BRPI0611112A2 - sistemas promotores induzidos por manitol em células hospedeiras bacterianas - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para produzir peptideos recombinantes em um hospedeiro bacteriano que utiliza um promotor induzível por manitol, arabitol, glucitol, ou gliceroi, onde a célula bacteriana hospedeira que produz o peptídeo se tornoLi incapaz de degradar ou metabolizar manitol, arabitol, ou glucitol, ou derivados ou análogos dos mesmos. A presente invenção refere-se a células bacterianas que foram geneticamente alteradas para inibir o metabolismo ou degradação de manitol, glucitol, ou arabitol, ou derivados ou análogos dos mesmos. A presente invenção utiliza manitol, arabitol, glucitol, ou glicerol para induzir a expressão de um polipeptídeo alvo de um promotor induzível, permitindo o uso de um indutor de fonte de carbono económico e estável nos processos de fermentação para a produção de peptídeos recombinantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMASPROMOTORES INDUZIDOS POR MANITOL EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS BACTERIANAS".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo de produção de peptí-deo recombinante. Em particular, a presente invenção proporciona a produ-ção aperfeiçoada de peptídeos recombinantes utilizando um promotor indu-zível por manitol, glucitol ou arabitol, onde a célula hospedeira que expressao peptídeo a partir do promotor se torna deficiente em sua capacidade demetabolizar ou degradar manitol, glucitol, ou arabitol, que é utilizado parainduzir o promotor. Ademais, a invenção proporciona células hospedeirasbacterianas aperfeiçoadas para a produção de peptídeos recombinantes,onde a célula bacteriana se tornou deficiente em sua capacidade de metabo-lizar ou degradar manitol, glucitol, ou arabitol, ou análogos ou derivados destes.
Antecedentes da Invenção
O uso de células bacterianas para produzir peptídeos recombi-nantes vem crescendo em importância comercial. Um dos objetivos para sedesenvolver um sistema de expressão bacteriana é a produção de polipeptí-deos alvo de alta qualidade de forma rápida, eficiente e abundante. Umacélula hospedeira ideal para tal sistema de expressão poderia ser capaz deutilizar de forma eficiente uma fonte de carbono para desenvolver, produzirde forma eficiente um polipeptídeo alvo, desenvolver rapidamente altas den-sidades de célula em uma reação de fermentação, expressar o polipeptídeoalvo apenas quando induzido, e permitir a indução do polipeptídeo alvo demaneira econômica e eficiente.
Uma dificuldade na criação da célula hospedeira ideal é superara produção ineficiente e de baixo nível de polipeptídeos alvo no processo defermentação. Controlar a expressão do peptídeo alvo até densidades ótimasde célula hospedeira e condições de fermentação serem atingidas permiteuma produção mais eficiente e maior de polipeptídeo. Os motivos para istosão diversas dobras, inclusive uma utilização mais eficiente de uma fonte decarbono e a redução de estresses metabólicos prolongados sobre a célulahospedeira.
Uma forma de controlar a expressão de polipeptídeos alvo du-rante o processo de fermentação inclui o uso de promotores induzíveis oureguláveis para controlar a expressão dos peptídeos. Os promotores sãoseqüências de ácido nucléico reguladoras geralmente localizadas a montan-te da seqüência de codificação de peptídeo desejada, dirigindo a transcriçãodo ácido nucléico. Os promotores são geralmente classificados como promo-tores constitutivos ou regulados. Os promotores regulados incluem: (1) pro-motores ativáveis, que estão inativos até um peptídeo ativador se ligar àsregiões reguladoras 5'; e (2) promotores repressíveis, que estão inativos en-quanto a região reguladora 5' estiver ligada por um peptídeo repressor. Al-guns genes ou óperons são regulados por mais de um mecanismo.
Um promotor induzível ou regulável pode ser um componenteessencial para a produção de altos níveis de peptídeos recombinantes demaneira eficiente, uma vez que tais promotores reguláveis permitem que asdensidades de célula atinjam níveis ótimos antes da indução de produção depeptídeo. Os atributos de um promotor ideal podem incluir: repressão firmede modo que pouco ou nenhum peptídeo alvo se forme durante a fase decrescimento; forte atividade de promotor após a adição do indutor; baixo cus-to de indução; estabilidade do indutor no meio de cultura celular de modoque o indutor precise ser adicionado apenas uma vez durante a fase de a-cúmulo de peptídeo de um processo de fermentação; fácil passagem do in-dutor do promotor através da membrana celular de modo que as concentra-ções externas do indutor estejam diretamente relacionadas com a concen-tração interna dentro da célula, e linearmente relacionadas com a produçãode peptídeo; e capacidade de serem usadas em conjunto com outros promo-tores. Tal promotor ideal permite que os peptídeos recombinantes sejam in-duzidos em altos níveis de forma eficiente e econômica.
Um promotor regulável que encontrou uso freqüente em proces-so de fermentação bacteriana para a produção de peptídeos recombinantesé o promotor lac, e seus derivados, especialmente os promotores tac e trc.Em sistemas de fermentação comerciais que utilizam um promotor tipo lac, oindutor isopropil-p-D-1-tiogalaetopiranosídeo ("IPTG") é quase universalmen-te empregado. IPTG é, entretanto, dispendioso e deve ser cuidadosamentecontrolado uma vez que este é significativamente tóxico para sistemas bioló-gicos. As preparações de IPTG padrão estão atualmente disponíveis a cercade USD $18 por grama ou cerca de USD $125 por 10 gramas. Ademais, aspreparações de IPTG padrão podem conter dioxano, uma toxina. O IPTGisento de dioxano está disponível no mercado, porém custa aproximadamen-te duas vezes o preço de IPTG padrão. Ademais, as questões ambientais ereguladoras de saúde surgem com relação à presença de IPTG na fermen-tação, ou na proteína purificada a partir da fermentação, dados os riscos detoxicidade de IPTG em seres humanos, animais, e outros organismos biológicos.
Devido às toxicidades e custos associados a IPTG, os sistemaspromotores induzíveis alternativos foram propostos para uso em processosde fermentação bacteriana para a produção de peptídeos recombinantes.
Por exemplo, os promotores induzidos por altas temperaturas tais como λΡρe λΡι_, inanição de triptofano tal como trp, l-arabinose tal como araBAD, ina-nição de fosfato tal como phoA, ácido nalidíxico tal como recA, osmolaridadetal como proU, inanição de glicose tal como cst-1, tetraciclina tal como tetA,pH tal como cadA, condições anaeróbicas tal como nar, infecção T4 tal comoT4 gene32, alquil ou halo-benzoatos tal como Pm, alquil ou halo-toluenos talcomo Pu, salicilatos tal como Psal, e oxigênio tal como VHb, foram examina-dos como alternativas para promotores induzíveis por IPTG. Vide, por exem-pio, Makrides, S.C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538; Hannig G. &Makrides, S.C. (1998) TIBTECH 16, 54-60; Stevens, R.C. (2000) Structures8, R177-R185; J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo, Genetic Engineering ofNonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Envi-ronmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp.460-74 (1999) (ASM Press, Washington,D.C.); H. Schweizer, Vectors to express foreign genes and techniques tomonitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnol-ogy, 12:439-445 (2001); e R. Slater & R. Williams, The Expression of ForeignDNA in Bactéria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Ra-pley, eds.) pp.125-54 (2000) (The Royal Society of Chemistry, Cambridge,UK). Ocorrem diversos problemas com estes tipos de promotores. Por e-xemplo: indução em alta temperatura pode ser prejudicial às células, e podenão ser prática para fermentação em ampla escala devido às limitações deequipamento; a manipulação de oxigênio pode afetar a dinâmica total dosaspectos de densidade de crescimento celular da fermentação, reduzindo ascondições ideais; o uso de toluenos ou outros tipos similares de produtosquímicos potencialmente tóxicos pode requerer purificação adicional paragarantir que estes compostos não estejam presentes no produto final; e o pHpode afetar a capacidade de o peptídeo de interesse se dobrar corretamenteou ser solubilizado no hospedeiro, tornando a purificação mais dispendiosa edifícil.
Os promotores que podem ser induzidos por fontes de carbonoeconômicas e não-tóxicas permanecem atrativos para uso em processos defermentação bacteriana. Uma vantagem potencial de tal promotor é que ohospedeiro bacteriano pode possuir mecanismos endógenos para absorverde forma eficiente o indutor. As fontes de carbono potenciais que podem serusadas como indutores incluem maltose, maltodextrina, glicose, arabinose,frutose, galactose, sacarose, glicerol, manose, acetato e lactose. Outros in-dutores de fonte de carbono potenciais incluem as formas de álcool de açú-cares de carbono, tais como manitol, glucitol e arabitol.
Manitol como Indutor Potencial
O manitol é a forma de álcool de manose, e é uma fonte de car-bono econômica para inúmeras bactérias, inclusive Pseudomônadas. O ópe-ron envolvido com a absorção e degradação de manitol em Pseudomonasfluorescens (P. fluorescens) contém sete genes, sendo que quatro destes(mtlEFGK) codificam proteínas envolvidas em absorção e transporte de ma-nitol/glucitol/arabitol, e três destes (mtIDYZ) codificam proteínas envolvidasno catabolismo de manitol, glucitol e arabitol. Vide Brunker et al. (1998)"Structure and function of the genes involved in manitol, arabitol, and glucitolutilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106," Gene 206(1 ):117-126 e Figura 1.
Brunker et al. identificou adicionalmente uma seqüência similarao consenso de promotores de E. coli sigma 70 90 bp a montante do códonde partida do primeiro gene no óperon de P. fluorescens DSM50106, mtlE.Vide, Figura 2. Um fragmento de 660 bp que contém o promotor putativo foiclonado a montante de um gene da Iuciferase através do qual foi conferida aexpressão induzível por manitol. A expressão induzida por arabitol do geneno mesmo nível, e expressão induzida por glucitol a um meio nível tão elevado.
Os benefícios de promotores induzíveis por fonte de carbono,entretanto, não descartam suas limitações. Um problema potencial associa-do à utilização de promotores induzíveis por fonte de carbono é a capacida-de da célula hospedeira metabolizar o indutor e reduzir a eficácia do indutor,ou requerer que esta seja adicionada continuamente ao meio durante a in-dução. Ademais, o indutor pode comprometer os parâmetros de utilização decarbono do processo de fermentação, e o fluxo de indutor constante poderesultar em rendimentos de produção de peptídeo menos desejados. A exi-gência de se adicionar continuamente um indutor ao meio durante a induçãopossui a desvantagem adicional de aumentar o custo do processo de fermentação.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona células bacterianas e métodospara produzir peptídeos recombinantes em um hospedeiro bacteriano queutilize promotor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol ligado de formaoperável a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo alvo, onde a célu-la hospedeira bacteriana se tornou incapaz de degradar ou metabolizar ma-nitol, glucitol ou arabitol. Devido ao fato de a célula bacteriana ser desprovi-da da capacidade de metabolizar ou degradar uma fonte de carbono sele-cíonada a partir do grupo que consiste em manitol, glucitol, arabitol e deriva-dos ou análogos destes, estas fontes de carbono podem ser utilizadas parainduzir a expressão de um polipeptídeo, onde o ácido nucléico que codifica opolipeptídeo é ligado de forma operável a um promotor induzível por manitol,glucitol, ou arabitol, sem que o indutor seja continuamente removido do meioatravés da célula hospedeira. O indutor, portanto, é capaz de proporcionarníveis de indução contínuos e estáveis durante a fermentação sem a exigên-cia de adicionar indutor adicional ao meio.
As modalidades da presente invenção incluem células bacteria-nas que foram geneticamente alteradas para inibir o metabolismo ou degra-dação de uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consisteem manitol, glucitol, arabitol e derivados ou análogos destes. As células bac-terianas podem ser transformadas em uma construção de ácido nucléico quecodifica um peptídeo recombinante de interesse ligado de forma operável aum promotor induzível selecionado a partir do grupo que consiste em promo-tores induzíveis por manitol, glucitol, ou arabitol, permitindo o uso de manitol,glucitol, ou arabitol, ou derivados ou análogos destes, como um indutor eco-nômico e estável nos processos de fermentação para a produção de peptí-deos recombinantes sem a metabolização ou degradação subseqüente doindutor no processo de fermentação.
O promotor utilizado na presente invenção é capaz de induçãopor uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste emuma fonte de carbono como açúcar, álcool, ou derivados destes. O promotorpode ser induzido pelo grupo selecionado a partir de manitol, arabitol ou glu-citol. Alternativamente, o promotor também pode ser induzido por glicerol.Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor induzível pormanitol. Em outras modalidades, o promotor pode incluir o promotor putativode um óperon manitol bacteriano endógeno, e é induzido por derivados ouanálogos de manitol destes. Em modalidades adicionais, os promotor podeincluir o promotor putativo do óperon de Pseudomonas fluorescens m-tlEFGKDYZ. Ainda em modalidades adicionais, o promotor pode incluir adi-cionalmente uma seqüência de ácido nucléico que atua como uma região deligação (MtIR) de proteína ativadora mtl. As modalidades adicionais incluemonde o promotor é a seqüência de ácido nucléico selecionada a partir dogrupo que consiste em Seq. ID. N5S 1-13. Em outras modalidades, o promo-tor manitol é capaz de ser induzido por uma fonte de carbono selecionada apartir do grupo que consiste em manitol, glucitol, arabitol, glicerol, ou deriva-dos ou análogos destes.
As modalidades da presente invenção também incluem célulasbacterianas para uso na expressão de peptídeos recombinantes de interesseproporcionadas que se tornaram incapazes de metabolizar ou degradar umafonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em manitol, glu-citol, arabitol e derivado ou análogo destes. Em algumas modalidades, a mu-tação é um resultado de manipulação genética exógena através da mutaçãode pelo menos um gene, ou a deleção de pelo menos um gene que codificauma enzima requerida para o metabolismo ou degradação da fonte de car-bono usada como um indutor. Em outras modalidades, o(s) gene(s) modifi-cado(s) ou deletado(s) que codifica(m) a(s) enzima(s) requerida(s) no meta-bolismo ou degradação de manitol, arabitol ou glucitol, ou derivado ou aná-logo destes. Em outra modalidade, o(s) gene(s) modificado(s) ou deletado(s)é(são) gene(s) requerido(s) no metabolismo de manitol, ou derivados ouanálogos deste. Em modalidades adicionais, o gene é selecionado a partirdo óperon mtl. O gene modificado ou deletado pode ser selecionado a partirdo grupo que consiste em mtlD, mtlY e mtIZ. Em uma modalidade aiternati-va, a mutação ou deleção inclui qualquer combinação de mtlD, mtlY, e mtIZ(mtIDYZ). Em modalidades adicionais, a mutação ou deleção pode incluirmtlD, mtlY, e mtIZ (mtIDYZ).
Em algumas modalidades, a célula bacteriana compreende adi-cionalmente uma construção de ácido nucléico que inclui um promotor indu-zível por manitol, arabitol ou glucitol ligado de forma operável a um peptídeode interesse. Alternativamente, uma modalidade inclui a célula bacterianaque compreende adicionalmente uma construção ou construções de ácidonucléico que incluem mais de um promotor induzível por manitol, arabitol, ouglucitol ligado de forma operável ao mesmo peptídeo ou peptídeos diferentesde interesse. Em modalidades adicionais, pelo menos um dos promotores éum promotor induzível por manitol, e a célula bacteriana que expressa opeptídeo recombinante de interesse foi geneticamente manipulada para inibira degradação ou metabolismo de manitol. Alternativamente, o promotor écapaz de indução por glicerol, bem como manitol, e a célula bacteriana queexpressa o peptídeo recombinante de interesse foi geneticamente manipula-da para inibir a degradação ou metabolismo de manitol.
Em algumas modalidades, a célula bacteriana é selecionada apartir de qualquer célula bacteriana capaz de expressar um ácido nucléicoligado de forma operável ao promotor induzível por fonte de carbono. Emoutras modalidades, a célula bacteriana é Escherichia coli. Em outra modali-dade, a célula bacteriana é selecionada a partir das Pseudomônadas e bac-térias estreitamente relacionadas. Em outras modalidades, a célula bacteria-na é uma Pseudomonas. Em outra modalidade, a célula bacteriana é Pseu-domonas fluorescens.
A presente invenção proporciona adicionalmente métodos paraproduzir peptídeos recombinantes que compreendem uma célula bacterianaque se tornou incapaz de degradar ou metabolizar manitol, glucitol, ou arabi-tol, ou derivados destes, transformando a célula em pelo menos uma cons-trução de ácido nucléico que compreende pelo menos um ácido nucléico quecodifica pelo menos um peptídeo de interesse ligado de forma operável apelo menos um promotor induzível por fonte de carbono, onde o indutor éselecionado a partir do grupo que consiste em manitol, glucitol, arabitol, gli-cerol, ou derivado ou análogo destes. Em certas modalidades, a expressãodo peptídeo de interesse é controlada de maneira linear diretamente correla-cionada com a concentração de indutor. Em algumas modalidades, pelo me-nos um promotor é um promotor induzível por manitol, onde pelo menos acélula bacteriana se tornou incapaz de metabolizar ou degradar manitol, e oindutor é manitol, arabitol, glucitol, glicerol ou derivados ou análogos destes.
Em outras modalidades, a presente invenção proporciona a ex-pressão de um ácido nucléico que codifica um peptídeo ligado de forma ope-rável a um promotor induzido por manitol, glucitol, arabitol, ou glicerol, ouanálogo destes, em combinação com outros promotores induzíveis em umacélula bacteriana que se tornou deficiente em sua capacidade de degradarou metabolizar manitol, glucitol, arabitol, ou análogos ou derivados destes.Em outras modalidades, os promotores induzíveis adicionais podem ser li-gados de forma operável em conjunto com o promotor induzível por manitol,glucitol ou arabitol, ou independente uns dos outros e ligados de forma ope-rável para separar os ácidos nucléicos que codificam peptídeos de interesse.
As modalidades adicionais da presente invenção incluem o uso de múltiplospromotores, inclusive pelo menos um promotor induzível por manitol, glucitolou arabitol, onde os promotores são independentes uns dos outros e ligadosde forma operável a ácidos nucléicos que codificam peptídeos diferentes deinteresse e induzidos de forma diferencial, tanto em momentos diferentes,como em níveis de expressão diferentes controlados através da utilização degradientes de concentração de indutor.
As modalidades da presente invenção também proporcionammétodos para produzir peptídeos recombinantes em células hospedeirasbacterianas que utilizam um promotor induzível por fonte de carbono. Asmodalidades adicionais proporcionam promotores alternativos para uso emprocessos de fermentação bacteriana de ampla escala que são induzidospor produtos químicos de fonte de carbono de baixo custo. Outras modalida-des da presente invenção proporcionam células hospedeiras bacterianasaperfeiçoadas para a expressão de proteínas recombinantes de promotoresinduzidos por uma fonte de carbono.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 ilustra uma trajetória de degradação de manitol, gluci-tol e arabitol, como descrito por Brunker et al. (1998) "Structure and functionof the genes involved in mannitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseu-domonas fluorescens DSM50106", Gene 206(1): 117-126.
A Figura 2 ilustra a estrutura do óperon de manitol (mtl) de P.fluorescens em DSM50106, que identifica sítios -10 e -35 putativos no pro-motor (negrito) e uma região de homologia invertida (setas), como descritopor Brunker et al. (1998) "Structure and function of the genes involved inmannitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescensDSM50106", Gene 206(1): 117-126. O ativador mtIR está presente em umsítio distante do óperon mtl.A Figura 3 ilustra uma comparação do óperon manitol emMB101 e outras Pseudomônadas. A figura mostra um alinhamento do ópe-ron mtlem quatro cepas diferentes de Pseudomonas, P. fluorescens MB101,P. fluorescens DSM50601, P. fluorescens PfO-1, e P. aeruginosa PA0-1. Ogene mtIR, que codifica o ativador transcricional do óperon mtl, fica direta-mente localizado a montante do óperon mtl em todos os casos exceto emMB101, onde ocorre diversos kB a montante e DSM50601, onde este ocorreem um local desconhecido no genoma.
A Figura 4 ilustra uma comparação da região genômica a mon-tante de mtIE em diversas Pseudomônadas. A região a montante do genemtIE em MB101, DSM50106, P. fluorescens PfO-1, e P. aeruginosa PA0-1 foialinhada. As regiões de homologia perfeita entre as quatro cepas são indica-das por letras minúsculas. As regiões -35 e -10, o sítio de ligação de ribos-somo (RBS) putativo e o códon de partida estão sublinhados. A caixa emlinha pontilhada mostra a seqüência mínima requerida para indução de ma-nitol.
A Figura 5 ilustra a clonagem de fragmento de promotor mtl nafrente do gene repórter CopGFP. Uma região de 299 bp a montante do genemtIE MB101 (SEQ. ID. N9 9) foi clonada por amplificação de PCR com inici-adores mtlE3 (SEQ. ID. N5 14) e mtlE4 (SEQ. ID. N5 15) (vide, Tabela 8),para fabricar pDOW1365-1, utilizando polimerase de DNA termoestável Her-culase (Stratagene) e DNA genômico de MB214 (uma cepa derivada deMB101) como um modelo.
A Figura 6 ilustra a comparação de atividade de diversos frag-mentos da região a montante de mtIE. A cepa DC283AmtIDYZ transportatanto pDOW1365-1, pDOW1377, pDOW1369, pDOW1378, comopDOW2212 (sem gene CopGFP) que foram remendadas sobre placas deágar M9 que contêm 1% de manitol com uracila suplementar. A indução daproteína fluorescente foi determinada por exposição à luz azul. As duas regi-ões de 15 bp de homologia entre as quatro cepas (vide, Figura 4) são indi-cadas por caixas hachuradas. As regiões 35 e 10 são indicadas, e os inicia-dores usados para clonar cada seqüência são observados na borda da caixaaberta que indica a região clonada a montante do gene repórter CopGFP.
A Figura 7 ilustra o efeito de manitol sobre a expressão deCopGFP a partir de Pmtl em um crescimento anterior de cepa tipo selvagemsobre meio de produção padrão. A cepa DC283 pD0W1365-1 foi cultivadaem meio de frasco agitado que contém 9,5% (v/v) de suplementação de Qli-cerol e uracila. Manitol, 1% (p/v), foi adicionado a um conjunto em 24h EFT(quadrados preenchidos) ou não adicionado (triângulos abertos). A fluores-cência após a indução foi monitorada ao longo do tempo. A fluorescência foimedida em amostras que foram normalizadas para OD6oo = 1.
A Figura 8 ilustra o efeito de manitol sobre a expressão deCopGFP a partir de Pmtl em uma cepa tipo selvagem secundária (back-ground) em meio com diversas concentrações de glicerol. A cepa DC283pD0W1365-1 foi cultivada em meio de frasco agitado que contém 2% (qua-drados), 5% (triângulos), ou 9,5% (círculos) de glicerol. As culturas foramnão-induzidas (símbolos abertos) ou induzidas (símbolos fechados) com 1%de manitol em 20h EFT. A fluorescência-após-a4ndução-foi-monitorada aolongo do tempo. A fluorescência foi medida em amostras que foram normali-zadas para OD6oo = 1.
A Figura 9 ilustra um mapa vetorial de vetor de deleçãopDOW1373-3 de mtIDYZ. O vetor pDOW1373-3 foi designado para deletaros genes de mtIDYZ por mutagênese por troca de alelos. As regiões flan-queadoras de mtlDYZ foram amplificadas utilizando DNA genômico MB214como um modelo e unidas utilizando a junção por meio de técnica de exten-são da superposição, que utiliza iniciadores man1 (SEQ. ID. N9 18) e man2(SEQ. ID. N5 19) para a região a montante e man3 (SEQ. ID. N9 20) e man4(SEQ. ID. Ns 21) para a região a jusante. Os iniciadores man2 e man3 con-têm superposições complementares. O produto unido foi clonado empDOW1261/Stf/ para formar pDOW1373-3. As colônias foram peneiradascom iniciador H3seq (SEQ. ID. Ne 22) e man4; aquelas com o produto de1170 esperado foram ordenadas em seqüência para garantir que nenhumamutação derivada de PCR fosse incorporada.
A Figura 10 ilustra o crescimento e a utilização de fonte de car-bono (manitol ou glicose) de cepa DC283AmtIDYZ. As culturas se desenvol-veram em meio M9 com 1% de fonte de carbono, e suplementadas com ura-cila (250 μς/ιηΙ) e prolina (250 μς/ηιΙ). As concentrações de glicose (círculoaberto) e manitol (triângulo aberto) e densidade óptica a 600 nm (triângulofechado para manitol, círculo fechado para glicose) após a indução forammonitoradas ao longo do tempo.
A Figura 11 ilustra o efeito de concentração de glicerol sobre aexpressão de CopGFP a partir de Pmtl na cepa defeituosa de degradaçãode manitol após a indução com 1% de manitol. A cepaDC283Amf/DVZ'pDOW1365-1 foi cultivada em meio de frasco agitado comuma concentração inicial de 2% (quadrados), 5% (triângulos), ou 9,5% (cír-culos) de glicerol com uracila suplementar. As culturas foram tanto induzidascom 1% de manitol em 22h EFT (símbolos fechados) como deixadas não-induzidas (símbolos abertos). A fluorescência após a indução foi monitoradaao longo do tempo. A fluorescência foi medida em amostras que foram nor-malizadas para OD6oo = 1
A Figura 12 ilustra a comparação de atividade de Pmtl no mu-tante de deleção de mtIDYZe tipo selvagem em diversas fontes de carbono.A atividade de Pmtl foi comparada na cepa defeituosa de degradação demanitol (D283Amí/DV2/pDOW1365-1) (símbolos fechados) e o tipo selva-gem (DC283/pDOW1365-1) (símbolos abertos) em meio de frasco agitadocom concentrações iniciais de 5% (quadrados) ou 9,5% de glicerol (triângu-los) (a), ou 10% de glicose (círculos) (b). As culturas foram induzidas com1 % de manitol em 24h EFT e a fluorescência após a indução foi monitoradaao longo do tempo. A fluorescência foi medida em amostras que foram nor-malizadas para OD6oo = 1 ·
A Figura 13 ilustra a atividade de Pmtl após a indução com di-versas concentrações de manitol. Diversas quantidades de manitol (0,0,01%, 0,1%, 0,5%, 1%) foram adicionadas como um indutor em 25h EFT aD283Amí/DVZ7pDOW1365-1 desenvolvidas com 9,5% de glicerol e uracilasuplementar (triângulos) ou D283Amf/DY27pDOW1365-1 pDOW1339 desen-volvidas com 12,5% de glicose (quadrados). A fluorescência após a induçãofoi monitorada ao longo do tempo em amostras que foram normalizadas paraOD600 = 1 ·
A Figura 14 ilustra a atividade de Pmtl em culturas desenvolvi-das com glicose após a indução com glicerol. A cepa DC283 Am-t/DYZ/pDOW1365-1 pDOW1339 foi cultivada em meio de frasco agitado quecontém 12,5% de glicose. Diversas concentrações de glicerol (O, 0,1%,0,5%, 1%, 2%, 5%, 9,5%) foram adicionadas em 12 h EFT e a fluorescênciafoi medida ao longo do tempo em amostras normalizadas (acima). O nível defluorescência em 17 h (quadrados) ou 35 h (triângulos) foi representado gra-ficamente.
A Figura 15 ilustra uma análise de citometria de fluxo que utilizaconcentrações variadas de indutor. A fluorescência das células de culturasdesenvolvidas com glicose induzidas com níveis variados de manitol (vide,Figura 13) (a) ou com glicerol (vide, Figura 14) (b) foi analisada por citome-tria de fluxo e os resultados cobertos em um histograma. O eixo geométricoχ é a fluorescência e o eixo geométrico y é a contagem celular em cada valorde fluorescência. Para comparação, a fluorescência após a indução com 2%de manitol está incluída em (b).
A Figura 16 ilustra a indução por manitol de CopGFP Pmi/ em20-L de xarope de milho (glicose) ou culturas fermentadoras de glicerol. Aanálise de densidades ópticas (A) e fluorescência (B) de cepa DC283 Am-tlDYZ/pDO\N1365-1 pDOW1339 (= DC390) desenvolvida em 20L de fermen-tadores com xarope de milho (glicose) (losangos) ou glicerol (quadrados) émostrada. As culturas foram induzidas com 1% de manitol em 20,5 h EFT ea densidade óptica a 575 nm e a fluorescência foi medida ao longo do tempoem amostras normalizadas.
A Figura 17 ilustra uma análise de citometria de fluxo da indu-ção por manitol de expressão de CopGFP a partir de Pmtl em 20L de xaropede milho (glicose) ou culturas fermentadoras de glicerol. A análise de citome-tria de fluxo de cepa DC283 Amf/DVZ/pDOWI 365-1 pDOW1339 (=DC390)desenvolvida em 20L de fermentadores com xarope de milho (glicose) (aci-ma) ou glicerol (abaixo). As culturas foram induzidas com 1% de manitol em20,5 h EFT. As amostras foram removidas para análise de citometria de flu-xo em 0 e 48 h após a indução. Ò eixo geométrico χ do histograma é fluo-rescência e o eixo geométrico y é a contagem celular em cada valor de fluo-rescência.
Descrição Detalhada
A presente invenção proporciona métodos para produzir peptí-deos recombinantes em um hospedeiro bacteriano que utilize um promotorinduzível por manitol, arabitol, glucitol, ou glicerol, onde a célula bacterianahospedeira que produz o peptídeo se tornou incapaz de degradar ou meta-bolizar manitol, arabitol, ou glucitol, ou derivados ou análogos destes. A pre-sente invenção proporciona células bacterianas que foram geneticamentealteradas para inibir o metabolismo ou degradação de manitol, glucitol, ouarabitol, ou derivados ou análogos destes. Em certas modalidades, manitol,arabitol, glucitol, ou glicerol podem ser então usados para induzir a expres-são de um polipeptídeo alvo a partir de um promotor induzível, permitindo ouso de um indutor de fonte de carbono econômico e estável nos processosde fermentação para a produção de peptídeos recombinantes. Devido aofato de a célula bacteriana ser desprovida da capacidade de metabolizar oudegradar manitol, glucitol ou arabitol, se estas fontes de carbono forem usa-das como um indutor, então o indutor não é continuamente removido domeio através da célula hospedeira, e portanto, é capaz de proporcionar ní-veis de indução contínuos e estáveis durante a fermentação sem a exigênciade adicionar indutor adicional ao meio. Em algumas modalidades, a célulabacteriana se torna incapaz de degradar ou metabolizar manitol, glucitol, ouarabitol, ou derivados ou análogos destes, e o promotor ligado de forma ope-rável a um peptídeo de interesse é capaz de indução por glicerol, bem comomanitol, glucitol, ou arabitol, ou derivados ou análogos destes.
I. Promotores Induzíveis por Manitol
Os promotores para uso na presente invenção são seqüênciasde ácido nucléico tipicamente com mais de 25 ácidos nucléicos localizados amontante da seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo de inte-resse. Os promotores geralmente contêm uma região -35, que é geralmenteuma seqüência com 5 a 6 ácidos nucléicos que começa aproximadamente35 pares de base a montante do sítio de início da transcrição de um peptí-deo de interesse. O sítio de início da transcrição do peptídeo de interesse égeralmente numerado como +1.
Na presente invenção, um promotor induzível que é utilizado écapaz de indução por uma fonte de carbono. Em algumas modalidades, opromotor é capaz de indução por uma fonte de carbono selecionada a partirdo grupo que consiste em manitol, arabitol, glucitol e glicerol, ou derivadosou análogos destes. Em outras modalidades, o promotor é um promotor in-duzível por manitol, ou derivado de manitol. Em modalidades adicionais, opromotor é um promotor putativo de um óperon de manitol bacteriano endó-geno. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor putativo, e regiõesreguladoras relacionadas, do óperon mtlEFGKDYZ de Pseudomonas fluo-rescens. Em outras modalidades da presente invenção, o promotor induzívelpor manitol é capaz de ser induzido por uma fonte de carbono que não mani-tol. Tais fontes de carbono incluem, porém sem caráter limitativo, glucitol,arabitol e glicerol. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é glicerol.
Em algumas modalidades, o promotor induzível por manitol dapresente invenção compreende a região -35 do promotor de óperon mtl nati-vo de Pseudomônada ligado a montante da região -10 do promotor nativo,através de um Iigante de 15 a 20 nucleotídeos. Em outras modalidades, oIigante possui 17 a 18 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade,a região -35 é compreendida da seqüência de ácido nucléico 5'-TTGTCA-3'.Ainda em outra modalidade, a região -10 é compreendida da seqüência deácido nucléico 5'-TGTAAT-3'. Ainda em outra modalidade, o promotor écompreendido da região -35 Si-TTTGTC-S1, ligado a uma seqüência de nu-cleotídeo de 15 a 20 nucleotídeos, que é adicionalmente ligado à região -10 5'-TGTAAT-3\
Em modalidades alternativas, o promotor induzível por manitolinclui a seqüência de nucleotídeo que compreende 5'-TTGTCACAACCCCGTTTGAAGGCTGTAAT-3' (SEQ. ID. N2 1) (Tabela 1). Em outra moda-lidade, o promotor inclui a seqüência de nucleotídeo que compreende 5'-TTGTCACCGCCG Illll GAAGGCTGTAAT-3' (SEQ. ID. Ng 2) (Tabela 1).
Ainda em outra modalidade, o promotor inclui a seqüência de nucleotídeoque compreende Si-Ttgtcagccctgcgtcagaaggctgtaat-S' (seq. ID. N9 3) (Tabela 1). Ainda em outra modalidade, o promotor inclui a se-qüência de ácido nucléico 5'-TTGTCGGTTGCGTGACGCGCCTGTGTAA-3'(SEQ. ID. N2 4) (Tabela 1).
Em algumas modalidades, o promotor induzível por manitol dapresente invenção inclui adicionalmente as seqüências de ácido nucléicoque atuam como um sítio de ligação de peptídeo ativador ou repressor. Emalgumas modalidades, as seqüências de ácido nucléico atuam como um sítiode ligação de peptídeo ativador. Em outras modalidades, o sítio ativador éuma seqüência de ácido nucléico de um sítio de ligação de proteína MtIRendógeno de Pseudomônada. Em outras modalidades, o sítio ativador éuma seqüência de ácido nucléico de um sítio de ligação de proteína de MtIRendógeno de Pseudomonas fluorescens.
Em algumas modalidades, o sítio de ligação ativador inclui a se-qüência de ácido nucléico 5'-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGAT-3' (SEQ. ID. N9 5) (Tabela 2). Em outra modalidade, osítio de ligação ativador inclui a seqüência de ácido nucléico 5'-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTCCAAGTGCTCCCAAGGAT -3' (SEQ. ID.Nq 6) (Tabela 2). Alternativamente, o sítio de ligação ativador inclui a se-qüência de ácido nucléico 5'-CCGAGTGCAAAAAAGTATCGATTCAAGTGCTAGGGATGAT-3' (SEQ. ID. N2 7) (Tabela 2). Em outra modalidade, osítio de ligação ativador inclui 5'-GGCGGTGCAAAAAAGTATCGGTCGAAGTGCAGTCGAGGCT-3' (SEQ. ID. Ne 8) (Tabela 2).
Em modalidades adicionais, o promotor induzível por manitol dapresente invenção inclui SEQ. ID. N9 9, uma região com 299 pares de basede um óperon de mtl endógeno de Pseudomônada (Tabela 3). Em outra mo-dalidade, o promotor de manitol da presente invenção inclui SEQ. ID Ns 10,uma região com 203 pares de base de um óperon de mtl endógeno dePseudomônada (Tabela 3). Ainda em outra modalidade, o promotor da pre-sente invenção inclui SEQ. ID. N911, uma região com 126 pares de base deum óperon de mf/endógeno de Pseudomônada (Tabela 3). Em outra moda-lidade, o promotor da presente invenção inclui SEQ. ID. N9 12, uma regiãocom 147 pares de base de um óperon de mf/endógeno de Pseudomônada(Tabela 3). Em modalidades adicionais, o promotor da presente invençãoinclui SEQ. ID. Ne 13, uma região com 77 pares de base de um óperon demí/endógeno de Pseudomônada (Tabela 3).
Tabela 1. Regiões de Ácidos nucléicos -35 a -10 de Promotor Induzível por
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Tabela 2: Reqiões de Ácido nucléíco Ativador de Promotor Induzível por Manitol
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Tabela 3: Reqiões de Ácido nucléico de Óperon mtl de Promotor Induzível por Manitol
<table>table see original document page 18</column></row><table>As seqüências relatadas neste pedido podem ser homólogas(possuem identidade similar). As proteínas e/ou seqüências de proteína são"homólogas" quando estas forem derivadas, natural ou artificialmente, deuma proteína ou seqüência de proteína hereditária comum. Similarmente, osácidos nucléicos e/ou seqüências de ácido nucléico são homólogos quandoestes forem derivados, natural ou artificialmente, de um ácido nucléico ouseqüência de ácido nucléico hereditária comum. Por exemplo, qualquer áci-do nucléico naturalmente ocorrente pode ser modificado por qualquer méto-do de mutagênese disponível para incluir um ou mais códons selecionado-res. Quando expresso, este ácido nucléico mutagenizado codifica um poli-peptídeo que compreende um ou mais aminoácidos não-naturais. O proces-so de mutação pode, naturalmente, alterar de forma adicional um ou maiscódons padrão, desta forma, alterando um ou mais aminoácidos padrão naproteína mutante resultante também. A homologia é geralmente deduzida apartir da similaridade de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ouproteínas (ou seqüências destes). A porcentagem precisa de similaridadeentre as seqüências que é útil para estabelecer homologias varia com o áci-do nucléico e proteína em questão, porém tão pouco quanto 25% de simila-ridade de seqüência é rotineiramente usado para estabelecer homologia.
Altos níveis de similaridade de seqüência, por exemplo, 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais também podeser usado para estabelecer homologia. Os métodos para determinar as por-centagens de similaridade de seqüência (por exemplo, BLASTP e BLASTNque utilizam parâmetros padrão) são descritos aqui e estão geralmente dis-poníveis.
Conforme observado acima, os polipeptídeos podem compreen-de uma seqüência de sinal (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína,que conduz de forma co-translacional ou pós-translacional a transferência daproteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado a um Iigante ou outraseqüência para facilitar a síntese, purificação ou identificação do polipeptí-deo (por exemplo, poli-His), ou para aumentar a ligação do polipeptídeo aum suporte sólido.Quando se compara as seqüências de polipeptídeo, duas se-qüências são consideradas "idênticas" se a seqüência de aminoácidos nasduas seqüências for a mesma quando alinhada para correspondência máxi-ma, como descrito abaixo. As comparações entre duas seqüências são tipi-camente realizadas ao comparar as seqüências através de uma janela decomparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade deseqüência. Uma "janela de comparação" como usado aqui, se refere a umsegmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 acerca de 75, 40 a cerca de 50, onde uma seqüência pode ser comparadacom uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguasapós as duas seqüências serem otimamente alinhadas.
O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode serconduzido utilizando o programa Megalign na Lasergene suite de softwarebioinformatics (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), que utiliza parâmetros pa-drão. Este programa inclui diversos esquemas de alinhamento descritos nasseguintes referências: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary changein proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical ResearchFoundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345 358; Hein J. (1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626 645 Methods in En-zymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G.and Sharp, Ρ. M. (1989) CABIOS 5:151 153; Myers, E. W. and Muller W.(1988) CABIOS 4:11 17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; San-tou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406 425; Sneath, Ρ. H. A. and Sokal,R. R. (1973) Numerical Taxonomy~the Principies and Practice of NumericalTaxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman,D, J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sei. USA 80:726 730.
Alternativamente, o alinhamento ótimo de seqüências para com-paração pode ser conduzido através do algoritmo de identidade local deSmith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, através do algoritmo dealinhamento de identidade de NeedIeman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48:443, através da pesquisa de métodos de similaridade de Pearson e Lip-man (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444, através de implementaçõescomputadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, eTFASTA em Wisconsin Geneties Software Paekage, Geneties ComputerGroup (GCG), 575 Science Dr., Madison1 Wis.), ou através de inspeção.
Um exemplo de algoritmos que podem ser adequados para de-terminar a porcentagem de identidade de seqüência e similaridade de se-qüência são algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschulet al. (1977) NucL Acids fíes. 25:3389 3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403 410, respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser usados,por exemplo, com os parâmetros descritos aqui, para determinar a porcenta-gem de identidade de seqüência para os polinucleotídeos e polipeptídeos dainvenção. O software para realizar análises de BLAST está publicamentedisponível através do National Center for Biotechnology Information. Paraseqüências de aminoácido, uma matriz de contagem pode ser usada paracalcular a contagem cumulativa. A extensão de ocorrência de palavras emcada direção é parada quando: a contagem de alinhamento cumulativa dimi-nui através da quantidade X de seu valor máximo obtido; a contagem cumu-lativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamen-tos de resíduo de contagem negativa; ou o final de cada seqüência é atingi-do. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidadee velocidade do alinhamento.
Em uma abordagem, a "porcentagem de identidade de seqüên-cia" é determinada ao comparar duas seqüências otimamente alinhadas a-través de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, onde aparte da seqüência de polipeptídeo na janela de comparação pode compre-ender adições ou deleções (isto é, intervalos) de 20 porcento ou menos, ge-ralmente 5 a 15 porcento, ou 10 a 12 porcento, como comparado com asseqüências de referência (que não compreendem adições ou deleções) paraalinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada ao de-terminar o número de posições onde o resíduo de aminoácido idêntico ocor-re em ambas as seqüências para proporcionar o número de posições com-binadas, ao dividir o número de posições combinadas pelo número total deposições na seqüência de referência (isto é, o tamanho da janela) e ao mul-tiplicar os resultados por 100 para proporcionar a porcentagem de identidadede seqüência.
II. Células Hospedeiras
A presente invenção também proporciona célula bacterianas queforam geneticamente modificadas para reduzir sua capacidade de metaboli-zar ou degradar uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo queconsiste em manitol, glucitol, arabitol, e derivado ou análogo destes, tal fontede carbono pode ser utilizada para induzir a expressão de um promotor in-duzível. A modificação genética pode ser em um gene ou genes que codifi-cam uma enzima que é operativa em uma via metabólica envolvida na me-tabolização ou degradação de uma fonte de carbono selecionada a partir dogrupo que consiste em manitol, glucitol, arabitol, e derivados ou análogosdestes utilizados para induzir a expressão do promotor induzível. De prefe-rência, a célula hospedeira possui modificações genéticas em genes quecodificam atividade enzimática relacionada com a metabolização ou degra-dação do indutor, enquanto genes relacionados com o transporte do indutorsão não-afetados, permitindo o transporte para dentro da célula sem degra-dação ou metabolização subseqüente. Em algumas modalidades, a célulabacteriana é uma célula de E. coli. Em algumas modalidades, a célula bacte-ríana é selecionada a partir de Pseudomônadas e células estreitamente rela-cionadas. Em algumas modalidades, a célula bacteriana é uma célula dePseudomonas fluorescens.
Uma célula hospedeira bacteriana selecionada para uso na pre-sente invenção pode se tornar deficiente em sua capacidade de metabolizarou degradar qualquer indutor utilizado para induzir a expressão de um peptí-deo de interesse de um promotor induzível. Por exemplo, quando manitol forselecionado como o indutor, a célula hospedeira pode se tornar deficienteem sua capacidade de expressar uma enzima requerida para metabolizarmanitol, ou qualquer enzima de substituição eficaz capaz de metabolizarmanitol. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode se tornar defi-ciente para a metabolização ou degradação do indutor ao alterar seu geno-ma de modo que a célula não possa expressar, a partir de seu genoma, umaenzima funcional envolvida na metabolização ou degradação do indutor. Es-ta alteração pode ser realizada ao alterar a seqüência de codificação genô-mica da célula do gene que codifica a enzima ou enzimas de metabolizaçãoou degradação. Em outras modalidades, a alteração de seqüência de codifi-cação será realizada ao introduzir: mutações de inserção ou deleção quealteram o quadro de leitura de seqüência de codificação; substituições oumutações de inversão que alteram um número suficiente de códons; e/oumutações de deleção que deletam um grupo suficientemente grande de có-dons contíguos, a partir daqui, capazes de produzir uma enzima não-funcional.
Tais cepas nocautes podem ser preparadas de acordo comqualquer um dos diversos métodos conhecidos na técnica como eficazes.
Por exemplo, os vetores de recombinação homóloga que contêm seqüênciasde gene marcadas homólogas 5' e 3' da seqüência de deleção de ácido nu-cléico desejada podem ser transformados na célula hospedeira. Idealmente,mediante a recombinação homóloga, um nocaute de gene enzimático mar-cado desejado pode ser produzido.
Exemplos específicos de metodologias de nocaute de gene sãobem-conhecidos na técnica. Por exemplo, a inativação de gene por inserçãode um polinucleotídeo foi anteriormente descrita. Vide, por exemplo, DL Ro-eder & A Collmer, Marker-exchange mutagenesis ofa pectate Iyase isozymegene in Erwinia chrysanthemi, J Bacteriol. 164(1):51-56 (1985). Alternativa-mente, a mutagênese e seleção de transpóson de fenótipo desejado (tal co-mo a incapacidade de metabolizar uma fonte de carbono particular) podemser usadas para isolar as cepas bacterianas onde os genes foram inativadosde forma insercional. Vide, por exemplo, K Nida & PP Cleary, Insertional in-activation of streptolysin S expression in Streptococcus pyogenes, J Bacte-riol. 155(3):1156-61 (1983). As mutações ou deleções específicas em umgene podem ser construídas utilizando cassete mutagênese, por exemplo,como descrito em JA Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient methodfor generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34(2-3):315-23(1985); por meio disto, mutações diretas ou aleatórias são feitas em umaparte selecionada de um gene, e então incorporadas na cópia cromossomaldo gene por recombinação homóloga.
Em modalidades adicionais da presente invenção, a célula bac-teriana se tornou deficiente em uma enzima necessária para metabolizar afonte de carbono usada como um indutor para expressão de peptídeo re-combinante. Em algumas modalidades, a célula bacteriana se tornou defici-ente em uma enzima necessária para metabolizar a fonte de carbono mani-tol, glucitol, arabitol, ou derivados destes. Em algumas modalidades, a célulabacteriana é construída para ser desprovida de atividade enzimática codifi-cada por um gene de um óperon manitol endógeno - mtl. Em outra modali-dade, a célula bacteriana é construída para ser desprovida de atividade en-zimática codificada pelo gene mtlD endógeno, ou homólogo deste. Em umamodalidade alternativa, a célula bacteriana é construída para ser desprovidade atividade enzimática codificada por um gene mtlY endógeno, ou homólo-go deste. Ainda em outra modalidade, a célula bacteriana é construída paraser desprovida de atividade enzimática codificada por um gene mtIZ endó-geno, ou homólogo deste. Alternativamente, a célula bacteriana pode serconstruída para ser desprovida de atividade de qualquer combinação de en-zimas codificadas pelos genes mtIDYZ, ou homólogos destes. Em modalida-des adicionais, a célula bacteriana é construída para ser desprovida de ativi-dade enzimática codificada por genes mtlD, mtlY, e mtIZendógenos.
Em uma modalidade alternativa, a célula bacteriana pode ser ummutante natural, onde o mutante é incapaz de degradar ou metabolizar umafonte de carbono usada como um indutor para expressão de peptídeo re-combinante devido a uma mutação que surge naturalmente em um geneendógeno necessário para tal degradação de fonte de carbono de metaboli-zação.
Ademais, a presente invenção proporciona adicionalmente célu-las bacterianas que compreendem uma construção de ácido nucléico queinclui uma seqüência de ácido nucléico que codifica pelo menos um peptídeode interesse ligado de forma operável a pelo menos um promotor induzívelpor fonte de carbono, onde o promotor induzível por fonte de carbono é umpromotor induzível por manitol, arabitol, ou glucitol. Em algumas modalida-des, o promotor induzível por fonte de carbono é um promotor induzível pormanitol. Em outras modalidades, o promotor induzível por manitol é capazde ser induzido por glicerol.
Alternativamente, a célula bacteriana compreende uma primeiraconstrução de ácido nucléico que inclui uma seqüência de ácido nucléicoque codifica pelo menos um peptídeo de interesse ligado de forma operávela pelo menos um promotor induzível por fonte de carbono, e uma segundaconstrução de ácido nucléico que inclui uma seqüência de ácido nucléicoque codifica pelo menos um peptídeo de interesse ligado de forma operávela pelo menos um promotor induzível. Em algumas modalidades, o promotorinduzível por fonte de carbono é um promotor induzível por manitol, glucitol,ou arabitol. Os múltiplos promotores podem ficar localizados sobre as mes-mas construções de ácido nucléico, ou sobre construções de ácido nucléicoseparadas. Durante o processo de fermentação, a expressão dos peptídeosde interesse pode ser induzida de maneira diferente, inclusive em momentosdiferentes ou em níveis de expressão diferentes. Em certas modalidades, ospromotores induzíveis (e indutores relacionados) usados em combinaçãocom os promotores induzíveis por manitol, arabitol, ou glucitol da presenteinvenção podem incluir, por exemplo, Iac (IPTG), lacUV5 (IPTG), tac (IPTG),trc (IPTG), Psyn (IPTG), trp (inanição de triptofano), araBAD (l-arabinose),Ippa (IPTG), Ipp-Iac (IPTG), phoA (inanição de fosfato), recA (ácido nalidíxi-co), proU (osmolaridade), cst-1 (inanição de glicose), tetA (tetraciclina), cadA(pH), nar (condições anaeróbicas), PL (troca térmica a 42°C), cspA (trocatérmica a 20°C), T7 (indução térmica), operador T7-lac (IPTG), operador T3-Iac (IPTG), operador T5-lac (IPTG), gene32 T4 (infecção T4), operador n-prM-lac (IPTG), Pm (alquil- ou halo-benzoatos), Pu (alquil ou halo-toluenos),Psal (salicilatos), ant (antranilato), ben (benzoato) ou promotor VHb (oxigê-nio). Vide, por exemplo, Makrides, S.C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538;Hannig G. & Makrides, S.C. (1998) TIBTECH 16, 54-60; Stevens, R.C.(2000) Structures 8, R177-R185. Vide, por exemplo, : J. Sanchez-Romero &V. De Lorenzo, Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strainsas Bioeatalysts for Industrial and Environmental Processes, in Manual of In-dustrial Mierobiology and Bioteehnology (A. Demain & J. Davies, eds.)pp.460-74 (1999) (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer, Veetors toexpress foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseu-domonads, Current Opinion in Bioteehnology, 12:439-445 (2001); and R. Sla-ter & R. Williams, The Expression of Foreign DNA in Bactéria, in MolecularBiology and Bioteehnology (J. Walker & R. Rapley1 eds.) pp. 125-54 (2000)(The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK).
As construções de ácido nucléico contidas na célula bacterianapodem ser mantidas de forma epissomal, ou ser integradas no genoma dacélula.
Organismos Bacterianos
A presente invenção proporciona células bacterianàs que sãodeficientes em uma enzima necessária para o metabolismo de uma fonte decarbono selecionada a partir do grupo que consiste em manitol, glucitol, earabitol, ou derivado ou análogo destes, tal fonte de carbono é utilizada parainduzir a expressão de um peptídeo de interesse, onde a seqüência de ácidonucléico que codifica o peptídeo de interesse é ligada de forma operável aum promotor induzido por uma fonte de carbono, a fonte de carbono selecio-nada a partir do grupo que consiste em manitol, glucitol, arabitol, e derivadoou análogo destes. A presente invenção pretende utilizar qualquer célulabacteriana capaz de expressar um peptídeo recombinante. Tais células sãobem-conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a célula hospedeirapode ser uma célula de Escherichia coli. Em outra modalidade, a célula éselecionada a partir de uma Pseudomônada ou célula estreitamente relacio-nada. Em outras modalidades, a célula bacteriana é Pseudomonas fluores-cens. Em outras modalidades, a célula bacteriana pode ser deficiente emuma enzima necessária para o metabolismo de uma fonte de carbono sele-cionada a partir do grupo que consiste em manitol, glucitol, ou arabitol, ouderivados e análogos destes.
Pseudomônadas e bactérias estreitamente relacionadas, comousado aqui, é coextensiva ao grupo definido aqui como "Subgrupo de Prote-obactérias Gram(-) 1". "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" é mais es-pecificamente definido como o grupo de Proteobactérias que pertence àsfamílias e/ou gêneros descritos como incluídos naquela "Parte" taxonômicachamada "Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci" por R.E. Buchanan andN.E. Gibbons (eds.), Bergey1S Manual of Determinative Bacteriology, pp.217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, USA)(daqui por diante "Bergey (1974)"). A Tabela 4 apresenta as famílias e gêne-ros de organismos listados nesta "Parte" taxonômica.
Tabela 4. Famílias e Gêneros Listados na Parte1 "Cocos e Bastonetes Gram-Negativos Aeróbicos" (em Berqev (1974))
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O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" contém todas asProteobactérias classificadas abaixo, bem como todas as Proteobactériasque poderiam ser classificadas de acordo com os critérios usados para for-mar aquela "Parte" taxonômica. Como um resultado, o "Subgrupo de Prote-obactéria Gram(-) 1" exclui, por exemplo: todas as bactérias Gram-positivas;aquelas bactérias Gram-negativas, tais como Enterobacteriaceae, que estãoincluídas em outras das 19 "Partes" desta taxonomia de Bergey (1974); to-das as "Halobacteriaceae da Família V" desta "Parte" de Bergey (1974), talfamília foi reconhecida como uma família não-bacteriana de Archaea; e ogênero, Thermus, listado dentro desta "Parte" de Bergey (1974), tal gênerofoi reconhecido como um gênero de bactérias não-Proteobacterianas.
O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" inclui adicionalmen-te aquelas Proteobactérias que pertencem (e espécies anteriormente cha-madas de) aos gêneros e famílias definidas nesta "Parte" de Bergey (1974),e que lhe foi dado outros nomes taxonômicos Proteobacterianos. Em algunscasos, estas renomeações resultaram na criação de gêneros Proteobacteri-anos totalmente novos. Por exemplo, os gêneros Acidovorax, Brevundimo-nas, Burkholderia, Hydrogenophaga, Oceanimonas, fíalstonia, e Stenotro-phomonas, foram criados ao reagrupar os organismos que pertencem (e es-pécies anteriormente chamadas de) aos gêneros Pseudomonas como defi-nido em Bergey (1974). Também, por exemplo, o gênero Sphingomonas (e ogênero Blastomonas, derivado deste) foi criado ao reagrupar os organismosque pertencem (e espécies anteriormente chamadas de) ao gênero Xantho-monas como definido em Bergey (1974). Similarmente, por exemplo, o gêne-ro Acidomonas foi criado ao reagrupar os organismos que pertencem (e es-pécies anteriormente chamadas de) ao gênero Acetobacter como definidoem Bergey (1974). Tais espécies subseqüentemente reatribuídas tambémestão incluídas no "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" como definidoaqui.
Em outros casos, as espécies Proteobacterianas que estão in-cluídas nos gêneros e famílias definidos nesta "Parte" de Bergey (1974) fo-ram simplesmente reclassificadas sob outros gêneros existentes de Proteo-bactérias. Por exemplo, no caso do gênero Pseudomonas, Pseudomonasenalia (ATCC 14393), Pseudomonas nigrífaciens (ATCC 19375), e Pseudo-monas putrefaciens (ATCC 8071) foram reclassificados respectivamentecomo Alteromonas halopianktis, Aiteromonas nigrífaciens, e Alteromonasputrefaciens. Similarmente, por exemplo, Pseudomonas acidovorans (ATCC15668) e Pseudomonas testosteroni (ATCC 11996) foram reclassificadoscomo Comamonas acidovorans e Comamonas testosteroni, respectivamen-te; e Pseudomonas nigrifaciens (ATCC 19375) e Pseudomonas piscicida(ATCC 15057) foram reclassificados respectivamente como Pseudoaltero-monas nigrifaciens e Pseudoalteromonas piscicida. Tais espécies Proteo-bacterianas subseqüentemente reatribuídas também estão incluídas dentrodo "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" como definido aqui.
O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" também inclui espé-cies Proteobacterianas que foram descobertas, ou que foram reclassificadascomo pertencentes, dentro das famílias e/ou gêneros Proteobacterianos des-ta "Parte" de Bergey (1974). Com relação às famílias Proteobacterianas, o"Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1" também inclui Proteobactériasclassificadas como pertencente a qualquer uma das famílias: Pseudomona-daceae, Azotobacteraceae (agora geralmente chamadas pelo sinônimo, o"grupo Azotobacter" de Pseudomonadaceae), Rhizobiaceae, e Methylomo-nadaceae (agora geralmente chamada pelo sinônimo, "Methylococcaceae").Conseqüentemente, além daqueles gêneros descritos aqui, os gêneros Pro-teobacterianos adicionais que estão incluídos em "Subgrupo de Proteobacté-rias Gram(-) 1" incluem: 1) bactérias do grupo Azotobacter do gênero Azo-rhizophilus; 2) bactérias da família Pseudomonadaceae do gênero Cellvibrio,Oligellal e Teredinibacter, 3) bactérias da família Rhizobiaceae do gêneroChelatobacter, Ensifer, Liberibacter (também chamadas de "Candidatus Li-beribacter"), e Sinorhizobium; e 4) bactérias da família Methylococcaceae dogênero Methylobacter, Methylocaldum, Methylomicrobium, Methylosarcina, eMethylosphaera.
As modalidades da presente invenção incluem a célula hospe-deira que é selecionada do "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1", comodefinido acima.
Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada do"Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 2". O "Subgrupo de ProteobactériasGram(-)2" é definido como o grupo de Proteobactérias do seguinte gênero(com os números totais de catálogos listados, publicamente disponíveis lis-tadas em catálogo deste indicados entre parênteses, todos depositados emATCC, salvo indicação em contrário): Acidomonas (2); Acetobacter (93);Gluconobacter {37); Brevundimonas (23); Beijerinekia (13); Derxia (2); Bru-eella (4); Agrobaeterium (79); Chelatobaeter (2); Ensifer (3); Rhizobium(144); Sinorhizobium (24); Blastomonas (1); Sphingomonas (27); Alealigenes(88); Bordetella (43); Burkholderia (73); Ralstonia (33); Acidovorax (20); Hy-drogenophaga (9); Zoogloea (9); Methylobaeter (2); Methyloealdum (1 emNCIMB); Methyloeoeeus (2); Methylomicrobium (2); Methylomonas (9); Meth-ylosarcina (1); Methylosphaera-, Azomonas (9); Azorhizophilus (5); Azotobae-ter (64); Cellvibrio (3); Oligella (5); Pseudomonas (1139); Franeisella (4);Xanthomonas (229); Stenotrophomonas (50); e Oeeanimonas (4).
As espécies de célula hospedeira exemplificativas do "Subgrupode Proteobactérias Gram(-) 2" incluem, porém sem caráter limitativo, as se-guintes bactérias (com ATCC ou outros números de depósito de cepa(s) e-xemplificativa(s) destas entre parênteses): Aeidomonas methanoliea (ATCC43581); Aeetobaeter aeeti (ATCC 15973); Glueonobaeter oxydans (ATCC19357); Brevundimonas diminuta (ATCC 11568); Beijerinekia indica (ATCC9039 e ATCC 19361); Derxia gummosa (ATCC 15994); Brueella melitensis(ATCC 23456), Brueella abortus (ATCC 23448); Agrobaeterium tumefaeiens(ATCC 23308), Agrobaeterium radiobaeter (ATCC 19358), Agrobaeteriumrhizogenes (ATCC 11325); Chelatobaeter heintzii {ATCC 29600); Ensifera-dhaerens (ATCC 33212); Rhizobium Ieguminosarum (ATCC 10004); Sinorhi-zobium fredii (ATCC 35423); Blastomonas natatoria (ATCC 35951); Sphin-gomonas paueimobilis (ATCC 29837); Alealigenes faeealis (ATCC 8750);Bordetella pertussis (ATCC 9797); Burkholderia eepaeia (ATCC 25416);Ralstonia piekettii (ATCC 27511); Aeidovorax faeilis (ATCC 11228); Hydro-genophaga fiava (ATCC 33667); Zoogloea ramigera (ATCC 19544); Meth-ylobaeter Iuteus (ATCC 49878); Methyloealdum graeile (NCIMB 11912); Me-thyloeoeeus eapsulatus (ATCC 19069); Methylomierobium agite (ATCC35068); Methylomonas methanica (ATCC 35067); Methylosareina fibrata(ATCC 700909); Methylosphaera hansonii (ACAM 549); Azomonas agilis(ATCC 7494); Azorhizophilus paspali (ATCC 23833); Azotobacter chroococ-cum (ATCC 9043); Cellvibrio mixtus (UQM 2601); Oligella urethralis (ATCC17960); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Pseudomonas fIuores-cens (ATCC 35858); Francisella tularensis (ATCC 6223); Stenotrophomonasmaltophilia (ATCC 13637); Xanthomonas campestris (ATCC 33913); andOceanimonas doudoroffii (ATCC 27123).
Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada a partirdo "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 3". O "Subgrupo de Proteobacté-rias Gram(-) 3" é definido como o grupo de Proteobactérias dos seguintesgêneros: Brevundimonas; Agrobacterium; fíhizobium; Sinorhizobium; Blas-tomonas; Sphingomonas; Alcaligenes; Burkholderia; fíalstonia; Acidovorax;Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Methylo-microbium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; A-zorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibac-ter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.
Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada a partirdo "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 4". O "Subgrupo de Proteobacté-rias Gram(-) 4" é definido como o grupo de Proteobactérias dos seguintesgêneros: Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Fíals-tonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Meth-ylococcus; Methylomiçrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylospha-era; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomo-nas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas·, e Ocea-nimonas.
Em uma modalidade, a célula hospedeira é selecionada a partirdo "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-)5". O "Subgrupo de Proteobacté-rias Gram(-) 5" é definido como o grupo de Proteobactérias dos seguintesgêneros: Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Methylomiçrobium;Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus;Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella;Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Oceanimonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 6". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 6" é defi-nido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Brevundimo-nas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hy-drogenophaga; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella;Pseudomonas; Teredinibacter; Stenotrophomonas; Xanthomonas·, e Ocea-nimonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 7". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) Proteo-bacteria 7" é definido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêne-ros: Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomo-nas; Teredinibacter; Stenotrophomonas; Xanthomonas-, e Oceanimonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 8". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 8" é defi-nido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Brevundimo-nas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hy-drogenophaga; Pseudomonas; Stenotrophomonas; Xanthomonas; e Ocea-nimonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 9". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-)9" é defini-do como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Brevundimo-nas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Pseudomonas;Stenotrophomonas; e Oceanimonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-)10". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 10" é de-finido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Burkholderia;Ralstonia; Pseudomonas; Stenotrophomonas·, e Xanthomonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 11". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 11" édefinido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Pseudo-monas; Stenotrophomonas·, e Xanthomonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 12". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 12" édefinido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Burkhol-deria; Ralstonia; Pseudomonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 13". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 13" édefinido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Burkhol-deria; Ralstonia; Pseudomonas; e Xanthomonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 14". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 14" édefinido como o grupo de Proteobactérias dos seguintes gêneros: Pseudo-monas e Xanthomonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 15". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 15" édefinido como o grupo de Proteobactérias do gênero Pseudomonas.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 16". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 16" édefinido como o grupo de Proteobactérias das seguintes espécies de Pseu-domonas (com ATCC ou outros números de depósito de cepa(s) exemplifi-cativa(s) mostrados entre parênteses): Pseudomonas abietaniphila (ATCC700689); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145); Pseudomonas alcalige-nes (ATCC 14909); Pseudomonas anguilliseptica (ATCC 33660); Pseudo-monas citronellolis (ATCC 13674); Pseudomonas Havescens (ATCC 51555);
Pseudomonas mendocina (ATCC 25411); Pseudomonas nitroreducens(ATCC 33634); Pseudomonas oleovorans (ATCC 8062); Pseudomonaspseudoalcaligenes (ATCC 17440); Pseudomonas resinovorans (ATCC14235); Pseudomonas straminea (ATCC 33636); Pseudomonas agarici(ATCC 25941); Pseudomonas alcaliphila; Pseudomonas alginovora; Pseu-domonas andersonii; Pseudomonas asplenii (ATCC 23835); Pseudomonasazelaica (ATCC 27162); Pseudomonas beijerinckii (ATCC 19372); Pseudo-monas borealis; Pseudomonas boreopolis (ATCC 33662); Pseudomonasbrassicacearum; Pseudomonas butanovora (ATCC 43655); Pseudomonascellulosa (ATCC 55703); Pseudomonas aurantiaca (ATCC 33663); Pseudo-monas chiororaphis (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461);Pseudomonas fragi (ATCC 4973); Pseudomonas Iundensis (ATCC 49968);Pseudomonas taetrolens (ATCC 4683); Pseudomonas cissicola (ATCC33616); Pseudomonas coronafaciens; Pseudomonas diterpeniphila; Pseu-domonas elongata (ATCC 10144); Pseudomonas flectens (ATCC 12775);
Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrel-la; Pseudomonas corrugata (ATCC 29736); Pseudomonas extremorientalis;Pseudomonas fIuorescens (ATCC 35858); Pseudomonas gessardii; Pseu-domonas libanensis; Pseudomonas mandelii (ATCC 700871); Pseudomonasmarginalis (ATCC 10844); Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucido-lens (ATCC 4685); Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseu-domonas synxantha (ATCC 9890); Pseudomonas tolaasii (ATCC 33618);Pseudomonas veronii (ATCC 700474); Pseudomonas frederiksbergensis;Pseudomonas geniculata (ATCC 19374); Pseudomonas gingeri; Pseudomo-nas graminis; Pseudomonas grimontii; Pseudomonas halodenitrificans;Pseudomonas halophila; Pseudomonas hibiscicola (ATCC 19867); Pseudo-monas huttiensis (ATCC 14670); Pseudomonas hydrogenovora; Pseudomo-nas jessenii (ATCC 700870); Pseudomonas kilonensis; Pseudomonas Ian-ceolata (ATCC 14669); Pseudomonas lini; Pseudomonas marginata (ATCC25417); Pseudomonas mephitica (ATCC 33665); Pseudomonas denitrificans(ATCC 19244); Pseudomonas pertucinogena (ATCC 190); Pseudomonaspictorum (ATCC 23328); Pseudomonas psychrophila; Pseudomonas fulva(ATCC 31418); Pseudomonas monteilii (ATCC 700476); Pseudomonas mos-selii; Pseudomonas oryzihabitans (ATCC 43272); Pseudomonas plecoglossi-cida (ATCC 700383); Pseudomonas putida (ATCC 12633); Pseudomonasreactans; Pseudomonas spinosa (ATCC 14606); Pseudomonas balearica;Pseudomonas Iuteola (ATCC 43273); Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588);Pseudomonas amygdali (ATCC 33614); Pseudomonas avellanae (ATCC700331); Pseudomonas caricapapayae (ATCC 33615,); Pseudomonas cicho-rii (ATCC 10857); Pseudomonas ficuserectae (ATCC 35104); Pseudomonasfuscovaginae·, Pseudomonas meliae (ATCC 33050); Pseudomonas syringae(ATCC 19310); Pseudomonas viridiflava (ATCC 13223); Pseudomonasthermocarboxydovorans (ATCC 35961); Pseudomonas thermotolerans;Pseudomonas thivervalensis; Pseudomonas vancouverensis (ATCC700688); Pseudomonas wisconsinensis; e Pseudomonas xiamenensis.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 17". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 17" édefinido como o grupo de Proteobactérias conhecido na técnica como o"Pseudomonas fluorescentes" que inclui aqueles que pertencem, por exem-plo, às seguintes espécies de Pseudomonas: Pseudomonas azotoformans;Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata;Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonasgessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonasmarginalis; Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens; Pseudomo-nas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha; Pseudo-monas tolaasii] e Pseudomonas veronii.
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 18". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 18" édefinido como o grupo de todas as subespécies, variedades, cepas, e outrasunidades subespeciais das espécies de Pseudomonas fluorescens, que in-cluem aqueles que pertencem, por exemplo, aos seguintes (com ATCC ououtros números de depósito de cepa(s) exemplificativa(s) mostrados entreparênteses): Pseudomonas fluorescens biotipo A, também chamada de bio-var 1 ou biovar I (ATCC 13525); Pseudomonas fluorescens biotipo B, tam-bém chamada de biovar 2 ou biovar Il (ATCC 17816); Pseudomonas fluores-cens biotipo C, também chamada de biovar 3 ou biovar Ill (ATCC 17400);Pseudomonas fluorescens biotipo F, também chamada de biovar 4 ou biovarIV (ATCC 12983); Pseudomonas fluorescens biotipo G, também chamada debiovar 5 ou biovar V (ATCC 17518); Pseudomonas fluorescens biovar VI;Pseudomonas fluorescens Pf0-1; Pseudomonas fluorescens Pf-5 (ATCCBAA-477); Pseudomonas fluorescens SBW25; e Pseudomonas fluorescenssubsp. cellulosa (NCIMB 10462).
A célula hospedeira pode ser selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 19". O "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 19" édefinido como o grupo de todas as cepas de Pseudomonas fluorescens bio-tipo A. Uma cepa deste biotipo é a cepa P fluorescens MB101 (vide, PatenteU.S. Nq 5.169.760 de Wilcox), e derivados desta.
Em algumas modalidades, a célula hospedeira é qualquer umadas Proteobactérias da ordem Pseudomonadales. Em outras modalidades, acélula hospedeira é qualquer uma das Proteobactérias da família Pseudo-monadaceae.
Em modalidades adicionais, a célula hospedeira é selecionadado "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 1". Em algumas modalidades, acélula hospedeira é selecionada do "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-)2". Em outras modalidades, a célula hospedeira é selecionada do "Subgrupode Proteobactérias Gram(-) 3". Em modalidades adicionais, a célula hospe-deira é selecionada do "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 5". Em algu-mas modalidades, a célula hospedeira é selecionada do "Subgrupo de Pro-teobactérias Gram(-) 7". Ainda, em outras modalidades, a célula hospedeiraé selecionada do "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 12", do "Subgrupode Proteobactérias Gram(-) 15", do "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-)17", do "Subgrupo de Proteobactérias Gram(-) 18", e/ou do "Subgrupo deProteobactérias Gram(-) 19".
As cepas P. fluorescens adicionais que podem ser usadas napresente invenção incluem Pseudomonas fluorescens Migula e Pseudomo-nas fluorescens Loitokitok, que possuem as seguintes designações deATCC: [NCIB 8286]; cepa NRRL B-1244; NCIB 8865 C01; cepa NCIB 8866C02; 1291 [ATCC 17458; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1864; pirroli-dina; PW2 [ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899]; 13475; NCTC 10038;NRRL B-1603 [6; IFO 15840]; 52-1C; CCEB 488-A [BU 140]; CCEB 553 [IEM15/47]; IAM 1008 [AHH-27]; IAM 1055 [AHH-23]; 1 [IFO 15842]; 12 [ATCC25323; NIH 11; den Dooren de Jong 216]; 18 [IFO 15833; WRRL P-7]; 93[TR-10]; 108 [52-22; IFO 15832]; 143 [IFO 15836; PL]; 149 [2-40-40; IFO15838]; 182 [IFO 3081; PJ 73]; 184 [IFO 15830]; 185 [W2 L-I]; 186 [IFO15829; PJ 79]; 187 [NCPPB 263]; 188 [NCPPB 316]; 189 [PJ227; 1208]; 191[IFO 15834; PJ 236; 22/1]; 194 [Klinge R-60; PJ 253]; 196 [PJ 288]; 197 [PJ290]; 198 [PJ 302]; 201 [PJ 368]; 202 [PJ 372]; 203 [PJ 376]; 204 [IFO15835; PJ 682]; 205 [PJ 686]; 206 [PJ 692]; 207 [PJ 693]; 208 [PJ 722]; 212[PJ 832]; 215 [PJ 849]; 216 [PJ 885]; 267 [Β-9]; 271 [Β-1612]; 401 [C71A;IFO 15831; PJ 187]; NRRL Β-3178 [4; IFO 15841]; KY 8521; 3081; 30-21;[IFO 3081.]; Ν; PYR; PW; D946-B83 [BU 2183; FERM-P 3328]; Ρ-2563[FERM-P 2894; IFO 13658]; ΙΑΜ-1126 [43F]; Μ-1; Α506 [Α5-06]; Α505 [Α5-05-1]; Α526 [Α5-26]; Β69; 72; NRRL Β-4290; PMW6 [NCIB 11615]; SC12936; Α1 [IFO 15839]; F 1847 [CDC-EB]; F 1848 [CDC 93]; NCIB 10586;Ρ17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02; 6519Ε01; Ν1; SC15208; BNL-WVC; NCTC 2583 [NCIB 8194]; Η13; 1013 [ATCC 11251; CCEB 295]; IFO3903; 1062; OU Pf-5.
III. Construções de Ácido Nucléico
As construções de ácido nucléico são proporcionadas para usona presente invenção, que compreende ácidos nucléicos que codificam pep-tídeos de interesse ligados de forma operável aos promotores induzíveis porfonte de carbono. Em algumas modalidades, pelo menos um promotor indu-zível por fonte de carbono está contido sobre uma construção de ácido nu-cléico e ligado de forma operável a um ácido nucléico que codifica pelo me-nos um peptídeo de interesse. Em outras modalidades, o promotor induzívelpor fonte de carbono é manitol, glucitol, arabitol, ou derivado destes. O pep-tídeo de interesse pode ser um monômero. Em uma modalidade alternativa,o promotor induzível por fonte de carbono é ligado de forma operável a umaseqüência de ácido nucléico que codifica mais de um monômero. Em outrasmodalidades, mais de um promotor induzível por manitol, glucitol, ou arabitolestá contido sobre uma construção de ácido nucléico, onde os promotoressão covalentemente ligados em conjunto, e ligados de forma operável a umácido nucléico que codifica um peptídeo de interesse. Em outras modalida-des, mais de um promotor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol estácontido sobre uma construção de ácido nucléico, onde cada promotor ficaligado de forma separada e operável a um ácido nucléico que codifica umpeptídeo de interesse. Em algumas modalidades, os peptídeos de interessepodem ser os mesmos peptídeos ou peptídeos diferentes.
Em outra modalidade, a construção de ácido nucléico pode con-ter um promotor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol e outro promotorque não é induzido por manitol, glucitol, arabitol, ou um derivado destes. Opromotor induzível por manitol pode ser covalentemente ligado em conjunto,ou ligado de forma separada e operável a um ácido nucléico separado quecodifica um peptídeo de interesse. Por exemplo, um promotor pode ser umpromotor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol e o outro promotor podeser Iac (IPTG), lacUV5 (IPTG), tac (IPTG), trc (IPTG), Psyn (IPTG)p trp (inani-ção de triptofano), araBAD (l-arabinose), Ippa (IPTG), Ipp-Iac (IPTG), phoA(inanição de fosfato), recA (ácido nalidíxico), proU (osmolaridade), cst-1 (i-nanição de glicose), tetA (tretracilina), cadA (pH), nar (condições anaeróbi-cas), PL (troca térmica a 42°C), cspA (troca térmica a 20°C), T7 (induçãotérmica), operador T7-lac (IPTG), operador T3-lac (IPTG), operador T5-lac(IPTG), gene32 T4 (infecção T4), operador nprM-lac (IPTG), Pm (alquil ouhalobenzoatos), Pu (alquil ou halotoluenos), Psal (salicilatos), ant (antranila-to), ben (benzoato) ou promotor VHb (oxigênio). Vide, por exemplo, Makri-des, S.C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538; Hannig G. & Makrides, S.C.(1998) TIBTECH 16, 54-60; Stevens, R.C. (2000) Structures 8, R177-R185.Vide, por exemplo: J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo, Genetic Engineer-ing of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial andEnvironmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotech-nology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp.460-74 (1999) (ASM Press, Wash-ington, D.C.); H. Schweizer, Vectors to éxpress foreign genes and tech-niques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion inBiotechnology, 12:439-445 (2001); e R. Slater & R. Williams, The Expressionof Foreign DNA in Bactéria, in Molecular Biology and Biotechnology (J.Walker & R. Rapley, eds.) pp. 125-54 (2000) (The Royal Society of Chemis-try, Cambridge, UK).
Outros Elementos
Outros elementos reguladores podem ser incluídos na constru-ção de expressão de ácido nucléico. Tais elementos incluem, porém semcaráter limitativo, por exemplo, seqüências intensificadoras transcricionais,seqüências intensificadoras translacionais, outros promotores, ativadores,sinais translacionais de início e parada, terminadores de transcrição, regula-dores cistrônicos, reguladores policistrônicos, seqüências de marcação, taiscomo "marcadores" de seqüência de nucleotídeo e seqüências de codifica-ção de peptídeo "marcadoras", que facilitam a identificação, separação, puri-ficação, ou isolamento de um polipeptídeo expresso, que inclui His-tag, Flag-tag, T7-tag, S-tag, HSV-tag, B-tag, Strep-tag, poliarginina, policisteína, poli-fenilalanina, ácido poliaspártico, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, tioredoxina, beta-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase, ciclomaltodextrina glucono-transferase, CTP:CMP-3-desoxi-D-manno-octulosonato citidiltransferase,trpE ou trpLE, avidina, estreptavidina, gene T7 10, T4 gp55, peptídeo A esta-filocócico, peptídeo G estreptocócico, GST, DHFR, CBP, MBP, domínio deligação à galactose, o domínio de ligação à Calmodulina, GFP, KSI1 c-myc,ompT, ompA, pelB, , NusA, ubiquitina, e hemosilina A.
Um gene codificador de peptídeo de acordo com a presente in-venção pode incluir, além da seqüência de codificação de peptídeo, os se-guintes elementos reguladores ligados de forma operável a este: um promo-tor, um sítio de ligação de ribossomo (RBS), um terminador de transcrição,sinais translacionais de início e parada. Os RBSs úteis podem ser obtidos apartir de qualquer espécie útil como células hospedeiras em sistemas deexpressão de acordo com a presente invenção, de preferência a partir dacélula hospedeira selecionada. Uma variedade de RBSs de consenso e mui-to específicos é conhecida, por exemplo, aqueles descritos e referidos por D.Frishman et al., Starts of bacterial genes: estimating the reliability of compu-ter predictions, Gene 234(2):257-65 (8 Jul 1999); e B.E. Suzek et al., A pro-babilistic method for identifying start codons in bacterial genomes, Bioinfor-matics 17(12): 1123-30 (Dec 2001). Ademais, RBSs tanto nativos como sinté-ticos podem ser usados, por exemplo, aqueles descritos em: EP 0207459(synthetic RBSs); O. Ikehata et al., Primary structure of nitrile hydratase de-duced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its ex-pression in Eseheriehia eoli, Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989) (nativeRBS sequence of AAGGAAG). Exemplos adicionais de métodos, vetores, eelementos de tradução e transcrição, e outros elementos úteis na presenteinvenção estão descritos, por exemplo: na Patente N9 U.S. 5.055.294 de Gil-roy e Patente Ne U.S. 5.128.130 de Gilroy et al.; Patente N9 U.S. 5.281.532de Rammler et al.; Patente N9S U.S. 4.695.455 e 4.861.595 de Barnes et al.;Patente N9 U.S. 4.755.465 de Gray et al.; e Patente N9 U.S. 5.169.760 deWilcox.
Vetores
Geralmente, a construção de ácido nucléico estará contida sobreum vetor de expressão, e irá incluir origens de réplica e marcadores selecio-náveis que permitem a transformação da célula hospedeira bacteriana. Opeptídeo recombinante de interesse é arranjado na fase apropriada com se-qüências de iniciação e término de tradução, e em certas modalidades, umaseqüência líder capaz de dirigir a secreção do polipeptídeo traduzido podeser incluída na construção de ácido nucléico. Opcionalmente, e de acordocom a presente invenção; a seqüência de peptídeo recombinante pode codi-ficar um polipeptídeo de fusão que inclui um peptídeo de identificação N-terminal que confere características desejadas, por exemplo, estabilizaçãoou purificação simplificada de produto recombinante expresso. Em certasmodalidades, o vetor pode ser mantido em uma forma epissomal (de formaextra-cromossomal), ou ser inserido no genoma da célula bacteriana hospe-deira.
Os vetores de expressão úteis para uso com bactérias para ex-pressar peptídeos recombinantes são construídos ao inserir uma seqüênciade DNA estrutural que codifica um peptídeo alvo desejado juntamente comos sinais de iniciação e término de tradução adequados em fase de leituraoperável com o promotor induzível por fonte de carbono. O vetor irá compre-ender um ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem deréplica para garantir a manutenção do vetor e para, se desejado, proporcio-nar amplificação dentro do hospedeiro. Alternativamente, o vetor pode pro-porcionar adicionalmente seqüências que permitem a integração no genomada célula hospedeira. Os hospedeiros adequados para transformação deacordo com a presente descrição incluem qualquer célula bacteriana capazde expressar um peptídeo recombinante conduzido por um promotor induzi-vel por fonte de carbono. Em algumas modalidades, as bactérias podem in-cluir diversas espécies dentro dos gêneros Escherichia e Pseudomonas.
Os vetores são conhecidos na técnica como úteis para expres-sar peptídeos recombinantes em células hospedeiras, e qualquer um destespode ser modificado e usado para expressar peptídeos recombinantes deinteresse de acordo com a presente invenção. Tais vetores incluem, por e-xemplo, plasmídeos, cosmídeos, e vetores e expressão de fago. Exemplosde vetores de plasmídeo úteis que podem ser modificados para uso na pre-sente invenção incluem, porém sem caráter Iimitativo1 os plasmídeos de ex-pressão pBBRIMCS, pDSK519, pKT240, pML122, pPS10, RK2, RK6,pR01600, e RSF1010. Exemplos adicionais podem incluir pALTER-Ex1,pALTER-Ex2, pBAD/His, pBAD/Myc-His, pBAD/glII, pCal-n, pCal-n-EK, pCal-c, pCal-Kc, pcDNA 2.1, pDUAL, pET-3a-c, pET 9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c,pET-14b, pET15b, pET-16b, pET-17b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+),pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET31b(+), pET-32a-c(+),pET-33b(+), pET-34b(+), pET35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+),pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-42a-c(+), pET-43a-c(+), pET-Blue-1, pETBIue-2, pETBIue-3, pGEMEX-1, pGEMEX-2, pGEXUT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-3X, pGEX-4T, pGEX-5X, pGEX-6P, pHAT10/11/12,pHAT20, pHAT-GFPuv, pKK223-3, pLEX, pMAL-c2X, pMAL-c2E, pMAL-c2g,pMAL-p2X, pMAL-p2E, pMAL-p2G, pProEX HT, pPROLar.A, pPROTet.E,pQE-9, pQE-16, pQE-30/31/32, pQE-40, pQE-50, pQE-70, pQE-80/81/82L,pQE-100, pRSET, and pSE280, pSE380, pSE420, pThioHis, pTrc99A, pTr-cHis, pTrcHis2, pTriEx-1, pTriEx-2, pTrxFus. Outros exemplos de tais veto-res úteis incluem aqueles descritos por, por exemplo: N. Hayase, in Appl.Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (Sep 1994); A.A. Lushnikov et al., in BasicLife Sei. 30:657-62 (1985); S. Graupner & W. Wackernagel, in Biomolec.Eng. 17(1 ):11-16. (Oct 2000); H.P. Schweizer, in Curr. Opin. Biotech.12(5):439-45 (Oct 2001); M. Bagdasarian & K.N. Timmis, in Curr. Topics Mi-crobiol. Immunol. 96:47-67 (1982); T. Ishii et al., in FEMS Microbiol. Lett.116(3):307-13 (Mar 1, 1994); I.N. Olekhnovich & Y.K. Fomichev, in Gene140(1):63-65 (Mar 11, 1994); Μ. Tsuda & Τ. Nakazawa1 in Gene 136(1-2):257-62 (Dec 22, 1993); C. Nieto et al., in Gene 87(1 ):145-49 (Mar 1,1990); J.D. Jones & N. Gutterson, in Gene 61(3):299-306 (1987); M. Bag-dasarian et al., in Gene 16(1-3):237-47 (Dec 1981); H.P. Schweizer et al., inGenet. Eng. (NY) 23:69-81 (2001); P. Mukhopadhyay et al., in J. Bact.172(1):477-80 (Jan 1990); D.O. Wood et al., in J. Bact. 145(3): 1448-51 (Mar1981); e R. Holtwick et al., in Microbiology 147(Pt 2):337-44 (Feb2001).
Exemplos adicionais de vetores de expressão que podem serúteis em células hospedeiras bacterianas incluem aqueles listados na Tabelacomo derivado dos replicons indicados:
Tabela 5. Alguns Exemplos de Vetores de Expressão Úteis
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O plasmídeo de expressão, RSF1010, é descrito, por exemplo,por F. Heffron et al., in Proc. Nat1I Acad. Sei. USA 72(9):3623-27 (Sep 1975),e por K. Nagahari & K. Sakaguchi, em J. Bact. 133(3): 1527-29 (Mar 1978). Oplasmídeo RSF1010 e derivados deste podem ser usados como vetores napresente invenção. Os derivados úteis exemplificativos de RSF1010, quesão conhecidos na técnica, incluem, por exemplo, pKT212, pKT214, pKT231e plasmídeos relacionados, e pMYC1050 e plasmídeos relacionados (vide,por exemplo, Patente NQs U.S. 5.527.883 e 5.840.554 de Thompson et al.),tal como, por exemplo, pMYC1803. O plasmídeo pMYC1803 é derivado doplasmídeo pTJS260 baseado em RSF1010 (vide, Patente NQ U.S. 5.169.760de Wilcox), que transporta um marcador de resistência à tetraciclina regula-do e os locais de réplica e mobilização do plasmídeo RSF1010. Outros veto-res úteis exemplificativos incluem aqueles descritos na Patente N9 U.S.4.680.264 de Puhleret al.
Em modalidades adicionais, um plasmídeo de expressão é usa-do como o vetor de expressão. Em outra modalidade, RSF1010 ou um deri-vado deste é usado como o vetor de expressão. Ainda em outra modalidade,pMYC1050 ou um derivado deste, ou pMYC1803 ou um derivado deste, éusado como o vetor de expressão.
VI. Expressão de Polipeptídeos Recombinantes em uma Célula HospedeiraBacteriana
As modalidades da presente invenção incluem processos paraexpressar peptídeos recombinantes para uso na produção de peptídeo. Emgeral, o processo proporciona expressão de uma construção de ácido nu-cléico que compreende ácidos nucléicos que codificam pelo menos um poli-peptídeo recombinante ligado de forma operável a pelo menos um promotorinduzível por manitol, arabitol, ou glucitol, onde a construção de ácido nu-cléico é expressa em uma célula hospedeira que se tornou deficiente em suacapacidade de metabolizar ou degradar manitol, glucitol, ou arabitol, ou deri-vados ou análogos destes. Em algumas modalidades, o promotor induzívelpode ser um promotor induzível por manitol, ou derivado destes. Em outrasmodalidades, a célula hospedeira se torna deficiente para a metabolizaçãoou degradação de manitol, que é usado como um indutor em indução depromotor. Em uma modalidade, a célula hospedeira é Escherichia coli. Emoutra modalidade, a célula hospedeira pode ser uma Pseudomônada ou cé-lula bacteriana estreitamente relacionada. Em modalidades adicionais, a cé-lula hospedeira pode ser uma célula Pseudomonas fluorescens. Em algumasmodalidades, a célula hospedeira é deficiente para a metabolização ou de-gradação de manitol, arabitol, ou glucitol, ou análogos ou derivados destes,e expressa um ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo re-combinante ligado de forma operável a pelo menos um promotor induzívelpor manitol, arabitol, glucitol, ou glicerol.O método geralmente inclui:
a) proporcionar uma célula hospedeira, de preferência, uma Ecoli ou Pseudomonas fluorescens, como descrito na presente invenção,
b) transfectar a célula hospedeira com pelo menos um ácido nu-cléico que expressa o vetor que compreende pelo menos um polipeptídeorecombinante de interesse ligado de forma operável a pelo menos um pro-motor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol, e desenvolver uma célulahospedeira em um meio de crescimento suficiente; e
c) adicionar um manitol, glucitol, ou arabitol, ou análogos ou de-rivados destes ao meio de crescimento em uma quantidade capaz de induzira expressão do peptídeo de interesse, onde a célula hospedeira se tornaincapaz de degradar ou metabolizar o manitol, glucitol, ou arabitol, ou análo-gos ou derivados destes adicionados; e
d) expressar o polipeptídeo recombinante alvo de interesse.
O método pode compreender adicionalmente e) transfectar acélula hospedeira com pelo menos uma construção de expressão dè ácidonucléico que compreende um promotor induzível adicional ligado de formaoperável a pelo menos um peptídeo de interesse. Ademais, o método podecompreender adicionalmente f) isolar pelo menos um peptídeo recombinan-te. O método também pode incluir g) purificar pelo menos um peptídeo re-combinante.
Alternativamente, o método pode compreender na etapa c) adi-cionar glicerol, ou um derivado ou análogo deste, ao meio de crescimentoem uma quantidade capaz de induzir o peptídeo de interesse, onde a célulahospedeira se torna incapaz de degradar ou metabolizar manitol, glucitol, ouarabitol, ou análogos ou derivados destes.
Em algumas modalidades, o promotor induzível é um promotorinduzível por manitol. Em outras modalidades, o promotor induzível por ma-nitol, glucitol, ou arabitol também é capaz de indução por glicerol.
Quando o método compreender adicionalmente e) transfectar acélula hospedeira com pelo menos uma construção de expressão de ácidonucléico que compreende um promotor induzível adicional ligado de formaoperável a pelo menos um peptídeo de interesse, o peptídeo de interessepode ser o mesmo ou um peptídeo diferente de interesse daquele codificadopelo ácido nucléico ligado de forma operável ao promotor induzível por mani-tol, arabitol, ou glucitol. Outros promotores induzíveis podem ser, por exem-pio, um promotor da família Iac ou tac, que inclui Plac, Ptac, Ptrc, Ptacll, Pla-cUV5, Ippa1 lpp-PlacUV5, Ipp-lac, nprM-lac, T7lac, T5lac, T3lac, e Pmac, trp(inanição de triptofano), araBAD (l-arabinose), phoA (inanição de fosfato),recA (ácido nalidíxico), proU (osmolaridade), cst-1 (inanição de glicose), tetA(tretracilina), cadA (pH), nar (condições anaeróbicas), PL (troca térmica a 49C), cspA (troca térmica a 20°C), T7 (troca térmica), gene32 T4 (infecção T4),Pm (alquil ou halo-benzoatos), Pu (alquil ou halo-toluenos), Psal (salicilatos),ant (antranilato), ben (benzoato) ou promotor VHb (oxigênio).
Em algumas modalidades, a presente invenção pode empregarmais de um promotor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol na produçãode um peptídeo, ou mais de um peptídeo, de interesse. Em outras modalida-des, os múltiplos promotores podem possuir seqüências diferentes, com ca-da promotor capaz de indução através da mesma fonte de carbono em umataxa diferente baseada na seqüência específica utilizada. Por exemplo, umaseqüência de promotor induzível por manitol pode ser capaz de expressarum peptídeo de interesse em uma expressão maior do que um promotor in-duzível por manitol com uma seqüência de ácido nucléico diferente baseadanas características ou inerentes ou modificações diferentes. Alternativamen-te, os elementos intensificadores podem estar contidos, além da seqüênciade promotor, dentro da região de promotor que afeta a taxa de expressãodas seqüências de promotor de forma diferente baseada no espaçamento ouligação dos respectivos promotores aos elementos intensificadores, se asseqüências de promotor forem iguais ou diferentes.
Em modalidades da presente invenção, o promotor induzível pormanitol, glucitol, ou arabitol é usado de forma concomitante em uma célulahospedeira bacteriana com um promotor da família Iac ou tac que inclui, porexemplo, Plac, Ptac, Ptrc, Ptacll, PlacUV5, Ipp-lac, nprM-lac, T7lac, T5lac,T3lac, e Pmac.Em algumas modalidades, o sistema de expressão é capaz deexpressar o polipeptídeo alvo em uma produtividade total de polipeptídeo depelo menos 0,1 g/L a pelo menos 80 g/L. Em outras modalidades, o polipep-tídeo recombinante é expresso em um nível de pelo menos 0,3 g/L, 0,4 g/L,0,7 g/L, 1,0 g/L, 1,5 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4g/L, 5g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 60g/L, 70 g/L, ou pelo menos 80 g/L.
Em uma modalidade, pelo menos um peptídeo recombinantepode ser expresso em uma célula bacteriana que é incapaz de degradar oumetabolizar manitol, arabitol, ou glucitol, onde a expressão do polipeptídeorecombinante é induzida utilizando manitol, arabitol, glucitol, ou glicerol, ouderivados ou análogos destes. Alternativamente, mais de um peptídeo re-combinante pode ser expresso em uma célula da presente invenção, ondeos ácidos nucléicos que codificam os peptídeos recombinantes podem estarcontidos sobre o mesmo vetor, ou alternativamente, sobre múltiplos vetores,e ligado de forma operável a mais de um promotor, que inclui pelo menosum promotor induzível por manitol, arabitol, ou glucitol.
Ainda em outra modalidade, as construções de ácido nucléicoque codificam polipeptídeos alvo podem ser mantidas em uma célula hospe-deira bacteriana incapaz de degradar ou metabolizar manitol, glucitol, ouarabitol, ou derivados ou análogos destes, onde manitol, glucitol, arabitol, ouglicerol é utilizado para induzir a expressão dos polipeptídeos alvo. Em taismodalidades, um primeiro ácido nucléico que codifica um primeiro peptídeode interesse, e um segundo ácido nucléico que codifica um segundo peptí-deo de interesse são regulados de forma independente um do outro atravésdo uso de promotores diferentes, onde pelo menos um promotor é um pro-motor induzível por manitol, glucitol, ou arabitol. Tais sistemas de gene commúltiplos alvos permitem a regulação e otimização independente de expres-são de cada peptídeo. Em certas modalidades, um peptídeo expresso podemodular a expressão ou característica de peptídeo resultante do outro peptí-deo de interesse.
Exemplos de tal sistema de gene com múltiplos alvos incluem,porém sem caráter limitativo: (1) sistemas onde o produto de expressão deum dos genes alvo interage com o outro gene alvo por si só; (2) sistemasonde o produto de expressão de um dos genes alvo interage com o outroproduto de expressão do gene alvo, por exemplo, um peptídeo e seu peptí-deo de ligação ou os α e β-polipeptídeos de um αη-βη peptídeo; (3) sistemasonde os dois produtos de expressão interagem com um terceiro componen-te, por exemplo, um terceiro componente presente na célula hospedeira; (4)sistemas onde os dois produtos de expressão dos dois genes participam emuma via biocatalítica comum; e (5) sistemas onde os dois produtos de ex-pressão dos dois genes funcionam independentemente um do outro, por e-xemplo, um sistema de expressão de anticorpo biclonal.
Em um exemplo de um sistema de gene com múltiplos alvos dotipo listado acima (1), um primeiro gene alvo pode codificar um peptídeo alvodesejado, onde o primeiro gene alvo está sob o controle de um promotorregulável; o segundo gene alvo pode então codificar um peptídeo envolvidona regulação do promotor do primeiro gene alvo, por exemplo, o segundogene alvo pode codificar o primeiro peptídeo ativador ou repressor do pro-motor do gene alvo. Em um exemplo onde o segundo gene codifica um pep-tídeo regulador de promotor do primeiro gene, a seqüência de codificação dosegundo gene pode estar sob o controle de um promotor induzível por mani-tol. Em algumas modalidades, o segundo gene será parte de uma constru-ção de DNA separada que é mantida na célula como uma construção dehigh-copy-number com um número de cópias de pelo menos 10, 20, 30, 40,50, ou mais de 50 cópias que são mantidas na célula hospedeira, ou que foiinserida no genoma da célula.
Em outro exemplo de um sistema genético de dois alvos, o se-gundo gene alvo pode codificar um peptídeo que auxilia na dobra do primei-ro produto de gene alvo, ou auxilia na direção do peptídeo de interesse atéum compartimento celular (por exemplo, uma proteína do tipo "chapenone"(proteína de alicerse)). Por exemplo, o primeiro produto de gene alvo podeser um peptídeo que é normalmente expresso em uma célula hospedeirabacteriana em uma forma incorretamente dobrada. Alternativamente, o pri-meiro produto de gene alvo pode ser um peptídeo que é normalmente ex-presso em uma célula bacteriana em uma forma insolúvel. O segundo genealvo, nestes casos, pode codificar uma proteína que ajuda a dobrar apropri-adamente a proteína, ou direcionar a proteína para um local específico nacélula (por exemplo, tal como o periplasma). Exemplos de tais peptídeos eproteínas incluem, porém sem caráter limitativo: proteínas cbpA, htpG, dnaK,dnaJ, fkbP2, groES, groEL, htpG ou cbpA, HSP70, proteínas HSP110/SSE,proteínas HSP40 (relacionas com DNAJ), proteínas tipo GRPE, proteínasHSP90, proteínas CPN60 e CPN10, chaperoninas citosólicas, proteínasHSP100, HSPs pequenos, Calnexina e calreticulina, PDI e proteínas relacio-nadas com tioredoxina, Peptidil-prolil isomerases, Ciclofilina PPIases, proteí-nas de ligação FK-506, Parvulina PPIases, chaperoninas individuais, chape-rones específicas de proteína, ou chaperones intramoleculares. Outras pro-teínas que podem ser expressas na presente invenção incluem moduladoresde dobra que estão geralmente descritos em "Guidebook to Molecular Cha-perones and Protein-Folding Catalysts" (1997) ed. M. Gething, MelbourneUniversity, Australia.
Transformação
A transformação das células hospedeiras com o(s) vetor(es) po-de ser realizada utilizando qualquer metodologia de transformação conheci-da na técnica, e as células hospedeiras bacterianas podem ser transforma-das como células intactas ou como protoplastos (ou seja, que inclui citoplas-tos). As metodologias de transformação exemplificativas incluem metodolo-gias de poração, por exemplo, eletroporação, fusão de protoplasto, conjuga-ção bacteriana, e tratamento com cátion divalente, por exemplo, tratamentocom cloreto de cálcio ou tratamento com CaC^/Mg^+, ou outros métodosbem-conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, J. Bact., 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101:347-362(Wu et al., eds, 1983), Sambrook et al., Molecular Cloning, A LaboratoryManual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Labora-tory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.,eds., 1994)).Seleção
De preferência, as células que não são transformadas com êxitosão selecionadas contra a seguinte transformação, e continuamente durantea fermentação. O marcador de seleção pode ser um marcador de seleçãoauxotrófico ou um marcador de seleção antibiótico tradicional. Quando a cé-lula for auxotrófica para múltiplos compostos nutrientes, a célula auxotróficapode se desenvolver sobre meio suplementado com todos os compostosnutrientes até ser transformada pelo vetor de restauração de fototrofia.Quando o marcador de seleção for um gene de resistência a antibiótico, oantibiótico associado pode ser adicionado ao meio para selecionar contracélulas não transformadas e células revertentes, como bem-conhecido natécnica.
Fermentação
Como usado aqui, o termo "fermentação" inclui ambas modali-dades onde a fermentação literal é empregada e modalidades onde outrosmodos de culturas não-fermentativos são empregados. A fermentação podeser realizada em qualquer escala. Em algumas modalidades, o meio de fer-mentação pode ser selecionado entre meio rico, meio mínimo, um meio desais minerais; um meio rico pode ser usado, porém é, de preferência, evita-do. Em outra modalidade, tanto um meio mínimo como um meio de sais mi-nerais é selecionado.
O meio de sais minerais consiste em sais minerais e uma fontede carbono tal como, por exemplo, glicose, sacarose, ou glicerol. Exemplosde meio de sais minerais incluem, por exemplo, meio M9, Pseudomonas(ATCC 179), Davis e meio Mingioli (vide, BD Davis & ES Mingioli, in J. Bact.60:17-28 (1950)). Os sais minerais usados para formar meio de sais mine-rais incluem aqueles selecionados entre, por exemplo, fosfatos de potássio,sulfato ou cloreto de amônio, sulfato ou cloreto de magnésio, e minerais-traço tais como cloreto de cálcio, borato, e sulfatos de ferro, cobre, manga-nês, e zinco. Nenhuma fonte de nitrogênio orgânico, tal como peptona, trip-tona, aminoácidos, ou um extrato de levedura, está incluída em um meio desais minerais. Ao contrário, uma fonte de nitrogênio inorgânica é usada eesta pode ser selecionada entre, por exemplo, sais de amônio, amônia a-quosa, e amônia gasosa. Um meio de sais minerais típico irá conter glicosecomo a fonte de carbono. Em comparação com meio de sais minerais, omeio mínimo também pode conter sais minerais e uma fonte de carbono,porém pode ser suplementado com, por exemplo, baixos níveis de aminoá-cidos, vitaminas, peptonas, ou outros ingredientes, apesar destes serem adi-cionados em níveis muito mínimos.
Idealmente, o meio selecionado permite cultivo celular de altadensidade (HCDC) para desenvolvimento de células bacterianas. O HCDCpode começar como um processo de lote que é seguido por cultivo por lotealimentado de duas fases. Após o desenvolvimento ilimitado na parte de lo-te, o desenvolvimento pode ser controlado em uma taxa de desenvolvimentoespecífica reduzida durante um período de 3 tempos de duplicação onde aconcentração de biomassa pode aumentar diversas dobras. Detalhes adicio-nais de tais procedimentos de cultivo são descritos por Riesenberg, D.; S-chulz, V.; Knorre, W. A.; Pohl, H. D.; Korz, D.; Sanders, Ε. A.; Ross, A.;Deckwer, W. D. (1991) "High cell density cultivation of Escherichia coli atcontrolled specific growth rate" J Biotechnol: 20(1) 17-27.
O sistema de expressão de acordo com a presente invençãopode ser cultivado em qualquer formato de fermentação. Por exemplo, lote,lote alimentado, modos de fermentação semicontínuos, e contínuos podemser empregados aqui.
Os sistemas de expressão de acordo com a presente invençãosão úteis para expressão de transgene em qualquer escala (ou seja, volume)de fermentação. Desta maneira, por exemplo, volumes de fermentação deescala em microlitro, escala em centilitro, e escala em decilitro podem serusados; e volumes de fermentação em escala de 1 Litro e maiores podemser usados. Em algumas modalidades, o volume de fermentação estará emou acima de 1 Litro. Em outras modalidades, o volume de fermentação esta-rá em ou acima de 5 Litros, 10 Litros, 15 Litros, 20 Litros, 25 Litros, 50 Litros,75 Litros, 100 Litros, 200 Litros, 500 Litros, 1.000 Litros, 2.000 Litros, 5.000Litros, 10.000 Litros ou 50.000 Litros.Na presente invenção, o desenvolvimento, cultivo, e/ou fermen-tação das células hospedeiras transformadas é realizado dentro de uma fai-xa de temperatura que permite a sobrevivência das células hospedeiras, depreferência, uma temperatura dentro da faixa de cerca de 4°C a cerca de55°C, inclusive.
Densidade Celular
Em modalidades da presente invenção Pseudomônadas e bac-térias estreitamente relacionadas são utilizadas na presente invenção.
Pseudomonadas, e particularmente, Pseudomonas fluorescens, podem sedesenvolver em altas densidades celulares. Para esta finalidade, os siste-mas de expressões de Pseudomonas fluorescens de acordo com a presenteinvenção podem proporcionar uma densidade celular de cerca de 20 g/L oumais. Os sistemas de expressões de Pseudomonas fluorescens de acordocom a presente invenção também podem proporcionar uma densidade celu-lar de pelo menos cerca de 70 g/L, como estabelecido em termos de bio-massa por volume, sendo que a biomassa é medida como peso celular seco.
Em algumas modalidades, a densidade celular será de pelo me-nos 20 g/L. Em outra modalidade, a densidade celular será de pelo menos25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L,100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, ou pelo menos 150 g/L.
Em outras modalidades, a densidade celular em indução seráentre 20 g/L e 150 g/L;, 20 g/L e 120 g/L; 20 g/L e 80 g/L; 25 g/L e 80 g/L; 30g/L e 80 g/L; 35 g/L e 80 g/L; 40 g/L e 80 g/L; 45 g/L e 80 g/L; 50 g/L e 80g/L; 50 g/L e 75 g/L; 50 g/L e 70 g/L; 40 g/L e 80 g/L.
Níveis de Expressão de Peptídeos Recombinantes
Os sistemas de expressão de acordo com a presente invençãopodem expressar polipeptídeos transgênicos em um nível entre 5% e 80%de peptídeo celular total (%tcp). Em algumas modalidades, o nível de ex-pressão estará em ou acima de 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%,35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% de tcp.
Isolamento e Purificação
Os peptídeos recombinantes produzidos de acordo com estainvenção podem ser isolados e purificados em pureza substâncial por técni-cas padrão bem-conhecidas, que incluem, porém sem caráter limitativo, sul-fato de amônio ou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografiade troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografiade interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de ní-quel, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia em fase reversa, croma-tografia de lectina, cromatografia de eletroforese preparativa, solubilizaçãode detergente, precipitação seletiva com tais substâncias como cromatogra-fia em coluna, métodos de imunopurificação, e outros. Por exemplo, os pep-tídeos que possuem propriedades de adesão molecular estabelecidas po-dem ser fundidos de forma reversível com um ligante. Com o Iigante apropri-ado, o peptídeo pode ser seletivamente absorvido em uma coluna de purifi-cação e então liberado da coluna em uma forma relativamente pura. O pep-tídeo fundido é então removido por atividade enzimática. Ademais, o peptí-deo pode ser purificado utilizando colunas de imunoafinidade ou colunas deNi-NTA. Técnicas gerais são adicionalmente descritas em, por exemplo, R.Scopes, Peptide Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: N.Y.(1982); Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990);U.S. Pat. N- 4,511,503; S. Roe, Peptide Purification Techniques: A PracticalApproach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al.,Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Peptide Expr Purif,18(2): p/ 182-92 (2000); e R. Mukhija, et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995).Vide também, por exemplo, Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements);Deutscher (1990) "Guide to Peptide Purification", Methods in Enzymologyvol. 182, and other volumes in this series; Coligan, et al. (1996 and periodicSupplements) Current Protocois in Peptide Science Wiley/Greene, NY; e aliteratura do fabricante sobre uso de produtos de purificação de peptídeo, porexemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., or Bio-Rad, Richmond, Calif. Combi-nação com técnicas recombinantes permitem a fusão com segmentos apro-priados, por exemplo, com uma seqüência FLAG ou um equivalente que po-de ser fundido através de uma seqüência removível de protease. Vide tam-bém, por exemplo., Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli(1990) "Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent"in Setlow (ed.) Genetic Engineering1 Principie and Methods 12:87-98, Ple-num Press, NY; and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Levei Ex-pression & Peptide Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.
A detecção do peptídeo expresso é realizada por métodos co-nhecidos na técnica e inclui, por exemplo, radioimunoensaios, técnicas deWestern blotting ou imunoprecipitação.
O peptídeo expresso produzido de forma recombinante pode serrecuperado e purificado a partir das culturas celulares recombinantes atravésde inúmeros métodos, por exemplo, a cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC) pode ser empregada para etapas de purificação final, quando ne-cessário.
Certos peptídeos expressos nesta invenção podem formar agre-gados insolúveis ("corpos de inclusão"). Diversos protocolos são adequadospara purificação de peptídeos a partir de corpos de inclusão. Por exemplo, apurificação de corpos de inclusão envolve tipicamente a extração, separaçãoe/ou purificação de corpos de inclusão por divisão das células hospedeiras,por exemplo, por incubação em um tampão de 50 mM de TRIS/HCL pH 7,5,50 mM de NaCI, 5 mM de MgCl.sub.2, 1 mM de DTT, 0,1 mM de ATP, e 1mM de PMSF. A suspensão celular é tipicamente Iisada utilizando 2 a 3 pas-sagens através de uma Prensa Francesa. A suspensão celular também podeser homogeneizada utilizando um Polytron (Brinknan Instruments) ou soni-cada em gelo. Métodos alternados para Iisar bactérias são óbvios para osversados na técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel etal., supra).
Se necessário, os corpos de inclusão podem ser solubilizados, ea suspensão de célula Iisada pode ser tipicamente centrifugada para remo-ver matéria insolúvel indesejada. Os peptídeos que formaram os corpos deinclusão podem ser renaturado por diluição ou diálise com um tampão com-patível. Os solventes adequados incluem, porém sem caráter limitativo, uréia(de cerca de 4 M a cerca de 8 M), formamida (pelo menos cerca de 80%,volume/base de volume), e cloridrato de guanidina (de cerca de 4 M a cercade 8 Μ). Embora cloridrato de guanidina e agentes similares sejam desnatu-rantes, esta desnaturação não é irreversível e a renaturação pode ocorrermediante a remoção (por diálise, por exemplo) ou diluição do desnaturante,permitindo a re-formação de peptídeo imunológica e/ou biologicamente ativo.Outros tampões adequados são conhecidos pelos versados na técnica.
Alternativamente, é possível purificar os peptídeos recombinan-tes a partir do periplasma hospedeiro. Após a Iise da célula hospedeira,quando o peptídeo recombinante for exportado no periplasma da célula hos-pedeira, a fração periplásmica das bactérias pode ser isolada por choque frioosmótico além de outros métodos conhecidos pelo versado na técnica. Paraisolar os peptídeos recombinantes do periplasma, por exemplo, as célulasbacterianas podem ser centrifugadas para formar um pélete. O pélete podeser re-suspenso em um tampão que contém 20% de sacarose. Para Iisar ascélulas, as bactérias podem ser centrifugadas e o pélete pode ser re-suspenso em 5 mM de MgSO.sub.4 gelado e mantido em um banho de gelodurante aproximadamente 10 minutos. A suspensão celular pode ser centri-fugada e o sobrenadante decantado e guardado. Os peptídeos recombinan-tes presentes no sobrenadante podem ser separados dos peptídeos hospe-deiros por técnicas de separação padrão bem-conhecidas pelo versado natécnica.
Um fracionamento de sal inicial pode separar muitos dos peptí-deos derivados de célula hospedeira indesejados (ou peptídeos derivadosdo meio de cultura celular) do peptídeo recombinante de interesse. Um talexemplo pode ser sulfato de amônio. O sulfato de amônio precipita os peptí-deos ao reduzir de forma eficaz a quantidade de água na mistura de peptí-deo. Os peptídeos então se precipitam sobre a base de sua solubilidade.Quanto mais hidrofóbico for um peptídeo, este será mais propenso a se pre-cipitar em concentrações de sulfato de amônio inferiores. Um protocolo típicoinclui adicionar sulfato de amônio saturado a uma solução de peptídeo demodo que a concentração de sulfato de amônio resultante esteja entre 20 a30%. Esta concentração irá precipitar o peptideo mais hidrofóbico. O precipi-tado é então descartado (a menos que o peptídeo de interesse seja hidrofó-bico) e o sulfato de amônio é adicionado ao sobrenadante a uma concentra-ção conhecida por precipitar o peptídeo de interesse. O precipitado é entãosolubilizado em tampão e o excesso de sal removido se necessário, tantoatravés de diálise como diafiltração. Outros métodos que contam com a so-lubilidade de peptídeos, tal como precipitação de etanol frio, são bem-conhecidos pelo versado na técnica e podem ser usados para fracionar mis-turas complexas de peptídeo.
O peso molecular de um peptídeo recombinante pode ser usadopara isolar o mesmo de peptídeos de tamanho maior e menor utilizando ul-trafiltração através de membranas de tamanho de poro diferente (por exem-plo, membranas Amicon ou Millipore). Como uma primeira etapa, a misturade peptídeo pode ser ultrafiltrada através de uma membrana com um tama-nho de poro que possui um corte de peso molecular menor do que o pesomolecular do peptídeo de interesse. O retentado da ultrafiltração pode serentão ultrafiltrado contra uma membrana com um corte molecular maior doque o peso molecular do peptídeo de interesse. O peptídeo recombinante irápassar através da membrana dentro do filtrado. O filtrado pode ser entãocromatografado como descrito abaixo.
Os peptídeos recombinantes também podem ser separados deoutros peptídeos sobre a base de seu tamanho, carga de superfície líquida,hidrofobicidade, e afinidade de ligantes. Ademais, os anticorpos suspensoscontra os peptídeos podem ser conjugados em matrizes de coluna e os pep-tídeos imunopurificados. Todos estes métodos são bem-conhecidos na téc-nica. Tornar-se-á óbvio para o versado que técnicas cromatográficas podemser realizadas em qualquer escala e utilizando equipamento de muitos fabri-cantes diferentes (por exemplo, Pharmacia Biotech).Renaturacão e Redobra
O peptídeo insolúvel pode ser renaturado ou redobrado para ge-rar conformação de estrutura peptídica secundária e terciária. As etapas deredobra de peptídeo podem ser usadas, quando necessário, para completara configuração do produto recombinante. A redobra e renaturação podemser realizadas utilizando um agente que é conhecido na técnica para promo-ver dissociação/associação de peptídeos. Por exemplo, o peptídeo pode serincubado com ditiotreitol seguido por incubação com sal dissódico de glutati-ona oxidada seguido por incubação com um tampão que contém um agentede redobra tal como uréia.
O peptídeo recombinante também pode ser renaturado, por e-xemplo, ao dialisar o mesmo contra salina tamponada com fosfato (PBS) outampão com 50 mM de Na-acetato, pH 6 mais 200 mM de NaCI. Alternati-vamente, o peptídeo pode ser redobrado enquanto imobilizado sobre umacoluna, tal como a coluna Ni NTA que utiliza 6M-1M de gradiente de uréialinear em 500 mM de NaCI1 20% de glicerol, 20 mM de Tris/HCI pH 7,4, quecontém inibidores da protease. A renaturação pode ser realizada durante umperíodo de 1,5 hora ou mais. Após a renaturação os peptídeos podem sereluídos através da adição de 250 mM de imidazol. O imidazol pode ser re-movido através de uma etapa de diálise contra PBS ou tampão com 50 mMde acetato de sódio pH 6 mais 200 mM de NaCI. O peptídeo purificado podeser armazenado a 4 graus C. ou congelado a -80 graus C.
Outros métodos incluem, por exemplo, aqueles que podem serdescritos em MH Lee et al., Peptide Expr. Purif., 25(1): p. 166-73 (2002),W.K. Cho et al., J. Biotechnology, 77(2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, et al.(1987 and periodic supplements), Deutscher (1990) "Guide to Peptide Purifi-cation", Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series,Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in PeptideScience Wiley/Greene, NY, S. Roe, Peptide Purification Techniques: A Prac-tical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag,et al., Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996).
VI. Polipeptídeos Recombinantes
A presente invenção proporciona a produção de peptídeos re-combinantes em sistemas de expressão bacteriana. Exemplos de polipeptí-deos recombinantes que podem ser usados na presente invenção incluempolipeptídeos derivados de organismos procarióticos e eucarióticos. Taisorganismos incluem organismos do domínio Archea, Bactéria, Eukarya, in-clusive organismos Kingdom Protista, Fungi, Plantae, e Animalia.Os tipos de peptídeos que podem ser utilizados na presente in-venção, além das proteínas e peptídeos descritos acima, incluem exemplossem caráter limitativo, tais como, enzimas, que são responsáveis pela catali-sação de milhares de reações químicas da célula viva; queratina, elastina, ecolágeno, que são tipos importantes de peptídeos estruturais, ou de supor-te,; hemoglobina e outros peptídeos de transporte de gás; ovalbumina, case-ína, e outras moléculas nutrientes; anticorpos, que são moléculas do sistemaimune; hormônios peptídeos, que regulam o metabolismo; e peptídeos querealizam trabalho mecânico, tais como actina e miosina, os peptídeos mus-culares contráteis.
Outros polipeptídeos não Iimitativos específicos incluem molécu-las tal como, por exemplo, renina, um hormônio do crescimento, que incluihormônio de crescimento humano; hormônio de crescimento bovino; fator deliberação de hormônio do crescimento; hormônio da paratireóide; hormôniotireóide estimulante; lipopeptídeos; alfa.l-antitripsina; insulina de cadeia A;insulina de cadeia B; pró-insulina; trombopoietina; hormônio folículo estimu-lante; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coagulação,tais como, fator VIIIC1 fator IX, fator tecidual, e fator de von Willebrands; fato-res anticoagulantes tal como Peptídeo C; fator atrial natriurético; tensoativopulmonar; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina hu-mana ou ativador de plasminogênio tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina;fator de crescimento hemopoiético; fator alfa e beta de necrose tumoral; en-cefalinase; uma albumina do soro tal como albumina de soro humano; subs-tância de inibição mulleriana; relaxina de cadeia A; relaxina de cadeia B; pro-relaxina; peptídeo associado com gonadotropina de camundongo; um peptí-deo microbiano, tal como beta-lactamase; Dnase; inibina; activina; fator decrescimento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormônios ou fatoresde crescimento; integrina; peptídeo A ou D; fatores reumatóides; um fatorneurotrófico tal como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)1 neuro-trofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de cresci-mento do nervo tal como NGF-.beta.; cardiotrofinas (fator de hipertrofia car-díaca) tal como cardiotrofina-1 (CT-1); fator de crescimento derivado de pia-quetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto tal como aFGF e bFGF;fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transforma-ção (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, inclusive TGF-.beta.1, TGF-beta.2, TGF-.beta.3, TGF-.beta.4, ou TGF-.beta.5; fator de crescimento tipoinsulina I e Il (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-l (cérebro IGF-I), peptídeos deligação de fator de crescimento tipo insulina; peptídeos CD tais como CD-3,CD-4, CD-8, e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas;um peptídeo morfogenético ósseo (BMP); um interferon tal como interferon-alfa, -beta, e -gama; fatores estimulantes de colônias (CSFs), por exemplo,M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs)1 por exemplo, IL-1 a IL-10;anticorpo anti-HER-2; superóxido dismutase; receptores de célula T; peptí-deos de membrana de superfície; antígeno CD55; antígeno viral tal como,por exemplo, uma parte do envelope AIDS; peptídeos de transporte; recepto-res residentes; adressinas; peptídeos reguladores; anticorpos; e fragmentosde qualquer um dos polipeptídeos listados acima.
Os peptídeos recombinantes que serão expressos de acordocom a presente invenção podem ser expressos a partir de polinucleotídeosonde a seqüência codificadora de polipeptídeo alvo é ligada de forma operá-vel aos elementos reguladores de transcrição e tradução para formar umgene funcional a partir do qual a célula hospedeira pode expressar o peptí-deo. A seqüência codificadora pode ser uma seqüência codificadora nativado polipeptídeo alvo, se disponível, porém será mais preferivelmente umaseqüência codificadora que foi selecionada, aperfeiçoada ou otimizada parauso na célula hospedeira de expressão selecionada: por exemplo, sinteti-zando o gene para refletir a tendenciosidade de uso de códon de uma espé-cie Pseudomonas species tal como Pseudomonas fluorescens. 0(s) gene(s)que resulta(m) foi/foram construído(s) dentro ou será(ão) inseridos dentro deum ou mais vetores, que será(ão) então transformado(s) na célula hospedei-ra de expressão. O ácido nucléico ou um polinucleotídeo considerado porser proporcionado de uma "forma exprimível" significa o ácido nucléico ouum polinucleotídeo que contém pelo menos um gene que pode ser expressopela célula hospedeira de expressão bacteriana selecionada.As informações de seqüência abrangentes requeridas para ge-nética molecular e técnicas de engenharia genética estão ampla e publica-mente disponíveis. O acesso às seqüências de nucleotídeo completas demamífero, bem como de humano, genes, seqüências de cDNA, seqüênciasde aminoácido e genomas pode ser obtido a partir de GenBank no endereçoURL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez. Informações adicionais tambémpodem ser obtidas de GeneCards, uma enciclopédia eletrônica que integrainformações sobre genes e seus produtos e aplicações biomédicas deWeizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/), informações de seqüência denucleotídeo também podem ser obtidas de EMBL Nucleotide Sequence Da-tabase (http://www.ebi.ac.uk/embl/) ou DNA Databank ou Japan (DDBJ,http://www.ddbi.nig.ac.jp/: sítios adicionais para informações sobre seqüên-cias de aminoácido incluem Georgetown1S peptide information resourcewebsite (http://www-nbrf.qeorqetown.edu/pir/) e Swiss-Prot(http://au.expasv.org/sprot/sprot-top.html)·
A presente invenção é explicada em detalhe nos Exemplos quese seguem. Estes exemplos são considerados ilustrativos da invenção e nãodevem ser interpretados como uma limitação desta.
Exemplos
Materiais e Métodos
Salvo observação em contrário, as técnicas padrão, vetores, e-Iementos de seqüência de controle, e outros elementos de sistema de ex-pressão conhecidos no campo de biologia molecular são usados para mani-pulação, transformação e expressão de ácido nucléico. Tais técnicas padrão,vetores, e elementos podem ser encontrados, por exemplo, em : Ausubel etai (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons);Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold SpringHarbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); andBukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elementsl Plasmids and Episomes(1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).Salvo observação em contrário, as reações de PCR foram reali-zadas utilizando um termociclador PTC225 (MJ Research, South San Fran-cisco, CA, USA) de acordo com o protocolo na Tabela 6.
Tabela 6. Protocolo PCR
Mistura de reação (100 μΙ_ volu- me total) Etapas de termociclagem
μL 10 X Herculase buf- fer* Etapa 1 1 Ciclo 2 minutos 94°C 30 se- gundos 2μL 10mM dNTPs* Etapa 2 35 Ci- clos 30 se- gundos 55°C0,25 ng Cada iniciador 1 minuto 68°C
1-5 ng DNA modelo Etapa 3 1 Ciclo 10 minu- tos 70°C
1 μL Herculase DNA Poli- me rase* Etapa 4 1 Ciclo Mantém 4°C
Restan- te H2O destilada e deio- nizada (ddH20)
* (Stratagene, La Jolla, Ca. USA, daqui por diante "Stratagene")Cepas e Plasm ídeos
As cepas utilizadas nos presentes Exemplos estão descritas naTabela 7. Os plasm ídeos foram preparados utilizando o kit QIAprep Spin Mi-niprep de Qiagen; Valencia, CA) e transformados em Pseudomonas fluores-cens DC283 ou DC388 mediante eletroporação de células recentementesemeadas como se segue. Vide, por exemplo, Enderle et al. (1998) "Electro-poration of freshly plated Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa cel-Is", Biotechniques 25: 954-958. As células foram retalhadas em uma placade ágar-LB com um alça de inoculação, lavadas 3 vezes em 500 μΙ de águaMilli-Q, e ressuspensas em 40 μΙ de água Milli-Q. Um μΙ de DNA de plasmí-deo foi misturado com 40 μΙ de células e transferido em uma cubeta de ele-troporação resfriada. A eletroporação foi realizada com um Gene Pulser Il(Bio-Rad, Hercules, CA) com uma resistência de campo de 2,25 kV/cm. Ascélulas foram imediatamente transferidas para 1 ml de meio SOC (Invitro-gen; Carlsbad, CA), incubadas durante 1 a 1,5 hora a 30°C, e subseqüente-mente espalhadas sobre placas de ágar (glicose M9 mais uracila). As placasde ágar foram incubadas a 30°C.
Tabela 7. Cepas usadas neste relatório
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Experimentos de Crescimento
A porcentagem de todas as concentrações de glícerol é expres-sa como v/v e aquelas de glicose e manitol como p/v. Os experimentos decrescimento foram realizados em aparelho agitador com erlenmeyer de 1Lque contêm 200 ml de meio de sais of minerais com 5 g/L de extrato de le-vedura e elementos-traço. O meio padrão continha 9,5% de glicerol, que cor-responde a uma concentração de 1,3 M. Para alguns experimentos, a con-centração de glicerol foi reduzida para 2% (=274 mM) ou 5% (=685 mM).
Quando a glicose foi usada como uma fonte de carbono, uma solução de25% de glicose em meio de frasco agitado sem glicerol foi esterilizada porfiltro e adicionada em meio autoclavado para fornecer uma concentraçãofinal de 5% (=278 mM) ou 12,5% (=694 mM) de glicose. Se necessário, adi-ciona-se uracila (750 μg/ml) ao meio contido no erlenmeyer. Quatro mL deuma cultura durante a noite da cepa desenvolvida em glicose M9 (mais 250μg/ml de uracila se requerido) foram usados como inóculo em frascos agita-dos. O crescimento foi monitorado ao medir a densidade óptica das culturasa 600 nm em intervalos de tempo definidos em cubetas plásticas de 1 cmcom um Eppendorf BioPhotometer (Eppendorf AG; Hamburg, Germany). Aindução do promotor manitol foi tipicamente realizada em um tempo de fer-mentação de 24 horas decorridas através da adição de 1% (=55 mM) demanitol de 20% de uma solução estoque.Cultivo de DC390 em fermentadores de 20 litros
A cepa DC390 se desenvolveu em recipientes de fermentaçãode pesquisa aerados padrão de 20L em um meio de sais minerais descritopor Risenberg et al. (1991) "High cell density cultivation of Escherichia coli atcontrolled specific growth rate", J. Biotech. 20(1): 17-27, com leve modifica-ção. As culturas se desenvolveram em 72h a 32°C; o pH foi mantido em 6,5através da adição de amônia aquosa. A taxas de agitação e fluxo de ar es-palhado foram inicialmente aumentadas para controlar o oxigênio dissolvidoem um nível positivo, porém foram fixadas em níveis máximos quando estesforam atingidos. A glicose ou glicerol foi alimentado através do processo defermentação para manter um leve excesso. O processo de fermentação dealta densidade de lote alimentado foi dividido em uma fase de crescimentoinicial de aproximadamente 24h e uma fase de expressão (indução) genéticaonde manitol a 1% (p/v) de concentração foi adicionado para iniciar a ex-pressão genética recombinante em uma densidade celular alvo de 170 ODunidades em 575 nm. As densidades ópticas e fluorescência celular forammonitoradas ao longo do tempo. As densidades celulares finais variaramdependendo da fonte de carbono.
Análises de Fluorescência
A fluorescência de culturas foi medida com um fluorímetro demicroplacas Spectramax Gemini (Molecular Devices Corporation; Sunnyvale,CA) que utiliza os seguintes ajustes: excitação 485 nm, emissão 538 nm,filtro passa-faixa 530 nm. Antes da análise, a densidade óptica (OD6oo) deamostras foi medida em cubetas de 1 cm como descrito acima. As amostrasforam diluídas a OD6oo= 5 com meio de frasco agitado em tubos Eppendorfe então a OD6oo = 1 com água diretamente na microplaca de 96 cavidades.O meio de frasco agitado diluído (1:5) foi usado como um blank. A densidadeóptica a 600 nm das amostras na placa de 96 cavidades foi medida com umespectrofotômetro de microplaca Spectramax Plus (Molecular Devices Cor-poration; Sunnyvale, CA), e os valores de fluorescência foram indicados co-mo unidades de fluorescência relativa RFUs.Para citometria de fluxo, as amostras de cultura foram fixadaspor formaldeído como se segue: 1 ml_ de células foi peletado e ressuspensoem salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,2). Na capela, 37% de for-maldeído (concentração de estoque) foram adicionados a uma concentraçãode 2%. As células foram incubadas durante 5 min em temperatura ambiente,então centrifugadas e ressuspensas em PBS em um total de três vezes.OD6Oo foi ajustado para 0,01 e as células foram armazenadas a 4°C até aanálise. Todas as lavagens foram coletadas como resíduos perigosos. Asanálises de citometria de fluxo foram realizadas por Cytometry Research,San Diego1 CA. Os dados foram representados graficamente utilizando osoftware FCS Express2 (DeNovo Software; Thornhill, Ontario, Canada).Análise de concentração de manitol, qlicerol e glicose
A concentração de manitol, glicerol e glicose em caldo de culturafoi determinada com um cromatógrafo iônico Dionex ajustado com uma co-luna analítica CarboPac PA10 e um detector amperométrico pulsado ED50(PAD) (Dionex Corporation; Sunnyvale, CA). As células e caldo de culturaforam separados por centrifugação, e as amostras de sobrenadante foramarmazenadas a -20°C até o uso. As amostras foram diluídas diversas milha-res de dobras com água a uma concentração estimada de cerca de 10 μg/mle injetada sobre a coluna (volume de injeção 25 μΙ) com um amostrador au-tomático. A coluna foi equilibrada com 18 mM de hidróxido de sódio em á-gua. Em uma taxa de fluxo de 1 ml/min, as condições cumpridas foram asseguintes: 18 mM de NaOH durante 10 min; aumentar para 100 mM de Na-OH dentro de 1 min; 100 mM de NaOH durante 1 min; 18 mM de NaOH du-rante 8 min para condicionar a coluna. Os tempos de retenção aproximadoseram os seguintes: Glicerol 2,2 min; manitol 3,4 min; glicose 12,8 min. Asconcentrações foram calculadas baseadas em padrões de concentraçõesconhecidas.
Exemplo 1: Identificação do óperon de mtlen) diversas Pseudomônadas
Uma pesquisa BLAST do genoma MB101 de P. fluorescens nobanco de dados ERGO, que utiliza a seqüência de mtIE DSM50106 comodescrito por Brunker et al. (1998) "Structure and function of the genes invol-ved in manitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseudomonas fluores-cens DSM50106", Gene 206(1):117-126, mostrou que MB101 possui umóperon de mtl que é similar àquele descrito em DSM50106, começando comRXF01195 (mtIE). Um alinhamento de gene do óperon de mtl em quatro ce-pas diferentes de Pseudomonas, P. aeruginosa PAO-1, P. fluorescensDSM50106, P. fluorescens PfO-1, e P. fluorescens MB101, é mostrado naFigura 3. Há dois tipos de arranjo de gene - um onde o gene ativador trans-cricional, mtIR, está diretamente localizado a montante do óperon de mtl, eum onde mtIR não está presente diretamente a montante do óperon de mtl,que é o caso de MB101 e DSM50106.
Um alinhamento de seqüência entre as regiões diretamente amontante do códon de início mtIE ATG em MB101, DSM50106, P. fluores-cens PfO-1, e P. aeruginosa PAO-1 é mostrado na Figura 4. As seqüênciasperfeitamente conservadas que combinam a seqüência consenso de região -35 e -10 de promotor foram encontradas em quatro cepas, que sustenta aconclusão que a região serve como o promotor do óperon de mtl. Ademais,duas regiões perfeitamente conservadas foram encontradas, uma de 15 bp,a montante da região-35, e uma de 14 bp a jusante do região-10.
Exemplo 2: Clonagem da região de promotor do óperon de mtl.
Uma região de 299 bp a jusante do gene mtIE MB101(Seq.ID.No. 9, Tabela 3) foi amplificada por PCR utilizando iniciadores mtlE3(5'-ATATGAGCTCGAGCGTGGGAACGATCAAGTGT-3' - SEQ. ID. Ns 14) emtlE4 (5'-ATATCCGCGGTTCCGCGCCCAGAGGGCTAC-3'-SEQ. ID. Ne15), (vide, Tabela 8) e clonada em frente ao gene repórter CopGFP paraformar pDOW1365-1 (Figura 5). A região clonada contém todas as seqüên-cias que são conservadas entre DSM50106 e MB101 bem como as seqüên-cias mais distantes a jusante. Dois clones pDOW1365-1 foram colocados emseqüência; um (pDOW1365-1) possuía a mesma seqüência do genoma dereferência (seqüenciado por The Dow Chemical Company), enquanto o outropossuía quatorze diferenças entre o clone e a seqüência de referência. Vistoque é improvável que este grande número de alterações resulte somente doprocesso de amplificação PCR passível de erro, especula-se que a polime-rase de DNA aparentemente trocou modelos entre as quatro repetições euma metade direta na região a jusante entre os ciclos na amplificação dePCR. A seqüência das repetições varia levemente, resultando em diversida-de de seqüência no produto de PCR.
Uma região de promotor de 126 bp da mesma região (SEQ. ID.Nq 11, Tabela 3) foi amplificada por PCR utilizando iniciadores mtlE5 (5'-ATATGAGCTCTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCA-3'-SEQ. ID. N9 16) emtlE4, e clonada em frente ao gene CopGFP para formar pDOW1369 (mapanão mostrado).
A região de 203 bp entre mtlfí e mtIE em P. fluorescens PfO-1(SEQ. ID. N9 10) foi clonada por amplificação de PCR utilizando iniciadoresmtlE6 (SEQ. ID. N9 17) e mtlE7 (SEQ. ID. N9 18) (Tabela 8) e inserida a ju-sante do gene repórter CopGFP, resultando em pDOW1370-7 (mapa nãomostrado). A seqüência da região de promotor clonada era a mesma da se-qüência de referência obtida do banco de dados ERGO.
Uma região de promotor de 147 bp da mesma região (SEQ. ID.N9 12, Tabela 3) foi amplificada por PCR utilizando iniciadores mtlE9 (5'-ATATGAGCTCACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAG 3'-SEQ. ID. N9 19) emtlE4 (Tabela 8), e clonada em frente ao gene CopGFP para formarpDOW1377 (mapa não mostrado).
Uma região de promotor de 77 bp da mesma região (SEQ. ID. N913, Tabela 3) foi amplificada por PCR utilizando iniciadores mtlE9 e mtlE11(5'- ATATCCGCGGGTGCGTTGATTACAGCCTTCAAA 3'-SEQ. ID. N9 20)(Tabela 8), e clonada em frente ao gene CopGFP para formar pDOW1378(mapa não mostrado).
Para medir a atividade de promotor relativa sobre placas de á-gar, DC283, um mutante auxotrófico de uracila e prolina de P. fluorescensMB101, foi transformado nos plasmídeos e estriado sobre placas M9 quecontêm 250 μg/mL de uracila, 100 μΜ de FeCI3 (para suprimir a produção depioverdina fluorescente que é produzida por células quando limitadas porferro), e diversas fontes de carbono e incubado a 30°C. As colônias foramexaminadas por um transiluminador de luz azul (Dark Reader, Clare Chemi-cal Research). Apenas o fragmento MB101 de 299 bp em pDOW1365-1 oupDOW1365-2 e o fragmento de 147 bp em pDOW1377 induziu o geneCopGFP na presença de manitol (Vide Tabela 9 e Figura 6) - os outrosfragmentos não expressaram qualquer CopGFP sob nenhuma das condi-ções testadas. Todos os fragmentos continham as regiões de promotor -35 e-10. Quando manitol foi suplementado com 1% de glicerol ou glicose, aconstrução pD0W1365-1 ainda produziu CopGFP, que indicou que o promo-tor não foi reprimido por catabolito por ambas fontes de carbono. O promotorpDOW1365-1 não possuía atividade quando 1% de glicerol ou 1% de glicoseera a única fonte de carbono. Entretanto, o promotor era ativo quando glice-rol foi usado em níveis de 5% e 9,5% (Tabela 9), indicando que glicerol podeatuar como um indutor fortuito do promotor mtl.
Tabela 8. Oliqonucleotídeos com sítios de restrição enqenheirados estãosublinhados.
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Tabela 9. atividade de promotor mtl sobre diversas fontes de carbono
<table>table see original document page 66</column></row><table>Exemplo 3 Indução de Manitol
Os experimentos para examinar a indução de manitol foram rea-lizados em cepa de Pseudomonas fluorescens DC283, um mutante auxotró-fico de uracila e prolina de P. fluorescens MB101. Vide, por exemplo, JCSchneider et al. (2005) "Auxotrophic markers pyrF and proC can replace an-tibiotic markers on protein production plasmids in high cell density Pseudo-monas fluorescens fermentation", Biotech Prog 21:343. Os experimentos decrescimentos com a cepa DC283/pDOW1365-1 foram inicialmente conduzi-dos em meio de frasco agitado padrão que contém 9,5% de glicerol. Após ocultivo das células durante cerca de 24 horas, 1% de manitol (55 mM) foiadicionado para induzir a expressão de CopGFP1 que foi seguido ao longodo tempo pela medida da fluorescência da cultura. De forma interessante, ascélulas mostraram um alto grau de fluorescência antes da indução com ma-nitol, e a fluorescência celular não aumentou após a indução (Figura 7). Ex-perimentos adicionais revelaram que o nível de fluorescência antes da indu-ção e a capacidade de indução do promotor manitol foi correlacionado com aquantidade de glicerol no meio. O aumento da concentração de glicerol nomeio de frasco agitado de 2% a 5% para 9,5% resultou em níveis crescentesde fluorescência não-induzida e níveis decrescentes de fluorescência induzi-da (Figura 8). A expressão de CopGFP apenas foi imediatamente induzívelpor manitol em meio que contém 2% de concentração de glicerol. A utiliza-ção destes baixos níveis de glicerol não foi satisfatória para análise em fras-co agitado pois toda a fonte de carbono foi consumida em 24 horas.
Exemplo 4: Deleção dos genes de degradação de manitol mfDYZ em P. flu-orescens.
Para impedir a degradação de manitol pela cepa DC283 três ge-nes (mtIDYZ) foram deletados do óperon manitol no cromossomo. O vetorsuicida pD0W1373-3 (Figura 9) foi designado para deletar os genes mtIDYZpor mutagênese de troca de alelos. As regiões flanqueadoras mtIDYZ foramamplificadas utilizando DNA genômico MB214 como um modelo e unidasutilizando a junção por meio de técnica de extensão da superposição, queutiliza iniciadores man1 (5'-GCCGACAAGGTAGTGGTGCTCAACA-3') (SEQ.ID. N- 21) e man2 (5'-TGCCCGCTCGCCTCACATCGGGAAATACTC-3')(SEQ. ID. Ng 22) para a região a montante e man3 (GAGTATTTCCC-GATGTGAGGCGAGCGGGCA-3') (SEQ. ID. N5 23) e man4 (5'-ACCGATAGTGCCACCGCTCTGGTAG-3') (SEQ. ID. Ns 24) para a região ajusante. Os iniciadores man2 e man3 contêm superposições complementa-res. O produto unido foi clonado em pDOW1261/Stf/ para formarpD0W1373-3. (Figura 9). As colônias foram examinadas com iniciadorH3seq (5'-GTCCTGCAATTTCAGCCCGA-3') (SEQ. ID. N9 25) e man4; a-quelas com o produto de 1170 bp esperado foram seqüenciadas para con-firmar que nenhuma mutação gerada por PCR foi incorporada.
O plasmídeo pDOW1373-3 foi transformado na cepa DC283,onde este não pode ser replicar independentemente e os integrantes dentrodo genoma foram selecionados por resistência à tetraciclina. Os transfor-mantes com uma integração bem sucedida do plasmídeo dentro do cromos-somo tanto a montante como a jusante do cluster do gene mtIDYZ foramidentificados ao realizar amplificação de PCR. Poucos integrantes a montan-te e a jusante foram então cultivados na ausência de tetraciclina para enri-quecer os clones que foram agrupados com êxito no plasmídeo (com ou semgenes mtIDYZ) do cromossomo através de uma segunda troca. A perda doplasmídeo fez com que os clones ficassem resistentes ao ácido 5'-fluoroorótico, que foi usado em meio de cultivo de ágar para selecionar osclones com o genótipo desejado. Os clones que não tinham mais o plasmí-deo (e os genes mtIDYZ) integrado no cromossomo tiveram sua auxotrofiade uracila restabelecida. A amplificação de PCR que utiliza iniciadores man5(5'-TGTTCGACGAACCGCTGTCCA-3') (SEQ. ID. Ns 26) e man6 (5'-Ttcaatggtccccccggtcatttcata-S') (seq. id. n2 27), que se situ-am for a da região amplificada para a troca de alelos, resultou em produto depcr do sítio esperado (1308 bp) em diversos clones isolados, isto indicouque o plasmídeo mais os genes mtIDYZ foram deletados de forma bem su-cedida do cromossomo dc283. o seqüenciamento de pcr da região cro-mossomal de interesse confirmou que os genes mtIDYZ estavam ausentesna cepa dc283 AmtIDYZ (=dc388).A cepa DC388 foi analisada para crescimento e metabolismo decarbono em meio de sais minerais M9 suplementado com uracila e prolina(250 μρ/ml cada) e 1% (p/v) de glicose ou 1% (p/v) de manitol como a únicafonte de carbono e energia. O mutante se desenvolveu em meio com glicosepara um OD6oo de cerca de 2,2 dentro de 24 horas e a glicose foi depletadade forma concomitante. Ao contrário, apenas um aumento menor em densi-dade óptica foi observado em meio com manitol como a única fonte de car-bono, e a concentração de manitol não reduziu ao longo do tempo (Figura10). Estes resultados mostraram que o mutante de deleção mtIDYZ possuíao fenótipo esperado e não poderia degradar manitol.
Exemplo 5 - Expressão de CopGFP induzida por Manitol no mutante de de-leção mtDYZ sob diversas condições de crescimento.
O plasmídeo pDOW1365-1 (que transporta o gene CopGFP con-trolado pelo promotor mtl de 299 bp) foi transformado na cepa DC283 Am-tlDYZ. A construção resultante, cepa DC389, foi testada em meio de frascoagitado com diversas concentrações de glicerol (2%, 5%, 9,5%). Na cepadefeituosa de degradação de manitol, manitol induziu CopGFP em todas asconcentrações de glicerol (Figura 11), enquanto na cepa tipo selvagem, a-penas as culturas que não se desenvolveram em 2% de glicerol inicial mos-traram indução imediata (Figura 7). A quantidade de atividade de promotorfoi positivamente correlacionada com a concentração de fonte de carbono;os níveis de indução mais altos foram atingidos utilizando 9,5% de glicerol. Adeleção removeu as primeiras etapas de assimilação de manitol, portanto, aindução de Pmtl por manitol indica que manitol, e não um produto de de-composição, é o indutor de Pmtl.
Em uma comparação lado a lado do mutante de deleção e a ce-pa tipo selvagem foi confirmado que a cepa de mutante era induzível pormanitol em meio com 9,5% de glicerol, enquanto que a cepa tipo selvagemnão era (Figura 12). A concentração de manitol permaneceu constante nacepa de mutante, porém declinou para zero na cepa tipo selvagem (dadosnão mostrados). O mutante se desenvolveu em OD6oo inferior que pode seratribuído à sua incapacidade de utilizar manitol como uma fonte de carbonoe a expressão maior do gene CopGFP no mutante, que pode depositar umacarga sobre o crescimento celular. O mutante mostrou níveis de pré-induçãomaiores de expressão do que o tipo selvagem que pode resultar da incapa-cidade de a cepa de mutante degradar quantidades-traço de indutores pre-sentes no extrato de levedura.
O promotor de manitol também atingiu níveis maiores de indu-ção quando a cepa de mutante se desenvolveu sobre 10% de glicose comouma fonte de carbono (Figura 12b). As culturas desenvolvidas com glicoseexperimentaram uma perda rápida em atividade de CopGFP após 48 horas,que é atribuída à acidificação do meio e morte concomitante e desnaturaçãoprotéica.
Exemplo 6: atividade de promotor mtl após indução com diversas concentra-ções de manitol.
Para induzir a expressão de CopGFP a partir do promotor mtl,uma concentração de 1% (= 55 mM) de manitol foi adicionada ao meio decultura em experimentos anteriores. Neste experimento, a concentração demanitol adicionada em 24 h em culturas de crescimento com glicose oucrescimento com glicerol variou entre 0,01% e 1% para determinar se con-centrações de indutor inferiores poderiam ser usadas para induzir a expres-são. A fluorescência após indução aumentou com a concentração crescentede manitol (Figura 13). O manitol a 0,01% foi suficiente para causar um au-mento na atividade de promotor tanto nas células desenvolvidas com glicerolcomo desenvolvidas com glicose, embora níveis maiores fossem atingidosem 1% de manitol.
Exemplo 7: Indução de glicerol do promotor mtl.
Em experimentos com frasco agitado, observou-se que tanto acepa tipo selvagem como mutante mostrou fluorescência de fundo antes daindução em meio dotado de glicerol, porém não em meio dotado de glicose.O glicerol partilha similaridades estruturais com manitol e suspeita-se queglicerol possa atuar como um indutor fortuito do promotor mtl se a concen-tração de glicerol for suficientemente alta. A hipótese foi testada ao realizarexperimentos com frasco agitado com cepa DC283 AmtlDYZ/pDOV\/1339pDOW1365-1 em meio com 12,5% de glicose e adicionar glicerol em vezmanitol em diversas concentrações no momento da indução. O manitol foiadicionado como um indutor para controlar os frascos. A indução foi realiza-da em 12h EFT em vez de 24h EFT para impedir a interferência do deslo-camento de pH que pode ocorrer em pontos de tempo posteriores em cultu-ras desenvolvidas com glicose.
Quando a concentração de indutor de glicerol for 2% ou abaixo,a atividade de promotor não é detectavelmente diferente de nenhuma adi-ção. Em concentrações de glicerol maiores (5% e 9,5%) a fluorescência au-mentou para 2 a 3 vezes mais que níveis anteriores (Figura 14) em 17 h a-pós a indução. Este resultado mostra claramente que glicerol pode induziratividade de promotor mtl (embora em nível menor do que manitol) isto resul-tou em expressão de CopGFP e explica a fluorescência anterior observadaem meio que contém uma alta concentração de glicerol.
Exemplo 8: Indução uniforme do promotor mtl em menos que concentraçõesde indutor de saturação.
Uma parte das culturas em frasco agitado de Exemplos 6 e 7 foianalisada por citometria de fluxo para determinar se níveis de sub-saturaçãode indutor criaram um estilo bimodal "todos ou nenhum" de indução, ou se aindução era uniforme entre todas as células. Nas culturas testadas, com 0 a1% de manitol como um indutor, ou 0 a 9,5% de glicerol como um indutor,em culturas que utilizam glicose como a fonte de carbono, a distribuição defluorescência criou uma distribuição única em formato normal (Figura 15),indicando que todas as células foram induzidas em um nível similar dentrode uma cultura.
Exemplo 9: atividade de promotor mtl em fermentadores de 20L.
A cepa DC390 (=DC283Amf/DyZí>DOW1365-1 pDOW1339) foicultivada em fermentadores de 20L em meio de sais minerais tanto com gli-cerol como xarope de milho (glicose) como única fonte de carbono. O glice-rol e glicose foram freqüentemente encravados no meio em diversos pontosde tempo de acordo com um regime de alimentação padronizado que é de-pendente da taxa de absorção de oxigênio das células. A concentração deglicerol ou glicose nunca excedeu 1% e 0,1%, respectivamente, e o pH domeio de cultura foi mantido constante em 6,5. Em meio com glicerol, a cultu-ra atingiu uma densidade óptica OD575 de cerca de 250. A densidade ópticamáxima era levemente inferior (OD575 cerca de 230), quando as células sedesenvolveram com xarope de milho (Figura 16a).
Em uma densidade óptica de cerca de 170 em tempo de fermen-tação decorrido de 20,5 horas (EFT), as culturas de fermentador foram indu-zidas com 1% (p/v) de manitol. Como mostrado (Figura 16b), a fluorescênciacelular aumentou para cerca de 3000 RFUs em meio com xarope de milho epara cerca de 1500 RFUs em meio com glicerol. Tanto a fluorescência defundo, aumenta em fluorescência ao longo do tempo, como RFUs eramcomparáveis com resultados obtidos em experimentos com frasco agitadocom 12,5% de glicose (máximo de 3500 RFUs) ou 2% de glicerol (Máximode 1000 RFUs) (dados não mostrados), isto é, os níveis deprimidos erambaixos. A análise peptídica por SDS-PAGE mostrou o aspecto de CopGFP(com um tamanho molecular esperado de 25 kDa) após indução com manitol(dados não mostrados). Em ambos fermentadores, a expressão de CopGFPentre as células na cultura foi uniformemente induzida, como avaliado porcitometria de fluxo (Figura 17).
Exemplo 10: Uso do promotor mtl para co-expressar moduladores de dobraGrpE1 DnaK e DnaJ para aumentar a solubilidade de hormônio de cresci-mento humano.
O hormônio de crescimento humano (hGH), quando expressoem P. fluorescens, se acumula quase inteiramente como corpos de inclusãoinsolúveis. Baseado nos dados de definição de perfil transcricional, a ex-pressão de moduladores de dobra de P. fluorescens (FMs) DnaK e DnaJaumentou em cepas após a indução de expressão de hGH recombinante ese acumulou como corpos de inclusão no citoplasma de P. fluorescens,comparada com as cepas que não expressaram a proteína alvo (vide, porexemplo, Pedido Provisório N- U.S. 60/591.489). Uma cepa, portanto, foiengenheirada com o óperon putativo que codifica GrpE, DnaK e DnaJ sobcontrole do promotor mtl sobre um plasmídeo para co-expressar FMs comhGH.
A utilização do DNA cromossomal DNA isolado de MB214(DNeasy; Qiagen, Valencia, CA) como um modelo e iniciadores RC199(SEQ. ID. NO:28) e RC200 (SEQ. ID. NO:29), grpE dnaKJ foram amplifica-dos utilizando PfuTurbo (Stratagene, La Jolla1 CA) por meio de recomenda-ções do fabricante. O produto de PCR resultante (4 kb) foi digerido com SpeIe Xba\ (sítios de restrição sublinhados nos iniciadores acima) e ligado apDOW2236 (um derivado de pDOW1306-6) (Schneider, J. C., A. F. Jenings,D. M. Mun1 Ρ. M. McGovern and L. C. Chew (2005). "Auxotrophic markerspyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmidsin high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation". Biotech Prog21: 343-348) para criar pDOW2240 que contém o óperon grpEdnaKJ sobcontrole do promotor tac. pDOW2240 foi digerido com Spel e HindiW e ofragmento de 4,0 kb dotado de grpEdnaKJ resultante foi purificado com gelutilizando Qiaquick (Qiagen, Valencia, CA) e ligado a pDOW2247 (um deri-vado de pDOW1365-1) também digerido com Spel e HindIII. O plasmídeoresultante, pDOW3501, que contém grpEdnaKJ sob o controle do promotormanitol, foi transformado em DC388 ao selecionar sobre placas de glicoseM9 suplementadas com 250 pg/ml de uracila. Por fim, pDOW1426 [ref?] foieletroporado na cepa acima (DC462) e selecionado sobre placas de glicoseM9, resultando em cepa DC463 com dois plasmídeos induzíveis: 1)pDOW1426 que transporta PtacZiGHe 2) pDOW3501 que transporta PmtIgr-pEdnaKJ.
Tabela 10. Oliqonucleotídeos com sítios de restrição enqenheirados estãosublinhados.
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As culturas em duplicata de DC463 se desenvolveram em meiode sais minerais e OD600 foi registrado em cada cultura em diversos pontosde tempo. A indução foi realizada através da adição de 0,1 mM de IPTG pa-ra hGH e 0,5% de manitol para GrpEDnaKJ em tempo variados após inocu-lação. As amostras foram coletadas em 0, 4, 8, 24 e 48 horas após indução.Em cada ponto de tempo, 20 OD6oo normalizados em 1 mL foram colhidos,Iisados utilizando EasyLyse™ (Epicentre, Madison, Wl) e separados em fra-ções solúveis e insolúveis por centrifugação a 14000 rpm durante 30 minu-tos. Volumes iguais de amostras foram combinados com BioRad (Hercules,CA) 2x tampão Laemmli, aquecidos a 95°C durante 5 minutos com 30 μΙ_carregados em 15% de gel Criterion Tris-HCI BioRad utilizando 1x Tris tam-pão Glicina SDS (BioRad). As proteínas foram visualizadas com Simply BlueSafestain (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a produção de hGH foi quantificadautilizando padrões Prediluted BSA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) car-regada sobre o mesmo gel. Os géis maculados de Coomassie resultantesforam examinados utilizando Molecular Devices Personal Densitometer (Mo-lecular Devices, Sunnyvale, CA) com análises realizadas utilizando Image-Quant e Excel. Como mostrado na Tabela 11, a co-expressão de GrpEDnaKJ aumentou significativamente a solubilidade de hGH, convertendoquase 100% da proteína alvo na fração solúvel. Os experimentos adicionaisque repetem o crescimento e indução de DC463 utilizando a adição simultâ-nea de IPTG e manitol imitou intimamente os resultados mostrados aqui,com 50 a 100% de hGH encontrado na fração solúvel (dados não mostra-dos) quando co-superexpressa com GrpE DnaKJ, comparada com uma100% insolúvel. Estes resultados foram observados tanto na adição simultâ-nea de IPTG e manitol, como adição escalonada, porém a densidade celularde culturas com indução precoce de GrpE DnaKJ não progrediu igualmente,indicando que um alto nível de expressão destes FMs é prejudicial à saúdeda célula. Visto que níveis inferiores de expressão podem ser ótimos paraum efeito menos prejudicial sobre o metabolismo celular e produção maisalta de hGH solúvel; o controle destes genes FM de um promotor que é re-gulado independentemente da proteína alvo irá permitir a otimização inde-pendente de expressão.
Tabela 11. Quantificação de hGH resultante de co-expressão com GrpE1DnaKJ
Os valores listados aqui são a média de frascos em duplicata,mostrados em mg/ml baseado nos resultados de densitometria mostrados naFigura x. Apenas hGH correspondentes às faixas foram quantificados emcada viela. *EFT refere-se ao tempo de fermentação decorrido.
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Claims (24)

1. Sistema de expressão, que compreende pelo menos um ácidonucléico isolado que compreende um promotor manitol, em que a seqüênciade ácido nucléico compreende uma faixa de pelo menos 299 nucleotídeoscontínuos a montante do gene MB101 de mtlE.
2. Construção de ácido nucléico isolado, que compreende a se-qüência de ácido nucléico de um promotor de gene Pseudomonas Fluores-cens onde a dita seqüência de ácido nucléico é selecionada do grupo queconsiste em(a) SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO 12;(b) uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 90%de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido estabelecidaem SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO 12; e(c) uma seqüência de nucleotídeo que se hibridiza em qualquerum entre a) ou b) sob condições de alta severidade.
3. Construção de ácido nucléico recombinante, que compreendeo promotor, de acordo com a reivindicação 2, ligado de forma operável a umgene de interesse.
4. Sistema de expressão, que compreende uma construção, deacordo com a reivindicação 3.
5. Vetor, que compreende a construção de ácido nucléico, deacordo com a reivindicação 2, em que a dita construção de ácido nucléico éexpressa em uma célula de Pseudomonas Fluorescens.
6. Célula de Pseudomonas fluorescens, para uso na produçãode um ácido nucléico recombinante, que compreende:pelo menos uma construção de ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo recombinante ligado de forma operável a um promotor induzívelpor fonte de carbono selecionado do grupo que consiste em promotores in-duzíveis por manitol, glucitol e arabitol,em que a célula bacteriana foi geneticamente alterada para inibiro metabolismo ou degradação de uma fonte de carbono capaz de induzir opromotor induzível por fonte de carbono.
7. Célula, de acordo com a reivindicação 6, em que o promotor éum promotor induzível por manitol.
8. Célula, de acordo com a reivindicação 7, em que o promotorcompreende o promotor putativo de um óperon de manitol bacteriano endógeno.
9. Célula, de acordo com a reivindicação 8, em que o promotorcompreende o promotor putativo do óperon mtlEFGKDYZ de Pseudomonasfluorescens.
10. Célula, de acordo com a reivindicação 9, em que o promotorcompreende adicionalmente uma seqüência de ácido nucléico que atua co-mo uma região de ligação de proteína de ativador mtl.
11. Célula, de acordo com a reivindicação 10, em que o promo-tor compreende a seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo queconsiste em Seq. ID. Nes 1-13.
12. Célula, de acordo com a reivindicação 6, em que a alteraçãogenética é uma mutação ou deleção de um gene requerido no metabolismode manitol, arabitol, ou glucitol, ou um derivado ou análogo dos mesmos.
13. Célula, de acordo com a reivindicação 12, em que o gene éselecionado do óperon mtl.
14. Célula, de acordo com a reivindicação 13, em que o gene éselecionado do grupo que consiste em mtlD, mtlY e mtIZ, ou uma combina-ção dos mesmos.
15. Método para expressar um polipeptídeo recombinante emuma célula de Pseudomonas fluorescens que compreende:a) proporcionar uma célula hospedeira capaz de expressar umpolipeptídeo recombinante;b) transfectar a célula hospedeira com pelo menos uma constru-ção de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo recombinante ligado deforma operável a um promotor induzível por fonte de carbono selecionado dogrupo que consiste em promotores induzíveis por manitol, glucitol e arabitol;c) desenvolver a célula hospedeira em um meio de crescimento;d) adicionar a fonte de carbono ao meio de crescimento em umaquantidade capaz de induzir a expressão do peptídeo de interesse do pro-motor induzível por fonte de carbono, ee) expressar o polipeptídeo recombinante de interesse ao induziro promotor induzível por fonte de carbono; e,f) isolar o polipeptídeo recombinante expresso;em que a célula bacteriana foi geneticamente alterada para inibiro metabolismo ou degradação de uma fonte de carbono capaz de induzir opromotor induzível por fonte de carbono.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o promo-tor é um promotor induzível por manitol.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que o promo-tor compreende o promotor putativo de um óperon de manitol bacteriano en-dógeno.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o promo-tor compreende o promotor putativo do óperon mtlEFGKDYZ de Pseudomo-nas fluorescens.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o promo-tor compreende adicionalmente uma seqüência de ácido nucléico que atuacomo uma região de ligação de proteína de ativador mtl.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o promo-tor compreende a seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo queconsiste em Seq. ID. N9S 1-13.
21. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a alteraçãogenética é uma mutação ou deleção de um gene requerido no metabolismo demanitol, arabitol ou glucitol, ou um derivado ou análogo dos mesmos.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o gene éselecionado do óperon de mtl.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o gene éselecionado do grupo que consiste em mtlD, mtlY, e mtIZ, ou uma combina-ção dos mesmos.
24. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a célulabacteriana foi geneticamente alterada para inibir o metabolismo ou degrada-ção de manitol, glucitol, ou arabitol.
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