BRPI0610764A2

BRPI0610764A2 - promotor e método para a introdução de uma substáncia extracelular em um oócito de mamìfero

Info

Publication number: BRPI0610764A2
Application number: BRPI0610764-8A
Authority: BR
Inventors: Kenji Miyado; Mami Miyado; Hidenori Akutsu
Original assignee: Japan Science & Tech Agency
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2010-11-09
Also published as: AU2006242041A1; US20080274544A1; KR20080003426A; EP1876237A1; CA2607772A1; AU2006242041B2; WO2006117991A1; JPWO2006117991A1; CN101160398A; JP4448172B2

Abstract

PROMOTOR E METODO PARA A INTRODUçãO DE UMA SUBSTáNCIA EXTRACELULAR EM UM OóCITO DE MAMìFERO Pretende-se fornecer um método, pela introdução de uma substância extracelular, tais como um esperma, um núcleo de célula, um ácido nucléico ou uma proteína em um óvulo de mamífero, para a introdução da substância extracelular no óvulo de mamífero, que é segura para o óvulo de mamífero, permite introdução eficiente e é tecnicamente fácil. Pelo tratamento do óvulo de mamífero com um a inibidor de polimerização de tubulina tal como a vinblastina, é promovida a fusão da membrana entre o óvulo e o esperma e sem fazer um orificio na membrana da célula, o esperma e o óvulo são fundidos e pode ser conseguida a fertilização. O método da invenção pode ser aplicado não apenas ao caso em que um esperma é introduzido em um óvulo de mamífero, mas também em um caso em que umasubstância extracelular, tais como um núcleo de célula, um ácido nucléico ou uma proteína é introduzido em um óvulo de mamífero.

Description

"PROMOTOR E MÉTODO PARA A INTRODUÇÃO DE UMASUBSTÂNCIA EXTRACELULAR EM UM OÓCITO DE MAMÍFERO"

A presente invenção refere-se a um promotor para a introduçãode uma substância extracelular em um oócito de mamífero que contém uminibidor de polimerização de tubulina e método de introdução em um oócitode mamífero por utilização do promotor de introdução. Mais especificamente,a presente invenção refere-se a um método para a introdução de umasubstância extracelular tais como um esperma, um núcleo de célula, um ácidonucléico e uma proteína, em um oócito de mamífero por utilização de umpromotor para a introdução de uma substância extracelular em um oócito demamífero que contém um inibidor de polimerização de tubulina como umingrediente ativo e um promotor para a introdução de uma substânciaextracelular para um oócito de mamífero a ser usado com o mesmo. Umacaracterística da invenção é fornecer um método para a promoção defertilização de um oócito de mamífero, por promoção da introdução de umesperma em um oócito de mamífero, por melhoria da fertilidade de um oócitode mamífero por um tratamento com um promotor para a introdução de umasubstância extracelular para um oócito de mamífero que contém um inibidorde polimerização de tubulina como um ingrediente ativo.

Técnica Fundamental

No campo de modificação de mamíferos que usa terapiagênica, tratamento para reprodução ou engenharia de desenvolvimento, aintrodução de uma substância extracelular tais como um esperma, um núcleode célula e ácido nucléico em um oócito de mamífero é conduzida paramodificar as células germinativas. Como um método para a introdução desubstâncias genéticas (ácido nucléico) em uma célula tal como um oócito demamífero, um método de introdução que usa vetores tais como retrovírus éconhecido até agora (WO 97/18318). Como um método para a introdução deuma substância extracelular tais como um esperma e um núcleo de célula umoócito de mamífero, geralmente é usado o método de ICSI (injeçãointracitoplásmica de esperma), em que é feito um orifício em um oolemausando-se um capilar de vidro, infundindo assim uma substância extracelular.

0 método de ICSI também é um método corrente para a introdução de umesperma em um oócito de mamíferos inclusive de um ser humano (Pedido dePatente Japonesa Depositado em Aberto N0. 5-38345) e que é amplamenteusado para tratamento de infertilidade humana.

No entanto, o Método de ICSI apresenta alguns problemascomo um método para a introdução de uma substância extracelular em umoócito de mamífero. Mais especificamente, o Método de ICSI tem osseguintes problemas: (1) é necessário treinamento técnico para introduzir umasubstância extracelular em um oócito de mamífero sem falhar pelo Método deICSI; (2) a taxa de sucesso da introdução de uma substância extracelular emum oócito de mamífero pelo Método de ICSI é baixa; (3) como o Método deICSI é utilizado pela realização de um orifício em um oolema utilizando-seum capilar de vidro, pode ser concebível um efeito adverso sobre odesenvolvimento do embrião causado pela realização de um orifício. Atémesmo se os problemas foram ressaltados, o Método de ICSI está em uso poisnão há alternativa para o Método de ICSI habitualmente.

Por outro lado, a introdução de um esperma em um oócito demamífero é conduzida por fertilização e são propostos diversos métodos parapromover a introdução de um esperma em um oócito de mamífero. Porexemplo, a tradução Japonesa Publicada da publicação de PCT internacional8-503705 divulga um método para tratamento da infertilidade masculina demamíferos pela administração de um polipeptídeo timosina que melhora afertilidade tal como timosina ai para promover a fertilização. O Pedido dePatente Japonesa Depositado em Aberto N0. 9-28721 divulga um método paramelhorar a fertilidade in vitro de esperma de gado, em que o esperma de gadoé co-cultivado com uma célula epitelial de oviduto de gado, então cultivadocom um oócito de gado para ser submetido à fertilização in vitro.

Além disso, a tradução Japonesa Publicada da publicação dePCT internacional 2001-506225 divulga um método de utilização deangiotensina II para promover a fertilização de um oócito de mamífero. OPedido de Patente Japonesa Depositado em Aberto N°. No. 6-189650 divulgaum método para aumentar a taxa de concepção pela magnetização de umesperma e de um oócito e melhoria da atividade dos mesmos. Além disso, atradução Japonesa Publicada da publicação de PCT internacional 2001-500102 divulga um método para melhorar a ligação de eesperma-oócito epara melhorar a fertilidade pela utilização de um polipeptídeo purificado porcentrifugação de uma suspensão congelada e descongelada na presença de10% até 12% de glicerol e que é um membro de um grupo de proteínasinclusive a prosaposina (SGP-I) e a saposina. Todos os métodos estãovisando a obtenção de um efeito de ativação de um oócito e de esperma epromovendo a fertilização do mesmo durante a fertilização do oócito demamífero.

Por outro lado, em uma célula de eucariotes tais como animais,plantas e fungos, é sabido que há uma organela denominada microtúbulos,que é difundida na célula e consiste de fibras tubulares de proteína que têmum diâmetro de aproximadamente 25 nm. As funções das organelas são defaixa extremamente ampla e envolvida na formação de aparelhagem mitótica,na formação e na manutenção da morfologia da célula, no movimentoflagelar/ciliar, na colocação de organelas intracelulares, transporte dematerial, secreção hormonal e fluidez da membrana citoplásmica.

Especialmente, os microtúbulos estão presentes como as principais moléculasconstituintes dos áxons e de dendritos em neurônios e contribuem para otransporte de materiais como caminhos para as proteínas motoras. Osmicrotúbulos são geralmente formados por polimerização regular de umhétero-dímero que consiste de uma molécula de α-tubulina e de uma moléculade β-tubulina e expansão e contração repetidamente causadas pelapolimerização/despolimerização juntamente com a progressão do ciclo dacélula.

Além disso, a polimerização/despolimerização dosmicrotúbulos também é controlada pelas Proteínas Associadas a Microtúbulo(MAPs, proteína τ) e uma proteína quinase e uma proteína fosfatase quecontém a proteínas de ligação de microtúbulo como um substrato principalestão envolvidas no mecanismo de controle de microtúbulos. Por estes fatos, ésabido que os compostos que agem sobre o sistema de microtúbuloapresentam várias atividades vitais tal como inibição da divisão da célula.

Como descrito acima, microtúbulos são os principaiscomponentes de fibras de eixo mitótico que direcionam os cromossomosdispostos sobre a placa equatorial na ocasião da mitose para os pontos polarese representam um papel indispensável em muitas ações celulares inclusive amanutenção do formato, da motilidade e da adesão das células e do transportedentro das células, durante a divisão de fase (Shiff, P.B. e Horwitz, S.B.,1981, "Molecular Actions and Targets for Anticancer ChemotherapeuticAgents" seção de "Tubulin: a target for chemotherapeutic agents", pp 483-507, Academic Press, NY, USA; Glotz, J.S. e outros, 1992, Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 89:7026-7030; Rowinsky, E.K. e outros, 1990, Nature, 82:1247-1259). Além disso, os microtúbulos representam um papel importante nasinterações entre os fatores de crescimento e os receptores na superfície dascélulas e no controle dos sinais derivados destas interações. A relação entre afertilização e o citoesqueleto também foi apresentadas (MolecularReproduction and Development, 56:89-98,2000).

A tubulina é o principal componente de microtúbulos e umaproteína indispensável para divisão da célula/crescimento da célula, que é umchamado elemento citoesqueletal. Portanto a inibição da polimerização ou adespolimerização das tubulinas tem uma relação importante com divisão dacélula/crescimento da célula. Por tais funções da tubulina, a tubulina tambémé conhecida como um alvo de um agente anticâncer, de um agente antifungale de herbicidas. Além disso, a tubulina foi profundamente envolvida tanto nafundação como na aplicação na ciência da vida.

São conhecidos até agora alguns inibidores de polimerizaçãoda tubulina. O alcalóide vinca é um inibidor bem conhecido de polimerizaçãoda tubulina usado para tratamento de cânceres (Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 5-192174). O alcalóide vinca é um termo genéricousado para se referir a uma espécie de agentes anticâncer, cujo componente éextraído de plantas. O alcalóide vinca se liga a uma proteína denominadatubulina que está envolvida no movimento d acetato de etila e na manutençãodo formato da célula e inibe microtúbulos, sendo que inibe a divisão dacélula.

Exemplos representativos de alcalóide vinca incluem avinblastina e a vincristina (J. Med. Chem. 34:1998,1991). A vinblastina é umalcalóide indol que tem uma atividade antitumor entre os alcalóides contidosno Catharanthus roseus, que age sobre os microtúbulos ou sobre a tubulinaque é um componente proteína de microtúbulos, para interromper a mitose dacetato de etila no estágio da metáfase, inibindo desse modo a divisão dacélula. A vincristina é atualmente usada para o tratamento de leucemia,linfoma maligno, tumor pediátrico etc. ao passo que a vinblastina é usada parao tratamento do câncer da célula não pequena. Nestes últimos anos, avinblastina é preparada por um método de síntese (Pedido de PatenteJaponesa Depositado em Aberto N°.2003-64084).

São conhecidos muitos outros inibidores de polimerização datubulina tais como a rizoxina (Tetrahedron Lett., 34:1035, 1993), acombretastatina (Biochemistry, 28:6984, 1989; Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N°.6-207264), a 2-estirilquinazolina-4 (3H)-ona (SQO)(J. Med. Chem., 33:1721,1990), a halistatina 1, 2 (Pedidos de PatenteJaponesa Depositados em Aberto N°. 6-279450; N°. 6-279451) e pironetinaou seus derivados (Pedido de Patente Japonesa Depositado em Aberto N°. 11-1434) e tem sido pesquisado o uso dos mesmos para droga antitumor esimilares.

Documento da Patente 1: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 5-38345

Documento da Patente 2: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N°. 5-192174

Documento da Patente 3: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 6-189650

Documento da Patente 4: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 6-207264

Documento da Patente 5: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N°. 6-279450

Documento da Patente 6: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 6-279451

Documento da Patente 7: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 9-28721

Documento da Patente 8: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N0. 11 -1434

Documento da Patente 9: Pedido de Patente JaponesaDepositado em Aberto N°.2003-64084

Documento da Patente 10: Tradução Japonesa Publicada dapublicação de PCT internacional 8-503705

Documento da Patente 11: Tradução Japonesa Publicada dapublicação de PCT internacional 2001-500102

Documento da Patente 12: Tradução Japonesa Publicada dapublicação de PCT internacional 2001-506225

Documento da Patente 13: WO 97/18318Documento sem ser da Patente 1: Shiff, P.B. e Horwitz, S.B.,1981, "Tubulin: a target for chemotherapeutic agents" seção sobre "MolecularActions and Targets for Câncer Chemotherapeutic Agents", pp 483-507,Academic Press, NY, USA

Documento Sem ser da Patente 2: Glotz, J.S. e outros, 1992,Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 89:7026-7030

Documento Sem ser da Patente 3: Rowinsky, E.K. e outros,1990, Nature, 82:1247-1259

Documento Sem ser da Patente 4: Molecular Reproduction andDevelopment, 56:89-98,2000

Documento Sem ser da Patente 5: J. Med. Chem.34:1998,1991

Documento Sem ser da Patente 6: Tetrahedron Lett, 34:1035,1993

Documento Sem ser da Patente 7: Biochemistry, 28:6984,1989

Documento Sem ser da Patente 8: J. Med. Chem.,33:1721,1990

Divulgação da Invenção

Objetivo a ser resolvido pela presente invenção

Um objetivo da presente invenção é fornecer um método paraa introdução de uma substância extracelular em um oócito de mamífero,permitindo uma introdução segura e eficaz em um oócito de mamífero quandose introduz uma substância extracelular tais como um esperma, núcleo decélula, ácido nucléico e proteína em um oócito de mamífero, o que étecnicamente fácil. Um outro objetivo da presente invenção é fornecer ummétodo para a introdução de um esperma em um oócito de mamífero, o que étecnicamente fácil e causa menos danos ao oócito de mamífero quando seintroduz um esperma em um oócito de mamífero.Meios para resolver o objetivo

Os presentes inventores conduziram um estudo intensivo sobreum método para a introdução de um a substância extracelular tal como umesperma em um oócito de mamífero e descobriram que, pelo tratamento deum oócito de mamífero com um inibidor de polimerização de tubulina talcomo a vinblastina, é promovida uma fusão da membrana entre o oócito e oesperma, desse modo pode ser conseguida a fertilização pela fusão doesperma e do oócito sem fazer um orifício em um oolema. A presenteinvenção foi realizada dessa maneira.

Mais especificamente, com um método convencional para aintrodução de uma substância extracelular tal como um esperma em umoócito de mamífero, foi usado o Método de ICSI em que é feito em umorifício em um oolema com um capilar de vidro. O Método de ICSI étecnicamente difícil e a taxa de sucesso do mesmo é baixa. Além disso, há umefeito adverso sobre o desenvolvimento do embrião provocado pelo fato de sefazer um orifício no oolema com um capilar de vidro. Portanto, os presentesinventores conduziram um estudo intensivo sobre um método para aintrodução de um esperma que é tecnicamente fácil e causa menos danos nooócito e focalizado no desenvolvimento de um promotor para a introdução deum esperma para um oócito de mamífero, que promove a fusão da membranaentre um oócito e um esperma.

A fusão de membrana citoplásmica é indispensável para que afusão de um esperma e um oócito forneçam um oócito fertilizado. Os detalhesem relação a um mecanismo molecular para o controle da fusão da membranadurante a fertilização são desconhecidos, entretanto, verificou-se que osmicrotúbulos que têm a tubulina como uma unidade constituinte representamum papel importante nos recentes estudos dos inventores. Dado este fator, osefeitos de promotor da polimerização da tubulina e de inibidor em relação àfusão da membrana durante a fertilização foram investigados e foi descobertoque o inibidor de polimerização da tubulina, vinblastina, tem um efeitopromotor sobre a fusão do esperma a um oolema. Então, foi descoberto queeste tratamento químico permite que o esperma seja introduzido em um oócitosem realizar um orifício em um oolema.

Isto é, para investigar um mecanismo em que o tratamentocom a vinblastina promove a fusão da membrana, foi examinada a localizaçãodas proteínas da membrana em um oócito de camundongo que foi fertilizadoin vitro depois do tratamento com a vinblastina. Os resultados revelaram quea localização de uma proteína CD9 de quatro transmembranas, que se acreditacontrole a fusão da membrana, fosse diferente daquela de um tipo selvagem.O estudo até agora revelou que é essencial que uma área em que não estejapresente a CD9 em um oolema é formada transientemente pelo esperma paraque ocorra a fusão da membrana de fertilização. Foi descoberto que uma áreacircular em que a CD9 não está presente é formada antes da ligação doesperma por tratamento com vinblastina. Além disso, somente um espermafundido ao centro de uma área em que a CD9 não está presente.

A presente invenção foi completada à base de descobertasdescritas acima e um método da presente invenção pode ser aplicado nãoapenas ao caso da introdução de um esperma em um oócito de mamífero, mastambém ao caso da introdução de uma substância extracelular tais como umnúcleo de célula, ácido nucléico e proteína em um oócito de mamífero. Ouseja, a presente invenção refere-se a um método para a introdução de umasubstância extracelular tais como um esperma, um núcleo de célula, ácidonucléico e proteína em um oócito de mamífero pela utilização de umpromotor para a introdução de uma substância extracelular para um oócito demamífero que contém um inibidor de polimerização de tubulina como umingrediente ativo e a um promotor para a introdução de uma substânciaextracelular a um oócito de mamífero para o mesmo. Além disso, um aspectoda presente invenção é fornecer um método para promover a fertilização deum oócito de mamífero, pela promoção de um esperma em um oócito demamífero, por melhoria da fertilidade de um oócito de mamífero por umtratamento com um promotor para a introdução de uma substânciaextracelular para um oócito de mamífero que contém um inibidor depolimerização de tubulina como um ingrediente ativo.

Especificamente, a presente invenção compreende: (1) umpromotor para a introdução de uma substância extracelular para um oócito demamífero usado para a introdução de uma substância extracelular que contémum inibidor de polimerização de tubulina como um ingrediente ativo em umoócito de mamífero; (2) o promotor para a introdução de uma substânciaextracelular para um oócito de mamífero de acordo com (1), em que oinibidor de polimerização de tubulina é a vinblastina; (3) o promotor para aintrodução de uma substância extracelular para um oócito de mamífero deacordo com (1) ou (2), em que a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero é a introdução de um esperma no oócito demamífero; (4) o promotor para a introdução de uma substância extracelularpara um oócito de mamífero de acordo com (3), em que a introdução de umesperma no oócito de mamífero é promovida pela melhoria da fertilidade dooócito de mamífero; (5) o promotor para a introdução de uma substânciaextracelular para um oócito de mamífero de acordo com qualquer um de (1) a(4), em que o mamífero é um ser humano e (6) o promotor para a introduçãode uma substância extracelular para um oócito de mamífero de acordo comqualquer um de (1) a (4), em que o mamífero é selecionado do grupo queconsiste de um camundongo, um rato, gado, porco, cavalo, ovelha e macaco.

Além disso, a presente invenção compreende: (7) um métodopara a introdução de uma substância extracelular em um oócito de mamífero,em que o oócito de mamífero é tratado com um promotor para a introdução deuma substância extracelular para um oócito de mamífero que contém uminibidor de polimerização de tubulina como um ingrediente ativo, quando seintroduz a substância extracelular no oócito de mamífero; (8) o método para aintrodução de uma substância extracelular em um oócito de mamífero deacordo com (7), em que o oócito de mamífero é tratado com vinblastina,quando se introduz a substância extracelular no oócito de mamífero; (9) ométodo para a introdução de uma substância extracelular em um oócito demamífero de acordo com (7) ou (8), em que a introdução de uma substânciaextracelular em um oócito de mamífero é a introdução de um esperma em umoócito de mamífero; (10) o método para a introdução de uma substânciaextracelular em um oócito de mamífero de acordo com (9), em que aintrodução de uma substância extracelular em um oócito de mamífero éconseguida por fusão de esperma-oócito fora do corpo de um mamífero; (11)o método para a introdução de uma substância extracelular em um oócito demamífero de acordo com (9) ou (10), em que a introdução do esperma em umoócito de mamífero é promovida pela melhoria da fertilidade do oócito demamífero e (12) o método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero de acordo com (11), em que a melhoria dafertilidade do oócito de mamífero é a promoção da fusão do esperma a umoolema.

Breve Descrição das Figuras

[Fig. 1]

É uma figura que apresenta o resultado do número de espermafundido com um oócito como um resultado da fertilização in vitro de espermade camundongo e de oócito não fertilizado de camundongo isento de zonapelúcida que foi tratado com vinblastina, um inibidor de polimerização detubulina, em um exemplo da presente invenção.

[Fig- 2]

E uma figura que apresenta o resultado da razão de oócitosfertilizados que resultaram de uma fertilização in vitro de esperma decamundongo e um oócito de camundongo não fertilizado com zona pelúcidaque foi tratado com vinblastina, um inibidor de polimerização de tubulina, emum exemplo da presente invenção.

Melhor Modo de Realização da Invenção

Um método da presente invenção inclui o tratamento do oócitode mamífero com um promotor para a introdução de uma substânciaextracelular para o oócito de mamífero que contém um inibidor depolimerização de tubulina como um ingrediente ativo e a introdução dasubstância extracelular no oócito de mamífero quando se introduz umasubstância extracelular tal como esperma em um oócito de mamífero. Comoum inibidor de polimerização de tubulina usada como um ingrediente ativo dopromotor para a introdução de uma substância extracelular pára o oócito demamífero da presente invenção, pode ser usado um inibidor de polimerizaçãode tubulina que é publicamente conhecido como um inibidor para apolimerização da tubulina. O inibidor de polimerização de tubulina incluialcalóide vinca e exemplos típicos de alcalóide vinca incluem vinblastina evincristina. Como um ingrediente ativo mais preferível ainda do promotorpara a introdução de uma substância extracelular para o oócito de mamíferoda presente invenção, pode ser exemplificada a vinblastina.

Um oócito de mamífero de interesse na presente invençãoinclui, mas não especialmente limitado a, um oócito de um ser humano, decamundongo, de rato, de gado, de porco, de cavalo e de macaco. Um métodode introdução de uma substância extracelular em um oócito de mamífero deacordo com a presente invenção pode ser aplicado a substâncias extracelularestais como um esperma, um núcleo de célula, um ácido nucléico e umaproteína. No entanto, o método para a introdução de uma substânciaextracelular de acordo com a presente invenção pode ser especialmenteaplicado à introdução de um esperma em um oócito de mamífero, desse modopode ser fornecido com um método eficaz de fertilização de um oócito demamífero.Na presente invenção, o tratamento de um oócito de mamíferocom o promotor para a introdução de uma substância extracelular para o oócito demamífero que contém um inibidor de polimerização de tubulina como um ativo,pode ser realizado por: coleta de um oócito, cultura em um meio adequado (porexemplo, meio TYH) seguida por cultura no meio ao qual foi adicionado uminibidor de polimerização de tubulina durante algumas horas.

Embora a invenção seja descrita com mais detalhe a seguir pormeio de exemplos, o âmbito técnica da presente invenção não é limitado aosmesmos.

EXEMPLO 1

(Aumento na eficiência de fertilização por tratamento com vinblastina)

Para examinar a influência de um inibidor de polimerização detubulina sobre a fertilização de um oócito não fertilizado de camundongo, foiusada vinblastina como um inibidor de polimerização de tubulina para tratarum oócito não fertilizado de camundongo. Então foi investigada a fertilidadedo mesmo.

(Materiais e condições experimentais)

<table>table see original document page 14</column></row><table>Ajustar o pH até 2,5 com HCl e esterilizado com filtro.

3. Temperatura de Cultivo: 37°C(Operação de experimento)

1. Coleta de Oócito

(1) Camundongos com oito semanas de idade ou mais velhosforam adquiridos e tornados adaptados para crescer em ambiente durante 1semana antes do uso.

PMS (Serotropina exclusive para animal, fabricada porASUKA Pharmaceutical) foi injetada em uma quantidade de 0,11 ml nacavidade abdominal do camundongo a 8:00 pm.

(2) 48 horas mais tarde, HCG (Gonadotropina exclusive paraanimal, fabricada por ASUKA Pharmaceutical) foi injetada em umaquantidade de 0,11 ml na cavidade abdominal.

(3) Os camundongos foram eutanasiados no dia seguinte (14 a16 horas depois da injeção de HCG)e a ampola do oviduto foi removida. Umoócito circundado por células cumulus foi coletado e cultivado em uma gota(100 nL) de meio de TYH.

(4) AS células cumulus foram removidas por tratamento comhialuronidase (300 μg/mL), então o oócito foi cultivado em meio TYHdurante 3 horas. No caso de se conduzir a remoção da zona pelúcida, a zonapelúcida do oócito foi removida por tratamento com uma solução ácida deTyrode seguido por cultura do oócito em meio TYH durante 3 horas.

2. Tratamento com um inibidor de polimerização de tubulina

O oócito não fertilizado coletado foi tratado por utilização devinblastina (VB) como um inibidor de polimerização de tubulina. Comocontroles, foram usados um oócito tratado com paclitaxel (Pac; Nome deMarca: taxol), um promotor de polimerização de tubulina e um oócito nãotratado (controle). O tratamento com vinblastina (VB) foi conduzido porcultura do oócito em solução de vinblastina a 20 μΜ (meio TYH) durante 1hora, enquanto foi conduzido tratamento com paclitaxel (Pac) por cultura dooócito em 10 μΜ de solução de paclitaxelel (Pac) (em meio TYH)similarmente durante hora.

3. Fertilização in vitro

O oócito não fertilizado de camundongo foi tratado comvinblastina (VB)5 um inibidor de polimerização de tubulina e a fertilização invitro foi conduzida com esperma de camundongo. Como controles, foramusados um oócito não fertilizado tratado com paclitaxel (Pac; Nome deMarca: taxol), um promotor de polimerização de tubulina e um oócito nãotratado (controle).

(Resultados)

(No caso em que foram usados oócitos isentos de zona pelúcida):

Para avaliar quantitativamente a eficiência da fusão deesperma-oócito, oócitos não fertilizados de camundongo isentos de zonapelúcida foram tratados com vinblastina (VB), um inibidor de polimerizaçãode tubulina ou paclitaxel (Pac), promotor de polimerização de tubulina oudeixado não tratado (controle). Então os oócitos foram fertilizados in vitrocom esperma de camundongo, respectivamente. Os resultados sãoapresentados na Fig. 1. A figura apresenta os resultados da fertilização in vitro(oócitos isentos de zona pelúcida, 1 hora depois da inseminação). Na figura,as barras brancas apresentam o número de esperma fundido. Quando secompara o número de esperma que fundiu com os oócitos 1 hora depois dainseminação, o oócito tratado com a VB (vinblastina)- apresentou o maiornúmero. Por outro lado, um grande número de esperma aderiu à superfície dooócito tratado com paclitaxel (Pac) orem não fundiu com o mesmo, porque ooócito tratado com paclitaxel tornou o esperma difícil de ser fundido.

(No caso em que são usados oócitos com zona pelúcida):

Os oócitos não fertilizados de camundongo um instante depoisda ovulação, que não tinha sido submetido a tratamento especial tal comoremoção da zona pelúcida, foram tratados com vinblastina, um inibidor depolimerização de tubulina e fertilizado in vitro com esperma de camundongo.

Os resultados são apresentados na Fig. 2. Foi conduzido um experimento queusa anticorpo CD9 anti-camundongo que tem um efeito inibidor sobre a fusãosimultaneamente com este experimento. No caso de camundongo,aproximadamente 20% dos oócitos não podem ser fertilizados emconseqüência da imaturidade e da super-maturidade. No entanto, depois dainvestigação da fertilização que usa os oócitos no estágio de 2 células, aeficiência da fertilização dos oócitos tratados com vinblastina aumentou uns20% em comparação àquela do oócito não tratado. Como será descrito aseguir, até mesmo um oócito imaturo podia ser fundido com esperma quandotratado com vinblastina. Desse modo, acredita-se que isto seja o resultado damaior eficiência de fusão de esperma-oócito devido ao tratamento comvinblastina. O resultado experimental revela que oócitos imaturos ou super-maduros se tornam possíveis para fundir com o esperma por tratamento comvinblastina. Além disso, a eficiência de fusão dos oócitos que foram tratadoscom anticorpo CD9 anti-camundongo que tem um efeito inibidor, também foiaumentada pelo tratamento com vinblastina.

(Aumento da eficiência de fertilização pelo tratamento com vinblastina)

Depois do tratamento dos oócitos não fertilizados decamundongo com vinblastina, um inibidor de polimerização de tubulina, osoócitos foram fertilizados in vitro com esperma de camundongo. Osresultados revelaram que a eficiência de fertilização dos mesmos aumentou20% em comparação a um grupo não tratado. No caso do camundongo,aproximadamente 20% dos oócitos não podem ser fundidos com esperma emvirtude da imaturidade.No entanto, até mesmo oócitos imaturos podiam sefundir com esperma quando tratados com vinblastina.

(Tratamento com paclitaxelel)

Quando um oócito não fertilizado de camundongo foi tratadocom paclitaxelel (Pac), promotor de polimerização de tubulina, foi inibida afusão de esperma-membrana do oócito. Foram observados alguns microvilosdeformados quanto a morfologia da membrana do oócito foi examinada comum microscópio eletrônico.

(Formação de área de fusão do esperma por tratamento com vinblastina)

Foi investigado o mecanismo pelo qual a fusão da membranafoi promovida por tratamento com vinblastina. Depois do tratamento comvinblastina, foi examinada a localização das proteínas da membrana em umoócito de camundongo fertilizado in vitro. Quando tratado com vinblastina,um inibidor de polimerização de tubulina, foram formadas áreas circularesonde a localização de CD9 sobre a membrana do oócito não varia. O númerode áreas circulares diferia dependendo dos oócitos e estava na faixa de 1 a 6.

Além disso, foi confirmado que um esperma foi fundido ao centra de áreascirculares. Isto demonstra que a despolimerização da tubulina é necessáriapara a fusão do esperma.

A saber, os resultados revelaram que a localização de umaproteína CD9 de quatro transmembrana, que se acredita controle a fusão damembrana, era diferente daquela do tipo selvagem. O estudo até agorarevelou que é essencial que uma área em que a CD9 não está presente éformada transientemente pelo esperma sobre um oolema para a ocorrência dafusão da membrana de fertilização. Foi descoberto que é formada uma áreacircular em que a CD9 não está presente por tratamento com vinblastina antesda ligação de com esperma. Além disso, apenas um esperma fundido aocentro de uma área onde a CD9 não está presente. Além disso, foi confirmadoque, na fertilização de um oócito com uma membrana semi-permeável, onúmero de esperma a ser introduzido no oócito é limitado a um em virtude doseu mecanismo de bloqueio da poliespermia. Por estes resultados, tornou-seaparente que, pelo tratamento da área específica da membrana do oócito comvinblastina, a introdução de esperma em um oócito se torna possível sem autilização de um capilar de vidro.

Aplicabilidade Industrial

A presente invenção pode fornecer um método para aintrodução de uma substância extracelular em um oócito de mamífero, quepermite uma introdução segura e eficaz em um oócito de mamífero quando seintroduz uma substância extracelular tais como um esperma, um núcleo decélula, ácido nucléico e proteína em um oócito de mamífero, que étecnicamente fácil. Especificamente, um método da presente invenção podeser aplicado com um método de introdução de um esperma em um oócito demamífero e fornecer um método tecnicamente fácil sem utilizar umdispositivo especial tal como aquele usado no Método de ICSI convencional epermite que o esperma seja introduzido em um oócito de mamífero causandomenos danos para o oócito de mamífero, porque não é necessário que se façaum orifício no oolema com um capilar de vidro como no Método de ICSI.

Portanto, pode-se esperar que a presente invenção possa contribuir para odesenvolvimento no campo da modificação de mamíferos que usa terapiagênica, tratamento em reprodução ou engenharia de desenvolvimento, comoum meio útil para a introdução de uma substância extracelular tais como umesperma, um núcleo de célula, ácido nucléico e proteína em um oócito demamífero, para fertilização ou modificação de células germinativas.

Claims

1. Promotor para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero, caracterizado pelo fato de que é usado para aintrodução de uma substância extracelular que contém um inibidor depolimerização de tubulina como um ingrediente ativo em um oócito demamífero.

2. Promotor para a introdução de uma substância extracelularpara um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o inibidor de polimerização de tubulina é a vinblastina.

3. Promotor para a introdução de uma substância extracelularpara um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a introdução de uma substância extracelular emum oócito de mamífero é a introdução de um esperma no oócito de mamífero.

4. Promotor para a introdução de uma substância extracelularpara um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que a introdução de um esperma no oócito de mamífero épromovida pela melhoria da fertilidade do oócito de mamífero.

5. Promotor para a introdução de uma substância extracelularpara um oócito de mamífero de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

6. Promotor para a introdução de uma substância extracelularpara um oócito de mamífero de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mamífero é selecionado do grupo queconsiste de um camundongo, um rato, gado, porco, cavalo, ovelha e macaco.

7. Método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero, caracterizado pelo fato de que o oócito demamífero é tratado com um promotor para a introdução de uma substânciaextracelular para um oócito de mamífero que contém um inibidor depolimerização de tubulina como um ingrediente ativo, quando se introduz asubstância extracelular no oócito de mamífero.

8. Método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o oócito de mamífero é tratado com vinblastina, quando seintroduz a substância extracelular no oócito de mamífero.

9. Método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 7 ou 8,caracterizado pelo fato de que a introdução de uma substância extracelular emum oócito de mamífero é a introdução de um esperma no oócito de mamífero.

10. Método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a introdução de uma substância extracelular em um oócito demamífero é conseguida pela fusão in vitro de esperma-oócito.

11. Método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que a introdução de um esperma em um oócito demamífero é promovida pela melhoria da fertilidade do oócito de mamífero.

12. Método para a introdução de uma substância extracelularem um oócito de mamífero de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a melhoria da fertilidade do oócito de mamífero é apromoção da fusão do esperma a um oolema.