BRPI0610975A2 - anticorpos monoclonais e métodos para seu uso na detecção de doença cervical - Google Patents

Abstract

São fornecidos métodos e composições para o diagnóstico de doença cervical de alto grau em uma amostra de paciente. As composições incluem novos anticorpos monoclonais e variantes e fragmentos desses, que se ligam especificamente a MCM2. Anticorpos monoclonais que têm as características de ligação de um anticorpo de MCM2 da invenção também são fornecidos. São também aqui reveladas linhas de células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal de MCM2 da invenção. As composições têm uso na prática dos métodos para diagnóstico de doença cervical de alto grau que compreendem a detecção de superexpressão de MCM2 em uma amosLra cervical de um paciente. Kits para a prática dos métodos da invenção são também fornecidos. Os polipeptídeos que compreendem a seqúência de aminoácidos para um epitopo de MCM2 e métodos de uso desses polipeptídeos na produção de anticorpos também são englobados pela presente invenção.

Description

ANTICORPOS MONOCLONAIS E MÉTODOS PARA SEU USO NA DETECÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção relaciona-se a anticorpos capazes de seligar a MCM2 e métodos de uso desses anticorpos,particularmente no diagnóstico de doença cervical.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

O carcinoma cervical uterino é a segunda neoplasiamais comum em mulheres, respondendo por aproximadamente 12%0 de todos os cânceres femininos e causando aproximadamente250.000 mortes por ano. Baldwin e cols. (2003) NatureReviews Câncer 3: 1-10. Em vários países em desenvolvimentoem que os programas de rastreamento em massa não sãodisponíveis, o problema clínico é mais sério. O câncercervical nesses países é a causa número um de mortes porcâncer em mulheres.

A maioria dos casos de câncer cervical representacarcinoma escamoso celular, embora adenocarcinoma tambémseja visto. O câncer cervical pode ser evitado por exame dapopulação, uma vez que ele se desenvolve através deestágios intraepiteliais não invasivos, bem definidos, quepodem ser morfologicamente distintos. Williams e cols.(1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 14.932-14.937. Emboranão se entenda como as células normais se tornamtransformadas, o conceito de um espectro contínuo demudança histopatólogica de epitélio normal, estratifiçadoatravés de neoplasia intraepitelial cervical (CIN) paracâncer invasivo, tem sido aceito por anos. O precursor parao câncer cervical é a displasia, também conhecida natécnica como CIN ou lesões intraepiteliais escamosas (SIL).

DE DOENÇA CERVICALAs anormalidades intraepiteliais escamosas podem serclassificadas pelo uso do sistema de três fileiras (CIN) oude duas fileiras (Bethesda). Sob o sistema de Bethesda,lesões intraepiteliais escamosas (LSIL) de baixo grau, quecorrespondem a infecção por CINI e HPV, geralmenterepresentam infecção de HPV produtiva com um riscorelativamente baixo de progressão para doença invasiva.

Lesões intraepiteliais escamosas (HSIL) de alto grau, quecorrespondem a CINII e CINIII no sistema de três fileiras,mostram um maior risco de progressão para câncer cervicalque LSIL, embora tanto LSIL quanto HSIL sejam vistas comoprecursores potenciais de malignidade. Amostras do pacientetambém podem ser classificadas como ASCUS (célulasescamosas atípicas de significância desconhecida) ou AGUS(células glandulares atípicas de significânciadesconhecida) sob esse sistema.

Foi estabelecida uma forte associação de câncercervical e infecção por tipos de alto risco de vírus dopapiloma humano (HPV), como tipos 16, 18 e 31. De fato, umgrande corpo de evidência epidemiolõgica e biológicamolecular estabeleceu a infecção por HPV como um fatorcausador no câncer cervical. Além disso, HPV é encontradoem 85% ou mais dos casos de doença cervical de alto grau.

No entanto, infecção por HPV é muito comum, ocorrendopossivelmente em 5-15% das mulheres com idade de 30, maspoucas mulheres HPV-positivas desenvolverão doença cervicalde alto grau ou câncer. A presença de HPV isoladamente éindicativa apenas de infecção, não de doença cervical dealto grau, e, portanto, o teste para infecção por HPVisoladamente resulta em vários falso positivos. Veja, porexemplo, Wright e cols. (2004) Obstet. Gynecol. 103: 304-309.

A literatura atual sugere que o HPV infecta ascélulas-tronco basais no tecido subjacente da cérvixuterina. A diferenciação das células-tronco emqueratinócitos maduros, com a resultante migração dascélulas para o epitélio cervical estratifiçado, estáassociada à replicação viral de HPV e à re-infecção dascélulas. Durante esse processo de replicação viral, ocorreminúmeras mudanças celulares que incluem desregulação dociclo celular, proliferação ativa, replicação de DNA,ativação transcricional e instabilidade genômica (Crum(2000) Modern Pathology 13: 243-251; Middleton e cols.(2003) J". Virol. 77: 10.186-10.201; Pett e cols. (2004)Câncer Res. 64: 1.359-1.368).

A maioria das infecções por HPV é transitória emnatureza, com a infecção viral solucionando por si mesma emum período de 12 meses. Para aqueles indivíduos quedesenvolvem infecções persistentes com um ou mais subtiposoncogênicos de HPV, há um risco para o desenvolvimento deneoplasia em comparação com pacientes sem uma infecção porHPV. Dada a importância do HPV no desenvolvimento deneoplasia cervical, a detecção clínica de HPV tem setornado uma ferramenta diagnostica importante naidentificação de pacientes em risco de desenvolverneoplasia cervical. A utilidade clínica de rastreamentobaseado em HPV para doença cervical está em seu valorpreditivo negativo. Um resultado negativo para HPV emcombinação com uma história de Papanicolau normal é umexcelente indicador de uma condição livre de doença e de umbaixo risco de desenvolvimento de neoplasia cervicaldurantes os 1-3 anos subseqüentes. No entanto, um resultadopositivo para HPV não é diagnóstico de doença cervical; aocontrário, é uma indicação de infecção. Embora a maioriadas infecções por HPV seja transitória e sumaespontaneamente em um período de 12 meses, uma infecçãopersistente com um subtipo viral de HPV de alto riscoindica um alto risco para o desenvolvimento de neoplasiacervical. Para suplementar o teste de HPV, a identificaçãode marcadores moleculares associados a neoplasia cervicaldeve melhorar a especificidade clínica para o diagnósticode doença cervical.

O exame citológico de esfregaços cervicais corados porPapanicolau atualmente é o método de escolha para adetecção de câncer cervical. O teste de Papanicolau é ummétodo subjetivo que permaneceu substancialmente nãomodificado por 60 anos. No entanto, há várias preocupaçõesem relação a seu desempenho. A sensibilidade relatada de umteste único de Papanicolau (a proporção de positivos paradoença que é teste-positivo) é baixa e mostra amplavariação (30-87%). A especificidade de um único teste dePapanicolau (a proporção de negativos para doença que éteste-negativo) deve ser tão baixa quanto 86% em umapopulação examinada e consideravelmente mais baixa napopulação ASCUS PLUS para a determinação de doença de altograu subjacente. Veja Baldwin e cols., supra. Umapercentagem significativa de Papanicolau caracterizada comoLSIL ou CINI é realmente positiva para lesões de alto grau.Além disso, até 10% dos exames de Papanicolau sãoclassificados como ASCUS (células escamosas atípicas designificância indeterminada), ou seja, não é possível fazeruma categorização clara como lesão normal, moderada ousevera, ou tumor. No entanto, a experiência mostra que até10% dessa população ASCUS tem lesões de alto grau, que sãoconseqüentemente desconsideradas. Veja, por exemplo, Manose cols. (1999) JAMA 281: 1.605-1.610. Portanto,biomarcadores moleculares que sejam superexpressosseletivamente em doença cervical de alto grau e composiçõespara a detecção desses biomarcadores são necessários paramétodos práticos confiáveis para o diagnóstico de doençacervical de alto grau.

As proteínas de manutenção de minicromossomo (MCM) têmuma participação essencial na replicação de DNA-eucariótico. As proteínas de manutenção de minicromossomo(MCM) funcionam nos estágios iniciais da replicação do DNAatravés da carga do complexo pré-replicação em DNA e"funcionando como uma helicase para ajudar a desenrolar oDNA duplo durante a síntese de novo da fita de DNAduplicata. Cada um das proteínas MCM tem motivos de ATPasedependentes de DNA em seu domínio central altamenteconservado. Os níveis de proteínas MCM geralmente aumentamde forma variável à medida que células normais progridem dafase GO para a fase Gl/S do ciclo celular. Na fase GO,proteínas MCM2 e MCM5 são bem menos abundantes do que asproteínas MCM7 e MCM3. MCM6 forma um complexo com MCM2,MCM4 e MCM7, que se liga à histona H3. Além disso, osubcomplexo de MCM4, MCM6 e MCM 7 possui atividade dehelicase, que é mediada pela atividade de ligação à ATP deMCM6 e pela atividade de ligação ao DNA de MCM4. Veja, porexemplo, Freeman e cols. (1999) Clin. Câncer Res. 5: 2.121-2.132; Lei e cols. (2001) J. Cell Sei. 114: 1.447-1.454;Ishimi e cols. (2003) Eur. J. Biochem. 270: 1.089-1.101,todos aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Publicações anteriores demonstraram que as proteínasMCM e, em particular, MCM-5, são úteis para a detecção dedoença cervical (Williams e cols. (1998) Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A. 95: 14.932-14.937), além de outros cânceres(Freeman e cols. (1999) Clin. Câncer Res. 5: 2.121-2.132).A literatura publicada indica que anticorpos para MCM-5 sãocapazes de detectar células neoplásicas cervicais. Aespecificidade para detecção de doença cervical de altograu não foi demonstrada para MCM-5 (Williams e cols.(1998) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 14.932-14.937). Adetecção da expressão de MCM-5 não se restringe à doençacervical de alto grau, mas também é detectada na displasiade baixo grau identificada e em células proliferativas quereingressam no ciclo celular após infecção com HPV de altorisco. Além de MCM-5, outros membros da família MCM, queinclui MCM-2 e MCM-7, demonstraram ser marcadorespotencialmente úteis para a detecção de neoplasia cervicalem amostras de tecido (Freeman e cols. (1999) Clin. CâncerRes. 5: 2.121-2.132; Brake e cols. (2003) Câncer Res. 63:8.173-8.180). Resultados recentes demonstraram que MCM-7parece ser um marcador específico para a detecção de doençacervical de alto grau com o uso de formatos de imunoquímica(Brake e cols. (2003) Câncer Res. 63: 8.173-8.180;Malinowski e cols. (2004) Acta Cytol. 43: 696).

Portanto, há na técnica a necessidade de anticorposque sejam capazes de detectar a expressão de um biomarcadorque seja superexpresso seletivamente na doença cervical dealto grau. Tais anticorpos poderiam ser usados nos métodospara a diferenciação entre doença de alto grau e condiçõesque não são consideradas doença clínica, por exemplo,infecção por HPV em estágio inicial e displasia leve.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São fornecidos composições e métodos para odiagnóstico de doença cervical de alto grau. Composiçõesincluem anticorpos monoclonais capazes de se ligar àsproteínas biomarcadoras nucleares da invenção,particularmente proteínas MCM, mais particularmente MCM2.Fragmentos de ligação de antígeno e variantes dessesanticorpos monoclonais, linhagens celulares de hibridomascapazes de produzir esses anticorpos e kits que compreendemos anticorpos monoclonais da invenção também são aqui englobados.

As composições da invenção são utilizadas em métodospara o diagnóstico de doença cervical de alto grau. Osmétodos compreendem a detecção da superexpressão de pelomenos um biomarcador nuclear, em que a superexpressão dobiomarcador nuclear é indicativa de doença cervical de altograu. Especificamente, os métodos compreendem o uso dosanticorpos da invenção para detectar a superexpressão deMCM2 em uma amostra cervical.

As composições da invenção ainda incluem polipeptídeosisolados que compreendem um epitopo capaz de se ligar a umanticorpo monoclonal de MCM2. Esses polipeptídeos podem serusados em métodos para a produção de anticorpos de MCM2.Também são fornecidas moléculas de ácido nucléico isoladoque codificam seqüências de aminoácidos dos epitopos de MCM2.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

São fornecidos composições e métodos para odiagnóstico de doença cervical de alto grau. As composiçõesincluem anticorpos monoclonais que são capazes de se ligaràs proteínas biomarcadoras nucleares que são superexpressasseletivamente na doença cervical de alto grau,particularmente proteínas MCM, mais particularmente, MCM2.

Também são reveladas linhagens celulares de hibridomas queproduzem os anticorpos monoclonais da presente invenção.

São ainda fornecidos kits que compreendem os anticorposmonoclonais aqui descritos. As presentes composições podemser usadas em métodos para o diagnóstico de doença cervicalde alto grau em um paciente.

As composições da invenção incluem anticorposmonoclonais que se ligam especificamente à MCM2, ou a umavariante ou um fragmento desta. Em particular, sãofornecidos os anticorpos de MCM2 designados 27C5.6 e26H6.19. As linhagens celulares de hibridomas que produzemanticorpos monoclonais de MCM2 27C5.6 e 26H6.19 foramdepositadas com um Depositário de Patente da "American TypeCulture Collection" (ATCC), Manassas, Virgínia, 20110-2209em 14 de abril de 2005, e foram atribuídos os Depósitos dePatente Nos PTA-6668 e PTA-6667, respectivamente. Essesdepósitos serão mantidos sob os termos do Tratado deBudapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósitode Microorganismos para as Finalidades de Procedimento dePatente. Esses depósitos foram feitos simplesmente comoconveniência para aqueles habilitados na técnica e nãoconstituem uma admissão de que seja necessário um depósitosob 35 U.S.C. § 112.Anticorpos que possuem as características de ligaçãodos anticorpos monoclonais 27C5.6 e 26H6.19 também são aquirevelados. Tais anticorpos incluem, sem limitação,anticorpos que competem em ensaios de ligação competitivacom esses anticorpos, além de anticorpos que se ligam a umepitopo capaz de se ligar ao anticorpo monoclonal 27C5.6 ou26H6.19. Também são fornecidos variantes e fragmentos deanticorpos monoclonais 27C5.6 e 26H6.19 que retêm acapacidade de se ligar especificamente à MCM2. Ascomposições ainda incluem linhagens celulares de hibridomasque produzem os anticorpos monoclonais da presente invençãoe kits que compreendem pelo menos um anticorpo monoclonalaqui revelado.

"Anticorpos" e "imunoglobulinas" (Igs) sãoglicoproteínas que possuem as mesmas característicasestruturais. Embora os anticorpos exibam especificidade deligação para um antígeno, imunoglobulinas incluem tantoanticorpos quanto outras moléculas semelhantes a anticorpodesprovidas de especificidade de antígeno. Polipeptídeosdesse último tipo são, por exemplo, produzidos em níveisbaixos pelo sistema linfático e em níveis elevados por mielomas.

Os termos "anticorpo" e "anticorpos" englobam de formaampla formas de ocorrência natural de anticorpos eanticorpos recombinantes, tais como anticorpos de cadeiaúnica, anticorpos quiméricos e humanizados, e anticorposmultiespecíficos, além de fragmentos e derivados de todosos citados anteriormente, cujos fragmentos e derivadostenham pelo menos um sítio de ligação antigênica. Derivadosde anticorpos podem compreender uma proteína ou uma porçãoquímica conjugada ao anticorpo. O termo "anticorpo" é usadoem seu sentido mais amplo e cobre anticorpos totalmentemontados, fragmentos de anticorpo que podem se ligar a umantígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos decadeia única, diacorpos) e peptídeos recombinantes quecompreendem os citados anteriormente. Como aqui usado,"anticorpo de MCM2" refere-se a qualquer anticorpo que seligue especificamente a MCM2 (Id. de Seq. N°: 1), ou a umvariante ou fragmento deste, e inclui anticorposmonoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos de cadeiaúnica e fragmentos destes que retenham a função de ligaçãode antígeno do anticorpo parente.

Os anticorpos de MCM2 da invenção são otimamenteanticorpos monoclonais. O termo "anticorpo monoclonal" comoaqui usado refere-se a um anticorpo obtido a partir de umapopulação de anticorpos substancialmente homogêneos, ouseja, os anticorpos individuais que compreendem a populaçãosão idênticos, exceto quanto a possíveis mutações deocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores.

"Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" sãonormalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de150.000 dáltons, compostas de duas cadeias leves (L)idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeialeve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligaçãodissulfeto covalente, enquanto o número de ligaçõesdissulfeto varia entre as cadeias pesadas de isótipos deimunoglobulinas diferentes. Cada cadeia pesada e levetambém possui pontes dissulfeto intracadeia regularmenteespaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade umdomínio variável (VH), seguido por diversos domíniosconstantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em umaextremidade (V,) e um domínio constante na sua outraextremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhadocom um primeiro domínio constante da cadeia pesada, e odomínio variável da cadeia leve é alinhado com um domíniovariável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos deaminoácidos específicos formem uma interface entre osdomínios variáveis da cadeia leve e pesada.

0 termo "variável" refere-se ao fato de que certasporções dos domínios variáveis diferem intensamente emtermos de seqüências entre anticorpos, e de que elas sãousadas na ligação e especificidade de cada anticorpo emparticular por seu antígeno em particular. No entanto, avariabilidade não é igualmente distribuída pelos domíniosvariáveis de anticorpos. Ela está concentrada em trêssegmentos denominados regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis nosdomínios variáveis tanto da cadeia leve quanto da cadeiapesada. As porções mais altamente conservadas de domíniosvariáveis são denominadas regiões framework (FR). Osdomínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativascompreende quatro regiões FR, que adotam amplamente umaconfiguração em lâmina p, conectadas por três CDRs, queformam alças que conectam, e em alguns casos formam, parteda estrutura em lâmina p. As CDRs em cada cadeia sãomantidas intimamente juntas pelas regiões FR e, com as CDRsda outra cadeia, contribuem para a formação do sítio deligação de antígeno de anticorpos (veja Kabat e cols., NIHPubl. N° 91-3.242, Vol. I, páginas 647-669 (1991)).Os domínios constantes não estão envolvidosdiretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, masexibem várias funções efetoras, por exemplo, participaçãodo anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.

O termo "região hipervariável", quando usado nestaespecificação, refere-se aos resíduos de aminoácidos de umanticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. Aregião hipervariável compreende resíduos de aminoácidos deuma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (ouseja, resíduos 24-34 (LI), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) nodomínio variável da cadeia leve, e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat ecols., "Sequences of Proteins of Immunological Interest",5a Ed. Public Health Service, "National Institute ofHealth", i 25 Bethesda, MD. [1991]) e/ou aqueles resíduosde uma "alça hipervariável" (ou seja, resíduos 26-32 (LI),50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia levee 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variávelda cadeia pesada; Clothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 -917 [1987]). Resíduos "framework" ou "FR" são aquelesresíduos do domínio variável diferentes dos resíduos daregião hipervariável como aqui considerados.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção deum anticorpo intacto, preferivelmente a região de ligaçãode antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos defragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab1,F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata ecols. (1995) Protein Eng. 8(10): 1.057-1.062); moléculas deanticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficosformados por fragmentos de anticorpo. A digestão compapaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação deantígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada umcom um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento"Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade paracristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina gera umfragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação deantígenos que ainda é capaz de entrecruzamento comb antígeno.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umsítio de reconhecimento e ligação de antígeno de completo.Em uma espécie de Fv de duas cadeias, essa região consisteem um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e umde cadeia leve em estreita associação não covalente. Em umaespécie de Fv de cadeia única, um domínio variável decadeia pesada e um de cadeia leve podem ser ligados deforma covalente por um vinculador peptídico flexível, detal forma que as cadeias leves e pesadas possam se associarem uma estrutura "dimérica" análoga àquela em uma espéciede Fv de duas cadeias. É nessa configuração que as trêsCDRs de cada domínio variável interagem para definir umsítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL.Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade deligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até mesmo umdomínio variável único (ou metade de um Fv que compreendeapenas três CDRs específicas para um antígeno) tem acapacidade de reconhecer e se ligar a antígeno, embora commenor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeiapesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' pelaadição de poucos resíduos no terminal carboxi do domínioCH1 da cadeia pesada que inclui uma ou mais cisteínas daregião de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designaçãoaqui utilizada para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteínados domínios constantes abriga um grupo tiol livre.Fragmentos de anticorpos F(ab')2 originalmente foramproduzidos como pares de fragmentos Fab' que possuemcisteínas como dobradiça entre eles.

Fragmentos dos anticorpos de MCM2 são englobados pelainvenção, desde que retenham a afinidade desejada doanticorpo de comprimento total. Dessa forma, por exemplo,um fragmento de um anticorpo de MCM2 irá reter a capacidadede se ligar ao antígeno MCM2. Tais fragmentos sãocaracterizados por propriedades similares àquelas doanticorpo de comprimento total correspondente, ou seja, osfragmentos irão se ligar especificamente a MCM2. Taisfragmentos são aqui denominados fragmentos de "ligação deantígeno".

Fragmentos de ligação de antígeno adequados de umanticorpo compreendem uma porção de um anticorpo decomprimento total, geralmente a região de ligação deantígeno ou variável deste. Exemplos de fragmentos deanticorpo incluem, sem limitação, fragmentos Fab, F(ab')2 eFv, e moléculas de anticorpo de cadeia única. O termo "Fab"significa um fragmento de ligação de antígeno monovalentede uma imunoglobulina que é composto pela cadeia leve eparte da cadeia pesada. F(ab')2 significa um fragmento deligação de antígeno bivalente de uma imunoglobulina quecontém ambas as cadeias leves e parte de ambas as cadeiaspesadas. "Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo"sFv" significa fragmentos que compreendem os domínios VH eVL de um anticorpo, estando esses domínios presentes em umaúnica cadeia polipeptídica. Veja, por exemplo, as PatentesU.S. Nos 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030, e 5.856.456, aquiincorporadas por referência. Geralmente, o polipeptídeo Fvainda compreende um vinculador polipeptídico entre osdomínios VH e VL que permite que o sFv forme a estruturadesejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão sobresFv, consulte Pluckthun (1994) em "The Pharmacology ofmonoclonal antibodies", Vol. 113, ed. Rosenburg e Moore(Springer-Verlag, Nova York), pp. 269-315.

Anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem serisolados de bibliotecas de fago de anticorpos geradas com ouso de técnicas descritas, por exemplo, em McCafferty ecols. (1990) Nature 348: 552-554 (1990) e na Patente U.S.N° 5.514.548. Clackson e cols. (1991) Nature 352: 624-628 eMarks e cols. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 descrevem oisolamento de anticorpos murídeos e humanos,respectivamente, com o uso de bibliotecas de fago.Publicações subseqüentes descrevem a produção de anticorposhumanos de alta afinidade. (na faixa de nM) porembaralhamento de cadeias (Marks e cols. (1992)Bio/'Technology 10: 779-783), bem como infecção combinatóriae recombinação in vivo como estratégia para a construção debibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse e cols.(1993) Nucleic. Acids Res. 21: 2.265-2.266). Dessa forma,essas técnicas são alternativas viáveis para as técnicastradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para oisolamento de anticorpos monoclonais.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção defragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentoseram derivados por meio de digestão proteolítica deanticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto e cols.(1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan e cols. (1985) Science 229: 81) .No entanto, esses fragmentos agora podem ser produzidosdiretamente por células hospedeiras recombinantes. Porexemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados apartir de bibliotecas de fago de anticorpos discutidasacima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem serrecuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamentepara formar fragmentos F(ab')2 (Carter e cols. (1992)Bio/Technology 10: 163-167). De acordo com outra abordagem,fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente decultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicaspara a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentespara aqueles habilitados na técnica.

De preferência, os anticorpos da invenção são denatureza monoclonal. Como indicado acima, "anticorpomonoclonal" significa um anticorpo obtido a partir de umapopulação de anticorpos substancialmente homogêneos, ouseja, os anticorpos individuais que compreendem a populaçãosão idênticos, exceto quanto a possíveis mutações deocorrência natural que podem estar presentes em pequenasquantidades. O termo não é limitado em termos de espécie oufonte do anticorpo. O termo engloba imunoglobulinasinteiras, além de fragmentos tais como Fab, F(ab')2# Fv eoutros que retenham a função de ligação de antígeno doanticorpo. Anticorpos monoclonais são altamenteespecíficos, sendo dirigidos contra um único sítioantigênico, ou seja, um epitopo em particular dentro daproteína MCM2, como aqui definido abaixo. Além disso, aocontrário das preparações de anticorpos convencionais(policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentesdirigidos contra determinantes (epitopos) diferentes, cadaanticorpo monoclonal é dirigido contra um únicodeterminante no antígeno. 0 modificador "monoclonal" indicao caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de umapopulação substancialmente homogênea de anticorpos, e nãodeve ser considerado como que exige a produção do anticorpopor um método específico. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a serem usados de acordo com a presenteinvenção podem ser feitos pelo método de hibridoma descritoinicialmente por Kohler e cols. (1975) Nature 256: 495, oupor métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, aPatente U.S. N° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais"também podem ser isolados de bibliotecas de fago deanticorpos com o uso das técnicas descritas, por exemplo,em Clackson e cols. (1991) Nature 352: 624-628; Marks ecols. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; e na Patente U.S.N° 5.514.548.

Anticorpos monoclonais podem ser preparados com autilização do método de Kohler e cols. (1975) Nature 256:495-496, ou uma modificação deste. Tipicamente, umcamundongo é imunizado com uma solução contendo umantígeno. A imunização pode ser realizada por mistura ouemulsificação da solução contendo antígeno em sorofisiológico, de preferência em um adjuvante como, porexemplo, adjuvante completo de Freund, e injetando-se amistura ou emulsão por via parenteral. Qualquer método deimunização conhecido na técnica pode ser usado para seobter os anticorpos monoclonais da invenção. Após aimunização do animal, o baço (e, opcionalmente, várioslinfonodos grandes) é removido e dissociado em célulasúnicas. As células esplênicas podem ser rastreadasaplicando-se uma suspensão de células em uma placa ou poçorevestido com o antígeno de interesse. As células B queexpressam imunoglobulina ligada à membrana específica parao antígeno (ou seja, células produtoras de anticorpo) seligam à placa e não são removidas por enxãgüe. As células Bresultantes, ou todas as células esplênicas dissociadas,são então induzidas a se fundirem com células de mielomapara formar hibridomas produtores de anticorpo monoclonal,e são cultivadas em um meio seletivo. As célulasresultantes são plaqueadas por diluição serial e sãotestadas quanto à produção de anticorpos que se ligamespecificamente ao antígeno de interesse (e que não seligam a antígenos não relacionados). Os hibridomas quesecretam anticorpo monoclonal (mAb) selecionados são entãocultivados in vitro (por exemplo, em garrafas de cultura detecido ou em reatores de fibra oca) ou in vivo (como asciteem camundongos). Anticorpos monoclonais também podem serproduzidos com o uso de tecnologia de Sítios de ImunizaçõesMúltiplas Repetitivas (RIMMS). Veja, por exemplo,Kilpatrick e cols. (1997) Hybridoma 16(4): 381-389; Wring ecols. (1999) J. Pharm. Biomed. Anal. 19(5): 695-707; eBynum e cols. (1999) Hybridoma 18(5): 407-411, todos aquiincorporados por referência em sua totalidade.

Como alternativa ao uso de hibridomas, o anticorpopode ser produzido em uma linhagem celular como, porexemplo, linhagem celular CHO, como revelado nas PatentesU.S. Nos 5.545.403, 5.545.405 e 5.998.144, aquiincorporadas por referência. Resumidamente, a linhagemcelular é transfectada com vetores capazes de expressar umacadeia leve e uma cadeia pesada, respectivamente. Com atransfecção de duas proteínas em vetores separados, podemser produzidos anticorpos quiméricos. Outra vantagem é aglicosilação correta do anticorpo. Um anticorpo monoclonaltambém pode ser identificado e isolado rastreando-se umabiblioteca recombinante combinatória de imunoglobulinas(por exemplo, uma biblioteca de exibição de fago deanticorpos) com uma proteína biomarcadora para, desse modo,isolar os membros da biblioteca de imunoglobulinas que seligam à proteína biomarcadora. Kits para a geração erastreamento de bibliotecas de exibição de fago sãodisponíveis comercialmente (por exemplo, o "PharmaciaRecombinant Phage Antibody System", N° de Catálogo 27-9400-01; e o "Stratagene SurfZAPJ Phage Display Kit", N° deCatálogo 24 0612) . Adicionalmente, exemplos de métodos ereagentes particularmente adequados para uso na geração eno rastreamento de biblioteca de exibição de anticorpospodem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. N°5,223,409, Publicações PCT Nos WO 92/18619, WO 91/17271, WO92/20791, WO 92/15679, 93/01288, WO 92/01047, 92/09690, e90/02809; Fuchs e cols. (1991) Bio/Technology 9: 1.370-1.372; Hay e cols. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse e cols. (1989) Science 246: 1.275-1.281; Griffithse cols. (1993) EMBO J. 12: 725-734.

Em alguns aspectos da invenção, anticorpos podem serselecionados com base na coloração desejável de amostrascitológicas, e não histológicas. Ou seja, em modalidadesespecíficas, os anticorpos são selecionados com o tipo deamostra final (por exemplo, preparações de citologia) emmente e para especificidade de ligação. Anticorposdirigidos a biomarcadores de interesse específicos, porexemplo, MCM2, são selecionados e purificados por meio deum processo de rastreamento em multietapas. Tais métodospara seleção de anticorpos são descritos no Pedido U.S.pendente N° de Série 11/087.227, intitulado "Methods andCompositions for the Detection of Cervical Disease",depositado em 23 de março de 2005, que é aqui incorporadopor referência em sua totalidade.

Também são fornecidos anticorpos que possuem ascaracterísticas de ligação de um anticorpo monoclonal dainvenção. "Características de ligação" ou "especificidadede ligação", quando usado em relação a um anticorpo,significa que o anticorpo reconhece o mesmo epitopoantigênico ou um epitopo antigênico similar que umanticorpo de comparação. Exemplos de tais anticorposincluem, por exemplo, um anticorpo que compete com umanticorpo monoclonal da invenção em um ensaio de ligaçãocompetitiva. Aqueles habilitados na técnica podemdeterminar se um anticorpo interfere competitivamente comoutro anticorpo através de métodos-padrão.

"Epitopo" significa a parte de uma molécula antigenicapara a qual um anticorpo é produzido e à qual o anticorpoirá se ligar. Um "epitopo de MCM2" compreende a parte daproteína MCM2 à qual um anticorpo monoclonal de MCM2 seliga. Epitopos podem compreender resíduos de aminoácidoslineares (ou seja, os resíduos dentro do epitopo estãodispostos seqüencialmente um depois do outro de formalinear), resíduos de aminoácidos não lineares (aquidenominados "epitopos não lineares"; esses epitopos nãoestão dispostos seqüencialmente), ou resíduos deaminoácidos tanto lineares quanto não lineares.Tipicamente, epitopos são seqüências de aminoácidos curtas,por exemplo, com comprimento de cerca de cinco aminoácidos.Metodologias sistemáticas para a identificação de epitopossão conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, naPatente U.S. N° 4.708.871 e nos exemplos apresentadosabaixo. Resumidamente, em um método, um conjunto deoligopeptídeos superpostos derivados do antígeno pode sersintetizado e ligado a um arranjo de fase sólida de pinos,com um único oligopeptídeo em cada pino. O arranjo de pinospode compreender uma placa de microtitulação de 96 poços,que permite testar todos os 96 oligopeptídeossimultaneamente, por exemplo, quanto à ligação a umanticorpo monoclonal específico para o biomarcador.Alternativamente, kits de biblioteca de peptídeos deexibição de fago (New England BioLabs) são atualmentedisponíveis comercialmente para mapeamento de epitopos. Coma utilização desses métodos, a afinidade de ligação paratodos os subconjuntos possíveis de aminoácidos consecutivospode ser determinada a fim de identificar o epitopo ao qualcerto anticorpo se liga. Epitopos também podem seridentificados por dedução quando são usadas seqüênciaspeptídicas do comprimento do épitopo para a imunização deanimais dos quais os anticorpos foram obtidos.

A invenção também engloba polipeptídeos isolados quecompreendem um epitopo para a ligação de um anticorpomonoclonal de MCM2. Esses polipeptídeos correspondem a umaporção do antígeno (ou seja, MCM2) que se liga a umanticorpo monoclonal. Tais polipeptídeos podem serutilizados em métodos para a produção de anticorpos que seligam seletivamente a MCM2. A capacidade de um polipeptídeopara ser usado na produção de anticorpos é aqui denominada"atividade antigênica". Por exemplo, as seqüências deaminoácidos apresentadas nos Ids. de Seq. NoS: 3, 4 e 14(que correspondem aos resíduos 369 a 382, 688 a 710 e 683 a692, respectivamente, na seqüência de aminoácidos de MCM2apresentada no Id. de Seq. N°: 1) compreendem epitoposreconhecidos por anticorpos monoclonais de MCM2, maisparticularmente, anticorpos monoclonais 27C5.6 e 26H6.19.Veja o Exemplo 4 para detalhes. Variantes e fragmentos dasseqüências do epitopo de MCM2 apresentadas nos Ids. de Seq.NoS: 3, 4 e 14 que retêm a atividade antigênica dopolipeptídeo original também são fornecidos. A invençãoainda inclui moléculas de ácido nucléico isolado quecodificam polipeptídeos que compreendem epitopos de MCM2, evariantes e fragmentos destas.

Os polipeptídeos da invenção que compreendem epitoposde MCM2 podem ser usados nos métodos para a produção deanticorpos monoclonais que se ligam especificamente a MCM2,como aqui descritos acima. Tais polipeptídeos também podemser usados na produção de anticorpos policlonais de MCM2.Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser preparadosimunizando-se um indivíduo adequado (por exemplo, coelho,cabra, camundongo ou outro mamífero) com um polipeptídeoque compreenda um epitopo de MCM2 (ou seja, um imunógeno) .A titulação do anticorpo no indivíduo imunizado pode sermonitorada ao longo do tempo por técnicas-padrão, porexemplo, com um ensaio imünoabsorvente ligado à enzima(ELISA) com o uso de proteína biomarcadora imobilizada. Nomomento apropriado após a imunização, por exemplo, quandoas titulações de anticorpo são as mais elevadas, célulasprodutoras de anticorpo do indivíduo podem ser obtidas eusadas para a preparação de anticorpos monoclonais portécnicas-padrão, por exemplo, a técnica do hibridomadescrita originalmente por Kohler e Milstein (1975) Nature256: 495-497, a técnica de hibridoma de célula B humana(Kozbor e cols. (1983) Immunol. Today 4:72), a técnica dohibridoma de EBV (Cole e cols. (1985) em MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, ed. Reisfeld e Sell (Alan R.Liss, Inc., Nova York, NY) , pp. 77-96) ou técnicas detrioma. A tecnologia para a produção de hibridomas é bemconhecida (veja, geralmente, Coligan e cols., eds. (1994)Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc.,Nova York, NY) ; Galfre e cols. (1977) Nature 266: 55.052;Kenneth (198 0) em Monoclonal Antibodies: A New Dimension InBiological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY; e Lerner(1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402).

Variantes da seqüência de aminoácidos de um anticorpomonoclonal ou um polipeptídeo que compreende um epitopo deMCM2 aqui descrito também são englobadas pela presenteinvenção. Variantes podem ser preparadas por mutações naseqüência de DNA clonada que codifica o anticorpo deinteresse. Métodos para mutagênese e alterações daseqüência de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica.Veja, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983)"Techniques in Molecular Biology" (MacMillan PublishingCompany, Nova York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 82: 488-492; Kunkel e cols. (1987) Methods Enzymol.154: 367-382; Sambrook e cols. (1989) "Molecular Cloning: ALaboratory Manual" (Cold Spring Harbor, Nova York); PatenteU.S. N° 4.873.192; e as referências neles citadas; aquiincorporados por referência. Um guia sobre substituiçõesapropriadas de aminoácidos que não afetam a atividadebiológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontradono modelo de Dayhoff e cols. (1978) no Atlas of ProteinSequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.Substituições conservadoras, por exemplo, a troca de umaminoácido por outro que possua propriedades similares,podem ser preferidas. Exemplos de substituiçõesconservadoras incluem, sem limitação, Gly<=>Ala,Val<=>Ile<s>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, AsnoGln e Phe<»Trp«-Tyr.

Na construção de variantes do polipeptídeo deinteresse, são feitas modificações de tal forma que asvariantes continuem a possuir a atividade desejada, ouseja, afinidade de ligação similar ao biomarcador.Obviamente, qualquer mutação feita no DNA que codifica opolipeptídeo variante não deve colocar a seqüência fora doquadro de leitura e, de preferência, não criará regiõescomplementares que poderiam produzir estrutura de mRNAsecundário. Veja A Publicação de Pedido de Patente EP N° 75.444.

De preferência, variantes de um polipeptídeo dereferência possuem seqüências de aminoácidos que têm pelomenos 70% ou 75% de identidade de seqüência,preferivelmente pelo menos 80% ou 85% de identidade deseqüência, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%,93%, 94% ou 95% de identidade de seqüência para a seqüênciade aminoácidos para a molécula de anticorpo de referência,ou para uma porção mais curta da molécula de anticorpo dereferência. Mais preferivelmente, as moléculas compartilhampelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência.Para as finalidades da presente invenção, o percentual deidentidade de seqüência é determinado com a utilização doalgoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman usandouma pesquisa de lacunas afins com uma penalidade de lacunaaberta de 12 e uma penalidade de extensão de lacuna de 2,matriz BLOSUM de . 62. 0 algoritmo de pesquisa de homologiade Smith-Waterman é ensinado em Smith e Waterman (1981)Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Uma variante, por exemplo,pode diferir do anticorpo de referência em apenas 1 a 15resíduos de aminoácidos, apenas 1 a 10 resíduos deaminoácidos, por exemplo, 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2,ou até mesmo 1 resíduo de aminoácido.

Com relação ao alinhamento ótimo de duas seqüências deaminoácidos, o segmento contíguo da seqüência deaminoácidos variante pode ter resíduos de aminoácidosadicionais ou resíduos de aminoácidos eliminados comrelação à seqüência de aminoácidos de referência. 0segmento contíguo usado para comparação com a seqüência deaminoácidos de referência incluirá pelo menos 20 resíduosde aminoácidos contíguos, e pode ter 30, 40, 50 ou maisresíduos de aminoácidos. Podem ser feitas correções paraidentidade de seqüência associada às substituiçõesconservadoras de resíduos ou lacunas (veja algoritmo depesquisa de homologia de Smith-Waterman).Os anticorpos monoclonais de MCM2 da invenção podemser rotulados com uma substância detectável, como descritoabaixo, para facilitar a detecção da proteína biomarcadorana amostra. Tais anticorpos podem ser usados na prática dosmétodos da invenção. Os anticorpos e fragmentos deanticorpo da invenção podem ser acoplados a uma substânciadetectável para facilitar a detecção da ligação deanticorpo. A palavra "rótulo", quando aqui usada, refere-sea um composto ou uma composição detectável que sejaconjugada direta ou indiretamente ao anticorpo, de forma agerar um anticorpo "rotulado". O rótulo pode ser detectávelpor si próprio (por exemplo, rótulos de radioisótopo ourótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático,pode catalisar a alteração química de um composto ou umacomposição de substrato que seja detectável. Exemplos desubstâncias detectáveis com a finalidade de rotular os.anticorpos incluem várias enzimas, grupos prostéticos,materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiaisbioluminescentes e materiais radioativos. Exemplos deenzimas adequadas incluem peroxidase de raiz-forte (HRP) ,fosfatase alcalina, p-galactosidase óu acetilcolinesterase;exemplos de complexos de grupo prostético incluemestreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos demateriais fluorescentes adequados incluem umbeliferona,fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ouficoeritrina,- um exemplo de um material luminescente incluiluminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluemluciferase, luciferina e aequorina; e exemplos de materialradioativo adequado incluem 1251, 131I, 35S ou 3H.São ainda fornecidos kits que compreendem pelo menosum anticorpo monoclonal de MCM2 da invenção. "Kit"significa qualquer produto manufaturado (por exemplo, umpacote ou um recipiente) que compreenda pelo menos umreagente, ou seja, um anticorpo, para detectarespecificamente a expressão de MCM2. O kit pode serpromovido, distribuído ou vendido como uma unidade para arealização dos métodos da presente invenção.Adicionalmente, os kits podem conter uma bula que descrevao kit e os métodos para seu uso.

Os kits da invenção geralmente compreendem pelo menosum anticorpo monoclonal dirigido a MCM2, substânciasquímicas para a detecção de ligação de anticorpo, umcontracorante e, opcionalmente, um agente azulador parafacilitar a identificação de células com coloraçãopositiva. Qualquer substância química que detecte a ligaçãoantígeno-anticorpo pode ser usada nos kits da invenção. Emalgumas modalidades, as substâncias químicas de detecçãocompreendem um polímero rotulado conjugado a um anticorposecundário. Por exemplo, pode ser fornecido um anticorposecundário que é conjugado a uma enzima que catalisa odepósito de um cromógeno no sítio de ligação antígeno-anticorpo. Tais enzimas e metodologias para sua utilizaçãona detecção da ligação de anticorpo são bem conhecidas natécnica. Em uma modalidade, o kit compreende um anticorposecundário que é conjugado a um HRP-polímero rotulado.Podem ainda ser fornecidos cromógenos compatíveis com aenzima conjugada (por exemplo, DAB, no caso de um anticorposecundário rotulado com HRP) e soluções, tais como peróxidode hidrogênio, para o bloqueio da coloração não específica.Em outras modalidades, a ligação de anticorpo a umaproteína biomarcadora é detectada através do uso de umreagente de sonda de camundongo que se liga aos anticorposmonoclonais, seguido pela adição de um polímero de dextranaconjugado à HRP que se liga ao reagente de sonda decamundongo. Esses reagentes de detecção são disponíveiscomercialmente, por exemplo, por Biocare Medicai.

Os kits da presente invenção podem ainda compreenderum reagente de bloqueio de peroxidase (por exemplo,peróxido de hidrogênio), um reagente de bloqueio deproteína (por exemplo, caseína purificada) e umcontracorante (por exemplo, hematòxilina). Um agenteazulador (por exemplo, hidróxido de amônio ou TBS, pH 7,4,com Tween-20 e azida de sódio) pode ainda ser fornecido nokit para facilitar a detecção de células com coloraçãopositiva. Os kits também podem conter amostras de controlepositivo e negativo para finda de controle de qualidade.

Em outra modalidade, os kits da invenção compreendemdois anticorpos monoclonais de MCM2, mais particularmenteanticorpos monoclonais 27C5.6 e 26H6.19. É ainda fornecidoum kit que compreende dois anticorpos monoclonais de MCM2 eum terceiro anticorpo dirigido à topoisomerase II alfa(Topo2A). Quando estão presentes vários anticorpos no kit,cada anticorpo pode ser fornecido como um reagenteindividual ou, alternativamente, como um coquetel deanticorpos que compreende todos os anticorpos de interesse.Além disso, qualquer um ou todos os reagentes do kit podemser fornecidos em recipientes que os protejam do ambienteexterno, por exemplo, em recipientes lacrados. Os kits dainvenção são úteis no diagnóstico de doença cervical dealto grau e podem ainda incluir reagentes para coloração dePapanicolau (por exemplo, EA50 e Laranja G).

As composições da invenção podem ser usadas em métodospara o diagnóstico de doença cervical de alto grau em umapaciente, tais como aqueles revelados no Pedido U.S.pendente N° de Série 11/087.227, intitulado "Methods andCompositions for the Detection of Cervical Disease",depositado em 23 de março de 2005, que ê aqui incorporadopor referência em sua totalidade. O "diagnóstico de doençacervical de alto grau" visa a incluir, por exemplo, odiagnóstico ou a detecção da presença de doença cervical, omonitoramento da progressão da doença e a identificação oudetecção de células ou amostras que sejam indicativas dedoença cervical de alto grau. Os termos "diagnóstico","detecção" e "identificação" de doença cervical de altograu são aqui usados de foram intercambiável. "Doençacervical de alto grau" significa aquelas condiçõesclassificadas por colposcopia como patologia pré-maligna,patologia maligna, displasia moderada a severa e câncercervical. Doença cervical de alto grau subjacente inclui aidentificação histológica de CÍNII, CINIII, HSIL, carcinomain situ, adenocarcinoma e câncer (estágios FIGO I-IV).

Os métodos da invenção compreendem a detecção dasuperexpressão de pelo menos um biomarcador nuclear que éseletivamente superexpresso em doença cervical de altograu. "Biomarcador nuclear" significa qualquer gene deproteína que seja expresso predominantemente no núcleo dacélula. Um biomarcador nuclear pode ser expresso em um graumenor em outras partes da célula. "Superexpressoseletivamente em doença cervical de alto grau" significaque o biomarcador nuclear de interesse é superexpresso emdoença cervical de alto grau, mas não é superexpresso emcondições classificadas como LSIL, CINI, amostrasinfectadas por HPV, sem nenhuma displasia presente, célulasmetaplásicas imaturas e outras condições que não sãoconsideradas como sendo doença clínica. Dessa forma, adetecção dos biomarcador nucleares da invenção permite adiferenciação de amostras indicativas de doença cervical dealto grau subjacente de amostras que são indicativas deproliferação benigna, infecção por HPV em estágio inicialou displasia leve. Os biomarcadores nucleares de interesseparticular incluem proteínas MCM, particularmente MCM2, e Topo2A.

Em um aspecto particular da invenção, os métodoscompreendem a obtenção de uma amostra cervical de umpaciente, o contato da amostra com pelo menos um anticorpomonoclonal de MCM2 da invenção, e a detecção da ligação doanticorpo à MCM2. Em outras modalidades, a amostra écolocada em contato com pelo menos dois anticorposmonoclonais que se ligam especificamente a MCM2,particularmente anticorpos monoclonais 27C5.6 e 26H6.19. Emuma modalidade adicional, a amostra é colocada em contatocom esses dois anticorpos monoclonais de MCM2 e um terceiroanticorpo que se liga especificamente a Topo2A.Metodologias para detecção da ligação de anticorpo são bemconhecidas na técnica. A ligação de anticorpo a umbiomarcador de interesse pode ser detectada através do usode reagentes químicos que geram um sinal detectável quecorresponde ao nível de ligação de anticorpo e,conseqüentemente, ao nível de expressão protéicabiomarcadora. Qualquer método para detecção da ligaçãoanticorpo-antígeno pode ser usado para a prática dosmétodos da invenção.

Como aqui usado, o termo "amostra cervical" refere-sea qualquer amostra de células, tecidos ou líquidoscorporais da cérvix na qual a expressão de um biomarcadorpossa ser detectada. Exemplos dessas amostras corporaisincluem, sem limitação, líquidos ginecológicos, biópsias eesfregaços. Amostras cervicais podem ser obtidas de umapaciente por diversas técnicas, incluindo, por exemplo,raspando ou esfregando uma área ou com o uso de uma agulhapara aspiração de líquidos corporais. Métodos para a coletade amostras cervicais são bem conhecidos na técnica. Emmodalidades específicas, a amostra cervical compreendecélulas cervicais, particularmente em uma preparação debase líquida. Em uma modalidade, as amostras cervicais sãocoletadas de acordo com as diretrizes de preparação deamostras de citologia de base líquida, por exemplo, apreparação SurePath® (TriPath Imaging, Inc.) ou apreparação ThinPrep® (CYTYC, Inc.). As amostras cervicaispodem ser transferidas para uma lâmina de vidro para seremvisualizadas com ampliação. Soluções de fixação e coloraçãopodem ser aplicadas às células na lâmina de vidro parapreservar a amostra e para facilitar o exame. Em umamodalidade, a amostra cervical será coletada e processadapara fornecer uma amostra de monocamada, como apresentadona Patente U.S. N° 5.346.831, aqui incorporada por referência.

Aqueles habilitados na técnica observarão que qualqueruma ou todas as etapas nos métodos da invenção poderiam serimplementadas por profissionais de forma manual ouautomatizada. Dessa forma, as etapas de preparação daamostra cervical, anticorpo e detecção de ligação deanticorpo podem ser automatizadas. Os métodos da invençãotambém podem ser combinados com técnicas convencionais decoloração de Papanicolou para permitir um diagnóstico maispreciso de doença cervical de alto grau.

Os exemplos a seguir são oferecidos como forma deilustração, e não como forma de limitação.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1

Produção de anticorpos monoclonais de camundongo para MCM2

Foram gerados anticorpos monoclonais de camundongoespecíficos para MCM2. O antígeno (um polipeptídeoimunogênico) foi uma proteína MCM2 recombinante decomprimento total rotulada com hexahistidina. O antígenofoi expresso usando um sistema de expressão de baculovírusem células Tni. Especificamente, a seqüência de codificaçãopara a MCM2 rotulada com hexahistidina (Id. de Seq. N°: 10)foi clonada no plasmídeo pFastBacl (Invitrogen) paraexpressão em células Tni. Métodos para a produção deproteínas recombinantes com a utilização de sistemas deexpressão de baculovírus são bem conhecidos na técnica. Aproteína MCM2 rotulada foi purificada usando uma agarosequelante carregada com íons Ni+2 (Ni-NTA de Qiagen) e usadacomo imunógeno. Uma seqüência de aminoácidos dopolipeptídeo MCM2 imunogênico é fornecida no Id. de Seq.N°: 11.

As imunizações dos camundongos e as fusões dehibridoma foram realizadas basicamente como descrito emKohler e cols. (1975) Nature 256: 495-496. Os camundongosforam imunizados com a proteína MCM2 imunogênica rotuladaem solução. As células produtoras de anticorpos foramisoladas dos camundongos imunizados e fundidas com célulasde mieloma para formar hibridomas produtores de anticorpomonoclonal. Os hibridomas foram cultivados em um meioseletivo. As células resultantes foram plaqueadas pordiluição serial, e testadas quanto à produção de anticorposque se ligam especificamente a MCM2 (e que não se ligam aantígenos não relacionados). Para confirmar que osanticorpos monoclonais de interesse reagiram somente com aproteína MCM2, e não com o rótulo de hexahistidina,hibridomas selecionados foram rastreados contra umaproteína rotulada com MCM2-FLAG. As seqüências denucleotídeos e de aminoácidos para a proteína MCM2-FLAG sãoapresentadas nos Ids. de Seq. N°s: 12 e 13,respectivamente. Hibridomas selecionados que secretamanticorpo monoclonal (mAb) foram então cultivados.

Os anticorpos foram purificados a partir dossobrenadantes dos meios de cultura de células de hibridoma"exauridas" (ou seja, células que cresceram até que aviabilidade caísse até entre 0-15%) usando resinarecombinante revestida com Proteína A (STREAMLINE®,Amersham, Inc.). Os anticorpos foram eluídos usando pHbaixo, seguido por neutralização imediata do pH. As fraçõescom absorbâncias significativas a 280 nM foram reunidas empool. O pool resultante foi dialisado contra PBS. Osanticorpos purificados foram submetidos a umacaracterização adicional. Ambos os anticorpos monoclonaisde MCM2, 26H6.19 e 27C5.6 foram determinados como sendoisótipos de IgGl. Detalhes do mapeamento de epitopos dessesanticorpos são descritos abaixo.

Exemplo 2

Isolamento de anticorpos monoclonais de células de

hibridoma

O procedimento seguinte é usado para isolar anticorposmonoclonais de células de hibridoma:

Preparação dos meios

- A uma garrafa de estocagem estéril de 1.000 ml,adicionar 100 ml de soro bovino fetal (FBS) Hyclone.

Adicionar 10 ml de solução de aminoácidos nãoessenciais MEM.

Adicionar 10 ml de solução de penicilina-estreptomicina-L-glutamina.

- QS até aproximadamente 1.000 ml com meio ExCell 610-HSF.

- Colocar tampas estéreis na garrafa e apertar comforça. Agitar suavemente para misturar.

- Conectar uma unidade de filtro a vácuo de acetatoestéril de 1.000 ml (0,2 um) a um sistema de bomba a vácuo.

Derramar gentilmente aproximadamente metade dasolução de meio em uma unidade de filtro a vácuo de acetatoestéril e ligar o vácuo.

- Após metade do meio ter sido filtrado, derramar omeio restante na unidade de filtro e continuar a filtraçao.

- Após todo o meio ter sido filtrado, desconectar amangueira de vácuo da unidade de filtro a vácuo e desligara bomba de vácuo. Remover a porção receptora da unidade defiltro da garrafa de filtro. Colocar uma nova tampa degarrafa estéril na garrafa.- Estocar a 2°C a 10°C. Proteger da luz.Cultura inicial de células de hibridoma

- Descongelar o frasco de cultura de estoque congeladade hibridoma em um banho de H20 pré-aquecido a 3 7°C.

- Vaporizar o exterior do frasco congelado com etanol 70%.

- Mover o frasco congelado para o interior do gabinetede segurança biológica.

- Remover as células do frasco congelado e transferiras células a um tubo de centrifuga de 15 ml.

- Adicionar 7 ml de meios de cultura de células gota agota ao tubo de centrífuga de 15 ml que contém as célulasdescongeladas.

- Centrifugar o tubo de centrífuga de 15 ml contendoas células descongeladas e o meio de cultura por 5 minutosem uma força de 200 g.

- Enquanto as células estão na centrífuga, adicionar45 ml de meio de cultura de células a um frasco T-225estéril.

- Após centrifugação, inspecionar visualmente o tuboquanto à presença de um pélete de células.

Remover o meio do tubo de centrífuga, tendo ocuidado de não deslocar o pélete de células. Observação:caso o pélete de células seja alterado, repetir a etapa decentrifugação.

- Adicionar 5 ml de meio de cultura de células ao tubode centrífuga de 15 ml que contém as células peletizadas.Pipetar para ressuspender o pélete de células no meio.

- Transferir todo o conteúdo das células ressuspensase meio de cultura para o frasco T-225 contendo os 45 ml demeio.

- Tampar o frasco T-225.

Observar a presença de células intactas sob omicroscópio. Colocar o frasco T-225 imediatamente em umaincubadora de C02 e permitir que as células sejam incubadasde um dia para o outro.

Expansão de linhagem celular de hibridoma

- Continuar a monitorar a cultura de células quanto àviabilidade, concentração e presença de contaminação.

- Monitorar e ajustar a suspensão de células a partirdo frasco T-225 inicial, até que a concentração seja deaproximadamente 600.000 células/ml a 800.000 células/ml eum total de 2 00 a 250 ml de meio.

Deslocar as células e adicionar meio, como fornecessário para atender às exigências mínimas de densidadecelular. Dividir e transferir a suspensão de células em umnovo frasco T-225 estéril. Colocar os 2 x frascos T-225 naincubadora de C02.

- Monitorar as células dos 2 x frascos T-225 até que aconcentração seja de aproximadamente 600.000 células/ml a800.000 células/ml, e um total entre 200 a 250 ml de meiopara cada frasco.

Deslocar as células e adicionar meio, como fornecessário para atender às exigências mínimas de densidadecelular. Dividir e transferir as suspensões de células em 2novos frascos T-225 estéreis adicionais por um total de 4 xfrascos T-225. Retornar todos os frascos para a incubadora de C02.

- Monitorar as células e ajustar o volume nos 4 xfrascos T-225, até que a concentração celular seja deaproximadamente 600.000 células/ml a 800.000 células/ml,com um volume total de aproximadamente 250 ml por frasco T-225 (ou aproximadamente 1.000 ml no total).

- Continuar a monitorar as células dos 4 x frascos T-225, até que as células tenham crescido à exaustão, com umaviabilidade final de 0%-15%. O sobrenadante da cultura decélulas está agora pronto para o processo de clarificação.

Clarificação do sobrenadante

Ligar a centrifuga de bancada. Colocar osadaptadores do tubo de 50 0 ml nos compartimentos do rotor,fechar a tampa e ajustar a temperatura em 4°C (+/-) 4°C.

- Usando técnica asséptica, derramar o meio de todosos quatro frascos T-225 agora exauridos em 2 x tubos decentrífuga cônicos de 500 ml.

- Certificar-se de que os 2 x tubos de 500 ml estãoequilibrados. Transferir o sobrenadante de um tubo para ooutro, como necessário para equilibrá-los.

- Centrifugar o sobrenadante exaurido a 1.350 g (+/-40 g) por 15 minutos a 2°C a 10°C.

Após o término da centrifugação, decantarassepticamente o sobrenadante em uma garrafa de estocagemestéril de 1.000 ml e fechá-la com uma tampa estéril.

Transferir assepticamente 1 ml para o tubo damicrocentrífuga. Estocar o tubo da microcentrífuga comamostra a 2°C a 10°C (proteger da luz).

- A amostra clarificada do sobrenadante está prontapara avaliação de IgG com o uso do ensaio Easy-Titer®.

Preparação do tampão

Tampão de ligação:

- Adicionar aproximadamente 600 ml de H20 Dl a umbécher limpo.

- Adicionar 77,28 ml de solução de ácido bórico (4%p/v). Agitar em temperatura ambiente com uma barra deagitação limpa.

- Pesar 233,76 g de cloreto de sódio e colocar nasolução durante agitação constante.

- Levar a solução até aproximadamente 950 ml com H20Dl e continuar agitação.

- Quando o cloreto de sódio tiver se dissolvido e asolução estiver transparente, ajustar o pH até 9,0 ± 0,2com hidróxido de sódio.

- Remover a solução para um cilindro graduado limpo de1.000 ml e QS até 1.000 ml com H20 Dl.

- Transferir o tampão completado para uma garrafa deestocagem apropriada. Esse tampão pode ser estocado por até7 dias, antes de ser utilizado.

- Repetir todo o processo para preparar um adicionalde 0,2 litro para 1,0 litro de tampão de ligação.

Tampão de eluição

Pesar 1,725 g de fosfato de sódio monobásico ecolocá-lo em um bécher limpo de 250 ml com uma barra deagitação limpa.

- Pesar 3,676 g. de citrato de sódio e colocá-los nomesmo bécher limpo de 250 ml.

- Adicionar aproximadamente 175 ml de H20 Dl e agitarem temperatura ambiente até ser dissolvido.

- Pesar 4,3 8 g de cloreto de. sódio e colocá-los nasolução durante agitação.

- Levar a solução até aproximadamente 225 ml com H20Dl e continuar a agitação.- Quando o cloreto de sódio tiver se dissolvido e asolução estiver transparente, ajustar o pH até 3,5 ± 0,2com ácido clorídrico.

- Remover a solução para um cilindro graduado limpo de250 ml e QS até 250 ml com H20 Dl.

- Conectar uma unidade de filtro a vácuo de acetatoestéril de 500 ml (0,2 um) a um sistema de bomba a vácuo eesterilizar por filtração a solução.

- Remover o filtro e fechar o recipiente com uma tampaestéril.

Adsorção de anticorpo

- Derramar o sobrenadante clarificado (~ 1 1) em umabécher plástico limpo de 4.000 ml com uma barra de agitação limpa.

- Adicionar uma quantidade aproximadamente igual (~ 11) do tampão de ligação ao bécher plástico limpo de 4.000ml que contém o sobrenadante clarificado. Adicionar umabarra de agitação limpa.

- Cobrir o bécher com um filme plástico e rotular"Ligação de Anticorpo".

Calcular a quantidade aproximada de Proteína ASTREAMLINE® que será necessária usando os dados da Tabela 1.

Tabela 1: Volume necessário de Resina de Proteína A

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

Fixar um conjunto limpo de coluna descartável eválvula reguladora a um suporte em anel e prender. Fechar aválvula reguladora.

- Misturar uma quantidade apropriada de glóbulos deProteína A STREAMLINE invertendo-se a garrafa várias vezes.Retirar o volume necessário e colocá-lo na colunadescartável.

- Lavar os glóbulos de Proteína A STREAMLINE com 10 mlde H20 Dl. Abrir a válvula reguladora e permitir que a H20Dl seja drenada. Fechar a válvula reguladora. Repetir comum adicional de 10 ml de H20 Dl.

- Lavar os glóbulos de Proteína A STREAMLINE com 10 mlde tampão de ligação. Abrir a válvula reguladora e permitirque o tampão de ligação seja drenado. Fechar a válvulareguladora. Repetir com um adicional de 10 ml de tampão deligação.

- Ressuspender os glóbulos de Proteína A STREAMLINE emaproximadamente 10 ml do sobrenadante clarificado e soluçãode tampão de ligação (da proveta de 4.000 ml) e transferiros glóbulos para o bécher de 4.000 ml que contém osobrenadante transparente e a solução de tampão de ligação.Repetir, como for necessário, para transferir quaisquerglóbulos restantes. Quando completado, descartar a coluna ea válvula reguladora.

- Permitir que a mistura seja misturada vigorosamentea 2°C a 10°C por aproximadamente 18 horas.

- Quando a mistura estiver completa, desligar a placade agitação e remover a proveta de "Ligação de Anticorpo"com o sobrenadante tamponado e a suspensão de glóbulos devolta para a área da bancada do laboratório. Permitir queos glóbulos de Proteína A STREAMLINE se depositem no fundodo bécher (aproximadamente 5 minutos).

Fixar um conjunto limpo de coluna descartável eválvula reguladora a um suporte em anel e prender. Fechar aválvula reguladora.

- Rotular uma garrafa limpa de 250 ml ou um recipienteadequado com "Ligação Pós-Lavagem da Coluna".

- Rotular uma proveta plástica limpa com "Ligação Pós-Sobrenadante".

- Decantar o sobrenadante da proveta de 4.000 ml nobécher plástico limpo e rotulado de 2 litros, deixando osglóbulos no fundo da proveta de 4.000 ml. Cobrir o bécherde 2.000 ml que contém a solução de "Ligação Pós-Sobrenadante" com filme plástico limpo e estocar a 2°C a 10°C.

- Adicionar aproximadamente 15 ml de tampão de ligaçãona proveta decantada de 4.000 ml rotulada "Ligação deAnticorpo". Ressuspender os glóbulos de Proteína ASTREAMLINE e transferi-los para a coluna. Abrir a válvulareguladora e permitir que o tampão de ligação seja drenadono recipiente "Ligação Pós-Lavagem da Coluna". Fechar aválvula reguladora quando drenada.

- Transferir quaisquer glóbulos restantes de ProteínaA STREAMLINE no bécher "Ligação de Anticorpo" por adição detampão de ligação adicional, misturar e transferir para acoluna, como nas etapas precedentes. Fechar a válvulareguladora quando drenada.

Calcular a quantidade aproximada de tampão deligação necessária para lavar os glóbulos de Proteína ASTREAMLINE na coluna com os usos dos dados da Tabela 2.

Tabela 2: Volume de tampão de ligação para lavagem dacoluna

<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>

- Lavar os glóbulos de Proteína A STREAMLINE na colunacom o volume apropriado de tampão de ligação pelo númeroapropriado de lavagens, continuando a coletar o efluente norecipiente "Ligação Pós-Lavagem da Coluna".

- Quando completado, fechar a válvula reguladora.

Estocar o recipiente "Ligação Pós-Lavagem da Coluna" a 2°Ca 10°C.

- Determinar os Volumes Totais de Tampão de Eluição eTampão de Neutralização necessários para eluir os glóbulosde Proteína A STREAMLINE na coluna a partir da Tabela 3.

Tabela 3: Determinação da quantidade de tampão de eluição e tampão deneutralização <table>table see original document page 44</column></row><table>Rotular 9 tubos de centrífuga cônicos estéreis"Anticorpo Eluido", Fração # (1 até 9).

Colocar o volume apropriado de tampão deneutralização necessário por fração (como determinado apartir da Tabela "C" acima) e cada um dos 9 tubos da fraçãode "Anticorpo Eluído" e colocar de forma segura sob a saídada válvula reguladora da coluna.

- Eluir os glóbulos de Proteína A STREAMLINE na fraçãoda coluna por fração com o volume apropriado de tampão deeluição necessário por fração (como determinado a partir daTabela 3 acima), enquanto se coleta o eluído em cada um dostubos de "Anticorpo Eluído" que contêm tampão de neutralização.

- Quando as eluições estiverem completas, misturarcada tubo da fração de "Anticorpo Eluído" gentilmenteagitando-se várias vezes. Remover aproximadamente 50 ul dafração # 3 e colocar em uma tira de papel de teste de pHpara assegurar que o eluído foi neutralizado até um pHaproximado entre 6,5 a 8,5. Se necessário, acrescentar maistampão de neutralização ou tampão de eluição, como fornecessário para levar o pH até essa faixa.

Quando a avaliação do pH estiver completada,realizar uma varredura de absorbância da amostra de cadafração a 280 nm-4 00 nm para determinar a concentraçãoaproximada de IgG no eluído, antes de proceder para oprocesso de diálise. Aceitar as frações como parte do poolde eluídos, caso o valor de A280-A400 seja > 0,200.Rejeitar as frações como parte do pool de eluídos, caso ovalor de A280-A400 seja < 0,200.

Rotular um tubo de centrífuga cônico estéril"Anticorpo Eluído", "Pool de Eluídos", e combinar todas asfrações que foram aceitas como parte do pool.

- Realizar uma varredura de absorbância de uma amostrado pool de eluídos para determinar a concentraçãoaproximada de IgG no eluído, antes de proceder para oprocesso de diálise.

- Estimar o volume do pool de eluídos e calcular ototal aproximado em mg de IgG.

- Volume do Pool de Eluídos: _ ml x _ IgG

mg/ml = _ Total em mg de IgG

Diálise do anticorpo

- Remover o tubo de "Anticorpo Eluído" de 2°C para 10°C.

- Calcular o comprimento aproximado de tubulação dediálise que será necessário para dialisar o eluído deanticorpo usando o volume aproximado de eluído e os dadosda Tabela 4.

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>

Cortar o comprimento necessário de tubulação dedialise (Membrana de Celulose Regenerada Spectra/Por® 2,valor de corte de peso molecular de 12.000-14.000 Dáltons(MWCO), diâmetro de 16 mm, Spectrum Laboratories Inc., N°de Cat. 132678).

- Hidratar a tubulação da membrana de dialise em 1.000ml de H20 Dl por > 3 0 minutos.

- Calcular o volume aproximado de tampão de dialisenecessário para dialisar o eluído de anticorpo com o usodos dados da Tabela 5.

Tabela 5: Volume necessário de tampão de dialise

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>

- Colocar a quantidade apropriada de tampão de diáliseem um bécher plástico com dimensões adequadas. Rotular obécher "Anticorpo Dialisado". Adicionar uma barra deagitação limpa e colocar o bécher em uma placa de agitaçãodentro de um refrigerador ou em uma sala refrigerada a 2°Ca 10°C.

- Enxaguar a tubulação de diálise cuidadosamente emH20 Dl. Amarrar dois nós terminais a aproximadamente 7 cmde uma extremidade da tubulação de diálise e fixar bemapertado.

Adicionar aproximadamente 5 ml de H20 Dl natubulação de diálise.

- Preencher a tubulação de diálise com o anticorpoeluído do tubo de coleta "Anticorpo Eluido".

- Amarrar dois nós terminais a aproximadamente 7 cm daextremidade aberta restante da tubulação de diálise e fixarbem apertado. Assegurar que o espaço entre o líquido e atampa {headspa.ce) é aproximadamente aquele derivado da Tabela 4.

- Colocar a tubulação de diálise preenchida e fechadano reservatório de diálise com o volume apropriado de 1 XPBS (a partir da Tabela 5) .

- Cobrir o bécher com filme plástico limpo. Ajustar avelocidade na placa de agitação de tal forma que a amostrade diálise gire livremente, mas não seja puxada para ovórtice do dialisado. A diálise deve ocorrer a 2°C a 10°Ccom 3 trocas de tampão no total em um período de 24 horas.

Filtração do anticorpo

Rotular um tubo de coleta estéril "Anticorpo Dialisado".

- Remover a tubulação da amostra dialisada do bécherde diálise. Cortar a tubulação de diálise aberta em umaextremidade e transferir a amostra dialisada para o tubo decentrífuga de "Anticorpo Dialisado".- Rotular outro tubo de coleta estéril "AnticorpoDialisado".

Selecionar uma seringa "Luer Lok" estéril comcapacidade adequada para conter o volume dialisado final.

- Anexar um filtro de seringa Acrodisc® à abertura daseringa (Membrana de 0,2 um HT Tuffryn®, ligação de "LowProtein", Gelman Laboratories, N° de Cat. 4192). Remover oembolo da seringa e, segurando a seringa voltada para cima,transferir o anticorpo monoclonal dialisado do tubo de"Anticorpo Dialisado" para a seringa. Recolocar o embolo.

- Manter o filtro de seringa Acrodisc® sobre tubo decoleta aberto, estéril e rotulado "Anticorpo Purificado", epressionar o embolo da seringa para filtrar o anticorpopurificado no tubo de "Anticorpo Purificado".

Após o término da fil tração, tampar o tubo de"Anticorpo Purificado" e estocar a 2°C a 10°C.

- Determinar a concentração de anticorpo monoclonalpurificado usando o procedimento A280.

Exemplo 3

Método geral para mapeamento de epitopos

Abordagem geral

O mapeamento de epitopos é realizado para identificara seqüência de aminoácidos linear dentro de uma proteínaantigênica (ou seja, o epitopo) que é reconhecida por umanticorpo monoclonal específico. Uma abordagem geral paramapeamento de epitopos exige a expressão protéica decomprimento total, além de vários fragmentos (ou seja,formas truncadas) da proteína, geralmente em um sistema deexpressão heterólogo. Essas várias proteínas recombinantessão então usadas para determinar se o anticorpo monoclonalespecífico é capaz de se ligar a uma ou mais das formastruncadas da proteína-alvo. Através do uso de truncamentosrepetitivos e da geração de proteínas recombinantes comregiões superpostas de aminoácidos, é possível identificara região que é reconhecida pelo anticorpo monoclonal sobinvestigação. É empregada a análise Western blot ou ELISApara determinar se o anticorpo monoclonal específico sobinvestigação é capaz de se ligar a um ou mais dosfragmentos recombinantes da proteína. Essa abordagem pode,ao final, identificar as regiões do peptídeo que contêm oepitopo e, em alguns casos, refinar o epitopo precisamenteaté uma seqüência de 8-11 aminoácidos.

Projeto e criação da construção

A primeira etapa no mapeamento de epitopos é o projetode truncamentos gênicos aninhados. Freqüentemente, o gene édividido em quatro partes iguais para análise posterior.

Estratégia de clonagem gênica

A estratégia de clonagem geral começa com a geraçãobaseada em PCR de fragmentos gênicos clonados. A fim deexpressar eficientemente o fragmento clonado, especialmentequando são utilizadas pequenas regiões de aminoácidos, ofragmento clonado é expresso como uma proteína de fusão, ouseja, fundido a outra proteína transportadora que éexpressa estavelmente no sistema. A proteína fluorescenteverde (GFP) é freqüentemente usada como proteínatransportadora. GFP é incluída como um parceiro de fusãopara estabilizar os fragmentos de truncamento e melhorar aexpressão durante a etapa subseqüente de expressão protéicain vitro. GFP também permite o rastreamento da expressão daproteína de fusão com o uso de anticorpos anti-GFP.A clonagem para a criação da construção GFP-proteína érealizada com a utilização da abordagem mega-iniciador ouatravés do uso de clonagem de plasmideo no vetor pScreen-GFP. Geralmente, os fragmentos de truncamento são fundidosa GFP e a seqüências de controle necessárias para aexpressão protéica usando uma técnica denominada mega-iniciador.

O mega-iniciador é a união de dois ou mais fragmentosde DNA por anelamento de regiões homólogas na extremidadedos respectivos fragmentos e extensão do DNA anelado defita simples com uma DNA polimerase termoestável. Esseprocesso cria um fragmento de DNA grande a partir de doisou mais fragmentos menores, ligando-os por sua seqüênciacompartilhada. Esse fragmento grande é então amplificadousando PCR-padrão.

Caso o mega-iniciador não possa ser usado com sucesso,os fragmentos de truncamento podem ser clonados em umplasmideo que contém GFP e seqüências de controle daexpressão protéica. Essa clonagem cria as fusõesGFP/fragmento necessárias para o mapeamento de epitopos. O restante do protocolo pode então proceder como descritoabaixo.

Expressão de proteína

As construções de expressão criadas, por exemplo, pormega-iniciador, são então introduzidas em um Sistema deTradução Rápida (RTS). RTS é um sistema de expressão deproteína sem células derivado de usados de E. coli. Essesistema permite a expressão rápida (3-4 horas) de proteínasa partir de modelos de DNA.

Caso RTS não produza níveis adequados de expressãoprotéica, então os fragmentos de truncamento serão clonadosno plasmídeo proteína GFP-expressão. Esses plasmídeos defusão são então transformados em uma cepa otimizada de E.coli para expressão protéica. A expressão protéica éinduzida em uma cultura de crescimento de bactéria e, apóso crescimento, as células são lisadas. As proteínas nolisado celular complexo são então separadas poreletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), e o restantedo protocolo é igual ao apresentado abaixo.

Detecção de proteína e mapeamento de epitopos

Os fragmentos protéicos produzidos por RTS sãoseparados com o uso de PAGE, e transferidos para membranasde nitrocelulose. As proteínas ligadas à membrana são entãoexpostas ao anticorpo sob investigação em solução. Aligação anticorpo/proteína é identificada com o uso demetodologias colorimétricas conhecidas na técnica.

A ligação de anticorpo da proteína de comprimentototal e de algum subconjunto dos fragmentos truncados deproteína constitui um resultado positivo. Caso a ausênciade uma seção específica da proteína elimine a ligação deanticorpo, então o epitopo se situa nesse fragmento.

Caso o anticorpo a ser mapeado não reconheça proteínaligada às membranas de nitrocelulose, então são usadosmétodos alternativos para a detecção de interaçõesanticorpo/proteína como, por exemplo, ELISA ouimunoprecipitação. Métodos para a detecção de interaçõesanticorpo/proteína são bem conhecidos na técnica.

Refinamento da localização do epitopo

Como o protocolo descrito acima irá somente limitar alocalização do epitopo a até aproximadamente um quarto daproteína, é necessário repetir o processo na quarta parteda proteína determinada como contendo o epitopo, a fim deespecificar ainda mais a localização do epitopo. Para umaproteína muito grande, pode ser necessário repetir esseprocesso duas a três vezes para limitar o epitopo a até 8-15 aminoácidos.

Exemplo 4

Caracterização de epitopos para os anticorpos monoclonaisde MCM2 27C5.6 e 2 6H6.19

O mapeamento de epitopos para Anticorpos monoclonaisde MCM2 27C5.6 e 26H6.19 foi realizado basicamente comodescrito no Exemplo 3. Especificamente, foi usada PCR paracriar truncamentos do gene MCM2, seguido por RTS para gerarfragmentos recombinantes da proteína MCM2 e, finalmente,western blotting para detectar a ligação de anticorpo aMCM2. GFP foi unida aos truncamentos do gene MCM2 em umasegunda rodada de PCR para assegurar uma expressão robustae estável em RTS

A seqüência de codificação de comprimento total paraMCM2 (Id. de Seq. N°: 2; NM_004526) tem um tamanho de 2.715bp. No entanto, o cDNA que foi usado para expressar aproteína MCM2 recombinante e que foi usado para imunizar oscamundongos durante a produção de anticorpos de MCM2 tinhaum tamanho de gene de 2.688 bp (Id. de Seq. N° : 5). O cDNAtruncado de MCM2 usado tinha uma região de 27 bp faltandona extremidade 5' da proteína MCM2, especificamente ofragmento ATGGCGGAATCATCGGAATCCTTCACC (Id. de Seq. N° : 6).Foram realizadas as seguintes etapas seqüenciais a fim demapear o epitopo do anticorpo MCM2-27C5.6:

Como o gene MCM2 era grande (> 1.000 bp) , e paraminimizar o número de interações de PCR necessárias, o genefoi dividido igualmente em seis regiões [1-6] deaproximadamente 400 bp. Seqüências superpostas, que contêmseqüências homólogas para permitir mega-iniciador duranteum segundo ciclo de PCR e sítios de restrição para umasegunda opção de subclonagem em plasmídeo pScreen-GFP,foram adicionadas ao gene de interesse durante a primeiraPCR. A primeira rodada de PCR criou fragmentos da seqüênciade nucleotídeos truncada de MCM2 (Id. de Seq. N° : 5)incluindo: região [1] tinha 1-426 bp, região [1-2] tinha 1-888 bp, região [1-3] tinha 1-137 7 bp, região [1-4] tinha 1-1.84 5 bp, região [1-5] tinha 1-2.241 bp, região [1-6] tinha1-2.688 bp e, finalmente, a região [2-6] tinha 427 -2.688bp. Regiões individuais (por exemplo, região [5]) não foramexpressas para evitar epitopos perdidos que estavampresentes em seqüência de junção entre regiões.

Os produtos da primeira rodada de PCR de MCM2 foramsubclonados em pSCREEN-GFP (BamHI-Xhol), na medida em queos tamanhos dos fragmentos eram muito grandes para mega-iniciador. O único truncamento que não foi bem sucedido foia região de comprimento total [1-6]. Os iniciadoresoriginais usados para amplificar o gene de comprimentototal e os truncamentos foram projetados para incluirsítios de restrição (extremidade 5' BAMHI; extremidadeXHOI) para permitir a subclonagem direta em pSCREEN-GFP.

As fusões GFP-gene criadas foram usadas como modelopara a produção de proteína na reação RTS, usando o kit RTS100 E. coli HY da Roche. Os produtos protéicos de RTS foramprecipitados por acetona, carregados diretamente em um geldesnaturante de poliacrilimida e analisados por westernblotting. O western blot foi sondado diretamente com oanticorpo monoclonal 27C5.6 e anticorpos GFP.

Os produtos da primeira rodada de RTS foram sondadostanto com anticorpos GFP quanto com o anticorpo monoclonalde MCM2 27C5.6. Foi detectada uma banda positiva na região[1-3]. O processo acima foi repetido usando o fragmentoenglobado pela região [1-3] como seqüência de partida.

Uma segunda rodada de RTS produziu um resultadopositivo para o anticorpo 27C5.6 na região MCM2-3Q3(CQSAGPFEVNMEETIYQNYQRIRIQESP (Id. de Seq. N° : 7), quecorresponde aos resíduos de aminoácidos 355 a 382 do Id. deSeq. N°: 1). O processo acima foi repetido usando ofragmento englobado pela região MCM2-3Q3 como seqüência departida.

Uma terceira rodada de RTS produziu um resultadopositivo para o anticorpo 27C5.6 na região MCM2-3Q3.2(IYQNYQRIRIQESP (Id. de Seq. N° : 3), que corresponde aosresíduos de aminoácidos 369 a 382 do Id. de Seq. N° : 1) .

Não foi obtido resultado positivo na região MCM2-3Q3.1(CQSAGPFEVNMEET (Id. de Seq. N° : 8), que corresponde aosresíduos de aminoácidos 355 a 368 do Id. de Seq. N°: 1) ouem MCM2-3Q3.2 (EVNMEETIYQNYQR (Id. de Seq. N° : 9), quecorresponde aos resíduos de aminoácidos 362 a 375 do Id. deSeq. N°: 1 ).

Resultados

Os resultados iniciais mostraram que o epitopo para oanticorpo monoclonal de MCM2 27C5.6 está localizado dentroda região N-terminal da proteína MCM2. Truncamentoscontinuados da proteína MCM2 mostraram que o epitoporeconhecido por 27C5.6 está localizado dentro de uma regiãode catorze aminoácidos, que corresponde especificamente aosresíduos de aminoácidos 369-382 do Id. de Seq. N° : 1(IYQNYQRIRIQESP (Id. de Seq. N°: 3)). Rodadas adicionais deRTS podem ser capazes de refinar ainda mais a localizaçãodo epitopo.

O processo idêntico descrito acima foi usado paraidentificar o epitopo para o anticorpo monoclonal de MCM226H6.19. Os resultados iniciais indicaram que o epitopoestava localizado dentro da região do C-terminal daMCM2. 0 epitopo foi preliminarmente definido a umaregião de vinte e três aminoácidos, que correspondeespecificamente aos resíduos de aminoácidos 688-710 do Id.de Seq. N° : 1 (PSNKEEEGLANGSAAEPAMPNTY (Id. de Seq. N° :4)). Análises adicionais refinaram o epitopo do anticorpomonoclonal de MCM2 26H6.19 a uma região de dez aminoácidosque compreende os resíduos de aminoácidos 683-692 do Id. deSeq. N°: 1 (HVRHHPSNKE (Id. de Seq. N°: 14)).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Fischer, Timothy J.

Malinowski, Douglas P.Taylor, Adriann J.

<120> ANTICORPOS MONOCLONAIS E MÉTODOS PARA SEU USO NA DETECÇÃO DEDOENÇA CERVICAL

<130> 46143/310882

<150> 60/675,305<151> 2005-04-27

<150> 60/718,082<151> 2005-09-16

<160> 14

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1

<211> 904

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Glu Ser Ser Glu Ser Phe Thr Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln

1 5 10 15

Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser

20 25 30

Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro

35 40 45

Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu

50 55 60

Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu lie Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp

65 70 75 80

Tyr Arg Ala lie Pro Glu Leu Asp Ala Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala

85 90 95

Leu Asp Asp Glu Asp Vai Glu Glu Leu Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala

100 105 110

Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu

115 120 125

Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Vai Glu Arg Ala Thr Glu Asp

145 150 155 160

Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met lie Glu Ser lie Glu Asn Leu Glu Asp

165 170 175

Leu Lys Gly His Ser Vai Arg Glu Trp Vai Ser Met Ala Gly Pro Arg

180 185 190

Leu Glu lie His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Vai Asp

195 200 205

Ser His Gly His Asn Vai Phe Lys Glu Arg lie Ser Asp Met Cys Lys

210 215 220

Glu Asn Arg Glu Ser Leu Vai Vai Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg

225 230 235 240

Glu His Vai Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu

245 250 255

Gln lie Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Vai Vai Leu Ala Met Tyr Pro260

Lys Tyr Asp Arg275

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Leu lie Arg Thr305

Gln Leu Ser Met

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Asn Lys Vai Ala450

Thr Ser Leu Ser465

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Leu Ala Leu Phe500

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Gln Arg His Pro

Vai Leu Ala Asp580

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lie Ser lie Ser610

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Leu Thr Phe Ser

Phe Asp lie Leu660

Glu Met Leu Ala675

Ser Asn Lys Glu690

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Lys Lys Tyr lie

Gln Met Asp Gln740

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Glu Leu Arg Ser295

Ser Gly Vai Vai310

Vai Lys Tyr Asn325

Gln Ser Gln Asn

Ser Ala Gly Pro360

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Thr Vai lie Leu440

Vai Gly Glu Leu455

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lie Tyr Gly His485

Gly Gly Glu Pro

lie Asn Vai Leu520

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Arg Thr Ser lie600

Lys Ala Gly lie615

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Glu Asn Vai Asp645

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265

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Arg lie Gln Glu380

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Thr Asp Glu Asp460

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Glu Asp lie Lys490

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Glu Lys Vai Ser540

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Leu lie Asp Glu585

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Vai Thr Ser Leu620

lie Gly Gly Arg635

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Ala Asn Gly Ser700

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Lys Met Tyr Ser745

270

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Gly Vai Leu Pro320

Asn Phe Vai Leu335

Pro Gly Ser Cys350

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Glu Leu Thr Gly415

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Vai Lys Met lie

lie Phe Ala Ser480

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Gly Lys His Lys510

Pro Gly Thr Ala525

Ser Arg Ala lie

Thr Ala Tyr Vai560

Ala Gly Ala Leu575

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Gln Ala Arg Cys

Tyr Asp Pro Ser640

lie lie Ser Arg655

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Ala Ala Glu Pro

Gln Glu Vai Leu720

Pro Lys Leu Asn735

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Ser Met lie Arg770

Tyr Vai lie Glu785

Ser Phe lie Asp

Thr Phe Ala Arg820

Leu Phe lie Leu835

Asn Arg Phe Gly850

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Tyr Asp Ser Glu

Arg Lys Met lie900

Thr Gly Ser lie760

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Asp Asp Vai Asn790

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Tyr Leu Ser Phe

Lys Gln Leu Vai840

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Ala Arg Gln lie870

Leu Phe Arg Met885

Leu Gln Gln Phe

Pro lie Thr Vai

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Thr lie Glu Vai860

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Arg His lie Glu765

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Leu Ser Ala Phe880

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<210> 2

<211> 3453

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220><221> CDS

<222> (58) . . . (2772)<400> 2

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gaa gag gat gga gag gag etc att gga gat ggc atg gaa agg gac tac 3 00Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu lie Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr70 75 80

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gag cgg gcc atg cgg cag cgt gac cgg gag gct ggc cgg ggc ctg ggc 444Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly115 120 125

cgc atg cgc cgt ggg etc ctg tat gac age gat gag gag gac gag gag 492Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu130 135 140 145

cgc cet gcc cgc aag cgc cgc cag gtg gag cgg gcc acg gag gac ggc 540Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Vai Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly150 155 160

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ctg gtg gag gag ctg cgc tcg ctg agg cag ctg cat ctg aac cag ctg 972Leu Vai Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu290 295 300 305

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ctg gtg gac age tgc aag cca gga gac gag ata gag ctg act ggc ate 13 08Leu Vai Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu lie Glu Leu Thr Gly lie405 410 415

tat cac aac aac tat gat ggc tec etc aac act gcc aat ggc ttc cet 1356Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro420 425 430

gtc ttt gcc act gtc ate cta gcc aac cac gtg gcc aag aag gac aac 1404Vai Phe Ala Thr Vai lie Leu Ala Asn His Vai Ala Lys Lys Asp Asn435 440 445

aag gtt gct gta ggg gaa ctg acc gat gaa gat gtg aag atg ate act 1452Lys Vai Ala Vai Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Vai Lys Met lie Thr450 455 460 465

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gcc ctg ttc gga ggg gag ccc aaa aac cca ggt ggc aag cac aag gta 1596Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Vai500 505 510

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acc act ggc cag ggg gcg tcg gct gtg ggc etc acg gcg tat gtc cag 1740Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Vai Gly Leu Thr Ala Tyr Vai Gln550 555 560

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2604

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2652

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2748

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agtgccctctgtcagggctttgctttgtgcaacatcttgcgttcaggatggctgccctcttggttgaagaaagagggcacgagtcatgcgcccactctctaataaaatat

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28622922298230423102316232223282334234023453

<210> 3<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos para o epitopo de MCM2 do anticorpomonoclonal 27C5.6

<400> 3

lie Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg lie Arg lie Gln Glu Ser Pro15 10

<210> 4<211> 23<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos para o epitopo de MCM2 do anticorpomonoclonal 26H6.19 (preliminar)

<400> 4

Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu

15 10 15

Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr20<210> 5

<211> 2688

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de nucleotídeos para o gene MCM2 truncado

<221> CDS

<222> (1)...(2688)

<223> Gene MCM2 truncado desprovido de 27 bp na extremidade 5'<400> 5

atg gca tcc age ceg gcc cag cgt cgg cga ggc aat gat cet etc acc 48Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr1 5 10 15

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tat gag gcc gag gga ctg gct ctg gat gat gag gac gta gag gag ctg 288Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Vai Glu Glu Leu85 90 95

acg gcc agt cag agg gag gca gca gag cgg gcc atg cgg cag cgt gac 33 6Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp100 105 110

cgg gag gct ggc cgg ggc ctg ggc cgc atg cgc cgt ggg etc ctg tat 3 84Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr115 120 125

gac age gat gag gag gac gag gag cgc cet gcc cgc aag cgc cgc cag 432Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln130 135 140

gtg gag cgg gcc acg gag gac ggc gag gag gac gag gag atg ate gag 480Vai Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met lie Glu145 150 155 160

age ate gag aac ctg gag gat etc aaa ggc cac tet gtg cgc gag tgg 528Ser lie Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Vai Arg Glu Trp165 170 175

gtg age atg gcg ggc cec cgg ctg gag ate cac cac cgc ttc aag aacVai Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu lie His His Arg Phe Lys Asn180 185 190

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aag gac gcc att etc etc gea gat ctg gtg gac age tgc aag cca gga 1200Lys Asp Ala lie Leu Leu Ala Asp Leu Vai Asp Ser Cys Lys Pro Gly385 390 395 400

gac gag ata gag ctg act ggc ate tat cac aac aac tat gat ggc tec 1248Asp Glu lie Glu Leu Thr Gly lie Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser405 410 415

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gtg ggc etc acg gcg tat gtc cag cgg cac cet gtc age agg gag tgg 1680Vai Gly Leu Thr Ala Tyr Vai Gln Arg His Pro Vai Ser Arg Glu Trp545 550 555 560

acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt ctg gct gac cga gga gtg tgt etc 1728Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Vai Leu Ala Asp Arg Gly Vai Cys Leu565 570 575

att gat gaa ttt gac aag atg aat gac cag gac aga acc age ate cat 1776lie Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser lie His580 585 590

gag gcc atg gag caa cag age ate tec ate tcg aag gct ggc ate gtc 1824Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser lie Ser lie Ser Lys Ala Gly lie Vai595 600 605

acc tec ctg cag gct cgc tgc acg gtc att gct gcc gcc aac cec ata 1872Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Vai lie Ala Ala Ala Asn Pro lie610 615 620

gga ggg cgc tac gac cec tcg ctg act ttc tet gag aac gtg gac etc 1920Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Vai Asp Leu625 630 635 640

aca gag cec ate ate tca cgc ttt gac ate ctg tgt gtg gtg agg gac 1968Thr Glu Pro lie lie Ser Arg Phe Asp lie Leu Cys Vai Vai Arg Asp645 650 655

acc gtg gac cca gtc cag gac gag atg ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc 2016Thr Vai Asp Pro Vai Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Vai Vai Gly660 665 670

age cac gtc aga cac cac cec age aac aag gag gag gag ggg ctg gcc

2064Ser His Vai Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala675 680 685

aat ggc age gct gct gag cec gcc atg cec aac acg tat ggc gtg gag 2112Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Vai Glu690 695 700

cec ctg cec cag gag gtc ctg aag aag tac ate ate tac gcc aag gag 2160Pro Leu Pro Gln Glu Vai Leu Lys Lys Tyr lie lie Tyr Ala Lys Glu705 710 715 720

agg gtc cac ceg aag etc aac cag atg gac cag gac aag gtg gcc aag 2208Arg Vai His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Vai Ala Lys725 730 735

atg tac agt gac ctg agg aaa gaa tet atg gcg aca ggc age ate cec 2256Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser lie Pro740 745 750

att acg gtg cgg cac ate gag tec atg ate cgc atg gcg gag gcc cac 2304lie Thr Vai Arg His lie Glu Ser Met lie Arg Met Ala Glu Ala His755 760 765

gcg cgc ate cat ctg cgg gac tat gtg ate gaa gac gac gtc aac atg 2352Ala Arg lie His Leu Arg Asp Tyr Vai lie Glu Asp Asp Vai Asn Met770 775 780

gcc ate cgc gtg atg ctg gag age ttc ata gac aca cag aag ttc age 2400Ala lie Arg Vai Met Leu Glu Ser Phe lie Asp Thr Gln Lys Phe Ser785 790 795 800

gtc atg cgc age atg cgc aag act ttt gcc cgc tac ctt tca ttc cgg 2448Vai Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg805 810 815

cgt gac aac aat gag ctg ttg etc ttc ata ctg aag cag tta gtg gea 2496Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe lie Leu Lys Gln Leu Vai Ala820 825 830

gag cag gtg aca tat cag cgc aac cgc ttt ggg gcc cag cag gac act 2544Glu Gln Vai Thr Tyr Gln Arg Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr835 840 845

att gag gtc cet gag aag gac ttg gtg gat aag gct cgt cag ate aac 2592lie Glu Vai Pro Glu Lys Asp Leu Vai Asp Lys Ala Arg Gln lie Asn850 855 860

ate cac aac etc tet gea ttt tat gac agt gag etc ttc agg atg aac 2640lie His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn865 870 875 880

aag ttc age cac gac ctg aaa agg aaa atg ate ctg cag cag ttc tga 2688Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys Met lie Leu Gln Gln Phe *885 890 895

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de nucleotídeos 5' omitida da seqüência denucleotídeos truncada de MCM2

<400> 6

atggcggaat catcggaatc cttcacc 27

<210> 7<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Fragmento de MCM2 que corresponde aos resíduos de aminoácidos355 a 382 do Id. de Seq. N°: 1

<400> 7

Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Vai Asn Met Glu Glu Thr lie Tyr

15 10 15

Gln Asn Tyr Gln Arg lie Arg lie Gln Glu Ser Pro20 25

<210> 8<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Fragmento de MCM2 que corresponde aos resíduos de aminoácidos355 a 368 do Id. de Seq. N° : 1

<400> 8

Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Vai Asn Met Glu Glu Thr15 10

<210> 9<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Fragmento de MCM2 que corresponde aos resíduos de aminoácidos362 a 375 do Id. de Seq. N°: 1

<400> 9

Glu Vai Asn Met Glu Glu Thr lie Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg15 10

<210> 10<211> 2718<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeoimunogênico MCM2 rotulado com hexa-histidina<221> característica variada<222> (2698)...(2715)

<223> Seqüência de nucleotídeos que codifica o rótulo de hexa-histidina

<400> 10

atggcatcca gcccggccca gcgtcggcga ggcaatgatc ctctcacctc cagccctggc 60cgaagctccc ggcgtactga tgccctcacc tccagccctg gccgtgacct tccaccattt 120gaggatgagt ccgaggggct cctaggcaca gaggggcccc tggaggaaga agaggatgga 180gaggagctca ttggagatgg catggaaagg gactaccgcg ccatcccaga gctggacgcc 240tatgaggccg agggactggc tctggatgat gaggacgtag aggagctgac ggccagtcag 3 00agggaggcag cagagcgggc catgcggcag cgtgaccggg aggctggccg gggcctgggc 3 60cgcatgcgcc gtgggctcct gtatgacagc gatgaggagg acgaggagcg ccctgcccgc 420aagcgccgcc aggtggagcg ggccacggag gacggcgagg aggacgagga gatgattgag 480agcatcgaga acctggagga tctcaaaggc cactctgtgc gcgagtgggt gagcatggcg 54 0ggcccccggc tggagatcca ccaccgcttc aagaacttcc tgcgcactca cgtcgacagc 600cacggccaca acgtcttcaa ggagcgcatc agcgacatgt gcaaagagaa ccgtgagagc 660ctggtggtga actatgagga cttggcagcc agggagcacg tgctggccta cttcctgcct 720gaggcaccgg cggagctgct gcagatcttt gatgaggctg ccctggaggt ggtactggcc 780atgtacccca agtacgaccg catcaccaac cacatccatg tccgcatctc ccacctgcct 840ctggtggagg agctgcgctc gctgaggcag ctgcatctga accagctgat ccgcaccagt 900ggggtggtga ccagctgcac tggcgtcctg ccccagctca gcatggtcaa gtacaactgc 960aacaagtgca atttcgtcct gggtcctttc tgccagtccc agaaccagga ggtgaaacca 1020ggctcctgtc ctgagtgcca gtcggccggc ccctttgagg tcaacatgga ggagaccatc 1080tatcagaact accagcgtat ccgaatccag gagagtccag gcaaagtggc ggctggccgg 1140ctgccccgct ccaaggacgc cattctcctc gcagatctgg tggacagctg caagccagga 1200gacgagatag agctgactgg catctatcac aacaactatg atggctccct caacactgcc 1260aatggcttcc ctgtctttgc cactgtcatc ctagccaacc acgtggccaa gaaggacaac 1320aaggttgctg taggggaact gaccgatgaa gatgtgaaga tgatcactag cctctccaag 1380gatcagcaga tcggagagaa gatctttgcc agcattgctc cttccatcta tggtcatgaa 1440gacatcaaga gaggcctggc tctggccctg ttcggagggg agcccaaaaa cccaggtggc 1500aagcacaagg tacgtggtga tatcaacgtg ctcttgtgcg gagaccctgg cacagcgaag 1560tcgcagtttc tcaagtatat tgagaaagtg tccagccgag ccatcttcac cactggccag 1620ggggcgtcgg ctgtgggcct cacggcgtat gtccagcggc accctgtcag cagggagtgg 1680accttggagg ctggggccct ggttctggct gaccgaggag tgtgtctcat tgatgaattt 1740gacaagatga atgaccagga cagaaccagc atccatgagg ccatggagca acagagcatc 1800tccatctcga aggctggcat cgtcacctcc ctgcaggctc gctgcacggt cattgctgcc 1860gccaacccca taggagggcg ctacgacccc tcgctgactt tctctgagaa cgtggacctc 1920acagagccca tcatctcacg ctttgacatc ctgtgtgtgg tgagggacac cgtggaccca 1980gtccaggacg agatgctggc ccgcttcgtg gtgggcagcc acgtcagaca ccaccccagc 2040aacaaggagg aggaggggct ggccaatggc agcgctgctg agcccgccat gcccaacacg 2100tatggcgtgg agcccctgcc ccaggaggtc ctgaagaagt acatcatcta cgccaaggag 2160agggtccacc cgaagctcaa ccagatggac caggacaagg tggccaagat gtacagtgac 2220ctgaggaaag aatctatggc gacaggcagc atccccatta cggtgcggca catcgagtcc 2280atgatccgca tggcggaggc ccacgcgcgc atccatctgc gggactatgt gatcgaagac 2340gacgtcaaca tggccatccg cgtgatgctg gagagcttca tagacacaca gaagttcagc 2400gtcatgcgca gcatgcgcaa gacttttgcc cgctaccttt cattccggcg tgacaacaat 2460gagctgttgc tcttcatact gaagcagtta gtggcagagc aggtgacata tcagcgcaac 2520cgctttgggg cccagcagga cactattgag gtccctgaga aggacttggt ggataaggct 2580cgtcagatca acatccacaa cctctctgca ttttatgaca gtgagctctt caggatgaac 2640aagttcagcc acgacctgaa aaggaaaatg atcctgcagc agttcctcga gggtggtcat 2700catcatcatc atcattga 2718

<210> 11<211> 905<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeoimunogênico MCM2 rotulado com hexa-histidina<223> Rótulo de hexa-histidina

<400> 11Met Ala Ser Ser1

Ser Ser Pro Gly20

Pro Gly Arg Asp35

Gly Thr Glu Gly50

Gly Asp Gly Met65

Tyr Glu Ala Glu

Thr Ala Ser Gln100

Arg Glu Ala Gly115

Asp Ser Asp Glu130

Vai Glu Arg Ala145

Ser lie Glu Asn

Vai Ser Met Ala180

Phe Leu Arg Thr195

Arg lie Ser Asp210

Tyr Glu Asp Leu225

Glu Ala Pro Ala

Vai Vai Leu Ala260

His Vai Arg lie275

Arg Gln Leu His290

Ser Cys Thr Gly305

Asn Lys Cys Asn

Glu Vai Lys Pro340

Glu Vai Asn Met355

lie Gln Glu Ser370

Lys Asp Ala lie385

Asp Glu lie Glu

Leu Asn Thr Ala420

Asn His Vai Ala435

Asp Glu Asp Vai

Pro Ala Gln Arg5

Arg Ser Ser Arg

Leu Pro Pro Phe40

Pro Leu Glu Glu55

Glu Arg Asp Tyr70

Gly Leu Ala Leu85

Arg Glu Ala Ala

Arg Gly Leu Gly120

Glu Asp Glu Glu135

Thr Glu Asp Gly150

Leu Glu Asp Leu165

Gly Pro Arg Leu

His Vai Asp Ser200

Met Cys Lys Glu215

Ala Ala Arg Glu230

Glu Leu Leu Gln245

Met Tyr Pro Lys

Ser His Leu Pro280

Leu Asn Gln Leu295

Vai Leu Pro Gln310

Phe Vai Leu Gly325

Gly Ser Cys Pro

Glu Glu Thr lie360

Pro Gly Lys Vai375

Leu Leu Ala Asp390

Leu Thr Gly lie405

Asn Gly Phe Pro

Lys Lys Asp Asn440

Lys Met lie Thr

Arg Arg Gly Asn10

Arg Thr Asp Ala25

Glu Asp Glu Ser

Glu Glu Asp Gly60

Arg Ala lie Pro75

Asp Asp Glu Asp90

Glu Arg Ala Met105

Arg Met Arg Arg

Arg Pro Ala Arg140

Glu Glu Asp Glu155

Lys Gly His Ser170

Glu lie His His185

His Gly His Asn

Asn Arg Glu Ser220

His Vai Leu Ala235

lie Phe Asp Glu250

Tyr Asp Arg lie265

Leu Vai Glu Glu

lie Arg Thr Ser300

Leu Ser Met Vai315

Pro Phe Cys Gln330

Glu Cys Gln Ser345

Tyr Gln Asn Tyr

Ala Ala Gly Arg380

Leu Vál Asp Ser395

Tyr His Asn Asn410

Vai Phe Ala Thr425

Lys Vai Ala VaiSer Leu Ser Lys

Asp Pro Leu Thr15

Leu Thr Ser Ser30

Glu Gly Leu Leu45

Glu Glu Leu lie

Glu Leu Asp Ala80

Vai Glu Glu Leu95

Arg Gln Arg Asp110

Gly Leu Leu Tyr125

Lys Arg Arg Gln

Glu Met lie Glu160

Vai Arg Glu Trp175

Arg Phe Lys Asn190

Vai Phe Lys Glu205

Leu Vai Vai Asn

Tyr Phe Leu Pro240

Ala Ala Leu Glu255

Thr Asn His lie270

Leu Arg Ser Leu285

Gly Vai Vai Thr

Lys Tyr Asn Cys320

Ser Gln Asn Gln335

Ala Gly Pro Phe350

Gln Arg lie Arg365

Leu Pro Arg Ser

Cys Lys Pro Gly400

Tyr Asp Gly Ser415

Vai lie Leu Ala430

Gly Glu Leu Thr445

Asp Gln Gln lieGly Glu Lys lie465

Asp lie Lys Arg

Asn Pro Gly Gly500

Cys Gly Asp Pro515

Lys Vai Ser Ser530

Vai Gly Leu Thr545

Thr Leu Glu Ala

lie Asp Glu Phe580

Glu Ala Met Glu595

Thr Ser Leu Gln610

Gly Gly Arg Tyr625

Thr Glu Pro lie

Thr Vai Asp Pro660

Ser His Vai Arg675

Asn Gly Ser Ala690

Pro Leu Pro Gln705

Arg Vai His Pro

Met Tyr Ser Asp740

lie Thr Vai Arg755

Ala Arg lie His770

Ala lie Arg Vai785

Vai Met Arg Ser

Arg Asp Asn Asn820

Glu Gln Vai Thr835

lie Glu Vai Pro850

lie His Asn Leu865

Lys Phe Ser His

Glu Gly Gly His900

455

Phe Ala Ser lie470

Gly Leu Ala Leu485

Lys His Lys Vai

Gly Thr Ala Lys520

Arg Ala lie Phe535

Ala Tyr Vai Gln550

Gly Ala Leu Vai565

Asp Lys Met Asn

Gln Gln Ser lie600

Ala Arg Cys Thr615

Asp Pro Ser Leu630

lie Ser Arg Phe645

Vai Gln Asp Glu

His His Pro Ser680

Ala Glu Pro Ala695

Glu Vai Leu Lys710

Lys Leu Asn Gln725

Leu Arg Lys Glu

His lie Glu Ser760

Leu Arg Asp Tyr775

Met Leu Glu Ser790

Met Arg Lys Thr805

Glu Leu Leu Leu

Tyr Gln Arg Asn840

Glu Lys Asp Leu855

Ser Ala Phe Tyr870

Asp Leu Lys Arg885

His His His His

15/21

460

Ala Pro Ser lie475

Ala Leu Phe Gly490

Arg Gly Asp lie505

Ser Gln Phe Leu

Thr Thr Gly Gln540

Arg His Pro Vai555

Leu Ala Asp Arg570

Asp Gln Asp Arg585

Ser lie Ser Lys

Vai lie Ala Ala620

Thr Phe Ser Glu635

Asp lie Leu Cys650

Met Leu Ala Arg665

Asn Lys Glu Glu

Met Pro Asn Thr700

Lys Tyr lie lie715

Met Asp Gln Asp730

Ser Met Ala Thr745

Met lie Arg Met

Vai lie Glu Asp780

Phe lie Asp Thr795

Phe Ala Arg Tyr810

Phe lie Leu Lys825

Arg Phe Gly Ala

Vai Asp Lys Ala860

Asp Ser Glu Leu875

Lys Met lie Leu890

His905

Tyr Gly His Glu480

Gly Glu Pro Lys495

Asn Vai Leu Leu510

Lys Tyr lie Glu525

Gly Ala Ser Ala

Ser Arg Glu Trp560

Gly Vai Cys Leu575

Thr Ser lie His590

Ala Gly lie Vai605

Ala Asn Pro lie

Asn Vai Asp Leu640

Vai Vai Arg Asp655

Phe Vai Vai Gly670

Glu Gly Leu Ala685

Tyr Gly Vai Glu

Tyr Ala Lys Glu720

Lys Vai Ala Lys735

Gly Ser lie Pro750

Ala Glu Ala His765

Asp Vai Asn Met

Gln Lys Phe Ser800

Leu Ser Phe Arg815

Gln Leu Vai Ala830

Gln Gln Asp Thr845

Arg Gln lie Asn

Phe Arg Met Asn880

Gln Gln Phe Leu895

<210> 12<211> 2718<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo MCM2-FLAG<400> 12

atggcatcca gcccggccca gcgtcggcga ggcaatgatc ctctcacctc cagccctggc 60cgaagctccc ggcgtactga tgccctcacc tccagccctg gccgtgacct tccaccattt 120gaggatgagt ccgaggggct cctaggcaca gaggggcccc tggaggaaga agaggatgga 180gaggagctca ttggagatgg catggaaagg gactaccgcg ccatcccaga gctggacgcc 24 0tatgaggccg agggactggc tctggatgat gaggacgtag aggagctgac ggccagtcag 300agggaggcag cagagcgggc catgcggcag cgtgaccggg aggctggccg gggcctgggc 360cgcatgcgcc gtgggctcct gtatgacagc gatgaggagg acgaggagcg ccctgcccgc 420aagcgccgcc aggtggagcg ggccacggag gacggcgagg aggacgagga gatgattgag 480agcatcgaga acctggagga tctcaaaggc cactctgtgc gcgagtgggt gagcatggcg 540ggcccccggc tggagatcca ccaccgcttc aagaacttcc tgcgcactca cgtcgacagc 600cacggccaca acgtcttcaa ggagcgcatc agcgacatgt gcaaagagaa ccgtgagagc 660ctggtggtga actatgagga cttggcagcc agggagcacg tgctggccta cttcctgcct 720gaggcaccgg cggagctgct gcagatcttt gatgaggctg ccctggaggt ggtactggcc 780atgtacccca agtacgaccg catcaccaac cacatccatg tccgcatctc ccacctgcct 840ctggtggagg agctgcgctc gctgaggcag ctgcatctga accagctgat ccgcaccagt 900ggggtggtga ccagctgcac tggcgtcctg ccccagctca gcatggtcaa gtacaactgc 960aacaagtgca atttcgtcct gggtcctttc tgccagtccc agaaccagga ggtgaaacca 1020ggctcctgtc ctgagtgcca gtcggccggc ccctttgagg tcaacatgga ggagaccatc 1080tatcagaact accagcgtat ccgaatccag gagagtccag gcaaagtggc ggctggccgg 114 0ctgccccgct ccaaggacgc cattctcctc gcagatctgg tggacagctg caagccagga 1200gacgagatag agctgactgg catctatcac aacaactatg atggctccct caacactgcc 1260aatggcttcc ctgtctttgc cactgtcatc ctagccaacc acgtggccaa gaaggacaac 1320aaggttgctg taggggaact gaccgatgaa gatgtgaaga tgatcactag cctctccaag 1380gatcagcaga tcggagagaa gatctttgcc agcattgctc cttccatcta tggtcatgaa 1440gacatcaaga gaggcctggc tctggccctg ttcggagggg agcccaaaaa cccaggtggc 1500aagcacaagg tacgtggtga tatcaacgtg ctcttgtgcg gagaccctgg cacagcgaag 1560tcgcagtttc tcaagtatat tgagaaagtg tccagccgag ccatcttcac cactggccag 1620ggggcgtcgg ctgtgggcct cacggcgtat gtccagcggc accctgtcag cagggagtgg 1680accttggagg ctggggccct ggttctggct gaccgaggag tgtgtctcat tgatgaattt 1740gacaagatga atgaccagga cagaaccagc atccatgagg ccatggagca acagagcatc 1800tccatctcga aggctggcat cgtcacctcc ctgcaggctc gctgcacggt cattgctgcc 1860gccaacccca taggagggcg ctacgacccc tcgctgactt tctctgagaa cgtggacctc 1920acagagccca tcatctcacg ctttgacatc ctgtgtgtgg tgagggacac cgtggaccca 1980gtccaggacg agatgctggc ccgcttcgtg gtgggcagcc acgtcagaca ccaccccagc 2040aacaaggagg aggaggggct ggccaatggc agcgctgctg agcccgccat gcccaacacg 2100tatggcgtgg agcccctgcc ccaggaggtc ctgaagaagt acatcatcta cgccaaggag 2160agggtccacc cgaagctcaa ccagatggac caggacaagg tggccaagat gtacagtgac 2220ctgaggaaag aatctatggc gacaggcagc atccccatta cggtgcggca catcgagtcc 2280atgatccgca tggcggaggc ccacgcgcgc atccatctgc gggactatgt gatcgaagac 2340gacgtcaaca tggccatccg cgtgatgctg gagagcttca tagacacaca gaagttcagc 2400gtcatgcgca gcatgcgcaa gacttttgcc cgctaccttt cattccggcg tgacaacaat 2460gagctgttgc tcttcatact gaagcagtta gtggcagagc aggtgacata tcagcgcaac 2520cgctttgggg cccagcagga cactattgag gtccctgaga aggacttggt ggataaggct 2580cgtcagatca acatccacaa cctctctgca ttttatgaca gtgagctctt caggatgaac 2640aagttcagcc acgacctgaa aaggaaaatg atcctgcagc agttcctcga ggactacaaa 2700gacgacgacg acaagtag 2718

<210> 13<211> 905<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos para o polipeptídeo MCM2-FLAG<400> 13Met Ala Ser Ser1

Ser Ser Pro Gly20

Pro Gly Arg Asp35

Gly Thr Glu Gly50

Gly Asp Gly Met65

Tyr Glu Ala Glu

Thr Ala Ser Gln100

Arg Glu Ala Gly115

Asp Ser Asp Glu130

Vai Glu Arg Ala145

Ser lie Glu Asn

Vai Ser Met Ala180

Phe Leu Arg Thr195

Arg lie Ser Asp210

Tyr Glu Asp Leu225

Glu Ala Pro Ala

Vai Vai Leu Ala260

His Vai Arg lie275

Arg Gln Leu His290

Ser Cys Thr Gly305

Asn Lys Cys Asn

Glu Vai Lys Pro340

Glu Vai Asn Met355

lie Gln Glu Ser370

Lys Asp Ala lie385

Asp Glu lie Glu

Leu Asn Thr Ala420

Asn His Vai Ala435

Asp Glu Asp Vai450

Gly Glu Lys lie

Pro Ala Gln Arg5

Arg Ser Ser Arg

Leu Pro Pro Phe40

Pro Leu Glu Glu55

Glu Arg Asp Tyr70

Gly Leu Ala Leu85

Arg Glu Ala Ala

Arg Gly Leu Gly120

Glu Asp Glu Glu135

Thr Glu Asp Gly150

Leu Glu Asp Leu165

Gly Pro Arg Leu

His Vai Asp Ser200

Met Cys Lys Glu215

Ala Ala Arg Glu230

Glu Leu Leu Gln245

Met Tyr Pro Lys

Ser His Leu Pro280

Leu Asn Gln Leu295

Vai Leu Pro Gln310

Phe Vai Leu Gly325

Gly Ser Cys Pro

Glu Glu Thr lie360

Pro Gly Lys Vai375

Leu Leu Ala Asp390

Leu Thr Gly lie405

Asn Gly Phe Pro

Lys Lys Asp Asn440

Lys Met lie Thr455

Phe Ala Ser lie

Arg Arg Gly Asn10

Arg Thr Asp Ala25

Glu Asp Glu Ser

Glu Glu Asp Gly60

Arg Ala lie Pro75

Asp Asp Glu Asp90

Glu Arg Ala Met105

Arg Met Arg Arg

Arg Pro Ala Arg140

Glu Glu Asp Glu155

Lys Gly His Ser170

Glu lie His His185

His Gly His Asn

Asn Arg Glu Ser220

His Vai Leu Ala235

lie Phe Asp Glu250

Tyr Asp Arg lie265

Leu Vai Glu Glu

lie Arg Thr Ser300

Leu Ser Met Vai315

Pro Phe Cys Gln330

Glu Cys Gln Ser345

Tyr Gln Asn Tyr

Ala Ala Gly Arg380

Leu Vai Asp Ser395

Tyr His Asn Asn410

Vai Phe Ala Thr425

Lys Vai Ala Vai

Ser Leu Ser Lys460

Ala Pro Ser lie

Asp Pro Leu Thr15

Leu Thr Ser Ser30

Glu Gly Leu Leu45

Glu Glu Leu lie

Glu Leu Asp Ala80

Vai Glu Glu Leu95

Arg Gln Arg Asp110

Gly Leu Leu Tyr125

Lys Arg Arg Gln

Glu Met lie Glu160

Vai Arg Glu Trp175

Arg Phe Lys Asn190

Vai Phe Lys Glu205

Leu Vai Vai Asn

Tyr Phe Leu Pro240

Ala Ala Leu Glu255

Thr Asn His lie270

Leu Arg Ser Leu285

Gly Vai Vai Thr

Lys Tyr Asn Cys320

Ser Gln Asn Gln335

Ala Gly Pro Phe350

Gln Arg lie Arg365

Leu Pro Arg Ser

Cys Lys Pro Gly400

Tyr Asp Gly Ser415

Vai lie Leu Ala430

Gly Glu Leu Thr445

Asp Gln Gln lieTyr Gly His Glu465

Asp lie Lys Arg

Asn Pro Gly Gly500

Cys Gly Asp Pro515

Lys Vai Ser Ser530

Vai Gly Leu Thr545

Thr Leu Glu Ala

lie Asp Glu Phe580

Glu Ala Met Glu595

Thr Ser Leu Gln610

Gly Gly Arg Tyr625

Thr Glu Pro lie

Thr Vai Asp Pro660

Ser His Vai Arg675

Asn Gly Ser Ala690

Pro Leu Pro Gln705

Arg Vai His Pro

Met Tyr Ser Asp740

lie Thr Vai Arg755

Ala Arg lie His770

Ala lie Arg Vai785

Vai Met Arg Ser

Arg Asp Asn Asn820

Glu Gln Vai Thr835

lie Glu Vai Pro850

lie His Asn Leu865

Lys Phe Ser His

Glu Asp Tyr Lys900

470

Gly Leu Ala Leu485

Lys His Lys Vai

Gly Thr Ala Lys520

Arg Ala lie Phe535

Ala Tyr Vai Gln550

Gly Ala Leu Vai565

Asp Lys Met Asn

Gln Gln Ser lie600

Ala Arg Cys Thr615

Asp Pro Ser Leu630

lie Ser Arg Phe645

Vai Gln Asp Glu

His His Pro Ser680

Ala Glu Pro Ala695

Glu Vai Leu Lys710

Lys Leu Asn Gln725

Leu Arg Lys Glu

His lie Glu Ser760

Leu Arg Asp Tyr775

Met Leu Glu Ser790

Met Arg Lys Thr805

Glu Leu Leu Leu

Tyr Gln Arg Asn840

Glu Lys Asp Leu855

Ser Ala Phe Tyr870

Asp Leu Lys Arg885

Asp Asp Asp Asp

475

Ala Leu Phe Gly490

Arg Gly Asp lie505

Ser Gln Phe Leu

Thr Thr Gly Gln540

Arg His Pro Vai555

Leu Ala Asp Arg570

Asp Gln Asp Arg585

Ser lie Ser Lys

Vai lie Ala Ala620

Thr Phe Ser Glu635

Asp lie Leu Cys650

Met Leu Ala Arg665

Asn Lys Glu Glu

Met Pro Asn Thr700

Lys Tyr lie lie715

Met Asp Gln Asp730

Ser Met Ala Thr745

Met lie Arg Met

Vai lie Glu Asp780

Phe lie Asp Thr795

Phe Ala Arg Tyr810

Phe lie Leu Lys825

Arg Phe Gly Ala

Vai Asp Lys Ala860

Asp Ser Glu Leu875

Lys Met lie Leu890

Lys905

480

Gly Glu Pro Lys495

Asn Vai Leu Leu510

Lys Tyr lie Glu525

Gly Ala Ser Ala

Ser Arg Glu Trp560

Gly Vai Cys Leu575

Thr Ser lie His590

Ala Gly lie Vai605

Ala Asn Pro lie

Asn Vai Asp Leu640

Vai Vai Arg Asp655

Phe Vai Vai Gly670

Glu Gly Leu Ala685

Tyr Gly Vai Glu

Tyr Ala Lys Glu720

Lys Vai Ala Lys735

Gly Ser lie Pro750

Ala Glu Ala His765

Asp Vai Asn Met

Gln Lys Phe Ser800

Leu Ser Phe Arg815

Gln Leu Vai Ala830

Gln Gln Asp Thr845

Arg Gln lie Asn

Phe Arg Met Asn880

Gln Gln Phe Leu895

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<22 3> Seqüência de aminoácidos para o epitopo de MCM2 do anticorpomonoclonal 26H6.19 (refinado)

<400> 14

His Vai Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu1 5 10

<210> 15<211> 895<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácido para proteína MCM2 truncada codificadapela seqüência de nucleotídeo de ID. de SEQ. N° : 5

<400> 1

Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr

1 5 10 15

Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser

20 25 30

Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu

35 40 45

Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu lie

50 55 60

Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr Arg Ala lie Pro Glu Leu Asp Ala

65 70 75 80

Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Vai Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp

100 105 110

Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr

115 120 125

Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln

130 135 140

Vai Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met lie Glu

145 150 155 160

Ser lie Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Vai Arg Glu Trp

165 170 175

Vai Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu lie His His Arg Phe Lys Asn

180 185 190

Phe Leu Arg Thr His Vai Asp Ser His Gly His Asn Vai Phe Lys Glu

195 200 205

Arg lie Ser Asp Met Cys Lys Glu Asn Arg Glu Ser Leu Vai Vai Asn

210 215 220

Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His Vai Leu Ala Tyr Phe Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln lie Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu

245 250 255

Vai Vai Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr Asp Arg lie Thr Asn His lie

260 265 270

His Vai Arg lie Ser His Leu Pro Leu Vai Glu Glu Leu Arg Ser Leu

275 280 285

Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu lie Arg Thr Ser Gly Vai Vai Thr

290 295 300

Ser Cys Thr Gly Vai Leu Pro Gln Leu Ser Met Vai Lys Tyr Asn Cys

305 310 315 320

Asn Lys Cys Asn Phe Vai Leu Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn GlnGlu Vai Lys Pro340

Glu Vai Asn Met355

lie Gln Glu Ser370

Lys Asp Ala lie385

Asp Glu lie Glu

Leu Asn Thr Ala420

Asn His Vai Ala435

Asp Glu Asp Vai450

Gly Glu Lys lie465

Asp lie Lys Arg

Asn Pro Gly Gly500

Cys Gly Asp Pro515

Lys Vai Ser Ser530

Vai Gly Leu Thr545

Thr Leu Glu Ala

lie Asp Glu Phe580

Glu Ala Met Glu595

Thr Ser Leu Gln610

Gly Gly Arg Tyr625

Thr Glu Pro lie

Thr Vai Asp Pro660

Ser His Vai Arg675

Asn Gly Ser Ala690

Pro Leu Pro Gln705

Arg Vai His Pro

Met Tyr Ser Asp740

lie Thr Vai Arg755

Ala Arg lie His770

Ala lie Arg Vai785

Vai Met Arg Ser

325

Gly Ser Cys Pro

Glu Glu Thr lie360

Pro Gly Lys Vai375

Leu Leu Ala Asp390

Leu Thr Gly lie405

Asn Gly Phe Pro

Lys Lys Asp Asn440

Lys Met lie Thr455

Phe Ala Ser lie470

Gly Leu Ala Leu485

Lys His Lys Vai

Gly Thr Ala Lys520

Arg Ala lie Phe535

Ala Tyr Vai Gln550

Gly Ala Leu Vai565

Asp Lys Met Asn

Gln Gln Ser lie600

Ala Arg Cys Thr615

Asp Pro Ser Leu630

lie Ser Arg Phe645

Vai Gln Asp Glu

His His Pro Ser680

Ala Glu Pro Ala695

Glu Vai Leu Lys710

Lys Leu Asn Gln725

Leu Arg Lys Glu

His lie Glu Ser760

Leu Arg Asp Tyr775

Met Leu Glu Ser790

Met Arg Lys Thr805

20/21

330

Glu Cys Gln Ser345

Tyr Gln Asn Tyr

Ala Ala Gly Arg380

Leu Vai Asp Ser395

Tyr His Asn Asn410

Vai Phe Ala Thr425

Lys Vai Ala Vai

Ser Leu Ser Lys460

Ala Pro Ser lie475

Ala Leu Phe Gly490

Arg Gly Asp lie505

Ser Gln Phe Leu

Thr Thr Gly Gln540

Arg His Pro Vai555

Leu Ala Asp Arg570

Asp Gln Asp Arg585

Ser lie Ser Lys

Vai lie Ala Ala620

Thr Phe Ser Glu635

Asp lie Leu Cys650

Met Leu Ala Arg665

Asn Lys Glu Glu

Met Pro Asn Thr700

Lys Tyr lie lie715

Met Asp Gln Asp730

Ser Met Ala Thr745

Met lie Arg Met

Vai lie Glu Asp780

Phe lie Asp Thr795

Phe Ala Arg Tyr810 335

Ala Gly Pro Phe350

Gln Arg lie Arg365

Leu Pro Arg Ser

Cys Lys Pro Gly400

Tyr Asp Gly Ser415

Vai lie Leu Ala430

Gly Glu Leu Thr445

Asp Gln Gln lie

Tyr Gly His Glu480

Gly Glu Pro Lys495

Asn Vai Leu Leu510

Lys Tyr lie Glu525

Gly Ala Ser Ala

Ser Arg Glu Trp560

Gly Vai Cys Leu575

Thr Ser lie His590

Ala Gly lie Vai605

Ala Asn Pro lie

Asn Vai Asp Leu640

Vai Vai Arg Asp655

Phe Vai Vai Gly670

Glu Gly Leu Ala685

Tyr Gly Vai Glu

Tyr Ala Lys Glu720

Lys Vai Ala Lys735

Gly Ser lie Pro750

Ala Glu Ala His765

Asp Vai Asn Met

Gln Lys Phe Ser800

Leu Ser Phe Arg815Arg Asp Asn Asn820

Glu Gln Vai Thr835

lie Glu Vai Pro850

lie His Asn Leu865

Lys Phe Ser His

Glu Leu Leu Leu

Tyr Gln Arg Asn840

Glu Lys Asp Leu855

Ser Ala Phe Tyr870

Asp Leu Lys Arg885

Phe lie Leu Lys825

Arg Phe Gly Ala

Vai Asp Lys Ala860

Asp Ser Glu Leu875

Lys Met lie Leu890

Gln Leu Vai Ala830

Gln Gln Asp Thr845

Arg Gln lie Asn

Phe Arg Met Asn880

Gln Gln Phe895

Claims (21)

1. Anticorpo monoclonal que é capaz de se ligarespecificamente a MCM2, ou uma variante ou fragmento desse,caracterizado pelo fato do anticorpo ser selecionado dogrupo que consiste em:(a) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 27C5.6, depositada com a ATCC comodepósito de Patente No. PTA-6668;(b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 26H6.19, depositada com a ATCC comodepósito de Patente No. PTA-S667;(c) um anticorpo monoclonal que tem ascaracterísticas de ligação do anticorpo monoclonalproduzido pela linha de células de hibridoma 27C5.6 ou26H6.19;(d) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 27C5.6 ou 26H6.19;(e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende a seqüência de aminoácidos apresentada emId. de Seq. N°:3;(f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq.N° : 14(g) um anticorpo monoclonal que compete em um ensaiode ligação competitiva com o anticorpo monoclonal produzidopela linha de células de hibridoma 27C5.6 ou 26H6.19; e,(h) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação do antígeno de um anticorpo monoclonal de (a) -(g) , em que o fragmento retém a capacidade de se ligarespecificamente a MCM2 ou uma variante ou fragmento desse.

2. Linha de células de hibridoma 27C5.6caracterizada por ser depositada com a ATCC como depósitode Patente No. PTA-6668.

3. Linha de células de hibridoma 26H6.19caracterizada por ser depositada com a ATCC como depósitode Patente No. PTA-6667.

4. Linha de células de hibridoma caracterizada porser capaz de produzir um anticorpo monoclonal dareivindicação 1.

5. Kit para diagnóstico de doença cervical de altograu caracterizado por compreender pelo menos um anticorpomonoclonal conforme definido na reivindicação 1.

6. Kit, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato do anticorpo monoclonal ser oanticorpo monoclonal produzido pela linha de células dehibridoma 27C5.6, depositada com a ATCC como depósito dePatente No. PTA-6668, ou o anticorpo monoclonal produzidopela linha de células de hibridoma 26H6.19, depositada coma ATCC como depósito de Patente No. PTA-6667.

7. Kit, de acordo com a reivindicação 5caracterizado por compreender pelo menos dois anticorpos,em que um primeiro anticorpo é o anticorpo monoclonalproduzido pela linha de células de hibridoma 27C5.6,depositada com a ATCC como depósito de Patente No. PTA-6668e um segundo anticorpo é o anticorpo monoclonal produzidopela linha de células de hibridoma 26H6.19, depositada coma ATCC como depósito de Patente No. PTA-6667.

8. Kit, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por também compreender um anticorpo que seliga especificamente a Topo2A.

9. Kit, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que cada anticorpo é fornecidocomo um reagente de anticorpo separado.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que todos os anticorpos sãofornecidos como um coquetel de anticorpos.

11. Kit, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o referido kit tambémcompreende um reagente de bloqueio de peroxidase, umreagente de bloqueio de proteína, agentes químicos para adetecção de ligação de anticorpo às referidas proteínasbiomarcadoras, uma contra-coloração, um agente de coloraçãoazul e instruções para uso.

12. Kit, de acordo com a reivindicação 5caracterizado por também compreender reagentes paracoloração de Pap.

13. Kit, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que os reagentes para coloraçãode Pap compreendem EA50 e Laranja G.

14. Método para diagnóstico de doença cervical dealto grau em um paciente caracterizado por compreender:a) a obtenção de uma amostra cervical do paciente;b) o contato da amostra com pelo menos um anticorpomonoclonal da reivindicação 1 que se liga especificamente aMCM2; and,c) detecção da ligação do anticorpo a MCM2.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato do anticorpo monoclonal ser oanticorpo monoclonal produzido pela linha de células dehibridoma 27C5.6, depositada com a ATCC como depósito dePatente No. PTA-6668 ou o anticorpo monoclonal produzidopela linha de células de hibridoma 26H6.19, depositada coma ATCC como depósito de Patente No. PTA-6667.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14caracterizado por compreender o contato da amostra com pelomenos dois anticorpos monoclonais que se ligamespecificamente a MCM2, em que um primeiro anticorpo é oanticorpo monoclonal produzido pela linha de células dehibridoma 27C5.6, depositada com a ATCC como depósito dePatente No. PTA-6668 e um segundo anticorpo é o anticorpomonoclonal produzido pela linha de células de hibridoma 26H6.19, depositada com a ATCC como depósito de Patente No.PTA-6667.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de também compreender o contato daamostra com um anticorpo que se liga especificamente aTopo2A.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato dos anticorpos fazerem contato coma amostra seqüencialmente como reagentes de anticorpoindividuais ou simultaneamente como um coquetel deanticorpos.

19. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato decompreender um epitopo para ligação a um anticorpomonoclonal de MCM2, em que o polipeptídeo compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consisteem:(a) um polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácidos apresentada em Id. de Seq. N°:3 ou 14; e,(b) um polipeptídeo que tem pelo menos 90% deidentidade de seqüência a Id. de Seq. N°:3 ou 14, em que opolipeptídeo tem atividade antigênica.

20. Método para a produção de um anticorpo de MCM2caracterizado pelo fato de compreender a imunização de umanimal com um polipeptídeo conforme definido nareivindicação 19.

21. Método para a produção de um anticorpo monoclonalde MCM2 caracterizado por compreender:(a) imunização de um animal com um polipeptídeoconforme definido na reivindicação 19 sob condições paradespertar uma resposta imune;(b) isolação das células que produzem anticorpos doanimal;(c) fusão das células que produzem anticorpo comcélulas imortalizadas em cultura para formar células dehibridoma que produzem anticorpo monoclonal;(d) cultura das células de hibridoma; e,(e) isolação de anticorpos monoclonais da cultura.