BRPI0611336A2

BRPI0611336A2 - método para produzir uma partìcula multivalente semelhante a vìrus, partìcula multivalente semelhante a vìrus, método de aumentar a solubilidade de uma partìcula multivalente semelhante a vìrus e vacina

Info

Publication number: BRPI0611336A2
Application number: BRPI0611336-2A
Authority: BR
Inventors: Lada Rasochova; Philip Phuoc Dao; Jaime Phelps
Original assignee: Dow Global Technologies Inc
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2010-08-31
Also published as: WO2007053188A3; AU2006309286A1; CA2608515A1; WO2007053188A2; JP2009501001A; EP1885394A2; EP1885394A4; CN101287489A; KR20080018176A; US20070041999A1

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR UMA PARTICULA MULTIVALENTE SEMELHANTE A VìRUS, PARTìCULA MULTIVALENTE SEMELHANTE A VìRUS, MéTODO DE AUMENTAR A SOLUBILIDADE DE UMA PARTìCULA MULTI VALENTE SEMELHANTE A VìRUS E VACINAL. A presente invencao refere-se à producao e unióo in vitro de proteínas de capsídeo viral recombinantes em partículas semelhantes vírus. Em particular, a presente invencao fornece métodos rápidos, escalonáveis e economicos para a producao de partículas multivalentes semelhantes a vírus utilizando populacões separadas de peptídeos de fusao de capsídeo contendo diferentes insertos de peptídeo antigenico que sao combinados in vitro para produzir populacões homogeneas de partículas multivalentes semelhantes a vírus. As partículas semelhantes a vírus produzidas de acordo com a presente invencóo podem ser utilizadas para induzir uma resposta imunologica em um ser humano ou animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃODE PARTÍCULAS MULTIVALENTES SEMELHANTES A VÍRUS".

Referência cruzada a Pedido Relacionado

Esse pedido reivindica prioridade ao pedido Provisório U.S. No.60/686.541 depositado em 1 de junho de 2005.

Declaração de Interesse Governamental

Esse pedido está sob um contrato do Governo dos EstadosUnidos com o National Institutes of Health, National Institute of Allergyand Infectious Disease (NIAID), Acordo Cooperativo N9 1-U01-AI05464101.

Campo da invenção

A presente invenção está direcionada a produção e montagemin vitro de proteínas recombinantes de capsídeo viral em partículas seme-lhantes a vírus. Em particular, a presente invenção fornece métodos rápidos,expansíveis, e econômicos para a produção de partículas multivalentes se-melhantes a vírus utilizando populações separadas de peptídeos de fusãode capsídeo contendo diferentes insertos de peptídeos antigênicos que sãocombinados in vitro para produzir partículas multivalentes semelhantes avírus. As partículas semelhantes a vírus produzidas de acordo com a pre-sente invenção podem ser utilizadas para induzir uma resposta imunológicaem seres humanos ou animais.

Antecedentes da Invenção

Vacinações são uma das maneiras mais eficazes e eficientesde proteger animais e seres humanos de infecções por agentes patogênicos.Recentemente, o uso de inoculações de vacina contendo epítopos para maisdo que um agente patogênico vem sendo examinado. O racional por trás detal estratégia inclui a redução no número de inoculações necessárias parainduzir imunidade, o que pode reduzir as consultas aos médicos e aumentara adesão aos protocolos de vacina recomendados. Por exemplo, a primeiravacina pentavalente nos Estados Unidos contra difteria, tétano, coqueluche,poliomielite, e hepatite B foi desenvolvida por GIaxoSmithKIine sob o nomecomercial de Pediarix outras vacinas multivalentes em uso ou em desenvol-vimento incluem: Comvax, produzida pela Merck, que combina a vacina dahepatite B e Hib em uma injeção; TriHIBit, produzida pela Aventis, que com-bina Hib e DTaP; e Twinrix, produzida pela GIaxoSmithKIine, que combinahepatite A e Hepatite B em uma injeção e é dada como uma série de trêsdoses. Outras vacinas de combinação em desenvolvimento incluem inocu-Iantes únicos que combinam: MMR e Varivax; DTaP e IPV; DTaP e hepatiteB; DTaP, IPV e Hib (Pentavac); DTaP1 hepatite B, e Hib; DTaP1 IPV, Hib ehepatite B (Hexavac); e DTaP, Hib1 IPV, hepatite A e hepatite B.

Partículas semelhantes a vírus

Partículas semelhantes a vírus (VLPs) vêm sendo investigadascomo agentes de vacina. Em geral, vírus encapsulados incluem um revesti-mento protéico ou "capsídeo" que é montado para conter o ácido nucléicoviral. Vários vírus têm capsídeos que podem ser "auto-montados" a partir deproteínas de capsídeo expressas individualmente para formar VLPs, tantodentro da célula o capsídeo é expresso internamente ("montagem in vivo")como fora da célula após isolamento e purificação ("montagem in vitro").

Partículas semelhantes a vírus imitam a estrutura geral de umapartícula de vírus sem a necessidade de conter material infeccioso. VLPspodem não ter um genoma de DNA ou RNA viral, mas reter a estrutura tridi-mensional de um vírus autêntico. As VLPs têm a habilidade de estimularrespostas mediadas por células B, respostas proliferativas de CD4 e respos-tas de linfócitos T citotóxicos. Vide, Schirmbeck et al (1996) "Vírus Iike parti-cies induce MHC class l-restricted T-cell responses. Lessons Iearned fromthe hepatitis B small surface antigen." Intervirology 39, 111-119; Paliard et al(2000) "Priming of strong, broad, e Iong Iived HIV type I p55gag-specificCD8+ cytotoxic T cells after administration of a virus Iike particle vaccine inrhesus macaques." AIDS Res. Hum. Retrovírus 16, 273-282; Murata et al.(2000) "Immunization with hepatitis V virus Iike particles protects mice fromrecombinant hepatitis C virus-vaccinia infection." PNAS USA 100, 6753-6758.VLPs têm sido produzidas para mais de 30 vírus diferentes queinfectam humanos e outros animais, incluindo Norwalk, Hepatite B e C, Papi-lomavírus, Parvovírus, e Influenza A e vários testes clínicos em seres huma-nos usando VLPs estão atualmente em andamento. Vide, Koutsky et al.(2002) "A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine," NEJM347:1645-1651; Pinto et al. (2003) "Cellular immune responses to humanpapillomavirus (HPV)-16 Ll in healthy volunteers immunized with recombi-nant HPV-16 Ll virus Iike particles," J. Infect. Dis 188:327-338; Tacket et al.(2003) "Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalkvirus Iike particles in volunteers," Clin. Immunol. 108:241-247.

Partículas semelhantes a vírus também podem ser manipuladaspara agir como moléculas transportadoras para a liberação de epítopos deoutros agentes patogênicos. Vide, Noad et al. (2003) "Virus Iike particles asimmunogens," Trends in Microbiology 11(9), 438-444; Sadeyen et al. (2003)"Insertion of a foreign sequence on capsid surface Ioops of human papillo-mavirus type 16 virus Iike particles reduces their capacity to induce neutrali-zing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope." Viro-Iogy 309:32-40; WO 2005/005614; Publicação de Patente U.S. Nos.2004/0033585 e 2005/0048082; Patentes U.S. Nos. 6.448.070; 6.110.466;6.171.591; Brinkman et al. (2004) "Recombinant murine polyoma virus-like-particles induce protective anti-tumour immunity," Lett. Drug Des. & Disc.1:137-147. Uma proteína de capsídeo pode ser modificada para conter umpeptídeo antigênico, gerando uma fusão recombinante de proteína de capsí-deo viral-peptídeo antigênico. Esse produto de fusão de proteína de capsí-deo-peptídeo antigênico pode então ser expresso em uma célula hospedei-ra, montada in vivo ou in vitro para formar partículas virais ou semelhantes avírus recombinantes, e administrado a um hospedeiro a fim de criar umaresposta imune.

Produção de VLPs

O método de produção ideal de VLP multivalente deveria permi-tir montagem rápida, flexível e controlada de populações homogêneas deVLPs contendo múltiplos insertos de peptídeos antigênicos de diferentesagentes patogênicos, enquanto é livre de ácidos nucléicos virais infecciososextemporâneos. Métodos atuais de construção de VLPs multivalentes so-frem de: i) falta de flexibilidade e controle na geração de VLPs in vivo, o quereduz o número de combinações potenciais de insertos antigênicos devido alimitações inerentes na capacidade de inserção da proteína do capsídeo, ouii) a produção de populações de VLP não-homogêneas devido a simplesmistura in vitro de populações de VLPs montadas previamente contendo in-sertos diferentes.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece métodos in vitro expansíveis demontagem de partícula semelhante a vírus (VLP) usando proteínas de cap-sídeo viral recombinantes que contêm insertos de peptídeos antigênicos eque não têm genomas de ácido nucléico viral infeccioso de extensão com-pleta. O método inclui a montagem de proteínas de capsídeo viral que con-têm insertos antigênicos em VLPs que não possuem genomas de ácido nu-cléico viral infeccioso de extensão completa. Especificamente, o método in-clui misturar uma primeira proteína de capsídeo viral que contém pelo menosum inserto de peptídeo antigênico in vitro com pelo menos uma segundaproteína de capsídeo viral que contém pelo menos um inserto de peptídeoantigênico, em que pelo menos um inserto de peptídeo antigênico do segun-do peptídeo de fusão de capsídeo é derivado de uma seqüência de peptídeoantigênico diferente, ou de um agente patogênico diferente do pelo menosum inserto de peptídeo antigênico do primeiro peptídeo de fusão de capsí-deo, e montar as proteínas de capsídeo sob condições apropriadas in vitropara formar uma partícula semelhante a vírus. A partícula semelhante a ví-rus montada compreende pelo menos duas seqüências antigênicas diferen-tes, fornecendo uma partícula multivalente semelhante a vírus. Em algumasmodalidades, as misturas dos peptídeos de fusão de capsídeo recombinan-tes contendo insertos de peptídeo antigênico diferentes podem ser controla-das para que proporções específicas dos peptídeos antigênicos desejadossejam obtidas nas partículas semelhantes a vírus montadas. Em outras mo-dalidades, a VLP montada de acordo com a presente invenção não contémácidos nucléicos virais infecciosos de extensão completa. Em outras modali-dades, a VLP montada de acordo com a presente invenção não contém áci-dos nucléicos virais. O método atual permite flexibilidade na produção departículas semelhantes a vírus contendo combinações de vários peptídeosantigênicos. Essas VLPs multivalentes podem ser usadas em várias aplica-ções, incluindo estratégias de vacina para criar respostas imunes em animais.

O método atual utiliza misturas de peptídeos de fusão de capsí-deo recombinantes contendo insertos de peptídeo antigênico para montaruma única população de VLPs multivalentes que não requerem ácidos nu-cléicos virais infecciosos. Pelo fato de que a VLP é montada in vitro com pro-teínas de capsídeo contendo diferentes peptídeos antigênicos, a proporçãodesejada de antígenos contidos na VLP pode ser controlada. Usando essatécnica, uma grande variedade de combinações e proporções de proteínasde capsídeo contendo peptídeos antigênicos diferentes pode ser misturada erapidamente montada para produzir VLPs multivalentes. Tal estratégia per-mite a rápida adaptação do conteúdo de uma VLP para refletir uma compo-sição antigênica desejável.

A invenção atual pode utilizar proteínas de fusão de capsídeorecombinantes derivadas de qualquer fonte. Por exemplo proteína de capsí-deo recombinante contendo o inserto pode ser derivada de uma partículasemelhante a vírus montada anteriormente. Tais partículas semelhantes avírus, por exemplo, podem ter sido montadas in vivo ou in vitro. Alternativa-mente, proteínas de capsídeo recombinantes que não foram montadas ante-riormente em VLPs podem ser utilizadas. Além disso, proteínas de capsídeorecombinantes derivadas de VLPs montadas anteriormente podem ser mis-turadas com proteínas de capsídeo recombinantes que não foram montadasanteriormente em VLPs para produzir VLPs multivalentes.

As proteínas de capsídeo recombinantes para uso na presenteinvenção podem ser geradas em qualquer sistema de expressão de célulahospedeira que possa produzir tais peptídeos, incluindo, mas não se limitan-do a sistemas de célula hospedeira bacterianos, de levedura, de insetos, demamíferos e de plantas, dentre outros. Em certas modalidades a proteína decapsídeo pode ser expressa em uma célula hospedeira procariótica. Emuma modalidade, a célula hospedeira procariótica é uma célula hospedeirabacteriana. Em algumas modalidades, os peptídeos de fusão de capsídeopodem ser produzidos como proteínas de capsídeo solúveis ou corpos deinclusão insolúveis. Em certas modalidades, a proteína capsídeo recombi-nante pode ser expressa em uma célula de Pseudomonas fluorescens comoproteínas de fusão de capsídeo solúveis ou em corpos de inclusão insolú-veis. Em outra modalidade, a proteína de capsídeo é produzida em uma cé-lula hospedeira eucariótica. Em uma modalidade particular, a célula hospe-deira eucariótica é uma célula de planta. Em outra modalidade os peptídeosde fusão de capsídeo são produzidos nas plantas inteiras.

A presente invenção fornece a mistura de diferentes tipos depeptídeos de fusão de capsídeo recombinantes, em que os peptídeos defusão de capsídeo recombinantes selecionados para a mistura contêm pelomenos um peptídeo antigênico que não está presente nos outros peptídeosde fusão de capsídeo aos quais eles estão sendo misturados. O peptídeoantigênico pode ser do mesmo ou de diferentes agentes patogênicos. Emalgumas modalidades, os peptídeos de fusão de capsídeo selecionados paraa mistura contêm peptídeos antigênicos de agentes patogênicos diferentes.

Em certas modalidades a mistura pode conter pelo menos duas populaçõesde peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes, em que cada populaçãode peptídeo de fusão de capsídeo recombinante contém pelo menos umpeptídeo antigênico diferente de um agente patogênico diferente que nãoestá presente em nenhum outro peptídeo de fusão de capsídeo recombinan-te que está sendo misturado a ele. Em outra modalidade, a mistura contémmais do que duas populações de peptídeos de fusão de capsídeo recombi-nantes, em que cada peptídeo de fusão de capsídeo recombinante contémpelo menos um peptídeo antigênico diferente de pelo menos um agente pa-togênico diferente. Em algumas modalidades, os peptídeos de fusão de cap-sídeo contêm múltiplos insertos de peptídeos antigênicos. Em algumas mo-dalidades, os peptídeos de fusão de capsídeo contêm peptídeos antigênicosque atingem tipos específicos de células efetoras imunes, incluindo, mas nãose limitando a epítopos direcionados para células T, células B, e células C-TL. Em uma modalidade adicional, a mistura também contém uma proteínade capsídeo selvagem.

A proteína de capsídeo viral utilizada na presente invenção po-de ser derivada de qualquer tipo de vírus capaz de se remontar em uma par-tícula semelhante a vírus. Em certas modalidades todas as proteínas decapsídeo viral recombinantes misturadas e remontadas em VLPs podem serderivadas do mesmo vírus. Em uma modalidade alternativa, as proteínas decapsídeo viral recombinantes misturadas e remontadas em VLPs são deri-vadas de vírus diferentes. Por exemplo, proteínas de capsídeo viral recom-binantes derivadas de vírus diferentes com estrutura morfológica de capsí-deo similar (isto é, icosaédricas, helicoidal, etc.) podem ser misturadas e re-montadas em VLPs.

A presente invenção permite geração eficiente e flexível de va-cinas multivalentes por permitir que a proporção e composição da vacinamultivalente seja controlada. Pelo fato da presente invenção proporcionarque os peptídeos de fusão de capsídeo contendo o epítopo desejado sejammisturados após isolamento e purificação a partir da produção independenteem células hospedeiras separadas, regulação rígida das combinações dese-jadas pode ser obtida. A presente invenção permite a remontagem de prote-ínas de capsídeo recombinantes em qualquer proporção de componentesantigênicos desejável pelo ajuste das quantidades de cada população depeptídeo de fusão de capsídeo recombinante adicionadas à mistura.

Outro aspecto da presente invenção inclui a inserção de se-qüências de aminoácidos funcionais predeterminadas que não sejam peptí-deos antigênicos na proteína de capsídeo viral. Essas seqüências podem terfunções que não sejam criar uma resposta imune. Um exemplo não Iimitantede tal seqüência é uma seqüência de aminoácido direcionadora, tal comoum sítio de ligação de receptor, e o método inclui misturar a proteína de cap-sídeo que contém as seqüências de aminoácido direcionadoras com pelomenos uma proteína de capsídeo que contém um inserto de peptídeo anti-gênico. Em algumas modalidades, tal inserto de aminoácido direcionadorpode direcionar partículas montadas para células específicas ou permitir aentrada na célula.

Um aspecto adicional da presente invenção fornece a inclusãode seqüências de ácido nucléico imunoestimulatórias tais como seqüênciasCpG na partícula de VLP montada produzida pelos métodos aqui descritos.

A presente invenção pode fornecer métodos de aumentar a efi-ciência e produção expansível de vacinas multivalentes utilizando partículassemelhantes a vírus contendo insertos antigênicos de mais de um agentepatogênico.

A presente invenção também pode fornecer métodos de produ-zir VLPs multivalentes que contêm insertos antigênicos de mais do um agen-te patogênico em que a proporção de agentes de antígeno contida na VLPpode ser facilmente controlada.

Adicionalmente, a presente invenção pode produzir VLPs multi-valentes que são livres de um genoma de ácido nucléico viral infeccioso deextensão completa.

Breve descrição das figuras

Figura 1 é um western blot das frações de proteína insolúveisde células hospedeiras de Pseudomonas fluorescens MB214 com peptídeosde fusão de capsídeo de CCMV manipulados para expressar os insertos depeptídeo PA1, PA2, PA3 e PA4 na fração insolúvel. As células foram Iisadasa 0,12 e 44 horas. O peptídeo de fusão de capsídeo quimérico está indicadopor uma seta.

Figura 2 é um é um western blot das frações de proteína solú-veis de células hospedeiras de Pseudomonas fluorescens MB214 com pep-tídeos de fusão de capsídeo de CCMV manipulados para expressar os inser-tos de peptídeo PA1, PA2, PA3 e PA4 na fração solúvel. As células foramIisadas a O, 12 e 44 horas.

Figura 3 são imagens de gradientes de densidade de sacarosemostrando a separação de VLPs de CCMV-PA3 com e sem RNA.

Figura 4 é um gel de SDS-PAGE de bandas de VLP de CCMV-ΡΑ1 e CCMV-PA2 com e sem RNA isoladas de um gradiente de densidadede sacarose.

Figura 5 é uma eletromicrografia de VLPs remontadas a partirde CCMV-PA4 na ausência de RNA.

Figura 6 é um diagrama de expressão e remontagem de VLPsmultivalentes contendo múltiplos epítopos de Antígeno Protetor ("PA").

Figura 7 é um diagrama ilustrando o empacotamento de CpGsem VLPs durante a reação de montagem.

Figura 8 são análises de HPLC de estágios de produção deVLP. 8A ilustra uma análise de SEC-HPLC de partículas de vírus CCMVproduzidas em planta. 8B demonstra a desmontagem de partículas de vírusCCMV produzidos em planta. 8C mostra a remontagem de dímeros deCCMV isolados em VLPs.

Figura 9 é uma análise de SEC-HPLC de dímero de CCMVdesmontado purificado e VLP de CCMV remontado contendo oligonucleotí-deos CpG encapsulados.

Figura 10 mostra imagens de gel de agarose a 1,2% coradocom EtBr (acima) e coloração de proteína (abaixo) e VLPs de CCMV con-tendo oligonucleotídeos CpG padrão encapsulados ou CpGs com a estruturaprincipal protegida.

Descrição detalhada da invenção

I. Proteínas de Capsídeo Viral Recombinantes

Capsídeos virais

Modalidades da presente invenção fornecem a produção departículas semelhantes a vírus multivalentes compreendidas da mistura invitro de populações de peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes con-tendo pelo menos um peptídeo antigênico, em que cada população de pep-tídeos de fusão de capsídeo recombinantes contém pelo menos um peptídeoantigênico que não está contido nos peptídeos de fusão de capsídeo aosquais ela está sendo misturada, e remontagem in vitro dos peptídeos de fu-são de capsídeo recombinantes misturados em proporções predeterminadaspara formar partículas multivalentes semelhantes a vírus. Em algumas mo-dalidades os peptídeos antigênicos contidos nas VLPs resultantes podemser derivados de diferentes agentes patogênicos.

O termo "multivalente" conforme usado aqui indica a presençade pelo menos duas seqüências de peptídeo antigênico diferentes na partí-cula semelhante a vírus remontada.

Morfologia

A invenção atual não depende do tipo de vírus usado para ori-ginar a proteína de capsídeo. Qualquer proteína de capsídeo viral, após in-serção de um peptídeo antigênico, que seja capaz de ser remontada emuma partícula semelhante a vírus, ou estrutura de jaula, pode ser utilizada napresente invenção. Em modalidades da presente invenção, a seqüência deaminoácido do capsídeo pode ser selecionada a partir de capsídeos de vírusclassificados como tendo qualquer morfologia, incluindo: icosaédrica (icosa-édrica propriamente dita, isométrica, quase-isométrica, geminada ou "twin-ned"), poliédrica (incluindo esférica, ovóide, e em forma de limão), bacilifor-me (incluindo em forma de vara ou de bala, e fusiforme ou em forma de cha-ruto), e helicoidal (incluindo bastonete, cilíndrica, e filamentosa); qualqueruma das quais pode ter uma cauda e/ou pode conter projeções de superfí-cie, tais como espinhos e saliências arredondadas.

Em modalidades da presente invenção a seqüência de aminoá-cido do capsídeo pode ser selecionada a partir de capsídeos de entidadesque tem formato helicoidal. Em outras modalidades a seqüência de aminoá-cido do capsídeo pode ser selecionada a partir dos capsídeos de entidadesque são icosaédricas. Em certas modalidades a seqüência de aminoácido docapsídeo pode ser selecionada a partir dos capsídeos entidades que sãoicosaédricas propriamente ditas. Em certas modalidades a seqüência de a-minoácido do capsídeo pode ser selecionada a partir dos capsídeos de vírusicosaédricos. Em algumas modalidades a seqüência de aminoácido do cap-sídeo pode ser selecionada a partir dos capsídeos de um vírus icosaédricode plantas. Entretanto, em outras modalidades o capsídeo viral pode ser de-rivado de um vírus icosaédrico não infeccioso para plantas. Por exemplo, emuma modalidade o vírus é um vírus infeccioso para mamíferos.Geralmente, capsídeos virais de vírus icosaédricos são com-postos de várias subunidades de proteínas dispostas em simetria icosaédri-ca (cúbica). Capsídeos icosaédricos nativos podem ser construídos, por e-xempio, com 3 subunidades formando cada face triangular de um capsídeo,resultando em 60 subunidades formando um capsídeo completo. Um repre-sentante dessa pequena estrutura viral é, por exemplo, o bacteriófago0X174. Vários capsídeos de vírus icosaédricos contêm mais de 60 subuni-dades. Vários capsídeos de vírus icosaédricos contêm um motivo de dobra-mento em cilindro de oito filamentos antiparalelas. O motivo tem um blocoem forma de cunha com quatro filamentos beta (designadas BIDG) de umlado e quatro (designadas CHEF) do outro. Também há duas alfa-hélicesconservadas (designadas A e B), uma está entre a betaC e betaD, a outraestá entre betaE e betaF.

Vírus

Taxonomias virais reconhecem os seguintes táxons de entida-des de partícula encapsuladas.

• Vírus do grupo I, isto é, os vírus de dsDNA;

• Vírus do grupo II, isto é, os vírus de ssDNA;

• Vírus do grupo III, isto é, os vírus de dsRNA;

• Vírus do grupo IV, isto é, os vírus de ssRNA filamento-(+) sem estágio de DNA;

• Vírus do grupo V, isto é, os vírus de ssRNA filamento-(-);

• Vírus do grupo VI, isto é, os retro vírus de RNA, que sãovírus de transcrição reversa de ssRNA.

• Vírus do grupo VII, isto é, os retro vírus de DNA, quesão vírus de transcrição reversa de dsRNA;

• Deltavírus

• Viróides; e

• Fagos Satélite e vírus Satélite, excluindo ácidos nucléi-cos Satélite e Príons.

Membros desses táxons são bem-conhecidos dos versados natécnica são revisados em: Η. V. Van Regenmortel et al. (eds.), Virus Taxo-nomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viru-ses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., EUA); a página daInternet de Taxonomia Viral do Departamento de Microbiologia & Imunologiada Leicester University (UK) em http://www.micro.msb.le.ac.uk/3035/ Virus-groups.html; e as seções online "Vírus" e "Viroid" do navegador de taxono-mia do National Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Li-brary of Medicine do National Institutes of Health do US Department of Heal-th & Human Services (Washington, D.C., EUA) emhttp://www.ncbi.nhn.nih.g0v/T axonomy/ tax.html.

A seqüência de aminoácido do capsídeo pode ser selecionadaa partir dos capsídeos de qualquer membro de qualquer um desses táxons.Seqüências de aminoácido para capsídeos desses táxons podem ser obti-das a partir de fontes, incluindo, mas não limitadas, por exemplo, às seçõesonline "Nucleotide" (Genbank), "Protein," e "Structure" do instrumento depesquisa PubMed oferecido pelo NCBI emhttp://www.ncbi.nhn.nih.gov/entrez/ query.fcgi.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que aseqüência de aminoácido do capsídeo pode ser selecionada a partir demembros de táxon que são específicos para pelo menos um dos seguinteshospedeiros: fungos incluindo leveduras, plantas, protistas incluindo algas,animais invertebrados, animais vertebrados, e seres humanos. Em modali-dades adicionais a seqüência de aminoácido do capsídeo pode ser selecio-nada de membros de qualquer um dos seguintes táxons: Grupo I, Grupo II,Grupo III, Grupo IV, Grupo V, Grupo VII, Viróides, Vírus Satélite. Em certasmodalidades, a seqüência de aminoácido do capsídeo pode ser selecionadaa partir de membros de qualquer um desses sete táxons que são específicospara pelo menos um dos seis tipos de hospedeiro descritos acima. Em cer-tas modalidades a seqüência de aminoácido do capsídeo pode ser selecio-nada de membros de qualquer um do Grupo II, Grupo III, Grupo IV, GrupoVII, e Vírus Satélite; ou de qualquer um do Grupo II, Grupo IV, Grupo VI, evírus satélites. Em uma modalidade, o capsídeo viral é selecionado do grupoIV ou do Grupo VII. Em algumas modalidades o capsídeo viral é selecionadode um vírus do Grupo IV.

A seqüência do capsídeo viral pode ser derivada de um vírusque não é um agente infeccioso nativo para a célula na qual o peptídeo defusão de capsídeo é produzido. Modalidades da presente invenção incluemaquelas em que a célula não inclui proteínas virais do vírus particular sele-cionado exceto os capsídeos icosaédricos desejados. Em algumas modali-dades o capsídeo viral é derivado de um vírus com um tropismo para umafamília de organismos diferente daquela da célula na qual o peptídeo de fu-são de capsídeo é produzido. Em outra modalidade, o capsídeo viral é deri-vado de um vírus com tropismo para um gênero de organismos diferentedaquele da célula na qual o peptídeo de capsídeo é produzido. Em outramodalidade, o capsídeo viral é derivado de um vírus com um tropismo parauma espécie de organismos diferente daquela da célula hospedeira na qualo peptídeo de fusão de capsídeo é produzido.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que ocapsídeo viral é selecionado de um vírus icosaédrico. O vírus icosaédricopode ser selecionado de um membro de qualquer um de Papillomaviridae,Totiviridae1 Dicistroviridae, Hepadnaviridae, Togaviridiae, Polyomaviridiae,Nodaviridae, Tectiviridae, Leviviridae, Microviridae, Sipoviridae, Nodaviridae,Picornoviridae, Parvoviridae, Calciviridae, Tetraviridae, e Vírus Satélites.

Em certas modalidades da presente invenção, a seqüência po-de ser selecionada de membros de qualquer um dos táxons que são especí-ficos para pelo menos um hospedeiro de planta. Em algumas modalidades, aespécie de vírus de planta icosaédrico pode ser uma espécie de vírus infec-cioso para plantas que é ou é um membro de qualquer um dos táxons Bun-yaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Luteoviridae, Nanoviridae, Partitiviri-dae, Sequivirídae, Tymoviridae, Ourmiavirus, Vírus Satélite da Necrose doTabaco, Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tom-busviridae, ou Bromoviridae. Em algumas modalidades, a espécie de vírusde planta icosaédrico é uma espécie de vírus infeccioso para plantas que éou é um membro de qualquer um dos táxons Luteoviridae, Nanoviridae, Par-titiviridae, Sequiviridae1 Tymoviridae, Ourmiavirus, Vírus Satélite da Necrosedo Tabaco, Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tom-busviridae, ou Bromoviridae. Em algumas modalidades, a espécie de vírusde planta icosaédrico é uma espécie de vírus infeccioso para plantas que éou é um membro de qualquer de Caulimoviridae, Geminiviridae, Comovirida-e, Sobemovirus, Tombusviridae1 ou Bromoviridae. Em outras modalidades, aespécie de vírus de planta icosaédrico pode ser uma espécie de vírus infec-cioso para plantas que é ou é um membro de qualquer um de Comoviridae,Sobemovirus, Tombusviridae, ou Bromoviridae. Em outras modalidades adi-cionais, a espécie de vírus de planta icosaédrico pode ser uma espécie devírus infeccioso para plantas que é um membro das famílias Comoviridae ouBromoviridae. Em certas modalidades o capsídeo viral é derivado de umaespécie do táxon Bromoviridae. Em certas modalidades o capsídeo é deri-vado de um Harvirus ou um Alfamovirus. Em certas modalidades o capsídeoviral é derivado de um Vírus do Mosáico do Feijão Caupi (Cowpea MosaicVírus) ou um Vírus do Mosqueado Clorótico do Feijão Caupi (Cowpea Chlo-rotic Mottle Vírus). Em outras modalidades o capsídeo é derivado de um Ví-rus da Necrose Branca do Fumo (Tobacco streak vírus), Vírus do Mosáicodo Capim Bromo (Brome Mosaic virus), ou um vírus do mosáico da alfafa(Alfafa mosaic virus) (AMV).

II. Insertos de Peptídeo Antiqênico

Tamanho

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que ospeptídeos antigênicos ou proteínas operativamente ligados a uma seqüênciade capsídeo viral contêm pelo menos dois aminoácidos. Os peptídeos anti-gênicos podem ser de tamanho suficiente para gerar uma resposta imunoló-gica quando administrados em uma quantidade eficaz a um animal. Os pep-tídeos podem ter pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 30, 45, 50, 60, 65, 75, 85, 95, 96, 99 ou mais aminoácidos deextensão.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que opeptídeo de fusão do capsídeo recombinante contém pelo menos um peptí-deo antigênico. Em uma modalidade alternativa, o peptídeo de fusão docapsídeo recombinante contém mais do que um peptídeo antigênico. Emalgumas modalidades, o peptídeo antigênico é composto de pelo menos 5,pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 peptídeos antigênicos se-parados. Ainda em outra modalidade, o peptídeo antigênico é inserido naproteína de capsídeo viral para que ela seja exposta em pelo uma volta dasuperfície quando a proteína do capsídeo for remontada para formar partícu-las semelhantes a vírus.

Peptídeos antigênicos

Os peptídeos antigênicos para uso na presente invenção po-dem ser qualquer seqüência de peptídeo capaz de gerar uma resposta imu-nológica. Por exemplo, o peptídeo antigênico pode ser um epítopo de peptí-deo, hapteno, ou um peptídeo relacionado (por exemplo, peptídeo antigênicoviral; peptídeo relacionado a vírus, por exemplo, peptídeo relacionado aoHIV1 peptídeo relacionado à hepatite, domínio idiotípico de anticorpo, peptí-deo de superfície celular, peptídeo antigênico humano, de animal, de protis-ta, de planta, fúngico, bacteriano e/ou de archaea; peptídeo alergênico epeptídeo dessensibilizante de alérgeno). O peptídeo antigênico pode ser se-lecionado a partir daqueles que são peptídeos antigênicos de agentes pato-gênicos humanos ou animais, incluindo agentes infecciosos, parasitas, célu-las de câncer, e outros agentes patogênicos. Tais agentes patogênicos tam-bém incluem os fatores de virulência e fatores de patogênese, por exemplo,exotoxinas, endotoxinas et al, daqueles agentes. Os agentes patogênicospodem exibir qualquer nível de virulência, isto é, eles podem ser, por exem-plo, virulentos, avirulentos, pseudo-virulentos, semi-virulentos, e assim pordiante. Em algumas modalidades o peptídeo antigênico pode conter umaseqüência de aminoácido epitópica do(s) agente(s) patogênico(s). Em moda-lidades adicionais a seqüência de aminoácido epitópica pode incluir aquelade pelo menos uma porção de um peptídeo de superfície de pelo menos umde tal agente.

Mais de um peptídeo antigênico pode ser selecionado para in-serção em uma única proteína de capsídeo, em cujo caso as partículas se-melhantes a vírus resultantes podem apresentar múltiplos peptídeos antigê-nicos diferentes de múltiplos peptídeos de fusão de capsídeo diferentes. Emalgumas modalidades do formato de múltiplos peptídeos antigênicos, os vá-rios peptídeos antigênicos podem ser todos selecionados de uma pluralidadede epítopos do mesmo agente patogênico. Em outras modalidades de umformato de multi-peptídeo antigênico, os vários peptídeos antigênicos sele-cionados podem ser todos selecionados a partir de uma pluralidade de agen-tes patogênicos intimamente relacionados, por exemplo, cepas, subespé-cies, biovares, patovares, serovares, ou genovares diferentes, da mesmaespécie ou de espécies diferentes do mesmo gênero. Em uma modalidadealternativa, os peptídeos antigênicos para inserção no peptídeo de fusão docapsídeo podem ser de agentes patogênicos não relacionados.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em queo(s) agente(s) patogênico(s) pode(m) pertencer a pelo menos um dos se-guintes grupos: agentes patogênicos de Bactéria e Micoplasma incluindo,mas não se limitando a: Bacillus spp., por exemplo Bacillus anthracis; Barto-nella spp., por exemplo, B. quintana; Brucella spp.; Burkholderia spp., porexemplo, B. pseudomallei; Campylobacter spp.;

Clostridium spp., por exemplo, C. tetani, C. botulinum; Coxiella spp., por e-xemplo, C. burnetii; Edwardsiella spp., por exemplo, E. tarda; Enterobacterspp., por exemplo, E. cloacae; Enterococcus spp., por exemplo, E. faecalis,E. faecium; Escherichia spp., por exemplo, E. coli; Francisella spp., por e-xemplo, F. tularensis; Haemophilus spp., por exemplo, H. influenzae; Klebsi-ella spp., por exemplo, K. pneumoniae; Legionella spp.; Listeria spp., porexemplo, L. monocytogenes; Meningococos e Gonococos por exemplo,Neisseria spp.; Moraxella spp.; Mycobacterium spp., por exemplo, M. leprae,M. tuberculosis; Pneumococos, por exemplo, Diplococcus pneumoniae;Pseudomonas spp., por exemplo, P. aeruginosa; Rickettsia spp., por exem-plo, R. prowazekii, R. rickettsii, R. typhi; Salmonella spp., por exemplo, S.typhi; Staphylococcus spp., por exemplo, S. aureus; Streptococcus spp., in-cluindo Estreptococo do Grupo A e Estreptococo hemolítico, por exemplo, S.pneumoniae, S. pyogenes; Streptomyces spp.; Shigella spp.; Vibrio spp., porexemplo, V. cholerae; e Yersinia spp., por exemplo, Y. pestis, Y. enterocoliti-ca. Agentes patogênicos de fungos e leveduras incluindo, mas não se limi-tando a: Alternaria spp.; Aspergillus spp.; Blastomyces spp., por exemplo, B.dermatiditis; Candida spp., por exemplo, C. albicans; Cladosporium spp.;Coccidiodes spp., por exemplo, C. immitis; Cryptococcus spp., por exemplo,C. neoformans; Histoplasma spp., por exemplo, H. capsulatum; e Sporothrixspp., por exemplo, S. schenckii.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em queo(s) agente(s) patogênico(s) pode(m) ser de um agente patogênico protistaincluindo, mas não se limitando a: Amebas, incluindo Acanthamoeba spp.,Amoeba spp., Naegleria spp., Entamoeba spp., por exemplo, E. histolytica;Cryptosporidium spp., por exemplo, C. parvum; Cyclospora spp.; Encephali-tozoon spp., por exemplo, E. intestinalis; Enterocytozoon spp.; Giardia spp.,por exemplo, G. Iamblia; Isospora spp.; Microsporidium spp.; Plasmodiumspp., por exemplo, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax; Toxoplasmaspp., por exemplo, T. gondii; e Trypanosoma spp., por exemplo, T. brucei.Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que o(s) agente(s)patogênico(s) pode(m) ser um agente parasítico (por exemplo, parasitashelmínticos) incluindo, mas não de limitando a, patogênicos: Ascaris spp.,por exemplo, A. lumbricoides; Dracunculus spp., por exemplo, D. medinen-sis; Onchocerca spp., por exemplo, O. volvulus; Schistosoma spp.; Trichinel-Ia spp., por exemplo, T. spiralis; e Trichuris spp., por exemplo, T. trichiura.

Em outras modalidades o(s) agente(s) patogênico(s) pode(m)ser de um agente patogênicos viral incluindo, mas não se limitando a: Ade-novírus; Arenavírus, por exemplo, Vírus da Febre de Lassa; Astrovírus; Bu-niavírus, por exemplo, Hantavírus, Vírus da Febre de Rift Valley; Coronaví-rus, Deltavírus; Citomegalovírus, vírus Epstein-Barr, vírus do Herpes, vírusda Varicela; Filovírus, por exemplo, vírus Ebola, vírus de Marburg; Flavírus,por exemplo, vírus da Dengue, vírus da Febre do Nilo Ocidental, vírus daFebre Amarela; vírus da Hepatite; Influenzavírus; Lentivírus, vírus Linfotrópi-co de célula-T, outros vírus de leucemia; vírus Norwalk; Papilomavírus, ou-tros vírus de tumor; Paramixovírus, por exemplo, vírus do Sarampo, vírus daCaxumba, Parainfluenzavírus, Pneumovírus, vírus Sendai; Parvovírus; Pi-cornavírus, por exemplo, Cardio vírus, vírus Coxsackie, Ecovírus, vírus daPoliomielite, Rinovírus, outros Enterovírus; Poxvírus, por exemplo, vírus daVaríola, vírus da Vacínia, Parapoxvírus; Reovírus, por exemplo, Coltivírus,Orbivírus, Rotavírus; Rabdovírus, por exemplo, Lissavírus, vírus da estomati-te Vesicular; e Togavírus, por exemplo, vírus da Rubéola, vírus Sindbis, vírusda encefalite Ocidental.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que opeptídeo antigênico é selecionado a partir do grupo que consiste em umpeptídeo de parvovírus canino, peptídeo antigênico de antígeno protetor(PA) de Bacillus anthracis, e um peptídeo antigênico do vírus da encefaliteEqüina Oriental. Em outras modalidades o peptídeo antigênico é o peptídeoderivado de parvovírus canino. Em modalidades adicionais o peptídeo anti-gênico é o peptídeo antigênico de antígeno protetor (PA) de Bacillus anthra-cis com qualquer uma das seqüências de aminoácido das SEQ. ID. NOs: 4,6, 8, ou 10. Ainda em outras modalidades o peptídeo antigênico é um peptí-deo antigênico do vírus da Encefalite Oriental com a seqüência de aminoáci-do de uma das SEQ. ID. NOs: 11 ou 13.

A seqüência codificante para o peptídeo ou peptídeos antigêni-cos de interesse pode ser inserida na seqüência codificante para uma prote-ína de capsídeo viral ou de revestimento em um local predeterminado. Emalgumas modalidades o peptídeo é inserido na seqüência codificante docapsídeo para que seja expressa como um Ioop durante a formação de uma VLP.

Peptídeos podem ser inseridos em mais um local de inserçãoem um capsídeo. Dessa forma, peptídeos podem ser inseridos em mais deum motivo Ioop da superfície de um capsídeo; peptídeos podem ser inseri-dos em vários locais dentro de um dado motivo loop. 0(s) peptídeo(s) fun-cionais) e/ou estrutural(is) individual(is) do(s) inseto(s), e/ou o(s) inserto(s)de peptídeo inteiros, podem ser separados por sítios de clivagem, isto é, sí-tios nos quais um agente que cliva ou hidrolisa proteína pode agir para sepa-rar o(s) peptídeo(s) de restante da estrutura ou montagem do capsídeo.

Os peptídeos podem ser inseridos dentro de loop(s) voltado(s)para a face externa e/ou dentro de loop(s) voltado(s) para a face interna, istoé, dentro de alças do capsídeo que estão voltadas respectivamente para foraou em direção ao centro do capsídeo. Qualquer ligação de aminoácido oupeptídeo em um Ioop de superfície de um capsídeo pode servir como umainserção para o peptídeo. Tipicamente, o sítio de inserção pode ser selecio-nado aproximadamente no centro do loop, isto é, aproximadamente na posi-ção localizada mais distante do centro da estrutura terciária do peptídeo decapsídeo dobrado. A seqüência codificante do capsídeo pode ser inseridaoperativamente dentro da posição da seqüência codificante do capsídeo quecorresponde a esse centro aproximado do(s) loop(s) selecionado(s). Issoinclui a retenção da fase de leitura para aquela porção da seqüência de pep-tídeo do capsídeo que é sintetizada à jusante do sítio de inserção do peptí-deo. Em outras modalidades o peptídeo pode ser inserido na terminaçãoamino do capsídeo. O peptídeo pode ser ligado ao capsídeo através de umaou mais seqüências ligantes. Em algumas outras modalidades o peptídeopode ser inserido na terminação carbóxi do capsídeo. O peptídeo tambémpode ser ligado à terminação carbóxi através de um ou mais ligantes, quepodem ser cliváveis por hidrólise química ou enzimática. Em modalidadesadicionais, seqüências de peptídeo são ligadas a ambas as terminações a-mino e carbóxi, ou em uma terminação e pelo menos um local interno, talcomo um local que é expresso sobre a superfície do capsídeo na sua con-formação tridimensional. Para outras modalidades da presente invenção,pelo menos um peptídeo antigênico está expresso dentro de pelo menos umIoop interna, ou em pelo menos um Ioop da superfície externa da VLP.

Mais de um Ioop do capsídeo viral podem ser modificadas. Emalgumas modalidades o peptídeo antigênico está exposto sobre pelo menosduas alças de superfície da partícula semelhante a vírus. Em outras modali-dades pelo menos dois peptídeos antigênicos estão inseridos dentro de umaproteína do capsídeo e expostas sobre pelo menos duas alças da superfíciedo capsídeo viral, jaula ou partícula semelhante a vírus. Em outra modalida-de, pelo menos três peptídeos antigênicos estão inseridos dentro da proteínado capsídeo e expostas sobre pelo menos três alças de superfície da parti-cuia semelhante a vírus. Os peptídeos recombinantes nas alças de superfí-cie podem ter a mesma seqüência de aminoácidos. Em modalidades adicio-nais, a seqüência de aminoácido dos peptídeos recombinantes nas alças desuperfície difere.

A seqüência de ácido nucléico que codifica o capsídeo ou pro-teínas virais também pode ser modificada para alterar a formação das VLPs(vide, por exemplo, Brumfield, et al. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1049- 1053).Por exemplo, três classes gerais de modificação são as mais tipicamentegeradas para modificar a montagem da VLP. Essas modificações são plane-jadas para alterar o interior, o exterior ou a interface entre subunidades adja-centes na jaula de proteína montada. Para alcançar isso, iniciadores muta-gênicos podem ser usados para: (i) alterar a carga da superfície interior daregião de ligação de ácido nucléico viral pela substituição de resíduos bási-cos (por exemplo, K, R) na terminação N por ácidos glutâmicos acídicos(Douglas et al, 2002b); (ii) deletar resíduos do interior da terminação N (emCCMV, geralmente resíduos 4-37); (iii) inserir um cDNA que codifica umaseqüência de peptídeo de 11 aminoácidos que direciona para uma célula(Graf et al., 1987) em um Ioop exposto na superfície; e (iv) modificar intera-ções entre subunidades virais pela alteração dos sítios de ligação de metal(em CCMV, resíduos 81/148 mutante).

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que opeptídeo antigênico pode ser inserido dentro do capsídeo de um Vírus doMosqueado Clorótico do Feijão Caupi (CCMV). Em algumas modalidades opeptídeo pode ser inserido no aminoácido 129 do vírus CCMV. Em outramodalidade, a seqüência de peptídeo pode ser inserida nos aminoácidos 60,61, 62 ou 63 do vírus CCMV. Ainda em outra modalidade, o peptídeo podeser inserido tanto no aminoácido 129 como nos aminoácidos 60-63 do vírusCCMV.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em queuma seqüência "tag" adjacente ao peptídeo antigênico de interesse, ou liga-da a uma porção da proteína de capsídeo viral, também pode estar incluída.Em modalidades da presente invenção essa seqüência "tag" pode permitirpurificação do peptídeo de fusão da proteína de capsídeo recombinante. Aseqüência "tag" pode ser um "tag" de afinidade, tal como um "tag" de afini-dade por hexa-histidina. Em outra modalidade, o "tag" de afinidade pode seruma molécula de glutationa-S-transferase. O "tag" também pode ser umamolécula fluorescente, tal como YFP ou GFP1 ou análogos de tais proteínasfluorescentes. O "tag" também pode ser uma porção de uma molécula deanticorpo, ou um antígeno conhecido ou Iigante para um parceiro de ligaçãoútil para purificação.

III. Produção de Peptídeo de Fusão da Proteína de Capsídeo Recombinante

A presente invenção contempla o uso de sistema de expressãosintético ou qualquer tipo de sistema de expressão biológico para produzir ospeptídeos de fusão de capsídeo recombinantes para uso na subseqüentemontagem de VLPs multivalentes. Métodos atuais de expressão de proteínade capsídeo incluem sistemas de expressão de célula de inseto, sistemas deexpressão de célula bacteriana tais como E. coli, B. subtilus, e P. fluores-cens, sistemas de expressão de cultura de planta e de células de planta,sistemas de expressão de levedura tais como S. cervisiae e P. Pastoris, esistemas de expressão de mamífero.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que ospeptídeos de fusão de capsídeo recombinantes são produzidos em célulasde planta ou plantas inteiras. Em certas modalidades os peptídeos de fusãode capsídeo podem ser produzidos como proteínas solúveis. Em outra mo-dalidade, os peptídeos de fusão de capsídeo são montados em partículas devírus infecciosas. Em uma modalidade alternativa, os peptídeos de fusão decapsídeo são montados como VLPs.

Modalidades da presente invenção podem incluir aquelas emque os peptídeos de fusão da proteína de capsídeo recombinantes são pro-duzidos em uma cultura de célula bacteriana. Em modalidades, os peptídeosde fusão de capsídeo recombinantes podem se agregar como corpos de in-clusão insolúveis dentro da célula hospedeira. Em uma modalidade alternati-va os peptídeos de fusão da proteína de capsídeo são produzidos como mo-léculas solúveis dentro da célula hospedeira. Em outras modalidades ospeptídeos de fusão de capsídeo recombinantes são produzidos em uma cé-lula hospedeira de Pseudomonas1 incluindo uma célula de Pseudomonasfluorescens.

Os peptídeos de fusão da proteína de capsídeo para uso napresente invenção podem ser produzidos em sistemas de expressão biológi-cos utilizando técnicas bem-conhecidas na técnica. Por exemplo, construtosde ácido nucléico que codificam um peptídeo de fusão de uma proteína decapsídeo viral operativamente ligada a pelo menos um peptídeo antigênicopodem ser introduzidos em uma célula hospedeira e expressos. Elementosregulatórios transcricionais e traducionais, tais como seqüências intensifica-doras transcricionais, seqüências intensificadoras traducionais, promotores,sítios de entrada ribossomal, incluindo sítios de entrada ribossomal interno,ativadores, sinais de início e parada traducional, terminadores de transcri-ção, reguladores cistrônicos, reguladores policistrônicos, seqüências "tag",tais como seqüências que codificam seqüências de nucleotídeo "tags" e"tag", que facilitam a identificação, separação, purificação ou isolamento dopeptídeo de fusão da proteína de capsídeo recombinante expresso, incluindoHis-tag, Flag-tag, T7-tag, S-tag, HSV-tag, B-tag, Strep-tag, poliarginina, poli-cisteína, polifenilalanina, ácido poliaspártico, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, tioredoxina,beta-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase, ciclomaltodextrina gluco-notransferase, CTP:CMP-S-desóxi-D-mano-octulosonato citidiltransferase,trpE ou trpLE, avidina, estreptavidina, 10 gene 11, T4 gp55, proteína A esta-filocócica, proteína G estreptocócica, GST, DHFR, CBP, MBP, domínio deligação de galactose, domínio de ligação de calmodulina, KSI, c-myc, ompT,ompA, pelB, NusA, ubiquitina, hex-histidina, glutationa-S-transferase, GFP,YFP, ou análogos de tais proteínas fluorescentes, moléculas de anticorpo,hemolisina A, ou um antígeno conhecido ou Iigante para um parceiro de liga-ção conhecido útil para purificação pode ser ligado covalentemente a se-qüência descrita para que pela ação da célula hospedeira, os elementos re-gulatórios possam direcionar a expressão do peptídeo de fusão de proteínade capsídeo recombinante.

Em um processo de fermentação, uma vez que a expressão dopeptídeo de fusão recombinante é induzida, o ideal é ter um alto nível deprodução a fim de maximizar a eficácia da produção dos peptídeos de fusãode capsídeo.

IV. Purificação de Peptídeos de Fusão de Proteína de Capsídeo recombinantes

Uma vez que o peptídeo de fusão da proteína do capsídeo re-combinante, as partículas semelhantes a vírus ou as estruturas semelhantesa jaula são produzidas, elas podem ser isoladas e purificadas para purezasubstancial por técnicas padronizadas bem-conhecidas na técnica.

As técnicas de isolamento e purificação podem depender da cé-lula hospedeira utilizada para produzir os peptídeos de fusão da proteína decapsídeo recombinantes. Tais técnicas podem incluir, mas não se limitam aPEG, precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, croma-tografia de troca de anion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, croma-tografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografiade níquel, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de fase reversa,cromatografia de lectina, eletroforese preparatória, solubilização em deter-gente, precipitação seletiva com tais substâncias como cromatografia de co-luna, métodos de imunopurificação, cromatografia de exclusão de tamanho,métodos de imunopurificação, centrifugação, ultracentrifugação, centrifuga-ção de gradiente de densidade (por exemplo, em um gradiente de sacaroseou cloreto de césio (CsCI)), ultracentrifugação através de filtro de exclusãode tamanho, e quaisquer outros métodos de isolamento de proteína conhe-cidos na técnica. Por exemplo, peptídeo de fusão de proteína de capsídeoque tem propriedades de adesão molecular estabelecidas pode ser fundidode forma reversível a um ligante. Com o Iigante apropriado, o peptídeo defusão da proteína do capsídeo pode ser adsorvido seletivamente a uma co-luna de purificação e então liberado da coluna em uma forma relativamentepura. A proteína de capsídeo é então removida por atividade enzimática.

Além disso, o peptídeo de fusão da proteína do capsídeo por der purificadousando colunas de imunoafinidade ou colunas de Ni-NTA.Técnicas gerais são ainda descritas em, por exemplo, R. Sco-pes. "Peptide Purification: Principies and Practice", Springer- Verlag: N.Y.(1982); Deutscher, "Guide to Peptide Purification", Academic Press (1990);Pat. U.S. No. 4.511.503; S. Roe, "Peptide Purification Techniques: A Practi-cal Approach (Practical Approaeh Series)", Oxford Press (2001); D. Bollag, etal, "Peptide Methods", Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Peptide ExprPurif, 18(2): p. 182-92 (2000); e R. Mukhrja, et al., Gene 165(2): p. 303-6(1995). Vide ainda, por exemplo, Ausubel, et al. (1987 e suplementos perió-dicos); Deutscher (1990) "Guide to Peptide Purification," Methods in Enzy-mology vol. 182, e outros volumes nessa série; Coligan, et al. (1996 e su-plementos periódicos) "Current Protocols in Peptide Science" Wiley/Greene,NY; e literatura do fabricante sobre o uso de produtos de purificação de pep-tídeo, por exemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., ou Bio-Rad, Richmond,Calif. Combinação com técnicas recombinantes permite fusão a segmentosapropriados, por exemplo, a uma seqüência FLAG ou uma equivalente quepode ser fundida através de uma seqüência removível por protease. Videainda, por exemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli(1990) "Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent"em Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Ple-num Press, NY; e Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Levei Expres-sion & Peptide Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.

Em algumas modalidades, os peptídeos de fusão da proteínado capsídeo expressos nas células hospedeiras, especialmente células hos-pedeiras bacterianas, podem formar agregados insolúveis ("corpos de inclu-são"). Vários protocolos são adequados para purificação de peptídeos a par-tir de corpos de inclusão. Por exemplo, purificação de corpos de inclusãoenvolve tipicamente a extração, separação e/ou purificação de corpos deinclusão por quebra das células hospedeiras, por exemplo por incubação emum tampão de TRIS/HCL 50 mM pH 7.5, NaCI 50 mM, MgCI2 5 mM, DTT 1mM, ATP 0,1 mM, e PMSF 1 mM. A suspensão celular é tipicamente Iisadausando 2-3 passagens através de uma Prensa Francesa. A suspensão celu-lar também pode ser homogeneizada usando um "Polytron" (Brinknan ins-truments) ou sonicado em gelo. Métodos alternativos de Iisar bactérias sãoclaros para aqueles versados na técnica (vide, por exemplo Sambrook et al.,supra; Ausubel et al., supra).

Se necessário, os corpos de inclusão podem ser solubilizados,e a suspensão celular Iisada pode ser tipicamente centrifugada para removermaterial insolúvel indesejado. Peptídeos de fusão de proteína de capsídeoque formaram os corpos de inclusão podem ser renaturados por diluição oudiálise com um tampão compatível. Solventes adequados incluem, mas nãose limitam a uréia (de cerca de 4 M a cerca de 8 M), formamida (pelo menoscerca de 80% volume/volume), e cloridrato de guanidina (de cerca de 4 M acerca de 8 M). Embora o cloridrato de guanidina e agentes similares sejamdesnaturantes, essa desnaturação não é irreversível e renaturação podeocorrer por remoção (por diálise, por exemplo) ou diluição do desnaturante.Outros tampões adequados são conhecidos dos versados na técnica.

Alternativamente, é possível purificar os peptídeos de fusão daproteína de capsídeo recombinantes, partículas semelhantes a vírus, ou es-truturas de jaula a partir do periplasma. Após a Iise da célula hospedeira,quando o peptídeo recombinante é exportado para dentro do periplasma dacélula hospedeira, a fração periplasmática da bactéria pode ser isolada porchoque osmótico gelado além de outros métodos conhecidos dos versadosna técnica. Para isolar peptídeos recombinantes a partir do periplasma, porexemplo, as células bacterianas podem ser centrifugadas para formar umprecipitado. O precipitado pode ser ressupenso em um tampão contendo20% de sacarose. Para Iisar as células, as bactérias podem ser centrifuga-das e o precipitado pode ser ressuspenso em MgS04 5 mM gelado e manti-do em um banho de gelo por aproximadamente 10 minutos. A suspensãocelular pode ser centrifugada e o sobrenadante decantado e reservado. Ospeptídeos recombinantes presentes no sobrenadante podem ser separadosdos peptídeos do hospedeiro por técnicas de separação padronizadas bem-conhecidas daqueles versados na técnica.

Um fracionamento com sal inicial pode separar muitos dos pep-tídeos da célula hospedeira indesejados (ou peptídeos derivados do meio decultura celular) dos peptídeos de fusão da proteína do capsídeo recombinan-tes de interesse. Um exemplo pode ser sulfato de amônio. O sulfato de a -mônio precipita peptídeos reduzindo eficazmente a quantidade de água namistura de peptídeo. Peptídeos então precipitam com base na sua solubili-dade. Quanto mais hidrofóbico for o peptídeo, mais provavelmente ele preci-pitará em concentrações de sulfato de amônio menores. Um protocolo típicoinclui adicionar sulfato de amônio saturado a uma solução de peptídeo paraque a concentração de sulfato de amônio resultante esteja entre 20-30%.Essa concentração pode precipitar os peptídeos mais hidrofóbicos. O preci-pitado é então descartado (a menos que o peptídeo de interesse seja hidro-fóbico) e sulfato de amônio é adicionado ao sobrenadante para uma concen-tração conhecida para precipitar o peptídeo de fusão da proteína de capsí-deo de interesse. O precipitado é então solubilizado em tampão e o excessode sal é removido se necessário, tanto através de diálise como diafiltração.Outros métodos que contam com a solubilidade de peptídeos, tal como pre-cipitação em etanol gelado, são bem-conhecidos dos versados na técnica epodem ser usados para fracionar misturas complexas de peptídeo de fusãoda proteína de capsídeo.

O peso molecular de um peptídeo de fusão da proteína de cap-sídeo recombinante pode ser usado para isolá-lo de peptídeos de tamanhomaior ou menor usando ultrafiltração através de membranas de tamanho deporo diferente (por exemplo membranas Amicon ou Millipore). Como umaprimeira etapa, a mistura de peptídeo de fusão da proteína de capsídeo po-de ser ultrafiltrada através de uma membrana com tamanho de poro que temum ponto de corte de peso molecular menor do que o peso molecular dopeptídeo de fusão de capsídeo recombinante de interesse. O retentado daultrafiltração pode então ser ultrafiltrado contra uma membrana com um pon-to de corte molecular maior do que o peso molecular do peptídeo de fusãoda proteína de capsídeo de interesse. O peptídeo de fusão da proteína decapsídeo recombinante pode passar através da membrana para dentro dofiltrado. O filtrado pode então ser cromatografado como descrito abaixo.

Peptídeos de fusão da proteína de capsídeo recombinantes po-dem também ser separados de outros peptídeos com base no seu tamanho,carga da superfície, hidrofobicidade, e afinidade por ligantes. Além disso,anticorpos criados contra as proteínas de capsídeo podem ser conjugados amatrizes de coluna e as proteínas de capsídeo imunopurificadas. Todos es-ses métodos são bem-conhecidos na técnica. Pode ser evidente para umversado que técnicas cromatográficas podem ser realizadas em qualquerescala e usando equipamento de diferentes fabricantes (por exemplo, Phar-macia Biotech).

V. Desmontagem de partículas semelhantes a vírus montadas

Em um aspecto da presente invenção, peptídeos de fusão daproteína de capsídeo recombinantes que foram montados anteriormente empartículas semelhantes a vírus podem ser utilizados na presente invenção,em que as partículas semelhantes a vírus são desmontadas, e os peptídeosde fusão da proteína de capsídeo recombinantes das partículas semelhantesa vírus são isolados e purificados e subseqüentemente utilizados na forma-ção de partículas multivalentes semelhantes a vírus.

Processos de desmontagem são bem-conhecidos na técnica.Por exemplo, tampões de dissociação contendo Tris, EGTA, DTT, e NaCIpodem ser utilizadas para desmontar as partículas semelhantes a vírus pre-viamente montadas. Vide, por exemplo, Brady et al. (1977) "Dissociation ofpolyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purifiedvirions," J. Virology 23(3):717-724. Além disso, exposição prolongada a altosníveis de agentes redutores de sulfidrila tais como β-mercaptoetanol, glutati-ona, ditiotreitol, ditioeritritol, cisteína, sulfeto de hidrogênio, e misturas des-ses, pode ser utilizada para desmontar VLPs previamente montadas. Vide,por exemplo, Pat. U.S. No. 6.146.945. Métodos de desmontagem, tais comoaqueles descritos nos exemplos, também podem ser usados na presenteinvenção.

VI. Remontaqem de VLPs

Populações diferentes de peptídeos de fusão de capsídeo re-combinantes contendo insertos de peptídeo antigênico podem ser mistura-das in vitro e remontadas para formar partículas semelhantes a vírus. Em umaspecto da presente invenção, proteínas de capsídeo viral contendo insertosantigênicos são remontadas em VLPs que não possuem genomas de ácidonucléico viral infeccioso de extensão completa. Ácido nucléico viral infeccio-so de extensão completa é um ácido nucléico genômico de um vírus quecontém todas as seqüências de nucleotídeo que são necessárias para repli-cação viral na célula. Esses elementos incluem (i) regiões codificantes, (ii)regiões não-codificantes, e (iii) regiões regulatórias. O ácido nucléico genô-mico viral pode ser RNA ou DNA. As regiões não codificantes podem estarlocalizadas nas terminações 5' e 3' dos ácidos nucléicos virais ou elas po-dem estar localizadas entre as regiões codificantes. As regiões codificantespodem estar superpostas ou não-superpostas e podem ser multifuncionais.Tanto as regiões codificantes como as não codificantes podem ter funçõesregulatórias e conter elementos regulatórios tais como seqüências necessá-rias para replicação do vírus, ou encapsulação e formação de partícula.

Em modalidades adicionais a VLP pode ser remontada na pre-sença de um RNA viral. Em outra modalidade, a VLP é remontada na au-sência de ácidos nucléicos virais. Em outra modalidade, a VLP é remontadana presença de ácidos nucléicos não virais. Em outra modalidade, a VLP éremontada na presença de seqüências de ácido nucléico imunoestimulató-rias, tal como uma seqüência CpG.

Em um aspecto da presente invenção, populações separadasde populações de peptídeo de fusão de capsídeo recombinante contendodiferentes insertos de peptídeo antigênico são misturadas in vitro e remonta-das em partículas multivalentes semelhantes a vírus. As populações separa-das contem cada pelo menos um inserto de peptídeo antigênico que nãoestá presente em nenhum outro peptídeo de fusão recombinante que estásendo misturado.

Em uma modalidade, as fusões de capsídeo recombinantes sãomisturadas nas mesmas proporções, por exemplo, uma proporção 1:1, 1:1:1.Em outra modalidade as fusões de capsídeo recombinantes são misturadasem proporções diferentes por exemplo, 1:2, 1:3, 1:2:1, 2:1:3:1. Proporçõespodem ser determinadas pelo número de diferentes tipos de peptídeos defusão de capsídeo contendo insertos antigênicos incluídos na mistura. Emalgumas modalidades a mistura de peptídeos de fusão de capsídeo recom-binantes contém pelo menos uma primeira proteína de capsídeo viral con-tendo pelo menos um inserto antigênico, e uma segunda proteína de capsí-deo viral contendo pelo menos um inserto de peptídeo antigênico, em quepelo menos um inserto de peptídeo antigênico do segundo peptídeo de fu-são de capsídeo é derivado de uma seqüência de peptídeo antigênico dife-rente, ou de um agente patogênico diferente do que pelo menos um insertode peptídeo antigênico do primeiro peptídeo de fusão de capsídeo. Em al-gumas modalidades da presente invenção pelo menos duas populações depeptídeos de fusão de capsídeo recombinantes contendo insertos de peptí-deos antigênicos são misturadas, em que cada população contém pelo me-nos um inserto de peptídeo antigênico que não está presente no peptídeo defusão de capsídeo que está sendo misturado. O inserto de peptídeo antigê-nico pode ser do mesmo ou de diferentes agentes patogênicos. Em algumasmodalidades, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20, ou mais de 20 popula-ções de peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes são misturadas, emque cada população contém pelo menos um inserto de peptídeo antigênicoque não está presente em nenhuma outra população de peptídeo de fusãode capsídeo recombinante que está sendo misturada. Em outras modalida-des da presente invenção, proteínas de capsídeo contendo insertos de pep-tídeo não-antigênico também podem ser incluídas na mistura. Tais insertosde peptídeo não-antigênico incluem, mas não se limitam a peptídeos dire-cionadores, peptídeos que agem como moduladores do sistema imune, taiscomo citocinas e quimiocinas, e peptídeos que agem como adjuvantes deri-vados de meios sintéticos.

Além disso, seqüências de ácido nucléico não-viral podem seradicionadas à mistura, tais como seqüências imunoestimulatórias, que po-dem ser úteis em aumentar a resposta imune aos insertos de peptídeo anti-gênico contidos nas VLPs. Ácidos nucléicos imunoestimulatórios tais comoseqüências CpG, são oligonucleotídeos curtas que imitam a resposta imuneinata a DNA microbiano. CpGs contêm ou mais motivos que contem dinucle-otídeos citosina-fosfato-guanina (CpG) com resíduos de citosina não metila-dos. Motivos CpG não metilados contidos no DNA comuns em DNA bacteri-ano mas não mamífero mostraram induzir fortes respostas imunes polariza-das por TH1 tanto in vivo como in vitro. Enquanto não se deseja estar limita-do a uma única teoria, acredita-se que a indução de respostas de TH1 é umresultado da habilidade de seqüências imunoestimulatórias contendo CpG(oligodesoxinucleotídeos CpG) induzirem a ativação e secreção de IL-12 eIL-18 por macrófagos e células dendríticas. Essas citocinas então sinergizampara induzir a produção de IFN-gama por células natural killer e células T.Além disso, CpGs fazem com que células dendríticas imaturas sejam matu-radas para células apresentadoras de antígeno profissionais capazes de ati-var células T naive reativas ao antígeno. CpGs também são capazes de le-var diretamente linfócitos B a proliferar e disparar a produção de imunoglo-bulina.

Em uma modalidade, a VLP remontada inclui seqüências CpGnão metiladas dentro de um hexâmero palindrômico que segue a fórmula 5'-R1R2CGY1Y2-3' (SEQ ID NO: 19), onde R1 é uma purina (preferência paraG), R2 é uma purina ou T, e Y1 e Y2 são pirimidinas. Em uma modalidade, aVLP inclui uma seqüência CpG selecionada a partir do grupo que consisteem 5'-GACGTC-3' (SEQ ID NO: 20), 5'-AGCGCT-3' (SEQ ID NO: 21), e 5'-AACGTT-3' (SEQ ID NO: 22), ou uma combinação dessas. Em uma modali-dade a VLP inclui uma seqüência CpG que compreende 5 1 TCC ATG ACGTTC CTG ACG TT 3 ' (SEQ ID NO: 23). Em outra modalidade, a seqüênciade oligonucleotídeo CpG é AACGTTCG (SEQ ID NO: 24).

A partícula semelhante a vírus resultante, ou estrutura de jaula,que é formada após a remontagem das populações mistas de peptídeos defusão de capsídeo recombinantes, conforme descrito acima, contém pelomenos o mesmo número de peptídeos antigênicos diferentes que as popula-ções mistas. Por exemplo, se duas populações de peptídeos de fusão decapsídeo recombinantes são misturadas, cada população contendo pelomenos um peptídeo antigênico que não está presente na outra população,então a partícula semelhante a vírus resultante pode conter pelo menos doisinsertos de peptídeo antigênicos diferentes.

Em outro aspecto da presente invenção, populações separadasde peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes contendo pelo menos uminserto de peptídeo antigênico são misturadas in vitro para formar VLPs1 emque cada população de peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes con-tém pelo menos uma proteína de capsídeo derivada de um vírus diferente doque qualquer outro peptídeo de fusão de capsídeo recombinante que estásendo misturado. Em outras modalidades, a mistura de peptídeos de fusãode capsídeo recombinantes contém pelo menos uma primeira proteína decapsídeo viral contendo pelo menos um inserto de peptídeo antigênico euma segunda proteína de capsídeo viral contendo pelo menos um inserto depeptídeo antigênico, em que a proteína de capsídeo da primeira proteína decapsídeo viral é derivada de um vírus diferente do que a proteína de capsí-deo da segunda proteína de capsídeo viral. Em outras modalidades o insertode peptídeo antigênico pode ser a mesma ou uma seqüência de peptídeodiferente. Ainda em modalidades adicionais, o inserto de peptídeo antigênicopode ser do mesmo ou de agentes patogênicos diferentes. Em algumas mo-dalidades 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 20, ou mais de 20 populaçõesde peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes são misturadas, em quecada população contém uma proteína de capsídeo viral derivada que nãoestá presente em nenhuma outra população de peptídeo de fusão de capsí-deo recombinante que está sendo misturada. Em modalidades adicionais dapresente invenção, proteínas de capsídeo contendo insertos de peptídeonão-antigênicos podem ser inclusa na mistura, como discutido acima. Alémdisso, seqüências de ácido nucléico não-virais podem ser adicionadas á mis-tura, tal como seqüências CpG, que podem ser úteis em aumentar a respos-ta imune aos insertos de peptídeo antigênico contidos nas VLPs.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em queproteínas de fusão de capsídeo que não contêm insertos de peptídeo (prote-ínas de capsídeo selvagens) também podem ser adicionadas às misturasdescritas acima. As proteínas de capsídeo viral selvagens podem ser deri-vadas de qualquer vírus, incluindo o mesmo vírus ou um vírus diferente deum usado para derivar o peptídeo de fusão de capsídeo que contém o inser-to de peptídeo antigênico.

A remontagem dos peptídeos de fusão de capsídeo pode pro-duzir partículas semelhantes a vírus ou estruturas de jaula. Em algumas mo-dalidades a VLP ou estrutura de jaula é uma montagem multimérica doscapsídeos mistos, incluindo de três a cerca de 1000 ou mais capsídeos. Emoutras modalidades a VLP ou estrutura de jaula inclui pelo menos 30, pelomenos 50, pelo menos 60, pelo menos 90, pelo menos 120, ou pelo menos200 capsídeos. Em outra modalidade, cada VLP ou estrutura de jaula incluipelo menos 150 capsídeos, pelo menos 160 capsídeos, pelo menos 170 oupelo menos 180 capsídeos.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que aVLP pode ser remontada como uma estrutura icosaédrica. Em outra modali-dade, a VLP é remontada na mesma geometria que o vírus nativo do qual aseqüência de capsídeo é derivada. Em uma outra modalidade, entretanto, aVLP não tem a geometria idêntica no vírus nativo. Em algumas modalidades,por exemplo, a estrutura é produzida em uma partícula formada de múltiploscapsídeos, mas que não formam uma estrutura de VLP do tipo nativa. Porexemplo, uma estrutura de jaula, de apenas 3 capsídeos virais pode ser for-mada. Em modalidades separadas, estruturas de jaula de cerca de 6, 9, 12,15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, ou 60 capsídeospodem ser formadas.

Em alguns aspectos, a presente invenção fornece a habilidadede controlar e direcionar a proporção de insertos de peptídeo antigênico con-tidos na VLP remontada no estágio de mistura. As proporções de insertos depeptídeo antigênico contidos na VLP podem ser ajustáveis através dasquantidades adicionadas á mistura antes da montagem. Dessa maneira, apresente invenção pode permitir regulação e controle mais estreitos daquantidade de alguns peptídeos antigênicos contidos em uma VLP remonta-da do que é alcançável quando a VLP é montada in vivo. Tal controle, porexemplo, pode ser útil em uma estratégia de vacina que utiliza uma VLP quecontém um peptídeo antigênico que está sendo usado como um inoculantepela primeira vez em um animal, e um segundo peptídeo antigênico que estásendo usando como um "reforço" porque o peptídeo antigênico já foi usadoanteriormente como um inoculante em um animal. Nesse caso, por exemplo,o peptídeo antigênico de "reforço" pode estar presente em uma quantidademenor do que o outro peptídeo antigênico, e, usando o método atual, a po-pulação de peptídeo de fusão de capsídeo recombinante contendo o peptí-deo antigênico de "reforço" pode ser adicionada à mistura em uma quantida-de menor do que a população contendo o outro inserto de peptídeo antigêni-co. Em outras modalidades pelo menos uma das estruturas de VLP remon-tadas inclui pelo menos um peptídeo de fusão de capsídeo de cada popula-ção adicionada á mistura. Em modalidades adicionais as estruturas de VLPremontadas incluem proporções aproximadamente iguais de cada peptídeode fusão de capsídeo de cada população adicionada à mistura. Alternativa-mente, as proporções podem ser ajustadas conforme desejado, em que pro-porções desproporcionais de misturas são obtidas.

Montagem de partícula semelhante a vírus requer proteínas decapsídeo corretamente dobradas. Entretanto, fatores adicionais significantespara a formulação estabilidade de VLP podem existir, incluindo pH, forçaiônica, ligações dissulfeto, ligação de cátion divalente, entre outros. Vide porexemplo, Brady et al, (1977) "Dissociation of polyoma virus by the chelationof calcium ions found associated with purified virions," J. Virol. 23(3):717-724; Gajardo et al, (1997) "Two proline residues are essential in the calciumbinding activity of rotavirus VP7 outer capsid protein," J. Virol., 71:2211-2216; Walter et al, (1975) "Intermolecular disulfide bonds: an important struc-tural feature of the polyoma virus capsid," Cold Spring Har. Symp. Quant.Biol., 39:255-257 (1975); Christansen et al, (1977) "Characterization of com-ponente released by alkali disruption of simian virus 40," J Virol., 21:1079-1084; Salunke et al, (1986) "Self-assembly of purified polyomavirus capsidprotein VPI," Cell 46:895-904; Salunke et al, (1989) "Polymorphism in theassembly of polyomavirus capsid protein VP," Biophys. J., 56:887- 900; Gar-cea et al, (1983) "Host range transforming gene of polyoma virus plays a rolein virus assembly," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:3613-3617; Xi et al, (1991)"Baculovirus expression of the human papillomavirus type 16 capsid prote-ins: detection of L1-L2 protein complexes," J. Gen. Virol., 72:2981-2988.Técnicas que podem ser utilizadas para a remontagem são bem-conhecidasna técnica, e incluem, mas não se limitam às técnicas escritas nos Exemplos.

A remontagem dos peptídeos de fusão de capsídeo produz par-tículas semelhantes a vírus ou estruturas de jaula. Em outras modalidades aVLP ou estrutura de jaula é uma montagem multimérica dos peptídeos defusão de capsídeo misturados, incluindo de três a cerca de 1000 ou maiscapsídeos. Em modalidades adicionais, a VLP ou estrutura de jaula incluipelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 90, pelo menos120 capsídeos, ou pelo menos 200 capsídeos. Em outra modalidade cadaVLP ou estrutura de jaula inclui pelo menos 150 capsídeos, pelo menos 160capsídeos, pelo menos 170 capsídeos ou pelo menos 180 capsídeos.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que aVLP é remontada como uma estrutura icosaédrica. Em outras modalidades aVLP pode ser remontada na mesma geometria que o vírus nativo do qual aseqüência de capsídeo é derivada. Em modalidades adicionais a VLP nãotem a geometria idêntica a do vírus nativo. Em algumas modalidades, porexemplo, a estrutura é produzida em uma partícula formada de múltiploscapsídeos, mas que não forma uma estrutura de VLP do tipo nativa. Por e-xemplo, uma estrutura de jaula de apenas 3 capsídeos virais pode ser for-mada. Em modalidades separadas, estruturas de jaula de cerca de 6, 9, 12,15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, ou 60 capsídeospodem ser formadas.

VII. Vacinações

Em alguns aspectos da presente invenção, as VLPs multivalen-tes remontadas podem ser utilizadas em uma estratégia de induzir uma res-posta imune em um animal ou um ser humano. Modalidades da presenteinvenção incluem aquelas em que a proteína de capsídeo viral utilizada nopeptídeo de fusão de capsídeo é derivada de um vírus CCMV. Em algumasmodalidades os insertos antigênicos contidos nas VLPs incluem o "AntígenoProtetor" de Bacillus anthracis, ou, alternativamente, a glicoproteína E2 daEncefalite Eqüina Oriental.

Em geral, uma quantidade eficaz de VLP é administrada a umanimal ou ser humano que é suficiente para induzir uma resposta imune. Aquantidade administrada para induzir tal resposta pode ser determinada portécnicas geralmente conhecidas na técnica. Em algumas modalidades aquantidade de VLP administrada é vantajosamente entre 10 e 500 pg poranimal ou ser humano individual. A quantidade da VLP administrada podevariar como uma função da via de administração e do peso do indivíduo.

A vacina contendo a VLP pode ser administrada através de umveículo farmaceuticamente aceitável. O veículo farmaceuticamente aceitávelpode ser qualquer veículo fisiológico conhecido daqueles versados na técni-ca útil para formular farmacêuticos. Em algumas modalidades o veículo far-macêutico pode ser um líquido e a vacina contendo a VLP poderia estar naforma de uma solução. Em uma modalidade adicional, o veículo farmacêuti-co é um gel e a vacina contendo a VLP está na forma de um supositório oucreme. Ainda em modalidade adicional, a vacina contendo a VLP pode serformulada como uma parte de um emplastro transdérmico farmaceuticamen-te aceitável.

Veículos líquidos são usados na preparação de soluções, sus-pensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. A VLPpode ser suspensa em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável talcomo água, um solvente orgânico, uma mistura de ambos ou óleos ou gor-duras farmaceuticamente aceitáveis. O veículo líquido pode conter outrosaditivos farmacêuticos adequados tais como solubilizantes, emulsificantes,tampões, conservantes, adoçantes, agentes flavorizantes, agentes de sus-pensão, agentes espessantes, cores, reguladores de viscosidade, estabili-zantes ou osmo-reguladores. Exemplos adequados de veículos líquidos paraadministração oral e parenteral incluem água (contendo parcialmente aditi-vos como acima, por exemplo, derivados de celulose, solução de carbóximetil celulose), alcoóis (incluindo alcoóis monoídricos e poliídricos, por e-xemplo, glicóis) e seus derivados, e óleos (por exemplo, óleo de coco fracio-nado e óleo de amendoim). Para administração parenteral, o veículo tam-bém pode ser um éster oleoso tal como oleato de etila e miristato de isopro-pila. Veículos líquidos estéreis são úteis em composições de forma líquidaestéreis para administração parenteral. O veículo líquido para composiçõespressurizadas pode ser hidrocarboneto halogenado ou outro propelente far-maceuticamente aceitável. Geralmente, o veículo líquido não interfere com odobramento da VLP remontada.

A vacina contendo a VLP pode ser administrada usando qual-quer técnica atualmente utilizada na técnica, incluindo, por exemplo, oral-mente, pela mucosa, intravenosamente, intramuscularmente, intratecalmen-te, epiduralmente, intraperitonealmente ou subcutaneamente. Em algumasmodalidades a VLP é liberada na mucosa através do nariz ou boca. Em ou-tras modalidades a VLP remontada é compreendida de uma proteína decapsídeo derivada de CCMV, e liberada através da mucosa.

EXEMPLOS

Nesses exemplos, o vírus do mosqueado clorótico do feijãocaupi (CCMV) foi usado como um transportador de peptídeo e Pseudomo-nas fluorescens foi usada como hospedeiro de expressão. CCMV é ummembro do grupo bromovírus dos Bromoviridae. Bromovírus são vírus ico-saédricos de 25-28 nm de diâmetro, com um genoma de RNA filamento sim-ples, sentido positivo, de quatro componentes. RNA1 e RNA2 codificam en-zimas replicase. RNA3 codifica uma proteína envolvida em movimento viraldentro de hospedeiros de planta. RNA4 (um RNA sub-genômico derivado doRNA3), isto é, sgRNA4, codifica a proteína do capsídeo (CP) de 20 kDa,SEQID NO: 1.

Proteína de revestimento de CCMV selvagem codificada por sgRNA4(SEQID NO: 1)_

Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala AlaAla Arg Lys

Asn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val Ile Val Glu Pro He AlaSerGIyGIn Gly_Lys Ala Ile Lys Ala Trp Thr Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr Ala SerCys Ala Ala Ala

Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala Ile Thr Ile Ser Leu Pro Asn Glu Leu SerSer Glu Arg Asn

Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu Trp Leu Gly Leu Leu ProSer Val Ser Gly

Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ser PheGln Val Ala

Leu Ala Val Ala Asp Asn Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro GluAla Phe Lys

Gly Ile Thr Leu Glu Gln Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ile Tyr Leu Tyr SerSer Ala Ala Leu

Thr Glu Gly Asp Val Ile Val His Leu Glu Val Glu His Val Arg Pro ThrPhe Asp Asp

Ser Phe Thr Pro Val Tyr_

Cada partícula de CCMV contém até cerca de 180 cópias daCP de CCMV. Uma seqüência de DNA exemplar que codifica CP de CCMVé mostrado na SEQ ID N0:2

Seqüência de DNA exemplar que codifica CP de CCMV (SEQ ID NO: 2)atg tct aca gtc gga aca ggg aag tta act cgt gca caa cga agg gct gcg gcc cgtaag aac aag

cgg aac act cgt gtg gtc caa cct gtt att gta gaa ccc ate gct tca ggc caa ggc aaggct att aaa

gca tgg acc ggt tac age gta tcg aag tgg acc gcc tct tgc gcg gcc gcc gaa gctaaa gta acc tcg

gct ata act ate tct etc cct aat gag cta tcg tcc gaa agg aac aag cag ctc aag gtaggt aga gtt tta

tta tgg ctt ggg ttg ctt ccc agt gtt agt ggc aca gtg aaa tcc tgt gtt aca gag acgcag act act gct

gct gcc tcc ttt cag gtg gca tta gct gtg gcc gac aac tcg aaa gat gtt gtc gct gct<table>table see original document page 39</column></row><table>

A estrutura cristalina de CCMV foi esclarecida. Essa estruturafornece uma visão mais clara das interações da proteína de revestimentoque parecem ser críticas para a estabilidade e dinâmica da partícula e foi degrande ajuda na orientação do desenho racional de sítios de inserção. Estu-dos anteriores demonstraram que as proteínas de revestimento de CCMVpodem ser modificadas geneticamente para transportar peptídeos heterólo-gos sem interferir com sua habilidade de formar partículas. Vários sítios deinserção adequados foram identificados.

Acredita-se que um total de até cerca de 180 cópias de uma u-nidade de peptídeo heterólogo (seja um peptídeo individual ou concatâmero)podem ser inseridas na partícula de CCMV se um único sítio de inserção naCP de CCMV for usado. Sítios de inserção identificados dentro de CP deCCMV até agora podem acomodar peptídeos de várias extensões. Além dis-so, formas multiméricas dos peptídeos podem ser inseridas nos sítios deinserção. Além disso, múltiplos sítios de inserção podem ser usados aomesmo tempo para expressar peptídeos iguais ou diferentes na/sobre amesma partícula. Os insertos de peptídeos podem ter cerca de 200 resíduosde aminoácidos ou menos de extensão, mais tipicamente até ou cerca de180, ainda mais tipicamente até ou cerca de 150, ainda mais tipicamente atéou cerca de 120 e ainda mais tipicamente até ou cerca de 100 resíduos deaminoácidos de extensão. Em algumas modalidades, os insertos de peptí-deo podem ter cerca de 5 ou mais resíduos de aminoácidos de extensão.

Em outras modalidades, os insertos de peptídeo podem ter cerca de 5 a cer-ca de 200, cerca de 5 a cerca de 150, cerca de 5 a cerca de 120, mais tipi-camente cerca de 5 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos de extensão.Materiais e Métodos

A menos que observado o contrário, técnicas padronizadas, ve-tores, elementos de seqüência de controle e outros elementos do sistema deexpressão conhecidos no campo da biologia molecular são usados para amanipulação, transformação e expressão de ácido nucléico. Tais técnicaspadronizadas, vetores e elementos podem ser encontrados, por exemplo,em: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995)(John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Clo-ning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel,Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987)(Academic Press); e Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmidsand Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).

Construções de Mapa de Plasmídeo

Todos os mapas de plasmídeo foram construídos usando VEC-TORNTI (InforMax Inc., Frederick, MD, EUA).

Extrações de DNA

Todas as extrações de DNA do plasmídeo de E. coli foram rea-lizadas usando os kits mini, midi e maxi da Qiagen (Alemanha) de acordocom as instruções do fabricante.

Estratégia Experimental

Os seguintes procedimentos foram seguidos. Células hospedei-ras de P. fluorescens foram transformadas com plasmídeos de expressãoque codificam fusões quiméricas de proteína de revestimento viral-inserto depeptídeo-alvo. As células transformadas foram cultivadas até a densidadedesejada e induzidas a expressar as fusões de proteína de revestimento vi-ral-peptídeo. As células foram então Iisadas e seus conteúdos analisados.

Exemplo 1 - Síntese de peptídeo e clonagem em CP de CCMV

1 .A.Clonagem de Antígeno Protetor

Quatro peptídeos de antígeno protetor ("PA") diferentes de Ba-Cillus anthracis (PA1-PA4) foram expressos independentemente em VLPs deCCMV. Ácidos nucléicos que codificam PA1-PA4 foram sintetizados porSOE ("splicing-by-overlap-extension") de oligonucletídeos sintéticos. Cadaum dos insertos foi sintetizado pela superposição de de oligos de DNA como programa de termociclagem detalhado abaixo:

<table>table see original document page 41</column></row><table>

* (de Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA, daqui para diante"Invitrogen")

Os ácidos nucléicos resultantes continham terminação de sítiode reconhecimento de BamHI. As seqüências de nucleotídeos que codifi-cam, e as seqüências de aminoácidos, desses protídeos PA eram respecti-vamente como se segue: 1) para PA1, SEQ ID NOs: 3 e 4; 2) para PA2,SEQ ID NOs: 5 e 6; 3) para PA3, SEQ ID NOs: 7 e 8; e 4) para PA4, SEQ IDNOs: 9 e 10. Os ácidos nucléicos resultantes foram digeridos com BamHIpara criar extremidades aderentes para clonagem no vetor de transferência.Cada um dos insertos de PA resultantes foi clonado no plasmídeo de trans-ferência pESC-CCMV129BamHI no sítio de BamHI de CCMV129 CDS. Ca-da plasmídeo de transferência resultante foi digerido com as enzimas de res-trição Spel e Xhol. Cada um dos fragmentos quiméricos desejados que codi-fica CCMV129-PA foi isolado por purificação em gel.<table>table see original document page 42</column></row><table>

Os polinucleotídeos CCMV129PA quiméricos resultantes foramentão inseridos, cada, no plasmídeo de expressão pMYC1803 no lugar daseqüência codificante de buibui, em ligação operativa com o promotor tac. Oplasmídeo de expressão resultante foi rastreado por digestão de restriçãocom Spel e Xhol para a presença do inserto.

1 .B. Gliproteína E2 da Encefalite Eqüina OrientalDois peptídeos EEE diferentes (EEE- 1 -25 e EEE- 238-262) fo-ram expressos independentemente em VLPs de CCMV, representando pep-tídeos de 25 AA da glícoproteína E2 do Vírus da Encefalite Eqüina Oriental.

Seqüência do peptídeo de EEE-1-25:DLDTHFTQYKLARPYIADCPNCGHS (SEQ. ID. NO: 11)Seqüência de ácido nucléico de EEE-1-25:5'-gacctggacacccacttcacccagtacaagctggcccgcccgtacatcgccgactgcccgaactgcggccacagc-3' (SEQ. ID. NO: 12).

Seqüência do peptídeo de EEE-238-262:GRLPRGEGDTFKGKLHVPFVPVKAK (SEQ. ID. NO: 13)Seqüência de ácido nucléico de EEE-238-262:5'-ggccgcctgccgcgcggcgaaggcgacaccttcaagggcaagctgcacgtgccgttcgtgccggtgaaggccaag-3'

(SEQ ID NO: 14).

Ácidos nucléicos que codificam EEE-1-25 e EEE-238-262 foramsintetizados por SOE de oligonucleotídeos sintéticos. Os ácidos nucléicosresultantes continham a terminação do sítio de reconhecimento de BamHI.Os iniciadores de oligonucleotídeo de sentido direto e reverso para a síntesedos insertos incluíam os sítios de restrição de BamHI e eram como segue:EEE1.S:

5' - cgg gga tcc tgg acc tgg aca ccc act tca ccc agt aca age tgg ccc gcc cgtac-3'(SEQ ID NO: 15)EEEI. AS:

5' - cgc agg ate ccg ctg tgg ccg cag ttc ggg cag tcg gcg atg tac ggg egg gccage - 3' (SEQ ID NO: 16)EEE2.S:

5' - cgg gga tcc tgg gcc gcc tgc cgc gcg gcg aag gcg aca cct tca agg gea age-3'(SEQIDNO: 17)

EEE2.AS:

5' - cgc agg ate ccc ttg gcc ttc acc ggc acg aac ggc acg tgc age ttg ccc ttg - 3'

(SEQ ID NO: 18)

Os ácidos nucléicos resultantes foram digeridos com BamHI pa-ra criar terminações adesivas para clonagem no plasmídeo de transferênciapESC-CCMV129BamHI.

Cada um dos insertos de EEE resultantes foi clonado no plas-mídeo de transferência pESC-CCMV129BamHI no sítio de BamHI de CCMV129 CDS. Cada plasmídeo de transferência resultante foi digerido com asenzimas de restrição Spel e Xhol. Cada um dos fragmentos quiméricos quecodifica CCMV-129-EEE foi isolado por purificação em gel.

Os fragmentos do polinucleotídeo CCMV129-EEE quimérico re-sultantes foram então inseridos, cada, no plasmídeo de expressãopMYC1803 restrito com Spel e Xhol no lugar da seqüência codificante bui-bui, em ligação operativa com o promotor tac. O plasmídeo de expressãoresultante foi rastreado por digestão de restrição com Spel e Xhol para apresença do inserto.

Exemplo 2 - Expressão de peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV re-combinantes

Os plasmídeos de expressão do peptídeo de fusão CCMV129foram transformados em células hospedeiras de Pseudomonas fluorescensMB214 de acordo com o seguinte protocolo. Células hospedeiras foram des-congeladas gradualmente em frascos mantidos em gelo. Para cada trans-formação 1μΙ_ de DNA do plasmídeo de expressão purificado foi adicionadoàs células hospedeiras e a mistura resultante foi agitada gentilmente comuma ponteira de pipeta para misturar, e então incubada sobre gelo por 30min. A mistura foi transferida para cubetas descartáveis de eletroporação(BioRad Gene Pulser Cuvette, distância dos eletrodos de 0,2 cm, cat. no.165-2086). As cubetas foram colocadas em um Biorad Gene Pulser pré-ajustado a 200 Ohms, 25 pfarads, 2,25kV. As células foram pulsadas rapi-damente (cerca de 1-2 seg). Meio LB gelado foi então adicionado imediata-mente e a suspensão resultante foi incubada a 30°C por 2 horas. As célulasforam então plaqueadas em ágar LB tet15 (meio LB suplementado com te-traciclina) e cultivadas a 30°C durante a noite.

Uma colônia foi retirada de cada placa e a amostra colhida foiinoculada dentro de 50 mL de cultura de semeadura LB em um frasco deagitação com chicana. Culturas de suspensão líquidas foram cultivadas du-rante a noite a 30°C com agitação a 250 rpm. 10 mL de cada cultura de se-meadura resultante foram então usados para inocular 200 mL de meio "sha-ke-flask" (isto é, extratos de levedura e sal com elementos traço, citrato desódio, e glicerol, pH 6.8) em um frasco de agitação com chicana de 1 litro.

Tetraciclina foi adicionada para seleção. As culturas inoculadas foram culti-vadas durante a noite a 30°C com agitação a 250 rpm e induzidas com IPTGpara expressão das proteínas de revestimento quiméricas do peptídeo defusão CCMV129. Alíquotas de 1 mL de cada cultura de "shake-flask" foramentão centrifugados para precipitar as células. Os precipitados celulares fo-ram ressuspensos em 0,75 mL de Tris-HCI 50mM gelado, pH 8.2, contendo2mM de EDTA. 0,1% do volume de detergente TritonX-100 foi então adicio-nado, seguido por uma adição de Iisozima para uma concentração final de0,2 mg/mL. As células foram então incubadas em gelo por 2 horas, tempo noqual um Iisado celular claro e viscoso deveria ser aparente.

Aos lisados, 1/200 volume de MgCI2 1M foi adicionado, seguidopor uma adição de 1/200 volume de DNAse 2 mg/mL, e então incubação emgelo por 1 hora, tempo pelo qual o Iisado deveria se tornar um líquido muitomenos viscoso. Os lisados tratados foram centrifugados por 30 min a 4°c emvelocidade máxima em uma centrífuga "tabletop" e os sobrenadantes foramdecantados em tubos limpos. Os sobrenadantes decantados são as fraçõesde proteína "solúveis". Os precipitados restantes foram então ressuspensosem 0,75 mL de tampão TE (Tris-CI IO mM1 pH 7.5, EDTA 1 mM). Os precipi-tados ressuspensos são então as frações "insolúveis".

Essas frações "solúveis" e "insolúveis" foram então submetidasa eletroforese em géis de Bis-Tris 4-12% NuPAGE (de Invitrogen, Cat.NP0323), tendo 15 χ 1,0 mm cavidades, de acordo com a especificação dofabricante. 5 μί de cada fração foram combinados com 5 \iL do tampão deaplicação de SDS-PAGE redutor a 2X, e fervidos por 5 minutos antes de cor-rer no gel. Os géis foram corados com SimpIyBIue Safe Stain (de Invitrogen,Cat. LC6060) e descorados durante a noite com água. Detecção por Wes-tern blot empregou IgG de CCMV (No. de Acesso AS00I1 de DSMZ, Alema-nha) e o kit WESTERN BREEZE (de Invitrogen, Cat. WB7105), seguindo osprotocolos do fabricante.

A figura 1 mostra a expressão de proteínas de capsídeo deCCMV recombinantes manipuladas para expressar os insertos de peptídeoΡΑ1, ΡΑ2, ΡΑ3 e ΡΑ4 na fração insolúvel. O peptídeo de fusão de capsídeorecombinante está indicado por uma seta. A figura 2 mostra a expressão depeptídeos de fusão de CCMV recombinantes manipulados para expressar osinsertos de peptídeo PA1, PA2, PA3 e PA4 na fração solúvel.

Exemplo 3 - Remontaaem de VLP

3. A. Remontagem de VLP sem RNA:

Para montar as partículas semelhantes a vírus, 50 ml de culturade células hospedeiras de Pseudomonas fluorescens expressando peptí-deos de fusão de capsídeo recombinante foi submetido à prensa francesa, eas frações solúvel e insolúvel foram separadas por centrifugação. Os corposde inclusão insolúveis foram lavados duas vezes. Amostras das frações so-lúvel e insolúvel foram tomadas e armazenadas a -80°C. A fração insolúvelfoi ressuspensa em tampão B (Tris 50 mM pH 7.5, NaCI 1M, DTT 1 mM)contendo 8M de uréia a 4°C durante a noite. A solução de uréia 8M foi entãodiluída em incrementos de 0,25 M com tampão B até uma concentração finalde 2M de uréia. Polietilenimina (PEI) foi adicionada para uma concentraçãofinal de 0,033%, e a solução foi incubada em gelo por 10 minutos. O sobre-nadante foi dialisado contra Tampão B (3 trocas de tampão) para removercompletamente a uréia durante a noite. O sobrenadante foi centrifugado a27.000 χ g por 30 minutos.

Para determinar o rendimento final de peptídeo de fusão decapsídeo de CCMV recombinante, o sobrenadante foi analisado por absor-bância a 280 nm, usando um coeficiente de 1,20 para proteína de capsídeolivre para quantificar a quantidade de proteína de fusão de capsídeo na solução.10 μΜ de solução de peptídeo de fusão de capsídeo foi dialisa-da em Tampão (usar 1 mg de peptídeo de fusão de capsídeo por 4 ml) con-tra tampão de Montagem Vazia ("Empty Assembly buffer") (Acetato de Sódio50mM pH 5.2, NaCI 1mM, EDTA 1mM, DTT 1mM) por 2 h a4°C. As partícu-Ias montadas foram lavadas com tampão de montagem vazia usando micro-concentradores Centricon-100. O retentado de amostra contendo as VLPsmontadas foi medido por absorbância a 280 nm para determinar o rendimen-to de VLP. Uma porção da amostra foi aplicada em um gradiente de sacaro-se para determinar a montagem de VLP, e a porção restante foi concentradaem Tampão de Vírus (Acetato de Sódio 0,1 M, pH 5.2), e corrido em umSDS-PAGE.

3. B. Montagem de VLP com RNA:

Para montar as partículas semelhantes a vírus, 50 ml de culturade células hospedeiras de Pseudomonas fluorescens expressando peptí-deos de fusão de capsídeo recombinantes foi submetida à prensa francesa,e as frações solúvel e insolúvel foram separadas por centrifugação. Os cor-pos de inclusão insolúveis foram lavados 2 vezes. Amostras das frações so-lúvel e insolúvel foram tomadas e armazenadas a -80°C. A fração insolúvelfoi ressuspensa em Tampão B (Tris 50 mM pH 7.5, NaCI 1M, DTT 1mM)contendo 8M de uréia a 4°C durante a noite. A solução de uréia a 8M foi en-tão diluída em incrementos de 0,25M com Tampão B para uma concentra-ção final de 2,0 M de uréia. Polietilenimina (PEI) foi adicionada para umaconcentração final de 0,033%, e a solução foi incubada em gelo por 10 minu-tos. O sobrenadante foi centrifugado a 27.000 χ g por 30 minutos. O sobre-nadante foi dialisado contra Tampão B (3 trocas de tampão) pára removercompletamente a uréia durante a noite.

Para determinar o rendimento final de peptídeo de fusão decapsídeo de CCMV recombinante, o sobrenadante foi analisado por absor-bância a 280 nm, usando um coeficiente de extinção de 1,20 para proteínade capsídeo livre para quantificar a quantidade de proteína de fusão de cap-sídeo na solução. Uma proporção de peptídeo de fusão de capsídeo paraRNA de CCMV de 5:1 peso para peso foi usada para montagem. A fonte deRNA foi RNA1, RNA2, RNA3, ou RNA4 subgenômico de CCMV transcrito invitro ou qualquer porção desses. Alternativamente, RNA viral de CCMV iso-lado de plantas infectadas com RNA de CCMV ou de vírus do mosáico decapim bromo produzido in vitro ou in vivo pode ser usado. AlternativamenteRNAm aleatório isolado de um organismo tal como plantas ou Pseudomonasfluorescens pode ser usado. A concentração de peptídeos de fusão de cap-sídeo foi 10 mM (1 mg em 4 ml). 10 μΜ de solução de peptídeo de fusão decapsídeo e RNA foi dialisada contra tampão de montagem (Tris-HCI 50mMpH 7.2, NaCI 50mM, KCI 10 mM, MgCI2 5mM, DTT 1mM) por 2 a 12 horas a4°C. As partículas montadas resultantes foram lavadas com tampão de mon-tagem usando microconcentradores Centricon-100. Uma porção do retenta-do de amostra foi tomada e medida por absorbância a 280 nm para determi-nar o rendimento de VLP. Uma porção do retentado foi aplicado em um gra-diente de sacarose para determinar a montagem de VLP, e a porção restan-te foi concentrada em Tampão de Vírus (Acetato de Sódio 0,1 M, pH 5.2), ecorrido em um SDS-PAGE.

A figura 3 mostra a separação de VLPs de CCMV-PA3 com esem RNA em um gradiente de densidade de sacarose. A figura 4 mostra umgel de SDS-PAGE das bandas de VLP de CCMV-PA1 e CCMV-PA2 com esem RNA isoladas do gradiente de densidade de sacarose. A figura 5 mostrauma analise de microscopia eletrônica de VLPs remontadas a partir de pep-tídeos de fusão de capsídeo de CCMV-PA4 na ausência de RNA.

Exemplo 4 - Remontagem de VLPs contendo múltiplos peptídeos de fusãode capsídeo de CCMV recombinantes.

Peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes con-tendo peptídeos antigênicos do mesmo ou de diferentes patógenos (comodescrito no Exemplo 1) podem ser produzidos em Pseudomonas fluorescenscomo corpos de inclusão. Os corpos de inclusão podem ser isolados, os vá-rios peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes solubilizadose reenovelados como descrito no Exemplo 3. Várias combinações de peptí-deos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes contendo insertos anti-gênicos do mesmo ou de diferentes agentes patogênicos podem ser mistu-radas em várias proporções antes da montagem. A reação de remontagempode ser realizada na presença ou ausência de RNA como descrito no E-xemplo 3. As VLPs multivalentes resultantes contem múltiplas populaçõesde peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes contendo dife-rentes insertos antigênicos. As proporções de peptídeos antigênicos podemser ajustadas pelo ajuste da quantidade de cada população de peptídeos defusão de capsídeo de CCMVrecombinantes contendo diferentes insertos depeptídeo antigênico adicionados à mistura antes das reações de montagem.A figura 6 mostra um diagrama de expressão e remontagem de VLPs multi-valentes compostas de peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombi-nantes separados contendo os peptídeos antigênicos Antígeno Protetor-3("PA-3") e PA-4.

Exemplo 5 - Produção de partículas de vírus CCMV em plantas,desmontagem de partículas de vírus CCMV produzidas em planta e remon-tagem de proteína de capsídeo de CCMV em VLPs.

Produção de partículas de vírus CCMV em plantas: misturas decoquetel de RNA1, RNA2 e RNA 3 de CCMV foram usadas para infectarplantas de feijão caupi. Sementes de feijão caupi Califórnia Blackeye #5(Ferry-Morse Seed Co. KY) foram germinadas e transplantadas para vasosde 15,24 cm (6 polegadas) com mistura para plantio Miracle-Gro (Miracle-Gro Lawn Products OH). Plantas de feijão caupi foram infectadas no estágiode duas folhas (aproximadamente 7 dias após a germinação). Uma porçãode pó de carborundum de 440 grit (Fisher Scientific cat. 409-21-2) foi aplica-da sobre uma folha de cada planta. Misturas de coquetel de RNA foram apli-cadas sobre a camada de carborundum. As folhas foram friccionadas porleve atrito com unha coberta por luva. As infecções foram estabelecidas 7-14dias após a inoculação. O tecido da folha foi coletado e congelado a -80°Caté posterior processamento. O tecido da folha foi rompido pela mistura emtampão de vírus (Acetato de sódio 0,2M pH 5.2; EDTA 1,0 Μ). O homogena-do resultante foi comprimido através três camadas de gaze de algodão e foientão centrifugado por 15 min a 15.000 χ g a 4°C. Os sobrenadantes resul-tantes foram removidos. A cada sobrenadante, PEG8000 foi adicionado parauma concentração final de 10% e a solução foi incubada em gelo por 1 h oudurante a noite a 4°C. A seguir, a solução foi centrifugada a 15.000 χ g por10 min a 4°C. Os precipitados foram então ressuspensos em um volume1/10 do sobrenadante inicial de tampão de vírus e as amostras ressuspen-sas foram centrifugadas por 10 min a 15.000 χ g a 4°C. O sobrenadante foirecuperado e submetido a um segundo ciclo de precipitação com PEG.PEG8000 foi adicionado para uma concentração final de 15% e agitado a4°C por 2 horas. A solução foi então centrifugada a 15.000 χ g por 10 mins eo precipitado foi ressuspenso em um pequeno volume de tampão de vírus. Asolução de VLP ressuspensa foi aplicada a um Centricon Plus-20 com pontode corte de peso molecular de 300K e centrifugada a 4.000 χ g por 5 min.

A amostra de VLP concentrada foi então analisada por SDS-PAGE e Western Blotting com anticorpos policlonais anti-CCMV. Alternati-vamente, as partículas virais foram purificadas em gradiente de densidadede sacarose. As partículas virais purificadas foram analisadas por cromato-grafia de exclusão de tamanho (SEC)-HPLC (Figura 8).

Desmontagem das partículas de vírus CCMV produzidas emplanta: CCMV purificado por desmontado por diálise contra tampão A (TrisHCI 50 mM pH 7.5, CaCI2 500mM, DTT 1mM, PMSF 0,2mM) por 16-29 ho-ras a 4°C. O vírus desmontado foi centrifugado a 14.000 rpm por 15 min a4°C para precipitar o RNA viral. O sobrenadante restante foi dialisado contratampão B (Tris HCI 200mM pH 7.5, NaCH M, DTT1M, PMSF0.2 mM) por 2horas a 4°C. O CCMV se desmontou em dímeros de proteína de capsídeoque foram purificados adicionalmente por cromatografia de exclusão de ta-manho FPLC Superose 12. O CCMVs desmontado foi analisado por SEC-HPLC (Figura 8).

Montagem de VLPs de CCMV: VLPs de CCMV foram montadaspor diálise dos dímeros purificados durante a noite contra tampão de monta-gem com baixo teor de sal (Acetato de Sódio 100mM pH 4.8, NaCI 100mM,PMSF 0,2 mM) a 4°C. As VLPs de CCMV remontadas foram analisadas porSEC-HPLC (Figura 8).

Exemplo 6 - Desmontagem e remontagem de VLPs produzidasem vários organismos.

Partículas de CCMV montadas previamente in vitro ou in vivocontendo vários insertos antigênicos do mesmo ou de diferentes agentespatogênicos podem ser produzidas em plantas e/ou Pseudomonas fluores-cens individualmente. As partículas de VLP montadas podem ser isoladas edesmontadas in vitro. Os peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV resul-tantes contendo os peptídeos antigênicos dos mesmos ou de diferentes a-gentes patogênicos podem ser misturados em uma proporção predetermina-da, e subseqüentemente remontados na presença ou ausência de RNA co-mo descrito no Exemplo 3. As VLPs multivalentes resultantes são compostasde peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes separados econtêm múltiplos insertos. As proporções de peptídeos antigênicos podemser ajustadas pelo ajuste da quantidade de cada população de peptídeos defusão de capsídeo de CCMV recombinantes contendo diferentes insertos depeptídeo antigênico adicionada à mistura antes das reações de montagem.

A proteína de capsídeo selvagem também pode ser adicionada à mistura deremontagem antes da montagem.

Exemplo 7 - Remontagem de VLP na presença de CpG

A reação de montagem pode ser realizada na presença de CpGcomo mostrado na Figura 7. As VLPs multivalentes resultantes são compos-tas de peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes separadose contêm múltiplos insertos, e ainda encapsulam CpG dentro das partículas.CpGs agem como adjuvantes de mucosa e podem induzir respostas imunesde Th1 contra antígenos co-administrados. As vantagens de encapsular se-qüências CpG com VLPs pode incluir necessidade de dosagens menores,uma redução nos efeitos colaterais associados com co-administração deCpG, e estabilidade aumentada da CpG e VLP. A figura 7 mostra empaco-tamento de CpGs em VLPs durante as reações de montagem. O CCMV pro-duzido em planta foi desmontado conforme descrito no Exemplo 5. Os díme-ros de CCMV desmontados em tampão B) 0,5 mg/ml) foram misturados comoligonucleotídeos de CpG (120 nmol/ml). Ambos os oligonucleotídeos pa-dronizados e oligonucleotídeos com um esqueleto protegido por DNase fo-ram usados (lntegrated DNA Technologies, Coralville, IA). A seqüência deoligonucleotídeo CpG era 5' TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT 3' (SEQ IDNO: 23). A solução foi dialisada contra tampão de montagem (Tris-HCI 50mM pH 7.2, NaCI 50 mM, KCI 10 mM, MgCI2 5 mM, DTT 1 mM) por 2 a 12horas a 4°C como descrito no exemplo 3B. As partículas montadas resultan-tes foram lavadas com tampão de montagem usando microconcentradoresCentricon-100 e trocadas de tampão para Tampão de Vírus (Cetato de Sódio0,1 Μ, ρΗ 5.2). As amostras foram corridas em SEC-HPLC (Figura 9). Osresultados indicaram que os dímeros se montaram em VLPs tanto na pre-sença de oligonucleotídeos padronizados como na presença de oligonucleo-tídeos com esqueleto protegido por DNase. As amostras foram ainda anali-sadas em gel de agarose a 0,8-1,2%. O gel de agarose foi corado com EtBrpara detectar a presença de oligonucleotídeos CpG e subseqüentemente porcoloração para proteína para detectar a presença de CP de CCMV (Figura10). Os resultados confirmaram que VLPs remontadas encapsularam CpGsdentro das partículas. A raia 1 é o marcador de peso molecular, raia 2 mos-tra amostra de VLP de CCMV com CpGs padronizadas encapsuladas, e raia3 mostra VLP de CCMV com CpGs contendo o esqueleto protegido porDNase encapsuladas.

Claims

1. Método para produzir uma partícula multivalente semelhante avírus que compreende:a) misturar, in vitro:i) pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral quecompreende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico; e,ii) pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral quecompreende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico, em que pelomenos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral compreende pelomenos um inserto de peptídeo antigênico que não está presente no primeiropeptídeo de fusão de capsídeo viral; e,b) juntar o pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral eo pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral para formarpelo menos uma partícula multivalente semelhante a vírus, em que a partícu-la multivalente semelhante a vírus não tem ácidos nucléicos virais infeccio-sos de extensão completa.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a união dopelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral e o pelo menosum segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral ocorre após uma etapa depurificação.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o capsídeoviral do primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral e o segundo peptídeode fusão de capsídeo viral são derivados do mesmo ou de diferentes mem-bros de táxon viral.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o capsídeoviral do primeiro e/ou segundo peptídeos de fusão de capsídeo viral são de-rivados da seqüência de aminoácido de um vírus icosaédrico.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o vírus ico-saédrico é o vírus do mosqueado clorótico do feijão caupi.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inserto depeptídeo antigênico do primeiro e do segundo peptídeos de fusão de capsí-deo viral compreende um inserto de peptídeo antigênico derivado de umagente patogênico.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que os insertosde peptídeo antigênicos do primeiro peptídeo de fusão de capsídeo e do se-gundo peptídeo de fusão de capsídeo são derivados do mesmo ou de dife-rentes agentes patogênicos.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a partículasemelhante a vírus não tem ácidos nucléicos virais.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiroe/ou segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral é derivado de uma partí-cuia de vírus ou semelhante a vírus produzida anteriormente in vivo.

10. Método para produzir uma partícula multivalente semelhan-te a vírus que compreende:a) misturar, in vitro:i) pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral quecompreende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico,ii) pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral quecompreende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico, em que o peloum segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral compreende pelo menosum inserto de peptídeo antigênico que não está presente no primeiro peptí-deo de fusão de capsídeo viral; eiii) pelo menos um ácido nucléico imunoestimulatório, em que a seqüênciado ácido nucléico imunoestimulatório é uma seqüência de oligonucleotídeoCpG; eb) juntar o pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral, opelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral, e o ácido nu-cléico imunoestimulatório para formar pelo menos uma partícula multivalentesemelhante a vírus,em que a partícula multivalente semelhante a vírus não tem ácidos nucléicosvirais infecciosos de extensão completa.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a se-qüência de oligonucleotídeo CpG é AACGTTCG (SEQ ID NO: 24).

12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o capsí-deo viral do primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral e do segundo pep-tídeo de fusão de capsídeo viral são derivados do mesmo membro de táxonviral ou de um membro de táxon viral diferente.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o capsí-deo viral do primeiro e/ou segundo peptídeos de fusão de capsídeo viral éderivado da seqüência de aminoácidos de um vírus icosaédrico.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o vírusicosaédrico é vírus do mosqueado clorótico do feijão caupi.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o insertode peptídeo antigênico dos primeiro e segundo peptídeos de fusão de capsí-deo viral compreendem um inserto de peptídeo derivado de um agente pato-gênico.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o primei-ro peptídeo de fusão de capsídeo viral e o segundo peptídeo de fusão decapsídeo viral compreendem insertos de peptídeo antigênico derivados domesmo ou de diferentes agentes patogênicos.

17. Método para produzir uma partícula multivalente semelhan-te a vírus que compreende:a) fornecer:i) pelo menos uma primeira partícula semelhante a vírus que compre-ende pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo que compre-ende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico; e,ii) pelo menos uma segunda partícula semelhante a vírus que com-preende pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo que com-preende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico;b) separar:i) a primeira partícula semelhante a vírus para fornecer pelo menosum primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral isolado que compreendepelo menos um inserto de peptídeo antigênico; eii) a segunda partícula semelhante a vírus para fornecer pelo menosum segundo peptídeo de fusão de capsídeo isolado que compreende pelomenos um inserto de peptídeo antigênico, em que o pelo menos um segun-do peptídeo de fusão de capsídeo viral compreende pelo menos um insertode peptídeo antigênico que não está presente no primeiro peptídeo de fusãode capsídeo viral; ec) misturar, in vitro:i) o pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral; eii) o pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral; ed) unir o pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral e opelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral para formarpelo menos uma partícula multivalente semelhante a vírus,em que a partícula multivalente semelhante a vírus não tem ácidos nu-cléicos virais infecciosos de extensão completa.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o capsí-deo viral do primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral e do segundo pep-tídeo de fusão de capsídeo viral são derivados dos mesmos ou de diferentesmembros de táxon viral.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o capsí-deo viral do primeiro e/ou segundo peptídeo de fusão de capsídeo viral sãoderivados da seqüência de aminoácido de um vírus icosaédrico.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o vírusicosaédrico é um vírus do mosqueado clorótico do feijão caupi.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, em que inserto depeptídeo antigênico dos primeiro e segundo peptídeos de fusão de capsídeoviral compreende um inserto antigênico derivado de um agente patogênico.

22. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o primei-ro peptídeo de fusão de capsídeo e o segundo peptídeo de fusão de capsí-deo compreendem diferentes insertos de peptídeo antigênico derivados domesmo ou de diferentes agentes patogênicos.

23. Método de acordo com a reivindicação 17, em que os pri-meiro e/ou segundo peptídeo de fusão de capsídeo é derivado de expressãoem Pseudomonas fluorescens.

24. Método de acordo com a reivindicação 17, ainda compreen-dendo misturar, in vitro, iii) pelo menos uma seqüência de ácido nucléicoimunoestimulatória, em que a seqüência imunoestimulatória é uma seqüên-cia de oligonucleotídeo CpG.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a se-qüência de oligonucleotídeo CpG é AACGTTCG (SEQ ID NO: 24).

26. Partícula multivalente semelhante a vírus que compreende:i) pelo menos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo do vírus domosqueado clorótico do feijão caupi que compreende pelo menos um insertoantigênico; e,ii) pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeo do vírus domosqueado clorótico do feijão caupi que compreende pelo menos um insertoantigênico, em que pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeoviral compreende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico que nãoestá presente no primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral; eem que a partícula multivalente semelhante a vírus não tem ácidos nu-cléicos virais infecciosos de extensão completa.

27. Partícula multivalente semelhante a vírus da reivindicação-26, em que o primeiro peptídeo de fusão de capsídeo e o segundo peptídeode fusão de capsídeo compreendem um inserto de peptídeo antigênico ondeos insertos de peptídeo antigênico são derivados do mesmo ou de diferentesagentes patogênicos.

28. Partícula multivalente semelhante a vírus de acordo com areivindicação 26, em que a partícula multivalente semelhante a vírus resul-tante não tem ácidos nucléicos virais.

29. Partícula multivalente semelhante a vírus da reivindicação-26, em que a partícula semelhante a vírus compreende uma seqüência deoligonucleotídeo CpG.

30. Partícula multivalente semelhante a vírus da reivindicação-26, em que a seqüência de oligonucleotídeo CpG compreende AACGTTCG(SEQ ID NO: 24).

31. Método de aumentar a solubilidade de uma partícula multiva-lente semelhante a vírus que compreende misturar, in vitro, pelo menos umprimeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral que compreende pelo menosum inserto de peptídeo antigênico, e pelo menos um segundo peptídeo defusão de capsídeo viral que compreende pelo menos um inserto de peptídeoantigênico, em que pelo menos um segundo peptídeo de fusão de capsídeoviral compreende pelo menos um inserto de peptídeo antigênico que nãoestá presente no primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral, e unir o pelomenos um primeiro peptídeo de fusão de capsídeo viral e o pelo menos se-gundo peptídeo de fusão de capsídeo viral para formar pelo menos uma par-tícula multivalente semelhante a vírus, em que a partícula multivalente seme-lhante a vírus resultante não tem ácidos nucléicos virais infecciosos de ex-tensão completa.

32. Vacina que compreende a partícula multivalente semelhante avírus como definido na reivindicação 1.