BRPI0610821A2 - método de identificação de compostos que modulam a interação de receptor de androgênio com beta-catenina - Google Patents

método de identificação de compostos que modulam a interação de receptor de androgênio com beta-catenina Download PDF

Info

Publication number
BRPI0610821A2
BRPI0610821A2 BRPI0610821-0A BRPI0610821A BRPI0610821A2 BR PI0610821 A2 BRPI0610821 A2 BR PI0610821A2 BR PI0610821 A BRPI0610821 A BR PI0610821A BR PI0610821 A2 BRPI0610821 A2 BR PI0610821A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
catenin
androgen
test compound
dna
sequence
Prior art date
Application number
BRPI0610821-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Edward Judson Kilbourne
Thomas J Berrodin
Original Assignee
Wyeth Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth Corp filed Critical Wyeth Corp
Publication of BRPI0610821A2 publication Critical patent/BRPI0610821A2/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

MéTODO DE IDENTIFICAçãO DE COMPOSTOS QUE MODULAM A INTERAçãO DE RECEPTOR DE ANDROGêNIO COM BETA-CATENINA. A presente invenção refere-se a métodos para determinação de se compostos de teste são capazes de modular a interação entre receptor de androgênio e <225>-catenina. Métodos para determinação de se um composto de teste seletivamente modula um curso de sinalização de receptor de androgênio em um curso de sinalização de <225>-catenina-Wnt ou um curso de sinalização de <225>-catenina-Wnt em um curso de sinalização de receptor de androgênio são também descritas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DEIDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS QUE MODULAM A INTERAÇÃO DERECEPTOR DE ANDROGÊNIO COM BETA-CATENINA".
Referência Cruzada a Pedido Relacionado
O presente pedido reivindica prioridade do Pedido ProvisórioU.S. N2 60/682.580 depositado em 19 de maio de 2005, que é aqui incorpo-rado a título de referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a um ensaio para identificação decompostos que modulam a interação dependente de androgênio entre re-ceptor de androgênio (AR) e (3-catenina. A presente invenção refere-se par-ticularmente à identificação de moléculas que podem ser capazes de rompera interação de receptor de androgênio e (3-catenina e então especificamenteremover o efeito de (3-catenina sobre a sinalização de AR ou remover o efei-to de AR sobre sinalização de p-catenina e Wnt.
Antecedentes da Invenção
Tradicionalmente, ligantes de ligação de receptor nuclear/esteró-ide são identificados através de avaliação da habilidade de compostos deteste em realizar a transcrição de genes contendo elementos de DNA dereceptor nuclear de consenso responsivos a este receptor nuclear/esteróide.No entanto, alguns receptores esteróides também afetam, e são afetadospor, cursos de sinalização não-esteroidais em adição aos seus mecanismosde controle transcripcional esteroidal clássicos. Em muitos casos, seria útilter um meio para identificar compostos específicos que fossem seletivamen-te eficazes na modulação apenas do curso de sinalização não-esteroidalassociado ao tal receptor ou compostos que fossem seletivamente eficazesna modulação apenas das atividades transcripcionais do receptor sobre ge-nes tradicionalmente responsivos a tal receptor. Compostos com tal seletivi-dade teriam utilidade farmacêutica potencial em situações onde modulaçãodo curso não-esteroidal é desejada mas inibição de transcrição mediada porreceptor esteróide clássico não é desejada, ou vice-versa.
É sabido, por exemplo, que o receptor de androgênio (AR), umreceptor esteróide clássico que é sabido ativar a transcrição de genes res-ponsivos a AR, também afeta o curso de sinalização Wnt através da intera-ção mediada por androgênio de AR com (3-catenina (1,2,3). O curso Wnt de-sempenha um papel importante na diferenciação e atividade funcional deuma variedade de tecidos incluindo osso, intes.tino, pele e folículos pilosos.Alterações no curso Wnt têm sido implicadas em estados de doença tal co-mo osteoporose e câncer de próstata e colo. Outras condições onde sinali-zação Wnt pode ficar alterada incluem resistência à insulina em síndrome doovário policístico e alòpecia androgênica (4,5). Em muitas dessas condições,androgênios e AR têm sido implicados como sendo moduladores potenciaisdo curso Wnt.
A presente invenção descreve um novo ensaio de avaliação pa-ra identificar compostos que modulam a interação de receptor de androgêniocom (3-catenina. Quando usado em conjunto com ensaios padrão medindo amodulação de transcrição dependente de AR mediada por androgênio clás-sico, o ensaio da invenção permite que o usuário identifique novas classesde moduladores de AR que seletivamente inibem a habilidade de AR eminteragir com (3-catenina e modulam sua atividade sem afetar atividade ago-nista ou antagonista de AR clássica tal como, por exemplo, transcrição porAR mediada por androgênio. Compostos com esta atividade seletiva nãopoderiam ser detectados usando ensaios transcripcionais de AR clássicossozinhos.
Sumário da Invenção
A presente invenção prove um método de determinação de seum composto de teste é capaz de modular a interação entre receptor de an-drogênio (AR) e (3-catenina compreendendo as etapas de:
(a) provisão de uma célula compreendendo:
(i) uma seqüência de DNA codificando uma proteína hí-brida compreendendo um domínio de ligação de DNAfundido à região terminal NH3 de (3-catenina,
(ii) uma seqüência de DNA compreendendo uma seqüên-cia de ativação a montante correspondendo ao ditodomínio de ligação de DNA operavelmente ligada a econtrolando a transcrição de um gene repórter, e(iii) uma seqüência de DNA codificando proteína receptorade androgênio,
(b) introdução do composto de teste na célula, opcionalmentena presença de androgênio; e
(c) medição da expressão do gene repórter,onde uma diminuição ou aumento de expressão pelo gene repórter indicaque a molécula de teste é capaz de modular a interação entre receptor deandrogênio e (3-catenina.
Em um modo preferido, a presente invenção prove ainda um mé-todo onde o domínio de ligação de DNA de (i) compreende um domínio deligação de DNA GAL-4; e a seqüência de DNA de ativação a montante ope-ravelmente ligada a um gene repórter de (ii) compreende GAL-4 UAS opera-velmente ligada ao gene repórter.
Em um modo mais preferido, a presente invenção prove aindaonde a região terminal NH3 de (3-catenina de (i) compreende aminoácidos 2a 424 de (3-catenina humana; onde o gene repórter é luciferase; onde há có-pias múltiplas da seqüência GAL-4 UAS operavelmente ligadas ao gene luci-ferase; onde a modulação realizada pelo composto de teste é uma diminuiçãona expressão do gene luciferase; e onde o androgênio na etapa (b) é DHT.
Um outro aspecto da invenção é quanto a um método de deter-minação de se um composto de teste é capaz de modular a interação entrereceptor de androgênio e (3-catenina compreendendo as etapas de:
(a) provisão de uma célula compreendendo:
(i) uma seqüência de DNA codificando uma proteína híbri-da compreendendo um domínio de ligação de DNAfundido à (3-catenina,
(ii) uma seqüência de DNA compreendendo uma seqüên-cia de ativação a montante correspondendo ao ditodomínio de ligação de DNA operavelmente ligada a umgene repórter, e(iii) uma seqüência de DNA codificando proteína receptorade androgênio,
(b) introdução do composto de teste na célula, opcionalmentena presença de androgênio; e (c) medição da expressão do gene repórter, onde um aumentoou diminuição de expressão pelo gene repórter indica que amolécula de teste é capaz de modular a interação entre re-ceptor de androgênio e (3-catenina.
Um outro aspecto é quanto a um método de determinação de seum composto de teste seletivamente modula o curso de sinalização de (3-cate-nina-Wnt em um curso de sinalização de receptor de androgênio compreen-dendo:
(a) identificação de um composto de teste que aumente ou di-minua a expressão de um gene através da inibição da inte-ração com (3-catenina mediada por AR, onde o composto deteste remove a repressão de AR ligado (liganded) a andro-gênio sobre a sinalização Wnt sem reprimir a transcriçãomediada por AR de androgênio; e
(b) ensaio do composto de teste de (a) para determinar se ocomposto de teste aumenta ou diminui a expressão de umgene através de um curso de sinalização de receptor deandrogênio independente de (3-catenina;com o que o composto de teste de (a) seletivamente modula o curso de sina-lização de (3-catenina-Wnt através da inibição da habilidade de AR ligado aandrogênio para interagir com (3-catenina se o composto de teste falhar emaumentar ou diminuir a expressão de um gene através de um curso de sina-lização de receptor de androgênio.
Um aspecto adicional é quanto um método de determinação dese um composto de teste seletivamente modula um curso de sinalização dereceptor de androgênio em um curso de sinalização de (3-catenina-Wnt com-preendendo:
(a) identificação de um composto de teste que aumente ou di-minua a expressão de um gene através de um curso de si-nalização de receptor de androgênio; e(b) ensaio do composto de teste de (a) para determinar se ocomposto de teste aumenta ou diminui a habilidade de ARligado a hidrogênio ou AR não-ligado em inibir a sinalizaçãode (3-catenina-Wnt;
com o que o composto de teste de (a) seletivamente modula um curso desinalização de receptor de androgênio sem remover repressão de AR ligadoa androgênio de sinalização Wnt ou não promove a interação entre AR e (3-catenina na ausência de um agonista de AR resultando no composto de tes-te não tendo nenhuma atividade em aumento ou diminuição da expressão deum gene regulado pelo curso de sinalização de |3-catenina-Wnt.
Breve Descrição das Figuras
A figura 1 mostra os construtos de plasmídeo usados em umamodalidade da invenção.
A figura 2 é um Western blot demonstrando que diidrotestoste-rona (DHT) estimula a interação entre AR e (3-catenina em células L929.
A figura 3 é um gráfico em barras ilustrando que o método dainvenção mede a interação dependente de DHT entre AR e (3-catenina.
A figura 4 é um gráfico em barras ilustrando que a interação pro-teína-proteína entre (3-catenina e receptores nucleares é específica para AR.
A figura 5 é um gráfico ilustrando que a interação estimulada porDHT entre AR e (3-catenina é inibida pelo antagonista de AR acetato de ci-proterona.
A figura 6 mostra a seqüência de aminoácido para (3-cateninahumana (N- de Acesso no GenBank® 2208332A; SEQ ID NO: 1).
Descrição Detalhada
As requerentes especificamente incorporam os conteúdos inte-grais de todas as referências citadas nesta descrição. Ainda, quando umaquantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro é dado ou como umafaixa, faixa preferida ou uma lista de valores preferidos superiores e valorespreferidos inferiores, isto deve ser compreendido como especificamentemostrando todas as faixas formadas de qualquer par de qualquer limite defaixa superior ou valor preferido ou qualquer limite de faixa inferior ou valorpreferido, não importando se as faixas são separadamente descritas. Ondeuma faixa de valores numéricos for mencionada aqui, a menos que de outromodo declarado, a faixa pretende incluir os se,us pontos finais, e todos osinteiros e frações dentro da faixa. Não é pretendido que o escopo da inven-ção seja limitado aos valores específicos mencionados quando definindouma faixa.
A presente invenção avalia a interação dependente de androgê-nio entre AR e p-catenina e utiliza i) uma primeira seqüência de DNA com-preendendo DNA codificando uma proteína híbrida compreendendo um do-mínio de ligação de DNA fundido à p-catenina; ii) uma segunda seqüênciade DNA compreendendo uma seqüência de ativação a montante capaz dereconhecer o domínio de ligação de DNA de (i) que é operavelmente ligadaa um gene repórter; e iii) uma terceira seqüência de DNA codificando proteí-na AR. O método da invenção envolve provisão de compostos de teste auma célula compreendendo e capaz de expressar as seqüências de DNA i, iie iii, opcionalmente na presença de um androgênio, para determinar se ocomposto de teste é capaz de modular a interação estimulada por androgê-nio de p-catenina e receptor de androgênio, conforme medido através dedetecções de expressão do gene repórter. Se a expressão do gene repórterfor não-afetada pela adição do composto de teste à célula, tal composto éincapaz de modular a interação dependente de androgênio de p-cateninacom receptor de androgênio. Em um modo preferido, o domínio de ligaçãode DNA de (i) compreende o domínio de ligação de DNA de GAL 4; a se-qüência de ativação a montante operavelmente ligada ao gene repórter de(ii) é GAL-4-UAS; e o gene repórter é luciferase. Em uma modalidade maispreferida da invenção, cópias múltiplas da seqüência de ativação a montantesão operavelmente ligadas ao gene repórter, e a p-catenina de (i) que é fun-dida ao domínio de ligação de DNA compreende os aminoácidos 2 a 424 deP-catenina humana.
As requerentes demonstraram que seu ensaio é uma medidaseletiva da interação dependente de androgênio entre AR e (3-catenina. Emgeral, em modo de avaliação, células transformadas com as seqüências deDNA da invenção são tratadas com um androgênio tal como diidrotestoste-rona (DHT) que causa a interação de AR e (3-catenina resultando em ativi-dade repórter aumentada. Moléculas que diminuem a atividade repórter po-dem ser identificadas e testadas mais em ensaios secundários quanto à suahabilidade em romper a interação entre AR e elementos de consenso deresposta de DNA que se ligam a AR ligado e causam a ativação ou inibiçãode transcrição. Moléculas identificadas através desta metodologia nesta ava-liação podem ser particularmente úteis como tratamentos para alopecia an-drogênica, câncer de próstata e sensibilidade à insulina em síndrome do o-vário policístico.
O ensaio das requerentes é similar ao ensaio de ligação de doishíbridos de Fields e outros (6,7), que utiliza um híbrido compreendendo umaproteína fundida a um domínio de ligação de DNA, e um híbrido secundáriocompreendendo uma proteína fundida a um domínio de ativação de transcri-ção. O presente ensaio de ligação de um híbrido é distinto, no entanto, pelofato de que ele deve favorecer a identificação de moléculas que podem sercapazes de romper a interação de AR e (3-catenina e então especificamenteremover o efeito de (3-catenina sobre a sinalização de AR ou remover o efei-to de AR sobre sinalização de (3-catenina ou Wnt. Ainda, em um modo prefe-rido, apenas uma porção da seqüência de codificação de (3-catenina é fundi-da ao domínio de ligação de DNA GAL4 (GAL4 DBD). Devido ao fato dopresente ensaio utilizar AR do tipo selvagem, de comprimento completo, aproteína AR toda está disponível para direcionamento e compostos de testenão são bloqueados de ligação a AR por um construto de fusão. Em contras-te, no ensaio de dois híbridos (6,7), o uso de dois construtos de proteína defusão recombinantes tem a desvantagem que a conformação natural da pro-teína alvo pode ser alterada no construto de fusão.
Um ensaio da invenção pode ser conduzido nas, por exemplo,células CV-1 bem caracterizadas e amplamente usadas (linhagem de célulade rim de macaco verde Africano) ou células COS (linhagem de célula de rimde macaco verde Africano), mas uma pessoa versada na técnica reconhece-ria que outras linhagens de célula são adequadas também.
Um aspecto adicional da invenção é quanto um método de de-terminação de se um composto de teste seletivamente modula um curso desinalização de p-catenina-Wnt em um curso de sinalização de receptor deandrogênio. No método, compostos.de teste são identificados com base emsua habilidade em aumentar ou diminuir a expressão de um gene através damodulação da repressão mediada por AR de androgênio do curso de sinali-zação de p-catenina-Wnt. "Modulação mediada por receptor de androgênioligado a androgênio do curso de sinalização de p-catenina-Wnt" ou, conformeaqui usado, refere-se a um curso de sinalização resultando em um aumento oudiminuição transcripcional de qualquer gene modulado pelo curso de sinali-zação mediado por Wnt iniciado através de uma interação de receptor deandrogênio/p-catenina (vide, por exemplo, Mulholland, D. J. e outros, J. Biol.Chem. 277:17933-43 (2002); Yang, F. e outros, J. Biol. Chem. 277:11336-44(2002); Song L.N. e outros, Mol. Cell. Biol. 23:1674-87 (2003)).
Métodos de avaliação da interação de receptor de androgêniocom p-catenina são de preferência utilizados para identificar compostos deteste capazes de aumentar ou diminuir a expressão de um gene através damodulação da interação de AR e p-catenina resultando em repressão ouinibição de repressão mediada por AR de androgênio sobre o curso de sina-lização de p-catenina-Wnt. Em um contexto específico de tipo de célula, ainteração entre AR e p-catenina pode ter um efeito positivo sobre a sinaliza-ção Wnt ou sinalização mediada por AR. Nesta modalidade, reguladorespositivos da interação AR-p-catenina seriam desenvolvidos como ativadoresde Wnt.
Um composto de teste que positivamente ou negativamente afe-ta a habilidade de AR ligado a androgênio em modular sinalização transcrip-cional de p-catenina-Wnt é então ensaiado para determinar se o compostode teste aumenta ou diminui a expressão de um gene através de um cursode sinalização de receptor de androgênio. "Curso de sinalização de receptorde androgênio" ou "curso de sinalização de AR", conforme aqui usado, refe-re-se ao curso transcripcional tradicional do receptor de androgênio. Em res-posta à ligação de um ligante, receptor de androgênio migra para o núcleode uma célula onde ele forma um homodímero. Quando da ligação a um e-lemento de resposta de androgênio (ARE) como um homodímero, AR ligadoa agonista estimula a transcrição através do recrutamento de um complexoco-ativador enzimático grande que inclui GRIP1/TIF2, CBP/p300 e outros co-ativadores. Ainda, AR ligado a ligante pode também suprimir a transcriçãoatravés de interação proteína-proteína com complexos de fator de transcri-ção tal como, por exemplo, família AP1, NF-kB e Ets.
Uma pessoa versada na técnica reconheceria que qualquer en-saio de avaliação de curso de sinalização de AR é útil na presente invenção.
Compostos de teste que falham em aumentar ou diminuir a ex-pressão de um gene através de um curso de sinalização de androgênio, napresença ou ausência de androgênios endógenos ou exógenos naturais,seletivamente modulam um curso de sinalização de (3-catenina-Wnt. Por "fa-lha em aumentar ou diminuir a expressão de um gene" se quer dizer quenenhum aumento ou diminuição de expressão de gene é observável atravésde técnicas de ensaio conhecidas de uma pessoa versada na técnica talcomo, por exemplo, Northern Blotting, Western Blotting, Southern Blotting,ensaios de repórter de plasmídeo ou reação de cadeia de polimerase (PCR),ou através da observação de mudanças gerais em morfologia ou funções desistema de órgão in vivo (animal) sabidas ser moduladas por androgênios ou(3-catenina. Um exemplo de efeitos de modelo de animal conhecidos de an-drogênios seriam os efeitos de moduladores de AR e moduladores de Wntsobre o crescimento/peso da próstata em roedores/mamíferos onde agonis-tas de AR aumentam o crescimento de célula da próstata e peso do órgão eantagonistas de AR inibem este efeito de androgênios.
Uma modalidade alternativa é quanto a um método de determi-nação de se um composto de teste seletivamente modula um curso de sina-lização de receptor de androgênio em um curso de sinalização de (3-catenina-Wnt. No método, compostos de teste são identificados com base em suahabilidade em aumentar ou diminuir a expressão de um gene através de umcurso de sinalização de receptor de androgênio através de métodos confor-me são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Um composto deteste que positivamente ou negativamente afeta sinalização de AR é entãoensaiado para determinar se o composto de teste aumenta ou diminui a ex-pressão de um gene através de um curso de sinalização de p-catenina-Wntmediado por AR conforme acima descrito.
Dentro do contexto do relatório da Requerente, termos terão seusignificado técnico comum na técnica a menos que de outro modo indicado.Alguns termos e aspectos da invenção são descritos mais abaixo.
O termo "receptor de androgênio" ou "AR" refere-se à proteínaAR conforme definido pela sua seqüência de codificação de aminoácidoconservada em uma conformação estrutural ativa ou nativa.
"Hibridização" inclui uma reação onde um ou mais polinucleotí-deos reagem para formar um complexo que é estabilizado através de ligaçãohidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo. A ligação hidrogêniopode acontecer através de emparelhamento de base Watson-Crick, ligaçãoHoogstein ou de qualquer outra maneira específica de seqüência. O comple-xo pode compreender dois filamentos formando uma estrutura dúplex, trêsou mais filamentos formando um complexo multifilamento, um filamento deauto-hibridização simples ou qualquer combinação desses. Uma reação dehibridização pode constituir uma etapa em um processo mais extensivo, talcomo a iniciação de uma reação de PCR, ou a clivagem enzimática de umpolinucleotídeo por uma ribozima.
Reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de"estringência" diferente. A estringência de uma reação de hibridização incluia dificuldade com a qual quaisquer duas moléculas de ácido nucléico vãohibridizar uma para a outra. Sob condições estringentes, moléculas de ácidonucléico pelo menos 65%, 70%, 75% ou mais idênticas uma à outra perma-necem hibridizadas uma para a outra, enquanto moléculas com baixa identi-dade percentual não podem permanecer hibridizadas. Um exemplo não-limitante, preferido, de condições de hibridização altamente estringentes sãohibridização em 6x de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a50°C, de preferência a 55°C, com mais preferência a 60°C e com mais pre-ferência ainda a 65°C.
Quando a hibridização acontece em uma configuração antipara-leia entre dois polinucleotídeos de filamento simples, a reação é chamada"anelamento" e esses polinucleotídeos são descritos como "complementares".Um polinucleotídeo de filamento duplo pode ser "complementar" ou "homó-logo" a um outro polinucleotídeo se hibridização acontecer entre um dos fi-lamentos do primeiro polinucleotídeo e do segundo. "Complementaridade"ou homologia é quantificável em termos da proporção de bases em filamen-tos opostos que são esperados ligar com hidrogênio um ao outro, de acordocom regras de emparelhamento de base geralmente aceitáveis.
O termo "(3-catenina" é usado para compreender proteínas decomprimento completo compreendendo, por exemplo, na proteína humana,781 aminoácidos e também fragmentos da seqüência de aminoácido da(3-catenina conforme descrito, por exemplo, na Figura 6 (SEQ ID NO: 1). For-mas preferidas da proteína incluem particularmente aminoácidos de 1 a cer-ca de 423. Em outras modalidades, uma proteína (3-catenina tem pelo me-nos 65%, pelo menos 70% de identidade de aminoácido, com mais prefe-rência 80% de identidade de aminoácido, com mais preferência 90% e commais preferência ainda 95% de identidade de aminoácido com a seqüênciade aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 ou uma porção dela.
Em uma outra modalidade, o termo "(3-catenina" é usado paracompreender proteínas de comprimento completo ou seus fragmentos codi-ficados por polinucleotídeos que hibridizam sob condições estringentes paraum polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1ou um seu fragmento ou complemento. De preferência, as condições sãotais de modo que as seqüências pelo menos 65%, de preferência pelo me-nos cerca de 70%, com mais preferência pelo menos cerca de 80%, commais preferência ainda pelo menos cerca de 85% ou 90% homólogas umasàs outras tipicamente permanecem hibridizadas umas para as outras. Depreferência, um polinucleotídeo de (3-catenina que hibridiza sob condiçõesestringentes para uma seqüência de polinucleotídeo que codifica a seqüên-cia de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou seus fragmentos ou complementoscorresponde a uma molécula de ácido nucléico de ocorrência natural.
Em adição a variantes alélicas de ocorrência natural de seqüên-cias de p-catenina que podem existir na população, o versado na técnica vaicompreender ainda que mudanças pequenas podem ser introduzidas atravésde mutação nas seqüências de polinucleotídeo que codificam, por exemplo,a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, deste modo levando a mudan-ças na seqüência de aminoácido da proteína codificada, sem alterar a ativi-dade funcional de uma proteína (3-catenina. Por exemplo, substituições denucleotídeo que levam a substituições de aminoácido em resíduos de ami-noácido "não-essenciais" podem ser feitas em uma seqüência de polinucleo-tídeo que codifica a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. Um resíduode aminoácido "não-essencial" é um resíduo que pode ser alterado da se-qüência do tipo selvagem de um polinucleotídeo de p-catenina (por exemplo,um polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1) sem alterar a atividade funcional de uma molécula de p-catenina. Resí-duos exemplares que são não-essenciais e, então, receptivos à substituição,podem ser identificados por um versado na técnica através da realização deum alinhamento de aminoácido de moléculas relacionadas com p-catenina edeterminação de resíduos que não são conservados. Tais resíduos, devidoao fato deles não terem sido conservados, são mais provavelmente recepti-vos à substituição.
Deste modo, o termo "P-catenina" também diz respeito a polinu-cleotídeos codificando proteínas p-catenina que contêm mudanças em resí-duos de aminoácido que não são essenciais para a atividade de p-catenina.Tais proteínas p-catenina diferem em seqüência de aminoácido da SEQ IDNO: 1 ainda retendo uma atividade de p-catenina inerente. Um polinucleotí-deo isolado codificando uma variante não-natural de uma proteína p-cate-nina pode ser criado através da introdução de uma ou mais substituições,adições ou deleções de nucleotídeo em uma seqüência de polinucleotídeocodificando a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, de modo que umaou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido são introduzidas naproteína codificada. Mutações podem ser introduzidas na SEQ ID NO: 1 atravésde técnicas padrão, tal como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênesemediada por PCR. De preferência, substituições de aminoácido conservati-vas são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não-essenciais.
Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma onde oresíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendouma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadei-as laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias lateraisbásicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (porexemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeia lateral polar não-carre-gada (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina,isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais a-romáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Destemodo, um resíduo de aminoácido não-essencial em um polipeptídeo de (3-catenina é de preferência substituído com um outro resíduo de aminoácidoda mesma família de cadeia lateral.
Alternativamente, em uma outra modalidade, mutações podemser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüênciade codificação de (3-catenina, tal como através de mutagênese por saturação.
O termo "região terminal NH3 de (3-catenina" compreende qual-quer seqüência de aminoácido contígua do aminoácido um através das regi-ões de repetição armadillo de (3-catenina capazes de interação com receptorde androgênio. Deste modo, a região terminal NH3 pode compreender, porexemplo, aminoácido 1 ao aminoácido 424, aminoácido 2 ao aminoácido424, aminoácido 3 ao aminoácido 424, aminoácido 1 ao aminoácido 423,aminoácido 2 ao 423, aminoácido 3 ao 423 e assim por diante. A região ter-minai NH3 compreende de preferência repetições armadillo 1-6 de (3-catenina, com mais preferência repetições armadillo 1-6 de p-catenina e commais preferência ainda repetições armadillo 1.-12 de (3-catenina. Em umaoutra modalidade preferida, a região terminal NH3 são os aminoácidos 2-424de (3-catenina humana. A região terminal NH3 pode compreender seqüênciasde aminoácido de apenas uma região de repetição armadillo. Modalidadescompreendendo uma seqüência de aminoácido de região terminal NH3 con-tígua com pelo menos uma porção da região Ç-terminal de (3-catenina sãotambém compreendidas contanto que o domínio de transativação C-terminalde p-catenina seja inativo. Substituições, deleções ou inserções conservado-ras de aminoácidos são também compreendidas contanto que uma interaçãoentre (3-catenina e receptor de androgênio seja mantida.
Substituições típicas incluem, por exemplo, substituição de umaminoácido com um aminoácido tendo características de carga, hirofóbicasou estereoquímicas similares. Por exemplo, uma "substituição de aminoáci-do conservadora" pode envolver uma substituição de um resíduo de amino-ácido nativo com um resíduo não-nativo de modo que há pouco ou nenhumefeito sobre a polaridade ou carga do resíduo de adição amino nesta posi-ção. Substituições de aminoácido desejadas (sejam conservadoras ou não-conservadoras) podem ser determinadas por aqueles versados na técnicano momento que tais substituições forem desejadas. Por exemplo, substitui-ções de aminoácido podem ser usadas para identificar resíduos importantesda seqüência de molécula ou para aumentar ou diminuir a afinidade das mo-léculas descritas aqui. Em certas modalidades, substituições de aminoácidoconservadoras também compreendem resíduos de aminoácido de ocorrêncianão-natural que são tipicamente incorporados através de síntese de peptí-deo química ao invés de através de síntese em sistemas biológicos.
O termo "interação com receptor de androgênio" significa a inte-ração proteína-proteína entre o domínio de ligação de ligante de AR e asregiões armadillo de (3-catenina. A interação entre essas duas proteínas écausada por mudanças na conformação secundária/terciária da proteína ARque é estimulada por ligação de androgênio a AR.
O termo "modula" compreende ou uma diminuição ou um au-mento em atividade; por exemplo, um composto de teste pode ser conside-rado modular a interação entre receptor de androgênio e p-catenina se apresença de tais compostos de teste no ensaio da invenção resultar em ouuma diminuição ou aumento na expressão de gene luciferase.
O termo "domínio de ligação de DNA" descreve qualquer domí-nio de ligação de proteína que tenha um motivo de ligação de DNA conser-vado que se ligue de uma maneira específica de seqüência à sua seqüênciade ativação a montante conservada também referida como "elemento deresposta de DNA" que contém a seqüência de nucleotídeo específica ou"seqüência de reconhecimento" que é reconhecida pelo domínio de ligaçãode DNA da proteína. O elemento de resposta de DNA é posto em um plas-mídeo repórter de modo que as proteínas que se ligam ao elemento de res-posta de DNA são capazes de trazer ativadores transcripcionais em proximi-dade íntima com o repórter através de interações proteína-proteína resultan-do em ativação da transcrição de repórter.
O termo "seqüência de ativação a montante" ou "UAS" inclui qual-quer seqüência de DNA que seja capaz de se ligar ao domínio de ligação deDNA que foi selecionado para uso no ensaio como uma proteína de fusãocom (3-catenina.
O termo "gene repórter" é usado da maneira geralmente conhe-cida na técnica para descrever qualquer seqüência de codificação genéticaque seja capaz de expressar uma proteína ou seqüência de aminoácido quepossa ser detectada e quantificada. Exemplo de produções de gene repórterbem-conhecidos que poderiam ser usados no ensaio da invenção incluem,por exemplo, as enzimas luciferase, cloranfenicol acetiltransferase e (3-galacto-sidase. Aqueles versados na técnica conhecerão muitos outros genes repór-teres adequados.
O termo "composto de teste" inclui compostos com estruturaquímica conhecida mas não necessariamente com uma função ou atividadebiológica conhecida. Compostos de teste poderiam ter também estruturasnão-identificadas ou ser misturas de compostos desconhecidos, por exem-pio, de amostras biológicas brutas tal como extratos de planta. Grandes nú-meros de compostos poderiam ser aleatoriamente avaliados a partir de "bi-bliotecas químicas" que refere-se a coleções de compostos químicos purifi-cados ou coleções de extratos brutos de várias fontes. As bibliotecas quími-cas podem ter compostos que foram quimicamente sintetizados ou purifica-dos a partir de produtos naturais. Os compostos podem compreender molé-culas pequenas inorgânicas ou orgânicas ou compostos orgânicos grandestal como, por exemplo, proteínas, peptídeos, gl,icoproteínas, esteróides, lipí-deos, fosfolipídeos, ácidos nucléicog e lipoproteínas. A quantidade de com-posto testado pode variar dependendo da biblioteca química, mas, para bi-bliotecas de composto purificado (homogêneas), 10 uM é tipicamente a doseinicial maior testada.
Métodos de introdução de compostos de teste em células sãobem-conhecidos na técnica.
O termo "androgênio" inclui todos os compostos conhecidos comatividade androgênica. Atividade androgênica de compostos pode ser de-terminada de uma variedade de maneiras incluindo ensaios de transcriçãode AR baseados em célula e em ensaios de atividade biológica onde umcomposto pode ser demonstrado ter atividade que é similar à atividade deandrogênios conhecidos. Esses ensaios podem ser realizados usando ani-mais ou tecidos. Por exemplo, compostos com atividade de androgênio napróstata são capazes de estimular crescimento da próstata em roedores.
Metabólitos de androgênio naturais que têm atividade biológica podem serusados e incluem, por exemplo, testosterona, androstenodiona, androstano-diona e diidrotestosterona (DHT), com DHT particularmente preferida.
O ensaio é tolerante de uma faixa de concentração ampla deandrogênios. Em um modo preferido, a dose de DHT é 1 nM para avaliarcompostos. Entre 0,1 e 10 nM de androgênio poderiam ser usados comouma dose inicial para otimizar o ensaio em uma linhagem de célula.
Na ausência de androgênio, um ensaio da presente invençãopode ser também usado para identificar compostos que estimulam a intera-ção entre AR e B-catenina. Por exemplo, um composto com atividade similarà DHT ativaria a atividade repórter através da estimulação da interação entreAR e B-catenina.
O termo "operavelmente ligada" significa que uma molécula deácido nucléico, isto é, DNA, e uma ou mais seqüências reguladoras (por e-xemplo, um promotor ou uma porção dele) são conectadas de tal modo apermitir transcrição de mRNA a partir da molécula de ácido nucléico ou per-mitir expressão do produto (isto é, um polipeptídeo) da molécula de ácidonucléico quando as moléculas apropriadas são ligadas a seqüências regula-doras.
O termo "construto de expressão" significa qualquer DNA de fi-lamento duplo ou RNA de filamento duplo feito para transcrever um RNA,por exemplo, um construto que contém pelo menos um promotor operavel-mente ligado a um gene ou região de codificação a jusante de interesse (porexemplo, um cDNA ou fragmento de DNA genômico que codifica uma prote-ína, ou qualquer RNA de interesse). Transfecção ou transformação do cons-truto de expressão em uma célula recipiente permite que a célula expresseRNA ou proteína codificada(o) pelo construto de expressão. Um construto deexpressão pode ser um plasmídeo geneticamente construído, vírus ou umcromossomo artificial derivado de, por exemplo, um bacteriófago, adenoví-rus, retrovírus, poxvírus ou herpesvírus, ou modalidades adicionais descritassob "vetor de expressão" abaixo. Um construto de expressão pode ser repli-cado em uma célula viva ou ele pode ser feito sinteticamente. Para propósi-tos do presente pedido, os termos "construto de expressão", "vetor de ex-pressão", "vetor" e "plasmídeo" são usados intercomutavelmente para de-monstrar a aplicação da invenção em um sentido geral, ilustrativo, e não pre-tendem limitar a invenção a um tipo particular de construto de expressão.
Ainda, o termo construto ou vetor de expressão pretende também incluir ca-sos onde a célula utilizada para o ensaio já compreende endogenamente talseqüência de DNA.
Conforme aqui usado, os termos "polinucleotídeo" e "oligonucle-otídeo" são usados intercomutavelmente e incluem formas poliméricas denucleotídeos de qualquer comprimento, ou desoxirribonucleotídeos ou ribo-nucleotídeos, ou seus análogos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estru-tura tridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desco-nhecida. O que segue são exemplos não-limitantes de polinucleotídeos: umgene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNAde transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos re-combinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isola-do de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas de'ácido nucléico e primers. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotí-deos modificados, tal como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotí-deo. Se presentes, modificações da estrutura do nucleotídeo podem ser con-feridas antes ou após montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeospode ser interrompida por componentes não-nucleotídeos. Um polinucleotí-deo pode ser modificado mais após polimerização, tal como através de con-jugação com um componente de marcação. O termo também inclui ambasmoléculas de filamento duplo e simples. A menos que de outro modo especi-ficado ou requerido, qualquer modalidade da presente invenção que é umpolinucleotídeo compreende ambas a forma de filamento duplo e cada umade duas formas de filamento simples çomplementares conhecidas ou previs-tas para constituir a forma de filamento duplo.
Um polinucleotídeo é composto de uma seqüência específica dequatro bases de nucleotídeo: adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina(T) e uracila (U) para guanina quando o polinucleotídeo for RNA. Deste mo-do, o termo "seqüência de polinucleotídeo" é a representação alfabética deuma molécula de polinucleotídeo.
Um "gene" inclui um polinucleotídeo contendo pelo menos umaestrutura de leitura aberta que é capaz de codificar um polipeptídeo ou prote-ína particular após ser transcrito e traduzido. Qualquer uma das seqüênciasde polinucleotídeo descritas aqui pode ser usada para identificar fragmentosmaiores ou seqüências de codificação de comprimento completo do genecom o qual eles estão associados. Métodos de isolamento de seqüências defragmento maiores são conhecidos daqueles versados na técnica, algunsdos quais são descritos aqui;
Conforme aqui usado, "expressão" inclui o processo através doqual polinucleotídeos são transcritos em mRNA e traduzidos em peptídeos,polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genô-mico, expressão pode incluir união do mRNA, se um hospedeiro eucarióticoapropriado for selecionado. Elementos reguladores requeridos para expres-são incluem seqüências promotoras para ligar polimerase de RNA e se-qüências de iniciação de transcrição para ligação de ribossomo. Por exem-pio, um vetor de expressão bacteriano inclui um promotor tal como o promo-tor lac e para iniciação de transcrição a seqüência Shine-Delgarno e o códonde partida (Sambrook, J. Fritsh, E.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A La-boratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Similarmente, um vetorde expressão eucariótico inclui um promotor heterólogo ou homólogo parapolimerase de RNA II, um sinal de poliadenilação a jusante, o códon de par-tida AUG e um códon de terminação para separação do ribossoma. Tais ve-tores podem ser obtidos comercialmente ou montados pelas seqüênciasdescritas em métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, os métodosdescritos abaixo para construção de vetores em geral.
Exemplos
A presente invenção é definida adicionalmente nos Exemplosque seguem. Deve ser compreendido que esses Exemplos, embora indicandomodalidades preferidas da invenção, são dados a título de ilustração ape-nas. A partir da discussão acima e desses Exemplos, um versado na técnicapode verificar as características preferidas da presente invenção, e, sem seafastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modifica-ções na invenção para adaptá-la a vários usos e condições.
Exemplo 1
Este Exemplo ilustra uma modalidade preferida onde células cul-turadas foram transformadas com um plasmídeo de elemento de resposta deDNA GAL4-repórter luciferase, um plasmídeo expressando a região de codi-ficação do GAL4 DBD fundida à região de codificação de cDNA para amino-ácidos 2-424 de (3-catenina humana (GAL-4-p-catenina) e um plasmídeo ex-pressando AR humano do tipo selvagem de comprimento completo (Figura1). O fragmento de cDNA de 0-catenina foi feito através de amplificação comPCR da seqüência de codificação de DNA para os aminoácidos 2-424 de (3-catenina humana usando um vetor de expressão de B-catenina pcDNA3.1(Invitrogen) como um molde e primers de DNA de filamento simples conten-do sítios de restrição Bam Hl e Xba I respectivamente. O fragmento de DNAamplificado foi inserido no sítio de clonagem múltiplo do plasmídeo pM quefoi linearizado usando as enzimas de restrição ,Bam Hl e Xba I (Promega) eque contém a seqüência de codificação para GAL4 DBD a montante do sítiode clonagem múltiplo. O plasmídeo repórter foi feito através de subclonagemde cinco cópias de seqüência de ativação a montante de GAL4 (UAS) empGL3-Basic (Promega) que contém a seqüência de codificação de cDNApara luciferase. O vetor de expressão de AR é cDNA de AR de comprimentocompleto humano em pcDNA3 (Invitrogen) que foi obtido da Leonard Fre-edman (Sloan Kettering). A seqüência de cDNA para AR humano está dis-ponível no website para informação de seqüência de gene GenBank® (N- deAcesso M35884, incorporado aqui a título de referência).
Células CV-1 foram culturadas em placas de 96 cavidades etransfectadas após 24 horas com os plasmídeos de expressão e repórterusando o procedimento de lipofectamina (Invitrogen). Neste procedimento,os três construtos de plasmídeo diferentes usados foram misturados no meiode cultura de célula e lipofectamina e incubados por 15 minutos de acordocom as instruções do fabricante (Invitrogen). A mistura de plasmídeo-lipofectamina foi diluída em meio de cultura, adicionada a células e incubadapor 4 horas. As células foram enxaguadas e então tratadas com meio decultura. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadascom agonistas e antagonistas de androgênio ou veículo. Após 18 horas, oslisatos foram coletados e ensaiados quanto à atividade de luciferase usandoreagente de luciferase (Promega) e luminômetro (Wallac). Outras técnicasde transfecção conhecidas podem ser usadas, incluindo, por exemplo, técni-ca de transfecção de precipitação de fosfato de cálcio.
Os construtos dé plasmídeo usados no ensaio de um híbrido sãomostrados na Figura 1. Linhas pontilhadas denotam regiões de interação deproteína-proteína ou proteína-DNA conhecidas. Setas denotam sítios de par-tida de transcrição.Exemplo 2
Células L929 foram usadas para determinar se DHT estimula ainteração entre AR e p-catenina em uma linhagem celular que expressa endo-genamente ambas as proteínas. Células 929, que expressam AR e p-cate-nina endógenos, foram tratadas com DHT a 10 nM, hidroxiflutamida a 30 nM(flut), DHT mais flut ou veículo (veí) por 17 horas. Lisatos de célula foramcoletados, pré-limpos com proteína A/G Sepharose e (3-catenina foi imuno-precipitada usando um IgG policlonal de cabra contra (3-catenina conjugadaà agarose (Santa Cruz Biotechnology). Os imunoprecipitados foram analisa-dos através de eletroforese de gel de poliacrilamida seguido por análiseWestern para AR e (3-catenina ((3-cat) conforme indicado usando anticorposda Santa Cruz (Figura 2). O agonista de androgênio DHT a 10 nM foi verifi-cado estimular a interação entre AR e (3-catenina. Não havia nenhuma inte-ração detectável entre essas proteínas na ausência de DHT. Quando célulasforam tratadas com DHT na presença de um excesso de 30 vezes do anta-gonista de AR hidroxiflutamida (300 nM) sobre DHT, a interação proteína-proteína foi atenuada (Figura 2). Esses resultados demonstram que a intera-ção de AR e p-catenina é estimulada pelo agonista de androgênio DHT. Osresultados também demonstram que esta interação é suscetível a rompi-mento por moléculas pequenas tal como hidroxiflutamida.
Exemplo 3
Experimentos foram realizados para determinar a necessidadede cada vetor de expressão para atividade de luciferase em células CV-1.
O ensaio da invenção é demonstrado medir a interação depen-dente de DHT entre AR e p-catenina. O plasmídeo repórter (GAL4-luciferase)contendo o gene luciferase sob controle transcripcional do elemento de res-posta de DNA 5XGAL4-UAS foi transfectado em células CV-1 na presençaou ausência do vetor de expressão de receptor de androgênio (AR), o vetorde expressão de proteína de fusão de GAL4-DBD-p-catenina conforme indi-cado. As células foram tratadas com 1nM de DHT (+) ou veículo (-) por 18horas onde indicado. Lisatos de célula foram coletados e analisados quantoà atividade de luciferase. DHT (1 nM) causou uma ativação grande de ativi-dade de repórter quando ambos os vetores de expressão de AR e GAL4-B-catenina foram transfectados nas células com o repórter luciferase-5XGAL4(Figura 3). AR e DHT não tiveram nenhum efeito sobre a atividade repórterna ausência do vetor de expressão de GAL4-B-catenina demonstrando aausência de um efeito direto de AR e DHT sqbre o construto promotor deGAL4-repórter (Figura 3).
Exemplo 4
O receptor de estrogênio (ER) e receptor de progesterona (PR)foram também testados quanto à sua habilidade em interagir com B-cateninaatravés da medição de seu efeito sobre a atividade repórter (Figura 4), e ainteração proteína-proteína entre B-catenina e receptores nucleares foi mos-trada ser específica para AR. Células CV-1 foram transfectadas com o repór-ter 5XGAL4-luciferase e o plasmídeo de expressão de GAL4-B-catenina naausência de um vetor de expressão de receptor nuclear (-), com o plasmídeode expressão de AR, PR ou ER. As células foram tratadas por 18 horas comveículo, 10 nM de DHT, 10 nM de trimegestona (Trim) ou 10 nM de 17-estra-diol (E2) conforme indicado. Os lisatos de célula foram coletados e analisa-dos quanto à atividade de luciferase. Os receptores de ER e PR não tinhamnenhuma atividade no ensaio de um híbrido na presença de trimegestona,17B-estradiol ou DHT. Houve um grande aumento na atividade repórterquando DHT foi adicionada a células expressando AR mas não com 10 nMde 17B-estradiol ou trimegestona. Esses resultados demonstram que a inte-ração de B-catenina neste ensaio com receptores nucleares parece ser es-pecífica para AR quando comparado com ER e PR.
Exemplo 5
Para determinar se o ensaio da Requerente tem o potencial paraidentificar compostos que rompem a interação dependente de DHT de AR eB-catenina, o efeito de acetato de ciproterona (CA), um antagonista de AR,foi testado na presença de DHT (Figura 5).
Células CV-1 foram transfectadas com os plasmídeos de ex-pressão de AR e GAL4-B-catenina e repórter luciferase descritos na Figura1. As células foram tratadas 18 horas com (+) ou sem (.-) 1 nM de DHT e asconcentrações indicadas do antagonista de AR acetato de ciproterona. Oslisatos de célula foram coletados e analisados quanto à atividade de lucifera-se. A interação estimulada por DHT entre AR e (3-catenina é inibida pelo an-tagonista de AR acetato de ciproterona. Na ausência de CA, DHT a 1nMcausou Uma ativação grande de atividade repórter. Este efeito de DHT erarevertido dependentemente da dose por CA dentre 1 e 1000 nM (Figura 5).Listagem de Referências
1. Yang F., Li X., Sharma M, Sasaki C, Long D., Lim B., Sun Z. (2002) J.Biol. Chem. 277:13; 11336-11344.
2. Pawlowski J., Ertel J., Allen M., Xu M., Butler C, Wilson E., Wierman M.,(2002) J. Biol. Chem. 277:23; 20702-20710.
3. Song L, Herrell R., Byers S., Shah S., Wilson E., Gelmann E. (2003) Mol.Cell. Biol. 23:5; 1674-1687.
4. Sharma M., Chuang W., Sun Z (2002) J. Biol. Chem. 277:34; 30935-30941.
5. Truica C, Byers S., Gelmann E. (2000) Câncer Res. 60:4709-4713.
6. Patente U.S: N2 5.283.173, Fields e outros, "System to Detect Protein-Protein Interactions".
7. Patente U.S. N2 5.468.614, Fields e outros, "System to Detect Prótein-Protein Interactions".Listagem de Seqüência
<110> Wyeth
Kilbourne, EdwardBerrodin, Thpmas
<120> MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS QUE MODULAM A
INTERAÇÃO DE RECEPTOR DE ANDROGÊNIO COM BETA-CATENIN/
<130> AM101857 .
<150> US 60/682,580 !<151> 2005-05-19
<160> 1
<170> Patente versão 3.3
<210> l
<211> 781
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 1
Met Ala Thr Gln Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro1 5 10 15
Asp Arg Lys Ala Ala Vãl ser His Trp Gln Gln Gln Ser Tyr Leu Asp20 25 30
Ser Gly lie His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly35 40 45
Lys Gly Asn Pro Glu Glu Glu Asp vai Asp Thr ser Gln vai Leu Tyr50 55 60
Glu Trp Glu Gln Gly Phe Ser Gln Ser Phe Thr Gln Glu Gln Vai Ala65 70 75 80
Asp lie Asp Gly Gln Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gln Arg vai Arg Ala85 90 95
Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gln lie Pro Ser Thr100 105 110
Gln Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn vai Gln Arg Leu Ala Glu Pro115 120 125
Ser Gln Met Leu Lys His Ala vai vai Asn Leu lie Asn Tyr Gln Asp130 135 140
Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala lie Pro Glu Leu Thr Lys Leu Leu145 150 155 160
Asn Asp Glu Asp Gln vai vai vai Asn Lys Ala Ala vai Met vai His165 170 175Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ala ser Arg His Ala lie Met Arg Ser Pro180 185 190
Gln Met Vai ser Ala lie Vai Arg Thr Met Gln Asn Thr Asn Asp vai195 200 205
Glu Thr Ala Arg cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His His210 215 220
Arg Glu Gly Leu Leu Ala lie Phe Lys Ser Gly Gly lie Pro Ala Leu225 230 235 240
vai Lys Met Leu Gly Ser Pro Vai Asp Ser Vai Leu Phe Tyr Ala lie245 250 255
Thr Thr Leu His Asn Leu Leu Leu His Gln Glu Gly Ala Lys Met Ala260 265 270
Vai Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gln Lys Met Vai Ala Leu Leu Asn Lys275 280 285
Thr Asn Vai Lys Phe Leu Ala lie Thr Thr Asp Cys Leu Gln lie Leu290 295 300
Ala Tyr Gly Asn Gln Glu Ser Lys Leu lie lie Leu Ala Ser Gly Gly305 310 315 320
Pro Gln Ala Leu vai Asn lie Met Arg Thr Tyr Thr Tyr Glu Lys Leu325 330 335
Leu Trp Thr Thr Ser Arg Vai Leu Lys vai Leu Ser Vai Cys Ser Ser340 345 350
Asn Lys Pro Ala lie vai Glu Ala Gly Gly Met Gln Ala Leu Gly Leu355 360 365
His Leu Thr Asp Pro Ser Gln Arg Leu Vai Gln Asn Cys Leu Trp Thr370 375 380
Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln Glu Gly Met Glu Gly385 390 395 400
Leu Leu Gly Thr Leu vai Gln Leu Leu Gly Ser Asp Asp lie Asn vai405 410 415
vai Thr Cys Ala Ala Gly lie Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr420 425 430
Lys Asn Lys Met Met vai Cys Gln Vai Gly Gly lie Glu Ala Leu Vai435 440 445Arg Thr vai Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp lie Thr Glu Pro Ala450 455 460
lie Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gln Glu Ala Glu Met465 470 475 480
Ala Gln Asn Ala Vai Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro vai Vai vai Lys485 490 , 495
Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu lie Lys Ala Thr vai Gly500 505 510
Leu lie Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Arg515 520 525
Glu Gln Gly Ala ile Pro Arg Leu Vai Gln Leu Leu Vai Arg Ala His530 535 540
Gln Asp Thr Gln Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr Gln Gln Gln Phe545 550 555 560
vai Glu Gly Vai Arg Met Glu Glu lie Vai Glu Gly Cys Thr Gly Ala565 570 575
Leu His ile Leu Ala Arg Asp Vai His Asn Arg lie vai lie Arg Gly580 585 590
Leu Asn Thr ile Pro Leu Phe vai Gln Leu Leu Tyr Ser Pro Ile Glu595 600 605
Asn lie Gln Arg vai Ala Ala Gly vai Leu cys Glu Leu Ala Gln Asp610 615 620
Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Glu Ala Glu Gly Ala Thr Ala Pro Leu625 630 635 640
Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly vai Ala Thr Tyr Ala Ala645 650 655
Ala vãl Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gln Asp Tyr Lys Lys660 665 670
Arg Leu Ser vai Glu Leu Thr ser Ser Leu Phe Arg Thr Glu Pro Met675 680 685
Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Leu Asp ile Gly Ala Gln Gly690 695 700
Glu Pro Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Phe His705 710 715 720Ser Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Ala Leu Gly Met Asp Pro Met Met Glu725 730 735
His Glu Met Gly Gly His His Pro Gly Ala Asp Tyr Pro vai Asp Gly740 745 750
Leu Pro Asp Leu Gly His Ala Gln Asp Leu Met Asp Gly Leu Pro Pro755 760 765
Gly Asp Ser Asn Gln Leu Ala Trp Phe Asp Thr Asp Leu770 775 780

Claims (28)

1. Método de determinação de se um composto de teste é capazde modular a interação entre receptor de androgênio e p-catenina caracteri-zado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) provisão de uma célula compreendendo:(i) uma seqüência de DNA codificando uma proteína híbridacompreendendo um domínio de ligação de DNA fundido à região terminalNH3 de p-catenina,(ii) uma seqüência de DNA compreendendo uma seqüênciade ativação a montante correspondendo ao dito domínio de ligação de DNAoperavelmente ligada a e controlando a transcrição de um gene repórter, e(iii) uma seqüência de DNA codificando proteína receptorade androgênio,(b) introdução do composto de teste na célula, opcionalmentena presença de androgênio; e(c) medição da expressão do gene repórter,onde um aumento ou diminuição de expressão pelo gene repór-ter indica que a molécula de teste é capaz de modular a interação entre re-ceptor de androgênio e p-catenina.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o domínio de ligação de DNA de (i) compreende um domínio deligação de DNA GAL-4.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência de ativação a montante operavelmente ligada a umgene repórter de (ii) compreende GAL-4 UAS.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que há uma ou mais cópias de seqüência GAL-4 UAS operavelmenteligada ao gene repórter.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o gene repórter é luciferase.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de p-catenina de (i) compreende aminoá-cidos 2 a 424 de B-catenHta humana.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região ternsÉial NH3 de B-catenina de (i) compreende uma se-qüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido tendopelo menos 65% de iderífdade de seqüência com os aminoácidos 2-424 daSEQ ID NO: 1.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina de (i) compreende uma se-qüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido tendopelo menos 75% de identidade com os aminoácidos 2-424 da SEQ ID NO: 1.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina de (i) compreende uma se-qüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido tendopelo menos 85% de identidade de seqüência com os aminoácidos 2-424 daSEQ ID NO: 1.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina de (i) compreende uma se-qüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido tendopelo menos 95% de identidade de seqüência com os aminoácidos 2-424 daSEQIDNO:1.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina de (i) compreende uma se-qüência de nucleotídeo que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeocodificando aminoácidos 2-424 de SEQ ID NO: 1 sob as condições que se-guem: 6XSSC a 45°C e lavada pelo menos uma vez com 0.2XSSC, SDS a-0,1% a 50°C.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que a região terminal NH3 de B-catenina de (i) compreende umaseqüência de nucleotídeo que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeocodificando aminoácidos 2-424 de SEQ ID NO: 1 sob as condições que se-guem: 6XSSC a 45°C e lavada pelo menos uma vez com 0.2XSSC, SDS a-0,1% a 55°C.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe-lo fato de que a região terminal NH3 de B-catenina de (i) compreende umaseqüência de nucleotídeo que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeocodificando aminoácidos 2-424 de SEQ ID NO: 1 sob as condições que se-guem: 6XSSC a 45°C e lavada pelo menos uma vez com 0.2XSSC, SDS a-0,1% a 65°C.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita célula é uma célula eucariótica.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe-Io fato de que a dita célula é uma célula de mamífero.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a modulação de expressão do gene repórter é uma diminuiçãoem expressão.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito androgênio na etapa (b) é DHT.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o domínio de ligação de DNA de (i) compreende um domínio deligação de DNA GAL-4; onde a região terminal NH3 de B-catenina de (i)compreende os aminoácidos 2 a 424 de B-catenina humana; em que hámais de uma cópia da seqüência de ativação a montante GAL-4 UAS opera-velmente ligada ao gene repórter; onde o gene repórter é luciferase; em queo androgênio na etapa (b) é DHT; e onde a modulação é uma diminuição emexpressão.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina compreende repetições ar-madillo 1-12.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina compreende repetições ar-madillo 1-7.
21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região terminal NH3 de B-catenina compreende repetições ar-madillo 1-16.
22. Método de determinação de se um composto de teste é ca-paz de modular a interação entre o receptor de androgênio e B-catenina ca-racterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) provisão de uma célula compreendendo:(i) uma seqüência de DNA codificando uma proteína híbridacompreendendo um domínio de ligação de DNA fundido à B-catenina,(ii) uma seqüência de DNA compreendendo uma seqüênciade ativação a montante correspondendo ao dito domínio de ligação de DNAoperavelmente ligada a e controlando a transcrição de um gene repórter, e(iii) uma seqüência de DNA codificando proteína receptorade androgênio,(b) introdução do composto de teste na célula, opcionalmentena presença de androgênio; e(c) medição da expressão do gene repórter, em que um aumentoou diminuição de expressão pelo gene repórter indica que a molécula de teste écapaz de modular a interação entre receptor de androgênio e B-catenina.
23. Método de determinação de se um composto de teste modu-la seletivamente o curso de sinalização de B-catenina-Wnt em um curso desinalização de receptor de androgênio, caracterizado pelo fato de que com-preende:(a) identificação de um composto de teste que aumente ou di-minua a expressão de um gene através da inibição da interação mediada porAR com B-catenina, em que o composto de teste remove repressão de ARligado a hidrogênio sobre sinalização Wnt sem reprimir a transcrição media-da por AR de androgênio; e(b) ensaio do composto de teste de (a) para determinar se ocomposto de teste aumenta ou diminui a expressão de um gene através deum curso de sinalização de receptor de androgênio independente de B-catenina;com o que o composto de teste de (a) seletivamente modula ocurso de sinalização de B-catenina-Wnt através da inibição da habilidade doAR ligado a hidrogênio em interagir com B-catenina se o composto de testefalhar em aumentar ou diminuir a expressão do gene através de um curso desinalização de receptor de androgênio.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe-lo fato de que a etapa (a) compreende as etapas de(A) provisão de uma célula compreendendo:(i) uma seqüência de DNA codificando uma proteína híbri-da compreendendo um domínio de ligação de DNA fundido à (3-catenina,(ii) uma seqüência de DNA compreendendo uma seqüênciade ativação a montante correspondendo ao dito domínio de ligação de DNAoperavelmente ligada a e controlando a transcrição de um gene repórter, e(iii) uma seqüência de DNA codificando proteína receptorade androgênio,(B) introdução do composto de teste na célula, opcionalmentena presença de androgênio; e(C) medição da expressão do gene repórter,em que um aumento ou diminuição de expressão pelo gene repórter indicaque a molécula de teste é capaz de modular a interação entre receptor deandrogênio e (3-catenina.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pe-Io fato de que a seqüência de DNA de (i) codifica uma proteína híbrida com-preendendo um domínio de ligação de DNA fundido à região terminal NH3 de(3-catenina.
26. Método de determinação de se um composto de teste seleti-vamente modula um curso de sinalização de receptor de androgênio em umcurso de sinalização de (3-catenina-Wnt, caracterizado pelo fato de quecompreende:(a) identificação de um composto de teste que aumente ou di-minua a expressão de um gene através de um curso de sinalização de re-ceptor de androgênio; e(b) ensaio do composto de teste de (a) para determinar se ocomposto de teste aumenta ou diminui a habilidade de um AR ligado a andro-gênio ou AR não-ligado a androgênio em inibir sinalização de (3-catenina/Wnt;com o que o composto de teste de (a) seletivamente modula umcurso de sinalização de receptor de androgenio sem remover repressão deAR ligado a androgenio de sinalização Wnt ou não promove a interação en-tre AR e p-catenina na ausência de um agonista de AR resultando no com-posto de teste não tendo nenhuma atividade em aumento ou diminuição daexpressão de um gene regulado pelo curso de sinalização de p-cateninaWnt.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pe-lo fato de que a etapa (b) compreende as etapas de(A) provisão de uma célula compreendendo:(i) uma seqüência de DNA codificando uma proteína híbri-da compreendendo um domínio de ligação de DNA fundido à p-catenina,(ii) uma seqüência de DNA compreendendo uma seqüênciade ativação a montante correspondendo ao dito domínio de ligação de DNAoperavelmente ligada a e controlando a transcrição de um gene repórter, e(iii) uma seqüência de DNA codificando proteína receptorade androgenio,(B) introdução do composto de teste (a) na célula, opcionalmen-te na presença de androgenio; e(C) medição da expressão do gene repórter,em que um aumento ou diminuição de expressão pelo gene repórter indicaque a molécula de teste é capaz de modular a interação entre receptor deandrogenio e p-catenina.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe-Io fato de que a seqüência de DNA de (i) codifica uma proteína híbrida com-preendendo um domínio de ligação de DNA fundido à região terminal NH3 deP-catenina.
BRPI0610821-0A 2005-05-19 2006-05-17 método de identificação de compostos que modulam a interação de receptor de androgênio com beta-catenina BRPI0610821A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68258005P 2005-05-19 2005-05-19
US60/682,580 2005-05-19
PCT/US2006/019143 WO2006125031A2 (en) 2005-05-19 2006-05-17 Method of identifying compounds that modulate interaction of androgen receptor with beta-catenin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0610821A2 true BRPI0610821A2 (pt) 2010-07-27

Family

ID=37432114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0610821-0A BRPI0610821A2 (pt) 2005-05-19 2006-05-17 método de identificação de compostos que modulam a interação de receptor de androgênio com beta-catenina

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20060269950A1 (pt)
EP (1) EP1896583A2 (pt)
JP (1) JP2008545395A (pt)
CN (1) CN101175854A (pt)
AU (1) AU2006247234A1 (pt)
BR (1) BRPI0610821A2 (pt)
CA (1) CA2607963A1 (pt)
MX (1) MX2007014221A (pt)
WO (1) WO2006125031A2 (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011223706A1 (en) * 2010-03-05 2012-09-20 Baylor Research Institute Involvement of androgen/androgen receptor pathway in Fabry disease
KR101285259B1 (ko) * 2011-08-04 2013-07-11 (주)케어젠 Ｗｎｔ 계열 유래 펩타이드 및 이의 용도
US10322113B2 (en) 2014-08-20 2019-06-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Pharmaceutical compositions directly targeting FKBP52 for the treatment of prostate cancer and methods of using same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
AU784513B2 (en) * 2000-01-18 2006-04-27 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Expansion of stem and progenitor cells by beta-catenin
US6787321B1 (en) * 2000-10-13 2004-09-07 The Regents Of The University Of California Mammalian two-hybrid system for screening for modulators of the accumulation of metabolic products

Also Published As

Publication number Publication date
CN101175854A (zh) 2008-05-07
US20060269950A1 (en) 2006-11-30
WO2006125031A2 (en) 2006-11-23
MX2007014221A (es) 2009-02-17
JP2008545395A (ja) 2008-12-18
AU2006247234A1 (en) 2006-11-23
WO2006125031A3 (en) 2007-02-01
EP1896583A2 (en) 2008-03-12
CA2607963A1 (en) 2006-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hall et al. Quaking and PTB control overlapping splicing regulatory networks during muscle cell differentiation
Böhm et al. SALL4 is directly activated by TCF/LEF in the canonical Wnt signaling pathway
Hartmann et al. The interaction and colocalization of Sam68 with the splicing-associated factor YT521-B in nuclear dots is regulated by the Src family kinase p59fyn
Andreou et al. The DEAD-box helicase eIF4A: paradigm or the odd one out?
Robin et al. SORBS2 transcription is activated by telomere position effect–over long distance upon telomere shortening in muscle cells from patients with facioscapulohumeral dystrophy
Kim et al. Ubiquitin ligase MKRN1 modulates telomere length homeostasis through a proteolysis of hTERT
Attardi et al. Drosophila tissue-specific transcription factor NTF-1 contains a novel isoleucine-rich activation motif.
Rinschen et al. The ubiquitin ligase Ubr4 controls stability of podocin/MEC-2 supercomplexes
Fritz et al. RNA-binding protein RBMS3 is expressed in activated hepatic stellate cells and liver fibrosis and increases expression of transcription factor Prx1
US20090092985A1 (en) Screening tools for discovery of novel anabolic agents
David et al. Splice-variant changes of the CaV3. 2 T-type calcium channel mediate voltage-dependent facilitation and associate with cardiac hypertrophy and development
WO2003027634A2 (en) Identification of modulatory molecules using inducible promoters
Wise et al. Identification of domains of c-Jun mediating androgen receptor transactivation
Du et al. Co‐expression of alternatively spliced forms of PAX3, PAX7, PAX3‐FKHR and PAX7‐FKHR with distinct DNA binding and transactivation properties in rhabdomyosarcoma
Nakayama et al. A nuclear targeting determinant for SATB1, a genome organizer in the T cell lineage
Kam et al. Oct-1 and nuclear factor Y bind to the SURG-1 element to direct basal and gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-stimulated mouse GnRH receptor gene transcription
Sankaranarayanan et al. Gene regulatory activity associated with polycystic ovary syndrome revealed DENND1A-dependent testosterone production
Faus et al. Androgen receptor acetylation sites differentially regulate gene control
Tillman et al. c-Fos dimerization with c-Jun represses c-Jun enhancement of androgen receptor transactivation
Kim et al. Modulation of EWS/WT1 activity by the v-Src protein tyrosine kinase
Smagulova et al. GATA4/FOG2 transcriptional complex regulates Lhx9 gene expression in murine heart development
Twomey et al. Regulation of MYPT1 stability by the E3 ubiquitin ligase SIAH2
BRPI0610821A2 (pt) método de identificação de compostos que modulam a interação de receptor de androgênio com beta-catenina
Saadi et al. An unusual class of PITX2 mutations in Axenfeld‐Rieger syndrome
Zhao et al. Structure and function of the upstream promotor of the human Mafbx gene: The proximal upstream promotor modulates tissue‐specificity

Legal Events

Date Code Title Description
B11A Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing
B11Y Definitive dismissal acc. article 33 of ipl - extension of time limit for request of examination expired