de células de cada população por centrifugação a3.150 x g por 10 minutos a 21°C. Após centrifugação, osobrenadante foi descartado e os péletes celularesressuspensos em 10 ml de MRS fresco, pré-incubados a 55°C.Foram coletadas amostras em 0, 10, 20, 30 e 45 minutos, eelas foram diluídas e plaqueadas em duplicata. Cada ensaiofoi realizado em triplicata.

Análise estatística. Os dados obtidos dos experimentosacima foram analisados usando o teste t de Student, com P <0,05 sendo considerado significativo.

Foi testado o envolvimento de LuxS com váriasrespostas ao estresse de L. acidophilus NCFM. O crescimentoem ágar MRS suplementado com Oxgall 2,0% (bile frescadesidratada) diminuiu significativamente o crescimento domutante LuxS", comparado com NCFM, quando as populaçõesbacterianas foram plaqueadas a OD600 0,2. Quando as célulasforam plaqueadas de populações de OD60o 0,7, foi observadauma diminuição significativa no crescimento na cepa LuxS"em MRS suplementado com Oxgall 1,0%. As células coletadasdo ponto do tempo final, OD6oo 1/2, não mostraram diferençasno crescimento em Oxgall (Fig 10). Esses resultados indicamque a produção de AI-2 correlaciona-se com a tolerância àbile pela fase log médio, mas à medida que a população deLuxS" alcança a fase estacionaria, a sensibilidade à bileem função da ausência de AI-2 não está presente.

Adicionalmente, quando populações colhidas de OD6oo 0,2e OD60o 0,7 foram expostas ao estresse por calor de 55°C, omutante LuxS" foi mais sensível (Figura 11). As populaçõesde células do mutante LuxS" colhidas do ponto do tempofinal, OD6oo 1/2, não evidenciaram uma diminuiçãosignificativa, quando comparadas com NCFM. Esse padrão desobrevida ao estresse por calor implica ainda mais oenvolvimento de AI-2 com a resposta ao estresse durante asfases de crescimento de log inicial e médio, mas não àmedida que a população se aproxima da fase de crescimentoestacionário, quando as células eram inerentemente maistolerantes ao calor.

Produção de bacteriocinaCinco uL de L. acidophilus NCFM e NCK1818 foramespalhados sobre ágar MRS e incubados a 3 7°C de um dia parao outro em uma câmara anaeróbica. No dia seguinte, 100 \ilda cepa indicadora Lactojbacillus delbrueckii (NCK235) foramadicionados a 10 ml de ágar revestido com MRS derretido(0,75% p/v) e derramados igualmente sobre a superfície daplaca de ágar. Após 24 horas de incubação, foram avaliadaszonas de inibição que indicam atividade antagonística delactacina B.

Curvas de crescimento

L. acidophilus NCFM e NCK1818 foram transferidos trêsvezes de culturas de estoque congeladas em MRS e MRSmodificado (mMRS). O meio mMRS usado neste estudo seguiu osingredientes do MRS disponível comercialmente (Becton,Dickinson and Company, Sparks, MD), substituindo dextrosecom 1% p/v de glicose, lactose, trealose ou sacarose. Ascurvas de crescimento foram realizadas a 37°C em placas de96 poços (Corning) contendo 200 j^l de cada meiosemidefinido suplementado ou caldo MRS. Permitiu-se que asculturas crescessem por 16 horas, e a OD6oo foi medida acada 15 minutos em poços em triplicata. As placas foramincubadas a 37°C, e o crescimento foi automaticamentemonitorado pela determinação das alterações na A60o como umafunção do tempo usando uma leitora de placa demicrotitulação "FLUOStar OPTIMA" (BMG Labtech). A taxa decrescimento específico máximo foi calculada a partir dainclinação de uma linha de regressão linear durante ocrescimento exponencial com um coeficiente de correlação(r2) de 0,99. Cada ponto representava a média de trêsculturas independentes.Conclusões

Este pedido é o primeiro a relatar uma análise datranscrição do régulon LuxS em diferentes estágios decrescimento. Estudos de microarranjo prévios da expressãogênica modulada por AI-2 estudavam a resposta de uma cepamutante LuxS" ao AI-2 exógeno (De Lisa, e cols. (2001)Journal of Bacteriology 183: 5.239-5.247), ou identificavamum único ponto de crescimento e analisavam a diferença detranscrição entre um mutante de inserção e o tipo selvagem(Merritt, e cols. (2003) Infect Immun. 71: 1.972-9; Wang, ecols. (2005) Journal of Bacteriology 187: 8.350-8.360;Yuan, e cols. (2005) Infect. Immun. 73: 4.146-4.154).Embora essas abordagens possam identificar com sucessogenes regulados por AI-2 em pontos isolados, o perfil deexpressão representa somente uma visão instantânea dorégulon LuxS. A fim de se obter uma compreensão maiscompleta da expressão gênica influenciada por LuxS,selecionamos três pontos do tempo ao longo da fase decrescimento de L. acidophilus NCFM para análise datranscrição. No primeiro ponto de amostragem, OD6oo 0,2, aatividade de AI-2 detectada nos meios de crescimento eramínima, uma vez que as populações estavam nos estágiosiniciais da fase de crescimento logarítmico. O segundoponto de amostragem, durante crescimento de log médio (OD6oo0,7), foi obtido durante o acúmulo rápido de AI-2 no meio.

As células foram coletadas em OD6oo 1,2, fase log tardio,para o ponto de amostragem final, que era aproximadamente3 0 minutos após os níveis de AI-2 alcançarem seu pico nomeio. Esses pontos foram escolhidos para representar aexpressão gênica antes, durante e depois da produção de AI-2, como descrito acima. A cepa LuxS" usada neste estudo eraum mutante de eliminação de gene e, portanto, supostamentelivre de quaisquer efeitos pleiotrópicos causados porintegrações ou adição de componentes exogenos selecionadosao meio.

O maior número de genes expressos diferencialmente foiidentificado durante a fase log inicial de crescimento. Umnúmero relativamente elevado de genes foi induzido no tiposelvagem, comparado com a cepa LuxS", indicando que AI-2facilita a expressão de certos genes durante as fasesiniciais de crescimento. A maioria desses genes foirelacionada à transcrição, tradução e replicação. Trêsgenes (LBA772, LBA773, e LBA775) do operon que codifica aFiF0-ATPase (Mullen e Klaenhammer (1999) Mol. Microbiol.33: 1.152-1.161) (LBA772-LBA779) foram superexpressos nacepa do tipo selvagem. A trealose hidrolase (treC, LBA1014)também aumentou a expressão no tipo selvagem, emboratrealose não estivesse presente no meio. A ausência de AI-2não afetou o crescimento de NCFM em trealose (Tabela 5) ,enquanto nem uma cepa mutante TreB" (transportador) nemTreC" foram capazes de crescer em trealose (Duong, e cols.(2006) Appl. Environ. Microbiol. 72: 1.218-1.225). Aexpressão diferencial desses supostos sistemas de produçãode energia associa LuxS ao crescimento e metabolismo.

Resultados similares obtidos por DeLisa e cols. (2001,Journal of Bacteriology 183: 5.239-5.247) implicaram AI-2 àregulação da divisão celular, processamento de DNA eprocessos morfológicos.

Além do crescimento normal e de processos metabólicos,LuxS afetou a expressão de vários fatores da superfíciecelular. Dois genes (LBA1735 e LBA1736) de um supostooperon de exopolissacarídeo (EPS) também foram expressosdiferencialmente no tipo selvagem em fase log inicial. Umasuposta proteína de ligação de fibronectina, proteína essaque, conforme se constatou previamente, participa da adesãoàs células Caco-2 (Buck, e cols. (2005) Appl. Environ.Microbiol. 71: 8.344-8.351), também foi induzida durantefase log inicial por AI-2. A fibronectina é um componenteda matriz extracelular intestinal humana (ECM) e poderiaser um alvo para a adesão de células bacterianas noambiente intestinal (Kapczynski e cols. (2000) Curr.Microbiol. 41: 136-41). Uma cepa mutante LuxS" deLactobacillus reuteri exibiu desempenho ecológico diminuídono trato gastrintestinal murídeo (Tannock, 2005, supra). Aregulação da expressão de fatores da superfície celular noinício da fase de crescimento pode pré-adaptar a bactéria àinteração com uma comunidade microbiana diversa ou aodesempenho ecológico no trato intestinal.

Moléculas associadas à superfície celular demicroorganismos intestinais são reconhecidas pelohospedeiro e podem ser importantes tanto na respostainflamatória quanto na manutenção da homeostasia intestinal(Rakoff-Nahoum, e cols. (2004) Cell 118: 229-241). Umadessas moléculas da superfície bacteriana, o ácidolipoteicóico, está ligada à membrana celular e se estendeatravés da parede celular para apresentar a si mesmo aoambiente da bactéria. O gene dltD (LBA1923) , um membro dooperon dlt responsável pela D-alanação adequada de ácidoslipoteicóicos em lactobacilos, foi induzido na presença deLuxS na fase log inicial de crescimento. Quando um mutanteDlt" de Lactobacillus plantarum foi exposto às célulasmononucleares do sangue periférico (PBMCs), a secreção decitocinas pró-inflamatórias TNFa e IL-12 foi diminuída(Grangette, e cols. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A102: 10.321-10.326). A expressão de IL-10 pelos PBMCs eraaumentada após exposição ao mutante Dlt", desviando operfil de citocina para uma resposta antiinflamatória. Aregulação por AI-2 da estrutura desses ácidos lipoteicoicospoderia participar das interações hospedeiro-micróbio notrato intestinal.

Acredita-se também que AI-2 participe da regulação derespostas ao estresse em bactérias (Wen, e cols. (2004) J".Bacteriol. 186: 2.682-91; Xavier, e cols. (2005) J.Bacteriol. 187: 238-248). Conseqüentemente, a expressão demúltiplos genes supostamente relacionados às respostas aoestresse foi influenciada por AI-2, incluindo dnaK(LBA124 7) , grpE (LBA124 8) e clpX (LBA84 7) envolvidos com aremoção de proteínas dobradas erroneamente e polipeptídeosprematuros produzidos durante o estresse por calor. Aanálise da influência de AI-2 sobre a sobrevida porestresse por calor revelou que, quando comparada com a cepado tipo selvagem, a cepa mutante LuxS" de L. acidophilusNCFM era mais sensível ao estresse por calor de 55 °C (Fig11) . Essa sensibilidade só foi observada quando aspopulações bacterianas eram estressadas da fase decrescimento de log inicial médio. Esses resultados sãoconsistentes com a expressão aumentada dos genes daresposta ao choque térmico nos estágios iniciais docrescimento. Em um estudo recente de Porphyromonoasgingivalis, uma cepa mutante LuxS" foi mais resistente doque o tipo selvagem ao estresse por calor (Xavier, 2005supra), sugerindo uma alteração cepa-dependente da respostaao estresse por AI-2.

Bactérias intestinais devem sobreviver à passagematravés das condições hostis do trato gastrintestinal a fimde persistir no intestino. Um dos obstáculos que devem sersuperados é a exposição à bile na região gástrica. Umasuposta hidrolase de sal biliar (LBA0892) foi induzida porLuxS em fase log inicial. A cepa mutante LuxS" foi testadaquanto à sua tolerância à bile, e constatou-se que é maissensível quando as culturas foram coletadas da fase loginicial ou médio de crescimento. Culturas coletadas da faselog tardio não exibiram diferenças na tolerância à bile emrelação ao tipo selvagem. Esses resultados indicam que AI-2poderia atuar para preparar a célula para as condiçõesestressantes ao influenciar positivamente a expressão degenes que têm uma função relacionada ao crescimento e ãsobrevida em diferentes condições ambientais.

Foi relatado que AI-2 é um fator sensível ao quorumque se acumula no ambiente à medida que a densidade celularaumenta, embora a fase de crescimento na qual AI-2 afeta aexpressão gênica não tenha sido relatada. Nossos resultadossugerem que AI-2 atua sobre populações celulares nosestágios iniciais de crescimento logarítmico, antes doacúmulo apreciável de AI-2. O número elevado de genes quetiveram sua expressão diminuída da fase de crescimento delog inicial a log médio na cepa mutante LuxS", comparadacom o tipo selvagem, apoia a hipótese de que LuxSinfluencia positivamente a expressão gênica precocemente nafase de crescimento. Quando a expressão gênica foiexaminada por toda a fase de crescimento, pareceu que LuxSprepara a população para os estresses e para as condiçõesinterativas encontradas naturalmente durante crescimentoplanctônico. É evidente que AI-2 tem um impacto sobre aexpressão de genes relacionados ao crescimento rápido e àresposta ao estresse de L. acidophilus NCFM, além depossivelmente influenciar interações hospedeiro-micróbio.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Buck, B. LoganAzcarate-Peril, M. AndréaAltermann, EricKlaenhammer, Todd R.

<120> VIA SINTÉTICA DE AUTO-INDUTOR-2 EM BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁTICO

<130> 035051/308683

<150> 60/671,887<151> 2005-04-15

<160> 38

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1<211> 693<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1) . . . (693)

<223> MTA/SAH nucleosidase (E.C.3.2.2.9) ORF Lba820<400> 1

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130 135 140

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210 215 220

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<210> 2<211> 231<212> PRT

<213> Lactobacillus acidophilus<400> 2

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210 215 220

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<210> 3

<211> 942

<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(942)

<223> metiltransferase dependente de SAM ORF LBA931<400> 3

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260 265 270

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290 295 300

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<210> 4

<211> 314

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<213> Lactobacillus acidophilus

<400> 4

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290 295 300

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<210> 5

<211> 657

<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(657)

<22 3> Permease de transportador ABC que transpõe a membrana ORFLBA104 2

<400> 5

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<210> 6<211> 219<212> PRT

<213> Lactobacillus acidophilus<400> 6

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15 10 15

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20 25 30

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195 200 205

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<210> 7<211> 672<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(672)

<223> transportador ABC ORF LBA1044<400> 7

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<213> Lactobacillus acidophilus

<400> 8

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<210> 9<211> 738<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(738)

<223> proteína de ligação de ATP de transportador ABC ORF LBA1045<400> 9

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<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1689)

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<400> 19

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<210> 20

<211> 563

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<213> Lactobacillus acidophilus

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<213> Lactobacillus acidophilus

<220><221> CDS

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819

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<213> Lactobacillus acidophilus<400> 22

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<210> 23<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo<400> 23

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<210> 24<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo

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<210> 25<211> 29<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo<400> 25

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<210> 26<211> 29<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo<400> 26

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<210> 27<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo<400> 27

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<210> 28<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo<400> 28

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<210> 29<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo<400> 29

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<210> 30<211> 22<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo<400> 30

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<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo

<400> 31

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<210> 32<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotideo<400> 32

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<210> 33

<211> 794

<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (12)...(794)

<223> ORF LBA1735

<400> 33

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ctt act gaa gaa cac tac gat tta gtt att ate gac tta gct cct gtt 530Leu Thr Glu Glu His Tyr Asp Leu Vai lie lie Asp Leu Ala Pro Vai160 165 170

ctt gaa gta tet gat aca caa gaa ctt gct agt cac tta gat ggg gtt 578Leu Glu Vai Ser Asp Thr Gln Glu Leu Ala Ser His Leu Asp Gly Vai175 180 185

g.tc tta gta gtt cgc caa ggg aag acg caa aag atg gcc att aag cgt 626Vai Leu Vai Vai Arg Gln Gly Lys Thr Gln Lys Met Ala lie Lys Arg190 195 200 205

gct gtt gaa atg ctt gaa ttt gca aag gca cgt ate ttg ggt tac ate 674Ala Vai Glu Met Leu Glu Phe Ala Lys Ala Arg lie Leu Gly Tyr lie210 215 220

atg aat gat gta agt tet gat aat gcg ggt tat ggc tat ggt tac ggc 722Met Asn Asp Vai Ser Ser Asp Asn Ala Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly225 230 235

tac ggc tat ggt tat ggc tac gga gaa gaa gat aca aag aaa aaa gga 770Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Glu Glu Asp Thr Lys Lys Lys Gly240 245 250

ttg ttc tet aaa ttt agg aag taa 794Leu Phe Ser Lys Phe Arg Lys *255 260

<210> 34<211> 260<212> PRT

<213> Lactobacillus acidophilus<400> 34

Met Pro Leu Phe Lys Lys Lys Arg

1 5Gly Ala Lys Leu lie Thr Vai Ala20

Gln Phe Arg Thr Vai Arg Thr Asn35 40

Gly Thr Asp Glu Thr lie Lys His

10 15Lys Pro Lys Ser Pro lie Ala Glu25 30lie Asn Phe Met Ala Vai Asp His45Asp lie Lys Ser50

Ser Thr Vai Ala65

Lys Vai Leu Leu

Thr Phe Asn Leu100

Thr Ala Lys Glu115

Asp Asn Leu Tyr130

Glu Leu lie Gly145

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Ser Asp Thr Gln180

Vai Arg Gln Gly195

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Vai Ser Ser Asp225

Gly Tyr Gly Tyr

Lys Phe Arg Lys260

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Vai Asp Leu Asp120

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Glu Leu Ala Ser

Lys Thr Gln Lys200

Ala Lys Ala Arg215

Asn Ala Gly Tyr230

Gly Glu Glu Asp245

Ser Ala Asn lie60

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Leu Arg Arg Pro90

Gly Leu Ser Thr105

Ser Vai Vai Gln

Gly Pro Met Pro140

Arg Asp Phe Vai155

Asp Leu Ala Pro170

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Met Ala lie Lys

lie Leu Gly Tyr220

Gly Tyr Gly Tyr235

Thr Lys Lys Lys250

Ser Glu Gly Lys

Gln Ala Gly Arg80

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Vai lie Ser Ser110

Glu Ser Gly Vai125

Pro Asn Pro Ala

Lys Leu Thr Glu160

Vai Leu Glu Vai175

Vai Vai Leu Vai190

Arg Ala Vai Glu205

lie Met Asn Asp

Gly Tyr Gly Tyr240

Gly Leu Phe Ser255

<210> 35<211> 887<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

c220>

<221> CDS

<222> (12) . . . (887)

<223> ORF LBA1736

<400> 35

aggaaagaga t atg gaa caa aaa caa gaa caa gaa aat aca ate gat ctt 50

Met Glu Gln Lys Gln Glu Gln Glu Asn Thr lie Asp Leu15 10

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agt cgt aac aat gat cca aac gea gct tat gcg act caa caa gct aacSer Arg Asn Asn Asp Pro Asn Ala Ala Tyr Ala Thr Gln Gln Ala Asn65 70 75

242atg cag atg gtt act act tat aaa gac att gta aca agt aac aag ate 290Met Gln Met Vai Thr Thr Tyr Lys Asp lie Vai Thr Ser Asn Lys lie80 85 90

tta aca gaa gct tet aat cgt ttg gcc aat cca act gtt gtt gtg aaa 338Leu Thr Glu Ala Ser Asn Arg Leu Ala Asn Pro Thr Vai Vai Vai Lys95 100 105

aaa gea caa aaa gea gtg tac aga act gat gaa aat ggt aga aga aga 386Lys Ala Gln Lys Ala Vai Tyr Arg Thr Asp Glu Asn Gly Arg Arg Arg110 115 120 125

tta gta aga aaa gct caa cca gct gta att gaa cga age ggt aag agt 434Leu Vai Arg Lys Ala Gln Pro Ala Vai lie Glu Arg Ser Gly Lys Ser130 135 140

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caa caa caa tca caa gtc ttc tca att tca gcg gaa gcc gat aca cca 530Gln Gln Gln Ser Gln Vai Phe Ser lie Ser Ala Glu Ala Asp Thr Pro160 165 170

gct aag gcg aag gea gaa gta aat gea gta gct gaa acg ttc cgt aaa 578Ala Lys Ala Lys Ala Glu Vai Asn Ala Vai Ala Glu Thr Phe Arg Lys175 180 185

gaa att cet act att atg age gtt aat aac gta acg att gtg gea aat 626Glu lie Pro Thr lie Met Ser Vai Asn Asn Vai Thr lie Vai Ala Asn190 195 200 205

ggt act aat ggt gtt caa tec tca cet aac gtt aag ttg ttc act cta 674Gly Thr Asn Gly Vai Gln Ser Ser Pro Asn Vai Lys Leu Phe Thr Leu210 215 220

gct gga ttt gta gtt ggg tta gta ttg age ttt gct gta gtt att att 722Ala Gly Phe Vai Vai Gly Leu Vai Leu Ser Phe Ala Vai Vai lie lie225 230 235

cgt gaa atg agt aat act act gtt cgt gac gat gaa ttc tta act cgt 770Arg Glu Met Ser Asn Thr Thr Vai Arg Asp Asp Glu Phe Leu Thr Arg240 245 250

gaa tta ggc tta act aac tta ggt caa att gct cac ttc cac ttg tca 818Glu Leu Gly Leu Thr Asn Leu Gly Gln lie Ala His Phe His Leu Ser255 260 265

tet tca ttt act att aaa aag agt gea aat atg act aat cgt gga caa 866Ser Ser Phe Thr lie Lys Lys Ser Ala Asn Met Thr Asn Arg Gly Gln270 275 280 285

gct aag aga cgt aga gta taa 887Ala Lys Arg Arg Arg Vai 290

<210> 36<211> 291<212> PRT

<213> Lactobacillus acidophilus<400> 36

Met Glu Gln Lys Gln Glu Gln Glu Asn Thr lie Asp Leu Thr Gln Leu

1 5 10 15

Leu Arg lie Cys Arg Lys His lie Trp Ala Leu lie Leu Trp Ser Vai

20 25 30

Gly Leu Ala Leu Vai Gly Trp Gly Vai Ser Glu Phe Vai lie Ser Pro

35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Ser Ala Ser Glu Leu Ala Lys Ser lie Ser Vai Gly Thr Gln Gln Gln145 150 155 160

Ser Gln Vai Phe Ser lie Ser Ala Glu Ala Asp Thr Pro Ala Lys Ala

165 170 175

Lys Ala Glu Vai Asn Ala Vai Ala Glu Thr Phe Arg Lys Glu lie Pro

180 185 190

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195 200 205

Gly Vai Gln Ser Ser Pro Asn Vai Lys Leu Phe Thr Leu Ala Gly Phe

210 215 220

Vai Vai Gly Leu Vai Leu Ser Phe Ala Vai Vai lie lie Arg Glu Met225 230 235 240

Ser Asn Thr Thr Vai Arg Asp Asp Glu Phe Leu Thr Arg Glu Leu Gly

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Arg Arg Vai290

<210> 37<211> 1287<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1287)

<223> ORF LBA1923

<400> 37

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cta ggt gga cca ggt agt caa tct ttg gct caa ttc ttg ggg atg cag 336Leu Gly Gly Pro Gly Ser Gln Ser Leu Ala Gln Phe Leu Gly Met Gln100 105 110

ggt aca act aaa cag ctt aaa aac aaa aag gct gta gtg att att tca 384Gly Thr Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Lys Ala Vai Vai lie lie Ser115 120 125

cca caa tgg ttt acc aag aaa ggc caa gat cet aat gea ttt gct tta 432Pro Gln Trp Phe Thr Lys Lys Gly Gln Asp Pro Asn Ala Phe Ala Leu130 135 140

tat tat tca cca ctt caa gea tgt aac ttc ttg tta agt gct aag aat 480Tyr Tyr Ser Pro Leu Gln Ala Cys Asn Phe Leu Leu Ser Ala Lys Asn145 150 155 160

aat aag act gat cgt tat gct gct aag cgt ctg ctt gat atg cca gat 528Asn Lys Thr Asp Arg Tyr Ala Ala Lys Arg Leu Leu Asp Met Pro Asp165 170 175

gta aag ggt gaa att aga aac agt ctt aag caa att gct gea ggt aaa 576Vai Lys Gly Glu lie Arg Asn Ser Leu Lys Gln lie Ala Ala Gly Lys180 185 190

aag cta act act ttt gaa aga ttt tat tta gaa aat cgt cgt aga atg 624Lys Leu Thr Thr Phe Glu Arg Phe Tyr Leu Glu Asn Arg Arg Arg Met195 200 205

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gta aat aag att caa aat aga gct aaa gta tta cet aat act tat tct 720Vai Asn Lys lie Gln Asn Arg Ala Lys Vai Leu Pro Asn Thr Tyr Ser225 230 235 240

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385 390 395 400

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Vai Asn Leu Asn Asn Lys Asp Arg Leu Lys Vai Lys *420 425

<210> 38<211> 428<212> PRT<213> Lactobaci

<400> 38Met Ser Asn Lys1

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Phe Ser Lys Gln35

Vai Phe Lys Gly50

Vai Pro Phe Tyr65

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Leu Gly Gly Pro100

Gly Thr Thr Lys

lus acidophilus

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Leu Leu Vai Vai

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Ser Thr Met Lys55

Gly Ser Ser Glu70

Ala Glu Lys Tyr85

Gly Ser Gln SerGln Leu Lys Asn

Gln lie Phe Gly10

Phe Leu lie Pro25

Ala Ala Ala Ser

Gln Glu Ala Tyr60

Leu Ser Arg Phe75

His Arg Asn Tyr90

Leu Ala Gln Phe105

Lys Lys Ala Vai

Pro Vai Leu Cys15

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Gln Asn Ser Thr45

Lys Asp Gly Tyr

Asp Pro Leu His80

Arg Pro Phe Leu95

Leu Gly Met Gln110

Vai lie lie SerPro Gln Trp Phe130

Tyr Tyr Ser Pro145

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Vai Lys Gly Glu180

Lys Leu Thr Thr195

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Vai Asn Lys lie225

Vai Ala Ala Leu

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Gly Lys Trp Met

Ser Vai Ala Lys340

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Thr lie His Leu370

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Vai Asn Leu Asn420

120

Thr Lys Lys Gly135

Leu Gln Ala Cys150

Arg Tyr Ala Ala165

lie Arg Asn Ser

Phe Glu Arg Phe200

Asp Asn Phe Phe215

Gln Asn Arg Ala230

Asn Lys Vai Ala245

Leu Gly lie Asp

Leu Lys Arg Leu280

Vai Glu Tyr Gly295

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Lys Tyr Thr Gly325

lie Glu Gln Gln

Ser Lys Arg Gly360

Gly Trp Lys Gly375

Lys Leu Pro Asn390

Ser Lys Lys Trp405

Asn Lys Asp Arg

35/35

Gln Asp Pro Asn140

Asn Phe Leu Leu155

Lys Arg Leu Leu170

Leu Lys Gln lie185

Tyr Leu Glu Asn

Ser Ser Phe Gln220

Lys Vai Leu Pro235

Glu Glu Gln Ala250

Asn Thr Phe Tyr265

Lys Gly Ser Gln

Asp Phe Gln Leu300

Leu Phe lie lie315

Leu Ser Gln Lys330

Leu Thr Ser Gln345

Asn Glu Lys Tyr

Trp Vai Ala Vai380

Glu Arg Tyr Asn395

Gln Asn Lys Asp410

Leu Lys Vai Lys425

125

Ala Phe Ala Leu

Ser Ala Lys Asn

160

Asp Met Pro Asp

175

Ala Ala Gly Lys

190

Arg Arg Arg Met

205

Leu Arg Asp Arg

Asn Thr Tyr Ser

240

Ala Ala His Thr

255

Arg Thr Arg Leu

270

Arg His Phe Asp

285

Met Leu Glu Gln

Pro Pro lie Asn

320

Met Tyr Gln Glu

335

Gly Phe Glu Asn

350

Phe Met Gln Asp

365

Asp Gln Ala Vai

Tyr Asp Met Ser

400

Asn Vai Lys Arg

415

Claims (45)

1. Método de aumento da adesão em uma bactéria deácido lático caracterizado pelo fato de compreender aexposição da bactéria a condições adaptáveis de adesão quecompreendem incubação das referidas células em umaconcentração de pelo menos 1 x IO9 cfu/ml por um temposuficiente para aumentar a adesão da bactéria de ácidolático.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as condições adaptáveis deadesão compreendem uma concentração de cerca de 1 x IO9cfu/ml das células por cerca de 1 hora.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as condições adaptáveis deadesão aumentam a expressão de pelo menos umpolinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em Id. deSeq. N° : 19, 33, 35 ou 37, ou um polinucleotídeo que tempelo menos 90% de identidade de seqüência à seqüência deId. de Seq. N°: 19, 33, 35 ou 37.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende ocontato das bactérias de ácido lático a um substrato.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o substrato compreende umacélula do trato gastrointestinal ou do trato urogenital.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a célula compreende umacélula epitelial ou uma célula mucosa.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a adesão aumentada melhorapelo menos uma propriedade probiótica das bactérias deácido lático.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada dogrupo que consiste em Lactobacillus acidophilus, L.gasseri, L. johnsonii e L. plantarum.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a bactéria de ácido láticoexpressa um polipeptídeo terapêutico.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo terapêutico éheterólogo à bactéria.

11. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a célula do tratogastrointestinal ou do trato urogenital é de um ser humano,animal doméstico ou um animal de agricultura.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a tolerância ao estresse dabactéria de ácido lático é melhorada.

13. Bactéria de ácido lático caracterizada pelo fatode ser produzida pelo método da reivindicação 1.

14. Bactéria de ácido lático caracterizada pelo fatode ser produzida método da reivindicação 2.

15. Cultura de bactérias caracterizada pelo fato decompreender a bactéria de ácido lático da reivindicação 13.

16. Método de liberação de um polipeptídeo terapêuticoa um indivíduo caracterizado pelo fato de compreender:a) o fornecimento de uma bactéria de ácido lático quetem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo terapêutico;b) exposição das referidas bactérias de ácido lático acondições adaptáveis de adesão que compreendem incubaçãodas referidas células em uma concentração de pelo menos 1 xIO9 cfu/ml por um tempo suficiente para aumentar a adesãoda referida bactéria de ácido lático;c) administração da referida bactéria de ácido láticoda etapa (b) ao indivíduo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que as condições adaptáveis deadesão compreendem uma concentração de cerca de 1 x IO9cfu/ml das referidas células por cerca de 1 hora.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada dogrupo que consiste em Lactobacillus acidophilus, L.gasseri, L. johnsonii, and L. plantarum.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o indivíduo compreende umser humano, animal doméstico ou um animal de agricultura

20. Método de indução ou aumento da produção de""auto-indutor-2"" em uma bactéria caracterizado pelo fatode compreender a introdução na bactéria de pelo menos duasmoléculas de ácido nucleico heterólogo selecionadas dogrupo que consiste em:(a) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°:l;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (a) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem a hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em0,1 X SSC em 60°C a 65°C;(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 1; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 2;(b) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°: 3;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (b) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em0,1 X SSC a 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 3; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 4;(c) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendea seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. de Seq.N° :15;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (c) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 5 0%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N° : 15; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 16;(d) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°: 21;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (d) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 21; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 22; e,(e) (i) uma molécula de ácido nucleico quecompreende uma seqüência de nucleotídeos como apresentadaem Id. de Seq. N°: 13;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (e) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 13;(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 14;em que a bactéria produz maiores quantidades de "auto-indutor-2" do que a bactéria de controle correspondente.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de ainda compreender a exposição dabactéria a condições adaptáveis de adesão que compreendemincubação das células em uma concentração de pelo menos 1 x 10'9 cfu/ml por um tempo suficiente para aumentar a adesãoda bactéria de ácido lático.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que as condições adaptáveis deadesão compreendem uma concentração de cerca de 1 x IO9cfu/ml das células por cerca de 1 hora.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria deácido lático.

24. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a bactéria é probiótica.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a adesão aumentada melhorapelo menos uma propriedade probiótica da bactéria.

26. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a bactéria de ácido lático éselecionada do grupo que consiste em Lactobacillusacidophilus, L. gasseri, L. johnsonii e L. plantarum.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a bactéria de ácido láticoexpressa um polipeptídeo terapêutico.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo terapêutico éheterólogo à bactéria.

29. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a tolerância ao estresse dabactéria de ácido lático é melhorada.

30. Bactéria caracterizada pelo fato de compreenderpelo menos duas moléculas de ácido nucleico heterólogoselecionadas do grupo que consiste em:(a) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°: 1;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (a) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 5 0%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 1; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptideo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 2;(b) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°: 3;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (b) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; and(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 3; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codificaum polipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id.de Seq. N°: 4;(c) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°:15;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (c) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 15; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 16;(d) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N° : 21;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (d) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 21; ou,(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 22; e,(e) (i) uma molécula de ácido nucleico que compreendeuma seqüência de nucleotídeos como apresentada em Id. deSeq. N°: 13;(ii) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (e) (i) sob condiçõesseveras, as condições severas compreendem hibridização emformamida 5 0%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em-0,1 X SSC em 60°C a 65°C; e(iii) uma molécula de ácido nucleico que tem pelomenos 90% de identidade à seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N°: 13;(iv) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°: 14;em que a referida bactéria produz maiores quantidadesde "auto-indutor-2" que a bactéria de tipo selvagemcorrespondente.

31. Bactéria, de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que a bactéria é uma bactéria deácido lático.

32. Bactéria, de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que a bactéria é probiótica.

33. Bactéria, de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que a bactéria de ácido lático éselecionada do grupo que consiste em Lactobacillusacidophilus, L. gasseri, L. johnsonii e L. plantarum.

34. Bactéria, de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que a bactéria de ácido láticoexpressa um polipeptídeo terapêutico.

35. Bactéria, de acordo com a reivindicação 34,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo terapêutico éheterólogo à bactéria.

36. Bactéria, de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que a tolerância ao estresse dabactéria de ácido lático é melhorada.

37. Cultura de bactérias caracterizada pelo fato decompreender as bactérias da reivindicação 30.

38. Método de rastreamento de condições ambientaisque aumentem a adesão da bactéria de ácido lático a umsubstrato caracterizado pelo fato de compreender:a) a submissão da bactéria a uma condição ambientalsuspeita de aumentar a adesão,- e,b) contato da bactéria ao substrato;em que um aumento na adesão da bactéria submetida àcondição ambiental ao substrato comparada à adesão de umabactéria de controle que não foi submetida às condiçõesambientais indica que a condição ambiental é eficaz noaumento da adesão da bactéria.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada dogrupo que consiste em Lactobacillus acidophilus, L.gasseri, L. johnsonii e L. plantarum.

40. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que o substrato compreende umacélula do trato gastrointestinal ou do trato urogenital.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que a célula compreende umacélula epitelial ou uma célula mucosa.

42. Método para modular a adesão em uma bactériacaracterizada pelo fato de compreender a introdução nabactéria de pelo menos uma molécula de ácido nucleicoheterologo selecionada do grupo que consiste em:a) uma molécula de ácido nucleico que compreende umaseqüência de nucleotideos como apresentada em Id. de Seq. N°:1, 3, OU 21;b) uma molécula de ácido nucleico que hibridiza aocomplemento do ácido nucleico de (a) sob condições severas,as referidas condições severas compreendem hibridização emformamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,1 X SSC em 60°C a 65°C;c) uma molécula de ácido nucleico que tem pelo menos 90% de identidade à seqüência de nucleotideos apresentadaem Id. de Seq. N°: 1, 3 ou 21; ou,d) uma molécula de ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo que tem pelo menos 90% de identidade a Id. deSeq. N°:2, 4 OU 22;em que a adesão na bactéria é modulada quandocomparada à adesão em uma bactéria que não compreende amolécula de ácido nucleico heterologo de (a), (b) , (c) , ou (d).

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada dogrupo que consiste em Lactobacillus acidophilus, L.gasseri, L. johnsonii e L. plantarum.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que o substrato compreende umacélula do trato gastrointestinal ou do trato urogenital.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que a célula compreende umacélula epitelial ou uma célula mucosa.