BRPI0611301A2 - composicões farmacêuticas compreendendo peptìdeos derivados da caseìna e métodos de uso das mesmas - Google Patents

Abstract

COMPOSIcõES FARMACêUTICAS COMPREENDENDO PEPTìDEOS DERIVADOS DA CASEìNA E MéTODOS DE USO DAS MESMAS. A presente invencao se refere aos peptídeos derivados da caseína e seu uso no controle de animais lactantes, especificamente aos métodos para diminuicóo do período de seca de um animal de criacao lactante, para aumentar seu rendimento de leite, higienizacao do leite apos o parto e para aperfeicoar o bem-estar dos animais de criacao. A pre- sente invencao se refere, adicionalmente, às composicões farmaceuticas compreendendo peptídeos derivados da caseína na forma de uma solucao estéril, as composicões sendo límpidas e substancialmente isentas de micelas.

Description

"COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO PEPTÍDEOSDERIVADOS DA CASEÍNA E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos peptideos deri-vados da caseina e seu emprego no controle de animais Iac-tantes, especificamente aos métodos para diminuir o períodode seca de um animal de criação lactante para aumentar seurendimento de leite e higienização do leite após o parto epara aperfeiçoamento do bem-estar dos animais de criação. Apresente invenção também se refere à composição farmacêuticacompreendendo peptideos derivados de caseina, na forma deuma solução estéril, que é límpida e substancialmente isentade micelas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A caseina (CN) é a proteína predominante no leitedos mamíferos humanos e não humanos. A caseina vem sendo ca-racterizada como composta de três frações, α, β e γ, de a-cordo com a mobilidade eletroforética de cada fração (Hipp eoutros, 1952. Dairy Sci., 35:272). Atualmente, a caseina édefinida de acordo com as seqüências de aminoácido de cadaum dos subgrupos aSl, aS2, β e κ (Engel e outros, 1984, J.Dairy Sei. 67:1607-1608).

A hidrólise enzimática da caseina libera peptideosque podem contribuir com a saúde e desenvolvimento apropria-do das crianças (FitzGerald e outros, 1998, Int. Dairy J.8:451-457) e que servem como reguladores locais da função daglândula mamária (Silanikove e outros, 2000. Life Sei.67:2201-2212; Shamay e outros, 2002. Life Sei. 70:2707-2719). A serina protease, plasmina, é a protease predominan-te no leite e é conhecida por produzir peptideos resistentesa fervura (proteose-peptonas) da β-caseína, aSl caseina eaS2-caseína.

As Proteose-peptonas (PPs) , também conhecidas comofosfopeptídeos da caseina (CPP), constituem cerca de um ter-ço das proteínas do soro (Andrews, 1983. J. Dairy Res.50:45-55). A plasmina no leite é encontrada principalmenteem sua forma inativa, plasminogênio, e a conversão do plas-minogênio na plasmina é modulada por ativadores de plasmino-gênio (Politis I., 1996, J. Dairy Sei. 7 9:1097-1107).

Os peptideos derivados da caseina mostraram possu-ir várias atividades biológicas e aplicações. Estudos com oscompostos do leite demonstraram a atividade bactericida re-lacionada à caseina. A Patente US número 3.764.670 revelanovos polipeptídeos derivados da caseina possuindo proprie-dades antibióticas contra microorganismos.

A atividade de modulação imune dos peptideos dacaseina foi também observada. Por exemplo, o Pedido de Pa-tente PCT Internacional WO 01/13739 revela um método de po-tencializar a imunidade dos mamíferos e promover o cresci-mento dos mesmos por administração de proteínas contendo a-minoácidos fosforilados, tais como, fosfopeptídeos da casei-na, diretamente ou ao alimento. Conforme a imunidade dos ma-míferos é potencializada, a resistência dos mesmos contradoenças infecciosas é reforçada e fatores de inibição docrescimento dos mesmos são eliminados, pelo que provendo ocrescimento dos mamíferos.As Publicações dos Pedidos de Patentes US números20020147144 e 20040167073 revelam peptideos biologicamenteativos que são derivados ou são semelhantes às seqüênciasidênticas ao término N da fração aSl da caseina do leite quesão capazes de estimular e melhorar a resposta imune, prote-ção contra infecção viral, normalização dos níveis de coles-terol no soro e estimulação da hematopoiese.

O Pedido de Patente PCT Internacional WO2005/081628 revela peptideos biologicamente ativos que sãoderivados ou são semelhantes às seqüências das frações aSl,aS2, β ou κ-caseína da caseina do leite, capazes de modula-ção imune e outras atividades terapêuticas, incluindo, porémnão limitado à estimulação e melhora da resposta imune, pro-teção contra infecção viral, normalização dos níveis de co-lesterol no soro e estimulação da hematopoiese. Os peptideosderivados da caseina são não tóxicos e podem ser usados paratratar e prevenir patologias imunes, diabetes, hipercoleste-rolemia, distúrbios hematológicos e doenças relacionadas aosvírus.

O Pedido de Patente Europeu número EP1375513 reve-la que entre os peptideos derivados da caseina, os peptideospossuindo seqüências de aminoácido compreendendo resíduos defosfoserina plural mostram uma forte atividade de melhoraimune. Especificamente, a invenção se refere a um agente demelhora imunológica compreendendo um peptídeo consistindo naseqüência de aminoácido Ql-SerP-X-SerP-Q2, onde, SerP repre-senta o resíduo fosfoserina, X representa um a três dequaisquer resíduos de aminoácido e Ql e Q2 estão independen-temente ausentes ou representam pelo menos um de qualquerresíduo de aminoácido.

A Patente US número 6.391.849 cedida a um dos in-ventores da presente invenção e colaboradores revela proteo-se-peptonas derivadas da caseína que atuam como queladoresde cálcio e seu emprego no controle das alterações fisioló-gicas em uma glândula mamária, incluindo cessação transitó-ria e persistente de produção do leite, indução de involuçãoe prevenção, tratamento e reversão de infecções.

Os fosfopeptídeos da caseína mostraram possuir apropriedade única de serem capazes de se ligarem aos macroe-lementos, tais como, Ca, Mg, e Fe, junto com elementos detraço, tais como, Zn, Ba, Cr, Ni, Co e Se, que podem ser so-lubilizados no intestino delgado e, portanto disponíveis pa-ra absorção. Como tal, os CPPs são usados como aditivos embebidas e alimentos infantis e em medicamentos dentários.Por exemplo, a Patente US número 5.834.427 revela um fosfo-peptídeo de caseína purificado (CPP) possuindo uma seqüênciade aminoácido nova e caseína purificada incluindo o mesmo. 0CPP ou a caseína contendo o mesmo possui uma capacidade a-perfeiçoada de solubilizar os minerais e absorver os mesmosnos mamíferos. 0 CPP o a β-caseína-H contendo o mesmo podeser adicionado aos gêneros alimentícios, bebidas, medicamen-tos, cosméticos e alimentos em uma quantidade eficaz paramelhorar a absorção de minerais nos animais. Uma composiçãooral compreendendo a beta-caseína H ou o CPP da invenção eum veículo farmaceuticamente aceitável pode reduzir ou ali-viar uma hipersensibilidade dentinal.A Patente US número 5.227.154 revela um método pa-ra controlar o odontólito por tratamento do dente com umacomposição oral que compreende fosfopeptídeos da caseina es-pecíficos e/ou sais dos mesmos. A Patente US número6.652.875 revela uma formulação para a liberação de consti-tuintes bioativos às superfícies biológicas, incluindo su-perfícies dentárias tais como dentes e gengivas, onde a for-mulação compreende uma suspensão ou solução de pelo menosuma proteína de caseina isolada e purificada ou sal da mesmaem água, em conjunto com pelo menos um constituinte bioativo.

Vários métodos para preparação de hidrolisados dacaseina, especificamente de CPPs, foram propostos. Por exem-plo, a Patente US número 4.740.462 revela a produção de CPPpor hidrólise da caseina com uma tripsina cristalina seguidopor fracionamento e separação por ultrafiltração ou técnicascromatográficas, tais como, cromatografia de permeação degel ou cromatograf ia de troca de íon. Esse método pode teralguma utilidade de pesquisa, porém não é apropriado ou eco-nômico em escala industrial. Outros métodos envolvem o usode substâncias tóxicas, tais como, cloreto de bário, que nãosão aceitáveis em produtos alimentícios e/ou composiçõesfarmacêuticas.

Independente do método usado para preparação, umasolução contendo um hidrolisado de caseina tende a turvação.A turvação é considerada como uma desvantagem significativanas composições farmacêuticas, bem como em alguns produtosalimentícios, especialmente bebidas, como é difícil ou im-possível de rastrear visivelmente alterações na composiçãoturva, especificamente detectar contaminações. A Patente USnúmero 5.405.756 revela um método para a preparação de fos-fopeptídeo de caseína apropriado para uso como um aditivopara bebidas sem afetar a transparência da bebida; contudo,a proteína obtida contém cálcio e, além disso, uma soluçãoclara é obtida apenas em um pH ácido.

Controle dos Animais de Criação LactantesNa indústria de laticínios moderna, os animaislactantes em rebanhos passam por ciclos controlados de orde-nha e gravidez, uma vem que tais regimes contribuem para umaumento significativo na produção do leite. No controle cor-rente dos rebanhos leiteiros, por exemplos, vacas e cabras,existe uma sobreposição significativa entre a lactação e agravidez, onde um "período de seca" é imposto entre 50 a 70dias antes do animal partir por cessação da lactação. Esseregime é estabelecido como um compromisso entre a necessida-de de induzir a involução, um processo necessário para o pe-ríodo de ordenha saudável subsequente e o requisito de pro-dução alta de leite por todo o ano.

A cessação da retirada do leite leva a alteraçõesrápidas na secreção mamária e ao início do processo de invo-lução mamária ativo. Esse processo compreende uma seqüênciademorada e altamente ordenada de alterações no tecido e com-posição do leite, que ocorrem durante a transição entre osestados de lactação e não lactação. Durante o primeiro está-gio da involução mamária, o processo é desencadeado por es-tímulos locais que iniciam a apoptose, porém a involução po-de ser revertida por reinicio da remoção do leite (Capucoand Akers, 1999, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 4:137-144;Wilde e outros, 1999, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia4:129-136). Esse controle local pode causar involução quandoa estase do leite é induzida nas glândulas individuais, con-forme foi observado nas cabras lactantes seguindo-se cessa-ção unilateral do leite (Quarrie e outros, 1994. Biochem.Soe. Trans. 22:178S) ou nos camundongos fêmea lactantes se-guindo vedação da teta (Li e outros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:3425-3430; Marti e outros, 1997. Eur. J. Cell.Biol. 73:158-165).

O segundo estágio de involução é persistente, e aremoção do leite não pode causar recomeço da secreção doleite (Capuco and Akers, 1999. ibid; Wilde e outros, 1999.ibd) . A reversão do segundo estado de involução pode ocorrerapenas em um estágio de lactação subsequente após o parto.Este estágio é caracterizado por ativação das proteases quedestroem a estrutura lobular-alveolar da glândula por degra-dação da matriz extracelular e membrana de base, bem comoperda de massa das células alveolares.

A cessação da ordenha para induzir involução estáassociada a um risco aumentado de desenvolvimento de masti-te, uma doença causada por infecção intramamária (IMI) comagentes patogênicos, em sua maioria bactérias, porém tambémlevedura, fungos ou mesmo algas. A mastite pode ser clinica,com sinais clínicos locais (e em alguns casos gerais) e a-normalidades no leite ou subclínicos com perdas de produçãoe queda da qualidade do leite.Vacas leiteiras modernas são geralmente secas ain-da produzindo 20 a 40 litros de leite por dia. Portanto, aestase do leite pode causar vazamento de secreção mamária, oque aumenta substancialmente o risco de IMI. A secagem con-vencional, conduzindo a um longo processo de involução, estátipicamente associada a uma razão maior de IMI. A mastiteclinica e subclinica produz perdas econômicas significantesdevido ao leite rejeitado (menos produção na fazenda), qua-lidade do leite degradada (menos rendimento), afastamentoprecoce das vacas (perda do potencial genético) , custos demedicamento, despesas veterinárias e custos de trabalho au-mentados para o fazendeiro. A mastite é a doença que debili-ta mais o rebanho leiteiro, custando a indústria de laticí-nios dos Estados Unidos cerca de 2 bilhões de dólares anualmente.

Foi mostrado anteriormente por um dos inventoresda presente invenção e colaboradores que uma fração de β-caseína pura (β-CN) 1-28 infraregula secreção de leite emvacas e cabras. A atividade desse peptídeo foi correlaciona-da a sua capacidade de bloquear os canais de potássio nasmembranas apicais do epitélio mamário (Silanikove e outros, 2000. supra).

Também foi mostrado que a injeção da preparaçãobruta de hidrolisados da caseína (CNH) no úbere de uma cabraou vaca imita o fenômeno natural de involução, induzindo auma resposta inflamatória local e perda da integridade dajunção da teta (TJ), seguido por secagem rápida da secreçãomamária (Patente US número 6.391.849; Shamay e outros, 2002.ibid; Shamay e outros, 2003. J. Dairy Sei. 86:1250-1258). Oprocesso induzido por CNH foi mais rápido e sincronizado queaquele induzido em secagem natural. Esses resultados indicamque é possível reduzir significativamente o tempo necessáriopara involução. Contudo, ainda não está claro se é possívelencurtar ou omitir o período de seca sem afetar o rendimentodo leite no período de lactação subsequente. Annen e outros(2004. J. Dairy Science 87:37 4 6-37 61) mostraram que o trata-mento de vacas que tiveram vários partos com somatotropinabovina (bST) permitiu o encurtamento e mesmo a omissão doperíodo de seca sem redução na produção do leite; contudo,esse tratamento não foi tão eficaz para as vacas que estavamem sua primeira gestação. Além disso, foi mostrado anterior-mente que o tratamento com bST causa mastite, transtornos dereprodução e outras doenças relacionadas a produção e quetal tratamento aumenta distúrbios das patas.

O bem-estar do animal de fazenda é uma questão deinteresse público crescente nas sociedades do Oeste dos Es-tados Unidos nas últimas décadas (Broom DM 1992 Em: Phillipse outros, Ed. Farm Animais and the Environment. CAB Wallig-ford Reino Unido, pp 245-253). O desenvolvimento recente daspráticas de alojamento e controle de animais de fazenda sobsistemas de produção intensivos reflete o aumento nas ques-tões morais do bem-estar dos animais (Fregonesi e outros,2001. Livestock Production Sci.68:205-216; Fregonesi e ou-tros, 2002. Livestock Production Sei. 78:245-257). 0 aper-feiçoamento do bem-estar do animal, definido como a preven-ção do sofrimento e aumento da presença de sentimentos posi-tivos ou conforto é um fator importante no controle dos ani-mais de criação (Broom, 1992. ibid). Medições dos prejuízosno funcionamento biológico, especialmente aqueles ligados apiora da saúde e respostas aumentadas de tensão fisiológicasão usadas para avaliar o estado de bem-estar dos animais defazenda.

Existe uma necessidade não satisfeita de um trata-mento eficiente e seguro para reduzir o período de seca norebanho leiteiro sem afetar negativamente o rendimento doleite, para aumentar o rendimento do leite e higienização epara manter e/ou melhorar o bem-estar dos animais de cria-ção. Adicionalmente, seria altamente vantajoso a obtençãodas composições farmacêuticas na forma de solução límpida,pronta para usar compreendendo peptídeos derivados da caseína.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere em geral ao controlede lactação dos animais de criação e às composições farma-cêuticas compreendendo os peptídeos derivados da caseína.Especificamente, a presente invenção se refere aos métodospara diminuir o período de seca imposto aos animais lactan-tes, para aumentar seu rendimento de leite e higienização doleite, e para impedir sofrimento associado a infecção naglândula mamária e cessação abruta da ordenha. A presenteinvenção também se refere às composições farmacêuticas com-preendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelomenos um peptídeo derivado da caseína, onde as composiçõesestão na forma de uma solução estéril límpida, substancial-mente isenta de micelas de caseína e compreende peptídeospossuindo um peso molecular baixo, substancialmente uniformede cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Dalton.

É uma prática comum nos rebanhos mantidos paraprodução de leite forçar a cessação de produção de leite porum animal lactante antes do parto. 0 período de não lacta-ção, definido como o "período de seca" é muito importantepara a saúde do animal e para manter sua capacidade de pro-duzir leite. Até agora, um período de seca de 50 a 70 diasvem sendo o padrão na indústria. Inesperadamente, a presenteinvenção mostra agora que é possível encurtar o período deseca sem afetar negativamente o rendimento do leite após oparto. Surpreendentemente, a presente invenção agora revelaum método para aumentar o rendimento do leite após o partoem comparação ao rendimento do leite no período de lactaçãoantes do parto.

Assim, de acordo com um aspecto, a presente inven-ção provê um método para reduzir o período de seca entre osciclos de lactação em um animal lactante, sem afetar negati-vãmente o rendimento do leite, compreendendo administraçãoao animal lactante de uma quantidade terapeuticamente eficazde pelo menos um peptídeo derivado da caseína.

De acordo com determinadas modalidades, o períodode seca é reduzido a menos de 50 dias, preferivelmente a me-nos de cerca de 40 dias, mais preferivelmente a entre cercade 20 a cerca de 30 dias.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãoprovê um método para aumentar o rendimento do leite de umanimal lactante após o parto em comparação ao rendimento doleite obtido no período de lactação antes do parto, compre-endendo administração ao animal lactante de uma quantidadeeficaz de pelo menos um peptídeo derivado da caseina.

Nos rebanhos leiteiros, a higiene do leite produ-zido, quando medida por contagens de células somáticas (SSC)por mL do leite, possui uma grande influência na lucrativi-dade do rebanho, uma vez que o leite compreendendo altos ní-veis de células por mL de leite deve ser descartado.

Ainda de acordo com outro aspecto, a presente in-venção provê um método para aumentar a higienização do leitede um animal lactante, compreendendo administração a umaglândula mamária do animal lactante de uma quantidade tera-peuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo derivado dacaseina, de modo a reduzir as contagens de células somáticas(SCC) no leite, como comparado a SSC antes da administraçãodo peptídeo De acordo com determinadas modalidades, a SCCapós administração do peptídeo é de cerca de 750.000 célulaspor mL de leite e menos, preferivelmente 60.000 células/mL emenos, mais preferivelmente 400.000 células/mL e menos, mes-mo mais preferivelmente 300.000 células/mL do leite, maispreferivelmente 200.000 células/mL do leite e menos. De a-cordo com determinadas modalidades, a SCC é reduzida duranteo ciclo de lactação onde o tratamento é aplicado. De acordocom determinadas modalidades preferidas, a SCC é reduzidadurante um ciclo de lactação subsequente para um período deseca imposto após o tratamento ser aplicado.

A infecção na glândula mamária e/ou cessação a-brupta da ordenha causa dor e tensão ao animal. Não apenas ofato de que tal tensão reduz a produtividade do animal so-frendo, a consciência aumentada das condições gerais dos a-nimais em sistemas de produção altamente intensos pede méto-dos de aperfeiçoamento do bem-estar de tais animais de cria-ção. Surpreendentemente, a presente invenção agora revelaque é possível reduzir ou mesmo prevenir o sofrimento asso-ciado à infecção da glândula mamária ou cessação abrupta daordenha.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção provê um método para redução do sofrimento associadoà infecção da glândula mamária ou cessação abrupta da orde-nha em um animal de criação lactante, compreendendo adminis-tração à glândula mamária do animal lactante de uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo deri-vado da caseina, pelo que, aperfeiçoando o bem-estar do ani-mal lactante.

De acordo com determinadas modalidades, o aperfei-çoamento do bem-estar de um animal lactante é medido pelaredução do número de caminhadas diárias e pelo prolongamentodo período de repouso diário do animal. De acordo com umamodalidade, pelo menos um peptídeo derivado da caseina é ad-ministrado a uma glândula mamária infectada. De acordo comoutra modalidade, o peptídeo ou peptídeos são administradosa uma glândula mamária não infectada.

De acordo com determinadas modalidades, os métodosda presente invenção empregam peptídeos derivados da caseinaque são fosfopeptídeos. De acordo com uma modalidade, o fos-fopeptideo compreende a seqüência de aminoácido Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ ID NO: 1) e análogos ou derivadosda mesma. De acordo com modalidades adicionais, o fosfopep-tideo é selecionado do grupo consistindo em um fosfopeptideoderivado da β-caseína, aSl-caseína ou aS2-caseína. De acordocom determinadas modalidades correntemente preferidas, ofosfopeptideo empregado de acordo com os métodos da presenteinvenção compreende uma seqüência de aminoácido selecionadado grupo consistindo nas SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 5 e aná-logos, derivados ou fragmentos das mesmas. De acordo com mo-dalidades adicionais presentemente preferidas, os métodos dapresente invenção empregam um fosfopeptideo consistindo emuma seqüência de aminoácido selecionada dos análogos das SEQID NO: 2 à SEQ ID NO: 5, derivados ou fragmentos das mesmas.Um tipo de peptideo simples, bem como vários tipos de peptí-deo podem ser empregados.

De acordo com determinadas modalidades, os métodosda presente invenção compreendem administração intracanal depelo menos um peptideo derivado da caseina. De acordo comdeterminada modalidade presentemente preferida, os métodoscompreendem administração ao canal da teta de uma glândulamamária do animal lactante. A administração ao canal da tetapode ser por meio de injeção ou infusão. Pelo menos um pep-tideo pode ser administrado a uma ou mais glândulas mamá-rias, incluindo administração concomitante à todas as glân-dulas mamárias do animal lactante. De acordo com as modali-dades adicionais, os métodos da presente invenção compreen-dem, adicionalmente, co-administração de uma terapia antimi-crobiana, selecionada do grupo consistindo em antibiótico,bactericida, tratamento antiinflamatório esteróide e não es-teróide, tratamento com um imunomodulador e vacinação.

De acordo com uma modalidade, o método para redu-zir o período de seca entre os ciclos de lactação compreendeadministração de pelo menos um peptídeo derivado da caseínaao mesmo tempo em que cessa a ordenha. A administração sim-ples, bem como administrações múltiplas são contempladas.Tipicamente, o peptídeo é administrado entre uma ou mais ve-zes, preferivelmente uma a três vezes em um intervalo sele-cionado do grupo consistindo em cerca de 6 horas, cerca de 8horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 20 ho-ras ou cerca de 24 horas. De acordo com uma modalidade pre-sentemente mais preferida, pelo menos um peptídeo é adminis-trado apenas uma vez. De acordo com as modalidades adicio-nais, a cessão da ordenha ocorre cerca de 60 dias antes deum parto esperado, preferivelmente cerca de 40 dias, maispref erivelmente entre cerca de 20 a cerca de 30 dias antesde um parto esperado.

De acordo com outra modalidade, o método para au-mentar o rendimento do leite após o parto e durante o perío-do de lactação subsequente compreende administração de pelomenos um peptídeo derivado da caseína ao mesmo tempo da ces-sação da ordenha, tipicamente, cerca de 60 dias antes doparto esperado, preferivelmente cerca de 40 dias, mais pre-ferivelmente cerca de 30 dias antes do parto. A dosagem erepetição da etapa de administração de pelo menos um peptí-deo são selecionadas de modo a obter aumento no rendimentodo leite após o parto. De acordo com determinadas modalida-des, o peptideo é administrado a pelo menos uma glândula ma-mária entre uma ou mais vezes, tipicamente uma a três vezes,em um intervalo selecionado do grupo consistindo de cerca de6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16horas, cerca de 20 horas ou cerca de 24 horas. De acordo comuma modalidade presentemente mais preferida, pelo menos umpeptideo é administrado apenas uma vez. De acordo com umamodalidade adicional, presentemente preferida, o peptideo éadministrado a todas as quatro glândulas mamárias do úbere.De acordo com determinadas modalidades, o aumento médio norendimento do leite é de pelo menos 3%, preferivelmente depelo menos 6%, mais preferivelmente de pelo menos cerca de9%, mais preferivelmente entre cerca de 10% a cerca de 25%.

Ainda de acordo com modalidades adicionais, um au-mento na higienização do leite é obtido por administração depelo menos um peptideo derivado da caseina no começo do pe-ríodo de seca, tipicamente cerca de 60 dias antes de um par-to esperado. A dosagem e repetição da etapa de administraçãoà glândula mamária são selecionadas de modo a reduzir a SCCe obter um aumento na higienização do leite no período delactação subseqüente ao período de seca. De acordo com umamodalidade atualmente mais preferida, pelo menos um peptideoé administrado apenas uma vez.

De acordo com modalidades adicionais, o método pa-ra prevenção do sofrimento associado à infecção da glândulamamária ou cessação abrupta da ordenha compreende uma admi-nistração simples de peptideo ou peptídeos derivados da ca-seina.

Durante o curso de investigação dos novos métodosrevelados na presente invenção, os inventores reconheceram anecessidade de composições aperfeiçoadas compreendendo pep-tideos derivados da caseina.

Os peptideos derivados da caseina, que são tipica-mente digestos enzimáticos hidrolisados da caseina, são co-nhecidos por seu valor nutricional e como tal, são emprega-dos em nutrição clinica, em fórmulas para alimentação de be-bes e como enriquecimento protéico de alimentos e bebidas.Também é sugerido que os hidrolisados da caseina também pos-suam aplicações farmacêuticas. Tais preparações são geral-mente comercializadas como um pó seco para constituição comum veiculo apropriado, por exemplo, água estéril, imediata-mente antes do uso. A solução obtida é tratável em relação àcontaminação, devido ao seu alto valor nutricional, emborasua turvação interfira com a identificação imediata da con-taminação. Além disso, as preparações turvas tendem a possu-ir precipitados.

Inesperadamente, os inventores da presente inven-ção descobriram que a filtração adicional de uma preparaçãode caseina turva através de um filtro de cerca de 0,1 mícrona cerca de 0,5 micron, preferivelmente através de um filtroabaixo de 0,25 micron, remove substancialmente as micelas dacaseina, a presença das quais sendo a causa principal deturvação. Adicionalmente, após filtração, a composição com-preende peptideos na faixa de cerca de 1.000 Dalton a cercade 5.000 Dalton. Essa faixa de tamanho compreende uma popu-lação preferida de peptideos derivados da caseina, especial-mente fosfopeptideos, tal que o processo de filtração provêadicionalmente uma composição compreendendo peptideos deri-vados da caseina substancialmente uniformes possuindo um pe-so molecular na faixa de 1.000 a 5.000 Dalton.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãoprovê uma composição farmacêutica compreendendo uma quanti-dade terapeuticamente efetiva de pelo menos um peptideo de-rivado da caseina, onde a composição está na forma de umasolução estéril límpida, pronta para uso, substancialmenteisenta de micelas, possuindo um pH acima de 6,0. De acordocom determinadas modalidades, a composição compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um fosfo-peptídeo derivado da caseina. De acordo com as modalidadesadicionais, um peptideo ou peptideos possuem um peso molecu-lar de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Dalton, preferivel-mente cerca de 2.500 Dalton.

Deve ser entendido que embora as composições far-macêuticas da presente invenção tenham sido obtidas pelafiltração descrita acima, elas podem ser obtidas por qual-quer método conhecido na arte para remoção de substânciasacima de cerca de 0,25 μπι e/ou peptideos acima de 5.000 Dal-ton, tais como, ultrafiltração, diálise e semelhantes.

De acordo com uma modalidade, o fosfopeptideo de-rivado da caseina compreende a seqüência de aminoácidoSer(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ ID NO: 1) e análogos ouderivados da mesma possuindo um peso molecular na faixa de1.000-5.000 Dalton. De acordo com modalidades adicionais, acomposição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um fosfopeptideo selecionado do grupo con-sistindo em um fosfopeptideo derivado da β-caseína, um fos-fopeptideo derivado da aSl-caseína, um fosfopeptideo deriva-do da aS2-caseína ou uma combinação dos mesmos. De acordocom determinadas modalidades correntemente preferidas, ofosfopeptideo derivado da β-caseína compreende uma seqüênciade aminoácido conforme estabelecida na SEQ ID NO:2 e análo-gos, derivados ou fragmentos da mesma. De acordo com modali-dades adicionais presentemente preferidas, o fosfopeptideoderivado da aSl-caseína compreende uma seqüência de aminoá-cido conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3 e análogos, deri-vados ou fragmentos da mesma. Ainda de acordo com outras mo-dalidades correntemente preferidas, o fosfopeptideo derivadoda aS2-caseína é selecionado de um peptídeo compreendendouma seqüência de aminoácido conforme estabelecida na SEQ IDNO: 4 e um peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidoconforme estabelecida na SEQ ID NO: 5 e análogos, derivados efragmentos da mesma. De acordo com modalidades adicionais, acomposição farmacêutica compreende vários peptídeos da case-ína conforme descrito acima. De acordo com uma modalidade, acomposição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um peptídeo consistindo essencialmente emuma seqüência de aminoácido conforme estabelecida em qual-quer uma das SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ IDNO:5 ou análogos, derivados e fragmentos das mesmas ou qual-quer combinação das mesmas possuindo um peso molecular nafaixa de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Dalton.O peptideo derivado da caseina pode ser obtidopor hidrólise da caseina ou pode ser um peptideo sintético.Os peptideos sintéticos podem ser preparados conforme des-crito aqui a seguir e como é conhecido por um versado natécnica.

De acordo com uma modalidade, o teor de proteínada composição farmacêutica da presente invenção é de cercade 10 ng/mL a cerca de 15 mg/mL. Essa quantidade é eficaznas aplicações terapêuticas, embora a solução seja límpida.

De acordo com uma modalidade, a turvação da composição é in-ferior a cerca de 6 Unidades de Turvação Nefelométrica(NTU) . De acordo com outra modalidade, o pH da composição éde cerca de 6,0 a cerca de 8,0.

Os fosfopeptídeos dentro das composições da pre-sente invenção são altamente estáveis dentro de uma amplafaixa de temperatura. De acordo com uma modalidade, os fos-fopeptídeos são resistentes ao aquecimento, tal que, nenhumaperda de atividade de observada quando a composição compre-endendo os peptideos é aquecida a 50°C a 70°C apor 10-15 mi-nutos. De acordo com outra modalidade, os fosfopeptídeos sãoresistentes ao congelamento, tal que a composição pode serarmazenada a -20°C por pelo menos 6 meses, preferivelmentepor pelo menos 12 meses.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãoprove uma composição farmacêutica compreendendo uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptideo deri-vado da caseina, na forma de um pó liofilisado, onde o pó éreconstituído como um líquido antes do uso para formar umasolução límpida, substancialmente isenta de micelas e possu-indo um pH acima de 6,0.

Deve ser entendido que as novas composições farma-cêuticas da presente invenção, compreendendo pelo menos umpeptídeo derivado da caseína, especificamente fosfopeptídeoderivado da caseína, que estão na forma de uma solução esté-ril, límpida são apropriadas para uso nos novos métodos paracontrole de animais de criação descritos aqui acima. Alter-nativamente, essas composições farmacêuticas podem tambémser empregadas para qualquer uso de tais peptídeos conformedescrito na seção de antecedentes precedente e como conheci-do na técnica.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção provê uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptídeoderivado da caseína, onde a composição está na forma de umasolução estéril, límpida, pronta para uso, substancialmenteisenta de micelas, possuindo um pH acima de 6,0 para trata-mento de uma glândula mamária de um animal lactante. De a-cordo com determinadas modalidades, a composição compreendeuma quantidade terapeuticamente eficaz de um fosfopeptídeoderivado da caseína. De acordo com modalidades adicionais,os fosfopeptídeos dentro da composição farmacêutica possuemum peso molecular médio de cerca de 1.000 Dalton a cerca de5.000 Dalton. De acordo com uma determinada modalidades pre-sentemente preferida, o peso molecular médio é de cerca de2.500 Dalton.

As novas composições farmacêuticas da presente in-venção são surpreendentemente eficientes no tratamento deuma glândula mamária em qualquer animal lactante, incluindoo ser humano; animais de criação para produção de carne eleite incluindo gado, cabras, carneiros e búfalos; outrosanimais de criação incluindo camelos, lhamas, cavalos e porcos; e animais de estimação incluindo gatos e cães.

De acordo com determinadas modalidades, o trata-mento é selecionado do grupo consistindo na indução da ces-sação transitória de produção do leite, indução de uma ces-sação persistente da produção do leite ou indução de involu-ção. Vantajosamente, as composições farmacêuticas da presen-te invenção induzem uma involução em cerca de 3 dias, semafetar negativamente a reconstituição dos tecidos da glându-la mamária na direção do próximo periodo de lactação. Alémdisso, a involução pode ser induzida em qualquer estágio dociclo de lactação, incluindo o ponto máximo de lactação.

De acordo com outro aspecto, a nova composiçãofarmacêutica da presente invenção é empregada para prevençãoe tratamento de infecção microbiana e reversão da infecçãomicrobiana.

As composições são eficazes no tratamento das in-fecções causadas por uma ampla faixa de agentes patogênicosincluindo, porém não limitados às bactérias gram positivasbem como gram negativas, fungos, micoplasma e virus. De a-cordo com uma modalidade, as composições da presente inven-ção são eficazes no tratamento das infecções microbianas quecausam mastite. Assim, as composições farmacêuticas providaspela presente invenção reduzem a dependência de antibióticospara o tratamento de infeções incluindo infecções na glându-la mamária, alivio de ambos os problemas de infecções resis-tentes aos antibióticos e problemas de resíduos antibióticospresentes no leite no caso da mastite. Alternativamente, ascomposições farmacêuticas da presente invenção podem ser ad-ministradas em combinação com a terapia antimicrobiana adi-cional. De acordo com uma modalidade, a composição farmacêu-tica da presente invenção é administrada em combinação comum agente antimicrobiano selecionado do grupo consistindo emum antibiótico, um bactericida, um agente antiinflamatórioesteróide e um agente antiinflamatório não esteróide. A te-rapia de combinação pode reduzir a dose necessária do agentemencionado anteriormente e/ou melhorar seu efeito terapêuti-co. De acordo com outra modalidade, a composição farmacêuti-ca é administrada em combinação com uma vacina. De acordocom uma modalidade adicional, a composição farmacêutica éadministrada em combinação com um imunomodulador.

Além de serem eficientes no tratamento da mastitedurante a lactação, as novas composições farmacêuticas dapresente invenção superam com sucesso o problema de persis-tência de infecção por mastite de um ciclo de lactação parao outro, quando administradas ao mesmo tempo da indução deum período de seca.

A nova composição farmacêutica da presente inven-ção é tipicamente formulada para administração parenteral.De acordo com uma modalidade, a composição farmacêutica éformulada para administração intracanal, por exemplo, porinfusão ou por injeção. De acordo com uma modalidade corren-temente preferida, a formulação farmacêutica é formulada porinjeção em uma cavidade glandular através do canal da tetada glândula mamária do animal lactante. A composição farma-cêutica pode ser também formulada para aplicação tópica àteta ou úbere como um gel, ungüento, creme, emulsão ou for-mulação de liberação prolongada, incluindo um emplastrotransdérmico. Alternativamente, as composições farmacêuticasda presente invenção são formuladas para administração sistêmica oral.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção provê uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptideoderivado da caseina, onde a composição está na forma de umasolução estéril límpida, pronta para uso, substancialmenteisenta de micelas, possuindo um pH acima de 6,0 para um usoselecionado do grupo consistindo em, porém não limitado aouso dentário e uso terapêutico. Esses usos conhecidos sãorevelados, por exemplo, nas Patentes US números 5.227.154;5.834.427 e 6.652.875; Pedido de Patente Europeu númeroEP1375513; Pedidos PCT Internacionais WO 01/13739 e WO2005/081628; e Publicações de Pedidos de Patentes US números20020147144 e 20040167073, entre outros.

Ainda de acordo com um aspecto adicional, a pre-sente invenção provê um método para tratar uma glândula ma-mária em um animal lactante, compreendendo a etapa de admi-nistração ao animal lactante de uma composição farmacêuticacompreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelomenos um peptideo derivado da caseina, onde a composição es-tá na forma de uma solução estéril, límpida, pronta para u-so, substancialmente isenta de micelas, possuindo um pH aci-ma de 6,0.

De acordo com uma modalidade, o tratamento é sele-cionado do grupo consistindo na indução da cessação transi-tória da produção de leite, cessação persistente da produçãode leite e indução da involução.

De acordo ainda com um aspecto adicional, a pre-sente invenção provê um método para tratar e inibir uma in-fecção microbiológica.

De acordo com determinadas modalidades, a infecçãoé mastite, incluindo uma mastite subclínica, bem como clíni-ca e a composição é administrada a uma glândula mamária in-fectada de um animal lactante. De acordo com uma modalidade,a composição farmacêutica é administrada durante um períodode lactação de modo a tratar mastite durante a ordenha. Deacordo com outra modalidade, a composição farmacêutica é ad-ministrada ao final do ciclo de lactação ou durante o perío-do de seca. A administração no início e durante o período deseca contempla administração a uma glândula mamária infecta-da, de modo a tratar a mastite existente, bem como à glându-la mamária não infectada como um tratamento profilático.

A cessação simultânea da ordenha de todas as glân-dulas mamárias de um animal lactante tipicamente resulta emuma reação inflamatória indesejada. Surpreendentemente, apresente invenção agora mostra que a administração das com-posições farmacêuticas da invenção a todas as glândulas ma-mária de um animal lactante ao mesmo tempo não é acompanhadade qualquer efeito adverso Assim, é possível induzir a ces-sação de produção de leite e involução e tratar a mastite emqualquer número desejado de glândulas mamárias de um animalindividual. A administração de acordo com a presente inven-ção inclui administração a apenas uma glândula a todas asglândulas, por exemplo, em todas as quatro glândulas do úbe-re de uma vaca.

Os regimes de aplicação da composição farmacêuticada presente invenção dependem do resultado desejado e do a-nimal tratado. São contempladas administrações simples oumúltiplas. De acordo com determinadas modalidades, para otratamento da mastite, o peptideo é administrado entre 1 oumais vezes, preferivelmente 1 a 3 vezes, em um intervalo se-lecionado do grupo consistindo em cerca de 6 horas, cerca de8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 20horas ou cerca de 24 horas. De acordo com outras modalida-des, para a indução da cessação de produção de leite e invo-lução, o peptideo é administrado como um tratamento simples.Um regime de administração simples é altamente desejável,uma vez que aumenta a adequação ao tratamento.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção provê um método para modulação de uma resposta imunea um indivíduo, compreendendo a etapa de administração aoanimal lactante de uma composição farmacêutica compreendendouma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um pep-tideo derivado da caseína, onde a composição está na formade uma solução estéril, límpida, pronta para uso, substanci-almente isenta de micelas possuindo um pH acima de 6,0.De acordo com uma modalidade, a modulação da res-posta imune compreende estimulação e melhora da resposta i-mune inata.

Outros objetivos, aspectos e vantagens da presenteinvenção ficarão claros a partir da descrição e dos desenhosque se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra o aumento na produção de leiteda vaca número 2425 após administração de hidrolisado de ca-seina em comparação aos períodos de lactação anteriores.

A Figura 2 mostra o aumento na produção de leiteda vaca número 2331 após administração de hidrolisado de ca-seína em comparação aos períodos de lactação anteriores.

A Figura 3 mostra o índice de pressão do úbere de10 vacas que receberam tratamento (cessação abrupta da orde-nha + tratamento na seca com antibiótico + tratamento comhidrolisado da caseína) e 10 vacas de controle que secaramdo modo convencional (cessação abrupta da ordenha + trata-mento na seca com antibiótico) durante os últimos 3 dias delactação (Lactação) e nos primeiros sete dias após secarem.As diferenças entre os tratamentos no período pós-seca foramsignificativas em P < 0,01.

A Figura 4 mostra o úbere de 2 vacas no quarto diaapós tratamento com rendimento do leite de 30 L. A Figura 4Amostra uma vaca tratada com C (cessão abrupta da ordenha +tratamento na seca com antibiótico). A Figura 4B mostra umavaca com C+N (cessação abrupta da ordenha + hidrolisado dacaseína + tratamento na seca com antibiótico).A Figura 5 mostra a razão cumulativa média entre onúmero de duração de caminhadas e repouso de 10 vacas quereceberam tratamento (C+N - cessação abrupta da ordenha +tratamento na seca com antibiótico + tratamento com hidroli-sado da caseina) e 10 vacas de controle que secaram no modoconvencional (C - cessação abrupta da ordenha + tratamentona seca com antibiótico) durante os últimos 3 dias de lacta-ção (Lactação) e nos primeiros sete dias após secarem. Asdiferenças entre os tratamentos no período pós-seca foramsignificativas em P < 0,005.

Descrição Detalhada da Invenção

Antes de explicar pelo menos uma modalidade da in-venção em detalhes, deve ser entendido que a invenção nãoestá limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos nadescrição que se segue ou exemplificados pelos Exemplos. Ainvenção é capaz de outra modalidades ou de ser praticada ourealizada de vários modos. Também, deve ser entendido que afraseologia e a terminologia empregadas aqui são para finsde descrição e não devem ser consideradas como limitantes.

Definições

Conforme usado aqui, o termo "caseina" se refere àproteína predominante nos mamíferos não humanos e leite hu-mano, compreendendo os subgrupos aSl, aS2, β e κ.

Conforme usado aqui, o termo aSl, aS2 e β-caseínase refere a proteína da aSl, aS2 e β-caseína de um mamífero,incluindo porém não limitado aos animais de criação (por e-xemplo, gado, carneiro, cabras, éguas, camelo, cervo e búfa-lo) seres humanos e mamíferos marinhos.O termo "peptídeo" é usado através de todo o rela-tório descritivo para designar uma série linear de resíduosde aminoácido conectados um ao outro por ligações peptídi-cas. 0 peptídeo de acordo com os princípios da presente in-venção é diferente da proteína intacta.

Conforme usado aqui, o termo "fosfopeptídeo" de-signa um peptídeo fosforilado na forma de um peptídeo conju-gado onde a porção do não peptídeo é um resíduo do ácidofosfórico. Especificamente, a expressão "fosfopeptídeo dacaseina" ou "CPP" designa um fosfopeptídeo contendo um frag-mento de caseina.

Conforme usado aqui, o termo "cessação da produçãode leite" se refere à cessação transitória bem como à cessa-ção persistente da produção de leite. A cessação transitóriada produção de leite se refere à cessação reversível. A ces-sação persistente se refere à interrupção na lactação que éreversível apenas no parto seguindo a gravidez e por trata-mento com hormônios sexuais. De acordo com os ensinamentosda presente invenção, estímulos mecânicos (isto é, ordenha)podem também reverter uma cessão persistente de produção deleite induzia pelas composições e métodos da invenção.

Conforme usado aqui, o termo "período de seca" serefere à fase antes do parto na qual o leite cessa. De acor-do com as presentes práticas, a aplicação de um período deseca é necessária para completar o processo de involução,após o que a capacidade de secreção de leite é restauradaatravés do parto. Correntemente, o período de seca se encon-tra entre 50 a 70 dias. De modo surpreendente, a presenteinvenção agora mostra que o período de seca pode ser reduzi-do a menos de cerca de 50 dias, preferivelmente a menos decerca de 40 dias, mais preferivelmente para entre cerca de20 dias a cerca de 30 dias, sem afetar negativamente o ren-dimento do leite. De modo surpreendente, a presente invençãomostra que a aplicação do peptideo derivado da caseína paraimpor um período de seca resulta em um aumento significativono rendimento do leite em um período de lactação subsequenteao período de seca.

Conforme usado aqui, o termo "mastite" se refere auma inflamação de uma glândula mamária ou úbere, causada poruma lesão física, introdução de substâncias químicas, vírus,fungos, parasitas ou, mais comumente, uma invasão bacterianae suas toxinas. "Mastite" é usada para descrever todas asformas de tal inflamação, incluindo mastite subclínica eclínica, mastite clínica incluindo mastite branda, severa ecrônica.

Na mastite subclínica, nenhum intumescimento dateta ou úbere é detectado nem existem anormalidades que pos-sam ser observadas no leite. Testes de classificação especi-al, contudo, tais como, o Teste de Mastite da Califórnia(CMT) , Teste de Mastite de Wisconsin (WMT) com base em umaestimativa das contagens de células somáticas e o teste decatalase mostrará alterações na composição do leite Esse ti-po de mastite é geralmente referido como "oculto".

A mastite clínica pode ser branda ou aguda e é ca-racterizada pela presença de leucócitos no leite. A mastiteclínica envolve alterações na aparência do leite incluindopresença de flocos ou coágulos, leite aguado ou outras for-mas incomuns de leite. A mastite clinica branda pode ser a-companhada de outros sintomas incluindo teta ou úbere quen-te, sensível ou intumescido.

A mastite clínica grave envolve os sintomas de te-ta ou úbere quente, sensível, firme o que é bastante dolori-do ao animal lactante. 0 início da mastite clínica grave éabrupto e o animal lactante pode ficar doente mostrando si-nais de febre, pulso rápido, depressão, fraqueza e perda deapetite. Quanto o sistema de lactação integral do animal éafetado, a condição é referida como mastite sistêmica aguda.Os sintomas severos podem também ser acompanhados por cessa-ção da produção de leite.

A mastite crônica é a infecção persistente do úbe-re, tipicamente na forma de mastite subclínica, que ocasio-nalmente pode se desenvolver na forma clínica e de volta pa-ra a forma subclínica. A mastite crônica é caracterizada porgrumo rígido dentro da glândula mamária devido ao estabele-cimento de bactérias e formação de tecido conjuntivo.

Conforme usado aqui, os termos "terapia da vacaseca" ou "terapia de seca" se referem a uma terapia adminis-trada na forma intramamária imediatamente após a última or-dena em um período de lactação de modo a eliminar, tratar ecurar a inflamação de mastite diagnosticada ao final do pe-ríodo de lactação.

Conforme usado aqui, o termo "terapia preventi-va/de profilaxia da vaca seca" se refere a uma terapia admi-nistrada na forma intramamária imediatamente após a últimaordena em um período de lactação, de modo a prevenir a in-flamação de mastite durante o período de seca e após o partodurante o próximo período de lactação.

Conforme usado aqui, o termo "bem-estar dos ani-mais de criação" ou "bem-estar no animal de fazenda" se re-fere à prevenção do sofrimento e aumento da presença de sen-timentos positivos, geralmente denominados conforto ou pra-zer, resultando entre outros, no aumento de períodos de des-canso, um aumento no tempo de ruminação, uma diminuição danecessidade metabólica, uma diminuição na pressão do úberee/ou vazamento da teta, diminuição na incidência de mastitee outras doenças e diminuição no efeito de coxeadura devidoao alto rendimento do leite.

Conforme usados aqui, os termos "composição farma-cêutica límpida", e/ou "solução límpida" se referem a umasolução líquida possuindo valor de turvação inferior a 6NTU. Conforme usado aqui, a turvação é uma unidade de medi-ção de quantificação do grau ao qual a luz, viajando atravésda coluna de água, é difundida pelas partículas orgânicas einorgânicas suspensas. A difusão da luz aumenta com cargasuspensa maior. A turvação é geralmente medida em Unidadesde Turvação Nefelométricas, que substituem a Unidade de Tur-vação Jackson (JTU). 0 método nefelométrico compara a luzdifundida pela amostra e luz difundida por uma solução dereferência.

Conforme usados aqui, os termos "micela" ou "mice-las" se referem a um agregado molecular que constitui umapartícula coloidal, especificamente as micelas da caseínaque contêm principalmente proteína, cálcio e fosfato. As mi-celas também contêm citrato, ions menores, lipase e enzimasplasmina além de soro de leite aprisionado. As micelas dacaseína são estruturas mais porosas, ocupando cerca de 6-12%da fração de volume total do leite. 0 diâmetro das micelasda caseína varia de 90 a 150 nm. A evidência da microscopiade elétron e outros meios sugerem que as micelas são compos-tas de unidades menores denominadas submicelas, possuindodiâmetros de 10 a 20 nm.

Conforme usado aqui, o termo "estéril" se refere auma solução que é isenta de agente patogênico, conforme de-terminado por um teste de esterilidade convencional como éconhecido de um versado na arte, e isento de endotoxina, on-de o nível de endotoxina no produto final é inferior a 0,5EU/mL de acordo com o teste de Lisado Amebócito de Límulo (LAL).

Conforme usado aqui, o termo "peso molecular mé-dio" se refere à média mais ou menos de desvio padrão do pe-so molecular do peptídeo ou proteína, conforme medida por ummétodo conhecido de um versado na arte. Tais métodos inclu-em, por exemplo, eletroforese de gel SDS e cromatografia deexclusão de tamanho em um aparelho, tal como, HPLC, onde aamostra é operada contra padrão com peso molecular conhecido.

Os peptídeos nas composições farmacêuticas dessainvenção preferivelmente possuem um peso molecular médio decerca de 1.000 a cerca de 5.000 Dalton. Assim, a invençãocontempla especificamente peptídeos possuindo entre 10-50resíduos de aminoácido no total. A presente invenção tambémcontempla proteína na qual a seqüência de motivo de núcleo,por exemplo, as seqüências de aminoácido estabelecidas naSEQ ID N0:1, é artificialmente implantada dentro de uma se-qüência de um polipeptídeo, tais como, peptídeos fabricadospela tecnologia de DNA recombinante ou por síntese química.Os peptídeos podem ser obtidos por hidrólise da caseína pararender uma mistura de peptídeos. De acordo com os ensinamen-tos da presente invenção, a mistura de peptídeos pode serusada, ou a mistura pode ser adicionalmente purificada porqualquer método de purificação da proteína conhecido na artepara obter os peptídeos isolados.

Os peptídeos nas composições farmacêuticas da pre-sente invenção podem também ser sintetizados usando métodosbem conhecidos na arte incluindo síntese química e tecnolo-gia de DNA recombinante. A síntese pode ser realizada na so-lução ou por síntese de peptídeo de fase sólida conformedescrito por Merrifield (vide J. Am. Chem. Soc., 85:2149,1964). A fosforilação dos resíduos de serina pode ser reali-zada por qualquer método conforme é conhecido na arte, con-forme descrito, por exemplo, em Meggio e outros, 1991. FEBSLett. 283 (2) :303-306 e Perich JW 1997. Method Enzymol.289:245-246, entre outros.

Em geral, os métodos de síntese de peptídeo com-preendem a adição seqüencial de um ou mais aminoácidos ouaminoácidos apropriadamente protegidos ou derivatizados auma cadeia de peptídeo em desenvolvimento. Normalmente, tan-to o amino ou grupo carboxila do primeiro aminoácido é pro-tegido por um grupo de proteção apropriado. 0 aminoácidoprotegido ou derivatizado pode então ser anexado a um supor-te sólido inerte ou ser utilizado na solução por adição dopróximo aminoácido na seqüência, possuindo o grupo comple-mentar (amino ou carboxila) apropriadamente protegido, sobcondições apropriadas para formar a ligação amida. 0 grupode proteção é então removido desse resíduo de aminoácido a-dicionado recentemente e o próximo aminoácido (apropriada-mente protegido) é então adicionado e assim por diante; tra-dicionalmente esse processo é acompanhado por etapas de la-vagem. Após todos os aminoácidos desejados terem sido liga-dos na seqüência apropriada, quaisquer grupos de proteçãoremanescentes (e qualquer suporte sólido) são removidos se-qüencial ou concorrentemente, para fornecer o peptídeo fi-nal. Pela modificação simples desse procedimento geral, épossível adicionar mais de um aminoácido por vez a uma ca-deia em crescimento, por exemplo, por acoplamento (sob con-dições que não racemizam centros quirais) de um tripeptídeoprotegido com um dipeptídeo apropriadamente protegido paraformar, após desproteção, um pentapeptídeo e assim por diante.

A presente invenção revela métodos para o gerenci-amento geral de um rebanho de animais de criação lactantes,os métodos utilizando peptídeos derivados da caseína.

De acordo com um aspecto, a presente invenção pro-vê um método para reduzir o comprimento do período de secaentre ciclos de lactação, sem afetar negativamente o rendi-mento do leite, por administração a um animal de criaçãolactante de uma quantidade eficaz de pelo menos um peptideoderivado da caseina.

Em uma indústria de laticínios moderna, o animallactante dá a luz uma vez ao ano, tal que a ordenha continuaenquanto o animal está em gestação. A imposição do períodode seca em um animal lactante antes do parto é uma práticarealizada para induzir o processo de involução na glândulamamária, de modo a permitir a restauração do tecido mamárioem direção ao próximo período de lactação. A indução do pe-ríodo de seca é necessária, entre outras coisas, para mantero rendimento de leite semelhante antes e após o parto. Emvacas, o processo natural de involução é completado 21 a 30dias após sua indução por cessação da ordenha. Assim, perío-dos de seca entre 50 e 70 dias vêm sendo um padrão na indús-tria, como período de seca de menos de 40 dias resultaram emrendimento de leite reduzido em 10% a 30% na lactação subse-quente. Recentemente, foi mostrado nas vacas que um períodode seca de 30 dias pode também acontecer sem perda na produ-ção do leite, contudo, apenas para vacas que tenham tido vá-rios partos, usando somatotropina bovina que pode ter efei-tos colaterais indesejados (Annen e outros, ibid.). Um in-ventor da presente invenção e colaboradores mostraram previ-amente que o período do processo de involução pode ser redu-zido em cerca de 3 dias em cabras e vacas lactantes. A pre-sente invenção agora mostra, surpreendentemente, que é pos-sível induzir a involução em todas as quatro glândulas mamá-ria de um úbere de uma vaca lactante dentro de 3 dias.

A presente invenção agora revela que a administra-ção dos peptideos derivados da caseina é eficiente não ape-nas na indução de uma involução rápida, porém também no en-curtamento do período de seca para menos de 50 dias, prefe-rivelmente menos de cerca de 40 dias, mais preferivelmentepara entre cerca de 20 a cerca de 30 dias, sem afetar nega-tivamente o rendimento do leite. Vacas leiteiras modernassão geralmente secas enquanto ainda produzem 20 a 40 litrosde leite por dia. Assim, o encurtamento do período de secapossui um valor econômico significativo. Além disso, a pre-sente invenção agora demonstra que o início do período deseca em um animal lactante pelo método da presente invenção,isto é, por administração de pelo menos um peptídeo derivadoda caseina ao animal lactante ao invés cessação da ordenha,resulta em aumento do rendimento do leite durante o períodode ordenha subseqüente ao período de seca. Sem desejar estarligado a um mecanismo específico, esse aumento pode estarrelacionado a (a) uma diminuição na SCC e seus efeitos nega-tivos no rendimento do leite e/ou (b) uma substituição maisextensiva de população celular epitelial mamária com novascélulas como resultado de apoptose mais extensiva induzidapela administração de pelo menos um peptídeo derivado da ca-seina.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãoprovê um método para aumentar a higiene do leite de um ani-mal de criação lactante, compreendendo administração a umaglândula mamária do animal lactante de uma quantidade tera-peuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo derivado dacaseina.Conforme usado aqui, termo "higiene do leite" serefere à contagem de célula somática (SCC) por mL do leite."Aumento da higiene do leite" se refere a redução da SCC pa-ra igual ou inferior a cerca de 750.000 células por mL doleite, preferivelmente igual ou inferior a cerca de 600.000células por mL do leite, mais pref erivelmente igual ou infe-rior a 400.000 células por mL do leite, mesmo mais preferi-velmente igual ou inferior a cerca de 300.000 células por mLdo leite, mais preferivelmente igual ou inferior a 200.000células por mL do leite. Um fenômeno típico das fazendas delaticínios modernas é o alto rendimento do leite obtido deanimais de lactação, especificamente uma vaca, apesar da in-fecção subclínica do úbere. Tal vaca preferivelmente produzuma alta quantidade de leite, contudo, a infecção em uma oumais glândulas aumenta a SCC no leite a um nível que podeaumentar as contagens totais em um tanque de coleta, assimreduzindo a classificação do leite no nível da fazenda. Aterapia com antibiótico aplicada intramamária durante a lac-tação mostrou resultar em cura bacteriana; contudo, não re-duz a SCC da teta ou da vaca em comparação aos níveis dopré-tratamento. (Cattell e outros, 2001. J. Dairy Sei.84:2036-2043) . A presente invenção mostra agora que a admi-nistração dos peptídeos derivados da caseína resulta em umadiminuição significativa na SCC. Surpreendentemente, a pre-sente invenção agora revela que uma administração simples depelo menos um peptídeo derivado da caseína é suficiente paraobter tal redução na SCC. De acordo com os ensinamentos dapresente invenção, os peptídeos derivados da caseína são ad-ministrados localmente ao canal da teta da glândula mamáriainfectada, de modo restringir o tratamento apenas à glândulainfectada. A atividade local do peptideo em uma glândula in-fectada permite continuação da ordenha de outras glândulasnão infectadas. A higiene do leite é, portanto, significati-vamente aperfeiçoada após o tratamento, como a glândula in-fectada é tipicamente a única a contribuir para SCC elevada.A presente invenção agora mostra que a administração de pelomenos um peptideo derivado da caseina é eficaz na redução daSCC em vacas infectadas subclinicamente e a uma extensão me-lhor em vacas infectadas clinicamente. Uma vez que o efeitodo tratamento pode ser restrito à glândula tratada, um aper-feiçoamento imediato na qualidade do leite é obtido, sem anecessidade de descarte do leite da glândula não infectada.Isso é importante, porque o leite descartado é uma das maio-res causas de perdas econômicas nas vacas leiteiras possuin-do mastite clinica (DeGraves e Fetrow, 1993. Vet. Clin. No-th. Am. Food Animal Pract. 9:421-434). A administração podeser a uma glândula mamária, bem como a todas as glândulasmamárias, por exemplo, a todas as quatro glândulas mamáriasde uma vaca lactante. Inesperadamente, o leite obtido daglândula tratada no próximo ciclo de lactação compreendecontagens de células somáticas menores. De acordo com deter-minadas modalidades, o peptideo derivado da caseina é admi-nistrado a uma glândula mamária ou glândulas de um animallactante durante o período de seca, de modo a aumentar a hi-giene do leite no próximo período de lactação.

Os métodos da presente invenção podem ser pratica-dos com um tipo de um peptideo derivado da caseina, ou comvários tipos de peptideo derivados da caseina. De acordo comdeterminadas modalidades, os métodos da presente invençãosão praticados com as composições farmacêuticas límpidas,pronta para uso da presente invenção, descritas aqui a seguir.

De acordo com determinadas modalidades adicionais,o peptideo derivado da caseina compreende fosfopeptideos. Deacordo com as modalidades adicionais, o fosfopeptideo com-preende uma seqüência de aminoácido conforme estabelecida naSEQ ID NO:1. De acordo com modalidades adicionais, o fosfo-peptídeo é selecionado do grupo consistindo em um fosfopep-tídeo derivado da β-caseína, um fosfopeptideo derivado da a-Sl-caseína e um fosfopeptideo derivado da aS2-caseína. Deacordo com determinadas modalidades preferidas, o fosfopep-tídeo empregado de acordo com os métodos da presente inven-ção compreende uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo na SEQ ID NO:2 à SEQ ID NO:5, e análogos,derivados e fragmentos das mesmas, como esses termos são de-finidos aqui. Os métodos da presente invenção podem ser pra-ticados com peptídeos derivados da hidrólise da caseina, co-mo hidrolisado da caseina não purificada, hidrolisado da ca-seina purificada e peptídeos purificados do hidrolisado dacaseina. Adicionalmente, os métodos da presente invenção po-dem ser praticados com peptídeos sintéticos derivados da ca-seina. Os peptídeos derivados da caseina podem ser incorpo-rados a uma composição farmacêutica.

De acordo ainda com outro aspecto, a presente in-venção provê um método para prevenir o sofrimento associadoa infecção da glândula mamária ou cessação abrupta da orde-nha em um animal de criação lactante, compreendendo adminis-tração à glândula mamária do animal lactante de uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptideo deri-vado da caseina, pelo que, aperfeiçoamento o bem-estar doanimal lactante.

De acordo com determinadas modalidades, o aperfei-çoamento do bem-estar do animal lactante é medido por redu-ção no número de caminhadas diárias e pelo prolongamento doperíodo de repouso diário do animal. De acordo com uma moda-lidade, pelo menos um peptideo derivado da caseina é admi-nistrado a uma glândula mamária infectada. De acordo com ou-tra modalidade, pelo menos um peptideo é administrado a umaglândula mamária não infectada.

A presente invenção revela adicionalmente que, i-nesperadamente, a filtração das composições turvas compreen-dendo peptídeos derivados da caseina através de filtros de0,1 pm a cerca de 0,5 μπ\ preferivelmente através de filtroabaixo de 0,25 μιη resulta em uma solução límpida, que é al-tamente desejável para uso farmacêutico.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção provê uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptideoderivado da caseina, onde a composição está na forma de umasolução límpida, estéril, pronta para uso, substancialmenteisenta de micelas, possuindo um pH acima de 6,0. De acordocom uma modalidade, a composição farmacêutica compreende a-dicionalmente um diluente farmaceuticamente aceitável, exci-piente ou veiculo. De acordo com determinadas modalidades, acomposição compreende uma quantidade terapeuticamente eficazde pelo menos um fosfopeptideo derivado da caseina. De acor-do com modalidades adicionais, a composição farmacêuticacompreende fosfopeptideos possuindo um peso molecular médiode cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Dalton. De acordo com de-terminadas modalidades correntemente preferidas, o peso mo-lecular médio dos peptideos nas novas composições farmacêu-ticas da presente invenção é de cerca de 2.500 Dalton.

Conforme empregada aqui, a frase "peptideos deri-vados da caseina" se refere aos peptideos que são produtosde clivagem da caseina (referidos aqui como peptideos deri-vados da caseina natural), peptideos sintéticos, quimicamen-te sintetizados para corresponder às seqüências de aminoáci-do das unidades de caseina (referidos aqui como peptideossintéticos derivados da caseina) e peptideos semelhantes(homólogos) à caseina, por exemplo, peptideos CARACTERIZADOSpor uma ou mais substituições de aminoácido, inserções oudeleções, tal como, porém não limitado a substituições per-missiveis, contanto que pelo menos 70%, pelo menos 80% maispreferivelmente pelo menos 90% de similaridade sejam manti-dos e homólogos funcionais dos mesmos. Os termos "homólogos"e "homólogos funcionais" são empregados aqui significandopeptideos com quaisquer inserções, deleções e substituiçõesque não afetem a atividade biológica do peptideo conformedescrito aqui.

Conforme usada aqui, a frase "combinação dos mes-mos" é definida como qualquer um dos peptideos mencionadosacima, derivados de α ou β-caseína, combinados em uma mistu-ra com um ou mais peptideos adicionais, não idênticos, deri-vados da oc ou β-caseína. Conforme usado aqui, o termo "mis-tura" conforme definido como uma combinação não covalente depeptideos existindo em proporções variáveis um com relaçãoao outro.

De acordo com determinadas modalidades, o peptídeoderivado da caseína é um fosfopeptideo compreendendo o moti-vo ativo Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ ID N0:1). Deveser entendido que qualquer peptídeo compreendendo esse moti-vo - se derivado da caseína, de uma proteína que não caseí-na, sintetizado de forma sintética ou produzido por tecnolo-gia recombinante, que mantenha as atividades biológicas dospeptideos como são descritos aqui, também está englobado noescopo da presente invenção. Os fosfopeptídeos da presenteinvenção são exemplificados por peptideos possuindo uma se-qüência de aminoácido conforme estabelecido em qualquer umadas SEQ ID NOs:2-25 conforme listadas a seguir:

SEQ ID NO. Seqüência Derivada de Número do Re- síduo

SEQ ID NO: 2 RELEELNVPGEIVES(P)LS(P)S(P)EESITR β" caseína 1-25

SEQ ID NO: 3 QMEAESIS(P)S(P)S(P)EEIVPDSVEQK aSl- caseína 59-79

SEQ ID KNTMEHVS(P)S(P)S(P)EESIISNETYK aS2- 1-21<table>table see original document page 45</column></row><table>

A presente invenção também engloba composiçõesfarmacêuticas compreendendo análogos, derivados ou fragmen-tos dos peptideos listados acima, à medida que os análogos,derivados e fragmentos mantêm sua atividade biológica con-forme descrito aqui e a composição farmacêutica está na for-ma de uma solução límpida conforme descrito aqui, e os aná-logos de peptídeo, derivados e fragmentos dos mesmos possuemum peso molecular de cerca de 1.000 a 5.000 Dalton.

O termo "análogo" inclui qualquer peptídeo compre-endendo seqüência alterada por substituições de aminoácido,adições, deleções ou modificações químicas dos peptideos dainvenção e que mantêm a atividade biológica do peptídeo."Substituições de aminoácido" significa que resíduos de ami-noácido funcionalmente equivalentes são substituídos por re-síduos dentro da seqüência resultando em uma alteração si-lenciosa. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidodentro da seqüência podem ser substituídos por outro aminoá-cido de uma polaridade semelhante, que atua como um equiva-lente funcional, resultando em uma alteração silenciosa.Substitutos para um aminoácido dentro da seqüência podem serselecionados de outros elementos da classe a qual o aminoá-cido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hi-drófobos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, pro-lina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidosneutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína,tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregadospositivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidi-na. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluemácido aspártico e ácido glutâmico. Tais substituições sãoconhecidas como substituições de conservação. Adicionalmen-te, uma substituição não conservadora pode ser feita em umaminoácido que não contribua para a atividade biológica dopeptideo. Será apreciado que a presente invenção engloba a-nálogos de peptideo, onde pelo menos um aminoácido é substi-tuído por outro aminoácido para produzir um análogo ativo deum peptideo da invenção possuindo estabilidade aumentada oumeia vida útil mais longa, em comparação ao peptideo listadoaqui.

Embora os resíduos de aminoácido das seqüências depeptideo estabelecidas na SEQ ID N0:1 a 5 estejam todas naforma isomérica "L", resíduos na forma ísomérica "D" podemsubstituir qualquer resíduo de L-aminoácido, à medida que oanálogo ao peptideo mantenha sua atividade. Métodos de pro-dução de um análogo ao peptideo de D-aminoácido retro-inverso onde o peptideo é constituído com os mesmos aminoá-cidos conforme revelado, porém pelo menos um ou mais aminoá-cidos incluindo todos aminoácidos sejam D-aminoácidos, sãobem conhecidos na arte. Quando todos os aminoácidos no aná-logo ao peptideo são D-aminoácidos, e os términos N e C doanálogo ao peptideo são revertidos, o resultado é um análogopossuindo os mesmos grupos estruturais estando nas mesmasposições como na forma de L-aminoácido do peptideo. Contudo,o análogo ao peptideo é mais estável à degradação proteolí-tica e é, portanto, útil em muitas aplicações citadas aqui.

O termo "derivado" se refere a um peptideo possu-indo uma seqüência de aminoácido que compreende a seqüênciade aminoácido do peptideo da invenção, onde um ou mais dosresíduos de aminoácido são submetidos à derivatizações quí-micas por uma reação de cadeias laterais ou grupos funcio-nais, onde tais derivatizações não destroem a atividade doderivado de peptideo. A derivatização química dos resíduosde aminoácido inclui, porém não está limitada a glicosila-ção, oxidação, redução, miristilação, sulfatação, acilação,acetilação, ADP-ribosilação, amidação, ciclização, formaçãode ligação de dissulfeto, hidroxilação, iodonação e metilação.

Os derivados de peptideo de acordo com os princí-pios da presente invenção também incluem modificações de li-gação, incluindo, porém não limitado a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH e CF-CH e modifi-cações de estrutura. Ligações de peptideo (-C0-NH-) dentrodo peptideo podem ser substituídas, por exemplo, por liga-ções N-metiladas (-N(CH3)-CO-); ligações éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N); ligações cetometileno (-CO-CH2-); ligações α-aza(-NH-N(R)-CO), onde R é qualquer grupo alquila, por exemplo,metila; ligações carba (-CH2-NH-); ligações hidroxietileno(-CH(OH)-CH2-); ligações tioamida (-C=S-NH-); ligações ole-fínicas duplas (-CH=CH-); e derivados de peptideo (-N (R)-CH2-CO-) onde R é a cadeia lateral "normal", naturalmentepresente no átomo de carbono. Essas modificações podem ocor-rer em qualquer uma das ligações ao longo da cadeia de pep-tideo e mesmo em várias (2-3) ao mesmo tempo.

A presente invenção também engloba aqueles peptí-deos onde grupos aminoácido livres foram derivatizados paraformar sais de amina, incluindo porém não limitado aos clo-ridratos, grupos p-tolueno sulfonila, grupos carbobenzóxi,grupos t-butiloxicarbonila, grupos cloroacetila ou gruposformila. Grupos carboxila livre podem ser derivatizados paraformar, por exemplo, sais, ésteres metilico e etilico ou ou-tros tipos de ésteres ou hidrazidas. Grupos hidroxila livrepodem ser derivatizados para formar, por exemplo, derivadosde o-acila ou o-alquila. O imidazol nitrogênio da histidinapode ser derivatizado para formar N-im-benzilistidina.

Também são incluídos como derivados químicos aque-les peptídeos, que contêm um ou mais derivados de aminoácidoocorrendo naturalmente de vinte resíduos de aminoácido pa-drão. Por exemplo: 4-hidroxipropila pode ser substituída porprolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metilistidina pode ser substituída por histidina; hemoresinapode ser substituída por serina e ornitina pode ser substi-tuída por lisina. Os peptídeos também podem conter aminoáci-do não natural. Exemplos não limitantes de aminoácidos nãonaturais são norleucina, ornitina, citrulina, ácido diamino-butírico, homoserina, homocisteína, isopropil Lys, 3 — (2' —naftil)-Al, nicotinil Lys, ácido amino isobutírico e 3-(3'-piridíl-Ala). Os peptídeos podem também conter cadeias late-rais não proteína. Além do acima, os peptídeos da presenteinvenção também podem incluir um ou mais monômeros não ami-noácido ou oligômeros (por exemplo, ácidos graxos, carboi-dratos complexos e semelhantes). Também está englobado qual-quer peptideo possuindo uma ou mais adições de resíduos deaminoácido em relação às seqüências dos peptídeos listadosaqui acima, à medida que a atividade de requisito e preferi-velmente o peso molecular são mantidos. Os resíduos de ami-noácido podem ser adicionados ao término amino e/ou términocarbóxi e/ou juntamente com a seqüência de peptideo.

Um derivado de peptideo de acordo com a presenteinvenção pode também ser um peptideo cíclico. A ciclizaçãopode ser obtida, por exemplo, através da formação de ligaçãode amida, por exemplo, por incorporação de Glu, Asp, Lys,Orn, ácido di-amino butírico (Dab), ácido di-amino propiôni-co (Dap) em várias posições na cadeia (ligações -CO-NH ou -NH-CO). A estrutura para a ciclização da estrutura pode tam-bém ser obtida através da incorporação de aminoácidos modi-ficados das fórmulas H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH ou Η-Ν ( (CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2, onde η = 1-4, e adicionalmente ondeR é qualquer cadeia lateral natural ou não natural de um a-minoácido. São também contempladas ciclizações de estruturapara cadeia lateral e de cadeira lateral para cadeia lateral.

A ciclização através da formação de ligações S-Svia incorporação de dois resíduos de Cys é também possível.A ciclização da cadeia lateral para cadeia lateral pode serobtida através da formação de uma ligação de interação dafórmula - (-CH2) n-S-CH2-C-, onde η = 1 ou 2, que é possível,por exemplo, através da incorporação de Cys e homoCys e rea-ção de seu grupo SH livre com, por exemplo, Lys, Orn, Dab ouDap bromoacetilados.

O termo "fragmento" conforme usado aqui, se referea um peptideo possuindo uma ou mais deleções de resíduos deaminoácido em relação às seqüências de peptídeos listadosaqui, à medida que a atividade de requisito for mantida. Osresíduos de aminoácido podem ser deletados dos terminais a-mino e/ou carbóxi e/ou ao longo da seqüência de peptideo.

Os fragmentos de peptideo podem ser produzidos porsíntese química, tecnologia de DNA recombinante ou por su-jeição dos peptídeos listados aqui a pelo menos um agente declivagem. Um agente de clivagem pode ser um agente de cliva-gem químico, por exemplo, brometo de cianogênio ou uma enzi-ma, por exemplo, uma exoproteinase ou endoproteinase. As en-15 doproteinases que podem ser usadas para clivar os peptídeosinvenção incluem tripsina, quimiotripsina, papaína, V8protease ou qualquer outra enzima conhecida na arte paraproduzir fragmentos proteolíticos.

Conforme descrito acima, os peptídeos da presenteinvenção podem ser obtidos por hidrólise da caseína ou ospeptídeos podem ser obtidos sinteticamente.

A hidrólise da caseína é realizada tipicamente pordigestão com tripsina ou extratos pancreáticos. A caseínanão digerida é então separada da solução contendo peptideo,que é adicionalmente purificada de outras impurezas por ummétodo apropriado como é conhecido na arte e como exemplifi-cado aqui abaixo. De acordo com determinadas modalidades dapresente invenção, a purificação e preparação da composiçãofarmacêutica pronta para uso, límpida, compreende filtraçãoda solução. De acordo com algumas modalidades correntementepreferidas, a filtração é realizada através de filtro de0,2-0,5 μπι usando gás inerte incluindo, por exemplo, Nitro-gênio e Aragon em uma pressão baixa. Preferivelmente, a fil-tração é realizada através de filtro de 0,22 μπι. Surpreen-dentemente, a presente invenção demonstra que a filtração deuma preparação de hidrolisado de caseina através de uma mem-brana com um tamanho de poro abaixo de 0,5 μπι, preferivel-mente a cerca de 0,2 μπι, provê uma solução límpida. A apa-rência límpida da solução é principalmente devido à remoçãodo restante das micelas da caseina não digeridas. As partí-culas coloidais de formação da micela da caseina fornecem acor branca, não transparente do leite. Deve ser entendidoque as composições farmacêuticas possuindo as mesmas carac-terísticas da composição farmacêutica da presente invenção,isto é, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficazde pelo menos um peptídeo derivado da caseina, estando naforma de uma solução límpida, substancialmente isenta de mi-celas, onde pelo menos um peptídeo possui um peso molecularna faixa de 1.000-5.000 Dalton, obtidas por outros métodosconforme conhecidos na arte, são também contempladas dentrodo escopo da presente invenção.

As composições farmacêuticas da presente invençãosão muito estáveis. Conforme usado aqui, o termo "estável"se refere à atividade de um peptídeo derivado da caseina a-pós incubação a uma determinada temperatura, que retém pelomenos 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95% oumais da atividade inicial do peptideo.

Os fosfopeptideos dentro das composições farmacêu-ticas da invenção são estáveis em temperaturas altas bem co-mo baixas. Os fosfopeptideos dentro da composição farmacêu-tica podem ser mantidos congelados sem perda substancial daatividade. Além disso, a composição farmacêutica pode seraquecida para até 70% por cerca de 15 minutos, sem perder aatividade.

A presente invenção provê composição farmacêuticacompreendendo peptideos derivados da caseina, que está naforma de uma solução pronta para uso, límpida, estéril. Essacomposição é vantajosa para os produtos derivados da caseinacorrentemente disponíveis, como a clareza da solução permiteuma detecção fácil e rápida de qualquer contaminação, espe-cificamente contaminação microbiana. A solução pronta parauso não requer etapas de reconstituição antes da administra-ção, em comparação a muitas composições conhecidas até aqui,providas na forma de um pó. De acordo com determinadas moda-lidades, as composições farmacêuticas da presente invençãosão destinadas ao uso veterinário, tal que a composição far-macêutica seria administrada a um grande número de indiví-duos. As composições farmacêuticas da presente invenção sa-tisfazem as necessidades de tais condições, provendo uma de-tecção fácil da contaminação e uma formulação pronta para uso.

A limpidez da solução pode ser medida por quais-quer métodos conhecidos dos versados na arte. De acordo comdeterminadas modalidades, a limpidez da solução é determina-da de acordo com seu valor de turvação. Conforme usado aqui,uma solução "límpida" é uma solução possuindo um valor deturvação inferior a 6 NTU.

O termo "composição farmacêutica" se destina, emum sentido mais amplo aqui, a incluir preparações contendouma composição de proteína de acordo com a presente invençãousada não apenas para fins terapêuticos, porém, também comoreagentes ou diagnóstico como é conhecido na técnica. A com-posição farmacêutica destinada ao uso terapêutico conteriauma quantidade terapêutica de um peptídeo derivado da caseí-na, isso é aquela quantidade necessária para medidas de saú-de preventiva ou curativa. Se a composição farmacêutica forempregada como um reagente ou de diagnóstico, então ela con-terá quantidades de reagente ou diagnóstico do peptídeo de-rivado da caseína.

De acordo com determinadas modalidades, a concen-tração de proteína da composição farmacêutica da presenteinvenção é de cerca de 10 ng/mL a cerca de 15 mg/mL.

O termo "composição farmacêutica" se refere adi-cionalmente à preparação de um ou mais peptídeos descritosaqui acima, com outros componentes químicos, tais como, di-luentes farmaceuticamente aceitáveis, veículos e excipien-tes. A finalidade de uma composição farmacêutica é facilitara administração de um composto a um organismo.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" con-forme usado aqui, se refere a um veículo ou diluente que nãocausa irritação significativa a um organismo e não anula aatividade biológica e propriedades do composto administrado.Exemplos não limitantes de veículos são: água, propilenoglicol, salmoura, emulsões e misturas de solventes orgânicoscom água. 0 termo "excipiente" conforme usado aqui se referea uma substância inerte adicionada a uma composição farma-cêutica para adicionalmente facilitar a administração docomposto. Exemplos não limitantes de excipientes incluemcarbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares etipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vege-tais e polietileno glicóis.

Técnicas para formulação e administração de medi-camentos podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceuti-cal Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edi-ção, o conteúdo da mesma sendo incorporado aqui como refe-rência. De acordo com determinadas modalidades correntementepreferidas, as composições farmacêuticas da presente inven-ção são formuladas para administração parenteral, por exem-plo, para administração intracanal, especificamente para in-jeção ou infusão dentro do canal da teta de uma glândula ma-mária. Para injeção, os peptideos da invenção podem ser for-mulados nas soluções aquosas, preferivelmente em tampões fi-siologicamente compatíveis, tais como, solução de Hank, so-lução de Ringer, ou em um tampão de salmoura fisiológica comou sem solventes orgânicos, tais como, propileno glicol epolietileno glicol. A administração intracanal a um canal dateta de uma glândula mamária não é definida em termos de ad-ministração tópica ou sistêmica. Conforme revelado aqui, aadministração intracanal da composição farmacêutica da in-venção pode ter um efeito local, por exemplo, por indução dainvolução apenas na glândula mamária tratada, e pode, por-tanto, ser referida como administração tópica. As composi-ções farmacêuticas podem ser administradas topicamente comum gel, ungüento, creme, emulsão ou formulação de liberaçãoprolongada incluindo um emplastro transdérmico. A presenteinvenção engloba adicionalmente a administração sistêmica,tanto parenteral quanto oral.

De acordo com outro aspecto, a presente invençãoprovê uma composição farmacêutica compreendendo uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptideo deri-vado da caseina na forma de um pó liofilisado, onde o pó éreconstituído em um líquido antes do uso para formar uma so-lução límpida, substancialmente isenta de micelas e possuin-do um pH acima de 6,0.

De acordo com um aspecto adicional, a presente in-venção provê uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptideoderivado da caseina, onde a composição está na forma de umasolução límpida, estéril, pronta para uso, substancialmenteisenta de micelas possuindo um pH acima de 6,0, para trata-mento de uma glândula mamária de um animal lactante, indu-zindo cessão transitória de produção do leite e induzindocessão persistente da produção de leite.

Ainda de acordo com um aspecto adicional, a novacomposição farmacêutica da presente invenção é útil paraprevenção e tratamento de infecção ou reversão da infecção.De acordo com modalidades adicionais, a composição farmacêu-tica compreende fosfopeptídeos possuindo um peso molecularmédio de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Dalton. De acordocom determinadas modalidades correntemente preferidas, o pe-so molecular médio dos peptideos é de cerca de 2.500 Dalton.

De acordo com determinadas modalidades, o animallactante é selecionado do grupo de animais consistindo emseres humanos, vacas, cabras, carneiros, búfalos, camelos,burros, lhamas, cavalos, porcos, gatos e cães.

De acordo com determinadas modalidades corrente-mente preferidas, o animal lactante é um ser humano. Nas úl-timas décadas, a alimentação no seio declinou em todas associedades tecnologicamente avançadas do mundo e também,mesmo a uma extensão menor, nos países em desenvolvimento.Muitas mulheres escolhem não amamentar seus bebes ou cessama amamentação após um período curto de tempo. Outras são im-pedidas de amamentar em razão de várias razões médicas, in-cluindo mulheres que sofrem de determinadas doenças trans-missíveis ou não transmissíveis, um exemplo específico sendoo de mulheres portando HIV. Recomendação corrente das auto-ridades de saúde para portadoras de HIV é manter a alimenta-ção do seio por apenas cerca de 10 semanas após a liberação,após o que apenas os substitutos do leite deverão ser forne-cidos. As mulheres que dão a luz a bebês prematuros, ou be-bes terminais que não sobrevivem são também impedidas de a-mamentar. Em todos tais casos, o leite é produzido pelaglândula mamária, porém não se apresenta como leite. Tal es-tase do leite está associada ao intumescimento da mama a umgrau que causa agonia conspícua, ambos física e psicologica-mente. Além disso, a estase do leite é freqüentemente asso-ciada ao vazamento da secreção mamária, o que aumenta subse-qüentemente o risco de adquirir infecção intramamária. Ascomposições farmacêuticas e métodos da presente invenção as-sim respondem à necessidade de uma indução rápida e eficien-te da involução e cessão da produção de leite de modo preve-nir as condições indesejáveis descritas acima.

De acordo com as modalidades adicionais, atuais epreferidas, o animal é um animal de criação selecionado dogrupo consistindo em gado, búfalo, cabra e carneiro.

As novas composições farmacêuticas da presente in-venção são eficazes para induzir cessação transitória oupersistente do leite. 0 efeito transitório no rendimento doleite pode ser obtido em uma glândula mamária de um animallactante em resposta a uma aplicação simples, tipicamentepor injeção direta ou infusão dentro da cavidade glandularatravés do canal da teta da composição farmacêutica da in-venção. Tipicamente, a injeção simples ou infusão causa umdeclínio acentuado na produção de leite após cerca de 8 ho-ras. A presente invenção agora revela que uma administraçãosimples das composições farmacêuticas da presente invençãopode também causar cessação do leite e involução persisten-te. A cessação da produção de leite ocorre apenas em umaglândula tratada; este fenômeno é de importância significa-tiva, como o leite das glândulas não tratadas pode continuarde modo a limitar a perda do rendimento do leite. Alternati-vamente, caso desejado, todas as glândulas mamárias de umanimal lactante podem ser tratadas para induzir a cessação da produção de leite.O processo de involução induzida por composiçõesfarmacêuticas da presente invenção é mais rápido e sincroni-zado em comparação à involução induzida por cessação da or-denha, e a produção de leite pode ser obtida por estímulosmecânicos como a ordenha. Um recomeço da produção de leitetambém ocorre, como no processo natural de involução, apósuma gravidez e parto subseqüente. A involução rápida induzi-da pelas composições da presente invenção não interfere coma reconstrução do tecido da glândula mamária e restauraçãoda capacidade de secretar leite após o parto.

As novas composições farmacêuticas da presente in-venção são adicionalmente úteis para o tratamento de uma in-fecção da glândula mamária. Conforme usado aqui, o termo"tratamento" se refere à prevenção da infecção, bem como otratamento de uma glândula infectada de modo a reverter ainfecção e curar a glândula mamária, ambos em mamíferos nãohumanos e humanos.

As composições farmacêuticas da presente invençãosão úteis no tratamento de uma ampla variedade de infecçõesmicrobianas, incluindo infecções causadas por bactériasgram-positivas, bactérias gram-negativas, fungos, micoplasmae vírus.

De acordo com determinadas modalidades, as compo-sições farmacêuticas são úteis no tratamento de mastite, es-pecificamente em animais de criação incluindo gado, carnei-ros, búfalos e cabras.

As mastites clínica e subclínica são estados in-flamatórios do úbere resultando principalmente da infecçãobacteriana. A mastite possui uma variedade de etiologiasbacterianas e causa grandes perdas na produção de leite anu-almente. Os microorganismos patogênicos que mais freqüente-mente causam a mastite podem ser divididos em dois gruposcom base em sua fonte: agentes patogênicos ambientais e a-gentes patogênicos contagiosos. Os agentes patogênicos con-tagiosos principais são Streptococcus agalactiae, Staphylo-coccus aureus, Staphylococcus coagulase-negativo (CNS) eE.coli. Com a exceção de algumas infecções micoplásmicas,que podem originar em outros sítios do corpo e se espalharemsistemicamente, esses cinco tipos principais de microorga-nismos entram na glândula mamária através do canal da teta.Os organismos contagiosos são bem adaptados para sobrevive-rem e crescerem na glândula mamária e freqüentemente causaminfecções que duram semanas, meses ou anos. A glândula in-fectada é a fonte principal desses organismos em um rebanholeiteiro e a transmissão de agentes patogênicos contagiosospara tetas não infectadas e vacas ocorre principalmente du-rante o período da ordenha.

A mastite clínica é facilmente diagnosticada devi-do a alterações marcantes na composição e aparência do lei-te, produção de leite diminuída, temperatura corpórea eleva-da e intumescimento, vermelhidão ou febre nas glândulas in-fectadas. A mastite subclínica, a forma mais prevalecente dadoença, freqüentemente permanece não detectada porque os si-nais não são prontamente aparentes. Muitas IMI subclínicastendem a persistir, resultando em uma diminuição na qualida-de do leite devido à SCC elevada do leite, e também devido àdiminuição na produção do leite. IMI localizada em uma glân-dula mamária simples pode conduzir ao desenvolvimento demastite clinica levando a dispersão de determinados agentespatogênicos da mastite das tetas mamárias infectadas para asnão infectadas. Em contraste com a mastite clinica, não égeralmente aconselhável tratar os animais de criação possu-indo mastite subclinica por administração de antibiótico du-rante a lactação (Gruet e outros, 2001. Adv. Drug DeliveryVer. 50:245-259) porque a razão de cura é baixa e porque ocusto do tratamento e o período de retirada de 4-5 dias doleite tornam o mesmo economicamente injustificado (Yamagatae outros, 1987. J. Am. Vet. Med. Assoc. 191:1556-1561). Ascomposições farmacêuticas da presente invenção podem ser ad-ministradas durante o período de lactação. Conforme descritoaqui, as composições da invenção podem ter um efeito local,tal que o tratamento pode ser administrado apenas a(s) glân-dulas mamárias infectadas, embora a ordenha da(s) glându-la (s) não infectada(s) possa continuar, reduzindo a perda doleite a um mínimo.

Para o tratamento da mastite, a administração dedoses repetidas das composições farmacêuticas da invenção emuma glândula mamária infectada pode ser necessária. Tipica-mente, a administração é repetida pelo menos uma vez, prefe-rivelmente entre 1-10 vezes, mais preferivelmente 1 a 3 ve-zes, em um intervalo selecionado do grupo consistindo emcerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cercade 16 horas, cerca de 20 horas e cerca de 24 horas durante 1à 10 dias, preferivelmente 1 à 3 dias.De acordo com determinadas modalidades, as novascomposições farmacêuticas da presente invenção são adminis-tradas para o tratamento de infecções no úbere durante o pe-ríodo de seca. O tratamento pode ser direcionado às glându-las infectadas (terapia da vaca seca) ou como uma terapiaprofilática (terapia preventiva da vaca seca). O tratamentodas infecções no início e durante o período de seca é vanta-joso em relação ao tratamento durante a lactação uma vez quepermite administração da composição farmacêutica não apenasa uma glândula infectada possuindo sinais visíveis de infec-ção, porém para todas as glândulas do úbere. Tal administra-ção resulta na erradicação da infecção existente e impedeaquisição de novas infecções durante o período de seca. Alémdisso, a presente invenção demonstra que a administração dascomposições farmacêuticas da invenção durante o período deseca diminui dramaticamente a incidência de infecção no pe-ríodo de lactação subseqüente. As composições farmacêuticaspodem ser administradas a uma glândula mamária identificadacomo possuindo mastite clínica ou subclínica, a uma glândulanão infectada como tratamento profilático, ou a ambas.

De acordo com modalidades adicionais, a nova com-posição farmacêutica da presente invenção é administrada emcombinação com um tratamento antimicrobiano adicional, sele-cionado do grupo consistindo, porém não limitado ao trata-mento com antibióticos, bactericidas, antiinflamatórios es-teróides e não esteróides, com um imunomodulador e vacina-ção. De acordo com uma modalidade, a composição farmacêuticada presente invenção e o tratamento antimicrobiano adicionalsão co-administrados, tanto como uma composição farmacêuticasimples, combinada ou como composições separadas. Alternati-vamente, a composição farmacêutica da presente invenção éadministrada como um pré-tratamento seguido por aplicação detratamento antimicrobiano adicional e vice-versa.

Os exemplos que se seguem são apresentados de modoa ilustrar mais completamente as modalidades preferidas dainvenção. Eles não devem de modo algum ser vistos como limi-tando o amplo escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação da Composição FarmacêuticaCaseina bovina comercial (por exemplo, da Sigma)foi dissolvida (100 g/litro) em 25 mM de tampão Tris, pH 8,e digerida com tripsina (500 U/litro) por 4 horas a 37°C. Asolução foi então acidificada para pH 4,7 com HCl, e a case-ina não digerida foi transformada em microesferas por cen-trifugação. O sobrenadante foi fervido por 15 minutos, res-friado para temperatura ambiente e ajustado para pH 7 comsolução de NaOH. O material que foi dissolvido nessas condi-ções foi removido por centrifugação e descartado. Alternati-vamente, um hidrolisado de caseina comercial de classifica-ção alimentícia foi empregado como um material de partida e1-40 g/litro foram dissolvidos em salmoura ou água rendendopH de aproximadamente 7,2. A água e a salmoura usadas atra-vês de todo o processo estão de acordo com as monografiasUSP para "Water for Injection". A solução foi então aquecidapara 40-60°C e após resfriamento, filtrada através de fil-tros de 5 micra usando gás inerte, tal como, nitrogênio ouargônio em pressão baixa (6,9 a 41,3 kPa) . Várias bateladasprecisaram de uma filtração adicional através de filtros de3 micra. 0 filtrado foi então aquecido a 50°C a 70°C de modoa aumentar a solubilidade dos peptideos.

A solução turva resultante foi então filtrada a-través de um filtro de 0,2 micron usando gás inerte, tal co-mo nitrogênio ou argônio em pressa baixa (6,9 a 41,3 kPa).Essa etapa de filtração removeu todas as micelas da caseinarestantes, tal que a solução obtida após a filtração eralímpida. O filtrado foi amostrado e ensaiado quanto ao teorde peptídeo total pelo método Bradford e a concentração deproteína foi ajustada para 5-15 mg/mL. 0 pH da solução foientão ajustado tanto com HCl concentrado (classificação doreagente ACS) quanto 1,0 NaOH normal para cerca de 7,3-7,6 ea solução foi filtrada novamente através de filtros de 0,2micron com gás inerte em pressão baixa. 0 filtrado final(cerca de 10 mL) foi então enchido e vedado em ampolas devidro esterilizado de 20 mL enquanto em atmosfera de gás inerte.

Com determinadas fontes de hidrolisado de caseiacomerciais, uma etapa de pré-filtração através de filtro de5 micra usando gás inerte, tal como, nitrogênio ou argônioem pressão baixa (6,9 a 41,3 kPa) pode ser necessária a fimde impedir o entupimento do filtro de 0,2 micron ao final doprocesso.

A limpidez da solução foi determinada pelo turbi-dímetro (Micro 100 General Purpose Turbidometer, Metex Coo-peration, Toronto, Canadá). A solução obtida era límpida,possuindo uma NTU de 4,0. A composição resultante é denomi-nada aqui como MLTS-2.

Exemplo 2: Tratamento da Mastite

Exemplo 2.1: Terapia seca aplicada às vacas com mastite

População de vacas

Trinta e duas vacas participaram do estudo (8 ca-sos, isto é, vacas recebendo tratamento, versus 24 contro-les, escolhidas de acordo com o projeto de estudo, vide a-baixo). As oito vacas diagnosticadas com mastite clinicae/ou subclinica, de acordo com diagnóstico bacteriológico,foram admitidas de modo a receberem tratamento com a compo-sição da invenção preparada conforme descrito no exemplo 1acima (MLTS-2) . Vinte e quatro vacas serviram como controle,das quais 6 foram diagnosticadas como tendo mastite como a-cima e 18 não estavam infectadas. A mastite clinica é carac-terizada por sinais visíveis incluindo flocos ou coágulos nosangue, aumento acentuado na SCC, febre, pulso rápido, perdade apetite, desidratação e depressão. A teta infectada ouúbere pode também estar intumescido. A mastite subclinica écaracterizada por declínio da produção de leite, qualidadereduzida do leite e SCC elevada que é detectada por aumentono volume da contagem de células somáticas no tanque. As va-cas de controle e ensaiadas que foram amostradas eram domesmo rebanho e da mesma raça.

Os critérios de inclusão para todas as vacas fo-ram: estágio tardio de lactação, 1-2 semanas antes do pri-meiro dia esperado para o período de seca; quatro tetas fun-cionais; grávidas; nenhuma lesão externa significativa nateta; as vacas não receberam terapia antimastite sistêmica 4semanas antes da admissão; s vacas não consumiram alimentoscom antibióticos 4 semanas antes da admissão; nenhum sinalde morbidez que pudesse ter influência em potencial no re-sultado do tratamento de acordo com o julgamento do investi-gador. As vacas diagnosticadas com mastite eram vacas comIMI confirmada e SCC de pelo menos 400.000 células/mL.

As vacas foram excluídas do estudo, de acordo comos seguintes critérios de exclusão: vacas que receberam imu-noterapia 4 semanas antes da admissão; vacas que receberamterapia com antibiótico, hormônio, antiinflamatório e/ou a-nabólico, tanto sistemicamente quanto por alimento 4 semanasantes da admissão; vacas que receberam terapia com vacina 12meses antes da admissão; uso concorrente de imunoterapias evacinas, tanto sistemicamente quanto por alimento; outrasterapias alternativas concorrentes; vacas com tuberculoseativa ou outras doenças infecciosas de acordo com o julga-mento do investigador; uso concorrente de esteróides anabó-licos, tanto sistemicamente quanto por alimento; uso concor-rente de hormônios, tanto sistemicamente quanto por alimento.

Projeto do Estudo

As vacas tratadas (caso) e de controle foram sele-cionadas de modo a minimizar a variação externa, por defini-ção de classificação de combinação de acordo com as seguin-tes variáveis: rebanho, raça, número de partos, data dospartos, número de períodos de seca, data de seca e data denascimento da vaca. A combinação plena foi classificada como5; nenhuma combinação foi classificada como 0. Uma combina-ção plena foi necessária para rebanho e raça. Fatores adi-cionais incluem (do fator mais importante para o menos im-portante) : número de partos (combinação permitida ± 1) , di-ferença da data do parto (combinação permitida ± 2 meses),número de períodos de seca (combinação permitida ± 1), dife-rença da data de início do período de seca (combinação per-mitida ± 2 meses), data de nascimento (combinação permitida± 3 meses).

As vacas foram admitidas no estudo uma ou duas se-manas antes da entrada programada no período de seca, que éde cerca de 75 dias antes do parto. Dentro desse período, osparâmetros que se seguem foram medidos de modo a estabeleceruma data de linha de base: aparência geral do úbere; SCC;existência de IMI de acordo com o teste bacteriológico e si-nais visíveis. Cerca de 60 dias antes do parto, a ordenhacessou e o tratamento foi administrado. As vacas ensaiadasreceberam 10 mL de MLTS-2 com 8 mg/mL de peptídeo duas vezeso dia durante 3 dias. As vacas de controle que foram diag-nosticadas como tendo mastite receberam tratamento de vacaseca de um antibiótico de amplo espectro (Cefquinona, 75 mgpor aplicação) . A administração foi por injeção em uma cavi-dade glandular através do canal da teta da glândula mamáriacomo uma dose simples a cada teta. Todas os quatro tetas deum úbere foram tratadas. Para cada dose injetada, uma novaampola foi usada. As ampolas usadas foram mantidas para ve-rificação adequação e prestação de contas pelo monitor doestudo. Após o último tratamento as vacas não foram ordenha-das mais até o próximo período de lactação após o parto. Se-guindo-se o término de 3 dias de tratamento, as vacas foramacompanhadas por 9 semanas durante o periodo de seca quantoaos sinais visíveis de mastite. A presença de microorganis-mos em cada teta do úbere por teste bacteriológico, aparên-cia geral do úbere e SCC foram examinadas durante o próximoperíodo de lactação, um, dois e três meses após o parto.

Resultados

A tabela 1 mostra que nenhum microorganismo detec-tado antes do tratamento estava presente após o tratamento(isto é, a razão de cura da infecção existente foi de 100%).

Tabela 1: Efeito dos tratamentos de período de se-ca na cura bacteriana e novas infecções nas vacas tratadascom hidrolisado da caseína (8 vacas, 32 tetas) em comparaçãoàs vacas de controle combinadas (24 vacas, 96 tetas)

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Observação: S indica Staphylococcus; CNS indicastreptococcus coagulase-negativo.

As vacas de controle que não foram diagnosticadascomo tendo mastite no começo do estudo e não receberam qual-quer tratamento, desenvolveram mastite durante esse período(n = 12 tetas de 18 tetas); outras 6 tetas infecção recor-rente, uma pelo mesmo microorganismo e as 5 tetas restantespor microorganismo de tipos diferente.

Exemplo 2.2: Terapia de seca em dose única aplica-da às vacas no nível do rebanho compreendendo as que apre-sentam ou não mastite

Projeto de Estudo

O objetivo desse experimento foi o de estudar aeficácia de MLTS-2 como uma terapia de vaca seca ao nível dorebanho. Cinqüenta e quatro vacas Holstein de um rebanholeiteiro estando pelo menos no segundo período de lactação,participaram do experimento de 25 de julho de 2005 a 11 denovembro de 2005.

O estudo foi realizado de acordo com as Diretrizesdo International Coordination of Harmonzation in Veterinary.Os critérios de inclusão e exclusão foram conforme descritono Exemplo 2.1

As vacas foram admitidas no estudo uma ou duas se-manas antes da entrada programada no período de seca, que éde cerca de 75 dias antes do parto. Amostras de leite foramcoletadas de forma asséptica e cultivadas de acordo com asdiretrizes estabelecidas em cada teta pelo menos duas vezesantes do tempo programado de tratamento na seca. A infecçãointramamária pré-seca (IMI) foi definida por identificaçãode pelo menos duas culturas positivas. Dentro do período depré-tratamento, os parâmetros que se seguem fora medidos demodo a estabelecer dados de linha de base: aparência geraldo úbere; SCC; existência de IMI de acordo com teste bacte-riológico e sinais visíveis. Cerca de 60 dias antes do par-to, a ordenha foi parada e o tratamento foi administrado. Ostratamentos foram administrados de forma asséptica por infu-são intramamária em quatro tetas das cinqüenta e cinco vacasensaiadas. Cada teta foi infusada uma vez com 10 mL de MLTS-2 contendo 8 mg de peptídeo por mL. Para cada dose injetada,uma nova ampola era usada. As ampolas usadas foram guardadaspara verificação da adequação e prestação de contas pelo mo-nitor do estudo. Após o último tratamento as vacas não forammais ordenhadas até o próximo período de lactação após oparto. Seguindo-se o término do tratamento, as vacas foramacompanhadas por cerca de 9 semanas durante o período de se-ca quanto a sinais visíveis de mastite. De modo a avaliar arazão de cura e razão de nova infecção ao nível da teta, a-mostras de colostro de todas as tetas foram obtidas nos pri-meiros dois meses da lactação subsequente e cultivadas emmeios apropriadas. Foi presumido que as tetas com duas cul-turas de leite negativas consecutivas tivessem uma cura mi-crobiológica ou que teta não tivesse sido infectada. Um edois meses após o parto, a aparência geral do úbere e SCCforam examinadas. Todos os parâmetros foram compilados paracada teta e analisados pelo pacote SAS/STAT quanto aos efei-tos antes versus depois usando o teste Qui-quadrado.

Resultados

Na amostragem inicial, foi verificado que 14 vacas(25,5%) têm uma infecção, das quais 19 tetas (8,6%) estavaminfectadas. Os organismos predominantes detectados foram va-riantes de staphilococcus (14/19) (Tabela 2).

Tabela 2: IMI detectada antes e após o tratamento(vaca η = 55, tetas η = 220)

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Observação: S. indica Staphylococcus; CNS Staph-ylococci coagulase-negativo; NOS de outra forma não especi-ficado. Strep, Streptococcus. Prev. Indica predomínio. Di-ferença na existência de IMI entre antes e após o tratamentofoi estatisticamente significativa, ρ < 0,005.

Os dados mostram que após o parto apenas uma tetapermaneceu infectada com o mesmo tipo de organismo até por 89 dias.

Exemplo 2.3: Tratamento da mastite durante lactação

Trinta e sete vacas foram admitidas nesse estudo.Todas as vacas foram diagnosticadas como apresentando masti-te clínica em uma glândula. Hidrolisado da caseína foi admi-nistrado por injeção na cavidade glandular infectada atravésdo canal da teta da glândula mamária duas vezes ao dia: umavez durante a manhã e uma vez durante a tarde.

As vacas admitidas no estudo estavam em estágiosdiferentes com relação ao número de partos, e consequente-mente, número de lactação. Os organismos foram identificadose quantificados por técnicas laboratoriais padrão (Leitner eoutros, 2004 Dairy Sei. 87:46-52). As verificações positivasse basearam em duas identificações consecutivas de agentespatogênicos de mastite. Como é evidente da Tabela 3 a se-guir, a composição farmacêutica da presente invenção é alta-mente eficaz no tratamento da mastite durante o período delactação.

Tabela 3: Efeito de MLTS-2 na cura bacteriana emvacas possuindo IMI durante lactação

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Exemplo 3: Encurtamento do período de secaPopulação de vacas

As vacas foram admitidas no estudo de acordo comos critérios de inclusão/exclusão descritos no Exemplo 2.1acima. A classificação de combinação entre um grupo tratado(n = 5) e um grupo de controle (n = 15) é também como no e-xemplo mencionado anteriormente. Dentro do grupo de contro-le, pelo menos um quinto das vacas têm diagnóstico positivode mastite e são tratadas com terapia antibiótica de vaca na seca.Projeto do Estudo

As vacas foram admitidas no estudo duas semanasantes da entrada programada no estudo. A entrada no estudoaconteceu cerca de 60, 40, 30, 20 e 10 dias antes do partoantecipado. Antes da entrada no estudo, os parâmetros que seseguem foram medidos de modo a estabelecer os dados da linhade base: SCC; existência de IMI de acordo com teste bacteri-ológico e sinais visíveis, além de rendimento do leite. Hi-drolisado da caseína, preparado conforme descrito no Exemplo4 abaixo, foi administrado apenas uma vez por dia. A reduçãodo número de administrações a uma aplicação simples é alta-mente desejável, como um tratamento simples poderia simpli-ficar consideravelmente os procedimentos e a carga de traba-lho em uma dada fazenda, consequentemente, trazendo a proba-bilidade de que os fazendeiros adotem o procedimento. A ad-ministração foi por injeção em uma cavidade glandular atra-vés do canal da teta da glândula mamária. Para cada dose in-jetada, uma nova ampola foi usada. As ampolas usadas foramguardadas para verificação da adequação e prestação de con-tas pelo monitor do estudo. Após o tratamento as vacas nãoforam mais ordenhadas até o próximo período de lactação. Se-guindo-se o término do tratamento, as vacas foram acompanha-das (incluindo exame do úbere) durante o período imposto deseca. Além disso, após o parto, os parâmetros que se seguemforam examinados: SCC; IMI por teste bacteriológico e sinaisvisíveis e avaliação do canal da teta incluindo avaliação docanal aberto ou fechado e consistência do tampão. 0 rendi-mento do leite também foi medido. O tratamento é definidocomo de sucesso quando ele causa cessação completa da produ-ção de leite e não possui qualquer efeito adverso nos parâ-metros medidos após o parto. 0 encurtamento do período deseca para 45 dias ou menos é definido como altamente de su-cesso. As análises estatísticas foram conforme descrito noExemplo 2.2 aqui acima. Como é conhecido, o rendimento doleite aumenta do primeiro período de lactação (após o pri-meiro parto) para pelo menos o quarto período de lactação.Portanto, a fim de padronizar o rendimento do leite de vacastratadas versus não tratadas, os dados do rendimento do lei-te foram corrigidos de acordo com o número de lactações comose segue: para a primeira lactação, litro de leite por diafoi dividido por 0, 795; para a segunda lactação, o litro deleite por dia foi dividido por 0,965; para a terceira lacta-ção, o litro de leite por dia foi dividido por 1.001, e paraa quarta e outras - nenhuma padronização foi realizada. Es-ses fatores de correção são usados correntemente pela Israe-Ii Cow Breeding Association (ICBA) para seleção genética devacas em Israel.

Resultados

As vacas de todos os casos e as de controle pari-ram de acordo com o projeto de estudo, e não houve casos deaborto ou qualquer doença pós-parto foi registrada. A exten-são do período de seca (em dias) na lactação precedente foio mesmo para os casos e os controles. Por outro lado, nalactação corrente, a extensão do período de seca foi signi-ficativamente mais curta (p < 0,01) nos casos em comparaçãoaos controles após tratamento com hidrolisado da caseína(Tabela 4)

Tabela 4: Efeito do tratamento com hidrolisado dacaseina na extensão do período de seca

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Após o parto, o rendimento do leite após o partonão diferiu entre as vacas onde o período de seca foi encur-tado pelo menos durante os períodos de tempo descritos na tabela 5 abaixo.

Tabela 5: Rendimento do leite após tratamento comhidrolisado da caseina aplicado para encurtar o período da seca

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Exemplo 4: Redução das Contagens de Células Somá-ticas do Leite

População de Vacas

Trinta e sete vacas completaram o estudo, após umrecrutamento inicial de 42. As vacas seriam elegiveis pararecrutamento nesse estudo se elas tivessem quatro tetas fun-cionais, das quais pelo menos uma estaria infectada, não ti-vessem lesão significativa nas tetas, estivessem com boa sa-úde e não tivessem recebido terapia antibiótica e/ou antiin-flamatória dentro de 30 dias antes do começo do tratamento.Além disso, nenhuma vacina para mastite foi empregada emqualquer um dos rebanhos dos quais as vacas foram seleciona-das pelo menos durante o último ano. As vacas dessas fazen-das foram alimentadas com uma ração de mistura total israe-lense tipica, que compreendida 65% de concentrados e 35% deforragem contendo 17% de proteína.

Preparação dos Fosfopeptideos da Caseina

Hidrolisado da caseína, compreendendo fosfopeptí-deos da caseína foi preparado conforme descrito anteriormen-te (Shamay e outros, 2003, supra). 0 procedimento aconteceunos Hy Laboratories (Rehovot, Israel), garantindo que o pro-duto final fosse estéril e que o produto fosse engarrafadoem ampolas estéreis. 0 nível da endotoxina no produto finalfoi de 0, 48 EU/mL de acordo com o teste de Lisado de Amebó-cito de Limulo (LAL). A quantidade de endotoxina injetadacom 10 mL dessa solução, 0,0001 EU/kg de peso corpóreo (pre-sumindo que o peso corpóreo médio da vaca é de 500 kg) é2.000 vezes menor que o limite de tolerância da endotoxinanos medicamentos para seres humanos administrados intrate-calmente (K = limite de tolerância = 5 EU/kg para medicamen-tos parenterais e 0,2 EU/kg para medicamentos intratecais).Os produtos finais para injeção simples em uma teta simplescontinham 10 mL de CNH com concentração peptidica de 10mg/mL.

Projeto do Estudo e Resultados

Hidrolisado da caseina foi administrado duas vezespor dia durante três (3) dias apenas à glândula mamária in-fectada do úbere através do canal da teta. A ordenha e indu-ção do período da seca continuaram de acordo com a programa-ção regular do rebanho.

Amostras de leite foram examinadas no laboratóriocentral da Israeli Cow Breeding Association (ICBA), Caesare-a, Israel ou no National Mastitis Reference Center, KimronVeterinary Institute. Os organismos foram identificados equantificados por técnicas laboratoriais padrão (Leitner eoutros, 2004, Dairy Sei. 87:46-52). Verificações positivasse basearam em duas identificações consecutivas de agentespatogênicos da mastite.

Contagens de células somáticas no leite antes daaplicação do tratamento (SCC-PRÉ) foram comparadas à SCC ob-servada após o parto (SCC-PÓS). SCC-PRÉ apresentada na tabe-la 6 descrita a seguir é a média de duas medições até 15 di-as antes da aplicação do tratamento de hidrolisado da casei-na. SCC-PÓS apresentado é a média de pelo menos duas medi-ções entre 15-60 dias após o parto. Para 27 vacas, SCC tam-bém foi acompanhada uma vez ao mês por até 10 meses após o parto.

Análise Estatística

SCC-PRÉ foi comparada à SCC-PÓS com o pacoteSAS/STAT por emprego do teste Qui-quadrado para SCC e ANOVAde uma via para variáveis contínuas. Todas as amostras deleite foram analisadas quanto a SCC com um Fossomatic 360 nolaboratório ICBA e conversor de escala Iog para análise estatística.

Resultados

Os dados foram coletados de 37 vacas de 9 rebanhos(2 a 7 vacas/rebanho) com um diagnóstico confirmado de mas-tite em uma teta. Os agentes patogênicos identificados maispredominantes foram Arcanobacterium pyogenes, Staphylococcusaureus, Eseheriehia eoli e Streptoeoeeus uberis. As infec-ções com espécies Streptoeoeeus, P. auroginosa, Corynobaete-rium bovis e Mierococeus foram exclusivamente sub-clínicas,considerando-se que ~60% de infecções com S.aureus, E.eoli eA.pyogenes eram clínicas e ~40% eram subclínicas.

Foram detectadas diferenças significativas entreSCC-PRÉ (média 2.210.200) e SCC-PÓS (média 205.000) tantoquando testadas quanto ao agente patogênico individual quan-to no grupo de estudo integral (p<0,001) (Tabela 6).

Tabela 6: Efeito do hidrolisado da caseína na SCCpós-parto em vacas lactantes tratadas em uma das glândulasinfectadas

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Nas glândulas infectadas clinicamente, SCC-PÓS em75% das vacas (n = 9/12) foi de 201.000 células/mL ou menosapós o tratamento e em todas as vacas tratadas SCC-PÓS foide 401.000 células/mL ou menos (Tabela 7). Nas glândulas in-fectadas subclinicamente, SCC-PÓS em 57% (n = 12/21) das va-cas foi de 201.000 células/mL ou menos após tratamento e em81% dos casos 401.000 células/mL ou menos. Quando se consi-dera todos os dados estabelecidos, SCC-PÓS em 63,6% (n =21/33) dos casos estava abaixo de 201.000 células/mL, quefoi significativamente menor (p<0,01) que o número de casos(n = 12/33) onde SCC-PÓS estava acima de 201.000 células/mL.Tabela 7: Efeito do hidrolisado da caseína na SCCpós-parto em vacas lactantes tratadas nas glândulas simplesinfectadas

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Para vinte e sete vacas, em média, 6,1 meses sepassaram entre os tratamentos e a indução da seca, isto é, oparto foi após o período da seca. Assim, nessas vacas, SCC-PÓS representa a SCC observada no período de lactação apósum período de seca. Em 59,3% das vacas (16/27), SCC-PÓS es-tava abaixo de 201.000 células/mL, o que não é significati-vamente diferente de 21/23, o número de casos nos quais SCC-PÓS estava abaixo de 201.000 células/mL no período entre otratamento e a seca. Vale frisar que em quase 26% das vacas,SCC-PÓS estava abaixo de 101.000 células/mL durante toda aobservação de acompanhamento e em 85% (23/27) SCC-PÓS estavaabaixo de 401.000 células/mL.

Exemplo 4.2: Efeito de uma dose do hidrolisado dacaseína administrada a quatro glândulas na contagem de célu-las somáticas após parto

A redução do número de tratamentos a um único émuito importante do ponto de vista prático em razão do tra-tamento único simplificar consideravelmente os procedimentose a carga de trabalho em uma dada fazenda, consequentemente,havendo assim probabilidade dos fazendeiros adotarem esseprocedimento.

O objetivo desse experimento foi o de estudar oefeito do tratamento com hidrolisado da caseina aplicado emuma única dose às quatro glândulas na contagem de célula so-mática pós-parto. Vacas Holstein (55) estando pelo menos nosegundo período de lactação, de um rebanho leiteiro, parti-ciparam do experimento de 25 de julho a 11 de novembro de 2005.

As vacas do estudo, critérios de inclusão e exclu-são, amostragem do leite e protocolos de estudo são essenci-almente conforme descritos no Exemplo 2.1 acima. As conta-gens de células somáticas no leite antes da aplicação dotratamento (SCC-PRÉ) foram comparadas à SCC observada apósparto (SCC-PÓS). SCC-PRÉ era a média de duas medições até 15dias antes do tratamento em cada glândula individual. SCC-PÓS era a média de pelo menos duas medições entre 15-60 (in-tervalo 15-30, 31-60) após a data do parto. Os dados e a SCCforam analisadas como no Exemplo 4.1.

Resultados

Antes do tratamento, a SCC-PRÉ média medida nastetas infectadas (19 tetas de 13 vacas) foi de 557.278 célu-las/mL em comparação as 183.381 células/mL (p<0,001) nas te-tas não IMI. Conforme mostrado na Tabela 8 a seguir, o tra-tamento foi eficaz na redução de SCC-PÓS (p<0,01). A dife-rença entre S CC antes e após o tratamento foi mais notávelnas glândulas infectadas intramamárias (p<0,001) em compara-ção à diferença para glândulas não IMI (p<0,05); contudo,esses resultados mostram claramente que a ampliação dos pep-tideos derivados da caseina reduz a SCC no leite, assim a-perfeiçoando a higiene do leite quando aplicada às glândulasinfectadas bem como não infectadas.

Tabela 8: Efeito do hidrolisado da caseina na SCCpós parto em glândulas infectadas e não infectadas

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Exemplo 5: Efeito do hidrolisado da caseina norendimento do leite após o parto

Exemplo 5.1: Efeito de múltiplas aplicações de hi-drolisado da caseina

População de vacas

Onze vacas (casos) diagnosticadas como tendo mas-tite clinica e/ou subclinica por diagnóstico bacteriológicoforam admitidas para receber tratamento com hidrolisado dacaseina. Trinta e três vacas serviram como um controle, dasquais 6 foram diagnosticadas como tendo mastite como acima e27 não estavam infectadas. As vacas de controle e ensaiadasforam amostradas do mesmo rebanho e eram da mesma raça.

Cerca de 60 dias antes do parto, a ordenha foi pa-rada e o tratamento foi administrado. As vacas de ensaio re-ceberam 10 mL de MLTS-2 com 8 mg/mL de peptideo duas vezespor dia durante 3 dias. As vacas de controle receberam tra-tamento de vaca seca com antibiótico como um tratamento sim-ples. Todas as quatro tetas do úbere foram tratadas. As va-cas não foram ordenadas entre os tratamentos; acúmulo doleite residual foi descartado da glândula tratada antes dotratamento com hidrolisado da caseina.

Os dados desse experimento foram submetidos aANOVA de três vias com um projeto de medições repetidas ("s-plit-plot" - gráfico de desdobramento) usando Grupos (vacastratadas versus vacas de controle); lactação (lactação tes-tada: 1, 2, 3 ou 4-5) e mês após parto (primeiro, segundo,terceiro ou quarto mês de lactação) . Para comparação da pro-dução de leite média antes e após o tratamento, o rendimentodo leite por dia foi padronizado conforme descrito no Exemplo 3 acima.

Resultados

As Figuras 1 e 2 ilustram resposta típica ao hi-drolisado da caseina (vaca número 2425 e 2331 respectivamen-te). Ambas as vacas foram infectadas com Staphilococcus au-reus na época do tratamento. Pode ser visto que a infecçãocausou uma diminuição no rendimento da produção do leite du-rante o segundo período de lactação. Após o tratamento, con-tudo, o rendimento do leite aumentou significativamente doparto até a última medição (60 dias após o parto) . A tabela9 mostra que o aumento no rendimento do leite não afeta ne-gativamente a qualidade do leite, medida pela concentraçãode proteína e gordura.

Tabela 9: Efeito do tratamento com hidrolisado dacaseína na concentração de proteínas e gorduras do leite ob-tido após parto até 100 dias da lactação

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Exemplo 5.2: Efeito de aplicações simples do hi-drolisado da caseína

O objetivo desse experimento foi estudar o efeitode um tratamento simples com hidrolisado da caseína, aplica-do às quatro glândulas em seca antes do parto no rendimentodo leite após parto. A importância de um regime e aplicaçãosimples reside na redução da carga de trabalho em uma fazen-da e na adequação do pessoal à administração do tratamento.

Vacas Holstein (55) estando pelo menos no segundoperíodo de lactação, de um rebanho leiteiro participaram doexperimento de 25 de julho de 2005 à 11 de novembro de 2005.

As vacas de estudo, critérios de inclusão e exclu-são, amostragem do leite, testes bacteriológicos e protoco-los de estudo são semelhantes ao Exemplo 2.2 e 4.2. O rendi-mento do leite de vacas individuais foi automaticamente re-gistrado três vezes ao dia. O efeito do hidrolisado da case-ina no rendimento do leite após parto (de 4 a 103 dias) foiavaliado por comparação do rendimento do leite nos períodosdefinidos que se seguem:

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O rendimento do leite do período 3 foi comparadoao rendimento do leite dos períodos 1 e 2 (vide o esquemaacima para a definição dos períodos).

As vacas que participaram do estudo estavam em es-tágios diferentes considerando-se o número de partos e, con-sequentemente, número de lactações. A padronização do rendi-mento do leite entre vacas em lactações diferentes foi cor-rigida de acordo com o rendimento do leite do número delactações conforme descrito no Exemplo 3 acima. Vinte e oitovacas foram tratadas ao final da primeira lactação, 17 aofinal da segunda e 10 ao final da terceira ou mais lacta-ções. O rendimento do leite em litros é apresentado como re-sultados brutos e após padronização. Os dados foram analisa-dos pelo pacote SAS/STAT conforme descrito no exemplo 5.1.

Resultados

Os dados foram coletados de 55 vacas. 0 rendimentodo leite no periodo 3 aumento em 11,60% (p<0,01) em compara-ção ao rendimento do leite no periodo 1 (Tabela 10).

Tabela 10: Efeito do hidrolisado da caseina trata-do como uma dose simples no periodo da seca no rendimento doleite após parto

<table>table see original document page 86</column></row><table>

Nas vacas com infecção intramamária (IMI) (n = 13,glândulas = 19) o efeito do tratamento com hidrolisado dacaseina foi mais proeminente (p<0,01) porque a quantidade deleite diária no periodo 2 (Tabela 11) foi 2,2 litros menosem comparação à quantidade de leite obtida das vacas semIMI, considerando-se que no periodo 3 o rendimento do leitedas vacas com IMI e vacas sem IMI foi semelhante (Tabela 12).

Tabela 11; Rendimento do leite no período 2 comIMI e sem IMI

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Tabela 12: Efeito do hidrolisado da caseína trata-do como uma dose simples no período da seca no rendimento doleite após parto (período 3)

<table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>

Exemplo 6: Efeito do Hidrolisado da Caseína noBem-Estar das Vacas Induzidas a Seca

De acordo com as práticas padrão, as vacas leitei-ras modernas são levadas à seca 60 dias antes do parto espe-rado como um compromisso entre o desejo do fazendeiro de ma-ximizar a produção do leite e a necessidade de um "períodode seca" mínimo que levaria ao declínio na produção do leitena próxima lactação (Annen e outros, 2004, ibid). Esta prá-tica está associada à cessação abrupta da ordenha das vacasainda produzindo quantidades consideráveis de leite, 20 a 40litros por dia e algumas vezes mesmo 50 litros por dia. Talprática resulta no acúmulo de quantidades maciças de leiteno úbere e está associada ao ingurgitamento do úbere e vaza-mento do leite o que leva freqüentemente a uma agonia obser-vada da vaca associada a gritos agudos e fortes por váriosdias. Assim, a prática corrente para secar as vacas nas fa-zendas de gado leiteiro modernas dificulta consideravelmenteo bem-estar das vacas.

O objetivo desse experimento é testar a influênciado tratamento com hidrolisado da caseína no comportamento ebem-estar das vacas leiteiras induzidas à seca por cessaçãoabruta da ordenha.Vinte vacas Holstein em direção ao final da lacta-ção (-60 dias) e produzindo 17-35 litros de leite por diaentraram no estudo. As vacas foram emparelhadas de acordocom o número de lactações, dias com leite, dias para o par-to, integridade da extremidade da teta, rendimento do leite,SCC por mL de leite por vaca ou teta e número de tetas in-fectadas no dia da seca (Tabela 13).

Tabela 13: Comparação do ponto de partida para va-cas do caso (CNH + Cefquinoma) e vacas de controle (Cefqui-noma) (n = 10 por grupo, o dado sendo apresentado como média± SD)

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>

SCC do leite das tetas e isolamento bacteriano fo-ram testados uma semana a parte por 3 vezes, antes da seca.Uma vaca de cada par foi então classificada para um subgrupoaleatoriamente (por lançar uma moeda ao ar) . As vacas nosubgrupo 1 foram tratadas após a ordenha com hidrolisado dacaseina e com a ampla faixa de Cefquinoma antibiótica (75 mgpor dose) (N+C), enquanto as vacas no subgrupo 2 foram tra-tadas com Cefquinoma sozinha (75 mg por dose) (C). As vacasdos subgrupos 2 foram alojadas em conjunto para ajuste em umabrigo confinado provendo 10 metros quadrados de piso de ar-dósia e com sombra e 10 metros quadrados de área com super-fície de concreto para cada vaca por uma semana antes dotratamento e então elas permaneceram naquele lugar por maisduas semanas. Após as três semanas, a partir da semana antesdo tratamento ao final da segunda semana após o tratamento,as vacas usaram um sensor montado na pata, computadorizado(Afifarm Management System, S.A.E. Afikim, Israel), que per-mite o monitoramento, registro e transmissão da atividade doanimal (caminhadas) e comportamento em repouso (LB), com al-teração mínima em relação a outro comportamento de animalsolto.

O índice de pressão do úbere (UPI) foi como se se-gue: 0, 1, 2 e 3, onde 0 é pressão zero, 1 é pressão média,2 é pressão alta e 3 é pressão extremamente alta. Valores deUPI arbitrários foram determinados por avaliação da pressãodo úbere por pressão do dedo no tecido e avaliando sua re-sistência à pressão em duas áreas, a cavidade do leite e ocorpus ubeis, 10 cm acima das tetas. Todas as medições deUPI foram realizadas pela mesma pessoa treinada uma vez aodia, na mesma hora, durante todo o experimento.

Os dados foram estatisticamente analisados usandoo procedimento de ajustamento de modelo para repetidas medi-ções de JMP (Versão 5, SAS Institute, Cary, NC) ; o tratamen-to era o coeficiente indivíduo-entre e o tempo era o coefi-ciente indivíduo-dentro. As diferenças foram consideradassignificativas em P < 0,05. O modelo era:

Yijkim = μ + Pi + aj + C (ij) k + γ = αγ il + eijkim

Onde Yijkim = a variável dependente, μ = média to-tal, Pi = efeito fixo do período (pré e pós seca; i = 1 a2), aj = efeito de tratamento fixo i (I = 1 ou 2), C(j.j)k =efeito aleatório da vaca k (k = 1 a 10) dentro do período ie tratamento j; γΐ = efeito no dia 1 (1 = 1 a 9), ayil = e-feito da interação do tratamento j e dia 1; e Cijkim = erroaleatório associado a vaca k no período i e tratamento j nodia 1.

As comparações entre os tratamentos para o períodoou para pós-tratamento em dia específico foram feitas porteste t usando o Tukey-Kramer HSD.

Além disso, uma análise de regressão linear foirealizada para cada tratamento separadamente em dois casos:i) dias no experimento como variável independente versus nú-mero de etapas cumulativo e ii) Δ (onde Δ se refere à dife-rença dos dados medidos em um dado dia após parto menos amédia da mesma data durante pré-parto) ou UPI como uma vari-ável independente versus Δ da razão entre o número de etapase duração do repouso. 0 significado da regressão foi avalia-do do coeficiente de regressão e n, considerando-se que asdiferenças entre as inclinações de regressão foram avaliadasda inclinação de regressão (b) , erro padrão da inclinação(Sb) e η por teste t.

Os valores arbitrários de UPI (Figura 3) aumenta-ram significativamente de ~1,2 antes do tratamento para va-lores na faixa de 1,8 a 2,5 nas vacas tratadas apenas comantibiótico (C) , em comparação com uma queda acentuada nasvacas tratadas com N+C durante os 4 primeiros dias após in-dução das vacas à involução, assim, durante esses 4 dias osvalores de UPI foram significativamente diferentes entre osgrupos (p < 0,01). Apenas seguindo-se o quinto dia após se-rem induzidas a seca, UPI da vacas de controle abaixou. AFigura 4 apresenta as fotografias do úbere de 2 vacas o dia4 após o tratamento. O rendimento de leite dessas duas vacasespecificas foi superior a 30 litros por dia na seca. O qua-dro na Figura 3 demonstra as diferenças entre a vaca tratadacom UPI = 0 (painel B) e aquela da vaca não tratada, com UPI= ~2 (painel A).A razão entre o número de etapas e duração do re-pouso (RSL) foi usada como um meio para avaliar o "confortodo animal" (Figura 5) . A razão se tornou menor para vacastratadas com N+C, partindo do segundo dia após o tratamentoenquanto nas vacas tratadas com C a razão ficou inalterada.Como resultado, a diferença entre os grupos aumentou e setornou significativa (p<0,005) a partir do terceiro dia apóso tratamento e progressivamente.

Com tudo incluido, a pressão do úbere, a atividadee comportamento em repouso das vacas tratadas com o hidroli-sado da caseina foi claramente associado aos sinais de queas vacas não sofreram e que elas estavam mais calmas e maisconfortáveis que as vacas induzidas a seca pelo método con-vencional.

Embora determinadas modalidades da invenção tenhamsido ilustradas e descritas, ficará claro que a invenção nãoestá limitada às modalidades descritas aqui. Várias modifi-cações, alterações, variações, substituições e equivalentesserão aparentes aos versados na arte, sem com isso fugir doespirito e escopo da presente invenção conforme descrito pe-las reivindicações que se seguem.LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> MILEUTIS LTD.

<120> COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO PEPTÍDEOSDERIVADOS DA CASEíNA E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS

<130> MLTS/001 PCT

<150> 60/676,292

<151> 2005-05-02

<150> 60/688,697

<151> 2005-06-09

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> peptideo sintético

<220>

<221> peptideo sintético

<222> (13..(3)

<223>

<400> 1

ser ser Ser Gly Gly

<210> 2<211> 25<212> PRT

<213> peptideo sintético<220>

<222> Aspectos diversos<222> (17)..(19)

<223> modificado por ácido fosfórico<400> 2

Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn vai Pro Gly Glu Ile Val Glu ser Leu15 10 15

Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg20 25

<210> 3<211> 21<212> PRT

<213> peptideo sintético<220>

<221> Aspectos diversos<222> (8)..(10)

<223> modificado por ácido fosfórico<400> 3

Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile Ser ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asp1 5 10 15

Ser Val Glu Gln Lys20

<210> 4<211> 21<212> PRT

<213> peptídeo sintético<220>

<221> Aspectos diversos<222> (8) .. (10)

<223> modificado por ácido fosfórico<400> 4

Lys Asn Thr Met Glu His Val ser ser Ser Glu Glu ser Ile Il e ser1 5 10 15

Asn Glu Thr Tyr Lys20

<210> 5<211> 25<212> PRT

<213> peptideo sintético<220>

<221> Aspectos diversos<222> Cll)..(13)

<223> modificado por ácido fosfórico<400> 5

Asn Ala Asn Glu Glu Glu Tyr ser Ile Gly Ser ser ser Glu Glu Ser15 10 15

Ala Glu Val Ala Thr Glu Glu Val Lys20 25

Claims (43)

1. Método para redução do período de seca entreciclos de lactação em um animal lactante sem afetar negati-vamente o rendimento do leite, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende administração ao animal lactante de uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo de-rivado da caseina.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o período de seca é reduzidopara menos de 50 dias; ouem que o período de seca é reduzido para entrecerca de 20 dias a 30 dias; ouem que o peptídeo é administrado ao mesmo tempo emque o leite cessa; ouem que o peptídeo é administrado de uma a cincovezes em intervalos de cerca de 6 horas a cerca de 24 horas;ouem que o peptídeo é administrado somente uma vez;ouem que o pelo menos um peptídeo derivado de caseí-na é obtido por hidrólise de caseina; ouem que o pelo menos um peptídeo derivado de casei-na é um peptídeo sintético.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um peptídeo é umfosfopeptídeo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que o f osf opeptídeo compreende aseqüência de aminoácido Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ IDNO: 1).

5. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptideo é derivado deum subgrupo da caseina selecionado do grupo consistindo emβ-caseína, aSl-caseína e aS2-caseína.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que o f osf opeptideo derivado deβ-caseína compreende uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 2, um análogo, derivado ou fragmento damesma; ouem que o fosfopeptideo derivado de aSl-caseínacompreende uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQID NO: 3, um fragmento, análogo ou derivado da mesma; ouem que fosfopeptideo derivado de aS2-caseína é se-lecionado do grupo consistindo em um peptídeo compreendendouma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 4, umpeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 5 e análogos, derivados e fragmentos dasmesmas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um peptídeo éadministrado a pelo menos uma glândula mamária do animallactante.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um peptídeo éadministrado ao canal da teta da glândula mamária.

9. Método para aumentar o rendimento do leite emum animal de criação lactante após ter parido, em comparaçãoao rendimento do leite do animal lactante antes do parto,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administração aoanimal lactante de uma quantidade terapeuticamente eficaz depelo menos um peptideo derivado de caseina.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento médio no rendimentodo leite é de pelo menos cerca de 3% nos primeiros 100 diasapós o parto; ouem que o parto é subseqüente a um período de seca;ouem que o peptideo é administrado a pelo menos umaglândula mamária do animal lactante, preferivelmente em queo pelo menos um peptideo é administrado ao canal da teta daglândula mamária; ouem que o peptideo é administrado ao mesmo tempo emque o leite cessa; ouem que o peptideo é administrado de uma a cincovezes em intervalos de cerca de 6 horas a cerca de 24 horas;ouem que o peptideo é administrado somente uma vez;ouem que o pelo menos um peptideo derivado de caseí-na é obtido por hidrólise de caseina; ouem que o pelo menos um peptideo derivado de casei-na é um peptideo sintético.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um peptideo é umfosfopeptideo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o f osf opeptideo compreende aseqüência de aminoácido Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ IDNO: 1).

13. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o f osf opeptideo é derivado deum subgrupo da caseina selecionado do grupo consistindo emβ-caseína, aSl-caseína e aS2-caseína.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptideo derivado deβ-caseína compreende uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 2, um análogo, derivado ou fragmento damesma; ouem que o fosfopeptideo derivado de aSl-caseínacompreende uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQID NO: 3, um análogo, derivado ou fragmentos da mesma; ouem que o fosfopeptideo derivado da aS2-caseína éselecionado do grupo consistindo em um peptideo compreenden-do uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 4,um peptideo compreendendo uma seqüência de aminoácido de a-cordo com a SEQ ID NO: 5 e análogos, derivados ou fragmentosdas mesmas.

15. Método para aumentar a higiene do leite de umanimal Iactante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz depelo menos um peptídeo derivado de caseína a uma glândulamamária do animal lactante, de modo a reduzir as contagensde células somáticas no leite, em comparação à SCC antes daadministração do peptideo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de . que as contagens de células somá-ticas no leite são inferiores a 400.000 células/mL; ouem que o peptideo é administrado a pelo menos umaglândula mamária do animal lactante, preferivelmente em queo pelo menos um peptideo é administrado ao canal da teta daglândula mamária; ouem que o peptideo é administrado ao mesmo tempo emque o leite cessa; ouem que o peptideo é administrado de uma a cincovezes em intervalos de cerca de 6 horas a cerca de 24 horas;ouem que o peptideo é administrado somente uma vez;ouem que o pelo menos um peptideo derivado de caseí-na é obtido por hidrólise de caseína; ouem que o pelo menos um peptídeo derivado de caseí-na é um peptídeo sintético.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um peptídeo é umfosfopeptídeo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que o f osf opeptídeo compreende aseqüência de aminoácido Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ IDNO: 1).

19. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptideo é derivado deum subgrupo da caseina selecionado do grupo consistindo emβ-caseina, aSl-caseina e aS2-caseína.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato de que o f osf opeptideo derivado deβ-caseina compreende uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 2, um análogo, derivado ou fragmento damesma; ouem que o fosfopeptideo derivado de aSl-caseínacompreende uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQID NO: 3, um análogo, derivado ou fragmento da mesma; ouem que fosfopeptideo derivado de aS2-caseína é se-lecionado do grupo consistindo em um peptideo compreendendouma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 4, umpeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 5 e análogos, derivados ou fragmentos dasmesmas.

21. Método para prevenir o sofrimento associado àinfecção da glândula mamária ou cessação abrupta de lactaçãoem um animal de criação lactante, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende administração a uma glândula mamária do ani-mal lactante de uma quantidade terapeuticamente eficaz depelo menos um peptideo derivado da caseina, desse modo aper-feiçoando o bem-estar do animal lactante.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que o aperfeiçoamento do bem-estar do animal lactante é medido pela redução no número decaminhadas diárias e prolongamento do período de descansodiário do animal; ouem que o pelo menos um peptídeo derivado de caseí-na é obtido por hidrólise de caseína; ouem que o pelo menos um peptídeo derivado de caseí-na é um peptídeo sintético.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo é um fosfopeptídeo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que o fosfopeptídeo compreende aseqüência de aminoácido Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu (SEQ ID NO: 1).

25. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que o fosf opeptídeo é derivado deum subgrupo da caseína selecionado do grupo consistindo emβ-caseína, aSl-caseína e aS2-caseína.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o fosf opeptídeo derivado deβ-caseína compreende uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 2, um análogo, derivado ou fragmento damesma; ouem que o fosfopeptídeo derivado de aSl-caseínacompreende uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQID NO: 3, um análogo, derivado ou fragmento da mesma; ouem que o fosfopeptideo derivado da aS2-caseína éselecionado do grupo consistindo em um peptideo compreenden-do uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 4,um peptideo compreendendo uma seqüência de aminoácido de a-cordo com a SEQ ID NO: 5 e análogos, derivados ou fragmentosdas mesmas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptideo é administrado apelo menos uma glândula mamária do animal lactante, preferi-velmente em que o pelo menos um peptideo é administrado aocanal da teta da glândula mamária.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptideo é administrado àglândula mamária selecionada do grupo consistindo em glându-Ia mamária infectada e uma glândula mamária não infectada.

29. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptideo é administrado aomesmo tempo em que o leite cessa; ouem que o peptideo é administrado de uma a cincovezes em intervalos de cerca de 6 horas a cerca de 24 horas;ouem que o peptideo é administrado somente uma vez.

30. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de que compreende uma quantidade terapeuticamente efi-caz de pelo menos um peptideo derivado de caseina, onde acomposição está na forma de uma solução límpida, estéril,pronta para uso, substancialmente isenta de micelas, possu-indo um pH acima de 6,0.

31. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o pelo menosum peptideo possui um peso molecular de cerca de 1.000 Dal-ton a cerca de 5.000 Dalton.

32. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o pelo menosum peptideo é um fosfopeptideo.

33. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que o fosfopeptí-deo compreende a seqüência de aminoácido Ser(p)-Ser(p)-Ser(P)-Glu-Glu (SEQ ID NO: 1).

34. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que o fosfopepti-deo é derivado de um subgrupo da caseina selecionado do gru-po consistindo em β-caseína, aSl-caseína e aS2-caseína.

35. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que o fosfopepti-deo derivado de β-caseína compreende uma seqüência de amino-ácido de acordo com a SEQ ID NO: 2, um fragmento, análogo ouderivado da mesma; ouem que o fosfopeptideo derivado de aSl-caseínacompreende uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQID NO: 3, um fragmento, análogo ou derivado da mesma; ouem que fosfopeptideo derivado de ocS2-caseína é se-lecionado do grupo consistindo em um peptideo compreendendouma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 4, umpeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácido de acordocom a SEQ ID NO: 5 e fragmentos, análogos ou derivados dasmesmas.

36. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o pelo menosum peptideo derivado de caseina é obtido por hidrólise dacaseína; ouem que o pelo menos um peptideo derivado da casei-na é um peptideo sintético;em que a referida composição farmacêutica compre-ende uma quantidade terapeuticamente eficaz de vários peptí-deos possuindo um peso molecular médio de cerca de 1.000Dalton a cerca de 5.000 Dalton; ouem que a referida composição farmacêutica possuium valor de turbidez inferior a 6 Unidades de Turbidez Nefe-lométrica (NTU); ouem que a referida composição farmacêutica compre-ende cerca de 10 ng/mL a cerca de 15 mg/mL do pelo menos umpeptideo; ouem que o pH da referida composição está na faixade cerca de 6,0 a cerca de 8,0; ouem que o pelo menos um peptideo é estável quandodo aquecimento da referida composição a 50°C-70°C; ouem que o pelo menos um peptideo é estável mediantecongelamento da referida composição.

37. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de um peptideo consistin-do essencialmente de uma seqüência de aminoácido de acordocom qualquer uma das SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5 e derivados, fragmentos ou análogos das mesmas,ou qualquer combinação das mesmas possuindo um peso molecu-lar de cerca de 1.000 Dalton a cerca de 5.000 Dalton.

38. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de que compreende uma quantidade terapeuticamente efi-caz de pelo menos um peptideo derivado de caseina na formade um pó liofilizado, onde o pó é reconstituído em um líqui-do antes do uso para formar uma solução límpida, substanci-almente isenta de micelas e possuindo um pH acima de 6,0.

39. Uso de pelo menos um peptideo derivado de ca-seina, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de umacomposição farmacêutica, em que a composição está na formade uma solução límpida, estéril, pronta para uso, substanci-almente isenta de micelas e tendo um pH acima de 6,0, paratratamento de uma glândula mamária.

40. Uso, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento da glândula ma-mária é selecionado do grupo consistindo em indução de ces-sação transiente da produção do leite, indução da cessaçãopersistente de produção do leite e indução da involução.

41. Uso de pelo menos um peptideo derivado de ca-seina, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de umacomposição farmacêutica, em que a composição está na formade uma solução límpida, estéril, pronta para uso, substanci-almente isenta de micelas e tendo um pH acima de 6,0, paraprevenção, tratamento e reversão de uma infecção microbiológica.

42. Uso, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção é mastite e onde areferida composição é administrada a uma glândula mamáriainfectada de um animal lactante; ouem que a referida composição é administrada em umperíodo de tempo selecionado do grupo consistindo no períodode lactação, no início do período de seca, na cessação doleite e no período de seca; ouem que a referida composição é administrada emcombinação com terapia antimicrobiana adicional, selecionadado grupo consistindo em tratamento antibiótico, tratamentobactericida, tratamento antiinflamatório esteroidal e nãoesteroidal, tratamento com um imunomodulador e vacinação; ouem que a referida composição é administrada a pelomenos uma glândula mamária do animal lactante; ouem que a referida composição é administrada a to-das as glândulas mamárias do animal lactante.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que o animal lactante é selecio-nado do grupo consistindo em vaca, cabra, carneiro, búfalo,camelo, burro, lhama, cavalo, porco, gato, cachorro e um serhumano.